▶ ディスカバリーバイオメッド， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-03
(54)【発明の名称】ヒトの疾患及び正常腎臓上皮細胞培養物及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20220727BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220727BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220727BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220727BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220727BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02
C12Q1/68
C12N5/10
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570906
(86)(22)【出願日】2020-05-28
(85)【翻訳文提出日】2021-12-13
(86)【国際出願番号】 US2020034992
(87)【国際公開番号】W WO2020243360
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/854,756
(32)【優先日】2019-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515226984
【氏名又は名称】ディスカバリーバイオメッド， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】シュウィーバート， エリック
(72)【発明者】
【氏名】マイ， デボラ
(72)【発明者】
【氏名】レッドマン， マシュー ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ04
4B063QQ12
4B063QQ13
4B063QR51
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA90Y
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4B065BA06
4B065BC03
4B065BC42
4B065BD09
4B065BD12
4B065BD14
4B065BD15
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA33
4B065CA46
(57)【要約】
本明細書において、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞を産生するための組成物及び方法を提供する。また、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団も提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の産生方法であって、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で前記１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞が、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；
（ｅ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化する
ことを含む、前記産生方法。
【請求項2】
前記１つ以上の単離された細胞の遺伝子型決定または全エクソーム配列決定をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記移した複数の単一嚢胞由来細胞が、移す前に５回未満継代されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記移した複数の細胞が、３回未満継代されている、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記単離した１つ以上の細胞を、透過性フィルター上で培養する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記不死化を、テロメラーゼを使用して実施する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記不死化を、ウイルスがん遺伝子を使用して実施する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ウイルスがん遺伝子がＳＶ４０である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養。
【請求項10】
前記細胞を、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットが、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；
（ｅ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作出する
ことによって産生する、請求項９に記載の初代培養物。
【請求項11】
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって誘導される、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
【請求項13】
（ａ）請求項１１または１２の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団及び（ｂ）三次元ゲル
を含む、多嚢胞性腎臓由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養物。
【請求項14】
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、（ｂ）前記接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして
（ｃ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを決定することを含み、嚢胞様形成のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項15】
前記多嚢胞性腎臓由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の嚢胞形成レベルである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養系を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、（ｂ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の前記三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを測定することを含み、嚢胞形成能のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項19】
前記多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の前記嚢胞形成レベルである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
先行関連出願
本出願は、２０１９年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／８５４，７５６号の利益を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／８５４，７５６号の利益を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）は、著しく肥大した腎臓において多数の嚢胞が分布することを特徴とする。これらの嚢胞は腎機能の障害を引き起こし、最終的に腎不全を引き起こし得る。ヒトでは、ＰＫＤは、常染色体優性（ＡＤＰＫＤ）または常染色体劣性（ＡＲＰＫＤ）の形で遺伝し得る。ＡＤＰＫＤは、ヒトにおける最も一般的な優性遺伝性腎疾患であり、最終的な透析または移植の主要な遺伝的病因である。ＡＤＰＫＤでは、両方の腎臓において液体で満たされた嚢胞が発生して拡大し、最終的に腎不全を引き起こす。ＡＤＰＫＤは腎不全の第４の主要な病因であり、ＡＤＰＫＤ患者の５０％以上が５０歳までに腎不全を発症する。腎不全になると、透析または腎移植が生存のための唯一の選択肢となる。現在、この分野には、ＰＫＤを治療または予防することができる薬剤を同定するための実用的な解決策が存在しない。
【発明の概要】
【0003】
本明細書において、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞を産生する方法を提供する。方法は、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；（ｂ）単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して、複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；（ｃ）複数の単一嚢胞由来細胞を嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｄ）任意選択で、複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｅ）複数の単一嚢胞由来細胞が三次元培養において嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；そして（ｆ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化するステップを含む。
【0004】
さらに、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団を提供する。また、（ａ）不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団及び（ｂ）三次元ゲルを含む、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養物も提供する。
【0005】
さらに、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。方法は、（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングする薬剤と接触させ；（ｂ）接触させた細胞を嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして（ｃ）対照レベルと比較した、薬剤での処理後の接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成レベルを測定するステップを含む。嚢胞様形成レベルの低下は、薬剤により、多発性嚢胞腎疾患が予防または治療されることを示す。
【0006】
本出願は、以下の図を含む。これらの図は、組成物及び方法の特定の実施形態及び／または特徴を説明し、組成物及び方法の任意の説明（複数可）を補足することを意図している。書面による説明がそうであると明示的に示さない限り、図は、組成物及び方法の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】残存するヒトＡＤＰＫＤ疾患の腎臓組織が、初代培養において、どのように単一の嚢胞培養物へと処理されるかの概略図を示す。
【図2】多発性嚢胞腎の単一嚢胞から単離された細胞をプレーティングした後、細胞を洗浄する前の、初代ヒトＡＤＰＫＤ（ｈｕＡＤＰＫＤ）単一嚢胞培養物を示す。
【図3】洗浄後の初代ｈｕＡＤＰＫＤ単一嚢胞培養物を示す。
【図4】９日間のインキュベーション後にコンフルエントになった初代ｈｕＡＤＰＫＤ単一嚢胞培養ウェルを示す。
【図5】嚢胞予防アッセイの３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成される小さな嚢胞に対する様々な濃度及び時点でのトルバプタンの効果を示す。
【図6】嚢胞予防アッセイの３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成される小さな嚢胞に対する様々な濃度及び時点でのラパマイシンの効果を示す。
【図7】嚢胞予防アッセイの３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成される小さな嚢胞に対する様々な濃度及び時点でのボスチニブの効果を示す。
【図8A】嚢胞予防アッセイの３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成される小さな嚢胞に対するＤＭＳＯ当量ビヒクル対照を示す。１～３００μＭのＤＭＳＯ濃度当量物の結果を示す。
【図8B】嚢胞予防アッセイの３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成される小さな嚢胞に対するＤＭＳＯ当量ビヒクル対照を示す。嚢胞予防アッセイにおける１～３０ｎＭのＤＭＳＯ濃度当量物の結果を示す。
【図9】３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより大きな嚢胞の嚢胞攻撃アッセイにおける重要な濃度での嚢胞画像追跡におけるトルバプタンの効果を示す。
【図10】３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより大きな嚢胞の嚢胞攻撃アッセイにおける重要な濃度での嚢胞画像追跡におけるラパマイシンの効果を示す。
【図11】３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより大きな嚢胞の嚢胞攻撃アッセイにおける重要な濃度での嚢胞画像追跡におけるボスチニブの効果を示す。
【図12】３次元培養系において、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより大きな嚢胞に対するＤＭＳＯ当量ビヒクル対照を示す。
【図13】ハイコンテントイメージングベースの嚢胞形成バイオアッセイのために、初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞を３次元培養系に播種した３８４ウェルマイクロタイタープレートの設計を示す。
