ホーム > 特許ランキング > ＩＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｐＳ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(54)【発明の名称】ＴＧＦ－ベータワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220728BHJP
C07K 14/495 20060101ALI20220728BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220728BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220728BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220728BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220728BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20220728BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220728BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220728BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220728BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20220728BHJP
A61K 38/22 20060101ALN20220728BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20220728BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/495 ZNA
C12N5/0783
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61K38/02
A61K45/00
A61K35/76
A61K39/00 H
A61K39/39
A61K38/22
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571915
(86)(22)【出願日】2020-06-04
(85)【翻訳文提出日】2022-01-19
(86)【国際出願番号】 EP2020065472
(87)【国際公開番号】W WO2020245264
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】1908012.6
(32)【優先日】2019-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518289427
【氏名又は名称】アイオー バイオテック エーピーエス
【氏名又は名称原語表記】ＩＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｐＳ
【住所又は居所原語表記】Ｏｌｅ Ｍａａｌｏｅｓ Ｖｅｊ ３， ２２００ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン，マッズ ハルド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD21
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA20
4C084CA18
4C084DB61
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZC75
4C085AA02
4C085BB01
4C085BB11
4C085CC32
4C085EE01
4C085EE03
4C085FF11
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086NA05
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA86
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、ＴＧＦｂ１に由来する新規なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドの使用、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの使用、ならびに前記ポリペプチドを含む組成物およびそれらの使用に関する。
【選択図】図１－１
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトトランスフォーミング成長因子１（ＴＧＦｂ１）の免疫原性断片であり、かつ配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号１の最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含むまたはそれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
配列番号６６、２８～３１、６７、５～９、４２～４５、１２～１５、５５～５８、２３～２６、４９～５２、６３、６４、６５または２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号６６、２８、６７、５、６、４２、１２、５５、２３、４９または６３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸の最大長を有する、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置換されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項6】
ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを含み、場合によりここで、ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープが、配列番号６６または６７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項7】
