特表 2022-534625 標的ゲノム領域の捕捉と分析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-02

(54)【発明の名称】標的ゲノム領域の捕捉と分析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20220726BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220726BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20220726BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220726BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220726BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6806 Z ZNA

C12Q1/686 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506557

(86)(22)【出願日】2020-05-13

(85)【翻訳文提出日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 US2020032615

(87)【国際公開番号】W WO2020232081

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】62/846,988

(32)【優先日】2019-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521521219

【氏名又は名称】ラピッド ゲノミクス エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110003339

【氏名又は名称】特許業務法人南青山国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ネヴェス，レアンドロ ゴミデ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含む特定の認識部位でエンドヌクレアーゼを使用して、標的ゲノム領域を開裂し、標的ゲノム領域を、架橋オリゴにハイブリダイズさせることによって、標的ゲノム領域を捕捉することを含む、標的ゲノム領域を捕捉する材料及び方法に関する。本開示はまた、捕捉した標的ゲノム領域を分析することにも関する。開裂に用いられるエンドヌクレアーゼは、認識部位に特異的に結合して、開裂に向ける１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼとすることができる。捕捉された標的ゲノム領域は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応又はローリングサークル増幅を介して増幅され、検出又は配列決定することができる。さらに、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットに関し、１つ以上の標的ゲノム領域を開裂するように設計された１つ以上のエンドヌクレアーゼと、１つ以上の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された架橋オリゴヌクレオチドを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝物質から標的ゲノム領域を捕捉する方法であって、
ａ）最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含み、前記標的ゲノム領域に隣接する第１の認識部位及び第２の認識部位を有する１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、前記遺伝物質から前記標的ゲノム領域を開裂する工程と、
ｂ）前記開裂した遺伝物質を一本鎖形態に変性する工程と、
ｃ）前記標的ゲノム領域を、前記一本鎖形態の標的ゲノム領域の３'及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'及び５'の配列を含む架橋オリゴにハイブリダイズさせることによって、前記一本鎖形態の標的ゲノム領域を捕捉する工程と
ことを含む、方法。

【請求項2】

前記第１の認識部位及び第２の認識部位はそれぞれ、最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含み、前記第１の認識部位及び第２の認識部位は、前記標的ゲノム領域に隣接する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

特異的な制限部位で前記遺伝材料を開裂する前記１つ以上のエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ又はプログラマブルエンドヌクレアーゼである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上の制限エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ、ＲＮＡ又はＤＮＡ誘導アルゴノートタンパク質及び構造誘導エンドヌクレアーゼから選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記プログラマブルエンドヌクレアーゼは、第１の認識部位に相補的な配列を有する第１のガイド分子に基づいて第１の認識部位でＤＮＡを切断する第１のヌクレアーゼ、及び第２の認識部位に相補的な配列を有する第２のガイド分子に基づいて第２の認識部位でＤＮＡを切断する第２のプログラマブルエンドヌクレアーゼを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記架橋オリゴは、前記一本鎖標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列にハイブリダイズする３'及び５'末端の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記架橋オリゴは、前記一本鎖標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列にハイブリダイズする３'及び５'末端オーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記架橋オリゴは、レアカッター制限エンドヌクレアーゼに特異的な制限部位、プログラマブルエンドヌクレアーゼ及び／又はプライマー結合配列をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

前記架橋オリゴは、固体基質上に固定化される、又はビオチン化される、請求項７～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記第１及び第２の認識部位は、前記遺伝物質の同じ鎖上に存在する、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記第１及び第２の認識部位は、前記遺伝物質の異なる鎖上に存在する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記開裂遺伝物質を、前記一本鎖形態に変性する工程は、前記開裂遺伝物質を、７５℃から１１５℃の間、８０℃から１１０℃の間、８５℃から１０５℃の間、９０℃から１００℃の間、又は約９５℃の温度に晒すことを含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

ｄ）前記架橋オリゴにハイブリダイズした前記一本鎖標的ゲノム領域の前記自由端部をライゲーションして、前記架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖環状標的ゲノム領域を生成し、
ｅ）任意で、非環状化遺伝物質を分解し、
ｆ）任意で、核酸増幅によって前記標的ゲノム領域を増幅して、前記標的ゲノム領域の複数のコピーを生成し、
ｇ）前記増幅された標的ゲノム領域を分析すること
を含む、前記標的ゲノム領域をさらに分析することを含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

露出した３'又は５'末端から核酸を分解するエキソヌクレアーゼの組み合わせによって、非環状化遺伝物質を分解して、前記架橋オリゴにハイブリダイズした環状化標的ゲノム領域のみを残す、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記標的ゲノム領域を増幅して、前記標的ゲノム領域の複数のコピーを生成することを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項17】

ＰＣＲプライマーは、標的領域に特異的であるか、又は、前記架橋オリゴによって導入される共通領域に結合するように設計することによって、全ての標的に共通とすることができる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応により、前記標的ゲノム領域を増幅して、前記標的ゲノム領域の複数の連結コピーを生成することを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項19】

前記架橋オリゴを、前記ＲＣＡ反応のためのプライマーとして用いて、一本鎖形態で標的ゲノム領域の複数の連結コピーを生成する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記架橋オリゴ及び／又は１つ以上の追加のプライマーを、前記ＲＣＡ反応のために用いて、二本鎖形態で前記標的ゲノム領域の複数の連結コピーを生成する、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記分析は、前記標的ゲノム領域を検出することを含む、請求項１４～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記標的ゲノム領域を検出することは、前記標的ゲノム領域を、前記標的ゲノム領域に特異的に結合するラベル付きプローブ又は前記増幅標的分子に結合する基質と接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記分析は、前記標的ゲノム領域を配列決定することを含む、請求項１４～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記配列決定は、ナノポア配列決定、可逆的色素ターミネーター配列決定、又は単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

遺伝物質から複数の標的ゲノム領域を捕捉する方法であって、
ａ）複数対のエンドヌクレアーゼを用いて、前記遺伝物質から複数の標的ゲノム領域を開裂し、各対のエンドヌクレアーゼは、第１の認識部位及び第２の認識部位を有し、各認識部位は、最低約１７～約２４のヌクレオチドの配列を含み、各対の認識部位は、前記複数の標的ゲノム領域からの標的ゲノム領域に隣接し、
ｂ）前記開裂遺伝物質を一本鎖形態に変性させ、
ｃ）複数の標的ゲノム領域を、複数の架橋オリゴにハイブリダイズさせることによって、一本鎖形態の前記複数の標的ゲノム領域を捕捉し、各架橋オリゴは、一本鎖形態の複数の標的ゲノム領域から、標的ゲノム領域の３'末端及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'末端及び５'末端の配列を含む、方法。

【請求項26】

ｄ）前記複数の架橋オリゴにハイブリダイズした前記一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、対応する架橋オリゴにハイブリダイズした、複数の標的ゲノム領域からの標的ゲノム領域を各々含有する複数の一本鎖環状遺伝物質を生成し、
ｅ）任意で、非環状遺伝物質を除去し、
ｆ）任意で、核酸増幅によって、前記複数の標的ゲノム領域を増幅して、各標的ゲノム領域の複数のコピーを生成し、
ｇ）前記増幅された標的ゲノム領域を分析することを含む、前記複数の標的ゲノム領域を分析することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記複数の架橋オリゴは、固体基質上に固定化される、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

前記複数の標的ゲノム領域を、核酸増幅により増幅して、各標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記標的ゲノム領域を増幅して、前記標的ゲノム領域の複数のコピーを生成することを含む、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

ＰＣＲプライマーは、標的領域に特異的であるか、又は、好ましくは、前記架橋オリゴによって導入される共通領域に結合するように設計することによって、全ての標的に共通とすることができる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応により、前記複数の標的ゲノム領域のそれぞれを増幅して、前記複数の標的ゲノム領域のそれぞれの複数の連結コピーを生成することを含む、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

前記架橋オリゴを、前記ＲＣＡ反応のためのプライマーとして用いて、一本鎖形態で標的ゲノム領域のそれぞれの複数の連結コピーを生成する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記架橋オリゴ及び／又は１つ以上の追加のプライマーを、前記ＲＣＡ反応のために用いて、二本鎖形態で前記標的ゲノム領域のそれぞれの複数の連結コピーを生成する、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記分析は、前記標的ゲノム領域を検出することを含む、請求項２８～３１のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

前記標的ゲノム領域を、前記複数の標的ゲノム領域から検出することは、前記標的ゲノム領域を、前記標的ゲノム領域に特異的に結合するラベル付きプローブ又は前記増幅された標的分子に結合する物質と接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記分析は、前記標的ゲノム領域の配列決定することを含む、請求項２８～３３のいずれかに記載の方法。

