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▶ ミルテニイ ビオテック ベー．ファー． ウント コー．カーゲーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(54)【発明の名称】遺伝子改変Ｔ細胞の生成方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220728BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220728BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570325
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2021-11-26
(86)【国際出願番号】 EP2020064755
(87)【国際公開番号】W WO2020239866
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】19176957.9
(32)【優先日】2019-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520493902
【氏名又は名称】ミルテニイ ビオテック ベー．ファー． ウント コー．カーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】シャゼル，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】カイザー，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】アッセンマッハ，マリオ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための方法であって、ａ）Ｔ細胞を含む試料を準備するステップ、ｂ）前記試料を遠心分離により調製するステップ、ｃ）Ｔ細胞を濃縮するステップ、ｄ）調節剤を使用して、Ｔ細胞を活性化するステップ、ｅ）レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入により、Ｔ細胞を遺伝子改変するステップ、ｆ）調節剤を除去するステップを含み、それにより遺伝子改変Ｔ細胞の試料が生成され、ここで、前記方法は１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で実施される、方法を提供する。本発明の一実施形態では、前記Ｔ細胞の濃縮は、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子を使用して磁気細胞分離により実施され、前記磁気粒子は、分離後に細胞から除去され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための方法であって、ａ）Ｔ細胞を含む試料を準備するステップ、
ｂ）前記試料を遠心分離により調製するステップ、
ｃ）ステップｂのＴ細胞を濃縮するステップ、
ｄ）調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を使用して、濃縮されたＴ細胞を活性化するステップ、
ｅ）レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入により、活性化されたＴ細胞を遺伝子改変するステップ、
ｆ）前記調節剤を除去するステップ
を含み、
それにより、遺伝子改変Ｔ細胞の試料が生成され、
前記方法が１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で実施される、方法。
【請求項2】
ステップａ）の前記試料はヒト血清を含み、前記血清はステップｂ）で除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップｃ）において、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４および／またはＣＤ８を陽性選択マーカーとして使用することにより、ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞が濃縮され、および／または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を陰性選択マーカーとして使用することにより、がん細胞が枯渇される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮が、ｉ）前記Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片が除去され得る、ステップ、
ｉｉ）前記ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）分離後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮が、ｉ）前記Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片とは、化学的におよび／または酵素的に分断され得る、ステップ；
ｉｉ）前記ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片との化学的および／または酵素的分断により、前記分離ステップ後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記調節剤は、リンカーを介して直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片は、除去され得る、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記調節剤は、リンカーを介して直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片は、化学的および／または酵素的に分断され得、前記調節剤は、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片の化学的および／または酵素的分断により除去される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記調節剤は、生分解性リンカーを介して直接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記生分解性リンカーは、前記生分解性リンカーのグリコシド連結を特異的に消化する酵素を添加することにより分解される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記生分解性リンカーは、ポリサッカライドであるかまたはポリサッカライドを含み、前記グリコシド連結を特異的に消化する酵素は、加水分解酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入によるＴ細胞の遺伝子改変後、残留レンチウイルスベクター粒子が除去される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記残留レンチウイルスベクター粒子の除去は、洗浄により実施され、前記洗浄は、前記遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料中の残留ベクター粒子の１０分の１以下、好ましくは１００分の１の低減をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記残留レンチウイルスベクター粒子の除去は、レンチウイルスベクター粒子を不活性化するおよび／またはそれらの安定性を低減する物質と共にインキュベーションすることにより実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
請求項３の除去されたヒト血清、またはレンチウイルスベクター粒子のＴ細胞への生産的形質導入を阻害するそれから単離された物質を、遺伝子改変Ｔ細胞に添加し、それにより残留レンチウイルスベクター粒子を除去および／または中和する、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
閉鎖系で実施される自動化された方法である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記生成された試料中のＴ細胞の数が、前記準備した試料中のＴ細胞の数と比較して１０倍未満である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子操作Ｔ細胞の生成に関する分野、特に、短期間内に、ならびに標的集団における汚染物質および／または望ましくない細胞の濃度が低くなるように遺伝子操作Ｔ細胞を生成することに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子改変Ｔ細胞の臨床製造は複雑なプロセスである。患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｔ細胞が豊富であることが多く、それらをウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによる遺伝子改変前に活性化させる。次いで、改変Ｔ細胞を、治療に必要な細胞数に到達させるために拡大増殖させ（ｅｘｐａｎｄ）、その後細胞を最終的に、再輸注前に製剤化および／または凍結保存する。細胞製品は、少なからぬ品質管理アッセイにかけられ、すべての出荷基準および「医薬品の製造および品質管理に関する基準」（ＧＭＰ）の指針を満たさなければならない。したがってこれまで、遺伝子改変Ｔ細胞が使用される養子細胞移入（ＡＣＴ）は、間に合わせのデバイスおよび基本的施設を使用することによる小規模臨床治験のための独自製造プロセスを開発した研究者により実施されることが多かった。一方、閉鎖系での自動化されたプロセスも利用可能である（例えば、国際公開第２０１５１６２２１１号Ａ１パンフレット、国際公開第２０１９０４６７６６号Ａ１パンフレット）。国際公開第２０１９０３２９２９号Ａ１パンフレットには、Ｔ細胞を遺伝子操作するための方法が開示されており、その方法では、Ｔ細胞を含む試料が刺激条件下でインキュベートされ、インキュベーションの少なくとも一部の期間中に、刺激されたＴ細胞に核酸が導入される。
【0003】
当技術分野では、例えば、生成されたＴ細胞の毒性を低減するためにおよび／またはプロセス時間を短縮するために、例えばそれを必要とする患者への投与の向上を可能にするために、遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための改良方法、優先的には自動化されたプロセスが必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
薬物製品を汚染する残留調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞の望ましくない活性化に結び付く可能性があるため、輸注すると有害である可能性がある。これは、炎症性サイトカインの急速な放出に結び付き、重度のサイトカイン放出症候群、発熱、低血圧、臓器不全、およびさらには死を引き起こす可能性がある。加えて、可溶性形態および／または細胞結合形態の薬物製品を汚染する残留レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの非標的細胞の形質導入により送達される抗原に対する養子免疫応答を含む、補体活性化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの望ましくない免疫応答を誘発する場合があるため、輸注すると有害である可能性がある。非標的細胞の形質導入および導入遺伝子のその後の発現は、望ましくない免疫応答の誘導、発がん性、生存率の変化、増殖の変化、生理学的状態の変化、および天然機能の変化など、望ましくない副作用を誘導する可能性がある。
【0005】
驚くべきことに、本明細書で開示する改変Ｔ細胞を生成するためのプロセスは、プロセスの開始から１４４時間未満に、１２０時間未満に、９６時間未満に、７２時間未満に、４８時間未満に、または２４時間未満にさえ短縮することができ、その期間に、患者にとって潜在的に有害な分子、試薬が、クリーンアップおよび追加の安全層としてプロセス中におよび／またはプロセスの終了時に除去され、つまりＴ細胞を含む試料が、その後それを必要とする患者にそのまま（再）輸注することができる遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料へと準備されることを見出した。遺伝子改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞であってもよく、適用は、患者のがんを治療するためであってもよい。
【0006】
こうした遺伝子改変Ｔ細胞の治療有効量へのさらなる拡大増殖はｉｎ ｖｉｖｏで生じることになるため、遺伝子操作Ｔ細胞を、患者の効果的な治療に必要であることが知られている細胞数へとｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させる必要がないことは驚くべきことだった。本明細書で開示の通りに生成された試料中の遺伝子改変Ｔ細胞の数（量）の拡大増殖は、プロセスの開始時に準備された試料のＴ細胞の数（量）と比較して１０倍未満、優先的には５倍未満であってもよい。これは、本明細書に開示の方法により生成される遺伝子改変Ｔ細胞の組成物／試料が高品質であるため、つまり試薬、レンチウイルスベクター、および未遺伝子操作Ｔ細胞成分による汚染が少ないため可能になったものである。
【0007】
本発明は、明示的な拡大増殖ステップの非存在下で本明細書に開示の方法を使用して数日以内に、例えば３日間（７２時間）でまたはそれ未満でｉｎ ｖｉｔｒｏにて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞が、驚くべきことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでロバストな抗腫瘍活性を促進することを実証することに成功し、機能的ＣＡＲ Ｔ細胞の生成には、ｉｎ ｖｉｖｏでの拡大増殖は必須であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大増殖は必須ではないことを証明する（実施例１０を参照）。
【0008】
３日間で実施された方法のデータが示されているが、７２時間（３日間）未満で、例えば４８時間または２４時間で本方法により生成される試料でもｉｎ ｖｉｖｏ効果が観察されることになり、生成された細胞によるがん性細胞の死滅というｉｎ ｖｉｖｏ効果を引き起こすまでの期間が遅延されることになるに過ぎないことは自明である。図９には、遺伝子移入効率が低減するのみで、製造時間をさらにまた短縮することができることを示すデータが提供されている。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】短期間での遺伝子改変Ｔ細胞の生成についての概略図。ヒトの全血、白血球アフェレーシス、バフィーコート、ＰＢＭＣ、増殖または単離Ｔ細胞などの、Ｔ細胞を含む試料を準備する。任意選択で、試料は、レンチウイルスベクターによる遺伝子改変を阻害する物質を含む血清を含む。効率的な形質導入を可能にするため、血清を洗浄により除去する。加えて、Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合する調節剤でポリクローナルに活性化し、その後レンチウイルスベクターを使用して遺伝子改変する。クリーンアップとして、調節剤を除去して、精製された遺伝子操作Ｔ細胞を得る。
【図2】調節性活性化作用剤の除去についての概略図。Ｔ細胞を、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含む調節試薬（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｒｅａｇｅｎｔ）でポリクローナルに活性化する。抗体またはそれらの断片は両方とも、生分解性リンカーに直接的または間接的にカップリングされている。調節活性化試薬（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）は、洗浄することにより、またはリンカーを特異的に分解する酵素を添加することにより除去することができ、それによりＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体または断片が遊離される。加えて、活性化試薬は、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片の化学的分断により除去することができる。調節剤またはその断片の細胞からの除去は、１つまたは幾つかの洗浄ステップにより実施することができる。
【図3】磁気濃縮試薬の除去についての概略図。磁気粒子を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片とカップリングしたＴ細胞と直接的にまたは間接的に接触させる、ＭＡＣＳなどの磁気細胞分離により、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離する。抗体またはその抗原結合性断片は、生分解性リンカーを介して磁気粒子にカップリングされている。カップリングした磁気粒子は、洗浄することにより、またはリンカーを特異的に分解する酵素を添加することにより除去することができ、それによりＣＤ４および／またはＣＤ２８に特異的な抗体または断片が磁気粒子から遊離される。加えて、磁気粒子は、化学的分断により除去することができる。磁気粒子またはその断片の除去は、１つまたは幾つかの洗浄ステップにより実施することができる。
【図4】Ｔ細胞の間接的磁気標識用試薬の除去についての概略図。Ｔ細胞は、磁気粒子を、ビオチン化されている生分解性リンカーを介してＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片とカップリングしたＴ細胞と接触させることにより間接的に標識することができ、磁気粒子は、ビオチンに特異的な抗体またはその抗原結合性断片にカップリングされている。磁気粒子は、生分解性リンカーを特異的に消化する酵素を添加することにより、および／またはビオチンを（競合物として）添加することにより、Ｔ細胞から遊離させることができる。加えて、間接的にカップリングした磁気粒子は、洗浄および／または化学的分断により除去することができる。分断された作用剤または磁気粒子の除去は、１つまたは幾つかの洗浄ステップにより実施することができる。
【図5】洗浄による活性化試薬の除去。濃縮Ｔ細胞を、生分解性リンカーと直接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。調節活性化試薬を含む刺激２０時間後のＴ細胞を洗浄し、結合した生分解性リンカーの存在を、刺激後の幾つかの時点にてフローサイトメトリーにより測定した。生分解性リンカーレベルの経時的な低減により検出されるように、刺激試薬は洗浄により効率的に除去される。
【図6】洗浄および酵素活性による調節剤の除去。濃縮Ｔ細胞を、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。調節活性化試薬に結合した刺激２０時間後のＴ細胞を洗浄し、２４時間後に生分解性リンカーの存在をフローサイトメトリーにより測定した。刺激２６時間後に、生分解性リンカーに特異的な酵素を添加し、生分解性リンカーの存在を、刺激後の幾つかの時点にて経時的に測定した。刺激試薬は、洗浄することおよび生分解性リンカーに特異的な酵素を添加することにより、効率的に除去される。
【図7】生分解性リンカーに特異的な酵素は無毒性である。濃縮Ｔ細胞を、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。刺激２６時間後に酵素をＴ細胞に添加し、２４時間後にＰＩ染色によるフローサイトメトリーで生存率を測定した。生分解性リンカーに特異的な酵素の有無に関わらず同等の生存率が検出可能だったため、生分解性リンカーに特異的な酵素は、濃縮および活性化されたＴ細胞に有害ではない。
【図8】累積的洗浄による非細胞成分の効率的な除去。非細胞成分の累積的洗浄および除去の効率を、個々の洗浄ステップ毎に２．６倍希釈のまたは個々の洗浄ステップ毎に５倍希釈のいずれかの２つの異なる洗浄レジメンに基づいて算出した。算出した累積希釈効率を、未希釈（つまり１００％）に対して正規化した。２．６倍段階希釈の場合、非細胞成分の比は、１１回の連続洗浄ステップ後に０．００１％を下回る。５倍段階希釈の場合、非細胞成分の比は、７回の連続洗浄ステップ後に０．００１％を下回る。
【図9】３日間でＴ細胞を遺伝子操作するためのプロセスの設定。０日目に形質導入し、１日目に生分解性リンカーに特異的な酵素であるデキストラナーゼと共にインキュベートしたＴ細胞は、最も低い形質導入効率レベルを示した。これは、Ｔ細胞刺激が不十分だったことを示す。これは、２日目または３日目に後から添加してより長期間刺激したＴ細胞を分析したところ、０日目に酵素と共にインキュベートしたＴ細胞と比較して、より高い形質導入効率レベルが検出可能だったことにより確認された。従来のプロトコールに近かったより良好な形質導入効率は、１日目に形質導入し、２日目または３日目にデキストラナーゼと共にインキュベートした刺激Ｔ細胞で観察された。
【図10】３日以内に生成された遺伝子操作Ｔ細胞のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における調節剤の効率的な除去。最大で１ｅ９個のＣＤ４／ＣＤ８細胞を有する、健康ドナーの白血球アフェレーシス試料を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で自動的に処理して、ＣＡＲ Ｔ細胞を３日以内に生成した。４ｅ８個のＴ細胞を、調節剤であるＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激し、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターで遺伝子改変した。２日目に、デキストラナーゼを含む１０ｍｌの溶液を自動的に添加し、生分解性リンカーを特異的に分解して、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体または断片を遊離させ、調節剤の活性を無効化した。対照として、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系での製造ランを、同じ条件下および同じドナー物質だが、生分解性リンカーに特異的な酵素を添加せずに実施した。図１０Ａ：ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における両Ｔ細胞遺伝子操作ランについて、生分解性リンカーの存在を、生分解性リンカーに特異的な抗体で染色した製剤化細胞に対するフローサイトメトリーにより評価した。図１０Ｂ：酵素を添加しないＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙランと比較したところ、わずかな割合のリンカー陽性細胞しか検出可能でなかったため、生分解性リンカーは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で効率的に除去された。加えて、すべての生存細胞の生分解性リンカーの平均強度レベル（ＭＦＩ）は、酵素を添加した場合は、バックグラウンドレベルだった。
【図11】２日目に活性化試薬を酵素的に除去する際のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系におけるＴ細胞刺激レベル。調節剤の除去が刺激レベルに及ぼす影響を、両方とも信頼性の高いＴ細胞活性化マーカーであると報告されているＣＤ２５およびＣＤ６９を染色してフローサイトメトリーにより評価した（ＣＤ２５：ＲＥＡ５７０；ＣＤ６９：ＲＥＡ８２４；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。小規模培養に由来する同じドナーから得られた非刺激Ｔ細胞は対照としての役目を果たし、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系から回収したＴ細胞を酵素で処理してまたは処理せずに分析した。未刺激対照細胞と比較して、活性化マーカーは両方とも非常に高い平均強度レベルが、デキストラナーゼで処理したまたは処理しなかったＴ細胞試料で検出された。これにより、両活性化マーカーの上方制御には２日目までの刺激ですでに十分であることが確認された。これは、すでに２日目にはまたはそれ以前でさえ、刺激に影響を及ぼすことなく、調節剤を除去することができることも示す。
