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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-03
(54)【発明の名称】思春期遅発を予測および処置するためのキスペプチン
(51)【国際特許分類】
A61K 38/00 20060101AFI20220727BHJP
A61P 5/24 20060101ALI20220727BHJP
A61K 31/485 20060101ALI20220727BHJP
A61K 31/568 20060101ALI20220727BHJP
A61K 31/565 20060101ALI20220727BHJP
A61K 31/57 20060101ALI20220727BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20220727BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220727BHJP
【ＦＩ】
A61K38/00
A61P5/24 ZNA
A61K31/485
A61K31/568
A61K31/565
A61K31/57
A61K38/22
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021572513
(86)(22)【出願日】2020-06-08
(85)【翻訳文提出日】2022-02-04
(86)【国際出願番号】 US2020036662
(87)【国際公開番号】W WO2020247936
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】62/858,479
(32)【優先日】2019-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(71)【出願人】
【識別番号】596115687
【氏名又は名称】ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】セミナラ，ステファニー ベス
(72)【発明者】
【氏名】チャン，イー－ミン
(72)【発明者】
【氏名】リピンコット，マーガレット フリン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA20
4C084BA44
4C084DB01
4C084DB10
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZC04
4C084ZC10
4C084ZC11
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB23
4C086DA08
4C086DA09
4C086DA10
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZC04
4C086ZC10
4C086ZC11
4C086ZC75
(57)【要約】
キスペプチンおよびキスペプチンアナログを使用して、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症および生殖内分泌機能不全を診断および処置する方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生殖内分泌機能不全、任意に病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象を処置する方法であって、治療的有効量の（ｉ）複数用量のキスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、および／または（ｉｉ）オピオイドアンタゴニストもしくは混合アゴニスト－アンタゴニストを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記複数用量が、１～６時間、好ましくは２時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１～１２ヶ月にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記複数用量がそれぞれ、静脈内ボーラス（ＩＶＢ）によって投与される、０．０８～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記複数用量がそれぞれ、０．２～０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、好ましくは０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記複数用量が、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の少なくとも１つの超生理学的用量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの超生理学的用量が、前記複数用量の最初の用量、または最初の２回または３回以上の用量、任意に前記複数用量の全てとして投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
治療的有効量のオピオイドアンタゴニストまたは混合アゴニスト－アンタゴニストを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記オピオイドアンタゴニストがナロキソンまたはナルトレキソンであるか、または前記混合アゴニスト－アンタゴニストがブプレノルフィンである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
対象を、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症のリスクがある、または軽症型の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有するものとして特定する方法であって、前記対象におけるＬＨのベースラインレベルを測定することと、
刺激用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログ、例えば静脈内ボーラス（ＩＶＢ）によって投与される、０．０８～１５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む用量、または皮下（ＳＣ）注射によって投与される、０．８～５００ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む用量を前記対象に投与することと、
前記刺激用量の投与後、例えば前記刺激用量の投与後の約１０、１５、２０、３０、４５または６０分以内に少なくとも１つのＬＨレベルを測定すること、
前記対象における前記ＬＨのベースラインレベルを前記刺激用量の投与後のＬＨレベルと比較することと、
前記ＬＨのベースラインレベルと有意差のない前記刺激用量の投与後のＬＨレベルを有する、思春期遅発を有する対象を、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有するものとして特定することと
を含む、方法。
【請求項10】
病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の処置を前記特定した対象に施すことをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記処置が、複数用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログを投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記複数用量が、１～６時間、好ましくは２時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１～１２ヶ月にわたって投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記複数用量がそれぞれ、静脈内ボーラス（ＩＶＢ）によって投与される、０．０８～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記複数用量がそれぞれ、０．２～０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、好ましくは０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記複数用量が、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の少なくとも１つの超生理学的用量を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１つの超生理学的用量が、前記複数用量の最初の用量、または最初の２回または３回以上の用量、任意に前記複数用量の全てとして投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
治療的有効量のオピオイドアンタゴニストまたは混合アゴニスト－アンタゴニストを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
前記オピオイドアンタゴニストがナロキソンまたはナルトレキソンであるか、または混合アゴニスト－アンタゴニストがブプレノルフィンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記処置が、性腺ステロイド補充療法を施すことをさらに含む、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項20】
前記性腺ステロイド補充療法が、男性においてはテストステロンを、女性においてはエストロゲンおよび／またはプロゲステロン／プロゲスチンを投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
１つ以上のゴナドトロピンの投与をさらに含む、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項22】
複数用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログを投与することを含む、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象を処置する方法における使用のための、（ｉ）キスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、および／または（ｉｉ）オピオイドアンタゴニストもしくは混合アゴニスト－アンタゴニストを含む組成物。
【請求項23】
前記複数用量が、１～６時間、好ましくは２時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１～１２ヶ月にわたって投与される、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項24】
前記複数用量がそれぞれ、静脈内ボーラス（ＩＶＢ）によって投与される、０．０８～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項25】
前記複数用量がそれぞれ、０．２～０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、好ましくは０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む、請求項２４に記載の使用のための組成物。
【請求項26】
前記複数用量が、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の少なくとも１つの超生理学的用量を含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項27】
前記少なくとも１つの超生理学的用量が、前記複数用量の最初の用量、または最初の２回または３回以上の用量、任意に前記複数用量の全てとして投与される、請求項２６に記載の使用のための組成物。
【請求項28】
治療的有効量のオピオイドアンタゴニストまたは混合アゴニスト－アンタゴニストを前記対象に投与することをさらに含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項29】
前記オピオイドアンタゴニストがナロキソンまたはナルトレキソンであるか、または前記混合アゴニスト－アンタゴニストがブプレノルフィンである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項30】
前記方法が、性腺ステロイド補充療法を施すことをさらに含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項31】
前記性腺ステロイド補充療法が、男性においてはテストステロンを、女性においてはエストロゲンおよび／またはプロゲステロン／プロゲスチンを投与することをさらに含む、請求項３０に記載の使用のための組成物。
【請求項32】
前記方法が、１つ以上のゴナドトロピンの投与をさらに含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張
本出願は、２０１９年６月７日に出願された、米国仮特許出願第６２／８５８，４７９号の利益を主張するものである。前述の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年６月７日に出願された、米国仮特許出願第６２／８５８，４７９号の利益を主張するものである。前述の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府の援助による研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられる助成金番号ＨＤ０４３３４１、および食品医薬品局によって与えられる助成金番号ＦＤ００５７１２の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられる助成金番号ＨＤ０４３３４１、および食品医薬品局によって与えられる助成金番号ＦＤ００５７１２の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本明細書において、キスペプチンを使用して思春期遅発を診断および処置する方法が記載されている。
本明細書において、キスペプチンを使用して思春期遅発を診断および処置する方法が記載されている。
【背景技術】
【0004】
特発性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（ＩＨＨ）は、視床下部においてＧｎＲＨニューロンが存在しないこと、または調節性の神経回路が存在しないことによる稀少な障害である。これは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌の欠損ならびに１８歳までに正常な生殖機能を達成できないことをもたらす。嗅覚消失を伴う場合、ＩＨＨはカルマン症候群（ＫＳ）と処置する。未処置の患者は、性的に乳児性のままである。
【0005】
思春期遅発を示す子供は、臨床医に厄介な課題を提起し、これは、どの子供が最終的に思春期に進行し、どの子供が進行しないかを予測することが困難であるためである（１、２）。思春期遅発のいくつかの原因は容易に認識可能であり、例えば原発性性腺機能不全、視床下部／下垂体領域の解剖学的病変、および機能的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（すなわち、慢性的な疾患、ストレスまたは陰性のエネルギー収支による生殖内分泌軸の生理学的抑制）である。しかし、これらの症状は、小児内分泌学治療を示す、少女の３６～４７％および少年の１１～２９％の思春期遅発しか説明していない（３～５）。思春期遅発を有する少女および少年の大部分について、提供者は顕著に異なる転帰、体質性遅発およびＩＨＨの２つの可能性のある診断が残されている（１）。体質性遅発は、思春期が遅れて開始する（または開始した後一時的に停止する）が、最終的に開始し、完全な成人の生殖内分泌機能の達成へと進行する自然治癒症状である（６）。対照的に、ＩＨＨは、処置を必要とする病的障害である（７）。現在のところ、体質性遅発をＩＨＨから前向きに区別する信頼性の高い方法は存在しない。
【発明の概要】
【0006】
本明細書において、生殖内分泌機能不全、任意選択で病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象を処置する方法が提供される。本方法は、治療的有効量の （ｉ）複数用量（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、例えば２、３、４、５または６／日）のキスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、および／または（ｉｉ）オピオイドアンタゴニストもしくは混合アゴニスト－アンタゴニストを対象に投与することを含む。本明細書において、複数用量のキスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、および／または（ｉｉ）オピオイドアンタゴニストもしくは混合アゴニスト－アンタゴニストを投与することを含む、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象を処置する方法における使用のための、（ｉ）キスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、および／または（ｉｉ）オピオイドアンタゴニストもしくは混合アゴニスト－アンタゴニストを含む組成物が提供される。
【0007】
いくつかの実施形態において、複数用量は、１～６時間の間隔、好ましくは２～３時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１、２、３、４、６、または１２ヶ月にわたって投与される。
【0008】
いくつかの実施形態において、複数用量はそれぞれ、静脈内ボーラス（ＩＶＢ）、皮下注射（ＳＣ）またはポンプによって投与される、０．０８～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、複数用量はそれぞれ、０．２～０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、好ましくは０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０に同等の用量を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、複数用量は、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の少なくとも１つの超生理学的用量を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの超生理学的用量は、複数用量の最初の用量、または最初の２回または３回以上の用量、任意に複数用量の全てとして投与される。
【0011】
いくつかの実施形態において、本方法は、治療的有効量のオピオイドアンタゴニストまたは混合アゴニスト－アンタゴニストを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、オピオイドアンタゴニストは、ナロキソンまたはナロトレキソンであるか、または混合アゴニスト－アンタゴニストはブプレノルフィンである。
【0012】
いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のゴナドトロピン（例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および／または濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））を投与することをさらに含む。
【0013】
