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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(54)【発明の名称】水処理の方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A01N 25/00 20060101AFI20220728BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20220728BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20220728BHJP
A01N 37/06 20060101ALI20220728BHJP
A01N 25/02 20060101ALI20220728BHJP
A01N 33/20 20060101ALI20220728BHJP
A01N 37/34 20060101ALI20220728BHJP
A01N 43/50 20060101ALI20220728BHJP
C02F 1/50 20060101ALI20220728BHJP
C02F 1/76 20060101ALI20220728BHJP
【ＦＩ】
A01N25/00 101
A01P1/00
A01P3/00
A01N37/06
A01N25/02
A01N33/20 101
A01N37/34 101
A01N43/50 R
C02F1/50 510A
C02F1/50 510C
C02F1/50 520A
C02F1/50 520B
C02F1/50 520K
C02F1/50 520L
C02F1/50 532C
C02F1/50 532H
C02F1/50 540B
C02F1/50 540D
C02F1/50 540E
C02F1/50 550C
C02F1/50 550L
C02F1/50 560F
C02F1/50 560Z
C02F1/76 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570300
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2022-01-21
(86)【国際出願番号】 IL2020050591
(87)【国際公開番号】W WO2020240559
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/853,205
(32)【優先日】2019-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500165175
【氏名又は名称】ブローミン コンパウンズ リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】520456169
【氏名又は名称】ザ リサーチ ファウンデーション フォー ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】110001494
【氏名又は名称】前田・鈴木国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ロデンスキー， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ゾルコフ， チェン
(72)【発明者】
【氏名】デイヴィス， デビット ジー．
【テーマコード（参考）】
4D050
4H011
【Ｆターム（参考）】
4D050AA01
4D050AA08
4D050AA10
4D050AB06
4D050BB03
4D050BD03
4D050BD04
4D050BD08
4H011AA02
4H011BA01
4H011BA06
4H011BB04
4H011BB06
4H011BB09
4H011BC03
4H011BC06
4H011BC18
4H011DA13
4H011DF04
(57)【要約】
本発明は、１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を水中に添加することを含む、水中の微生物制御の方法を提供する。臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を含む液体濃縮物の形態の組成物も記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を水中に添加することを含む、水中の微生物制御の方法。
【請求項2】
前記微生物制御は、水と接触する表面上の浮遊性の細菌及び／又はバイオフィルム細菌を除去しようとすること、及び／又はバイオフィルム増殖しやすい表面上でのバイオフィルム形成を阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記臭素系殺生物剤は、非酸化性臭素系殺生物剤である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記非酸化性臭素系殺生物剤は、２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオール（ブロノポール）、及び２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記臭素系殺生物剤は、酸化性臭素系殺生物剤である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記酸化性臭素系殺生物剤は、１，３－ジハロ－５，５－ジアルキルヒダントインであり、ハロゲン原子の少なくとも１つは、臭素であり、アルキル基は、同じであっても異なってもよい、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記１，３－ジハロ－５，５－ジアルキルヒダントインは、１－ブロモ－３－クロロ－５，５－ジメチルヒダントイン、１－クロロ－３－ブロモ－５，５－ジメチルヒダントイン、１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルヒダントイン及び１－ブロモ－３－クロロ－メチルエチルヒダントイン、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記酸化性臭素系殺生物剤は、水中に活性臭素種を放出する、現場で酸化された臭化物源である、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記現場で酸化された臭化物源は、次亜塩素酸塩、塩素により、又は電気化学的に、現場で酸化されて活性型となり、被処理水系に添加される臭化ナトリウムと、
次亜塩素酸塩、塩素により、又は電気化学的に、現場で酸化されて活性型となり、被処理水系に添加されるＨＢｒと、
次亜塩素酸塩、塩素により、又は電気化学的に、現場で酸化されて活性型となり、被処理水系に添加される臭化アンモニウムと、
次亜塩素酸塩、塩素により、又は電気化学的に、現場で反応してブロモ尿素活性型となり、被処理水系に添加されるＨＢｒおよび尿素の溶液とからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記臭素系殺生物剤の有効な殺菌剤投与量は、１～１００ｐｐｍであり、シス－２－デセン酸の増強誘導量は、０．００５～５ｐｐｍである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ガスクロマトグラフィーで測定した純度が９５％未満の低純度ＣＤＡグレードを水中に添加する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
複数種の供給溶液を使用して、微生物が寄生した表面と接触する工業用水流に前記臭素系殺生物剤及びＣＤＡを供給することにより、前記臭素系殺生物剤及び前記ＣＤＡを連続的又は同時に水中に添加する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
単一の供給溶液を使用して、微生物が寄生した表面と接触する工業用水流に前記臭素系殺生物剤及びＣＤＡを供給することにより、前記臭素系殺生物剤及び前記ＣＤＡを同時に水中に添加する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記臭素系殺生物剤は、非酸化性臭素系殺生物剤であり、前記臭素系殺生物剤及び前記ＣＤＡは、単一の供給溶液を使用して前記工業用水流に供給する液体濃縮物に配合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
有効な殺菌剤投与量の前記臭素系殺生物剤と増強誘導量の前記シス－２－デセン酸を水中に添加することによってバイオフィルム細菌を除去しようとすること、同じ投与量の前記臭素系殺生物剤を単独で作用させた場合に達成される減少よりも少なくとも２ｌｏｇ単位低いバイオフィルムの減少を達成することを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を含む、組成物。
【請求項17】
請求項１６に記載の組成物であって、前記組成物は、担体中に１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を含む液体濃縮物であり、前記担体は、水、水混和性溶媒又はそれらの混合物、ならびに任意選択で共溶媒、不凍液及び安定剤のうち１つ以上を含む、組成物。
【請求項18】
前記液体濃縮物が、１０～５０重量％の非酸化性臭素系殺生物剤、０．０５～１重量％のシス－２－デセン酸又はその塩、ならびに水、グリコール共溶媒及び抗酸化剤を含む担体を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記液体濃縮物が、１０～３５重量％の２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオールと、
０．０５～０．５％のシス－２－デセン酸と、
５．０～８０．０％の水と、
１０～７０．０％の、エチレングリコール、プロピレングリコール及びジプロピレングリコールモノメチルエーテルからなる群から選択されるグリコールと、
０．０５～０．５％の抗酸化剤と、を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記液体濃縮物が、１５～２５重量％の２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミドと、
０．０５～０．５％のシス－２－デセン酸と、
１０～６０．０％の水と、
４０～６０．０％のポリエチレングリコールと、
０．０５～０．５％の抗酸化剤と、を含む、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は水の微生物制御に関し、例えば、臭素系殺生物剤と、殺生物剤の作用を増強することが見出された補助剤とを組み合わせて用いる、浮遊性及びバイオフィルム細菌の除去に関する。
【背景技術】
【0002】
工業用水処理における臭素の使用は、十分に確立されており、現在、さまざまな臭素系殺生物剤が市販品として入手可能である。殺生物剤の使用濃度と供給頻度は、水の種類、微生物負荷、有機負荷、検討中の特定の殺生物剤、投与方法などによって決定される。
【0003】