【図12】Ｔ細胞を３日以内に遺伝子操作するための、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における刺激Ｔ細胞の増殖。３回の独立製造ランにおいてＴ細胞拡大増殖は３日目では検出可能ではなかった。これは、Ｔ細胞は十分に活性化されたが、Ｔ細胞の増殖はまだ始まっていないことを示唆する（図１２も参照）。結果的に、Ｔ細胞を３日以内に遺伝子改変するための製造プロトコールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖を支援するには短かすぎる。
【図13】小規模でのＣＡＲ発現動態の評価。図１３Ａ：５日後に、形質導入効率は１８～２２％のプラトーレベルに達し、安定した導入遺伝子送達および導入遺伝子発現が確認された。図１３Ｂ：形質導入２日後では、Ｔ細胞の１６％はすでにＣＡＲ陽性だったが、明確なＣＡＲ陽性集団はまだ検出可能ではなかった。後の時点では、明確なＣＡＲ発現集団がフローサイトメトリーで検出された。
【図14】ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系での大規模製造のＣＡＲ発現動態の評価。小規模での実験とは対照的に（図１３を参照）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でのＣＡＲ発現は、初期時点ではプラトーレベルに到達しなかった。形質導入２日後では、Ｔ細胞の１９％がＣＡＲ陽性だった。形質導入効率は、後期時点では７５％に増加した。これは、形質導入２日後ではＣＡＲがまだ十分に発現されていなかったことを示す。
【図15】ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でのＣＡＲ Ｔ細胞製造パラメーターの最適化。単離した刺激Ｔ細胞を、２．５ｍｌのＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ２０／ＣＤ１９タンデムＣＡＲコードレンチウイルスベクターを１ｅ８個のＴ細胞に対して用いて（図１５：条件Ｉを参照）、並行して同じレンチウイルスベクター容積を４ｅ８個のＴ細胞に対して用いて（図１５：条件ＩＩを参照）、遺伝子改変した。また、条件ＩＩでは、容積を増加させることにより、および初期振盪ステップを実施することにより、より高い細胞密度での培養を支援する。２日目に、同じ容積のデキストラナーゼを両Ｔ細胞製造条件に適用した。３日目に、製造されたＴ細胞を複数回洗浄し、回収し、総Ｔ細胞数を細胞計数により決定した。両ＣＡＲ Ｔ細胞製造条件の洗浄および回収した細胞試料を、インキュベーター内の２４ウェルでさらに８日間培養して、定常状態レベルのＣＡＲ発現が典型的に観察される際の形質導入効率の高信頼性評価を可能にした。図１５Ａ：条件ＩＩの形質導入効率は３２％だったが、条件Ｉの形質導入効率はわずか２０％だった。重要なことには、条件Ｉでは、１細胞当たりより高いＬＶ用量（ＭＯＩ）が適用された。図１５Ｂ：条件ＩＩでは、より高い形質導入効率が決定されただけでなく、４倍多くの（つまり４ｅ８個の）Ｔ細胞が形質導入された。これにより、条件ＩＩのＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の収率が、条件Ｉと比較してほぼ７倍に増加した。
【図16】３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン発現レベル。刺激され、ＣＤ２０－ＣＡＲが形質導入され、デキストラナーゼで処理された、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で３日以内に製造されたＴ細胞を、様々なエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で、ＣＤ２０、ＧＦＰ発現Ｒａｊｉ細胞と共に共培養し、２４時間後に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびＩＬ－２などの炎症性サイトカインの存在を、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカインキットアッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して評価した。３日以内に生成されたＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞では、ＩＦＮ－ｇ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－２レベルは、定量化レベルさえも超える高レベルにてＥ：Ｔ依存的様式で検出可能だった。対照的に、未刺激Ｔ細胞および未形質導入のままだった刺激Ｔ細胞では、サイトカインは検出可能ではなかった。これにより、３日以内に製造されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の腫瘍抗原特異的応答が確認される。
【図17】３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性。３日以内に製造されたＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ－ＧＦＰ細胞を、さらに２日間共培養し、細胞の５０％をフローサイトメトリーで分析して、残留腫瘍細胞の数、および結果的にはＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解能力を定量化した（ラウンド１；左）。別の２０，０００個のＲａｊｉ－ＧＦＰ腫瘍細胞を共培養の残り５０％に添加して、第２の連続ラウンドの共培養でＣＡＲ Ｔ細胞の効力を評価した。第２の連続ラウンドの共培養では、追加の腫瘍細胞を添加し、ＣＡＲ Ｔ細胞にとって困難であることが意図される条件下で細胞傷害活性を評価した（ラウンド２：右）。７２時間後、フローサイトメトリーを実施して、第２のラウンドの共培養の残留腫瘍細胞数を定量化した。Ｅ：Ｔ比が高い場合（つまり、１．２５：１）、Ｒａｊｉ細胞のほぼ１００％が、第１のラウンドでおよび第２のラウンドでも溶解された。対照的に、未形質導入対照では、わずか５０％および４０％の残留標的細胞が検出可能だった。Ｅ：Ｔ比が０．４２５：１の場合、機能性は、１．２５：１の場合と同等だったが、全体的なレベルは低かった。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の存在下では、第１および第２のラウンドの共培養において腫瘍細胞の６０％が溶解された。対照的に、未形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下では、第１のラウンドでは腫瘍細胞の４０％しか溶解せず、第２のラウンドでは死滅は検出可能ではなかった。未形質導入Ｔ細胞をＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較すると、Ｅ：Ｔ比が０．１５：１の場合、第１のラウンドでは特異的死滅は検出可能ではなかった。要するに、２回の連続ラウンドの共培養後に存在していた腫瘍細胞が、未形質導入対照と比較してより少ないことが検出可能だったため、３日以内に製造されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の機能性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認された。
【図18】３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能。３日以内に生成されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能性を、６～８週齢のＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスで確認した。実験はすべて、「科学的目的で使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会および理事会の指令２０１０／６３／ＥＵ（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２０１０／６３／ＥＵ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ２２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｕｒｐｏｓｅｓ）」に準拠し、ドイツ動物保護法の規制に準拠して実施した。手短に言えば、健康ドナーの白血球アフェレーシス試料を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で自動的に処理し、ＣＡＲ Ｔ細胞を３日以内に生成した（図１８上段を参照）。０日目に、白血球アフェレーシス試料を含むバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）チューブセット５２０に溶接により滅菌接続した。細胞を自動的に洗浄し、ＣＤ４およびＣＤ８ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬で標識して、Ｔ細胞を濃縮した。２ｅ８個のＴ細胞を、培養チャンバーのＩＬ－７／ＩＬ－１５含有培地に移し、２００ｍｌの培養容積中でＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した刺激Ｔ細胞をＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターで遺伝子改変して、ＣＤ２２／ＣＤ１９タンデム－ＣＡＲの発現を誘導した。１０ｍｌのレンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーへと自動的に移送した。２日目に、デキストラナーゼを含む１０ｍｌの溶液をチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーに自動的に添加してリンカーを特異的に分解した。これにより、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはそれらの断片が遊離され、調節剤の活性が阻害される。複数回洗浄した後、細胞産物をフローサイトメトリーで分析して、各ステップにおける形質導入効率、生存率、および細胞組成を決定した（図１９を参照）。マウス１匹当たりの総数が３ｅ６個または６ｅ６個のＣＡＲ形質導入群のＴ細胞を、回収した日に注射した（図１８下段を参照）。４日目前に、５ｅ５個のホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を静脈内接種することにより腫瘍を確立した（図１７を参照）。１群当たり７匹のマウスを処置した。２つの追加のグループを陰性対照として確立した。１群は、腫瘍細胞を受け取ったがＴ細胞は受け取らなかった（ｎ＝７；腫瘍のみ）。１群は、腫瘍細胞、および小規模で並行して培養した同じドナーに由来する３ｅ６個の未形質導入Ｔ細胞を受け取った（ｎ＝７）。腫瘍増殖ならびに抗腫瘍応答を、Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ）を使用して頻繁にモニターした。この目的のために、１００μｌのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｒｅｄｉｊｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｕｌｔｒａをｉ．ｐ．注射し、その後イソフルランＸＧＩ－８麻酔系を使用してマウスに麻酔をかけた。基質注射の６分後に測定を実施した。実験の終了時に、脾臓、骨髄、および血液を調製し、フローサイトメトリーで分析して、腫瘍細胞およびＴ細胞サブセットの頻度を決定した。
【図19】細胞組成。濃縮前、濃縮後、および回収後に採取した試料のＣＤ４５ｈ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６／ＣＤ５６、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９、ＣＤ１４を染色することによりフローサイトメトリーで細胞組成を決定して、細胞産物の品質を決定した。製剤化後の細胞組成は、６７％ＣＤ４ Ｔ細胞、１８％ＣＤ８ Ｔ細胞、および７％ＮＫＴ細胞だった。ＮＫ細胞、好酸球、好中球、Ｂ細胞、または単球の頻度はバックグラウンドレベルであった。これにより、濃縮後のＴ細胞純度が確認された。
【図20】選択した群の代表的なｉｎ ｖｉｖｏ画像化データ。腫瘍量ならびにＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化により頻繁にモニターした。３ｅ６個の生存Ｔ細胞を受け取ったマウスを含むコホートの場合、形質導入されたものおよび形質導入されていないものすべてのマウスが示されている。腫瘍のみの群の場合は、７匹中３匹の代表的なマウスが示されている。未形質導入Ｔ細胞または腫瘍細胞のみを受け取ったコホートのマウスでは、腫瘍量が急速に増加した。両対照群のマウスは、腫瘍量が臨界レベルに達したため、Ｔ細胞注射の１４日後に犠牲死させなければならなかった。対照的に、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を受け取ったマウスは、Ｔ細胞注射の３日後および７日後の初期時点では、対照群と比較して用量依存的様式で増加の減速を示した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の腫瘍量のレベルは、Ｔ細胞注射後７日目にピークに達し、続いて腫瘍量は、実験の開始時に測定されたレベルまで着実に低減された。
【図21】すべての群のｉｎ ｖｉｖｏ画像化データ。ｐ／ｓとして経時的に測定された平均腫瘍量＋／－ＳＥＭが、すべての群のすべてのマウスについて示されている。６Ｅ６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群（ｎ＝７）のデータが含まれている。６Ｅ６個のＴ細胞で処置したマウスは、３Ｅ６群よりも素早い抗腫瘍応答を示した。Ｔ細胞注射後１４日目では、腫瘍量は、両Ｔ細胞用量とも同等の低レベルに実質的に減少した。対照群（つまり、腫瘍のみおよび未形質導入Ｔ細胞）は、腫瘍増殖を制御することができず、強力な抗腫瘍活性を媒介することができなかった。
【図22】骨髄におけるＴ細胞の存在量。３匹のランダムに選択したマウスの骨髄におけるヒトＴ細胞の存在量を、ＣＤ４５ｈ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９ ＣＡＲ検出の染色により（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）フローサイトメトリーで定量化した。各マウスの数が示されている。対照群の場合、１４日目に試料採取した骨髄に対して分析を実施した。３ｅ６個ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の場合、３匹のランダムに選択したマウスを１８日目に分析した。予想通り、腫瘍のみの群ではＴ細胞は見出されなかった。未形質導入コホートでは、最大で２０％のＴ細胞が検出可能だった。対照的に、ヒトＴ細胞の頻度は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を輸注したマウスを含むコホートで最大７５％と最も高く、ＣＡＲ Ｔ細胞がこの微小環境へと回帰し、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖したことが示された。
【図23】骨髄における腫瘍およびＴ細胞の存在量。ヒト細胞内区画をより詳細に調査して、ヒトＲａｊｉ腫瘍細胞およびヒトＴ細胞の頻度を決定した。したがって、すべてのヒト細胞の頻度を１００％に設定した。各マウスの数が示されている。予想通り、腫瘍のみのコホートでは、ヒトＴ細胞は見出されず、Ｒａｊｉ細胞のみが見出された。骨髄は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の好ましい微小環境である。対照的に、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の場合、この臓器ではわずかな割合のＲａｊｉ細胞しか検出可能ではなかった。これは、こうした代表的なマウスの臓器には約５０％のヒトＣＤ４ Ｔ細胞および約５０％のヒトＣＤ８ Ｔ細胞が存在することと一致する。ヒト細胞の２０～６０％は、未形質導入Ｔ細胞群のＲａｊｉ細胞であり、ＣＤ４ Ｔ細胞対ＣＤ８ Ｔ細胞の比は２：１～３：１だった。
【図24】脾臓におけるＴ細胞サブセットの存在量。３匹のランダムに選択したマウスの脾臓におけるＴ細胞の存在量を、ＣＤ４５ｈ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９ ＣＡＲ検出の染色により（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）フローサイトメトリーで定量化した。各マウスの数が示されている。対照群の場合、１４日目に試料採取した脾臓に対して分析を実施した。３ｅ６個ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の場合、３匹のランダムに選択したマウスを１８日目に分析した。予想通り、腫瘍のみの群ではＴ細胞は見出されなかった。未形質導入コホートでは、最大で１０％のＴ細胞が検出可能だった。対照的に、ヒトＴ細胞の頻度は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を輸注したマウスを含むコホートで最大４０％と最も高かった。
【図25】血液中のＴ細胞サブセットの存在量。３匹のランダムに選択したマウスの血液中を循環するＴ細胞の存在量を、ＣＤ４５ｈ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９ ＣＡＲ検出の染色により（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）フローサイトメトリーで定量化した。各マウスの数が示されている。対照群の場合、１４日目に試料採取した脾臓に対して分析を実施した。３ｅ６個ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の場合、３匹のランダムに選択したマウスを１８日目に分析した。腫瘍のみの群ではＴ細胞は見出されなかった。未形質導入Ｔ細胞を有するマウスを含むコホートではわずかな割合のＴ細胞しか見出されなかった。対照的に、血液中を循環するヒトＴ細胞の頻度は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を輸注したマウスを含むコホートで最大２５％と最も高かった。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の一態様は、遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための方法であって、
ａ）Ｔ細胞を含む試料を準備するステップ、
ｂ）試料を遠心分離により調製するステップ、
ｃ）ステップｂのＴ細胞を濃縮する（調製した試料からＴ細胞を濃縮する）ステップ、
ｄ）調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を使用して、濃縮されたＴ細胞を活性化するステップ、
ｅ）レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入により、活性化されたＴ細胞を遺伝子改変するステップ、
ｆ）調節剤を除去するステップ
を含み、
それにより、遺伝子改変Ｔ細胞の試料が生成され、
前記方法が１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で実施される、方法を提供する。
ａ）Ｔ細胞を含む試料を準備するステップ、
ｂ）試料を遠心分離により調製するステップ、
ｃ）ステップｂのＴ細胞を濃縮する（調製した試料からＴ細胞を濃縮する）ステップ、
ｄ）調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を使用して、濃縮されたＴ細胞を活性化するステップ、
ｅ）レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入により、活性化されたＴ細胞を遺伝子改変するステップ、
ｆ）調節剤を除去するステップ
を含み、
それにより、遺伝子改変Ｔ細胞の試料が生成され、
前記方法が１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で実施される、方法を提供する。
【0011】
現在まで、ＣＡＲ Ｔ細胞輸注後の最も一般的な副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）として知られている免疫活性化の開始である。これは、輸注したＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲ抗原を発現する潜在的に高負荷の腫瘍細胞を認識して輸注直後に放出するサイトカインにより引き起こされる全身性炎症応答である。すべてのＣＡＲ Ｔ細胞がこの初期時点でＣＡＲを発現するわけではなく、ＣＡＲ発現レベルはその後着実にだがゆっくりと増加するため、短期間内でＣＡＲ Ｔ細胞を製造することにより、この毒性を少なくとも部分的に低減することができる（実施例１０を参照）。
【0012】
例えば、本明細書で開示のＴ細胞濃縮に使用される調節剤および／または磁気粒子を除去すること、および１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間（３日間）未満、４８時間未満、または２４時間未満で本明細書に開示の方法を実施することを組み合わせることにより、例えば、がんを罹患している患者のｉｎ ｖｉｖｏ治療への適用を成功させることが可能になり、ここで、前記方法の前記生成された試料中のＴ細胞の数は、前記準備した試料中のＴ細胞の数と比較して１０倍未満または５倍未満である。
【0013】
Ｔ細胞を含む準備した試料（または試料の準備）は、ヒトなどの対象から準備してもよい（試料は、対象により提供されるＴ細胞を含む）。前記準備した試料は、ヒトの全血、対象の白血球アフェレーシス、バフィーコート、ＰＢＭＣ、増殖または単離Ｔ細胞であってもよい。
【0014】
前記試料の調製は、容積低減、再緩衝化、血清除去、赤血球低減、血小板除去、および／または洗浄をもたらし得る。
【0015】
あるいは、前記方法は、Ｔ細胞を含む試料を準備するステップａから開始してもよい。
【0016】
あるいは、前記方法は、Ｔ細胞を含む試料を遠心分離により調製するステップｂから開始してもよい。この代替ステップｂの後には、ステップｃ～ｆが続いてもよい。
【0017】
前記方法において、ステップａ）の前記試料はヒト血清を含み、前記血清はステップｂ）により除去される。
【0018】
前記ヒト血清は、細胞へのレンチウイルスベクター粒子の形質導入効率を低減させる成分を含んでいてもよい。形質導入効率を低下させる可能性のあるヒト血清の前記成分は、対象の補体系の成分であってもよく、または中和抗体であってもよい（例えば、ＤｅＰｏｌｏら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：２１８～２２２頁を参照）。
【0019】
ヒト血清の除去は、前記遠心分離により達成される洗浄（洗浄ステップ）により実施され得る。洗浄ステップは、一連の培地／緩衝液交換（少なくとも２回の交換）により実施され得、それによりヒト血清および／またはその成分がＴ細胞から除去される。
【0020】
前記方法において、前記Ｔ細胞は、２時間未満、優先的には１時間未満で調製および濃縮される。
【0021】
前記方法において、前記Ｔ細胞は、前記調節剤を使用して、７２時間未満、優先的には４８時間未満、より優先的には２４時間未満で活性化（刺激）される、つまり、前記調節剤の添加および前記調節剤の除去は、前記時間内に生じる。
【0022】
前記方法において、前記活性化Ｔ細胞の形質導入は、調節剤を使用した前記Ｔ細胞刺激の２日後に、優先的には前記刺激の１日後に、より優先的には前記刺激と同時に開始される。
【0023】
前記方法において、前記調節性活性化作用剤は、前記調節剤をＴ細胞に添加した（ステップｄ）後２時間未満に、優先的には１時間未満に、より優先的には３０分未満に除去され得る（ステップｆ）。
【0024】
前記方法において、レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入による前記Ｔ細胞の前記遺伝子改変（ステップｅ）は、２日未満で、優先的には１日未満で、より優先的には１２時間未満で実施され得る。
【0025】