【請求項37】

前記配列決定は、ナノポア配列決定、可逆的色素ターミネーター配列決定、又は単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ａ）エンドヌクレアーゼを標的に向ける１つ以上のガイド分子と、
ｂ）１つ以上の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された１つ以上の架橋オリゴと、任意で、
ｃ）１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼと
を含む、キット。

【請求項39】

ＰＣＲ又はＲＣＡ反応において環状化標的ゲノム領域を増幅するように設計されたプライマー、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び１つ以上のレアカッター制限エンドヌクレアーゼのうち１つ以上をさらに含む、請求項３８に記載のキット。

【請求項40】

前記キットは、１つ以上の特異的な標的ゲノム領域のためにカスタマイズされている、請求項３８又は３９に記載のキット。

【請求項41】

複数の架橋オリゴを含み、各前記架橋オリゴは、複数の標的ゲノム領域から、標的ゲノム領域の３'末端及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'末端及び５'末端の配列を含む、キット。

【請求項42】

前記複数の架橋オリゴは、固体基質上に固定化される、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

エンドヌクレアーゼを前記標的に向ける１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼと１つ以上のガイド分子とをさらに含む、請求項４１又は４２に記載のキット。

【請求項44】

ＰＣＲ又はＲＣＡ反応において環状化標的ゲノム領域を増幅するように設計されたプライマー、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び１つ以上のレアカッター制限エンドヌクレアーゼのうち１つ以上をさらに含む、請求項４１～４３のいずれかに記載のキット。

【請求項45】

前記キットは、複数の特異的な標的ゲノム領域のためにカスタマイズされている、請求項４１～４３のいずれかに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年５月１３日出願の米国仮出願第６２／８４６，９８８号の優先権を主張するものであり、全ての図表及びアミノ酸又は核酸配列を含む内容を参照することにより組み込まれる。

【0002】

本出願の配列表は、２０２０年５月１１日に作成され、３ＫＢである「Seq-List.txt」とラベル付けされたものである。配列表の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

標的ゲノム領域の配列決定等の捕捉と分析は、農学、分類学から医学に至るまでの多様なバイオテクノロジー分野において極めて重要である。例えば、ゲノム中の標的領域の配列決定は、ゲノムの特異的な領域における遺伝的多様性を理解することが、被験者の健康に関する表現型情報と結びつき、その結果、治療選択肢を指示することができる、精密かつ個別化された医学において重要である。また、ゲノムの標的領域を配列決定することは、種子や食品製造等の植物における望ましい形質を改善するための農学用途において重要である。

【0004】

標的ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ配列を分析するためのいくつかの方法が存在する。例えば、配列決定前の標的増幅は一般的であり、ゲノムの標的領域を単離及び／又は増幅するために複数の方法が利用可能である。共通のテーマとして、当技術分野で公知の方法は、標的ゲノム領域を単離及び増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション連鎖反応、又はプローブハイブリダイゼーション等を利用する。遺伝物質の等温検出のための現在の方法は、例えば、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）や鎖置換増幅を使用して行われる。しかしながら、これらの技術は、異なる標的に対して最適化するのが困難であり、長い標的を分析するのに適していない。また、これらの等温技術は、多数の標的について多重化することが困難又は不可能であり、増幅生成物を容易に配列決定するのに適していない。例えば、例えば、少なくとも約１～５０キロベース（ｋｂ）といったＤＮＡ配列の長めの伸縮を特定する、特に、検出及び配列決定することは、特に着目されている。しかし、このような検出及び配列決定は、従来の方法では容易に達成されない。従って、標的ゲノム領域の特定、例えば、検出及び配列決定、特に、標的ゲノム領域の長い伸縮の検出及び配列決定のための改善された方法が望まれている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Dahl, F., Stenberg, J., Fredriksson, S., Welch, K., Zhang, M., Nilsson, M., et al. (2007). Multigene amplification and massively parallel sequencing for cancer mutation discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 9387-92. doi:10.1073/pnas.0702165104.

【非特許文献2】Fredriksson, S., Baner, J., Dahl, F., Chu, A., Ji, H., Welch, K., et al. (2007). Multiplex amplification of all coding sequences within 10 cancer genes by Gene-Collector. Nucleic Acids Res. 35, e47. doi:10.1093/nar/gkm078.

【非特許文献1】Hegge, J. W., Swarts, D. C., and van der Oost, J. (2017). Prokaryotic Argonaute proteins: novel genome-editing tools? Nat. Rev. Microbiol. 16, 5-11. doi:10.1038/nrmicro.2017.73.

【非特許文献3】Hu, J. H., Miller, S. M., Geurts, M. H., Tang, W., Chen, L., Sun, N., et al. (2018). Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature 556, 57-63. doi:10.1038/nature26155.

【非特許文献4】Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-21. doi:10.1126/science.1225829.

【非特許文献5】Nilsson, M., Malmgren, H., Samiotaki, M., Kwiatkowski, M., Chowdhary, B. P., and Landegren, U. (1994). Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science 265, 2085-8. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7522346 [Accessed May 1, 2018].

【非特許文献6】Swarts, D. C., Hegge, J. W., Hinojo, I., Shiimori, M., Ellis, M. A., Dumrongkulraksa, J., et al. (2015). Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Res. 43, 5120-5129. doi:10.1093/nar/gkv415.

【非特許文献7】Varshney, G. K., and Burgess, S. M. (2016). DNA-guided genome editing using structure-guided endonucleases. Genome Biol. 17, 187. doi:10.1186/s13059-016-1055-4.

【非特許文献8】Xu, S., Cao, S., Zou, B., Yue, Y., Gu, C., Chen, X., et al. (2016). An alternative novel tool for DNA editing without target sequence limitation: the structure-guided nuclease. Genome Biol. 17, 186. doi:10.1186/s13059-016-1038-5.

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の特定の実施形態は、標的ゲノム領域を捕捉し、任意で、例えば、検出及び／又は配列決定によって、さらに分析するための材料及び方法を提供する。本明細書中に開示される材料及び方法は、少なくとも約１ｋｂ、好ましくは、少なくとも約１０ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｋｂ、又は最も好ましくは、少なくとも約５０ｋｂを含む標的ゲノム領域を分析するのに特に適切である。

【0007】

本明細書に開示される方法によれば、標的ゲノム領域は、２つの特異的認識部位での開裂に基づいて単離され、各認識部位は、最低約１０～約３０のヌクレオチドを含む。２つの認識部位は、標的ゲノム領域に隣接する。次いで、開裂した標的ゲノム領域は、本明細書中で「架橋オリゴ」と呼ばれるオリゴヌクレオチドを使用して捕捉される。架橋オリゴは、開裂した標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列にハイブリダイズする３'及び５'末端の配列を有する。次いで、捕捉された標的ゲノム領域は、例えば、増幅及び配列決定を介して、検出及び／又は配列決定される。

【0008】

従って、本発明の特定の実施形態は、遺伝物質から標的ゲノム領域を捕捉する方法であって、
ａ．最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含み、標的ゲノム領域に隣接する第１の認識部位及び第２の認識部位を有する１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、遺伝物質から標的ゲノム領域を開裂し、
ｂ．開裂した遺伝物質を一本鎖形態に変性し、
ｃ．標的ゲノム領域を、一本鎖形態の標的ゲノム領域の３'及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'及び５'の配列を含む架橋オリゴに、ハイブリダイズさせることによって一本鎖形態の標的ゲノム領域を捕捉する
ことを含む。

【0009】

捕捉された標的ゲノム領域は、さらに分析、例えば、検出又は配列決定される。このような分析は、
ｄ．架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖環状標的ゲノム領域を生成する工程と、
ｅ．任意で、非環状化遺伝物質を分解する工程と、
ｆ．任意で、核酸増幅によって標的ゲノム領域を増幅して、標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する工程と、
ｇ．増幅された標的ゲノム領域を分析する工程と
を含む。

【0010】

好ましい実施形態において、認識部位における標的ゲノム領域の開裂は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）といった第１及び第２のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えば、第１の認識部位に相補的な配列を有する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び第２の認識部位に相補的な配列を有する第２のｇＲＮＡを含む第２のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて行われる。