本明細書において、また、生殖内分泌機能不全（ＲＥＤ）、例えば病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する、そのリスクがある、またはその軽症型を有する対象を特定するための方法が提供される。本方法は、対象におけるＬＨのベースラインレベルを測定すること、刺激用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログ、例えば静脈内ボーラス（ＩＢＶ）によって投与される、０．０８～１５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む用量、または皮下（ＳＣ）注射によって投与される、０．８～５００ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む用量を対象に投与すること、刺激用量の投与後、例えば刺激用量の投与後の約１０、１５、２０、３０、４５または６０分以内に少なくとも１つのＬＨレベルを測定すること、対象におけるＬＨのベースラインレベルを刺激用量の投与後のＬＨレベルと比較すること、およびＬＨのベースラインと同等の刺激用量の投与後のＬＨレベル（例えば、ベースラインの３．５、３、２．５、または２倍未満）を有する、思春期遅発を有する対象を、ＲＥＤ、例えば病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有するものとして特定することを含む。
【0014】
あるいは、本方法は、刺激用量、例えば静脈内ボーラス（ＩＶＢ）によって投与される、０．０８～１５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む静脈内用量、または皮下（ＳＣ）注射によって投与される０．８～５００ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０を含む用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログを対象に投与すること、刺激用量の投与後、例えば刺激用量の投与後約１０、１５、２０、３０、４５または６０分以内に少なくとも１つのＬＨレベルを測定すること、刺激用量の投与後のＬＨレベルを参照レベルと比較すること、およびＬＨの参照レベルを下回る（またはそれと有意差がない）刺激用量の投与後のＬＨレベルを有する、思春期遅発を有する対象をＲＥＤ、例えば病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有するものとして特定することを含んでいてもよい。
【0015】
いくつかの実施形態において、本方法は、生殖内分泌機能不全、例えば病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の処置を、特定した対象に施すことを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、処置は、複数用量のキスペプチン、またはキスペプチンアナログを投与することを含む。いくつかの実施形態において、複数用量は、１～６時間の間隔、好ましくは２～３時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１～１２ヶ月にわたって投与される。いくつかの実施形態において、複数用量はそれぞれ、静脈内ボーラス（ＩＶＢ）、皮下注射（ＳＣ）またはポンプによって投与される、０．０８～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む。いくつかの実施形態において、複数用量は、それぞれ、０．２～０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、好ましくは０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量を含む。いくつかの実施形態において、複数用量は、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の少なくとも１つの超生理学的用量を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの超生理学的用量は、複数用量の最初の用量、または最初の２回または３回以上の用量、任意に複数用量の全てとして投与される。
【0017】
いくつかの実施形態において、本方法は、治療的有効量のオピオイドアンタゴニストまたは混合アゴニスト－アンタゴニストを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、オピオイドアンタゴニストはナロキソンまたはナルトレキソンであり、または混合アゴニスト－アンタゴニストはブプレノルフィンである。
【0018】
いくつかの実施形態において、処置は、性腺ステロイド補充療法、例えば男性においてはテストステロンを、女性においてはエストロゲンおよび／またはプロゲステロン／プロゲスチンを投与することをさらに含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、本方法は、１つまたは複数のゴナドトロピン（例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および／または濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））を投与することをさらに含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、複数用量は、１～６時間、好ましくは２時間の間隔で、少なくとも２～３日、好ましくは少なくとも１～１２ヶ月にわたって投与される。
【0021】
特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料は本明細書に記載されており、当技術分野において公知の他の適当な方法および材料もまた使用し得る。材料、方法および実施例は、例示のためのものに過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参照文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。
【0022】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】募集および参加の概要。
【図2-1】思春期の遅発または停止を提示している子供における神経内分泌特性。プロトコルの概略図をパネルＡに示す。プロトコルの詳細は参照文献（２０）に示す。最初の来診時に、参加者は、血清ＬＨを測定し、一晩の自発性の拍動性を評価し、キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答を図表化する。その後、参加者は外因性の拍動性ＧｎＲＨを受け、ＧｎＲＨに対する下垂体応答性を増強した。彼らは、次いで２回目の来診に戻り、この下垂体「プライミング」後のキスペプチンおよびＧｎＲＨに応答するＬＨ分泌を測定した。結果を、「キスペプチン非応答者」である参加者Ａ（Ｂ）および「キスペプチン応答者」である参加者Ｂ（Ｃ）について示す。
【図2-2】思春期の遅発または停止を提示している子供における神経内分泌特性。プロトコルの概略図をパネルＡに示す。プロトコルの詳細は参照文献（２０）に示す。最初の来診時に、参加者は、血清ＬＨを測定し、一晩の自発性の拍動性を評価し、キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答を図表化する。その後、参加者は外因性の拍動性ＧｎＲＨを受け、ＧｎＲＨに対する下垂体応答性を増強した。彼らは、次いで２回目の来診に戻り、この下垂体「プライミング」後のキスペプチンおよびＧｎＲＨに応答するＬＨ分泌を測定した。結果を、「キスペプチン非応答者」である参加者Ａ（Ｂ）および「キスペプチン応答者」である参加者Ｂ（Ｃ）について示す。
【図3】思春期に進行した子供および進行しなかった子供におけるキスペプチンに対する異なる応答。思春期の遅発または停止を提示する少女（白丸）および少年（黒丸）は、キスペプチン刺激試験を受け、外因性キスペプチンに応答した黄体形成ホルモンの変化を評価した（ΔＬＨキスペプチン）。参加者は次いで１８歳まで経過観察し、自発的に思春期に進行したかを決定した。
【図4-1】思春期に進行したまたは進行しなかった子供のさらなるホルモン評価。思春期の遅発および停止を示す少女（白丸）および少年（黒丸）は、提示時の血清黄体形成ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（それぞれＡおよびＢ）ならびに外因性ゴナドトロピン放出ホルモンに応答したＬＨの変化（ＧｎＲＨ、パネルＣ）について評価した。少年はさらに血清インヒビンＢについて評価した（Ｄ）。
【図4-2】思春期に進行したまたは進行しなかった子供のさらなるホルモン評価。思春期の遅発および停止を示す少女（白丸）および少年（黒丸）は、提示時の血清黄体形成ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（それぞれＡおよびＢ）ならびに外因性ゴナドトロピン放出ホルモンに応答したＬＨの変化（ＧｎＲＨ、パネルＣ）について評価した。少年はさらに血清インヒビンＢについて評価した（Ｄ）。
【図5-1】キスペプチンに対するＬＨ応答。点線は投与のタイムポイントを表す。（下向き黒三角）＝改変されたＳａｎｔｅｎ ＆ Ｂａｒｄｉｎ判断基準によって決定されるＬＨパルス。Ａ：健常男性。遺伝学は評価していない。６時間におけるキスペプチン０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（＋）応答。Ｂ：ＫＳ男性。ＰＲＯＫＲ２ ｃ．５１８Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｌ１７３Ｒヘテロ、ＤＭＸＬ２ ｃ．４０１６Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｖ１３３９Ｇヘテロ。６時間におけるキスペプチン ０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（－）応答。Ｃ．ＫＳ女性。遺伝学は評価していない。ＬＨ応答は、キスペプチン用量に対応してグラフ化した。（＋）用量範囲にわたるＬＨ応答。Ｄ．ＫＳ男性。ＣＨＤ７ ｃ．２４１７Ｔ＞Ｃｐ．Ｍ８０６Ｔヘテロ；ＰＲＯＫＲ２ ｃ．２５４Ｇ＞Ａｐ．Ｒ８５Ｈヘテロ。パネルＣと同一の用量。（＋）ＬＨ応答。全てのデータを同一のＹ軸上でグラフ化する。
【図5-2】キスペプチンに対するＬＨ応答。点線は投与のタイムポイントを表す。（下向き黒三角）＝改変されたＳａｎｔｅｎ ＆ Ｂａｒｄｉｎ判断基準によって決定されるＬＨパルス。Ａ：健常男性。遺伝学は評価していない。６時間におけるキスペプチン０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（＋）応答。Ｂ：ＫＳ男性。ＰＲＯＫＲ２ ｃ．５１８Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｌ１７３Ｒヘテロ、ＤＭＸＬ２ ｃ．４０１６Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｖ１３３９Ｇヘテロ。６時間におけるキスペプチン ０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（－）応答。Ｃ．ＫＳ女性。遺伝学は評価していない。ＬＨ応答は、キスペプチン用量に対応してグラフ化した。（＋）用量範囲にわたるＬＨ応答。Ｄ．ＫＳ男性。ＣＨＤ７ ｃ．２４１７Ｔ＞Ｃｐ．Ｍ８０６Ｔヘテロ；ＰＲＯＫＲ２ ｃ．２５４Ｇ＞Ａｐ．Ｒ８５Ｈヘテロ。パネルＣと同一の用量。（＋）ＬＨ応答。全てのデータを同一のＹ軸上でグラフ化する。
【図5-3】キスペプチンに対するＬＨ応答。点線は投与のタイムポイントを表す。（下向き黒三角）＝改変されたＳａｎｔｅｎ ＆ Ｂａｒｄｉｎ判断基準によって決定されるＬＨパルス。Ａ：健常男性。遺伝学は評価していない。６時間におけるキスペプチン０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（＋）応答。Ｂ：ＫＳ男性。ＰＲＯＫＲ２ ｃ．５１８Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｌ１７３Ｒヘテロ、ＤＭＸＬ２ ｃ．４０１６Ｔ＞Ｇ ｐ．Ｖ１３３９Ｇヘテロ。６時間におけるキスペプチン ０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ。（－）応答。Ｃ．ＫＳ女性。遺伝学は評価していない。ＬＨ応答は、キスペプチン用量に対応してグラフ化した。（＋）用量範囲にわたるＬＨ応答。Ｄ．ＫＳ男性。ＣＨＤ７ ｃ．２４１７Ｔ＞Ｃｐ．Ｍ８０６Ｔヘテロ；ＰＲＯＫＲ２ ｃ．２５４Ｇ＞Ａｐ．Ｒ８５Ｈヘテロ。パネルＣと同一の用量。（＋）ＬＨ応答。全てのデータを同一のＹ軸上でグラフ化する。
【図7-1】ベースライン神経内分泌プロファイリング。Ａ．試験概略図、Ｂ．２０１０～２０１１年に８時間サンプリングを受けたＩＨＨを有する試験対象、Ｃ．卵胞期前期（ＥＦＰ）の健常姉妹。Ｅ２＝エストラジオール。Ｐ＝プロゲステロン、ＬＨ＝黄体形成ホルモン。
【図7-2】ベースライン神経内分泌プロファイリング。Ａ．試験概略図、Ｂ．２０１０～２０１１年に８時間サンプリングを受けたＩＨＨを有する試験対象、Ｃ．卵胞期前期（ＥＦＰ）の健常姉妹。Ｅ２＝エストラジオール。Ｐ＝プロゲステロン、ＬＨ＝黄体形成ホルモン。
【図8-1】キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答についてのベースライン試験。Ａ．試験概略図、Ｂ．試験対象。矢印は、アルゴリズムによって検出される黄体形成ホルモンパルスを示していた。Ｋ＝静脈内ボーラスによるキスペプチン－１０であり、添字は、用量、１＝０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、２＝０．７２ｎｍｏｌ／ｋｇ、３＝２．４ｎｍｏｌ／ｋｇを示す。Ｇ＝ＧｎＲＨ ＩＶＢ ７５ｎｇ／ｋｇ。Ｅ２＝エストラジオール、ＦＳＨ＝濾胞刺激ホルモン、ＬＨ＝黄体形成ホルモンである。
【図8-2】キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答についてのベースライン試験。Ａ．試験概略図、Ｂ．試験対象。矢印は、アルゴリズムによって検出される黄体形成ホルモンパルスを示していた。Ｋ＝静脈内ボーラスによるキスペプチン－１０であり、添字は、用量、１＝０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、２＝０．７２ｎｍｏｌ／ｋｇ、３＝２．４ｎｍｏｌ／ｋｇを示す。Ｇ＝ＧｎＲＨ ＩＶＢ ７５ｎｇ／ｋｇ。Ｅ２＝エストラジオール、ＦＳＨ＝濾胞刺激ホルモン、ＬＨ＝黄体形成ホルモンである。
【図9】キスペプチン注入およびＧｎＲＨに対する応答。Ａ．試験概略図、Ｂ．試験対象。矢印は、アルゴリズムによって検出される黄体形成ホルモンパルスを示していた。Ｇ＝ ＧｎＲＨ ＩＶＢ ７５ｎｇ／ｋｇ。Ｅ２＝エストラジオール、ＦＳＨ＝濾胞刺激ホルモン。ＬＨ＝黄体形成ホルモンである。
【図10-1】キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答および神経ペプチド投与。Ａ．試験概略図、Ｂ．試験対象。矢印は、アルゴリズムによって検出される黄体形成ホルモンパルスを示していた。Ｋ＝静脈内ボーラスによるキスペプチン－１０であり、添字は、用量、１＝０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、２＝０．７２ｎｍｏｌ／ｋｇ、３＝２．４ｎｍｏｌ／ｋｇを示す。Ｇ＝ＧｎＲＨ ＩＶＢ ７５ｎｇ／ｋｇ。Ｅ２＝エストラジオール、ＦＳＨ＝濾胞刺激ホルモン、ＬＨ＝黄体形成ホルモンである。
【図10-2】キスペプチンおよびＧｎＲＨに対する応答および神経ペプチド投与。Ａ．試験概略図、Ｂ．試験対象。矢印は、アルゴリズムによって検出される黄体形成ホルモンパルスを示していた。Ｋ＝静脈内ボーラスによるキスペプチン－１０であり、添字は、用量、１＝０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、２＝０．７２ｎｍｏｌ／ｋｇ、３＝２．４ｎｍｏｌ／ｋｇを示す。Ｇ＝ＧｎＲＨ ＩＶＢ ７５ｎｇ／ｋｇ。Ｅ２＝エストラジオール、ＦＳＨ＝濾胞刺激ホルモン、ＬＨ＝黄体形成ホルモンである。
【図11-1】性的発達の間をコントロールするＴａｃ２ノックアウトマウスおよび同腹仔に対するキスペプチン投与。点線＝キスペプチン投与。黄体形成ホルモン値は各タイムポイントについての平均値±ＳＥＭである。
【図11-2】性的発達の間をコントロールするＴａｃ２ノックアウトマウスおよび同腹仔に対するキスペプチン投与。点線＝キスペプチン投与。黄体形成ホルモン値は各タイムポイントについての平均値±ＳＥＭである。
【図12-1】成体ＯＶＸ ＷＴおよびＴａｃ２ノックアウトマウスにおける、ＬＨパルスプロファイル（ＡおよびＤ）ならびにナロキソン（ＮＬＸ）の効果（Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ）。ＡおよびＤ：ＮＬＸ注射の１２０分前、およびＮＬＸ注射の１８０分後のＬＨパルス。ＮＬＸ注射は矢印によって示す。矢頭はＬＨパルスを示す。ＢおよびＥ：それぞれ、ＷＴおよびＯＶＸ Ｔａｃ２ＫＯマウスにおける、ＮＬＸの６０分前および１２０分後のＬＨ分泌の変化（平均値±ＳＥＭ）。ＣおよびＦ：ＬＨ放出に対するＮＬＸ処置の効果もまた、ＮＬＸ注射の２０分前（ＮＬＸ前）および２０分後（ＮＬＸ後）の平均値±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。
【図12-2】成体ＯＶＸ ＷＴおよびＴａｃ２ノックアウトマウスにおける、ＬＨパルスプロファイル（ＡおよびＤ）ならびにナロキソン（ＮＬＸ）の効果（Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ）。ＡおよびＤ：ＮＬＸ注射の１２０分前、およびＮＬＸ注射の１８０分後のＬＨパルス。ＮＬＸ注射は矢印によって示す。矢頭はＬＨパルスを示す。ＢおよびＥ：それぞれ、ＷＴおよびＯＶＸ Ｔａｃ２ＫＯマウスにおける、ＮＬＸの６０分前および１２０分後のＬＨ分泌の変化（平均値±ＳＥＭ）。ＣおよびＦ：ＬＨ放出に対するＮＬＸ処置の効果もまた、ＮＬＸ注射の２０分前（ＮＬＸ前）および２０分後（ＮＬＸ後）の平均値±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。
【図12-3】成体ＯＶＸ ＷＴおよびＴａｃ２ノックアウトマウスにおける、ＬＨパルスプロファイル（ＡおよびＤ）ならびにナロキソン（ＮＬＸ）の効果（Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ）。ＡおよびＤ：ＮＬＸ注射の１２０分前、およびＮＬＸ注射の１８０分後のＬＨパルス。ＮＬＸ注射は矢印によって示す。矢頭はＬＨパルスを示す。ＢおよびＥ：それぞれ、ＷＴおよびＯＶＸ Ｔａｃ２ＫＯマウスにおける、ＮＬＸの６０分前および１２０分後のＬＨ分泌の変化（平均値±ＳＥＭ）。ＣおよびＦ：ＬＨ放出に対するＮＬＸ処置の効果もまた、ＮＬＸ注射の２０分前（ＮＬＸ前）および２０分後（ＮＬＸ後）の平均値±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【0024】
ＧｎＲＨの発見から５０年近くが経過しているにも関わらず（３１）、性成熟を開始し、それに続いて生殖機能を維持する因子を理解することは、診断および処置を複雑化している課題のままであり続けている。特発性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（ＩＨＨ）を有する患者は、異常なＧｎＲＨ分泌／作用を有する（３２、３３）ため、これらのシグナルを明らかにするための重要な集団である。ほとんどのＩＨＨ患者は、遅発した思春期発達を有する１０代として示され、処置されないままであれば、生涯にわたる性的幼稚症および不妊症を罹患する（３２、３３）。
【0025】
本明細書において、キスペプチンを使用して思春期遅発を診断および処置する方法が記載されている。