【図14】３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェル全体のハイコンテントイメージングの例を示す。６つの画像を撮影してウェル全体をキャプチャし、３Ｄバイオゲルを介してレイヤーでＺスタッキングを実施する。後で画像をつなぎ合わせて、表示されている画像を生成する。嚢胞は時間とともに拡大し、嚢胞形成を誘発するために刺激する必要はない。嚢胞形成は、ＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地で生じる。
【図15】アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）で刺激された嚢胞形成（下段）及び未刺激の対照（上段）の例を示す。嚢胞は、この生理学的サイクリックＡＭＰ刺激の存在下では、平均的により大きい。
【図16A】ハイコンテンツイメージングの例を示す（各ウェルで使用するリコリノスタット濃度でラベル付けしている）。
【図16B】細胞生存率の分析結果を示す。
【図16C】嚢胞カウント数を示す。
【図16D】自動化されたハイコンテンツイメージングによる３８４ウェル嚢胞形成プラットフォームにおける業界標準の対照薬であるリコリノスタットを使用した嚢胞サイズ分析結果を示す。
【図17A】ナノモル濃度での化合物１とトルバプタンを比較した嚢胞予防アッセイの要約データを示す。
【図17B】ナノモル濃度での化合物１とトルバプタンを比較した嚢胞攻撃アッセイの要約データを示す。
【図18】ナノモル濃度での化合物１とトルバプタンを比較した嚢胞予防アッセイにおける３８４ウェルプレートのウェルの一般的な嚢胞画像を示す。
【図20】ナノモル濃度の化合物２とトルバプタンを比較した嚢胞予防アッセイにおける３８４ウェルプレートのウェルの一般的な嚢胞画像を示す。
【図21A】ナノモル濃度での低効果の化合物３とトルバプタンを比較した嚢胞予防アッセイの要約データを示す。
【図21B】ナノモル濃度での低効果の化合物３とトルバプタンを比較した嚢胞攻撃アッセイの要約データを示す。
【図22】ナノモル濃度での低効果の化合物３とトルバプタンを比較した嚢胞予防アッセイにおける３８４ウェルプレートのウェルの一般的な嚢胞画像を示す。
【図23】嚢胞予防アッセイにおける３８４ウェルプレートでのナノモル濃度のトルバプタンによる一般的な嚢胞画像を示す。
【図24】ナノモル濃度での化合物１、２、４、及び３ならびにトルバプタン（左から右へ）の効力を示す３８４ウェルプレートでの嚢胞予防アッセイのデータ概要を示す。
【図25】三次元培養系において初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより大きな嚢胞に対する、ＣＦＴＲ補正剤及びＥＮａＣ阻害剤である化合物１、２、及び５（それぞれ１μＭ）ならびにＶｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正剤（それぞれ１０μＭ）及びトルバプタン（１０μＭ）の効力を示す３８４ウェルプレートでの嚢胞攻撃アッセイのデータ概要を示す。培地のみ、ＤＭＳＯ対照、ＶＸ－８０９、ＶＸ－６６１、化合物１、化合物２、化合物６、及びトルバプタンについて、左から右にデータを示す。
【図26】三次元培養系において初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞によって形成されるより小さな嚢胞に対する、ＣＦＴＲ補正剤及びＥＮａＣ阻害剤である化合物１、２、及び５、ならびにＶｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正剤及びトルバプタンの効力を示す３８４ウェルプレートでの嚢胞減少アッセイのデータ概要を示す。
【図27】三次元培養系に播種した初代ｈｕＡＤＰＫＤ細胞から嚢胞が形成される前の３Ｄバイオゲルに対する、ＣＦＴＲ補正剤及びＥＮａＣ阻害剤である化合物１、２、及び５、ならびにＶｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正剤及びトルバプタンの効力を示す３８４ウェルプレートでの嚢胞予防アッセイのデータ概要を示す。
【図28】新規ヒトＡＤＰＫＤ嚢胞腎及びインフラマソーム阻害剤の合理的かつ病理生理学的に関連するハイスループットスクリーニングのための３８４ウェルプレートでの３Ｄバイオゲルによる嚢胞形成アッセイの使用の概略図を示す。
【図29】選択した化合物の濃度応答曲線への曝露後、３Ｄ嚢胞予防アッセイ形式で１３日間増殖させたＡＤＰＫＤ細胞のエンドポイントＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（細胞生存率）の結果を示す。
【図30】選択した化合物の濃度応答曲線への曝露後、３Ｄ嚢胞予防アッセイ形式で１３日間増殖させたＡＤＰＫＤ細胞の嚢胞数を示す。
【図31】選択した化合物の濃度応答曲線への曝露後、３Ｄ嚢胞予防アッセイ形式で１３日間増殖させたＡＤＰＫＤ細胞の嚢胞サイズ測定値を示す。
【図32】選択した化合物の濃度応答曲線への曝露後、３Ｄ嚢胞予防アッセイ形式で１４日間増殖させたＡＤＰＫＤ細胞の代表的な画像を示す。画像は、候補治療薬のいずれについても細胞毒性が観察されなかった０．１μＭの濃度から示している。
【図33】ＡＤＰＫＤ細胞の細胞生存率及びＬＤＨ分泌を測定するマルチプレックスアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
ＰＫＤは、尿細管が構造的に異常になり、腎臓内に複数の嚢胞が発生し、成長する遺伝性疾患である。これらの嚢胞は、子宮内、乳児期、小児期、または成人期に発症し始める場合がある。嚢胞は、液体で満たされた機能していない尿細管であり、サイズは微視的なものから十分に大きなものまであり、隣接する正常な尿細管を押しつぶし、最終的には正常な尿細管も機能しなくなる。ＰＫＤは、尿細管の発達に影響を及ぼす異常なタンパク質をコードする異常な遺伝子（ＰＫＤ１、ＰＫＤ２またはＰＫＤ３）によって引き起こされる。全体を通して用いられているように、ＰＫＤとは、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）または常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患（ＡＲＰＫＤ）を指す。
【0009】
嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の作製方法
本明細書において、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞を産生するための組成物及び方法を提供する。いくつかの方法は、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；（ｂ）単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；（ｃ）複数の単一嚢胞由来細胞を嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｄ）複数の単一嚢胞由来細胞が三次元培養において嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；そして（ｅ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化するステップを含む。図１は、アッセイ系で有用な３次元培養物を生成するための単一嚢胞の一次処理の概略図を示す。
本明細書において、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞を産生するための組成物及び方法を提供する。いくつかの方法は、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；（ｂ）単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；（ｃ）複数の単一嚢胞由来細胞を嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｄ）複数の単一嚢胞由来細胞が三次元培養において嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；そして（ｅ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化するステップを含む。図１は、アッセイ系で有用な３次元培養物を生成するための単一嚢胞の一次処理の概略図を示す。
【0010】
本明細書に提供する方法では、１つ以上の細胞を、多発性嚢胞腎の単一嚢胞から単離する。いくつかの方法では、多発性嚢胞腎は、ヒト対象由来である。いくつかの方法では、１つ以上の複数の単一嚢胞由来細胞を、同じ単一嚢胞から単離した１つ以上の細胞から産生することができる。他の方法では、１つ以上の複数の単一嚢胞由来細胞を、多発性嚢胞腎の異なる単一嚢胞由来の１つ以上の細胞から産生することができる。多発性嚢胞腎から単一嚢胞を単離または解剖する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｃａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｓｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ｄｏ ｎｏｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，”Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３５：１３５１－１３５７（１９８９）を参照されたい。単一嚢胞の単離方法もまた、実施例に記載されている。
【0011】
単離後、単一嚢胞または単一嚢胞由来組織をさらに処理することができる。例えば、機械的破壊または酵素消化技術を使用して、単一嚢胞または単一嚢胞由来組織をさらに処理することができる。（例えば、Ｃａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。実施例に記載の酵素消化プロトコルを使用して、単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離することもできる。次いで、単離した１つ以上の細胞を培養皿またはウェルに入れ、増殖させて、複数の単一嚢胞由来細胞、すなわち初代細胞培養物を作出する。培養皿は、３５ｍｍ組織培養プレート、６０ｍｍ組織培養プレート、１００ｍｍ組織培養プレート、１５０ｍｍ組織培養プレート組織培養プレート、またはより大きな組織培養プレートであり得る。細胞は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、１９２ウェル、３８４ウェル、または７６８ウェルの組織培養プレートに配置することもできる。細胞はまた、フラスコ、例えば、Ｔ－２５、Ｔ－７５またはＴ－１７５フラスコで増殖させることができる。本明細書に提供する方法のいずれにおいても、ディッシュ、ウェル、プレート、フラスコなどが少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％コンフルエントになるまで細胞を増殖させることができる。
【0012】
任意選択で、単離した１つ以上の細胞を透過性フィルター支持体ベースの培養物に配置し、増殖させて、初代細胞培養物を作出する。
【0013】
全体を通して用いられるように、初代細胞に関しての初代という語句は、形質転換されていないか、または不死化されていない細胞を指す。そのような初代細胞は、限られた回数、培養、継代培養、または継代する（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回培養する）ことができる。いくつかの場合では、初代細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件に適応させる。いくつかの場合では、初代細胞を刺激または活性化する。
【0014】
いくつかの方法では、多発性嚢胞腎の単一嚢胞から単離した１つ以上の細胞は、１つ以上の線維芽細胞を含み得る。したがって、増殖中、複数の単一嚢胞由来細胞は、線維芽細胞を含み得る。いくつかの例では、複数の単一嚢胞由来細胞は、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満の線維芽細胞を含む。任意選択で、１つ以上の細胞を、単一嚢胞由来細胞の上皮表現型が維持される培地中で培養する。任意選択で、１つ以上の細胞を、単一嚢胞由来細胞の上皮表現型が維持され、細胞の増殖速度を増加させる培地中で培養する。いくつかの例では、増殖率は、培地に接触させていない複数の嚢胞由来細胞に比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％または４００％だけ増加する。
【0015】
１つ以上の単一嚢胞由来細胞を増殖させて複数の単一嚢胞由来細胞を作出した後、その複数の細胞を、嚢胞形成用に構成された３次元（３Ｄ）培養系に移す。任意選択で、３Ｄ培養系は、単一嚢胞由来細胞の上皮表現型が維持され、及び／または１つ以上の細胞の増殖速度を増加させる培地を含む。３Ｄ細胞培養系は、組織内に細胞が存在する微小環境をより正確に表すことから、３Ｄ培養された単一嚢胞由来細胞の挙動は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞応答、例えば、腎臓実質組織内の腎臓細胞による嚢胞形成をより反映している。
【0016】
従来の２次元培養では、通常、細胞をガラス上で単層に成長させるが、より一般的には、組織培養ポリスチレンプラスチックフラスコ内で、３Ｄ細胞培養は、足場／マトリックスを使用して、または足場を使わない方法で細胞を３Ｄ凝集体／スフェロイドに成長させる。足場／マトリックスベースの３Ｄ培養は、無細胞３Ｄマトリックスに細胞を播種するか、または液体マトリックスに細胞を分散させた後、凝固または重合させることによって生成することができる。一般的に使用される足場／マトリックス材料には、生物由来の足場系及び合成ベースの材料が含まれる。ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリックス（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜抽出物（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及びヒアルロン酸などの市販の製品は、一般的に使用される生物由来マトリックスである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ＰＬＧ）、及びポリカプロラクトン（ＰＬＡ）は、合成足場を形成するために使用される一般的な材料である。足場のない３Ｄ細胞スフェロイドは、強制浮遊法、ハンギングドロップ法、または撹拌ベースのアプローチによって懸濁液中に生成することができる。例えば、Ｂｒｅｓｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，”ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ １８：２４０－２４９（２０１３）；Ｇｕｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｏｎｃｏｌ Ｉｓｓｕｅｓ ２５：２０－２５（２０１０）；及びＥｄｍｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，”Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２（４）：２０７－２１８（２０１４）を参照されたい。３Ｄ細胞培養法を使用すると、細胞は３Ｄ環境で自然に増殖し、細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、及びそれらの微小環境と互いに相互作用できるようになる。次いで、そのような３Ｄ空間配置におけるこれらの相互作用は、細胞増殖、分化、形態、遺伝子発現及びタンパク質発現、ならびに外部刺激に対する細胞応答を含む、様々な細胞機能に影響を及ぼす。
