特表 2022-534724 がんを治療するためのＰＲＧ４の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-03

(54)【発明の名称】がんを治療するためのＰＲＧ４の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20220727BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220727BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20220727BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220727BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20220727BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20220727BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220727BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 111

C07K14/78 ZNA

C07K16/28

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570319

(86)(22)【出願日】2020-06-03

(85)【翻訳文提出日】2022-01-25

(86)【国際出願番号】 US2020035841

(87)【国際公開番号】W WO2020247440

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/856,514

(32)【優先日】2019-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/013,427

(32)【優先日】2020-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511282830

【氏名又は名称】ルブリス，エルエルシー．

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ボンニ，シリン

(72)【発明者】

【氏名】サルカール，アヌシ

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，タンニン，エー．

(72)【発明者】

【氏名】サリバン，ベンジャミン，ディー．

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA02

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA34

4C084CA18

4C084CA53

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC411

4C084ZC412

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書で開示されるのは、ルブリシンとしても知られているＰＲＧ４糖タンパク質を使用して、がんを治療又は予防する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＲＧ４を患者に投与して、がんを治療するか又はがんの増殖若しくは進行を遅らせることを含む、患者の前記がんを治療するか又は前記がんの増殖若しくは進行を遅らせる方法。

【請求項2】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択される請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記がんが乳がんである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記がんが肝細胞がん腫である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記がんが、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ＰＲＧ４が、別の抗がん剤と関連して投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗がん剤が、ＰＲＧ４なしで単独で投与される場合にがんを治療するために必要とされる前記抗がん剤の治療有効量よりも低い用量で投与される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗がん剤が、化学療法又は放射線である、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記化学療法が、アクチノマイシン、アブラキサン、アルトレタミン、アラノース、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カバジタキセ、カペシタビン、カルボプラチン、カルモフール、カルムスチン、クロラムブシル、クロルメチン、クロロゾトシン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン(ertramustine)、エチルニトロソウレア、エルロチニブ、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フォテムスチン、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イマチニブ、イクサベピロン、ラパチニブ、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ネララビン、ニムスチン、ニロチニブ、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、プロカルバジン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、ラニムスチン、ラルチトレキセド、レゴラフェニブ、ロミデプシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾトシン、タフルポシド、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テモゾロマイド、テムシロリムス、テニポシド、チオグアニン、トファシチニブ、トポテカン(opotecan)、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はビスモデギブから選択される請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記化学療法が、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、イブリツモマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、イノツズマブ、ゲムツズマブ、ベバシズマブ、セミプリマブ(camiplimab)、又はスパルタリズマブから選択される抗体治療である、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記化学療法又は抗がん剤がソラフェニブ及び／又はレゴラフェニブである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

ソラフェニブの用量が１日２回４００ｍｇ未満である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

レゴラフェニブの用量が１日１回１６０ｍｇ未満である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記放射線が、外照射療法、近接照射療法、又は体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である、請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

前記ＰＲＧ４が全身投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記投与が、皮下、筋肉内、又は静脈内である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ＰＲＧ４が、前記がんの位置に局所的に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記投与が、注射によるものである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＰＲＧ４が、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ＰＲＧ４が、前記抗がん剤に対する前記がんの化学感受性を増強する、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＰＲＧ４と前記抗がん剤との組み合わせが、前記がんを治療する、請求項９～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

治療有効量のＰＲＧ４をそれを必要とする患者に投与して、以前に治療されたがんの再発又は増殖を予防することを含む、以前に治療されたがんの再発を予防又は抑制する方法。

【請求項26】

前記ＰＲＧ４が、前記以前に治療されたがんの部位に局所的に投与される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＰＲＧ４が、局所的に又は部位への注射によって投与される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＰＲＧ４が前記患者に全身投与される、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記以前に治療されたがんが、外科的切除によって患者から除去され、前記腫瘍の外科的切除後に、ＰＲＧ４が前記患者に投与される、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＰＲＧ４が、前記腫瘍の外科的切除の部位に局所的に投与される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＰＲＧ４が、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与される、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択される、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記がんが乳がんである、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記がんが、頭頸部扁上皮がん腫、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病である、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記がんが肝細胞がん腫である、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記患者が、以前に治療されたがんから完全寛解している、請求項２５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記患者が、以前に治療されたがんから部分寛解している、請求項２５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記以前に治療されたがんの再発が、前記ＰＲＧ４の投与によって、１年間、２年間、３年間、４年間又は５年間予防される、請求項２５～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ＰＲＧ４を免疫療法剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含み、前記ＰＲＧ４と前記免疫療法の組み合わせががんを治療する、がんを治療する方法。

【請求項44】

前記免疫療法が、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項４３記載の方法。

【請求項45】

前記免疫療法が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、イピリムマブから選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ＰＲＧ４と免疫療法剤による前記患者の治療が、前記免疫療法単独での治療と比較して、前記がんの治療を改善する、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択される請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記がんが乳がんである、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記がんが、頭頸部扁上皮がん腫、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病である、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記がんが肝細胞がん腫である、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ＰＲＧ４が、前記患者に全身投与される、請求項４３～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＰＲＧ４が、がんの部位で局所的に前記患者に投与される、請求項４３～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＰＲＧ４が、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与される、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である、請求項４３～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４３～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ＰＲＧ４が、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４３～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含むか又は配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか又は配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換えヒトＰＲＧ４である、がんの治療に使用するためのＰＲＧ４。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、それぞれそれらの全体が参照により本明細書に援用される、２０１９年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５６，５１４号及び２０２０年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，４２７号の優先権及び利益を主張する。

【0002】

配列表
[0002] 本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年６月２日に作成され、ＬＵＢ＿０３２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは１９，２４６バイトである。

【0003】

技術分野
[0003] 本発明は、ルブリシンとしても知られている、ヒト糖タンパク質ＰＲＧ４の新規用途に関する。より具体的には、それは、ＰＲＧ４を使用して、がん及びがんに関連する又はがんに付随する病状を治療することに関する。

【背景技術】

【0004】

背景
[0004] プロテオグリカン４遺伝子（ＰＲＧ４）は、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）、並びに高度にグリコシル化された異なるスプライシングを受けた変異型、及びルブリシンとしても知られている「表在ゾーンタンパク質」のグリコフォームをコード化する。表在ゾーンタンパク質は、最初に表在ゾーンからの外植片軟骨の表面に局在し、馴化培地で同定された。ルブリシンは最初に滑液から単離され、軟骨－ガラス界面及びラテックス－ガラス界面で滑液と同様の生体外での潤滑能力を実証した。その後、それは滑膜線維芽細胞の産物として同定され、その潤滑能力性は、エクソン６でコード化される９４０アミノ酸の大きなムチン様ドメイン内のＯ－結合型β（１－３）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃオリゴ糖に依存することが発見された。ルブリシン分子は差示的にグリコシル化されており、いくつかの天然に存在するスプライス変異型が報告されてきた。それらは、本明細書で集合的にＰＲＧ４と称される。ＰＲＧ４は、体内の滑膜、腱、半月板などの関節軟骨の表面、眼の保護膜などに存在することが示されてきており、関節の潤滑と滑膜の恒常性に重要な役割を果たす。

【0005】

[0005] 完全長の組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）タンパク質は、成功裏に大規模発現されており、基本的な翻訳ベースの調査に利用できる。ｒｈＰＲＧ４は、適切なより高次の構造及びグリコシル化を保持することが示されており、したがって効率的な生体外潤滑及び抗付着機能を示す(Abubacker et al., Ann Biomed Eng. 2016; 44(4):1128-37; Samsom et al., Exp Eye Res. 2014;127:14-9)。重要なことに、ｒｈＰＲＧ４は、前臨床生体内変形性関節症モデルにおいて、関節内注射を介して、関節の健康を維持する上で効果的な生体内治療的価値を提供する(Elsaid et al., Osteoarthritis and Cartilage. 2015;23(1):114-21; Walker et al., Am. J. Sports Med., 2017;45(7):1512-21)。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

出願人らは今や、ルブリシンががん細胞に影響を及ぼし、がんとがんに付随する病状を治療するために使用され得ることを発見した。特に、出願人らは、ＰＲＧ４が新生物細胞の表現型並びに新生物細胞のストレス応答を変化させ、例えば、腫瘍細胞の浸潤性及び遊走性を低下させると判断した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明の概要
[0006] 本発明は、一態様では、ＰＲＧ４が患者に投与され、がんが治療されるか又はがんの増殖若しくは進行が遅延される、患者におけるがんを治療するか又はがんの増殖若しくは進行を遅延させる方法を含む。

【0008】

[0007] 一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である。一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

【0009】

[0008] 一実施形態では、がんは、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択される。例えば、がんは乳がんであってもよい。例えば、がんは、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病であってもよい。例えば、がんは肝細胞がん腫であってもよい。

【0010】

[0009] 一実施形態では、ＰＲＧ４は、別の抗がん剤と関連して投与される。例えば、抗がん剤は、化学療法又は放射線治療であってもよい。放射線治療は、例えば、外照射療法、近接照射療法、又は体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）であってもよい。

【0011】

[0010] 一実施形態では、ＰＲＧ４は別の抗がん剤と関連して投与され、抗がん剤は、ＰＲＧ４なしで単独で投与されるがんを治療するための抗がん剤の治療有効用量よりも少ない用量で投与される。例えば、一実施形態では、抗がん剤は、１日当たり８００ｍｇ未満又は１日２回４００ｍｇ未満の用量で投与されるソラフェニブである。別の実施形態では、抗がん剤は、１日１６０ｍｇ未満の用量で投与されるレゴラフェニブである。別の実施形態では、がんは肝細胞がん腫である。

【0012】

[0011] 一実施形態では、化学療法は、アクチノマイシン、アブラキサン、アルトレタミン、アラノース、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カバジタキセ、カペシタビン、カルボプラチン、カルモフール、カルムスチン、クロラムブシル、クロルメチン、クロロゾトシン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン(ertramustine)、エチルニトロソウレア、エルロチニブ、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フォテムスチン、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イマチニブ、イクサベピロン、ラパチニブ、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ネララビン、ニムスチン、ニロチニブ、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、プロカルバジン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、ラニムスチン、ラルチトレキセド、レゴラフェニブ、ロミデプシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾトシン、タフルポシド、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テモゾロマイド、テムシロリムス、テニポシド、チオグアニン、トファシチニブ、トポテカン(opotecan)、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はビスモデギブから選択されてもよい。一実施形態では、化学療法は、ソラフェニブ及び／又はレゴラフェニブである。さらなる実施形態では、がんは肝細胞がん腫であり、化学療法はソラフェニブ及び／又はレゴラフェニブである。

【0013】

[0012] 別の実施形態では、化学療法は、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、イブリツモマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、イノツズマブ、ゲムツズマブ、ベバシズマブ、セミプリマブ(camiplimab)、又はスパルタリズマブから選択される抗体治療であってもよい。

【0014】

[0013] 一実施形態によれば、ＰＲＧ４は患者に全身投与される一方で、その他の実施形態では、ＰＲＧ４は皮下、筋肉内、又は静脈内投与によって投与される。ＰＲＧ４はまた、がんの位置に局所的に投与されてもよい。投与は、注射によるものであってもよい。ＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与されてもよい。

【0015】

[0014] いくつかの実施形態では、ＰＲＧ４は、抗がん剤に対するがんの化学感受性を増強する。いくつかの実施形態では、ＰＲＧ４と抗がん剤の組み合わせは、がんを治療する。

【0016】

[0015] 別の態様では、本発明は、以前に治療されたがんの再発を予防又は抑制するための方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に治療的有効量のＰＲＧ４を投与して、患者における以前に治療されたがん再発又は増殖を防止することを含む。一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である。一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

【0017】

[0016] いくつかの実施形態では、以前治療されたがんは、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択されるがんである。例えば、一実施形態では、がんは乳がんである。さらなる実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がんである。なおも別の実施形態では、がんは、頭頸部扁上皮がん腫、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病である。一実施形態では、がんは肝細胞がん腫である。

【0018】

[0017] いくつかの実施形態では、ＰＲＧ４は、以前に治療されたがんの部位に局所的に投与される。例えば、局所投与は、局所投与又は部位への注射によって起こり得る。その他の実施形態では、ＰＲＧ４は患者に全身投与される。ＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与されてもよい。

【0019】

[0018] いくつかの実施形態では以前に治療されたがんは、外科的切除によって患者から除去され、ＰＲＧ４は、腫瘍の外科的切除後に患者に投与される。このような場合、ＰＲＧ４は腫瘍の外科的切除部位に局所的に投与されてもよい。ＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与されてもよい。

【0020】

[0019] この方法のいくつかの実施形態によれば、患者は以前に治療されたがんから完全に寛解している一方で、その他の実施形態では、患者は以前に治療されたがんから部分的に寛解している。いくつかの実施形態では、以前に治療されたがんの再発は、ＰＲＧ４の投与によって、１年間、２年間、３年間、４年間又は５年間予防される。

【0021】

[0020] 別の態様では、本発明は、それを必要とする患者に免疫療法剤と組み合わせてＰＲＧ４を投与することを含むがんを治療する方法を含み、ＰＲＧ４と免疫療法の組み合わせががんを治療する。一実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の実施形態では、免疫療法は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、イピリムマブから選択される。さらなる実施形態では、ＰＲＧ４と免疫療法剤による患者の治療は、免疫療法単独による治療と比較して、がんの治療を改善する。

【0022】

[0021] 本発明のこの方法によれば、がんは、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍から選択されてもよい。がんは、一実施形態では乳がんであってもよく、別の実施形態ではトリプルネガティブ乳がんであってもよく、又はがんは頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、又は白血病であってもよい。一実施形態では、がんは肝細胞がん腫である。

【0023】

[0022] 一実施形態によれば、ＰＲＧ４は、全身的に患者に投与される一方で、別の実施形態では、ＰＲＧ４は、がんの部位で局所的に患者に投与される。一実施形態では、ＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの量で投与される。なおも別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である。一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

【0024】

[0023] 一実施形態では、本発明は、がんの治療に使用するためのＰＲＧ４を含む。例えば、一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む組換えヒトＰＲＧ４である。一実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

図面の簡単な説明

【図1A】[0024]４５０ｎｍでのＴＭＢ－ＥＬＩＳＡによって検出された、リコンビナントヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）、高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）、及び中間分子量ヒアルロン酸（ＭＭＷ ＨＡ）の組換えヒトＣＤ４４受容体への結合を示すデータを示す棒グラフである。データは、群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、ＭＭＷ ＨＡ、及びビトロネクチンと、ＣＤ４４－ＩｇＧ１ Ｆｃ及びＩｇＧ Ｆｃとを使用した場合の結合を示す。星印（^＊）は、ＣＤ４４－ＩｇＧ１ Ｆｃウェルの４５０ｎｍ吸光度が、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡのＩｇＧ１ Ｆｃウェルよりも統計的に有意に高かったことを示す（ｐ＜０．００１）。

【図1B】[0024]４５０ｎｍでのＴＭＢ－ＥＬＩＳＡによって検出された、リコンビナントヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）、高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）、及び中間分子量ヒアルロン酸（ＭＭＷ ＨＡ）の組換えヒトＣＤ４４受容体への結合を示すデータを示す棒グラフである。データは、群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ及びＭＭＷ ＨＡの濃度依存性ＣＤ４４結合を示す。ｒｈＰＲＧ４へのＣＤ４４結合は、ＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。二重星（^＊＊）は、ｒｈＰＲＧ４へのＣＤ４４の結合が、ＭＭＷ ＨＡよりも有意に高かったことを示す（ｐ＜０．００１）。

【図1C】[0024]４５０ｎｍでのＴＭＢ－ＥＬＩＳＡによって検出された、リコンビナントヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）、高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）、及び中間分子量ヒアルロン酸（ＭＭＷ ＨＡ）の組換えヒトＣＤ４４受容体への結合を示すデータを示す棒グラフである。データは、群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに被覆されたＣＤ４４への結合における、ｒｈＰＲＧ４（５μｇ／ｍＬ）と、ＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡのどちから（０．０１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ）の間の競合を示す。星印（^＊）は、ＨＭＷ ＨＡ＋ｒｈＰＲＧ４ウェルのＣＤ４４結合百分率が、ｒｈＰＲＧ４ウェルよりも有意に低かったことを示し（ｐ＜０．０５）；（^＊＊）は、ＭＭＷ ＨＡ＋ｒｈＰＲＧ４ウェルのＣＤ４４結合百分率が、ｒｈＰＲＧ４ウェルよりも有意に低かったことを示す（ｐ＜０．０５）。

【図2A】[0025]表面プラズモン共鳴を用いて、組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）の組換えＣＤ４４への結合、及びＤ４４結合におけるｒｈＰＲＧ４と高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）との間の競合を示す。固定化ＣＤ４４－ＩｇＧ_１ＦｃへのｒｈＰＲＧ４（３００μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ）の濃度依存性の会合及び解離を描写するセンソグラムである。破線の曲線はｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４キメラタンパク質への結合曲線を表し、黒線は適合させた１：１結合モデルを表す。

【図2B】[0025]表面プラズモン共鳴を用いて、組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）の組換えＣＤ４４への結合、及びＤ４４結合におけるｒｈＰＲＧ４と高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）との間の競合を示す。相対応答－ＨＭＷ ＨＡ結合と対比した、相対応答－ｒｈＰＲＧ４結合を示すプロットである。固定化ＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃへの結合におけるｒｈＰＲＧ４とＨＭＷ ＨＡの間の競合。ｒｈＰＲＧ４は、３００（１）、２５０（２）、２００（３）、１５０（４）、１００（５）、５０（６）、及び０（７）μｇ／ｍＬで注射された。ｒｈＰＲＧ４の解離に続いて、ＨＭＷ ＨＡは５０で注入されたμｇ／ｍＬ。ｒｈＰＲＧ４の濃度が増加すると、引き続くＣＤ４４へのＨＭＷ ＨＡの結合は減少した。

【図3A】[0026]組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）のシアリダーゼ－Ａ及びＯ－グリコシダーゼ消化が、ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合に及ぼす影響を示す。データは、群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。ｒｈＰＲＧ４、シアリダーゼＡ消化ｒｈＰＲＧ４、Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４、シアリダーゼＡ＋Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合を描写する棒グラフである。異なる群全体の４５０ｎｍの吸光度値は、未消化ｒｈＰＲＧ４群の吸光度値に正規化された。（^＊）は、シアリダーゼＡ消化及びＯ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４におけるＣＤ４４結合が、未消化ｒｈＰＲＧ４と比較して有意に高かったことを示す（ｐ＜０．０１）。（^＊＊）は、シアリダーゼＡ＋Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４におけるＣＤ４４結合が、シアリダーゼＡ消化ｒｈＰＲＧ４、Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４、未消化ｒｈＰＲＧ４と比較して有意に高かったことを示す（ｐ＜０．０１）。

【図3B】[0026]組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）のシアリダーゼ－Ａ及びＯ－グリコシダーゼ消化が、ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合に及ぼす影響を示す。データは、群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。ｒｈＰＲＧ４、シアリダーゼＡ消化ｒｈＰＲＧ４、Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４、及びシアリダーゼＡと、Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４との組み合わせのＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真である。ゲルは、クーマシー｛Commassie｝ブルーで一晩染色された。シアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼによる消化は、ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量の減少をもたらした。

【図4A】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。未処理のままの、又は完全増殖培地中の増加する濃度（０．１、１０、及び１００μｇ／ｍＬ）のｒｈＰＲＧ４あり又はなしで、１００ｐＭのＴＧＦβと共にインキュベートされた、８日齢の３次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅでは、緑色矢印及び赤色矢印は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。緑色矢印は、図４Ａの上段の全てのボックスと、右側の２つのボックスの下段に現れる。左側の下段の２つのボックスには、赤色矢印がある。

【図4B】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。棒グラフは、Ａに示されるものを含めた４つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図4C】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。完全増殖培地の異なる組み合わせ中で、１００ｐＭのＴＧＦβ及び１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４あり又はなしで、１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ又は抗ＰＲＧ４ ｍＡｂ ４Ｄ６と共にインキュベートされた、８日齢の３次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅでは、緑色矢印及び赤色矢印は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。図４Ｃでは、上段の左から右方向に、１番目、３番目、及び４番目のボックスに緑色矢印がある一方で、左から２番目のボックスには赤色矢印がある。図４Ｃでは、下段の左側の１番目のボックスに緑色矢印がある一方で、下段の残りのボックスには赤色矢印がある。

【図4D】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。棒グラフは、Ｃに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図4E】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４と混合されたマトリゲルを使用した、未処理のままの、又はビヒクル又は１００ｐＭのＴＧＦβで処理された、８日齢の３次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。図４Ａ、４Ｃ、及び４Ｅでは、緑色矢印及び赤色矢印は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。図４Ｅでは、赤色矢印がある下段の左側のボックスを除いて、全てのボックスに緑色矢印がある。

【図4F】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。棒グラフは、Ｅに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図4G】[0027]ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性浸潤性増殖を抑制する。未処理のままの、又は完全増殖培地中でｒｈＰＲＧ４あり又はなしでＴＧＦβと共にインキュベートされた、ホルムアルデヒド固定された８日齢のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの核（ヘキスト３３３４２、青色）、アクチン（ＴＲＩＴＣ－ファロイジン、黄色）、及びラミニン（ラット抗ラミニン／抗ラットアレクサ６４７、赤色）染色の代表的な蛍光顕微鏡画像である。この実験は２回独立して繰り返され、同様の結果が得られた。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１。棒目盛は、５０μｍを示す。図４Ｇでは、緑色の矢印は皮質アクチンを示し（ＴＧＦβ＋とＴＧＦβ－の双方に対する下段中央ボックス）、黄色矢印はストレスファイバー様アクチンを示し（ＴＧＦβ＋とＴＧＦβ－の双方に対する上段中央ボックス）、青色矢印は無傷のラミニンリングを示し（ＴＧＦβ－に対する上段及び下段の右端の画像、並びにＴＧＦβ＋に対する下段の右端の画像）、赤色矢印はラミニンリングの破壊を示し（ＴＧＦβ＋に対する上段右端の画像）、白色矢印（ＴＧＦβ＋に対する上段右端の画像）は、ラミニン喪失の代表的な部位を示す。

【図5A】[0028]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の浸潤性及び遊走性を抑制する。トランスウェルインサートのマトリゲル被覆された膜の下側に現れたクリスタルバイオレット染色された１２時間血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像であり、下部ウェルは、１００ｐＭのＴＧＦβなし（－）又はあり、単独、又は１０μＭのＴβＲＩ阻害剤ＳＢ４３５１４２（ＫＩ）又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４ありの、完全増殖培地を含有する。棒目盛は、１５０μｍに相当する。

【図5B】[0028]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の浸潤性及び遊走性を抑制する。棒グラフは、Ａに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件について、８つのランダムに選択された重複しないフィールドからカウントされた、浸潤性細胞の平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図5C】[0028]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の浸潤性及び遊走性を抑制する。１００ｐＭのＴＧＦβなし（－）又はあり、単独、又は１０μＭのＫＩ又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４ありの、０．２％ＦＢＳ含有培地でインキュベートされた、スクラッチの導入の０及び３６時間後における、１２ウェルプレートのウェルに播種された、血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的なＤＩＣ光学顕微鏡像である。棒目盛は、５００μｍに相当する。

