特表2022-534723味が良い（Ｐａｌａｔａｂｌｅ）高度に加水分解されたホエイタンパク質加水分解物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-03
(54)【発明の名称】味が良い（Ｐａｌａｔａｂｌｅ）高度に加水分解されたホエイタンパク質加水分解物
(51)【国際特許分類】
A23J 3/34 20060101AFI20220727BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20220727BHJP
C12P 21/06 20060101ALI20220727BHJP
C07K 1/12 20060101ALI20220727BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20220727BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20220727BHJP
A23L 2/54 20060101ALI20220727BHJP
A23L 2/00 20060101ALI20220727BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20220727BHJP
【ＦＩ】
A23J3/34
C12P1/00 A
C12P21/06
C07K1/12
A23L33/18
A23L2/00 F
A23L2/52
A23L2/54
A23L2/00 T
C12N9/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021570291
(86)(22)【出願日】2020-05-29
(85)【翻訳文提出日】2021-12-03
(86)【国際出願番号】 EP2020065022
(87)【国際公開番号】W WO2020239998
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】19177371.2
(32)【優先日】2019-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20156159.4
(32)【優先日】2020-02-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514140089
【氏名又は名称】アーラ フーズ エエムビエ
【氏名又は名称原語表記】Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ ａｍｂａ
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】スレンセン，ハンス ペーター
(72)【発明者】
【氏名】ベルテルセン，ハンス
(72)【発明者】
【氏名】スレンセン，アネッタ キンド
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4B064
4B117
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB07
4B018LB08
4B018LE03
4B018MD22
4B018ME02
4B018ME06
4B018ME14
4B018MF12
4B050CC08
4B050DD02
4B050DD03
4B050KK18
4B050LL02
4B064AG01
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4B064DA10
4B117LC04
4B117LK12
4B117LK14
4B117LK15
4B117LL01
4B117LL02
4B117LP06
4B117LP18
4H045AA30
4H045CA43
4H045EA01
(57)【要約】
本発明は、高い加水分解度を有し、味が良く、限外濾過に供しなくても低い濁度を有する新規なホエイタンパク質加水分解物に関する。さらに本発明は、新規なホエイタンパク質加水分解物を調製する方法、新規なホエイタンパク質加水分解物の使用、及びそれらの新規なホエイタンパク質加水分解物を含む食品に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホエイタンパク質加水分解物を調製する方法であって、ａ）ホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも５０重量％の量で含むホエイタンパク質溶液を用意すること、
ｂ）前記ホエイタンパク質溶液を、以下の酵素の組み合わせ：
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
のうちのいずれか１つを使って行われる酵素加水分解に供すること、
ｃ）加水分解度（ＤＨ）が１５％以上のときに前記酵素を失活させることによって前記酵素加水分解を停止させてホエイタンパク質加水分解物を得ること
を含む方法。
【請求項2】
ステップｃ）で得られた前記ホエイタンパク質加水分解物を濃縮する、かつ／又は乾燥させるステップｄ）をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液が、脂質を全固形分に対して最大１０重量％の量で含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップｂ）の前記酵素加水分解が、４０℃～７５℃の範囲の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップｃ）の酵素の失活が、少なくとも８０℃、好ましくは８０℃～１３０℃の温度に加熱することによる請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
ステップｃ）で得られた前記ホエイタンパク質加水分解物を限外濾過するステップを全く含まない請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記ホエイタンパク質溶液が、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質分離物、及び／又はホエイタンパク質分離物を含む請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記ホエイタンパク質溶液が、タンパク質を前記ホエイタンパク質溶液の２重量％以上の量で含む請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記加水分解度（ＤＨ）が１５～３５であるとき、ステップｃ）の前記酵素加水分解が、前記酵素を失活させることによって停止される請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
ステップｂ）の前記酵素加水分解が、以下の酵素の組み合わせ：ｉ．少なくともバチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくとも微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ．少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
のうちのいずれか１つを使って行われる請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれかに記載の方法により得られるホエイタンパク質加水分解物。
【請求項12】
ホエイタンパク質加水分解物であって、－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも１５％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドをペプチドの総量の２５重量％以下の量で有し、
－遊離アミノ酸を、前記加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量で有し、かつ
４％（重量／重量）タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有するホエイタンパク質加水分解物。
【請求項13】
前記加水分解度が１５％～３５％である請求項１２に記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項14】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において、１００以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）を有する請求項１２又は１３に記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項15】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、遊離アミノ酸を、前記加水分解物の総タンパク質含有量の２～１５重量％の量で含む請求項１２～１４のいずれかに記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項16】
前記ホエイタンパク質加水分解物が抗酸化活性を有する請求項１２～１５のいずれかに記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項17】
前記ホエイタンパク質加水分解物の前記抗酸化活性が、１．５重量％タンパク質溶液において５４～６０の消去率を有することとして測定される請求項１２～１６に記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項18】
請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物を含む食品。
【請求項19】
前記ホエイタンパク質加水分解物を、２～２５重量％の加水分解タンパク質に相当する量で含む請求項１８に記載の食品。
【請求項20】
乳製品、飲料、シェイク、ゲル、ショット及びフードバーからなる群より選択される請求項１８又は１９に記載の食品。
【請求項21】
食品成分としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項22】
６．５～８．０のｐＨを有するＵＨＴ安定飲料の調製における食品成分としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項23】
スポーツ栄養として使用するための飲料の調製における食品成分としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項24】
臨床用飲料の調製における食品成分としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項25】
炭酸飲料の調製における成分としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項26】
酸化防止剤としての請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項27】
請求項１１～１７のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高い加水分解度を有し、味が良く、限外濾過に供しなくても低濁度を有する新規なホエイタンパク質加水分解物に関する。さらに本発明は、新規なホエイタンパク質加水分解物を調製する方法、新規なホエイタンパク質加水分解物の使用、及びそれらの新規なホエイタンパク質加水分解物を含む食品に関する。
【背景技術】
【0002】
ホエイタンパク質加水分解物をさまざまな食品の成分として使用することはよく知られている。通常、ホエイタンパク質加水分解物は、ホエイタンパク質分離物又はホエイタンパク質濃縮物などのホエイタンパク質物質を、食品グレードのタンパク質分解調製物及び／又はペプチド分解調製物を用いて所望の加水分解度まで加水分解することによって調製される。状況によっては、低い抗原性をもつホエイタンパク質加水分解物又は腸から良好に吸収される加水分解物を調製するために、高い加水分解度、例えば１５％以上、例えば２０～３０％の加水分解度をもつホエイタンパク質加水分解物を調製することが望まれる。しかし、既存のホエイタンパク質加水分解物には、加水分解が進みすぎて、高い加水分解度が得られたときには、ホエイタンパク質加水分解物は苦い不快な味を有し、したがって食品又は飲料に多量に使用するのには適していないという問題がある。
【0003】
国際公開第０２／１９８３７Ａ１号には、風味が改善され、機能性を有し、かつＡＣＥ－Ｉ阻害特性を有するホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）基質からホエイタンパク質加水分解物を調製する方法が開示されている。国際公開第０２／１９８３７Ａ１号は、ホエイタンパク質加水分解物における苦い風味（bitter flavours）の問題を論じており、加水分解度が３～１０％など最大で１０％になったときに加水分解が終わるように酵素加水分解を制御することによって苦い風味の問題を解決している。
【0004】
したがって、加水分解度が高いこと（１５％を超える加水分解度）によって、抗原性が低く、吸収特性が向上し、その一方で不快な苦い味をもたないホエイタンパク質加水分解物は有利であることになる。
【発明の概要】
【0005】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ホエイタンパク質の酵素加水分解に酵素の特定の組み合わせを使用すると、高い加水分解度でホエイタンパク質加水分解物が得られ、その一方で、ホエイタンパク質加水分解物は、許容できる味を有し、苦い風味がない、又は少なくとも許容できるレベルの苦い化合物を有することを見出した。
【0006】
したがって、本発明の目的は、少なくとも１５％の加水分解度を有するホエイタンパク質加水分解物を調製する方法に関し、４％（重量／重量）のタンパク質溶液が、ホエイタンパク質加水分解物を苦み低減処理に供することなく、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有する。
【0007】
好ましくは、本発明の方法は、いずれの限外濾過のステップもなしに、濁度が低く、したがって見た目が透明なホエイタンパク質加水分解物を調製する方法に関する。
【0008】
特に、本発明の目的は、加水分解度が高い場合に不快な苦味を伴う先行技術の上記の問題を解決するホエイタンパク質加水分解物を提供することである。
【0009】
したがって、本発明の一態様は、ホエイタンパク質加水分解物を調製する方法であって、
ａ）ホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも５０重量％の量で含むホエイタンパク質溶液を用意すること、
ｂ）前記ホエイタンパク質溶液を、以下の酵素の組み合わせ：
ｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
のうちのいずれか１つを使って行われる酵素加水分解に供すること、
ｃ）加水分解度（ＤＨ）が１５％以上になったときに酵素を失活させることによって酵素加水分解を停止させてホエイタンパク質加水分解物を得ること
を含む方法に関する。
ａ）ホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも５０重量％の量で含むホエイタンパク質溶液を用意すること、
ｂ）前記ホエイタンパク質溶液を、以下の酵素の組み合わせ：
ｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
のうちのいずれか１つを使って行われる酵素加水分解に供すること、
ｃ）加水分解度（ＤＨ）が１５％以上になったときに酵素を失活させることによって酵素加水分解を停止させてホエイタンパク質加水分解物を得ること
を含む方法に関する。
【0010】
本発明の別の態様は、ホエイタンパク質加水分解物であって、
－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも１５％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドを、ペプチドの総量の２５重量％以下の量で含み、
－遊離アミノ酸を、加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量を含むホエイタンパク質加水分解物に関し、
そのホエイタンパク質加水分解物は４％（重量／重量）タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有する。
－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも１５％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドを、ペプチドの総量の２５重量％以下の量で含み、
－遊離アミノ酸を、加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量を含むホエイタンパク質加水分解物に関し、
そのホエイタンパク質加水分解物は４％（重量／重量）タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有する。
【0011】
本発明のさらなる態様は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含む食品を提供することである。
【0012】
本発明のさらに別の態様は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含む飲料を提供することであり、そのホエイタンパク質加水分解物は、２～２５重量％の加水分解ホエイタンパク質に相当する量で飲料に存在する。
【0013】
本発明のさらに別の態様は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の食品成分としての使用である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】図１Ａは、試料１６（ＷＰＩの酵素加水分解によって作られた本発明によるホエイタンパク質加水分解物）、試料１４（ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）の酵素加水分解によって作られた本発明によるホエイタンパク質加水分解物）、及び試料１３（本発明の酵素の組み合わせを使用することによって調製されていない参照ホエイタンパク質加水分解物、このホエイタンパク質加水分解物は限外濾過に供されている）のさまざまなタンパク質濃度における比濁法濁度（ＮＴＵ）を示す。
【図2】図２は、試料１３、１４及び１６のさまざまなタンパク質濃度の試料を示す。タンパク質の濃度（重量／重量）は、左から右に、８％、６．４％、４．８％、３．２％及び１．８％である。Ａ）が試料１６を示し、Ｂ）が試料１４を示し、Ｃ）が試料１３を示す。
【図4】図４は、試料１３、１５及び１６の味と口当たりのプロファイルをレーダーチャートで表したものを示す。最高スコアをもつ属性と最低のスコアをもつ属性の間の差の有意水準は＊＊＊で示され、９９．９％でＰ＜０．００１である（ＡＮＯＶＡ分析）。
【図5】図５は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ）を用いて分析したときの、アミノ酸が７～１９個のペプチドの７～１０個の範囲のアミノ酸と１１～１９個の範囲のアミノ酸の割合を示す。
【図6】図６は、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン及びβ－カゼインのすべてのペプチドに対する割合として示したフェニルアラニンを含むペプチドを示す。分析したペプチドの最も短いものは５個のアミノ酸であった。
【0015】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本発明をさらに詳しく説明する前に、まず以下の用語や慣例を定義する。
本発明をさらに詳しく説明する前に、まず以下の用語や慣例を定義する。
【0017】
本発明の１つの特徴又は限定への言及はすべて、別段の指定がない限り、又は言及がなされる文脈によって反対のことが明らかに示唆されない限り、対応する複数の特徴又は限定を含むものとし、その逆もまた同様である。
【0018】
本明細書で言及されているパーセンテージはすべて、別段の記載がない限り、重量パーセントである。また、「乾燥物質の重量で」及び「乾燥物質ベースで」という用語は、同じ概念を指し、交換可能に使用される。
【0019】
例えば１％（重量／重量）にあるような「重量／重量」という用語は、１重量％の化合物を含む組成物を指す。
【0020】
「味が良い」とは、食べたり飲んだりするのに十分な味を持っていること、すなわち、人間の消費者にとって許容できる又は満足できる味を有することを指す。
【0021】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されている技術的及び科学的用語はすべて、当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。
【0022】
ホエイタンパク質溶液
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質溶液」にあるように「溶液」という用語は、液体と固体の化合物又は例えばタンパク質粒子などの半固体粒子の組み合わせを含有する組成物を包含する。したがって、「溶液」は、懸濁液でもよく、又はスラリーであってもよい。しかしながら、「ホエイタンパク質溶液」は、好ましくはポンプ可能であり、ホエイタンパク質溶液中の液体の量は、好ましくは７０～９８％、より好ましくは８０～９６％である。ホエイタンパク質溶液に使用される液体は、典型的には水である。