前記方法において、準備した試料のＴ細胞は、Ｔ細胞の前記遺伝子改変を行う前に、ＣＤ４および／またはＣＤ８を陽性選択マーカーとして使用することにより、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞が濃縮され得、および／または準備した試料のＴ細胞は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を陰性選択マーカーとして使用することにより、Ｔ細胞を含む試料を汚染するがん細胞が枯渇され得る。ＴＡＡは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＩｇＫ、ＩＬ－１Ｒａｐ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＲＯＲ１、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＦＡＰ、ＦＲ－ａ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ－１３Ｒａ２、Ｌ１－ＣＡＭ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、およびＣＤ１６Ｖの１つまたは複数のマーカーから選択することができる。
【0026】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の濃縮および／または準備した試料からのがん細胞の枯渇は、分離ステップにより実施することができる。前記分離は、ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇなどのフローサイトメトリー法（蛍光活性化細胞選別）、ＭＡＣＳなどの磁気細胞分離、またはＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｔｙｔｏ（登録商標）などのマイクロチップベースの細胞選別により実施することができる。磁気細胞分離ステップの使用が好ましい。
【0027】
前記方法において、前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮は、
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片が除去され得る、ステップ、
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）分離後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片が除去され得る、ステップ、
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）分離後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
【0028】
前記方法において、前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮は、
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片が、洗浄により除去され得る、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）分離後に洗浄により前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片が、洗浄により除去され得る、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）分離後に洗浄により前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
【0029】
前記方法において、前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮は、
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片とが、化学的におよび／または酵素的に分断され得る、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片との化学的および／または酵素的分断により、分離ステップ後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させるステップであって、前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片とが、化学的におよび／または酵素的に分断され得る、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）前記磁気粒子と、それにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片との化学的および／または酵素的分断により、分離ステップ後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
【0030】
化学的および／または酵素的分断による分離ステップ後の濃縮されたＴ細胞からの前記磁気粒子の前記除去は、磁場内で実施され得、または磁場の除去後に実施され得る。
【0031】
前記細胞に直接的にまたは間接的に結合した磁気粒子を細胞から除去するための方法および系は、当技術分野で周知である。
【0032】
細胞からの磁気粒子の分断をもたらす、細胞を磁気粒子で可逆的に標識するための例示的な一部の方法および系は、本明細書に挙げられている。
【0033】
１つの戦略では、非共有結合相互作用の特異的競合が活用される。米国特許出願公開第２００８０２５５００４号明細書には、固体支持体に結合されている、デスチオビオチンのような修飾ビオチンおよび修飾ストレプトアビジンまたはアビジンにコンジュゲートされている、標的部分を認識する抗体を使用して、固体支持体、例えば磁気粒子に可逆的に結合させる方法が開示されている。修飾結合パートナーの結合相互作用は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の強力で特異的な結合と比較して弱いため、こうした競合物質の存在下では解離が促進される。欧州特許第２７２５３５９号Ｂ１明細書には、標的部分を認識するリガンド－ＰＥＯ－ビオチン－コンジュゲートと、競合分子であるビオチン、ストレプトアビジン、または補助試薬を添加することにより遊離させることができる、磁気粒子を含む抗ビオチン－抗体との間の非共有相互作用に基づく可逆的磁気細胞分離系が記載されている。
【0034】
前記方法において、前記ＣＤ４および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の濃縮は、
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片にリンカーを介して間接的にカップリングされている磁性粒子と接触させるステップであって、前記磁性粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記リンカーと前記抗体またはその抗原結合性断片との間の結合と競合する競合剤を添加することにより除去することができる、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）競合剤を添加することにより、分離ステップ後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
ｉ）Ｔ細胞を、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片にリンカーを介して間接的にカップリングされている磁性粒子と接触させるステップであって、前記磁性粒子およびそれにカップリングされている前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記リンカーと前記抗体またはその抗原結合性断片との間の結合と競合する競合剤を添加することにより除去することができる、ステップ；
ｉｉ）ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞を磁場中で分離するステップ、
ｉｉｉ）競合剤を添加することにより、分離ステップ後に前記磁気粒子を、濃縮されたＴ細胞から除去するステップ
を含む磁気細胞分離ステップにより実施される。
【0035】
前記方法において、前記競合剤は、ビオチン、ストレプトアビジン、または補助試薬である。
【0036】
こうした競合遊離機序の他に、標識の除去としては、機械的撹拌、化学的に切断可能なまたは酵素的に分解可能なリンカーが言及される。国際公開第９６／３１７７６号パンフレットには、分離後に、粒子コーティングの部分、またはコーティングと抗原認識部分との間の連結基に存在する部分を酵素的に切断することにより、磁気粒子を標的細胞から遊離させる方法が記載されている。一例は、デキストランでコーティングされている、および／またはデキストランを介して抗原認識部分に連結されている磁気粒子の応用である。その後の単離標的細胞の磁気粒子からの切断は、デキストラン分解酵素であるデキストラナーゼの添加により開始される。欧州特許第３０３７８２１号明細書の関連方法には、酵素分解性スペーサーを有するコンジュゲートを用いた、例えば蛍光シグナルによる標的部分の検出および分離が開示されている。
【0037】
最近、標的部分に対する結合が低親和性定数により特徴付けられる抗原認識部分を使用する技法への関心が高まっている。そうした低親和性抗原認識部分による特異的で安定した標識を確保にするため、標識コンジュゲートの構造は、高い結合力を提供する、抗原認識部分の多量体化を含んでいなければならない。低親和性抗原認識部分は、多量体化が分断されると標的部分から解離することができるため、検出部分および抗原認識部分を最良の状態で標的部分から遊離させる機会が提供される。
【0038】
この可逆的多量体染色は、米国特許第７７７６５６２号明細書において最初に記載され、また米国特許第８２９８７８２号明細書にもそれぞれ記載されており、多量体化は、非共有結合相互作用により構築されている。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを有する例示的な低親和性ペプチド／ＭＨＣモノマーは、ストレプタクチンと多量体化されており、多量体化は、競合分子であるビオチンを添加すると解除可能である。
【0039】
この方法は、可逆的標識を可能にするための抗原認識部分に対応する受容体結合試薬の特徴に関して米国特許第９０２３６０４号明細書で概説されている。結合パートナーＣとの解離速度定数が約０．５×１０－４ｓｅｃ－１またはそれよりも大きいことにより特徴付けられる受容体結合試薬は、結合パートナーＣと可逆的に非共有結合で相互作用する少なくとも２つの結合部位Ｚを有する多量体化試薬により多量体化され、標的抗原に対して高い結合力を有する複合体を提供する。検出可能な標識は、多価結合複合体に結合されている。多量体化の可逆性は、結合パートナーＣと多量体化試薬の結合部位Ｚとの間の結合が分断されると開始される。例えば、Ｆａｂ－ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ストレプタクチンの多量体では、多量体化は、競合物質であるビオチンにより解除することができる。
【0040】
欧州特許第０８１９２５０号Ｂ１明細書には、親和性試薬、例えば、抗体またはその抗原結合性断片を介して細胞表面に結合している磁気粒子を遊離させるための方法が提供されている。磁気粒子は、（ａ）粒子のコーティングおよび（ｂ）コーティングと親和性試薬との間の連結基の少なくとも１つに存在するグリコシド連結に特異的なグリコシダーゼの作用により遊離される。
【0041】
欧州特許第３３３６５４６号Ａ１明細書には、
ａ）基本式（Ｉ）：
Ａｎ－Ｐ－Ｂｍ－Ｃｑ－Ｘｏ （Ｉ）
を有する少なくとも１つのコンジュゲートであって、
式中、Ａ：抗原認識部分
Ｐ：酵素分解性スペーサー
Ｂ：第１の結合部分
Ｃ 第２の結合部分
Ｘ：検出部分
ｎ、ｍ、ｑ、ｏ １～１００の整数であり、
式中、ＢおよびＣは互いに非共有結合で結合しており、ＡおよびＢはＰと共有結合で結合している、コンジュゲートを準備するステップ；
ｂ）抗原認識部分Ａにより認識される標的部分を少なくとも１つのコンジュゲートで標識するステップ；
ｃ）標識された標的部分を検出部分Ｘにより検出するステップ；
ｄ）ＢｍとＣｑの間の非共有結合を分断することにより、標識された標的部分からＣｑ－Ｘｏを、切断するステップ；
ｅ）スペーサーＰを酵素的に分解することにより、標識された標的部分から結合部分Ｂｍを切断するステップ
により、生物学的検体の試料中の標的部分を検出するための方法が開示されている。
ａ）基本式（Ｉ）：
Ａｎ－Ｐ－Ｂｍ－Ｃｑ－Ｘｏ （Ｉ）
を有する少なくとも１つのコンジュゲートであって、
式中、Ａ：抗原認識部分
Ｐ：酵素分解性スペーサー
Ｂ：第１の結合部分
Ｃ 第２の結合部分
Ｘ：検出部分
ｎ、ｍ、ｑ、ｏ １～１００の整数であり、
式中、ＢおよびＣは互いに非共有結合で結合しており、ＡおよびＢはＰと共有結合で結合している、コンジュゲートを準備するステップ；
ｂ）抗原認識部分Ａにより認識される標的部分を少なくとも１つのコンジュゲートで標識するステップ；
ｃ）標識された標的部分を検出部分Ｘにより検出するステップ；
ｄ）ＢｍとＣｑの間の非共有結合を分断することにより、標識された標的部分からＣｑ－Ｘｏを、切断するステップ；
ｅ）スペーサーＰを酵素的に分解することにより、標識された標的部分から結合部分Ｂｍを切断するステップ
により、生物学的検体の試料中の標的部分を検出するための方法が開示されている。
【0042】
欧州特許第３３３６５４６号Ａ１明細書の方法は、標的部分、つまり、そのような標的部分を発現する標的細胞を検出するためだけでなく、生物学的検体の試料から標的細胞を単離するためにも使用することができる。単離手順では、標的部分の検出が駆使される。例えば、蛍光による標的部分の検出を使用して、ＦＡＣＳまたはＴＹＴＯ分離系で実施されるような適切な分離プロセスを開始することができる。欧州特許第３３３６５４６号Ａ１明細書の方法では、周知の磁気細胞分離プロセスを、検出および分離プロセスとして使用することもでき、磁気粒子は磁場により検出される。
【0043】
本発明の好ましい実施形態では、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片に直接的にカップリングされている前記磁気粒子は、生分解性リンカーを介してカップリングされており、前記生分解性リンカーは、生分解性リンカーを（特異的に）消化する酵素を添加することにより分解される。前記生分解性リンカーは、ポリサッカライドであってもよくまたはポリサッカライドを含んでいてもよく、前記グリコシド連結を特異的に消化する酵素は、加水分解酵素である。
【0044】
前記生分解性リンカーは、デキストランであってもよくまたはデキストランを含んでいてもよく、前記デキストランを（特異的に）消化する酵素は、デキストラナーゼであってもよい。
【0045】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片に間接的にカップリングされている前記磁気粒子は、２つの成分：
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、デキストランなどのリンカー、またはＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、ＣＤ４および／もしくはＣＤ８に特異的な前記Ｆａｂ、
ｉｉ）前記タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはその抗原結合性断片にカップリングされている磁気粒子を介してカップリングされており、成分ｉおよびｉｉを一緒にした後、およびＴ細胞を、前記間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させた後、前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより、磁気粒子を分断（除去）することができる。
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、デキストランなどのリンカー、またはＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、ＣＤ４および／もしくはＣＤ８に特異的な前記Ｆａｂ、
ｉｉ）前記タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはその抗原結合性断片にカップリングされている磁気粒子を介してカップリングされており、成分ｉおよびｉｉを一緒にした後、およびＴ細胞を、前記間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させた後、前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより、磁気粒子を分断（除去）することができる。
【0046】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤ４および／またはＣＤ８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片に間接的にカップリングされている前記磁気粒子は、２つの成分：
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、デキストランなどの生分解性リンカー、
ｉｉ）前記タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはその抗原結合性断片にカップリングされている磁気粒子を介してカップリングされており、成分ｉおよびｉｉを一緒にした後、およびＴ細胞を、前記間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させた後、デキストラナーゼなどの、生分解性リンカーを特異的に消化する酵素を添加することにより、および／または前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより、磁気粒子は前記Ｔ細胞から分断され得る。
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、デキストランなどの生分解性リンカー、
ｉｉ）前記タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはその抗原結合性断片にカップリングされている磁気粒子を介してカップリングされており、成分ｉおよびｉｉを一緒にした後、およびＴ細胞を、前記間接的にカップリングされている磁気粒子と接触させた後、デキストラナーゼなどの、生分解性リンカーを特異的に消化する酵素を添加することにより、および／または前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより、磁気粒子は前記Ｔ細胞から分断され得る。
【0047】
前記方法において、前記競合剤は、ビオチン、ストレプトアビジン、または補助試薬である。
【0048】
本発明のこの実施形態の原理は、遊離／分断原理に関して図４に例示されている。
【0049】
前記方法において、前記調節剤は、リンカーを介して直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片は除去され得る。
【0050】
前記方法において、前記細胞からの調節剤の除去は、１つまたは複数の洗浄ステップによりさらに実施され得る。
【0051】
前記方法において、ている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片は、化学的および／または酵素的に分断され得、前記調節剤は、前記ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片の化学的および／または酵素的分断により除去される。分断された調節剤の細胞からの除去は、１つまたは複数の洗浄ステップによりさらに実施され得る。
【0052】
また、前記細胞と直接的にまたは間接的にカップリングされている磁気粒子を細胞から除去するための前記に記載の方法および系は、リンカーを介して直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含む前記調節剤の除去に好適であり得、移行させてもよく、および／または適用してもよい。
【0053】
前記方法において、前記ＣＤ３および／またはＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片の前記調節剤の前記除去は、
ａ）タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加するステップを含む競合反応であって、ただし前記調節剤は、２つの成分を介して間接的にカップリングされている、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片を含み、前記２つの成分は、
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどの前記タグにカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片、またはＰＥＯ－ビオチンなどの前記タグにカップリングされているデキストランなどのリンカーを介してカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはＦａｂなどのその抗原結合性断片、ならびに
ｉｉ）タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはＦａｂなどのそれらの抗原結合性断であってもよく、前記成分ｉ）およびｉｉ）は、細胞と一緒にされており、接触している、競合反応；ならびに／あるいは
ｂ）前記リンカーを生分解する酵素を添加するステップを含む酵素的分断であって、ただしリンカーは生分解性リンカー（つまり、リンカーを介した２つの抗体またはその抗原結合性断片の間接的または直接的な連結）である、酵素的分断
により実施される。
ａ）タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加するステップを含む競合反応であって、ただし前記調節剤は、２つの成分を介して間接的にカップリングされている、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片を含み、前記２つの成分は、
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどの前記タグにカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片、またはＰＥＯ－ビオチンなどの前記タグにカップリングされているデキストランなどのリンカーを介してカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはＦａｂなどのその抗原結合性断片、ならびに
ｉｉ）タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはＦａｂなどのそれらの抗原結合性断であってもよく、前記成分ｉ）およびｉｉ）は、細胞と一緒にされており、接触している、競合反応；ならびに／あるいは
ｂ）前記リンカーを生分解する酵素を添加するステップを含む酵素的分断であって、ただしリンカーは生分解性リンカー（つまり、リンカーを介した２つの抗体またはその抗原結合性断片の間接的または直接的な連結）である、酵素的分断
により実施される。
【0054】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記調節剤は、２つの成分：
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片、またはＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされているデキストランなどのリンカーを介してカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはＦａｂなどのその抗原結合性断片、
ｉｉ）タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片
を介して間接的にカップリングされている、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片を含み、
成分Ｉおよびｉｉを一緒にした後、および前記一緒にした成分をＴ細胞と接触させた後、前記一緒にした成分は、前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより分断（除去）され得る。
ｉ）ＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片、またはＰＥＯ－ビオチンなどのタグにカップリングされているデキストランなどのリンカーを介してカップリングされている、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはＦａｂなどのその抗原結合性断片、