【図5D】[0028]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の浸潤性及び遊走性を抑制する。棒グラフは、Ｃに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件の５つの重複しない画像の０時間目に対する、３６時間目のスクラッチクロージャの平均±ＳＥＭ比率（％）を示す。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１。

【図6A】[0029]ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達に影響を与えない。未処理のままの（対照）、又は完全増殖培地中で１２時間、１０μＭのＫＩ又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４なし又はありで、１００ｐＭのＴＧＦβと共にインキュベートされた、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解産物のホスホ－Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）、全Ｓｍａｄ２／３（ｔＳｍａｄ２／３）、及びアクチン免疫ブロットである。

【図6B】[0029]ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達に影響を与えない。棒グラフは、Ｓｍａｄ２／３の総タンパク質存在量に対するｐＳｍａｄ２の比率の平均±ＳＥＭを表し、Ａに示されるものを含めた４つの独立した実験からの対照に対する倍数変化として表す。

【図6C】[0029]ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達に影響を与えない。３つの連続したＴＰＡ（１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール１３－アセテート）応答要素（ＴＲＥ）と、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）プロモーター領域の一部とを有する、３ＴＰ－Ｌｕｘレポーターコンストラクトの概略図である。ＴＧＦβ処理は、リン酸化、核転移、及び３ＴＰプロモーターへのＳｍａｄの結合を誘発し、ルシフェラーゼ酵素の存在量を増加させる。

【図6D】[0029]ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達に影響を与えない。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるウミシイタケルシフェラーゼ発現コンストラクトと共に、ＴＰ－Ｌｕｘレポーターコンストラクトで形質移入された。細胞は、未処理のまま（対照）、又は０．２％ＦＢＳ含有培地中の１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４あり又はなしで、１００ｐＭのＴＧＦβと共にインキュベートされた。棒グラフは、ウミシイタケルシフェラーゼ発現（相対光単位）に対して正規化された３ＴＰプロモーター駆動ルシフェラーゼ値を表し、正規化されたデータは、未処理細胞の溶解産物中の正規化されたルシフェラーゼデータと比較して表される。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊＊＊Ｐ≦０．００１。

【図7A】[0030]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）誘発性浸潤を抑制する。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物は、ＣＤ４４抗体（ＣＤ４４ ＩＰ）又は非特異的ラットＩｇＧ抗体（ＩｇＧ ＩＰ）を使用した免疫沈降に供され、免疫沈降物のＣＤ４４免疫ブロット法がそれに続いた。溶解産物中のＣＤ４４タンパク質の存在量は、ＣＤ４４免疫ブロット法（入力）によっても確認された。

【図7B】[0030]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）誘発性浸潤を抑制する。増加する濃度のＬＭＷＨＡ（１０、１００又は４００μｇ／ｍＬ）なし又はありの増殖培地中で、単独で、又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４と共にインキュベートされた、８日齢の３次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。棒目盛は、５０μｍを示す。緑色矢印（上段、２つの左側の画像と下段の全ての画像）及び赤色矢印（上段、２つの右側の画像）は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。

【図7C】[0030]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）誘発性浸潤を抑制する。棒グラフは、Ｂに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図7D】[0030]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）誘発性浸潤を抑制する。トランスウェルインサートのマトリゲル被覆された膜の下側に現れたクリスタルバイオレット染色された１２時間血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像であり、下部ウェルは、４００μｇ／ｍＬのＬＭＷＨＡなし（－）又はあり、単独、又は５μｇ／ｍＬのＣＤ４４中和抗体又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４ありの、完全増殖培地を含有する。棒目盛は、１５０μｍに相当する。

【図7E】[0030]ｒｈＰＲＧ４は、乳がん細胞の低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）誘発性浸潤を抑制する。棒グラフは、対照と比較した、Ｄに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件について、８つのランダムに選択された重複しないフィールドからカウントされた浸潤性細胞の平均±ＳＥＭ比率を示す。ＡＮＯＶＡ：有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１。

【図8A】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。ｐＵ６ ＲＮＡｉベクター（ベクター対照）、又はＣＤ４４ ｍＲＮＡの２つの異なる配列を標的化するｓｈＲＮＡを発現するプラスミドＣＤ４４ｉ－１、ＣＤ４４ｉ－２の単独又は併用（ＣＤ４４ｉ－１＋２）で形質移入された、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物のＣＤ４４免疫ブロットである。アクチンが、ローディング対照として使用された。

【図8B】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。Ａと同様に形質移入され、抗ＣＤ４４間接免疫蛍光法（ラット抗ＣＤ４４／抗ラットアレクサ６４７、赤色；色は下段の画像に現れる）に供され、ヘキスト３３３４２蛍光ヌクレオチド染色（青色；上段の画像に現れる）で対比染色されて、核が視覚化されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的なＣＤ４４、ＧＦＰ、及び核蛍光顕微鏡画像である。ＧＦＰ（緑色；画像の中央段に現れる）シグナルは、ベクター対照又はＣＤ４４ ＲＮＡｉ－１／２形質移入細胞を示す。矢印は、２つのＣＤ４４ ＲＮＡｉプラスミドによる内因性ＣＤ４４のノックダウンを強調するために、ベクター（左）、ＣＤ４４ｉ－１（２列目）、ＣＤ４４ｉ－２（３列目）、及びＣＤ４４ｉ－１２（右）形質移入細胞の例を示す。この実験は３回繰り返され、同様の結果が得られた。

【図8C】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。ベクター対照、又はＣＤ４４ｉ－１及びＣＤ４４ｉ－２を個別に又は組み合わせて形質移入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に由来する、完全増殖培地中の未処理（－）、１００ｐＭのＴＧＦβ又は４００μｇ／ｍＬのＬＭＷＨＡで処理された、８日齢三次元オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。中央及び下段の右端の画像を除いて、図８Ｃの全ての画像に緑色矢印が現れ；上段の左端の画像が緑色であるのを除いて、図８Ｆ－ｒｈＰＲＧ４の全ての画像に赤色矢印が現れ；ｒｈＰＲＧ４パネルの全ての画像に緑色矢印が現れる。

【図8D】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。棒グラフは、Ｃに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図8E】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。空ベクター又はＣＤ４４／ＦＬＡＧ発現プラスミドで形質移入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物のＣＤ４４／ＦＬＡＧ免疫ブロットである。アクチンが、ローディング対照として使用された。

【図8F】[0031]ＣＤ４４はＴＧＦβ誘導性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性に重要である。１００ｐＭのＴＧＦβ又は４００のμｇ／ｍＬＬＭＷＨＡなし（－）又はあり、単独、又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４を含む、完全増殖培地中のベクター対照又はＣＤ４４／ＦＬＡＧを発現する、８日齢ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。中央及び下段の右端の画像を除いて、図８Ｃの全ての画像に緑色矢印が現れ；上段の左端の画像が緑色であるのを除いて、図８Ｆ－ｒｈＰＲＧ４の全ての画像に赤色矢印が現れ；ｒｈＰＲＧ４パネルの全ての画像に緑色矢印が現れる。

【図8G】[0031]棒グラフは、Ｆに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１。棒目盛は、５０μｍを示す。緑色矢印及び赤色矢印は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。

【図9A】[0032]ＴＧＦβは、ＨＡ－ＣＤ４４依存様式で乳がん細胞の浸潤性を誘導する。未処理のままの（－）、又は完全増殖培地中の１００ｐＭのＴＧＦβなし又はありで、ＫＩ（１０μＭ）、ＣＤ４４中和抗体（２．５μｇ／ｍＬ）、又はｒｈＰＲＧ４（１００μｇ／ｍＬ）あり又はなしで、異なる濃度のＬＭＷＨＡ（１００又は４００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートされた、８日齢三次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。図９Ａの上側パネルでは、上段の左から１番目、３番目、及び４番目の画像と、２番目の段の左から３番目の画像を除いて、全ての矢印は赤色である。図９Ａの下側パネルでは、全ての矢印は緑色である。

【図9B】[0032]ＴＧＦβは、ＨＡ－ＣＤ４４依存様式で乳がん細胞の浸潤性を誘導する。棒グラフは、Ａに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総オルガノイドの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図9C】[0032]ＴＧＦβは、ＨＡ－ＣＤ４４依存様式で乳がん細胞の浸潤性を誘導する。完全増殖培地中の０．５ｍＭの４－ＭＵなし又はありで、１００ｐＭのＴＧＦβなし又はありで、４００μｇ／ｍＬのＬＭＷＨＡ、及び１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４を含むＬＭＷＨＡあり又はなしで処理された、８日齢三次元ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＤＩＣ光学顕微鏡画像である。図９Ｃの上側パネルでは、赤色である右上の画像の矢印を除いて、全ての矢印は緑色である。図９Ｃの中部パネルでは、全ての矢印は赤色である。図９Ｃの下側パネルでは、全ての矢印は緑色である。

【図9D】[0032]ＴＧＦβは、ＨＡ－ＣＤ４４依存様式で乳がん細胞の浸潤性を誘導する。棒グラフは、Ｃに示されるものを含めた３つの独立した実験からの各実験条件についてカウントされた、総コロニーの百分率として表された、球状オルガノイドの平均±ＳＥＭ比率を示す。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１。棒目盛は、５０μｍを示す。緑色矢印及び赤色矢印は、それぞれ球状オルガノイド及び浸潤性オルガノイドを示す。

【図10A】[0033]ｒｈＰＲＧ４及びＴＧＦβは、ＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質量に反対の影響を及ぼす。１００ｐＭのＴＧＦβなし（対照）又はありで、単独で、又は１０μＭのＫＩ又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４と共に、完全増殖培地中でインキュベートされた、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物のＣＤ４４及びホスホ－Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）免疫ブロットである。アクチンが、ローディング対照として使用された。

【図10B】[0033]ｒｈＰＲＧ４及びＴＧＦβは、ＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質量に反対の影響を及ぼす。棒グラフは、Ａに示されたものを含めた４つの独立した実験から得られた、各処理条件におけるＣＤ４４免疫反応バンドの平均±ＳＥＭ比率を示す。

【図10C】[0033]ｒｈＰＲＧ４及びＴＧＦβは、ＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質量に反対の影響を及ぼす。１００ｐＭのＴＧＦβなし又はありの完全増殖培地中で、単独で、又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４と共にインキュベートされた、固定された８日齢ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの代表的なＣＤ４４（ラット抗ＣＤ４４／抗ラットアレクサ６４７、赤色、「ＣＤ４４」とラベルされた列に現れる）、及び核（ヘキスト、青色、「核」とラベルされた列に現れる）蛍光顕微鏡画像である。この実験は２回繰り返され、同様の結果が得られた。棒目盛は、５０μｍを示す。

【図10D】[0033]ｒｈＰＲＧ４及びＴＧＦβは、ＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質量に反対の影響を及ぼす。１００ｐＭのＴＧＦβなし（対照）又はありで、単独で、又は１０μＭのＫＩ又は１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４と共に、完全増殖培地中でインキュベートされた、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物のＨＡＳ２及びホスホ－Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）免疫ブロットである。アクチンが、ローディング対照として使用された。

【図10E】[0033]ｒｈＰＲＧ４及びＴＧＦβは、ＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質量に反対の影響を及ぼす。棒グラフは、Ｄに示されたものを含めた３つの独立した実験から得られた、各処理条件におけるＨＡＳ２免疫反応バンドの平均±ＳＥＭ比率を示す。有意差、ＡＮＯＶＡ：^＊＊＊Ｐ≦０．００１；^＊＊Ｐ≦０．０１；^＊Ｐ≦０．０５、不対ｔ検定：^＃Ｐ＝０．０１６４。

【図11】[0034]完全長（非短縮）のヒトＰＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１：１４０４残基）である。残基１～２４（太字で示される）はシグナル配列を表し、残基２５～１４０４はヒトＰＲＧ４の成熟配列を表す。糖タンパク質は、その活性形態中にリード配列を必要としない。

【図12】[0035]完全長の１４０４ＡＡヒトＰＲＧ４タンパク質をコード化する、ＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）の核酸配列である。

【図13】[0036]目的のマーカー（ルブリシン、ＣＳＰＧ４、ＶＣＡＮ、及びＨＳＰＧ２）の内因性組織ｍＲＮＡ発現のレベルに基づく肝細胞がん腫（ＨＣＣ）患者のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。Ｙ軸は累積生存率であり、Ｘ軸は月単位の生存期間である。患者は、目的のマーカーのｍＲＮＡ発現値の中央値を超えるか又はそれ未満の値に従って、高又は低に階層化される。データは、ルブリシン発現が、ＨＣＣ患者の生存と正の相関があることを示す。

【図14A】[0037]ＨＣＣにおけるルブリシンタンパク質の発現及び組織局在化を示す。１４人のＨＣＣ患者の腫瘍及び腫瘍周囲の対組織における、ルブリシンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析及び定量化を示す。

【図14B】[0037]ＨＣＣにおけるルブリシンタンパク質の発現及び組織局在化を示す。ルブリシン（緑）及びαＳＭＡ（赤）の局在化を提示する、ＨＣＣ腫瘍組織の免疫蛍光法を示す。核は青色によって表わされる。下段の右端パネルには、青色及び赤色のみが見られる。上段の１番目と２番目のパネルでは、緑色及び赤色が最も多く一緒に見られる。上段の最後のパネルと下段の最初の２つのパネルでは、緑色及び赤色がより少なく一緒に見られる。

【図15】[0038]ＴＧＦβが、ＣＡＦ（上段）及び生体外培養されたＨＣＣ組織（下段）において、ルブリシン発現を誘導することを示す一連の棒グラフである。グラフの上段には、対照、ＬＹ、ＴＧＦ、及びＴＧＦ＋ＬＹのｍＲＮＡレベルが、各グラフの左から右に示される。グラフの下段には、対照と対比して、ＬＹ、ＴＧＦ、及びＴＧＦ＋ＬＹのそれぞれのｍＲＮＡレベルが、各グラフの左から右に示される。αＳＭＡ、ＣＳＰＧ４、ＨＳＰＧ２、ルブリシン、及びＶＣＮのレベルが示される。４８時間処理されたＨＣＣ腫瘍由来ＣＡＦ（ｎ＝５）中、及び４８時間処理された生体外ＨＣＣ組織（ｎ＝６）中のルブリシンのｍＲＮＡ発現。Ｔ検定：^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図16】[0039]７８のＨＣＣ症例の累積生存率を示す、カプラン・マイヤー曲線を示す。患者は、相対的な中央値を超えるか又はそれ未満の値に従って層別化された。ルブリシンの腫瘍発現は、低ＣＤ４４レベルを伴うＨＣＣのより良い予後と相関する。↑でマークされた生存曲線は凡例に↑として示されている分子に対応し、マークされていない生存曲線は凡例に↓として示されている分子に対応する。上段では、左から右へ、１番目の曲線の凡例は、ｐ＝０．０００でルブリシン↑及びルブリシン↓を示し；２番目の曲線の凡例は、ｐ＝０．０８４でＴＧＦβ１↑及びＴＧＦ↓を示す。下段の１番目の曲線の凡例は、ｐ＝０．６３７でαＳＭＡ↑及びαＳＭＡ↓を示し；２番目の曲線の凡例は、ｐ＝０．３０２で、ＣＤ４４↑及びＣＤ４４↓を示す。「ルブリシン↑」とラベルされた曲線では、凡例は、ｐ＝０．４７８でＴＧＦβ１↑及びＴＧＦβ１↓を示す一方で、「ルブリシン↓」とラベルされた曲線では、凡例は、ｐ＝０．０２４でＴＧＦβ１↓及びＴＧＦβ１↓を示す。「ＣＤ４４↑」とラベルされた曲線では、凡例はｐ＝０．１８７のルブリシン↑及びルブリシン↓を示す一方で、「ＣＤ４４↓」というラベルされた曲線では、凡例はｐ＝０．０００でルブリシン↑及びルブリシン↓を示す。

【図17A】[0040]ＨＣＣ細胞におけるＣＤ４４サイレンシングが、ｒｈＰＲＧ４への細胞付着を損なうが、遊走は損なわないことを示す。棒グラフは、ＨＬＥ及びＨＬＦ細胞における細胞付着をＦＮの％として示す。Ｙ軸はＦＮの％としての細胞付着である。暗色バーは対照ｓｈＲＮＡである一方で、淡色バーはＣＤ４４－ｓｈＲＮＡである。未被覆、ルブリシン、及びＦＮの結果が左から右に示される。ウェルプレート画像では、上段は対照－ｓｈＲＮＡで下段はＣＤ４４－ｓｈＲＮＡであり、左から右へ未被覆、ルブリシン、及びＦＮウェルである。細胞を未被覆の、又はｒｈＰＲＧ４－又はフィブロネクチン（Ｆｎ）で被覆されたウェル表面に播種し、３０分間付着させて延展させた。

【図17B】[0040]ＨＣＣ細胞におけるＣＤ４４サイレンシングが、ｒｈＰＲＧ４への細胞付着を損なうが、遊走は損なわないことを示す。細胞は、トランスウェル膜の上部に播種され（事前に下部がＦｎで被覆された）、下部チャンバー内の可溶性ｒｈＰＲＧ４の存在下又は非存在下で、１６時間移動された。Ｔ検定：^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。ビヒクルの画像は上段にあり、ルブリシンの画像は下段にある。付随する棒グラフは、左から右へ、対照－ｓｈＲＮＡ（ＨＬＥ）、ＣＤ４４－ｓｈＲＮＡ（ＨＬＥ）、対照－ｓｈＲＮＡ（ＨＬＦ）、及びＣＤ４４－ｓｈＲＮＡ（ＨＬＦ）について、ルブリシンと対比して、ビヒクルの細胞数／顕微鏡視野を示す。

【図18】[0041]ｒｈＰＲＧ４が、優先的に、高ＣＤ４４発現ＨＣＣ細胞において、細胞増殖を阻害するソラフェニブ及びレゴラフェニブの有効性を増強することを示す。細胞は、ソラフェニブ、レゴラフェニブ（２．５μＭ）あり又はなしで、ｒｈＰＲＧ４濃度（０～１００μｇ／ｍｌ）を上げながら、増殖速度について２時間試験された。薬剤有効性は、増殖阻害のからｒｈＰＲＧ４阻害の寄与を差し引いた％として計算される。Ｔ検定：^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。細胞数が上段のグラフに示される一方で、２番目の段はｒｈＰＲＧ４の濃度と対比した細胞増殖のプロットを示し、３番目の段はｒｈＰＲＧ４の濃度と対比した薬物誘発性細胞増殖阻害の％のプロットを示す。対照は暗色線で示され、ソラフェニブの結果は「Ｘ」でマークされ、レゴラフェニブの結果は「Ｔ」でマークされる。

【図19A】[0042]ＨＣＣ細胞におけるＣＤ４４サイレンシングが、ルブリシンによる薬物有効性の増強を相殺することを示す。細胞はレンチウイルス感染を介して形質導入され、安定したＣＤ４４サイレンシングのためにさらに選択された。７２時間の増殖試験が実施され、ソラフェニブ又はレゴラフェニブ阻害作用の増強におけるルブリシンの正味の効果が、対照細胞とＣＤ４４－ｓｈＲＮＡ細胞の双方についてプロットされた。１番目の段は、ｒｈＰＲＧ４の濃度と対比した、細胞増殖のプロットを示す。対照は暗色線で示され、ソラフェニブの結果は「Ｘ」でマークされ、レゴラフェニブの結果は「Ｔ」でマークされる。２番目の段は、ｒｈＰＲＧ４の濃度と対比した、対照－ｓｈＲＮＡ（実線）及びＣＤ４４－ｓｈＲＮＡ（点線）の薬物阻害効果の増強のプロットを％として示す。

【図19B】[0042]ＨＣＣ細胞におけるＣＤ４４サイレンシングが、ルブリシンによる薬物有効性の増強を相殺することを示す。ＨＣＣ ＣＡＦはＴＧＦβ１で４８時間刺激され、さらに無血清条件で４８時間（ＴＧＦβ１なし）インキュベートされ、馴化培地（ＣＭ）の濃縮を可能にした。次に、ＣＭはルブリシン濃縮され、枯渇され又は枯渇されなかった。図１９Ｂの左側は、ＴＧＦβ１処理ＣＡＦのＣＭからのルブリシンの枯渇を示すウエスタンブロットである。ＩＤ＝イソタイプ又は抗ルブリシン抗体を使用した免疫枯渇ＴＧＦβ１処理ＣＡＦ－ＣＭ；ＩＰ＝イソタイプ又は抗－ルブリシン抗体を使用したＴＧＦβ１処理ＣＡＦｓ－ＣＭからの免疫沈降ルブリシン。図１９Ｂの右側では、ＨＬＦ細胞増殖に対するソラフェニブとレゴラフェニブ阻害作用に対する、ＴＧＦβ１処理ＣＡＦ－ＣＭルブリシン枯渇あり／枯渇なしの効果が示され；２０μｇ／ｍｌのＣＭタンパク質が、１％ＦＢＳの存在下での７２時間の増殖試験に使用された。Ｔ検定：^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図20】[0043]対照の非標的化（Ｖ）又は特異的ＣＤ４４標的化ｓｈＲＮＡ配列を保有するレンチウイルス粒子で形質導入された、ＨＬＥ及びＨＬＦ細胞株におけるＣＤ４４サイレンシング効率を示す。

【図21A】[0044]新鮮に採集された外科的に切除されたＨＣＣ標本から単離された、初代ＨＣＣ細胞株ＰＬＣ／ＤＣ１９の表面で検出された、様々な幹細胞性マーカー（ＯＶ６、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、及びＣＤ９０）、上皮マーカー（ＡＦＰ、Ｅ－Ｃａｄｈ、ＥｐＣＡＭ）、間葉系マーカー（Ｖｉｍ、Ｎ－Ｃａｄｈ、αＳＭＡ）、及びその他のがん関連表面タンパク質（ＣＤ１３、ＣＤ１５１）のレベルを示す。

【図21B】[0044]新鮮に採集された外科的に切除されたＨＣＣ標本から単離された、初代ＨＣＣ細胞株ＰＬＣ／ＤＣ１９の表面で検出された、様々な幹細胞性マーカー（ＯＶ６、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、及びＣＤ９０）、上皮マーカー（ＡＦＰ、Ｅ－Ｃａｄｈ、ＥｐＣＡＭ）、間葉系マーカー（Ｖｉｍ、Ｎ－Ｃａｄｈ、αＳＭＡ）、及びその他のがん関連表面タンパク質（ＣＤ１３、ＣＤ１５１）のレベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

詳細な説明
[0045] 転移は、がんに関連する罹患率と死亡率の主原因である。がん細胞が浸潤性及び遊走性になる能力は、転移性増殖に大きく寄与し、このため、新規の抗遊走性及び抗浸潤性治療アプローチの同定が必要になる。周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素への付着は、がん細胞がＥＣＭに浸潤し、最終的に転移性になるために重要である。出願人は、ＰＲＧ４が、がん細胞の浸潤性増殖を誘導する分泌タンパク質形質転換成長因子βの能力を抑制すること、及びｒｈＰＲＧ４が下流ヒアルロン酸（ＨＡ）－細胞表面の分化抗原群４４（ＣＤ４４）シグナル伝達軸を阻害することによって、がん細胞のＴＧＦβ誘導浸潤性を抑制することを発見した。さらに、出願人は、ｒｈＰＲＧ４が、ＣＤ４４タンパク質存在量、及びＨＡ生合成に関与する酵素ＨＡＳ２のタンパク質存在量のＴＧＦβ依存性の増加を抑制することを発見した。ＴＧＦβはがんにおいて、腫瘍抑制と腫瘍促進の双方の役割を果たしていることが広く認められている。ｒｈＰＲＧ４がＨＡＳ２及びＴＧＦβによるＣＤ４４誘導に対抗するという申請者の発見は、腫瘍を促進する役割を下方制御する一方で、ＴＧＦβ作用の腫瘍抑制的な側面を維持するという意味を有する。これらの知見は、がんの治療的処置としてのＰＲＧ４の臨床的有用性を支持する。