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質溶液」にあるように「溶液」という用語は、液体と固体の化合物又は例えばタンパク質粒子などの半固体粒子の組み合わせを含有する組成物を包含する。したがって、「溶液」は、懸濁液でもよく、又はスラリーであってもよい。しかしながら、「ホエイタンパク質溶液」は、好ましくはポンプ可能であり、ホエイタンパク質溶液中の液体の量は、好ましくは７０～９８％、より好ましくは８０～９６％である。ホエイタンパク質溶液に使用される液体は、典型的には水である。
【0023】
ホエイタンパク質溶液は、典型的には、ホエイタンパク質溶液の２重量％以上の量のタンパク質を含むことになる。本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の２～２０重量％の範囲のタンパク質を含む。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質溶液の５～１５重量％の範囲の量のタンパク質を含む。
【0024】
加水分解に使用されるホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を含む組成物を水などの液体に分散させることによって得られる。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質分離物及び／又はホエイタンパク質分離物のいずれかを水と混合することによって作られる。したがって、本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質分離物及び／又はホエイタンパク質分離物を含む。
【0025】
本発明のホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して少なくとも５０％の量でホエイタンパク質を含む。ホエイタンパク質の含有量が全固形分の５０％未満である場合、全体の分子組成（タンパク質や、炭水化物、脂質、ミネラルの間の比率）が異なり、酵素が異なる挙動をする可能性があり、したがって得られる生成物が異なることになる。
【0026】
ホエイタンパク質のほかに、ホエイタンパク質溶液は、他のタンパク質、例えばカゼインを少量含んでいてもよい。
【0027】
ホエイタンパク質溶液は、典型的には、タンパク質にくわえて他の成分を含む。ホエイタンパク質溶液は、例えばミネラル、炭水化物、及び／又は脂質などの、乳清又は乳の血清中に通常見出される他の成分を含んでいてもよい。代替として、又は追加として、ホエイタンパク質溶液は、ホエイ又は乳清に本来含まれていない成分を含んでいてもよい。しかし、そのような本来含まれていない乳成分は、食品の製造に使用するのに好適で、かつ安全であるべきである。
【0028】
ホエイタンパク質溶液は、全固形分に対してタンパク質の含有量が少ないほど、ホエイタンパク質以外の脂質、炭水化物（主にラクトース）、及び他のタンパク質の量が多くなる。
【0029】
ホエイタンパク質溶液は、例えば、ラクトース、オリゴ糖並びに／又はラクトースの加水分解生成物（すなわちグルコース及びガラクトース）などの炭水化物を含んでいてもよい。ホエイタンパク質溶液は、例えば、炭水化物を全固形分に対して０～１０重量％の範囲で含んでいてもよい。
【0030】
ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）及び乳清タンパク質分離物（ＳＰＩ）は、非常に少ない量のラクトースなどの炭水化物を含む。したがって、ＷＰＩ又はＳＰＩがホエイタンパク質溶液の調製に使用されるとき、ホエイタンパク質溶液中の炭水化物の含有量は、全固形分に対して０～１重量％の範囲にある。ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）又は乳清タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）がホエイタンパク質溶液を調製するのに使用される場合、ホエイタンパク質溶液中の炭水化物の量は、好ましくは全固形分に対して２～８重量％の範囲にある。
【0031】
ホエイタンパク質溶液はまた、脂質を、例えばトリグリセリド及び／又はリン脂質などの他のタイプの脂質の形態で含んでいてもよい。
【0032】
本発明の文脈では、「脂肪」及び「脂質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に用いることができる。
【0033】
本発明によるホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を、全固形分に対して少なくとも５０％の量で含むべきである。ホエイタンパク質溶液のタンパク質含有量が全固形分の５０％未満である場合、加水分解後に得られるホエイタンパク質加水分解物は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を画定する特徴、すなわち、４％タンパク質溶液において不快な苦味がなく、加水分解度が１５％を超え、遊離アミノ酸が１５重量％以下の量であり、２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドがペプチドの総量の２５重量％以下の量であるという特徴を有しない可能性がある。
【0034】
ホエイタンパク質含有量が全固形分に対して５０％未満のホエイタンパク質溶液は、多量のミネラル、脂肪及び炭水化物を含むことになる。ホエイタンパク質含有量が固形分の５０％未満であり、ミネラル、脂肪及び炭水化物を多量に含むホエイタンパク質加水分解物を作ることは望ましくない。いかなる理論にも縛られることなく、本発明の発明者らは、ミネラルがいくつかの酵素の活性に影響を及ぼしうると考えている。このことは、脂質や炭水化物にも当てはまる可能性がある。さらに、多量の脂質、ミネラル及び炭水化物は、得られるホエイタンパク質加水分解物の味や濁度にも影響を及ぼしうる。
【0035】
好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を、全固形分に対して少なくとも７０重量％など、全固形分に対して少なくとも６０重量％、さらにより好ましくは全固形分に対して少なくとも８０重量％の量で含む。本発明のより好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも８５重量％で含み、最も好ましいのは、ホエイタンパク質溶液がホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも９０重量％の量で含むことである。
【0036】
ホエイタンパク質溶液に存在するタンパク質は、主にホエイタンパク質であるべきである。しかし、例えばカゼインなどの他のタンパク質が微量存在してもよい。本発明の一実施形態では、したがって、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を、タンパク質の総量に対して９０重量％以上の量で含む。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質を、タンパク質の総量に対して９５重量％以上の量で含む。したがって、本発明のさらなる実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で１０重量％のカゼイン又は他の非ホエイタンパク質、タンパク質の総量に対して好ましくは最大で５重量％、より好ましくは最大で３重量％のカゼイン又は他の非ホエイタンパク質を含む。
【0037】
ホエイタンパク質溶液の脂肪含有量が多い場合、得られるタンパク質加水分解物の透明度や味に影響を及ぼすことになる。したがって、本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、全固形分に対して最大で８重量％など、全固形分に対して最大で１０重量％の量の脂質を含み、さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、脂質を全固形分に対して最大６重量％の量で含む。
【0038】
ホエイタンパク質濃縮物がホエイタンパク質溶液を調製するのに使用される場合、脂質／脂肪含有量は全固形分の約６～８重量％である。それに対して、ホエイタンパク質分離物がホエイタンパク質溶液の調製に使用される場合、ホエイタンパク質溶液は本質的に脂肪を含まない。
【0039】
本発明の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液は本質的に脂肪を含まない。「本質的に脂肪を含まない」という用語は、ホエイタンパク質溶液の脂質含有量が、全固形分に対して１重量％未満、好ましくは０．５重量％未満、さらに好ましくは全固形分に対して０．１重量％未満であることを意味する。
【0040】
全固形分に対して最大で０．５％など、ホエイタンパク質溶液の脂肪含有量が少ない場合、本発明の方法に従って調製されたホエイタンパク質加水分解物は、見た目が透明になる。好ましくは、ホエイタンパク質溶液中の脂質含有量は、全固形分の０．３重量％未満、より好ましくは全固形分に対して重量で０．２％未満の脂質である。
【0041】
本発明の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、ホエイタンパク質分離物及び／又は乳清タンパク質分離物のホエイタンパク質溶液を使用することによって得られる。ホエイタンパク質分離物及び／又は乳清タンパク質分離物が加水分解に使用されたとき、脂肪含有量が少ないことになる（０．５％未満）。これにより、高い加水分解度（ＤＨ＞１５％）と良好な味を有することにくわえて、見た目が透明なホエイタンパク質加水分解物を、限外濾過のステップを全く経ずに調製することができる。好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、ホエイタンパク質分離物又は乳清タンパク質分離物を水に混合したものである。
【0042】
ホエイタンパク質
本発明の一態様では、ホエイタンパク質加水分解物は、ホエイタンパク質を含む溶液を加水分解することによって得られる。
本発明の一態様では、ホエイタンパク質加水分解物は、ホエイタンパク質を含む溶液を加水分解することによって得られる。
【0043】
本発明の文脈では、「ホエイタンパク質」という用語は、ホエイ又は乳清に見られるタンパク質に関する。ホエイタンパク質溶液のホエイタンパク質は、ホエイ若しくは乳清中に見られるタンパク質種のサブセットであってもよく、又はホエイ及び／若しくは乳清中に見られるタンパク質種の完全なセットであってもよい。ホエイタンパク質は、チーズ製造の副産物として生成される液体材料であるホエイから分離される球状タンパク質の混合物である。ホエイタンパク質は、乳又は凝固した乳のいずれかの漿液相に存在するタンパク質である。乳の血清相のタンパク質は、ホエイタンパク質のほかに、乳清タンパク質と呼ばれることもある。
【0044】
「乳清」という用語は、例えば精密濾過又は大孔径限外濾過によってカゼイン及び乳脂肪球が乳から取り除かれたときに残る液体に関する。また、乳清は「理想的なホエイ」と呼ばれることもある。
【0045】
「乳清タンパク質」又は「漿液タンパク質」という用語は、乳清中に存在するタンパク質に関する。
【0046】
「ホエイ」という用語は、乳のカゼインを沈殿させて取り除いた後に残る液体上清に関する。カゼインの沈殿は、例えば、乳の酸性化及び／又はレンネット酵素の使用によって達成することができる。
【0047】
スイートホエイ、酸ホエイ、カゼインホエイなど、いくつかの種類のホエイが存在する。
【0048】
本発明のホエイタンパク質溶液に存在するホエイタンパク質は、ホエイ、例えばカゼインホエイ、酸ホエイ又はスイートホエイの相異なる供給源に由来することができる。
【0049】
本発明の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質溶液中のホエイタンパク質は、スイートホエイからのものである。スイートホエイは、主にタンパク質β－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、α－ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含む。しかし、スイートホエイは、免疫グロブリン、オステオポンチン、ラクトフェリン及び脂肪球膜タンパク質など、他のタンパク質を含みうる。ＣＭＰは、スイートホエイ又は酸ホエイには存在しない。本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液中のホエイタンパク質は、ＣＭＰが完全に又は部分的に取り除かれたスイートホエイからのものである。これは、変性スイートホエイと呼ばれることがある。スイートホエイからＣＭＰを取り除くことは、人乳のものにより近いスレオニン及びトリプトファンの含有量をもつタンパク質材料をもたらす。
【0050】
本発明の文脈では、「β－ラクトグロブリン」という用語は、「ＢＬＧ」と呼ばれることもある。この用語は交換可能に使用でき、哺乳類種由来のＢＬＧに関係する。さらに、「α－ラクトアルブミン」という用語は、本発明の文脈では「ＡＬＡ」と呼ばれることがあり、哺乳類種由来のα－ラクトアルブミンに関する。
【0051】
本明細書で使用される「スイートホエイ」という用語は、レンネットタイプのチーズを作る間に、乳を凝固させ、濾した後に残る液体を指す。「スイートホエイ」は、チェダーチーズやスイスチーズといったレンネットタイプのハードチーズの製造中得られる。スイートホエイは、レンネット酵素を乳組成物に加えることによって得られ、レンネット酵素は、κ－カゼインをパラ－κ－カゼインと、ペプチドであるカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）に切断し、それによってカゼインのミセルを不安定にし、カゼインを沈殿させる。レンネットで沈殿したカゼインのまわり液体がスイートホエイと呼ばれる。スイートホエイのｐＨ値は５．２～６．７の範囲である。
【0052】
スイートホエイはチーズの製造からの生成物であり、約１０～１５重量％のタンパク質及び約７５～８０％のラクトースを含む。スイートホエイ中のタンパク質は主にホエイタンパク質であるが、少量のカゼインが存在することもある。ホエイタンパク質には、β－ラクトグロブリン（約５５～６５％）、α－ラクトアルブミン（約１８～２５％）、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン及び乳脂肪球膜タンパク質が含まれる。
【0053】
「スイートホエイ」という用語（サワー乳清又は酸ホエイと呼ばれることもある）は、カゼイン／カゼイネートの製造から得られるホエイに関する。本発明の文脈では、スイートホエイは、酸ホエイと同じではない。スイートホエイは、カゼイン／カゼイネートを精密濾過によって分離した後に得られるホエイ画分である。スイートホエイはＣＭＰを含んでいない。
【0054】
酸ホエイという用語は、カッテージチーズやクワルクなどの酸タイプのチーズの製造の間に得られるホエイに使用される。酸タイプのチーズの製造では、酸沈殿によって、すなわち、カゼインの等電点である４．６より低いｐＨに乳のｐＨ値を下げ、カゼインミセルを崩壊及び沈殿させることによって乳からカゼインを取り除く。多くの場合、ｐＨは３．８～４．６の範囲に下げられる。酸沈殿したカゼインのまわりの液体が多く場合酸ホエイと呼ばれ、ＣＭＰを含有しない。
【0055】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液に使用されるホエイタンパク質は、酸ホエイでも、カゼインホエイでもない。
【0056】
本発明でホエイタンパク質溶液に使用されるホエイタンパク質は、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、乳清タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）又は乳清タンパク質分離物（ＳＰＩ）であることができる。ホエイタンパク質濃縮物とホエイタンパク質分離物との違いは、生成物の組成、特にタンパク質含有量である。ホエイタンパク質分離物は濃縮物よりも純度が高く、ホエイタンパク質を「分離」するように他の非タンパク質成分が部分的に取り除かれている。したがって、ホエイタンパク質分離物は、より高い割合のタンパク質を有しており、十分に純粋であるので、事実上ラクトースフリー、炭水化物フリー、脂肪フリー、かつコレステロールフリーであることができる。
【0057】
本文脈では、「ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）」及び「血清タンパク質濃縮物（ＳＰＣ）」という用語は、ホエイタンパク質の乾燥組成物と液体組成物の両方を包含する。本発明で使用されるＷＰＣ及びＳＰＣのタンパク質含有量は、全固形分に対して５０重量％以上である。しかし、ホエイタンパク質濃縮物は、より多量のホエイタンパク質、例えば、乾燥物質含量に対して８０重量％のホエイタンパク質を含んでいてもよい。液体ホエイの乾燥部分は、乾燥生成物が５０重量％以上のホエイタンパク質を含むように、ホエイから十分な非タンパク質成分を取り除くことによって得られる。
【0058】
典型的には、発明で使用されるＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含む。
全固形分に対して５０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して８～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
全固形分に対して５０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して８～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
【0059】
代替的に、しかしまた好ましいのは、以下を含むＷＰＣ又はＳＰＣである。
全固形分に対して５０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
全固形分に対して５０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
【0060】
好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含む。
全固形分に対して５０～８９重量％タンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
全固形分に対して５０～８９重量％タンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
【0061】
より好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは以下を含む。
全固形分に対して７０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して３０～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～３５重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～２５重量％のＣＭＰ
全固形分に対して７０～８９重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して３０～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～３５重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～２５重量％のＣＭＰ
【0062】
「ホエイタンパク質分離物」及び「漿液タンパク質分離物」という用語は、乾燥組成物又は液体組成物に関し、一般に、ラクトース及びコレステロールをほとんど含まず、ホエイタンパク質含有量が全固形分に対して少なくとも９０重量％であると考えられている。ホエイタンパク質分離物は、例えば、全固形分に対して９２重量％以上のホエイタンパク質を含みうる。好ましくは、ＷＰＩ及びＳＰＩは、全固形分に対して９２～９９重量％のタンパク質など、全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質を含む。
【0063】
ＷＰＩ又はＳＰＩは、好ましくは以下を含みうる。
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して８～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して１５～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して８～５０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～４０重量％のＣＭＰ
【0064】
代替的に、しかしまた好ましくは、ＷＰＩ又はＳＰＩは以下を含むことができる。
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して３０～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～３５重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～２５重量％のＣＭＰ
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して３０～８０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して４～３５重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して０～２５重量％のＣＭＰ
【0065】
好ましくは、ＷＰＩは好ましくは以下を含むことができる。
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して６０～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して１０～２０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して１０～２０重量％のＣＭＰ
