特表 2022-534969 併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-04

(54)【発明の名称】併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20220728BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220728BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220728BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 38/06 20060101ALI20220728BHJP

   C07D 519/00 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/69 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/427 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/5517 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20220728BHJP

   C07D 491/044 20060101ALN20220728BHJP

   C07D 487/04 20060101ALN20220728BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20220728BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20220728BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20220728BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P35/02 ZNA

A61P43/00 121

A61K47/68

A61K39/395 L

A61K38/06

C07D519/00 311

A61K9/08

A61K31/69

A61K31/5377

A61K31/122

A61K31/427

A61K31/5517

A61K38/05

A61K38/07

C07D491/044

C07D487/04 152

C07K16/28

C12N5/0781

C12N5/09

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570788

(86)(22)【出願日】2020-05-29

(85)【翻訳文提出日】2022-01-27

(86)【国際出願番号】 IB2020055128

(87)【国際公開番号】W WO2020240502

(87)【国際公開日】2020-12-03

(31)【優先権主張番号】62/855,040

(32)【優先日】2019-05-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/944,698

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(71)【出願人】

【識別番号】399052796

【氏名又は名称】デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】キニア，クリスタ

(72)【発明者】

【氏名】タイス，デイビッド アラン

(72)【発明者】

【氏名】コーツ，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】タイ， ユー－ツ

(72)【発明者】

【氏名】アンダーソン，ケネス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C050

4C072

4C076

4C084

4C085

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AC20

4B065CA44

4C050AA01

4C050AA07

4C050BB04

4C050CC11

4C050CC15

4C050DD10

4C050EE01

4C050EE02

4C050FF02

4C050FF05

4C050GG03

4C050HH01

4C050HH03

4C072MM01

4C072UU01

4C076AA11

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF11

4C076FF32

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA20

4C084BA08

4C084BA15

4C084BA16

4C084BA23

4C084BA32

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB27

4C084ZC75

4C085AA21

4C085EE03

4C085GG02

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC73

4C086BC82

4C086CB11

4C086DA43

4C086GA10

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA05

4C086ZB27

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206CB21

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA37

4C206MA86

4C206NA05

4C206ZB27

4C206ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための方法及び組成物に関する。具体的には、本開示は、（ａ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と、（ｂ）プロテアソーム阻害剤とを含むＢ細胞悪性腫瘍用薬剤又は組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤であって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
前記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
前記ＡＤＣを欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤。

【請求項2】

Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせであって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
前記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
前記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせ。

【請求項3】

Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法であって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含む治療的組み合わせを対象に投与することを含み、
前記治療的組み合わせが、前記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
前記治療的組み合わせが、前記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法。

【請求項4】

（ａ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣを、（ｂ）プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む、悪性Ｂ細胞のＡＤＣによる抑制を増強させるためのインビトロ法。

【請求項5】

（ａ）プロテアソーム阻害剤を、（ｂ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む、悪性Ｂ細胞のプロテアソーム阻害剤による抑制を増強させるためのインビトロ法。

【請求項6】

ａ．前記プロテアソーム阻害剤が、前記ＡＤＣより前に、それと同時に、若しくはそれに続いて投与されるか、又は
ｂ．前記ＡＤＣが、前記プロテアソーム阻害剤より前に、それと同時に、若しくはそれに続いて投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又はインビトロ法。

【請求項7】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、参照非悪性Ｂ細胞と比較してＢＣＭＡ抗原の発現レベルが増加した悪性Ｂ細胞を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又はインビトロ法。

【請求項8】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、骨髄腫、多発性骨髄腫、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項9】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫である、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合断片が、以下の６つのＣＤＲ：
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、又はその機能的変異体；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、又はその機能的変異体；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、又はその機能的変異体；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、又はその機能的変異体；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、又はその機能的変異体；及び
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、又はその機能的変異体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、若しくはその機能的等価物；及び／又は
ｂ．配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、若しくはその機能的等価物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項12】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２３９位のセリン（Ｓ）と２４０位のバリン（Ｖ）との間にシステイン（Ｃ）の挿入を含む重鎖定常領域を含み、付番がＫａｂａｔのＥＵインデックスに対応する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項13】

前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項14】

前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むヒトカッパ定常領域を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項15】

前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、マリゾミブ、オプロゾミブ、デランゾミブ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項16】

前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項17】

前記核酸架橋剤が、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項18】

前記核酸架橋剤が、式：

【化1】

をそれぞれ含む（ａ）ＳＧ３２４９、（ｂ）ＳＧ３３１５、若しくは（ｃ）ＳＧ３４００
又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上のＰＢＤである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項19】

前記核酸架橋剤が、下記式を含む前記ＰＢＤ ＳＧ３２４９である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【化2】

【請求項20】

前記抗体又はその抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項21】

前記薬剤又は前記治療的組み合わせが、薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項22】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、デキサメタゾン、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上に対して耐性である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項23】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、ボルテゾミブに対して耐性である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項24】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強が、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む対象における、腫瘍増殖の遅延の増大、腫瘍サイズの低減の増強、腫瘍転移の低減の増強、生存率の増大、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【請求項25】

前記薬剤又は前記治療的組み合わせが、静脈内注入によって投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の薬剤、使用のための治療的組み合わせ、方法、又は使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出された配列表に対する参照
本出願とともに提出される、ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の内容（名称：ＢＣＭＡ－１５０－ＵＳ－ＰＳＰ－ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１１，２７９バイト、作成日：２０１９年５月２８日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

血液癌とは、血球、骨髄、又はリンパ系に影響を及ぼす多くの異なる種類の癌を説明するために使用される用語である。血液癌は、米国では毎年新たな癌症例のほぼ１０％を占めており、米国のみで、１２０万人超が血液癌であるか又は血液癌の寛解状態にあると報告されている。血液癌は、英国では５番目に多い癌であり、英国では毎年２４０，０００人超が血液癌であり、４０，０００人が血液癌と診断されている。主な３つの群は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫であり、それぞれがＢ細胞悪性腫瘍を代表する。

【0003】

例えば、Ｂ細胞悪性骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ））は、前悪性の意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）から活動性ＭＭへの進行に関連した進行中のＤＮＡ損傷を伴う、クローン性形質細胞（例えば、Ｂ細胞）の悪性腫瘍である。現在の骨髄腫の処置レジメンには、従来のコルチコステロイド、アルキル化剤、プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）、及び免疫調節薬（ＩＭｉＤ）などがあり、これらは骨髄腫患者の全生存率を上昇させるのに役立っている。近年探求されている特に興味深い治療手段は、免疫療法（例えば、モノクローナル抗体を用いるもの）である。例えば、特許文献１及び特許文献２は、Ｂ細胞悪性腫瘍（特に骨髄腫細胞）に対して良好な選択性を有することが示されている、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）として知られる抗原に結合する抗体を記載しており、記載されている抗体は抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を示す。

【0004】

様々な処置の利用可能性が増加しているにもかかわらず、薬物耐性の発生が疾患（特に骨髄腫）の再発の根底にあり、あらゆる処置の有効性は、耐容用量によって実現可能な最大の有効性により制限される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１０／１０４９４９号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０１９／０２５９８３号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を有する改善された薬剤が必要とされている。本発明は、上述の問題の１つ以上に対処する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の併用療法に関する。

【0008】

本発明は、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）を、抗ＢＣＭＡ抗体－薬物コンジュゲートと相乗的に作用させるために使用して（またその逆も同様）、これらの薬剤の組み合わせとの接触後にＢ細胞悪性腫瘍の細胞の細胞毒性を増加させることができるという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明の将来性のある知見は、プロテアソーム阻害剤を、抗体－薬物コンジュゲートの抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を増強させるために（またその逆も同様）、より詳細には薬物（又は上記抗体－薬物コンジュゲート）が核酸架橋剤である場合に、用いることができるということである。

【0009】

一態様では、本明細書で提供されるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤であって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤である。

【0010】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせであって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせである。

【0011】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法であって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含む治療的組み合わせを対象に投与することを含み、
この治療的組み合わせが、上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
この治療的組み合わせが、上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法である。

【0012】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、悪性Ｂ細胞のＡＤＣによる抑制を増強させるためのインビトロ法であり、上記方法は、（ａ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣを、（ｂ）プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む。

【0013】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、悪性Ｂ細胞のプロテアソーム阻害剤による抑制を増強させるためのインビトロ法であり、上記方法は、（ａ）プロテアソーム阻害剤を、（ｂ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、Ｍ２がそのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログ（Ｍ３）よりもＭＭ細胞に対してより細胞毒性が高いことを示す。Ａ Ｍ２又はＭ３の段階希釈液をＭＭ細胞培養物に３日間添加し、続いてＣＣＫ８細胞生存率アッセイを行った。用量毎に三連で行った３回の反復からの１つの代表的な実験から決定されたＭ２（黒丸）及びＭ３（白丸）のＥＤ_５０値を示す。それぞれＭＭ１Ｓ及びＨ９２９に由来するＭＭ１Ｓ（Ｒ）及びＨ９２９（Ｒ）細胞は、レナリドミド及びポマリドミドに耐性である。ＲＰＭＩ－ＢＣＭＡはＢＣＭＡを過剰発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、ＲＰＭＩはＲＰＭＩ８２２６細胞である。Ｂ Ｍ２（黒丸）又はＭ３（白丸）を３日間添加し、続いて［Ｈ^３］チミジン取り込みを用いた細胞増殖アッセイ（左）、並びにＲＰＭＩ８２２６に関するＣＣＫ８ベースの生存率アッセイ、並びに対にしたＡＮＢＬ６及びＡＮＢＬ６－ＢＲ（ボルテゾミブ（ｂｔｚ）耐性）細胞に関する発光ベースのＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｒｏｗｔｈ（ＣＴＧ）を行った。Ｃ デキサメタゾン（Ｄｅｘ）耐性ＭＭ細胞及びｂｔｚ耐性ＭＭ細胞の対をＭ２又はＭ３で２日間処置し、続いてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析を行い、アポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／Ａｑｕａ－及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／Ａｑｕａ＋）のパーセンテージを求めた。＊＊＊、ｐ＜０．０００５；＊＊、ｐ＜０．００５。

【図2】図２は、Ｍ２がＢＭＳＣにより誘導されるＭＭ細胞の生存能をＭ３よりも強力に遮断し、患者由来の初代ＭＭ細胞に対して細胞毒性であることを示す。Ａ ＭＭ１Ｓｌｕｃ細胞を単独で又はＢＭＳＣと共にＭ２又はＭ３で４日間処置し、細胞生存率をＢＬＩによって求めた。Ｂ ＣＦＳＥを標識したＩＭｉＤ耐性ＭＭ１Ｓ（Ｒ）又はＨ９２９（Ｒ）細胞を、ＢＭＳＣの存在下又は非存在下で、示された薬物と共に２日間インキュベートし、続いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＬｉｖｅ／ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色を用いたＦＣＭ分析を行った。用量毎に三連で行った３回の実験のうちの１回のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－／Ａｑｕａ－（生存）ＣＦＳＥ＋ＭＭ細胞のパーセンテージを示す。Ｃ Ｈ９２９細胞を、単独で又はＩＬ－６（５ｎｇ／ｍｌ）と共にＭ２で２日間処置し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－／Ａｑｕａ－（生存）細胞のパーセンテージを測定した。Ｄ 代表的なＲＲＭＭ患者由来のＣＤ１３８＋細胞をＭ２又はＭ３と共に３日間インキュベートし、生／死細胞画分を測定した。Ｅ ＲＲＭＭ患者（ｎ＝３）由来のＣＤ１３８＋細胞をＭ２と共に３日間インキュベートし、続いてＣＴＧアッセイを行った。Ｆ ＭＭ患者（ＮＤＭＭ＝４、ＲＲＭＭ＝２）のＢＭＭＣをＭ２（１０μｇ／ｍｌ）で５日間処置した。生存ＣＤ３８ｈｉｇｈＣＤ１３８＋細胞のパーセンテージをＦＣＭ分析によって求めた。

【図3】図３は、薬物感受性に関係なく、ＭＭ細胞株においてＭ２がＭ３よりも強力に細胞増殖を遮断し、アポトーシスを誘導することを示す。Ａ Ｍ１（アイソタイプ－ＰＢＤ）、Ｍ２（抗ＢＣＭＡ－ＰＢＤ）、Ｍ３（抗ＢＣＭＡ－ＭＭＡＦホモログ）、及びＭ４（アイソタイプ－ＭＭＡＦ）をＭＭ細胞に３日間三連で添加し、続いてＣＣＫ８生存率アッセイを行った。Ｂ Ｍ２又はＭ３を３日間添加し、続いて［Ｈ^３］チミジン取り込みを用いた増殖アッセイを行った。Ｃ ＡＮＣＢＬ６（ｂｔｚ感受性）細胞及びＡＮＢＬ６－ＢＲ（ｂｔｚ耐性）細胞を、ＣＴＧベースの生存アッセイ（左）並びにＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＬｉｖｅ／ｄｅａｄ Ａｑｕａ染色を用いたＦＣＭベースのアポトーシスアッセイ（右）を使用したｂｔｚによる２日間の処置後に確認した。Ｄ ＭＭ１Ｓ細胞（上部パネル）及びＭＭ１Ｒ細胞（下部パネル）を、示された薬物で処置した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋ＭＭ細胞のパーセンテージを示す。