場合により、ベクター内に含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび／または請求項７に記載のポリヌクレオチド；および場合によりアジュバントを含む、組成物。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの異なるポリペプチド；請求項７に記載の少なくとも１つの異なるポリヌクレオチド；および／または少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、イミダゾキニリン、モンタニドＩＳＡアジュバントからなる群から選択されるアジュバントを含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項11】
対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、前記方法が、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項12】
前記疾患または病態が、（ｉ）場合により、乳癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、黒色腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、もしくは前立腺癌からなる群から選択される癌である；および／または
（ｉｉ）ＴＧＦｂ１発現細胞の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能ならびに／またはＩＬ－４および／もしくはＩＬ－１３の不適切なもしくは過剰な発現を少なくとも部分的に特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記疾患または病態が癌であり、前記方法が、追加の癌療法、好ましくは抗体の、同時投与または逐次投与をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
ＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞を刺激する方法であって、前記方法が、Ｔ細胞を、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび／または請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含み、前記組成物は、請求項１～６のいずれか一項で定義される少なくとも1つのポリペプチドを含む、方法。
【請求項15】
前記Ｔ細胞が、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、場合により腫瘍サンプル中に存在する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１；ＴＧＦｂ１）に由来する新規なポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこのようなペプチドを含む組成物に関する。本発明はまた、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物の使用および使用方法に関する。
本発明は、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１；ＴＧＦｂ１）に由来する新規なポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこのようなペプチドを含む組成物に関する。本発明はまた、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物の使用および使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ＴＧＦｂは、免疫系の調節に重要な役割を果たす多機能性サイトカインである。４種のアイソフォームが存在し、そのうち、アイソフォーム１（ＴＧＦｂ１）が、Ｔ細胞免疫において特に重要である。癌の文脈において、ＴＧＦｂ１は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍関連好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの種々の免疫細胞を無効化（disarm）する。これはまた、腫瘍の血管新生および転移にも寄与する。結果的に、ＴＧＦｂ１は、免疫系の抗腫瘍機構のダウンレギュレーションに寄与し、癌細胞による免疫回避を可能にする、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における重要な阻害分子である。
ＴＧＦｂは、免疫系の調節に重要な役割を果たす多機能性サイトカインである。４種のアイソフォームが存在し、そのうち、アイソフォーム１（ＴＧＦｂ１）が、Ｔ細胞免疫において特に重要である。癌の文脈において、ＴＧＦｂ１は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍関連好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの種々の免疫細胞を無効化（disarm）する。これはまた、腫瘍の血管新生および転移にも寄与する。結果的に、ＴＧＦｂ１は、免疫系の抗腫瘍機構のダウンレギュレーションに寄与し、癌細胞による免疫回避を可能にする、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における重要な阻害分子である。
【0003】
転移性肝臓癌のマウスモデルの最近の試験において、ＴＧＦｂ１は、ＰＤ－Ｌ１遮断などの免疫チェックポイント遮断薬（ＩＣＢ）の癌療法としての効率の減少に寄与することも認められている。
【発明の概要】
【0004】
本発明のポリペプチドは、ＴＧＦｂ１発現細胞に対する有益な免疫応答を刺激するのに特に有効であると期待される。癌に対する新規な免疫療法の開発は、病因に関与する分子および免疫系によって認識される特異的タンパク質の徹底的な理解を必要とする。臨床状況において、ＴＧＦｂ１特異的な免疫応答の誘導は、ＴＧＦｂ１発現癌細胞を直接死滅させ得るが、より重大なことに、これは、ＴＧＦｂ１の免疫抑制機能を抑制することにより、一般に抗癌免疫応答を支持する。例えば、本発明のポリペプチドのワクチン接種により、ＴＧＦｂ１およびＴＧＦｂ１発現細胞を標的とすることは、結果的に、免疫チェックポイント遮断薬（ＩＣＢ）などの追加の抗癌免疫療法と高度に相乗的となる。
【0005】
ＴＧＦｂ１は、分子内ジスルフィド結合によって一緒に接続されたシステインノット構造を共有する二量体サイトカインである。ＴＧＦｂ１は、単量体３９０アミノ酸前駆体タンパク質として合成され、これは、ＴＧＦｂ１プレタンパク質；ＴＧＦｂ１前駆体；全長ＴＧＦｂ１；プレプロＴＧＦｂ１と互換的に呼ばれる。ＴＧＦｂ１プレタンパク質の全長配列は、配列番号１として提供される。
【0006】