【0011】

さらなる実施形態において、架橋オリゴにハイブリダイズした標的ゲノム領域は、増幅反応、例えば、等温増幅反応を介して、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を介して増幅される。架橋オリゴのみが増幅のためのプライマーとして使用される場合、一本鎖増幅生成物は、一本鎖形態の標的ゲノム領域の連結コピーを含むＲＣＡを介して生成される。架橋オリゴに加えて、１つ以上のプライマーもまた、二本鎖形態の標的ゲノム領域の連結コピーを含む二本鎖増幅生成物を生成するために、ＲＣＡ反応において使用される。従来のＰＣＲ反応を用いて、標的領域又は架橋オリゴによって導入された共通領域に結合する適切なプライマーを用いて標的分子を増幅することもできる。

【0012】

増幅された標的ゲノム領域は、当該分野で公知の技術を使用して、例えば、標的ゲノム領域内の配列に相補的なラベル付きプローブを使用して検出される。増幅された標的ゲノム領域はまた、当該分野で公知の技術、例えば、ナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、可逆的色素ターミネーター配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標））及び単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定（ＰａｃＢｉｏ（商標））を使用して配列決定される。

【0013】

本明細書中に開示される材料及び方法は、例えば、多重反応において、複数の標的ゲノム領域を捕捉し、任意で、分析するように変形することができる。このような実施形態において、複数対の標的認識部位は、複数の標的認識部位を開裂するように設計され、これらの複数の標的ゲノム領域は、標的ゲノム領域を捕捉するようにそれぞれ特異的に設計される複数の架橋オリゴを介して捕捉される。特定の実施形態において、複数の架橋オリゴは、チップ等の固体基質に固定することができる。そのように捕捉された複数の標的ゲノム領域は、当技術分野で公知の技術を用いて検出又は配列決定することができる。

【0014】

本発明のさらなる実施形態はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、１つ以上の標的ゲノム領域を開裂するように設計された１つ以上のエンドヌクレアーゼ、及び１つ以上の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された特異的な架橋オリゴを含む。

【0015】

特定の実施形態において、本発明のキットは、１つ以上の標的ゲノム領域を開裂するように設計されたＤＮＡ又はＲＮＡの形態の１つ以上のガイド分子、及び１つ以上の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された特異的架橋オリゴを含む。このようなキットはまた、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含むこともできる。

【0016】

キットは、捕捉された１つ以上の標的ゲノム領域を増幅するためのポリメラーゼ、リガーゼ、プライマー及び他の試薬をさらに含むことができる。さらに、キットは、本発明の方法を実施するための説明書を提供することができる。

【0017】

この特許又は出願書類は，色彩を付して作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。本特許又は特許出願公開の写しであって、色彩図面を付したものは、要求し、かつ、必要な手数料を納付したときに特許商標庁が提供する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】標的ゲノム領域を捕捉する方法及び標的ゲノム領域を分析、すなわち、検出又は配列決定する２つの例の概要図である。

【図2】単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定（ＰａｃＢｉｏ（商標））を用いて捕捉された標的ゲノム領域を配列決定する例。

【図3】多数の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された架橋オリゴの配列を用いた、多数の標的ゲノム領域の検出の例。

【図4】ＰＣＲによる環状化標的分子の増幅の例。可逆的色素ターミネーター配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標））を用いた配列決定に必要なアダプターを含むプライマーを例示する。Ａ)プロセスの概要。Ｂ）配列を捕捉し、プライマーのための着地部位を提供するのに必要な架橋オリゴの構造。Ｃ）分子の同時増幅、固有のサンプル識別子の組み込み、及び色素ターミネーター配列決定に必要な構造の組み込みを可能にするプライマーの構造。

【図5】二本鎖ゲノムの同じ鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する例。

【図6】二本鎖ゲノムの逆の鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する例。

【図7】二本鎖ゲノムの逆の鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する他の例。

【図8】二本鎖ゲノムの同じ鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する他の例。

【図9】標的分子の末端をライゲーションして環状一本鎖構造を形成するための種々のアプローチの例。

【図10】相補的でない５'末端部分を有する架橋オリゴから生じるＲＣＡ反応の例。

【図11】単一のプログラマブルエンドヌクレアーゼ及び標的から伸長するプライマーを利用して、環状一本鎖分子及び架橋オリゴを形成する例。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本明細書で使用される単数形「１つ」及び「その」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、複数形も含むことを意図する。さらに、「含む」、「有する」、「備える」又はその変形が詳細な明細書及び／又は請求範囲のいずれかに使用される限り、そのような用語は、「含む（comprising）」という用語に類似した方法で包含することが意図されている。「含む」、「からなる」、「本質的にからなる」を含む移行用語／句（及びその任意の文法的変形）は、区別なく使用される。

【0020】

「から本質的になる」という句は、記載された実施形態が、特定の材料又は工程を含む実施形態、及び記載された実施形態の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない実施形態を包含することを示す。

【0021】

「約」という用語は、当業者によって求められる特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は求められるか、すなわち、測定方式の限界に部分的に依存している。「約」という用語が使用されるポリヌクレオチドの長さに関して、ポリヌクレオチドは、値（Ｘ±１０％）付近で０～１０％の変動を有する記載された数の塩基又は塩基対を含む。

【0022】

本開示において、範囲は、長さを設定し、その範囲内の各値及びすべての値を記述することを回避するために、簡潔に記載されている。範囲内の任意の適切な値は、適切な場合、範囲の上限値、下限値、又は末端として選択される。例えば、０．１～１．０の範囲は、０．１及び１．０の末端値、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９の中間値、そして０．２～０．５、０．２～０．８、０．７～１．０等の０．１～１．０内に包含されるすべての中間範囲を表す。範囲内に少なくとも２つの有効数字を有する値が想定され、例えば、５～１０の範囲は、５．０～１０．０の間、そして末端値を含む５．００～１０．００の間のすべての値を示す。ポリヌクレオチドのサイズ等の範囲が本明細書で使用される場合、範囲の組み合わせ及び下位組み合わせ（例えば、開示された範囲内の下位範囲）、その中の特定の実施形態は、明示的に含まれる。

【0023】

本明細書で使用される「生物」という用語は、ウイルス、細菌、真菌、植物及び動物を含む。生物のさらなる例は当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。本明細書中に記載されるアッセイは、任意の生物から得られる任意の遺伝物質を分析する際に有用である。

【0024】

「ゲノム」又は「遺伝物質」及び本明細書で使用されるその他の文法的変化は、任意の生物由来の遺伝物質を指す。遺伝物質は、ウイルスゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡのような核遺伝物質又はミトコンドリアＤＮＡ又は葉緑体ＤＮＡのような細胞小器官に存在する遺伝物質である。それはまた、天然又は人工の混合物又はいくつかの生物に由来する遺伝物質も表す。

【0025】

本明細書で使用される「長い標的ゲノム領域」という語句は、少なくとも約１ｋｂ、好ましくは、少なくとも約１０ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｋｂ、又は最も好ましくは、少なくとも約５０ｋｂを有する標的ゲノム領域を指す。

【0026】

標的ゲノム領域、特に、長い標的ゲノム領域を特定するための本明細書に開示される材料及び方法は、標的ゲノム領域、特に、長い標的ゲノム領域の捕捉及び検出のための従来の方法に関連する課題を解決する。

【0027】

特定の実施形態において、本発明は、遺伝物質から標的ゲノム領域を捕捉する方法を提供する。本方法は、
ａ．最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含み、標的ゲノム領域に隣接する、第１の認識部位及び第２の認識部位を有する１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、遺伝物質から標的ゲノム領域を開裂する工程と、
ｂ．開裂した遺伝物質を一本鎖形態に変性する工程と、
ｃ．標的ゲノム領域を、一本鎖形態の標的ゲノム領域の３'及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'及び５'末端の配列を含む架橋オリゴにハイブリダイズさせることによって一本鎖形態の標的ゲノム領域を捕捉する工程と
を含む。

【0028】

捕捉された標的ゲノム領域は、さらに分析、例えば、検出又は配列決定される。このような分析は、
ｄ．架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖環状標的ゲノム領域を生成する工程と、
ｅ．任意で、非環状化遺伝物質を分解する工程と、
ｆ．任意で、核酸増幅によって標的ゲノム領域を増幅して、標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する工程と、
ｇ．増幅された標的ゲノム領域を分析する工程と
を含む。

【0029】

本明細書中で使用される「標的ゲノム領域」は、生物のゲノムにおける当該領域である。このような領域は、第１の認識部位及び第２の認識部位に隣接する。第１及び第２の認識部位の各々は、最低約１０～約３０のヌクレオチドの配列を含む。