【図4】図４は、Ｍ２がＢＭＳＣ及びＩＬ－６によって保護されたＭＭ細胞に対して特異的な細胞毒性を誘導し、更にＣＤ３８ｈｉｇｈＣＤ１３８＋患者ＭＭ細胞を枯渇させることを示す。Ａ 種々の薬物感受性及び薬物耐性ＭＭ細胞株（ｎ＝６）を、単独で又はＢＭＳＣと共に、Ｍ２で３日間処置し、続いてＣＴＧアッセイを行った。Ｂ ＢＣＭＡ陰性ＢＭＳＣ、ＰＢＭＣ、及びＮＫ細胞をＭ２で５日間処置した。Ｃ Ｈ９２９細胞を、単独で又はＩＬ－６（５ｎｇ／ｍｌ）と共にＭ２で３日間処置した。Ｄ 代表的なＮＤＭＭ患者のＢＭＭＣをＭ２と共に５日間インキュベートした。Ｍ２は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＣＤ１３８＋ＭＭ細胞を用量依存的に減少させた。

【図5】図５は、Ｍ２がボルテゾミブと共に相乗的にＭＭ細胞死を誘導することを示す。Ａ～Ｂ ＭＭ細胞を示された薬物で２日間処置し、続いてＰＩ及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を使用してＦＣＭ分析した。各細胞株の１つの代表的な試料の結果（Ａ）、及び３回の反復からのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋細胞のパーセンテージの概要（Ｂ）を示す。＊、ｐ＜０．０１；＊＊、ｐ＜０．００５、＊＊＊、ｐ＜０．００２、Ｃ ＣＴＧベースの細胞生存率アッセイからのデータを使用して、併用指数（ＣＩ）を求める。「効果」は、Ｍ２及びｂｔｚによる細胞生存率の低減の程度を意味する。１未満のＣＩは両剤の相乗作用を示す。同様の結果が、更なる３回の反復から得られた。

【図6】図６は、低用量のＭ２とｂｔｚとの併用が、相乗的なＭＭ細胞死を誘発することを示す。示されたＭＭ細胞株を、Ｍ２及びｂｔｚと３日間、単独で又は一緒にインキュベートし、続いてＣＴＧベースの生存率アッセイを行った。「効果」は、Ｍ２＋ｂｔｚ処置の併用処置によって生存率の減少を示す細胞の画分を表す。１未満の併用指数（ＣＩ）は相乗作用を示す。全ての実験を三連で行い、平均値を示す。

【図7】図７は、ボルテゾミブと組み合わせたＭ２が、個々の薬物単独と比較した場合、マウスにおいてより強力なインビボ抗ＭＭ活性及び生存期間の延長を誘導することを示す。Ａ 触知可能なＭＭ１Ｓ腫瘍移植片を有するＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（各群につきｎ＝７）をランダム化し、対照溶媒、Ｍ２の単回用量（０．４ｍｇ／ｋｇ）、ｂｔｚの６用量（０．４ｍｇ／ｋｇ）、又はＭ２とｂｔｚの併用（Ｍ２＋ｂｔｚ）で２週間処置した。腫瘍増殖は、併用処置群で対照（ｃｎｔ）と比較して有意に阻害された（Ｍ２対Ｍ２＋ｂｔｚ、ｐ＝０．０３５；ｂｔｚ対Ｍ２＋ｂｔｚ、ｐ＜０．００５；ｃｎｔ対Ｍ２＋ｂｔｚ；ｐ＝０．００１２；ｂｔｚ対ｃｎｔ、ｐ＜０．００５；Ｍ２対ｃｎｔ、ｐ＜０．００５）。＊、ｐ＜０．０４；＊＊、ｐ＜０．００５、Ｂ 動物の体重を追跡した。Ｃ カプラン・マイヤー及びログランク分析を使用したところ、併用療法で処置された動物の全生存期間中央値は有意に延長された（ｃｎｔ、２２日；Ｍ２、４０．５日；ｂｔｚ、３５日；Ｍ２＋ｂｔｚ、５７日）（Ｍ２対Ｍ２＋ｂｔｚ、ｐ＜０．０４５；ｂｔｚ対Ｍ２＋ｂｔｚ、ｐ＜０．０２３；ｃｎｔ対Ｍ２＋ｂｔｚ、ｐ＜０．００２）。Ｄ 各群からの腫瘍組織切片を、Ｋｉ－６７について免疫組織化学的に分析した（原倍率、×４００）。

【図8】図８は、Ｍ２とｂｔｚとの併用処置がＭＭ１Ｓ異種移植片のインビボ増殖を著しく減少させ、骨髄腫の処置におけるＭ２及びｂｔｚのインビボ相乗作用を実証することを示す。代表的なマウスから同じ処置日に腫瘍を除去した。

【図9】図９は、Ｍ２がｐ５３の状態及び薬物耐性に関係なく、ＭＭ細胞のＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）シグナル伝達経路のリン酸化を著しく誘導することを示す。野生型（ＭＭ１Ｓ、ＭＭ１Ｒ、Ｈ９２９）ＭＭ細胞及び変異したｐ５３を有するＭＭ細胞（＊）を、示された時間（ａ）、一晩（ｂ、ｄ）、又は２日間（ｃ）、示された用量のＭ２（ａ～ｄ）で処置した。細胞溶解物を調製し、示された分子に対する特異的抗体を使用した免疫ブロッティングにより分析した。ｃＰＡＲＰは切断されたＰＡＲＰであり、ｃＣａｓ３は切断されたカスパーゼ３である。実験を３回繰り返した。

【図10】図１０は、Ｍ２がＤＤＲシグナル伝達カスケードを著しく誘導し、続いてＢＣＭＡ依存的にアポトーシスを誘導することを示す。示されたＭＭ細胞を、示された用量のＭ２（Ａ～Ｂ、Ｄ～Ｆ）又はＭ３（Ａ、Ｆ、Ｇ）で一晩（Ａ、Ｄ、Ｇ）又は２日間（Ｂ、Ｅ～Ｆ）処置した。細胞溶解物を調製し、示された分子に対する特異的抗体を使用した免疫ブロッティングにより分析した。Ｍ２はＤＤＲシグナル伝達経路を誘導するが、Ｍ３は誘導しない。ｃＰＡＲＰは切断されたＰＡＲＰであり、ｃＣａｓ３は切断されたカスパーゼ３である。（Ｃ）ＢＣＭＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した。ＢＣＭＡ^{ｍｅｄｉｕｍ}、ＢＣＭＡ^ｌｏｗ、及びＢＣＭＡ^ｈｉｇｈは、親ＲＰＭＩ８２２６に由来するものであった。

【図11】Ｍ２処置は、ＲＡＤ５１を含むＤＤＲ関連遺伝子の発現を誘導する。致死量以下の条件下でＭ２で処置した生存Ｈ９２９ ＭＭ細胞由来のＲＮＡを、ＴａｇＭａｎ（登録商標）ヒトＤＮＡ修復経路アレイ（ａ）を使用して分析した。転写物を内部対照の幾何平均により正規化し、対照（ｃｎｔ）群に対するＭ２処置群の倍率変化を示す。ＲＡＤ５１のタンパク質レベルを求めるための免疫ブロッティング用に、Ｍ２で処置した種々のＭＭ細胞株から細胞溶解物を作製した（ｂ～ｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0015】

一態様では、本明細書で提供されるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤であって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である薬剤と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍用薬剤である。

【0016】

別の態様は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせであって、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含み、
上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための治療的組み合わせを提供する。

【0017】

関連する態様では、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するための方法が提供され、この方法は、
ａ．核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと、
ｂ．プロテアソーム阻害剤とを含む治療的組み合わせを対象に投与することを含み、
この治療的組み合わせが、上記プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらすか、又は
この治療的組み合わせが、上記ＡＤＣを欠いている以外は同一である組成物と比較した場合に、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす、方法である。

【0018】

上記Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強は、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む対象における、腫瘍増殖の遅延の増大、腫瘍サイズの低減の増強、腫瘍転移の低減の増強、生存率の増大、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上を含み得る。

【0019】

「Ｂ細胞悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞が癌化し、（例えば、骨髄及び血液において）制御なしに分裂し、他の部位（例えば、組織及びリンパ系）に浸潤する可能性のある任意の疾患を包含する。一実施形態では、上記Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫及び骨髄腫前駆細胞）、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である。「Ｂ細胞」という用語は、成熟（分化）Ｂ細胞及びその前駆体（例えば、幹細胞）の両方を包含する。例えば、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞が包含される。

【0020】

一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ＢＣＭＡを発現する悪性Ｂ細胞を含むことを特徴とする。一実施形態では、上記悪性Ｂ細胞は、（参照非悪性Ｂ細胞と比較して）高レベルのＢＣＭＡ抗原を発現する。非悪性（例えば、健常）Ｂ細胞におけるＢＣＭＡ発現レベルと比較したときに、悪性Ｂ細胞におけるＢＣＭＡ抗原の発現レベルが統計学的に有意なレベルまで増加した場合、悪性Ｂ細胞は「高レベルのＢＣＭＡ」を発現すると見なされる。

【0021】

Ｂ細胞リンパ腫の例としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、及び原発性眼内リンパ腫が挙げられる。Ｂ細胞白血病の例としては、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、及び有毛細胞白血病が挙げられる。

【0022】

一実施形態では、上記Ｂ細胞悪性腫瘍は、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）である。

【0023】

形質細胞骨髄腫又はカーラー病としても知られる多発性骨髄腫（ＭＭ）は、通常は抗体の産生を担う、白血球の一種であるＢ細胞（形質細胞）の癌である。ＭＭに対する現在の療法としては、化学療法、放射線、手術、ビオホスホネート（ｂｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、及び自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）が挙げられる。これらの療法はしばしば寛解をもたらすが、ほぼ全ての患者が最終的に再発し、死亡する。多発性骨髄腫には、年間１００，０００人当たり１～４人が罹患する。疾患は、男性でより一般的であり、原因は未だ不明であるが、アフリカ系アメリカ人では、コーカサス系アメリカ人の２倍多く見られる。

【0024】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞系列の細胞上に発現する腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）のメンバーである。ＢＣＭＡの発現は、最終分化したＢ細胞で最も多い。ＢＣＭＡは、長期にわたり体液性免疫を維持するための形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの発現は、多数の癌、自己免疫障害、及び感染症に関連している。ＢＣＭＡ ＲＮＡは多発性骨髄腫細胞において普遍的に検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は複数の研究者により多発性骨髄腫患者の形質細胞の表面で検出されている。したがって、ＢＣＭＡは、Ｂ細胞悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫の治療標的を代表する。

【0025】

ヒトＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）のヌクレオチド配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ（アクセッション番号ＥＮＳＧ００００００４８４６２を参照されたい）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ０２２２３を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列は、配列番号１３に示されている。

【0026】

ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫幹細胞にも発現している。したがって、「骨髄腫」という用語は、多発性骨髄腫「幹」細胞、及び骨髄腫「前駆」細胞を包含する。更に、本発明の方法及び使用は、多発性骨髄腫幹細胞（例えば、ＢＣＭＡを発現するもの）を含む悪性腫瘍の処置を包含する。多発性骨髄腫幹細胞（及び／又は骨髄腫前駆細胞）は、多発性骨髄腫患者の骨髄において、ＣＤ１９のそれらの表面発現及びＣＤ１３８表面発現の欠如により、同定可能である。これらの細胞は、独特にクローン原性であり、免疫不全マウスに生着する一方で、ＣＤ１３８＋ＣＤ１９－と規定される骨髄腫形質細胞は生着しない。