【0026】
病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の診断
数十年間、臨床医および研究者は、思春期遅発を有する子供が、最終的に思春期に進行するかを予測するための試験を開発しようとしていた（８）。これらの試験は、ベースライン（非刺激）血清ゴナドトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ、および濾胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨアナログによる刺激後のゴナドトロピン、およびベースラインのインヒビンＢの測定を含む。不幸なことに、これらの試験は全て、感受性、特異性、または両方に有意な不足を有する（８）。例えば、試験により、体質性遅発を有する少年と、ＩＨＨを有する少年の間に、血清インヒビンＢ濃度に有意な重複が示され、体質性遅発を有する少年の１０～２９％、およびＩＨＨを有する少年の２２～４５％が、重複範囲にあるインヒビンＢを有する（９～１１）。ＩＨＨおよび体質性遅発の遺伝学の理解が次第に進んでいるにも関わらず、思春期の転帰を予測するには、遺伝学的試験は現在では不適当である。現在、ＩＨＨ患者の半分未満は、ＩＨＨ遺伝子に同定可能な変異を有する（７）。さらに、変異が発見された場合であっても、予測力は、可変性の浸透率および発現度によって限定され、同一家族において、ＩＨＨ遺伝子の変異のいくらかのキャリアがＩＨＨを有しており、他が体質性遅発を有している場合がある（２４）。
数十年間、臨床医および研究者は、思春期遅発を有する子供が、最終的に思春期に進行するかを予測するための試験を開発しようとしていた（８）。これらの試験は、ベースライン（非刺激）血清ゴナドトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ、および濾胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨアナログによる刺激後のゴナドトロピン、およびベースラインのインヒビンＢの測定を含む。不幸なことに、これらの試験は全て、感受性、特異性、または両方に有意な不足を有する（８）。例えば、試験により、体質性遅発を有する少年と、ＩＨＨを有する少年の間に、血清インヒビンＢ濃度に有意な重複が示され、体質性遅発を有する少年の１０～２９％、およびＩＨＨを有する少年の２２～４５％が、重複範囲にあるインヒビンＢを有する（９～１１）。ＩＨＨおよび体質性遅発の遺伝学の理解が次第に進んでいるにも関わらず、思春期の転帰を予測するには、遺伝学的試験は現在では不適当である。現在、ＩＨＨ患者の半分未満は、ＩＨＨ遺伝子に同定可能な変異を有する（７）。さらに、変異が発見された場合であっても、予測力は、可変性の浸透率および発現度によって限定され、同一家族において、ＩＨＨ遺伝子の変異のいくらかのキャリアがＩＨＨを有しており、他が体質性遅発を有している場合がある（２４）。
【0027】
後に思春期に進行する、思春期遅発を有する子供は、しばしば、最初の提示時には、持続性の性腺機能低下症を有する子供と区別が不可能であり、所与の子供の転帰がわかるまで数年の待機が必要であり得ることが知られている。結果として、患者、家族、および提供者は、思春期遅発についての２つの共通する管理アプローチ、性ステロイドによる処置または介入なしの待機療法を決定する際に難問に直面し得る。
【0028】
キスペプチンは、現在まで試験されたヒトを含む全ての哺乳動物種において、ＧｎＲＨ分泌を強力に刺激する、視床下部において分泌される神経ペプチドである（１２）。我々および他のグループによる試験において、生殖性がインタクトな成人は、単一ボーラスのキスペプチンに応答して、ＬＨが強度に上昇し、一方、ＩＨＨを有する成人は大幅には応答しなかった（１３～１９）。したがって、キスペプチンを使用した誘発性試験は、個人のＧｎＲＨ分泌能力を評価するために使用し得る。
【0029】
思春期が遅発または停止している子供は、応答なしから強い応答までの範囲のキスペプチンに対する応答を有する（２０）。本明細書において、キスペプチンに対する子供の応答能力が、子供がその後思春期に進行するかを予測し得ることを示す、前向きな試験の結果を記載している。
【0030】
本明細書に記載するキスペプチン刺激試験は、思春期遅発を有する子供の思春期の転帰を予測する際の２つの根本的な課題を克服している。第１の課題は、正常な思春期の子供の生理学的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を、ＩＨＨを有する子供の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症から区別する方法が存在しないことである。誘発性試験であるため、キスペプチン刺激試験は、子供の将来のＧｎＲＨ分泌についての潜在的な能力を測定するための第１の方法を提供する。実際、我々は、キスペプチンが、身体検査時および日中の研究室の評価時に思春期前と考えられる時点において、最終的に思春期に進行した子供においてＬＨ応答を誘発し得ることを見出した。
【0031】
第２の課題は、思春期発達が一時的に停止している子供を、ＩＨＨおよび持続的に停止した部分的な思春期発達を有する子供から区別することである。我々は、以前、ＩＨＨおよび部分的な生殖内分泌活性を有する成人は、キスペプチンに対して応答できないことを示している（１９）。同様に、現在の試験において、部分的な生殖内分泌活性を示した１人の参加者（参加者８）は、キスペプチンに対する応答が減少しており、これは１８歳まで思春期発達が見られないことを正確に予測しており、一方、インヒビンＢおよびＧｎＲＨ誘導ＬＨは、後に思春期に進行することを示唆していた。
【0032】
実施例１に記載するように、２人の参加者（参加者Ｂおよび１１）に一晩の測定時にＬＨパルスがないことは、参加者の最終的な思春期への進行を正確に予測するものではなく、一方、キスペプチン刺激試験は、参加者の転帰を正確に予測していた。これらの参加者は、その試験来診時に性ステロイド処置を受けており、これが内在性ＬＨ分泌を抑制していた可能性がある。対照的に、彼らのキスペプチンに対する応答は強く、したがって、キスペプチン刺激試験は、外因性性ステロイド処置（例えば、男性においてはテストステロン、女性においてはエストロゲンおよび／またはプロゲステロン／プロゲスチン）の状況において行った場合であっても、最終的な思春期進行を高い信頼性で予測した。
【0033】
ＩＨＨを有するいくらかの患者は、キスペプチンに対してインタクトな応答を有する可能性がある（例えば、キスペプチンの上流で機能すると考えられている、ニューロキニンＢまたはその受容体の遺伝子である、ＴＡＣ３およびＴＡＣＲ３、またはキスペプチン自体をコードするＫＩＳＳ１に変異を有する患者）（２５，２６）。しかし、これは、ＩＨＨ患者の小さいサブセットに過ぎない可能性が高く、これは、ＴＡＣＲ３における変異は、正常嗅覚ＩＨＨの患者の約５％にのみ存在し、ＴＡＣ３およびＫＩＳＳ１の変異は、ＩＨＨの稀な原因であるためである（２７～３０）。
【0034】
したがって、本発明の方法は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒト対象における病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、例えばＩＨＨを診断するために使用し得る。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５歳、および／または１８、１９もしくは２０歳未満であり、例えば、１０～２０歳、１０～１９、１０～１８、１１～１８、１１～１９、１１～２０、１２～１８、１２～１９、または１２～２０歳である。本方法は、また、例えば任意の年齢の対象における、生殖内分泌機能の機能不全、または部分的もしくは後期発症形態の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を検出するのに使用し得る。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、任意の年齢の子供、例えば新生児において、先天性形態の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を診断するのに使用される。
【0035】
いくつかの実施形態において、ＩＨＨの現在の公式の臨床的な定義は患者が１８歳以上であることを必要とするが、１８歳未満の対象において、本方法は、対象がＩＨＨを有することを決定し、この診断が従来の年齢カットオフよりも早い年齢で行われることが可能になる。いくつかの実施形態において、本方法は、対象が、ＩＨＨを発症するリスクがあるか、またはＩＨＨを発症する可能性が高いことを決定する。
【0036】
本方法は、好ましくは静脈内ボーラス（ＩＶＢ）として投与される、少なくとも１つの刺激用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログ、例えば少なくとも０．０８、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２０、０．２２または０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、最大約８、１０、１２、１４、または１５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．０８～１５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．１～１２ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．２～１０．１１ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．２～０．５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．２２～０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０と同等の用量の投与に応答したＬＨレベルの検出に依存する。用量はまた、例えば、皮下（ＳＣ）または鼻腔内ボーラスとして投与してもよい。ＳＣ投与される場合、用量は、ＩＶ用量範囲よりも高く、例えば、上記の範囲よりも、１０、２０または約３０倍高く、例えば少なくとも０．８ｎｍｏｌ／ｋｇ、最大約５００、６００、または７５０ｎｍｏｌ／ｋｇである。鼻腔内用量は、典型的には、皮下用量の約１０倍、すなわち２４～５０００、６０００、または７５００ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【0037】
本方法は、少なくとも１つ、例えば１つ以上のサンプルを対象から入手すること、およびサンプル中のＬＨのレベルを評価すること、およびレベルを、１つまたは複数の参照、例えば、正常なＬＨレベル、例えば病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有していない対象におけるレベルを表す対象参照、および／または病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象におけるＬＨレベルを表す疾患参照と比較することを含んでいてもよい。適切な参照値は、下記の実施例に示すものを含み得る。好ましい実施形態において、本方法は、対象から複数のサンプル、例えば、刺激用量の投与の前、間、および後に入手すること、およびサンプル中のＬＨレベルを決定すること、および刺激用量の投与前のサンプル中のＬＨレベル（例えばベースラインレベル）を、刺激用量の投与後のレベルと比較することを含む。したがって、本方法は、キスペプチン投与後の絶対的ＬＨレベルを、参照（例えば、対象のコホートを代表する参照、または対象におけるベースラインレベル）と比較すること、および／またはベースラインから刺激後へのＬＨレベルの変化を、ａ）単位上昇（差異）、ｂ）相対的変化（比率）のいずれかとして決定することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、３．５、４、４．５、またはそれ以上、例えば４．８５またはそれ以上のＬＨ比率を有する対象を、体質性遅発を有するものとして特定し、３．５未満、例えば３未満、例えば２．３３またはそれ未満のＬＨ比率を有する対象は、病的ＨＨを有するものとして特定する。
【0038】
本明細書において使用する場合、「サンプル」という用語は、本明細書に記載する方法を使用してＬＨの存在について試験する材料に言及する場合、とりわけ、全血、血漿、血清または尿を含む。
【0039】
サンプルからのＬＨの定量化については種々の方法が当技術分野において周知である。本方法は、定量化前に、サンプルからのＬＨの単離および／または精製を含んでいてもよい。「単離」または「精製」された生物学的マーカーは、生物学的マーカーが由来する細胞または組織由来の細胞物質または他の混入物を実質的に含まない、すなわち、ヒトの介入の間に天然の状態から、部分的もしくは完全に変化するかまたは除かれる。例えば、サンプル中に含まれる核酸は、最初に標準的な方法にしたがって、例えば溶解性酵素、化学的溶液を使用して単離されるか、または製造者の指示にしたがって、核酸結合樹脂によって単離される。
【0040】
ＬＨの存在および／またはレベルは、当技術分野において公知の方法、例えば、標準的な電気泳動およびタンパク質についての定量的な免疫アッセイ方法、例えば非限定的には、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ビオチン／アビジンタイプアッセイ、タンパク質アレイ検出、放射免疫アッセイ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫沈降アッセイ、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）、質量分析を使用して評価し得る（Kim (2010) Am J Clin Pathol 134:157-162; Yasun (2012) Anal Chem 84(14):6008-6015; Brody (2010) Expert Rev Mol Diagn 10(8):1013-1022; Philips (2014) PLOS One 9(3):e90226; Pfaffe (2011) Clin Chem 57(5): 675-687）。本方法は、典型的には、直接的または間接的のいずれかでシグナルを供給する、標識、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、および酵素または色素分子を明らかにすることを含む。本明細書で使用する場合、用語「標識」は、検出可能な物質、例えば放射活性剤またはフルオロフォア（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））の抗体またはプローブへのカップリング（すなわち物理的な結合）、ならびに検出可能な物質との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識化（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）を指す。
【0041】
いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡ法を使用してもよく、ここで、マイクロタイタープレートのウェルを、試験するタンパク質に対する抗体でコーティングする。生物学的マーカーを含む、または含む疑いがあるサンプルを次いでウェルにアプライする。抗体－抗原複合体が形成される、十分な時間の後、プレートを洗浄して非結合部分を除き、検出可能に標識された分子を添加する。再び、十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して過剰の非結合分子を除き、標識した分子の存在を当技術分野で公知の方法を使用して決定する。ＥＬＩＳＡ法のバリエーション、例えば競合ＥＬＩＳＡまたは競合アッセイ、およびサンドウィッチＥＬＩＳＡも、当業者に周知であるため、使用してもよい。免疫測定アッセイを使用することができる。
【0042】
質量分析、および具体的にはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）、および表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）は、ＬＨの検出に有用である（米国特許第５，１１８，９３７号、第５，０４５，６９４号、第５，７１９，０６０号、第６，２２５，０４７号を参照のこと）。
【0043】
ＬＨについての特異的なアッセイは、例えば、Wheeler, Methods Mol Biol. 2006;324:109-24; Beastall et al., Ann Clin Biochem. 1987 May;24 (Pt 3):246-62; Pappa et al., Theriogenology. 1999 Apr 1;51(5):911-26に記載されている。
【0044】
いくつかの実施形態において、キスペプチン刺激後のＬＨレベルは、疾患参照における、タンパク質の存在および／またはレベルと同等であり、対象は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に関連する１つまたは複数の症候を有し、その場合、対象は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する。いくつかの実施形態において、対象は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の顕性の徴候または症候を全く有さないが、評価されたタンパク質の１つまたは複数の存在および／またはレベルは、疾患参照におけるタンパク質の存在および／または同等であり、その場合、対象は、軽症型の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する、および／または病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の発症の高い可能性を有する。いくつかの実施形態において、対象は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の徴候または症候を有するが、正常なＬＨ応答を有し、この場合、対象はさらなる試験に送られる。いくつかの実施形態において、個人が病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有するか、または病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を発症するリスクが高いと一度決定されると、処置、例えば、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載する処置を投与してもよい。
【0045】
適切な参照値は、当技術分野において公知の方法、例えば標準的な臨床試験方法および統計学的解析を使用して決定し得る。参照値は、任意の関連する形態を有していてもよい。いくつかの場合において、参照は、有意義なＬＨレベル、例えば正常なＬＨレベルを表す対象参照レベル、例えば、罹患していない対象または本明細書に記載する疾患を発症するリスクがない対象におけるレベル、および／または病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に関連するＬＨレベルを表す疾患参照、例えば、ＩＨＨまたはＫＳを有する対象におけるレベルについての所定の値を含む。
【0046】
所定のレベルは、単一のカットオフ（閾値）値、例えば、中間値または平均値、または上または下の四分位値、三分位値、または他のセグメントから統計学的に異なっていると決定されている臨床試験集団の他のセグメントの境界を定義するレベルであり得る。それは、カットオフ（または閾値）値の範囲、例えば信頼区間であり得る。それは、比較群に基づいて確立されてもよく、例えば、ここで、１つの定義した群における疾患の発症のリスクまたは疾患の存在との関連は、他の定義した群における疾患のリスクまたは存在よりも数倍高い、または低い（例えば、約２倍、４倍、８倍、１６倍またはそれ以上）。これは、特定の範囲であってもよく、例えば、ここで、対象集団（例えば、対照の対象）が、群、例えば低リスク群、中間リスク群および高リスク群、または最下の四分位が、リスクが最も低い対象であり、最上の四分位がリスクが最も高い対象である四分位、またはｎ－分位の最下部が、リスクが最も低い対象であり、ｎ－分位の最上部が、リスクが最も高い対象である、ｎ－分位（すなわち、ｎ個の規則的に罹患した間隔）に均等（または非均等）に分割される。