【0027】

ＰＲＧ４タンパク質
[0046] ルブリシンとも称されるＰＲＧ４は、ヒトではＰＲＧ４としても知られている巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子から発現される潤滑ポリペプチドである（ＮＣＢＩ受入れ番号ＡＫ１３１４３４－Ｕ７０１３６を参照されたい）。ルブリシンは、体の関節面を覆う、遍在性の内因性糖タンパク質である。ルブリシンは、高度に表面活性の分子であり（例えば、水を保持する）、それは主に強力な細胞保護、抗付着剤、境界潤滑剤として作用する。分子は、分子が組織表面に付着して保護することを可能にする、末端タンパク質ドメインの間に位置する長い中央ムチン様ドメインを有する。その天然形態は、調査された全ての哺乳類において、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列の複数の反復を含む。天然ルブリシンは典型的には、この反復の複数の冗長な形態を含み、これは典型的には、プロリン及びスレオニン残基を含んで、大多数の反復中では少なくとも１つのスレオニンがグリコシル化されている。スレオニンに固定されたＯ－結合型糖側鎖は、ルブリシンの境界潤滑機能にとって重要である。側鎖部分は、典型的にはβ（１－３）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ部分であり、β（１－３）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃは、典型的にはシアル酸又はＮ－アセチルノイラミン酸でキャッピングされている。ポリペプチドはまた、Ｎ結合オリゴ糖も含有する。天然に存在する全長ルブリシンをコード化する遺伝子は、１２個のエクソンを含有し、天然に存在するＭＳＦ遺伝子産物は、ヘモペキシン様及びソマトメジン様領域を含めたビトロネクチンと複数のポリペプチド配列相同性がある１，４０４個のアミノ酸（分泌配列を含む）を含有する。中央に位置するエクソン６は、９４０個の残基を含有する。エクソン６は、Ｏ－グリコシル化ムチン様ドメインに富む反復をコード化する。この広範なＯ－結合型グリコシル化ムチン様ドメインは、関節軟骨、腱、心膜、眼球表面など、生体内の様々なバイオ界面におけるＰＲＧ４の境界潤滑性及び非粘着性に必要である(Jay et al., Matrix Biol., 2014; 39:17-24)。

【0028】

[0047] ルブリシンのタンパク質骨格のアミノ酸配列は、ヒトＭＳＦ遺伝子のエクソンの選択的スプライシング次第で異なってもよい。不均一性に対するこの堅牢性は、研究者らが中央ムチンドメインから４７４個アミノ酸を欠く組換え形態のルブリシンを作成したが、それでもなお、控えめながらも適度な潤滑性が達成されたときに例示された(Flannery et al., Arthritis Rheum 2009; 60(3):840-7)。ＰＲＧ４は、単量体としてだけでなく、Ｎ末端とＣ末端の双方で保存されたシステインリッチドメインを介して結合した、二量体及び多量体のジスルフィド結合としても存在することが示されている。ルブリス社は、ヒトルブリシンの完全長組換え形態を開発した。分子は、セレキシスチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ－Ｍ）を使用して発現され、最終的な見かけの分子量は４５０～６００ｋＤａであり、多分散の多量体は１，０００ｋＤａ以上になることが多く、全て、ＳＤＳトリス－アセテート３～８％のポリアクリルアミドゲルの分子量標準との比較によって推定される。全グリコシル化のうち、約半分は２つの糖単位（ＧａｌＮＡｃ－Ｇａｌ）を含み、残りの半分は３つの糖単位（ＧａｌＮＡｃ－Ｇａｌ－シアル酸）を含む。この組換えヒトＰＲＧ４の製造方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１４／０６１８２７号で開示される。

【0029】

[0048] 様々な天然及び組換えＰＲＧ４タンパク質及びイソ型のいずれか１つ又は複数が、本明細書に記載される様々な実施形態で用いられてもよい。例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許第６，４３３，１４２号；米国特許第６，７４３，７７４号；米国特許第６，９６０，５６２号；米国特許第７，０３０，２２３号；及び米国特許第７，３６１，７３８合は、様々な形態のヒトＰＲＧ４発現産物を作製する方法を開示している。本発明の実施における使用に好ましいのは、ＣＨＯ細胞から発現される、全長、グリコシル化、組換えＰＲＧ４、又はルブリシンである。このタンパク質は、１，４０４個のアミノ酸（図１１；配列番号１を参照されたい）を含み、Ｏ－結合型β（１－３）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃオリゴ糖で様々にグリコシル化された配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の反復を含む中央エクソンを含んで、ビトロネクチンとの相同性があるＮ及びＣ末端配列を含む。分子は、個々の分子のグリコシル化パターンが異なる多分散体であり、単量体、二量体、多量体の各種からなる。

【0030】

[0049] 本明細書の用法では、「ＰＲＧ４」という用語は、「ルブリシン」という用語と同義的に使用される。広義に、これらの用語は、機能的な単離又は精製された天然又は組換えＰＲＧ４タンパク質、ホモログ、機能性断片、イソ型、及び／又はそれらの変異体を指す。全ての有用な分子は、エクソン６によってコード化された配列、又はそのホモログを含み、又は例えば、好ましくはＯ－結合型グリコシル化と一緒に、この中央ムチン様ＫＥＰＡＰＴＴ反復ドメイン内の反復がより少ないバージョンなどのその短縮型バージョンを含む。全ての有用な分子はまた、少なくともエクソン１～５及び７～１２によってコード化された配列の生物学的活性部分、すなわち、分子にＥＣＭ及び内皮表面に対する親和性を与えることに関与する配列も含む。特定の実施形態では、好ましいＰＲＧ４タンパク質は、５０ｋＤａ～５００ｋＤ、好ましくは２２４～４６７ｋＤａの平均モル質量を有し、ＰＲＧ４タンパク質の１つ又は複数の生物学的活性部分、又は潤滑断片又はその同族体などの機能性断片を含む。より好ましい実施形態では、ＰＲＧ４タンパク質は、平均モル質量が２２０ｋＤａ～約２８０ｋＤａの間の単量体を含む。特定の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、又は少なくとも９９．７％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列との配列同一性は、少なくとも９８％である。一実施形態では、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列とのＰＲＧ４の配列同一性は、少なくとも９９％である。一実施形態では、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列とのＰＲＧ４の配列同一性は、９９．５％である。一実施形態では、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列とのＰＲＧ４の配列同一性は、９９．６％である。一実施形態では、配列番号１の残基２５～１４０４のアミノ酸配列とのＰＲＧ４の配列同一性は、９９．７％である。

【0031】

[0050] ＰＲＧ４タンパク質などのタンパク質を単離、精製、及び組換え発現するための方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、この方法は、ＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲなどの標準的分子生物学技術を使用して、ＰＲＧ４タンパク質又はイソ型をコード化するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡをクローニング及び単離することから始まる。次に、ＰＲＧ４タンパク質又はイソ型をコード化する単離ｃＤＮＡは、発現ベクターにクローン化され、組換えＰＲＧ４タンパク質を産生するために宿主細胞で発現され、細胞培養上清から単離される。組換えヒトＰＲＧ４を製造するための方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１４／０６１８２７号に記載されている。

【0032】

[0051] これまでのＰＲＧ４の機能は、関節の摩擦低減及び摩耗防止、眼の表面とまぶたの間などのインターフェース組織の潤滑に関わるものがほとんどであった。関節の維持におけるＰＲＧ４の機能的重要性は、ヒトの屈指症－関節症－内反股－心膜炎（ＣＡＣＰ）疾患症候群を引き起こす変異によって示されてきた。ＣＡＣＰは、屈指症；非炎症性関節症；及び内反股変形、心膜炎、及び胸水を伴う肥大性滑膜炎によって顕在化する。また、ＰＲＧ４ヌルマウスでは、軟骨の劣化と引き続く関節障害が観察された。したがって、ＰＲＧ４の発現は健康な滑膜関節の必要な構成要素である。しかしながら、出願人は、ＰＲＧ４を使用して、がんを治療又は抑制できることを今や断定した。

【0033】

がんの治療に使用するためのＰＲＧ４
[0052] 出願人らは、ＰＲＧ４がＣＤ４４に結合でき、したがってＣＤ４４媒介受容体シグナル伝達を下方制御できると判断した。ＣＤ４４は、糖タンパク質であり、炎症に主要な役割を果たす選択的スプライシングとグリコシル化によって生成される様々なアイソ型がある、主要な細胞表面受容体であり(Cutly et al., J Cell Biol 1992; 116(4):1055-62)、様々な細胞間相互作用、腫瘍転移、及びリンパ球活性化に関与する。ＣＤ４４は多数の哺乳類細胞型で発現され、その発現レベルは、細胞型とそれらの活性化状態によって異なる。がん性細胞又は腫瘍性細胞もまた、ＣＤ４４を発現してもよく、このような細胞上のＣＤ４４の存在は、がんの制御及び転移への関与を示す。ヒトでは、ＣＤ４４は１番染色体上のＣＤ４４遺伝子によってコード化されている。ＣＤ４４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖とＩＬ－２産生、ＮＫ細胞傷害活性性の用量反応依存性増強、サイトカインとケモカインのマクロファージ産生、並びにその他の機能を誘導する。

【0034】

[0053] ＣＤ４４の十分確立されたリガンドは、高分子量（ＨＭＷ ＨＡ）を含むヒアルロン酸であり、ＨＭＷ ＨＡはＣＤ４４の細胞外モチーフに結合し、その他のＨＡ結合タンパク質との相同性があり、引き続くＨＭＷ ＨＡの細胞内取り込みをもたらす。(Knudson et al., Matrix Biol 2002; 21(1):15-23; Harada et al., J Biol Chem 2007; 282(8):5597-607; Tibesku et al., Ann Rheum Dis 2006; 65(1):105-8)。低分子量及び中分子量のヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ及びＭＭＷＨＡ）もまた、ＣＤ４４のリガンドである。ＨＡ／ＣＤ４４相互作用は、様々な疾病状態でよく見られる。例えば、結腸上皮から生じるがん腫は、ＨＡに富むな微小環境で発生する傾向があり、その中では上皮腫瘍細胞上のＣＤ４４受容体は、チロシンキナーゼ媒介細胞生存経路を活性化し、抑制されない細胞分裂及び増殖をもたらす(Misra S et al. Connect Tissue Res. 2008;49(3):219-24)。しかしながら、ＣＤ４４はがん幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーとしても認識されており、ＨＡはがん細胞によって発現される(Chen et al., J. Hematol. Oncol., 2018; 1:64)。例えば、ＣＤ４４の発現は、頭頸部扁平上皮がん、乳がんがん、膵臓がん、胃腸がん、結腸直腸腺がん、前立腺がん、結腸がん、膀胱がん、及び白血病で認められている。(Chen et al., J. Hematol. Oncol., 2018; 1:64)。ＣＤ４４へのＨＡ結合は、細胞増殖を誘導し、細胞生存を延長し、細胞骨格変化を調節し、細胞の運動性を促進する、細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。(Chen et al., J. Hematol. Oncol., 2018; 1:64)。

【0035】

[0054] その他のＣＤ４４のリガンドとしては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニン(Naor et al., Adv Cancer Res 1997; 71:241-319; Knudson et al., Cell Mol. Life Sci. 2002; 59:36-44)、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９、ＨＡ血清由来ヒアルロン酸関連タンパク質複合体（ＨＡ－ＳＨＡＰ）、ヘモペキシン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ソマトメジンＢ、オステオポンチン、ＯＫＴ３、又は補体関連タンパク質（Ｃ３ａ、ＣＤ３、ＣＤ４６など）などの細胞外マトリックス構成要素が挙げられる。

【0036】

[0055] 以下の実施例１に提示されるデータによって実証されるように、ルブリシン－ＣＤ４４相互作用は、この糖タンパク質が、その境界の潤滑及び機械的特性を超えた機能を有することを示す。実際に、実施例１Ａ～Ｄは、ルブリシンがリガンドとして作用し、ＣＤ４４に結合することを示す。したがって、ルブリシンはＣＤ４４と結合するので、ルブリシンは、ヒアルロン酸などのリガンドのＣＤ４４への結合を防ぐためのＣＤ４４拮抗薬として使用され、ひいては、細胞増殖を誘導し、細胞生存を増加させ、細胞骨格変化を調節し、がんに関与するとされる細胞運動活性を促進する、ＣＤ４４活性化による細胞シグナル伝達経路の活性化を妨げてもよい。さらに、実施例２～７のデータは、ｒｈＰＲＧ４ががん細胞の浸潤性及び遊走性能力を抑制することを示し、具体的には、ＰＲＧ４の投与は、腫瘍進行に必要ながん細胞のネガティブな挙動を抑制する直接的な効果を有し得る。本明細書に提示されるデータによって実証されるように、これは、少なくともＣＤ４４を介した低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）シグナル伝達を抑制してがん細胞増殖の誘導を妨げる、ｒｈＰＲＧ４の能力によって達成される。

【0037】

[0056] 証拠は、ＣＤ４４シグナル伝達ががんの進行に関与しており、また特定の化学療法薬の有効性に鑑賞してもよいことを示唆する。例えば、化学療法剤であるデキサメタゾンによる治療に対する多発性骨髄腫の抵抗性は、ＣＤ４４とＨＡとの係わり合いによって引き起こされ得ることが示されてきた。(Ohwada et al., Eur J Heamatol 2008; 80:245)。したがって、ＰＲＧ４を使用して、がん細胞表面上のＣＤ４４に結合させ、がん細胞増殖、生存可能性、進行又は転移活性に関与するＣＤ４４シグナル伝達を阻害し得る。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、がんを有する患者又はがんを発症するリスクのある患者に投与され、がんを治療するか又はがん又は腫瘍の増殖若しくは進行を遅延させる。別の実施形態によれば、ＰＲＧ４は、がんの化学療法又は放射線治療と同時に投与されてもよい。したがって、一実施形態では、ＰＲＧ４は、がんを有する患者に投与され、その中では、ＰＲＧ４は、がんを治療するために投与され、又はその中では、ルブリシンは、がんを治療するために、その他のがん治療薬又は治療法と関連して投与される。一実施形態では、がんはヒト対象にある。

【0038】

[0057] 一実施形態によれば、ＰＲＧ４は、がんの化学療法又は放射線治療と組み合わせて患者に投与される。例えば、一実施形態では、化学療法剤は、アクチノマイシン、アブラキサン、アルトレタミン、アラノース、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カバジタキセ、カペシタビン、カルボプラチン、カルモフール、カルムスチン、クロラムブシル、クロルメチン、クロロゾトシン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン(ertramustine)、エチルニトロソウレア、エルロチニブ、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フォテムスチン、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イマチニブ、イクサベピロン、ラパチニブ、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ネララビン、ニムスチン、ニロチニブ、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、プロカルバジン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、ラニムスチン、ラルチトレキセド、レゴラフェニブ、ロミデプシン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾトシン、タフルポシド、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テモゾロマイド、テムシロリムス、テニポシド、チオグアニン、トファシチニブ、トポテカン(opotecan)、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はビスモデギブから選択される。一実施形態では、化学療法剤は、レゴラフェニブ及び／又はソラフェニブである。一実施形態では、化学療法剤は、レゴラフェニブ及び／又はソラフェニブであり、がんは肝細胞がん腫である。

【0039】

[0058] 例えば、一実施形態では、化学療法剤は、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、イブリツモマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、イノツズマブ、ゲムツズマブ、ベバシズマブ、セミプリマブ(camiplimab)、又はスパルタリズマブから選択される抗体である。

【0040】

[0059] 一実施形態によれば、ＰＲＧ４は、がんの放射線治療と組み合わせて患者に投与される。例えば、一実施形態では、放射線治療は、外照射療法、近接照射療法、又は体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である。

【0041】

[0060] 一実施形態では、がんの化学療法又は放射線治療と組み合わせたＰＲＧ４の投与は、化学療法又は放射線治療に対するがんの感受性又は応答性を増強する。したがって、一実施形態では、化学療法又は放射線治療と組み合わせたＰＲＧ４の投与は、化学療法又は放射線治療単独での治療と比較して、がんの治療を改善する。例えば、化学療法又は放射線療法単独による治療と比較して、組み合わせは、患者が治療によりがんの部分寛解又は完全寛解を経験する速度を増加させ、又は組み合わせは、患者が治療によりがんの部分寛解又は完全寛解を経験する可能性を増加させる。換言すれば、併用療法は、化学療法又は放射線治療単独での治療よりも、がんを治療するのにより効果的である。

【0042】

[0061] ＰＲＧ４と抗がん剤との同時投与は、患者への毒性効果がより少ない低用量でそれらを投与することを可能にすることによって、このような薬剤の毒性を低減し得る。したがって、別の実施形態では、ＰＲＧ４をがんの化学療法又は放射線治療と組み合わせて投与することにより、化学療法又は放射線治療を単独で投与した場合のがんを治療するための治療用量よりも低い用量で、化学療法又は放射線治療を投与できる。「治療有効量」は、ヒト患者の特定のがんを治療するのに有効であることが実証されている量を指す。「単独投与の治療有効量」とは、特定のがんを治療するために患者に投与される抗がん剤が唯一の抗がん剤である場合に、ヒト患者の特定のがんの治療に有効であることが実証されている抗がん剤の用量を指す。用量は、治療経過を規定する期間にわたって投与される１日量であってもよい。用量は、治療経過を規定する投薬スケジュールの一部として、一度に投与される単回用量であってもよい。治療有効量は、政府機関によって承認された用量であってもよい。例えば、治療有効量は、所与のがんを治療するために欧州医薬品庁によって承認された用量であってもよい。治療有効量は、がんを治療するために米国食品医薬品局によって承認された用量であってもよい。一実施形態では、ＰＲＧ４はレゴラフェニブと共に投与され、レゴラフェニブは１６０ｍｇ／日未満の用量で投与される。一実施形態では、ＰＲＧ４はレゴラフェニブと共に投与され、レゴラフェニブは１６０ｍｇ／日未満の用量で投与され、がんは肝細胞がん腫である。別の実施形態では、ＰＲＧ４はソラフェニブと共に投与され、ソラフェニブは８００ｍｇ／日未満又は４００ｍｇ／１日２回の用量で投与される。別の実施形態では、ＰＲＧ４はソラフェニブと共に投与され、ソラフェニブは８００ｍｇ／日未満又は４００ｍｇ／１日２回の用量で投与され、がんは肝細胞がん腫である。本明細書で実証されるように、例えば、実施例１３において、ＰＲＧ４がこのような抗がん治療法と同時投与される場合、ＰＲＧ４は、例えば、化学療法剤などの抗がん治療法の治療効果を増強する。その結果、このような抗がん治療法は、治療有効性に必要とされるよりも低用量で投与されてもよい。

【0043】

[0062] 別の実施形態では，ＰＲＧ４は、がんを治療するために免疫療法と組み合わせて投与され、ここで組み合わせは、がんを治療する。例えば、免疫療法は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、イピリムマブ、又はＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－１を標的とする別の薬剤であってもよい。したがって、一実施形態では、免疫療法と組み合わせたＰＲＧ４の投与は、免疫療法単独での治療と比較して、がんの治療を改善する。例えば、免疫療法単独による治療と比較して、組み合わせは、患者が治療によりがんの部分寛解又は完全寛解を経験する速度を増加させ、又は組み合わせは、患者が治療によりがんの部分寛解又は完全寛解を経験する可能性を増加させる。換言すれば、併用療法は、免疫療法単独での治療よりも、がんを治療するのにより効果的である。

【0044】

[0063] 別の実施形態では、本発明は、患者において以前に治療されたがんの再発を予防又は抑制する方法を提供する。この方法は、ＰＲＧ４の治療有効量を患者に投与して、患者におけるがんの再発を阻害又は予防することを伴い、ここで患者は、以前にがん治療を受けて治療されたがんの寛解を経験したか又はがんを切除するための手術を受けている。一実施形態では、患者は以前にがんの完全寛解を経験しており、別の実施形態では、患者は以前にがんの部分寛解を経験している。一実施形態では、再発の予防又は抑制は、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間、少なくとも１０年間又はそれ以上の期間である。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、患者ががんの寛解又は切除を経験した後、毎年、年２回、四半期、又は隔年に、以前に治療されたがんの部位に投与され、患者における以前に治療されたがんの再発を予防又は抑制する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、患者ががんの寛解又は切除を経験した後、毎年、年２回、四半期、又は隔年に、以前に治療されたがんを有する患者に全身投与され、患者における以前に治療したがんの再発を予防又は抑制する。

【0045】

[0064] 一実施形態では、がんの「治療（treating）」、「治療（treat）」、又は「治療（treatment）」は、腫瘍の数及び／又はサイズの減少、転移の数及び／又はサイズの減少、腫瘍の成長又は増殖速度の減少、又は腫瘍の症状の減少をもたらす治療的介入を指す。場合によっては、本発明の方法に従ってがんを治療することにより、患者はがんの完全寛解又は部分寛解を経験することになる。いくつかの実施形態では、がんの「予防（preventing）」、「予防（prevent）」、又は「予防（prevention）」は、がんの部分的又は全面的な発生を抑制することを指す。例えば、いくつかの実施形態では、がんを「予防」することは、非がん性増殖又は腫瘍ががん性腫瘍に変化することを抑制することを意味する一方で、いくつかの実施形態では、がんの予防は、例えば、がんが以前に寛解していた場合、がんが再発することを抑制することを意味する。

【0046】

[0065] 本発明の方法に従ってＰＲＧ４で治療されてもよいがんとしては、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍が挙げられる。一実施形態では、がんは乳がんである。さらなる実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がんである。別の実施形態では、がんは肝細胞がん腫である。

【0047】

[0066] 本発明の方法によれば、がんが治療されている患者は、好ましくはヒトである；しかしながら、患者は、例えば、馬、牛、ブタ、ラット、マウス、イヌ、又はネコなどの任意の哺乳類であってもよい。

【0048】

[0067] ＰＲＧ４は、前述の抗がん剤のいずれかと同時投与されてもよい。一実施形態では、同時投与は、ＰＲＧ４と抗がん剤を、例えば、同じ日に次々に連続して投与することを意味する。その他の実施形態では、同時投与は、ＰＲＧ４が抗がん剤とは異なる日に投与される場合に起こり得る。別の実施形態では、共投与は、１つの製剤においてＰＲＧ４及び抗がん剤を一緒に投与することを含む。別の実施形態では、ＰＲＧ４と抗がん剤とが別々の製剤として同時に共投与される。別の実施形態では、同時投与は、たとえそれらが同時に投与されなくても、ＰＲＧ４と抗がん剤が同じ治療過程中の異なる時点で提供されることを指す。一実施形態では、ＰＲＧ４は、抗がん剤の投与の前に投与される。別の実施形態では，ＰＲＧ４は、抗がん剤の投与の後に投与される。