【0027】

「抗体－薬物コンジュゲート」という用語は、化学的リンカーを介して細胞毒性剤（一般に高い全身毒性を有する小分子薬物）に結合された抗体（又はその抗原結合断片）を意味する。この用語は、本明細書において、核酸架橋剤にコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片を記載するために使用される。一実施形態では、ＡＤＣは、リンカーを含有するように化学的に修飾された核酸架橋剤（例えば、小分子細胞毒素）を含み得る。次に、リンカーを使用して、核酸架橋剤（細胞毒素）を抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートすることができる。細胞の表面上の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）への結合時、ＡＤＣは内部移行され、リソソームに輸送されて、そこで核酸架橋剤（細胞毒素）は、（例えば、リソソーム内で見出されるカテプシンＢによる）切断可能リンカーのタンパク質加水分解、又は例えば、切断不能リンカーを介して細胞毒素に結合される場合での抗体のタンパク質分解のいずれかにより放出される。次に、細胞毒素は、リソソームから外部へ、またサイトゾル又は核内部へと移行し、そこで次に、その作用機構に応じてその標的に結合し得る。

【0028】

一実施形態では、上記核酸架橋剤は、細胞毒性の核酸架橋剤である。

【0029】

プロテアソーム阻害剤は、多くの癌療法において有用性が見出されている。驚くべきことに、本発明者らは、プロテアソーム阻害剤を用いて、本発明のＡＤＣの抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を増強（例えば、相乗的に増強）することができ、また逆に、本発明のＡＤＣを用いて、プロテアソーム阻害剤の抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を増強（例えば、相乗的に増強）することができることを見出した。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、プロテアソーム阻害剤の活性が、下流（分子）効果（例えば、ＡＤＣの核酸架橋剤（例えば、ＰＢＤ細胞毒素）の活性を通常は阻害することができ、且つ核酸架橋剤に対する耐性をもたらすことさえ可能である分子の抑制をもたらす）を引き起こすことによって、本発明のＡＤＣの活性を増強することができると考える。この活性は、直接的なプロテアソーム阻害剤としてのその「通常の」活性に関連付けられる場合もあれば、又はそれとは別個である場合もある。この理論は、本発明の治療的組み合わせが、単剤療法としてのプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）に対して耐性である悪性Ｂ細胞に対してさえも、活性の増強を示すという観察結果によって裏付けられる。

【0030】

逆に、理論に束縛されることを望まないが、本発明のＡＤＣの活性が、下流（分子）効果（例えば、プロテアソーム阻害剤の活性を通常は阻害することができ、且つプロテアソーム阻害剤に対する耐性をもたらすことさえ可能である分子の抑制をもたらす）を引き起こすことによって、プロテアソーム阻害剤の活性を増強させることができる。

【0031】

プロテアソーム阻害剤は、様々な結果を生じさせる。例えば、プロテアソーム阻害剤は、核内因子カッパＢ（細胞の生存に関与するタンパク質）の阻害因子であるＩκＢなどの生物学的に活性なタンパク質のレベルの上昇を引き起こし得る。更に、ミスフォールディングされたタンパク質及び他の古くなったタンパク質も同様に蓄積され、これらは小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を誘発する。

【0032】

一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ボロン酸ベースのプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）である。

【0033】

一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、マリゾミブ、オプロゾミブ、デランゾミブ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である。一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。

【0034】

以前はＰＳ－３４１として知られていたボルテゾミブ（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）は、ユビキチン化タンパク質の分解を担うマルチサブユニットタンパク質複合体である２６Ｓプロテアソームの阻害剤として機能する。ボルテゾミブは、分子式がＣ_１９Ｈ_２５ＢＮ_４Ｏであるペプチドボロネートである：

【化1】

【0035】

カルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標））は、β５サブユニット（ＰＳＭＢ５）に不可逆的に結合するエポキシケトンプロテアソーム阻害剤である。その式は以下の通りである：

【化2】

【0036】

イキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ（登録商標））は、タンパク質プロテアソームサブユニットβ５型（ＰＳＭＢ５）を選択的且つ可逆的に阻害する。その式は以下の通りである：

【化3】

【0037】

マリゾミブ（Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ Ａ）は２０Ｓプロテアソームの活性部位であるスレオニン残基を共有結合的に修飾することにより、プロテアソーム活性を阻害する。マリゾミブは、タンパク質プロテアソームサブユニットβ５、β１及びβ２上の３つの主要な触媒部位に不可逆的に結合する。その式は以下の通りである：

【化4】

【0038】

オプロゾミブ（ＯＮＸ ０９１２として知られる）は、以下の式を有する：

【化5】

【0039】

デランゾミブ（ＣＥＰ－１８ ７７０として知られる）は、以下の式を有する：

【化6】

【0040】

一実施形態では、薬剤及び／又は治療用組成物は、医薬組成物内に含まれる。「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効であることが可能な形態であり、且つその組成物が投与される対象にとって許容できないほど高毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。このような組成物は無菌であり得る。薬剤及び／又は治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。担体の例は、生理食塩水である。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸若しくはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール）、及びバイオアベイラビリティを高める吸収促進剤の１つ以上、並びに／又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を含み得る。

【0041】

一実施形態では、本発明の薬剤、治療的組み合わせ、又は医薬組成物は、薬学的に許容可能な非毒性の滅菌担体、例えば生理食塩水、非毒性緩衝液、防腐剤などを含み得る。本明細書に開示される治療方法における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）に記載されている。一実施形態では、本発明の薬剤、治療的組み合わせ、又は医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、溶液、鼻エアロゾル、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の製剤内に含まれ得る。一実施形態では、医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。

【0042】

「細胞毒性」薬剤（本明細書では「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」と称される）は、細胞の機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞の破壊（細胞死）を引き起こし、及び／又は抗増殖効果を発揮する薬剤である。ＡＤＣの細胞毒素又は細胞毒性剤が、当該技術分野でＡＤＣの「ペイロード」とも称されることは理解されるであろう。

【0043】

「核酸架橋剤」という用語は、核酸の２つのヌクレオチドと反応し、それらの間に共有結合を形成する分子を意味する。この架橋は、二本鎖ＤＮＡの同じ鎖内（鎖内）又は向かい合った鎖間（鎖間）で生じ得る。これらの結合（付加物）は、ＤＮＡ複製及び転写などの細胞代謝を妨害し、典型的には細胞死を引き起こす。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。

【0044】

一実施形態では、核酸架橋剤は、ＤＮＡ鎖切断（一本鎖切断及び／又は二本鎖切断）を誘導することによりＤＮＡに損傷を与え、典型的には続いてアポトーシスをもたらす薬剤である。一実施形態では、核酸架橋剤は、細胞毒性の核酸架橋剤である。

【0045】

一実施形態では、核酸架橋剤は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ナイトロジェンマスタード、シスプラチン、クロロエチルニトロソウレア（ＣＥＮＵ）、ソラレン、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）抗生物質、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である。上記ナイトロジェンマスタードは、シクロホスファミド、クロルメチン（例えば、メクロレタミン又はムスチン）、ウラムスチン、ウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上であり得る。一実施形態では、上記ＣＥＮＵは、カルムスチンである。

【0046】

一実施形態では、核酸架橋剤は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。

【0047】

「ピロロベンゾジアゼピン」という用語は、ピロロベンゾジアゼピン及びその機能的誘導体の両方を包含する。

【0048】

ＰＢＤは、ＤＮＡを架橋する前に核に移行し、有糸分裂中の複製を防止し、ＤＮＡ鎖切断（一本鎖切断及び／又は二本鎖切断）を誘導することによりＤＮＡに損傷を与え、続いてアポトーシスをもたらす、細胞毒性剤のクラスである。一部のＰＢＤはまた、ＤＮＡの特定の配列を認識し、それに結合する能力を有する。一実施形態では、ＰＢＤは、以下の一般的構造を含む：

【化7】

【0049】

ＰＢＤは、芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方において、その置換基の数、種類、及び位置が異なり、またＣ環の飽和度が異なる。Ｂ環では、ＤＮＡのアルキル化を担う求電子性中心であるＮ１０～Ｃ１１位に、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ－ＣＨ（ＯＨ））、又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ－ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。公知の天然産物の全てが、キラルなＣ１１ａ位に（Ｓ）配置を有しており、これによりＣ環からＡ環に向かって見た場合に右回りのねじれが天然産物に付与される。この特徴はまた、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対してイソらせん性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）となるための適切な三次元形状をＰＢＤに与え、結合部位でぴったりと適合させる。ＰＢＤは、副溝内に付加物を形成し、ＤＮＡプロセシングを妨害することができる。

【0050】

最初のＰＢＤ抗腫瘍抗生物質であるアントラマイシンは、１９６５年に発見された。それ以降、多数の天然に存在するＰＢＤが報告されており、種々の類似体に至る１０を超える合成経路が開発されている。ファミリーメンバーには、アベイマイシン、チカマイシン、ＤＣ－８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡ及びＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシン、シバノマイシン（ＤＣ－１０２）、シビロマイシン、並びにトママイシンが含まれる。ＰＢＤ及びそれを含むＡＤＣはまた、国際公開第２０１５／１５５３４５号パンフレット及び同第２０１５／１５７５９２号パンフレット（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）にも記載されている。

【0051】

一実施形態では、ＰＢＤは、本明細書で「ＳＧ３２４９」とも称されるＰＢＤ３２４９（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０５７０７４号パンフレットに更に詳細に記載されているもの）である。ＰＢＤ３２４９（ＳＧ３２４９）は、以下の構造を含む：

【化8】

【0052】

一実施形態では、ＰＢＤは、本明細書で「ＳＧ３３１５」とも称されるＰＢＤ３３１５（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０５２３２２号パンフレットに更に詳細に記載されているもの）である。ＰＢＤ３３１５（ＳＧ３３１５）は、以下の構造を含む：

【化9】

【0053】

一実施形態では、ＰＢＤ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１３７５５３号パンフレットに詳細に記載されているもの）は、以下の式を含む：

【化10】

；
式中、
（ａ）Ｒ^１０及びＲ^１１は、それらが結合される窒素原子及び炭素原子の間に窒素－炭素二重結合を形成するか、又は
（ｂ）Ｒ^１０はＯＨであり、Ｒ^１１は以下であるか、のいずれかである：

【化11】

【0054】

別の実施形態では、ＰＢＤは、化合物２３とも称されるＳＧ３４００（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１３７５５３号パンフレットに詳細に記載されているもの）であり、以下の構造を有する：

【化12】

【0055】

一実施形態では、ＰＢＤは、少なくとも２つのＰＢＤモノマーを含むＰＢＤ二量体である。例えば、少なくとも２つのＰＢＤモノマーは、可撓性プロピルジオキシテザーを介して、それらの芳香族Ａ環フェノールのＣ８位を通じて連結される。

【0056】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、部位特異的又は非部位特異的コンジュゲーション方法を使用して、ＰＢＤなどの細胞毒素（異種薬剤）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＰＢＤ部分を含む。一実施形態では、ＰＢＤ部分（抗体又はその抗原断片にコンジュゲートされる）は全て、同じ構造を含む。

【0057】

本発明の核酸架橋剤（細胞毒素）は、スペーサー（例えば、少なくとも１つのスペーサー）によって、抗体又はその抗原結合断片に連結（例えば、コンジュゲート）され得る。一実施形態では、スペーサーは、ペプチドスペーサーである。一実施形態では、スペーサーは、非ペプチド（例えば、化学的）スペーサーである。

【0058】

抗体又はその抗原結合断片の従来のコンジュゲーション戦略は、リジン又はシステインを介してペイロード（細胞毒素）を抗体又は抗原結合断片にランダムにコンジュゲートすることに依存する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、例えば抗体又は断片の部分的還元と、その後のリンカー部分が付加された又は付加されていない所望の薬剤との反応によって、薬剤（例えば、細胞毒素）にランダムにコンジュゲートされる。抗体又は抗原結合断片は、ＤＴＴ又は同様の還元剤を使用して還元され得る。次に、リンカー部分が付加された又は付加されていない薬剤を、ＤＭＳＯの存在下で還元された抗体又は断片にモル過剰で加えることができる。コンジュゲーション後、未反応の薬剤をクエンチするため、過剰な遊離システインを添加してもよい。次に、反応混合物を精製し、ＰＢＳに緩衝液交換することができる。

【0059】

一実施形態では、核酸架橋剤（例えば、細胞毒素）は、部位特異的コンジュゲーションによって抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。一実施形態では、特定の位置の反応性アミノ酸残基を使用した核酸架橋剤（例えば、細胞毒素）の抗体又はその抗原結合断片への部位特異的コンジュゲーションにより、一定の化学量論比の均質なＡＤＣ調製物が得られる。

【0060】

部位特異的コンジュゲーションは、システイン残基又は非天然アミノ酸を介することができる。一実施形態では、核酸架橋剤（例えば、細胞毒素）は、少なくとも１つのシステイン残基を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。