全固形分に対して９０～１００重量％のタンパク質
総タンパク質含有量に対して６０～７０重量％のＢＬＧ
総タンパク質含有量に対して１０～２０重量％のＡＬＡ
総タンパク質含有量に対して１０～２０重量％のＣＭＰ
【0066】
本発明の一実施形態では、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の調製に使用されるホエイタンパク質溶液は、乾燥物質の７０～９７重量％などの５０～９８重量％の範囲、好ましくは７２～９５重量％、さらに好ましくは乾燥物質の７５～９５重量％の範囲のホエイタンパク質の総量を含む。
【0067】
いずれの好適なホエイタンパク質源も、本発明によるホエイタンパク質溶液を調製するのに使用することができる。本発明によるホエイタンパク質溶液に使用されるホエイタンパク質は、好ましくは、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダ、ラマ、牝馬、ウマ及び／又はシカの乳など、哺乳類の乳からのホエイタンパク質である。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ホエイタンパク質は、ウシ（乳牛）の乳に由来する。
【0068】
ホエイタンパク質溶液は、脱ミネラルされたホエイタンパク質溶液であることが好ましい。栄養及び健康の観点から、タンパク質加水分解物中のナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム及びリン酸などのミネラルは低濃度で含まれていることが好ましいので、ホエイタンパク質溶液中のミネラルの含有量が低いことが好ましい。さらに、例えばナトリウム及びカルシウムを含むミネラルは、ホエイタンパク質と相互作用し、ホエイタンパク質加水分解物の生成物の濁度、凝集挙動、及び耐熱性に影響を及ぼす可能性がある。高濃度では、特にナトリウム、カルシウム及び亜鉛を含むいくつかのミネラルは、いくつかのプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害又は促進する可能性があり、したがって、高濃度のこれらのイオンの存在により、プロテアーゼの協奏的な（concerted）切断パターンが変わりうる。したがって、本発明の実施形態では、ホエイタンパク質溶液のミネラルの含有量は、全固形分に対して１０％以下、より好ましくは８％以下である。本発明の文脈では、「ミネラル」という用語は灰分を指す。「ミネラル」及び「灰分」という用語は交換可能に使用され、同じものを指しうる。したがって、ホエイタンパク質溶液のミネラル含有量に言及することは、ホエイタンパク質溶液の灰分として理解されるべきである。
【0069】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、総タンパク質含有量の４０重量％以上のＢＬＧなど、３０重量％以上のＢＬＧを含む。最も好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、総タンパク質含有量に対して５０重量％以上のＢＬＧを含み、さらにより好ましくは、ホエイタンパク質溶液は、ＢＬＧを総タンパク質含有量に対して５５重量％以上の量で含む。本発明の別の実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、総タンパク質含有量に対して４０～９０重量％のＢＬＧなど、総タンパク質含有量に対して３０～９５重量％のＢＬＧ、さらに好ましくは総タンパク質含有量に対して４５～８０重量％の範囲の量のＢＬＧを含む。
【0070】
本発明の文脈では、「ホエイ」という用語は、乳からカゼインが取り除かれたときに残る液体組成物に関する。カゼインは、例えば、ミセラーカゼインを含まない、又はそれを本質的に含まないが、本来含まれているホエイタンパク質を含有する液体透過液をもたらす精密濾過によって取り除くことができる。この液体透過液は、理想的なホエイ、漿液又は乳清と呼ばれることがある。
【0071】
ホエイタンパク質溶液のタンパク質は、好ましくは、可能な限りその本来含まれている状態に近く、好ましくは、もしあったとしても穏やかな加熱処理のみに供されている。
【0072】
酵素加水分解
本発明による方法のステップｂ）は、ホエイタンパク質溶液を酵素加水分解に供することに関し、その酵素加水分解は、以下の酵素の組み合わせのいずれか１つを使用して行われる。
ｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ及び少なくともブロメラインを含む酵素の組み合わせ
本発明による方法のステップｂ）は、ホエイタンパク質溶液を酵素加水分解に供することに関し、その酵素加水分解は、以下の酵素の組み合わせのいずれか１つを使用して行われる。
ｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ．少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ及び少なくともブロメラインを含む酵素の組み合わせ
【0073】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、上記３つの酵素の組み合わせのうちのいずれかを加えることによるホエイタンパク質溶液の酵素加水分解が、１５％を超える加水分解度を有し、１５％以下の遊離アミノ酸の含有量を有するホエイタンパク質加水分解物をもたらすことになり、そのホエイタンパク質加水分解物は許容される味を有し、苦みペプチドの含有量が少ないことを見出した。本発明者らは、上記の酵素の組み合わせｉ．～ｉｉｉ．を用いた加水分解によって調製されたホエイタンパク質加水分解物が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において苦みがないことを見出した。
【0074】
本発明のステップｃ）では、酵素加水分解は、加水分解度（ＤＨ）が１５％以上のときに酵素を失活させることによって停止させて、ホエイタンパク質加水分解物を得る。加水分解度（ＤＨ）とは、加水分解によって切断された元のタンパク質のペプチド結合の割合として定義される。
【0075】
本発明の一実施形態では、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、アスペルギルス・オリゼー及び／又はアスペルギルス・フラバス由来のセリンエンドペプチダーゼである。アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシン様セリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）である。
【0076】
本発明の一実施形態では、酵素の組み合わせｉ）は、バシロリシン・バシロライシンなどのバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼをさらに含む。したがって、一実施形態では、酵素の組み合わせｉ）は以下を含む。
－少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼ
－少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼ
【0077】
本発明のさらなる実施形態では、酵素の組み合わせｉｉ）は、バシロライシンなどのバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼをさらに含むことができる。したがって、一実施形態では、酵素の組み合わせｉｉ）は以下を含む。
－少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ
－少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともバチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ
【0078】
本発明の一実施形態では、アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼはアスペルギルス・オリゼー由来である。
【0079】
一実施形態では、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼはサブチリシンである。サブチリシンは、好ましくはバチルス・リケニフォルミス由来である。
【0080】
本発明の別の実施形態では、メタロエンドペプチダーゼはバシロライシンである。バシロライシンは、好ましくはバチルス属由来であり、より好ましくはバチルス・アミロリクエファシエンス由来である。本発明の好ましい実施形態では、バシロライシンはバチルス・サブチルス由来ではない。
【0081】
本発明の文脈では、「トリプシン様プロテアーゼ」という用語は微生物由来のプロテアーゼである。好ましくは、微生物由来のトリプシン様プロテアーゼは、フザリウム属の種、特にフザリウム・オキシスポルム由来である。したがって、「トリプシン様プロテアーゼ」という用語には、例えば、微生物由来ではないパンクレアチンは含まれない。それに対して、パンクレアチンは、例えばトリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ及びリパーゼを含む膵臓由来の酵素の混合物である。さらに、「トリプシン様プロテアーゼ」という用語は、「トリプシン」と混同してはならない。
【0082】
さらに別の実施形態では、ブロメラインはアナナス・コモサス由来である。ブロメラインはシステインエンドペプチダーゼである。
【0083】
本発明の一実施形態では、ステップｂ）の酵素加水分解は、以下の酵素の組み合わせのいずれか１つを使用して行われる。
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼとメタロエンドペプチダーゼの組み合わせ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドプロテアーゼ、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼとメタロエンドペプチダーゼの組み合わせ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドプロテアーゼ、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
【0084】
本発明の好ましい実施形態では、ステップｂ）の酵素加水分解は、以下の酵素の組み合わせのいずれか１つを使用して行われる。
ｉ）少なくともバチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくとも微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属の種由来のサブチリシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属の種由来のバシロライシンとサブチリシンの組み合わせ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドプロテアーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉ）少なくともバチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくとも微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属の種由来のサブチリシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属の種由来のバシロライシンとサブチリシンの組み合わせ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドプロテアーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む酵素の組み合わせ
【0085】
本発明の好ましい実施形態では、酵素の組み合わせは以下のものである。
ｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素、及び少なくともＥＣ３．４．２１．４群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素、及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、さらなるＥＣ３．４．２４．２８群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともＥＣ３．４．２４．２８群からの酵素、少なくともさらなるＥＣ３．４．２２．３２群からの酵素及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素、及び少なくともＥＣ３．４．２１．４群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素、及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともＥＣ３．４．２１．６２群からの酵素、さらなるＥＣ３．４．２４．２８群からの酵素、少なくともＥＣ３．４．２１群のさらなる酵素及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
ｉｖ）少なくともＥＣ３．４．２４．２８群からの酵素、少なくともさらなるＥＣ３．４．２２．３２群からの酵素及び少なくともＥＣ３．４．１１群のさらなる酵素を含む酵素の組み合わせ
【0086】
本発明の別の好ましい実施形態では、酵素の組み合わせは以下である。
ｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともフザリウム・オキシスポルム由来のトリプシン様プロテアーゼ、任意選択でさらにバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシンを含む組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
バチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシンである。
ｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともフザリウム・オキシスポルム由来のトリプシン様プロテアーゼ、任意選択でさらにバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシンを含む組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
バチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシンである。
【0087】
本発明の別の好ましい実施形態では、酵素の組み合わせは以下である。
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、及び少なくともトリプシン様プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．４）を含む組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、バシロライシン（ＥＣ３．４．２４．２８）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６３，）及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン（ＥＣ３．４．２４．２８）、少なくともブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３２）、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、及び少なくともトリプシン様プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．４）を含む組み合わせ
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
ｉｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、バシロライシン（ＥＣ３．４．２４．２８）、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６３，）及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
ｉｖ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン（ＥＣ３．４．２４．２８）、少なくともブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３２）、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）を含む組み合わせ
【0088】
ホエイタンパク質加水分解物を調製する本発明の方法で使用される酵素の組み合わせｉ）～ｉｖ）は、上記の主要な酵素以外の他の酵素を含みうる。「主要な酵素」という用語は、調製物中に最も豊富に存在する酵素を意味する。以下のリストでは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号を括弧内に示して特定の命名に注釈されたプロテアーゼを識別する。例えば、酵素の組み合わせは、ペプチドヒドロラーゼ（Ａ０Ａ３６４ＭＤＲ７）、サブチラーゼ（subtilase）ファミリータンパク質（Ｉ８Ａ６Ｗ５）、ファンガリシン（fungalysin）メタロペプチダーゼＭ３６（Ａ０Ａ２Ｐ２Ｈ０１３）、中性プロテアーゼ２（Ａ０Ａ３６４ＭＨ７０）、アスペルギロペプシン－１（Ｂ８ＮＬＹ９）、ロイシルアミノペプチダーゼＡ（Ｑ２Ｕ１Ｆ３）、ロイシルアミノペプチダーゼ２（Ｑ２ＵＬＭ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（Ｑ２ＵＨ３５）、ジペプチジルペプチダーゼ５（Ｑ９Ｙ８Ｅ３）、中性プロテアーゼ１（Ｑ２Ｕ１Ｇ７）、中性プロテアーゼ２（Ｐ４６０７６）、アルカリプロテアーゼ１（Ｐ１２５４７）、及びプロリルオリゴペプチダーゼファミリータンパク質（Ｂ８ＮＢＭ３）からなる群より選択される酵素に高い同一性（９５～１００％）をもつ１つ又は複数の酵素を含むことができる。
【0089】
本発明の一態様では、酵素の組み合わせｉ）の主要な酵素は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びトリプシン様プロテアーゼである。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシンであり、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチラーゼファミリータンパク質である。本発明の一実施形態では、酵素の組み合わせｉ）は、アミノペプチダーゼ（ペプチドヒドロラーゼやロイシルアミノペプチダーゼなど）、メタロエンドペプチダーゼ（バシロライシンやファンガリシンメタロペプチダーゼ、中性プロテアーゼなど）、プロリルオリゴペプチダーゼファミリータンパク質、及びアスペルギロペプシン－１（アスパラギン酸エンドペプチダーゼ）のうちの１つ又は複数をさらに含むことができる。酵素の組み合わせｉ）に存在する酵素の少なくとも８０％は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、トリプシン様プロテアーゼであることが予想される。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼを含む調製物の例は、プロタメックス（Protamex）（ノボザイムズ社（Novozymes A/S））である。プロタメックスはまた、バシロライシンも含む。アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼを含む調製物の例は、Ｐｒｏｍｏｄ ７８２（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社（Ltd））及びプロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤ（天野エンザイム社（Amano Enzyme Ltd））であり、主要な酵素はアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼである。また、Ｐｒｏｍｏｄ ７８２及びプロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤは、ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、プロリルオリゴペプチダーゼファミリータンパク質、中性プロテアーゼ２及びアスペルギロペプシン－１の酵素を含み、主要な酵素はセリンエンドペプチダーゼである。トリプシン様プロテアーゼは、例えば、Ｆｏｒｍｅａ ＴＬ １２００ ＢＧ（ノボザイムズ社）から供給されうる。
【0090】