【0047】
いくつかの実施形態において、所定のレベルは、同一の対象における、例えば異なるタイムポイント、例えばより早いタイムポイント（例えば、キスペプチンまたはキスペプチンアナログによる刺激前）におけるレベルまたは出現である。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、レベルの比率またはレベルの差異を算出すること、およびキスペプチンまたはキスペプチンアナログによる刺激後のＬＨのレベルの変化の存在を検出することを含み得る。
【0048】
所定の値に関連する対象は、典型的には参照対象と称する。例えば、いくつかの実施形態において、対照参照対象は、本明細書に記載する障害（例えば、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症）を有さない。対照の対象が男性であることが望ましい場合も、対照の対象が女性であることが望ましい場合もあり、同一性別の対象について使用される参照レベルが確立される。対照の対象が病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有することが望ましい場合も、対照の対象が病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有さない（例えば、体質性思春期遅発症を有するが、最終的には介入なしに独力で思春期を経験する対象である）ことが望ましい場合もある。
【0049】
疾患参照対象は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象である。
【0050】
したがって、いくつかの場合において、対象におけるＬＨレベルが、ＬＨの参照レベル（または刺激後のＬＨの変化）未満または同等であることは、臨床状態を示す（例えば、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を示す）。他の場合において、対象におけるＬＨのレベルがＬＨの参照レベルを超えているかまたは同等であることは、疾患が存在しないこと、または疾患のリスクが通常であることを示している。いくつかの実施形態において、対象におけるレベルが参照レベルを下回る量は、対照の対象から対象を区別するのに十分であり、任意選択で、対照の対象におけるレベルを統計学的に有意に下回る。対象におけるＬＨのレベルが、ＬＨの参照レベルと同等である場合、「同等であること」は、ほとんど同等であること（例えば統計学的に異なっていない）ことを指す。
【0051】
性腺機能不全を有する思春期前の子供において（脳または脳下垂体のレベルの不十分性、すなわち低ゴナドトロピン性性腺機能低下症とは対照的に）、キスペプチンに対する応答は、一般集団におけるより大きい場合がある。彼らはそれでも病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の「通常のリスク」を有する。
【0052】
所定の値は、選択する特定の対象（例えば、ヒト対象）の集団に依存している可能性がある。例えば、健常と思われる集団は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する、有する可能性が高い、またはリスクが高い対象集団とは異なる「通常」範囲のＬＨレベルを有するであろう。したがって、選択した所定の値は、対象（例えば、ヒト対象）が属するカテゴリー（例えば、性別、年齢、他の疾患の存在）を考慮し得る。適当な範囲およびカテゴリーは、当技術分野の当業者によって、日常的な実験方法のみによって選択し得る。
【0053】
可能性またはリスクを特徴付ける際に、多数の所定の値を確立し得る。
【0054】
処置方法
本方法は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症についての処置を含み得る。いくつかの実施形態において、処置を、本明細書に記載する方法によって特定される対象に施す。
本方法は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症についての処置を含み得る。いくつかの実施形態において、処置を、本明細書に記載する方法によって特定される対象に施す。
【0055】
本明細書に記載する方法は、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に関連する障害の処置のための方法を含む。いくつかの実施形態において、障害は、ＩＨＨ、またはＫＳ（後えば、対象が嗅覚消失を有する場合）である。一般的に、本方法は、本明細書に記載する、治療的有効量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログを、かかる処置を必要とする、または処置を必要とすると決定された対象に投与することを含む。本方法は、また、例えば、陰性のエネルギー収支状態（例えば、栄養不良、食欲不振、または運動選手）、高プロラクチン血症、成人発症低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、薬物療法効果（例えば、グルココルチコイド、オピオイド）による視床下部性無月経、または軽症型の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象、および／または病的ＨＨを発症するリスクがある対象、例えば、特発性不妊症、不規則的な月経サイクル、または異常な精液分析を有する対象を処置するために使用し得る。
【0056】
この文脈において使用する場合、「処置する」ことは、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に関連する障害の少なくとも１つの症候を寛解させることを意味する。病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症は、しばしば、例えば１８歳まで思春期がないこと、または二次性徴の発達が不良であること、または発達していないこと、または不妊症をもたらし、そのため、処置は、思春期の開始、二次性徴の発達、および／または妊孕性の回復をもたらし得る。病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の処置のために本明細書に記載する化合物を治療的有効量投与することによって、ＬＨレベルの上昇、性ステロイド（例えば、男性においてはテストステロン、女性においてはエストロゲンおよび／またはプロゲステロン／プロゲスチン）のレベルの上昇、および配偶子形成、例えばいくつかの場合においては、刺激用量のキスペプチンまたはキスペプチンアナログの投与に応答したＬＨのレベルの上昇の１つまたは複数がもたらされる。
【0057】
したがって、いくつかの実施形態において、病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、例えばＩＨＨまたはＫＳを処置するための方法が本明細書に提供される。本方法は、１つまたは複数の用量、例えば、超生理学的および／または生理学的もしくは近生理学的用量のキスペプチン、またはキスペプチンアナログを投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、用量は、例えば周期的に、例えば、１～６、１～４、２～６または２～４時間ごとに、数日、数週間、数ヶ月または数年、例えば２～４日間、例えば４８時間の期間にわたって、任意選択で、１ヶ月に１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、４ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、８ヶ月ごとに１回、１０ヶ月ごとに１回、または１年に１回、任意選択で、長期的に、例えば、数日、数週間、数ヶ月または数年の期間にわたって毎日投与してもよい。処置は、所望の転帰、例えば、妊孕性、または二次性徴の発達が達成されるまで続けてもよく、これらが達成された際に、任意選択で停止しても、または減少させてもよい。いくつかの実施形態において、少なくともいくつかの用量は、生理学的または近生理学的なレベル、例えば、０．０８～２．４、例えば、０．１～５、０．２～０．４、例えば０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶＢである。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの超生理学的な用量、例えば２～２５、例えば、２．４～２４ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、例えば少なくとも２、２．４、２．５、２．６、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０、最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｎｍｏｌ／ｋｇのキスペプチン－１０に同等の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、用量は、０．８～６０ｎｍｏｌ／ｋｇの生理学的用量、および６０～１２００ｎｍｏｌ／ｋｇの超生理学的用量で皮下投与される。
【0058】
いくつかの実施形態において、投与は、例えば、静脈内、皮下、または経鼻である。いくつかの実施形態において、本方法は、用量を投与するためにポンプを使用することを含む。したがって、投与は、例えば、対象または患者が有するデバイスまたはシステムの形態の、活性剤を含む液体組成物を含むリザーバーおよび対象または患者への組成物の送達／投与のための注入ポンプを含む注入ポンプ、または対応する形態の活性剤の周期ボーラスを送達することができる、対象または患者の体内への埋め込みに適した小型化したデバイス、例えばインスリンポンプに類似したデバイスを使用して起こり得る。
【0059】
いくつかの実施形態において、本方法は、上記のように、例えば２～３日後にキスペプチン刺激試験を反復することを含む。いくつかの実施形態において、処置は、全ての所望の効果が見られるまで、数ヶ月および数年継続する。例えば、女性における排卵誘導については、過程は、１ヶ月～６ヶ月のいずれであってもよい。男性における精子形成誘導については、過程は３～２４ヶ月のいずれであってもよい。思春期誘導および／または生殖内分泌機能の維持については、処置は数年にわたるものであってもよい。
【0060】
本方法は追加で、または代替的に、オピオイドアンタゴニスト、および／または病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の慣用的な処置を施すことを含んでいてもよい。
【0061】
図５ＣおよびＤは、ＫＳを有する患者におけるものであるため、キスペプチン耐性は、性腺機能低下症の通常嗅覚または嗅覚消失形態で生じ得るものである。患者の遺伝的特性は、その人のキスペプチンに対する応答能力を予測するものではない。これは、実施例３により支持されており（図５Ｄ参照）、これにより、２つの遺伝子にバリアントを有する患者がそれでも応答することが示されていた。本試験のデータは、種々の根底にある遺伝学的診断にも関わらず、先天性の性腺機能低下症についての包括的な病理機序としてのキスペプチン耐性の役割を支持しており、これは、例えば、陰性のエネルギー収支状態（例えば、栄養不良、食欲不振、または運動選手）、高プロラクチン血症、成人発症低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、薬物療法効果（例えば、グルココルチコイド、オピオイド）による視床下部性無月経、または軽症型の病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を含む生殖内分泌機能不全、および／または病的ＨＨを発症するリスクがある対象、例えば、特発性不妊症、不規則的な月経サイクル、または異常な精液分析を有する対象の他の原因にも拡張し得る。キスペプチンに対する感受性は、反復性の暴露に伴って上昇し、そのため、いくつかの実施形態において、本方法は、内在性のキスペプチン分泌が、キスペプチン耐性の回復を誘導するために、有意義な応答をもたらす点まで感受性を上昇させるための、キスペプチンの反復投与を含み得る。
【0062】
キスペプチンおよびキスペプチンアナログ
本明細書において使用する場合、キスペプチンは、ＫＩＳＳ１遺伝子によってコードされる１４５アミノ酸前駆体ペプチドの切断によりもたらされる神経ペプチドのファミリーを指す（Lee et al. 1996, Ohtaki et al. 2001）。ヒトにおいて、活性形態のキスペプチンは、５４アミノ酸ペプチドと考えられている（Ohtaki et al. 2001, Terao et al. 2004）。本方法は、全長のキスペプチン（ＮＰ＿００２２４７．３）、５４アミノ酸ペプチド（キスペプチン－５４（ＫＰ５４））、または配列ＹＮＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号１）を含む１０アミノ酸ペプチドである、キスペプチン－１０の投与を含んでいてもよい。Ｋｉｓｓ－１０のアナログは、当技術分野において公知であり、Curtis et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2010 Feb; 298(2): E296-E303; Gutierrez-Pascual et al., Mol Pharmacol. 2009 Jul; 76(1):58-67; Niida et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006 Jan 1; 16(1):134-7; Orsini et al., J Med Chem. 2007 Feb 8; 50(3):462-71; Roseweir et al., J Neurosci. 2009 Mar 25; 29(12):3920-9に記載されているものを含む。いくつかの実施形態において、アナログは、［ｄＹ］１ＫＰ－１０である。アナログは、保存的な置換、例えば、１、２、または３アミノ酸置換が本明細書に記載されている配列においてなされているものを含んでいてもよく、ここで、アナログは、ＫＩＳＳ１Ｒに対するアゴニスト活性を維持している。いくつかの実施形態において、アナログは、とりわけ、例えば、国際公開第２０１４１１８３１８号に記載されているように、化合物のＣ末端に近接している領域に位置するグリシン残基と隣接する残基の間のペプチド結合が、二置換１，２，３－トリアゾール環によって置換されているペプチド化合物、米国特許出願公開第２０２００１７２５７５号に記載されているペプチド化合物、米国特許出願公開第２０２０００４６７９７号、米国特許第７，９６０，３４８号および第８，４０４，６４３号に記載されている化合物１、Parker et al., Theriogenology. 2019 May;130:111-119に記載されているＣ６、ＫＩＳＳ１－３０５、ＴＡＫ－４４８（Ａｃ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｔｒｐ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－ａｚａＧｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｍｅ）－Ｔｒｐ－ＮＨ２（配列番号２）、Decourt et al., Sci Rep. 2016; 6: 26908; MacLean et al., J Clin Endocrinol Metab. 2014 Aug;99(8):E1445-53; Skorupskaite et al., Hum Reprod Update. 2014 Jul; 20(4): 485-500）（例えば、ＴＡＫ－４４８酢酸塩）参照、またはＴＡＫ－６８３（Ｎ－アセチル－ＹＷＮＴＦＧＬ｛Ｍｅｔ－Ｒ｝Ｗ－ＮＨ２（配列番号３）、Kanai et al., J Reprod Dev. 2017 Jun; 63(3): 305-310）参照、および米国特許出願公開第２０１６００７４３２０号、国際公開第２００２８５３９９号、国際公開第２００４０６０２６４号、国際公開第２００４１０１７４７号、国際公開第２００４０６３２２１号、欧州特許出願公開第１６０４６８２号、国際公開第２００５１１７９３９号、および欧州特許出願公開第１４６４６５２号に記載されている化合物である。Matsui and Asami, Neuroendocrinology 2014;99:49-60も参照のこと。キスペプチンまたはキスペプチンアナログを含む、その薬学的に許容される塩、医薬組成物を本明細書中の方法において使用し得る。
本明細書において使用する場合、キスペプチンは、ＫＩＳＳ１遺伝子によってコードされる１４５アミノ酸前駆体ペプチドの切断によりもたらされる神経ペプチドのファミリーを指す（Lee et al. 1996, Ohtaki et al. 2001）。ヒトにおいて、活性形態のキスペプチンは、５４アミノ酸ペプチドと考えられている（Ohtaki et al. 2001, Terao et al. 2004）。本方法は、全長のキスペプチン（ＮＰ＿００２２４７．３）、５４アミノ酸ペプチド（キスペプチン－５４（ＫＰ５４））、または配列ＹＮＷＮＳＦＧＬＲＦ（配列番号１）を含む１０アミノ酸ペプチドである、キスペプチン－１０の投与を含んでいてもよい。Ｋｉｓｓ－１０のアナログは、当技術分野において公知であり、Curtis et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2010 Feb; 298(2): E296-E303; Gutierrez-Pascual et al., Mol Pharmacol. 2009 Jul; 76(1):58-67; Niida et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006 Jan 1; 16(1):134-7; Orsini et al., J Med Chem. 2007 Feb 8; 50(3):462-71; Roseweir et al., J Neurosci. 2009 Mar 25; 29(12):3920-9に記載されているものを含む。いくつかの実施形態において、アナログは、［ｄＹ］１ＫＰ－１０である。アナログは、保存的な置換、例えば、１、２、または３アミノ酸置換が本明細書に記載されている配列においてなされているものを含んでいてもよく、ここで、アナログは、ＫＩＳＳ１Ｒに対するアゴニスト活性を維持している。いくつかの実施形態において、アナログは、とりわけ、例えば、国際公開第２０１４１１８３１８号に記載されているように、化合物のＣ末端に近接している領域に位置するグリシン残基と隣接する残基の間のペプチド結合が、二置換１，２，３－トリアゾール環によって置換されているペプチド化合物、米国特許出願公開第２０２００１７２５７５号に記載されているペプチド化合物、米国特許出願公開第２０２０００４６７９７号、米国特許第７，９６０，３４８号および第８，４０４，６４３号に記載されている化合物１、Parker et al., Theriogenology. 2019 May;130:111-119に記載されているＣ６、ＫＩＳＳ１－３０５、ＴＡＫ－４４８（Ａｃ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｔｒｐ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－ａｚａＧｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｍｅ）－Ｔｒｐ－ＮＨ２（配列番号２）、Decourt et al., Sci Rep. 2016; 6: 26908; MacLean et al., J Clin Endocrinol Metab. 2014 Aug;99(8):E1445-53; Skorupskaite et al., Hum Reprod Update. 2014 Jul; 20(4): 485-500）（例えば、ＴＡＫ－４４８酢酸塩）参照、またはＴＡＫ－６８３（Ｎ－アセチル－ＹＷＮＴＦＧＬ｛Ｍｅｔ－Ｒ｝Ｗ－ＮＨ２（配列番号３）、Kanai et al., J Reprod Dev. 2017 Jun; 63(3): 305-310）参照、および米国特許出願公開第２０１６００７４３２０号、国際公開第２００２８５３９９号、国際公開第２００４０６０２６４号、国際公開第２００４１０１７４７号、国際公開第２００４０６３２２１号、欧州特許出願公開第１６０４６８２号、国際公開第２００５１１７９３９号、および欧州特許出願公開第１４６４６５２号に記載されている化合物である。Matsui and Asami, Neuroendocrinology 2014;99:49-60も参照のこと。キスペプチンまたはキスペプチンアナログを含む、その薬学的に許容される塩、医薬組成物を本明細書中の方法において使用し得る。