【0030】

第１及び第２の認識部位は、標的ゲノム領域に基づいて選択される。典型的には、標的ゲノム領域に隣接する独特の配列が第１及び第２の認識部位として選択される。これらの配列の独特さは、これらの配列がゲノムの他の場所で生じにくいことを保証するものであるため、非特異的開裂を最小化し、標的ゲノム領域以外の領域の捕捉を回避する。また、第１及び第２の認識部位の最小長は、好ましくは、約１０～約３０のヌクレオチドであり、これは、これらの配列がゲノム中でまれにしか生じないことを保証するものであるため、標的ゲノム領域以外の領域の非特異的開裂及び捕捉も最小限にする。第１及び第２の認識部位の配列は、互いに同一であってもよく、又は互いに異なっていてもよい。当業者であれば、標的ゲノム領域の配列及び特定の生物についての利用可能なゲノム配列に基づいて、例えば、ゲノム配列データベースから、第１及び第２の認識部位についての適切な配列を求めることができる。

【0031】

認識部位での遺伝物質の開裂は、特異的な認識部位で遺伝物質中のホスホジエステル結合（切断）を開裂する１つ以上のエンドヌクレアーゼを用いて行われる。エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。最低約１０～約３０のヌクレオチド、例えば、約８０までのヌクレオチドを含む認識部位を切断する特定の制限エンドヌクレアーゼには、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ系列、ＧＩＹ‐ＹＩＧ系列、ＨＮＨ系列、Ｈｉｓ‐Ｃｙｓボックス系列及びＰＤ‐（Ｄ／Ｅ）ＸＫ系列由来のホーミングエンドヌクレアーゼ等のメガヌクレアーゼが含まれる。最低約１０～約３０のヌクレオチド、例えば、約８０までのヌクレオチドを含む認識部位を切断する制限エンドヌクレアーゼのさらなる例は、当技術分野で公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。

【0032】

好ましい実施形態において、認識部位での開裂は、１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼを使用して行われる。プログラマブルエンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の特異的な領域を開裂するために標的化される酵素の異なる部類を記載するために使用される。このように、プログラム可能なエンドヌクレアーゼは、当該ヌクレオチド配列を開裂するように設計又はプログラムされるエンドヌクレアーゼである。例えば、プログラマブルエンドヌクレアーゼは、標的認識部分及びエンドヌクレアーゼ部分を含み、ここで、共通のエンドヌクレアーゼ部分は、任意の標的認識部分と組み合わされて、当該ヌクレオチド配列を開裂する。

【0033】

一実施形態において、プログラマブルエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）によって、又はガイド分子と標的との間に形成される構造によって標的化される（非特許文献７）。例えば、Ｃａｓ９は、認識部位の特定の位置で二本鎖切断を行うことによって二本鎖遺伝物質を開裂するので、プログラム可能なエンドヌクレアーゼである（非特許文献４）。認識部位の配列に相補的な特異的配列をもつｇＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを認識部位に向ける。ｇＤＮＡ又はｇＲＮＡ分子を用いて、いくつかの型のアルゴネートタンパク質を標的とすることもまた示されている（非特許文献２、非特許文献６）。プログラム可能なエンドヌクレアーゼのさらなる例としては、特に、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ、ＲＮＡ又はＤＮＡ誘導（RNA- or DNA-guided）アルゴノートタンパク質、構造誘導(structure-guided)エンドヌクレアーゼが挙げられる。

【0034】

新規なタンパク質はまた、ｇＤＮＡと標的配列との間に形成される特定のＤＮＡ構造、例えば、３'末端ミスマッチを認識することに基づいて、ＤＮＡを開裂するように設計することもできる（非特許文献８）。典型的には、本発明の方法において、２つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、遺伝物質から標的ゲノム領域を開裂する。遺伝物質は、すなわち、第１の認識部位に相補的な配列を有する第１のｇＲＮＡに基づいて第１の認識部位でＤＮＡを切断する第１のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び第２の認識部位に相補的な配列を有する第２のｇＲＮＡに基づいて第２の認識部位でＤＮＡを切断する第２のＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼの成分を含む複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と呼ばれる。いくつかの例において、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を開裂するために１つのみのＲＮＰが必要とされ、二本鎖ＤＮＡの他方の鎖上の選択点はプライマー伸長反応（図１１）の結果である。

【0035】

プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を使用すると、標的領域から環状分子を生成、捕捉又は操作するための当該分野で公知の他の方法に対して大幅な改善が提供される（非特許文献１、非特許文献２）。第１に、一般的な制限酵素の使用では、標的領域内で切断することなく標的領域の近くで切断する制限酵素の組み合わせが存在しないので、分析できる標的ゲノム領域が制限される。これは、部位の数が増加するにつれて特に問題となる。さらに、制限酵素のこのような組み合わせが存在する場合でさえ、それらは、新たな標的が想定されるたびに変化する可能性があり、このプロセスをスケーリングすることを非常に困難にしている。逆に、プログラマブルエンドヌクレアーゼを使用することは、独特のガイドオリゴの設計及びそれらの合成が当該分野で周知であるため、スケーラブルな処理において実質的に任意の領域の標的化が可能となる。第２に、非特許文献２で行われているように、環状化されるべき部位を抽出するためにエンドヌクレアーゼの代わりにＰＣＲを使用することは、ＰＣＲが１Ｋｂ未満のフラグメントに最もよく作用する傾向があるので、標的分子のサイズが制限される。さらに、ＰＣＲは厄介な最適化を必要とし、並行して多数の標的領域について実施することは、非常に困難であり、コストがかかりすぎ、不可能である。

【0036】

第１及び第２の認識部位の配列は、本開示において、５'から３'方向に発現される。従って、ｇＲＮＡの５'末端に向かう配列は、認識部位の配列と相補的である。認識部位に相補的な配列に加えて、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体は、標的ＤＮＡの非相補鎖上で、認識部位に相補的なｇＲＮＡの配列の３'末端に隣接して位置する、約２～５、典型的には３つのヌクレオチドの短い保存配列モチーフも認識する。これは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。ＰＡＭは、標的遺伝物質のＣａｓ９による切断と同様に認識部位へのｇＲＮＡ結合において重要であるが、このＰＡＭ部位の必要のないＣａｓ９酵素の設計が想定されている。

【0037】

ＰＡＭの一例としては、配列ＮＧＧが挙げられるが、異なるＣａｓ９酵素は、異なるＰＡＭ部位を必要とすることが知られており、酵素は可変ＰＡＭ部位を許容するように修飾されている（非特許文献３）。従って、本明細書中に開示される材料及び方法において有用なｇＲＮＡの特定の実施形態において、認識部位は、遺伝物質上の認識部位の配列が配列５'‐ＮＧＧ‐３'によって非相補鎖の３'側に直ぐ続くように設計される。

【0038】

ｇＲＮＡが認識部位に結合すると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、二本鎖遺伝物質において、非相補鎖上のＮＧＧ配列の５'側に向かって３つのヌクレオチドで二本鎖切断を行う。すなわち、５'末端から始まり、認識部位の３'末端に向かって、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、３番目と４番目のヌクレオチドの間で二本鎖切断を行う。

【0039】

適切なエンドヌクレアーゼを用いて遺伝物質が開裂されると、得られた標的ゲノム領域の混合物及び遺伝物質の開裂フラグメントは、例えば、変性条件にすることによって、変性されて、一本鎖形態に変性される。典型的には、開裂遺伝物質を変性条件にすることには、塩、ジメチルスルホキシド、水酸化ナトリウム等の適切な化合物の存在下、適切なｐＨで適切な温度に晒すことが含まれる。ＤＮＡはまた、ＮａＯＨ又は高塩濃度での化学処理を使用して変性される。好ましい実施形態において、開裂遺伝物質は、７５℃から１１５℃の間、好ましくは、８０℃から１１０℃の間、より好ましくは、８５℃から１０５℃の間、さらに好ましくは、９０℃から１００℃の間、最も好ましくは、約９５℃の温度に晒すことによって変性される。当業者であれば、適切な変性条件を決定することができ、かかる実施形態は本発明の範囲内である。

【0040】

遺伝物質から分離された標的ゲノム領域を捕捉するために、特異的に設計された架橋オリゴを、開裂され変性された遺伝物質と接触させる。典型的に、架橋オリゴは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。架橋オリゴは、一本鎖標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列にハイブリダイズする３'及び５'末端の配列を含む。架橋オリゴはまた、標的ＤＮＡ分子の両方の鎖を捕捉するために使用される、一本鎖標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列にハイブリダイズする３'及び５'末端オーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。架橋オリゴは、当技術分野で公知の異なる方法によってヌクレアーゼ分解から保護して、３'及び／又は５'末端に１つ以上のホスホロチオエート結合を付加し、逆（inverted）ｄＴ及びその３'及び５'末端の逆(inverted)ｄｄＴを付加する等、所定のヌクレアーゼでの処理後に反応中に存在したままとすることができる。