ｉｉ）タグ、例えばビオチンに特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片
を介して間接的にカップリングされている、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に特異的な抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片を含み、
成分Ｉおよびｉｉを一緒にした後、および前記一緒にした成分をＴ細胞と接触させた後、前記一緒にした成分は、前記タグ、例えばビオチン（競合物質としての）と競合する競合剤を添加することにより分断（除去）され得る。
【0055】
前記生分解性リンカーは、ポリサッカライドであってもよくまたはポリサッカライドを含んでいてもよく、前記グリコシド連結を特異的に消化する酵素は、加水分解酵素であってもよい。
【0056】
生分解性リンカーは、デキストランであってもよくまたはデキストランを含んでいてもよく、デキストランを特異的に消化する酵素は、デキストラナーゼであってもよい。
【0057】
本発明の好ましい実施形態では、調節剤は、生分解性リンカーを介して直接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片および／またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片を含み、前記生分解性リンカーは、生分解性リンカーを特異的に消化する酵素を添加することにより分解される。前記生分解性リンカーは、ポリサッカライドであってもよくまたはポリサッカライドを含んでいてもよく、前記グリコシド連結を特異的に消化する酵素は、加水分解酵素である。
【0058】
前記生分解性リンカーは、デキストランであってもよくまたはデキストランを含んでいてもよく、前記デキストランを特異的に消化する酵素は、デキストラナーゼであってもよい。
【0059】
レンチウイルスベクター粒子を用いた形質導入によるＴ細胞の遺伝子改変後、残留レンチウイルスベクター粒子が除去される、前記方法。
【0060】
前記残留レンチウイルスベクター粒子の除去は、前記調節剤の除去および／または前記磁気粒子の前記除去の前に、除去に続いて、または除去の後に実施してもよい。
【0061】
前記残留レンチウイルスベクター粒子の除去は、洗浄により実施され得、洗浄は、遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料中の残留ベクター粒子の１０分の１以下、好ましくは１００分の１の低減をもたらす。
【0062】
洗浄ステップは、一連の培地／緩衝液交換（少なくとも２回の交換）により実施してもよく、それにより、前記遺伝子改変Ｔ細胞を含む前記試料から前記残留レンチウイルスベクター粒子が除去される。交換は、遠心分離、沈降、付着、または濾過による細胞および培地／緩衝液の分離、およびその後の培地／緩衝液の交換により実施され得る。
【0063】
洗浄による、遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料中の残留ベクター粒子の１０分の１以下、好ましくは１００分の１の低減は、例えば、
ｉ）細胞および培地／緩衝液を分離すること
ｉｉ）培地／緩衝液の容積の９０％、好ましくは９９％を除去すること
ｉｉｉ）新しい培地／緩衝液を添加して元の容積にすること
ｉｖ）細胞を培地／緩衝液に再懸濁すること
により達成することができる。
ｉ）細胞および培地／緩衝液を分離すること
ｉｉ）培地／緩衝液の容積の９０％、好ましくは９９％を除去すること
ｉｉｉ）新しい培地／緩衝液を添加して元の容積にすること
ｉｖ）細胞を培地／緩衝液に再懸濁すること
により達成することができる。
【0064】
洗浄ステップは、レンチウイルスベクターの累積的低減をもたらすことができる連続的様式で実施され得る（つまり、１ステップ当たり１０分の１の低減を伴う２つの洗浄ステップは、１００分の１の累積的低減をもたらす）。
【0065】
前記残留レンチウイルスベクター粒子の除去は、レンチウイルスベクター粒子を不活性化するおよび／またはそれらの安定性を低減する物質と共にインキュベーションすることにより実施され得る。レンチウイルスベクター粒子を不活性化し、および／またはそれらの安定性を低減する物質は、前記インキュベーション後に洗い流すことができ、前記インキュベーションは、３時間よりも長期にわたっては、優先的には１時間よりも長期にわたっては行われない。
【0066】
レンチウイルスベクター粒子を不活性化し、および／またはそれらの安定性を低減するそのような物質は、例えば、ヘパリン、抗レトロウイルス剤、ヒト血液の補体因子、ヒト血液に含まれる中和抗体、または弱塩基性緩衝液であってもよい。
【0067】
前記抗レトロウイルス剤は、例えば、ジドブジン（ｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎ、ＡＺＴ）またはラルテグラビルなどの、ウイルス酵素の阻害剤であってもよい。
【0068】
血液、例えばヒトの血液に含まれる補体因子および／または中和抗体は、当技術分野で周知の方法により単離することができる。
【0069】
弱塩基性緩衝液は、試料のＴ細胞に害を及ぼさないように十分に穏やかな約７～９のｐＨ値を有してもよい。そのような緩衝液は、例えば、Ｈｏｌｉｃら（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４年９月；２５巻（３号）：１７８～８５頁）に記載されている。
【0070】
前記方法において、本明細書で開示の除去されたヒト血清、またはレンチウイルスベクター粒子のＴ細胞への生産的形質導入を阻害する補体因子および／もしくは中和抗体などのそれから単離された物質を、遺伝子改変Ｔ細胞に添加し、それにより残留レンチウイルスベクター粒子を除去および／または中和することができる。
【0071】
本明細書に開示の方法は、優先的には閉鎖系で実施される自動化された方法である。
【0072】
本明細書に開示の方法は、優先的にはＧＭＰ条件下の閉鎖系において自動化プロセスとして完全に実施することができる。
【0073】
そのような閉鎖系は、ＧＭＰまたはＧＭＰ様条件下（「滅菌」）での操作を可能にし、臨床的に適用可能な細胞組成物をもたらす。本明細書では、例示的に、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）が閉鎖系として使用されている。この系は、国際公開第２００９／０７２００３号パンフレットに開示されている。しかしながら、本発明の方法の使用をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙに限定することは意図されていない。
【0074】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）系は、完全な細胞製品製造プロセスを自動化および標準化するように設計されている。この系では、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）が、幅広い範囲のセンサー制御細胞処理機能と組み合わされている。このデバイスの顕著な特徴は、以下の通りである。
・ 標準化された細胞処理および培養を可能にする使い捨てＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバー
・ 単独でのまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）と組み合わせた細胞濃縮および枯渇機能
・ 温度および制御されたＣＯ２ガス交換による細胞培養および細胞拡大増殖機能
・ 事前に規定されている培地および容積での最終製品製剤化
・ 細胞処理をカスタマイズするためのＦｌｅｘｉｂｌｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｓｕｉｔｅ（ＦＰＳ）およびＧＡＭＰ５互換プログラミング言語を使用したデバイスのプログラミング実現性
・ 様々な用途向けの特注チューブセット
・ 標準化された細胞処理および培養を可能にする使い捨てＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバー
・ 単独でのまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）と組み合わせた細胞濃縮および枯渇機能
・ 温度および制御されたＣＯ２ガス交換による細胞培養および細胞拡大増殖機能
・ 事前に規定されている培地および容積での最終製品製剤化
・ 細胞処理をカスタマイズするためのＦｌｅｘｉｂｌｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｓｕｉｔｅ（ＦＰＳ）およびＧＡＭＰ５互換プログラミング言語を使用したデバイスのプログラミング実現性
・ 様々な用途向けの特注チューブセット
【0075】
遠心分離チャンバーおよび培養チャンバーは同一であってもよい。遠心分離チャンバーおよび培養チャンバーは、種々の条件で使用することができる。例えば、分離または形質導入の場合、高速回転速度（つまり、大きなｇの力）を適用することができるが、例えば、培養ステップは、回転を遅くしてまたはさらにはアイドリング状態で実施してもよい。本発明の別の変異形式では、チャンバーは、チャンバーが振盪し、細胞が懸濁状態で維持されることをもたらす振動様式で回転方向を変化させる。したがって、本発明のプロセスでは、Ｔ細胞刺激ステップ、遺伝子改変ステップ、および／または培養ステップは、遠心分離または培養チャンバーの定常または振盪条件下で実施され得る。
【0076】
前記方法において、生成された試料中のＴ細胞の数は、前記準備した試料中のＴ細胞の数と比較して１０倍未満、優先的には５倍未満であってもよい。
【0077】
前記方法において、生成されたＴ細胞は、４回未満の、優先的には３回未満の細胞分裂を起こす。
【0078】
こうした遺伝子改変Ｔ細胞の治療有効量へのさらなる拡大増殖はｉｎ ｖｉｖｏで生じることになるため、患者の効果的治療に必要であることが知られている細胞数へと、遺伝子操作Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させる必要はない（例えば、Ｇｈａｓｓｅｍｉら、２０１８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ６巻：１１００～１１０９頁を参照）。これは、本明細書に開示の方法により生成される遺伝子改変Ｔ細胞の組成物／試料が高品質であるため、つまり、未遺伝子操作Ｔ細胞成分および毒性物質による汚染が少ないため可能になったものである。
【0079】
遺伝子改変Ｔ細胞のより大きな細胞数へのｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大増殖／増殖の省略は、改変Ｔ細胞を含む臨床的に適用可能な組成物を調製するために必要な時間の短縮を可能にする。
【0080】
前記遺伝子改変Ｔ細胞は、それらの細胞表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または任意のアクセサリー分子を発現するように遺伝子改変されていてもよい。
【0081】
最終製剤化のために、遺伝子改変Ｔ細胞を、遠心分離により洗浄し、培養培地を、生成された細胞組成物を患者に輸注するなど、その後の用途に適切な緩衝液と置き換えてもよい。
【0082】
必要に応じて、遺伝子改変Ｔ細胞を、例えば磁気分離技術を再び使用して未改変Ｔ細胞から分離してもよい。
【0083】
一態様では、本発明は、本明細書に開示の方法により得られる細胞組成物を提供する。
【0084】
本発明の一実施形態では、前記細胞組成物は、任意選択で医薬担体を含む医薬細胞組成物である。
【0085】
本発明の方法は、本発明の任意の実施形態ならびに／または本明細書に記載のステップを、本明細書に開示の遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための機能的方法がもたらされる任意の順序および／もしくは組合せで含んでいてもよい。
【0086】
本発明の上記適用および実施形態に加えて、本発明のさらなる実施形態が下記に記載されているが、そうした実施形態への限定は意図されていない。
【0087】
実施形態
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用することにより、閉鎖系における自動化されたプロセスでキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用することにより、閉鎖系における自動化されたプロセスでキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。
【0088】
例えば、がんを罹患しているヒトに由来するＴ細胞を含む試料を準備することができる。Ｔ細胞を含む準備した試料のヒト血清は、遠心分離ステップにより洗い流すことができる。
【0089】
ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、デキストランを介して磁気粒子にカップリングされている抗ＣＤ４および／または抗ＣＤ８抗体またはその抗原結合性断片を使用して磁気分離ステップで濃縮することができる。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、Ｔ細胞を含む試料から磁場中で分離した後、デキストラン鎖を切断することにより抗体またはそれらの断片と磁気粒子との結合を分断するデキストラナーゼを添加することにより、磁気粒子を濃縮細胞から除去する。
【0090】
濃縮されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、デキストランを含むリンカーを介してカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を調節剤として使用して２４時間にわたって活性化することができる。
【0091】
ＣＡＲをコードする核酸を含むレンチウイルスベクター粒子を、活性化されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む試料に添加することができる。刺激中または刺激後に、２４時間にわたって形質導入を実施することができる。
【0092】
レンチウイルス粒子をＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞に形質導入した後、デキストラン鎖を切断することにより抗体またはそれらの断片の互いに対する結合を分断するデキストラナーゼを添加することにより、調節剤を洗い流すかまたは除去する。遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料中の残留レンチウイルスベクター粒子を、繰返し洗浄することにより、１０分の１以下に、優先的には１００分の１以下に低減させる。その結果、遺伝子改変Ｔ細胞を含む純粋な試料は、１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で達成され、生成された試料中の遺伝子改変Ｔ細胞の拡大増殖は、Ｔ細胞を含む元の準備した試料のＴ細胞の量と比較して１０倍未満、優先的には５倍未満である。遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料または組成物は、前記ヒトに適用することができ、前記遺伝子改変Ｔ細胞は、前記ヒトにおいてＴＡＡを認識するＣＡＲを発現することができる。
【0093】
定義
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0094】
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かに関わらず不特定の要素を含むことができる組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分に関して使用される。
【0095】
「調節剤」、「活性化剤」、および「刺激剤」という用語は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができる。
【0096】
調節剤は、アゴニスト抗体またはその抗原結合性断片、サイトカイン、組換え共刺激分子、および小型薬物阻害剤からなる群から選択することができる。調節剤は、ビーズまたはナノ構造にカップリングされている抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらの断片である。前記調節剤は、ナノマトリックスであってもよく、ナノマトリックスは、ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックス、ならびにｂ）可動性ポリマー鎖の前記マトリックスに付着している抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらの断片を含み、ナノマトリックスは、サイズが１～５００ｎｍである。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらの断片は、可動性ポリマー鎖の同じまたは別々のマトリックスに付着していてもよい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはそれらの断片が、可動ポリマー鎖の別々のマトリックスに付着している場合、Ｔ細胞を刺激するためのナノマトリックスの微調整が可能である。ナノマトリックスは生分解性であってもよい。ナノマトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、ポリサッカライド、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリックス組成物であってもよい。ポリサッカライドは、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム、またはアルギン酸塩を含んでいてもよい。分解酵素剤の選択は、グリコシド連結に応じて決定されることになる。高分子コーティングがポリサッカライドである場合、ポリサッカライドは、哺乳動物細胞では通常は見出されないグリコシド連結を有するように選択されることになる。例えば、デキストランおよびα（１－＞６）連結を切断するデキストラナーゼ；セルロースおよびβ（１－＞４）連結を切断するセルラーゼ；アミロースおよびアミラーゼ；ペクチンおよびペクチナーゼ；キチンおよびキチナーゼなど、特定のグリコシド構造を認識する加水分解酵素を酵素として使用することができる。
【0097】
加えて、例えば、国際公開第２０１４／０４８９２０号Ａ１パンフレットに開示の前記小型ナノマトリックスは滅菌濾過が可能であり、これは、厳格なＧＭＰ基準に準拠する条件下、つまり閉鎖系においてＴ細胞を活性化するための重要な特徴である。
【0098】
「枯渇」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の細胞を、粒子、フルオロフォア、またはハプテンなどの固相にカップリングされている抗体またはその抗原結合性断片により標識されている望ましくない細胞、本明細書では通常はがん細胞から分離するネガティブ選択のプロセスを指す。
【0099】
「粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、コロイド粒子、マイクロスフェア、ナノ粒子、またはビーズなどの固相を指す。そのような粒子を生成するための方法は、当技術分野で周知である。粒子は、磁気粒子であってもよい。粒子は、溶液中または懸濁中に存在してもよく、または本発明で使用する前は凍結乾燥状態であってもよい。次いで、凍結乾燥粒子を、本発明に従って処理しようとする試料と接触させる前に、便利な緩衝液に再構成する。
【0100】
「磁気粒子」における「磁気」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者に周知の方法で調製することができる磁気粒子のすべてのサブタイプ、特に強磁性粒子、超常磁性粒子、および常磁性粒子を指す。「強磁性」材料は、磁場の影響を強く受け、磁場が除去されても磁気特性を保持することが可能性である。「常磁性」材料は、弱い磁化率しか有しておらず、磁場が除去されると、すぐに弱い磁性を喪失する。「超常磁性」材料は、磁気に対して非常に感受性であり、つまり磁場に置かれると強く磁性を帯びるが、常磁性材料と同様に急速に磁性を喪失する。
【0101】
抗体（またはその抗原結合性断片）と粒子との連結は、共有結合であってもよくまたは非共有結合であってもよい。共有結合による連結は、例えば、ポリスチレンビーズのカルボキシル基との連結、または修飾ビーズのＮＨ２基またはＳＨ２基との連結であってもよい。非共有結合による連結は、例えば、ビオチン－アビジン、または抗フルオロフォア抗体に連結されているフルオロフォアカップリング粒子によるものである。抗体を、粒子、フルオロフォア、ビオチンのようなハプテン、または培養皿などのより大きな表面にカップリングするための方法は、当業者に周知である。
【0102】
濃縮、単離、または選択には、原理的に任意の選別技術を使用することができる。これには、例えば、親和性クロマトグラフィーまたは当技術分野で公知の任意の他の抗体依存性分離技法が含まれる。当技術分野で公知の任意のリガンド依存性分離技法を、細胞の物理的特性に依存するポジティブ分離技法およびネガティブ分離技法の両方と併せて使用することができる。特に強力な選別技術は、磁気細胞選別である。細胞を磁気的に分離する方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｌｌｐｒｏ、シアトル、またはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、ボストンから市販されている。例えば、モノクローナル抗体を、Ｄｙｎａｌ Ｍ４５０または類似の磁気粒子のような磁気ポリスチレン粒子に直接的にカップリングすることができ、例えば細胞分離に使用することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄ技術はカラムベースではなく、その代わり、細胞が付着したこうした磁気ビーズは、試料チューブ内での液相動態を享受し、チューブを磁気ラックに置くことにより細胞が単離される。しかしながら、本発明によるＴ細胞を含む試料からＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を濃縮するための好ましい実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、例えばポリサッカライドによる有機コーティングを有するコロイド状超常磁性マイクロ粒子と併せて使用される（磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ））。こうした粒子（ナノビーズまたはマイクロビーズ）は、モノクローナル抗体と直接コンジュゲートされていてもよく、または抗免疫グロブリン、アビジン、もしくは抗ハプテン特異的マイクロビーズと組み合わせて使用してもよい。
【0103】
ＭＡＣＳ技術では、特定の表面抗原に対する抗体でコーティングされた磁気ナノ粒子と共に細胞をインキュベートすることにより、細胞の分離が可能になる。これにより、その抗原を発現する細胞が磁気ナノ粒子に付着する。その後、細胞溶液を、強磁場に置かれたカラムに移す。このステップにて、細胞は、ナノ粒子（抗原を発現している）に付着しカラムに留まるが、他の細胞（抗原を発現していない）は通過する。この方法では、細胞を、特定の抗原／マーカーに関してポジティブまたはネガティブに分離することができる。
【0104】
ポジティブ選択の場合、カラムを磁場から取り出した後、磁気カラムに付着した目的の抗原を発現する細胞を別の容器へと洗い出す。
【0105】
ネガティブ選択の場合、使用される抗体は、目的の細胞ではない細胞に存在することが知られている表面抗原に対するものである。細胞／磁気ナノ粒子溶液をカラムに流した後、こうした抗原を発現する細胞はカラムに結合し、目的の細胞は通過画分に含まれる。しがたって通過画分を収集する。こうした細胞は、ナノ粒子にカップリングされている抗体により標識されないため、「未接触」である。
【0106】
この手順は、直接磁気標識または間接磁気標識を使用して実施することができる。直接標識の場合、特異的抗体が磁気粒子に直接的にカップリングされている。間接標識は、直接磁気標識が可能でないかまたは望ましくない場合の便利な代替手段である。この標識戦略では、任意の細胞表面マーカーに対する一次抗体、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体、一次抗体の組合せを使用することできる。一次抗体は、未コンジュゲート、ビオチン化、またはフルオロフォアコンジュゲートのいずれであってもよい。次いで、抗免疫グロブリンマイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、または抗フルオロフォアマイクロビーズを用いて磁気標識を達成する。