【0017】
任意選択で、移した複数の単一嚢胞由来細胞は、移す前に５回未満、継代されている。任意選択で、移した複数の単一嚢胞由来細胞は、移す前に３回未満、継代されている。任意選択で、細胞を３Ｄ組織培養系に播種する前に透過性フィルター支持体上で初代単一嚢胞由来腎臓細胞を増殖させることにより、本明細書に記載の初代培養物のいずれかの寿命を、１、２、３、４回またはそれ以上の継代によって延長させることができる。いくつかの場合では、組織培養プレート内で細胞を増殖させることができ、組織プレートの各ウェルには透明なポリエステルフィルター支持体が含まれており、これにより増殖中の細胞を可視化することができる。他の場合では、細胞を、ディッシュ透過性フィルター支持体、例えば、ポリカーボネート製の支持体上で増殖させることができる。任意選択で、嚢胞を形成するのに苦労する初代培養物を、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を動員するフォルスコリン及び／またはアルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）で、または上皮成長因子（ＥＧＦ）のような成長因子で刺激して、培地のみでは嚢胞を形成しない初代培養物中で嚢胞形成を誘発する。いくつかの方法では、３Ｄ組織培養系は、嚢胞形成を増強するフォルスコリン、ＡＶＰ、及び／またはＥＧＦを含む。
【0018】
いくつかの方法では、複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成を可能にするのに十分な時間、３Ｄ培養系に移すか、または埋め込む。例えば、細胞は、嚢胞の出現前及び出現中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日以上の間、３Ｄ培養系中に存在し得る。刺激の存在下または非存在下で、３Ｄ培養系中で嚢胞形成が生じる場合、３Ｄ培養前の初代培養試料に由来する複数の細胞は、不死化し得る嚢胞形成性の複数の細胞である。これらの不死化細胞株は、腎嚢胞形成を治療または予防する薬剤を同定するためのアッセイに使用することができる。
【0019】
本明細書に提供する方法において、嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上の細胞を、当技術分野で公知の方法を使用して不死化することができる。例えば、限定するものではないが、細胞に、ウイルスがん遺伝子、例えば、ＳＶ４０及び／またはヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）を形質移入することができる。例えば、Ｓａｒｒａｂ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０１（５）：Ｆ１１３１－Ｆ１１３８（２０１１）；Ｌｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｂｙ ＳＶ４０ ｒｅｔａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒａｆｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５（２）：５６３－７１（１９９２）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｈＴＥＲＴ ｔｏ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４５（１－２）：３３－３８（２００４））を参照されたい。他の方法は、ＣＤＫ４またはＣＤＮＫ２遺伝子構築物を、単独で、または不死化ｈＴＥＲＴ法と組み合わせて含む。
【0020】
いくつかの方法では、単一嚢胞から単離された１つ以上の細胞を遺伝子型決定し、及び／または全エクソームを配列決定する。遺伝子型判定により、単一嚢胞由来のすべての細胞に存在する一次生殖細胞系列ＰＫＤ１変異（複数可）、及び単一嚢胞の１つ以上の細胞に存在する任意の体細胞ＰＫＤ１変異を同定することができる。腎臓細胞の遺伝子型判定の方法は当技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡの制限断片長多型同定（ＲＦＬＰＩ）、ゲノムＤＮＡのランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシーケンシング（例えば、全ゲノムまたは全エクソームシーケンシング）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、及びＤＮＡマイクロアレイまたはビーズへのハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
ＰＫＤ１の生殖細胞変異の例として、Ｐ２７３６Ｒ変異、Ｌ２７６３Ｖ変異、Ｍ２７６４Ｔ変異、Ｅ６８５でのフレームシフト／トランケーション、Ｐ８７２Ｘ ｎｓ／トランケーション、Ｒ２７６７フレームシフト／トランケーション、及びＧ３６９０Ｅミスセンス変異が挙げられるが、これらに限定されない。体細胞ＰＫＤ１変異の例として、Ｐ３４４８フレームシフト変異、Ａ６２フレームシフト変異、Ｌ２３７フレームシフト変異、Ｌ７１５フレームシフト変異、Ｑ１６０フレームシフト変異、Ｋ７１８フレームシフト変異、Ｑ５４２フレームシフト変異、Ｙ６８４フレームシフト変異、Ｎ１１６フレームシフト変異及びＧ６１７フレームシフト変異が挙げられるが、これらに限定されない。単一嚢胞から単離した細胞を遺伝子型判定することにより、遺伝子型判定した細胞を使用して、細胞のＰＫＤ１遺伝子及び／またはＰＫＤ２内の特定の変異（複数可）に関連する嚢胞形成を治療または予防する薬剤を同定することができる。
【0022】
細胞培養及び細胞集団
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物もまた、提供する。任意選択で、嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養を、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して行うことができる。任意選択で、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；（ｂ）単離した１つ以上の細胞を培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して、複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；（ｃ）複数の単一嚢胞由来細胞の第１のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｄ）複数の単一嚢胞由来細胞の第１のサブセットが三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；そして（ｅ）複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作製することによって、嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を生成する。任意選択で、本明細書に記載の、または本明細書に記載の方法によって作製した、任意の初代培養物を不死化することができる。
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物もまた、提供する。任意選択で、嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養を、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して行うことができる。任意選択で、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；（ｂ）単離した１つ以上の細胞を培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して、複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；（ｃ）複数の単一嚢胞由来細胞の第１のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；（ｄ）複数の単一嚢胞由来細胞の第１のサブセットが三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；そして（ｅ）複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作製することによって、嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を生成する。任意選択で、本明細書に記載の、または本明細書に記載の方法によって作製した、任意の初代培養物を不死化することができる。
【0023】
本明細書に記載の初代培養物から継代した細胞の集団をさらに提供する。任意選択で、細胞の集団は、１、２、３、４、５回またはそれ以上継代された集団である。任意選択で、細胞の集団は、５、４、３、または２回未満、継代された集団である。
【0024】
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団もまた、提供する。任意選択で、集団は、本明細書に記載するような不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の産生方法のいずれかを使用して誘導される集団である。また、（ａ）不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団、及び（ｂ）３Ｄゲルを含む、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の３Ｄ培養物もまた、提供する。いくつかの例では、３Ｄ培養物中の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団は、本明細書に提供する方法のいずれかによって産生した不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団である。
【0025】
多発性嚢胞腎由来の特定の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞は、開回路条件下での経上皮電気抵抗及び電圧アッセイ、流体輸送アッセイ、及びウッシングチャンバー駆動電気生理学などの経上皮電気アッセイに有用である。細胞を、これらのバイオアッセイ用の透過性フィルター支持体上で増殖させる。
【0026】
スクリーニング方法
本明細書に記載の初代または不死化細胞培養物のいずれかを使用して、嚢胞様形成を減少または低下させる１つ以上の薬剤を同定することができる。嚢胞様形成の減少は、嚢胞の数の減少、既存の嚢胞の成長の減少、既存の嚢胞の成長速度の減少、または１つ以上の嚢胞の出現の遅延であり得る。本明細書において、（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ；（ｂ）接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして（ｃ）対照レベルと比較した、接触させた細胞の薬剤処理後の三次元培養系内での嚢胞様形成レベルを測定することを含む、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法を提供する。嚢胞様形成のレベルの低下は、薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す。
本明細書に記載の初代または不死化細胞培養物のいずれかを使用して、嚢胞様形成を減少または低下させる１つ以上の薬剤を同定することができる。嚢胞様形成の減少は、嚢胞の数の減少、既存の嚢胞の成長の減少、既存の嚢胞の成長速度の減少、または１つ以上の嚢胞の出現の遅延であり得る。本明細書において、（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ；（ｂ）接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして（ｃ）対照レベルと比較した、接触させた細胞の薬剤処理後の三次元培養系内での嚢胞様形成レベルを測定することを含む、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法を提供する。嚢胞様形成のレベルの低下は、薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す。
【0027】
さらに、（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の３Ｄ培養系をスクリーニングしようとする薬剤と接触させ、そして（ｂ）対照レベルと比較した、接触させた細胞の薬剤処理後の三次元培養系内での嚢胞様形成レベルを決定することを含む、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法を提供する。嚢胞形成能のレベルが低下することは、薬剤が多発性嚢胞腎疾患を克服または治療することを示している。
【0028】
任意選択で、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の３Ｄ培養系を、３Ｄ培養系内で２つ以上の嚢胞が形成された後、例えば、３Ｄ培養系内での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日以上の細胞増殖の後に、薬剤に接触させる。相当に大きい嚢胞が形成された後、３Ｄ系を薬剤と接触させ、３Ｄ培養系内での嚢胞様形成のレベルを測定する。嚢胞形成能のレベルの低下、例えば、対照に比べて、嚢胞がより少ない及び／または嚢胞がより小さいことは、薬剤が多発性嚢胞腎疾患を治療することを示している。
【0029】
嚢胞形成能のレベルは、３Ｄ培養系に薬剤を接触させてから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日後またはそれ以降に測定することができる。嚢胞形成能の低下は、細胞形成能の低下から１つ以上の既存の嚢胞の完全な切除にまで及び得るため、完全である必要はない。したがって、低下は、天然または対照のレベルに比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の割合の低下であり得る。