【0061】

一実施形態では、核酸架橋剤（例えば、細胞毒素）は、（例えば、抗体又は抗原結合断片のＦｃ領域内の特定のＫａｂａｔ位置で）アミノ酸側鎖に化学的にコンジュゲートされる。一実施形態では、核酸架橋剤（例えば、細胞毒素）は、２３９位、２４８位、２５４位、２７３位、２７９位、２８２位、２８４位、２８６位、２８７位、２８９位、２９７位、２９８位、３１２位、３２４位、３２６位、３３０位、３３５位、３３７位、３３９位、３５０位、３５５位、３５６位、３５９位、３６０位、３６１位、３７５位、３８３位、３８４位、３８９位、３９８位、４００位、４１３位、４１５位、４１８位、４２２位、４４０位、４４１位、４４２位、４４３位、及び４４６位（付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスに対応する）のうちの少なくとも１つのシステインを介した、Ｆｃ領域の任意の好適な位置におけるシステイン置換を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。一実施形態では、特定の位置は、２３９、４４２、又はその両方である（付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスに対応する）。一実施形態では、特定の位置は、４４２位、２３９位と２４０位の間のアミノ酸（システイン）の挿入、又はその両方である（付番はＫａｂａｔのＥＵインデックスに対応する）。一実施形態では、核酸架橋剤（細胞毒素）は、チオール－マレイミド結合を介して抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、アミノ酸側鎖は、スルフヒドリル側鎖、例えば、抗体又はその抗原結合断片のヒンジ及び重鎖－軽鎖に位置するスルフヒドリル反応性基である。

【0062】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0063】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むヒトカッパ定常領域を含む。

【0064】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、又はその機能的変異体；
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、又はその機能的変異体；
ｉｉｉ．配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、又はその機能的変異体；
ｉｖ．配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、又はその機能的変異体；
ｖ．配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、又はその機能的変異体；及び
ｖｉ．配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、又はその機能的変異体を含む。

【0065】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
ｉ．配列番号７の参照アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）、若しくはその機能的変異体；及び／又は
ｉｉ．配列番号８の参照アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、若しくはその機能的変異体を含む。

【0066】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖、又はその機能的変異体を含む。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はその機能的変異体を含む。

【0067】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖、又はその機能的変異体；及び
ｉｉ．配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はその機能的変異体を含む。

【0068】

配列番号７及び配列番号８は、ＶＨ及びＶＬの生殖系列化バージョンである。或いは、抗体又はその抗原結合断片は、非生殖系列化ＶＨ及び／又はＶＬ（例えば、配列番号９のＶＨ及び配列番号１０のＶＬ）を含み得る。

【0069】

本発明は、列挙されたＣＤＲ配列又は可変重鎖配列及び可変軽鎖配列（参照抗体）を有する、本明細書中に定義される抗体（例えば、抗体又は抗原結合断片）、並びにその機能的変異体を包含する。機能的変異体は、参照抗体と同じ標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に結合し、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示し得る。機能的変異体は、参照抗体と比較した場合、標的抗原に対して異なる親和性を有し得る。一実施形態では、機能的変異体は、実質的に同じ親和性を有する。

【0070】

一実施形態では、参照抗体の機能的変異体は、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、１つ以上のＣＤＲで配列変動を示す。したがって、機能的な抗体変異体は、ＣＤＲの機能的変異体を含み得る。用語「機能的変異体」がＣＤＲ配列に関して使用される場合、この用語は、ＣＤＲが、対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つ、又は最大で１つのアミノ酸差異を有しており、残りの５つのＣＤＲ（又はその変異体）と組み合わされた場合、参照抗体と同じ標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）への変異体抗体の結合を可能にすることを意味する。一実施形態では、機能的変異体は、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示す。

【0071】

一実施形態では、機能的変異体抗体又はその抗原結合断片は、
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ１；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ２；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ３；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ１；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ２；及び
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ３を含み；
機能的変異体は、参照抗体と同じ標的抗原に結合する。一実施形態では、機能的変異体は、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示す。

【0072】

一実施形態では、機能的変異体抗体又はその抗原結合断片は、
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ１；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ２；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ３；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ１；
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ２；及び
対応する参照ＣＤＲ配列と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ３を含み；
機能的変異体は、参照抗体と同じ標的抗原に結合する。一実施形態では、機能的変異体は、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示す。

【0073】

例えば、抗体又は抗原結合断片の機能的変異体は、
配列番号１と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ１；
配列番号２と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号３と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ３；
配列番号４と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号５と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ２；
配列番号６と比較した場合、最大で２つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み得；
変異体抗体は、ＢＣＭＡ（例えば、ＢＣＭＡポリペプチドエピトープ）に結合し、及び／又は変異体抗体は、参照抗体又は抗原結合断片と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示し得る。

【0074】

一実施形態では、抗体又は抗原結合断片の機能的変異体は、
配列番号１と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ１；
配列番号２と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号３と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する重鎖ＣＤＲ３；
配列番号４と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号５と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ２；
配列番号６と比較した場合、最大で１つのアミノ酸差異を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み得；
変異体抗体は、ＢＣＭＡ（例えば、ＢＣＭＡポリペプチドエピトープ）に結合し、及び／又は変異体抗体は、参照抗体又は抗原結合断片と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示し得る。

【0075】

上記は本明細書に記載される他の抗体の変異体に同様に適用することができ、ここで、アミノ酸差異はそのＣＤＲ配列に対して定義され、変異体抗体は上記抗体と同じ標的抗原に結合し、及び／又は変異体抗体は同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示し得る。

【0076】

一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、ＣＤＲ１つ当たり最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異が存在することを条件として、そのＣＤＲ全体で最大で５つ、４つ、又は３つのアミノ酸差異を有し得る。一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、ＣＤＲ１つ当たり最大で２つのアミノ酸差異が存在することを条件として、そのＣＤＲ全体で最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異を有する。一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、ＣＤＲ１つ当たり最大で１つのアミノ酸差異が存在することを条件として、そのＣＤＲ全体で最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異を有する。

【0077】

アミノ酸差異は、アミノ酸置換、挿入、又は欠失であり得る。一実施形態では、アミノ酸差異は、本明細書に記載の保存的アミノ酸置換である。

【0078】

一実施形態では、機能的変異体抗体は、本明細書に記載の例示的抗体と同じフレームワーク配列を有する。別の実施形態では、機能的変異体抗体は、（対応するフレームワーク配列と比較した場合）最大で２つ、又は最大で１つのアミノ酸差異を有するフレームワーク領域を含み得る。したがって、各フレームワーク領域は、（対応する参照フレームワーク配列と比較した場合）最大で２つ、又は最大で１つのアミノ酸差異を有し得る。

【0079】

一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、フレームワーク領域１つ当たり最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異が存在することを条件として、そのフレームワーク領域全体で最大で５つ、４つ、又は３つのアミノ酸差異を有し得る。一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、フレームワーク領域１つ当たり最大で２つのアミノ酸差異が存在することを条件として、そのフレームワーク領域全体で最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異を有する。一実施形態では、機能的変異体抗体は、対応する参照抗体と比較した場合、フレームワーク領域１つ当たり最大で１つのアミノ酸差異が存在することを条件として、そのフレームワーク領域全体で最大で２つ（例えば、最大で１つ）のアミノ酸差異を有する。

【0080】

したがって、機能的変異体抗体は、本明細書に記載の可変重鎖及び可変軽鎖を含み得、
重鎖は、本明細書に記載の重鎖配列（例えば、配列番号７）と比較した場合、最大で１４個のアミノ酸差異（各ＣＤＲ中に最大で２つのアミノ酸差異、及び各フレームワーク領域中に最大で２つのアミノ酸差異）を有し；
軽鎖は、本明細書に記載の軽鎖配列（例えば、配列番号８）と比較した場合、最大で１４個のアミノ酸差異（各ＣＤＲ中に最大で２つのアミノ酸差異、及び各フレームワーク領域中に最大で２つのアミノ酸差異）を有し；
機能的変異体抗体は、参照抗体と同じ標的抗原に結合し、及び／又は機能的変異体抗体は、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示す。

【0081】

上記変異体重鎖又は軽鎖は、参照重鎖又は軽鎖の「機能的等価物」と称される場合がある。

【0082】

一実施形態では、機能的変異体抗体は、本明細書に記載の可変重鎖及び可変軽鎖を含み得、
重鎖は、本明細書中の重鎖配列（例えば、配列番号７）と比較した場合、最大で７つのアミノ酸差異（各ＣＤＲ中に最大で１つのアミノ酸差異、及び各フレームワーク領域中に最大で１つのアミノ酸差異）を有し；
軽鎖は、本明細書中の軽鎖配列（例えば、配列番号８）と比較した場合、最大で７つのアミノ酸差異（各ＣＤＲ中に最大で１つのアミノ酸差異、及び各フレームワーク領域中に最大で１つのアミノ酸差異）を有し；
機能的変異体抗体は、参照抗体と同じ標的抗原に結合し、及び／又は機能的変異体抗体は、参照抗体と同じ抗原交差反応性（又はその欠如）を示す。

【0083】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭの解離定数（ＫＤ）で結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、又は約１．５ｎＭ～約２０ｎＭのＫＤでＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約２３ｎＭ～約２７ｎＭのＫＤでＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＭＣＡ）に結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、約１ｎＭ～約１．５ｎＭの間のＫＤでＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。ＫＤ測定（結合親和性）は、当該技術分野で公知の任意の適切なアッセイによって実施され得る。このような方法としては、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＰｒｏｔｅＯｎ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、例えばＯｃｔｅｔ）、結合平衡除外法（例えば、ＫｉｎＥｘＡ）、分離可能ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、抗原パニング、ＥＬＩＳＡ、及び／又はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムが挙げられる。好適な結合平衡除外法としては、ＫｉｎＥｘＡシステム（例えば、ＫｉｎＥｘＡ３１００、ＫｉｎＥｘＡ３２００、又はＫｉｎＥｘＡ４０００）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｄａｈｏ）が挙げられる。

【0084】

有利には、この治療的組み合わせは、通常はこのようなプロテアソーム阻害剤に対して非反応性（例えば、耐性）である細胞を標的とするためのこのようなプロテアソーム阻害剤の有意義な使用を提供する。例えば、本発明者らは、Ｂ細胞悪性腫瘍がプロテアソーム阻害剤に耐性である場合でも、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）が、ＡＤＣの抗Ｂ細胞悪性腫瘍活性を増強することを実証した（実施例３を参照されたい）。

【0085】

したがって、本発明は、通常であればＢ細胞悪性腫瘍の低い／不十分な抑制のみをもたらすプロテアソーム阻害剤の用量でＡＤＣをプロテアソーム阻害剤と組み合わせて投与することを包含し、その結果、上記添加後に、現在ではこの組み合わせによりＢ細胞悪性腫瘍の抑制の改善を実証することができる。したがって、本発明は、（スタンドアロン）単剤療法（通常であれば耐性悪性腫瘍に対して有効ではない）の使用とは対照的に、ＡＤＣの増強剤として使用するためのプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）の「別目的での使用」を提供する。

【0086】

同様に、本発明は、通常であればＢ細胞悪性腫瘍の低い／不十分な抑制のみをもたらすＡＤＣの用量でプロテアソーム阻害剤をＡＤＣと組み合わせて投与することを包含し、その結果、上記添加後に、現在ではこの組み合わせによりＢ細胞悪性腫瘍の抑制の改善を実証することができる。したがって、本発明は、（スタンドアロン）単剤療法（低レベルのＢＣＭＡ抗原を発現しているＢ細胞悪性腫瘍に対して通常であれば有効ではない）の使用とは対照的に、プロテアソーム阻害剤の増強剤として使用するためのＡＤＣの「別目的での使用」を提供する。

【0087】

したがって、一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、プロテアソーム阻害剤（例えば、本発明のＡＤＣの非存在下でプロテアソーム阻害剤を含む薬剤）に対して耐性である。一実施形態では、上記プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。

【0088】

一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、本発明のＡＤＣ（例えば、本発明のプロテアソーム阻害剤の非存在下でＡＤＣを含む薬剤）に対して耐性である。一実施形態では、本発明のＡＤＣに耐性であるＢ細胞悪性腫瘍は、参照非悪性Ｂ細胞と比較してＢＣＭＡ抗原の発現レベルの増加又は減少のない悪性Ｂ細胞を含むことを特徴とする。

【0089】

この治療的組み合わせはまた、他の多くの一般的な抗癌剤に耐性であるＢ細胞悪性腫瘍に対して活性が増強していることが示されている（実施例３を参照されたい）。したがって、一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、デキサメタゾン、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の薬物に対して耐性である。

【0090】

更に、組み合わせの相乗的性質によって、より低い用量の成分の一部分を用いることができ、これにより、過剰使用による成分の一部分のいずれかに対する耐性（主要な公衆衛生上の脅威）の発生のリスクを低減させる。実際、本発明は、慢性処置レジメンの処方の必要性を低減させる。例えば、本発明者らは、至適用量以下のＡＤＣのインビボ有効性が、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）と組み合わせて投与された場合に尚も増強されることを示した。