【0041】

架橋オリゴは、いくつかの目的に役立つ。架橋オリゴは、エンドヌクレアーゼによるオンターゲットカットによって生成された正しい標的ゲノム領域を環状化する。エンドヌクレアーゼとの反応においてオフターゲットカットが予想されるので、架橋オリゴは、正しい分子を環状化させることのみを可能にすることによって、さらなる特異性を提供する。また、架橋オリゴ自体は、その後の増幅のためのプライマーとして作用する。

【0042】

さらに、架橋オリゴは、配列決定のために得られる分子を調製する等、さらなる機能を提供するように設計することができる。例えば、架橋オリゴは、チップ上での検出のために固体表面上に固定化したり、又はストレプトアビジン結合ビーズで回収するためにビオチン化させることができる。架橋オリゴの５'及び３'末端はまた、標的領域に非相補的であるさらなる「尾部」配列を有し、ＰＣＲのためのプライマーの結合のための部位を提供すること、ビオチン分子を付加すること、又は当該分野で公知の他の変形例（図１０）のような、さらなる機能性を分子に連結するために使用される一般的な配列を生成することができる。

【0043】

標的ゲノム領域とハイブリダイズする２つの末端の配列の間に、架橋オリゴは、レアカッター制限エンドヌクレアーゼに特異的な制限部位、プライマー結合配列、又はプログラマブルエンドヌクレアーゼの標的等の配列をさらに含むことができる。レアカッター制限部位又はプログラマブルエンドヌクレアーゼの標的を用いて、核酸増幅後に生成された標的ゲノム領域の連結コピーから個々の標的ゲノム領域を開裂することができる。レアカッター制限エンドヌクレアーゼとしては、その全体、特に、表１が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０７９４８８に記載されたものが挙げられるが、これらに限られるものではない。

【0044】

本明細書中で使用される場合、「レアカッター制限エンドヌクレアーゼ」は、その制限部位が遺伝物質中でまれにしか生じないエンドヌクレアーゼである。例えば、ヒトゲノムでは、レアカッター制限エンドヌクレアーゼは、制限部位が平均５０～１００ｋｂごと、好ましくは、１００～２００ｋｂごと、より好ましくは、２００～４００ｋｂごと、さらにより好ましくは、４００～６００ｋｂごとに生じるエンドヌクレアーゼである。ヒトゲノムのレアカッター制限エンドヌクレアーゼ及びその制限部位の例を以下の表１に示す。

【0045】

【表1】

【0046】

さらなるレアカッターエンドヌクレアーゼは例えば、Pingoud(Editor)による制限エンドヌクレアーゼ（Nucleic Acids and Molecular Biology）、Springer;1ed（2004）に記載されている。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からローミングクラスのエンドヌクレアーゼのような多くのレアカッターエンドヌクレアーゼも市販されている。レアカッターエンドヌクレアーゼのさらに別の例は当技術分野で公知であり、そのような実施形態は、本発明の範囲内である。

【0047】

架橋オリゴ中のプライマー結合配列は、標的ゲノム領域を増幅し、元の分子の超分岐を介して二本鎖形成の標的ゲノム領域の連結コピーを生成するために、ＲＣＡ反応において追加のプライマーを使用することを容易にする。

【0048】

第１及び第２の認識部位は、遺伝物質の同じ鎖上に、又は遺伝物質の反対の鎖上に存在することができる。

【0049】

図５に、二本鎖ゲノムの同じ鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する例を示す。図５に示されるように、二本鎖ゲノムＤＮＡの下鎖は、認識部位を設計するために選択される。第１のｇＲＮＡは、第１の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第１の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。第２のｇＲＮＡは、第２の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第２の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。このように、標的ゲノム領域は、ゲノムＤＮＡから二本鎖形態で開裂される。この標的ゲノム領域は、第１の認識部位に向かう末端に、第１の認識部位からの最初の３つのヌクレオチドを除く全てを有し、第２の認識部位に向かう末端に、第２の認識部位からの最初の３つのヌクレオチドを有する。この二本鎖標的ゲノム領域は、一本鎖形態に変換され、１つ以上の架橋オリゴは、鎖のいずれか又は両方を捕捉するように設計される。

【0050】

図５から下鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、第２の認識部位の最初の３つのヌクレオチドに相補的な配列と、第２の認識部位の５'末端を越えて、かつそれに隣接して下鎖上に存在する配列に相補的である追加のヌクレオチドとを有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第１の認識部位に相補的な配列、及び、任意で、第１の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して下鎖上に存在する配列に相補的である追加のヌクレオチドを有する。

【0051】

図５から上鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第１の認識部位の配列、及び、任意で、第１の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して下鎖上に存在する配列を有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、第２の認識部位の最初の３つのヌクレオチドの配列、及び第２の認識部位の５'末端を越えて、かつそれに隣接する下鎖上に存在する追加のヌクレオチドを有する。

【0052】

図６は、二本鎖ゲノムの逆の鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する例を示す。図６に示すように、二本鎖ゲノムＤＮＡの下鎖は、第１の認識部位を設計するために選択され、二本鎖ゲノムＤＮＡの上鎖は、第２の認識部位を設計するために選択される。第１のｇＲＮＡは、下鎖の第１の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第１の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。同様に、２番目のｇＲＮＡは、上鎖の第２の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第２の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。このように、標的ゲノム領域は、ゲノムＤＮＡから二本鎖形態で開裂される。この標的ゲノム領域は、第１の認識部位に向かう末端に、最初の３つのヌクレオチドを除く第１の認識部位の配列を有し、第２の認識部位に向かう末端に、最初の３つのヌクレオチドを除く第２の認識部位の配列を有する。この二本鎖標的ゲノム領域は、一本鎖形態に変換され、１つ以上の架橋オリゴは、鎖のいずれか又は両方を捕捉するように設計される。

【0053】

図６からの下鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第２の認識部位の配列、及び、任意で、第２の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して上鎖上に存在する配列を有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第１の認識部位に相補的な配列、及び、任意で、第１の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して、下鎖上に存在する配列に相補的な配列を有する。

【0054】

図６からの上鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第１の認識部位の配列、及び、任意で、第１の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して下鎖上に存在する配列を有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除いて第２の認識部位に相補的な配列、及び、任意で、第２の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して上鎖上に存在する配列に相補的な配列を有する。

【0055】

図７は、二本鎖ゲノムの逆の鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する例を示す。図７に示すように、二本鎖ゲノムＤＮＡの上鎖は第１の認識部位を設計するために選択され、二本鎖ゲノムＤＮＡの下鎖は第２の認識部位を設計するために選択される。第１のｇＲＮＡは、上鎖の第１の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第１の認識部位の５'末端の下流で、ゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。同様に、第２のｇＲＮＡは、下鎖の第２の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第２の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。このように、標的ゲノム領域は、ゲノムＤＮＡから二本鎖形態で切断される。この標的ゲノム領域は、第１の認識部位に向かう末端に、第１の認識部位の最初の３つのヌクレオチドを有し、第２の認識部位に向かう末端に、第２の認識部位の最初の３つのヌクレオチドを有する。この二本鎖標的ゲノム領域は、一本鎖形態に変換され、１つ以上の架橋オリゴは鎖のいずれか又は両方を捕捉するように設計することができる。

【0056】

図７から下鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、第２の認識部位の最初の３つのヌクレオチドに相補的な配列と、第２の認識部位の５'末端を越えて、かつそれに隣接して下鎖上に存在する配列に相補的である追加のヌクレオチドとを有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、第１の認識部位の最初の３つのヌクレオチドの配列、及び第１の認識部位の５'末端を越え、かつそれに隣接する上鎖上に存在するさらなるヌクレオチドを有する。

【0057】

図７から上鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、第１の認識部位の最初の３つのヌクレオチドに相補的な配列、及び第１の認識部位の５'末端を越え、それに隣接して上鎖上に存在する配列に相補的である追加のヌクレオチドを有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、第２の認識部位の最初の３つのヌクレオチドの配列、及び第２の認識部位の５'末端を越えて、かつそれに隣接する下鎖上に存在する追加のヌクレオチドを有する。