ＴＧＦｂ１プレタンパク質単量体は、約２５ｋＤａの分子量を有する。ＴＧＦｂ１タンパク質単量体は、図１Ｅに示されるように、３つの異なるドメイン：シグナルペプチド（ＳＰ：アミノ酸１～２９；配列番号２）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ：アミノ酸３０～２７８；配列番号３）および成熟ペプチド（成熟ＴＧＦｂ１：アミノ酸２７９～３９０；配列番号４）を有する。
【0007】
ＴＧＦｂ１ ＳＰは、該タンパク質を分泌経路に指向させる；ＳＰは、粗面小胞体において切断される。ＬＡＰおよび成熟ＴＧＦｂ１を含むＴＧＦｂ１単量体は、ＬＡＰ（例えば、Ｃｙｓ２２３およびＣｙｓ２２５）ならびに成熟ＴＧＦｂ１ペプチド（例えば、Ｃｙｓ３５６）におけるシステイン残基間のジスルフィド架橋を介して小胞体において二量体化し、ＴＧＦｂ１ホモ二量体を形成し得る。このＴＧＦｂ１ホモ二量体は、小潜在型複合体（ＳＬＣ）という。ＳＬＣは、いわゆる潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に結合され、大潜在型複合体（ＬＬＣ）と呼ばれるより大きな複合体を形成し得る。ＬＬＣは、細胞外培地（ＥＣＭ）に分泌され得る。しかしながら、ＬＡＰおよびＬＴＢＰの存在が、ＴＧＦｂ１がその細胞外受容体に結合し、それを活性化することを妨げる。活性型ＴＧＦｂ１は、成熟ＴＧＦｂ１ペプチドのホモ二量体からなる。成熟ＴＧＦｂ１ホモ二量体がＬＡＰおよびＬＴＢＰから放出される種々の機序が存在し、プロテアーゼによるＬＡＰの分解、トロンボスポンジンとの相互作用によるＬＡＰのコンフォメーション変化の誘導、ならびにＬＡＰおよびＴＧＦβ－１間の非共有結合の破壊が挙げられる。
【0008】
本発明の目的は、ＴＭＥからＴＧＦｂ１を奪うためのＴ細胞媒介機序の開発である。本発明者らは、健常ドナーおよび癌患者由来のＰＢＭＣをスクリーニングすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける自発的なＴＧＦｂ１特異的なＴ細胞応答の存在を検討した。次いで、ＴＧＦｂ１特異的なＴ細胞集団を単離し、増幅し、ＨＬＡ拘束性、サイトカイン産生および細胞傷害性に関する種々のアッセイにより特徴付けた。
【0009】
本発明者らは、ヒトＴＧＦｂ１の最大の免疫原性を有する領域を同定した。意外にも、これらの免疫原性「ホットスポット」領域は、ＳＰおよびＬＡＰドメイン内、ならびに成熟ＴＧＦｂ１ペプチド内を含む、ヒトＴＧＦｂ１プレタンパク質の至る所に分布している。本発明者らはまた、より大きな頻度の免疫原性ペプチド配列を有するヒトＴＧＦｂ１ ＬＡＰ内のサブ領域（sub-region）、すなわち、配列番号１の１２１～１６０位（配列番号６５の配列に対応）を同定した。
【0010】
よって、本発明は、ヒトＴＧＦｂ１（配列番号１）の免疫原性断片であり、かつ配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなるポリペプチドを提供する。配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列は、配列番号２または６５の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列に対応し得る。ポリペプチドは、配列番号１の最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含んでもよいまたはそれからなってもよい。ポリペプチドは、配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、６３、７～９、４３～４５、１３～１５、２４～２６、２９～３１、５０～５２、５６～５８、６４、６５、２、６６、６７、または５のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなってもよく、好ましくは、ポリペプチドは、配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、６３、６６、６７または５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。ポリペプチドは、配列番号６６、２８～３１、６７、５～９、４２～４５、１２～１５、５５～５８、２３～２６、４９～５２、６３、６４、６５または２のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなってもよく、好ましくは、ポリペプチドは、配列番号６６、２８、６７、５、６、４２、１２、５５、２３、４９、または６３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【0011】
ポリペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の最大長を有してもよい。ポリペプチドのＣ末端アミノ酸は、対応するアミドに置換されてもよい。ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを含んでもよい。ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープは、配列番号６６または６７のアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなってもよい。
【0012】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。ポリヌクレオチドは、単離されていてもよい。ポリヌクレオチドを含むベクターも、本発明により提供される。
【0013】
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドおよび場合によりアジュバントを含む組成物を提供する。組成物は、本発明の少なくとも１つの異なるポリペプチド；本発明の少なくとも１つの異なるポリヌクレオチド；および／または少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体もしくは保存剤をさらに含んでもよい。アジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、イミダゾキニリン（imidazochiniline）、およびモンタニドＩＳＡアジュバントからなる群から選択され得る。
【0014】
本発明はまた、対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、前記方法が、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、および／または本発明の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。方法は、追加の癌療法、好ましくは、抗体の同時投与または逐次投与をさらに含んでもよい。
【0015】