【0107】
「分断（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」という用語は、活性化のための磁気粒子または調節剤を分断するという状況において本明細書で使用される場合、
洗浄することのみによる、および／または
競合剤を添加し、その後洗浄することによる、および／または
化学的分断による、つまり、共有結合を破断する物質（非タンパク質性化学化合物）を添加することによる、および／または
酵素的に分断し、その後の洗浄することによる、および／または
共有結合を破断するエネルギーを入力すること（物理的分断）による
除去を指す。
洗浄することのみによる、および／または
競合剤を添加し、その後洗浄することによる、および／または
化学的分断による、つまり、共有結合を破断する物質（非タンパク質性化学化合物）を添加することによる、および／または
酵素的に分断し、その後の洗浄することによる、および／または
共有結合を破断するエネルギーを入力すること（物理的分断）による
除去を指す。
【0108】
分断という状況における「競合反応」という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合で連結されていない２つの成分を含む、活性化のための磁気粒子または調節剤を指し、一方の成分は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、および／またはＣＤ２８に特異的な抗体または抗原結合性断片を介して前記細胞に結合し、タグおよび前記タグに結合する第２の成分を含み、そのような前記タグとの前記結合は、競合物質の添加により解消させることができる。
【0109】
競合物質は、例えば、対応する成分との親和性がより高いため、または競合分子の濃度が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、および／もしくはＣＤ８に特異的な抗体もしくはその抗原結合性断片と間接的にカップリングされている磁気粒子もしくは調節剤の濃度と比較してより高いため、一方の成分である前記磁気粒子、前記調節剤、または前記抗体もしくはその抗原結合性断片と競合および／または置換することができる。
【0110】
「酵素的分断」という用語は、磁気粒子または調節剤を分断するという状況において本明細書で使用される場合、生分解性リンカーを介して直接的にまたは間接的に連結されている、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片において、前記生分解性リンカーが、前記酵素の活性により特異的に生分解、消化、または切断することができ、それにより磁気粒子または調節剤を少なくとも２つの別々の分子に分割することができることを指す。したがって、ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な遊離された単一の抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片は、それが結合しているＴ細胞の活性化にさらなる影響を及ぼさない。加えて、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片が、低い親和性および／または高いｋ（オフ）速度を有する場合、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片は、結合している細胞から除去されることになる。
【0111】
「化学的分断」という用語は、磁気粒子または調節剤を分断するという状況において本明細書で使用される場合、化学分解性リンカーを介して直接的にまたは間接的に連結されている、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片において、化学分解性リンカーが、生理学的条件下で共有結合を破断し、それにより前記磁気粒子または調節剤を少なくとも２つの別々の分子に分割する非タンパク質性化学物質を添加することにより、特異的に分解または切断することができることを指す。生理学的条件下での化学的分断に好適な反応の例は、還元剤によるジスルフィド結合の還元もしくは亜ジチオン酸塩によるジアゾ結合の還元などの還元、または過ヨウ素酸塩によるグリコール残基の切断などの酸化であってもよい。
【0112】
したがって、ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な遊離された単一の抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片は、それが結合しているＴ細胞の活性化にさらなる影響を及ぼさない。加えて、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片が、低い親和性および／または高いｋ（オフ）速度を有する場合、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片は、結合している細胞から除去されることになる。
【0113】
「物理的分断」という用語は、磁気粒子または調節剤を分断するという状況において本明細書で使用される場合、前記物理的に分断可能なリンカーを介して直接的にまたは間接的に連結されている、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ８に特異的な抗体またはその抗原結合性断片において、物理的に分断可能なリンカーが、生理学的条件下で共有結合を破断し、それにより前記磁気粒子または調節剤を少なくとも２つの別々の分子に分割するエネルギー入力により特異的に分解または切断することができることを指す。生理学的条件下での物理的分断に好適な反応の例は、近ＵＶ光（３００～３６５ｎｍ）によるオルト－ニトロベンジル誘導体の切断により例示されるような、ＵＶ光または可視光による光感受性リンカーの光切断などの光反応であってもよい。したがって、ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な遊離された単一の抗体またはＦａｂなどのその抗原結合性断片は、それが結合しているＴ細胞の活性化にさらなる影響を及ぼさない。加えて、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片が、低い親和性および／または高いｋ（オフ）速度を有する場合、前記抗体または前記Ｆａｂなどのその抗原結合性断片は、結合している細胞から除去されることになる。
【0114】
「マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定の細胞タイプにより特異的に発現される細胞抗原を指す。優先的には、マーカーは、細胞表面マーカーであり、生細胞の濃縮、単離、および／または検出を実施することができる。マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ８、および／またはＣＤ６２Ｌなどのポジティブ選択マーカーであってもよく、またはネガティブ選択マーカー（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ５６を発現する細胞の枯渇）であってもよい。
【0115】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、そのプロモーターにより細胞内で駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳であると定義される。
【0116】
「抗原結合性分子」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の所望の標的分子、つまり抗原に好ましくは結合するかまたは特異的である任意の分子を指す。「抗原結合性分子」という用語は、例えば、抗体またはその抗原結合性断片を含む。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者に周知の方法により生成することができるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指す。抗体は、任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであってもよい。治療目的のために非ヒト抗原結合性断片を使用しようとする場合、それらは、当技術分野で公知の任意の方法によりヒト化することができる。また、抗体は、修飾抗体（例えば、オリゴマー、還元、酸化、および標識抗体）であってもよい。
【0117】
「抗体」という用語は、インタクト分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体などの抗原結合性断片を両方とも含む。加えて、「抗原結合性断片」という用語は、細胞の所望の標的分子に優先的に結合する、抗体または抗体断片以外の任意の分子を含む。好適な分子としては、これらに限定されないが、所望の標的分子、炭水化物、レクチン、または任意の他の抗原結合性タンパク質（例えば、受容体－リガンド相互作用）に結合する、アプタマーとして知られているオリゴヌクレオチドが挙げられる。抗体と粒子またはナノ構造との連結（カップリング）は、共有結合であってもよくまたは非共有結合であってもよい。共有結合による連結は、例えば、ポリスチレンビーズのカルボキシル基との連結、または修飾ビーズのＮＨ２基またはＳＨ２基との連結であってもよい。非共有結合による連結は、例えば、ビオチン－アビジン、または抗フルオロフォア抗体に連結されているフルオロフォアカップリング粒子によるものである。
【0118】
抗原結合性分子、例えば抗体またはその断片に関する「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、試料中の特定の抗原、例えばＣＤ４を認識しそれに結合するが、前記試料中の他の抗原を実質的に認識せず、結合もしない抗原結合性分子（抗原結合性ドメインに対する抗体またはその断片の場合）を指す。１つの種に由来する抗原と特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合性ドメインは、別の種のその抗原にも結合する場合がある。この種間反応性は、本明細書で使用される「特異的である」の定義に反するものではない。抗原、例えばＣＤ４抗原と特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合性ドメインは、前記抗原の様々な変異体（対立遺伝子変異体、スプライス変異体、アイソフォームなど）と実質的に結合する場合がある。この交差反応性は、その抗原結合性ドメインが、抗原、例えばＣＤ４に特異的であるという定義に反するものではない。
【0119】
「遺伝子改変Ｔ細胞」または「遺伝子操作Ｔ細胞」という用語は、同義的に使用することができ、引いては細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を改変する外来遺伝子または核酸配列を含むおよび／または発現することを意味する。特に、こうした用語は、細胞を当技術分野で周知の組換え法により操作して、ペプチドまたはタンパク質、例えば自然状態ではそうした細胞内で発現されないＣＡＲを安定的または一過性に発現させることができるという事実を指す。細胞の遺伝子改変としては、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非組込み型レトロまたはレンチウイルスベクター、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含むデザイナーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用した形質導入が挙げられる。
【0120】
本明細書に開示の方法により得られる遺伝子改変Ｔ細胞は、当業者に公知の研究、診断、薬理学的または臨床的応用など、その後のステップに使用することができる。
【0121】
遺伝子改変Ｔ細胞は、療法、例えば細胞療法、または疾患の予防における医薬組成物としても使用することができる。医薬組成物は、動物またはヒト、優先的にはヒト患者に移植することができる。医薬組成物は、哺乳動物、特にヒトの疾患を治療および／または予防するために使用することができ、治療および／または予防は、おそらくは、薬学的有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。本開示の医薬組成物は、治療しようとする（または予防しようとする）疾患に適切な様式で投与することができる。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因により決定されることになるが、適切な投薬量は、臨床治験により決定することができる。
【0122】
「治療有効量」という用語は、患者に治療上の利益を提供する量を意味する。
【0123】
本発明の方法により得られる遺伝子改変Ｔ細胞の組成物は、単独で、あるいは希釈剤とおよび／またはサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれでも投与することができる。手短に言えば、本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を含んでいてもよい。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含んでいてもよい。
【0124】
「活性化」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞の機能、増殖、および／または分化を増加させる細胞を用いて生理学的変化を誘導することを指す。
【0125】
「形質導入」という用語は、レンチウイルスベクター粒子などのウイルス剤に由来する遺伝物質を、Ｔ細胞などの真核細胞へと移動させること意味する。
【0126】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞で産生される抗原性物質を指す。腫瘍関連抗原は、診断試験で腫瘍／がん細胞を識別するのに有用な腫瘍またはがんマーカーであり、がん療法に使用するための潜在的候補である。優先的には、ＴＡＡは、腫瘍／がん細胞の細胞表面に発現されていてもよい。
【0127】
「調節剤の除去」という用語は、本明細書で使用される場合、調節剤をＴ細胞から物理的に除去すること、および／またはＴ細胞の活性に対してもはや影響を及ぼさないという効果が得られるまで調節剤を不活性化することを指す。
【0128】
レンチウイルス属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、ヒトおよび他の哺乳動物種において長い潜伏期間により特徴付けられる慢性および致死性疾患を引き起こすレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属である。最もよく知られているレンチウイルスは、非分裂細胞に対して効率的に感染することができるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶであるため、レンチウイルス由来レトロウイルスベクターは、遺伝子送達の最も効率的な方法の１つである。
【0129】
レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを生成するため、ベクター粒子のアセンブリに必要なｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質は、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔによりトランスで提供される。これは、通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む１つまたは複数のプラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクトすることにより達成される。
【0130】
「残留レンチウイルスベクター粒子の除去」という用語は、本明細書で使用される場合、残留レンチウイルスベクター粒子をＴ細胞から物理的に除去すること、および／またはそれらがもはやＴ細胞を遺伝子改変しないという効果が得られるまで残留レンチウイルスベクター粒子を不活性化することを指す。
【0131】
「残留レンチウイルスベクター粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞を含む試料中のＴ細胞に形質導入されていないレンチウイルスベクター粒子の部分を指す。
【0132】
「方法は、１４４時間もしくはそれ未満、１２０時間未満、９６時間未満、７２時間未満、４８時間未満、または２４時間未満で実施される」という用語は、プロセスの開始からの、つまりＴ細胞を含む試料を、その後それを必要とする患者にそのまま（再）輸注することができる遺伝子改変Ｔ細胞を含む試料へと提供してからの、本明細書に開示のプロセスの継続期間が、それぞれの時間枠よりも長くはかからないことを意味する。
【0133】
血液中、血清は、血液細胞（血清には、白血球細胞－白血球、または赤血球細胞－赤血球が含まれていない）でも凝固因子でもない成分であり、フィブリノーゲンを含まない血漿である。血清は、血液凝固に使用されないすべてのタンパク質、ならびにすべての電解質、抗体、抗原、ホルモン、およびあらゆる外因性物質を含む。ヒト血清は、ヒトに由来する血清である。
【0134】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物を指す。優先的には、対象は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳動物である。より優先的には、個体はヒトである。対象は、がんなどの疾患を罹患している対象（患者）であってもよいが、対象は、健康な対象であってもよい。
【0135】
「閉鎖系」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、形質導入による新しい物質の導入などの培養プロセスを実施する間、ならびに増殖、分化、活性化などの細胞培養ステップおよび／または細胞の分離を実施する間の細胞培養汚染のリスクを低減する任意の閉鎖系を指す。そのような系は、ＧＭＰまたはＧＭＰ様条件下（「滅菌」）での操作を可能にし、臨床的に適用可能な細胞組成物をもたらす。本明細書では、例示的に、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）が閉鎖系として使用されている。この系は、国際公開第２００９／０７２００３号パンフレットに開示されている。しかしながら、本発明の方法の使用をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に限定することは意図されていない。
【0136】
本発明のプロセスは、シリンダー、ポンプ、バルブ、磁気細胞分離カラム、およびチューブセットにより接続されており、ベースプレートおよびカバープレートを含む遠心分離チャンバーを含む閉鎖系（閉鎖細胞試料処理系）で実施することができる。血液試料またはＴ細胞を含む他の供給源は、滅菌ドッキングまたは滅菌溶接によりチューブセットを往来させて移送することができる。好適な系は、国際公開第２００９／０７２００３号パンフレットに開示されている。
【0137】
閉鎖系は、細胞が滅菌ドッキングまたは滅菌溶接によりＴＳ間で移送される複数のチューブセット（ＴＳ）を含んでいてもよい。
【0138】
プロセスの様々なモジュールを、様々な機能的閉鎖ＴＳで実施し、１つのチューブセットで生成された１つのモジュールの産物（細胞）を滅菌手段により別のチューブセットへと移送することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨによる第１チューブセット（ＴＳ）ＴＳ１００でＴ細胞を磁気的に濃縮することができ、濃縮Ｔ細胞を含む陽性画分を溶接してＴＳ１００から外し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨによる第２チューブセットＴＳ７３０に溶接して、さらに活性化、改変、培養、および洗浄を行う。
【0139】
「自動化された方法」または「自動化されたプロセス」という用語は、本明細書で使用される場合、デバイスならびに／またはコンピュータおよびコンピュータソフトウェアの使用により自動化されている任意のプロセスを指す。自動化されている方法（プロセス）は、より少ない人的介入およびより少ない人的時間しか必要としない。一部の場合では、本発明の方法は、本方法の少なくとも１つのステップが人的支援または介入を一切行わずに実施される場合、自動化されている。優先的には、本発明の方法は、本明細書に開示の方法のすべてのステップが、新鮮な試薬を系に接続する以外の人的支援または介入を行わずに実施される場合、自動化されている。優先的には、自動化されたプロセスは、本明細書に開示のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）などの閉鎖系で実施される。
【0140】
閉鎖系は、ａ）少なくとも１つの試料チャンバーを有する回転容器（または遠心分離チャンバー）にカップリングされている入力ポートおよび出力ポートを含む試料処理ユニットであって、第１の処理ステップを試料に提供するか、または試料に遠心力を加えて試料がチャンバー内に堆積するように容器を回転させて、堆積した試料の少なくとも第１の成分および第２の成分を分離するように構成されている試料処理ユニット；ならびにｂ）試料処理ユニットの出力ポートにカップリングされている試料分離ユニットであって、試料分離ユニットは、分離カラムホルダー、ポンプ、ならびに流体回路およびホルダー内に配置されている分離カラムを通る流体流動を少なくとも部分的に制御するように構成されている複数のバルブを含み、分離カラムは、カラムを通って流れる試料の標識成分および未標識成分を分離するように構成されている、試料分離ユニットを含んでいてもよい。
【0141】
前記回転容器は、温度制御された細胞インキュベーションおよび培養チャンバーとしても使用することができる（ＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔユニット＝ＣＣＵ）。このチャンバーは、取り付けられているガス混合ユニットにより提供される規定のガス混合物で満たされていてもよい（例えば、加圧空気／Ｎ２／ＣＯ２またはＮ２／ＣＯ２／Ｏ２の使用）。
【0142】
プロセス開始前に、すべての作用剤を閉鎖系に接続してもよい。これには、閉鎖系内での洗浄、移送、懸濁、培養、細胞回収、または免疫磁気細胞選別に使用されるすべての緩衝液、溶液、培養培地、および栄養補助剤、ＭｉｃｒｏＢｅａｄが含まれる。あるいは、そのような作用剤は、プロセス中の任意の時点で、滅菌手段により溶接または接続してもよい。
【0143】
Ｔ細胞を含む細胞試料は、無菌手段により閉鎖系に接続することができる移送バッグまたは他の好適な容器に準備することができる。
【0144】
「Ｔ細胞を含む（細胞）試料を準備する」という用語は、細胞試料、優先的には起源が血液であるヒト細胞試料の準備を意味する。通常、細胞試料は、ドナーまたは患者に由来する血液細胞で構成されていてもよい。そのような血液産物は、全血、バフィーコート、白血球アフェレーシス、ＰＢＭＣ、または血液産物の任意の臨床試料採取の形態であってもよい。そのような血液産物は、起源が新鮮であってもよくまたは凍結であってもよい。
【0145】
「洗浄」という用語は、例えば、細胞が維持されている培地または緩衝液の置換を意味する。上清の置換は部分的であってもよい（例えば、培地の５０％を除去し、５０％の新鮮な培地を追加する）。これは希釈目的または栄養供給目的で行われることが多い。または上清の置換は全部であってもよい。細胞が維持されている元の培地のより根本的な置換を得るために、幾つかの洗浄ステップを組み合わせてもよい。洗浄ステップは、遠心分離力により細胞をペレット化すること、および上清を除去することを含むことが多い。本発明の方法では、例えば、３００×ｇでチャンバーを回転させることにより細胞をペレット化することができ、チャンバーの回転中に上清を除去することができる。培地は、回転中に追加してもよくまたは定常状態中に追加してもよい。
【0146】
一般に、洗浄または洗浄ステップは、１回実施してもよく、または一連の培地／緩衝液交換（少なくとも２回の交換、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の交換）により実施してもよく、それにより、ヒト血清および／もしくはその成分、磁気粒子、または残留レンチウイルスベクター粒子などの、Ｔ細胞から除去することが意図されている物質が除去される。交換は、遠心分離、沈降、付着、または濾過、およびその後の培地／緩衝液の交換による細胞および培地／緩衝液の分離により実施することができる。
【0147】