【0058】

図８に、二本鎖ゲノムの同じ鎖に結合する２つのｇＲＮＡに基づいて認識部位及び架橋オリゴを設計する他の例を示す。図８に示すように、二本鎖ゲノムＤＮＡの上鎖は、第１の認識部位及び第２の認識部位を設計するために選択される。第１のｇＲＮＡは、上鎖の第１の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第１の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。同様に、第２のｇＲＮＡは、上鎖の第２の認識部位に結合し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、第２の認識部位の５'末端の下流でゲノムＤＮＡの３つのヌクレオチドを切断する。このように、標的ゲノム領域は、ゲノムＤＮＡから二本鎖形態で開裂される。この標的ゲノム領域は、第１の認識部位に向かう末端に、第１の認識部位の５'末端に最初の３つのヌクレオチドを有し、第２の認識部位に向かう末端に、第２の認識部位の５'末端に最初の３つのヌクレオチドを除く全てを有する。この二本鎖標的ゲノム領域は、一本鎖形態に変換され、１つ以上の架橋オリゴは、鎖のいずれか又は両方を捕捉するように設計される。

【0059】

図８からの下鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除く第２の認識部位の配列、及び、任意で、第２の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して上鎖上に存在する配列を有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、第１の認識部位の最初の３つのヌクレオチドの配列、及び第１の認識部位の５'末端を越え、かつそれに隣接する上鎖上に存在するさらなるヌクレオチドを有する。

【0060】

図８から上鎖を捕捉するために、架橋オリゴは、３'末端に向かって、第１の認識部位の最初の３つのヌクレオチドに相補的な配列、及び第１の認識部位の５'末端を越え、かつ隣接して上鎖上に存在する配列に相補的である追加のヌクレオチドを有するように設計される。この架橋オリゴは、５'末端に向かって、最初の３つのヌクレオチドを除いて第２の認識部位に相補的な配列、及び、任意で、第２の認識部位の３'末端を越えて、かつそれに隣接して上鎖上に存在する配列に相補的な配列を有する。

【0061】

図５～８で表され、前の段落に記載された架橋オリゴの配列は、架橋オリゴが標的ゲノム領域上の対応する配列とハイブリダイズすることができる限り、対応する配列と完全に相補的又は同一である必要はない。従って、ある程度のミスマッチを許容することができ、そのような変更は本発明の範囲内である。

【0062】

「ハイブリダイズする」という用語は、２つの配列が互いに十分に相補的であり、２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。互いにハイブリダイズする配列は、完全に相補的であるが、ある程度までミスマッチを有する。従って、架橋オリゴの５'及び３'末端の配列は、架橋オリゴが標的ゲノム領域とハイブリダイズし、標的ゲノム領域を捕捉する限り、標的ゲノム領域の５'及び３'末端の対応する配列とわずかなミスマッチを有していてもよい。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、２つの相補的配列間の約５％～約２０％のミスマッチは、２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にする。典型的に、高ストリンジェンシー条件は、より高い温度及びより低い塩濃度を有し、低ストリンジェンシー条件は、より低い温度及びより高い塩濃度を有する。ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件が好ましく、従って、架橋オリゴの３'及び５'末端の配列は、標的ゲノム領域のそれぞれ３'及び５'末端の配列に完全に相補的であることが好ましい。

【0063】

捕捉された標的ゲノム領域は、さらに分析、例えば、検出又は配列決定される。このような分析は、
ｄ．架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖環状標的ゲノム領域を生成する工程と、
ｅ．任意で、非環状化遺伝物質を分解する工程と、
ｆ．任意で、核酸増幅によって標的ゲノム領域を増幅して、標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する工程と、
ｇ．増幅された標的ゲノム領域を分析する工程と
を含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖環状標的ゲノム領域を生成することはリガーゼを使用することによって行われる（図９Ａ）。標的ゲノム領域の末端に相補的な配列を越えて架橋オリゴ中にさらなる配列が存在する場合、一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションすることはまた、適切なＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して標的ゲノム領域の２つの末端間の間隙を充填するための核酸合成を含む（図９Ｂ）。標的の末端間の間隙はまた、一本鎖オリゴを間隙中の架橋オリゴにハイブリダイズさせ、得られた分子を一緒にライゲーションすることによっても充填することができる（図９Ｃ）。一本鎖標的ゲノムの自由端部をライゲーションするのに適したリガーゼ酵素は、当技術分野で公知であり、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼを含む。

【0065】

特定の実施形態において、適切に環状化された標的配列は、二本鎖ベクターに変換される。これは、鎖置換能力のないＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼで反応を補うことによって行うことができ、環状化標的に相補的な第２鎖を合成する（図４）。

【0066】

特定の実施形態において、標的ゲノム領域が適切に環状化されると、残りの遺伝物質、例えば、開裂されていないゲノムＤＮＡ及びオフターゲットゲノムフラグメントが除去、例えば、分解される。これは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡにかかわらず、露出した３'又は５'末端から核酸を分解するエキソヌクレアーゼの組み合わせによって行うことができる。このように、適切なエキソヌクレアーゼでの処理は、環状化標的分子のみを残し、その後の工程の困難性を大幅に減少させる。

【0067】

特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼでの処理を介して遺伝物質の残部から分離され、架橋オリゴにハイブリダイズされた、適切に環状化された標的配列は、核酸増幅を介して増幅される。特定の好ましい実施形態において、環状分子を増幅し、それらを直鎖状分子に戻すことができるプライマーを設計するために、架橋オリゴ中の配列を使用して、ＰＣＲを介して増幅を行うことができる。これは、ＰＣＲが最も効率的であるＤＮＡの短い伸縮（＜１０Ｋｂ）に特に適している。複数標的のための架橋オリゴは、全てのフラグメントについて一対の共通プライマーを用いてＰＣＲ反応を駆動するために使用される、標的に対して非相補的な共通部位を含むことができる（図４）。他の好ましい実施形態において、このような増幅は、等温増幅、例えば、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。等温増幅は、ＤＮＡの長いストレッチの増幅を容易にし、例えば、標的ゲノム領域の複数のコピーであって、各コピーは少なくとも約１０～５０ｋｂを含むものを生成することができる。

【0068】

従来のＲＣＡ反応では、パドロック合成プローブを使用して、標的核酸配列をハイブリダイズさせ、サークルを生成する（非特許文献５）。次いで、このサークルをＲＣＡ反応で増幅する。本発明において、架橋オリゴを用いて捕捉された環状化標的配列は、ＲＣＡ反応を介して増幅される。このようなＲＣＡ反応において、架橋オリゴは、ＲＣＡ反応のためのプライマーとして作用し、これは、標的配列を直線的に増幅し、標的配列の長い一本鎖のタンデム反復を生成する。次いで、増幅された一本鎖標的配列は、その後の分析のために使用される。増幅された標的配列はまた、例えば、両方の標的鎖を捕捉し、それらのＲＣＡ生成物を再アニーリングさせることによって、二本鎖形態に変換することもできる。

【0069】

いくつかの実施形態において、標的環状化分子の指数関数的増幅は、標的配列の二本鎖タンデム反復を生成するために、１つ以上のさらなるプライマー（架橋オリゴ自体を超える）を使用して、超分岐ＲＣＡを通して得られる。架橋オリゴを超えるプライマーは、架橋オリゴの配列に基づいて、標的ゲノム領域に存在する配列に基づいて設計されるか、又はサークルの複数の位置を増幅するためのランダム塩基の組み合わせから構成される。

【0070】

一本鎖捕捉標的ゲノム領域を、二本鎖形態に変換するためのさらなるアプローチは、当該分野で公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。

【0071】

異なるサイズの標的ゲノム領域は、ＲＣＡによって生成及び増幅することができるため、ＰＣＲによって核酸を増幅することに依存し、長い標的ゲノム領域を増幅するのには有効ではなかった従来の方法の制限が回避される。本明細書中に開示された方法によって提供される重要な利点は、長い標的ゲノム領域、例えば、少なくとも約１ｋｂ、好ましくは、少なくとも約１５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｋｂ、又は最も好ましくは、少なくとも約５０ｋｂを含むゲノム領域の検出及び分析である。

【0072】

特定の実施形態において、ＲＣＡ反応の生成物は、標的ゲノム領域を検出又は配列決定するために分析される。例えば、増幅生成物は、反応の濁度、蛍光検出又はラベル付き分子ビーコンに基づいて検出することができる。

【0073】

「ラベル」という用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子をいう。例えば、有用なラベルには、蛍光色素（フルオロフォア）、蛍光消光剤、発光剤、高電子密度試薬、ビオチン、ジゴキシゲニン、³²Ｐ及び他の同位体、又は、例えば、オリゴヌクレオチドに組み込むことによって検出可能となる他の分子が含まれる。この用語には、ラベル化剤の組み合わせ、例えば、各々が、例えば、特定の波長又は波長の組み合わせで、固有の検出可能な署名を提供する蛍光体の組み合わせが含まれる。