本発明者の一人は、緑膿菌によって産生されるシス－２－デセン酸により、緑膿菌、他のグラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌が生理学的に媒介される分散反応を受けるように誘導することができ、その結果、バイオフィルムとして知られる表面に形成される微生物の集合体および共同体が分解されることを報告している（国際公開第２００８／１４３８８９号及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１９１：１３９３－１４０３（２００９））。
【0004】
バイオフィルムの制御は、水処理プログラムの重要な一面を構成する。米国特許出願公開第２００９／０１７８５８７号は、緑膿菌のバイオフィルムの制御における臭素系殺生物剤の特性について研究している。米国特許出願公開第２００９／０１７８５８７号は、バイオ分散剤として作用する界面活性剤を使用して処理の効率を高めることも提案しているが、このアプローチを説明するための実験データを提供していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００８／１４３８８９号
【特許文献2】米国特許出願公開第２００９／０１７８５８７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、水系及び水と接触する表面上のバイオフィルム及び浮遊性の細菌の処理における臭素含有殺生物剤の補助剤としてのシス－２－デセン酸の使用について記載している。実験モデルにおいて本発明を支持して実施された実験研究によって、シス－２－デセン酸と許容可能な使用濃度の臭素含有殺生物剤とを組み合わせると、殺生物剤のみで処理した場合と比較して、工業用水及び天然水に通常見られる純粋培養及び混合培養の両方で、細菌の死滅が顕著に増強されることが示されている。さらに、殺生物剤化合物によるシス－２－デセン酸の活性は、臭素化殺生物剤の効力を高め、使用される殺生物剤の有効量を減少させることができる。
【0007】
臭素ベースの水処理にシス－２－デセン酸（ＣＤＡ）を組み込むと、臭素化殺生物剤の単独作用と比較して、バイオフィルム制御の効果が大幅に向上するが、塩素ベースの水処理では効果が小さいことも注目に値する。例えば、臭素／ＣＤＡの組み合わせ処理により、同等の条件下で、塩素／ＣＤＡ処理と比較して、バイオフィルム細菌数の約２．５ｌｏｇ単位の減少を達成することが以下に示されている。
【0008】
したがって、本発明は、主に、例えば、水と接触する表面上の浮遊性及び／又はバイオフィルム細菌、藻類、及び真菌の減少を達成するために１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸（又はその塩）を水中に添加することを含む、水中の微生物制御の方法に関する。
【0009】
ＣＤＡは、工業用水の処理に現在使用されている臭素供給システムに簡単に組み込むことができる。例えば、臭素系殺生物剤及びＣＤＡは、連続的に又はバッチモードで水流に連続的に又は同時に注入される各種供給溶液を使用して、微生物が寄生した表面と接触する工業用水流に送達することができ、同時注入は、単一の添加剤溶液を生成するための個々の溶液の予備混合を含んでよい（すなわち、ＣＤＡ及び殺生物剤溶液は、水流への添加の前又は直前に混合することができる）。また、以下に説明するように、殺生物剤が単一成分として供給されるかどうかによっても、選択される供給方法が異なる。
【0010】
複数の添加剤供給の代わりに単一の添加剤供給を使用した水処理を可能にするために、室温での保存安定性に優れた臭素系殺生物剤とＣＤＡの適切な比率の組み合わせを含む液体濃縮物を調製した。
【0011】
したがって、本発明の別の態様は、水を含む液体担体中の１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸、水混和性溶媒又はそれらの混合物、ならびに任意選択で、共溶媒、不凍液及び安定剤、例えば、抗酸化剤などの１つ以上の添加剤を含む組成物（例えば、液体濃縮物）である。顆粒、フレーク及び錠剤などの、殺生物剤及びＣＤＡを含む固体組成物もまた、本発明によって意図される。
【0012】
本発明での使用に適した臭素系殺生物剤は、異なる形態、すなわち、固体（粉末及び圧縮形態、例えば、顆粒及び錠剤など）及び液体（例えば、処理すべき水系に容易に供給できる水性濃縮物又は他の流動性配合物）で、市販品を入手することができる。臭素系殺生物剤は、一般に、
Ａ）非酸化性殺生物剤と、
Ｂ）酸化性殺生物剤の２つのクラスに分類される。
Ａ）非酸化性殺生物剤と、
Ｂ）酸化性殺生物剤の２つのクラスに分類される。
【0013】
非酸化性殺生物剤は、Ａ１～Ａ３の群から選択され得る。
【0014】
Ａ１：２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオール（ブロノポール）、ここで、ブロノポールの合成は、例えば、国際公開第２００９／１０７１３３号に記載されている。生成物は、粉末形態又は水溶液で（例えば、ＩＣＬ－ＩＰから）入手可能であり、有効成分としてのその通常の投与量レベルが、１～１０００ｐｐｍの範囲（単独で使用される場合、例えば、１～３００ｐｐｍ）にある。
【0015】
Ａ２：２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミド、ここで、ＤＢＮＰＡの合成は、例えば、米国特許第４３２８１７１号に記載されている。ＤＢＮＰＡの水性濃縮物及び圧縮形態は、それぞれ米国特許第５６２７１３５号及び米国特許第７５２４８８４号に記載されている。ＤＢＮＰＡは、（ＩＣＬ－ＩＰなどから）市販されている。単独で使用される場合、有効成分としての投与率は、１～１０００ｐｐｍの範囲（例えば、１～２００ｐｐｍ）にある。
【0016】
Ａ３：非酸化性臭素系殺生物剤の他の例には、２－ブロモ－４－ヒドロキシアセトフェノン（ＢＨＡＰ）、ビス－ブロモアセチルブテン（ＢＢＡＢ）及びβ－ブロモ－β－ニトロ－スチレン（ＢＮＳ）が含まれる。
【0017】
酸化性臭素系殺生物剤は、溶解／解離によって、又はＢｒ-を元素臭素／Ｂｒ+に変換する臭化物酸化（酸化は、一般に、化学酸化剤を使用して達成されるが、電解的に生成された臭素の被処理水系への供給も、ＣＤＡと併せて本明細書に含まれる）によって、水中に活性臭素種（例えば、次亜臭素酸／次亜臭素酸塩）を放出する化合物である。本明細書に記載の酸化的殺生物剤の投与量は、一般に、滴定プロセッサー（Ｔｉｔｒｉｎｏ ８４８ ｐｌｕｓ）を使用したヨウ素滴定又はＳＱ－３００分光光度計（Ｍｅｒｃｋ ＳＱ－３００）を使用したＤＰＤ（Ｄｉｅｔｈｙｌ－ｐ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ Ｄｉａｍｉｎｅ）試薬法によって決定できる総ＣＩ2として表される。酸化性臭素系殺生物剤は、Ｂ１～Ｂ３の群から選択され得る。
【0018】
Ｂ１：１，３－ジハロ－５，５－ジアルキルヒダントインなどのＮ－臭素化アミド及びイミド、ここで、ハロゲン原子の少なくとも１つは、臭素であり（アルキル基は、同じであっても異なってもよい）、このクラスに属する商業的に重要な殺生物剤は、１－ブロモ－３－クロロ－５，５－ジメチルヒダントイン（ＢＣＤＭＨと略称する）と、１－クロロ－３－ブロモ－５，５－ジメチルヒダントインと、１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルヒダントイン（ＤＢＤＭＨ）と、１－ブロモ－３－クロロ－メチルエチルヒダントイン（ＢＣＭＥＨ）および１－クロロ－３－ブロモ－メチルエチルヒダントイン又はそれらの混合物など環の５位に２つの異なるアルキル基を含む「混合」アルキル化合物とである。１，３－ジハロ－５，５－ジメチルヒダントインを合成する方法は、例えば、米国特許第４７４５１８９号に見出すことができる。１，３－ジハロ－５，５－ジアルキルヒダントインの許容投与率は、総ＣＩ2として１～５０ｐｐｍである。
【0019】
Ｂ２：無機臭化物源、すなわち臭化物塩及び臭化水素酸は、酸化（例えば、次亜塩素酸塩又は塩素ガスを用いた化学的酸化、及び電気化学的酸化、すなわち陽極に生成された臭素）によって水中に臭素種を放出する。商業的に重要な生成物は、活性化臭化ナトリウム（現場で調製される臭化ナトリウム及び次亜塩素酸ナトリウムの水溶液からなり、直ちに被処理水系に送達される）と、活性化臭化アンモニウム（殺生物剤は、臭化アンモニウムを酸化剤と反応させることにより現場で調製される）と、次亜塩素酸ナトリウムと現場で反応するＨＢｒ及び尿素（本明細書ではブロモ尿素と呼ばれることもある）の溶液（例えば、ＩＣＬ－ＩＰからのＨＢｒ及び尿素で構成されるＢａｃｔｅｂｒｏｍ（登録商標）溶液）と、例えば、錠剤の形で直接水系に供給され、現場で反応して活性臭素種を生成するように処理される臭化物／塩素化合物の乾燥混合物と、を含む。なお、臭化ナトリウム、臭化水素酸、臭化アンモニウム、ＨＢｒ（又はＮａＢｒ）などの上記臭化物源と尿素溶液は、現場で化学的に（例えば、次亜塩素酸塩又は塩素ガスで）又は電気化学的に酸化され得る。
【0020】
Ｂ３：酸化性臭素系殺生物剤の他の例には、例えば、国際公開第９９／０６３２０号（安定化されたアルカリ／アルカリ土類金属次亜臭素酸塩水溶液（例えば、臭化物源としてＮａＢｒを使用する））又は国際公開第０３／０９３１７１号に記載されているように、ＩＣＬ－ＩＰからＢｒｏｍｏｓｏｌ（登録商標）として入手可能な、スルファミン酸安定化臭素系殺生物剤が含まれる。塩化臭素及びその安定化形態（米国特許第６０６８８６１号を参照）は、水性濃縮物として市販品を入手可能である。
【0021】
シス－２－デセン酸に目を向けると、該シス－２－デセン酸は、エタノールなどの適切な溶媒に溶解した純油として使用できる。高純度ＣＤＡ、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による純度≧９５％は、ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ社（英国バークシャー州コンプトン）及びＣｈｅｍｏｄｅｘ社（スイス、ザンクトガレン）などのさまざまな供給元から市販されている。しかしながら、以下に報告する実験研究は、より低い純度、例えば、ＧＣによる５０％～９５％の純油、例えば、８０～９３％、例えば、８９～９１％（すなわち、～９０％）のＣＤＡを使用して、臭素ベースの水処理の十分な増強を達成できることを示している。＜９５％（ガスクロマトグラフィー、ＧＣによる）の純粋なＣＤＡは、本明細書では「低純度ＣＤＡグレード」と呼ばれる。低純度ＣＤＡグレードを利用すれば経済的に有利であることが理解され得る。「純粋なＣＤＡ」という用語は、９５％を超える、例えば、ＧＣによって検出された９７％以上の純度レベルを有することを特徴とするＣＤＡを指す。
【0022】
任意の所望の純度レベルのＣＤＡは、米国特許第８７４８４８６号に記載されている合成経路を介して、２－デカノンＣＨ3－（ＣＨ2）7－Ｃ（０）－ＣＨ3をハロゲン化して１，３－ジハライドケトンを生成し（例えば、元素臭素と反応して１，３－ジブロモ－２－デカノンを生成し）、続いて水酸化ナトリウム又は水酸化リチウムによって生成されたアルカリ性環境での脱ハロゲン化により、ファヴォルスキー転位と同時に隣接する炭素－炭素二重結合を介して末端カルボン酸基を生成することによって得ることができる。そして、反応混合物を、従来の技術によって後処理して、本発明での使用に適した純度レベル、例えば、（ＧＣによる）８５～９７％のＣＤＡを回収することができる。