一般に、ＣＡＲは、抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン（細胞外部分）、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（細胞内シグナル伝達ドメイン）を含んでいてもよい。細胞外ドメインは、リンカーまたはスペーサーにより膜貫通ドメインに連結されていてもよい。また、細胞外ドメインは、シグナルペプチドを含んでいてもよい。本発明の一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ポリペプチドにカップリングされているタグまたはハプテン（「ハプテニル化（ｈａｐｔｅｎｙｌａｔｅｄ）」または「タグ化」ポリペプチド）に結合し、ポリペプチドは、がん細胞の表面に発現される場合がある腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などの疾患関連抗原に結合することができる。
【0148】
そのようなＣＡＲは、例えば、米国特許第９２３３１２５号Ｂ２明細書に開示の通り、「アンチタグ」ＣＡＲまたは「アダプターＣＡＲ」または「ユニバーサルＣＡＲ」とも称される場合がある。
【0149】
ハプテンまたはタグは、ポリペプチドに直接的にまたは間接的にカップリングされていてもよく（タグ化ポリペプチド）、ポリペプチドは、標的の（細胞）表面に発現される前記疾患関連抗原に結合することができる。
【0150】
「シグナルペプチド」は、細胞内のタンパク質の輸送および局在化を、例えば、ある特定の細胞小器官（小胞体など）および／または細胞表面へと向かわせるペプチド配列を指す。
【0151】
一般に、「抗原結合性ドメイン」は、抗原、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）と特異的に結合する、ＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の抗原結合性ドメイン（例えば、タンデムＣＡＲ）を含んでいてもよい。一般に、ＣＡＲの標的指向性領域は、細胞外にある。抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含んでいてもよい。抗原結合性ドメインは、例えば、全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含んでいてもよい。アフィボディまたは天然に存在する受容体に由来するリガンド結合性ドメインなどの、所与の抗原と特異的に結合する任意の分子を、抗原結合性ドメインとして使用することができる。多くの場合、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖでは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域が、可撓性リンカーにより融合されてｓｃＦｖが形成されている。そのようなリンカーは、例えば、「（Ｇ４／Ｓ）３－リンカー」であってもよい。
【0152】
一部の場合では、ＣＡＲが使用されることになるものと同じ種に由来する抗原結合性ドメインが有益である。例えば、ヒトの治療に使用することが予定されている場合、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ヒト抗体またはヒト化抗体またはその抗原結合性断片を含むことが有益であり得る。ヒト抗体またはヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で周知の様々な方法により製作することができる。
【0153】
「スペーサー」または「ヒンジ」は、本明細書で使用される場合、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域を指す。本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含んでいてもよいが、そのようなスペーサーを省くことも可能である。スペーサーとしては、例えば、抗体もしくはそれらの断片のＦｃ断片、抗体もしくはそれらの断片のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、またはそれらの組合せを挙げることができる。スペーサーの有名な例は、ＣＤ８アルファヒンジである。
【0154】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望の天然または合成供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してもよい。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８アルファまたはＣＤ２８に由来してもよい。重要なシグナル伝達および抗原認識モジュール（ドメイン）が、２つの（またはそれよりもさらに多くの）ポリペプチドに存在する場合、ＣＡＲは、２つの（またはそれよりも多くの）膜貫通ドメインを有してもよい。重要なシグナル伝達および抗原認識モジュールの分割は、ＣＡＲの各ポリペプチドの小分子依存性ヘテロ二量体化ドメインによる、ＣＡＲ細胞発現に対する小分子依存性で滴定可能な可逆的制御を可能にする（例えば、国際公開第２０１４１２７２６１号Ａ１パンフレット）。
【0155】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン（または細胞内シグナル伝達ドメイン）は、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊機能を意味し、例えばＴ細胞では、エフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、ＣＡＲを発現する細胞に特殊機能を実施するように指図するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を開始または遮断するシグナルを伝達するのに十分な、所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、突然変異した、または短縮された部分を含んでいてもよい。
【0156】
ＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの有名な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質シグナル伝達配列、および抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始する共受容体が挙げられる。
【0157】
一般に、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により媒介される場合がある。第１には、ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始するものであり（一次細胞質シグナル伝達配列、一次細胞質シグナル伝達ドメイン）、第２には、二次または共刺激シグナルを抗原非依存的様式で提供するものである（二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン）。したがって、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つもしくは複数の一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくは複数の二次細胞質シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
【0158】
刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）を含んでいてもよい。
【0159】
ＣＡＲによく使用されるＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲζ（ＣＤ３ζ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものである。最も有名なものは、ＣＤ３ζに由来する配列である。
【0160】
ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体がＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計されていてもよく、または任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされていてもよい。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域（ドメイン）を含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３である。
【0161】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、リンカーの有無に関わらず、ランダムにまたは指定の順序で互いに連結されていてもよい。好ましくは長さが２～１０アミノ酸である短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。有名なリンカーは、グリシン－セリンダブレットである。
【0162】
一例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。別の例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。さらなる例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
【0163】
また、上述の通り、ＣＡＲの細胞外部分または膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインはいずれも、ＣＡＲの重要なシグナル伝達および抗原認識モジュールを分割するために、ヘテロ二量体化ドメインを含んでいてもよい。
【0164】
ＣＡＲは、ＣＡＲをコードする核酸のレベルにおいて、自殺スイッチによりＣＡＲ発現免疫細胞を排除するための１つまたは複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに修飾されていてもよい。自殺スイッチとしては、例えば、アポトーシス誘導シグナル伝達カスケードまたは細胞死を誘導する薬物を挙げることができる。一実施形態では、ＣＡＲを発現およびコードする核酸は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに修飾されていてもよい。
【0165】
一部の実施形態では、内部ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインまたは共刺激領域を含んでいてもよいが、両方は含まない。こうした実施形態では、本開示のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、欠失ドメインを含む別のＣＡＲもその対応する抗原に結合する場合にのみ活性化される。
【0166】
本発明の一部の実施形態では、ＣＡＲは、「ＳＵＰＲＡ」（分割、ユニバーサル、およびプログラム可能な）ＣＡＲであってもよく、「ｚｉｐＣＡＲ」ドメインは、細胞内共刺激ドメインおよび細胞外ロイシンジッパーを連結することができる（国際公開第２０１７／０９１５４６号パンフレット）。このジッパーは、例えば、ｓｃＦｖ領域に融合された相補的ジッパーにより標的とされ、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍特異的にすることができる。この手法は、種々の腫瘍に対するユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために特に有用となるだろう。アダプター分子を腫瘍特異的に設計することができ、養子移入後に特異性を変更するための選択肢が提供されることになる。これは選択圧および抗原回避の状況で重要である。
【0167】
本明細書に開示の方法により得られる遺伝子改変Ｔ細胞で発現させることができるＣＡＲは、機能的ＣＡＲ、つまり本明細書に開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の免疫エフェクター応答を媒介するＣＡＲをもたらす任意の順序および／または組合せで、本明細書に記載の上記で言及したドメインの任意の部分または一部を含むように設計することができる。
【実施例1】
【0168】
遺伝子操作Ｔ細胞の短期間手作業生成
Ｔ細胞を含む試料をバフィーコートから準備し、ＰＢＭＣを単離した。血液産物をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液で１：２または１：３の比に希釈し、３０ｍＬをＰａｎｃｏｌｌ ｈｕｍａｎの１５ｍＬクッション上に層化した。チューブを室温で３０分間４５０×ｇにて遠心分離し、中程度のブレーキをかけた。遠心分離後、界面にある細胞を注意深く吸引し、血小板および残留Ｐａｎｃｏｌｌを除去するために５０ｍＬのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液で３回洗浄した。ＣＤ４およびＣＤ８特異的マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞を、ヒトＡＢ血清（１０％（容積／容積）ＧｅｍＣｅｌｌ）、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含むＴｅｘＭＡＣＳ培地中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１ウェル当たり２ｍＬのＴ細胞懸濁液を有する２４ウェルプレートに播種した。Ｔ細胞を活性化するため、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭを、最終希釈が１：１００になるように添加する。３７℃、５～１０％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した後、治療用ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、２のＭＯＩで添加する。形質導入の２４時間後、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭおよびマイクロビーズに存在する生分解性リンカーを特異的に分解する酵素デキストラナーゼを３７℃で１時間１：１００にて添加し、両試薬をＴ細胞から遊離させた。残留レンチウイルスベクター、Ｔ ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭおよびマイクロビーズの分解成分などの非細胞成分を、４５０×ｇで１０分間遠心分離することより形質導入Ｔ細胞から分離する。上清を除去し、新鮮な培地を添加して同じ容積にする。不純物を減少させるため、洗浄手順を３回繰り返す。形質導入Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析して、形質導入効率を決定し、ＣＡＲ抗原を発現する腫瘍標的細胞と共に共培養する死滅アッセイなどの機能アッセイを実施する。
Ｔ細胞を含む試料をバフィーコートから準備し、ＰＢＭＣを単離した。血液産物をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液で１：２または１：３の比に希釈し、３０ｍＬをＰａｎｃｏｌｌ ｈｕｍａｎの１５ｍＬクッション上に層化した。チューブを室温で３０分間４５０×ｇにて遠心分離し、中程度のブレーキをかけた。遠心分離後、界面にある細胞を注意深く吸引し、血小板および残留Ｐａｎｃｏｌｌを除去するために５０ｍＬのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液で３回洗浄した。ＣＤ４およびＣＤ８特異的マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞を、ヒトＡＢ血清（１０％（容積／容積）ＧｅｍＣｅｌｌ）、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含むＴｅｘＭＡＣＳ培地中１×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１ウェル当たり２ｍＬのＴ細胞懸濁液を有する２４ウェルプレートに播種した。Ｔ細胞を活性化するため、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭを、最終希釈が１：１００になるように添加する。３７℃、５～１０％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した後、治療用ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、２のＭＯＩで添加する。形質導入の２４時間後、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭおよびマイクロビーズに存在する生分解性リンカーを特異的に分解する酵素デキストラナーゼを３７℃で１時間１：１００にて添加し、両試薬をＴ細胞から遊離させた。残留レンチウイルスベクター、Ｔ ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭおよびマイクロビーズの分解成分などの非細胞成分を、４５０×ｇで１０分間遠心分離することより形質導入Ｔ細胞から分離する。上清を除去し、新鮮な培地を添加して同じ容積にする。不純物を減少させるため、洗浄手順を３回繰り返す。形質導入Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析して、形質導入効率を決定し、ＣＡＲ抗原を発現する腫瘍標的細胞と共に共培養する死滅アッセイなどの機能アッセイを実施する。
【実施例2】
【0169】
遺伝子改変Ｔ細胞の短期間内自動生成
ドナーの白血球アフェレーシスに由来するＴ細胞の試料をバッグに準備する。バッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに設置されているチューブセットに滅菌溶接で接続する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、ならびに活性化試薬も同じチューブセットに接続する。完全に自動化されたプロセスの一部分として、合計で３０分～２時間かかる濃縮ステップを開始する。詳細には、チューブセットを、緩衝液で自動的にプライミングし、次いで白血球アフェレーシス産物を、チューブセットのチャンバーへと移送し、そこで血清および血小板を除去するためにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬で磁気的に標識し、磁場に置かれているカラムに捕捉する。カラムに捕捉された標識細胞を数回すすぎ、標的細胞画分バッグへと溶出させる。濃縮細胞の一部を、滅菌溶接接続を介してＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバーへと移送し、ＩＬ－７／ＩＬ－１５で補完されたＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｅｘＭＡＣＳ培地（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で製剤化する。自動化されたプロセスの一部として、活性化ステップを開始させ、活性化試薬ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔを培養に自動的に添加する。濃縮後２４時間以内に、レンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌溶接し、レンチウイルスベクター懸濁物を、活性化Ｔ細胞を含むＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバーへと移送する。２４時間～４８時間後に、活性化試薬および磁気粒子に存在する生分解性リンカーに特異的なデキストラナーゼを添加することにより、活性化試薬および磁気粒子を分解する。１時間後、残留レンチウイルスベクター、分解酵素、ならびに活性化試薬およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬の分解成分などの非細胞成分を洗浄により除去する。遺伝子改変Ｔ細胞は、ヒト輸注に好適な溶液で自動的に製剤化される。
ドナーの白血球アフェレーシスに由来するＴ細胞の試料をバッグに準備する。バッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに設置されているチューブセットに滅菌溶接で接続する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、ならびに活性化試薬も同じチューブセットに接続する。完全に自動化されたプロセスの一部分として、合計で３０分～２時間かかる濃縮ステップを開始する。詳細には、チューブセットを、緩衝液で自動的にプライミングし、次いで白血球アフェレーシス産物を、チューブセットのチャンバーへと移送し、そこで血清および血小板を除去するためにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬で磁気的に標識し、磁場に置かれているカラムに捕捉する。カラムに捕捉された標識細胞を数回すすぎ、標的細胞画分バッグへと溶出させる。濃縮細胞の一部を、滅菌溶接接続を介してＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバーへと移送し、ＩＬ－７／ＩＬ－１５で補完されたＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｅｘＭＡＣＳ培地（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で製剤化する。自動化されたプロセスの一部として、活性化ステップを開始させ、活性化試薬ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔを培養に自動的に添加する。濃縮後２４時間以内に、レンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌溶接し、レンチウイルスベクター懸濁物を、活性化Ｔ細胞を含むＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔＴＭチャンバーへと移送する。２４時間～４８時間後に、活性化試薬および磁気粒子に存在する生分解性リンカーに特異的なデキストラナーゼを添加することにより、活性化試薬および磁気粒子を分解する。１時間後、残留レンチウイルスベクター、分解酵素、ならびに活性化試薬およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４およびＣＤ８試薬の分解成分などの非細胞成分を洗浄により除去する。遺伝子改変Ｔ細胞は、ヒト輸注に好適な溶液で自動的に製剤化される。
【実施例3】
【0170】
追加のクリーンアップステップを施したＣＡＲ Ｔ細胞の投与
ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、例えば、再発性または難治性ＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児および成人患者を治療するために提供される。遺伝子操作Ｔ細胞を調製するための臨床方法は、実施例２に基づいており、実施例２では、患者細胞（ＢＭ、血液、または白血球アフェレーシスに由来する）がＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに接続され、迅速に（つまり、好ましくは２４時間未満で）処理され、患者に再輸注される。プロセスの継続期間は、必要とされる患者調製レジメン（例えば、リンパ球枯渇に対する化学療法治療）のタイミングと一致し、医療必要性および臨床適用性（例えば、臨床プロトコール、患者の健康状態、医師の反応性（ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｃｔｏｒｓ）、入院）を満たすように調整することができる。本記載の発明の利点は、迅速な治療および患者ケアが可能になること、ならびに薬物製品の「ベッドサイド」調製が可能になることである。本発明では、ウイルスベクターおよび活性化試薬などの潜在的に有害な物質が輸注前に除去される迅速細胞調製の解決策が記載される。例えば、薬物製品を汚染する残留活性化試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化に結び付く場合があるため、輸注すると有害である可能性がある。これは、炎症性サイトカインの急速な放出に結び付き、重度のサイトカイン放出症候群、発熱、低血圧、臓器不全、およびさらには死を引き起こす可能性がある。
ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、例えば、再発性または難治性ＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児および成人患者を治療するために提供される。遺伝子操作Ｔ細胞を調製するための臨床方法は、実施例２に基づいており、実施例２では、患者細胞（ＢＭ、血液、または白血球アフェレーシスに由来する）がＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに接続され、迅速に（つまり、好ましくは２４時間未満で）処理され、患者に再輸注される。プロセスの継続期間は、必要とされる患者調製レジメン（例えば、リンパ球枯渇に対する化学療法治療）のタイミングと一致し、医療必要性および臨床適用性（例えば、臨床プロトコール、患者の健康状態、医師の反応性（ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｃｔｏｒｓ）、入院）を満たすように調整することができる。本記載の発明の利点は、迅速な治療および患者ケアが可能になること、ならびに薬物製品の「ベッドサイド」調製が可能になることである。本発明では、ウイルスベクターおよび活性化試薬などの潜在的に有害な物質が輸注前に除去される迅速細胞調製の解決策が記載される。例えば、薬物製品を汚染する残留活性化試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化に結び付く場合があるため、輸注すると有害である可能性がある。これは、炎症性サイトカインの急速な放出に結び付き、重度のサイトカイン放出症候群、発熱、低血圧、臓器不全、およびさらには死を引き起こす可能性がある。
【0171】
加えて、可溶性形態および／または細胞結合形態の薬物製品を汚染する残留レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの非標的細胞の形質導入により送達される抗原に対する養子免疫応答を含む、補体活性化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの望ましくない免疫応答を誘発するため、輸注すると有害である可能性がある。非標的細胞の形質導入および導入遺伝子のその後の発現は、望ましくない免疫応答の誘導、発がん性、生存率の変化、増殖の変化、生理学的状態の変化、および天然機能の変化など、望ましくない副作用を誘導する可能性がある。
【実施例4】
【0172】
３日間でＴ細胞を遺伝子操作するためのプロセスの設定
２人の健康ドナーに由来するＴ細胞は、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で未接触だったものを濃縮し、０日目に、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体または抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。同じ日または１日目に、ＩＬ－７／ＩＬ－１５含有ＴｅｘＭＡＣＳ培地中１ｅ６細胞／ｍｌの刺激Ｔ細胞を２４ウェルにてＭＯＩが２のＶＳＶ－ＧシュードタイプＧＦＰコードＬＶで形質導入した。１、２、または３日目に、生分解性リンカーを特異的に消化するデキストラナーゼを添加し、１０日目にフローサイトメトリーで形質導入効率を評価した。０日目に刺激し１日目に形質導入したがデキストラナーゼを添加しなかったＴ細胞は、Ｔ細胞を遺伝子操作するための従来のプロトコールための対照としての役目を果たした。図９に図示されているように、０日目に形質導入し、生分解性リンカーに特異的な酵素と共にインキュベートしたＴ細胞は、最も低い形質導入効率レベルを示し、Ｔ細胞刺激が不十分であったことを示す。これは、後から２日目または３日目に添加してより長期間刺激したＴ細胞を分析したところ、０日目に酵素と共にインキュベートしたＴ細胞と比較してより高い形質導入効率レベルが検出可能だったことにより確認された。従来のプロトコールに近かったより高い形質導入効率は、１日目に形質導入し、２日目または３日目にデキストラナーゼと共にインキュベートした刺激Ｔ細胞で観察された。
２人の健康ドナーに由来するＴ細胞は、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で未接触だったものを濃縮し、０日目に、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体または抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。同じ日または１日目に、ＩＬ－７／ＩＬ－１５含有ＴｅｘＭＡＣＳ培地中１ｅ６細胞／ｍｌの刺激Ｔ細胞を２４ウェルにてＭＯＩが２のＶＳＶ－ＧシュードタイプＧＦＰコードＬＶで形質導入した。１、２、または３日目に、生分解性リンカーを特異的に消化するデキストラナーゼを添加し、１０日目にフローサイトメトリーで形質導入効率を評価した。０日目に刺激し１日目に形質導入したがデキストラナーゼを添加しなかったＴ細胞は、Ｔ細胞を遺伝子操作するための従来のプロトコールための対照としての役目を果たした。図９に図示されているように、０日目に形質導入し、生分解性リンカーに特異的な酵素と共にインキュベートしたＴ細胞は、最も低い形質導入効率レベルを示し、Ｔ細胞刺激が不十分であったことを示す。これは、後から２日目または３日目に添加してより長期間刺激したＴ細胞を分析したところ、０日目に酵素と共にインキュベートしたＴ細胞と比較してより高い形質導入効率レベルが検出可能だったことにより確認された。従来のプロトコールに近かったより高い形質導入効率は、１日目に形質導入し、２日目または３日目にデキストラナーゼと共にインキュベートした刺激Ｔ細胞で観察された。
【実施例5】
【0173】
３日以内に遺伝的Ｔ細胞操作するためのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における調節剤の除去およびＴ細胞活性化レベルの分析
最大で１ｅ９個のＣＤ４／ＣＤ８細胞を有する健康ドナーの白血球アフェレーシス試料を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で自動的に処理して、ＣＡＲ Ｔ細胞を３日以内に生成した。０日目に、白血球アフェレーシス試料を含むバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）チューブセット５２０に溶接で滅菌接続した。細胞を自動的に洗浄し、ＣＤ４およびＣＤ８ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬で標識して、Ｔ細胞を濃縮した。４ｅ８個のＴ細胞を、遠心分離および培養チャンバーのＩＬ－７／ＩＬ－１５含有培地へと移送し、２００ｍｌの培養容積中にて調節剤ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した活性化Ｔ細胞を、ＭＯＩが３のＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターで遺伝子改変して、ＣＤ２０／ＣＤ１９特異的タンデムＣＡＲの発現を誘導した。１０ｍｌのレンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーへと自動的に移送した。２日目に、生分解性リンカーに特異的な酵素を含む１０ｍｌの溶液をチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーに自動的に添加してリンカーを特異的に分解した。これにより、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはそれらの断片が遊離され、調節剤の活性が阻害された。対照として、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系ランを、同じ条件下および同じドナー物質だが、生分解性リンカーに特異的な酵素を添加せずに実施した。複数回洗浄した後、治療応用に好適である細胞産物を得た。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における両Ｔ細胞遺伝子操作ランについて、生分解性リンカーの存在を、生分解性リンカーに特異的な抗体で染色することによる製剤化細胞に対するフローサイトメトリーで評価した。図１０Ａおよび図１０Ｂに図示されるように、酵素を添加しないＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙランと比較するとところ、わずかな割合のリンカー陽性細胞しか検出可能でなかったため、生分解性リンカーは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で効率的に除去された。加えて、すべての生存細胞の生分解性リンカーの平均強度レベル（ＭＦＩ）は、酵素を添加した場合は、バックグラウンドレベルだった（図１０Ｂを参照）。対照的に、酵素を添加しないＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙランでは、高い平均強度レベル（ＭＦＩ）が存在した。
最大で１ｅ９個のＣＤ４／ＣＤ８細胞を有する健康ドナーの白血球アフェレーシス試料を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で自動的に処理して、ＣＡＲ Ｔ細胞を３日以内に生成した。０日目に、白血球アフェレーシス試料を含むバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）チューブセット５２０に溶接で滅菌接続した。細胞を自動的に洗浄し、ＣＤ４およびＣＤ８ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬で標識して、Ｔ細胞を濃縮した。４ｅ８個のＴ細胞を、遠心分離および培養チャンバーのＩＬ－７／ＩＬ－１５含有培地へと移送し、２００ｍｌの培養容積中にて調節剤ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した活性化Ｔ細胞を、ＭＯＩが３のＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターで遺伝子改変して、ＣＤ２０／ＣＤ１９特異的タンデムＣＡＲの発現を誘導した。１０ｍｌのレンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーへと自動的に移送した。２日目に、生分解性リンカーに特異的な酵素を含む１０ｍｌの溶液をチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーに自動的に添加してリンカーを特異的に分解した。これにより、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはそれらの断片が遊離され、調節剤の活性が阻害された。対照として、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系ランを、同じ条件下および同じドナー物質だが、生分解性リンカーに特異的な酵素を添加せずに実施した。複数回洗浄した後、治療応用に好適である細胞産物を得た。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系における両Ｔ細胞遺伝子操作ランについて、生分解性リンカーの存在を、生分解性リンカーに特異的な抗体で染色することによる製剤化細胞に対するフローサイトメトリーで評価した。図１０Ａおよび図１０Ｂに図示されるように、酵素を添加しないＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙランと比較するとところ、わずかな割合のリンカー陽性細胞しか検出可能でなかったため、生分解性リンカーは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で効率的に除去された。加えて、すべての生存細胞の生分解性リンカーの平均強度レベル（ＭＦＩ）は、酵素を添加した場合は、バックグラウンドレベルだった（図１０Ｂを参照）。対照的に、酵素を添加しないＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙランでは、高い平均強度レベル（ＭＦＩ）が存在した。
【0174】
調節剤の除去が刺激に対して及ぼす影響を、ＣＤ２５およびＣＤ６９を染色してフローサイトメトリーで評価した。ＣＤ２５およびＣＤ６９は両方とも信頼性の高いＴ細胞活性化マーカーであることが記載されている（ＣＤ２５：クローンＲＥＡ５７０、およびＣＤ６９：ＲＥＡ８２４（両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）：ＣＤ６９は、ＣＤ２５よりも初期の活性化マーカーである）。小規模培養に由来する、同じドナーから得られた未刺激Ｔ細胞は対照としての役割を果たした。酵素による処理の有無に関わらず、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系から回収したＴ細胞を分析した。両活性化マーカーとも、未刺激対照細胞と比較して非常に高い平均強度レベルが、両Ｔ細胞遺伝子操作条件で検出された（図１１を参照）。これにより、両活性化マーカーの上方制御を誘導するには、２日目までの刺激ですでに十分であったことが確認された。これは、刺激に影響を及ぼすことなく、すでに２日目に調節剤を除去することができることも示す。
【実施例6】
【0175】
Ｔ細胞を３日以内に遺伝子操作するためのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系での刺激Ｔ細胞の拡大増殖能力の評価
刺激Ｔ細胞を用いた複数回の製造ランを、２日目に添加したデキストラナーゼの存在下で、しかしなから１ｅ８～４ｅ８の範囲の様々な開始Ｔ細胞数で、実施例５に記載の通りに実施した。０日目の入力Ｔ細胞数を、３日目に得られた出力Ｔ細胞数と比較した。Ｔ細胞拡大増殖は３日目では検出可能ではなかった。これは、Ｔ細胞は十分に刺激されたが、増殖がまだ始まっていなかったことを示唆する（図１２も参照）。結果的に、Ｔ細胞を３日以内に遺伝子改変するための製造プロトコールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖をサポートするには短すぎる。また、データは、回収可能なＣＡＲ Ｔ細胞の収率が、開始細胞数を増やすことにより効率的に増加することを示唆する。
刺激Ｔ細胞を用いた複数回の製造ランを、２日目に添加したデキストラナーゼの存在下で、しかしなから１ｅ８～４ｅ８の範囲の様々な開始Ｔ細胞数で、実施例５に記載の通りに実施した。０日目の入力Ｔ細胞数を、３日目に得られた出力Ｔ細胞数と比較した。Ｔ細胞拡大増殖は３日目では検出可能ではなかった。これは、Ｔ細胞は十分に刺激されたが、増殖がまだ始まっていなかったことを示唆する（図１２も参照）。結果的に、Ｔ細胞を３日以内に遺伝子改変するための製造プロトコールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖をサポートするには短すぎる。また、データは、回収可能なＣＡＲ Ｔ細胞の収率が、開始細胞数を増やすことにより効率的に増加することを示唆する。
【実施例7】
【0176】
小規模およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でのＣＡＲ発現動態の評価
ＣＡＲ発現動態は、短期間製造プロセスを適用する場合、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功にとって特に重要である。治療用ＣＡＲ分子を発現する輸注したＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍抗原が認識され得ないため、十分には非機能性のままではない。この間に、患者内で腫瘍進行が継続する可能性があり、ＣＡＲ Ｔ細胞がより高い腫瘍量に対応することがより困難になる。現在まで、ＣＡＲ Ｔ細胞の輸注後に最も多く見られる副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）として知られている免疫活性化の開始である。これは、輸注したＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲ抗原を発現する潜在的に高負荷の腫瘍細胞を認識して輸注直後に放出するサイトカインにより引き起こされる全身性炎症応答である。すべてのＣＡＲ Ｔ細胞が、この初期時点でおよび高いＣＡＲ発現レベルでＣＡＲを発現するわけではないため、短期間内でＣＡＲ Ｔ細胞を製造することにより、この毒性を少なくとも部分的に低減することができる。
ＣＡＲ発現動態は、短期間製造プロセスを適用する場合、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功にとって特に重要である。治療用ＣＡＲ分子を発現する輸注したＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍抗原が認識され得ないため、十分には非機能性のままではない。この間に、患者内で腫瘍進行が継続する可能性があり、ＣＡＲ Ｔ細胞がより高い腫瘍量に対応することがより困難になる。現在まで、ＣＡＲ Ｔ細胞の輸注後に最も多く見られる副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）として知られている免疫活性化の開始である。これは、輸注したＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲ抗原を発現する潜在的に高負荷の腫瘍細胞を認識して輸注直後に放出するサイトカインにより引き起こされる全身性炎症応答である。すべてのＣＡＲ Ｔ細胞が、この初期時点でおよび高いＣＡＲ発現レベルでＣＡＲを発現するわけではないため、短期間内でＣＡＲ Ｔ細胞を製造することにより、この毒性を少なくとも部分的に低減することができる。
【0177】
小規模研究では、２人の健康ドナーに由来するＣＤ４／ＣＤ８濃縮Ｔ細胞を、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。１日目に、１ｅ６細胞／ｍｌの刺激Ｔ細胞を、２４ウェルにてＭＯＩが９のＣＡＲコードＬＶで形質導入し、ＣＡＲ発現の動態を、ＰＥに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＡＲ抗原ペプチドを含むＣＡＲ検出試薬（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ抗体、抗ヒト、１３０－１１５－９６５、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて、形質導入細胞の比（つまり、形質導入効率）として１３日目までにフローサイトメトリーで決定した。図１３に図示されているように、形質導入２日後では、Ｔ細胞の１６％はＣＡＲ陽性だったが、ＣＡＲを発現する明確な集団はまだ検出可能ではなかった。５日目には、形質導入効率レベルは１８～２２％のプラトーレベルに達し、ＣＡＲ発現集団は明確だった。
【0178】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系での大規模研究では、２ｅ８個のＣＤ４、ＣＤ８濃縮Ｔ細胞を、０日目に培養チャンバーにて、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、１００ｍｌのＩＬ－７／ＩＬ－１５含有培地中でポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した刺激Ｔ細胞を、ＬＶ含有バッグをチューブセットに滅菌接続することにより、ＭＯＩが６２．５のＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ１９ ＣＡＲコードレンチウイルスベクターで遺伝子改変した。２日目に、調節剤の生分解性リンカーに特異的なデキストラナーゼを含む１０ｍｌの溶液を滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーに自動的に添加した。３日目に、細胞懸濁物の試料を、ＰＥに直接的にまたは間接的にカップリングされているＣＡＲ抗原ペプチドを含むＣＡＲ検出試薬（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ抗体、抗ヒト、１３０－１１５－９６５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で染色した後、フローサイトメトリーで分析した。図１４に図示されているように、形質導入２日後では、Ｔ細胞の１９％がＣＡＲ陽性だった。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ内での培養プロセスを延長して、後の時点での分析を可能にした。形質導入効率は、１０日目には７５％に増加した。これは形質導入２日後ではＣＡＲがまだ十分に発現されていないことを示す。
【実施例8】
【0179】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でのＣＡＲ Ｔ細胞製造パラメーターの最適化
ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスは、複数のパラメーターに依存する、ドナーのばらつき度合いが大きい複雑なプロセスである。遺伝子移入効率およびＴ細胞培養を最適化することにより、必要とされるレンチウイルスベクターの量を低減し、より多数の（ＣＡＲ）Ｔ細胞を得る可能性が提供される。２つの別々のＴ細胞遺伝子操作ランにおいて、１ｅ８または４ｅ８個のＣＤ４、ＣＤ８濃縮Ｔ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて０日目にＩＬ－２含有培地中でポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した刺激Ｔ細胞は、１ｅ８個のＴ細胞に２．５ｍｌのＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ２０／ＣＤ１９タンデムＣＡＲコードレンチウイルスベクターを用いて（図１５：条件Ｉを参照）遺伝子改変し、並行して４ｅ８個のＴ細胞に同じレンチウイルスベクター容積を用いて遺伝子改変した。４Ｅ８個のＣＡＲ Ｔ細胞の製造ランでは、プロセス活性マトリックスをさらに改変し、容積を増加させ、かつレンチウイルスベクター容積を添加した直後に初期振盪ステップを実施することにより、より高い細胞密度での培養を可能にした（図１５：条件ＩＩを参照）。２日目に、両Ｔ細胞製造ランとも、同容積のデキストラナーゼを、滅菌接続および培養チャンバーへの自動添加により適用した。３日目に、製造されたＴ細胞を複数回洗浄し、回収し、総Ｔ細胞数を細胞計数により決定した。両ＣＡＲ Ｔ細胞製造ランの洗浄および回収した細胞試料を、インキュベーター内の２４ウェルでさらに８日間培養し、ＰＥに直接的にまたは間接的にカップリングされているＣＡＲ抗原ペプチドを含むＣＡＲ検出試薬による後の時点での形質導入効率の信頼性の高い評価を可能にした（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ抗体、抗ヒト、１３０－１１５－９６５、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。図１５Ａに図示されているように、条件ＩＩの形質導入効率は３２％だったが、条件Ｉの形質導入効率は、条件Ｉでは１細胞当たりより高いＬＶ用量（ＭＯＩ）を適用したにも関わらず、わずか２０％だった。これは、条件ＩＩのパラメーターが、より高頻度のＣＡＲ Ｔ細胞に有利であることを示しており、ＣＡＲ Ｔ細胞製造プロトコール最適化の可能性が強調される。条件ＩＩでは、より高い形質導入効率が決定されただけでなく、４ｅ８個のＴ細胞が形質導入された。これにより、条件ＩＩでは、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の総数が、条件Ｉと比較してほぼ７倍増加した。