本発明はまた、疾患または病態の治療または予防における使用のための、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組成物、またはそれらの組合せを提供する。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、またはそれらの組合せは、追加の癌療法、好ましくは、抗体と組み合わせて使用するためのものであってもよい。
【0016】
本発明は、疾患または病態の治療または予防のための薬剤の製造のための、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組成物、またはそれらの組合せの使用をさらに提供する。
【0017】
疾患もしくは病態は、ＴＧＦｂ１発現細胞の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とし得る、および／または疾患もしくは病態は癌である。疾患または病態は、インターロイキン－４（ＩＬ－４）および／またはインターロイキン１３（ＩＬ－１３）の不適切なまたは過剰な発現を少なくとも部分的に特徴とし得る。疾患または病態は、癌であり得る。前記癌は、乳癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、黒色腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、または前立腺癌であり得る。
【0018】
本発明は、ＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞を刺激する方法であって、前記方法が、Ｔ細胞を、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む本発明の組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。Ｔ細胞は、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、場合により腫瘍サンプル中に存在してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1-1】図１Ａ～Ｃ．６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を、三重反復ウェルで実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＴＧＦｂ１プレタンパク質由来の３８個の重複２０ｍｅｒペプチドのアレイに対して評価した。各スポットは、各バックグラウンドシグナルを差し引いた後のＩＦＮγ分泌細胞の平均数を表し、灰色の水平バーは、試験ドナー間の平均値を示す。星は、最も強く、かつ最もＤＦＲｘ２ベースの統計学的に有意な応答を誘発し、かつさらなるスクリーニング実験のために選択されたペプチドを示す（図１Ｄに要約する）。
【図1-2】図１Ａ～Ｃ．６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を、三重反復ウェルで実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＴＧＦｂ１プレタンパク質由来の３８個の重複２０ｍｅｒペプチドのアレイに対して評価した。各スポットは、各バックグラウンドシグナルを差し引いた後のＩＦＮγ分泌細胞の平均数を表し、灰色の水平バーは、試験ドナー間の平均値を示す。星は、最も強く、かつ最もＤＦＲｘ２ベースの統計学的に有意な応答を誘発し、かつさらなるスクリーニング実験のために選択されたペプチドを示す（図１Ｄに要約する）。
【図1-3】図１Ａ～Ｃ．６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を、三重反復ウェルで実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＴＧＦｂ１プレタンパク質由来の３８個の重複２０ｍｅｒペプチドのアレイに対して評価した。各スポットは、各バックグラウンドシグナルを差し引いた後のＩＦＮγ分泌細胞の平均数を表し、灰色の水平バーは、試験ドナー間の平均値を示す。星は、最も強く、かつ最もＤＦＲｘ２ベースの統計学的に有意な応答を誘発し、かつさらなるスクリーニング実験のために選択されたペプチドを示す（図１Ｄに要約する）。
【図1-4】図１Ｄ．図１Ａ～１Ｃのスクリーニングに基づいた、最も免疫原性であるＴＧＦβペプチドおよびそれらの各平均ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ数を要約した表。上位８個の最もパフォーマンスの良いペプチドを、さらなる検討のために選択した。
【図1-5】図１Ｅ．上：ＴＧＦｂ１プレタンパク質の一次配列。強調表示したものは、さらなるスクリーニングのために選択した８個の免疫原性ＴＧＦｂ１ペプチドのアミノ酸配列である。下線を付したアミノ酸の１～２９位は、タンパク質（ＳＰ）のシグナル配列の位置を示し、一方、下線を付したアミノ酸の２７９～３９０位は、成熟ＴＧＦｂ１単量体タンパク質を示す。下：ＴＧＦｂ１プレタンパク質ドメインおよび８個の選択されたＴＧＦｂ１由来ペプチドの位置の模式図。数字（１、２９、２７９および３９０）は、ＴＧＦｂ１プレタンパク質の３つの主要ドメインの目印となる重要なアミノ酸の位置を示す。
【図2-1】図２．Ａ．図１Ａ～Ｃにおいて同定された８個の免疫原性ＴＧＦｂ１由来ペプチドに対するＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、追加の健常ドナーにおける応答を評価することによって検証した。各スポットは、各バックグラウンドシグナルを差し引いた後の個々のドナーにおけるＩＦＮγ分泌細胞の平均数を表し、黒色の水平バーは、試験ドナー間の平均値を示す。Ｂ．リードエピトープに対する健常対象由来のＰＢＭＣにおける応答の振幅を示すヒートマップ（上）；代表的なＥＬＩＳＰＯＴ応答（下）。
【図3-1】図３．Ａ．図１Ａ～Ｃにおいて同定された８個の免疫原性ＴＧＦｂ１ペプチドに対するＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を検証したが、今回は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより応答を評価することによって、癌患者を調べた。各スポットは、各バックグラウンドシグナルを差し引いた後の個々の癌患者におけるＩＦＮγ分泌細胞の平均数を表し、黒色の水平バーは、試験患者間の平均値を示す。Ｂ．リードエピトープに対する癌患者由来のＰＢＭＣにおける応答の振幅を示すヒートマップ。