【0023】
臭素／ＣＤＡの組み合わせは、さまざまな臭素系殺生物剤の幅広い濃度範囲にわたる実験モデルにおけるバイオフィルムに対して、驚くほど効果的であることが証明されている。組み合わせ処理に対して測定されたバイオフィルム関連の細菌数は、単独で作用する殺生物剤に対して測定された比較値よりも約１～５ｌｏｇ単位低くなる。「増強」という用語は、殺生物剤が単独で作用する処理と、ＣＤＡ（以下に報告されている研究で示されているように、ＣＤＡ自体は細菌数を減少させず、特に、ＣＤＡのみでは、広い濃度範囲で、３０００ｎＭを超える濃度でも、殺生物作用を示すことはできない）と組み合わせて作用する処理との細菌数の差を示すために用いられる。
【0024】
いくつかの選択された臭素系殺生物剤を、単独で使用する場合、及び異なる純度グレードのＣＤＡと組み合わせて使用する場合の特性を表１に示す。結果として、３日齢の緑膿菌バイオフィルム又は混合細菌によって形成されたバイオフィルムに対して、短い接触時間で臭素／ＣＤＡの効果が現れた。ＣＤＡとの接触時間を１時間、続いて臭素系殺生物剤との接触時間を１時間とし、投与量レベルはそれぞれ３１０ｎＭと５～２０ｐｐｍとした。
【0025】
【表1】
【0026】
以下に報告する別のテストでは、１つの主要な非酸化性臭素殺生物剤（ブロノポール）とＣＤＡの同時適用は、１０ｐｐｍブロノポール／３１０ｎＭのＣＤＡの処理レベルで２４時間の接触時間後に、緑膿菌バイオフィルムを根絶するのに効果的であることが証明された。結果を表２に示す。
【0027】
【表2】
**２時間の接触時間
【0028】
以下に報告する別の主な一連の結果として、少量のＣＤＡの添加が、臭素系殺生物剤の投与量レベルのかなりの減少を相殺し、それによって臭素系殺生物剤の作業可能な濃度範囲を拡大できることが示される。例えば、ＣＤＡを使用して、１つの主要な酸化性殺生物剤（ブロモ尿素）は、２．５ｐｐｍという低い投与量レベルで合理的なバイオフィルム制御を実現する（この投与量レベルで単独で作用した場合、殺生物剤は有用な効果を発揮することができない）。添加されたＣＤＡによって誘導される増強は、約４ｌｏｇ単位である。同じ殺生物剤は、３１０ｎＭのＣＤＡで５ｐｐｍの投与量レベルでバイオフィルムを根絶した。結果を表３にまとめる。
【0029】
【表3】
【0030】
上記を考慮して、臭素ベースの水処理は、ＣＤＡの添加により、多くの点で利益を得ることができる。
【0031】
１）シス－２－デセン酸は、水系の生物付着を処理するために通常使用される濃度の範囲内で、臭素含有殺生物剤の存在下で生物活性があることが示されているため、このプログラムによる通常の殺生物剤投与量レベル及び投与頻度で、つまり殺生物剤の適用率を変えることなく、ＣＤＡを臭素ベースの水処理プログラムに直接組み込み、定期的又は継続的に（殺生物剤の水への供給前、供給時、又は供給後に）バイオフィルムと接触する水流にＣＤＡを注入することにより、バイオフィルム制御の改善を達成し、又は場合によっては特に非常に望ましくないバイオフィルム形成の徴候に対して、迅速な制御を達成する。
【0032】
したがって、本発明の別の態様に係る水中の微生物制御の方法は、有効な殺菌剤量の臭素系殺生物剤と増強誘導量のシス－２－デセン酸を水中に添加して、単独で作用する殺生物剤の同じ投与量で達成される減少よりも少なくとも２ｌｏｇ単位（例えば、少なくとも３ｌｏｇ単位）低い、例えば＜１０5ＣＦＵ／ｃｍ2、例えば、＜１０3ＣＦＵ／ｃｍ2、好ましくは＜１０2ＣＦＵ／ｃｍ2までのバイオフィルムの減少、又は実質的なバイオフィルムの根絶、つまり＜１０1ＣＦＵ／ｃｍ2のバイオフィルムの減少を達成することによって、水と接触している表面上のバイオフィルム細菌を除去しようとすること、及び／又はそのような形成を起こしやすい表面上のバイオフィルム形成を阻害することを含む。
【0033】
臭素系殺生物剤の有効な殺菌剤量は、０．１～１０００、例えば、活性殺生物剤として０．１～３００ｐｐｍ、例えば、０．５～１００ｐｐｍであり、ＣＤＡの増強誘導量は、１ｎＭ～３０ｍＭである。投与量レベルは、殺生物剤の特性及び使用目的などの要因によって大きく異なる可能性があることに留意されたい。しかし、一般に、水流中のｗ／ｗとしての殺生物剤：ＣＤＡの有効な投与比は、２０：１～５０００：１、好ましくは１００：１～３０００：１の範囲で変化し得る。ＣＤＡの増強誘導量は、対象となるバイオフィルムの減少を達成するために、使用場所での試行錯誤によって決定できる。
【0034】
例えば、増強誘導量のＣＤＡは、０．００１～５ｐｐｍ、例えば、０．００５～５ｐｐｍ、例えば、０．０１～１ｐｐｍであってよい。以下に示すように、０．００５～０．５ｐｐｍの範囲（約３０～３０００ｎＭのＣＤＡに対応）で良好な結果が観察された。
【0035】
２）シス－２－デセン酸が、臭素系殺生物剤の投与量の減少を相殺し、少量の殺生物剤を効果的に使用し、高用量処理に匹敵するバイオフィルム制御を達成することを可能にするため、シス－２－デセン酸は、殺生物剤の投与量レベル及び／又は殺生物剤の投与頻度を減らすことにより、プログラム処理を変更することができる。例えば、水系の残留臭素を追跡し、残留臭素値が所定の閾値を下回ったら、ＣＤＡを注入して、残留臭素の少ない水系の維持をサポートし、バイオフィルム形成を阻害することができる。すなわち、活性殺生物剤が水系に存在する期間中、常に水サンプル中の残留殺生物剤の活性を高める。
【0036】
したがって、本発明の別の態様は、水と接触する表面上のバイオフィルム細菌を除去しようとするために、及び／又はそのような形成を起こしやすい表面上のバイオフィルム形成を阻害するために、水中に臭素を供給することを含む工業用水処理の方法であり、臭素の低投与レベルへの切り替えを水流へのＣＤＡの添加と共に行うように、処理中に臭素の適用率を変化させる。
【0037】
本発明は、特に、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、バチルスマイコイデス、カンジダアルビカンス、アスペルギルスニガー、及び工業用水又は環境水源に由来する混合種共同体で増殖する微生物の組み合わせに対する微生物制御を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【発明を実施するための形態】
【0039】
図１は、臭素系殺生物剤及びＣＤＡを工業用水系に供給する１つの簡便な方法を概略的に示したものである。バイオフィルムの表面又はバイオフィルムが形成されやすい表面と接触する水流は、数字（１）で示される。「工業用水」という用語は、例えば再循環及び貫流式冷却システム、冷却塔、パルプ及び製紙工場システム、膜、バイオディーゼル及びディーゼルを含む石油及びガス用途、浮体式生産貯蔵及び積出し（ＦＰＳＯ）システム、硫酸塩還元ユニット（ＳＲＵ）、製鉄所、砂糖及びエタノール生産、乳製品の生産、プールとスパ、配水システム、灌漑システム、エアウォッシャー、蒸発凝縮器、洗浄システム、醸造所の低温殺菌装置、装飾的噴水システム、及び油回収用水注入などの、臭素系殺生物剤で処理可能な水利産業用の水を示すために用いられる。
【0040】
図１に示す特定の設計では、殺生物剤とＣＤＡはそれぞれタンク（２）と（３）に別々に保持され、工業用水流への供給は２つの投与ポンプ（２ｐと３ｐ）を使用して行われることが見られる。この設計により、２つの活性成分を連続的又は同時に適用できる。
【0041】
図１に示す方法によく適合する殺生物剤は、単一のポンプ輸送可能な製剤として適用される殺生物剤、例えば、濃縮ブロノポール及びＤＢＮＰＡ溶液（例えば、５～５０重量％の濃縮物）、ならびに臭素又は次亜臭素酸塩の安定化溶液（例えば、スルファミン酸安定化臭素系殺生物剤）のような保存安定性のある液体製剤として市販品を入手可能な非酸化性殺生物剤である。
【0042】
図１に示す設計は、プロセスに第３の供給システムを設置することにより（つまり、１つの投与ポンプはＣＤＡの供給専用であり、２つの投与ポンプは殺生物剤の個々の成分（例えば、臭化物源と酸化剤）に使用される）、使用直前に臭化物源を酸化することにより、現場で調製された次亜臭素酸塩系の殺生物性溶液（これらの溶液は、次亜臭素酸塩が不安定であるため、すぐに適用しなければならない）の使用を可能にするように変更できる。
【0043】
臭素系殺生物剤が顆粒又は錠剤などの固体形態で適用される水処理へのＣＤＡの組み込み（侵食フィーダーを介して流入水ラインに供給）は、投与ポンプを使用してＣＤＡ溶液を水ライン又は主流からフィーダーに迂回させる補助水流に注入し、添加された固形物を溶解することによって達成できる。
【0044】
殺生物剤とＣＤＡ溶液は、処理プログラムに従って設定されたタイマーによって制御される計量ポンプ（それぞれ２ｐと３ｐ）を使用して投入される。殺生物剤及びＣＤＡ供給溶液を水流（１）に直接注入してよいが、混合チャンバー（図示せず）内で２つの個別の溶液を予備混合し、該混合溶液を水流に供給して、処理中の２つの成分の同時適用に基づく処理プログラムを可能にする。処理をより適切に制御するために、監視及び上流混合（４）装置、すなわち、ハロゲン監視装置、酸化還元電位（ＯＲＰ）、ｐＨセンサ、及びオンライン静的ミキサーが含まれる。
【0045】
正確な設計に関係なく、別途に供給されるＣＤＡは、必要に応じて界面活性剤及び安定剤の存在下で、単独で適用するか、又は４個までの炭素を含有する脂肪族アルコール、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリコール及びポリエチレングリコール、アセトニトリルなどの水混和性溶媒又は溶媒の混合物に溶解して適用することができる。
【0046】
操作中、殺生物剤を適用する前に、シス－２－デセン酸を２０分から２４時間以上注入することにより、シス－２－デセン酸による連続処理を行うことができる。活性殺生物剤が水系に存在する期間中いつでも、水サンプル中の残留殺生物剤の活性を高めるために、殺生物剤の適用後にシス－２－デセン酸を添加することもできる。
【0047】
本発明の方法は、図１に示すように、必ずしも複数回の供給を必要としない。ＣＤＡは、酸化性殺生物剤（無機臭化物源）の前駆体、スルファミン酸で安定化された臭素系殺生物剤、又は液体濃縮物に配合された非酸化性殺生物剤のいずれかと互換性があること、及び適切な安定剤、特に抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエンＢＨＴ）の存在下で、そのような液体濃縮物は、殺生物剤又はＣＤＡのいずれかの分解に対して、長期間の保存期間にわたって室温で安定したままであることがわかる。加速テストでも許容できる安定性が示される。このような液体濃縮物は、適切な供給システムを使用して工業用水系に投与することができ、殺生物剤／ＣＤＡの同時処理プログラムを好適に行うことができる。したがって、本発明はまた、単一の供給溶液を使用して、微生物が寄生した表面と接触する工業用水流に臭素系殺生物剤及びＣＤＡを供給することにより、殺生物剤及びＣＤＡを同時に水中に添加する方法を提供する。したがって、本発明は、１つ以上の臭素系殺生物剤及びシス－２－デセン酸又はその塩を含む組成物（例えば、上記方法で使用される）に関する。
【0048】
例えば、非酸化性臭素系殺生物剤とＣＤＡは、単一の供給溶液を使用して工業用水流に供給される液体濃縮物に配合される。
【0049】
本発明の液体濃縮物は、