【0049】

ＰＲＧ４の投与
[0068] 本発明は、ＰＲＧ４が、本明細書で開示される本発明の方法に従って、全身的又は局所的に患者に投与されてもよいことを考察する。がんが特定の組織又は臓器に限局しており、組織又は臓器へのアクセスが、例えば、注射又は局所投与によって可能である場合、局所投与が正当化されてもよい。したがって、ルブリシンは、本明細書で開示される本発明の方法に従って、局所的に投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、腫瘍部位又は腫瘍が切除された部位、或いは腫瘍部位の周囲又は近傍の位置に局所投与又は局所注射によって投与されてもよい。一実施形態では、ルブリシンは、腫瘍の外科的切除時に、腫瘍が除去された後の切除部位に投与される。別の実施形態では、ルブリシンは、切除不能腫瘍への、及び／又は切除不能腫瘍の部位又はその周辺への注射によって、投与される。

【0050】

[0069] しかしながら、ルブリシンは、本明細書で開示される本発明の方法に従って、全身的に投与されてもよい。全身投与は、例えば、がんが血液、リンパ液中にある場合、又はそうでなければ局所投与によって治療され得ない場合、本発明のいくつかの実施形態によって想定される。全身投与はまた、がんが患者の１つの領域に限局されておらず、患者全体又は患者の複数の場所に見られる場合、例えば、がんが転移している場合にも正当化されてもよい。許容可能な全身投与様式の例としては、経口、直腸、舌下、陰唇下、又は口腔内送達などの経腸送達；又は吸入による経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内又は経粘膜送達などの非経口送達が挙げられる。全身投与の別の許容可能な方法は、例えば、静脈内投与、皮下注射、又は筋肉内注射などの注射によるものである。

【0051】

[0070] この方法の一実施形態では、ルブリシンは、境界潤滑を提供するのに不十分な量で提供される。出願人らは、がんに対するルブリシンの効果は、境界潤滑を達成するために必要な濃度よりもはるかに低い濃度で達成され得ると判断した。したがって、一実施形態では、ルブリシンは、０．１μｇ／ｋｇ～４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。例えば、ルブリシンは、０．１μｇ／ｋｇ～２０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、５０μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、５００μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、１００μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、２０００μｇ／ｋｇ～３０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。例えば、ルブリシンは、２０００μｇ／ｋｇ～４０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与されてもよい。別の実施形態では、ルブリシンは、０．１μｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍＬ、又は２５～７５ｍｇ／ｍＬ、又は３０～６０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で投与される。一実施形態では、ルブリシンは３０ｍｇ／ｍＬで投与され、１容量当たり１～１００μＬの小容積で投与される。別の実施形態では、ルブリシンは、１用量当たり１００μＬ～４Ｌの容積で投与される。さらなる実施形態では、ルブリシンは全身投与され、１０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの範囲の血中濃度が達成される。なおも別の実施形態では、ルブリシンは、腫瘍又は切除された腫瘍の部位に１００μＬ～５ｍＬの量で小容積で投与され、ルブリシンの濃度は、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの範囲、又は１０μｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの範囲で提供される。

【0052】

[0071] 投与されるルブリシンの量は、がんのサイズ、タイプ、及び位置、あらゆる転移の程度、医薬製剤、及び投与経路などの変数に左右され得る。所望の血中レベル又は組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は上限レベルを超えて増加され得る。初期投与量は最適量よりも少なくあり得て、治療の過程で投与量が徐々に増加されてもよい。患者には、特定の血中レベルを達成するための誘導用量と、それに続く１つ又は複数の治療又は維持用量が提供されてもよい。最適用量は、日常的な実験によって決定され得る。

【0053】

[0072] ＰＲＧ４は、本明細書で開示される本発明の方法に従って、様々な異なる投薬スケジュール投与され得る。例えば、一実施形態では、ＰＲＧ４は、がんの外科的切除時に局所的に１回投与される。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、毎日、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、１４日毎、又は２８日毎に、がんを治療又は予防するために患者に投与される。例えば、患者は、患者が完全寛解又は部分寛解を経験するまで、ＰＲＧ４による治療を受けてもよい。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、腫瘍ががん化するのを防ぐために、まだがん性でない腫瘍を有する患者に、年単位、隔年単位、四半期単位、又は月単位で投与される。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、患者が化学療法又は放射線療法などのその他の抗がん治療を受けるのと同じ日に患者に投与され、患者がその他の抗がん剤治療を受けるたびに投与される。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、患者が化学療法又は放射線療法などのその他の抗がん治療を受ける前日に患者に投与され、患者がその他の抗がん剤治療を受けるたびに前日に投与される。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、患者が化学療法又は放射線療法などのその他の抗がん治療を受けた翌日に患者に投与され、患者がその他の抗がん剤治療を受けるたびに翌日に投与される。

【0054】

ＰＲＧ４の製剤
[0073] 投与のために、ルブリシンは、好ましくは、薬学的に許容可能な担体と組み合わされる。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な担体」とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、又はその他の問題や合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した緩衝剤、担体、及び賦形剤で、妥当な利益／リスク比に見合ったものを意味する。担体は、製剤のその他の成分と適合性があり、受容者に有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。担体薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与と適合性のある緩衝剤、溶剤、分散媒、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。担体はまた、マトリックス、ハイドロゲル、ポリマー、組織スキャフォールドなどの生体材料、及びコラーゲンスポンジを含めた吸収性担体材料も含んでもよい。エキソソームなどもまた、担体として使用されてもよい。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で公知である。有用な製剤は、製薬分野で周知の方法によって調製され得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。非経口投与に適した製剤成分としては、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶剤などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調節するための薬剤が挙げられる。投与用のルブリシンは、投与単位形態で提示され得て、任意の適切な方法で調製され得て、意図される投与経路と適合性があるように製剤化されなくてはならない。

【実施例】

【0055】

実施例
実施例１：ＣＤ４４ＰＲＧ４がＣＤ４４に拮抗するという実験的証拠
[0074] ヒトＰＲＧ４とＣＤ４４受容体の間の相互作用、及びこの相互作用の結果を評価するために、以下の実験を実施した。

【0056】

[0075] ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合と、高分子ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）との競合は、直接酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）と表面プラズモン共鳴を用いて評価した。ｒｈＰＲＧ４のシアリダーゼ－Ａ及びＯ－グリコシダーゼ消化を実施して、ＥＬＩＳＡを用いてＣＤ４４結合を評価した。リウマチ様関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ－ＦＬＳ）を、２０、４０、及び８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４又はＨＭＷ ＨＡ存在下又は非存在下で、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）で４８時間刺激し、細胞増殖を測定した。ＣＤ４４の寄与は、抗ＣＤ４４抗体（ＩＭ７）との同時インキュベーションによって評価した。ＩＭ７の存在下又は非存在下でＰｒｇ４－／－滑膜細胞をＩＬ－１β又はＴＮＦ－αで処理した後、ｒｈＰＲＧ４の抗増殖効果を調べた。

【0057】

[0076] 変数は、最初に正規性と等分散性について試験した。双方の仮定を満たす変数については、２群間比較ではスチューデントのＴ検定を使用し、２群以上の比較ではチューキーの事後検定を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、それぞれ統計的有意性を検定した。正規性の仮定を満たさなかった変数は、ランクのマン・ホイットニーＵ検定又はＡＮＯＶＡを使用して検定した。統計的有意性のレベルは、α＝０．０５に設定した。データは、平均±標準偏差としてグラフで表される。

【0058】

１Ａ．直接ＥＬＩＳＡ法を用いた、ｒｈＰＲＧ４、高分子量ＨＡ、中分子量ＨＡ、及びビトロネクチンのＣＤ４４への結合
[0077] 高結合型マイクロタイタープレート（米国コーニングのシグマアルドリッチ）をＰＢＳ緩衝液（ウェル当たり１００μＬ）中の４００μｇ／ｍＬで、４℃で一晩、ｒｈＰＲＧ４（Ｍ_ｒ≒２４０ＫＤａ）、高分子量ＨＡ（ＨＭＷ ＨＡ；Ｍ_ｒ≒１，５００ＫＤａ）（米国のＲ＆Ｄシステムズ）、培地分子量ＨＡ（ＭＭＷ ＨＡ；Ｍ_ｒ≒３００ＫＤａ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）、及びビトロネクチン（Ｍ_ｒ≒７５ＫＤａ）（シグマアルドリッチ）で被覆した。ｒｈＰＲＧ４は、ＣＨＯ－Ｍ細胞によって産生される全長産物である（米国マサチューセッツ州フラミンガムのルブリス）。ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０での洗浄後、ウェルを２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ウェル当たり３００μＬ）で室温で少なくとも２時間ブロックした。ＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ）又はＩｇＧ_１Ｆｃ（Ｒ＆システムズ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μｌ）でプレートに加え、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０での洗浄後、抗ＩｇＧ_１Ｆｃ－ＨＲＰ（シグマアルドリッチ）を１：１０，０００希釈（１ウェルあたり１００μＬ）で添加し、室温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０での洗浄後、１ステップＴｕｒｂｏ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ試薬（米国のテルモサイエンティフィック）を使用してアッセイを開発し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。データは、各グループにつき三連のウェルを用いた、４回の独立したアッセイの平均を表す。

【0059】

[0078] ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、ＭＭＷ ＨＡ、及びビトロネクチンと、ＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃ融合タンパク質及びＩｇＧ_１Ｆｃとの結合は、図１Ａに提示される。ＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃ群の４５０ｎｍの吸光度は、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡをコートされたウェルのＩｇＧ_１Ｆｃ群の吸光度より有意に高かった（ｐ＜０．００１）。対照的に、ビトロネクチンがコートされたウェルでは、ＣＤ４４－ＩｇＧ_１ＦｃとＩｇＧ_１Ｆｃとの間に有意差はなかった。

【0060】

[0079] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４と結合し、ＨＭＷ ＨＡ ＣＤ４４の結合に干渉することを示す。ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡは、極めて低い非特異的結合でキメラＣＤ４４に特異的に結合する。対照的に、ルブリシンとの有意な配列相同性を共有するビトロネクチンは、ＣＤ４４結合に対する特異性を示さない。ｒｈＰＲＧ４はＣＤ４４に結合することから、ＣＤ４４の拮抗薬として機能してもよく、それによってＣＤ４４の炎症誘発性シグナル伝達に干渉する。

【0061】

１Ｂ．直接ＥＬＩＳＡ法を用いた、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、ＭＭＷ ＨＡのＣＤ４４への濃度依存性結合、及びＣＤ４４への結合におけるｒｈＰＲＧ４とＨＡ間の競合
[0080] ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡのＣＤ４４への濃度依存的結合は、４００、２００、１００、２０、４、２及び０．１μｇ／ｍＬの高分子でマイクロタイタープレートを被覆することによって実施した。アッセイを上述したように実施した。ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度値をＣＤ４４ ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度値から差し引き、補正されたＣＤ４４ＩｇＧ_１Ｆｃ吸光度値を４００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４群のものに対して正規化し、データをＣＤ４４への結合百分率で表した。組換えＣＤ４４に対する、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡの濃度依存性結合は、図１Ｂに示される。４００、１００、２０、４、及び２μｇ／ｍＬ濃度のＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡで被覆されたウェルと比較して、ｒｈＰＲＧ４で被覆されたウェルでは、組換えＣＤ４４の結合百分率が有意に高かった（ｐ＜０．００１）。さらに、組換えＣＤ４４の結合百分率は、２００μｇ／ｍＬ濃度のＭＭＷ ＨＡで被覆されたウェルと比較して、ｒｈＰＲＧ４で被覆されたウェルで有意に高かった（ｐ＜０．００１）。０．１μｇ／ｍＬ濃度では、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷ ＨＡ、及びＭＭＷ ＨＡで被覆されたウェル間のＣＤ４４の結合百分率に有意差はなかった。データは、各グループにつき三連のウェルを用いた、４回の独立したアッセイの平均を表す。

【0062】

[0081] ＣＤ４４への結合におけるｒｈＰＲＧ４とＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡのどちらかとの間の競合を評価するために、４℃で一晩、１μｇ／ｍＬのＣＤ４４ ＩｇＧ_１Ｆｃ又はＩｇＧ_１Ｆｃ（ウェル当たり１００μＬ）のどちらかで、マイクロタイタープレートを被覆した。引き続いて、ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０でウェルを洗浄し、２％ＢＳＡ（ウェル当たり３００μＬ）を使用してウェルを室温で少なくとも２時間ブロックした。５μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４を、又はｒｈＰＲＧ４（５μｇ／ｍＬ）と０．０１、０．０５、０．２５、１、５又は５０μｇ／ｍＬのＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡとを組み合わせたものをウェル（ウェルあたり１００μＬ）に添加し、６０分間室温でインキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０での洗浄後、ルブリシン特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ ９Ｇ３）を１：１，０００で添加し（１００μＬ／ウェル）、室温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％ツイーン２０での洗浄後、１：１，０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（テルモサイエンティフィック）を添加し（ウェル当たり１００μＬ）、室温で６０分間インキュベートした。アッセイを上述したように開発した。ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度値をＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度値から差し引き、ｒｈＰＲＧ４＋ＨＡ群の補正された吸光度値をｒｈＰＲＧ４群の吸光度値に対して正規化し、データをＣＤ４４への結合百分率で表した。データは、各グループにつき三連のウェルを用いた、４回の独立したアッセイの平均を表す。

【0063】

[0082] 組換えＣＤ４４への結合におけるｒｈＰＲＧ４と、ＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡとの間の競合は図１Ｃに示される。０．０５、０．２５、１、５ｍ、及び２５μｇ／ｍＬのＨＭＷ ＨＡ又はＭＭＷ ＨＡでは、ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合が著しく減少した（ｐ＜０．０５）。

【0064】

[0083] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＨＭＷ ＨＡと同等の親和性で、濃度依存性様式でＣＤ４４に結合することを実証する。さらに、ｒｈＰＲＧ４はＣＤ４４への結合においてＨＭＷ ＨＡと競合する。過剰なＨＭＷ又はＭＭＷ ＨＡの存在は、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４結合を約５０％のみ減少させた。これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４の拮抗薬であることを示唆し；したがって、それはＣＤ４４シグナル伝達を妨害する可能性がある。

【0065】

１Ｃ．表面プラズモン共鳴を用いた、ｒｈＰＲＧ４とＣＤ４４の濃度依存性結合、及びｒｈＰＲＧ４とＨＭＷ ＨＡ間の競合
[0084] ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４－ＩｇＧ１Ｆｃへの結合は、表面プラズモン共鳴を用いて調べた（ビアコアＴ１００、米国ニュージャージー州のＧＥヘルスケアライフサイエンス）。図１Ｃを参照されたい。シリーズＳチップは、ヒト抗体捕捉キットｔ（ＧＥライフサイエンス）を使用して機能化させ、それぞれフローセル１（Ｆｃ_１）及びフローセル２（Ｆｃ_２）の機能化されたチップの表面に、ＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃ又はＩｇＧ_１ＦＣのどちらかに結合させた。ｒｈＰＲＧ４を３００、２５０、２００、１５０、１００、５０μｇ／ｍＬの濃度で、３０μＬ／分で８分間注入し、それに続いて、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５％のＰ２０（ＧＥライフサイエンス）を使用して１０分間解離させた。各サイクルの最後に３ＭのＭｇＣｌ_２の１分間のパルスでチップの表面を再生した。各分析物濃度は、二連で注入した。得られた曲線は二重参照した（すなわち、Ｆｃ_２－Ｆｃ_１、その後、０μｇ／ｍＬ曲線を減算した）。結合動態及び結合親和性は、それぞれ１：１結合／立体構造変化モデルを使用して、ビアエバリュエーションソフトウェアによって、又は定常状態平衡によって判定した。ＣＤ４４への結合におけるｒｈＰＲＧ４とＨＭＷ ＨＡ間の競合を研究するため、ｒｈＰＲＧ４を上記のように０～３００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で注入した。解離期の終了後、ＨＭＷ ＨＡを５０μｇ／ｍＬ（３０μＬ／分）で１分間注入した。次に、ｒｈＰＲＧ４（様々な濃度）のＣＤ４４への二重参照結合シグナルを、ｒｈＰＲＧ４注入後のＣＤ４４へのＨＭＷ ＨＡ結合によって生成された、結合シグナルに対してプロットした。

【0066】

[0085] ｒｈＰＲＧ４の組換えＣＤ４４への結合は、表面プラズモン共鳴を用いて確認した。ｒｈＰＲＧ４は、ｒｈＰＲＧ４の分子量２４０ＫＤａに基づいて、およそ３８ｎＭの見かけのＫ_ｄで、固定化されたＣＤ４４－ＩｇＧ_１Ｆｃとの濃度依存性の会合及び解離を示した（図２Ａ）。ＨＭＷ ＨＡ結合シグナル強度（ｘ軸）とｒｈＰＲＧ４結合シグナル強度（ｙ軸）との間の逆の関係によって示されるように、ｒｈＰＲＧ４は、組換えＣＤ４４へのＨＭＷ ＨＡの結合を妨害した（図２Ｂ）。

【0067】

[0086] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＨＭＷ ＨＡと同等の親和性で、濃度依存性様式でＣＤ４４に結合することを実証する。さらに、実施例１Ｂ及び１Ｃに示されるように、ＣＤ４４に結合したｒｈＰＲＧ４の存在は、ＨＭＷ ＨＡが濃度依存性様式でＣＤ４４に結合するのを妨げ、ｒｈＰＲＧ４及びＨＭＷ ＨＡが受容体上の共通の結合部位を共有することを示してもよい。ＨＡ ＳＦの濃度がルブリシンのおよそ１０倍である関節環境では、本明細書で示される競合的結合データに基づいて、ルブリシンは滑膜細胞及び軟骨細胞の表面のＣＤ４４に結合し、ＨＡの存在下でＣＤ４４を介した生物学的機能を発揮し、それによって、そうでなければ炎症を促進するメディエーターに干渉することによって、関節の恒常性を維持する役割を果たすことが期待される。

【0068】

１Ｄ．ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合に対するムチンドメイングリコシル化の除去の影響
[0087] ルブリシンの境界潤滑能力は、Ｏ－結合型（β１－３）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃオリゴ糖によって媒介される(Jay et al., Glucoconj J 2001; 18(10):807-15)。ノイラミニダーゼとβ－１，３，６ガラクトシダーゼ消化の組み合わせは、ルブリシンの境界潤滑能力を５０％低減した(Jay et al., Glucoconj J 2001; 18(10):807-15)。ＲＡ ＳＦサンプルから分離されたルブリシンは、増加したコア１グリコシル化構造を含有し、Ｌ－セレクチンリガンドの一部であると提案されている硫酸化エピトープを提示する(Estrella et al., Biochem J 2010; 429(2):359-67)。さらに、ＲＡ ＳＦからのルブリシンは、グリコシル化依存様式でＬ－セレクチンに結合し、ＲＡ患者の炎症を起こした滑液及びＳＦに動員された多形核顆粒球を覆う(Jin et al. J Biol Chem 2012; 287(43):35922-33)。

【0069】

[0088] ｒｈＰＲＧ４をシアリダーゼＡ（米国のプロザイム）、Ｏ－グリコシダーゼ（米国のニューイングランドバイオラブズ）又はシアリダーゼＡとＯ－グリコシダーゼの組み合わせを使って、３７℃で１６時間消化した。シアリダーゼＡ消化では、１８０μＬの総反応容積、及び００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４最終濃度で、１２μＬの酵素（１Ｕ／２００μＬ）をｒｈＰＲＧ４に添加した。Ｏ－グリコシダーゼ消化では、非変性条件下で、１８０μＬの総反応容積、３００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４最終濃度で、４．８μＬの酵素（４００万単位／ｍＬ）をｒｈＰＲＧ４に添加した。シアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼ消化では、上記と同じ容量で酵素を使用し、上述のような総反応容積及び最終ｒｈＰＲＧ４濃度でｒｈＰＲＧ４と共にインキュベートした。ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量に対するシアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼ消化の影響は、４～１２％のビス－トリスゲル（ヌーページ、米国のライフテクノロジーズ）を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより判定した。合計２０μＬのｒｈＰＲＧ４又は酵素消化されたｒｈＰＲＧ４を還元条件下（２００ｍＶで６０分間）で実行した後、ゲルコードブルーステイン（米国のテルモサイエンティフィック）を使用して染色した。上記の直接ＥＬＩＳＡ法アプローチを用いて、３０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４被覆濃度を用いて、酵素的に消化されたｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合を未消化ｒｈＰＲＧ４と比較した。データは、それぞれ群当たり三連のウェルを使用した４回の独立した実験の平均を表す。

【0070】

[0089] シアリダーゼＡ消化は、図３Ａに示されるように、未処理対照と比較して、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合百分率の有意な増加（ｐ＜０．００１）をもたらした。同様に、Ｏ－グリコシダーゼ消化は、未処理のコントロールと比較して、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合百分率の有意な増加（ｐ＝０．００８）をもたらした。シアリダーゼＡ消化ｒｈＰＲＧ４と、Ｏ－グリコシダーゼ共消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４結合百分率に、有意差はなかった（ｐ＝０．１０５）。シアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合率は、シアリダーゼＡ消化ｒｈＰＲＧ４（ｐ＝０．００７）、Ｏ－グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４（ｐ＜０．００１）、及び未処理コントロール（ｐ＜０．００１）よりも有意に高かった。シアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼによるｒｈＰＲＧ４の消化は、ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量を約２００ＫＤａに減少させた（図３Ｂ）。

【0071】

[0090] シアル酸の除去とＯ－グリコシル化により、ｒｈＰＲＧ４によるＣＤ４４結合が有意に増加した（ｐ＜０．００１）。シアリダーゼＡとＯ－グリコシダーゼの処理は個別に、ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４受容体への結合の増強をもたらした。累積的なシアリダーゼＡ及びＯ－グリコシダーゼ消化は、個々の酵素消化と比較して、ｒｈＰＲＧ４によるＣＤ４４へのなおもより有意な結合をもたらした。シアリダーゼＡはが糖タンパク質から分岐及び非分岐末端シアル酸残基を切断する一方で、Ｏ－グリコシダーゼは糖タンパク質からのコア１及び２の除去を触媒する。ＣＤ４４結合の増強は、コア１のグリコシル化もシアル酸末端残基も、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４結合に必要でないことを示す。したがって、ｒｈＰＲＧ４タンパク質コアに対するシアル酸付加及びコア１グリコシル化のレベルは、ＰＲＧ４がＣＤ４４に結合する能力に必須ではない。対照的に、これらの残基の除去は、ＣＤ４４との相互作用の強化をもたらす、ｒｈＰＲＧ４セミリジッド桿体形状構造の立体構造変化をもたらしてもよい。