【0091】

したがって、一実施形態では、ＡＤＣ及び／又はプロテアソーム阻害剤は、至適用量以下で投与される。

【0092】

治療的組み合わせの成分の一部分の適用／投与の順序は、変更することができる。ＡＤＣ及びプロテアソーム阻害剤は、単一の組成物の一部として、又は別個の組成物内のいずれかで、同時に（例えば、いずれも相乗作用を達成するためのそれら自体の特定の至適用量で）投与され得る。例えば、ＡＤＣは、第１の組成物（例えば、対象への静脈内投与に適合されたもの）中に存在してもよく、プロテアソーム阻害剤は、第２の組成物（例えば、対象への静脈内投与、皮下投与又は経口投与に適合されたもの）中に存在してもよい。例えば、プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブである場合、上記第２の組成物は、静脈内注射又は皮下注射に適合され得る。プロテアソーム阻害剤がイキサゾミブである実施形態では、上記第２の組成物は、追加的に又は代替的に、経口投与に適合され得る。

【0093】

更に、ＡＤＣ及びプロテアソーム阻害剤は、異なる時点で投与され得る（例えば、プロテアソーム阻害剤は、悪性Ｂ細胞をＡＤＣに対して感作させるために予め投与され得る）。したがって、更なる実施形態では、ＡＤＣ及びプロテアソーム阻害剤は、別個の組成物内で、異なる時点で対象に投与される。

【0094】

一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ＡＤＣの前に投与される。一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ＡＤＣと同時に投与される。一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ＡＤＣに続いて投与される。

【0095】

「処置する」又は「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、予防的処置（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の発症を防止するため）及び補正処置（Ｂ細胞悪性腫瘍に既に罹患している対象の処置）を包含する。一実施形態では、「処置する」又は「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、補正処置を指す。「処置する」又は「処置」という用語は、Ｂ細胞悪性腫瘍及びその症状の両方を処置することを包含する。いくつかの実施形態では、「処置する」又は「処置」は、Ｂ細胞悪性腫瘍の症状を指す。

【0096】

したがって、薬剤及び／又は治療的組み合わせは、治療的有効量又は予防的有効量で対象に投与され得る。

【0097】

「治療的有効量」は、Ｂ細胞悪性腫瘍（又はその症状）を処置するために単独で又は組み合わせて対象に投与される場合、Ｂ細胞悪性腫瘍又はその症状のそのような処置を行うのに十分である薬剤及び／又は治療的組み合わせの任意の量である。

【0098】

「予防的有効量」は、単独で又は組み合わせて対象に投与される場合、Ｂ細胞悪性腫瘍（又はその症状）の発症又は再発を阻害又は遅延させる、薬剤及び／又は治療的組み合わせの任意の量である。いくつかの実施形態では、予防的有効量はＢ細胞悪性腫瘍の発症又は再発を完全に防止する。発症の「阻害」とは、Ｂ細胞悪性腫瘍の発症（若しくはその症状）の可能性を減少させること、又は発症を完全に防止することのいずれかを意味する。

【0099】

本発明の更なる態様は、悪性Ｂ細胞のＡＤＣによる抑制を増強させるためのインビトロ法を提供し、上記方法は、（ａ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣを、（ｂ）プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む。

【0100】

別の態様では、悪性Ｂ細胞のプロテアソーム阻害剤による抑制を増強させるためのインビトロ法が提供され、上記方法は、（ａ）プロテアソーム阻害剤を、（ｂ）核酸架橋剤にコンジュゲートされた、ＢＣＭＡに結合する抗体又はその抗原結合断片、を含むＡＤＣと組み合わせて、悪性Ｂ細胞に接触させることを含む。

【0101】

「抑制する」又は「抑制」という用語は、本明細書に記載の文脈又は任意の薬剤、方法、若しくは使用において、悪性Ｂ細胞「の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）の阻害」、悪性Ｂ細胞「の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の阻害」、又は悪性Ｂ細胞「の死滅」を包含する。「悪性Ｂ細胞」への言及は、「悪性Ｂ細胞を含む腫瘍」を包含する。

【0102】

「阻害する」又は「阻害」という用語は、悪性Ｂ細胞の「増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を遅らせる」若しくは「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を停止させる」、又は悪性Ｂ細胞を含む腫瘍の「増殖を遅らせる」という用語と同義である。一実施形態では、本発明の治療的組み合わせは、悪性Ｂ細胞を「殺傷」し得るか、若しくは悪性Ｂ細胞を含む腫瘍、又は悪性Ｂ細胞を含む腫瘍を「殺傷するために使用」され得る。「抑制」という用語はまた、悪性Ｂ細胞、又は悪性Ｂ細胞を含む腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）（例えば、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ））を防止することを包含する。

【0103】

一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強は、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む対象における、腫瘍増殖の遅延の増大、腫瘍サイズの低減の増強、腫瘍転移の低減の増強、生存率の増大、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上を含み得る。一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強は、腫瘍増殖の遅延の増大、腫瘍サイズの低減の増強、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上を含む。

【0104】

一実施形態では、本発明の薬剤及び／又は治療的組み合わせは、プロテアソーム阻害剤を欠いている以外は同一である薬剤及び／又は組成物よりも少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％大きくＢ細胞悪性腫瘍を抑制する。一実施形態では、本発明の薬剤及び／又は治療的組み合わせは、本発明のＡＤＣを欠いている以外は同一である薬剤及び／又は組成物よりも少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％大きくＢ細胞悪性腫瘍を抑制する。

【0105】

抑制は、細胞増殖を測定することにより測定することができ、細胞増殖は、細胞分裂速度、及び／又は細胞集団内の細胞分裂が生じている細胞の割合、及び／又は終末分化若しくは細胞死に起因する細胞集団からの細胞減少率を測定する当該技術分野で認められている技法（例えば、チミジン取り込み）を用いてアッセイすることができる。

【0106】

上記の「Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強」の評価は、添付の実施例を参照することにより実証され、実施例（例えば、実施例３）に記載の手法を使用して評価され得る。例えば、実施例３は、試験試料との接触後の悪性Ｂ細胞のインビトロ培養物において「観察されたアポトーシス細胞の％」値を測定する、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩベースのＦＭＣ分析を含む方法を記載する。これにより、本発明の薬剤と、プロテアソーム阻害剤又はＡＤＣを欠いている以外は同一である薬剤との間のＢ細胞悪性腫瘍の抑制を直接比較することができる。

【0107】

一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制は、２つの主要な活性化合物（例えば、本発明のＡＤＣ及びプロテアソーム阻害剤）の組み合わせについて得られた「観察されたアポトーシス細胞の％」値が、本発明のＡＤＣ又はプロテアソーム阻害剤（好適にはプロテアソーム阻害剤）のいずれかが存在しない場合に（但し、他の点では同一の条件下において）得られた「観察されたアポトーシス細胞の％」値よりも大きい場合に増強されると見なされる。

【0108】

したがって、一実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強は、本発明のＡＤＣとプロテアソーム阻害剤との組み合わせについて得られた「観察されたアポトーシス細胞の％」値と、同一条件における本発明のＡＤＣ又はプロテアソーム阻害剤を欠く（好適にはプロテアソーム阻害剤を欠く）同じ製剤（例えば、薬剤）について得られた「観察されたアポトーシス細胞の％」値とを比較することによって決定され得る。

【0109】

一実施形態では、本発明は、同一条件における本発明のＡＤＣ又はプロテアソーム阻害剤を欠く（好適にはプロテアソーム阻害剤を欠く）同じ製剤（例えば、薬剤）により提供される観察されたアポトーシス細胞の％よりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％大きな（観察されたアポトーシス細胞の％で）、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす。一実施形態では、本発明は、同一条件における本発明のＡＤＣ又はプロテアソーム阻害剤を欠く（好適にはプロテアソーム阻害剤を欠く）同じ製剤（例えば、薬剤）により提供される観察されたアポトーシス細胞の％よりも、少なくとも約６５％大きな（観察されたアポトーシス細胞の％で）、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制の増強をもたらす。

【0110】

一実施形態では、本発明のＡＤＣとプロテアソーム阻害剤との組み合わせは、Ｂ細胞悪性腫瘍の相乗的抑制を示し得る。

【0111】

本明細書で使用される「相乗的」という用語は、示されるＢ細胞悪性腫瘍の抑制がその一部を合計したものよりも大きいことを意味する。換言すれば、Ｂ細胞悪性腫瘍の抑制は、相加的な抑制を超える。

【0112】

相乗作用は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ（ＣｏｍｂｏＳｙｎ，Ｉｎｃ．）などの分析ツールを使用して「併用指数」（ＣＩ）を決定することにより測定することができ、１未満のＣＩは本発明の主要な活性成分の組み合わせの間の相乗作用を示し、１を超えるＣＩは拮抗作用を示し、１のＣＩは効果が相加的であることを示す。上記ＣＩは、当該技術分野で公知の任意の細胞生存率アッセイにおいて（例えば、実施例３に記載の「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏベースの細胞生存率」アッセイなどの実施例１～３の手法の代わりに又はそれに加えて）、本発明の薬剤／治療的組み合わせを含む組成物の性能を、本発明のＡＤＣ又はプロテアソーム阻害剤を欠いている（好適にはプロテアソーム阻害剤を欠いている）以外は同一である組成物の性能と比較することにより測定することができる。

【0113】

実施例（例えば、実施例３）を参照すると、ＣＩが約０．９５未満、０．９未満、０．８５未満、０．８未満、０．７５未満、０．７未満、０．６５未満、０．６未満、０．５５未満、０．５未満、０．４５未満、０．４未満、０．３５未満、０．３未満、０．２５未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、又は０．０５未満である場合、Ｂ細胞悪性腫瘍の相乗的抑制が存在すると考えることができる。一実施形態では、上記ＣＩは、約０．７未満であり得る。一実施形態では、上記ＣＩは、約０．６未満であり得る。

【0114】

一実施形態では、「細胞生存率アッセイ」は、悪性Ｂ細胞を含む試験試料を治療的組み合わせ（本発明のＡＤＣ及びプロテアソーム阻害剤）を含む組成物の量の存在下でインキュベートすること；並びにインキュベーションに続いて（例えば、少なくとも０．５日、１．５日又は２日のインキュベーション後）、試験試料中の非生存細胞（例えば、アポトーシス細胞）の数を、（ａ）上記プロテアソーム阻害剤、又は（ｂ）上記ＡＤＣを欠いている（好適には上記プロテアソーム阻害剤を欠いている）以外は同一である組成物の存在下でインキュベートされた対照試料中の非生存細胞の数と比較することを含む。

【0115】

一実施形態では、治療的組み合わせは、対象に投与される。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では哺乳動物対象を指すために互換的に使用される。一実施形態では、「対象」は、ヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、及び／若しくはウサギなどのペット）、家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、及び／若しくはヤギ）、並びに／又はウマである。一実施形態では、対象はヒトである。

【0116】

本発明の方法において、対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有すると事前に診断されていない場合がある。或いは、対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有すると事前に診断されている場合がある。対象はまた、疾患リスク因子を示す者、又はＢ細胞悪性腫瘍に対して無症候性である者であり得る。対象はまた、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患している者、又はそれを発症するリスクのある者であり得る。一実施形態では、対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療を以前に施されている。

【0117】

一実施形態では、本発明の方法及び使用は、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、若しくは膣、吸入、局所、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上の投与ステップを含む。一実施形態では、投与は、静脈内、動脈内（例えば、注射若しくは点滴による）、皮下、又はこれらの組み合わせから選択される１つ以上である。

【0118】

抗体調製物
本発明の抗体は、当業者に公知の従来技法を使用して得ることができ、それらの有用性は、従来の結合試験（例示的な方法が実施例２に記載される）により確認することができる。例として、簡便な結合アッセイは、抗原を発現する細胞を抗体と共にインキュベートするものである。抗体がフルオロフォアでタグ付けされる場合、抗原への抗体の結合は、ＦＡＣＳ分析により検出され得る。

【0119】

本発明のＢＣＭＡ抗体及びその抗体断片を作製するための方法は、国際公開第２０１０／１０４９４９号パンフレット及び同第２０１９／０２５９８３号パンフレット（特に、同第２０１９／０２５９８３号パンフレット）に記載されており、これらはいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。