【0030】
任意の疾患または障害の治療または処置とは、対象に存在する疾患または障害を改善することを指す。改善という用語は、病状の治療における治療的に有益な結果、例えば、多発性嚢胞腎疾患の治療、その重症度もしくは進行の軽減、寛解もしくは寛解期間の促進、または治癒を指す。したがって、治療または処置には、少なくとも１つの物理的パラメータまたは症状を改善すること、例えば、対象の腎臓内の１つ以上の嚢胞のサイズを縮小させることが含まれる。治療または処置には、疾患または障害の調節が含まれる。治療または処置には、多発性嚢胞腎疾患の進行を遅らせるかまたは予防することが含まれる。治療とは、必ずしも疾患、病態、または疾患または病態の症状の治癒または完全な切除を指すとは限らないことを理解されたい。
【0031】
任意選択で、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の３Ｄ培養系を、３Ｄ培養系内で嚢胞が形成される前または形成された直後、例えば、３Ｄ培養系内での１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間の細胞増殖の前に、薬剤と接触させる。任意選択で、２つ以上の嚢胞が最初に形成された場合に、培養系を薬剤と接触させる。任意選択で、複数のウェルまたはディッシュでアッセイを実行する場合、培養系ごとに平均３つの嚢胞が最初に形成される場合に、培養系を薬剤と接触させる。嚢胞形成能のレベルは、三次元培養系を薬剤に接触させた後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日後またはそれ以降に測定することができる。嚢胞形成能のレベルの低下、例えば、対照に比べて嚢胞がより少ないか、または嚢胞がより小さいことは、薬剤が多発性嚢胞腎疾患の発症を予防することを示す。いくつかの例では、対照は、同じ嚢胞に由来する未処理細胞の嚢胞形成レベルである。
【0032】
任意選択で、本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれかは、正常ヒト腎臓細胞を薬剤と接触させて薬剤の毒性を測定することをさらに含み得る。例えば、３Ｄ培養系に移すかまたは埋め込まれると、正常ヒト腎臓細胞は、尿細管または管様ネットワークを生成する。正常ヒト腎臓細胞は、小さな嚢胞及びスフェロイドを形成する場合がある。ハイコンテントイメージングを実施して、嚢胞、スフェロイド、尿細管、及び他の構造を毎日及び経時的に視覚化する。毒性のスクリーニングを含む方法では、嚢胞形成活性について薬剤をスクリーニングする前に、正常ヒト腎臓細胞を含む３Ｄ培養系に１つ以上の薬剤を接触させ、尿細管形成のレベルを評価することができる。任意選択で、薬剤が毒性である場合、嚢胞形成活性について薬剤をスクリーニングしない。このアッセイでは、尿細管形成が５０％減少して尿細管構造が消失すると、細胞毒性があると見なされる。したがって、これらのアッセイは、腎細胞及び組織に毒性のある細胞傷害剤及び化学物質または小分子を同定する。
【0033】
任意選択で、本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれかは、薬剤と接触させた後に細胞によって分泌される炎症性因子のレベルを測定することをさらに含み得る。１つ以上の炎症性因子の産生または分泌の減少は、薬剤が多発性嚢胞腎疾患に関連する炎症を阻害することを示している。単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン８及び６（ＩＬ－８及びＩＬ－６）、ならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、一般的に、多嚢胞性腎臓由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞によって過剰分泌される。
【0034】
本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれにおいても、薬剤は、いくつか例を挙げると、化学物質、小分子もしくは高分子（有機または無機）、薬物、タンパク質、ペプチド、ｃＤＮＡ、抗体、モルフォリノ、三重らせん分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムであり得るが、これらに限定されない。任意選択で、本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれかにおいて、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養は、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養を含む。任意選択で、培養物は、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞を含む。任意選択で、本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれかにおいて、方法は、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含み得る。任意選択で、本明細書に提供するスクリーニング方法のいずれかにおいて、対照レベルは、同じ嚢胞に由来する未処理細胞の嚢胞形成レベルである。
【0035】
開示する実施形態のために使用することができるか、組み合わせて使用することができるか、または調製において使用することができる材料、組成物、及び成分を開示する。これら及び他の材料を本明細書に開示し、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどを開示する場合、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されているこれらの組成物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせならびに順列の特定の参照は明示的に開示されない場合があることを理解されたい。例えば、方法が開示され、議論され、方法に含まれるいくつかの分子に対して為し得るいくつかの変更が議論される場合、方法のすべての組み合わせ及び順列、ならびに可能な修正が、具体的に反対の指示がない限り、具体的に企図される。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され、開示される。この概念は、開示する組成物を使用する方法のステップを含むがこれらに限定されない、本開示のすべての態様に適用される。したがって、実施し得る様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示する方法の任意の特定の方法のステップまたは方法のステップの組み合わせで実施することができ、そのような各組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に企図され、開示されていると見なされるべきであることを理解されたい。
【0036】
本明細書中で引用される刊行物及びそれらが引用する材料は、参照によりその全体が具体的に本明細書に援用される。以下の説明は、開示する組成物及び方法のさらなる非限定的な例を提供する。
【実施例】
【0037】
培地
５００ｍｌボトルのＣａ２＋／Ｍｇ２＋’遊離リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（またはハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ））、５×抗生物質（（２５ｍｌの１００×ペニシリン／ストレプトマイシンストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）、１０ｍｌのファンギゾン（アンフォテリシンＢ）ストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１ｍｌのゲンタマイシンストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を調製した。
５００ｍｌボトルのＣａ２＋／Ｍｇ２＋’遊離リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（またはハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ））、５×抗生物質（（２５ｍｌの１００×ペニシリン／ストレプトマイシンストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）、１０ｍｌのファンギゾン（アンフォテリシンＢ）ストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１ｍｌのゲンタマイシンストック溶液（Ｃｏｍｉｎｇ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を調製した。
【0038】
５×抗生物質（上記）と、添加した５ｍｌのＬ－グルタミン１００×ストック溶液を含む、少なくとも２リットルのＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーＤＭＥＭ／Ｆ－１２ハム培地（１４．８グラムの粉末培地を１リットルの蒸留水と混合し、１リットルのフィルターボトル系でフィルター滅菌した）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を調製した。
【0039】
５％ＦＢＳ、５×抗生物質（上記）、及び添加した５ｍｌのＬ－グルタミン１００×ストック溶液を含む、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ），ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５００ｍｌボトル（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を調製した。この培地は、各消化後に組織を洗浄するために使用した。
【0040】
５×抗生物質（上記）、Ｌ－グルタミン（上記）及び０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む少なくとも１リットルのＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーＤＭＥＭ／Ｆ－１２ハム培地を調製して、４℃及び３７℃で消化するための消化培地を作成した。
【0041】
５×抗生物質を添加した数リットルのＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を調製した。
【0042】
腎臓検体全体の処理
氷上で三重袋に入れられた容器からヒト腎臓組織標本を取り出した。剰余の液体を吸引した。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳを組織に注ぎ、組織を洗浄／加湿した。組織から余分な脂肪組織を切除した。この切除は、最小限～かなり実質的に及び、ドナーに依存した。
氷上で三重袋に入れられた容器からヒト腎臓組織標本を取り出した。剰余の液体を吸引した。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳを組織に注ぎ、組織を洗浄／加湿した。組織から余分な脂肪組織を切除した。この切除は、最小限～かなり実質的に及び、ドナーに依存した。
【0043】
ＡＤＰＫＤ（またはＡＲＰＫＤ）腎臓の解剖
末期ヒトＡＤＰＫＤ腎臓組織断片または腎臓全体は非常に大きく、液体で満たされた嚢胞で完全に損なわれていた。個別に解剖できる大きな嚢胞はすぐに明らかとなった。最初の解剖では、できるだけ多くの単一嚢胞を隔離することに重点を置き、解剖の直後に、各嚢胞をそれぞれの別個の培養容器に入れた。その時点から、初代培養では、各嚢胞を別々に保持した。以下の手順では、単離した単一嚢胞の解剖について記載する。
末期ヒトＡＤＰＫＤ腎臓組織断片または腎臓全体は非常に大きく、液体で満たされた嚢胞で完全に損なわれていた。個別に解剖できる大きな嚢胞はすぐに明らかとなった。最初の解剖では、できるだけ多くの単一嚢胞を隔離することに重点を置き、解剖の直後に、各嚢胞をそれぞれの別個の培養容器に入れた。その時点から、初代培養では、各嚢胞を別々に保持した。以下の手順では、単離した単一嚢胞の解剖について記載する。
【0044】
大きな嚢胞を組織から個別に解剖した。多くの場合、最大の嚢胞を取り巻く丈夫な結合組織を切断するために、はさみが必要であった。嚢胞は、多くの場合、透明な液体、血液または濁った液体を保持していた。透明な液体で満たされた嚢胞の収集を優先したが、血液の色の液体で満たされた嚢胞も収集した。濁った液体で満たされた嚢胞は一般的に避けた。
【0045】
それぞれの単一嚢胞をそれ専用のペトリ皿に入れ、５×抗生物質を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳで再度洗浄した。次いで、外部組織を各嚢胞の表面から切除し、嚢胞内の液体をすべて排出した。体液を取り除くと、嚢胞は崩壊した。嚢胞は、５×抗生物質を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーの培地で再度洗浄し、部分的に細かく刻んだ。次いで、嚢胞壁組織断片を、通常は５０ｍｌのコニカルチューブ内の冷消化培地に入れ、各嚢胞由来の細かく刻んだ組織を２０ｍｌの消化培地に入れた。嚢胞組織を、５０ｍｌコニカルチューブ内の消化培地中、４℃で一晩インキュベートした。この手順を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳを解剖中に何度も組織に注ぐことにより、できるだけ多くの個々の単一嚢胞に対して繰り返した。すべての所望の単一嚢胞を個別に解剖し、別々のペトリ皿及びコニカルチューブに入れた後、多嚢胞性の微小嚢胞性組織切片をドナー腎臓組織から切除した。
【0046】
多嚢胞性／微小嚢胞性腎臓組織の切片を切除した。通常、これらは組織内の非常に小さな嚢胞のクラスターであった。そのような組織の切片をペトリ皿に入れた。切片をＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳで洗浄し、余分な脂肪組織または結合組織を切除した。組織をＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーの培地で再度洗浄し、はさみで細かく刻んだ。次いで、細かく刻んだ組織を、２０ｍｌの消化培地で満たされた５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、４℃で一晩インキュベートした。
【0047】
正常及び糖尿病のヒト腎臓の解剖