本発明の一態様では、酵素の組み合わせｉｉ）は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを主要な酵素として含む。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシンであり、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチラーゼファミリータンパク質及びアルカリプロテアーゼである。アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼは、例えば、ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼＡ及びロイシルアミノペプチダーゼ２のうちの１つ又は複数であることができる。本発明の一実施形態では、酵素の組み合わせｉｉ）は、メタロエンドペプチダーゼ；ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、中性プロテアーゼ１及び中性プロテアーゼ２のうちの１つ又は複数をさらに含むことができる。酵素の組み合わせｉｉ）はまた、アスペルギロペプシン－１（アスパラギン酸エンドペプチダーゼ）、ジペプチジルペプチダーゼ４、及びジペプチジルペプチダーゼ５を含むことができる。酵素の組み合わせｉｉ）に存在する酵素の少なくとも８０％は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼであることが予想される。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼを含む調製物の例は、サブチリシンを含むアルカラーゼ（ノボザイムズ社）である。アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼを含む調製物の例は、プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤ及びＰｒｏｍｏｄ ７８２であり、そこにおいて主要な酵素はアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼである。Ｐｒｏｍｏｄ ７８２及びプロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤはまた、酵素ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、プロリルオリゴペプチダーゼファミリータンパク質、中性プロテアーゼ２、アスペルギロペプシン－１も含み、主要な酵素はセリンエンドペプチダーゼである。アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む調製物の例は、フレーバーザイム Ｃｏｎｃ ＢＧ（ノボザイムズ社）であり、主要な酵素はロイシルアミノペプチダーゼである。フレーバーザイム Ｃｏｎｃ ＢＧはまた、ロイシルアミノペプチダーゼＡ、ロイシルアミノペプチダーゼ２、ジペプチジルペプチダーゼ４、ジペプチジルペプチダーゼ５、中性プロテアーゼ１、中性プロテアーゼ２、アルカリプロテアーゼ１を含み、主要な酵素はロイシルアミノペプチダーゼである。
【0091】
本発明の一態様では、酵素の組み合わせｉｉｉ）は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、バチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを主要な酵素として含む。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチリシンであり、バチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼは、好ましくはバシロライシンであり、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼは、好ましくはサブチラーゼファミリータンパク質及びアルカリプロテアーゼである。アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼは、例えば、ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼＡ及びロイシルアミノペプチダーゼ２のうちの１つ又は複数であることができる。本発明の一実施形態では、酵素の組み合わせｉｉｉ）は、メタロエンドペプチダーゼ；ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、中性プロテアーゼ１及び中性プロテアーゼ２のうちの１つ又は複数をさらに含むことができる。酵素の組み合わせｉｉｉ）はまた、アスペルギロペプシン－１（アスパラギン酸エンドペプチダーゼ）、ジペプチジルペプチダーゼ４及びジペプチジルペプチダーゼ５を含むことができる。酵素の組み合わせｉｉｉ）に存在する酵素の少なくとも８０％は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、バシロライシン、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼである。バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）とバシロライシンをともに含む調製物の例は、Ｐｒｏｍｏｄ ９５０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）及びプロタメックスである。アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼを含む調製物の例は、プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤ及びＰｒｏｍｏｄ ７８２である。Ｐｒｏｍｏｄ ７８２及びプロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤはまた、酵素ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、プロリルオリゴペプチダーゼファミリータンパク質、中性プロテアーゼ２及びアスペルギロペプシン－１を含み、主要な酵素はセリンエンドペプチダーゼである。アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む調製物の例は、フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧであり、主要な酵素はロイシルアミノペプチダーゼである。フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧはまた、酵素ロイシルアミノペプチダーゼＡ、ロイシルアミノペプチダーゼ２、ジペプチジルペプチダーゼ４、ジペプチジルペプチダーゼ５、中性プロテアーゼ１、中性プロテアーゼ２及びアルカリプロテアーゼ１を含み、主要な酵素はロイシルアミノペプチダーゼである。
【0092】
本発明の一態様では、酵素の組み合わせｉｖ）は、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、ブロメライン及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを主要な酵素として含む。アスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼは、例えば、ペプチドヒドロラーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼＡ及びロイシルアミノペプチダーゼ２のうちの１つ又は複数であることができる。本発明の一実施形態では、酵素の組み合わせｉｖ）は、メタロエンドペプチダーゼ；ファンガリシンメタロペプチダーゼＭ３６、中性プロテアーゼ１及び中性プロテアーゼ２のうちの１つ又は複数をさらに含むことができる。酵素の組み合わせｉｉ）はまた、ジペプチジルペプチダーゼ４、ジペプチジルペプチダーゼ５及びアルカリプロテアーゼ（アスペルギルス属由来のセリンプロテアーゼ）を含むことができる。酵素の組み合わせｉｖ）に存在する酵素の少なくとも８０％は、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、ブロメライン及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼであることが予想される。バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシンを含む調製物の例は、ニュートラーゼである。ブロメラインの例はＰｒｏｍｏｄ ５２３ ＭＤＰであり、一方ではアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼの例はフレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧである。
【0093】
酵素の量は酵素の種類及び酵素の活性に依存するので、本発明のホエイタンパク質加水分解物を調製する方法は、加水分解ステップの下で加えられる酵素の量に限定されるべきではない。しかし、指針として、酵素加水分解は酵素の組み合わせを用いて行われ、酵素の合計量は、１００ｇのタンパク質あたり０．１～７．５ｇの酵素など、１００ｇのタンパク質あたり０．０５～１０ｇの範囲である。好ましくは、酵素の量は、１００ｇのタンパク質あたり０．２～５．０ｇの量である。
【0094】
組み合わせｉ．～ｉｉｉ．における３つの異なる酵素の間の比率は、例えば、１～８：１～８：１～８の範囲など１－１０：１－１０：１－１０の範囲でありうる。しかし、酵素の添加量は使用される酵素の活性に依存するので、本発明はその酵素の添加量に限定されるべきではない。
【0095】
本発明のステップｂ）で行われる酵素加水分解は、好ましくは、４０℃～７０℃など４０℃～７５℃の範囲の温度で行われる。酵素加水分解は、酵素が最適活性を有する温度で行われるべきである。好ましい実施形態では、酵素加水分解は４５℃～６５℃の範囲の温度で行われる。
【0096】
加水分解がステップｃ）で停止されるまでの酵素加水分解の時間は、使用される酵素の量と活性に依存する。加水分解は加水分解度が１５％又はそれを超えるまで続けられる。ステップｂ）の酵素加水分解は、好ましくは、３．５時間～１５時間など３時間～２０時間、好ましくは４時間～１０時間、さらに好ましくは４時間～７時間の範囲の時間で行われる。
【0097】
ホエイタンパク質溶液は、好ましくは、酵素加水分解の間、６～９の範囲のｐＨを有するべきである。好ましい実施形態では、ステップｂ）の酵素加水分解の間のｐＨは６．５～８．０である。
【0098】
このｐＨ範囲では、酵素は最大の活性を有し、したがって最も効率的にタンパク質をペプチドと遊離アミノ酸に切断する。くわえて、このｐＨ範囲では、加水分解プロセスの間だけでなく、酵素を失活させるための加熱処理の間でも凝集が回避される。
【0099】
本発明によるホエイタンパク質加水分解物を調製する方法のステップｃ）では、酵素加水分解は、酵素を失活させることによって停止される。本発明の文脈では、「失活」という用語は酵素の不可逆的な不活性化を指す。酵素の失活は、他の条件で酵素が活性にならないように不可逆的でなければならない。
【0100】
加水分解は、加水分解度が少なくとも１８％など少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるときに停止される。本発明の一実施形態では、ステップｃ）において、加水分解は、加水分解度が１５％～３５％、好ましくは１７％～３０％、さらにより好ましくは１８％～２８％の範囲にあるときに停止される。
【0101】
ステップｃ）の酵素の失活、ひいては加水分解の停止は、当該技術分野で公知のいずれかの方法で行うことができる。例えば、酵素が失活する温度に温度を変えることによる酵素の失活。また、酵素の失活及び変性は、溶液のｐＨを酵素が失活するｐＨに変えることによっても可能である。
【0102】
したがって、本発明の一実施形態では、ステップｃ）の酵素の失活は、酵素が加えられたホエイタンパク質溶液を、少なくとも８０℃の温度に加熱することによる。酵素の失活は、好ましくは８５℃～１２５℃などの８０℃～１３０℃、さらにより好ましくは９０℃～１２０℃の温度に加熱することによる。加熱によるステップｃ）の酵素の失活は、例えば１１０℃～１３０℃の温度に１０～３０秒間加熱するなど、高温に短時間加熱することによることができる。代替的に、ステップｃ）の酵素の失活は、比較的低い温度で、より長い時間加熱することによってもよい。これは、８０℃～９０℃に５～１０分間加熱することを含みうる。
【0103】
本発明の別の実施形態では、ステップｃ）の酵素の不可逆的な失活は、酵素が加えられたホエイタンパク質溶液、すなわちホエイタンパク質加水分解物のｐＨを、酵素が失活するｐＨに増加又は減少させることを含む。本発明の一実施形態では、ｐＨは１０以上のｐＨに上げられる。別の実施形態では、ｐＨは４以下のｐＨに下げられる。
【0104】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ステップｃ）で得られたホエイタンパク質加水分解物を限外濾過するいかなるステップも含まない。本発明の発明者らにとって驚くべきことには、低量の脂質をもつホエイタンパク質溶液、すなわちＷＰＩ又はＳＰＩを、特定の酵素の組み合わせを用いて酵素加水分解すると、味が良く、また限外濾過のステップを全く伴わずに見た目が透明なホエイタンパク質加水分解物が結果として得られた。
【0105】
当該技術分野で公知のホエイタンパク質加水分解物は、限外濾過加水分解物と非限外濾過加水分解物に分けることができる。既知の非限外濾過タンパク質加水分解物は、見た目が透明でない又は濁っていることになり、限外濾過タンパク質加水分解物は一般的に見た目が透明である。
【0106】
本発明の文脈では、「限外濾過」という用語は、１５００Ｄａ～５００００Ｄａ、好ましくは２０００Ｄａ～２００００Ｄａの範囲のカットオフを有する膜を用いた膜濾過を意味する。
【0107】
タンパク質加水分解物の限外濾過の間、脂肪、完全な（intact）タンパク質、及び一部の大きいペプチドが限外濾過膜によって留められ、残余分に保持されるが、遊離アミノ酸、小さいペプチド及びミネラルは限外濾過の透過液中に含まれる。
【0108】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質溶液は、脂質含有量の少ないＷＰＩとＳＰＩの溶液として調製される。本発明の発明者らにとって驚くべきことに、本発明の酵素の組み合わせを用いてホエイタンパク質加水分解物を調製すると、高い加水分解度、苦みの少ない良好な味を有し、見た目が透明であるホエイタンパク質加水分解物が結果として得られた。
【0109】
しかし、脂質含有量が低いことだけが、発明の発明者らが透明なタンパク質加水分解物を調製することが可能であった理由ではない。本発明の発明者らは、驚くべきことに、脂質含有量の低いホエイタンパク質溶液が、上記の酵素の組み合わせのいずれか１つを用いて酵素加水分解に供されたとき、加水分解度が１５％を超え、４％タンパク質溶液において苦味がなく、見た目が透明なホエイタンパク質加水分解物を調製することが可能であったことを見出した。見た目が透明であるためには、脂質含有量が少ないホエイタンパク質溶液を使用する必要があった。しかし、脂質含有量が少ないことは、透明な加水分解物が得られた唯一の理由ではなかった。本発明の発明者によって驚くべきことに、特定の酵素の組み合わせを用いて加水分解すると、透明な加水分解物が得られることが見出された。比較試験において、脂質含有量は低いが、本発明の方法で使用される酵素とは別の酵素を用いて加水分解が行われた他のホエイタンパク質加水分解物では、見た目が透明で苦みの少ないホエイタンパク質加水分解物が得られないことが観察された。
【0110】
本発明の方法によって得られたホエイタンパク質加水分解物は、好ましくは濃縮する、かつ／又は乾燥させることができる。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の方法は、ステップｃ）で得られたホエイタンパク質加水分解物を濃縮する、かつ／又は乾燥させるステップｄ）を含む。濃縮は、例えば、単位操作のナノ濾過、逆浸透濾過、及び蒸発のうちの１つ又は複数によることができる。
【0111】
本発明の別の実施形態では、乾燥ステップは、単位操作の噴霧乾燥、凍結乾燥及びスピンフラッシュ乾燥のうちの１つ又は複数を含み、回転乾燥及び／又は流動床乾燥も用いることができる。
【0112】
ホエイタンパク質加水分解物
一態様では、本発明は、
－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも１５％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドを、ペプチドの総量の２５重量％以下の量で含み、
－遊離アミノ酸を、加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量で含むホエイタンパク質加水分解物に関し、
そのホエイタンパク質加水分解物は４％タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有する。
一態様では、本発明は、
－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも１５％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドを、ペプチドの総量の２５重量％以下の量で含み、
－遊離アミノ酸を、加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量で含むホエイタンパク質加水分解物に関し、
そのホエイタンパク質加水分解物は４％タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有する。
【0113】
本発明の一態様では、本発明のホエイタンパク質加水分解物の加水分解度は、少なくとも１５％である。本発明の目的は、加水分解度が高く、限外濾過のステップがなくても不快な苦味を有しないホエイタンパク質加水分解物を作ることであった。多くの加水分解物においてペプチドが苦味の原因であることはよく知られている。一般的に、加水分解度の高い加水分解物をもたらす広範な加水分解は、結果として苦味をもつ加水分解物になることが予想される。高度に加水分解されたタンパク質加水分解物の苦味を軽減するために、加水分解物を活性炭で処理できるが、その処理は苦味のあるペプチドとともにやはり加水分解物も除去する可能性がある。高度に加水分解されたタンパク質が望まれるのは、ペプチドが完全なタンパク質よりも他の機能性を有するからである。例えば、ペプチドは完全なホエイタンパク質よりも良好に熱処理に耐えうる可能性がある。
【0114】
しかし、本発明の発明者らは、驚くべきことに、ホエイタンパク質加水分解物を苦味のあるペプチドを除去するための追加の処理に供しなくとも、不快な苦味を有しない加水分解度が高いホエイタンパク質加水分解物を調製する方法を見出した。
【0115】
本発明の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物の加水分解度は少なくとも１８％であり、さらにより好ましくは、ホエイタンパク質加水分解物の加水分解度は少なくとも２０％である。
【0116】
本発明の別の実施形態では、本発明によるホエイタンパク質加水分解物は、加水分解度が、１８～３０％など１５～３５％、好ましくは１８～２８％、さらにより好ましくは２０～２５％である。
【0117】
ホエイタンパク質加水分解物は遊離アミノ酸を含むことがあり、もし遊離アミノ酸が存在するなら、加水分解物の総アミノ酸含有量１５重量％以下の量で存在する。好ましくは、遊離アミノ酸含有量は、総アミノ酸含有量の１２重量％以下である。「総アミノ酸含有量」という用語は、本発明の文脈では、遊離アミノ酸並びにペプチド及びタンパク質に結合したアミノ酸を含む、存在するアミノ酸の合計量である。
【0118】
本発明のいくつかの実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物の遊離アミノ酸含有量は、総アミノ酸含有量の１３重量％以下など総アミノ酸含有量の１５重量％以下、好ましくは総アミノ酸含有量１０重量％以下であり、さらにより好ましくは、遊離アミノ酸の含有量は総アミノ酸含有量の８％重量以下である。
【0119】
本発明の他の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、遊離アミノ酸を加水分解物の総アミノ酸含有量の２～１５重量％の量で、好ましくは、遊離アミノ酸を加水分解物の総アミノ酸含有量の４～１３重量％の量で含む。
【0120】
本発明の発明者らは、本発明のホエイタンパク質加水分解物のペプチドが、２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドをペプチドの総量の２５重量％以下の量で含むことを見出した。好ましくは、ホエイタンパク質加水分解物は、２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドを、８～２５重量％、さらにより好ましくは１０～２０重量％の範囲の量で含む。
【0121】
本発明の一実施形態では、本発明のホエイタンパク質加水分解物は、３７５Ｄａ以下の分子量を有するペプチドを少なくとも１０重量％の量で含む。３７５Ｄａ以下の分子量を有するペプチドは、例えば、１０～２５重量％の範囲の量でホエイタンパク質加水分解物に存在しうる。
【0122】
本発明の発明者らは、本発明のホエイタンパク質加水分解物が、限外濾過膜による膜濾過に供された場合及び／又は活性炭による処理に供された場合も、加水分解度の高い公知のホエイタンパク質加水分解物と比較して、苦味が低減されていることを見出した。
【0123】
ホエイタンパク質加水分解物の苦みをカフェインの苦みと比較した。４％（重量／重量）タンパク質溶液におけるホエイタンパク質加水分解物は、０．０８％（重量／体積）カフェインの溶液の味よりも苦みが少ない味を有する。したがって、４％（重量／重量）タンパク質溶液中のホエイタンパク質加水分解物の苦みスコアは、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの苦みスコアに相当する。好ましくは、本発明の４％（重量／重量）タンパク質溶液中のホエイタンパク質加水分解物の苦みスコアは、０．０７％（重量／体積）以下のカフェインの苦みスコアに相当し、さらに好ましくは０．０６５％以下のカフェインの苦みスコアに相当する。最も好ましくは、本発明の４％（重量／重量）タンパク質溶液中のホエイタンパク質加水分解物の苦みスコアは、０．０６０％（重量／体積）の苦みスコアに相当する。
【0124】