【0120】

本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サル、又はウマを含む種々の動物において産生され得る。抗体は、個々の莢膜多糖、又は複数の莢膜多糖による免疫後に産生され得る。これらの動物から単離された血液は、ポリクローナル抗体（同じ抗原に結合する複数の抗体）を含有する。抗原はまた、卵黄中でポリクローナル抗体を産生させるためにニワトリに注射され得る。抗原の単一エピトープに特異的なモノクローナル抗体を得るために、抗体分泌リンパ球を動物から単離し、それらを癌細胞株と融合させることによって不死化させる。融合細胞はハイブリドーマと呼ばれ、培養物中で連続的に増殖し、抗体を分泌する。単一のハイブリドーマ細胞は、希釈クローニングによって単離され、全てが同じ抗体を産生する細胞クローンを生成する。これらの抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に公知の従来技法である（例えば、Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．ＧＣ Ｈｏｗａｒｄ．ＣＲＣ Ｂｏｏｋｓ．２００６．ＩＳＢＮ ０８４９３３５２８０を参照されたい）。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、プロテインＡ／Ｇ又は抗原アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることが多い。

【0121】

本発明の抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体として調製することができ、これは、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法）を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用すると、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が上記の通り免疫され、免疫抗原に特異的に結合し得る抗体のリンパ球による産生が誘発される。リンパ球はまた、インビトロで免疫され得る。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成させ、次にそこから未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞を選択除去することができる。免疫沈降、免疫ブロッティング、又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））により決定された、選択抗原を特異的に対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、次に、標準的方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を用いたインビトロ培養で、又は動物の腹水腫瘍としてのインビボでのいずれかで増殖させることができる。モノクローナル抗体はその後、公知の方法を使用して培地又は腹水から精製され得る。

【0122】

或いは、抗体又はその抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体として）はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載される通りの組換えＤＮＡ法を使用して作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲなどにより成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離し、従来の手順を使用してそれらの配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを好適な発現ベクター中にクローニングし、これを、通常であれば免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞により産生される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されているように、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから単離することもできる。

【0123】

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを組換えＤＮＡ技術を用いた多くの異なる方法で更に修飾して、代替的な抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作製され得るか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作製され得る。いくつかの実施形態では、定常領域がトランケートされるか、又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作製される。可変領域の部位特異的突然変異誘発又は高密度突然変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。

【0124】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の種々の技法を使用して、直接調製され得る。インビトロで免疫されたか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）、米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。

【0125】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリから選択することができ、そのファージライブラリは例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９－３１４（１９９６）、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６１５７－６１６２（１９９８）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）に記載されるように、ヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリの作製及び使用のための技法は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；並びにＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２－１２００（２００８）（これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる）にも記載されている。

【0126】

親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略が、当該技術において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を作製するのに用いられ得る。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。

【0127】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体）は、ヒト化抗体であり得る。非ヒト又はヒト抗体を操作する、ヒト化する、又はリサーフェシングする方法も使用することができ、これらは当該技術分野において周知である。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様に操作された抗体は、非ヒト、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と呼ばれる残基によって置換されており、これらの残基は通常、公知のヒト配列の「インポート」可変ドメイン、定常ドメイン、又は他のドメインから取得される。このようなインポートされた配列を用いて、免疫原性を低減させるか、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、結合活性、特異性、半減期、若しくは当該技術分野において公知の他の任意の好適な特性を低減させ、増強させ、若しくは変更することができる。好適には、ＣＤＲ残基は、抗原（例えば、ＢＣＭＡ）結合への影響に直接且つ最も実質的に関与し得る。したがって、非ヒトＣＤＲ配列又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持することができ、同時に可変領域及び定常領域の非ヒト配列を、ヒトアミノ酸又は他のアミノ酸で置換することができる。

【0128】

抗体はまた、任意選択で、抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しながら操作されたヒト化抗体、リサーフェシング抗体、操作抗体、又はヒト抗体であり得る。この目標を達成するために、親の配列、操作された配列、及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、ヒト化（若しくはヒト）抗体又は操作抗体及びリサーフェシング抗体が、任意選択で、親の配列並びに種々の概念上のヒト化された生成物及び操作された生成物を分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図示して表示するコンピュータプログラムが利用可能である。それらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際の残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、ＦＷ残基をコンセンサス配列及びインポート配列から選択して組み合わせることができ、これにより所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が実現される。

【0129】

本発明の抗体又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング、又は操作は、任意の公知の方法、例えば、限定されるものではないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書、同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号明細書；同第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；同第ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；同第９０／１４４２４号パンフレット；同第９０／１４４３０号パンフレット、並びに欧州特許第２２９２４６号明細書（これらの各々は、その中に引用されている参照文献も含めて、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して実施され得る。

【0130】

抗体又はその抗原結合断片はまた、免疫時に内在性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。

【0131】

一実施形態では、本発明の抗体の断片（例えば、抗体断片）が提供される。抗体断片の生成のための種々の技法が公知である。「抗体断片」、「抗原結合断片」、「抗体の機能的断片」、及び「抗原結合部分」という用語は、本明細書において互換的に使用され、抗体（例えば、「全」抗体又は「親」抗体）が結合する抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片又は部分を指す。したがって、「その抗原結合断片」への言及は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合断片（例えば、抗体のＢＣＭＡ抗原結合断片）を意味する。

【0132】

従来、これらの断片は、例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７－１１７（１９９３）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）によって記載されているように、インタクト抗体のタンパク質分解消化を介して得られる。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体断片は組換えにより生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はその他の宿主細胞中で発現させてそこから分泌させることができ、これにより、これらの断片を大量に生成することができる。このような抗ＢＣＭＡ抗体断片はまた、上述の抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗ＢＣＭＡ抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているような線状抗体であってもよい。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者にとって明らかであろう。

【0133】

本明細書で提供される修飾抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はポリペプチドとＢＣＭＡとの会合をもたらす任意のタイプの可変領域を含み得る。これに関して、可変領域は、所望の抗原に対する体液性応答を開始して免疫グロブリンを産生するように誘導することができる任意のタイプの哺乳動物のものを含み得るか、又はそれに由来し得る。したがって、抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合断片の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）又はオオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）起源のものであり得る。一実施形態では、修飾抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域の両方は、ヒトである。一実施形態では、適合抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、分子の結合特性が向上するように又は免疫原性が低減するように操作され得るか、又は特異的に調整され得る。これに関して、本発明において有用な可変領域は、インポートされたアミノ酸配列を含めることによってヒト化され得るか、又は他の形で改変され得る。

【0134】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、及び／又は部分的なフレームワーク領域の置換及び配列変更によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又は更には同じサブクラスの抗体に由来し得るが、異なるクラスの抗体に、また特定の実施形態では異なる種の抗体に、ＣＤＲが由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置換する必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を考慮すれば、免疫原性が低減した機能的抗体を得るためにルーチンの実験を実施することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0135】

可変領域の改変にもかかわらず、当業者は、本発明の修飾抗体又はその抗原結合断片が、天然の又は改変されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、腫瘍局在の増加又は血清半減期の低減などの所望の生化学的特性がもたらされるように定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部分が欠失されているか、又は別途改変されている抗体（例えば、完全長抗体又はその抗原結合断片）を含むであろうことを理解するであろう。一実施形態では、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含み得る。本発明と適合する定常領域に対する修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含む。即ち、本明細書に開示される修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３）のうちの１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する改変又は修飾を含み得る。一実施形態では、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している修飾定常領域が企図される。一実施形態では、修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又は変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含み得る。一実施形態では、除かれた定常領域ドメインを、通常はその欠けた定常領域によって付与されるある程度の分子柔軟性をもたらす、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）に置き換えることができる。

【0136】

全定常領域ドメインの欠失に加えて、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、定常領域における数個又は更には単一のアミノ酸の部分欠失又は置換によって修飾することができる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域にある単一のアミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低減させ、それにより腫瘍局在を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインを、完全に又は部分的に欠失させることができる。定常領域のそのような部分欠失は、対象となる定常領域ドメインに付随する他の望ましい機能はそのままにしておきながら、抗体又はその抗原結合断片の選択された特性（例えば、血清半減期）を改善することができる。更に、抗体及びその抗原結合断片の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを増強させる１つ以上のアミノ酸の突然変異又は置換によって修飾することができる。これに関して、修飾抗体又はその抗原結合断片の配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によりもたらされる活性を妨害することが可能である。一実施形態では、エフェクター機能の低下若しくは増加などの望ましい特性を増強するために、又はより多くの細胞毒素若しくは炭水化物の結合を提供するために、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加が存在し得る。一実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合もある。

【0137】

本発明は更に、本発明の抗体又は抗原結合断片（例えば、マウス、キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその抗原結合断片）に実質的に相同である変異体及び等価物を包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、即ち１つ以上のアミノ酸の、同様のアミノ酸による置換を含み得る。例えば、保存的置換は、アミノ酸を同じ一般クラス内の別のアミノ酸で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することなどを指す。保存的アミノ酸置換によって意図されるものは、当該技術分野において周知である。

【0138】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、通常はそのタンパク質の一部ではない追加的な化学的部分を含むように更に修飾することができる。それらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期、又は吸収を向上させることができる。これらの部分はまた、タンパク質の任意の望ましい副作用などを低減又は消失させることもできる。それらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．（２０１２）に見ることができる。

【0139】

配列相同性
様々な配列アラインメント方法のいずれも、同一性パーセントを決定するために使用することができ、これらとしては、限定されないが、包括的方法、局所的方法、及び例えば、セグメントアプローチ方法などのハイブリッド方法が挙げられる。同一性パーセントを決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内のルーチン的な手順である。包括的方法は、分子の始まりから終わりまで配列を整列させ、個々の残基対のスコアを合計し、ギャップペナルティを付与することにより、最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６７３－４６８０（１９９４）を参照されたい）、及び反復改良法（例えば、Ｏｓａｍｕ Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｓ Ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２３－８３８（１９９６）を参照されたい）が挙げられる。局所的方法は、全ての入力配列によって共有される１つ以上の保存されたモチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法としては、例えば、Ｍａｔｃｈ－ｂｏｘ（例えば、Ｅｒｉｃ Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ ａｎｄ Ｅｒｎｅｓｔ Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ：Ａ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ ５０１－５０９（１９９２）を参照されたい）、ギブスサンプリング（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｓｕｂｔｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ Ｇｉｂｂｓ Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８－２１４（１９９３）を参照されたい）、Ａｌｉｇｎ－Ｍ（例えば、Ｉｖｏ Ｖａｎ ＷａＩＩｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｇｎ－Ｍ－Ａ Ｎｅｗ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：１４２８－１４３５（２００４）を参照されたい）が挙げられる。

【0140】

このように、配列同一性パーセントは従来の方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３－１６，１９８６及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１９，１９９２を参照されたい。簡潔に述べると、ギャップオープニングペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ：１、及び以下に示すようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリックスを使用して、アラインメントスコアを最適化するように２つのアミノ酸配列を整列させる（アミノ酸は標準的な１文字コードによって示される）。

【0141】

２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列によって共有される同一位置の数の関数である。したがって、同一性パーセントは、同一ヌクレオチド／アミノ酸の数をヌクレオチド／アミノ酸の総数で割り、１００を掛けたものとして算出することができる。配列同一性パーセントの算出はまた、２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップの長さを考慮に入れる場合がある。２つ以上の配列間での配列比較及び同一性パーセントの決定は、当業者によく知られているＢＬＡＳＴなどの特定の数学的アルゴリズムを使用して実施することができる。

【0142】

実質的に相同なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有することを特徴とする。これらの変化は好ましくは重要ではない性質のもの、即ち、保存的アミノ酸置換（以下を参照されたい）及びポリペプチドのフォールディング又は活性に著しく影響しない他の置換；小さな欠失、典型的には、１～約３０アミノ酸のもの；並びにアミノ末端又はカルボキシル末端のわずかな伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０～２５残基の小さなリンカーペプチド、又はアフィニティータグである。

【0143】

保存的アミノ酸置換
塩基性：アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：グルタミン
アスパラギン
疎水性：ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族性：フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型：グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン

【0144】

２０個の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリジン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン及びα－メチルセリン）を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、ポリペプチドアミノ酸残基と置換することができる。本発明のポリペプチドはまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。

【0145】

限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。

【0146】

本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該技術分野で公知の手順、例えば、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－５，１９８９）に従って同定され得る。生物学的相互作用の部位はまた、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識などの技法によって決定されるような構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－１２，１９９２、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４，１９９２、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４，１９９２を参照されたい。必須アミノ酸の同一性はまた、本発明のポリペプチドの関連成分（例えば、トランスロケーション成分又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測され得る。

【0147】

複数のアミノ酸置換を、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－７，１９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－６，１９８９）により開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法及びスクリーニング方法を用いて行い、また試験することができる。簡潔に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２箇所以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドの配列を決定して、各位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法について開示している。使用可能な他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２－７，１９９１、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書、Ｈｕｓｅ，国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４６：１４５，１９８６、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が挙げられる。

【0148】

別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

【0149】

本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。別段に示されない限り、それぞれ、任意の核酸配列は５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。