【0074】

蛍光体の例としては、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８等）、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ―Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ―ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｄｙｌｉｇｈｔ色素（Ｄｙｌｉｇｈｔ４０５、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ５５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００）、６‐ＦＡＭ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＨＥＸ、６‐ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ＲＯＸ、Ｒ‐フィコエリトリン（Ｒ‐ＰＥ）、スターブライトブルー染料（例えば、スターブライトブルー５２０、スターブライトブルー７００）、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、及びＴＲＩＴＣが挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

本発明の特定の実施形態は、５以上の異なる標的を並行して検出する。例えば、異なる架橋オリゴを、各架橋オリゴの座標、すなわち、各標的ゲノム領域の座標が既知である基質、例えば、チップ上に固定化することができる。このような基質を用いて、数十、数百、又は数千もの標的配列を、多重反応において検出及び分析することができる。

【0076】

さらなる実施形態において、ＰＣＲ又はＲＣＡ反応の生成物を配列決定する。ＰＣＲとＲＣＡの生成物の配列決定には、携帯型Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｍｉｎｉｏｎ（商標）又はベンチトップ機械、Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｐｒｏｍｅｔｈｉｏｎ（商標）、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ（商標）又はＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（商標）を使用する等、様々な配列決定方法を使用することができる。配列決定工程はまた、いくつかの標的の多重検出及び／又は多型検出に使用することもできる。

【0077】

特定の実施形態において、短い適切に環状化された標的配列は、ＰＣＲ増幅（図４）後の配列決定のために作製される。ＰＣＲプライマーは、標的領域に特異的であるか、又は、好ましくは、架橋オリゴによって導入される共通領域を増幅するようにそれらを設計することによって、全ての標的に共通な（universal）ものである（図４Ｂ～４Ｃ）。ひとたび増幅されると、アダプター分子は、特定の製造業者の推奨に従って、それらを使用するシーケンサーと適合させるために、分子に添加される。あるいは、架橋オリゴに相補的でない「尾部」を有するプライマーを使用して、ＰＣＲ中に必要なアダプターを組み込むことができ、これによって、方法がより効率的になる（図４Ａ及び４Ｃ）。これらのプライマーはまた、配列決定データをそれぞれの試料にリンクするためにＰＣＲ中に添加される短い独特の配列（４～１６ヌクレオチド）を含み、これは、一般にインデックス又はバーコードとして知られている（図４Ｃ）。

【0078】

特定の実施形態において、連結コピーを開裂して、例えば、レアカッター制限酵素を用いて、架橋オリゴを介して導入された制限部位で連結コピーを切断することにより、標的ゲノム領域の個々のコピーを生成することができる。このような開裂は、各々が粘着性末端を有する標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する。

【0079】

粘着性末端を用いて、標的ゲノム領域をアダプター配列に結合させることができる。例えば、レアカッター制限酵素に特異的な制限部位に相補的なオーバーハングを含むアダプターを、標的ゲノム領域のコピーと混合して、アダプターに隣接する標的ゲノム領域を含む二本鎖ＤＮＡを生成することができる。

【0080】

本明細書で使用される「アダプター」という用語は、使用される配列決定技術に応じて、４～１００のヌクレオチド、好ましくは、１０～２０のヌクレオチド、さらにより好ましくは、約１５ヌクレオチドの既知のヌクレオチド配列を指す。標的ゲノム領域の増幅されたコピーの末端に一旦組み込まれたアダプター配列は、例えば、プライマーのための結合部位を提供することによって、標的ゲノム領域の配列決定を容易にする。一実施形態において、アダプターに隣接する標的ゲノム領域は、対末端配列決定を使用して配列決定される。

【0081】

本明細書で使用される「対末端配列決定」という用語は、フラグメントの両端部が二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に存在する特異的プライマー結合部位を使用して配列決定される配列決定技術を指す。対末端配列決定は、２つのプライマー結合部位に隣接するポリヌクレオチドの配列を生成するために、コンピューターソフトウェアプログラムを使用して整列される高品質の配列決定データを生成する。分子の一方の末端のみからの配列決定だと、長い配列決定の読み取りが行われる際、配列決定の質が低下するため、二本鎖分子の両端部からの配列決定だと、二本鎖分子の両端部からの高品質データを可能になる。

【0082】

対末端配列決定において、アダプター取り込みの末端で生成された二本鎖ポリヌクレオチドは、アダプターに隣接する二本鎖標的ゲノム領域の２つの末端に結合する特異的プライマーを使用して配列決定される。対末端配列決定の概要及び原理は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．７７０－２００７－００２に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0083】

対末端配列決定技術としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑＤｘ（商標）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑＦＧｘ（商標）が挙げられるがこれらに限られるものではない。本発明のアッセイにおいて使用される対末端配列決定技術のさらなる例については、当該分野において公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。

【0084】

特定の実施形態において、標的ゲノム領域の開裂コピーの粘着性末端を使用して、標的ゲノム領域をヘアピンアダプターと結合させることができる。例えば、レアカッター制限酵素に特異的な制限部位に相補的なオーバーハングを含むヘアピンアダプターを、標的ゲノム領域のコピーと混合して、ヘアピンアダプターに隣接する標的ゲノム領域を含む二本鎖ＤＮＡを生成することができる。

【0085】

本明細書中で使用される「ヘアピンアダプター」という用語は、二本鎖ステムと一本鎖ヘアピンループを含むポリヌクレオチドをいう。ヘアピンアダプターの一本鎖ヘアピンループ領域は、配列決定のためのプライマー結合部位を提供する。このように、ヘアピンアダプターは、標的ゲノム配列の両粘着性末端とハイブリダイズすると、両末端がヘアピンループでキャップされた二本鎖領域に標的ゲノム領域を含む二本鎖ＤＮＡ鋳型が生成される。このような鋳型は、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定（ＰａｃＢｉｏ（商標））を介して標的ゲノム領域を配列決定するために使用される。

【0086】

ＳＭＲＴ配列決定の説明及び原理はPacific Biosciences(2018)、Publication No.: BR108‐100318に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0087】

さらなる実施形態において、ナノポア技術を用いて、標的ゲノム領域を配列決定する。特定のこのような実施形態において、例えば、Nanopore Technology Brochure、Oxford Nanopore Technologies(2019)、及びNanopore Product Brochure、Oxford Nanopore Technologies(2018)に記載されるように、標的ゲノム領域のコピーを処理して、標的ゲノム領域を配列決定する。これら両方のパンフレットの内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0088】

特定の実施形態において、複数の標的ゲノム領域が捕捉され、任意で、検出又は配列決定等、さらに分析される。このような実施形態において、一対のｇＲＮＡが、各標的ゲノム領域について設計される。複数の標的ゲノム領域について複数のｇＲＮＡを設計するために、ｇＲＮＡの配列は、１つの標的ゲノム領域についてのＣａｓ９エンドヌクレアーゼが他の標的ゲノム領域を破壊しないように選択される。当該生物の既知のゲノム配列に基づいて、当業者であれば、複数の標的ゲノム領域を特異的に開裂及び単離するための認識部位の適切な組み合わせを決定することができる。ｇＲＮＡはまた、複数の又は不確定要素位置へのハイブリダイゼーションを可能にするために、縮重又はウォブル塩基を用いて設計及び合成することもできる。例えば、これは、ｇＲＮＡ標的部位における既知の多型を補償するため、ゲノムの複数の位置にランダムにハイブリダイズするために複数の縮重塩基を加えるため、同じく、遺伝コードの縮重に基づいて既知のアミノ酸配列をコードする未知の遺伝子にハイブリダイズするｇＲＮＡを設計するために行うことができる。このような場合、必要であれば、架橋オリゴは縮重塩基を含有するように適合させることもできる。

【0089】

従って、本発明の特定の実施形態は、遺伝物質から複数の標的ゲノム領域を捕捉する方法を提供する。本方法は、
ａ．複数対のエンドヌクレアーゼを用いて、遺伝物質から複数の標的ゲノム領域を開裂する工程であって、各対のエンドヌクレアーゼは、第１の認識部位及び第２の認識部位を有し、各認識部位は、最低約１７～約２４のヌクレオチドの配列を含み、各対の認識部位は、複数の標的ゲノム領域からの標的ゲノム領域に隣接する、工程と、
ｂ．開裂遺伝物質を一本鎖形態に変性させる工程と、
ｃ．標的ゲノム領域を複数の架橋オリゴにハイブリダイズさせることによって、一本鎖形態の複数の標的ゲノム領域を捕捉する工程であって、各架橋オリゴは、一本鎖形態の複数の標的ゲノム領域から、標的ゲノム領域の３'末端及び５'末端にそれぞれハイブリダイズする３'末端及び５'末端の配列を含む、工程と
を含む。