本発明のさらなる実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、４％（重量／重量）タンパク質溶液において１００以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）を有する。さらなる実施形態では、高い加水分解度と許容される味を有することにくわえて、見た目が透明でもあるホエイタンパク質加水分解物を得る。透明で良好な味のホエイタンパク質加水分解物は、例えば飲料、ゲル、及びシェイクに使用でき、消費者へのアピールを向上できるので、望ましい。
【0125】
４％（重量／重量）タンパク質溶液において、実測比濁法濁度が１００ＮＴＵ未満の場合、試料は透き通っていると認識される。４％（重量／重量）タンパク質溶液において、実測比濁法濁度が１００ＮＴＵを超える場合、測定されたホエイタンパク質加水分解物は透き通っていないと認識される。比濁法濁度が４０ＮＴＵ未満の場合、溶液は透明であると認識される。しかし、４０ＮＴＵ～１００ＮＴＵの濁度を有するホエイタンパク質加水分解物は、透き通っている（しかし不透明又は濁っている）可能性がある。本発明の文脈では、「透き通っている（transparent）」という用語は、ある程度の光を通過させ、その結果溶液の背後にある物体を見ることができる溶液を指し、すなわちその溶液を通して見ることが可能である。「透明（clear）」という用語は、無色である溶液を指し、したがってその溶液を通して見ることが、それを制限するものが何もない状態で可能である。したがって、溶液は透き通っていても透明ではない場合がある。
【0126】
本発明のさらなる実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、４％（重量／重量）タンパク質溶液において６０以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）など、４％（重量／重量）タンパク質溶液において８０以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）、好ましくは４％（重量／重量）タンパク質溶液おいて５０以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）、さらにより好ましくは４％（重量／重量）タンパク質溶液において４０以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）を有する。
【0127】
本発明の一実施形態ではまた、ホエイタンパク質加水分解物は抗酸化活性を有する。好ましくは、ホエイタンパク質加水分解物の抗酸化活性は、１．５重量％タンパク質溶液において５４から６０の消去率を有することとして測定される。
【0128】
ホエイタンパク質加水分解物は、タンパク質以外の他の成分、例えば炭水化物、脂質、及びミネラルを含んでいてもよい。
【0129】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、脂質を、全固形分に対して６重量％以下など全固形分に対して８重量％以下の量で含む。別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、全固形分の０．５重量％以下の脂質含有量など、脂質を全固形分に対して１重量％以下の量で含む。
【0130】
ホエイタンパク質加水分解物はまた、カリウム、ナトリウム及びカルシウムなどのミネラルを含んでいてもよい。
【0131】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、カリウムを３．０重量％以下の量で含む。
【0132】
本発明の別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、ナトリウムを２重量％以下の量で含む。
【0133】
本発明のさらに別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、クエン酸を、ホエイタンパク質加水分解物の固形分１ｋｇあたり４～１０ｇの範囲の量で含む。
【0134】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、完全な又は分解されていないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、総タンパク質含有量に対して０．５～２重量％の量で含む。
【0135】
本発明の好ましい実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、粉末又は顆粒など乾燥組成物の形態である。
【0136】
別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物液体組成物である。
【0137】
食品
一態様では、本発明は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含む食品を提供することに関する。
一態様では、本発明は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含む食品を提供することに関する。
【0138】
例えば、食品は、飲料、シェイク、ゲル、フードバー、濃縮物又は液体ショット（shot）を含む乳製品の群から選択されるいずれか１つであってよい。
【0139】
好ましい実施形態では、食品は、プロテイン飲料、プロテインショット、プロテインシェイク、プロテインゲル又はプロテインバーの群から選択される。食品はまた、乳児用粉ミルク又は他の乳児用栄養製品であってもよい。
【0140】
食品が、飲料、シェイク、ゲル又はショットなどの液体形態である場合、食品は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含むことができる。ホエイタンパク質加水分解物は、好ましくは、２～２５重量％の加水分解ホエイタンパク質、好ましくは３～１５重量％の加水分解ホエイタンパク質など３～２０重量％の加水分解ホエイタンパク質、さらにより好ましくは３～１０重量％の加水分解ホエイタンパク質に相当する量で飲料に存在する。
【0141】
食品がプロテインバーなどのバーである場合、食品は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を、２～３０重量％の加水分解ホエイタンパク質に相当する量で含む。好ましくは、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の量は、４～１５重量％など３～２０重量％の加水分解ホエイタンパク質に相当する量で、バー中に存在する。本発明によるホエイタンパク質加水分解物を、例えばプロテインバーなどのフードバーに使用する場合、ホエイタンパク質加水分解物を軟化剤として使用することができる。プロテインバー中のタンパク質加水分解物の濃度を高くすることは、軟化作用があり、長期保存中にバーが堅くなるのを防ぐことはよく知られている。
【0142】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を、２～２０重量％の加水分解ホエイタンパク質に相当する量で含む飲料を提供することに関する。飲料は、タンパク質以外に、炭水化物、ビタミン及びミネラルを含むプロテイン飲料であることができる。
【0143】
本発明の好ましい実施形態では、飲料は中性のｐＨ、すなわち２２℃で４％タンパク質溶液において６．５～８．０の範囲のｐＨを有する。
【0144】
本発明の一実施形態では、本発明によるホエイタンパク質加水分解物は、炭酸飲料の調製において成分として使用することができる。したがって、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を含む本発明の食品は、炭酸飲料である。
【0145】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料に関する。
【0146】
一実施形態では、炭酸飲料は、ホエイタンパク質加水分解物を２～１０重量％に相当する量で含む。炭酸飲料はまた、炭水化物を含んでいてもよく、炭水化物が存在する場合、それは５重量％以下の量である。炭酸飲料は、好ましくは脂肪を含まない。
【0147】
一実施形態では、本発明のホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料の炭酸化の量は、（飲料中に存在する液体の１体積あたり）０．１体積の炭酸化～４体積の炭酸化の範囲である。より典型的には、炭酸化の量は約１．６体積～約３．５体積の範囲であり、最も典型的な濃度は約１．７体積～約３．０体積であり、炭酸化の量は最も好ましくは２．０～３．０体積の範囲である。炭酸化とは、本発明の文脈では、飲料に存在する炭酸量が液体混合物１体積あたり０．１体積～４体積の範囲である炭酸化タンパク質飲料を得るのに十分な量で、二酸化炭素を飲料用成分の混合物に添加することを意味する。
【0148】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、二酸化炭素は、無菌炭酸水の形態で添加される。他の実施形態では、滅菌した二酸化炭素が、所望の量の二酸化炭素が存在するまで、液体混合物を通してバブリングされる。
【0149】
炭酸化は、飲料の酸性度を増加させる。飲料に加えられる二酸化炭素が多いほど、飲料のｐＨ値は下がることになる。しかし、本発明の発明者らは、二酸化炭素の添加は、５℃の温度で飲料のｐＨを下限のｐＨ５．５～６．０に下げることを見出した。飲料１体積あたり約２．５～３．０体積の二酸化炭素を加えることにより、５℃の温度で飲料のｐＨは約ｐＨ６．０まで低下するようになり、一方で飲料１体積あたり約４体積の二酸化炭素を加えることにより、５℃の温度で飲料のｐＨは約ｐＨ５．５まで低下するようになる。
【0150】
したがって、本発明の一実施形態では、本発明のホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料は、５℃の温度で、少なくとも５．５のｐＨを有する。そのｐＨは、典型的には、５．５～７．０の範囲などの５．５～８．２５の範囲、好ましくは５．８～６．５の範囲のｐＨであることになる。５．５を超えるｐＨを有する炭酸飲料が好ましい。
【0151】
本発明のホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料は、例えば、例えば低温殺菌やオートクレーブなど熱処理することができる。本発明の発明者らは、本発明のホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料の濁度は、１２０℃までの温度で、例えば２０分間などの長い時間加熱処理した後に、変化しないことを見出した。
【0152】
本発明のさらなる実施形態では、炭酸飲料は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物を、加水分解されていないホエイタンパク質分離物と組み合わせて含むことができる。
【0153】
本発明のホエイタンパク質加水分解物はまた、プロテインショット、プロテインシェイク又はプロテインゲルの調製にも使用することができる。プロテインショット、シェイク又はタンパク質ゲルは、加水分解ホエイタンパク質のほかに、炭水化物、ビタミン及びミネラルを２～２０重量％の量で含む。プロテインショット、プロテインシェイク又はプロテインゲルのｐＨは、好ましくは中性、すなわち６．５～８．０の範囲のｐＨである。
【0154】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の食品成分としての使用に関する。ホエイタンパク質加水分解物は、食品成分としていずれのタイプの食品にも加えることができる。好ましくは、本発明のホエイタンパク質加水分解物は、冷たい飲料又は温かい飲料の調製において食品成分として使用される。
【0155】
本発明の一実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、６．５～８．５の範囲のｐＨを有するＵＨＴ安定飲料の調製において食品成分として使用される。
【0156】
本発明の別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、スポーツ栄養に使用される飲料の調製において食品成分として使用される。本発明の文脈では、「スポーツ栄養」という用語は、運動又はトレーニングに関連して、すなわち筋肉量を増やすのに適した栄養を指す。
【0157】
本発明のさらに別の実施形態では、ホエイタンパク質加水分解物は、臨床用飲料の調製において食品成分として使用される。本発明の文脈では、「臨床用飲料」という用語は、臨床的又は医学的な効能効果を有する飲料を指す。例えば、臨床用飲料は、健康に関連する効果を有する可能性がある。臨床用飲料は、典型的には、栄養に関して問題がある入院患者若しくは高齢者、又は病的状態から回復するために予め消化されたタンパク質を必要とする個人によって使用される。例えば、臨床用飲料は、栄養失調又は吸収不良に苦しむ個人に使用される飲料でありうる。また、臨床用飲料はまた、胃腸疾患を患っている個人のためでありうる。本文脈の文脈では、「臨床用飲料」及び「医療用飲料」という用語は、同じ意味を有する。
【0158】
臨床用飲料は、例えば、本発明のホエイタンパク質加水分解物を、２～２０重量％の加水分解ホエイタンパク質を含む飲料に相当する量で含みうる。臨床用飲料は、炭水化物を飲料の５～５０重量％の量で含むことができる。炭水化物の量は、例えば、１５～３５重量％など１０～４０重量％の範囲でありうる。臨床用飲料はまた、脂肪を含むことができる。例えば、臨床用飲料の脂肪含有量は、３～２０重量％などの２～３０重量％、より好ましくは３～１８重量％の範囲でありうる。
【0159】
一例では、臨床用飲料は、４～１０重量％の量に対応する本発明による加水分解ホエイタンパク質、３～１５重量％の脂肪及び１０～３５重量％の炭水化物を含む。
【0160】
臨床用飲料は、好ましくは中性のｐＨ値、すなわち６．５～８．０の範囲のｐＨを有する。
【0161】
臨床用飲料は、透明な飲料、ミルク様の（milky）飲料、チューブフィードの形態であってもよく、液体中に再溶解される粉末の形態であってもよい。
【0162】
一実施形態では、本発明のホエイタンパク質加水分解物はまた、ジュースタイプ（juice-style）飲料の調製にも使用することができる。ジュースタイプ飲料は、好ましくは、４～１０重量％のタンパク質に相当する量の本発明による加水分解ホエイタンパク質、０～１重量％の脂肪及び１５～３５重量％の炭水化物を含む。
【0163】
臨床用飲料がチューブフィードの形態である場合、それは、４～１５重量％の本発明による加水分解ホエイタンパク質、約５～３５重量％の炭水化物及び約３～１５重量％の脂肪を含むことができる。
【0164】
本発明によるホエイタンパク質加水分解物はまた、乳児用粉ミルクなどの乳児栄養にも使用することができる。本発明の文脈では、「乳児用粉ミルク」という用語は、フォローオン（follow-on）粉ミルク、グローイングアップ（growing-up）粉ミルク及び早産児用（preterm）粉ミルクを含む、いずれのタイプの乳児用粉ミルクも指す。
【0165】
本発明によるホエイタンパク質加水分解物が乳児用粉ミルクに使用される場合、乳児用粉ミルクのタンパク質含有量は１．６～５．０ｇ／１００ｋｃａｌの範囲である。乳児用粉ミルクは、ホエイタンパク質加水分解物の他に、ラクトースなどの炭水化物、オリゴ糖、脂質、ビタミン及びミネラルを含みうる。
【0166】
本発明によるホエイタンパク質加水分解物はまた、乳児用粉ミルク以外の他の乳児用栄養物、例えば、スムージー、ポリッジなどの調製に使用することもできる。
【0167】
本発明のホエイタンパク質加水分解物はまた、エマルションの調製にも使用することができる。エマルションは、典型的には、ホエイタンパク質加水分解物の粉末を、液体、例えば水又は乳、及び脂肪に再溶解させることによって調製されることになる。ホエイタンパク質加水分解物は、水及び脂肪に対して乳化作用を有することになる。粉末は、典型的には、ホエイタンパク質加水分解物を５～１５重量％のタンパク質に相当する量で含む。再溶解後、エマルションはタンパク質を２～４重量％の量で含む。
【0168】
タンパク質の加水分解は、荷電基の数の増加、平均分子量の減少、反応性基の露出などのタンパク質の変化を引き起こす。このことは、タンパク質加水分解物のエマルション形成能及びエマルション安定化能に影響を与える因子である。本発明のホエイタンパク質加水分解物は、他の成分と組み合わせることによって乳化剤、安定剤などとして使用することができる。
【0169】
本発明のホエイタンパク質加水分解物はまた、ベーカリー製品、例えばビスケット、クッキー及びクラッカーにも使用することができる。
【0170】
さらなる態様では、本発明は、抗酸化剤としての本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用に関する。本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明のホエイタンパク質加水分解物が抗酸化効果を有することを見出した。したがって、ホエイタンパク質加水分解物は、抗酸化ペプチドの供給源として栄養関連組成物に使用することができる。
【0171】
したがって、本発明は、抗酸化効果を有する本発明のホエイタンパク質加水分解物に関する。より詳細には、本発明は、１．５重量％のタンパク質を含む溶液中の消去率が５４から６０であることによって画定される抗酸化効果を有するホエイタンパク質加水分解物に関する。消去率は、ＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリル－ヒドラジル水和物）アッセイによって測定される。消去率は、１００ｘ（Ａ０－ＡＳ）／Ａ０として計算され、式中、Ａ０は試料非存在下での吸光度であり、ＡＳは試料存在下での吸光度である。
【0172】
本発明の１つの態様の文脈で説明された実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意すべきである。
【0173】
本出願で引用されている特許及び非特許文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0174】
本発明を、以下の非限定的な例でさらに詳細に説明する。
【実施例】
【0175】
実施例１：分析の方法
実施例１．１：加水分解度（ＤＨ）の求め方
加水分解度（ＤＨ）は、加水分解によって切断されたペプチド結合の割合として定義され、下記の式（１）を参照されたい。ＤＨ値は、利用可能なペプチド結合の数に関連して形成されるペプチドの数についての情報を与える。
実施例１．１：加水分解度（ＤＨ）の求め方
加水分解度（ＤＨ）は、加水分解によって切断されたペプチド結合の割合として定義され、下記の式（１）を参照されたい。ＤＨ値は、利用可能なペプチド結合の数に関連して形成されるペプチドの数についての情報を与える。
【0176】
ホエイタンパク質加水分解物のＤＨは、Adler-Nissen, J. Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem. 27, 1256-1262 (1979)及びNielsen, P. M., Petersen, D. & Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J. Food Sci. 66, 642-646 (2001)に記載のように測定した。式（１）において、ｈは切断されたペプチド結合の数を表し、ｈｔｏｔａｌは利用可能なペプチド結合の総数を表す。したがって、ＤＨは、切断されたペプチド結合の割合を与える。
式（１）：ＤＨ＝（遊離ｆｒｅｅアミノ末端の数）／（利用可能なペプチド結合の総数）・１００％＝ｈ／ｈｔｏｔａｌ・１００％
式（１）：ＤＨ＝（遊離ｆｒｅｅアミノ末端の数）／（利用可能なペプチド結合の総数）・１００％＝ｈ／ｈｔｏｔａｌ・１００％
【0177】
加水分解後に形成された遊離α－アミノ基は、ｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）と反応し、黄色の錯体を形成し、その錯体は３４０ｎｍの光を吸収するので分光光度的に測定することができる。この色形成に基づいて、ＤＨを計算することができる。
【0178】
加水分解物を適当な濃度（０．０３～０．０８％のタンパク質）で水に再懸濁し、２体積を１５体積のＯＰＡ試薬（１００ｍＭ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、６ｍＭ ＤＬ－ジチオレイトール，６ｍＭ ｏ－フタルアルデヒド、及び２％エチルアルコール）と２５℃で２分間反応させた。同様の反応を行ってＬ－セリンの濃度系列を作成した。次に、３４０ｎｍでの吸光度（Ａ３４０）を測定し、ＯＰＡと水の反応からのＡ３４０シグナルを差し引いた。真のＤＨを求めるために、上清中で測定されたセリン当量を、上述のＯＰＡ法と同じ応答を与えるトリニトロベンゼンスルホン酸法についてＡｄｌｅｒ－Ｎｉｓｓｅｎ（Adler-Nissen J; Agricultural and Food Chemistry, 1979 27 (6) 1256）によって提案されたように補正した。ホエイタンパク質加水分解物に用いた因数は、ａ＝１、ｂ＝０．４、ｈｔｏｔａｌ＝８．８であった。
【0179】
実施例１．２：濁度の測定
ホエイタンパク質加水分解物の比濁法濁度は、透明度と透き通りの度合いに関する測定値として用いられる。測定された比濁法濁度が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において１００ＮＴＵ未満の場合、試料は透き通っていると認識される。さらに、測定された比濁法濁度が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において４０ＮＴＵ未満の場合、試料は透明であると認識される。
ホエイタンパク質加水分解物の比濁法濁度は、透明度と透き通りの度合いに関する測定値として用いられる。測定された比濁法濁度が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において１００ＮＴＵ未満の場合、試料は透き通っていると認識される。さらに、測定された比濁法濁度が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において４０ＮＴＵ未満の場合、試料は透明であると認識される。