【0150】

本明細書で提供される見出しは、本開示の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。

【0151】

本明細書では、アミノ酸は、アミノ酸の名前、３文字の略称、又は１文字の略称を用いて言及される。「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基に関する従来の１文字及び３文字のコードが使用され得る。ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるアミノ酸の３文字コード。遺伝暗号の縮重に起因して、ポリペプチドは複数のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。

【0152】

用語の他の定義は、本明細書全体を通じて現れる場合がある。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示は、説明される特定の実施形態に限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ規定されることから、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないこともまた理解されたい。

【0153】

値の範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間の、下限値の１０分の１の単位までの各介在値もまた、具体的に開示されると理解される。記載された範囲内の記載された任意の値又は介在値と、その記載された範囲内の記載された他の任意の値又は介在値との間の、より小さな範囲の各々は、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含まれても又は除外されてもよく、また、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界値に従って、より小さな範囲にいずれかの限界値が含まれるか、どちらも含まれないか、又は両方とも含まれる各々の範囲もまた、本開示内に包含される。記載された範囲が一方又は両方の限界値を含む場合、含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。

【0154】

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上別途明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「細胞毒素（ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）」への言及は、複数のそのような細胞毒素を含み、「細胞毒素（ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）」への言及は、１つ以上の細胞毒素及び当業者に公知のその等価物などへの言及を含む。

【0155】

本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためのみに提供される。本明細書のいかなる記述も、そのような刊行物が本明細書に添付される特許請求の範囲に対して先行技術を構成することを認めるものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0156】

本発明を、これより以下の実施例を参照して単なる例示として説明する。

【0157】

材料及び方法
抗ＢＣＭＡ抗体の作製
国際公開第２０１０／１０４９４９号パンフレット及び同第２０１９／０２５９８３号パンフレット（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りに抗体を作製した。Ｋｉｎｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１８），Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３３，７６６－７７１及び国際公開第２０１９／０２５９８３号パンフレットに記載の通りに好適な抗体を作製した。

【0158】

抗ＢＣＭＡ ＡＤＣの作製
抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ（ＰＢＤにコンジュゲートした抗ＢＣＭＡ抗体を本明細書では「Ｍ２」と称する）を、前述の通りにプロテアーゼ切断可能リンカーを用いて、Ｋｉｎｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１８），Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３３，７６６－７７１（「Ｋｉｎｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１８）」）に記載のＢＣＭＡ－Ａｂ１抗体へのＰＢＤ二量体テシリン（ＳＧ３２４９）の部位特異的コンジュゲーションを介して調製した（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１８）を参照されたい）。ＢＣＭＡ抗体の例はＢＣＭＡ－Ａｂ２であり、Ｋｉｎｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１８）にも記載されている。上記抗体は、国際公開第２０１９／０２５９８３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）にそれぞれ１５Ｂ２ＧＬ、及びＪ６Ｍ０－ｍｃとして更に記載されている。モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）ペイロードを抗体ＢＣＭＡ－Ａｂ１に結合させることにより、ＡＤＣ「Ｍ３」を同様に作製した。両方のペイロードを、前述の通り、ＢＣＭＡ抗体のＣＨ２ドメイン中の２３９位の後に挿入した操作したシステイン（Ｃ２３９ｉ）に部位特異的にコンジュゲートさせた。簡潔に述べると、ＢＣＭＡ－Ａｂ１を４０モル過剰のＴＣＥＰで３７℃で３時間還元させ、続いて３回連続して透析しＴＣＥＰを除去した。次いで、抗体を２０モル過剰のＤＨＡＡで室温で４時間酸化させ、８モル当量のペイロードを用いてコンジュゲートさせた。コンジュゲーション後、遊離ペイロード及びタンパク質凝集体を、セラミックハイドロキシアパタイト精製によって除去した。

【0159】

ヒトＭＭのマウス異種移植モデル
全ての動物実験は、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物実験委員会の関連規制基準によって承認され、それに準拠した。無血清ＲＰＭＩ １６４０培地１００μｌ中の５．０×１０６のＭＭ．１Ｓ細胞を、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。ＭＭ細胞の注射の約３週間後に腫瘍が測定可能であったとき、マウス（８匹／群）をランダム化し、溶媒のみ、Ｍ２、ｂｔｚ、又はＭ２とｂｔｚで処置した。腫瘍サイズを、ノギスを使用して二次元で３日毎に測定し、以下の式を使用して腫瘍体積を算出した：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である）。腫瘍が２ｃｍ^３に達した時点で動物を屠殺した。

【0160】

免疫ブロッティング及び免疫染色を使用したマウスから採取した腫瘍の分析
３日間の処置後、各群からの腫瘍を採取し、免疫ブロッティング用の細胞溶解物を作製した。マウスから回収した腫瘍切片を、Ｋｉ６７（ＢＣＲ ＣＲＭ３２５）による増殖に関する免疫組織化学染色に供した。免疫組織化学的画像を、Ｋｉ６７についてＺｅｉｓｓ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで撮影した。Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３Ｘ／１．４０ Ｏｉｌ ＤＩＣ Ｍ２７対物レンズを使用した。

【0161】

細胞及び細胞培養
１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ、１０４３７０２８）、２ｍＭ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０１２２）を含有するＲＰＭＩ中でＭＭ細胞株を培養した。ＭＭ細胞株の真正性及びマイコプラズマ汚染について、ヒトＳＴＲプロファイリング細胞認証によってＭＭ細胞株をルーチン的に確認した。ヘルシンキ宣言に従い、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理審査委員会が承認したプロトコルの支援下で、インフォームドコンセントを行った後に患者ＭＭ及び正常ドナー試料を得た。抗ＣＤ１３８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、ＭＭ患者のＢＭ吸引液由来の骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）から初代ＣＤ１３８＋形質細胞（純度＞９５％）を精製した。残存するＣＤ１３８陰性ＢＭＭＣを更に培養して、ＢＭＳＣを誘導した。フィコール・ハイパック密度勾配を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＰＢ試料から単離した。ボルテゾミブをＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。

【0162】

細胞生存率アッセイ及びアポトーシスアッセイ
ＣＣＫ８（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＢＬＩ測定によって細胞生存率を分析した。製造業者の指示に従って、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ－Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び／又はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３４９５７）による染色後のフローサイトメトリー分析によってアポトーシスを評価した。ＭＭ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いで、単独で又はＢＭＳＣと共に２日間培養し、続いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／Ａｑｕａ染色及びフローサイトメトリー分析を行った。

【0163】

ルシフェラーゼ増殖アッセイ
ＢＭＳＣを９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートして細胞を接着させた。ＭＭ１Ｓｌｕｃ細胞を、ＲＰＭＩ培地中のＢＭＳＣのコンフルエントな層上で１００：１の比率で４日間培養した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のプロトコルに従ってルシフェラーゼアッセイを使用して、増殖を測定した。

【0164】

統計分析
各実験を少なくとも３回実施し、データを平均±ＳＤとして表す。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した、二群比較のためのスチューデントｔ検定、又は多重比較のための一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いてデータを分析した。０．０５未満のＰ値が統計学的に有意であった。薬物相互作用をＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアにより評価して、併用指数（ＣＩ）を求めた。１未満のＣＩは相乗作用を示す一方で、１を超えるＣＩは拮抗作用を示し、ＣＩ＝１は相加作用を示す。

【0165】

実施例１
本実施例に反映される実験結果は、抗ＢＣＭＡ抗体－ＰＢＤコンジュゲート（Ｍ２）がそのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログ（Ｍ３）よりも薬物耐性ＭＭ細胞に対してより強力な細胞毒性を誘導することを実証する。

【0166】

ＰＢＤにコンジュゲートした抗ＢＣＭＡ抗体（Ｍ２）で構成されたＡＤＣの細胞毒性を、様々なレベルのＢＣＭＡ発現及び現行の抗ＭＭ薬に対する応答を有するＭＭ細胞株のパネルに対する、そのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログ（Ｍ３）の細胞毒性と比較した。両方のＡＤＣは同じ抗ＢＣＭＡ ｍＡｂ（上記の通りのＢＣＭＡ－Ａｂ１／１５Ｂ２ＧＬ）から構成されるが、異なるペイロードに（即ちＭ２はＤＮＡに架橋するＰＢＤ（例えば、テシリン）に、Ｍ３は微小管に結合するＭＭＡＦに）コンジュゲートしている。ＣＣＫ８ベースの生存率アッセイを３日間使用すると、デキサメタゾン及びＩＭｉＤを含む抗ＭＭ療法に対する感度に関係なく、Ｍ２のＥＤ_５０値は、試験した全てのＭＭ細胞株（ｎ＝１０）においてＭ３の値よりも低い（図１Ａ、図３Ａ）。８つのＭＭ細胞株（ＲＰＭＩ８２２６（ＲＰＭＩ）及びそれに由来するＢＣＭＡを過剰発現するＲＰＭＩ－ＢＣＭＡを含まない）において、ＥＤ_５０値は、Ｍ２及びＭ３について、それぞれ、１１．８５～３４９９ｎｇ／ｍｌ及び２１．２８～２７１４３１ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＩＭｉＤに耐性であるＭＭ１Ｓ（Ｒ）細胞及びＨ９２９（Ｒ）細胞の２つがそれぞれ由来するＭＭ１Ｓ細胞及びＨ９２９細胞を除き、全てのＭＭ細胞は種々のｐ５３突然変異を保有している。Ｍ２は、最も低いＢＣＭＡレベルを発現しＩＭｉＤに耐性であるＲＰＭＩ８２２６細胞に対して細胞毒性であるが、Ｍ３はそうではない（図１Ａ～Ｂ）。ＤＮＡ合成アッセイを使用すると、Ｍ２は全てのＭＭ細胞の増殖の遮断に対し、Ｍ３より大きい（＞１～２ｌｏｇ）効力を示す（図１Ｂ、図３Ｂ）。例えば、Ｍ２対Ｍ３のＥＤ_５０は、ＲＰＭＩ８２２６細胞において１８９．７対２１４２７ｎｇ／ｍｌである。更に、Ｍ２は、ＩＬ－６と共に培養したＡＮＢＬ６及びそれに由来するボルテゾミブ（ｂｔｚ）耐性ＡＮＢＬ６－ＢＲ細胞の両方の生存率を低下させたが、Ｍ３はそうではなかった（図３Ｃ）。これらの対にしたＩＬ－６依存性ＡＮＢＬ６細胞は、Ｍ３に対して非感受性であり、ＲＰＭＩ８２２６細胞と同程度の細胞膜ＢＣＭＡタンパク質を発現する（データは示さず）。したがって、比較的低いＢＣＭＡ発現を有するＭＭ細胞もまた、Ｍ３と比べてＭ２に対して著しく感受性が高い。

【0167】

Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ａｑｕａで染色後にフローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析を使用したところ、Ｍ２は、デキサメタゾン（ｄｅｘ）又はボルテゾミブ（ｂｔｚ）に感受性であるか又は耐性である対にしたＭＭ細胞株において、Ｍ３と比較した場合、より早期の且つ増加したアポトーシスを用量依存的及び時間依存的な形で誘導することが示された（図１Ｃ、図３Ｄ）。これらのインビトロでの結果は、ＢＣＭＡレベル及びｐ５３の状態に関係なく、Ｍ２が、ＭＭ細胞において現行の抗ＭＭ薬（デキサメタゾン、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ）に対する耐性をＭ３よりも大幅に克服することを示す。

【0168】

実施例２
本実施例に反映される実験結果は、骨髄微小環境及び患者ＭＭ細胞中のＭＭ細胞に対する細胞毒性の誘導において、Ｍ２がＭ３よりも有効であることを実証する。

【0169】

次に、ＭＭ細胞の増殖、生存、及び薬物耐性を促進する骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）及びＩＬ－６と共培養したＭＭ細胞に対するＭ２及びＭ３の効果を評価した。ＢＬＩ測定を使用したところ、ＢＭＳＣは、ＭＭ１Ｓｌｕｃ細胞の増殖及び生存を著しく増加させることが示された（図４Ａ）。ＢＬＩベース及びＣＴＧベースのアッセイにおいて、Ｍ２は、ＢＭＳＣ、ＰＢＭＣ、及びＮＫ細胞などのＢＣＭＡ陰性非ＭＭ細胞サブセットに対する影響を最小限に抑えながら（図４Ｂ）、ＢＭＳＣと共培養したＭＭ１Ｓｌｕｃ及び他の全ての試験したＭＭ細胞株（ｎ＝６）の生存能をＭ３よりも強力に阻害する（図２Ａ、図４Ａ）。生存ＭＭ細胞を同定するためにＦＣＭ分析を使用すると、Ｍ２は、ＢＭＳＣの存在下であっても、ＩＭｉＤ耐性ＭＭ１Ｓ（Ｒ）細胞及びＨ９２９（Ｒ）細胞の生存をＭ３よりも効果的に低下させる（図２Ｂ）。定量的ＦＣＭベースの分析（図２Ｃ）及び定量的ＣＴＧベースの分析（図４Ｃ）では、Ｍ２は、ＩＬ－６の存在下又は非存在下で、Ｈ９２９ ＭＭ細胞の増殖及び生存を低減させた。