【図4-1】図４．細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析を実施し、ＴＧＦｂ１エピトープに応答するＴ細胞の機能性をさらに特徴付けた。この例では、健常ドナー（ＢＣ－Ｍ－４１）由来のＰＢＭＣを、アッセイの１３日前に解凍し、ＴＧＦｂ－０２（配列番号６）で刺激した。培養を実施した１日後（１２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＣＳを実施する３日前（６０Ｕ／ｍＬ）に、ＩＬ－２を加えた。各フローサイトメトリープロットにおいて、各細胞はドットとして表し、細胞の機能表現型を、各軸に各々が示される２つのマーカーの同時の発現に基づき分析している。生細胞集団をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞画分またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞画分に基づきゲーティングし、サイトカイン発現（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の発現量ならびに細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ）に関するマーカーを定量化した。各集団のパーセンテージを、右の階層表に要約する。
【図5】図５．Ａ．ＩＣＳを用いて決定したＴＧＦβエピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示すＦＡＣＳプロット。Ｂ．ＩＣＳを用いて決定したＴＧＦｂ１エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すＦＡＣＳプロット。
【図6】図６．いくつかのＴＧＦｂ１由来エピトープに対して特異的なバルク培養物を、特異的Ｔ細胞のＭＡＣＳ ＣＤ１３７富化により生成した。富化後に富化細胞を増幅し、富化細胞は、それらのエピトープに対して可変的な反応性を示した。Ａ～Ｄの各々に関して、上のＦＡＣＳプロットは、特異的ＣＤ４＋ゲート細胞の量を示し、下のＦＡＣＳプロットは、以下のエピトープ：ＴＧＦｂ－０２（Ａ）、ＴＧＦｂ－０５（Ｂ）、ＴＧＦｂ－２６（Ｃ）、およびＴＧＦｂ－３８（Ｄ）に対する特異的ＣＤ８＋ゲート細胞の量を示す。
【図7】図７．Ａ．左：ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した、癌患者および健常対象の両方に由来するＰＢＭＣにおける応答の振幅。ＰＢＭＣを一晩静置し、次いで、ＥＬＩＳＰＯＴウェルに直接蒔き、ＥＬＩＳＰＯＴウェル中にてエピトープで４８時間刺激した。右：ＴＧＦｂ１リードエピトープのいくつかに対するｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の例。Ｂ．ＩＣＳを用いた刺激のわずか５時間後におけるエピトープＴＧＦｂ－１５に対して同定されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図8】図８．Ａ．ペプチドによる事前の１４日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激とともに、エピトープによる１８時間の刺激後の、ＴＧＦｂ－１５エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す前立腺癌を有する患者由来のＰＢＭＣ。Ｂ．ドナーＵＲ１１２１．１４由来のＴＧＦｂ１５特異的Ｔ細胞を、ＴＧＦｂ－１５による刺激後に２回富化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１４日後に再刺激し、次いで、ＭＡＣＳ ＣＤ１３７富化法を用いて翌日に富化した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡおよびＢの各々に関して上のＦＡＣＳプロット）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＡおよびＢの各々に関して下のＦＡＣＳプロット）の両方とも、ＴＧＦｂ－１５による刺激に応答した。
【図10-1】図１０．ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ拘束性に標的細胞を死滅させ、ＴＧＦｂ１を発現する癌細胞株を死滅させる。Ａ．ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＧＦｂ－１５ペプチドでパルスしたＴ２細胞を効率的に溶解した。Ｂ．ＴＧＦｂ－１５応答がＨＬＡ－Ａ２拘束性であったことを確認するために、ペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ２＋標的細胞は溶解されたが、ペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ３＋標的細胞は溶解されなかったことを示した。Ｃ．ＨＬＡ－Ａ２＋癌細胞株ＵＫＥ－１およびＴＨＰ－１によるクローンの刺激は、ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを活性化した。他のＨＬＡ－Ａ２＋癌細胞は、Ｔ細胞を活性化しなかった。Ｄ．ＴＨＰ－１およびＵＫＥ－１癌細胞株の両方とも、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞により容易に死滅された。Ｅ．ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞の活性化は、サイトカイン処理ＴＨＰ－１細胞による刺激時に増強した。Ｆ．Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４またはＴＧＦｂ１によるＴＨＰ－１細胞の刺激は、ＴＧＦｂ－１５特異的細胞により死滅されたＴＨＰ－１細胞の量を増強した。
【図12-1】図１２．ＴＧＦｂ１シグナルペプチド配列におけるＨＬＡ－Ａ２結合十量体エピトープに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性にＴＧＦｂ１発現癌細胞株を容易に死滅させる。Ａ．健常ドナーＰＢＭＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の１４日後に、ＨＬＡ－Ａ２結合十量体エピトープＴＧＦｂ－Ａ２－０１ペプチドによる刺激時に分泌ＩＦＮ－γを示した。Ｂ．健常ドナーＰＢＭＣの細胞内サイトカイン染色は、刺激ＣＤ８＋細胞が、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１による刺激時にＣＤ１０７ａ発現亢進（右）に加えて、ＩＦＮ－γおよびＴＦＮ－αの両方の発現亢進（左）を示したように、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した。Ｃ．健常ドナー由来のＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１パルスＨＬＡ－Ａ２＋標的細胞を死滅させたが、非パルス細胞およびペプチドパルスＨＬＡ－Ａ３＋標的細胞は死滅されなかった。Ｄ．ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋ＴＧＦｂ１発現ＵＫＥ－１標的細胞を死滅させたが、ＭＡＲＩＭＯおよびＷＭ８５２細胞は死滅されなかった。Ｅ．ＨＬＡ－Ａ２＋ＴＨＰ－１細胞は、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的Ｔ細胞により容易に死滅されたが、アッセイの４８時間前における異なるサイトカインでの刺激によるＴＨＰ－１細胞のＴＧＦｂ１発現の調節は、死滅標的細胞の画分を増加させた。