正常及び糖尿病のヒト腎臓標本は、サイズが正常に近かったが、糖尿病のヒト腎臓は肥大を示し、大きくなり得る。洗浄後、上記のように、腎臓を縦方向に切断し、腎臓の長軸下方向に向かって半分にし、腎臓の内側領域が露出した２つの腎臓の半体を得た。集合管が合体する点の近位にある白質である内髄質を、残りの腎臓組織から切り離し、内髄質初代培養物として処理した。外髄質（髄質のピラミッド状の腎杯が存在するピンクまたは赤の部分）を別々に解剖し、処理して専用の初代培養物とした。腎臓組織の大部分（髄質領域を解剖した後に残ったもの）は腎臓の皮質であった。皮質を切片またはスライスに解剖し、処理して初代培養物とした。いくつかの手順では、処理するための、内髄質組織の約２～４枚のペトリ皿、外髄質組織の３～６枚のペトリ皿、及び皮質の１６枚ものペトリ皿が存在した。組織の各切片をペトリ皿に入れ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳで洗浄した。余分な脂肪組織または結合組織を切除した後、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーの培地で組織を再度洗浄した。はさみを使用して組織を細かく刻んだ。細かく刻んだ組織を、２０ｍｌの消化培地で満たされた５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、４℃で一晩インキュベートした。
正常及び糖尿病のヒト腎臓標本は、サイズが正常に近かったが、糖尿病のヒト腎臓は肥大を示し、大きくなり得る。洗浄後、上記のように、腎臓を縦方向に切断し、腎臓の長軸下方向に向かって半分にし、腎臓の内側領域が露出した２つの腎臓の半体を得た。集合管が合体する点の近位にある白質である内髄質を、残りの腎臓組織から切り離し、内髄質初代培養物として処理した。外髄質（髄質のピラミッド状の腎杯が存在するピンクまたは赤の部分）を別々に解剖し、処理して専用の初代培養物とした。腎臓組織の大部分（髄質領域を解剖した後に残ったもの）は腎臓の皮質であった。皮質を切片またはスライスに解剖し、処理して初代培養物とした。いくつかの手順では、処理するための、内髄質組織の約２～４枚のペトリ皿、外髄質組織の３～６枚のペトリ皿、及び皮質の１６枚ものペトリ皿が存在した。組織の各切片をペトリ皿に入れ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳで洗浄した。余分な脂肪組織または結合組織を切除した後、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーの培地で組織を再度洗浄した。はさみを使用して組織を細かく刻んだ。細かく刻んだ組織を、２０ｍｌの消化培地で満たされた５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、４℃で一晩インキュベートした。
【0048】
組織消化由来の初代細胞コレクション
疾患または正常ヒト腎臓から消化させたすべてのタイプの組織について、以下の段階的なプロセスを使用して、消化物から細胞ペレットを経時的に回収した。
疾患または正常ヒト腎臓から消化させたすべてのタイプの組織について、以下の段階的なプロセスを使用して、消化物から細胞ペレットを経時的に回収した。
【0049】
冷蔵庫からチューブを取り出し、５ｍｌの未希釈のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を各チューブに加え、コラゲナーゼＰ活性を停止させた。穏やかな撹拌を使用してＦＢＳを混合した。次いで、消化組織を含む各５０ｍｌコニカルチューブを２０～２５回反転させて撹拌した後、組織をチューブの底に定着させた。上澄みをピペットで取り除き、２０ｍｌのＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（＋５％ＦＢＳ＋５×抗生物質）を、組織片の入った各コニカルチューブに加えた。各チューブを再び約２０～２５回反転させて撹拌し、上澄みを再び取り除き、最初の上澄みとともに回収した。上清を２４００ＲＰＭで５分間遠心分離した。赤血球の存在により赤色に着色した大きな細胞ペレットがチューブの底に現れた。上澄みの大部分を除去し、少量の液体を残して、ボルテックスで細胞ペレットを分解した。Ｔ１７５フラスコに播種する前に、５×抗生物質を含む１ｍｌのＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を添加して、細胞を少量の新鮮な培地で再懸濁し、細胞を休止させた。細胞ペレット全体をＴ１７５フラスコに播種した。生成される各初代細胞培養の各細胞ペレットに対して、これを行った。
【0050】
２回目の消化を、細胞培養インキュベーター内で３７℃にて１時間実施した。最初の消化のステップを繰り返した。３回目の消化を、細胞培養インキュベーター内で３７℃にてさらに１時間実施した。０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰを含み、室温に保持した２０ｍｌのＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２（消化培地）を、消化しようとする組織をまだ含んでいるチューブに加えた。次いで、最後の１時間、チューブを細胞培養インキュベーターに入れ、最初の消化のステップを繰り返した。この時点で、確立された初代培養ごとに３つのＴ１７５フラスコが存在した。いくつかの場合では、消化された組織を上下にピペッティングして分解し、第４のＴ１７５フラスコにピペッティングして入れることができる小さな断片を播種して、Ｃｙｓｔ１外植片培養を確立した。
【0051】
継代０（ｐ０）初代細胞培養
Ｔ１７５フラスコをインキュベーターに入れ、４日間静置して、すべての生細胞を基質に十分に接着させた。小さな組織片もまた付着させ、細胞を増殖させた。４日間の細胞接着段階の後、フラスコを、５×抗生物質を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳで洗浄し、接着していないすべての破片を初代培養物から取り除く。初代培養物を洗浄するために、３回の洗浄が必要であった。この時点で、接着した生細胞を目視することができた。画像を撮影し、コンフルエンス率を評価した。
Ｔ１７５フラスコをインキュベーターに入れ、４日間静置して、すべての生細胞を基質に十分に接着させた。小さな組織片もまた付着させ、細胞を増殖させた。４日間の細胞接着段階の後、フラスコを、５×抗生物質を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳで洗浄し、接着していないすべての破片を初代培養物から取り除く。初代培養物を洗浄するために、３回の洗浄が必要であった。この時点で、接着した生細胞を目視することができた。画像を撮影し、コンフルエンス率を評価した。
【0052】
洗浄後、新鮮なＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を添加して（２０～２４ｍｌ）、培養物に再度栄養を補給した。細胞は、播種後８～９日でコンフルエンスに達したが、いくつかの場合では２～３週間を要した。Ｔ１７５フラスコがコンフルエントに到達した後、フラスコを５×抗生物質を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳで１回洗浄し、次いで、３７℃のインキュベーター内で１８ｍｌのフラスコ中で少なくとも１時間インキュベートした。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳによるインキュベーションステップの後、フラスコを複数回叩いて、接着した細胞を緩めた。緩んだ細胞を５０ｍｌのコニカルチューブに回収し、１０ｍｌのＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を加えて細胞に栄養を補給し続けた。次いで、１２ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加えた。次いで、すべての細胞が接着するまでフラスコをインキュベートした。トリプシン－ＥＤＴＡインキュベーションステップの後、フラスコを複数回叩き、緩めた細胞を、ＰＢＳで緩めた細胞及び培地を入れた同じ５０ｍｌコニカルチューブに回収した。
【0053】
その後、細胞を２４００ＲＰＭ、５分間の遠心分離によりペレット化した。上清を注出させたが、少量の液体を残して、ボルテックスで細胞ペレットを分解した。ＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地１ｍｌを添加した。細胞懸濁液の５μｌのアリコートを５μｌのトリパンブルーと混合し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩマシンでカウントした。この時点で、細胞のアリコートを継代数１のために新しいフラスコに播種するか、または細胞をアッセイに使用した。細胞の１０μｌアリコートを別の小さなチューブにピペットで移し、３００μｌの冷ＤＢＭ ３Ｄバイオゲル溶液と混合して３Ｄバイオゲルを形成させた。次いで、細胞を嚢胞形成性または尿細管形成性の表現型について試験した。図２は、プレーティング後及び洗浄前の初代ｈｕＡＤＰＫＤ単一嚢胞の培養を示す。図３は、洗浄後の初代ｈｕＡＤＰＫＤ単一嚢胞培養を示す。図４は、９日後にコンフルエントになった初代ｈｕＡＤＰＫＤ単一嚢胞培養ウェルを示す。
【0054】
初代細胞培養の凍結保存
細胞数を数えると、多くの場合、非常にコンフルエントなＴ１７５フラスコに由来する少なくとも１，０００万個の細胞が存在していたが、この数は様々であった。１ｍｌのＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地に細胞ペレットをすでに再懸濁している状態で、冷ＤＢＭ凍結保存培地を、すべての凍結バイアルに１．５ｍｌを用いて、添加した。一般的に、クライオバイアルあたり１００万個超の細胞が存在していたが、この数は様々に異なり得る。ＤＢＭ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）、またはＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈのＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ培地を使用することができる。
細胞数を数えると、多くの場合、非常にコンフルエントなＴ１７５フラスコに由来する少なくとも１，０００万個の細胞が存在していたが、この数は様々であった。１ｍｌのＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地に細胞ペレットをすでに再懸濁している状態で、冷ＤＢＭ凍結保存培地を、すべての凍結バイアルに１．５ｍｌを用いて、添加した。一般的に、クライオバイアルあたり１００万個超の細胞が存在していたが、この数は様々に異なり得る。ＤＢＭ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）、またはＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈのＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ培地を使用することができる。
【0055】
初代培養物の寿命の延長
標準的な組織培養プラスチック製品で培養した初代培養物の寿命は約４継代である。しかしながら、透過性フィルター支持体上で初代ｈｕＡＤＰＫＤ嚢胞性腎臓細胞を増殖させることにより、同じ初代培養の寿命が少なくとも８継代まで延長される。透過性フィルター支持体上で初代ｈｕＡＤＰＫＤ嚢胞細胞と初代正常ヒト腎臓細胞を増殖及び維持する方法はまた、３Ｄ組織培養系（３Ｄバイオゲルなど）内で細胞がそれぞれ嚢胞または尿細管を形成する能力を維持することも支援する。いくつかの場合では、各ウェルに２４ｍｍの大きな透明なポリエステルフィルター支持体を含むＣｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ３４５０－６プレートで細胞を増殖させることにより、増殖中に細胞を目視することができる。任意選択で、ポリカーボネート製のＣｏｍｉｎｇ ２４１９ １０ｃｍディッシュ透過性フィルター支持体上で細胞を増殖させた。
標準的な組織培養プラスチック製品で培養した初代培養物の寿命は約４継代である。しかしながら、透過性フィルター支持体上で初代ｈｕＡＤＰＫＤ嚢胞性腎臓細胞を増殖させることにより、同じ初代培養の寿命が少なくとも８継代まで延長される。透過性フィルター支持体上で初代ｈｕＡＤＰＫＤ嚢胞細胞と初代正常ヒト腎臓細胞を増殖及び維持する方法はまた、３Ｄ組織培養系（３Ｄバイオゲルなど）内で細胞がそれぞれ嚢胞または尿細管を形成する能力を維持することも支援する。いくつかの場合では、各ウェルに２４ｍｍの大きな透明なポリエステルフィルター支持体を含むＣｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ３４５０－６プレートで細胞を増殖させることにより、増殖中に細胞を目視することができる。任意選択で、ポリカーボネート製のＣｏｍｉｎｇ ２４１９ １０ｃｍディッシュ透過性フィルター支持体上で細胞を増殖させた。
【0056】
処理結果及び凍結保存法
ドナー由来の２つの１０ポンドの疾患ヒトＡＤＰＫＤ（ｈｕＡＤＰＫＤ）腎臓を受け取り、処理して、５０個の単一嚢胞由来の初代培養物及び８つの多嚢胞性微小嚢胞組織由来の初代培養物とした。合計で、クライオバイアルあたり１００万個の細胞の、およそ１，５００個のクライオバイアルを増殖させ、継代数０及び継代数１の細胞として凍結保存した。透過性フィルター支持体上での標準的な再誘導により、これらの初代培養物は、初期継代細胞として十分に維持することができる。
ドナー由来の２つの１０ポンドの疾患ヒトＡＤＰＫＤ（ｈｕＡＤＰＫＤ）腎臓を受け取り、処理して、５０個の単一嚢胞由来の初代培養物及び８つの多嚢胞性微小嚢胞組織由来の初代培養物とした。合計で、クライオバイアルあたり１００万個の細胞の、およそ１，５００個のクライオバイアルを増殖させ、継代数０及び継代数１の細胞として凍結保存した。透過性フィルター支持体上での標準的な再誘導により、これらの初代培養物は、初期継代細胞として十分に維持することができる。
【0057】
第２の消化と第２の洗浄を行ったｈｕＡＤＰＫＤ細胞ペレットからは、大きなＴ１７５フラスコに播種する際に、より良好な初代細胞の収率が得られた。第１の消化と第１の洗浄でも細胞は得られたが；培養物はコンフルエンスに到達するのが遅く、線維芽細胞の含有率が高かった。
【0058】
嚢胞形成表現型を評価するために、凍結保存し、３Ｄバイオゲルに播種するという点において、速い方から遅い方までの４群すなわち４波の細胞が存在していた。一般的に、初代培養の最初の２つの「波」は嚢胞形成性であり、細胞型の適切な混合を示していた。より遅い２つの「波」は、線維芽細胞の含有率が高く、線維芽細胞の数を減らすために示差的なトリプシン処理を行う必要がある場合があり；しかし、これらの培養物の多くはそれでもなお嚢胞を生成した。線維芽細胞が多すぎる培養物を使用して、悪性過剰増殖性線維芽細胞抗増殖アッセイの主要な治療資産を評価することができる。全体として、嚢胞形成性を評価した後、嚢胞形成性であった多くの初代培養物（大部分）が存在していた。合格とみなされた、望ましい線維芽細胞含有率よりも高いものに対しては、示差的なトリプシン分解を行い、嚢胞形成アッセイを改善させた。線維芽細胞の割合が許容できないほど高いものは、抗増殖アッセイに使用することができる。培養物の一部を使用して、分泌されたケモカイン阻害について、及び被験化合物の投与後の悪性過剰増殖性線維芽細胞に対する抗増殖効果について、アッセイした。