【0063】
【化1】
【0064】
いくつかの実施形態において、ペプチドアゴニストを使用する場合、ペプチドは改変されている。逆向きの配列、例えばＦＲＬＧＦＳＮＷＮＹ（配列番号４）を含むペプチドアナログもまた使用し得る。
【0065】
本明細書に記載するペプチドアナログは、当技術分野において公知の、ペプチド模倣物を作製するための方法にしたがって改変されたものを含み得る。例えば、Qvit et al., Drug Discov Today. 2017 Feb; 22(2): 454-462; Farhadi and Hashemian, Drug Des Devel Ther. 2018; 12: 1239-1254; Avan et al., Chem. Soc. Rev., 2014,43, 3575-3594; Pathak, et al., Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2015. 8; Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols, Human Press (Totowa NJ 1998); Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)、およびMayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746 (2003)を参照のこと。いくつかの場合において、本明細書に記載するペプチドおよび断片のこれらの改変ペプチド模倣バージョンは、非ペプチド模倣ペプチドと比較して、インビボにおける安定性の増強を示す。
【0066】
ペプチド模倣物を作製するための方法は、ペプチド配列中のアミノ酸の１つまたは複数、例えば全てをＤアミノ酸エナンチオマーで置換することを含む。かかる配列は、本明細書中で「レトロ」配列と称する。他の方法において、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端の順番が逆転し、元のペプチドのＮ末端からＣ末端のアミノ酸残基の順番が、改変ペプチド模倣物のＣ末端からＮ末端のアミノ酸残基の順番になるようになっている。かかる配列は、「インベルソ」配列と称し得る。
【0067】
ペプチド模倣物は、本明細書に記載のペプチドのインベルソバージョンの両方、すなわち「レトロ－インベルソ」バージョンであってもよい。新規のペプチド模倣物は、ペプチド模倣物中のＮ末端からＣ末端のアミノ酸残基の順番が、元のペプチドのＣ末端からＮ末端のアミノ酸残基の順番に対応するように配列されたＤアミノ酸から構成されていてもよい。
【0068】
ペプチド模倣物を作製する他の方法は、ペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基を、化学的には異なるが、アミノ酸の機能的に認識されるアナログ、すなわち人工アミノ酸アナログで置換することを含む。人工アミノ酸アナログは、β－アミノ酸、β－置換β－アミノ酸（「β３－アミノ酸」）、アミノ酸の亜リン酸アナログ、例えば∀－アミノホスホン酸および∀－アミノホスフィン酸、および非ペプチド結合を有するアミノ酸を含む。人工アミノ酸は、ペプチド模倣物、例えばペプチドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステルアナログ）、β－ペプチド、環状ペプチド、オリゴ尿素またはオリゴカルバメートペプチド、または複素環式環分子の作製に使用し得る。例示的なレトロ－インベルソペプチド模倣物としては、ＦＲＬＧＦＳＮＷＮＹが挙げられ、ここで配列は全てＤ－アミノ酸を含む。
【0069】
配列は、また、例えば、アミノ末端のビオチン化またはＰＥＧ化、および／またはカルボキシ末端のアミド化によって改変されていてもよい。
【0070】
オピオイドアンタゴニスト
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する方法は、有効量のオピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソンもしくはナルトレキソン、または混合アゴニスト－アンタゴニスト、例えばブプレノルフィンの投与を含む。他のもの、例えばナルメフェンもまた使用し得る。オピオイドアンタゴニストは、キスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、または本明細書に記載する他の処置の代替として、またはその前、後、もしくは同時に投与し得る。したがって、本明細書において、（ｉ）キスペプチンまたはキスペプチンアナログ、および（ｉｉ）オピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソンまたはナルトレキソン、または混合アゴニスト－アンタゴニスト、例えばブプレノルフィンを含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する方法は、有効量のオピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソンもしくはナルトレキソン、または混合アゴニスト－アンタゴニスト、例えばブプレノルフィンの投与を含む。他のもの、例えばナルメフェンもまた使用し得る。オピオイドアンタゴニストは、キスペプチンもしくはキスペプチンアナログ、または本明細書に記載する他の処置の代替として、またはその前、後、もしくは同時に投与し得る。したがって、本明細書において、（ｉ）キスペプチンまたはキスペプチンアナログ、および（ｉｉ）オピオイドアンタゴニスト、例えばナロキソンまたはナルトレキソン、または混合アゴニスト－アンタゴニスト、例えばブプレノルフィンを含む組成物が提供される。
【0071】
病的低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の慣用的な処置
いくつかの実施形態において、本方法は、性腺ステロイド補充療法、例えば男性におけるテストステロン、（例えばテストステロンエステル、（例えば、エナント酸エステル、シピオン酸エステル、ウンデカン酸エステル）および女性におけるエストロゲンおよび／またはプロゲスチン（例えば、結合型エストロゲン（Ｐｒｅｍａｒｉｎ）、エチニルエストラジオール、またはエストラジオール、および／またはメドロキシプロゲステロン、微粒子化プロゲステロン）、および／またはホルモン不妊薬（例えば、エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）を投与することを含む。本方法はまた、ゴナドトロピン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを含んでいてもよい。任意選択で、クロミフェンおよび／またはレトロゾールを、患者のサブセットにおいて排卵を刺激するために使用してもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、性腺ステロイド補充療法、例えば男性におけるテストステロン、（例えばテストステロンエステル、（例えば、エナント酸エステル、シピオン酸エステル、ウンデカン酸エステル）および女性におけるエストロゲンおよび／またはプロゲスチン（例えば、結合型エストロゲン（Ｐｒｅｍａｒｉｎ）、エチニルエストラジオール、またはエストラジオール、および／またはメドロキシプロゲステロン、微粒子化プロゲステロン）、および／またはホルモン不妊薬（例えば、エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）を投与することを含む。本方法はまた、ゴナドトロピン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを含んでいてもよい。任意選択で、クロミフェンおよび／またはレトロゾールを、患者のサブセットにおいて排卵を刺激するために使用してもよい。
【実施例】
【0072】
本発明はさらに、以下の実施例に記載されており、これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【0073】
[実施例１]
思春期遅発を有する若者についての思春期の転帰を予測するためのキスペプチンの使用
材料および方法
以下の材料および方法を本実施例で使用した。
思春期遅発を有する若者についての思春期の転帰を予測するためのキスペプチンの使用
材料および方法
以下の材料および方法を本実施例で使用した。
【0074】
試験承認
キスペプチン刺激試験時の生理学的試験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （ＭＧＨ）／Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＩＲＢによって承認され、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１４３８０３４）に登録される。キスペプチンはＩＮＤ１１３，５９１の下で使用され、ＧｎＲＨはＩＮＤ９３，３５３の下で使用された。思春期遅発およびＩＨＨの遺伝学についての試験は、それぞれＢｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＭＧＨによって承認された。全ての参加者は、書面によるインフォームドアセントを提出し、少なくとも１人の親が書面によるインフォームドコンセントを提出した。再試験を経験した２人の参加者については、反復試験がＰａｒｔｎｅｒｓ ＩＲＢによって承認され、参加者およびその親は再試験についての書面によるインフォームドアセントおよびコンセントを提出した。
キスペプチン刺激試験時の生理学的試験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （ＭＧＨ）／Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＩＲＢによって承認され、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１４３８０３４）に登録される。キスペプチンはＩＮＤ１１３，５９１の下で使用され、ＧｎＲＨはＩＮＤ９３，３５３の下で使用された。思春期遅発およびＩＨＨの遺伝学についての試験は、それぞれＢｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＭＧＨによって承認された。全ての参加者は、書面によるインフォームドアセントを提出し、少なくとも１人の親が書面によるインフォームドコンセントを提出した。再試験を経験した２人の参加者については、反復試験がＰａｒｔｎｅｒｓ ＩＲＢによって承認され、参加者およびその親は再試験についての書面によるインフォームドアセントおよびコンセントを提出した。
【0075】
試験プロトコル
試験プロトコルの詳細は、以前に記載されている（２０）。端的には、採用基準は、少女については１２歳以上であり、少年については１３．５歳以上であり、思春期の遅発または停止は、少女については乳房の発達、少年については精巣体積に基づいて定義される。特定可能な思春期遅発の原因を有する子供を排除した。参加者は、一晩の間のベースラインＬＨ分泌、０．３１３ｍｃｇ／ｋｇのキスペプチン－１０に応答したＬＨ分泌（ΔＬＨキスペプチン）、および７５ｎｇ／ｋｇのＧｎＲＨに応答したＬＨ分泌（ΔＬＨＧｎＲＨ）を測定するための１０分ごとの血液サンプリングについて、ＭＧＨ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＣＲＣ）への２回の入院をしていた。ΔＬＨキスペプチンおよびΔＬＨＧｎＲＨは、６日間、２時間ごとの拍動性の７５ｎｇ／ｋｇの皮下ＧｎＲＨを使用した、下垂体の「プライミング」の前後の両方において評価し、ＧｎＲＨに対する強い下垂体応答を確実にした（８）。
試験プロトコルの詳細は、以前に記載されている（２０）。端的には、採用基準は、少女については１２歳以上であり、少年については１３．５歳以上であり、思春期の遅発または停止は、少女については乳房の発達、少年については精巣体積に基づいて定義される。特定可能な思春期遅発の原因を有する子供を排除した。参加者は、一晩の間のベースラインＬＨ分泌、０．３１３ｍｃｇ／ｋｇのキスペプチン－１０に応答したＬＨ分泌（ΔＬＨキスペプチン）、および７５ｎｇ／ｋｇのＧｎＲＨに応答したＬＨ分泌（ΔＬＨＧｎＲＨ）を測定するための１０分ごとの血液サンプリングについて、ＭＧＨ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＣＲＣ）への２回の入院をしていた。ΔＬＨキスペプチンおよびΔＬＨＧｎＲＨは、６日間、２時間ごとの拍動性の７５ｎｇ／ｋｇの皮下ＧｎＲＨを使用した、下垂体の「プライミング」の前後の両方において評価し、ＧｎＲＨに対する強い下垂体応答を確実にした（８）。
【0076】
参加者は次いで６ヶ月ごとの経過観察診療に戻り、身体検査およびＦＳＨ、ＬＨ，およびエストラジオールまたはテストステロンの測定を受け、生殖内分泌活性を評価した。年齢が１８歳に達する際に、参加者は生殖内分泌活性の身体学的および研究室的な兆候についての最終評価を受けた。６つのステロイド処置を受けている参加者については、処置は研究室試験の前に行い、性ステロイド測定値が、外来性の投与（エストラジオールについては４週間、注射テストステロンについては６週間、および経皮テストステロンについては２週間にわたる）よりも内在性の産生を確実に反映するようにした。
【0077】
研究室アッセイ
ＴＣＲＣ来診については、ＬＨ、ＦＳＨ、テストステロン（Ｔ）、およびエストラジオールが以前に記載されている（２０）ように、ＭＧＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅ、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓａｙ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＣｏｒｅおよびＬａｂｃｏｒｐによって、例えば、血清ＬＨおよびＦＳＨについては、自動化Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳＹＭシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、血清Ｔ濃度についてはＤＰＣ Ｃｏａｔ－Ａ－Ｃｏｕｎｔ ＲＩＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を使用した微粒子酵素免疫アッセイを使用して測定した（６０）。ＬＨアッセイの精度は４．３～６．４％であった。インヒビンＢは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｃｏｒｅによる免疫アッセイによって単一のバッチにおいて測定し、アッセイ内の変動係数は２．５％であった。経過観察来診については、研究室試験は、Ｌａｂｃｏｒｐ ａｎｄ Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって行われた。Ｂｏｓｔｏｎ領域の外側の参加者については、経過観察データは、その地域の内分泌学者および臨床的研究室からの日常的な臨床治療によって得られた。
ＴＣＲＣ来診については、ＬＨ、ＦＳＨ、テストステロン（Ｔ）、およびエストラジオールが以前に記載されている（２０）ように、ＭＧＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅ、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓａｙ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＣｏｒｅおよびＬａｂｃｏｒｐによって、例えば、血清ＬＨおよびＦＳＨについては、自動化Ａｂｂｏｔｔ ＡｘＳＹＭシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、血清Ｔ濃度についてはＤＰＣ Ｃｏａｔ－Ａ－Ｃｏｕｎｔ ＲＩＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を使用した微粒子酵素免疫アッセイを使用して測定した（６０）。ＬＨアッセイの精度は４．３～６．４％であった。インヒビンＢは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｃｏｒｅによる免疫アッセイによって単一のバッチにおいて測定し、アッセイ内の変動係数は２．５％であった。経過観察来診については、研究室試験は、Ｌａｂｃｏｒｐ ａｎｄ Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって行われた。Ｂｏｓｔｏｎ領域の外側の参加者については、経過観察データは、その地域の内分泌学者および臨床的研究室からの日常的な臨床治療によって得られた。
【0078】
遺伝学的試験
全エキソーム解析は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において行った。エキソーム解析データは、ＩＨＨ／ＫＳ、思春期遅発または両方に関連する３０遺伝子におけるバリアントについてスクリーニングした（表１（２１）に列挙）。バリアントは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの診断基準に従って分類した（２２）。
全エキソーム解析は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において行った。エキソーム解析データは、ＩＨＨ／ＫＳ、思春期遅発または両方に関連する３０遺伝子におけるバリアントについてスクリーニングした（表１（２１）に列挙）。バリアントは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの診断基準に従って分類した（２２）。
【0079】
統計学
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して、キスペプチン刺激試験と思春期の転帰との間の相関を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。Ｊｅｆｆｒｅｙｓ区間を使用して、感受性および特異性について信頼区間を算出した。
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して、キスペプチン刺激試験と思春期の転帰との間の相関を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。Ｊｅｆｆｒｅｙｓ区間を使用して、感受性および特異性について信頼区間を算出した。
【0080】
【表1】
【0081】
【表2】
【0082】
【表3】
【0083】
【表4】
【0084】
【表5】
【0085】
結果
キスペプチンに対する応答