ＣＡＲ Ｔ細胞の製造プロセスは、複数のパラメーターに依存する、ドナーのばらつき度合いが大きい複雑なプロセスである。遺伝子移入効率およびＴ細胞培養を最適化することにより、必要とされるレンチウイルスベクターの量を低減し、より多数の（ＣＡＲ）Ｔ細胞を得る可能性が提供される。２つの別々のＴ細胞遺伝子操作ランにおいて、１ｅ８または４ｅ８個のＣＤ４、ＣＤ８濃縮Ｔ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系でＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて０日目にＩＬ－２含有培地中でポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した刺激Ｔ細胞は、１ｅ８個のＴ細胞に２．５ｍｌのＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ２０／ＣＤ１９タンデムＣＡＲコードレンチウイルスベクターを用いて（図１５：条件Ｉを参照）遺伝子改変し、並行して４ｅ８個のＴ細胞に同じレンチウイルスベクター容積を用いて遺伝子改変した。４Ｅ８個のＣＡＲ Ｔ細胞の製造ランでは、プロセス活性マトリックスをさらに改変し、容積を増加させ、かつレンチウイルスベクター容積を添加した直後に初期振盪ステップを実施することにより、より高い細胞密度での培養を可能にした（図１５：条件ＩＩを参照）。２日目に、両Ｔ細胞製造ランとも、同容積のデキストラナーゼを、滅菌接続および培養チャンバーへの自動添加により適用した。３日目に、製造されたＴ細胞を複数回洗浄し、回収し、総Ｔ細胞数を細胞計数により決定した。両ＣＡＲ Ｔ細胞製造ランの洗浄および回収した細胞試料を、インキュベーター内の２４ウェルでさらに８日間培養し、ＰＥに直接的にまたは間接的にカップリングされているＣＡＲ抗原ペプチドを含むＣＡＲ検出試薬による後の時点での形質導入効率の信頼性の高い評価を可能にした（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ抗体、抗ヒト、１３０－１１５－９６５、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。図１５Ａに図示されているように、条件ＩＩの形質導入効率は３２％だったが、条件Ｉの形質導入効率は、条件Ｉでは１細胞当たりより高いＬＶ用量（ＭＯＩ）を適用したにも関わらず、わずか２０％だった。これは、条件ＩＩのパラメーターが、より高頻度のＣＡＲ Ｔ細胞に有利であることを示しており、ＣＡＲ Ｔ細胞製造プロトコール最適化の可能性が強調される。条件ＩＩでは、より高い形質導入効率が決定されただけでなく、４ｅ８個のＴ細胞が形質導入された。これにより、条件ＩＩでは、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の総数が、条件Ｉと比較してほぼ７倍増加した。
【実施例9】
【0180】
３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能
ＣＡＲ Ｔ細胞の機能は、典型的には、ＣＡＲ抗原を発現する腫瘍細胞と共培養する際にｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。短期間内におよびＣＡＲ抗原との接触時に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびＩＬ－２などの炎症性サイトカインを放出する。加えて、グランザイムＢおよびパーフォリンＢが放出され、生存腫瘍細胞の数が低減される。こうした機能アッセイを実施して、３日以内に製造されたＣＡＲ Ｔ細胞の機能性を特徴付けた。２人の健康ドナーに由来するＴ細胞は、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で未接触だったものを濃縮し、０日目に、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体または抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。１日目に、ＩＬ－７／ＩＬ－１５含有ＴｅｘＭＡＣＳ培地中１ｅ６細胞／ｍｌの刺激Ｔ細胞を、２４ウェルにてＭＯＩが１０のＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ２０ ＣＡＲコードＬＶで形質導入した。２日目にデキストラナーゼを添加し、３日目に形質導入Ｔ細胞を洗浄および回収し、様々なエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）での共培養を設定した。ＣＡＲ特異的検出試薬を使用したフローサイトメトリーで測定したところ、形質導入効率は３日目では７０％だった。合計で５００００、１７０００、６０００、または２０００個のＴ細胞を、９６ウェル平底プレートのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／Ｌ－グルタミン培地中の４００００個のＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞に三重重複で添加した。ＧＦＰを発現するトランスジェニックＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－ＧＦＰ）を使用して、フローサイトメトリーによる共培養中の腫瘍細胞の識別および定量化を可能にし、製造されたＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性を決定した。対照として、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞との共培養を、未刺激で未形質導入のＴ細胞と並行して三重重複で確立した。加えて、腫瘍細胞を、刺激されているが形質導入されていないＴ細胞と共に共培養した。このようにすると、潜在的に非特異的な細胞傷害活性が容易に検出される。共培養を設定した２４時間後、各ウェルから１００μｌの上清を取り出し、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカインキットアッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したフローサイトメトリーでサイトカイン発現レベルを評価した。３日以内に生成されたＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞では、ＩＦＮ－ｇ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－２レベルは、定量化レベルさえも超える高レベルでＥ：Ｔ依存的様式で検出可能だった（図１６を参照）。対照的に、未刺激Ｔ細胞および未形質導入のままだった刺激Ｔ細胞では、サイトカインは検出可能ではなかった。これにより、３日以内に製造されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の特異的抗腫瘍応答が確認される。
ＣＡＲ Ｔ細胞の機能は、典型的には、ＣＡＲ抗原を発現する腫瘍細胞と共培養する際にｉｎ ｖｉｔｒｏで評価される。短期間内におよびＣＡＲ抗原との接触時に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびＩＬ－２などの炎症性サイトカインを放出する。加えて、グランザイムＢおよびパーフォリンＢが放出され、生存腫瘍細胞の数が低減される。こうした機能アッセイを実施して、３日以内に製造されたＣＡＲ Ｔ細胞の機能性を特徴付けた。２人の健康ドナーに由来するＴ細胞は、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で未接触だったものを濃縮し、０日目に、生分解性リンカーに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＤ３に特異的な抗体またはその抗原結合性断片およびＣＤ２８に特異的な抗体または抗原結合性断片を含む調節試薬であるＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でポリクローナルに刺激した。１日目に、ＩＬ－７／ＩＬ－１５含有ＴｅｘＭＡＣＳ培地中１ｅ６細胞／ｍｌの刺激Ｔ細胞を、２４ウェルにてＭＯＩが１０のＶＳＶ－ＧシュードタイプＣＤ２０ ＣＡＲコードＬＶで形質導入した。２日目にデキストラナーゼを添加し、３日目に形質導入Ｔ細胞を洗浄および回収し、様々なエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）での共培養を設定した。ＣＡＲ特異的検出試薬を使用したフローサイトメトリーで測定したところ、形質導入効率は３日目では７０％だった。合計で５００００、１７０００、６０００、または２０００個のＴ細胞を、９６ウェル平底プレートのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／Ｌ－グルタミン培地中の４００００個のＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞に三重重複で添加した。ＧＦＰを発現するトランスジェニックＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－ＧＦＰ）を使用して、フローサイトメトリーによる共培養中の腫瘍細胞の識別および定量化を可能にし、製造されたＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性を決定した。対照として、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞との共培養を、未刺激で未形質導入のＴ細胞と並行して三重重複で確立した。加えて、腫瘍細胞を、刺激されているが形質導入されていないＴ細胞と共に共培養した。このようにすると、潜在的に非特異的な細胞傷害活性が容易に検出される。共培養を設定した２４時間後、各ウェルから１００μｌの上清を取り出し、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカインキットアッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したフローサイトメトリーでサイトカイン発現レベルを評価した。３日以内に生成されたＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞では、ＩＦＮ－ｇ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－２レベルは、定量化レベルさえも超える高レベルでＥ：Ｔ依存的様式で検出可能だった（図１６を参照）。対照的に、未刺激Ｔ細胞および未形質導入のままだった刺激Ｔ細胞では、サイトカインは検出可能ではなかった。これにより、３日以内に製造されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の特異的抗腫瘍応答が確認される。
【0181】
共培養したＴ細胞およびＲａｊｉ－ＧＦＰ細胞を、さらに２日間共培養し、細胞の５０％をフローサイトメトリーで分析して、残留腫瘍細胞の数を、および結果的にはＣＡＲ Ｔ細胞の効力を定量化した（ラウンド１；左）。別の２０，０００個のＲａｊｉ－ＧＦＰ腫瘍細胞を、共培養の残りの５０％に添加して、ＣＡＲ Ｔ細胞にとって困難な状態に類似したより多くの腫瘍細胞が存在する場合のＣＡＲ Ｔ細胞の効力を評価した。さらに７２時間後、フローサイトメトリーを実施して、第２のラウンドの共培養の残留腫瘍細胞数を定量化した（ラウンド２：右）。Ｅ：Ｔ比が１．２５：１と高い場合、第１および第２のラウンドの共培養では、Ｒａｊｉ細胞のほぼ１００％が死滅した（図１７を参照）。対照的に、第１および第２の共培養の未形質導入対照では、標的細胞のわずか５０％および４０％が検出可能だった。Ｅ：Ｔ比が０．４２５：１の場合、１．２５：１の場合と同等の機能性パターンが検出可能だったが、全体的なレベルはより低くかった。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の存在下では、第１および第２のラウンドの共培養にて腫瘍細胞の６０％が溶解した。未形質導入対照とは対照的に、第１のラウンドでは腫瘍細胞の４０％が溶解し、第２のラウンドでは死滅は測定されなかった。Ｅ：Ｔ比が０．１５：１の場合、Ｔ細胞の頻度は低すぎて、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を誘導することができなかった。要するに、３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の機能性は、サイトカイン放出およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の特異的死滅を示すｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより確認された。
【実施例10】
【0182】
３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能
３日以内に生成されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能性を、６～８週齢のＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスで確認した。実験はすべて、「科学的目的で使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会および理事会の指令２０１０／６３／ＥＵ」に準拠し、ドイツ動物保護法の規制に準拠して実施した。
３日以内に生成されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能性を、６～８週齢のＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスで確認した。実験はすべて、「科学的目的で使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会および理事会の指令２０１０／６３／ＥＵ」に準拠し、ドイツ動物保護法の規制に準拠して実施した。
【0183】
手短に言えば、健康ドナーの白血球アフェレーシス試料を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ系で自動的に処理し、ＣＡＲ Ｔ細胞を３日以内に生成した（図１８上段を参照）。０日目に、白血球アフェレーシス試料を含むバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）チューブセット５２０に溶接で滅菌接続した。細胞を自動的に洗浄し、ＣＤ４およびＣＤ８ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬で標識して、Ｔ細胞を濃縮した。２ｅ８個のＴ細胞を、培養チャンバーのＩＬ－７／ＩＬ－１５含有培地に移送し、２００ｍｌの培養容積中でＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によりポリクローナルに刺激した。１日目に、単離した活性化Ｔ細胞をＶＳＶ－Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターで遺伝子改変して、ＣＤ２２／ＣＤ１９タンデム－ＣＡＲの発現を誘導した。１０ｍｌのレンチウイルスベクターを含むバッグをチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーへと自動的に移送した。２日目に、デキストラナーゼを含む１０ｍｌの溶液をチューブセットに滅菌接続し、Ｔ細胞を含むチャンバーに自動的に添加してリンカーを特異的に分解した。これにより、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはそれらの断片が遊離され、調節剤の活性が阻害された。複数回洗浄した後、細胞産物をフローサイトメトリーで分析して、各ステップにおける形質導入効率、生存率、および細胞組成を決定した（図１９を参照）。細胞組成は、ＣＤ４５ｈ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６／ＣＤ５６、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９、ＣＤ１４を染色して決定した。製剤化後に、６７％ＣＤ４ Ｔ細胞、１８％ＣＤ８ Ｔ細胞、および７％ＮＫＴ細胞が検出された。ＮＫ細胞、好酸球、好中球、Ｂ細胞、または単球の頻度は、検出の最低レベルだった。形質導入効率を、ＰＥに直接的にまたは間接的にカップリングされている、ＣＡＲ抗原ペプチドを含むＣＡＲ検出試薬（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ抗体、抗ヒト、１３０－１１５－９６５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、フローサイトメトリーで分析した。回収した日の形質導入効率は２１％だった。安定したＣＡＲ発現レベルが達成されたさらに８日間の小規模長期培養後に分析したところ、形質導入効率は７３％に増加した。遺伝子操作Ｔ細胞を回収する４日前に５ｅ５個のホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞を静脈内接種することにより、Ｒａｊｉ腫瘍を確立させた（図１７を参照）。ＣＡＲ形質導入群に由来する３ｅ６または６ｅ６個の総Ｔ細胞を、回収した日に１群当たり７匹のマウスに注射した（図１８の下段を参照）。２つの追加の群を陰性対照として確立した。１群は、５ｅ５個の腫瘍細胞を受け取ったがＴ細胞は受け取らなかった（ｎ＝７；腫瘍のみ）。１群は、５ｅ５個の腫瘍細胞、および並行して小規模で培養した同じドナーに由来する３ｅ６個の未形質導入Ｔ細胞を受け取った（ｎ＝７）。腫瘍増殖ならびに抗腫瘍応答を、Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ）を使用して頻繁にモニターした。この目的のために、１００μｌのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｒｅｄｉｊｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｕｌｔｒａをｉ．ｐ．注射し、その後イソフルランＸＧＩ－８麻酔系を使用してマウスに麻酔をかけた。基質注射の６分後に測定を実施した。
【0184】
３ｅ６個の未形質導入Ｔ細胞および３ｅ６個の形質導入Ｔ細胞を受け取った群のすべてのマウスが示されている（図２０を参照）。Ｔ細胞を受け取らなかった（つまり、腫瘍のみ）群の場合、７匹のマウスのうち３匹の代表的なマウスが示されている。腫瘍量は、未形質導入Ｔ細胞を受け取ったかまたはＴ細胞を受け取らなかったすべてのマウスで急速に増加した。経時的な腫瘍量の増加は、両対照群で同等である。両対照群のマウスは、臨界腫瘍量レベルに達する前に、Ｔ細胞注射の１４日後に犠牲死させなければならなかった。対照的に、３日以内に製造されたＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を受け取った群のマウスは、対照群と比較して、Ｔ細胞注射３日後および７日後に用量依存的様式で初期時点での増加減速を示した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群の腫瘍量のレベルは、Ｔ細胞注射後７日目にピークに達した。すべてのマウスの腫瘍量が、実験の開始時に初期測定されたレベルへと着実におよび一律に低減することで検出された通り、腫瘍の進行は完全に逆転した。３ｅ６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞および同じ用量の未形質導入Ｔ細胞を受け取った群のすべてのマウスの代表的なｉｎ ｖｉｖｏ画像化データが示されている。腫瘍のみの群の場合は、代表的なマウスが示されている。
【0185】
図２１には、腫瘍量は、群（ｎ＝７）のマウス１匹当たり６Ｅ６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞という最も高い用量を受けた群も含む、すべての群の平均およびＳＥＭとして図示されている。予想通り、６ｅ６群は抗腫瘍応答が最も速かったが、実験終了時の腫瘍量は、３ｅ６個のＣＡＲ Ｔ細胞群と同等だった。このデータにより、３日以内に拡大増殖を一切させずに生成したＣＡＲ Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍応答を媒介していることが確認される。この結果は、脾臓、骨髄、および血液中のヒト腫瘍細胞およびヒトＴ細胞サブセットを定量化するためのフローサイトメトリーデータにより確認された。「腫瘍のみ」および「３Ｅ６個の未形質導入Ｔ細胞」対照群からランダムに選択した３匹のマウスを１４日目に犠牲死させ、これらの臓器におけるヒト細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＴ細胞サブセットの存在量を、ＣＤ４５ｈ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、７－ＡＡＤ、ＣＤ１９ ＣＡＲ検出の染色により（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）定量化した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群のマウスは、７匹中３匹のマウスをランダムに選択し、１８日目に犠牲死させて同様に分析した。予想通り、腫瘍のみの群では、Ｔ細胞は見出されなかった（図２２を参照）。未形質導入コホートでは、最大で２０％のＴ細胞しか検出可能でなかった。対照的に、ヒトＴ細胞の頻度は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を輸注したマウスを含むコホートで最も高く、最大で７５％だった。したがって、Ｔ細胞は、未形質導入Ｔ細胞によるコホートよりも、形質導入Ｔ細胞を含むコホートでより多く存在する。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞が拡大増殖および存続することが可能であることを示す。これは、図２１に示されているデータと一致しており、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、腫瘍を制御することが可能であるが、未形質導入Ｔ細胞の存在量は比較的低く、腫瘍増殖を制御することができなかったことを示す。
【0186】
図２３には、腫瘍細胞が消失しており、またＣＤ８がより多く拡大増殖したことを示す形質導入群とは対照的に、未形質導入の効果では腫瘍が依然として存在することがさらに示されている。
【0187】
ヒト細胞のみの細胞サブセットの頻度を決定することにより、ヒトサブセットの細胞組成をより詳細に調査した（図２３を参照）。この場合も、腫瘍のみの群ではヒトＴ細胞は見出されなかった。未形質導入Ｔ細胞群の場合、ヒト細胞の２０～６０％は残留Ｒａｊｉ細胞であり、ＣＤ４対ＣＤ８比は２：１～３：１だった。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群では、約５０％のヒトＣＤ４ Ｔ細胞および５０％のヒトＣＤ８ Ｔ細胞が見出され、ＣＡＲ形質導入群の残留のＲａｊｉ細胞は、バックグラウンドレベルに近い値しか検出可能ではなかった。このデータは、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を有するマウスを含むコホートでは、ＣＤ８ Ｔ細胞サブセットが、ｉｎ ｖｉｖｏで特異的に拡大増殖したことを示唆する。
【0188】
脾臓を分析したところ、腫瘍のみのコホートでは、このリンパ球性臓器にヒトＴ細胞は見出されなかった（図２４を参照）。未形質導入Ｔ細胞を含むコホートでは、Ｔ細胞頻度は最大で１０％であることが決定された。対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化データで測定したところ、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞群では、ヒトＴ細胞の頻度がはるかにより高く、最大で４０％がヒトＴ細胞だった。これによりＴ細胞拡大増殖および抗腫瘍活性が確認された。
【0189】
要するに、ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性データを確認し、未形質導入Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞の増殖を制御することができなかったことを示す。対照的に、ヒトＴ細胞の最も高い割合は、骨髄（Ｒａｊｉ生着および拡大増殖の好ましい微小環境である）に見出された。これは、３日間拡大増殖したＣＡＲ Ｔ細胞も、そのような微小環境へと回帰し、抗腫瘍活性を促進することが可能であることを示す。
【0190】
したがって、３日以内に生成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、驚くべきことに、明示的な拡大増殖ステップが存在しない場合でさえ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでロバストな抗腫瘍活性を促進する。これは、機能的なＣＡＲ Ｔ細胞の生成には、ｉｎ ｖｉｖｏ拡大増殖は必須であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大増殖は必須ではないことを証明する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】