【0072】

実施例２．実施例３～９の材料と方法
（１）プラスミド
[0091] それぞれＣＤ４４配列５’ＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＡ３’及び５’ＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＡ３’を含有する、ＣＤ４４ｉ－１及びＣＤ４４ｉ－２と略記される、ｐＵ６／ＣＤ４４ＲＮＡ干渉－１／ＣＭＶ－強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びｐＵ６／ＣＤ４４ＲＮＡ干渉－２／ＣＭＶ－ＥＧＦＰ発現ベクターは、Sarker et al. (J. Biol. Chem. 2005;280(13):13037-46)に記載されるように作成した。各プラスミドＣＤ４４ｉ－１及びＣＤ４４ｉ－２では、マウスＵ６ ｓｍａｌｌ ＲＮＡプロモーターとＣＭＶプロモーターにより、それぞれヒトＣＤ４４ ｍＲＮＡ標的化ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ（ｓｈ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とＥＧＦＰの発現が誘導される。ｐＵ６／ＣＭＶ／ＥＧＦＰ対照ＲＮＡｉベクターについては、記載されてきた。(Sarker et al., J. Biol. Chem. 2005;280(13):13037-46)。蛍光顕微鏡によるＥＧＦＰタンパク質の発現は、ベクター対照又はＣＤ４４ｉ－１／２形質移入細胞を示した。ｐＣＭＶ５Ｂ／ＣＤ４４／ＦＬＡＧ発現ベクターは、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付けたヒトオープンリーディングＣＤ４４ ｃＤＮＡ（ＣＤ４４／ＦＬＡＧ）をｐＣＭＶ５ＢベクターのＴ４ＤＮＡリガーゼ（米国のニューイングランドバイオラブズ）ベースのライゲーションによって作成した(Kavsak et al., Molecular Cell. 2000;6(6):1365-75)。ＣＤ４４／ＦＬＡＧ ＤＮＡは、ｐｏｌｙＡ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃＤＮＡをテンプレートとして、５’ＣＣＣＡＣＧＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣ３’、及び５’ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣ３’をそれぞれ順方向及び逆方向プライマーとしてＰｗｏポリメラーゼ（米国のロシェダイアグノスティックス）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＴＲＩｚｏｌ－（加国のアンビオンライフテクノロジーズ）抽出ｍＲＮＡをスーパースクリプトＩＩトランスクリプターゼ（加国のインビトロジェン）とプライマーオリゴ－（ｄＴ）１２－１８（英国のアマーシャムバイオサイエンシズ）を使用して逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲ反応に供し、ポリＡｃＤＮＡを作製した。ＣＤ４４ｉ－１／２、及びＣＤ４４／ＦＬＡＧプラスミドは、ＤＮＡ配列分析（カルガリー大学コアシーケンシング施設）によって検証された。

【0073】

（２）細胞株及び形質移入
[0092] ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、米国微生物系統保存機関（米国のＡＴＣＣ）から購入され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；加国のテルモフィッシャー）を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；加国のインビトロジェン）中で培養した。細胞は、５％ＣＯ_２加湿細胞インキュベーター内で３７℃に保ち、３～４日毎に定期的に継代した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、リポフェクタミン３０００試薬（加国のインビトロジェン）を使用して形質移入した。

【0074】

（３）試薬
[0093] 以下の試薬を使用して、本試験の異なるアッセイで細胞を処理した：組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４；米国のルブリスバイオファームからの寄贈；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１～２．５ｍｇ／ｍＬの原液）(Abubacker et al., Ann Biomed Eng. 2016; 44(4):1128-37; Samsom et al., Exp Eye Res. 2014;127:14-9)、組換えヒト成熟形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）（米国のＲ＆Ｄシステムズ；１０μＭの原液）、低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ；ヒアルロン酸ナトリウム；ＨＡ５Ｋ；米国のライフコアバイオメディカル；ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬの原液）、キナーゼ阻害剤（ＫＩ；ＳＢ４３１５４２；加国のミリポア・シグマ；１０ｍＭの原液）(Halder et al., Neoplasia. 2005;7(5):509-21)、ＣＤ４４中和抗体（加国のテルモフィッシャーサイエンティフィック）(Kariya et al. BBA Clinical. 2015;3:126-34)、抗ＰＲＧ４ ｍＡｂ ４Ｄ６（カリフォルニア大学バークレー校のフィリップ・メッサースミス博士からの寄贈）(Abubacker et al., Connective Tissue Research. 2016;57(2):113-23; Chawla et al., Acta biomaterialia. 2010;6(9):3388-94)、マウス免疫グロブリンＧ（マウスＩｇＧ；米国のサンタクルーズ）、４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ；加国のミリポア・シグマ；ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの原液）。

【0075】

（４）三次元培養
[0094] 三次元培養アッセイのために、氷冷された、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ（加国のインビトロジェン）からなる完全増殖培地中の５０μｌの３３％成長因子低減マトリゲル（米国のコーニングインコーポレーテッド）を９６ウェル平底超低付着性プレート（加国のＢＤバイオサイエンシズ）のウェル毎に添加し、それに続いて、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター内で３７℃で、プレートを１時間保管し、ウェル内に１ｍｍ厚のマトリゲル床を形成させた。次に、氷冷された、完全増殖培地中の５０μｌの５０％マトリゲルに懸濁させた約４００個の単離ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレートのウェル毎にマトリゲル床の上に重ね、３７℃の５％ＣＯ_２加湿インキュベーター内でインキュベートした。マトリゲル－細胞懸濁液の添加と３７℃インキュベーションの１時間後、５０μｌの完全増殖培地を固化したマトリゲル－細胞混合物を覆うように添加した。翌日から３日おきに、図の説明にあるように、特定の試薬をなし又はありの新鮮な完全増殖培地５０μｌを三次元培養物に投与した。培養の８日目に、３０倍の対物レンズ（オリンパスＩＸ７０、加国）で光学顕微鏡を使用して、各ウェルから８つの代表的なオルガノイドの微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を撮影した。三次元培養の異なる日に光学顕微鏡でマトリゲル包埋培養物を観察すると、単離細胞は、連続的な分裂を経た後、それぞれが多細胞構造（本明細書ではオルガノイドと称される）を生じたことが示された。対照設定では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの大部分は、滑面の球状表現型を示し、これは、３Ｄ培養のインキュベーション条件に応じて変化し得る。「球状」と称される突起のない滑面のオルガノイドの数を各ウェルの８つの代表的な画像から数え、次に各条件での球状オルガノイドの百分率を棒グラフにプロットした。各実験は、統計解析のために少なくとも３回独立して実施した。

【0076】

（５）免疫細胞化学及び蛍光細胞ベースの分析
[0095] ３Ｄオルガノイドの免疫蛍光分析では、超低付着性８ウェルチャンバースライド（米国のミリポア・シグマ）の各ウェル内の８０μＬの３３％マトリゲルコート上の８０μＬの５０％マトリゲル内で、６００個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を増殖させた。８日目のＤＩＣイメージング後、生存多細胞構造を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％氷冷トリトンＸ－１００溶液での透過処理、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキングがそれに続いた。単層細胞培養物の免疫蛍光分析では、細胞をファルコン８ウェルチャンバー培養スライド（米国のコーニングインコーポレーテッド）のウェル上に播種し、３Ｄ培養について記載されたような固定と透過処理、及び５％ＢＳＡと５％ＰＢＳ中仔ウシ血清によるブロッキングがそれに続いた。細胞内のラミニンとＣＤ４４は、一次抗体としてそれぞれラット抗ラミニン抗体（加国のアブカム）とラット抗ＣＤ４４抗体（加国のテルモフィッシャー）、二次抗体としてアレクサ６４７標識抗ラットＩｇＧ（加国のテルモフィッシャー）を使用して、三次元又は単層培養物を間接免疫蛍光抗体法の供することによって視覚化した。細胞内のアクチンは、固定培養物をテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）コンジュゲートファロイジン（加国のミリポア・シグマ）とインキュベートすることによって視覚化した。ＤＮＡ結合色素ビスベンズイミド（ヘキスト３３３４２；加国のインビトロジェン）を使用して核を検出した。ＣＤ４４ノックダウン分析では、ベクター又はＣＤ４４ ｓｈＲＮＡ形質移入細胞をＧＦＰシグナルで同定した。免疫蛍光画像は、４０倍の対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡（加国のオリンパスＢｘ ＷＩ共焦点顕微鏡）を使用して撮影した。ラミニン、アクチン、核、及びＧＦＰ特異的シグナルの曝露時間は、各実験で一定に保った。各条件について、実験毎に３つのコロニー／フィールドを撮影し、実験毎に各スライド内の染色された細胞の代表として選択した。各実験は、独立して２回繰り返した。

【0077】

（６）生体外トランスウェル浸潤アッセイ
[0096] 一晩培養された０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、すなわち血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をポリカーボネートフィルター（２４ウェルインサート、孔径８μｍ；加国のＢＤバイオサイエンシズ）を使用したトランスウェル浸潤に使用した。細胞を添加する前に、各インサートを２４ウェル組織培養プレートのウェル内に配置し、０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭで平衡化し、３７℃で２時間上部チャンバーと下部チャンバーの双方に添加した。次に、平衡媒体を穏やかに除去し、インサートの上部チャンバー表面を５０μＬの３％マトリゲルで被覆し、３７℃で１時間固化可能にさせた。１×１０^５個の血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、上部のマトリゲル被覆チャンバーに添加した。それぞれの図の説明に記載されるように、５００μＬの完全増殖培地単独又は特定試薬を含有するものを下部チャンバーに添加した。細胞を３７℃で１２時間マトリックスに浸潤可能にさせた後、上部チャンバー上の細胞層をＰＢＳで３回洗浄することによって、非付着細胞を除去した。２回目の洗浄では、コットンチップアプリケーターを使用して、膜の上面の付着細胞を穏やかに掻き取った。トランスウェルインサートを１００％メタノールに－２０℃で１０分間浸漬し、それに続いて０．５％のクリスタルバイオレット色素（加国のＥＭＤミリポア）で室温で１時間染色することによって、浸潤した細胞を固定した。染色された各膜のランダムに選択された８つのフィールドをデジタルカメラに接続されたＤＩＣ顕微鏡（オリンパスＩＸ７０）の１０倍の対物レンズで画像化した。ハンドヘルドカウンターを使用して、各フィールドのクリスタルバイオレット染色された細胞の数を数えることによって、細胞数を得た。処理条件毎の全ての画像の平均細胞数を計算し、さらなる統計解析に使用した。各実験は、少なくとも３回独立して実施した。

【0078】

（７）生体外スクラッチアッセイ
[0097] ５×１０^５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェル組織培養プレートの各ウェル内に播種し、完全増殖培地中でほぼコンフルエンシーまで一晩増殖させ、次に３７℃のインキュベーターで５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、０．２％ＦＢＳを含有ＤＭＥＭ培地中でインキュベートすることによって、一晩血清飢餓状態にした。２００μＬのピペット先端を使用して、一晩血清飢餓状態の細胞単層の正中線に沿ってスクラッチを導入し、それに続いてＰＢＳで洗浄して浮遊細胞を除去し、ＴＧＦβなし又はありの０．２％ＦＢＳ含有培地中で、細胞を単独で、又はＫＩ又はｒｈＰＲＧ４と共に、３７℃のインキュベーターで５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で３６時間インキュベートした。各ウェル内のスクラッチクロージャに続いて、スクラッチを開始してから０時間後と３６時間後に、デジタルカメラに接続されたＤＩＣ顕微鏡（オリンパスＩＸ７０）の３倍対物レンズで各ウェルのスクラッチと周囲の細胞を撮影した。各実験条件毎に、スクラッチの垂直軸に沿って５つの画像を撮影した。イメージＪ（（米国国立衛生研究所）を使用して、画像毎に３つの異なる位置で各スクラッチの幅を測定し、合計１５回測定して、実験条件毎に平均化した。３６時間目の幅の平均を０時間目の幅の平均から差し引いて、各実験条件の０時間目の幅と比較してスクラッチクロージャを取得し、スクラッチクロージャの百分率として表した。

【0079】

（８）細胞抽出物調製物、免疫沈降、及び免疫ブロット法
[0098] 細胞をＰＢＳで洗浄し、全ての増殖培地を除去した。プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含有する、ＴＮＴＥ溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ ［ｖ／ｖ］のトリトン－Ｘ－１００）の適量を細胞単層に添加し、４℃で激しく振盪しながら２０分インキュベーションした。次に溶解産物を微量遠心管に採集し、１３，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。ブラッドフォードベースのタンパク質アッセイ（加国のバイオラッドラボラトリーズ）を使用して、５μＬの溶解産物をタンパク質濃度測定に供した。溶解産物は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有ラエンムリサンプル緩衝液中で、９５℃で３分間煮沸した。免疫沈降分析では、溶解産物を適切な抗体と共に４℃で穏やかに揺すりながら３時間インキュベートした後、免疫複合体をプロテインＧ結合アガロースビーズ（米国のＵＢＰバイオ）と共に、４℃で穏やかに揺すりながら３時間インキュベーした。最後に、ビーズをＴＮＴＥ洗浄緩衝液（０．１％ ［ｖ／ｖ］トリトン－Ｘ－１００）で洗浄し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有ラエンムリサンプル緩衝液中で９５℃で５分間煮沸した。次に、免疫沈降物とインプット溶解産物をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜（加国のバイオラッドラボラトリーズ） に転写した。５％脱脂乳を使用してブロットをブロックし、一次抗体としてのマウス抗－アクチン（米国のサンタクルーズ）、ウサギ抗ｐＳｍａｄ２（加国のアブカム）、マウス抗Ｓｍａｄ２／３（加国のミリポア・シグマ）、ラット抗ＣＤ４４（加国のテルモフィッシャー）、マウス抗ＨＡＳ２（米国のサンタクルーズ）又はマウス抗ＦＲＡＧ（加国のミリポア・シグマ）との４℃で一晩のインキュベーションがそれに続いた。次にＨＲＰ－コンジュゲートヤギ抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ（米国のジャクソンラボラトリーズ）又は抗ラットＩｇＧ（加国のミリポア・シグマ、）をブロットに室温で１時間添加し、ベルサドック５０００画像装置（バイオラッドラボラトリーズ）を使用した、増強化学発光（加国のミリポア・シグマ）及びシグナル検出がそれに続いた。濃度測定分析は、クオンティティワンソフトウエア（加国のバイオラッドラボラトリーズ）を使用して実施した。

【0080】

（９）レポーターアッセイ
[0099] 形質移入の１日前に、 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を約６×１０^４個の細胞／ウェルで、２４ウェルプレート内に播種した。細胞は、ＰＡＩ１プロモーター駆動ホタルルシフェラーゼレポーター（３ＴＰ－Ｌｕｘ）及びＣＭＶ－レニラルシフェラーゼコントロールレポーターコンストラクトで同時形質移した。形質移入の１８時間後、細胞を４時間血清飢餓状態（０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）にし、次に１００ｐＭのＴＧＦβ、１００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４単独又は併用の非存在下又は存在下で、新鮮な低血清（０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）含有培地でインキュベートし一晩静置した。溶解産物を調製し、市販の二重シフェラーゼアッセイキット（加国のプロメガ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を分析した。形質移入効率の変動を考慮して、任意のルシフェラーゼ活性（相対光単位）の値をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。各形質移入について、ＰＡＩ１プロモーター駆動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の百分率増加も判定し、それぞれの基礎状態溶解産物のルシフェラーゼ活性と比較して表した。各実験条件は三連で実行した。

【0081】

（１０）統計解析
[00100] 生化学的及びオルガノイド関連データは、スチューデントのＴ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）による統計分析に続いて、インスタット（米国のグラフパッド）を使用した、チューキー・クレーマー 又はスチューデント・ニューマン・クールズ事後検定に供した。Ｐ＜０．０５の値が、統計的に有意であると見なされた。データは、少なくとも３回独立して繰り返された実験からの平均±ＳＥＭとしてグラフで提示した。

【0082】

実施例２：ｒｈＰＲＧ４は３Ｄ乳がん細胞由来のオルガノイドの抗浸潤性増殖を促進する
[00101] 乳がん細胞の浸潤性に対するｒｈＰＲＧ４の効果を評価するために、本発明者らは、細胞を増殖可能にさせて、生体内で見られるＥＣＭに類似したマトリゲルなどのＥＣＭ構成要素と相互作用させる、三次元（３Ｄ）細胞培養システム（２７）を採用した。増殖因子、ホルモン、又は薬剤などの刺激に対する細胞応答は、単層培養モデルよりも三次元培養モデルの方が、生体内で観察される応答をより良く予測できると報告されており、したがって、増殖をモデル化し、正常細胞及び腫瘍細胞による外部刺激への応答を評価するのにより適切である(Antoni et al., Int. J. Mol Sci. 2015;16(3):5517-27)。

【0083】

[00102] ＴＮＢＣ由来細胞に対するｒｈＰＲＧ４の潜在的な抗浸潤効果を研究するために、本発明者らは、特定の刺激に応答したこれらの腫瘍細胞の遊走性及び浸潤性挙動を簡単に検出及び定量化し得る三次元モデルを採用した。ヒトＴＮＢＣ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞株は、３三次元培養モデルを含めた生体外及び生体内がん研究に広く使用されている、ＴＮＢＣ細胞モデルに相当し(Dadakhujaev et al., Oncoscience. 2014;1(3):229-40; Chanda et al., PloS One. 2017;12(5):e0177639)、したがって本発明者らは、調査においてこれらの乳がん細胞を使用した。予測通り、本発明者らは、細胞外サポートシステムとしてマトリゲルの文脈で培養された、単離された単一のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が分裂し、主に滑面球状表現型を提示する多細胞凝集体を形成することを見いだした（図４Ａ、４Ｂ）。分泌ポリペプチド形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、がんにおいて複雑な役割を果たす(Massague, Nat. Rev. Mol Cell. Biol. 2012;13(10):616-30)。特に、ＴＧＦβは移動と浸潤を促進し得て、したがってがん転移に寄与してもよい(Massague, Nat. Rev. Mol Cell. Biol. 2012;13(10):616-30)。ＴＧＦβが、腫瘍微小環境の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素を再構築する能力は、腫瘍細胞の移動と浸潤を増加させる役割に寄与している(Massague, Nat. Rev. Mol Cell. Biol. 2012;13(10):616-30)。予測通り、本発明者らは、ＴＧＦβが、３Ｄ－マトリゲル－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの滑らかな表面と球状性を破壊し、これらのオルガノイドの浸潤性増殖を促進することを見いだした(Dadakhujaev et al., Oncoscience. 2014;1(3):229-40; Chanda et al., PloS One. 2017;12(5):e0177639)。注目すべきことに、ｒｈＰＲＧ４は用量依存様式で作用し、３Ｄ乳がん細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性を劇的に抑制した。抗ＰＲＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｄ６は、ＰＲＧ４を特異的に認識する(Abubacker et al., Connective Tissue Res. 2016;57(2):113-23; Chawla et al. Acta biomaterialia. 2010;6(9):3388-94)。興味深いことに、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４を対照のマウスＩｇＧとではなく、抗ＰＲＧ４ ｍＡｂ ４Ｄ６とインキュベートすると、乳がん細胞由来オルガノイドのＴＧＦ誘発浸潤性増殖を抑制する能力が低下することを見いだした（図４Ｃ、図４Ｄ）。総合すると、これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４が用量依存的な特異的様式で作用し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性挙動を抑制することを示唆した。

【0084】

[00103] ＴＧＦβ存在下であってさえも、ＰＲＧ４が特異的に作用してＴＮＢＣ由来オルガノイドの非浸潤性表現型を維持するという知見は、単離細胞の添加前に、マトリゲルにＰＲＧ４を添加することで、乳がん細胞由来のオルガノイドのＴＧＦβ誘導性の浸潤性増殖を抑制するのに十分かどうかという重要な問いを提起した。注目すべきことに、三次元培養の設定前でも、ｒｈＰＲＧ４をマトリゲルに塗布することで、３Ｄ－ＴＮＢＣ由来オルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性増殖を抑制するのに十分であった（図４Ｅ、４Ｆ）。

【0085】

[00104] 基底膜の破壊と皮質からストレスファイバー様アクチンへの再編成は、細胞が浸潤性になるための２つの必要条件である(Akhavan et al., Cancer Res. 2012;72(10):2578-88, Tojkander et al., J. Cell Sci.,. 2012;125(Pt 8):1855-64)。ＥＣＭタンパク質ラミニンはオルガノイドの基底膜でそれらの構造的完全性と極性を維持しながら濃縮され、この濃縮は腫瘍性傾向の増加とともに徐々に失われることに留意することが重要である(Debnath et al., Nat. Rev. Cancer, 2005;5(9):675-88, O’Brien et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 2002;3(7):531-7)。このように次に、間接免疫蛍光分析（ラミニン）、蛍光標識ファロイジン（アクチン）、及びヘキスト（核）染色を使用して、ＴＧＦβが３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１由来オルガノイドの基底膜の状態とアクチン組織化を変化させる能力に対するｒｈＰＲＧ４の効果を試験した。未処理のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドでは、オルガノイドの外面を取り囲む固体環としてのラミニンの出現によって示唆されるように、基底膜は無傷であった一方で、アクチンは部分的に皮質性に配向していた（図４Ｇ）。ＴＧＦβは、オルガノイドを取り巻くラミニン環の喪失によって示されるように、オルガノイドの周りの基底膜組織化を破壊し、アクチンストレス繊維様外観を促進した。これらのＴＧＦβ効果は、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１オルガノイドの細胞構成要素の可動性と浸潤を増加させるその能力に一致する(Dadakjujaev et al., Oncoscience. 2014;1(3):229-40, Chanda et al., Plos One, 2017:12(5):e0177639)。興味深いことに、ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβの非存在下又は存在下で、これらの多細胞構造における皮質アクチン組織化と固体ラミニンリング形成を促進した。総合すると、これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４が、ＥＣＭサポートの文脈で増殖したＤ乳がん細胞由来オルガノイドの抗浸潤性増殖挙動を誘導することを示唆した。

【0086】

実施例３：ＰＲＧ４は乳がん細胞の浸潤と遊走を抑制する
[00105] 生体外トランスウェルアッセイを使用して、細胞浸潤に対するｒｈＰＲＧ４の効果を試験した(Dadakjujaev et al., Oncoscience. 2014;1(3):229-40)。具体的には、血清飢餓状態のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をマトリゲル被覆された膜の上面にある上部チャンバーに播種し、下部チャンバーは、ＴＧＦβ不在下又は存在下で、単独で、又は化学誘引物質としてのＴＧＦβＩタイプｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼレセプター（ＴβＲＩ）小分子キナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２（ＫＩ）若しくはｒｈＰＲＧ４と一緒に、１０％ＦＢＳ含有増殖培地を有した(Halder et al., Neoplasia, 2005;7(5):509-21)。ＴＧＦβはＴβＲＩシグナル伝達依存様式で作用し、未処理対照と比較してＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤を促進した（図５Ａ、５Ｂ）。興味深いことに、ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβの非存在下又は存在下で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が浸潤する能力をブロックした。浸潤に加えて、遊走は、転移のために原発性腫瘍部位の外側の部位に移動するがん細胞の能力において重要な役割を果たす(Bendas et al., Int. J. Cell Biol. 2012:676731)。したがって、生体外スクラッチアッセイを実施して、がん細胞の遊走性挙動に対するＰＲＧ４の効果を試験した。各ウェル内の一晩血清飢餓状態のコンフルエントな細胞単層の正中線に沿ってスクラッチを作成し、それに続いて、ＴＧＦβなし又はありの低血清培地で、単独で、又はＫＩ又はｒｈＰＲＧ４と共に、３６時間インキュベートした。ＴＧＦβシグナル伝達は、対照ウェルと比較してスクラッチクロージャープロセスを向上させた一方で、ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβの非存在下又は存在下でスクラッチクロージャープロセスを大幅に遅延させた（図５Ｃ、５Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ｒｈＰＲＧ４が生体外で乳がん細胞の浸潤性及び遊走性を強力に阻害することを示す。