【0170】

３日間の処置後、ＲＲＭＭを有する患者由来のＢＭ ＣＤ１３８＋の生細胞画分及び死細胞画分を、ＦＣＭ分析によって定量した。重要なことに、Ｍ２は、Ｍ３と比較して用量依存的にアポトーシス性ＣＤ１３８＋患者ＭＭ細胞を増加（２倍超）させた（図４Ｄ）。ＣＴＧベースのアッセイでは、Ｍ２はまた、ＲＲＭＭを有する更なる患者３名に由来するＣＤ１３８－精製ＢＭ細胞において用量依存的毒性を示し（図２Ｅ）、加えて、新たに診断されたＭＭ（ＮＤＭＭ）を有する患者４名（図２Ｆ、左、図４Ｄ）及びＲＲＭＭを有する患者２名（図２Ｆ、右）に由来する生存ＣＤ３８ｈｉｇｈＣＤ１３８＋ＢＭ細胞を著しく枯渇させた。これらのデータは、Ｍ２が、疾患状態に関係なく患者ＭＭ細胞を枯渇させ、ＢＭ微小環境中のＭＭ細胞に対してＭ３よりも著しく細胞毒性が高いことを示している。

【0171】

実施例３
本実施例に反映される実験結果は、ボルテゾミブと組み合わせたＭ２が、インビトロ及びインビボでＭＭ細胞に対して相乗的な細胞毒性を誘導することを実証する。

【0172】

ボルテゾミブ（ｂｔｚ）は、ｂｔｚが既存の骨髄腫療法であるため、Ｍ２の候補共療法として選択した。低用量で２日間Ｍ２とｂｔｚとを併用したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩベースのＦＭＣ分析は、いずれの薬剤の単独と比較した場合でも、ＪＪＮ３細胞及びＲＰＭＩ８２２６細胞におけるアポトーシスを更に増強させる（図５Ａ～Ｂ、ｐ＜０．０１）。併用処置後に著しく増加した細胞死はまた、ＩＬ－６中で培養したｂｔｚ耐性ＡＮＢＬ６－ＢＲ細胞においても見られる（ｂｔｚの添加は相加的な効果を超える効果をもたらすという観察結果を裏付ける）。次に、ＣＴＧベースの生存率アッセイからの結果を分析して、併用指数（ＣＩ）を算出した。６つを超える代表的なＭＭ細胞において１未満のＣＩが得られ、これは、Ｍ２＋ｂｔｚの相乗効果を示している（図５Ｃ、図６）。

【0173】

次に、ＭＭ１Ｓ異種移植マウスモデルにおいて、至適用量以下のＭ２とｂｔｚのインビボ有効性を評価した。触知可能なＭＭ１Ｓ腫瘍を有するマウスを、溶媒対照、Ｍ２の単独処置、又はｂｔｚ（０．４ｍｇ／ｋｇ）の６回の単独処置若しくはＭ２との併用処置のいずれかを施す４群にランダム化した。処置の２４日後に、Ｍ２の単回用量又は合計６用量のｂｔｚは、溶媒対照と比較して、マウスにおけるＭＭ１Ｓ腫瘍増殖を有意に遅延させる（図７Ａ、ｐ＜０．００５）。併用処置は、いずれの単剤単独と比べても腫瘍体積を有意に減少させた（ｐ＜０．０４）。全ての動物の体重が影響を受けなかったことから、Ｍ２＋ｂｔｚによる処置は忍容性が良好である（図７Ｂ）。１７７日間の追跡により、いずれかの薬剤単独で処置されたコホートに対する、併用処置群における全生存期間中央値の有意な延長が示される（ｃｎｔ、２２日間；Ｍ２、４０．５日間；ｂｔｚ、３５日間；Ｍ２＋ｂｔｚ、５７日間）（ｐ＜０．０４５）（図７Ｃ）。併用処置群では、１７７日目に１５％のマウスが何らの腫瘍増殖もなく依然として生存している。

【0174】

Ｋｉ６７（増殖の細胞マーカー）に関する免疫組織化学（ＩＨＣ）により、単剤処置後と比べて併用処置後に増殖がより強力に阻害されることが更に立証される（図７Ｄ）（Ｍ２＋ｂｔｚ処置における染色された細胞（暗色）の数の減少に注目されたい）。

【0175】

Ｍ２とｂｔｚとの併用処置は、ＭＭ１Ｓ異種移植片のインビボ増殖を著しく減少させ（図８）、骨髄腫の処置におけるＭ２及びｂｔｚのインビボ相乗作用が実証された。

【0176】

結論として、細胞レベルでインビトロで認められたＭ２のｂｔｚとの相乗的活性は、ＭＭの形質細胞腫モデルにおける優れたインビボ有効性に転換される。

【0177】

実施例１～３の考察
薬物耐性による疾患の再発は、依然としてＭＭにおける更なる長期生存に対する主要な障害である。したがって、薬物耐性を克服し、ＲＲＭＭにおけるアンメットメディカルニーズに対処するために、新規療法が必要とされている。このことに関して、本発明者らはまず、ＡＤＣ（Ｍ２；ＰＢＤにコンジュゲートした抗ＢＣＭＡ抗体）が、試験した全てのＭＭ細胞株及び患者ＭＭ細胞に対して、そのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログよりも優れた細胞毒性を有することを示す。チューブリンへの結合を介して増殖性腫瘍細胞を主に標的とするＭＭＡＦとは異なり、ＰＢＤ二量体は、急速に分裂している細胞とより静止状態にある細胞の両方において細胞死を引き起こす。Ｍ２は、ＢＭＳＣ及びＩＬ－６の存在下であっても、ＢＣＭＡ発現レベルが低く現行の療法に対して耐性である細胞を含むそのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログよりも、ＭＭ細胞の増殖に対してより強力な効果を誘発する。これらのデータは、高悪性度ＭＭの処置において、Ｍ２がそのＭＭＡＦ ＡＤＣホモログよりも有効であり得ることを示唆する。

【0178】

重要なことに、インビトロでのＭ２とｂｔｚとの併用処置は、試験した全てのＭＭ細胞において、ＣＩ＜１で証明される相乗的な死を誘導する。特に、Ｍ２はｂｔｚ耐性ＡＮＢＬ６－ＢＲ細胞においてさえｂｔｚと相乗作用し、このことは、他の不明確な分子もまた細胞毒性の増強に関与していることを示している。

【0179】

ＭＭ１Ｓ腫瘍担持マウスにおいて、Ｍ２は単剤療法としてｂｔｚよりも極めて有効である。重要なことに、インビボ腫瘍増殖の阻害は、Ｍ２をｂｔｚと併用した場合に更に増強される。両剤を投与されたマウスにおいて、著しい腫瘍壊死がいずれの薬物の単独よりも早期に認められ、１７７日目に、併用処置群の１５％のマウスは依然として腫瘍なしで生存する。重要なことに、体重減少は全ての群で認められず、このことは、インビボでのＭ２の好ましい安全性プロファイルを示し、Ｍ２とｂｔｚとの併用処置をインビボで安全に施すことが可能であることを示唆する。

【0180】

要約すると、現行のＭＭ療法に耐性であり、ＢＭ微小環境により保護されているＭＭ細胞においてさえ、Ｍ２は、強力な増殖阻害及び死を特異的に誘発する。インビボでは、Ｍ２はｂｔｚよりも有効であり、Ｍ２をｂｔｚと併用することにより有効性が更に増強され、宿主生存が延長される。

【0181】

実施例４
本実施例に反映される実験結果は、Ｍ２が、薬物感受性ＭＭ細胞及び薬物耐性ＭＭ細胞において、ＤＮＡ損傷応答及び修復シグナル伝達カスケードを著しく活性化させ、続いてアポトーシスを活性化させることを実証する。

【0182】

免疫ブロット分析を用いて、ＭＭ細胞株中で時間依存的及び用量依存的にＭ２により誘発されるＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）シグナル伝達カスケードの誘導を明らかにした。Ｍ２は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）応答の初期事象である、ＡＴＭ、細胞周期チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＫ１）、及びＣＨＫ２（ＣＨＫ１／２）、並びにヒストン２ＡＸ（Ｈ２ＡＸ）のリン酸化を誘導するが、Ｍ３はそうではない（図９Ａ及び図１０Ａ）。ＡＴＭ及びＣＨＫ１／２のＭ２の刺激によるリン酸化は４時間で検出され、処置後１日を超えて持続する。ＭＭ１Ｓ細胞よりも著しく高いＢＣＭＡレベルを発現するＨ９２９細胞において、Ｍ２によって誘発されるＡＴＭ及びＣＨＫ１／２のより早期且つより顕著な活性化が見られた（図１０Ａ、Ｃ）。ＡＴＭ及びＣＨＫ１／２のＭ２誘導性リン酸化の強度はまた、親ＲＰＭＩ８２２６ ＭＭ細胞に由来するＢＣＭＡレベルと相関した（図１０Ｄ）。試験したＭＭ細胞において、ＡＴＭ及びＣＨＫ１／２のＭ２誘導性リン酸化は、ＡＴＲのリン酸化よりもはるかに大規模に生じる。２日間のＭ２による処置後、リン酸化Ｈ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）の増加を伴って（図１０Ｂ）、ＰＡＲＰ（ｃＰＡＲＰ）及びカスパーゼ３（ｃＣａｓ３）の切断がＢＣＭＡ依存的に誘導され（図１０Ｂ、Ｅ～Ｆ）、このことは、Ｍ２がＭＭ細胞においてＤＮＡ損傷を誘導し、続いてアポトーシスを誘導することを示している。重要なことに、Ｍ２は、ｐ５３突然変異を有する６つの細胞株を含む全てのＭＭ細胞において、ＡＴＭ及びＣＨＫ１／２のリン酸化を用量依存的に誘導する（図９ｂ～ｃ）。Ｍ３は、Ｍ２と同じ処置条件下において、ＡＴＭ／ＡＴＲもＣＨＫ１／２も誘導しない（図１０Ａ）。Ｍ２はＭ３よりもｃＰＡＲＰ及びｃＣａｓ３の誘導に有効であり（図１０Ｆ）、これは、ＭＭ細胞のアポトーシスを誘発する効力がＭ３よりも高いことと一致する。重大なことに、Ｍ２は、ＡＮＢＬ６細胞及び対にしたｂｔｚ耐性ＡＮＢＬ６－ＢＲ細胞におけるＡＴＭ／ＡＴＲ及び下流のＣＨＫ１／２シグナル伝達経路、γＨ２ＡＸ及びＰＡＲＰの切断を誘発した（図９ｃ）。Ｍ２によるＡＴＭ及びＣＨＫ１／２の顕著な活性化は、親Ｈ９２９ ＭＭ細胞と同程度でＩＭｉＤ耐性Ｈ９２９（Ｒ）細胞においても見られる（図９ｄ）。したがって、ｂｔｚ及びｌｅｎ耐性ＭＭ細胞では、Ｍ２は依然として、ＡＴＲ／ＡＴＭ－ＣＨＫ１／２シグナル伝達カスケードの活性化を介したＢＣＭＡ依存的ＤＤＲシグナル伝達経路を誘導し、続いてアポトーシスを誘導する。

【0183】

ＤＮＡ修復機構ＴａｇＭａｎ（登録商標）アレイの解析により、Ｍ２は、Ｈ９２９ ＭＭ細胞のＤＮＡ損傷修復関連遺伝子の発現を変化させる（７２個中５１個）ことが示される（図１１ａ）。種々の薬物感受性ＭＭ細胞及び薬物耐性ＭＭ細胞（ｎ＞６）において、Ｍ２は、ＲＡＤ５１（ＤＳＢの発生前にＤＮＡ ＩＣＬに結合する）を用量依存的に誘導するが（図１１ｂ～ｃ）、Ｍ３は誘導しない（図１０Ｇ）。このように、ＭＭ細胞において、Ｍ２は、ＡＴＭ／ＡＴＲ－ＣＨＫ１／２を介したＤＤＲシグナル伝達カスケードを特異的に活性化し、γＨ２ＡＸ及びＲＡＤ５１の増加を伴って下流のＤＤＲ関連分子を誘導し、続いてアポトーシスを誘導する。

【0184】

上記明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の改変及び変形が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者には明らかである、本発明を実施するために記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

【0185】

【表1】

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【配列表】

2022534969000001.app

【国際調査報告】