思春期の遅発または停止を有する１７人の参加者が本試験に参加した（４人の少女および１３人の少年、図１）。これらの参加者のうちの１５人（参加者１～１５）についてのキスペプチン－およびＧｎＲＨ－刺激試験の結果は以前に参照文献（２０）に報告されている。参加者Ａは、新しく本試験に参加し、「キスペプチン非応答者」パターンを示し、一方、同様にこの試験に新しく参加した、参加者Ｂは、「キスペプチン応答者」パターンを示した（図２）。参加者およびその神経内分泌表現型の特性は、表４および表２（２１）に示す。
キスペプチンに対する応答
思春期の遅発または停止を有する１７人の参加者が本試験に参加した（４人の少女および１３人の少年、図１）。これらの参加者のうちの１５人（参加者１～１５）についてのキスペプチン－およびＧｎＲＨ－刺激試験の結果は以前に参照文献（２０）に報告されている。参加者Ａは、新しく本試験に参加し、「キスペプチン非応答者」パターンを示し、一方、同様にこの試験に新しく参加した、参加者Ｂは、「キスペプチン応答者」パターンを示した（図２）。参加者およびその神経内分泌表現型の特性は、表４および表２（２１）に示す。
【0086】
長期間経過観察
この最初の神経内分泌特徴付けの後、参加者は、６ヶ月ごとの経過観察来診に戻った。８人の参加者（２人の少女および６人の少年）は、経過観察期間の間に思春期に進行した（表４、表３（２１））。外来性処置の非存在下において、少年達は、精巣体積の進行性の増加を示し、少女達は、進行性の乳房発達を示した。これらの参加者は全員、外因性キスペプチンに応答し、ＬＨが０．８ｍＩＵ／ｍＬまたはそれ以上上昇する、「キスペプチン応答者」であった（図３、表４）。
この最初の神経内分泌特徴付けの後、参加者は、６ヶ月ごとの経過観察来診に戻った。８人の参加者（２人の少女および６人の少年）は、経過観察期間の間に思春期に進行した（表４、表３（２１））。外来性処置の非存在下において、少年達は、精巣体積の進行性の増加を示し、少女達は、進行性の乳房発達を示した。これらの参加者は全員、外因性キスペプチンに応答し、ＬＨが０．８ｍＩＵ／ｍＬまたはそれ以上上昇する、「キスペプチン応答者」であった（図３、表４）。
【0087】
対照的に、８人の参加者（１人の少女および７人の少年）は、１８歳までに思春期に進行することができなかった（表４、表３（２１））。これらの参加者は、身体検査時に持続性の性的未熟性を示し、少年は＜４ｍＬの精巣体積を示し、少女は、外因性のエストラジオールによる処置を開始するまで乳房発達がなかった。性ステロイド処置の中断後の内在性の生殖内分泌活性の評価時に、これらの参加者は全員、成人参照範囲を下回る血清濃度の性ステロイド（少女についてはエストラジオール、少年についてはテストステロン）、および低いか、または低性ステロイドの状況下では、不適性に通常のものである血清ゴナドトロピン濃度を有していた。思春期に入ることができなかった、これらの個人は、キスペプチンに対してほとんど～全く応答を示さなかった「キスペプチン非応答者」（１人の少女および６人の男性）（８番目の「非応答者」は、経過観察不能であった）および１人の男性の、０．４ｍＩＵ／ｍＬのキスペプチンに対してＬＨ応答を示した「中間応答者」であった（図３、表４）。
【0088】
したがって、キスペプチンに対する参加者の応答は、後に思春期に進行した参加者を、進行しなかった参加者から明らかに区別するものであった（ｐ＝０．０００２）。キスペプチン刺激試験についての感受性および特異性は共に１００％であった（９５％ＣＩ ７４～１００％）。
【0089】
３つの条件におけるＬＨ測定：日中、一晩およびＧｎＲＨ刺激後
非刺激ＬＨ濃度（日中または一晩の間に測定）および外因性ＧｎＲＨによる刺激後に測定されたＬＨは、子供が最終的に思春期に入るかどうかを予測する方法として試験されている（８）。この試験において、２人の少年は、登録時に思春期の範囲の非刺激血清ＬＨ濃度を有しており、１人は、後に思春期に進行する様子が見られた。登録時に思春期範囲にＬＨを有する残りの１４人の参加者のうち、７人は思春期に進行し、７人は進行しなかった（図４、表４）。したがって、非刺激ＬＨは、正確には思春期の転帰を予測するものではなかった。
非刺激ＬＨ濃度（日中または一晩の間に測定）および外因性ＧｎＲＨによる刺激後に測定されたＬＨは、子供が最終的に思春期に入るかどうかを予測する方法として試験されている（８）。この試験において、２人の少年は、登録時に思春期の範囲の非刺激血清ＬＨ濃度を有しており、１人は、後に思春期に進行する様子が見られた。登録時に思春期範囲にＬＨを有する残りの１４人の参加者のうち、７人は思春期に進行し、７人は進行しなかった（図４、表４）。したがって、非刺激ＬＨは、正確には思春期の転帰を予測するものではなかった。
【0090】
初期思春期において、日中ゴナドトロピン測定は、生殖内分泌軸の活性を正確に反映しているものではない可能性もあり、これは、ＧｎＲＨおよびＬＨ分泌のパルスは、夜間の睡眠の深いステージにのみ生じるためである（２３）。したがって、我々は、一晩の血液サンプリングを行い、睡眠関連ＬＨ分泌を検出した。一晩の間にＬＨ分泌のパルスを少なくとも１回有していた子供は６人全て、後に思春期に進行する様子が見られた（表４）。対照的に、一晩の間にＬＨパルスが見られない１０人の子供については、種々の転帰が観察された。８人は、思春期に進行することができなかったが、２人は思春期進行を示し、この２人は、神経内分泌評価時に、外因性性ステロイドで処置されていた１人の少女および１人の少年（参加者Ｂおよび１１）であり、これが内因性ＬＨ分泌を抑制した可能性がある。
【0091】
ＧｎＲＨ刺激ＬＨ分泌もまた、思春期の転帰を予測するための試験として研究されていた（８）。我々のコホートでは、ＧｎＲＨに対するＬＨ応答は重複しており、後に思春期に進行した対象では１．２～１５．４ｍＩＵ／ｍＬの範囲にあり、進行しなかった対象においては、０．２～７．５ｍＩＵ／ｍＬの範囲にあった（図４、表４）。
【0092】
したがって、これらの試験、日中に測定したものであっても夜間に測定したものであっても非刺激ＬＨ、またはＧｎＲＨ刺激ＬＨのいずれも、この試験コホートにおいて思春期の転帰を予測するためのキスペプチン刺激試験として正確なものではなかった。
【0093】
インヒビンＢ
血清インヒビンＢの測定は、思春期遅発を有する子供についての思春期の転帰を予測するための方法として提案されている（８～１１）。血清インヒビンＢは、後に思春期に進行した少年においては、３９～２０９ｐｇ／ｍＬの範囲にあり、進行しなかった少年については、＜１７ｐｇ／ｍＬ～４８ｐｇ／ｍＬの範囲にあった（図４、表４）。したがって、インヒビンＢは、後に思春期に進行するであろう子供と、進行しないであろう子供を正確に区別するものではなかった。
血清インヒビンＢの測定は、思春期遅発を有する子供についての思春期の転帰を予測するための方法として提案されている（８～１１）。血清インヒビンＢは、後に思春期に進行した少年においては、３９～２０９ｐｇ／ｍＬの範囲にあり、進行しなかった少年については、＜１７ｐｇ／ｍＬ～４８ｐｇ／ｍＬの範囲にあった（図４、表４）。したがって、インヒビンＢは、後に思春期に進行するであろう子供と、進行しないであろう子供を正確に区別するものではなかった。
【0094】
遺伝学的試験
患者のサブセットは、エキソーム解析に同意した。３０ＩＨＨ遺伝子における病原性および病原性のある可能性が高いバリアント（表１（２１））が、後に思春期に進行を見せた５人の参加者のうちの２人および、思春期に入らなかった６人の参加者のうちの２人において特定された（表５）。病原性または病原性のある可能性が高いバリアントは、ＩＧＳＦ１０においては同定されず、これは、体質性遅発と関連する可能性のある遺伝子である。したがって、遺伝学的試験からは、思春期遅発を有する子供についての思春期の転帰を予測することはできなかった。
患者のサブセットは、エキソーム解析に同意した。３０ＩＨＨ遺伝子における病原性および病原性のある可能性が高いバリアント（表１（２１））が、後に思春期に進行を見せた５人の参加者のうちの２人および、思春期に入らなかった６人の参加者のうちの２人において特定された（表５）。病原性または病原性のある可能性が高いバリアントは、ＩＧＳＦ１０においては同定されず、これは、体質性遅発と関連する可能性のある遺伝子である。したがって、遺伝学的試験からは、思春期遅発を有する子供についての思春期の転帰を予測することはできなかった。
【0095】
【表6】
【0096】
【表7】
【0097】
[実施例２]
思春期遅発を有する若者についての思春期の転帰を改善するための超生理学的キスペプチン
実施例１に記載する試験において思春期遅発を有する１人の対象は、１５．３歳の時点で０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ（生理学的用量）のキスペプチン－１０の投与を受けており、ＬＨ応答を開始することができなかった。その直後、別の入院の間に、対象は、超生理学的用量のキスペプチン（１８μｇ／ｋｇ）の投与を受け、驚くべきことに、応答を見せた。対象の最終的な診断は、１８歳までに思春期の身体的兆候を示すことができないことによって示されるように、ＩＨＨであった。このことによって、１）ＧｎＲＨ欠損は、キスペプチン耐性によるものであり得ること、ならびに２）この耐性は、高用量のキスペプチンによって克服し得ることが示される。
思春期遅発を有する若者についての思春期の転帰を改善するための超生理学的キスペプチン
実施例１に記載する試験において思春期遅発を有する１人の対象は、１５．３歳の時点で０．３１３μｇ／ｋｇ ＩＶＢ（生理学的用量）のキスペプチン－１０の投与を受けており、ＬＨ応答を開始することができなかった。その直後、別の入院の間に、対象は、超生理学的用量のキスペプチン（１８μｇ／ｋｇ）の投与を受け、驚くべきことに、応答を見せた。対象の最終的な診断は、１８歳までに思春期の身体的兆候を示すことができないことによって示されるように、ＩＨＨであった。このことによって、１）ＧｎＲＨ欠損は、キスペプチン耐性によるものであり得ること、ならびに２）この耐性は、高用量のキスペプチンによって克服し得ることが示される。
【0098】
この観察に基づいて、高用量および／または反復的なキスペプチンの投与が、ＩＨＨ／ＫＳを有する患者におけるＧｎＲＨ誘導ＬＨ分泌を刺激し得ることが仮定された。この仮説に取り組むために、次のプロトコルを開始した、１）ｑ１０分の血液サンプリング×６時間、２）キスペプチン投与ｑ２時間×４０時間（それぞれ４用量の５セット：０．３１３、０．９３９、３．１３、および１３．１９μｇ／ｋｇ）。比較のために、図５Ａは健常な男性を示している。彼は、正常なＬＨパルスを有し、生理学的な用量のキスペプチンは、明らかにＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスをもたらした。図５Ｂは、内在性ＬＨパルスを有さず、キスペプチンに対してＬＨ応答を示さない（すなわち、キスペプチン耐性）ＫＳ男性を示す。男性は、プロキネクチン受容体をコードする遺伝子、ＰＲＯＫＲ２およびＤＭＸＬ２に稀少なバリアントを有する。図５Ｃは、生理学的用量のキスペプチンには応答しなかったが超生理学的用量に応答し、明確なキスペプチン誘導ＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスを有するＫＳ女性を示している。さらに、パルスの振幅は経時的に上昇し、このことは、反復暴露の「プライミング」効果を示している。女性の遺伝学的特性は未だ知られていない。図５Ｄは、遺伝学的バリアントをも有するＫＳ男性を示し、男性の応答は明白ではないが、超生理学的キスペプチンに対しても応答した。図６は、経時的な各用量に対する応答を明らかに示す、再グラフ化された図５Ｃからのデータを示す。したがって、持続性の性腺機能低下症を有する患者は、単一のＩＶボーラス用量においてキスペプチン耐性であると考えられたが、これらの患者はキスペプチンを反復的に、特により高い用量において投与する際に大きく異なる応答を示した。そのデータは、ＩＨＨ／ＫＳを有する患者におけるＧｎＲＨニューロンが、反復的キスペプチン刺激によって、休止状態から呼び起こされ得ることを示している。さらに、この反復性キスペプチン刺激は、ＧｎＲＨ誘導ＬＨ脈動をもたらした。
【0099】
[実施例３]
ニューロキニンＢおよびダイノルフィンシグナル伝達から独立した、視床下部生殖内分泌パルス生成部活性
内在性因子（例えば、性腺ステロイド、ストレスホルモン、および栄養シグナル）および外部手がかり（例えば、社会的手がかりおよび日長）がＧｎＲＨ放出を調節する求心性経路の特定は、近年、キスペプチン／ニューロキニンＢ／ダイノルフィンシステムに焦点を当てている（３４）。キスペプチン、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）およびそれぞれの受容体における不活化変異は、ヒトおよびマウスにおいてＩＨＨを引き起こし、ＧｎＲＨパルスの生成においてこれらの神経ペプチドを関連付けている（３５～４２）。ダイノルフィンは、月経サイクルの黄体期の間にプロゲステロンに応答したＧｎＲＨパルス生成活性の重要な遅延化を提供することによって、この刺激活性に対立すると考えられている（４３～４５）。これらの３つの神経ペプチドは、弓状態核、ＫＮＤｙ（キスペプチン－ニューロキニンＢ－ダイノルフィン）二ユーロンのニューロン集団において融合し、協調した様式で作用し、ＧｎＲＨニューロンの分泌活性を同調させ、生殖内分泌機能を駆動させるのに必要なＧｎＲＨ分泌のパルスを生成する（４６～４８）。
ニューロキニンＢおよびダイノルフィンシグナル伝達から独立した、視床下部生殖内分泌パルス生成部活性
内在性因子（例えば、性腺ステロイド、ストレスホルモン、および栄養シグナル）および外部手がかり（例えば、社会的手がかりおよび日長）がＧｎＲＨ放出を調節する求心性経路の特定は、近年、キスペプチン／ニューロキニンＢ／ダイノルフィンシステムに焦点を当てている（３４）。キスペプチン、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）およびそれぞれの受容体における不活化変異は、ヒトおよびマウスにおいてＩＨＨを引き起こし、ＧｎＲＨパルスの生成においてこれらの神経ペプチドを関連付けている（３５～４２）。ダイノルフィンは、月経サイクルの黄体期の間にプロゲステロンに応答したＧｎＲＨパルス生成活性の重要な遅延化を提供することによって、この刺激活性に対立すると考えられている（４３～４５）。これらの３つの神経ペプチドは、弓状態核、ＫＮＤｙ（キスペプチン－ニューロキニンＢ－ダイノルフィン）二ユーロンのニューロン集団において融合し、協調した様式で作用し、ＧｎＲＨニューロンの分泌活性を同調させ、生殖内分泌機能を駆動させるのに必要なＧｎＲＨ分泌のパルスを生成する（４６～４８）。
【0100】
両アレル性の機能損失型の変異は、遺伝子の両コピーを破壊するため、かかる変異を有する患者（すなわち、「ヒトノックアウト」）は、遺伝子の破壊または損失の表現型の結果に対する新規の洞察を提供する。この試験において、ＮＫＢ（ＫＮＤｙニューロンの重要な神経ペプチドの１つ）をコードする遺伝子に両アレル性の完全な機能損失型の変異を有する４人の姉妹は、遺伝子型駆動性表現型決定を受けた。ＩＨＨと最初に診断されたにも関わらず、何人かの姉妹は、成人期において自然に生殖内分泌機能を回復した。試験は、正常および、ニューロキニンＢ欠損家族メンバーならびに正常およびニューロキニンＢ欠損マウスの両方において実施し、ＮＫＢのＧｎＲＨパルス生成における役割を検討し、ＮＫＢ、キスペプチンおよびダイノルフィンの間の相互作用を分析した。特異的な神経内分泌プローブの組合せの使用によって、視床下部が、３つのＫＮＤｙ構成要素、ＮＫＢおよびダイノルフィンのうちの２つの遺伝学的および薬理的なアンタゴニズムにも関わらず、ＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスを生成することができることが明らかになった。
【0101】
結果は、ＩＨＨを有する対象におけるＮＬＸ注入の間のＬＨレベルの上昇を示している。現在までに、ＩＨＨを有する患者において通常の生理学を模倣する内在性ＧｎＲＨ誘導ＬＨ脈動を刺激する能力は、存在していなかった。
【0102】
ＬＨパルスに関する考慮は、対象４が、対象５よりも顕著なＮＬＸに対する応答を有していると考えられた観察を含んでいる。対象４は、外因性ＧｎＲＨによる下垂体プライミングを受け、対象５は受けておらず、これが、対象４におけるＬＨ応答に対するＮＬＸの効果を増幅させた可能性がある。対象４はまた、ＧｎＲＨ放出時に内在性キスペプチン作用を増強させ得る間欠性のホルモン補充療法を受けていた。
【0103】
事前の試験において、健常男性および黄体期の女性において強いＧｎＲＨ誘導ＬＨ応答をもたらす、同用量のｋｐ－１０が、一定範囲の遺伝子型のＩＨＨ患者において何の効果ももたらすことができないことはＧｎＲＨ神経回路網の機能的な能力が、ＩＨＨを有する患者においては根本的に損なわれていることを示している（５８）。これらのＴＡＣ３またはＴＡＣＲ３以外の遺伝子型を有するＩＨＨ患者における以前の観察とは対照的に、対象３、４および５は、ｋｐ－１０ ＩＶＢに対して応答した（５８）。ここで、低頻度のパルスおよび外因性のｋｐ－１０投与に対する応答能力は、パルス生成に必要なＧｎＲＨ神経回路がＮＫＢを欠損する患者においてインタクトなままであることを示している。しかし、ＬＨパルスと共にｋｐ－１０に応答できることは、ＩＶＢ投与の状況においてのみ観察され、以前他者によって報告されているような（５９）継続的な注入では観察されなかった。ｋｐ－１０の用量、ＬＨアッセイおよびＬＨパルスアルゴリズムが異なっていることによって、この不一致を説明し得る。
【0104】
方法
以下の材料および方法を実施例３において使用した。
以下の材料および方法を実施例３において使用した。
【0105】
対象および適格性判断基準
単一の血族の家族由来の５人の女性をその遺伝子型に基づいて募集した（表６）。対象は、生殖的に正常である（対象１；遺伝子型 ＴＡＣ３ ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４ヘテロ接合型）か、または低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の診断を有していた（対象２～５、遺伝子型ＴＡＣ３ ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４ホモ接合型）。兄弟および親は、試験参加に利用できなかった。ＩＨＨは、１８歳以上の年齢および低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を引き起こし得る特定可能な医学的症状の非存在下において、低いまたは正常なゴナドトロピンレベルの状況における性腺機能低下性ステロイドレベル（女性においては、エストラジオール＜２０ｐｇ／ｍＬ）として定義した。以前の我々の報告（１９）にあるように、女性におけるＩＨＨの回復は、１）外因性ＧｎＲＨまたはゴナドトロピン療法を使用しない妊孕性、２）処置の非存在下における少なくとも３ヶ月間の自発的な月経サイクル、および／または３）女性についての正常な範囲内のＬＨパルス頻度および振幅として定義された。回復後の再発は、性腺機能低下性ステロイドレベル（女性においては、血清エストラジオール＜２０ｐｇ／ｍＬ）および／または無月経を再び有することとして定義された。
単一の血族の家族由来の５人の女性をその遺伝子型に基づいて募集した（表６）。対象は、生殖的に正常である（対象１；遺伝子型 ＴＡＣ３ ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４ヘテロ接合型）か、または低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の診断を有していた（対象２～５、遺伝子型ＴＡＣ３ ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４ホモ接合型）。兄弟および親は、試験参加に利用できなかった。ＩＨＨは、１８歳以上の年齢および低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を引き起こし得る特定可能な医学的症状の非存在下において、低いまたは正常なゴナドトロピンレベルの状況における性腺機能低下性ステロイドレベル（女性においては、エストラジオール＜２０ｐｇ／ｍＬ）として定義した。以前の我々の報告（１９）にあるように、女性におけるＩＨＨの回復は、１）外因性ＧｎＲＨまたはゴナドトロピン療法を使用しない妊孕性、２）処置の非存在下における少なくとも３ヶ月間の自発的な月経サイクル、および／または３）女性についての正常な範囲内のＬＨパルス頻度および振幅として定義された。回復後の再発は、性腺機能低下性ステロイドレベル（女性においては、血清エストラジオール＜２０ｐｇ／ｍＬ）および／または無月経を再び有することとして定義された。