【0087】

実施例４：ｒｈＰＲＧ４はＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達を調節しない
[00106] 実験を実施して、ｒｈＰＲＧ４がどのように抗浸潤性及び抗遊走性抗細胞応答を促進するかを判定した。ｒｈＰＲＧ４が生体外でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＴＧＦβ誘導性浸潤と遊走を抑制したことから、ｒｈＰＲＧ４がＴＧＦβシグナル伝達経路に拮抗してもよいという見解を検証した。細胞表面の同族受容体へのＴＧＦβリガンドの結合は、下流のＴＧＦβシグナル伝達に重要な受容体調節タンパク質Ｓｍａｄ２及び３のリン酸化をもたらす(Massague, Nat. Rev. Mol. Biol. 2012;13(10):616-30)。したがって、ｒｈＰＲＧ４がこれらの細胞において、ＴＧＦβがＳｍａｄ２の最後のＣ末端セリン残基のリン酸化を誘導する能力に影響を与えるかどうかを試験した。ＴＧＦβなし又はありの増殖培地中で、単独で、又はＫＩ又はｒｈＰＲＧ４と共にインキュベートされた、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物の免疫ブロット分析は、興味深いことに、ｒｈＰＲＧ４が、Ｃ末端のセリン残基４６５と４６７の上のＳｍａｄ２のＴＧＦβ誘導リン酸化を測定できる程に変化させないことを明らかにした（図６Ａ、６Ｂ）。

【0088】

[00107] ｒｈＰＲＧ４がＴＧＦβ－Ｓｍａｄ依存性シグナル伝達に影響を与えるかどうかを確認するために、さらなる分析を行った。特に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現が、ＴＰＡ応答要素（３Ｔ）とＴＧＦβ応答遺伝子のプロモーター要素、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）の３つのタンデム反復の制御下にある、広く使用されている３ＴＰ－Ｌｕｘレポーターアッセイを使用した、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄ誘導転写活性に対するｒｈＰＲＧ４の効果(Hsu et al., J. Biol. Chem., 2006;281(44):33008-18) を判定した。内部形質移入効率対照としてのＣＭＶ－ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドと共に、３ＴＰ－ｌｕｘプラスミドを同時形質移入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＴＧＦβなし又はありの低血清含有増殖培地中で、単独で、又はｒｈＰＲＧ４と共に、一晩インキュベートし、溶解し、次にルシフェラーゼアッセイに供した。予測通り、ＴＧＦβは、３ＴＰ－Ｌｕｘレポーター活性の有意な誘導をもたらした（図６Ｃ、６Ｄ）。しかしながら、ｒｈＰＲＧ４は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中で、ＴＧＦβ誘導３ＴＰ－Ｌｕｘレポーター活性を変化させなかった。これらのデータは、ＴＧＦβ誘導Ｓｍａｄ２リン酸化に対する、ｒｈＰＲＧ４の効果の欠如と一致する。総合すると、これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＴＧＦβ－Ｓｍａｄ誘導転写の下流で作用し、遊走及び浸潤の生物学的プロセスに影響を与えてもよいことを示唆する。

【0089】

実施例５：ｒｈＰＲＧ４は乳がん細胞のヒアルロン酸誘導浸潤を抑制する
[00108] 乳がんのＴＧＦβ誘導性浸潤と転移に寄与する重要な下流シグナル伝達軸は、ヒアルロン酸（ＨＡ）－分化抗原群４４（ＣＤ４４）経路であることを示唆する証拠が増えつつある(Meran et al., J. Biol. Chem., 2011;286(20):17618-30; Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22; Midgley et al., J. Biol. Chem., 2013;288(21):14824-38)。いくつかの報告は、ＴＧＦβが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、特に間質における低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）の産生と分泌を触媒する酵素である、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）酵素の存在量を増加し得ることを示唆する(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201; Porsch et al., Oncogene, 2013;32(37):4355-65)。さらに、ＴＧＦβは腫瘍細胞上のＨＡ受容体ＣＤ４４の発現を増加させることが示唆されている(Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22)。次に、証拠は、ＬＭＷＨＡがＣＤ４４と結合し、腫瘍細胞の浸潤及び転移能を増強する、特定のシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことを示唆している(Meran et al., J. Biol. Chem., 2011;286(20):17618-30; Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22; Midgley et al., J. Biol. Chem., 2013;288(21):14824-38)。最近の生体外データは、ｒｈＰＲＧ４が、境界潤滑剤であって抗付着特性を有することに加えて、ＣＤ４４結合についてＨＡと競合してもよく、それは下流のシグナル伝達を抑制し、変形性関節症及びリウマチ様関節炎由来の滑膜細胞の増殖に寄与してもよいという見解を支持する(Alquraini et al., Arthritis Research&Therapy. 2017;19(1):89; Al-Sharif et al., Arthritis Rheumatol. 2015;67(6):1503-13.)。これらの証拠を踏まえて、本発明者らは、３Ｄ乳がん細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ媒介浸潤性増殖のｒｈＰＲＧ４抑制、並びにトランスウェル浸潤及びスクラッチ治癒アッセイによって検出された細胞の浸潤性及び遊走（図４Ａ、５Ａ、５Ｃ）が、ＴＧＦβが制御するＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達軸の破壊を伴うかどうかを問うた。この質問に対処するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＣＤ４４の定常状態タンパク質レベルを特性決定した。免疫沈降とそれに続く細胞溶解産物の免疫ブロット分析は、ＣＤ４４がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で発現されることを示し（図７Ａ）、活性ＣＤ４４依存性シグナル伝達軸の可能性を高めているこの質問に対処するために、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤性挙動に対するＨＡの効果を、転移性疾患の乳房腫瘍間質及び血清中で上昇することが報告されてきた、ＬＭＷＨＡ（＜１０ｋＤａ）を使用して評価した(Wu et al., FASEB J., 2015;29(4):1290-8; Peng et al., Intl. J. Cancer, 2016;138(10):2499-509)。３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、未処理のままにするか、ＬＭＷＨＡの濃度を上げながら、単独で、又はｒｈＰＲＧ４と組み合わせてインキュベートした。ＬＭＷＨＡは量依存様式で作用して浸潤性オルガノイドの比率を増加させ、球状オルガノイドの比率の減少に反映されている（図７Ｂ、７Ｃ）。しかしながら、ｒｈＰＲＧ４は、ＬＭＷＨＡが乳がん細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を促進する能力を抑制した。３Ｄ培養の結果と一致して、本発明者らは、トランスウェル浸潤アッセイでは、ＬＭＷＨＡが浸潤細胞の比率を増加させることを見いだした（図７Ｄ、７Ｅ）。他方、ＨＡ－ＣＤ４４相互作用を妨げるＣＤ４４中和抗体(Kariya et al., BBA Clinical. 2015;3:126-34)、もまた、ＬＭＷＨＡの存在下で細胞の浸潤をブロックした。同様に、ｒｈＰＲＧ４は、外因性ＬＭＷＨＡの存在下で、乳がん細胞の浸潤を阻害できた。総合すると、これらの結果は、ＬＭＷＨＡが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で、ｒｈＰＲＧ４によってブロックされ得る３Ｄ培養とトランスウェル浸潤アッセイの双方において、浸潤性挙動を誘発することを示す。

【0090】

実施例６：ＣＤ４４はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＴＧＦβ誘導浸潤性に極めて重要である
[00109] ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＴＧＦβ及びＬＭＷＨＡ媒介浸潤性が、ＣＤ４４依存性であるかどうかをさらに調べるために、これらの細胞のＣＤ４４をノックダウンする遺伝子サイレンシングのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）アプローチを使用した。ＣＤ４４のエクソン１６とエクソン４の特定の配列をそれぞれ標的化して、２種類のスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を設計した。対照ｐＵ６ＲＮＡｉベクターで、又はｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２を単独又は一緒に発現するＲＮＡｉプラスミドで、形質移入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の溶解産物のＣＤ４４免疫ブロット法により、これらのｓｈＲＮＡが個別に又は一緒に効率的に内因性ＣＤ４４をノックダウンすることを確認した（図８Ａ）。ＲＮＡｉ対照ベクターで、又はＣＤ４４ｉ－１／２を発現するプラスミドで形質移入された固定ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＣＤ４４免疫蛍光分析は、内因性ＣＤ４４の劇的なＣＤ４４ｉ－１／２誘導ノックダウンを示した（図８Ｂ）。

【0091】

[00110] 次に、ＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡの存在下又は非存在下における、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドに対する、ＣＤ４４ｓｈＲＮＡ１／２による内因性ＣＤ４４ノックダウンの効果を試験した。興味深いことに、ＣＤ４のノ４ックダウンは、球状オルガノイドの百分率を増加させ、球状オルガノイドの保存によって実証されるように、ＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡが浸潤性挙動を誘導する能力を抑制した。興味深いことに、ＣＤ４４ｉ－１とＣＤ４４ｉ－２の共発現は、一貫して、ＴＧＦβ又はＨＡの非存在下又は存在下で、オルガノイドのサイズを大幅に減少させた。これらのデータは、ＣＤ４４が、ＴＧＦβ及びＬＭＷＨＡによる、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖の誘導を媒介してもよいことを示唆する（図８Ｃ、図８Ｄ）。

【0092】

[00111] ＭＤＡ－ＭＢ－２３１由来オルガノイドにおけるＴＧＦβ及びＬＭＷＨＡ誘導浸潤性に対する、受容体ＣＤ４４の重要性を確立した後、ＴＧＦβ及びＨＡの非存在下又は存在下でのこれらのオルガノイドに対する、ＣＤ４４の過剰発現の効果を分析した。最初に、ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞からのＣＤ４４ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを増幅し、次にＣＭＶベースのプラスミドにサブクローン化して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中でＣＤ４４／ＦＬＡＧを発現させ、これはＣＤ４４及びＦＬＡＧ免疫ブロット法によって確認した（図８Ｅ）。ベクター対照又はＣＤ４４／ＦＬＡＧ発現プラスミドで一過性に形質移入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から３Ｄ－オルガノイドを生成し、ＴＧＦβ、ＬＭＷＨＡなし又はありの増殖培地中で、単独で、又はｒｈＰＲＧ４と一緒にインキュベートした。ベクター対照で形質移入された細胞に由来する未処理の３Ｄオルガノイドは、ほとんどが球状であり、ＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡとのインキュベーションに際して浸潤性になった一方で、これらの効果はｒｈＰＲＧ４によって大幅に逆転した（図８Ｆ、８Ｇ）。しかしながら、過剰発現したＣＤ４４／ＦＬＡＧは、ＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡ不在下であってさえも、３Ｄオルガノイドの浸潤性増殖を促進した。興味深いことに、ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡの非存在下又は存在下で、過剰発現したＣＤ４４がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を促進する能力を抑制した。これらの結果は、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４依存様式で乳がん細胞の浸潤性増殖を抑制するという概念をさらに支持する。全体として、ＣＤ４４ノックダウン及び過剰発現試験からの知見は、ｒｈＰＲＧ４が、ＣＤ４４の媒介するＴＧＦβ又はＬＭＷＨＡによるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性表現型の促進を抑制することを示唆する。

【0093】

実施例７：ＨＡ－ＣＤ４４軸は乳がん細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性増殖を媒介する
[00112] ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性増殖におけるＣＤ４４の役割をさらに調べるために、３Ｄ培養物を増殖培地で又は増加する濃度のＬＭＷＨＡと共に、単独で、又はＴＧＦβ、ＫＩ、ＣＤ４４中和抗体又はｒｈＰＲＧ４の異なる組み合わせと共にインキュベートした（図９Ａ、９Ｂ）。以前の知見と一致して、ＬＭＷＨＡの濃度を増加させた３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来培養物のインキュベーションは、乳がん細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖殖を促進した。ＴＧＦβは、ＬＭＷＨＡがこれらのオルガノイドの浸潤性増殖を誘導する能力をさらに高めた。興味深いことに、ＴＧＦβ誘導浸潤性増殖を抑制したＫＩは、ＬＭＷＨＡ効果を逆転させ得ず、ＬＭＷＨＡ媒介浸潤は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の下流で作用することが示唆された。逆に、ＣＤ４４中和抗体は、ＬＭＷＨＡ刺激とＴＧＦβ刺激の双方が浸潤性増殖を誘導する能力を抑制し、実際、この介入は、ＫＩ治療法と比較して球状オルガノイドの数を大幅に増加させた。さらに、ＣＤ４４中和抗体によるこれらのオルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性増殖の遮断は、ＴＧＦβがこれらの細胞のＣＤ４４依存性経路に浸潤性を誘導することを示唆する。ＰＲＧ４は、ＣＤ４４抗体と同様に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ及びＬＭＷＨＡ誘導浸潤性増殖を抑制した。これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＬＭＷＨＡとＴＧＦβを介した経路の双方の下流で機能していることを示唆する。総合すると、これらの結果は、ＨＡ－ＣＤ４４軸がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＴＧＦβ誘導浸潤性増殖に顕著に寄与し、このシグナル伝達軸が、ｒｈＰＲＧ４標的であるように見えることを示す。

【0094】

[00113] これらの細胞のＴＧＦβ誘導浸潤性に対するＨＡ－ＣＤ４４経路の影響、より具体的にはヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）酵素によるＨＡ合成の役割をさらに判定するために(Auvinen et al., Breast ccancer research and treatment, 2014;143(2):277-86)、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドに対する４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ、ＨＡＳ阻害剤）の効果(Urakawa et al., Intl. J. Cancer,. 2012;130(2):454-66) を調べた。具体的には、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドを、４－ＭＵなし又はありで、単独で、又はＴＧＦβと一緒に、ＬＭＷＨＡとｒｈＰＲＧ４の異なる組み合わせで、インキュベートした（図９Ｃ、９Ｄ）。４－ＭＵは、ＴＧＦβ誘導３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を抑制したが、これは外因性ＬＭＷＨＡの添加によって逆転した。逆に、ｒｈＰＲＧ４は、４－ＭＵ処理３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドのＬＭＷＨＡ誘導浸潤性増殖を抑制した。総合すると、これらのデータは、ＨＡ－依存様式の、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドのＴＧＦβ誘導浸潤性増殖を示す。さらに、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来球状体のＴＧＦβ及びＬＭＷＨＡ誘導浸潤性増殖の双方のｒｈＰＲＧ４抑制は、ｒｈＰＲＧ４がＨＡ産生及びそのシグナル伝達経路の下流で作用することを示唆する。

【0095】

[00114] 全体として、これらの結果は、３Ｄ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性挙動を促進する上でのＴＧＦβシグナル伝達とＨＡ－ＣＤ４４軸の間の相互作用を示唆する。重要なことに、このデータは、ｒｈＰＲＧ４がＴＧＦβの下流で作用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１由来のオルガノイドの浸潤性増殖を促進するＨＡ－ＣＤ４４軸の能力を抑制してもよいことを示唆する。

【0096】

実施例８：ＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達軸はＴＧＦβとＰＲＧ４によって制御される
[00115] ＴＧＦβが、それによってＣＤ４４シグナルを制御してもよい、分子機序についてさらに理解を深めるために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中のＣＤ４４のタンパク質存在量に対する、ＴＧＦβの効果を免疫ブロット法分析で試験した。 興味深いことに、これらの実験により、ＴＧＦβ－シグナル伝達の活性化が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中のＣＤ４４のタンパク質存在量を促進することが示された（図１０Ａ、図１０Ｂ）。対照的に、本発明者らは、ＰＲＧ４がＴＧＦβの不在下又は存在下で、ＣＤ４４のタンパク質存在量を減少させることを見いだした。ｒｈＰＲＧ４はＴＧＦβ誘導Ｓｍａｄ２リン酸化を減少させず、ｒｈＰＲＧ４媒介ＣＤ４４抑制は、経路のこの段階に関与していなくてもよいことが示唆された。未処理の、ＴＧＦβ及び／又はＰＲＧ４処理された、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来のオルガノイドのＣＤ４４間接免疫蛍光法を用いたその他の分析では、ＴＧＦβがＣＤ４４免疫染色シグナルを増強した一方で、ｒｈＰＲＧ４はＴＧＦβの非存在下又は存在下でこのシグナルを低下させ、したがって免疫ブロット法データがさらに確認された（図１０Ｃ）。

【0097】

[00116] ＨＡＳ２阻害剤である４－ＭＵが、３Ｄ乳ガン細胞由来オルガノイドのＴＧＦ－誘導浸潤性を抑制したことから、ＴＧＦβがＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＨＡの産生を制御していてもよいことが示唆された。したがって、本発明者らは、ＨＡＳタンパク質レベルに対するＴＧＦβの効果を調べた。ＨＡＳ１／２／３イソ型の中で、ＨＡＳ２はこれらのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中で最も多く見られる酵素である(Schwertfeger et al., Front Immunol. 2015;6:236)。免疫ブロット法分析は、ＴＧＦβがＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＨＡＳ２のタンパク質存在量を増加させることを示した（図１０Ｄ、１０Ｅ）。興味深いことに、ｒｈＰＲＧ４は、ＴＧＦβの非存在下又は存在下で、ＨＡＳ２のタンパク質存在量を抑制した。

【0098】

[00117] 重要なことに、これらの分析は、ＴＧＦβとは対照的に、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４とＨＡＳ２のタンパク質存在量の減少を、外因性ＴＧＦβの非存在下又は存在下でもたらすことを明らかにし、これは、ｒｈＰＲＧ４が乳がん細胞のＴＧＦβ誘導浸潤を抑制する機序を提供し得る。

【0099】

実施例９：実施例３～８で提供されたデータからの知見の要約
[00118] 実施例３～８で提供されるデータは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）を有する患者に由来するがん細胞におけるムチン様糖タンパク質ｒｈＰＲＧ４の新規の抗遊走性及び抗侵襲性の役割を実証する。特に、サイトカインＴＧＦβが三次元ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を促進する能力を抑制することによって、ｒｈＰＲＧ４はこれらの多細胞構造の非浸潤性球状形態を維持する。エピスタティック研究により、ｒｈＰＲＧ４がＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達の下流で作用し、その抗遊走性及び抗浸潤性効果を達成することが明らかになった。さらに、データは、ｒｈＰＲＧ４がＴＧβ誘導ＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達活性化を妨害することを示唆し、これは、このサイトカインによるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖に重要な役割を果たす。データは、生化学的分析において、外因性ＴＧＦβの非存在下又は存在下で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＨＡ産生酵素ＨＡＳ２とＨＡ受容体ＣＤ４４のタンパク質存在量をＴＧＦβシグナル伝達が増加させる一方で、ｒｈＰＲＧ４は減少させることを示し、したがってｒｈＰＲＧ４が、これらの細胞において浸潤と遊走を阻害する機序が示唆される。全体として、これらの知見は、ｒｈＰＲＧ４の生物学的機能と潜在的な治療上の意味に重要な洞察を追加する。

【0100】

[00119] ｒｈＰＲＧ４が乳がん細胞で抗遊走及び抗浸潤効果を発揮することは、固形腫瘍の大部分を占める上皮組織由来がんにおけるこの糖タンパク質の役割を実証する。これらの知見は、ｒｈＰＲＧ４が細胞応答を制御し得て、したがって純粋な軟骨境界潤滑剤としての元来の特定された役割を超えて作用するという、高まりつつある見解を支持する重要な証拠に寄与し、組換え糖タンパク質の新たな生物療法活性への新しい次元を示唆する。

【0101】

[00120] 免疫ブロット法及び免疫組織化学分析に基づく(Abubacker et al., Connective Tissue Res., 2016;57(2):113-23; Chawla et al., Acta biomaterialia. 2010;6(9):3388-94)、ＰＲＧ４を特異的に認識する抗ＰＲＧ４ ｍＡｂ ４Ｄ６が、ｒｈＰＲＧ４による乳がん細胞由来オルガノイドの浸潤増殖抑制作用を妨げるという発見は、ｍＡｂ ４Ｄ６がＰＲＧ４中和抗体の役割を果たすことを示唆する。この以前に報告されていない抗ＰＲＧ４活性は、ＰＲＧ４の抗浸潤活性に関連するその他の分子との相互作用をｍＡｂ ４Ｄ６が妨害していることを反映しているかもしれない。この抗体によって標的化されるＰＲＧ４のエピトープの将来の同定は、その抗浸潤性に関してｒｈＰＲＧ４の機能ドメインへの洞察を追加してもよい。

【0102】

[00121] ＴＧＦβは、がんの発生と進行において二重の役割を果たす（３１、４６）。証拠は、腫瘍性疾患の初期段階では、ＴＧＦβが腫瘍抑制因子の役割を果たす一方で、がんの後期では、それが、乳がんを含めた異なるがん腫の浸潤性と転移を促進し得ることを示唆する(Massague, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2012;13(10):616-30; Lebrun et al.,. ISRN Mol. Biol. 2012:381428)。したがって、腫瘍抑制特性に影響を及ぼすことなく、ＴＧＦβの腫瘍促進の役割を下方制御する方法を同定することで、腫瘍増殖をさらに制御してもよい。ｒｈＰＲＧ４が、受容体制御スマッドＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２などのＲ－Ｓｍａｄ）のリン酸化及び転写活性に影響を及ぼすことなく、ＴＧＦβ誘導浸潤性増殖を抑制するという発見は、ＴＧＦβが腫瘍増殖を抑制する能力がそのまま残っているかもしれない可能性を高め、これは将来の調査の対象となり得る。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１由来オルガノイドに対するｒｈＰＲＧ４の抗浸潤作用は、ＬＭＷＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達軸の遮断によって媒介され、シグナル伝達軸は生体内での関連性を有してもよい。一般に、乳房を含む腫瘍細胞における細胞表面糖タンパク質ＣＤ４４の濃縮は、がんの浸潤性、転移性、ひいては予後不良と関連づけられている(Zoller, Nat. Rev. Cancer, 2011;11(4):254-67)。乳がん間質を含めた異なるながん腫で上昇するＨＡ(Auvinen et al., Am. J. Pathology, 2000;156(2):529-36) 、及び血清(Wu et al., FASEB J., 2015;29(4):1290-8; Peng et al., Intl. J. Cancer, 2016;138(10):2499-509) は、ＣＤ４４に対するリガンドの役割を果たす。二糖の繰り返しの数に応じて、ＨＡは一般に、高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷ ＨＡ）と低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）に分類される(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201)。重要なことに、ＬＭＷＨＡ－ＣＤ４４結合は、最終的にがん細胞の浸潤、移動、増殖を促進する別個のシグナル伝達経路の活性化を引き起こし得る(Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22; Wobus et al., Appl Immunohistochem. Mol Morphol., 2002;10(1):34-9; Nam et al., Cellular Signaling. 2015;27(9):1882-94; Liu et al., Cancer Res., 2017;77(14):3791-801)。さらに、ＬＭＷＨＡ－ＣＤ４４クラスターは、腫瘍塊の浸潤前部で間質ＥＣＭの組織修復リを誘導するように作用し得る(Yu et al., Genes&Development, 1999:13(1):35-48)。外因性ＬＭＷＨＡがＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を促進するというここでの新たな発見は、腫瘍間質におけるＬＭＷＨＡの上昇ががん浸潤性を促進し得るという見解と一致する(Auvinen et al., Breast ccancer research and treatment, 2014;143(2):277-86)。ｒｈＰＲＧ４が、がん細胞のＨＡ－ＣＤ４４誘導浸潤性に悪影響を与えるという見解は、ＰＲＧ４が、リウマチ様関節炎及び変形性関節症の滑膜細胞増殖と、ヒト及びマウスマクロファージにおけるいくつかの炎症性サイトカイン産生とを誘導する、ＨＡ－ＣＤ４４媒介炎症性シグナル伝達に拮抗することを示唆する、その他の研究と一致する(Alquraini et al., Arthritis Research&Therapy. 2017;19(1):89; Al-Sharif et al., Arthritis Rheumatol. 2015;67(6):1503-13; Qadri et al., Arthritis Res&Ther., 2018;20(1):192)。全体として、これらの知見は、ｒｈＰＲＧ４とＬＭＷＨＡがＣＤ４４結合に対して競合し(Al-Sharif et al., Arthritis Rheumatol. 2015;67(6):1503-13)、それらを乳がん細胞とＴＧＦβ経路に拡張するという見解と一致する。将来の研究では、その他の各種がん、特にＨＡに富む間質環境における高ＣＤ４４発現がん細胞における、ｒｈＰＲＧ４の抗浸潤効果を調べ得る(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201; Zoller, Nat. Rev. Cancer, 2011; 11(4):254-67)。