非酸化性臭素系殺生物剤とシス－２－デセン酸（又はその塩）の適切な比率の混合物であって、工業用水流で希釈すると、２つの活性成分が有効な比率、例えば、１０００：１～５０：１、好ましくは５００：１～５０：１、例えば、２５０：１～５０：１の重量比で適用されるように、例えば、液体濃縮物において、（液体濃縮物の総重量に基づく重量で）殺生物剤の濃度が、２～５０％、好ましくは１０～５０％であり、シス－２－デセン酸の濃度が、０．０５～１％、好ましくは０．１～０．５％である、混合物と、
水、水混和性溶媒又はそれらの混合物（すなわち、水のみ、有機溶媒のみ、又は水性／有機溶媒系）、ならびに任意選択で、１つ以上の共溶媒（例えば、非酸化性臭素系殺生物剤が高い安定性及び溶解性を示すグリコール）、不凍液及び安定剤（例えば、抗酸化剤）を含む担体と、を含む。
非酸化性臭素系殺生物剤とシス－２－デセン酸（又はその塩）の適切な比率の混合物であって、工業用水流で希釈すると、２つの活性成分が有効な比率、例えば、１０００：１～５０：１、好ましくは５００：１～５０：１、例えば、２５０：１～５０：１の重量比で適用されるように、例えば、液体濃縮物において、（液体濃縮物の総重量に基づく重量で）殺生物剤の濃度が、２～５０％、好ましくは１０～５０％であり、シス－２－デセン酸の濃度が、０．０５～１％、好ましくは０．１～０．５％である、混合物と、
水、水混和性溶媒又はそれらの混合物（すなわち、水のみ、有機溶媒のみ、又は水性／有機溶媒系）、ならびに任意選択で、１つ以上の共溶媒（例えば、非酸化性臭素系殺生物剤が高い安定性及び溶解性を示すグリコール）、不凍液及び安定剤（例えば、抗酸化剤）を含む担体と、を含む。
【0050】
本発明によって提供される１つの好ましい室温保存安定性液体濃縮物は、
２．０～４０．０％（例えば、１０～３５％）の２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオールと、０．０５～０．５％（例えば、０．１～０．３％）のシス－２－デセン酸と、
５．０～８０．０％（例えば、１０～３０％）の水と、
エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルなどの１０～７０．０％のグリコールと、
０．０５～０．５％の抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）と、を含む。
２．０～４０．０％（例えば、１０～３５％）の２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオールと、０．０５～０．５％（例えば、０．１～０．３％）のシス－２－デセン酸と、
５．０～８０．０％（例えば、１０～３０％）の水と、
エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルなどの１０～７０．０％のグリコールと、
０．０５～０．５％の抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）と、を含む。
【0051】
本発明によって提供される別の好ましい室温保存安定性液体濃縮物は、
５．０～５０．０％（例えば、１５～２５％）の２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミドと、
０．０５～０．５％（例えば、０．１～０．３％）のシス－２－デセン酸と、
１０～６０．０％（例えば、１０～２０％）の水と、
４０～６０．０％のグリコール（平均分子量２００のポリエチレングリコールなど）と、
０．０５～０．５％の抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）と、を含む。
５．０～５０．０％（例えば、１５～２５％）の２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミドと、
０．０５～０．５％（例えば、０．１～０．３％）のシス－２－デセン酸と、
１０～６０．０％（例えば、１０～２０％）の水と、
４０～６０．０％のグリコール（平均分子量２００のポリエチレングリコールなど）と、
０．０５～０．５％の抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン）と、を含む。
【0052】
濃縮物は、シス－２－デセン酸（又はその塩）、固体形態の非酸化性臭素系殺生物剤、グリコール、水、及び安定剤を室温で撹拌しながら組み合わせて透明な溶液を得ることによって容易に調製される。
【実施例】
【0053】
材料
実験研究で使用した材料と試薬を表４に示す。
実験研究で使用した材料と試薬を表４に示す。
【0054】
【表4】
【0055】
方法
ＧＣ測定は、ＡＧＩＬＥＮＴ ＨＰ－５ １９０９１Ｊ－４１３ ３０ｍ＊０．３２ｍｍ＊０．２５ミクロンで行った。
方法、５０℃／／２'／／１０℃／ｍｉｎ／／２８０℃／／５℃／ｍｉｎ／／３００℃／２'。
ＧＣ測定は、ＡＧＩＬＥＮＴ ＨＰ－５ １９０９１Ｊ－４１３ ３０ｍ＊０．３２ｍｍ＊０．２５ミクロンで行った。
方法、５０℃／／２'／／１０℃／ｍｉｎ／／２８０℃／／５℃／ｍｉｎ／／３００℃／２'。
【0056】
調製１
ＨＢｒ／尿素溶液の活性化による殺生物剤の調製
原液１－２４１．０６ｇの蒸留水で希釈したＩＣＬ－ＩＰからの８．９４ｇのＢａｃｔｅｂｒｏｍ（登録商標）（ＨＢｒ：尿素溶液）。
原液２－２２６．４２ｇの蒸留水で希釈した１０．６％ｗ／ｗの２３．５８ｇのＮａＯＣｌによって調製された約１％のＮａＯＣｌ。
ＨＢｒ／尿素溶液の活性化による殺生物剤の調製
原液１－２４１．０６ｇの蒸留水で希釈したＩＣＬ－ＩＰからの８．９４ｇのＢａｃｔｅｂｒｏｍ（登録商標）（ＨＢｒ：尿素溶液）。
原液２－２２６．４２ｇの蒸留水で希釈した１０．６％ｗ／ｗの２３．５８ｇのＮａＯＣｌによって調製された約１％のＮａＯＣｌ。
【0057】
上記希釈されたＢａｃｔｅｂｒｏｍ（登録商標）溶液（原液１）に、原液２（２５０．００ｇの１．０％ＮａＯＣｌ）を撹拌しながら徐々に添加し、総重量５００．００ｇの活性殺生物剤（オレンジ色溶液）を得た。滴定プロセッサー（Ｔｉｔｒｉｎｏ ８４８ ｐｌｕｓ）を使用したヨウ素滴定によって測定される予想殺生物剤濃度：Ｃｌ2として約０．５％（Ｃｌ2として約５０００ ｐｐｍ）とする。各実験における所望の殺生物剤濃度は、蒸留水で希釈して得た。
【0058】
調製２
臭化アンモニウムの活性化による殺生物剤の調製
９７５μｌの１０．２５重量％ａｑ．ＮａＯＣｌを、メスフラスコで、蒸留水で１００ｍＬに希釈した。Ｃｌ2濃度は、滴定プロセッサー（Ｔｉｔｒｉｎｏ ８４８ ｐｌｕｓ）を使用したヨウ素滴定によって決定されたＣｌ2として約１０００ｐｐｍとした。
臭化アンモニウムの活性化による殺生物剤の調製
９７５μｌの１０．２５重量％ａｑ．ＮａＯＣｌを、メスフラスコで、蒸留水で１００ｍＬに希釈した。Ｃｌ2濃度は、滴定プロセッサー（Ｔｉｔｒｉｎｏ ８４８ ｐｌｕｓ）を使用したヨウ素滴定によって決定されたＣｌ2として約１０００ｐｐｍとした。
【0059】
２１３ｍｇのＮＨ4Ｂｒをメスフラスコで、蒸留水で１００ｍＬに希釈した。
【0060】
等量の５ｍＬを次のように混合する。周囲温度でＮＨ4Ｂｒ溶液の混合溶液（マグネチックスターラーを使用）にＮａＯＣｌ溶液を一気に添加した。
【0061】
生成物（活性化されたＡｍＢｒ）の濃度は、次亜塩素酸ナトリウムの濃度（Ｃｌ2として約１０００ｐｐｍ）に基づいていた。等量の反応物を混合して、混合物中の活性塩素の濃度を、Ｃｌ2として約５００ｐｐｍの反応物ＮａＯＣｌの５０％の濃度として得た。各実験における所望の殺生物剤濃度は、蒸留水で希釈して得た。
【0062】
調製３
シス－２－デセン酸の合成と精製
以下に示すように、米国特許第８７４８４８６号に記載されている２ステップの合成経路に従ってシス－２－デセン酸を調製し、第２ステップで水酸化ナトリウムを水酸化リチウムに置き換えた（１，３－ジブロモ－２－デカノンの脱ハロゲン化／転位）。
シス－２－デセン酸の合成と精製
以下に示すように、米国特許第８７４８４８６号に記載されている２ステップの合成経路に従ってシス－２－デセン酸を調製し、第２ステップで水酸化ナトリウムを水酸化リチウムに置き換えた（１，３－ジブロモ－２－デカノンの脱ハロゲン化／転位）。
【化1】
【0063】
反応混合物を従来の技術（シリカゲル及び溶媒抽出など）によって後処理し、純度が６０～９７％（ＧＣ）の範囲で変化するシス－２－デセン酸を回収した。以下に報告する研究では、９０％の純粋なシス－２－デセン酸をテストした。
【実施例1】
【0064】
ＣＤＡを用いた３日間のバイオフィルムに対する臭素系殺生物剤の効果の増強
（同時適用）
事前に増殖したバイオフィルムに対するＣＤＡと臭素含有殺生物剤との組み合わせの効果について研究した。（Ａ）緑膿菌ＰＡ１４株、及び（Ｂ）環境水と工業用水に由来する混合細菌種を利用して実験を実行した。
（同時適用）
事前に増殖したバイオフィルムに対するＣＤＡと臭素含有殺生物剤との組み合わせの効果について研究した。（Ａ）緑膿菌ＰＡ１４株、及び（Ｂ）環境水と工業用水に由来する混合細菌種を利用して実験を実行した。
【0065】
この研究では、３つの臭素系殺生物剤（ブロノポール、ＤＢＮＰＡ、及びＢＣＤＭＨ）をテストした。
【0066】
実験手順について
ハトナーズミネラル溶液及びグルコース（０．２％）を添加したＥＰＲＩ培地で細菌を培養した。微生物を、振とうしながら好気性条件下で、室温（２２℃）でインキュベートした。使用したバイオフィルム培養システムは、Ｄａｖｉｅｓ ＤＧ、Ｍａｒｑｕｅｓ ＣＮ、２００９、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９１：１３９３－１４０３に記載されている方法に従ってバイオフィルム細菌の付着と増殖を促進するためにタンパク質で処理したポリスチレン２４ウェルプレートを含む。
ハトナーズミネラル溶液及びグルコース（０．２％）を添加したＥＰＲＩ培地で細菌を培養した。微生物を、振とうしながら好気性条件下で、室温（２２℃）でインキュベートした。使用したバイオフィルム培養システムは、Ｄａｖｉｅｓ ＤＧ、Ｍａｒｑｕｅｓ ＣＮ、２００９、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９１：１３９３－１４０３に記載されている方法に従ってバイオフィルム細菌の付着と増殖を促進するためにタンパク質で処理したポリスチレン２４ウェルプレートを含む。
【0067】
１ｍＬの細菌培養物を接種した後、使用済み培地を除去し、２４時間ごとに３日間滅菌培地と交換し、処理の３時間前に最終培地交換を行った。さらに、浮遊性の細菌を除去するために、処理前に培地を交換した。処理剤は、３１０ｎＭのＣＤＡ１００μＬと臭素含有殺生物剤で構成されるか、又は商業用水処理で使用される濃度の臭素含有殺生物剤のみで構成され、テストした殺生物剤のそれぞれについて以下に詳述するように、各殺生物剤の活性によって決定された、１時間～２４時間の範囲の接触時間の間、水を担体として使用した。
【0068】