【0180】
比濁法濁度を測定する場合、試料を５つの異なる濃度のタンパク質、１．８％、３．２％、４．８％、６．４％及び８％に希釈し、比濁法濁度をメルクのＴｕｒｂｉｑｕａｎｔ ３０００ ＩＲを用いて測定する。
【0181】
実施例１．３：総タンパク質の求め方
試料の総タンパク質含量（タンパク質換算）は以下によって求める。
１）ISO 8968-1/2IIDF 020-1/2-Milk - Determination of nitrogen content - Part 172: Determination of nitrogen content using the Kjeldahl methodに従って試料の全窒素を測定すること。
２）タンパク質の総量をＮｘ６．３８として算出すること。
試料の総タンパク質含量（タンパク質換算）は以下によって求める。
１）ISO 8968-1/2IIDF 020-1/2-Milk - Determination of nitrogen content - Part 172: Determination of nitrogen content using the Kjeldahl methodに従って試料の全窒素を測定すること。
２）タンパク質の総量をＮｘ６．３８として算出すること。
【0182】
実施例１．４：アミノ酸含有量の測定
アミノ酸組成の分析は、アミノ酸補給の源としてのタンパク質加水分解物についての詳細な情報を与える。
アミノ酸組成の分析は、アミノ酸補給の源としてのタンパク質加水分解物についての詳細な情報を与える。
【0183】
全アミノ酸含有量は、ＩＳＯ１３９０３：２００５、ＥＵ１５２／２００９の方法で測定した。試料を塩酸水溶液中で加水分解して試料中のペプチド結合を切断した。加水分解後、試料をｐＨ調整し、容量まで増量し、濾過した。アミノ酸をアミノ酸分析装置で分離し、ニンヒドリン試薬を使用したポストカラム誘導体化を用いて検出を行い、４４０ｎｍ及び５７０ｎｍで測定した。定量化では、１点検量線を用いた。品質保証のため、自家（in-house）標準物質をすべての分析実行で分析した。
【0184】
システイン及びメチオニンは、アミノ酸分析装置で分析する前に酸化しなければならない。試料は、過酸化水素とギ酸を用いて低温で酸化し、続いて塩酸水溶液を用いて酸加水分解した。酸化のプロセスはメチオニン及びシステインを酸化し、加水分解中の損失を防ぐ。加水分解後、試料を上記のように分析した。
【0185】
総トリプトファンの定量：トリプトファンはタンパク質の酸加水分解時に破壊されるので、他のアミノ酸と同じやり方で定量できないので、別の方法を使用して分析した。代わりに、試料をアルカリ処理によって加水分解し、ＨＰＬＣ分析で定量した。
【0186】
それぞれのアミノ酸の結果は、検出されたアミノ酸の総量に対して正規化する［ｇ／１００ｇアミノ酸］。
【0187】
実施例１．５：遊離アミノ酸含有量の測定
ホエイタンパク質加水分解物中の遊離アミノ酸は、R. Schuster, "Determination of Amino Acids in Biological, Pharmaceutical, Plant and Food Samples by Automated Precolumn Derivatization and HPLC", Journal of Chromatography, 431:271-284 (1988) and Henderson, J.W., Ricker, R.D. Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C., "Rapid, Accurate, Sensitive及びReproducible HPLC Analysis of Amino Acids, Amino Acid Analysis Us-ing Zorbax Eclipse-AAA columns and the Agilent 1100 HPLC," Agilent Publication, 2000の方法で測定する。
ホエイタンパク質加水分解物中の遊離アミノ酸は、R. Schuster, "Determination of Amino Acids in Biological, Pharmaceutical, Plant and Food Samples by Automated Precolumn Derivatization and HPLC", Journal of Chromatography, 431:271-284 (1988) and Henderson, J.W., Ricker, R.D. Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C., "Rapid, Accurate, Sensitive及びReproducible HPLC Analysis of Amino Acids, Amino Acid Analysis Us-ing Zorbax Eclipse-AAA columns and the Agilent 1100 HPLC," Agilent Publication, 2000の方法で測定する。
【0188】
遊離アミノ酸は、アミノ酸を水溶液又は酸性溶液に抽出することによって測定する。試料は、分子量濾過によってタンパク質を除去してもよい。試料は、注入前に誘導体化した後にＨＰＬＣによって分析される。注入前に、一級アミノ酸をｏ－フタルアルデヒドで誘導体化し、二級アミノ酸をフルオレニルメチルクロロフォメートで誘導体化する。結果は次のように示す：
［ｍｇ遊離アミノ酸／１００ｇホエイタンパク質加水分解物粉末］
［ｍｇ遊離アミノ酸／１００ｇホエイタンパク質加水分解物粉末］
【0189】
実施例１．６：ホエイタンパク質加水分解物中のペプチド分布の測定方法
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ホエイタンパク質加水分解物中のペプチドの分子量分布を分析した。ＳＥＣは、ポリマータイプの分子をサイズによって分離するのに使用される。異なるサイズの成分、ここではペプチドの混合物をＳＥＣによって分離することができる。溶出時間が分子の大きさに依存する。分子が小さければ小さいほど、溶出時間は長くなる。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ホエイタンパク質加水分解物中のペプチドの分子量分布を分析した。ＳＥＣは、ポリマータイプの分子をサイズによって分離するのに使用される。異なるサイズの成分、ここではペプチドの混合物をＳＥＣによって分離することができる。溶出時間が分子の大きさに依存する。分子が小さければ小さいほど、溶出時間は長くなる。
【0190】
試料を移動相に溶かし、０．５％（重量／体積）の濃度にした。注入前に、試料を０．４５μｍのフィルターでろ過した。直列に結合した３本のＴＳＫ Ｇ２０００ ＳＷＸＬ（１２５Å、５μｍ、７．５ｍｍ×３００ｍｍ）カラムでクロマトグラフィー分離を行った。０．０３７５Ｍリン酸緩衝液、０．３７５Ｍ塩化アンモニウム、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及び２５％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）のバッファーを移動相として使用し、毎分０．７ｍＬの流量とした。２１４ｎｍで測定するＵＶ検出器を使用して、ペプチドの検出を行った。
【0191】
保持時間に基づいて、ペプチドの分布をサイズに応じて分け、分子量に応じて相対量を得た。
【0192】
実施例２：酵素の組み合わせのスクリーニング
ホエイタンパク質の酵素加水分解に使用するために、合計で５５組のことなる酵素の組み合わせを試験した。得られたホエイタンパク質加水分解物を、透明度、苦み、加水分解度、及びペプチド組成に関して分析した。加水分解の試験は０．５リットルのスケールで行った。
ホエイタンパク質の酵素加水分解に使用するために、合計で５５組のことなる酵素の組み合わせを試験した。得られたホエイタンパク質加水分解物を、透明度、苦み、加水分解度、及びペプチド組成に関して分析した。加水分解の試験は０．５リットルのスケールで行った。
【0193】
さまざまな酵素の組み合わせを試験するのに使用した酵素は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．６２）、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、微生物由来のトリプシン様プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．４）、アスペルギルス属由来のアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．２８）、アナナス・コモサス（ブロメライン）由来のエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．３２）、アスペルギルス・ニガー由来のプロリン特異的エンドペプチダーゼ（ＥＣ： ３．４．２１．２６）、アスペルギルス・オリゼー由来のアミノペプチダーゼ調製物（ＥＣ３．４．１１）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のメタロエンドペプチダーゼ調製物（ＥＣ３．４．２４）及びバチルス・アミロリクエファシエンス由来のエンドペプチダーゼ調製物（ＥＣ３．４）であった。
【0194】
実験に使用した酵素調製物は以下のものであった。
バチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）及びバシロライシンを含むプロタメックス（ノボザイムズ社）
プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤ（天野エンザイム社）、アスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼを含む
Ｐｒｏｍｏｄ ７８２ ＭＤＰ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、アスペルギルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼを含む
Ｆｏｒｍｅａ ＴＬ １２００ ＢＧ（ノボザイムズ社）、微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む
Ｐｒｏｍｏｄ ９５０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、バチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）及びバシロライシンを含む
フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧ（ノボザイムズ社）、アスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む
アルカラーゼ ＡＦ ２．４Ｌ（ノボザイムズ社）、バチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）を含む
ニュートラーゼ ｃｏｎｃ ＢＧ（ノボザイムズ社）、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のメタロエンドペプチダーゼ（バシロライシン）を含む
Ｐｒｏｍｏｄ ５２３ ＭＤＰ（ブロメライン）（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、アナナス・コモサス由来のシステインエンドペプチダーゼを含む
Ｍａｘｉｐｒｏ ＰＳＰ（ＤＳＭ）、アスペルギルス・ニガー由来のプロリン特異的エンドペプチダーゼ
Ｆｌａｖｏｒｐｒｏ ７６６（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ社）、アスペルギルス・オリゼー由来のアミノペプチダーゼを含む
サモアーゼ ＰＣ１０Ｆ（天野エンザイム社）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のメタロエンドペプチダーゼを含む
プロチン ＮＹ１００（天野エンザイム社）、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のエンドペプチダーゼを含む
バチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）及びバシロライシンを含むプロタメックス（ノボザイムズ社）
プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤ（天野エンザイム社）、アスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼを含む
Ｐｒｏｍｏｄ ７８２ ＭＤＰ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、アスペルギルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼを含む
Ｆｏｒｍｅａ ＴＬ １２００ ＢＧ（ノボザイムズ社）、微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む
Ｐｒｏｍｏｄ ９５０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、バチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）及びバシロライシンを含む
フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧ（ノボザイムズ社）、アスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む
アルカラーゼ ＡＦ ２．４Ｌ（ノボザイムズ社）、バチルス・リケニフォルミス由来のセリンエンドペプチダーゼ（サブチリシン）を含む
ニュートラーゼ ｃｏｎｃ ＢＧ（ノボザイムズ社）、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のメタロエンドペプチダーゼ（バシロライシン）を含む
Ｐｒｏｍｏｄ ５２３ ＭＤＰ（ブロメライン）（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）、アナナス・コモサス由来のシステインエンドペプチダーゼを含む
Ｍａｘｉｐｒｏ ＰＳＰ（ＤＳＭ）、アスペルギルス・ニガー由来のプロリン特異的エンドペプチダーゼ
Ｆｌａｖｏｒｐｒｏ ７６６（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ社）、アスペルギルス・オリゼー由来のアミノペプチダーゼを含む
サモアーゼ ＰＣ１０Ｆ（天野エンザイム社）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のメタロエンドペプチダーゼを含む
プロチン ＮＹ１００（天野エンザイム社）、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のエンドペプチダーゼを含む
【0195】
５５組の酵素の組み合わせをホエイタンパク質の加水分解に用いた。加水分解の基質として、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）（アーラ・フーズ・イングレディエンツ（Arla Food Ingredients）製のＬａｃｐｒｏｄａｎ ＤＩ－９２２４）の溶液を使用した。すべての実験でＷＰＩの溶液は、８重量％のタンパク質濃度を有した。加水分解反応は、５０℃で、ｐＨスタットをｐＨ＝７とし、最初の酵素を加えてからの反応時間を６時間で行った。６時間の加水分解した後、９９℃に加熱して９０秒の保持時間で酵素を失活させることによって 加水分解を停止させた。使用した酵素の量は、タンパク質１００ｇ当たりの酵素のグラム単位の量として表１に記載されている。各加水分解試験の生成物を凍結乾燥し、（濁度測定の形での）透明度、加水分解度、並びに味の評価及び採点することを含むさらなる分析に使用した。その結果を下の表１に示す。
ＮＥＵ：ニュートラーゼを指す。
ＦＺ：フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧを指す。
Ａｌｃａ：アルカラーゼ ＡＦ ２．４Ｌを指す。
ＰＡ：プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤを指す。
ＦＴＬ：Ｆｏｒｍｅａ ＴＬ １２００ ＢＧを指す。
ＰＭ７８２：Ｐｒｏｍｏｄ ７８２ ＭＤＰを指す。
ＦＰ７６６：Ｆｌａｖｏｕｒｐｒｏ ７６６を指す。
ＭＰ ＰＳＰ：Ｍａｘｉｐｒｏ ＰＳＰを指す。
ＴＨＥＲ：サモアーゼ ＰＣ１０Ｆを指す。
ＰＲＯ：プロチン ＮＹ１００を指す。
ＰＭ９５０：Ｐｒｏｍｏｄ ９５０Ｌを指す。
ＰＴＭ：プロタメックスを指す。
ＮＥＵ：ニュートラーゼを指す。
ＦＺ：フレーバーザイム ｃｏｎｃ ＢＧを指す。
Ａｌｃａ：アルカラーゼ ＡＦ ２．４Ｌを指す。
ＰＡ：プロテアーゼ Ａ アマノ ２ ＳＤを指す。
ＦＴＬ：Ｆｏｒｍｅａ ＴＬ １２００ ＢＧを指す。
ＰＭ７８２：Ｐｒｏｍｏｄ ７８２ ＭＤＰを指す。
ＦＰ７６６：Ｆｌａｖｏｕｒｐｒｏ ７６６を指す。
ＭＰ ＰＳＰ：Ｍａｘｉｐｒｏ ＰＳＰを指す。
ＴＨＥＲ：サモアーゼ ＰＣ１０Ｆを指す。
ＰＲＯ：プロチン ＮＹ１００を指す。
ＰＭ９５０：Ｐｒｏｍｏｄ ９５０Ｌを指す。
ＰＴＭ：プロタメックスを指す。
【0196】
表１に提示の試験に使用した酵素は、９６ウェルスケールでの試験に基づいて、より多くの酵素の中から選択した。これらの試験には、さまざまな酵素の組み合わせによる加水分解と、見かけの透明度の目視による採点と熱安定性と加水分解（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が含まれていた。ｐＨスタットの加水分解と分析のための大量の材料を可能にするために、表１に示した組み合わせは、上記のように５００ｍｌスケールで行った。そのため、表１に示した酵素はランダムに選択されたものではない。表１の酵素の組み合わせのいくつか（例えば組み合わせ１～３）は、異なる量で繰り返した。
【0197】
表１中の「Ｖｉｓｕａｌ ａ ｉｎａｃｔ．」という用語は、「失活後の見た目」を指す。
【0198】
表１
【表1】
【0199】
各ホエイタンパク質加水分解物についてデータを評価した。肯定的な評価には、以下の条件が満たされるべきである。
－酵素の失活後の見た目が透明
－１５％を超える、好ましくは２０％を超える高い加水分解度を有すること
－４％（重量／重量）タンパク質溶液において苦みを有しないこと
－２５重量％以下のペプチドが２５００Ｄａを超える分子量を有するべきである。
－酵素の失活後の見た目が透明
－１５％を超える、好ましくは２０％を超える高い加水分解度を有すること
－４％（重量／重量）タンパク質溶液において苦みを有しないこと
－２５重量％以下のペプチドが２５００Ｄａを超える分子量を有するべきである。
【0200】
試料は９９℃で９０秒後に透明であるべきである。これはＵＨＴ安定性（４％溶液の１４３℃での６秒間の処理の後に安定で透明）を示すからである。
【0201】
したがって、上記の表から、５５組の酵素の組み合わせのうち４つの試料、すなわち試料４、１０、１１及び３０と呼ばれる試料が条件を満たしていることがわかる。
【0202】
試料４は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びトリプシン様プロテアーゼの酵素の組み合わせを用いた加水分解によって得られた。
【0203】
試料１０は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、バチルス属由来のメタロエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼの酵素の組み合わせを用いた加水分解によって得られた。
【0204】
試料１１は、バチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、アスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを用いた加水分解によって得られた。
【0205】
試料３０は、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、ブロメライン及びアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを用いた加水分解によって得られた。
【0206】
実施例３：本発明によるホエイタンパク質加水分解物のさらなる分析
透明度、味、加水分解度及びペプチド分布の条件を満たした実施例２の４つのホエイタンパク質加水分解物をさらに分析し、下表に試料１～４（Ｓ１～Ｓ４）として挙げた。
透明度、味、加水分解度及びペプチド分布の条件を満たした実施例２の４つのホエイタンパク質加水分解物をさらに分析し、下表に試料１～４（Ｓ１～Ｓ４）として挙げた。
【0207】
試料５～１２（Ｓ５－Ｓ１２）は、他の酵素の組み合わせを用いた加水分解からのホエイタンパク質加水分解物である。
【0208】
試料１３（Ｓ１３）は、バチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシン（アルカラーゼ）とバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン（ニュートラーゼ）の組み合わせによるスイートホエイの加水分解、それに続く限外濾過、活性炭での処理、及び活性炭を除去するための精密濾過（国際公開第１９９３／０２４０２０Ａ１号に記載）によって得られた噴霧乾燥ＷＰＩ加水分解物である。加水分解度は約２５％である。
【0209】
試料１４（Ｓ１４）は、試料４と同じ酵素の組み合わせ（本発明の酵素の組み合わせ）を使用することによって調製され、ＷＰＣが加水分解のための基質として使用されている。
【0210】