【0106】
対象はまた、遺伝学試験にも参加した。患者のＤＮＡは、以前に記載されているように（２０、２１）、ＩＨＨを引き起こすことが知られている遺伝子において、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｇｎｏｍＡＤ）において１％未満の少数のアレル頻度を有するものとして定義される、レア配列バリアント（ＲＳＶ）についてスクリーニングした。スクリーニングした遺伝子は、ＣＨＤ７（ＭＩＭ６０８８９２）、ＦＧＦ８（ＭＩＭ６００４８３）、ＦＧＦＲ１（ＭＩＭ１３６３５０）、ＧＮＲＨ１（ＭＩＭ１５２７６０）、ＧＮＲＨＲ（ＭＩＭ１３８８５０）、ＨＳ６ＳＴ１（ＭＩＭ６０４８４６）、ＡＮＯＳ１（以前はＫＡＬ１と称した、ＭＩＭ３００８３６）、ＫＩＳＳ１（ＭＩＭ６０３２８６）、ＫＩＳＳ１Ｒ（ＭＩＭ６０４１６１）、ＮＳＭＦ（以前はＮＥＬＦと称した、ＭＩＭ６０８１３）、ＰＲＯＫ２（ＭＩＭ６０７００２）、ＰＲＯＫＲ２（ＭＩＭ６０７１２３）、ＴＡＣ３（ＭＩＭ１６２３３０）およびＴＡＣＲ３（ＭＩＭ１６２３３２）であり、エキソンのＰＣＲ増幅およびその後のサンガー配列決定により行われた。ＲＳＶは、それらが、４つのインシリコ予測プログラムＰｏｌｙＰｈｅｎ－２（２２）、ＳＩＦＴ（２３）、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔａｓｔｅｒ（２４）またはＰａｎｔｈｅｒ（２５）のうちの少なくとも２つにおいて損傷性であると予測された場合に報告された。１２項目の嗅覚試験からのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｍｅｌｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ＵＰＳＩＴ）スコアを嗅覚能力の分類に使用した（２６、２７）。
【0107】
【表8】
【0108】
【表9】
【0109】
試験設計
２０１０年に、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象（対象２、３、４、５）は、血液サンプリングを１０分間ごと（ｑ１０分間に）６～８時間行い、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにおいて、Ｉ．Ｓａｄａｆ Ｆａｒｏｏｑｉ教授の指示の下で、内在性ＬＨ脈動をマッピングする、詳細な神経内分泌表現型決定を行った（図７Ａ）。
２０１０年に、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する対象（対象２、３、４、５）は、血液サンプリングを１０分間ごと（ｑ１０分間に）６～８時間行い、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにおいて、Ｉ．Ｓａｄａｆ Ｆａｒｏｏｑｉ教授の指示の下で、内在性ＬＨ脈動をマッピングする、詳細な神経内分泌表現型決定を行った（図７Ａ）。
【0110】
２０１６年に、対象１、３、４および５は、内在性のＬＨパルスパターンが、ＧｎＲＨ、キスペプチン１１２－１２１（ｋｐ－１０）およびダイノルフィンを遮断する非特異的なオピオイドアンタゴニスト、ナロキソン（ＮＬＸ）の投与によって改変し得るかを決定するための、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （ＭＧＨ） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＲＣ）における第２の一連の日中の試験に参加するように招待された（図８Ａ、図９Ａ、図１０Ａ）。下垂体性腺刺激ホルモン分泌細胞が、準備ができている状態にあることを確実にするために、対象３および４は、２５ｎｇ／ｋｇの外因性の拍動性ＧｎＲＨを２時間ごとに（ｑ２ｈ）、Ｃｒｏｎｏ Ｆポータブル注入ポンプによって（Ｃａｎｅ Ｓ．ｐ．Ａ、Ｔｕｒｉｎ、Ｉｔａｌｙ）ＭＧＨ ＣＲＣに入院する３日前に投与された（２８）。対象５は、何らかの神経内分泌活性（年単位の自発的出血）の近年の根拠を有していたため、拍動性ＧｎＲＨによるプライミングを受けなかった（表６）。
【0111】
【0112】
キスペプチンボーラス：内在性ＧｎＲＨ誘導ＬＨ分泌の評価後、対象３，４および５は、我々のグループの以前の仕事として、０．２４ｎｍｏｌ／ｋｇのｋｐ－１０の静脈内ボーラス（ＩＶＢ）の投与を受けており、この用量が、健常な男性および健常な黄体期の女性において生理学的な振幅のＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスを一貫して誘発することが示されていた（２９、３０）（図８Ａ）。対象４、５は、次いで０．７２および２．４ｎｍｏｌ／ｋｇのｋｐ－１０ＩＶＢを投与された。対象３、４、および５は、次いで、これらの試験の最後に７５ｎｇ／ｋｇ ＩＶＢのＧｎＲＨの投与を受け、これは、我々のグループが以前にこの用量が、インタクトな性腺刺激ホルモン分泌細胞機能を有する個人において強力なＧｎＲＨ誘導ＬＨ応答をもたらすことを示しているためである（３１）。
【0113】
キスペプチン注入：ＩＶＢ試験とは対照的に、対象３は、ＣＲＣに戻り、ｋｐ－１０が１２時間連続的な注入（９．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／時間）として投与される第２の入院に参加し、内在性ＧｎＲＨ誘導ＬＨ脈動に対する影響を決定した。ＩＶＢ試験と同様に、血液サンプルをｑ１０分間で採取し、７５ｎｇ／ｋｇ ＩＶＢのＧｎＲＨを試験の最後に投与した（図９Ａ）。
【0114】
ナロキソン注入、ダイノルフィン遮断：対象４および５は、ＣＲＣに戻り、ＮＬＸ注入（１０ｍｇ ＩＶＢのＮＬＸ後の、０．８ｍｇ／時間の注入）を１３時間受け、オピオイドアンタゴニズムによるダイノルフィンシグナル伝達の遮断の、ＮＫＢシグナル伝達の非存在下における内在性ＬＨパルスに対する影響を決定した。注入の途中に、ｋｐ－１０およびＧｎＲＨのボーラス（ｋｐ－１０用量範囲：０．２４～２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、ＧｎＲＨ：７５ｎｇ／ｋｇ）を投与し、ＮＬＸ投与が、これらのペプチドに対する応答を増強させ得るかを決定した（図１０Ａ）。再び、血液サンプルをホルモン測定のためにｑ１０分間採取した。看護の過誤により、対象５は、９時間で早期に終結したＮＬＸ注入を受けた。
【0115】
ペプチドの入手源
キスペプチンの１０アミノ酸アイソフォームであるキスペプチン１１２－１２１（プレプロホルモンのアミノ酸１１２－１２１に対応）およびＧｎＲＨは、ＮｅｏＭＰＳ（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による良好な製造実践によって合成された。ＮｅｏＭＰＳは、Ｅｕｎｉｃｅ Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｓｈｒｉｖｅｒ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔに対する契約の下で、キスペプチン１１２－１２１を供給した。ナロキソンは、Ｈｏｓｐｉｒａ（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）から注文された。
キスペプチンの１０アミノ酸アイソフォームであるキスペプチン１１２－１２１（プレプロホルモンのアミノ酸１１２－１２１に対応）およびＧｎＲＨは、ＮｅｏＭＰＳ（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による良好な製造実践によって合成された。ＮｅｏＭＰＳは、Ｅｕｎｉｃｅ Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｓｈｒｉｖｅｒ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔに対する契約の下で、キスペプチン１１２－１２１を供給した。ナロキソンは、Ｈｏｓｐｉｒａ（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）から注文された。
【0116】
ヒト研究室アッセイ
各サンプルについてのＬＨおよび２時間プールのエストラジオールを、自動化Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を以前に記載されているように使用して（２８）、直接的な免疫アッセイによって測定した。エストラジオールは、２０１０～２０１１年の試験については、質量分析ベースのアッセイに追跡可能な第２世代免疫アッセイによって、２０１６年の試験については、Ｅｌｅｃｓｙｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によって測定した（３２、３３）。
各サンプルについてのＬＨおよび２時間プールのエストラジオールを、自動化Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ システム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を以前に記載されているように使用して（２８）、直接的な免疫アッセイによって測定した。エストラジオールは、２０１０～２０１１年の試験については、質量分析ベースのアッセイに追跡可能な第２世代免疫アッセイによって、２０１６年の試験については、Ｅｌｅｃｓｙｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によって測定した（３２、３３）。
【0117】
思春期および成体Ｔａｃ２ノックアウトマウスにおける拍動性ＬＨ放出の評価
Ｔａｃ２＋／－繁殖対を、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ）によって作製し、遺伝子型を決定した（３４）。全てのマウスは、Ｓｖ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ハイブリッドバックグラウンドで作製および維持され、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、０６００～１８００時間の光、および供給される食料および水には自由に近づける状態で、温度および光を制御した環境で群収容（ケージ当たり３～５匹）された。マウスは、サンプリング条件への順応を可能にするために、実験前２～６週間毎日ハンドリングされた。
Ｔａｃ２＋／－繁殖対を、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ）によって作製し、遺伝子型を決定した（３４）。全てのマウスは、Ｓｖ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ ハイブリッドバックグラウンドで作製および維持され、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、０６００～１８００時間の光、および供給される食料および水には自由に近づける状態で、温度および光を制御した環境で群収容（ケージ当たり３～５匹）された。マウスは、サンプリング条件への順応を可能にするために、実験前２～６週間毎日ハンドリングされた。
【0118】
ＬＨ分泌の変化は、性的に成熟している途中である（６週齢）および成体（１６週齢）のインタクトな、および卵巣切除した（ＯＶＸ）Ｔａｃ２ノックアウト（ＫＯ）雌マウスおよび対照（野生型、ＷＴ）同腹仔（群当たりｎ＝４～５）において測定した。マウスにおけるＴａｃ２は、ヒトにおけるＮＫＢをコードしているため、これらのマウスはＮＫＢを欠損している。拍動性のＬＨ分泌の測定は、尾部の先端の単一の切開を介した反復性の血液採集によって評価した。尾部は、生理食塩水で洗浄した後、４μｌの血液を、ピペットで切断した尾部から各タイムポイントにおいて採取した。全血をすぐに１１６μｌの０．０５％ ＰＢＳＴで希釈し、ボルテックス振盪し、ドライアイス上で凍結させた。サンプルを次のＬＨ ＥＬＩＳＡのために－８０℃で保存した。ｋｐ－１０投与試験のために、３６の連続的な血液サンプルを、６時間のサンプリング期間にわたって収集した。サンプリング１７０分の時点（または思春期Ｔａｃ２ノックアウトマウスのサンプリングについては１８０分の時点）でマウスに、マウスｋｐ－１０を腹腔内注射した（７．５ｎｍｏｌ／１００μｌ生理食塩水、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。ＮＬＸ投与試験については、３０の連続的な血液サンプルを、ＷＴおよびＴａｃ２ ＫＯマウスからの５時間のサンプリング期間にわたって収集した。ＷＴおよびＴａｃ２ ＫＯマウスは卵巣切除されており、ＬＨパルスの生成におけるダイノルフィンの除去の作用をより良く決定するために、ＬＨパルスの頻度および振幅を増加させた。サンプリングの１２０分の時点において、マウスにＮＬＸを腹腔内注射した（５ｍｇ／ｋｇ／１００μｌ生理食塩水、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【0119】
データ解析
ヒトパルス解析：ＬＨパルスは、検証されたＳａｎｔｅｎ ａｎｄ Ｂａｒｄｉｎ法の改変（３５、３６）を使用して特定し、逆重畳積分アルゴリズムによって増強された（２９）。ｋｐ－１０誘導またはＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスのパルス振幅を、ｋｐ－１０またはＧｎＲＨ投与の０時点とパルスのピークとの間の差異として算出した。
ヒトパルス解析：ＬＨパルスは、検証されたＳａｎｔｅｎ ａｎｄ Ｂａｒｄｉｎ法の改変（３５、３６）を使用して特定し、逆重畳積分アルゴリズムによって増強された（２９）。ｋｐ－１０誘導またはＧｎＲＨ誘導ＬＨパルスのパルス振幅を、ｋｐ－１０またはＧｎＲＨ投与の０時点とパルスのピークとの間の差異として算出した。
【0120】
マウスパルス解析：ＬＨパルスは、ＬＨサンドウィッチＥＬＩＳＡによって収集される、ＬＨパルスデータを読み取るカスタムメイドのＭＡＴＬＡＢコードを使用して特定した。コードは、ａ）ＬＨ値の高さが、２の以前の値のいずれかの高さを２０％上回る、ならびに以下の値の高さを１０％上回るか、ｂ）第２の時間間隔（ｉ＝２）におけるピークが、パルスと見なされる前の単一の値を２０％上回るかに基づいてパルスを決定するループを含む。
【0121】
統計：対応のある両側ｔ検定を、ベースラインにおける平均ＬＨ、ＬＨ振幅（ＬＨパルスの最下点からピーク）およびＦＳＨを、上述の方法において規定するように、神経ペプチド介入に対する応答と比較して評価した。全ての値は、特に断らない限り、平均値±標準誤差として報告されている。
【0122】
試験承認
全てのヒト試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ＭＧＨ／Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅまたは Ｌｏｃａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍによって承認された。全ての対象は、試験に参加する前に、書面によるインフォームドコンセントを提出した。マウス試験については、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが全ての手法を承認している。
全てのヒト試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ＭＧＨ／Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅまたは Ｌｏｃａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍによって承認された。全ての対象は、試験に参加する前に、書面によるインフォームドコンセントを提出した。マウス試験については、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが全ての手法を承認している。
【0123】
結果
試験対象の最初の臨床的提示および続く過程
対象１は、正常な初潮タイミング、正常な月経サイクルおよび自然妊娠を有していた（表６）。その姉妹である、対象２、３、４および５は、１３～１５歳の時点において、原発性無月経を有すると提示され、二次性徴を誘導するためにエストロゲン療法を受けた。１８歳までの自発的な性成熟、正常なＭＲＩが見られないこと、および低ゴナドトロピンのために、対象２、３、４および５は全員ＩＨＨの診断を受けた（表６）。姉妹の中に嗅覚消失のものはいなかった。４人のＩＨＨ姉妹のうちの３人は、妊孕性についての薬物療法なしに妊娠したこと（対象３および４）および規則的な自発性の月経サイクル（対象５）によって証明されるように、２２～２８歳において性腺機能低下症の回復を示した。しかしながら、回復は持続的なものではなく、生理学的試験の時点では、対象３、４，および５は、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の状態に戻っていた（表６）。
試験対象の最初の臨床的提示および続く過程
対象１は、正常な初潮タイミング、正常な月経サイクルおよび自然妊娠を有していた（表６）。その姉妹である、対象２、３、４および５は、１３～１５歳の時点において、原発性無月経を有すると提示され、二次性徴を誘導するためにエストロゲン療法を受けた。１８歳までの自発的な性成熟、正常なＭＲＩが見られないこと、および低ゴナドトロピンのために、対象２、３、４および５は全員ＩＨＨの診断を受けた（表６）。姉妹の中に嗅覚消失のものはいなかった。４人のＩＨＨ姉妹のうちの３人は、妊孕性についての薬物療法なしに妊娠したこと（対象３および４）および規則的な自発性の月経サイクル（対象５）によって証明されるように、２２～２８歳において性腺機能低下症の回復を示した。しかしながら、回復は持続的なものではなく、生理学的試験の時点では、対象３、４，および５は、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の状態に戻っていた（表６）。
【0124】
遺伝学
候補遺伝子の配列決定により、対象１（正常な思春期タイミングおよび正常な月経サイクル）が、ＮＫＢをコードする遺伝子（ＴＡＣ３）における単一ヌクレオチドの欠損についてヘテロ接合型（ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４）であることが明らかになった。この塩基対欠損は、フレームシフト変異および、ＮＫＢ配列前にプレプロホルモンの未成熟なストップコドンがもたらされ、これはナンセンス変異依存分解機構をもたらすと予測される。転写物がナンセンス変異依存分解機構を回避する場合であっても、フレームシフト変異は、プロセシングされて、ＮＫＢとして知られるデカペプチドを産生するプレプロホルモンの一部を破壊するであろう。対象２、３、４および５は、全員低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有しており、このフレームシフト変異についてホモ接合型であるこの変異は新規であり、１２３，１３６のエキソームおよび１５，４９６のゲノムを含む規範的なデータベースであるｇｎｏｍＡＤには見出されない（２１）。注目すべきことに、ｇｎｏｍＡＤには、ＴＡＣ３についてタンパク質切断変異についてホモ接合型である個人は全く存在しない。この家族は、ＩＨＨを引き起こすことが知られている他の遺伝子変異を保有していない。