【0103】

[00122] 本明細書のデータは、ｒｈＰＲＧ４が、乳がん浸潤を促進する際にＴＧＦβをＨＡ－ＣＤ４４経路の活性化に結び付けることを示す。ＴＧＦβはＨＡＳ酵素、特にＨＡＳ２の発現を促進し、その結果、乳がんのＥＣＭに高レベルのＨＡが蓄積することが示されている(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201; Porsch et al., Oncogene, 2013;32(37):4355-65)。最後に、ＴＧＦβはＳｍａｄ依存様式で、ＣＤ４４の発現を促進することも示されている(Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22; Tripathy et al., Mol. Cell., 2016;64(3):549-64)。この研究では、本発明者らは、ＴＧＦβが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＨＡＳ２とＣＤ４４の双方のタンパク質存在料を増加させることを報告する。総合すると、これらの結果は、ＨＡＳ２の阻害及びＣＤ４４の機能喪失分析の効果と共に、ＨＡ－ＣＤ４４経路がこれらの細胞の浸潤と遊走を誘導するＴＧＦβの能力を媒介する上で、重要な役割を果たすことを示す。

【0104】

[00123] ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来オルガノイドの浸潤性増殖を誘導する、過剰発現したＣＤ４４の能力をｒｈＰＲＧ４が抑制することは、免疫ブロット法及び免疫蛍光法分析で示されたように、ＨＡ－ＣＤ４４結合の減少、及び／又はＣＤ４４とＨＡＳ２タンパク質レベルの減少を伴ってもよい。本発明者らの結果は、ｒｈＰＲＧ４が、Ｓｍａｄ２のリン酸化に影響を及ぼすことなく、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＣＤ４４とＨＡＳ２タンパク質存在量のＴＧＦβ誘導上方制御を低減し得る事を実証し、それがＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達経路の下流で機能していることが示唆される。以前の文献(Li et al., Int. J. Mol. Med., 2015;36(1):113-22)で示唆されているように、ｒｈＰＲＧ４がこれらの細胞におけるＭＡＰＫ活性化を抑制することによって、ＴＧＦβ誘導性ＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達軸を抑制するかどうかは、未だに解明されていない。さらに、異なる細胞型を用いた以前の研究(Al-Sharif et al., Arthritis Rheumatol. 2015;67(6):1503-13)で示されているように、ｒｈＰＲＧ４が乳がん細胞におけるＣＤ４４結合についてＨＡと競合するかどうかは、さらなる研究を必要とする。ＴＮＢＣ乳がん細胞のＴＧＦβ－ＨＡ－ＣＤ４４誘導浸潤を阻害する基本的な機序が何であれ、ｒｈＰＲＧ４が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のｒｈＰＲＧ４が、ＴＧＦβ及びＬＭＷＨ誘導浸潤性の双方を有意に抑制できることは明らかである。

【0105】

[00124] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４が、少なくとも部分的にはＴＧＦβ刺激を媒介するＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達軸の能力を抑制することにより、生体外でＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＴＮＢＣ細胞のＴＧＦβ誘導浸潤及び遊走を抑制し得ることを示す。我々の知見はまた、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４及びＨＡＳ２のタンパク質存在量のＴＧＦβ誘導増加に拮抗し得ることも示し、これはこれらの細胞のＴＧＦβ誘導浸潤性を説明してもよい。最後に、ｒｈＰＲＧ４はまた、これらの細胞のＬＭＷＨＡ誘導浸潤性も阻害し得る。ＴＮＢＣの侵襲性と死亡率がＣＤ４４の高発現と相関していること(Wang et al., Oncology Letters, 2017:14(5):5890-8))、及びＴＧＦβシグナル及びＣＤ４４シグナル伝達軸を標的化する以前の治療ストラテジーは、有望視されているものの有害な副作用があること(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201; Neuzillet et al., Pharmacology&Ther., 2015;147:22-31)を考慮すると、ｒｈＰＲＧ４の臨床評価に向けた迅速な技術移転アップデートの可能性と並んで、ｒｈＰＲＧ４は潜在的な生物学的抗がん療法としての理想的な候補に相当する。結論として、これらの知見は、これまで調査されていなかった乳がんの領域におけるＰＲＧ４の生物学的活性の理解に貢献し、乳がんだけでなく、生存、増殖、転移能についてＴＧＦβ及びＨＡ－ＣＤ４４シグナル伝達に依存している可能性のあるその他のがんを対象とする将来の調査の枠組みを提供する(Misra et al., Front. Immunol., 2015;6:201; Zoller, Nat. Rev. Cancer, 11(4):254-67)。

【0106】

実施例１０：トリプルネガティブ乳がんを有するヒトの治療。
[00125] 非転移性トリプルネガティブ乳がんと診断されたヒト女性に、腫瘍の領域に局所注射によって組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）を投与する。投与は局所麻酔下で行う。生理食塩水中の１００μｇ／ｍＬの濃度のｒｈＰＲＧ４の総量２ｍＬを１４ゲージ針で投与する。腫瘍の内部及びその表面に数回注射することで、腫瘍全体に用量を分散させる。用量は週に１回４週間投与する。４週間後、ＣＴスキャンにより腫瘍のサイズが縮小したことを明らかにする。

【0107】

実施例１１：前立腺がんを有するヒトの治療。
[00126] 結腸がんと診断された８０ｋｇのヒト男性に、中心静脈カテーテルを介した全身投与によって、組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）を投与する。２．０ｍｇ／ｍＬのルブリシンの濃度で２５０ｍＬの生理食塩水中の５００ｍｇのｒｈＰＲＧ４の総量を投与し、約１００μｇ／ｍＬの血中濃度を生じさせる。用量は週に１回４週間投与する。４週間後、ＣＴスキャンにより結腸の腫瘍のサイズが縮小したことを明らかにする。

【0108】

実施例１２：トリプルネガティブ乳がんを有するヒトの治療。
[00127] 非転移性トリプルネガティブ乳がんと診断されたヒト女性に、腫瘍の領域に局所注射によって組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）を投与する。投与は局所麻酔下で行う。生理食塩水中の１０μｇ／ｍＬの濃度のｒｈＰＲＧ４の総量２ｍＬを１４ゲージ針で投与する。腫瘍の内部及びその表面に数回注射することで、腫瘍全体に用量を分散させる。用量は週に１回４週間投与する。ｒｈＰＲＧ４の投与スケジュール中に、標準プロトコルに従ってタキサンとドキソルビシンのカクテルもまた患者に投与する。４週間後、ＣＴスキャンにより、腫瘍のサイズが縮小し、タキサンとドキソルビシンのみで治療されている患者よりも速い速度で縮小したことを明らかにする。

【0109】

実施例１３：ルブリシンによる肝細胞がん腫の治療
[00128] 肝細胞がん腫は、最も頻度が高く、致死的な新生物の１つであり、現在用いられている治療法にしばしば抵抗性を示す。ラフェニブとレゴラフェニブの投与は、このがんを治療するための優先的な薬物ベースのアプローチの１つであるが、全体として、満足のいく効果は得られない。しかしながら、これらの薬剤を様々なその他の化合物と組み合わせてその有効性を高めることは、ますます追求されている有望なストラテジーである。７８人のＨＣＣ患者の腫瘍及び腫瘍周囲組織のマイクロアレイ分析に基づいて、この実施例は、ルブリシン（ＰＲＧ４）がＨＣＣで発現され、さらに重要なことに、それがＨＣＣ患者の生存率の増加と強く相関している（ｐ＜０．００１）ことを示す。ＨＣＣ患者から単離されたヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）はルブリシンタンパク質を産生し、培養培地中で形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）で処理されたヒトＨＣＣ標本は、ルブリシンを放出した。さらに重要なことに、この実施例は、全長組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）による治療が、細胞増殖に大きな影響を与えないものの、ＨＣＣ細胞増殖を阻害するソラフェニブとレゴラフェニブの能力を劇的に高めることを示す。これらのデータは、ＴＧＦβの潜在的な新規腫瘍抑制の役割、及びルブリシンが腫瘍抑制機能を発揮してもよいことを示唆する。したがって、この実施例は、非合成の生理学的に生成された化合物ｒｈＰＲＧ４が、単独で、又はソラフェニブとレゴラフェニブとの組み合わせで、抗腫瘍剤として作用し、ＨＣＣの治療において価値があってもよいことを示す。

【0110】

[00129] 肝細胞がん腫（ＨＣＣ）は、世界中でがん関連死の最も頻繁な原因の１つである。ＨＣＣを有する患者の大多数は、外科的アプローチ又は高周波アブレーションに基づく治癒的治療に適格でないことから、全身的な薬物ベースの治療が必要である。しかしながら、ソラフェニブとレゴラフェニブなどの化合物の投与における複数年の経験は、全生存の観点から期待外れの結果をもたらした。(Kudo et al., Lancet 2018. doi:10.1016/S0140-6736(18)30207-1; Bruix et al. Lancet 2017. doi:10.1016/S0140-6736(16)32453-9; Abou-Alfa et al. N Engl J Med 2018. doi:10.1056/NEJMoa1717002; Kok et al. Cancers (Basel) 2019. doi:10.3390/cancers11070985)。ＨＣＣの腫瘍進行の根底にある分子機序に関する知識が乏しいこと、並びに付随する既存の肝疾患のためにこの疾患によって示される、腫瘍間及び腫瘍内の高い不均一性は、精密医療アプローチの開発を妨げている。(Nault et al., Clin Cancer Res 2015. doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-2602; Torrecilla et al., J Hepatol 2017. doi:10.1016/j.jhep.2017.08.013; Hung et al., 2019 doi:10.1007/978-3-030-21540-8_14)。上皮がん細胞と周囲の微小環境、特にがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）との間のクロストークは、ＨＣＣ進行に重要な役割を果たし、その結果、臨床転帰に重大な影響を与えると考えられている。(Kudo 2018 supra, Bruix 2017 supra)。

【0111】

[00130] ＣＡＦの起源については、まだ議論の余地がある。慢性肝疾患の炎症性及び進行性線維化過程、及びＨＣＣの発生過程で、多様な肝内細胞が表現型変化を起こし、最終的にＣＡＦに分化することが示唆されている。これに関連して、ＣＡＦは隣接する悪性細胞によって表現型的にプログラムされ、続いて、おそらくは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含めた異なる分子の沈着又は分泌を通じて、ＨＣＣ細胞の増殖と拡散を促進してもよい(Mazzocca A et al., Hepatology 2011. doi:10.1002/hep.24485; Mazzocca et al., Hepatology 2010. doi:10.1002/hep.23285)。実際、ＣＡＦは、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、エラスチン、及びプロテオグリカンなどのＩ型及びＩＩＩ型非コラーゲン性糖タンパク質のような小繊維コラーゲンを含めたＥＣＭ沈着の主要な寄与体である。(Bataller R et al., J Clin Invest 2005. doi:10.1172/JCI200524282)。プロテオグリカン（ＰＧ）は、高度にグリコシル化された高分子量タンパク質のクラスであり、全ての線維性組織、特に軟骨組織で広く発現され、関節の滑りを可能にする潤滑機能を有する。バーシカン（ＶＣＡＮ）などのいくつかのＰＲＧは、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－βによって発現が上方制御され、驚くべきことに、がん浸潤に寄与している。(Nikitovic et al., IUBMB Life 2006. doi:10.1080/15216540500531713; Cross et al. Prostate 2005. doi:10.1002/pros.20182)。最近、プロテオグリカンルブリシンのヒト組換え形態が、ＣＤ４４軸に作用することによって、ＴＧＦβ媒介乳がん細胞浸潤を阻害することが示された。(Sarkar et al. PLoS One 2019. doi:10.1371/journal.pone.0219697)。

【0112】

[00131] ＴＧＦβは、ＨＣＣにおいてより浸潤性で悪性の表現型を促進することが広く報告されてきた。(Mazzocca 2010 supra; Fransvea et al., Hepatology 2008. doi:10.1002/hep.22201; Fransvea et al., Hepatology 2009. doi:10.1002/hep.22731; Mazzocca et al., Hepatology 2009. doi:10.1002/hep.23118; Fransvea et al., Cancer Chemother Pharmacol 2011. doi:10.1007/s00280-010-1459-x)。ＴＧＦβ経路阻害剤であるガルニセルチブは、進行したＨＣＣを有する患者を対象とした多施設臨床試験で有効であることが報告された。(Abou-Alfa et al. N Engl J Med 2018. doi:10.1056/NEJMoa1717002。さらに、前臨床実験モデルでは、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害することで、ＨＣＣの侵襲性が低下し、ＣＤ４４の発現が低下した。(Rani et al., .Cell Death Dis 2018. doi:10.1038/s41419-018-0384-5)。ルブリシンの潜在的な抗腫瘍機能に照らして、この実施例では、患者の設定におけるその役割、並びにＨＣＣ細胞の増殖を制限して、ソラフェニブとレゴラフェニブの生体外細胞増殖阻害の可能性を高めるその機能を調べる。

【0113】

材料と方法
[00132] 細胞及び試薬：ＨＬＥ及びＨＬＦ細胞株は、ＪＣＲＢ細胞バンク（日本）から購入した。Ｈｅｐ３Ｂ及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株はＡＴＣＣ（米国）から購入した。これらの細胞株は全て、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質－抗真菌剤、Ｈｅｐｅｓ、及び１０％ウシ胎仔胎児血清（ＦＢＳ）（テルモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）中で培養した。全長組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）は、ルブリスバイオファーマ（米国マサチューセッツ州ウェストン）から提供された。

【0114】

[00133] 安定したＣＤ４４サイレンシング：対照の非標的化（Ｖ）、又はの特異的ＣＤ４４－標的化ｓｈＲＮＡ配列（Ａ～Ｄ）を保有するレンチウイルス粒子で、ＨＬＥ及びＨＬＦ細胞株を形質導入し、ピューロマイシン二塩酸塩（テルモフィッシャーサイエンティフィック）で選択して、製造業者の指示（米国メリーランド州ロックビル２０８５０のオリジーンテクノロジーズ社）に従って、安定したＣＤ４４サイレンシングを取得した。対照－ｓｈＲＮＡ配列（Ｖ）及びＣＤ４４－ｓｈＲＮＡ配列Ｂを、ＣＤ４４下方制御を伴う全ての実験で使用した。ＣＤ４４サイレンシング効率は、図２０に示される。

【0115】

[00134] 増殖アッセイ：１００μｌの完全培地に、３，０００個の細胞を９６ウェルプレートのウェル内に播種し、一晩放置して完全に付着させた。翌日（時間ｔ＝０時間）、培地を除去し、ソラフェニブ（２．５μＭ）、レゴラフェニブ（２．５μＭ）、ｒｈＰＲＧ４（１２．５～１００μｇ／ｍｌ）の存在／不在下で１００μｌの新鮮な培地と交換した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びＰＢＳ＋０．０１％ツイーン２０を、それぞれソラフェニブ／レゴラフェニブ及びｒｈＰＲＧ４のビヒクルとして使用した。各細胞株について三連のウェル内の細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、ｐＨ７．６、１０分間のインキュベーション）でｔ＝０時間に固定し、次にクリスタルバイオレット（ＣＶ）で染色して、完全に洗浄して過剰な染色を除去した。７２時間後、１００μｌの４％ＰＦＡを培地に直接添加して細胞を固定し（２％の最終ＰＦＡ濃度、２０分間のインキュベーション）、既述のようにＣＶ染色のために処理した。次に、１００又は２００μｌの１％ドデシル硫酸ナトリウムをウェルに添加し、染色された細胞から完全にＣＶが放出されるまでプレートを振盪し続けた。光学密度は、プレートリーダーを用いて波長５９５ｎｍで測定した。

【0116】

[00135] 免疫蛍光法：クリオスタットミクロトームを使用して、ＨＣＣ腫瘍サンプルの５μｍ厚の切片を切断した。切片をブロック緩衝液（ＲＰＭＩ中の１０％ＦＢＳ）と共に３０分間インキュベートして非特異的抗体結合を最小限に抑え、次に同一緩衝液中で希釈された一次抗体と共に２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し（各洗浄は振盪しながら５分間）、最後に二次ＡＦ４８８共役又はＡＦ５９４共役抗体とインキュベートした。このステップの最後に、切片を既述のように４回洗浄し、ＤＡＰＩを添加したベクタシールド退色防止封入剤で封入した。

【0117】

[00136] アッセイ：１００μｌの無血清ＤＭＥＭ（＋０．５％ＢＳＡ）で希釈した、５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートの未被覆、ｒｈＰＲＧ４、又はフィブロネクチン（ＦＮ）被覆ウェル上に、次に３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。等容積の４％ＰＦＡ（ＰＢＳ中ｐＨ７．２）を添加し、プレートを即座に数秒間フリックして混合した。３０分後、培地を除去し、付着細胞をクリスタルバイオレットで１０分間染色した。３０分後、培地を除去し、付着した細胞をクリスタルバイオレットで１０分間染色した。水道水と蒸留水で十分に洗浄した後、染色した細胞を乾燥させ、次にそれらを１００μｌの１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で可溶化した。吸光度は５９５ｎｍで読み取り、付着細胞数に比例していた。

【0118】

[00137] トランスウェル遊走アッセイ：アッセイは以前記載されたように実施した。(Dituri et al., PLoS One 2013. doi:10.1371/journal.pone.0067109)。簡潔に述べると、その膜の下面があらかじめフィブロネクチンで被覆されたトランスウェルの上部チャンバーに１５，０００個の細胞を負荷し、下部チャンバー内の無血清ＤＭＥＭ培地（＋０．５％ＢＳＡ）中で希釈されたｒｈＰＲＧ４（２５μｇ／ｍｌ）の存在／不在下で、１６時間移動させた。次に、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。５つのフィールド／膜を撮影し、細胞／フィールドの数を測定した。

【0119】

[00138] ウエスタンブロット：組織タンパク質は、停止プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー（テルモフィッシャーサイエンティフィック）を添加した、Ｔ－ＰＥＲ組織タンパク質抽出試薬を使用して抽出した。簡潔に述べると、タンパク質は、組織ホモジナイザーを使用して抽出した。溶解産物を氷上で３０分間インキュベートし、１０分毎にボルテックス処理した。次に、サンプルを１３，０００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心分離して清澄化し、不溶性残骸を沈殿させた。上清（抽出されたタンパク質を含有する）は、ブラッドフォード試薬（バイオラッド）を使用してタンパク質濃度をアッセイした。次に、タンパク質をラエンムリ緩衝液及び１０％β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）と混合し、９５℃で５分間変性させた。１０～２０μｇの総タンパク質を４～２０％ＰＡＡゲル上に負荷し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動した。

【0120】

[00139] ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成：３０～６０μｇの凍結生体外処理ＨＣＣ組織を、液体窒素の存在下で薄い粉末が得られるまで乳鉢乳棒を使用して粉砕した。粉砕組織を０．５～１ｍｌのＲＬＴ緩衝液＋１％（ＢＭＥ）で溶解し、製造業者の推奨（ＲＮイージーキット、キアジェン）に従って処理した。ＣＡＦからのＲＮＡ単離は、ＲＮイージーキットハンドブックで提案されている手順に従って実施した。得られたＲＮＡは、ナノドロップ２０００／２０００ｃ（テルモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、品質と濃度をアッセイした。相対的データシートに従って、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（テルモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。

【0121】

[00140] リアルタイムＰＣＲ：１ｎｇ／μｌのｃＤＮＡを、特定の目的の遺伝子に言及した、それぞれの５００ｎＭの順方向及び逆方向プライマーと、２ｘＳＹＢＲグリーンマスターミックス（バイオラッド）の存在下で、合計２０μｌ反応混合物中で使用した。反応は、ＣＦＸ９６タッチリアルタイム検出システム（バイオラッド）で実施した。

【0122】

[00141] ＣＡＦ単離：外科的切除の直後に、ＨＣＣ腫瘍及び腫瘍周囲標本を０．５～１ｃｍの小片に刻み、ＭＡＣＳ組織保存溶液（ミルテニーバイオテク）中に放置した。次に、組織をさらに小さなサイズの小片（１～２ｍｍ）に切断し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、ＩＶ型コラゲナーゼ（テルモフィッシャーサイエンティフィック）及び３ｍＭのＣａＣｌの存在下で、３７℃で穏やかに回転させながら４時間ＨＢＳＳ中でインキュベートした。このステップの終了時に、より大きなサイズのオリフィスの５０ｍｌピペットで消化された組織を上下にピペット操作することによって、解離を機械的に促進した。浮遊細胞を採取し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳの通常の培養条件で播種した。デカントされた部分的に消化された組織標本は、（既述のように）２回目の消化に供した。得られた解離細胞をＨＢＳＳで洗浄し、ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ中で培養した。これらの細胞を２～３回継代し、上皮／免疫／非付着細胞を排除した。ＣＡＦ調製物の純度を評価するために、免疫蛍光法又はフローサイトメトリー分析を実施して、間葉系マーカー（ビメンチン及びａＳＭＡ）の発現を評価した。最小限の汚染非線維芽細胞（主にがん性肝細胞、胆管細胞、及びマクロファージ）の存在は、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５、及びＣＤ１１ｂに対する抗体を使用して評価した。

【0123】

[00142] ＣＡＦ処理及びＣＡＦ馴化培地のルブリシン免疫枯渇：ＣＡＦを完全ＩＭＤＭ培地（＋２０％ＦＢＳ）中で、最終濃度５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１（ペプロテック）存在下／不在下で４８時間処理し、次に無血清培地で３回洗浄し、セクレトーム濃縮のためにさらに４８時間無血清培地でインキュベートした。次に、馴化培地を採取し、セントリコンデバイス（３ｋＤａカットオフ、メルク・ミリポア）を使用して濃縮し｝、製造業者の指示（シュアビーズプロテインＢ、バイオラッド）に従って、抗ルブリシン又はイソタイプ抗体結合ＰＢＳで事前に洗浄した磁性マイクロビーズと共にインキュベートした。次に、ルブリシンが枯渇した培地又は枯渇していない培地について、タンパク質濃度をアッセイし、さらなる試験に使用した。