処理後、各ウェルの培地をピペットで除去し、１ｍＬのＤＥ中和培養液を添加して処理を停止した。次に、ウェルに形成されたバイオフィルムを滅菌セルスクレーパーで掻き取ることによって各ウェルから細菌を除去し、１．０ｍＬの培養物を冷却した（４℃）９．０ｍＬのＤＥ中和培養液に移し、氷上で、４００００ｒｐｍで１５秒間ホモジナイズした。計数前にさらに希釈した（殺生物剤活性をさらに中和した）。水中、チオグリコール酸を含むＬＢ培地、及びＤＥ中和培養液中で、殺生物剤の異なる希釈度で細菌の回収をテストして、活性剤が適切に中和されていることを確認した。ドロッププレート法により生菌を数えた。緑膿菌を接種したが処理していない対照培養物（Ｃｔｌ）、臭素含有殺生物剤のみで処理されたＣＤＡマイナステスト（－ＣＤＡ）、及び臭素含有殺生物剤とＣＤＡで処理されたＣＤＡプラステスト（＋ＣＤＡ）により、それぞれ８ウェルがある２４ウェルプレートを使用して、各殺生物剤を評価した。
【0069】
結果について
Ａ）１０ｐｐｍのブロノポールでＰＡ１４細菌を処理した結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。図２Ａは、ブロノポールによる処理にＣＤＡを添加したところ、わずか２時間の処理後に細菌の数が１桁以上減少したことを示している。図２Ｂは、２４時間の処理後に達成された効果を示している。ブロノポールのみでもバイオフィルムの減少に非常に効果的であることがわかる。しかし、ＣＤＡの添加により、処理の効果が大幅に高くなり、バイオフィルムの根絶につながった。
Ａ）１０ｐｐｍのブロノポールでＰＡ１４細菌を処理した結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。図２Ａは、ブロノポールによる処理にＣＤＡを添加したところ、わずか２時間の処理後に細菌の数が１桁以上減少したことを示している。図２Ｂは、２４時間の処理後に達成された効果を示している。ブロノポールのみでもバイオフィルムの減少に非常に効果的であることがわかる。しかし、ＣＤＡの添加により、処理の効果が大幅に高くなり、バイオフィルムの根絶につながった。
【0070】
Ｂ．１５ｐｐｍのＤＢＮＰＡでＰＡ１４細菌を処理した結果を、棒グラフ形式で図３に示す。ＤＢＮＰＡとＣＤＡの両方を含む２時間の短時間処理は、ＤＢＮＰＡのみを使用して同じ条件で実行した処理と比較して、効果が改善されていることがわかる。
【0071】
Ｃ．１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨでＰＡ１４細菌を処理した結果を、棒グラフ形式で図４に示す。ＢＣＤＭＨとＣＤＡの両方の適用を含むわずか１時間の短時間処理は、ＢＣＤＭＨのみを使用した処理（ｌｏｇ減少＝２）と比較して、結果が改善されていることがわかる。
【0072】
Ｄ．１５ｐｐｍのＤＢＮＰＡを使用した、環境水源に由来する未定義の混合微生物バイオフィルム培養物と、冷却塔水から得られた淡水混合微生物共同体に由来するバイオフィルム培養物とに対する処理の結果を、それぞれ図５Ａと図５Ｂに示す。ＤＢＮＰＡとＣＤＡの両方を含む２時間の短時間処理は、ＤＢＮＰＡのみを使用して同じ条件で実行した処理と比較して、結果が改善されていることがわかる。
【実施例2】
【0073】
ＣＤＡを用いた３日間のバイオフィルムに対する臭素系殺生物剤の効果の増強（連続適用）
ホウケイ酸ガラス試験片上で、ＣＤＣバイオフィルム反応器で増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、ＣＤＡと臭素含有殺生物剤の連続添加の効果を調べた（テスト方法Ｅ２５６２）。３１０ｎＭのＣＤＡの添加の６０分後に臭素含有殺生物剤を添加した。テストした６つの臭素系殺生物剤に対応するセクションＡ～Ｆを参照されたい。以下のセクションＧでは、さらに２つの細菌株（黄色ブドウ球菌６５３８、バチルスマイコイデス６４６２）を反応器に加え、混合バイオフィルムの形成に寄与した。以下のセクションＨでは、他の２つのＣＤＡ濃度（３１ｎＭ及び３１００ｎＭ）を緑膿菌バイオフィルムに対してテストした。
ホウケイ酸ガラス試験片上で、ＣＤＣバイオフィルム反応器で増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、ＣＤＡと臭素含有殺生物剤の連続添加の効果を調べた（テスト方法Ｅ２５６２）。３１０ｎＭのＣＤＡの添加の６０分後に臭素含有殺生物剤を添加した。テストした６つの臭素系殺生物剤に対応するセクションＡ～Ｆを参照されたい。以下のセクションＧでは、さらに２つの細菌株（黄色ブドウ球菌６５３８、バチルスマイコイデス６４６２）を反応器に加え、混合バイオフィルムの形成に寄与した。以下のセクションＨでは、他の２つのＣＤＡ濃度（３１ｎＭ及び３１００ｎＭ）を緑膿菌バイオフィルムに対してテストした。
【0074】
使用したＣＤＡの純度レベルの効果を評価するために、６つの臭素系殺生物剤（ＤＢＮＰＡ、スルファミン酸安定化臭素、ＢＣＤＭＨ、ブロモ尿素、活性化臭化アンモニウム、活性化ＮａＢｒ）を純度の異なる２つのＣＤＡ生成物（調製３の市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と粗製ＣＤＡ（ＧＣによる純度９０％））と組み合わせてテストした。
【0075】
実験手順について
単一チューブ法（Ｅ２８７１－１３）に従って試験片の有効性テストを実施した。このテスト方法は、ＣＤＣバイオフィルム反応器で再現性のある緑膿菌バイオフィルムを増殖させるために用いる。
単一チューブ法（Ｅ２８７１－１３）に従って試験片の有効性テストを実施した。このテスト方法は、ＣＤＣバイオフィルム反応器で再現性のある緑膿菌バイオフィルムを増殖させるために用いる。
【0076】
バイオフィルム形成について
反応器をバッチモード（栄養素のフローなし）で４時間操作することによってバイオフィルムを確立した。反応器で栄養素の連続的なフローを伴ってさらに３日間操作した後、定常状態の集合体に達した。３日間の全期間中、バイオフィルムを、バッフル付き撹拌棒の回転による連続的な流体せん断力に暴露した。３日間の終わりに、試験片からのバイオフィルムを以下のａ．～ｂ．のようにサンプリングした。
反応器をバッチモード（栄養素のフローなし）で４時間操作することによってバイオフィルムを確立した。反応器で栄養素の連続的なフローを伴ってさらに３日間操作した後、定常状態の集合体に達した。３日間の全期間中、バイオフィルムを、バッフル付き撹拌棒の回転による連続的な流体せん断力に暴露した。３日間の終わりに、試験片からのバイオフィルムを以下のａ．～ｂ．のようにサンプリングした。
【0077】
ａ．試験片をすすいで浮遊細胞を除去した。ロッドを、３０ｍＬの滅菌緩衝水を含む５０ｍＬのコニカル遠心分離管の真上に垂直に配向した。ロッドを、飛散を最小限に抑えて、又は飛散がまったくない状態で、緩衝水に連続的に動かして浸漬し、その後すぐに取り外した。各ロッドには、３０ｍＬの滅菌緩衝水を含む新しい５０ｍＬコニカルチューブを使用した。
【0078】
ｂ．ランダムに選択した試験片の１つで、ロッドを空の滅菌の５０ｍＬコニカルチューブの中央に保持した。止めねじを緩めると、試験片をチューブの底に直接落とすことができた。
【0079】
ＣＤＡおよび臭素含有殺生物剤の連続添加について
ａ．リン酸緩衝液（未処理の対照例）、３１０ｎＭのＣＤＡを含む緩衝液、又は異なる濃度の殺生物剤を含む緩衝液のいずれかを含む４ｍＬの溶液を、試験片を含むチューブにピペットでゆっくりと入れた。
ｂ．各チューブを軽く叩いて、試験片の下に閉じ込められた気泡を放出した。
ｃ．チューブ（対照例、ＣＤＡ、又は殺生物剤を含む）を２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。
ｄ．１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ｅ．組み合わせ処理は、まずＣＤＡを導入し、ＣＤＡとの１時間の接触時間の後、殺生物剤を含む別のチューブに試験片を移し、２００ｒｐｍで振とうしながら、さらに２０℃で１時間の接触時間インキュベートする連続処理として実行した。１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ａ．リン酸緩衝液（未処理の対照例）、３１０ｎＭのＣＤＡを含む緩衝液、又は異なる濃度の殺生物剤を含む緩衝液のいずれかを含む４ｍＬの溶液を、試験片を含むチューブにピペットでゆっくりと入れた。
ｂ．各チューブを軽く叩いて、試験片の下に閉じ込められた気泡を放出した。
ｃ．チューブ（対照例、ＣＤＡ、又は殺生物剤を含む）を２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。
ｄ．１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ｅ．組み合わせ処理は、まずＣＤＡを導入し、ＣＤＡとの１時間の接触時間の後、殺生物剤を含む別のチューブに試験片を移し、２００ｒｐｍで振とうしながら、さらに２０℃で１時間の接触時間インキュベートする連続処理として実行した。１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
【0080】
バイオフィルムの除去と分解について
ａ．Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ－２ Ｍｏｄｅｌ ｎｏ．Ｇ５６０Ｅを使用して、各チューブを最高の設定で３０秒間ボルテックスした。
ｂ．チューブを４５ｋＨｚで３０秒間超音波処理した。
ｃ．チューブを上記のようにボルテックスし、次に超音波処理して再度ボルテックスした。
ｄ．サンプルを緩衝水で連続的に希釈した。
ｅ．注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｆ．プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。
ｇ．適切なコロニー数を数えた。
ａ．Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ－２ Ｍｏｄｅｌ ｎｏ．Ｇ５６０Ｅを使用して、各チューブを最高の設定で３０秒間ボルテックスした。
ｂ．チューブを４５ｋＨｚで３０秒間超音波処理した。
ｃ．チューブを上記のようにボルテックスし、次に超音波処理して再度ボルテックスした。
ｄ．サンプルを緩衝水で連続的に希釈した。
ｅ．注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｆ．プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。
ｇ．適切なコロニー数を数えた。
【0081】
結果について
Ａ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのＤＢＮＰＡ（２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミド）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭの市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図６の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。ＤＰＮＰＡのみを適用すると、バイオフィルムが減少する。特に、ＤＢＮＰＡのみでの処理と比較して、組み合わせ処理によって２ｌｏｇ単位の増強を達成した（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへのＤＢＮＰＡの添加で構成される）。