候補遺伝子の配列決定により、対象１（正常な思春期タイミングおよび正常な月経サイクル）が、ＮＫＢをコードする遺伝子（ＴＡＣ３）における単一ヌクレオチドの欠損についてヘテロ接合型（ｃ．６１＿６１ΔＧ ｐ．Ａ２１ＬｆｓＸ４４）であることが明らかになった。この塩基対欠損は、フレームシフト変異および、ＮＫＢ配列前にプレプロホルモンの未成熟なストップコドンがもたらされ、これはナンセンス変異依存分解機構をもたらすと予測される。転写物がナンセンス変異依存分解機構を回避する場合であっても、フレームシフト変異は、プロセシングされて、ＮＫＢとして知られるデカペプチドを産生するプレプロホルモンの一部を破壊するであろう。対象２、３、４および５は、全員低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有しており、このフレームシフト変異についてホモ接合型であるこの変異は新規であり、１２３，１３６のエキソームおよび１５，４９６のゲノムを含む規範的なデータベースであるｇｎｏｍＡＤには見出されない（２１）。注目すべきことに、ｇｎｏｍＡＤには、ＴＡＣ３についてタンパク質切断変異についてホモ接合型である個人は全く存在しない。この家族は、ＩＨＨを引き起こすことが知られている他の遺伝子変異を保有していない。
【0125】
ベースライン試験：緩やかなＬＨパルス頻度によって、ニューロキニンＢのないＩＨＨ個人を特徴付ける
これらのベースライン試験時に、ＩＨＨ姉妹（対象２，３，４および５）は、ホルモン薬物療法なしで、無月経であり血清エストラジオールレベルは低いが検出可能であり、プロゲステロンレベルは低かった（表６、図７Ｂ）。ＩＨＨを有する全ての対象は、低頻度のＬＨ分泌イベントによって証明される、弱まっているが、組織化されたＧｎＲＨパルス発生部の根拠を有していた（低エストラジオール、低プロゲステロンによって特徴付けられる生理学的な卵胞期前期における比較のため、ＬＨ頻度７．０±１．８パルス／１２時間、ＬＨ振幅２．３±１．０ＩＵ／Ｌ［平均±２ＳＤ］）（３７、３８）。対象２、４および５において１つのパルスが、サンプリング間隔において観察された（７～８時間、平均ＬＨ振幅１．５±０．８ｍＩＵ／ｍＬ）（図７Ｂ）。対象３においては、試験の間パルスは全く観察されなかった。さらに、対象３、４および５のＬＨレベルは、サンプリング間隔の開始時に緩やかな減衰を示し、このことは、ＬＨ分泌イベントが、試験の開始前に起こっていたことを示している。したがって、全ての対象が、異常に低い頻度のＬＨ分泌イベントを示した。２０１６年に試験を反復する際、試験対象（対象３、４、５）は再び無月経であり、ホルモン薬物療法なしでは、エストラジオールレベルは低いが検出可能であった。全ての試験は、２０１０年に観察されたものと同一の内在性ＬＨパターンを再現し、ＬＨ分泌イベントの頻度は低く、平均ＬＨ振幅は１．３±１．１ｍＩＵ／ｍＬであった（図８Ｂ）。
これらのベースライン試験時に、ＩＨＨ姉妹（対象２，３，４および５）は、ホルモン薬物療法なしで、無月経であり血清エストラジオールレベルは低いが検出可能であり、プロゲステロンレベルは低かった（表６、図７Ｂ）。ＩＨＨを有する全ての対象は、低頻度のＬＨ分泌イベントによって証明される、弱まっているが、組織化されたＧｎＲＨパルス発生部の根拠を有していた（低エストラジオール、低プロゲステロンによって特徴付けられる生理学的な卵胞期前期における比較のため、ＬＨ頻度７．０±１．８パルス／１２時間、ＬＨ振幅２．３±１．０ＩＵ／Ｌ［平均±２ＳＤ］）（３７、３８）。対象２、４および５において１つのパルスが、サンプリング間隔において観察された（７～８時間、平均ＬＨ振幅１．５±０．８ｍＩＵ／ｍＬ）（図７Ｂ）。対象３においては、試験の間パルスは全く観察されなかった。さらに、対象３、４および５のＬＨレベルは、サンプリング間隔の開始時に緩やかな減衰を示し、このことは、ＬＨ分泌イベントが、試験の開始前に起こっていたことを示している。したがって、全ての対象が、異常に低い頻度のＬＨ分泌イベントを示した。２０１６年に試験を反復する際、試験対象（対象３、４、５）は再び無月経であり、ホルモン薬物療法なしでは、エストラジオールレベルは低いが検出可能であった。全ての試験は、２０１０年に観察されたものと同一の内在性ＬＨパターンを再現し、ＬＨ分泌イベントの頻度は低く、平均ＬＨ振幅は１．３±１．１ｍＩＵ／ｍＬであった（図８Ｂ）。
【0126】
対照的に、対象１、ＴＡＣ３におけるヘテロ接合型の切断バリアントを有する健常姉妹は、月経サイクルの４日目において血液サンプリングを受けた（卵胞期前期；ＥＦＰ）。対象は、１２時間に１１のＬＨパルスを示し、平均ＬＨパルス振幅は、０．４６±０．２５ｍＩＵ／ｍＬであった（図７Ｃ）（健常な卵胞期前期の女性：頻度、７．０±１．８パルス／１２時間、振幅２．３±１．０ＩＵ／Ｌ［平均±２ＳＤ］）（１９、２０）。
【0127】
キスペプチンボーラス：ＮＫＢを有しないＩＨＨ個人はキスペプチンに応答する
全ての対象は、キスペプチンに応答し、ＬＨパルスを有する（図８Ｂ）。２人の試験対象は、３つのキスペプチンボーラスの投与を受け、６ボーラスの５つにおいて、キスペプチン後にＬＨパルスを示した。１つの例外は、内在性ＬＨピークの直後にキスペプチンが投与された場合に生じ、単一ピークの延長がもたらされた（図８Ｂ、対象５）。この応答性と一致して、全ての対象は、適切な下垂体プライミングを示し、これは、キスペプチン応答性を損ない得る下垂体欠損がないことを示している（ＧｎＲＨ投与後のＬＨパルス振幅、対象３：１．６ｍＩＵ／ｍＬ、対象４：５．１ｍＩＵ／ｍＬ、対象５：３．０ｍＩＵ／ｍＬ）。
全ての対象は、キスペプチンに応答し、ＬＨパルスを有する（図８Ｂ）。２人の試験対象は、３つのキスペプチンボーラスの投与を受け、６ボーラスの５つにおいて、キスペプチン後にＬＨパルスを示した。１つの例外は、内在性ＬＨピークの直後にキスペプチンが投与された場合に生じ、単一ピークの延長がもたらされた（図８Ｂ、対象５）。この応答性と一致して、全ての対象は、適切な下垂体プライミングを示し、これは、キスペプチン応答性を損ない得る下垂体欠損がないことを示している（ＧｎＲＨ投与後のＬＨパルス振幅、対象３：１．６ｍＩＵ／ｍＬ、対象４：５．１ｍＩＵ／ｍＬ、対象５：３．０ｍＩＵ／ｍＬ）。
【0128】
キスペプチン注入：拍動性ＬＨ分泌なし
対象３は、ｋｐ－１０注入（９．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／時間）を１２時間受け、ＬＨパルスは検出されなかった。注入の間、平均ＬＨの軽度の増加が見られた（ベースライン：０．４６±０．２４ｍＩＵ／ｍＬ；ｋｐ－１０注入：０．６３±０．０８ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０００１）（図８Ｂ＆９Ｂ）。平均ＦＳＨレベルはまた、ベースラインと比較して上昇した（ベースライン：１．９±０．２ｍＩＵ／ｍＬ；ｋｐ－１０注入：２．４±０．１ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．００１）。ｋｐ－１０注入後、対象３は、ＧｎＲＨのＩＶＢの投与を受け、これは、前日にベースライン試験において観察されたものと同等の振幅のＬＨパルスがもたらされた（ベースライン、１．６ｍＩＵ／ｍＬ、ｋｐ－１０注入後、２．５ｍＩＵ／ｍＬ）。
対象３は、ｋｐ－１０注入（９．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／時間）を１２時間受け、ＬＨパルスは検出されなかった。注入の間、平均ＬＨの軽度の増加が見られた（ベースライン：０．４６±０．２４ｍＩＵ／ｍＬ；ｋｐ－１０注入：０．６３±０．０８ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０００１）（図８Ｂ＆９Ｂ）。平均ＦＳＨレベルはまた、ベースラインと比較して上昇した（ベースライン：１．９±０．２ｍＩＵ／ｍＬ；ｋｐ－１０注入：２．４±０．１ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．００１）。ｋｐ－１０注入後、対象３は、ＧｎＲＨのＩＶＢの投与を受け、これは、前日にベースライン試験において観察されたものと同等の振幅のＬＨパルスがもたらされた（ベースライン、１．６ｍＩＵ／ｍＬ、ｋｐ－１０注入後、２．５ｍＩＵ／ｍＬ）。
【0129】
ナロキソン注入：ナロキソンによるダイノルフィンの遮断は、ＬＨ＆ＦＳＨ分泌およびＬＨパルス頻度を上昇させるが、キスペプチン誘導ＬＨパルスを増幅しない
対象４および５は、非選択的オピオイドアンタゴニスト、ＮＬＸならびに漸増ボーラスのキスペプチン（０．２４、０．７２、２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与を受け、ダイノルフィンシグナル伝達の遮断の、内在性およびキスペプチン刺激ＬＨ分泌パターンに対する影響を決定した。両方の試験は、ベースラインと比較して、ＮＬＸ注入の間の平均ＬＨレベルの上昇を示した（対象４－ベースライン：１．４４±０．７６ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：２．８２±０．５４ｍＩＵ／ｍＬ、ｐ＜０．００００１；対象５－ベースライン：０．６±０．２５ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：１．１±０．３７ｍＩＵ／ｍＬ、ｐ＜０．００００１、適合させたタイムポイントにわたる）（図８Ｂ、１０Ｂ）。ＮＬＸ注入のｏｎおよびｏｆｆのＬＨサンプリングが完了し、比較が可能になった試験対象、対象４について、ＬＨパルス頻度は、６時間に１つのパルス（図８Ｂ）から６時間に４つのパルス（図１０Ｂ）まで上昇した。平均ＦＳＨレベルもまた、ベースラインと比較して上昇した（対象４－ベースライン：３．７±０．３ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：５．０±０．９ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０１；対象５－ベースライン：３．３±０．３ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：５．１±０．１ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０００１）。ＬＨパルス振幅には一致する変化は見られなかった（対象４－ベースライン：２．５９ｍＩＵ／、ＮＬＸ：０．４５±０．２９ｍＩＵ／ｍＬ、対象５－ベースライン：０．８２ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：１．２２および１．３９ｍＩＵ／ｍＬ）。ＮＬＸ注入は、オピオイド緊張を阻害することによってダイノルフィンを遮断し、ＮＫＢシグナル伝達がないことによって、ＩＨＨを有する個人において、ゴナドトロピン分泌を上昇させ、ＬＨパルス頻度を改善する。
対象４および５は、非選択的オピオイドアンタゴニスト、ＮＬＸならびに漸増ボーラスのキスペプチン（０．２４、０．７２、２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与を受け、ダイノルフィンシグナル伝達の遮断の、内在性およびキスペプチン刺激ＬＨ分泌パターンに対する影響を決定した。両方の試験は、ベースラインと比較して、ＮＬＸ注入の間の平均ＬＨレベルの上昇を示した（対象４－ベースライン：１．４４±０．７６ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：２．８２±０．５４ｍＩＵ／ｍＬ、ｐ＜０．００００１；対象５－ベースライン：０．６±０．２５ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：１．１±０．３７ｍＩＵ／ｍＬ、ｐ＜０．００００１、適合させたタイムポイントにわたる）（図８Ｂ、１０Ｂ）。ＮＬＸ注入のｏｎおよびｏｆｆのＬＨサンプリングが完了し、比較が可能になった試験対象、対象４について、ＬＨパルス頻度は、６時間に１つのパルス（図８Ｂ）から６時間に４つのパルス（図１０Ｂ）まで上昇した。平均ＦＳＨレベルもまた、ベースラインと比較して上昇した（対象４－ベースライン：３．７±０．３ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：５．０±０．９ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０１；対象５－ベースライン：３．３±０．３ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：５．１±０．１ｍＩＵ／ｍＬ；ｐ＜０．０００１）。ＬＨパルス振幅には一致する変化は見られなかった（対象４－ベースライン：２．５９ｍＩＵ／、ＮＬＸ：０．４５±０．２９ｍＩＵ／ｍＬ、対象５－ベースライン：０．８２ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ：１．２２および１．３９ｍＩＵ／ｍＬ）。ＮＬＸ注入は、オピオイド緊張を阻害することによってダイノルフィンを遮断し、ＮＫＢシグナル伝達がないことによって、ＩＨＨを有する個人において、ゴナドトロピン分泌を上昇させ、ＬＨパルス頻度を改善する。
【0130】
対象４および５はまた、漸増ボーラスのｋｐ－１０（０．２４、０．７２、２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与を受け、ＬＨパルスが続き、再現結果がＮＬＸ ｏｆｆで見られた（図８Ｂ、１０Ｂ）。ｏｎまたはｏｆｆのＮＬＸに対するキスペプチン誘導ＬＨ応答の変化には有意な差はなく、明確な用量－応答関係性はなかったが、各用量における少数のボーラスが、かかる関係性を評価する能力を限定していた。
【0131】
キスペプチンボーラスは、思春期および成体のＷＴおよびＮＫＢ欠損（Ｔａｃ２ ＫＯ）マウスにおいてＬＨ放出を刺激する
ＩＨＨ患者における知見を実証するために、我々はＴａｃ２ ＫＯおよびＷＴの対照雌マウスにおいて試験を行った。ｋｐ－１０の辺縁投与は、年齢および遺伝子型に関わらず、全ての群においてＬＨの強い上昇を誘発した。興味深いことに、ＮＫＢを欠く、思春期のＴａｃ２ ＫＯ雌マウスは、対照の雌（２．６７±０．４８ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５；ｐ＜０．０１）よりも高い振幅のＬＨ放出を示した（５．２９±０．４３ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５）（図１１）。しかし、ＬＨは、Ｔａｃ２ ＫＯマウスにおいて（注射後５２±３．７２分、ｎ＝５）、ＷＴ対照（６８±３．７２分、ｎ＝５；ｐ＜０．０１）よりも速くベースラインに戻った。成体ＷＴマウスは、ｋｐ－１０に応答した予期されるＬＨパルスを示し、一方、ｋｐ－１０に応答したＴａｃ２ ＫＯマウスは、二相性の応答を示し、これはＬＨの２つの重複するピークを示す（図１０）。両方の成体群において、ＬＨ放出の誘導は、思春期マウス（思春期ＷＴ：注射後、６８±３．７４２分、ｎ＝５ ｖｓ 成体ＷＴ１４２．５±４．７８分、ｎ＝４、ｐ＜０．０００１；思春期Ｔａｃ２ ＫＯ：５２±３．７４２、ｎ＝５ ｖｓ 成体Ｔａｃ２ ＫＯ １５６．７±３．３３分、ｎ＝３、ｐ＝０．０７）よりも維持されていると考えられた。
ＩＨＨ患者における知見を実証するために、我々はＴａｃ２ ＫＯおよびＷＴの対照雌マウスにおいて試験を行った。ｋｐ－１０の辺縁投与は、年齢および遺伝子型に関わらず、全ての群においてＬＨの強い上昇を誘発した。興味深いことに、ＮＫＢを欠く、思春期のＴａｃ２ ＫＯ雌マウスは、対照の雌（２．６７±０．４８ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５；ｐ＜０．０１）よりも高い振幅のＬＨ放出を示した（５．２９±０．４３ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５）（図１１）。しかし、ＬＨは、Ｔａｃ２ ＫＯマウスにおいて（注射後５２±３．７２分、ｎ＝５）、ＷＴ対照（６８±３．７２分、ｎ＝５；ｐ＜０．０１）よりも速くベースラインに戻った。成体ＷＴマウスは、ｋｐ－１０に応答した予期されるＬＨパルスを示し、一方、ｋｐ－１０に応答したＴａｃ２ ＫＯマウスは、二相性の応答を示し、これはＬＨの２つの重複するピークを示す（図１０）。両方の成体群において、ＬＨ放出の誘導は、思春期マウス（思春期ＷＴ：注射後、６８±３．７４２分、ｎ＝５ ｖｓ 成体ＷＴ１４２．５±４．７８分、ｎ＝４、ｐ＜０．０００１；思春期Ｔａｃ２ ＫＯ：５２±３．７４２、ｎ＝５ ｖｓ 成体Ｔａｃ２ ＫＯ １５６．７±３．３３分、ｎ＝３、ｐ＝０．０７）よりも維持されていると考えられた。
【0132】
ナロキソンは成体ＯＶＸ ＷＴおよびＴａｃ２ ＫＯマウスにおける拍動性ＬＨ放出を増加させる
ＮＫＢの非存在下におけるオピエート性（ｏｐｉａｔｅｒｇｉｃ）（ダイノルフィン）のキスペプチンシグナル伝達に対する影響の役割を決定するために、我々は、ダイノルフィンを阻害する、ＮＬＸのＬＨ分泌に対する効果を試験した。ＮＬＸの５ｍｇ／ｋｇの辺縁投与は、投与の２０分以内に、ＷＴ（図１２Ａ～Ｃ）およびＴａｃ２ ＫＯの雌マウスの両方においてＬＨの上昇を誘導した（図１２Ｄ～Ｅ）（ＷＴ：ＮＬＸ前２０分、２．３７±０．５９、ｎ＝４ ｖｓ ＮＬＸ後２０分、４．３１±０．３２、ｎ＝４；ｐ＜０．０５．Ｔａｃ２ ＫＯ：ＮＬＸ前２０分、０．３１±０．０６、ｎ＝４ ｖｓ ＮＬＸ後２０分、１．２２±０．２９、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
ＮＫＢの非存在下におけるオピエート性（ｏｐｉａｔｅｒｇｉｃ）（ダイノルフィン）のキスペプチンシグナル伝達に対する影響の役割を決定するために、我々は、ダイノルフィンを阻害する、ＮＬＸのＬＨ分泌に対する効果を試験した。ＮＬＸの５ｍｇ／ｋｇの辺縁投与は、投与の２０分以内に、ＷＴ（図１２Ａ～Ｃ）およびＴａｃ２ ＫＯの雌マウスの両方においてＬＨの上昇を誘導した（図１２Ｄ～Ｅ）（ＷＴ：ＮＬＸ前２０分、２．３７±０．５９、ｎ＝４ ｖｓ ＮＬＸ後２０分、４．３１±０．３２、ｎ＝４；ｐ＜０．０５．Ｔａｃ２ ＫＯ：ＮＬＸ前２０分、０．３１±０．０６、ｎ＝４ ｖｓ ＮＬＸ後２０分、１．２２±０．２９、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【0133】
ＮＬＸ投与後、ＷＴマウスは、ＮＬＸ投与後の続くＬＨパルスの期間が増加して応答した（ＮＬＸ前：ＷＴ２５±２．６７分、ｎ＝３；Ｔａｃ２ ＫＯ ２３．３３±２．１０分、ｎ＝３、ｐ＝０．１３；ＮＬＸ後：ＷＴ：８３．３３±１２．０２分、ｎ＝３；Ｔａｃ２ ＫＯ：３０±５．７７分、ｎ＝３；ｐ＜０．０１）（図１２Ａ）。さらに、ＮＬＸ後のＬＨパルスの期間の増加は、ＷＴマウスにおける顕著なより長いパルス間の間隔を伴っていた（ＷＴパルス間間隔、ＮＬＸ前２５．３８±１．８３分、ＷＴパルス間間隔、ＮＬＸ後４６．６７±３．３３分、ｐ＜０．０００２）。
【0134】
Ｔａｃ２ ＫＯ動物は、ＯＶＸ対照よりも顕著に低下したＬＨベースラインおよびパルス数を示した（ＮＬＸ１２０分前において０－１ＬＨパルス）。ＮＬＸの投与は、全ての場合において、処置後２０分で生じた強いＬＨパルスを誘導し、ベースラインと比較して２倍の上昇に達したピークを有していた（ＮＬＸ前：０．３１±０．０６ｍＩＵ／ｍＬ、ＮＬＸ後：１．２±０．２８ｍＩＵ／ｍＬ、ｐ＜０．０２）。限られた数のＬＨパルスは、パルス間の間隔の解析を排除しており、データは、ＮＬＸが、ＬＨパルスの期間を上昇させなかったことを示している（ＮＬＸ前 Ｔａｃ２ ＫＯ ２３．３３±２．１０分、ｎ＝３、ＮＬＸ後：Ｔａｃ２ ＫＯ：３０±５．７７分、ｎ＝３、ｐ＞０．０５）（図１２Ｄ～Ｅ）。
【0135】
【表10-1】
【0136】
【表10-2】
【0137】
【表10-3】
【0138】
【表10-4】
【0139】
【表10-5】
【0140】
【表10-6】
【0141】
【表10-7】
【0142】
【表10-8】
【0143】
【表10-9】
【0144】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と関連して記載されているが、上述の記載は、例示を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは理解されるべきである。他の局面、利点および改変は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、その詳細な説明と関連して記載されているが、上述の記載は、例示を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは理解されるべきである。他の局面、利点および改変は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【配列表】
【国際調査報告】