【0059】
初代細胞培養物の不死化
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）及びＬｅｎｔｉ－ＣＤＮＫ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のＬｅｎｔｉ－ＳＶ４０Ｔ、Ｌｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴ－Ｎｅｏ及びＬｅｎｔｉ－ＣＤＫ４の高力価アリコート（１０９ｐｆｕ）を、細胞チャレンジのために形質移入培地１０７ｐｆｕ中に希釈した。いくつかの場合では、より新しい不死化法として、Ｌｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴとＬｅｎｔｉ－ＣＤＫ４またはＬｅｎｔｉ－ＣＤＮＫ２を組み合わせた。ｈｕＡＤＰＫＤ初代培養物を、強制的な遺伝子型、許容可能な細胞増殖率、及び３Ｄマトリゲル培養物中での嚢胞形成能力に基づいて、不死化のために選択した。両方の方法によって初代培養物から混合不死化培養物を確立し、そこでは、細胞の寿命が５継代（初代）から１０継代（混合不死）に倍増した。ＳＶ４０Ｔ法は、経上皮抵抗（ＴＥＥＲ）測定及びおそらくウッシングチャンバーベースのイオン輸送の電気生理学的記録のために、電気的にタイトな分極細胞単層を形成する不死細胞培養物を生成することに成功した。これらの不死のヒトＡＤＰＫＤ細胞単層は、体液輸送アッセイにも役立ち得る。新しい不死化ヒトＡＤＰＫＤ細胞株の経上皮／経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）データを、以下の表１に示す。アミロライド処理による抵抗性の増加は、上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）が細胞単層で発現していることを示している。
すべての値はオーム単位の経上皮抵抗であり、アミロライド前後の培養物について、平均値±標準偏差で示している。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）及びＬｅｎｔｉ－ＣＤＮＫ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のＬｅｎｔｉ－ＳＶ４０Ｔ、Ｌｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴ－Ｎｅｏ及びＬｅｎｔｉ－ＣＤＫ４の高力価アリコート（１０９ｐｆｕ）を、細胞チャレンジのために形質移入培地１０７ｐｆｕ中に希釈した。いくつかの場合では、より新しい不死化法として、Ｌｅｎｔｉ－ｈＴＥＲＴとＬｅｎｔｉ－ＣＤＫ４またはＬｅｎｔｉ－ＣＤＮＫ２を組み合わせた。ｈｕＡＤＰＫＤ初代培養物を、強制的な遺伝子型、許容可能な細胞増殖率、及び３Ｄマトリゲル培養物中での嚢胞形成能力に基づいて、不死化のために選択した。両方の方法によって初代培養物から混合不死化培養物を確立し、そこでは、細胞の寿命が５継代（初代）から１０継代（混合不死）に倍増した。ＳＶ４０Ｔ法は、経上皮抵抗（ＴＥＥＲ）測定及びおそらくウッシングチャンバーベースのイオン輸送の電気生理学的記録のために、電気的にタイトな分極細胞単層を形成する不死細胞培養物を生成することに成功した。これらの不死のヒトＡＤＰＫＤ細胞単層は、体液輸送アッセイにも役立ち得る。新しい不死化ヒトＡＤＰＫＤ細胞株の経上皮／経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）データを、以下の表１に示す。アミロライド処理による抵抗性の増加は、上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）が細胞単層で発現していることを示している。
【表1】
【0060】
遺伝子型判定
Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＰＫＤ Ｃｅｎｔｅｒ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｒｉｚｏｎａのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｅｓを使用して、初代ヒトＡＤＰＫＤ細胞培養物（主に単一嚢胞由来培養物）のフラッシュ凍結細胞ペレットをＣｏｒｅｓに送り、ＣｏｒｅｓがゲノムＤＮＡを単離し、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＨＤ１遺伝子のＤＮＡシーケンシングのサンガー法もしくは次世代シーケンシング、またはまれな場合では、腎臓が真正な多発性嚢胞腎であるかどうかが不明な場合に、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を使用した。表２は、遺伝子型判定試験の結果を示す。
Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ ＰＫＤ Ｃｅｎｔｅｒ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｒｉｚｏｎａのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｅｓを使用して、初代ヒトＡＤＰＫＤ細胞培養物（主に単一嚢胞由来培養物）のフラッシュ凍結細胞ペレットをＣｏｒｅｓに送り、ＣｏｒｅｓがゲノムＤＮＡを単離し、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＨＤ１遺伝子のＤＮＡシーケンシングのサンガー法もしくは次世代シーケンシング、またはまれな場合では、腎臓が真正な多発性嚢胞腎であるかどうかが不明な場合に、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を使用した。表２は、遺伝子型判定試験の結果を示す。
【表2】
【0061】
表２に示すように、１２人のドナーを処理した。表２では、ＳＣ＝単一嚢胞由来の初代培養物；ＭＣＴ＝微小嚢胞性多嚢胞性組織由来の初代培養物；及びＮＨＫ＝ＡＤＰＫＤ組織標本内で同定された非嚢胞性組織由来の初代培養物である。
【0062】
単一嚢胞由来の培養物を、生殖細胞変異及び二次体細胞変異について遺伝子型判定した。７人のドナーの結果は以下のことを示す：３人のドナーで体細胞変異は認められず、２人のドナーで１～２例の体細胞変異が認められ、ＰＫＤ２変異体を有する１人のドナーは、個々の嚢胞培養ごとに異なる二次的な体細胞ヒットの頻繁な例を有していた。変異はドナーに依存する。いくつかの例では、ＡＤＰＫＤ患者は、体細胞変異を防ぐのに十分な効率的な遺伝子編集を有している場合があり、一方で、他の患者は有していない場合がある。
【0063】
嚢胞予防細胞発生バイオアッセイ
３Ｄ嚢胞形成が可能な初代細胞を、液化３Ｄバイオゲルに播種した後、ゲルを固めた。ゲルを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で１８時間静置した。次いで、等量のＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を４８ウェルプレートの各ウェルに重層した。ウェルがいっぱいになるまで「添加」フィードを実行し、次いで培地の半分の量を取り除き、その後、同量の新しい培地を添加した。嚢胞が現れるまでに７～１０日を要した（光学顕微鏡による目視検査に基づく）。嚢胞予防アッセイでは、嚢胞が現れ始めたら（寸法が小さく、ウェルあたりの数が少ない）すぐに被験化合物でチャレンジした。被験化合物を添加するタイミング、被験化合物を添加する頻度、及び被験化合物の濃度を変化させた。嚢胞への影響を、光ベースの顕微鏡画像によって経時的に追跡した。試験全体で行う光ベースの顕微鏡イメージングによる目視検査に加えて、試験の最後にウェルごとに嚢胞の数を数え、光ベースのエンドポイント、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ（登録商標）（生細胞を定量化するため）、ＬＤＨ分泌（細胞膜の完全性を定量化するため）、及び／またはＣａｓｐａｓｅ－ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）（アポトーシスの誘導を測定するため）を多重に試験した。嚢胞形成を完全に防止するために毎日バイオゲルに播種した後のこのアッセイ画像の修正版と、１４～２１日間にわたる対応する対照との比較。複数の複製を実施し、複数のドナー由来の細胞を試験した。
３Ｄ嚢胞形成が可能な初代細胞を、液化３Ｄバイオゲルに播種した後、ゲルを固めた。ゲルを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で１８時間静置した。次いで、等量のＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地を４８ウェルプレートの各ウェルに重層した。ウェルがいっぱいになるまで「添加」フィードを実行し、次いで培地の半分の量を取り除き、その後、同量の新しい培地を添加した。嚢胞が現れるまでに７～１０日を要した（光学顕微鏡による目視検査に基づく）。嚢胞予防アッセイでは、嚢胞が現れ始めたら（寸法が小さく、ウェルあたりの数が少ない）すぐに被験化合物でチャレンジした。被験化合物を添加するタイミング、被験化合物を添加する頻度、及び被験化合物の濃度を変化させた。嚢胞への影響を、光ベースの顕微鏡画像によって経時的に追跡した。試験全体で行う光ベースの顕微鏡イメージングによる目視検査に加えて、試験の最後にウェルごとに嚢胞の数を数え、光ベースのエンドポイント、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ（登録商標）（生細胞を定量化するため）、ＬＤＨ分泌（細胞膜の完全性を定量化するため）、及び／またはＣａｓｐａｓｅ－ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）（アポトーシスの誘導を測定するため）を多重に試験した。嚢胞形成を完全に防止するために毎日バイオゲルに播種した後のこのアッセイ画像の修正版と、１４～２１日間にわたる対応する対照との比較。複数の複製を実施し、複数のドナー由来の細胞を試験した。
【0064】
図５に示すように、嚢胞予防アッセイの中間点及び終了時に、業界標準の薬剤であるトルバプタンは、嚢胞の出現と拡大にほとんど影響を及ぼさなかった。このバソプレシン受容体拮抗薬は、１０及び３０マイクロモルで嚢胞の拡大を遅らせた可能性があるが、この薬剤の溶解限度は３０マイクロモル近くであった。トルバプタンによる明白な細胞傷害性はなかった。図６に示すように、嚢胞予防アッセイの中間点及び終了時に、業界標準の薬剤であるラパマイシンは、嚢胞の出現と拡大にほとんど影響を与えなかった。このｍＴＯＲ阻害剤は１０マイクロモルで嚢胞の拡大を遅らせたが；この薬物の溶解限度は３０マイクロモル近くである。３０マイクロモルのラパマイシンによる明白な細胞傷害性があった。図７に示すように、嚢胞予防アッセイの中間点及び終了時に、業界標準の薬剤であるボスチニブは、嚢胞の出現と拡大に影響を及ぼさなかった。このＭＡＰキナーゼ阻害剤は、期待外れの業界標準の対照であった。ボスチニブによる明白な細胞傷害性はなかった。
【0065】
１～３０μＭの濃度でのＤＭＳＯビヒクル対照を実施した。結果を図８に示す。ＤＳＭＯの最高濃度（３０μＭ）では、７２～１４４時間の間に嚢胞拡張の適度な減弱が生じた。しかしながら、試験したすべての低濃度（１、３、及び１０μＭ）で、ＤＭＳＯビヒクル対照は７２時間と１４４時間のペア画像において効果を示さなかった。
【0066】
別の例示的な嚢胞予防アッセイでは、３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ（登録商標）を使用して、化合物スクリーニングアッセイで選択した化合物の濃度応答曲線に１３日間曝露した後、バイオゲル内の生存可能なＡＤＰＫＤ細胞を定量化した。結果を図２９に示す。細胞生存率に加えて、３Ｄ予防アッセイ形式で増殖したＡＤＰＫＤ細胞由来の嚢胞の数も測定した（図３０）。図３１に示すように、嚢胞のサイズも測定した。選択した化合物の濃度応答曲線に曝露した後、３Ｄ嚢胞予防アッセイで１４日間増殖させたＡＤＰＫＤ細胞の代表的な画像を図３２に示す。画像は、候補化合物のいずれについても細胞傷害性が観察されない濃度０．１μＭから示している。図３３は、細胞生存率（３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧＬＯ（登録商標）（バイオゲルあたりの生存細胞数）による）と、明白な細胞傷害性の尺度としてのＬＤＨ分泌または漏出の多重検出を示している。ＬＤＨは、細胞膜の完全性が失われると細胞から放出され、このことは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯを単独で使用するだけでは直接確認することができない明白な細胞傷害性を示している。図２９～３３は、広角レンズを備えたＣｙｔａｔｉｏｎ５ハイコンテントイメージャーを使用してウェル全体を一度に画像化して得られたデータを示している。本明細書に記載のように、多重化検出アッセイにおいて追加のアッセイを使用することができる。例えば、分泌された炎症性メディエーターまたはオートクリン／パラクリン因子（例えば、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、細胞外ＡＴＰなど）の検出を、細胞生存率アッセイと組み合わせて実施することができる。ＰＫＤのげっ歯類モデルではうまく再現されないヒトＰＫＤ疾患の特徴であるＰＫＤ「インフラマソーム」を測定するために、ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用して、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦαなどの選択した炎症性メディエーターの分泌を検出することができる。
【0067】
嚢胞攻撃細胞形成バイオアッセイ
３Ｄ嚢胞形成が可能な初代細胞を、嚢胞予防細胞形成バイオアッセイのために上記のように播種した。嚢胞攻撃アッセイでは、嚢胞の数を１２～２４に増加させることができ、かなりのサイズに拡大することができた。特定の嚢胞または嚢胞クラスターを各ウェルにマークした。次いで、被験化合物を加えて、すでに形成された嚢胞を攻撃し、嚢胞への影響を測定した。光ベースの顕微鏡画像によって経時的に嚢胞を追跡した。化合物の添加のタイミング、化合物の添加の頻度、及び化合物の濃度を変化させた。試験全体及び試験終了時に行う光ベースの顕微鏡イメージングによる目視検査、及び試験終了時にウェルごとにカウントした嚢胞の数に加えて、３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯ（生細胞を定量化するため）、ＬＤＨ分泌（細胞膜の完全性を定量化するため）、及びＣａｓｐａｓｅＧＬＯ（アポトーシスの誘導を測定するため）などの光ベースのエンドポイントを多重に調べた。複数の複製を実施し、複数のドナー由来の細胞を試験した。