試料１５及び１６（Ｓ１５～Ｓ１６）は試料４の複製である。試料１５及び１６は、試料４と同じ条件を用いてＵＦ濾過なしで調製したＷＰＩをベースとする加水分解物である。
【0211】
さまざまな酵素の組み合わせを用いた酵素加水分解によって作られたホエイタンパク質加水分解物を、透明かどうかについて、加水分解度及び２５００Ｄａを超える分子量を有するペプチドの含有量及び３７５Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの含有量について再度分析した。
【0212】
試料の透明度（濁度）は実施例１．２による測定によって決定し、試料が透明であると認識されるには比濁法濁度が４０ＮＴＵ未満であるべきであり、試料が透き通っていると認識されるには１００ＮＴＵ未満であるべきである。
【0213】
４％のタンパク質以下で苦味が感じられた場合、試料を苦いと評価した。
【0214】
加水分解度を実施例１．１に記載の方法で測定し、一方で苦みはさまざまな濃度の試料（タンパク質濃度２％、４％、８％）を試食することによって測定した。ペプチドの分布は実施例１．５に記載のように測定した。その結果を表２に示す。
【0215】
表２：
【表2】
【0216】
したがって、表２から、本発明による特定の酵素の組み合わせを使用すると、ホエイタンパク質加水分解物は、１）２０％を超える加水分解度を有し、２）２５％未満のペプチドが２５００Ｄａ以上の分子量を有し、３）４％タンパク質以下の濃度で苦味を有しないことが示されている。
【0217】
さらに、表２は、ＷＰＩがタンパク質加水分解のために使用される場合、本発明の特定の酵素の組み合わせを使用すると、見た目が透明なホエイタンパク質加水分解物が得られることを示す。表２はまた、ＷＰＣが基質として使用されるホエイタンパク質加水分解物の調製における特定の酵素の組み合わせの使用は、２０％を超える加水分解度を有するホエイタンパク質加水分解物をもたらし、２５％未満のペプチドが２５００Ｄａ以上の分子量を有し、タンパク質が４％以下の濃度で苦味を有しないことを示す。しかし、ＷＰＣを基質として使用することによって調製したホエイタンパク質加水分解物は見た目が透明ではない（ＷＰＣに存在する脂質のため）。
【0218】
本発明の好ましい実施形態では、透明な加水分解物を得るのにＷＰＩがタンパク質加水分解の基質として使用される。
【0219】
実施例４：濁度分析
さらに、実施例３の試料１～１６のさまざまなタンパク質濃度における比濁法濁度を分析した。１００ＮＴＵ未満の濁度をもつ試料を透き通っているとし、４０未満の濁度をもつ試料を透明と認識される。下の表３は、さまざまなタンパク質濃度で測定した、実施例３で試料１～１２として挙げた加水分解物の濁度を示す。タンパク質濃度は、１．８％のタンパク質、３．２％のタンパク質、４．８％のタンパク質、６．４％のタンパク質、及び８％のタンパク質である。タンパク質濃度は重量％である。
さらに、実施例３の試料１～１６のさまざまなタンパク質濃度における比濁法濁度を分析した。１００ＮＴＵ未満の濁度をもつ試料を透き通っているとし、４０未満の濁度をもつ試料を透明と認識される。下の表３は、さまざまなタンパク質濃度で測定した、実施例３で試料１～１２として挙げた加水分解物の濁度を示す。タンパク質濃度は、１．８％のタンパク質、３．２％のタンパク質、４．８％のタンパク質、６．４％のタンパク質、及び８％のタンパク質である。タンパク質濃度は重量％である。
【0220】
濁度を測定する前に、ホエイタンパク質加水分解物の粉末を、示された濃度で少なくとも３０分間水和させた（ｎ＝３）。
【0221】
表３：１．８、３．２、４．８、６．４及び８％のタンパク質における試験試料の濁度（ＮＴＵ）
【表3】
【0222】
したがって、表３より、本発明による特定の酵素の組み合わせは、タンパク質８％の濃度で１００ＮＴＵ未満の濁度を有することが示されている。
【0223】
図１Ａ～Ｃには、試料１３、１４及び１６の実測濁度が示されている。図１Ａは、試料１３、１４及び１６のホエイタンパク質加水分解物の濁度を示しており、濁度の違いを示している。図１Ａは、限外濾過に供したホエイタンパク質加水分解物（本発明ではない、試料１３）は、非常に低い濁度（１ＮＴＵ未満）を有し、その加水分解物が最も透明であることが示す。特定の酵素の組み合わせの１つを用いて本発明による方法に従って調製した加水分解物（試料１６）は、８％のタンパク質濃度で１００ＮＴＵ未満の濁度を有し、したがって透き通っている。さらに、本発明の加水分解物は、４％のタンパク質濃度で４０ＮＴＵ未満の濁度を有し、したがって、４％のタンパク質濃度で透明と認識される。それに対して、ＷＰＣを基質として使用することによって本発明に従って調製したホエイタンパク質加水分解物（試料１４）は、１０００ＮＴＵを超える濁度を有し、したがって不透明であると認識される認識される。
【0224】
図１Ｂは、試料１６の濁度が、タンパク質濃度５％以下で４０ＮＴＵ未満であることをより明確に示している。
【0225】
図１Ｃは試料１４の濁度を示す。非常に低い濃度（約２％）でも、濁度が２０００ＮＴＵを超えることが示されている。試料１４は非常に不透明で透き通っていないと認識される。
【0226】
図２Ａ～Ｃは、透明な試料対不透明な試料を視覚的に示すように試料１３、１４及び１６の写真を含んでいる。試料は、左から右へ、８％、６．４％、４．８％、３．２％、及び１．８％のタンパク質で調製した。
【0227】
図２Ａは、試料１６が８％、６．４％、４．８％、３．２％及び１．８％のタンパク質で見た目が透明で透き通っていることを示している。
【0228】
図２Ｂは試料１４を示し、試料１４が１．８％の最も低いタンパク質でも見た目が不透明で透き通っていないことを示している。
【0229】
図２Ｃは試料１３を示し、試料１３は全ての濃度で見た目が透明で透き通っていることを示している。
【0230】
実施例５：カフェインに関連付けた苦みの評価
実施例５では、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の苦みを、ＷＰＩを本発明以外の酵素を用いて酵素加水分解（バチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシン（アルカラーゼ）及びバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン（ニュートラーゼ）による加水分解）によって作られたＵＦ濾過及び活性炭処理ホエイタンパク質加水分解物と比較して分析している。
実施例５では、本発明によるホエイタンパク質加水分解物の苦みを、ＷＰＩを本発明以外の酵素を用いて酵素加水分解（バチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシン（アルカラーゼ）及びバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン（ニュートラーゼ）による加水分解）によって作られたＵＦ濾過及び活性炭処理ホエイタンパク質加水分解物と比較して分析している。
【0231】
実施例３の試料１３、１５及び１６の味を比較するために官能評価を行った。
【0232】
官能パネルは、カフェイン溶液を参考として用いて苦みを検出及び定量化する訓練を受けた。この訓練でパネリストは、最初に、カフェインの濃度を増加させた溶液から構成される参照試料を提供された。パネリストは、１５ｃｍのスケールで未知の溶液に苦みスコアを付ける訓練を受けた。参照試料は、０．０２５％、０．０５％、０．１％のカフェインをそれぞれ含有する３つのカフェイン溶液からなっていた。参照試料の評価後、パネリストは加水分解物試料を４重量％のタンパク質溶液で、順不同で３回試飲し、参照溶液の苦みに基づいて試験溶液の苦みの強さをランク付けした。０．０２５％のカフェインを含む参照液は苦くないと感じられ、０．１％のカフェインを含む基準液は苦いと感じられた（苦さの１５ｃｍスケールで１３のスコア）。官能パネルには、評価に参加する７名のパネラーが含まれていた。
【0233】
さらに、パネルを使って、国際規格であるQuantitative Descriptive Profile ISO 13299:2016 2nd ed. 5.5, Annex F1-F6&H3に従って官能プロファイリングを実施した。訓練を受けた７人の評価者が評価に参加した。評価は３回の繰り返しで行った。使用した回答スケールは、連続ラインスケール（１５ｃｍ）であった。約２ｍｌの試料を常温で提供した。評価の間、赤色光を使用した。
【0234】
カフェインの苦みに関連付けた官能パネルによる苦みスコアを図３に示す。試験試料の苦みスコアをカフェインの濃度に対してプロットしている。３つの異なる濃度のカフェインの苦みと、実施例３の試料１３、１５及び１６の苦みスコアを図３に示す。
【0235】
図３は、試料１３（ＷＰＩの加水分解物だが、本発明の酵素の組み合わせによるものではなく、加水分解物を限外濾過し、活性炭で処理したもの）が、０．０９５％の最も高い相対的苦みを有することを示す。試料１５（本発明の酵素の組み合わせを用いたが、限外濾過及び活性炭処理を用いなかったＷＰＩの加水分解物）は、３つの生成物試料のうち、０．０５４％の最も低い相対的苦みを有した。カフェインに対する０．０６１％の相対的苦みを有する試料１６（試料１５と同様）の加水分解物にかなり近かった。
【0236】
したがって、本発明に従って調製された味が良いホエイタンパク質加水分解物（試料１５及び試料１６）の味は、０．０８％のカフェインよりも苦くなく、試料１３よりも苦くないと感じられた。
【0237】
実施例６：味のプロファイリング
試料１３、１５及び１６のホエイタンパク質加水分解物の味のプロファイルを評価する実施例を行った。味のプロファイリングは訓練を受けたパネルによって行われ、５つの属性を用いて、におい、口当たり、味に注目して試料間の違いを識別した。
試料１３、１５及び１６のホエイタンパク質加水分解物の味のプロファイルを評価する実施例を行った。味のプロファイリングは訓練を受けたパネルによって行われ、５つの属性を用いて、におい、口当たり、味に注目して試料間の違いを識別した。
【0238】
データを解析して、各属性について試料間の有意差を明らかにした。データの統計的評価を表４に示す。さらに、試料間の差を明らかにするために多重比較検定が用いられている。表４において、同じ文字が付いている試料は有意差がない。
【0239】
表４：官能スコア
【表4】
【0240】
＊＊＊ｐ＜０．００１ ダンカン検定。属性について異なる文字をもつ試料は、９５％水準で有意に異なる（ｐ＜０．０５）
【0241】
したがって、試料１５及び１６の苦みスコアは、試料１３の苦みスコアよりも小さい。
【0242】
表４に記載のデータは、レーダーチャートに表したものとして示すことができる。図４を参照されたい。レーダーチャートでは、におい（Ｏ）、口当たり（ＭＦ）、味（Ｔ）の属性が示されている。それぞれの官能属性の「高い」強度（'high' intensity）がプロットの外側に示され、「わずかな」強度（'little' intensity ）がプロットの中央に示される。それぞれの生成物には、図の下に示されている異なるラベルが付いている。例として、「Ｂｉｔｔｅｒ＿Ｔ」のデータを参照されたい。＊＊＊は、試料１３並びに試料１５及び１６のデータが有意に異なることを示している（ｐ＜０．００１）。
【0243】
味のプロファイルをレーダーチャートで表したものから、試料１３は試料１５及び１６とは味のプロファイルが大きく異なり、最も重要なことに、試料１５及び１６は苦みが少ないことが示されている。
【0244】
実施例７：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析とペプチドの切断パターン
液体試料中のペプチドは、質量分析によるペプチド分析とデータベース検索によって同定することができる。試料１、２、３、１３、１５及び１６をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析して、ペプチド配列とそれが由来するタンパク質を同定した。それぞれの試料に存在するペプチドを水に溶かし、Ｄｉｏｎｅｘ ｎａｎｏ－ＬＣシステムに注入し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ ＱＴＯＦ質量分析計でのＭＳ／ＭＳ分析を行った。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた検索を、ウシ由来のタンパク質配列が入っているカスタムメイドのデータベースに対して行った。分析の全体的な結果は表５に示されている。
液体試料中のペプチドは、質量分析によるペプチド分析とデータベース検索によって同定することができる。試料１、２、３、１３、１５及び１６をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析して、ペプチド配列とそれが由来するタンパク質を同定した。それぞれの試料に存在するペプチドを水に溶かし、Ｄｉｏｎｅｘ ｎａｎｏ－ＬＣシステムに注入し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ ＱＴＯＦ質量分析計でのＭＳ／ＭＳ分析を行った。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた検索を、ウシ由来のタンパク質配列が入っているカスタムメイドのデータベースに対して行った。分析の全体的な結果は表５に示されている。
【0245】
表５：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで同定されたタンパク質
【表5】
【0246】
＊グリコシル化依存性細胞接着分子１
＊＊ウシ血清アルブミン
＊＊ウシ血清アルブミン
【0247】
表５のデータにより、この分析が、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、β－カゼインを含む試料中の最も多く含まれているタンパク質に関して高い配列カバレッジをもたらすことが示された。さらに，各試料から同定されたペプチドの数も示されている。データセットはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に期待される品質であったので、より詳細な分析に有効であった（実施例９）。
【0248】
実施例８：苦みペプチドのＬＳ－ＭＳ／ＭＳ分析
最初に、ペプチドの分布を比較することによって、実施例７のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータが、ＳＥＣ分析（サイズ排除クロマトグラフィー）で得られたデータに対応することを確認した。ここでは、ＳＥＣデータをパーセンテージ数（所与の分子量のペプチドの数）に変換し、各加水分解物について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づいて算出した同じデータとともにプロットした（図５を参照）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのデータにはβ－ラクトグロブリンのペプチドのみが含まれていた、一方でＳＥＣ分析では試料中のすべてのタンパク質が含まれていた。
最初に、ペプチドの分布を比較することによって、実施例７のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータが、ＳＥＣ分析（サイズ排除クロマトグラフィー）で得られたデータに対応することを確認した。ここでは、ＳＥＣデータをパーセンテージ数（所与の分子量のペプチドの数）に変換し、各加水分解物について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに基づいて算出した同じデータとともにプロットした（図５を参照）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのデータにはβ－ラクトグロブリンのペプチドのみが含まれていた、一方でＳＥＣ分析では試料中のすべてのタンパク質が含まれていた。
【0249】
図５から、７～１９個のアミノ酸β－ラクトグロブリン由来のペプチドの数の７～１０個のアミノ酸の範囲にあるβ－ラクトグロブリン由来のペプチドと１１～１９個のアミノ酸の範囲にあるβ－ラクトグロブリン由来のペプチドの割合は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとＳＥＣを用いたときに同様であることが示されている。
【0250】
したがって、データがＳＥＣデータと同等であり、ＳＥＣ法は定量的であることから、図５に示すデータは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータセットの相異なるアミノ酸長の範囲のペプチドの数が、ペプチドの相対的な分布に関する定量的な情報を抽出するために使用できることを示している。さらに、図５により、試料１３（本発明外）は、本発明による加水分解物に比べて、ペプチドサイズが小さいペプチドがより多いことが示されている。
【0251】
試料１、２、３、１３、１５及び１６において、ペプチドの総数に対する割合としての、フェニルアラニンを含む検出可能なペプチドの量をＭＳ－ＬＣ／ＭＳで明らかにして解析した。その結果を図６に示す。
【0252】
いかなる理論にも縛られることなく、本発明の発明者らは、ペプチド中のフェニルアラニンの存在が苦みと相関し、フェニルアラニンの苦みは、そのアミノ末端又はカルボキシ末端が別のアミノ酸残基とのペプチド結合によってブロックされているとき増強されると考えている。例えば、苦みのあるホエイタンパク質加水分解物中で同定された苦みペプチドＹＰＦＰＧＰＩＰＮのフェニルアラニン残基は、主要な苦み決定因子であることが示唆されている（Liu. X.. Jiang. D.. and Peterson. D.G. Identification of Bitter Peptides in whey protein hydrolysate. J. Agric. Food Chem. 2014. 62: 5719-5725）。
【0253】
図６は、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン及びβ－カゼインに由来するペプチドの総数の割合としてペプチド中のフェニルアラニン含有量を示す。フェニルアラニンを含むペプチドの割合は、ペプチドサイズが９個未満のアミノ酸残基では、苦みの少ない加水分解物の方が低かった。したがって、試料１及び３の本発明によるホエイタンパク質加水分解物については、フェニルアラニンは、ペプチドサイズがより大きいペプチドに存在する。また、試料２、１５及び１６に代表される本発明によるホエイタンパク質加水分解物は、フェニルアラニンを含むペプチドの割合が低いが、さらに、試料２、１５及び１６は、ペプチドに結合しているフェニルアラニンの割合も全体的に低いことを示した。このことは、試料１、３及び１３よりも試料２、１５及び１６のほうが、遊離アミノ酸として存在するフェニルアラニンがより多く存在する可能性を示す。したがって、本発明による苦みの無いホエイタンパク質加水分解物の指標は、フェニルアラニンの大部分が、より大きいペプチドに存在しているか、又は遊離アミノ酸として存在しているということである。
【0254】
図７では、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン及びβ－カゼインからの５～１９個のアミノ酸のペプチドの割合が示されている。
【0255】
図７から、試料１３（本発明外）は、他の５つのホエイタンパク質加水分解物に比べて、小さいペプチド（５～９個のアミノ酸）をより多く含むことが示されている。いかなる理論にも縛られることなく、本発明の発明者らは、試料１３の加水分解物において、より小さいペプチドサイズのペプチドを含むフェニルアラニンの含有量がより多いことが、本発明による加水分解物である試料１、２、３、１５及び１６に比べて、試料１３の苦みが高い理由でありうると考えている。
【0256】
実施例９：ＳＥＣサイズ分布データ
試料１、２、３、１３、１５及び１６中のペプチドのサイズをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した。その結果を下の表６に示す。
試料１、２、３、１３、１５及び１６中のペプチドのサイズをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した。その結果を下の表６に示す。
【0257】
表６：試料１、２、３、１３、１５及び１６のホエイタンパク質加水分解物に関するＳＥＣサイズ分布データ、ＤＨ及び遊離アミノ酸（ＦＡＡ）含有量
【表6】
【0258】
サイズ排除クロマトグラフィーデータは、主にペプチド結合が吸収されると予想される２１４ｎｍでの測定によって取得しているので、このデータは遊離アミノ酸を正確に考慮に入れていない。
【0259】
したがって、遊離アミノ酸の含有量を異なる別の方法で測定した（実施例１０を参照）。試料１３の参照ホエイタンパク質加水分解物と比較して、本発明によるホエイタンパク質加水分解物は、遊離アミノ酸の含有量がより高い。しかし、小さいペプチドの含有量は、本発明のホエイタンパク質加水分解物よりも参照ホエイタンパク質加水分解物（試料１３）のほうが高い。例えば、７５０Ｄａ以下のペプチドの含有量は、試料１３では５０％を超える。それに対して、７５０Ｄａ以下のサイズを有する本発明のホエイタンパク質加水分解物のペプチドの含有量は４０％未満である。さらに、試料１３には、本発明のホエイタンパク質加水分解物と比べて、２５００Ｄａ以上のペプチドがより少なく含まれる。
【0260】
これらのデータを実施例８のデータと比較すると、試料２、１５及び１６のベータ－ラクトグロブリン、アルファ－ラクトアルブミン、ベータ－カゼインに由来するペプチドのフェニルアラニン含有量が全体的に低いのは、これらのフェニルアラニン残基がペプチドから遊離アミノ酸画分に放出されている結果であることが明らかになる。したがって、加水分解物の苦みを低減する方法は、全加水分解物の遊離アミノ酸画分にフェニルアラニンを特異的に濃縮する酵素の組み合わせを特定することでありうる。
【0261】
実施例１０：実測遊離アミノ酸含有量
本発明のホエイタンパク質加水分解物中の遊離アミノ酸含量を測定し、参照ホエイタンパク質加水分解物（本発明外）と比較した。その結果を下の表７に示す。