Ａ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのＤＢＮＰＡ（２，２－ジブロモ－３－ニトリロプロピオンアミド）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭの市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図６の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。ＤＰＮＰＡのみを適用すると、バイオフィルムが減少する。特に、ＤＢＮＰＡのみでの処理と比較して、組み合わせ処理によって２ｌｏｇ単位の増強を達成した（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへのＤＢＮＰＡの添加で構成される）。
【0082】
Ｂ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する５ｐｐｍのスルファミン酸安定化臭素（Ｂｒｏｍｏｓｏｌ）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭのＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭからの商業的供給源又はＧＣによる純度９０％の調製３のいずれか）と組み合わせて処理した場合の効果を、図７の棒グラフに示す。その供給源に関係なく、ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。Ｂｒｏｍｏｓｏｌを単独で適用すると、バイオフィルムが減少する（４ｌｏｇ単位）。組み合わせ処理（つまり、ＣＤＡとそれに続く殺生物剤）は、殺生物剤のみでの処理と比較して、さらなるバイオフィルムの減少を達成している。市販ＣＤＡと粗製ＣＤＡを使用すると、殺生物剤のみでの処理と比較して、それぞれ１ｌｏｇ単位と２ｌｏｇ単位の減少をもたらすことは、注目に値する。
【0083】
Ｃ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨのみで処理した場合、及び３１０ｎＭのＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭからの商業的供給源又はＧＣによる純度９０％の調製３のいずれか）と組み合わせて処理した場合の効果を、図８の棒グラフに示す。その供給源に関係なく、ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。ＢＣＤＭＨを単独で適用すると、バイオフィルムが減少する（約３ｌｏｇ単位）。組み合わせ処理（つまり、ＣＤＡとそれに続く殺生物剤）は、殺生物剤のみでの処理と比較して、さらなるバイオフィルムの減少を達成した。市販ＣＤＡと粗製ＣＤＡの両方で、同等の増強、つまりＢＣＤＭＨのみでの処理と比較して約２ｌｏｇ単位の減少が生じた。
【0084】
Ｄ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する５ｐｐｍのブロモ尿素又は１０ｐｐｍのブロモ尿素のみで処理した場合、及び３１０ｎＭのＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭからの商業的供給源又はＧＣによる純度９０％の調製３のいずれか）と組み合わせて処理した場合の効果を、図９Ａ（５ｐｐｍのブロモ尿素）と図９Ｂ（１０ｐｐｍのブロモ尿素）の棒グラフに示す。供給源に関係なく、ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。なお、５ｐｐｍのブロモ尿素及び１０ｐｐｍのブロモ尿素を単独で適用した場合、同等のバイオフィルムの減少が測定されたことも特筆に値する。つまり、殺生物剤の濃度を２倍に増加（５ｐｐｍ→１０ｐｐｍ）しても、バイオフィルム制御の増強は見られなかった。しかしながら、組み合わせ処理（ＣＤＡの適用とそれに続く５ｐｐｍの殺生物剤又は１０ｐｐｍの殺生物剤の適用）は、殺生物剤のみでの処理と比較して大幅な改善を達成しており、市販ＣＤＡと粗製ＣＤＡの両方で、非常に良好な結果が得られた。つまり、５ｐｐｍのブロモ尿素のみで処理した場合と比較して約２～３ｌｏｇ単位増強され、１０ｐｐｍのブロモ尿素のみで処理した場合と比較して４～５ｌｏｇ単位増強されている。
【0085】
Ｅ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する５ｐｐｍの活性化臭化アンモニウム（ＡｍＢｒ）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭの市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図１０の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。殺生物剤のみを適用すると、バイオフィルムが減少する。特に、殺生物剤のみでの処理と比較して、組み合わせ処理によって約４．５ｌｏｇ単位の増強を達成した（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへの殺生物剤の添加で構成される）。
【0086】
Ｆ．バイオフィルムに対する２０ｐｐｍの活性化ＮａＢｒのみで処理した場合、及び３１０ｎＭの市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図１１の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。活性化ＮａＢｒのみを適用すると、バイオフィルムが減少する。特に、活性化ＮａＢｒのみでの処理と比較して、組み合わせ処理によって２ｌｏｇ単位の増強を達成した（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへの活性化ＮａＢｒの添加で構成される）。
【0087】
Ｇ．上記のように生成された混合細菌（３つの異なる細菌：黄色ブドウ球菌６５３８、バチルスマイコイデス６４６２、及び緑膿菌７００８８８）によって形成されたバイオフィルムに対する５ｐｐｍのＢＣＤＭＨ又は１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨのみで処理した場合、及び３１０ｎＭの市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図１２Ａと図１２Ｂ（それぞれ５ｐｐｍＢＣＤＭＨ又は１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨ）の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。殺生物剤のみを適用すると、バイオフィルムが減少するが、１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨによる処理は、５ｐｐｍのＢＣＤＭＨによる処理よりもそれほど優れていない。しかしながら、５ｐｐｍと１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨによる処理では、いずれも処理にＣＤＡを組み込むことで利益が得られる。組み合わせ処理は、５ｐｐｍと１０ｐｐｍの殺生物剤を単独で作用させた処理と比較して、それぞれ約２．５ｌｏｇ単位と約５．５ｌｏｇ単位の増強を達成していることがわかる（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへの殺生物剤の添加で構成される）。
【0088】
Ｈ．上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨのみで処理した場合、及び異なる濃度（３１ｎＭ、３１０ｎＭ、及び３１００ｎＭ）の市販ＣＤＡ（ＧＣによる純度９７％のＣＶ－ＣＨＥＭ）と組み合わせて処理した場合の効果を、図１３の棒グラフに示す。テストしたすべての濃度のＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。ＢＣＤＭＨを単独で適用すると、バイオフィルムが減少する。特に、ＢＣＤＭＨのみでの処理と比較して、ＣＤＡ（３１ｎＭと３１０ｎＭ）との組み合わせ処理では４．５ｌｏｇ単位の増強を達成し、ＣＤＡ（３１００ｎＭ）との組み合わせでは５．５ｌｏｇ単位の増強を達成している（組み合わせ処理は、殺生物剤の添加前にＣＤＡと１時間接触していたサンプルへのＢＣＤＭＨの添加で構成される）。
【実施例3】
【0089】
ＣＤＡを用いた臭素系殺生物剤の投与量レベルの低減
この研究の目的は、ＣＤＡの添加が臭素系殺生物剤の投与量レベルの低減をどの程度相殺できるかを推定することである。つまり、現在許容されている高投与量レベルの単独作用型臭素と同等に効果的な、臭素とＣＤＡとの組み合わせ処理プログラムを提供する。
この研究の目的は、ＣＤＡの添加が臭素系殺生物剤の投与量レベルの低減をどの程度相殺できるかを推定することである。つまり、現在許容されている高投与量レベルの単独作用型臭素と同等に効果的な、臭素とＣＤＡとの組み合わせ処理プログラムを提供する。
【0090】
テストした殺生物剤は、ＢＣＤＭＨであった。純度９７％グレードの市販ＣＤＡを使用した。実施例２の実験プロトコルを繰り返した（すなわち、まずＣＤＡを、次にＢＣＤＭＨを、殺生物剤との１時間の接触時間で、３日間増殖させたバイオフィルムに適用する連続処理）。
【0091】
結果は、図１４の棒グラフ形式で示し、３１０ｎＭのＣＤＡの存在下での５．０ｐｐｍのＢＣＤＭＨの効果が、ＣＤＡの非存在下での１０ｐｐｍのＢＣＤＭＨの効果に匹敵することを示している。したがって、水に非常に少量のＣＤＡを添加すると、殺生物剤の投与量レベルの５０％の低減を相殺することができる。
【実施例4】
【0092】
ＣＤＡを用いた臭素系殺生物剤の投与量レベルの低減
ＣＤＡ（市販の９７％純度グレード）をさまざまな量の臭素系殺生物剤（殺生物剤の投与量レベルを０～１０ｐｐｍの範囲で変化させた）と組み合わせて適用し、広い殺生物剤濃度範囲にわたって殺生物剤の作用をサポートするＣＤＡの能力を調べた。ＣＤＡを一定濃度３１０ｎＭで使用した。組み合わせ処理の臭素／ＣＤＡを、単独で適用した臭素系殺生物剤と比較した。
ＣＤＡ（市販の９７％純度グレード）をさまざまな量の臭素系殺生物剤（殺生物剤の投与量レベルを０～１０ｐｐｍの範囲で変化させた）と組み合わせて適用し、広い殺生物剤濃度範囲にわたって殺生物剤の作用をサポートするＣＤＡの能力を調べた。ＣＤＡを一定濃度３１０ｎＭで使用した。組み合わせ処理の臭素／ＣＤＡを、単独で適用した臭素系殺生物剤と比較した。
【0093】
テストした殺生物剤は、ブロモ尿素であった。実施例２の実験プロトコルを繰り返した（すなわち、殺生物剤との接触時間を１時間とし、３日間増殖させたバイオフィルムに、まずＣＤＡを、次にブロモ尿素を適用する連続処理を行った）。
【0094】
単独で適用された殺生物剤（ひし形でマーク）と組み合わせた殺生物剤／ＣＤＡ処理に対応する生存プロットの形式で、結果を図１５Ａと図１５Ｂに示す。テストした殺生物剤の濃度は、０．０、０．６２５、１．２５、２．５、５、及び１０ｐｐｍであった。結果は、２．５ｐｐｍブロモ尿素／３１０ｎＭのＣＤＡの処理レベル及び５ｐｐｍブロモ尿素／３１０ｎＭのＣＤＡという低いバイオフィルム根絶濃度でのＬＣ50（培養物の５０％が死滅するバイオフィルム濃度）バイオフィルム制御を明示することで、殺生物剤の濃度範囲全体（すなわち、＞０．５ｐｐｍ）にわたる３日間バイオフィルムに対する組み合わせ処理の有効性を示している。