３Ｄ嚢胞形成が可能な初代細胞を、嚢胞予防細胞形成バイオアッセイのために上記のように播種した。嚢胞攻撃アッセイでは、嚢胞の数を１２～２４に増加させることができ、かなりのサイズに拡大することができた。特定の嚢胞または嚢胞クラスターを各ウェルにマークした。次いで、被験化合物を加えて、すでに形成された嚢胞を攻撃し、嚢胞への影響を測定した。光ベースの顕微鏡画像によって経時的に嚢胞を追跡した。化合物の添加のタイミング、化合物の添加の頻度、及び化合物の濃度を変化させた。試験全体及び試験終了時に行う光ベースの顕微鏡イメージングによる目視検査、及び試験終了時にウェルごとにカウントした嚢胞の数に加えて、３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯ（生細胞を定量化するため）、ＬＤＨ分泌（細胞膜の完全性を定量化するため）、及びＣａｓｐａｓｅＧＬＯ（アポトーシスの誘導を測定するため）などの光ベースのエンドポイントを多重に調べた。複数の複製を実施し、複数のドナー由来の細胞を試験した。
【0068】
顕著な嚢胞を、治療前と治療開始後６日間、毎日画像化した。この大きな嚢胞は、業界標準の薬剤であるバソプレシン受容体拮抗薬であるトルバプタンの存在下で２．５～３．０倍に増加した。図９に示すように、３μＭトルバプタンの存在下で、小さな嚢胞と大きな嚢胞を、治療開始前と治療開始後６日間、毎日一緒に画像化した。小さい嚢胞はすぐにサイズが小さくなった（矢印を参照のこと）。大きな嚢胞はサイズが２倍になったが、１週間の治療の終わりにサイズがわずかに小さくなり、球形の一部が失われた。図１０に示すように、ラパマイシン（３μＭ）による治療を開始する前、次いで治療開始後６日間、毎日小さな嚢胞を画像化した。この嚢胞は適度にサイズが大きくなり、残りの日は静止したままであった。ラパマイシンはまた、他の画像で他の嚢胞及びスフェロイドを排除したが、この濃度では明白な毒性はなかった。図１１に示すように、３μＭボスチニブによる治療を開始する前、及び治療開始後６日間、毎日小さな嚢胞を画像化した。この嚢胞は、１～２日でサイズが２倍に増加したが、３～６日間、サイズが減弱または「ロック」され、それ以上の拡大は観察されなかった。
【0069】
図１２に示すように、ＤＭＳＯ ３μＭ当量を使用して、ビヒクル対照の開始前及び治療開始後６日間、単一の大きな嚢胞を画像化した。その大きな嚢胞はサイズが２倍になり、さらに小さなサテライト嚢胞が視野内により顕著になるか、または現れた。
【0070】
ハイスループット嚢胞形成アッセイ
ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）ハイコンテントイメージング及び光ベースのハイスループットスクリーニングイメージングシステムを使用して、９６ウェル及び３８４ウェルマイクロタイタープレートの３Ｄバイオゲルで増殖するｈｕＡＤＰＫＤ細胞を画像化した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ５はＢｉｏＴｅｋＢｉｏＳｐａ８（加湿ＣＯ２インキュベーター）に結合されており、それにより、リーダーで分析するためにトレイを一度に１つずつ抽出し、ＢｉｏＳｐａに戻すことができる。９６ウェルフルエリアウェルプレート、９６ウェルハーフエリアウェルプレート、及び３８４ウェルプレートの主要な初代及び不死化ｈｕＡＤＰＫＤ細胞培養物から、細胞形成を観察した。図１３は、３８４ウェルプレートの嚢胞形成アッセイの概略設計を示す。
ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）ハイコンテントイメージング及び光ベースのハイスループットスクリーニングイメージングシステムを使用して、９６ウェル及び３８４ウェルマイクロタイタープレートの３Ｄバイオゲルで増殖するｈｕＡＤＰＫＤ細胞を画像化した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ５はＢｉｏＴｅｋＢｉｏＳｐａ８（加湿ＣＯ２インキュベーター）に結合されており、それにより、リーダーで分析するためにトレイを一度に１つずつ抽出し、ＢｉｏＳｐａに戻すことができる。９６ウェルフルエリアウェルプレート、９６ウェルハーフエリアウェルプレート、及び３８４ウェルプレートの主要な初代及び不死化ｈｕＡＤＰＫＤ細胞培養物から、細胞形成を観察した。図１３は、３８４ウェルプレートの嚢胞形成アッセイの概略設計を示す。
【0071】
特に、特殊なＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地は、添加物（フォルスコリンまたは他のｃＡＭＰ刺激）なしで嚢胞形成を誘発するのに十分であった。ドライバーは必要ないが、必要に応じて使用することができる。エッジ効果を軽減するために、エッジウェルを生理食塩水で満たす。
【0072】
ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ５システムを使用して、３８４ウェルプレートに播種したＡＤＰＫＤ初代細胞のウェル全体の自動化されたハイコンテントイメージングを実施した。処理ごとに複数のウェルをキャプチャした。均一な画像を、分析のために深層学習アルゴリズムに供給した。図１４に示すように、ＤＢＭ ＲｅｎａｌＣｙｔｅ培地は嚢胞形成を促進するのに十分であったため、ｃＡＭＰアゴニストや成長因子のような刺激は必要なかった。
【0073】
ＡＤＰＫＤ細胞を、アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）の非存在下または存在下で１４日間培養した。図１５に示すように、この生理学的サイクリックＡＭＰ刺激の存在下での培養では、嚢胞は平均してより大きくなる。
【0074】
ハイコンテントイメージング、細胞生存率分析、嚢胞カウント、及び嚢胞サイズ分析を、業界標準の対照薬であるリコリノスタット（０．３～１００μＭ）の存在下で培養物に対して実施した。結果を図１６Ａ～Ｄに示し、これは、ウェル全体の嚢胞の一般的なハイコンテンツ画像、３Ｄバイオゲル細胞生存率及び嚢胞数、ならびに人工知能アルゴリズム及び「ビニング」法を使用した嚢胞サイズ分析のヒストグラムを示している。
【0075】
予防における化合物スクリーニング。攻撃及び減少アッセイ
化合物１を、予防アッセイ及び攻撃アッセイの両方で試験した。結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示し、化合物１の結果（ｎ＝９）とトルバプタンの結果（ｎ＝９）を比較する。それぞれについて３０～１０００ｎＭの濃度を試験し、データをＤＭＳＯ対照に対する生存率（ｎ＝１２）として表した。化合物１はナノモルの効力を示したが、トルバプタンは同じ範囲では無効であった。統計分析はＡＮＯＶＡを使用して実施した。図１８に示すように、嚢胞予防アッセイにおける嚢胞の減弱は、３０ｎＭを超える化合物１の濃度で観察された。化合物２は、図１９及び２０に示すように、予防及び攻撃アッセイで同様の結果をもたらす。しかしながら、図２１及び２２に示すように、化合物１の類似体である化合物３は、同じ濃度での予防及び攻撃アッセイの両方で効果がなかった。図２３に示すように、トルバプタンは中程度のマイクロモル濃度でのみ嚢胞予防アッセイで効果があると判断された。図２４は、ナノモル濃度の化合物１、２、４、及び３ならびにトルバプタンの結果を示す。
化合物１を、予防アッセイ及び攻撃アッセイの両方で試験した。結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示し、化合物１の結果（ｎ＝９）とトルバプタンの結果（ｎ＝９）を比較する。それぞれについて３０～１０００ｎＭの濃度を試験し、データをＤＭＳＯ対照に対する生存率（ｎ＝１２）として表した。化合物１はナノモルの効力を示したが、トルバプタンは同じ範囲では無効であった。統計分析はＡＮＯＶＡを使用して実施した。図１８に示すように、嚢胞予防アッセイにおける嚢胞の減弱は、３０ｎＭを超える化合物１の濃度で観察された。化合物２は、図１９及び２０に示すように、予防及び攻撃アッセイで同様の結果をもたらす。しかしながら、図２１及び２２に示すように、化合物１の類似体である化合物３は、同じ濃度での予防及び攻撃アッセイの両方で効果がなかった。図２３に示すように、トルバプタンは中程度のマイクロモル濃度でのみ嚢胞予防アッセイで効果があると判断された。図２４は、ナノモル濃度の化合物１、２、４、及び３ならびにトルバプタンの結果を示す。
【0076】
化合物１、２、４、及び３のＩＣ５０は１００ｎＭ以下であるが、トルバプタンのＩＣ５０は１０μＭ超である。トルバプタンは、ｃＡＭＰ刺激アッセイにおいてわずかにより効果的である。化合物１、２、及び５はまた、細胞生存率の３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯアッセイで、３Ｄバイオゲルごとに複数の嚢胞が拡大した初代ヒトＡＤＰＫＤ培養物において、Ｖｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正薬（１０μＭ）及びトルバプタン（１０μＭ）とも比較した。培養物を２週間インキュベートした後、薬物またはＤＭＳＯ対照及び培地のみの対照で１週間処理した。化合物１及び２では、６０～６５％の阻害が観察されたが、化合物６（化合物１の類似体）、Ｖｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正薬、及びトルバプタンは、１０倍高い濃度で約２０％の阻害しか示さなかった。
【0077】
化合物１、２、及び６を、ＣＲＣ設計を使用した細胞生存率の３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯアッセイで、Ｖｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲ補正薬と比較した。この設計では、ＡＤＰＫＤ細胞培養物中に３Ｄバイオゲルごとにいくつかの小さな嚢胞が形成され始めた（すなわち、薬物または培地またはＤＭＳＯのみによる１週間の治療の１０日前にインキュベートした）。嚢胞減少アッセイの結果を図２６に示す。化合物１と２は同様のＣＲＣ関係を有し、ＩＣ５０は２００ｎＭで、７５％の阻害は細胞増殖抑制または増殖停止を反映している。化合物６は、ＩＣ５０が３μＭの場合ははるかに効力が弱かったが、同様の最大阻害を示した。対照的に、ＶＸ－６６１は３０μＭのＩＣ５０、及びシグナルなしの完全な阻害を示し、明白な細胞傷害性を示した。ＶＸ－８０９は、トルバプタンと同様に、部分的な効果のみを示し、最高濃度でのみ効果を示した。
【0078】
同様に、図２７は、ＡＤＰＫＤ細胞を培養するＣＲＣ設計を使用した細胞生存率の３Ｄ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬＯアッセイにおいて、化合物１、２、及び６を使用した嚢胞予防アッセイとＶｅｒｔｅｘ ＣＦＴＲコレクター薬物の結果を示している。このアッセイでは、ＡＤＰＫＤ細胞培養物を、薬物、培地のみ、またはＤＭＳＯのみで処置する１週間の４日前にインキュベートした。化合物１は１００ｎＭ未満のＩＣ５０を示し、化合物２は２００ｎＭ未満のＩＣ５０を示した。細胞増殖抑制剤または増殖停止を反映して、７５％の阻害が再び観察された。化合物６ははるかに効力が低く、ＩＣ５０は４μＭであったが、同様の最大阻害を示した。対照的に、ＶＸ－６６１は１０μＭのＩＣ５０、及びシグナルなしの完全な阻害を示し、明白な細胞傷害性を示した。ＶＸ－８０９は部分的な効果のみを示し、最高濃度でのみ効果を示した。
【0079】
正常ヒト腎臓（ＮＨＫ）細胞の化合物スクリーニング
３Ｄバイオゲルで増殖させた正常ヒト腎臓（ＮＨＫ）細胞での小分子コレクションの初期スクリーニングを実施して、これらの分子がＮＨＫ細胞に対して毒性がなく、３Ｄバイオゲルの尿細管形成を妨害しないことを裏付ける。有害ではない小分子を、上記の主要なヒトＡＤＰＫＤ嚢胞形成アッセイで評価し、嚢胞形成が減弱するかどうかを経時的に判断する。選択した炎症性メディエーター（いわゆるＡＤＰＫＤインフラマソームの潜在的阻害剤）の産生／分泌が減弱しているかどうかを判断するために、試験終了時に上清を回収する。ＡＤＰＫＤ嚢胞形成及びインフラマソームの検証された阻害剤を、少なくとも２人の追加のＡＤＰＫＤドナーに由来する細胞で試験する。
３Ｄバイオゲルで増殖させた正常ヒト腎臓（ＮＨＫ）細胞での小分子コレクションの初期スクリーニングを実施して、これらの分子がＮＨＫ細胞に対して毒性がなく、３Ｄバイオゲルの尿細管形成を妨害しないことを裏付ける。有害ではない小分子を、上記の主要なヒトＡＤＰＫＤ嚢胞形成アッセイで評価し、嚢胞形成が減弱するかどうかを経時的に判断する。選択した炎症性メディエーター（いわゆるＡＤＰＫＤインフラマソームの潜在的阻害剤）の産生／分泌が減弱しているかどうかを判断するために、試験終了時に上清を回収する。ＡＤＰＫＤ嚢胞形成及びインフラマソームの検証された阻害剤を、少なくとも２人の追加のＡＤＰＫＤドナーに由来する細胞で試験する。
【0080】
図２８は、本明細書に記載のアッセイを使用してＡＤＰＫＤ嚢胞形成阻害剤を同定するためのプロセスの概略図である。簡潔に述べると、最初に初代正常ヒト腎臓細胞プラットフォームにおいて治療候補をスクリーニングして細胞傷害性の欠如を裏付け、それにより、ヒトＡＤＰＫＤ嚢胞腎阻害剤及び／またはインフラマソーム阻害剤としてスクリーニングされる「安全な」化合物を同定する。ハイコンテントイメージングが嚢胞形成の減弱または嚢胞の収縮を記録する場合、マルチプレックスアッセイを使用し、一方、３Ｄバイオゲルを覆う培地上清を採取して、ヒトＡＤＰＫＤ「インフラマソーム」のケモカイン、サイトカイン、及び他のバイオマーカーをＡｌｐｈａＬＩＳＡテクノロジーによって定量化する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の生体外での産生方法であって、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から単離された１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で前記１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｂ）前記複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞が、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；
（ｄ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化する
ことを含む、前記産生方法。
【請求項2】