本発明のホエイタンパク質加水分解物中の遊離アミノ酸含量を測定し、参照ホエイタンパク質加水分解物（本発明外）と比較した。その結果を下の表７に示す。
【0262】
表７：遊離アミノ酸含有量（ｍｇ／１００ｇタンパク質（Ｎ×６．３８））
【表7】
【0263】
表７から、本発明のホエイタンパク質加水分解物中の遊離アミノ酸含有量は、総タンパク質含有量の４重量％～１４重量％であることが示されている。それに対して、参照加水分解物（試料１３）の遊離アミノ酸含有量は、総タンパク質含有量の約０．４重量％である。
【0264】
さらに、表７は、本発明のホエイタンパク質加水分解物中の遊離ロイシンの含有量が、試料１３中の遊離ロイシンよりもはるかに高いことを示している。本発明のホエイタンパク質加水分解物中の遊離ロイシンの含有量は、総タンパク質含有量の１～４重量％である。それに対して、試料１３の遊離ロイシンの含有量は、総タンパク質含有量の約０．１５重量％である。
【0265】
さらに重要なことには、実施例８及び９で示唆された遊離フェニルアラニンの濃度は、試料１、３及び１３よりも試料２、１５及び１６で高い。表８には、総アミノ酸含量に対する遊離アミノ酸の割合が示されている。
【0266】
表８：総アミノ酸のうちの遊離アミノ酸（％）
【表8】
【0267】
本発明のホエイタンパク質加水分解物の全ロイシン含有量のうちの遊離ロイシンの割合が、参照加水分解物（試料１３）よりもはるかに高いことは特に注目すべきである。
【0268】
重要なことには、表８は、試料２、１５及び１６の本発明によるホエイタンパク質加水分解物に関して、フェニルアラニンの６～１２％が遊離フェニルアラニンの形態であったことを示している。試料１及び３の本発明によるホエイタンパク質加水分解物では、フェニルアラニンは遊離の形態では見られなかった。
【0269】
実施例１１：本発明のホエイタンパク質加水分解物中のミネラルの含有量
試料１５及び１６中のミネラルの量を測定した。その結果を下の表９に示す。
試料１５及び１６中のミネラルの量を測定した。その結果を下の表９に示す。
【0270】
表９：ミネラルの含有量
【表9】
【0271】
表９は、ホエイタンパク質加水分解物のミネラル含有量の一例として、試料１５及び１６のミネラル含有量と濁度を示す。表９の生成物はすべて、２２℃で４％タンパク質溶液のｐＨが７．８である。
【0272】
実施例１２：加水分解物中の非分解ＢＳＡ
非分解のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の量を、本発明のホエイタンパク質加水分解物（試料１、２、３、４、１５及び１６）で測定した。
非分解のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の量を、本発明のホエイタンパク質加水分解物（試料１、２、３、４、１５及び１６）で測定した。
【0273】
ＢＳＡの含有量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びシグマアルドリッチ製の製品コードＡ２１５３のＢＳＡ標準を使用して推定した（図９Ａ）。２０％のウェルに載せたＢＳＡの量は、１０μｇの純粋なＢＳＡに相当した。図９Ｂに示したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの各ウェルに加えたタンパク質の総量は、５０μｇのタンパク質に相当した。タンパク質試料を、１０ｍｇ／ｍｌのＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー及び２－メルカプトエタノールと混ぜ、タンパク質の最終濃度を３％にした後、９５℃で５分間インキュベートしてからゲルに載せた。
【0274】
図９ＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、図９ＢのＢＳＡがホエイタンパク質の総量の２０％、１０％、５％、２．５％、１．２５％又は０．６３％に当たる場合に予想される強度を示す滴定系列である。さまざまな濃度の標準のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ホエイタンパク質加水分解物のさまざまな試料を用いた図９Ｂに示したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルと比較した。左から右に、分子量標準、試料２、試料１、試料３、試料４、試料１５及び試料１６である。
【0275】
図９Ｂのバンドの強度が、図９Ａの０．６３％及び１．２５％の試料の強度に相当しているので、図９Ａ及び図９Ｂから、本発明のホエイタンパク質加水分解物（図９Ｂ）中の非分解ＢＳＡは０．５～２重量％の範囲にあると結論づけることができる。ＢＳＡは、本発明に従って使用される酵素によるタンパク質分解に対して耐性があった。
【0276】
実施例１３：スポーツ栄養のためのＵＨＴ処理飲料
実施例１３は、スポーツ栄養に使用するのに適した飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。その飲料は、アスリートによって、又はその他のスポーツ又は運動関連の用途で使用されることを意図している。
実施例１３は、スポーツ栄養に使用するのに適した飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。その飲料は、アスリートによって、又はその他のスポーツ又は運動関連の用途で使用されることを意図している。
【0277】
試料１６の粉末を水に再溶解させ、糖と風味料を加えて飲料を調製した。成分の量を下の表１０に示す。
【0278】
表１０は、さらなる濁りを発生させることなく、直接及び間接的なＵＨＴ処理による加熱処理も、低温殺菌も可能であった、不快な苦味のない偏らない味（neutral tasting）の飲料を示す。
【0279】
表１０：スポーツ飲料
【表10】
【0280】
表１０に示したスポーツ飲料を、１）直接ＵＨＴ、２）間接ＵＨＴ、及び３）低温殺菌に供した。直接ＵＨＴ処理は１４３℃で６秒間噴射して行った。間接ＵＨＴ処理は管状熱交換器で１４３℃にて６秒間行った。低温殺菌は９０℃で６．５分であった。飲料は５℃のフラスコに流し入れた。溶液はすべて、ｐＨが２２℃で約７．７であった。４．９ｇ／１００ｇの含有量の本発明のホエイタンパク質加水分解物は、４．０重量％のタンパク質に相当する。
【0281】
図８には、左から右に向かって、非処理飲料、直接ＵＨＴ処理飲料、間接ＵＨＴ処理飲料及び低温殺菌飲料の写真が示されている。飲料は室温である。図８は、すべての試料が透明で透き通り、ボトルの後ろの背景が見えることを示している。
【0282】
４つの飲料の比濁法濁度を測定し、その結果を表１１に示す。
【0283】
表１１：ＮＴＵで測定した飲料の濁度
【表11】
【0284】
したがって、表１１から、加熱処理した試料の濁度はすべて１００ＮＴＵ未満であったことが示されている。したがって、加熱処理は飲料の濁度に影響を与えず、見た目は透明又は透き通っていた。
【0285】
これらの飲料は、苦いとは感じられなかった。
【0286】
実施例１４：臨床／医療使用のための飲料
実施例１４は、医療又は臨床栄養に使用するのに適した飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例である。この臨床用飲料は、本発明のホエイタンパク質加水分解物からのほかに、多量の炭水化物を含む。
実施例１４は、医療又は臨床栄養に使用するのに適した飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例である。この臨床用飲料は、本発明のホエイタンパク質加水分解物からのほかに、多量の炭水化物を含む。
【0287】
試料１６の粉末を水に再溶解し、炭水化物と風味料を加えて飲料を調製した。成分の量を下の表１２に示す。
【0288】
表１２は、不快な苦味のない偏らない味の医療用飲料を示す。
【0289】
表１２：医療用飲料
【表12】
【0290】
実施例１５：炭酸飲料
実施例１５は、炭酸飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。
実施例１５は、炭酸飲料の調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。
【0291】
試料１６の粉末を水に再溶解させ、糖と風味料を加えて飲料を調製した。成分の量を下の表１３に示す。飲料１体積あたり２．５体積の二酸化炭素を含むようになるまで飲料に二酸化炭素を加えることによって、飲料を炭酸化した。
【0292】
表１３：炭酸飲料
【表13】
【0293】
実施例１６：炭酸化 － 炭酸化の量はどのようにｐＨに影響するか
試料１６を水に懸濁させて、８％タンパク質溶液を作った。溶液を５℃で強制的に炭酸化した。
試料１６を水に懸濁させて、８％タンパク質溶液を作った。溶液を５℃で強制的に炭酸化した。
【0294】
質量増加と溶液のｐＨ値を、ＣＯ２をより多く導入しつつ経時的に測定した。容器内の平衡状態での圧力が約１バールに達すると、それ以上ＣＯ２を吸収することができなかった（強制炭酸下で使用した圧力は５℃で３バールであった）。
【0295】
図１０では、ｐＨの測定値が、炭酸溶液に加えたＣＯ２の量は依存するのを示している。図１０は、試料１６のホエイタンパク質加水分解物を含む溶液を、溶液１体積あたり０～４体積のＣＯ２含有量になるように炭酸化したとき、５．５～８．２５のｐＨになることを示している。炭酸化していない溶液のｐＨは、ｐ値が８．２５であり、炭酸化の量が増えるにつれてｐＨ値は下がった。
【0296】
図１０は、溶液１体積あたり約２．５体積（４．９ｇ／Ｌ）にＣＯ２を加えると、５℃でｐＨが８．２５から約６．０に下がったことを示している。
【0297】
また、図１０は、ｐＨは約５．５～６．０の最小値に達することを示している。したがって、溶液１体積あたり２．５体積を超える量のＣＯ２を加えても、ｐＨが約５．５～６．０より下に減少することはないと結論づけることができる。
【0298】
さらに、溶液や飲料のｐＨ値に対する炭酸化の影響を、溶液／飲料１体積あたり２．５体積のＣＯ２の量に炭酸化した以下の溶液／飲料のｐＨを測定することによって分析した。－ 試料１６を水に再懸濁して調製した４％タンパク質溶液
－ 試料１６を水に再懸濁して調製した８％タンパク質溶液
－ 試料１６を８％含む飲料
その結果を図１１に示す。
－ 試料１６を水に再懸濁して調製した８％タンパク質溶液
－ 試料１６を８％含む飲料
その結果を図１１に示す。
【0299】
試料１６を８％含む飲料は以下の成分を含む。
【0300】
【表14】
【0301】
図１１は、試料１６の４％及び８％の溶液並びに試料１６から調製した飲料はいずれも、溶液１体積あたり２．５体積のＣＯ２のＣＯ２含有量まで炭酸化したときに、約６．０のｐＨを有することを示している。
【0302】
実施例１７：炭酸溶液の加熱処理の分析
試料１６の８％タンパク質の溶液を、実施例１６に開示のように、溶液１体積あたり２．５体積のＣＯ２で炭酸化した。
試料１６の８％タンパク質の溶液を、実施例１６に開示のように、溶液１体積あたり２．５体積のＣＯ２で炭酸化した。
【0303】
その溶液を、データログ付きの密閉容器で９５℃の温度に熱した。加熱中のさまざまな時間に、温度、ｐＨ及び濁度を測定し、その結果を図１２に示す。
【0304】
図１２に示すように、炭酸化された生成物は、加熱中ずっと、及び９５℃で５分後、実測濁度及び目視検査で示されるように透明なままであった。ｐＨは加熱中ずっと６．２のままであった。これらのデータにより、炭酸製品は、低温殺菌や、本質的に最高１２０℃の温度で長時間、例えば２０分間の処理であるオートクレーブなどの処理に適しうることが示された。
【0305】
実施例１８：プロテインバー
実施例１８は、プロテインバーの調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。
実施例１８は、プロテインバーの調製における本発明によるホエイタンパク質加水分解物の使用の例を示す。
【0306】
表１４は、本発明のホエイタンパク質加水分解物（粉末）の含有量が５ｇ／１００ｇのプロテインバーの例である。
【0307】
表１４：プロテインバー
【表15】
【0308】
表１５には、プロテインバーの別の例が示されており、その例では、ホエイタンパク質加水分解物（粉末）の含有量が１３ｇ／１００ｇの量である。
【0309】
表１５：プロテインバー
【表16】
【0310】
実施例１９：ＤＰＰＨアッセイを用いた抗酸化活性の分析
本発明のホエイタンパク質加水分解物の抗酸化効果は、ラジカル消去能アッセイであるＤＰＰＨアッセイを使用することによって分析した。ＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル－水和物）の色は、抗酸化ペプチドと反応すると紫色から黄色に変化するので、ＤＰＰＨを使用することによってこのアッセイは抗酸化効果を測定する。
本発明のホエイタンパク質加水分解物の抗酸化効果は、ラジカル消去能アッセイであるＤＰＰＨアッセイを使用することによって分析した。ＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル－水和物）の色は、抗酸化ペプチドと反応すると紫色から黄色に変化するので、ＤＰＰＨを使用することによってこのアッセイは抗酸化効果を測定する。
【0311】
ＤＰＰＨをメタノールに溶かして０．２ｍＭの濃度にした。本発明のホエイタンパク質加水分解物（試料１６）をミリＱ水に分散さて、さまざまな濃度のタンパク質（０、０．８、１．５、２．５、３．０、４．０、５．０及び６．０％タンパク質）にし、等量（比率１：１）でＤＰＰＨと混ぜた。この混合物を２２℃で２時間インキュベートして、抗酸化活性の結果として黄色に発色させた。５２５ｎｍでの吸光度を測定し、１００×（Ａ０－ＡＳ）／Ａ０として消去率を計算した。式中、Ａ０は試料が非存在下での吸光度であり、ＡＳは試料存在下での吸光度である。
【0312】
表１６は、本発明のホエイタンパク質加水分解物（試料１６）のさまざま濃度に対する消去率を示す。
【0313】
表１６
【表17】
【0314】
表１６から、試料１６のホエイタンパク質加水分解物は、タンパク質０．８～６％の濃度でＤＰＰＨアッセイに含まれたとき、抗酸化活性を有することが示されている。表１６に示されるように、タンパク質の濃度が上がるにつれて、抗酸化活性は増加した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホエイタンパク質加水分解物を調製する方法であって、ａ）ホエイタンパク質を全固形分に対して少なくとも５０重量％の量で含むホエイタンパク質溶液を用意すること、
ｂ）前記ホエイタンパク質溶液を、以下の酵素の組み合わせ：
ｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ）少なくともバチルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス属由来のセリンエンドペプチダーゼ及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ）少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともブロメライン、及び少なくともアスペルギルス属由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
のうちのいずれか１つを使って行われる酵素加水分解に供すること、
ｃ）加水分解度（ＤＨ）が２０％以上のときに前記酵素を失活させることによって前記酵素加水分解を停止させてホエイタンパク質加水分解物を得ること
を含み、
ステップｃ）で得られた前記ホエイタンパク質加水分解物を限外濾過するステップを全く含まない方法。
【請求項2】
ステップｃ）で得られた前記ホエイタンパク質加水分解物を濃縮する、かつ／又は乾燥させるステップｄ）をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップａ）の前記ホエイタンパク質溶液が、脂質を全固形分に対して最大１０重量％の量で含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップｂ）の前記酵素加水分解が、４０℃～７５℃の範囲の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップｃ）の酵素の失活が、少なくとも８０℃、好ましくは８０℃～１３０℃の温度に加熱することによる請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記ホエイタンパク質溶液が、乳清タンパク質濃縮物、ホエイタンパク質濃縮物、乳清タンパク質分離物、及び／又はホエイタンパク質分離物を含む請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記ホエイタンパク質溶液が、タンパク質を前記ホエイタンパク質溶液の２重量％以上の量で含む請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記加水分解度（ＤＨ）が２０％～３５％の範囲にあるとき、ステップｃ）の前記酵素加水分解が、前記酵素を失活させることによって停止される請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
ステップｂ）の前記酵素加水分解が、以下の酵素の組み合わせ：ｉ．少なくともバチルス属の種由来のセリンエンドペプチダーゼ、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくとも微生物由来のトリプシン様プロテアーゼを含む組み合わせ、
ｉｉ．少なくともバチルス・リケニフォルミス由来のサブチリシン、少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のセリンエンドペプチダーゼ、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ、
ｉｉｉ．少なくともバチルス・アミロリクエファシエンス由来のバシロライシン、少なくともアナナス・コモサス由来のブロメライン、及び少なくともアスペルギルス・オリゼー由来のロイシルアミノペプチダーゼを含む組み合わせ
のうちのいずれか１つを使って行われる請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
ホエイタンパク質加水分解物であって、－遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
－少なくとも２０％の加水分解度を有し、
－２５００Ｄａ以上の分子量を有するペプチドをペプチドの総量の８～２５重量％の量で有し、
－遊離アミノ酸を、前記加水分解物の総アミノ酸含有量の１５重量％以下の量で有し、かつ
４％（重量／重量）タンパク質溶液において、０．０８％（重量／体積）以下のカフェインの溶液に相当する苦みスコアを有するホエイタンパク質加水分解物。
【請求項11】
前記加水分解度が２０％～３５％である請求項１０に記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項12】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、４％（重量／重量）タンパク質溶液において、１００以下の比濁法濁度（ＮＴＵ）を有する請求項１０又は１１のいずれかに記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項13】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、遊離アミノ酸を、前記加水分解物の総タンパク質含有量の２～１５重量％の量で含む請求項１０～１２のいずれかに記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項14】
前記ホエイタンパク質加水分解物が抗酸化活性を有する請求項１０～１３のいずれかに記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項15】
前記ホエイタンパク質加水分解物の前記抗酸化活性が、１．５重量％タンパク質溶液において５４～６０の消去率を有することとして測定される請求項１０～１４に記載のホエイタンパク質加水分解物。
【請求項16】
食品における請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項17】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、前記食品において、２～２５重量％の加水分解タンパク質に相当する量で使用される請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記食品が、乳製品、飲料、シェイク、ゲル、ショット及びフードバーからなる群より選択される請求項１６又は１７のいずれかに記載の使用。
【請求項19】
食品成分としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項20】
６．５～８．０のｐＨを有するＵＨＴ安定飲料の調製における食品成分としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項21】
スポーツ栄養として使用するための飲料の調製における食品成分としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項22】
臨床用飲料の調製における食品成分としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項23】
炭酸飲料の調製における成分としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項24】
酸化防止剤としての請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物の使用。
【請求項25】
請求項１０～１５のいずれかに記載の前記ホエイタンパク質加水分解物を含む炭酸飲料。
【国際調査報告】