【0090】

標的ゲノム領域を捕捉する、例えば、認識部位を設計する、遺伝物質を開裂する際に使用されるエンドヌクレアーゼを設計する、及び開裂標的ゲノム領域を捕捉するための架橋オリゴを設計する、上記の態様は、複数の標的ゲノム領域を捕捉する本方法にも適用可能である。

【0091】

複数の標的ゲノム領域を捕捉する一実施形態において、特定の既知の位置で基質に結合された複数の架橋オリゴを有する基質が提供される。複数対のエンドヌクレアーゼで開裂された遺伝物質を一本鎖形態に変換し、一本鎖形態の複数の標的ゲノム領域を適切な条件下で基質と接触させて、基質に結合した架橋オリゴと複数の標的ゲノム領域とのハイブリダイゼーションを可能にする。ひとたび、標的ゲノム領域が、対応する架橋オリゴにハイブリダイズされ、環状化されると、特定の位置に存在する標的ゲノム領域が、さらに分析される。いくつかの実施形態において、捕捉標的ゲノム領域は、ＲＣＡを使用して増幅され、さらに、例えば、レーザー励起及び発光検出方法を使用して検出される。

【0092】

特定の実施形態において、複数の標的ゲノム領域はさらに分析され、例えば、検出又は配列決定される。このような分析は、
ｄ．複数の架橋オリゴにハイブリダイズした一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションして、対応する架橋オリゴにハイブリダイズした、複数の標的ゲノム領域からの標的ゲノム領域を各々含有する複数の一本鎖環状遺伝物質を生成する工程と、
ｅ．任意で、基質から非環状遺伝物質を除去する工程と、
ｆ．任意で、核酸増幅によって、複数の標的ゲノム領域を増幅して、各標的ゲノム領域の複数のコピーを生成する工程と、
ｇ．増幅された複数の標的ゲノム領域を分析する工程と。
を含む。

【0093】

標的ゲノム領域を分析する、例えば、一本鎖標的ゲノム領域の自由端部をライゲーションする、標的ゲノム領域を検出する、又は標的ゲノム領域を配列決定する上記の態様はまた、複数の標的ゲノム領域を分析する本方法に適用可能である。

【0094】

特定の実施形態において、非環状化遺伝物質は、エキソヌクレアーゼで分解することによって、又は基質から洗浄することによって除去することができる。

【0095】

本発明のさらなる実施形態は、本発明のアッセイを実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明のアッセイを実施するのに必要な特異的なエンドヌクレアーゼ、１つ以上の標的ゲノム領域を標的とするように設計された特異的なガイド分子、アッセイから得られた配列決定データを処理するように設計されたコンピューターソフトウェアプログラム、及び、任意で、アッセイを実施するための手順書を含む。一実施形態において、本発明のキットは、
ａ）１対以上のガイド分子と、
ｂ）１つ以上の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された１つ以上の架橋オリゴと
を含む。

【0096】

キットは、１つ以上のプログラマブルエンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。

【0097】

さらに、キットは、環状化標的ゲノム領域のＰＣＲ又はＲＣＡ反応のためのプライマー、ＤＮＡリガーゼ、ポリメラーゼ及びＰＣＲ又はＲＣＡのための他の試薬、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、標的ゲノム領域の連結コピーを開裂するためのレアカッター、及び配列決定試薬を含むことができる。

【0098】

特定の実施形態において、本発明のキットは、１つ以上の特異的な標的ゲノム領域についてカスタマイズすることができる。例えば、ユーザが、１つ以上の標的ゲノム領域の配列を提供すると、１つ以上の標的配列について本発明のアッセイを実施するためにキットが生成される。

【0099】

本明細書で言及又は引用した特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は全て、本明細書の明白な教示と矛盾しない限り、図表を含む全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0100】

以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定するものではない。特に断りのない限り、全てのパーセンテージは重量基準であり、全ての溶剤混合比は容積基準である。

【0101】

実施例１‐認識部位の設計及び標的遺伝子領域の捕捉
この実施例は、本明細書に開示される材料及び方法に従って、標的ゲノム領域を捕捉及び分析するための典型的な手順を記載する。例えば、以下の配列が、この実施例における分析のために同定される。
５'ＡＣＣＣＡＣＴＧＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＧＴＣＴＴＴＴＡＣＧＴＣＣＣＧＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＡＡＴＡＣＡＴ［Ａ／Ｇ］ＴＣＴＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡ｜ＧＣＡＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＴＡＧ［Ｇ／Ａ］ＡＴＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＡＧＴＣＴＧＴＡＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧ｜ＴＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴ［Ｃ／Ｇ］ＧＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＴＴＡＣＴＡＡＣＴＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＣＧＣＡＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＧＴＧＡＧＧＴＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＴＡＣＴＴＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＣＴＧＴＣＡＣＣ ３'（配列番号１）。

【0102】

配列番号１の配列は、非相補鎖の配列を提供する、すなわち、ｇＲＮＡは、反対側の鎖に結合する。従って、認識部位は、反対鎖上に存在し、認識部位に対応する領域は、配列番号１の７６番目から～９５番目までの「ＴＣＴＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡ｜ＧＣＡ」及び配列番号１の２６０番目から～２７９番目までの「ＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧ｜ＴＡＧ」であり、ＮＧＧ ＰＡＭモチーフは下線を付し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる開裂部位は縦棒で示す。第１のｇＲＮＡは、ＴＣＴＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡ（配列番号２）の配列に逆相補的な配列を有する第１の認識部位に結合するように設計され、第２のｇＲＮＡは、ＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＧ（配列番号３）の配列に逆相補的な配列を有する第２の認識部位に結合するように設計される。２つの認識部位は、実線の括弧内のヌクレオチドによって示される特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を有するゲノム配列に隣接する。Ｃａｓ９を介したこの配列の開裂により、１８４ｂｐの配列が生じる。このフラグメントの配列決定によって、この領域内に存在するＳＮＰについての情報が提供される。

【0103】

配列番号１の配列を含む遺伝物質のＣａｓ９媒介開裂は、標的ゲノム領域である以下のフラグメントを生成する。
５'ＧＣＡＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＴＡＧ［Ｇ／Ａ］ＡＴＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡ［Ｔ／Ｃ］ＡＧＴＣＴＧＴＡＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧ３'（配列番号４）。

【0104】

配列番号４の標的ゲノム領域を捕捉するための架橋オリゴを生成するために、上記で再現された配列で下線を引いた、標的ゲノム領域の末端からの以下の配列を選択する。
５'ＧＣＡＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣ（配列番号５）
５'ＧＣＡＴＡＧＴＣＴＧＴＡＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＧＧ（配列番号６）。

【0105】

これらの配列に相補的な配列は、配列番号４の標的ゲノム領域を捕捉するために、架橋オリゴの末端について生成される。
５'ＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＣ３'（配列番号７）
５'ＣＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＣＴＡＴＧＣ３'（配列番号８）

【0106】

配列番号７及び８を連結して、以下の配列の架橋オリゴを生成する。
５'ＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＣＴＡＴＧＣ３'（配列番号９）。

【0107】

本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のためであり、それらを考慮した様々な変形や変更が、当業者に示唆されるものであり、それらも本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれるものとする。さらに、本明細書に開示された発明又はその実施形態の要素又は限定は、本明細書に開示された任意の及び／又は全ての他の要素又は限定（別個、又は任意の組み合わせ）又は任意の他の発明又はその実施形態と組み合わせることができ、全てのそのような組み合わせは、それに限定されることなく本発明の範囲内と考えられる
で企図される。

【0108】

本明細書で引用された特許、特許出願及びその他公開された参考材料は全て、全体が本明細書に援用される。

【配列表フリーテキスト】

【0109】

配列番号の簡単な説明
配列番号１ 本発明の方法に従って研究されるべき例示的な領域。
配列番号２ 例示的な第１の認識部位。
配列番号３ 例示的な第２の認識部位。
配列番号４ 例示的な標的ゲノム領域。
配列番号５ 配列番号４の標的ゲノム領域の５'末端の配列。
配列番号６ 配列番号４の標的ゲノム領域の３'末端の配列
配列番号７ 配列番号４の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された架橋オリゴの５'末端の配列。
配列番号８ 配列番号４の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された架橋オリゴの３'末端の配列。
配列番号９ 配列番号４の標的ゲノム領域を捕捉するように設計された架橋オリゴ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2022534625000001.app

【国際調査報告】