【実施例5】
【0095】
ＣＤＡを用いた浮遊性の細菌に対する臭素系殺生物剤の効果の増強（連続適用）
３１０ｎＭのＣＤＡと臭素含有殺生物剤を、異なるレベルの有機物の負荷（ＴＯＣ １０－３０００ｐｐｍ）を含む培地中の浮遊性の細菌の混合物に導入した。有機物の負荷が高いと、工業用途における抗菌剤の効果が低下する傾向があるため、このテストは、これらの条件を模倣することを目的とした。修正欧州規格ＥＮ１０４０：２００５：「化学消毒剤及び防腐剤－化学消毒剤及び防腐剤の基本的な殺菌活性を評価するための定量的懸濁試験－テスト方法及び要件（フェーズ１）」に従ってテストを実行した。ＴＯＣ＝３０ｐｐｍの溶液を得るためのトリプトンを含む１９ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）、及び１．５×１０8－５×１０8ＣＦＵ／ｍＬの濃度の１ｍＬのテストした細菌懸濁液（大腸菌（ＡＴＣＣ １１２２９）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）、エンテロバクター・アエロゲネス（ＡＴＣＣ １３０４８９）、及び緑膿菌（ＡＴＣＣ １３３８８）で構成される）を適切な容量の容器に入れた。すぐにストップウォッチを開始し、３０℃に制御された水浴に容器を入れた。
３１０ｎＭのＣＤＡと臭素含有殺生物剤を、異なるレベルの有機物の負荷（ＴＯＣ １０－３０００ｐｐｍ）を含む培地中の浮遊性の細菌の混合物に導入した。有機物の負荷が高いと、工業用途における抗菌剤の効果が低下する傾向があるため、このテストは、これらの条件を模倣することを目的とした。修正欧州規格ＥＮ１０４０：２００５：「化学消毒剤及び防腐剤－化学消毒剤及び防腐剤の基本的な殺菌活性を評価するための定量的懸濁試験－テスト方法及び要件（フェーズ１）」に従ってテストを実行した。ＴＯＣ＝３０ｐｐｍの溶液を得るためのトリプトンを含む１９ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）、及び１．５×１０8－５×１０8ＣＦＵ／ｍＬの濃度の１ｍＬのテストした細菌懸濁液（大腸菌（ＡＴＣＣ １１２２９）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）、エンテロバクター・アエロゲネス（ＡＴＣＣ １３０４８９）、及び緑膿菌（ＡＴＣＣ １３３８８）で構成される）を適切な容量の容器に入れた。すぐにストップウォッチを開始し、３０℃に制御された水浴に容器を入れた。
【0096】
２．５ｐｐｍのＢＣＤＭＨのみで、３時間の接触時間で活性を測定した。ＣＤＡ（ＣＶ－ＣＨＥＭ）と２．５ｐｐｍのＢＣＤＭＨの組み合わせを、順（ＣＤＡについて１時間、次にＢＣＤＭＨについてさらに３時間）に添加してテストした。所望の接触時間で、１ｍＬのテスト混合物を９．０ｍＬの中和剤を含むチューブにピペットで入れた。５秒の中和時間後、すぐに１ｍＬのサンプルを２回採取し、ペトリ皿に移した。４５±１℃に冷却したＴＳＡを添加した。プレートを３７±２℃で４８時間インキュベートした。カウント可能なプレートを数え、各プレートについてコロニー形成単位の数を決定した。
【0097】
結果を図１６に示す。ＣＤＡ（ＣＶ－ＣＨＥＭ）とＢＣＤＭＨ（２．５ｐｐｍ）を順に導入した場合、ＣＤＡの非存在下でＢＣＤＭＨによって達成された効果と比較して、２ｌｏｇ単位の増強が得られたことがわかる。
【実施例6】
【0098】
ＤＢＮＰＡ及びＣＤＡの室温保存安定性組成物
２２ｍｇのシス－２－デセン酸（ＣｉＶｅｎｔｉＣｈｅｍ、純度９６．７２％）を、スターラーを備えた５０ｍＬのフラスコに入れた。３．９９グラムのＣ－１０３（ＩＣＬ、バッチ６４０１６０１４７）を添加し、続いて９．９７グラムのＰＥＧ２００（Ｍｅｒｃｋ ８．０７４８３．５０００ ロットＳ６９０４９８３ ４５１）、５．９５グラムのＤＩ水及び２２ｍｇのＢＨＴ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ１３７８－１００Ｇ、ＢＣＢＨ９４９１Ｖ）を添加した。得られた溶液を完全に澄み切るまで撹拌し、粒子が観察される場合、＋３０℃での超音波処理が推奨される。合計３０グラムであり２０：５０：３０：０．１：０．１の重量比のＣｌ０３－ＰＥＧ200－Ｈ2０－ＣＤＡ－ＢＨＴの無色透明の溶液を得た。
２２ｍｇのシス－２－デセン酸（ＣｉＶｅｎｔｉＣｈｅｍ、純度９６．７２％）を、スターラーを備えた５０ｍＬのフラスコに入れた。３．９９グラムのＣ－１０３（ＩＣＬ、バッチ６４０１６０１４７）を添加し、続いて９．９７グラムのＰＥＧ２００（Ｍｅｒｃｋ ８．０７４８３．５０００ ロットＳ６９０４９８３ ４５１）、５．９５グラムのＤＩ水及び２２ｍｇのＢＨＴ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ１３７８－１００Ｇ、ＢＣＢＨ９４９１Ｖ）を添加した。得られた溶液を完全に澄み切るまで撹拌し、粒子が観察される場合、＋３０℃での超音波処理が推奨される。合計３０グラムであり２０：５０：３０：０．１：０．１の重量比のＣｌ０３－ＰＥＧ200－Ｈ2０－ＣＤＡ－ＢＨＴの無色透明の溶液を得た。
【0099】
この溶液を２５℃で２か月間保存し、殺生物剤及びＣＤＡの安定性を判定するためにテストした。ＤＢＮＰＡもＣＤＡも、２５℃／２か月のテストで分解しなかった（ＨＰＬＣによる分析）。
【実施例7】
【0100】
ブロノポール及びＣＤＡの室温保存安定性組成物
４７．６ｇのシス－２－デセン酸（ＣｉＶｅｎｔｉＣｈｅｍ、純度９６．７２％）を、スターラーを備えた５０ｍＬのフラスコに入れた。９．０１グラムのブロノポール（ＩＣＬ、バッチ１７１０１６０７）を添加し、続いて１８．０３グラムのプロピレングリコール（Ｂｉｏｌａｂ １６２００２０１ ロット１００７８６１）、３．０グラムのＤＩ水及び３１．２ｍｇのＢＨＴ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ１３７８－１００Ｇ、ＢＣＢＨ９４９１Ｖ）を添加した。数分間撹拌した後、ＢＨＴ粒子を除去するために、溶解していない微量のＢＨＴを濾紙で濾過した。合計３０グラムであり３０：６０：１０：０．１５８：０．１の重量比のブロノポール－ＰＧ－Ｈ2０－ＣＤＡ－ＢＨＴの無色透明の溶液を得た。
４７．６ｇのシス－２－デセン酸（ＣｉＶｅｎｔｉＣｈｅｍ、純度９６．７２％）を、スターラーを備えた５０ｍＬのフラスコに入れた。９．０１グラムのブロノポール（ＩＣＬ、バッチ１７１０１６０７）を添加し、続いて１８．０３グラムのプロピレングリコール（Ｂｉｏｌａｂ １６２００２０１ ロット１００７８６１）、３．０グラムのＤＩ水及び３１．２ｍｇのＢＨＴ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ１３７８－１００Ｇ、ＢＣＢＨ９４９１Ｖ）を添加した。数分間撹拌した後、ＢＨＴ粒子を除去するために、溶解していない微量のＢＨＴを濾紙で濾過した。合計３０グラムであり３０：６０：１０：０．１５８：０．１の重量比のブロノポール－ＰＧ－Ｈ2０－ＣＤＡ－ＢＨＴの無色透明の溶液を得た。
【0101】
この溶液を２５℃で２か月間保存し、殺生物剤及びＣＤＡの安定性を判定するためにテストした。ブロノポールもＣＤＡも、２５℃／２か月のテストで分解しなかった（ＨＰＬＣによる分析）。
【実施例8】
【0102】
バイオフィルムに対する臭素／ＣＤＡ対塩素／ＣＤＡの効果
この実施例で報告されている一連の実験の目的は、臭素系及び塩素系の処理にＣＤＡを添加することにより、対象となるバイオフィルムに同等の効果が生じるかどうかを確認することであった。つまり、ＣＤＡが、バイオフィルムに対する臭素及び塩素の作用を同等に効果的に増強するかどうかということである。塩素系殺生物剤と臭素系殺生物剤の例示として、次亜塩素酸ナトリウムとＢＣＤＭＨをそれぞれ選択した。
この実施例で報告されている一連の実験の目的は、臭素系及び塩素系の処理にＣＤＡを添加することにより、対象となるバイオフィルムに同等の効果が生じるかどうかを確認することであった。つまり、ＣＤＡが、バイオフィルムに対する臭素及び塩素の作用を同等に効果的に増強するかどうかということである。塩素系殺生物剤と臭素系殺生物剤の例示として、次亜塩素酸ナトリウムとＢＣＤＭＨをそれぞれ選択した。
【0103】
純度９７％グレードの市販ＣＤＡを使用した。実施例２の実験プロトコルを繰り返した（すなわち、まずＣＤＡを、次にハロゲン化殺生物剤を、殺生物剤との１時間の接触時間で、３日間増殖させたバイオフィルムに適用する連続処理）。
【0104】
図１７の棒グラフは、次亜塩素酸ナトリウムとＢＣＤＭＨを５ｐｐｍの投与量レベルで単独で適用すると、バイオフィルムに同等の効果があることを示している。しかしながら、本発明の臭素／ＣＤＡの組み合わせは、塩素／ＣＤＡと比較して、バイオフィルムに対して驚くべき優れた効果を生み出した。５ｐｐｍのＢＣＤＭＨ／３１０ｎＭのＣＤＡの処理レベルで適用されたＢＣＤＭＨ／ＣＤＡの組み合わせは、単独で適用されたＢＣＤＭＨ処理と比較して４．５ｌｏｇ単位の減少を達成したが、対応する次亜塩素酸塩／ＣＤＡ処理は、より少ない程度で改善できた（２ｌｏｇ単位の減少）。
【実施例9】
【0105】
ＣＤＡを用いた大量のバイオフィルムに対する臭素系殺生物剤の効果の増強（連続適用）
ドリップフローチューブで増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、ＣＤＡ及び臭素含有殺生物剤の連続添加の効果を調べた（標準ＡＳＴＭ２６４７－１３の修正による、低せん断及び連続フローを備えたドリップフローバイオフィルム反応器を使用して増殖した緑膿菌バイオフィルムの定量化のための標準試験方法）。この方法は、処理が非常に困難な過酷な条件をもたらす大量のバイオフィルムを生成する。３１０ｎＭのＣＤＡの添加の１２０分後に臭素含有殺生物剤を添加した（この研究でテストした殺生物剤は、ＤＢＮＰＡであった）。
ドリップフローチューブで増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、ＣＤＡ及び臭素含有殺生物剤の連続添加の効果を調べた（標準ＡＳＴＭ２６４７－１３の修正による、低せん断及び連続フローを備えたドリップフローバイオフィルム反応器を使用して増殖した緑膿菌バイオフィルムの定量化のための標準試験方法）。この方法は、処理が非常に困難な過酷な条件をもたらす大量のバイオフィルムを生成する。３１０ｎＭのＣＤＡの添加の１２０分後に臭素含有殺生物剤を添加した（この研究でテストした殺生物剤は、ＤＢＮＰＡであった）。
【0106】
実験手順について
ａ）連続貫通チューブシステムは、追加のシリコンチューブを介して蠕動ポンプに接続されたシリコーンでコーティングされたラテックスチューブを使用して構成された。
ｂ）緑膿菌（ＡＴＣＣ ７００８８８）、１０％ＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス）中の５＊１０7ＣＦＵ／ＭＬの一晩培養物をシリンジ注射によってシリコーンでコーティングされたラテックスチューブに接種した。細菌細胞をチューブに２時間付着させた（静的インキュベーション）（バッチ段階）。
ｃ）２時間後、システムを２５℃のインキュベーターに移し、増殖培地（１０％ＴＳＢ）を１０ｍＬ／ｈｒの流速で約４２時間ポンプ輸送した。