【0124】

[00143] ＨＣＣ初代細胞株ＰＬＣ／ＤＣ／１９の特性評価：ＨＣＣ初代細胞株ＰＬＣ／ＤＣ／１９は、ＣＡＦを分離するのと同じ単離手順に従って、新鮮に採取された外科的に切除されたＨＣＣ標本から単離した。細胞の免疫表現型の特性評価は、抗体を使用して幹細胞性マーカー（ＯＶ６、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、及びＣＤ９０）、上皮マーカー（ＡＦＰ、Ｅ－Ｃａｄｈ、ＥｐＣＡＭ）、間葉系マーカー（Ｖｉｍ、Ｎ－Ｃａｄｈ、αＳＭＡ）、及びその他のがん関連表面タンパク質（ＣＤ１３、ＣＤ１５１）を検出することにより、数回（＜１０）の培養継代後に行った（図２１）。

【0125】

[00144] マイクロアレイ分析：マイクロアレイ分析は、既述のように実施した（ｇｕｔ２０１６）。簡潔に述べると、トリゾール（米国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン）を使用して、ＨＣＣの最初の同定時に前向きに登録された患者のコホートで得られた、非腫瘍（ＮＴ）及び腫瘍（Ｔ）肝臓組織から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡは４ｘ４４Ｋ全ゲノムオリゴヌクレオチドベースの遺伝子発現マイクロアレイを使用して処理した（カリフォルニア州パロアルトのアリジェントテクノロジーズ；ドイツ国ベルギッシュグラッドバッハのミルテニーバイオテク社のゲノミクスサービス部門）。クイックアンプ標識キットとワンカラーマイクロアレイベースの遺伝子発現解析プロトコルを用いて、アジレントによって提供される指示に従って、標識及びハイブリッド形成手順を実施した。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、標識及び増幅のステップで、ｃＤＮＡをｃＲＮＡに変換し、Ｃｙ３－ＣＴＰで標識した。精製後、ｃＲＮＡをアジレント全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ４ｘ４４Ｋにハイブリダイズさせた。シグナルを定量化し、リニアローネス法を用いて結果を正規化した後、データベース管理、品質管理、及び解析のためのレゾルバソフトウェア（ワシントン州カークランドのロゼッタバイオソフトウェア）に、データを取り込んだ。遺伝子発現データは、受入れ番号ＧＳＥ５４２３６の下に、遺伝子発現オムニバスウェブサイト(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)で入手できる。

【0126】

[00145] 統計解析：生存分析。カプラン・マイヤー法を使用して、全生存の累積確率を推定した。患者は、ＬＴ、死亡、又は最後に利用可能なフォローアップの時点で打ち切られた。観察された確率の違いは、ログランク検定を使用して評価した。

【0127】

結果
[00146] ＨＣＣ患者の腫瘍組織におけるＰＲＧ発現レベル：本発明者らは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、パーレカン（ＨＳＰＧ２）、バーシカン（ＶＣＡＮ）、及びルブリシン（ＰＲＧ４）をはじめとする、異なるＰＲＧの発現レベルを、前向きに募集した７８人のＨＣＣ患者のコホートにおいて、同じ対象からの腫瘍組織と腫瘍周囲組織のペアのマッチドマイクロアレイ遺伝子発現解析を組み合わせて解析した。患者は、中央値より上又は下の各ＰＲＧのｍＲＮＡ発現レベルに従って層別化した。以前に報告されたように、腫瘍中の目的の遺伝子の発現値を腫瘍周囲組織の値から差し引いて、同じ遺伝子のバックグラウンド腫瘍周囲発現に対して正規化された正味の遺伝子発現変化を得た。(Villa et al., Gut 2016. doi:10.1136/gutjnl-2014-308483)。注目すべきことに、カプラン・マイヤー分析によって示されるように、ルブリシンの発現レベルが高い患者は、発現レベルが低い患者と比較してより長く生存した（ｐ＝０．０００）一方で、ＣＳＰＧ４、ＨＳＰＧ２、及びＶＣＡＮは、生存との有意な相関係を示さなかった（図１３）。したがって、この実施例は、ルブリシンがＨＣＣ組織で発現され、高いレベルがより長い生存と相関していることを示す。

【0128】

[00147] ルブリシンはＨＣＣ腫瘍及び腫瘍周囲組織に存在しＴＧＦβ刺激の下で発現する：本発明者らの以前のマイクロアレイデータをさらに確認するために、本発明者らは、ウエスタンブロッティングによって、２つの正常な肝臓及びＨＣＣ患者からの１４個の腫瘍と周囲の非がん性標本のペアにおける、ルブリシンタンパク質の存在を調べた。次に、本発明者らはまた、異なる検体中のルブリシンの量も比較した。図１４Ａに報告されているように、ルブリシンのタンパク質発現レベルは、正常な肝臓、腫瘍と腫瘍周囲組織の間で類似していたが、異なるサンプル間で非常に変動した。これは、ルブリシンタンパク質の発現量が、腫瘍発生に関連する付帯徴候ではなく、むしろ個々の腫瘍又は腫瘍周囲組織の微小環境に特有の特徴であることを示唆する。

【0129】

[00148] ＨＣＣ進行に対するルビジンの関与を理解するために、本発明者らは、免疫蛍光法によってその発現をＨＣＣ組織に局在化させ、そこでそれは主に腫瘍の間質区画に分布しており、主にα平滑筋アクチン陽性（αＳＭＡ＋）細胞の近傍で検出される（図１４Ｂ）。

【0130】

[00149] 間質細胞のルブリシン分泌への関与をサポートするために、本発明者らは、ＣＡＦ及び生体外ＨＣＣ標本をＴＧＦβ、ＴＧＦβＲＩ阻害剤であるＬＹ２１５７２９９（ガルニセルチブ）、又はその双方で４８時間チャレンジし、ＰＲＧ４ ｍＲＮＡ発現を分析した。ＴＧＦβがＣＡＦ（ｐ＜０．０１）とＨＣＣサンプル（ｐ＜０．０５）の双方でルブリシンの発現を著しく増強した一方で、ＬＹ２１５７２９９はこの効果を相殺した（ｐ＜０．０１）。興味深いことに、ＬＹ２１５７２９９は対照と比較して、ルブリシンの発現もまた下方制御した。これはおそらく、少なくとも部分的には、この薬剤によって発揮される内因性ＴＧＦβ経路の遮断に依存する。同じ実験条件下で、本発明者らは、αＳＭＡ、ＣＳＰＧ４、ＨＳＰＧ２、及びＶＣＡＮのｍＲＮＡ発現もまた分析した。一貫して、ＣＡＦの筋線維芽細胞表現型は、ＴＧＦβによって増加した（強化されたαＳＭＡ発現によって示される）。ＴＧＦβはまた、ＨＣＣの培養組織ではＨＳＰＧ２とＶＣＡＮの発現レベルを有意に増加させ（それぞれｐ＜０．０５とｐ＜０．０１）、ＣＡＦではＶＣＡＮは増加させるがＨＳＰＧ２は増加させないことから、ＣＳＰＧ４発現がＴＧＦβによって制御されていないこと、及びＨＳＰＧ２がこのサイトカインの制御下でＨＣＣにおいてＣＡＦ以外の細胞によって生成されていてもよいことが示唆される（図１５）。

【0131】

[00150] ルブリシンは、ＣＤ４４発現が低いＨＣＣ患者のより良い予後と相関する：以前記載された関連性の臨床的役割を調査するために、本発明者らは、腫瘍侵襲性と全生存に関連するルブリシン及びその他の関連遺伝子の発現レベルの高低に応じて患者を層別化した。腫瘍におけるルブリシンのトランスクリプトミクス解析は、より低い発現レベルが腫瘍のより高い生物学的侵襲性と関連していることを実証した（侵襲性腫瘍対無刺激の腫瘍：１１．１±３．０対１３．４±１．６、ｐ＜．０００１）。ルブリシン発現の増加は、ＣＤ４４発現が低い患者のより良い予後と有意に（ｐ＜０．００１）相関していたが、ＴＧＦβ、ＣＤ４４、及びαＳＭＡの発現レベルは、臨床転帰とは関連していなかった。しかしながら、ルブリシンレベルが低い患者では、高いＴＧＦβ発現がより悪い予後と関連していたことは注目に値し、ＴＧＦβの腫瘍抑制の役割が、ルブリシン発現を刺激するその能力によって少なくとも部分的に媒介されてもよいことが示唆される一方で、この上方制御機序の欠如は、解き放たれたＴＧＦβ腫瘍促進作用をもたらしてもよい。なおもより興味深いことに、「保護」因子としてのルブリシンの推定効果は、ＣＤ４４発現が高い患者では失われていた（図１６）。

【0132】

[00151] ルブリシンはＨＣＣ細胞の付着と遊走を阻害する：ルブリシンが、ＨＣＣ患者、特にＣＤ４４発現レベルが中央値を下回る患者の全生存をどのように改善するかを理解するために（図１３及び１６）、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４がＨＣＣ細胞の侵襲性に必要ないくつかの重要な機能、すなわち付着と遊走に影響を与えるかどうかを調べ、次に、ＣＤ４４の発現が関係しているかどうかを調べた。ＨＬＥ及びＨＬＦは、２つの強力なＣＤ４４陽性浸潤性ＨＣＣ細胞株である（以下に説明される、図１８）。フィブロネクチンへの付着に関して、ＣＤ４４発現のサイレンシング時にルブリシンへの付着が損なわれる（図１７Ａ）。さらに、可溶性ｒｈＰＲＧ４（２５μｇ／ｍｌ）がフィブロネクチン上の同じ細胞の遊走を損なう一方で、ＣＤ４４の下方制御は運動性に影響を与えまない（図１７Ｂ）。これは、ＨＣＣ微小環境で発現するルブリシンが、発現が少ない場合にＣＤ４４受容体をより効率的に飽和させるかもしれないこと、及びＣＤ４４以外のその他のルブリシン受容体が、細胞の遊走と浸潤の抑制に関与している可能性が高いことを示唆する。

【0133】

[00152] ＣＤ４４／ルブリシン軸は、ＨＣＣ細胞に対するソラフェニブとレゴラフェニブの有効性を高める：ルブリシン／ＣＤ４４軸の生物学的役割をさらに詳しく調べるために、本発明者らは、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＰＬＣ／ＤＣ／１９ＨＣＣ ＣＤ４４陽性細胞、及びＨｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ５ ＨＣＣ ＣＤ４４陰性細胞に、ｒｈＰＲＧ４の存在／非存在下でソラフェニブとレゴラフェニブでチャレンジさせた。全てのＨＣＣ細胞は、ｒｈＰＲＧ４と、ＩＣ５０（約５μＭ）より低い濃度（２．５μＭ）ののソラフェニブ又はレゴラフェニブの存在下／不在下で、同じ実験条件下で７２時間培養した。ｒｈＰＲＧ４単独では細胞増殖を顕著に損なうことはなかったが、ソラフェニブ又はレゴラフェニブと組み合わせると、１２．５～１００μｇ／ｍｌの濃度でＨＬＥ、ＨＬＦ、及びＰＬＣ／ＤＣ／１９細胞に対する有効性が強く相乗的に改善された。ｒｈＰＲＧ４と薬剤の相乗効果は、ＨＬＥ、ＨＬＦ、及びＰＬＣ／ＤＣ／１９細胞で得られた効果より低くても、Ｈｅｐ３Ｂの増殖中に存在したが、ｒｈＰＲＧ４の最高濃度でのみ見られた。代わりに、ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞は全く応答しなかった（図１８）。

【0134】

[00153] ＣＤ４４／ルブリシン軸の分子機序を分析するために、本発明者らは、機能喪失アプローチを用いて、ｓｈＲＮＡレンチウイルス形質導入アプローチを介してＨＣＣ細胞におけるＣＤ４４発現をサイレンシングした。対照－ｓｈＲＮＡ及びＣＤ４４－ｓｈＲＮＡＨＣＣ細胞は、ｒｈＰＲＧ４（０～１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度）の存在／不在下、ソラフェニブ又はレゴラフェニブ（２．５μＭの濃度）なし又はありで、７２時間の増殖アッセイで試験した。細胞増殖を阻害する双方の薬剤の能力は、対照細胞と比較して、ＣＤ４４サイレンシング細胞で有意に減少し（ｒｈＰＲＧ４濃度に応じてｐ＜０．０５～ｐ＜０．００１）、ルブリシン膜結合を可能にするためにＨＣＣ細胞がＣＤ４４を発現する必要性と、それに続く生体外でのＨＣＣ細胞増殖の増強された薬物誘発性障害を実証する（図１９Ａ）。ｒｈＰＲＧ４に曝露されたＣＤ４４サイレンシング細胞で起こるこの薬物有効性の抑制は、薬物に曝露された低ＣＤ４４発現ＨＣＣ細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨｅｐ３ＢのｒｈＰＲＧ４に対する感受性の低下と一致している（図１８）。

【0135】

[00154] ＴＧＦβによって刺激されたＣＡＦ馴化培地はルブリシン分泌を介してソラフェニブとレゴラフェニブの有効性を高める：ルブリシンの役割をさらに確認するために、本発明者らは、より生理学的な状況に類似した生物学的カスケードを生体外で再現し、それによって、ＴＧＦβはルブリシンを分泌するＣＡＦを刺激し、ＨＣＣ細胞に対するソラフェニブとレゴラフェニブの双方の薬効を改善する。（図１９Ｂ）。ＣＡＦを完全培地中でＴＧＦβと共に４８時間インキュベートし、飢餓状態（無血清）でさらに４８時間（ＴＧＦβなしで）培養し、分泌タンパク質を濃縮させた。次に馴化培地を採取し、イソタイプ又は抗ルブリシン抗体と共にインキュベートし、タンパク質濃度をアッセイし、それを使用して、１．５μＭのソラフェニブとレゴラフェニブの存在下、及び／又はＴＧＦβ刺激ＣＡＦからの２０μｇ／ｍｌルブリシン枯渇又は非枯渇馴化培地（ＣＭ）の存在下で、ＨＣＣ細胞を増殖させるようにチャンレンジした。ＴＧＦβ刺激ＣＡＦからの馴化培地は、ルブリシン枯渇馴化培地と比較して、ＨＬＦ細胞に対するソラフェニブとレゴラフェニブの有効性を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）（図１９Ｂ）。これは、ＣＤ４４／ルブリシン軸が、ソラフェニブとレゴラフェニブの薬剤有効性を高めることを示唆する。

【0136】

考察
[00155] 今に至るまで、免疫学的チェックポイントに向けられた薬のいくつかの例外を除いて、がん細胞は常に唯一の信頼できる治療ターゲットと考えられてきたが、ＨＣＣの場合のように、臨床転帰に関する結果はしばしば満足のいくものではない。このがんでは、ＥＣＭタンパク質、炎症細胞、及びＣＡＦを豊富に含む慢性肝疾患に由来する周辺組織の中で細胞が増殖し、その中に入り込んでいく。この実施例では、本発明者らは、これまで関節の軟骨部位に存在することが知られているＰＧファミリーに属する糖タンパク質であるルブリシンが肝臓で発現していることを示した。さらに、本発明者らは、その発現が５年間追跡された７８人の患者のコホート（ＲＥＦＶｉｌｌａ、ＧＵＴ）のより長い生存と正の相関があることも示す。実験モデルでは、本発明者らはまた、ルブリシンがＣＤ４４受容体と結合することによってＨＣＣ細胞の付着と遊走を阻害することも示す。これは、臨床データの理解に貢献する。それはまた、ルブリシンは、ＣＤ４４に結合することにより、ＴＧＦβが誘導する乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１の遊走及び浸潤の増強を相殺し、その結果、その浸潤促進性の下流シグナル伝達を妨害できるという、Sarkar et al. (PLoS One 2019. doi:10.1371/journal.pone.0219697)による実証とも一致する。さらに、これらの著者は、ＣＤ４４の発現がルブリシンへの結合に続いて減少することを発見した。

【0137】

[00156] ＣＤ４４はＨＣＣの幹細胞性マーカーであり、その発現は、ＴＧＦβによって誘導され(Fernando et al., Int J Cancer 2015. doi:10.1002/ijc.29097)、一貫して、ＨＣＣを有する患者の多施設臨床試験でも有効であることが証明された(Kelley et al., Clin Transl Gastroenterol 2019. doi:10.14309/ctg.0000000000000056)、ＴＧＦβ阻害剤によって阻害される(Rani et al.Cell Death Dis 2018. doi:10.1038/s41419-018-0384-5)ことが報告されている。最後に、ＣＤ４４／ルブリシン軸は、生体外で、ＨＣＣ細胞に対するソラフェニブとレゴラフェニブの抗増殖作用を増強する。現在まで、ルブリシン機能は主にがんの文脈の外で知られている。Nahon et al.は、ルブリシンの不在が、すでに動脈硬化を発症しやすい２つの高脂血症モデルマウス、すなわちアポリポタンパク質Ｅノックアウト（ＡｐｏＥ ＫＯ）マウス及び低密度リポタンパク質受容体ノックアウト（Ｌｄｌｒ ＫＯ）マウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の易罹患性が高まることを示した(Nahon et al., Atherosclerosis. 2018. doi:10.1016/j.atherosclerosis.2018.06.883)。ＴＧＦ－βシグナル伝達の発現低下は、ヒトの加齢性変形性関節症に関連している。ヒト変形性関節症を効果的に再現するＴＧＦ－βシグナル伝達に欠陥のあるマウスでは、その関節潤滑機能により、ルブリシンがこの疾患の発症を予防するのに効果的であることが証明されている(Chavez et al., PLoS One 2019. doi:10.1371/journal.pone.0210601)。

【0138】

[00157] 特にルブリシンとＣＤ４４の相互作用を実証した最近の報告に照らして、がんにおけるルブリシンの役割への関心が高まっている。ルブリシンは、ＣＤ４４への結合についてヒアルロン酸と競合し、インターロイキン－１β又は腫瘍壊死因子αで刺激された、リウマチ様関節炎線維芽細胞様滑膜細胞におけるこの受容体の成長をサポートする、シグナル伝達機能を弱め得ることが分かった。(Al-Sharif A et al., Arthritis Rheumatol 2015. doi:10.1002/art.39087)。

【0139】

[00158] 新たに出現したルブリシンの抗腫瘍の役割は、それがＴＧＦβによって上方制御されるという証拠と明らかに矛盾してもよく、これは、このサイトカインががんの初期段階と後期段階で二重の反対の役割を果たすと考えられているためである。実際、これまでに蓄積された知識は、ＴＧＦβシグナル伝達が分子スイッチとして挙動し、ＨＣＣなどの固形悪性腫瘍の初期段階では細胞分裂阻害／アポトーシス促進性であるが、進行期では転移促進因子に変化することを示唆する(Moreno-Caceres et al. Cell Death Dis 2017. doi:10.1038/cddis.2017.469; Fabregat et al. TFEBS J 2016. doi:10.1111/febs.13665; Arrese et al., Curr Protein Pept Sci 2017. doi:10.2174/1389203718666171117112619)。より具体的には、ＴＧＦβシグナル伝達はＣＤ４４の発現／活性化に影響を及ぼし得て、ＣＤ４４機能に依存して、がん性浸潤を促進することが示された。ＴＧＦβは、肺線維芽細胞におけるＥＧＲ１媒介ＡＰ－１（活性化タンパク質－１）の活性化を通じて、ＣＤ４４がん関連ＣＤ４４Ｖ６イソ型の発現を上方制御することが実証されている(Ghatak et al., J Biol Chem 2017. doi:10.1074/jbc.M116.752451)。それにもかかわらず、その他の研究は、ＬＡＴＳ１などの腫瘍抑制因子遺伝子、又はＤＮＡ損傷修復タンパク質（ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、及びＦＡＮＣＦ）の発現を誘導することを介して、ＨＣＣ細胞の腫瘍形成促進能を抑制するＴＧＦβの能力を明らかに示してきた(Zhang et al. Oncotarget 2017. doi:10.18632/oncotarget.14523; Chen et al., Gastroenterology 2018. doi:10.1053/j.gastro.2017.09.007)。

【0140】

[00159] この実施例は、ｒｈＰＲＧ４とソラフェニブ又はレゴラフェニブとの組み合わせから生じる相乗的な抗増殖効果が、ＨＣＣ患者の治療効果を大幅に改善してもよいことを示唆する。ルブリシン発現とＨＣＣ患者の全生予後との強い関連性は、この分子が直接的又は間接的であるが、まだ解明されていない腫瘍抑制活性を有していてもよいことを示唆する。ＣＤ４４発現が高い患者においてルブリシンレベルと平均余命の間に正の相関がないという発見は、この受容体の発現が十分に高い場合、ＣＤ４４シグナル伝達の前悪性機能を克服するルブリシン抗腫瘍活性の失敗を反映しているかもしれない。或いは、ＣＤ４４の異なる転写変異型は、薬物有効性と内因性ストレスの相殺に明確に関与していてもよい。これらの変異型のいくつかは、ルブリシンに結合できないかもしれず、その結果、影響を受けないＣＤ４４下流シグナル伝達をもたらす。さらに、ＣＤ４４のこれらのルブリシン非感受性プロ腫瘍活性と、可能性な現在未知の受容体を介して媒介される腫瘍抑制ルブリシン活性との間に、競合があってもよい（図１９Ａ～Ｂを参照されたい）。

【0141】

[00160] 全体として、この実施例は、ＣＤ４４阻害が高ＣＤ４４発現ＨＣＣにおけるｒｈＰＲＧ４投与と組み合わされてもよい、新しい介入フレームワークを提案する。さらに、ソラフェニブとレゴラフェニブの効力は、ｒｈＰＲＧ４との相乗投与によって大幅に強化されてもよい。ＣＤ４４へのルブリシン結合の効率は、シアル酸の除去とＯ－グリコシル化の後に、大幅に増加し得ることが実証されている(Al-Sharif et al., Arthritis Rheumatol 2015. doi:10.1002/art.39087)。したがって、このプロセスされた形態の濃度を低くすることで、ルブリシンの潜在的に有害なオフターゲット効果を最小限に抑え得る。ルブリシンの外因性投与による可能な悪影響については、まだ慎重に評価されていない。

【0142】

[00161] 結論として、本発明者らは、ルブリシンが抗腫瘍剤として作用するだけでなく、ソラフェニブとレゴラフェニブなどの薬剤の有効性を改善する可能性があると示唆する。間質ＨＣＣ微小環境におけるルブリシン合成の分子機序、並びにおそらく新規のルブリシンカップリング因子、代替受容体、又は相互作用のパートナーを同定することによって得られる、その機能的特徴へのさらなる洞察は、より効果的な薬理学的ツールを設計するために価値があることを証明してもよい。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17A】

【図17B】

【図18-1】

【図18-2】

【図19A-1】

【図19A-2】

【図19B】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【配列表】

2022534724000001.app

【国際調査報告】