前記１つ以上の単離された細胞の遺伝子型決定または全エクソーム配列決定をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記移した複数の単一嚢胞由来細胞が、移す前に５回未満継代されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記移した複数の細胞が、３回未満継代されている、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記単離した１つ以上の細胞を、透過性フィルター上で培養する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記不死化を、テロメラーゼを使用して実施する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記不死化を、ウイルスがん遺伝子を使用して実施する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ウイルスがん遺伝子がＳＶ４０である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養。
【請求項10】
前記細胞を、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットが、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；
（ｅ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作出する
ことによって産生する、請求項９に記載の初代培養物。
【請求項11】
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって誘導される、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
【請求項13】
（ａ）請求項１１または１２の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団及び（ｂ）三次元ゲル
を含む、多嚢胞性腎臓由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養物。
【請求項14】
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、（ｂ）前記接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして
（ｃ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを決定することを含み、嚢胞様形成のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項15】
前記多嚢胞性腎臓由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の嚢胞形成レベルである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養系を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、（ｂ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の前記三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを測定することを含み、嚢胞形成能のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項19】
前記多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の前記嚢胞形成レベルである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0005】
さらに、多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。方法は、（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングする薬剤と接触させ；（ｂ）接触させた細胞を嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして（ｃ）対照レベルと比較した、薬剤での処理後の接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成レベルを測定するステップを含む。嚢胞様形成レベルの低下は、薬剤により、多発性嚢胞腎疾患が予防または治療されることを示す。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の産生方法であって、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で前記１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞が、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；
（ｅ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化する
ことを含む、前記産生方法。
（項目２）
前記１つ以上の単離された細胞の遺伝子型決定または全エクソーム配列決定をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記移した複数の単一嚢胞由来細胞が、移す前に５回未満継代されている、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記移した複数の細胞が、３回未満継代されている、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記単離した１つ以上の細胞を、透過性フィルター上で培養する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記不死化を、テロメラーゼを使用して実施する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記不死化を、ウイルスがん遺伝子を使用して実施する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ウイルスがん遺伝子がＳＶ４０である、項目７に記載の方法。
（項目９）
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養。
（項目１０）
前記細胞を、
（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットが、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；
（ｅ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作出する
ことによって産生する、項目９に記載の初代培養物。
（項目１１）
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
（項目１２）
項目１～８のいずれか一項に記載の方法によって誘導される、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
（項目１３）
（ａ）項目１１または１２の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団及び
（ｂ）三次元ゲル
を含む、多嚢胞性腎臓由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養物。
（項目１４）
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、
（ｂ）前記接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして
（ｃ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを決定することを含み、嚢胞様形成のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
（項目１５）
前記多嚢胞性腎臓由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の嚢胞形成レベルである、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養系を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、
（ｂ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の前記三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを測定することを含み、嚢胞形成能のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
（項目１９）
前記多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の前記嚢胞形成レベルである、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の産生方法であって、（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で前記１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞が、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成するかどうかを判定し；
（ｅ）嚢胞様構造を形成する複数の単一嚢胞由来細胞のうちの１つ以上を不死化する
ことを含む、前記産生方法。
（項目２）
前記１つ以上の単離された細胞の遺伝子型決定または全エクソーム配列決定をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記移した複数の単一嚢胞由来細胞が、移す前に５回未満継代されている、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記移した複数の細胞が、３回未満継代されている、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記単離した１つ以上の細胞を、透過性フィルター上で培養する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記不死化を、テロメラーゼを使用して実施する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記不死化を、ウイルスがん遺伝子を使用して実施する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ウイルスがん遺伝子がＳＶ４０である、項目７に記載の方法。
（項目９）
多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養。
（項目１０）
前記細胞を、
（ａ）多発性嚢胞腎の単一嚢胞から１つ以上の細胞を単離し；
（ｂ）前記単離した１つ以上の細胞を、培養皿またはウェル内で１つ以上の細胞を増殖させるための条件下で培養して複数の単一嚢胞由来細胞を作出し；
（ｃ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットを、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；
（ｄ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の最初のサブセットが、前記三次元培養物中で嚢胞様構造を形成することを決定し；
（ｅ）前記複数の単一嚢胞由来細胞の第２のサブセットを単離して、多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の初代培養物を作出する
ことによって産生する、項目９に記載の初代培養物。
（項目１１）
多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
（項目１２）
項目１～８のいずれか一項に記載の方法によって誘導される、多発性嚢胞腎由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団。
（項目１３）
（ａ）項目１１または１２の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の集団及び
（ｂ）三次元ゲル
を含む、多嚢胞性腎臓由来の不死化された嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養物。
（項目１４）
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、
（ｂ）前記接触させた細胞を、嚢胞形成用に構成された三次元培養系に移し；そして
（ｃ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを決定することを含み、嚢胞様形成のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
（項目１５）
前記多嚢胞性腎臓由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の嚢胞形成レベルである、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
（ａ）多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の三次元培養系を、スクリーニングしようとする薬剤と接触させ、
（ｂ）対照レベルと比較した、前記薬剤での処理後の前記接触させた細胞の前記三次元培養系内での嚢胞様形成のレベルを測定することを含み、嚢胞形成能のレベルの低下が、前記薬剤が多発性嚢胞腎疾患を予防または治療することを示す、
多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤のスクリーニング方法。
（項目１９）
前記多発性嚢胞腎由来の嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の培養物が、単一嚢胞または不死化細胞から単離した細胞の初代培養物を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記多発性嚢胞腎疾患を予防または治療する薬剤を、前記嚢胞形成性の単一嚢胞由来細胞の特定の遺伝子特性と相関させることをさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記対照レベルが、同じ嚢胞に由来する未処理の細胞の前記嚢胞形成レベルである、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】