ａ）連続貫通チューブシステムは、追加のシリコンチューブを介して蠕動ポンプに接続されたシリコーンでコーティングされたラテックスチューブを使用して構成された。
ｂ）緑膿菌（ＡＴＣＣ ７００８８８）、１０％ＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス）中の５＊１０7ＣＦＵ／ＭＬの一晩培養物をシリンジ注射によってシリコーンでコーティングされたラテックスチューブに接種した。細菌細胞をチューブに２時間付着させた（静的インキュベーション）（バッチ段階）。
ｃ）２時間後、システムを２５℃のインキュベーターに移し、増殖培地（１０％ＴＳＢ）を１０ｍＬ／ｈｒの流速で約４２時間ポンプ輸送した。
【0107】
ｄ）ＣＤＡ及び臭素含有殺生物剤の連続添加について
バイオフィルム処理は、培地を緩衝水（対照例）又は緩衝ＣＤＡ溶液と交換し、次に殺生物剤溶液と交換することによって行った。
以下の処理を行った。
１．リン酸緩衝液について５時間（対照例）。
２．リン酸緩衝液について２時間、続いて殺生物剤溶液（異なる濃度）について３時間。
３．ＣＤＡ緩衝液について２時間、続いて殺生物剤溶液（異なる濃度）又は緩衝液について３時間（対照例）。
バイオフィルム処理は、培地を緩衝水（対照例）又は緩衝ＣＤＡ溶液と交換し、次に殺生物剤溶液と交換することによって行った。
以下の処理を行った。
１．リン酸緩衝液について５時間（対照例）。
２．リン酸緩衝液について２時間、続いて殺生物剤溶液（異なる濃度）について３時間。
３．ＣＤＡ緩衝液について２時間、続いて殺生物剤溶液（異なる濃度）又は緩衝液について３時間（対照例）。
【0108】
ｅ）実験終了後、シリコーンでコーティングされたラテックスチューブをチューブから外し、特別に作られたクリーニングロッドを挿入してバイオフィルムをチューブ内から取り外した。
ｆ）バイオフィルムをバイアルに取り出し、ボルテックスで分解した。
ｇ）サンプルを連続的に希釈した。注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｈ）プレートを３６℃で１７～２０時間インキュベートした。
ｉ）適切なコロニー数を数えた。
ｆ）バイオフィルムをバイアルに取り出し、ボルテックスで分解した。
ｇ）サンプルを連続的に希釈した。注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｈ）プレートを３６℃で１７～２０時間インキュベートした。
ｉ）適切なコロニー数を数えた。
【0109】
結果
図１８に示した結果は、３１０ｎＭのＣＤＡとの組み合わせ処理における３０．０ｐｐｍのＤＢＮＰＡの効果が、殺生物剤単独の殺生物効果を約２ｌｏｇオーダー増強したことを示している。
図１８に示した結果は、３１０ｎＭのＣＤＡとの組み合わせ処理における３０．０ｐｐｍのＤＢＮＰＡの効果が、殺生物剤単独の殺生物効果を約２ｌｏｇオーダー増強したことを示している。
【実施例10】
【0110】
塩形態のＣＤＡを用いた３日間のバイオフィルムに対する臭素系殺生物剤の効果の増強（同時適用）
ＣＤＡナトリウム／リチウム塩の実験的な段階的酸性化は、シス－ＤＡ ｐＫａ値が６．５～７．５の範囲にあることを示す。いくつかの工業用途では、処理水のｐＨ値はアルカリ度が高いため、塩形態のシス－ＤＡの形成を促進する。ホウケイ酸ガラス試験片上で、ＣＤＣバイオフィルム反応器で増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、塩形態のＣＤＡと臭素含有殺生物剤との同時添加の効果を調べた（テスト方法Ｅ２５６２）。テストした臭素含有殺生物剤は、スルファミン酸安定化臭素（Ｂｒｏｍｏｓｏｌ）であり、３１０ｎＭのＣＤＡと同時に６０分間添加された。処理された溶液のｐＨは、ｐＨ８～９の範囲（塩形態のシス－ＤＡの形成を促進する条件）であった。
ＣＤＡナトリウム／リチウム塩の実験的な段階的酸性化は、シス－ＤＡ ｐＫａ値が６．５～７．５の範囲にあることを示す。いくつかの工業用途では、処理水のｐＨ値はアルカリ度が高いため、塩形態のシス－ＤＡの形成を促進する。ホウケイ酸ガラス試験片上で、ＣＤＣバイオフィルム反応器で増殖した緑膿菌バイオフィルムを使用して、塩形態のＣＤＡと臭素含有殺生物剤との同時添加の効果を調べた（テスト方法Ｅ２５６２）。テストした臭素含有殺生物剤は、スルファミン酸安定化臭素（Ｂｒｏｍｏｓｏｌ）であり、３１０ｎＭのＣＤＡと同時に６０分間添加された。処理された溶液のｐＨは、ｐＨ８～９の範囲（塩形態のシス－ＤＡの形成を促進する条件）であった。
【0111】
実験手順について
単一チューブ法（Ｅ２８７１－１３）に従って試験片の有効性テストを実施した。このテスト方法は、ＣＤＣバイオフィルム反応器で再現性のある緑膿菌バイオフィルムを増殖させるために用いる。
単一チューブ法（Ｅ２８７１－１３）に従って試験片の有効性テストを実施した。このテスト方法は、ＣＤＣバイオフィルム反応器で再現性のある緑膿菌バイオフィルムを増殖させるために用いる。
【0112】
バイオフィルム形成について
反応器をバッチモード（栄養素のフローなし）で４時間操作することによってバイオフィルムを確立した。反応器で栄養素の連続的なフローを伴ってさらに３日間操作した後、バイオフィルムは定常状態の集合体に達した。３日間の全期間中、バイオフィルムを、バッフル付き撹拌棒の回転による連続的な流体せん断力に暴露した。３日間の終わりに、試験片からのバイオフィルムを以下のａ．～ｂ．のようにサンプリングした。
反応器をバッチモード（栄養素のフローなし）で４時間操作することによってバイオフィルムを確立した。反応器で栄養素の連続的なフローを伴ってさらに３日間操作した後、バイオフィルムは定常状態の集合体に達した。３日間の全期間中、バイオフィルムを、バッフル付き撹拌棒の回転による連続的な流体せん断力に暴露した。３日間の終わりに、試験片からのバイオフィルムを以下のａ．～ｂ．のようにサンプリングした。
【0113】
ａ．試験片をすすいで浮遊細胞を除去した。ロッドを、３０ｍＬの滅菌緩衝水を含む５０ｍＬのコニカル遠心分離管の真上に垂直に配向した。ロッドを、飛散を最小限に抑えて、又は飛散がまったくない状態で、緩衝水に連続的に動かして浸漬し、その後すぐに取り外した。各ロッドには、３０ｍＬの滅菌緩衝水を含む新しい５０ｍＬコニカルチューブを使用した。
【0114】
ｂ．ランダムに選択された試験片の１つで、ロッドを空の滅菌の５０ｍＬのコニカルチューブの中央に保持した。止めねじを緩めると、試験片をチューブの底に直接落とすことができた。
【0115】
ＣＤＡおよび臭素含有殺生物剤の同時添加について
ａ．リン酸緩衝液（未処理の対照例）、３１０ｎＭのＣＤＡを含む緩衝液、又は異なる濃度の殺生物剤を含む緩衝液のいずれかを含む４ｍＬの溶液を、試験片を含むチューブにピペットでゆっくりと入れた。
ｂ．各チューブを軽く叩いて、試験片の下に閉じ込められた気泡を放出した。
ｃ．チューブ（対照例、ＣＤＡ、又は殺生物剤を含む）を２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。
ｄ．１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ｅ．組み合わせ処理を、ＣＤＡ（３１０ｎＭのＣＤＡ）と殺生物剤を一緒にチューブに添加する同時処理として実行した。チューブを２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。システムで測定されたｐＨは、８～９の間にあった。
１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ａ．リン酸緩衝液（未処理の対照例）、３１０ｎＭのＣＤＡを含む緩衝液、又は異なる濃度の殺生物剤を含む緩衝液のいずれかを含む４ｍＬの溶液を、試験片を含むチューブにピペットでゆっくりと入れた。
ｂ．各チューブを軽く叩いて、試験片の下に閉じ込められた気泡を放出した。
ｃ．チューブ（対照例、ＣＤＡ、又は殺生物剤を含む）を２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。
ｄ．１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
ｅ．組み合わせ処理を、ＣＤＡ（３１０ｎＭのＣＤＡ）と殺生物剤を一緒にチューブに添加する同時処理として実行した。チューブを２００ｒｐｍで振とうしながら、２０℃で１時間の接触時間インキュベートした。システムで測定されたｐＨは、８～９の間にあった。
１時間の接触時間の後、３６ｍＬの中和剤を各チューブに添加した。
【0116】
バイオフィルムの除去と分解について
ａ．Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ－２ Ｍｏｄｅｌ ｎｏ．Ｇ５６０Ｅを使用して、各チューブを最高の設定で３０秒間ボルテックスした。
ｂ．チューブを４５ｋＨｚで３０秒間超音波処理した。
ｃ．チューブを上記のようにボルテックスし、次に超音波処理して再度ボルテックスした。
ｄ．サンプルを緩衝水で連続的に希釈した。
ｅ．注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｆ．プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。
ｇ．適切なコロニー数を数えた。
ａ．Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ－２ Ｍｏｄｅｌ ｎｏ．Ｇ５６０Ｅを使用して、各チューブを最高の設定で３０秒間ボルテックスした。
ｂ．チューブを４５ｋＨｚで３０秒間超音波処理した。
ｃ．チューブを上記のようにボルテックスし、次に超音波処理して再度ボルテックスした。
ｄ．サンプルを緩衝水で連続的に希釈した。
ｅ．注入プレーティング法を使用して、コロニーを増殖させるために各希釈液を（Ｒ２Ａ寒天上で）２回培養した。
ｆ．プレートを３５℃で７２時間インキュベートした。
ｇ．適切なコロニー数を数えた。
【0117】
結果について
上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのスルファミン酸安定化臭素（Ｂｒｏｍｏｓｏｌ）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭのＣＤＡと組み合わせて処理した場合の効果を、図１９の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。Ｂｒｏｍｏｓｏｌを単独で適用すると、バイオフィルムが減少する（２．５ｌｏｇ単位）。組み合わせ処理（つまり、ＣＤＡと殺生物剤）は、殺生物剤のみでの処理と比較して、さらなるバイオフィルムの減少、１．４ｌｏｇ単位の増強を達成している。
上記のように生成されたバイオフィルムに対する１０ｐｐｍのスルファミン酸安定化臭素（Ｂｒｏｍｏｓｏｌ）のみで処理した場合、及び３１０ｎＭのＣＤＡと組み合わせて処理した場合の効果を、図１９の棒グラフに示す。ＣＤＡのみでは、対照例と比較して有用な効果を示していないことがわかる。Ｂｒｏｍｏｓｏｌを単独で適用すると、バイオフィルムが減少する（２．５ｌｏｇ単位）。組み合わせ処理（つまり、ＣＤＡと殺生物剤）は、殺生物剤のみでの処理と比較して、さらなるバイオフィルムの減少、１．４ｌｏｇ単位の増強を達成している。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【国際調査報告】