【0020】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＴＧＦｂ１全長前駆体（ＴＧＦｂ１プレタンパク質ともいう）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＴＧＦｂ１のシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＴＧＦｂ１のＬＡＰペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４は、成熟ヒトＴＧＦｂ１のアミノ酸配列である。
配列番号５～６４はそれぞれ、ヒトＴＧＦｂ１由来のポリペプチド断片のアミノ酸配列である。
配列番号６５は、高頻度の免疫原性配列を含むＬＡＰサブ領域のアミノ酸配列である。
配列番号６６は、ＴＧＦｂ－１５ペプチド配列（配列番号２８）内の最小エピトープ配列のアミノ酸配列である。配列番号６６は、本明細書において「ＴＧＦｂ－１５ｓｈｏｒｔ」ともいう。
配列番号６７は、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１のアミノ酸配列である。
配列番号１は、ヒトＴＧＦｂ１全長前駆体（ＴＧＦｂ１プレタンパク質ともいう）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＴＧＦｂ１のシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＴＧＦｂ１のＬＡＰペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４は、成熟ヒトＴＧＦｂ１のアミノ酸配列である。
配列番号５～６４はそれぞれ、ヒトＴＧＦｂ１由来のポリペプチド断片のアミノ酸配列である。
配列番号６５は、高頻度の免疫原性配列を含むＬＡＰサブ領域のアミノ酸配列である。
配列番号６６は、ＴＧＦｂ－１５ペプチド配列（配列番号２８）内の最小エピトープ配列のアミノ酸配列である。配列番号６６は、本明細書において「ＴＧＦｂ－１５ｓｈｏｒｔ」ともいう。
配列番号６７は、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１のアミノ酸配列である。
【0021】
発明の詳細な説明
開示される製品および方法の異なる適用が、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
開示される製品および方法の異なる適用が、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【0022】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容によって別途明確に規定されない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ポリペプチド(a polypeptide)」に対する言及は、「複数のポリペプチド(polypeptides)」などを含む。
【0023】
本明細書において、「ポリペプチド」は、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド疑似の化合物を指すように使用される。よって、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列と、より長いポリペプチドおよびタンパク質も包含する。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体の両方を含む、天然および／もしくは非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれか、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド疑似を指す。
【0024】
用語「患者」および「対象」は、互換的に使用され、通常はヒトを指す。
【0025】
上記または下記を問わず、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。
【0026】
本明細書における「免疫原性」とは、好ましくは、ＴＧＦｂ１タンパク質が、ＴＧＦｂ１タンパク質を発現する細胞内または細胞上に存在する場合に、ポリペプチドがＴＧＦｂ１タンパク質に対する免疫応答を誘発できることを意味する。言い換えれば、ポリペプチドは、ＴＧＦｂ１に対して免疫原性であると説明され得る。あるいは、ポリペプチドは、ＴＧＦｂ１の免疫原性断片として説明され得る。免疫応答は、好ましくは、Ｔ細胞応答であり、ポリペプチドはＴ細胞エピトープを含むＴＧＦｂ１の免疫原性断片として説明され得る。免疫応答は、個体（または個体から採取したサンプル）に対するポリペプチドの投与後、少なくとも１つの個体（または前記サンプル）において検出され得る。
【0027】
ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を含む任意の適切な方法を用いて、免疫原性であると同定することができる。例えば、ペプチドは、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の特徴のうち少なくとも１つを有する場合、免疫原性であると同定することができる：
ｉ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定された場合、健常対象および／または癌患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ－γ産生細胞を誘発することができる；および／または
ｉｉ．ＴＧＦｂ１と反応性であるＣＴＬの腫瘍組織のサンプルにおいてｉｎ ｓｉｔｕで検出することができる；および／または
ｉｉｉ．特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を誘導することができる。
ポリペプチドが免疫原性であるかどうかを決定するのに適切な方法も、以下の実施例の項で説明される。
ｉ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定された場合、健常対象および／または癌患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ－γ産生細胞を誘発することができる；および／または
ｉｉ．ＴＧＦｂ１と反応性であるＣＴＬの腫瘍組織のサンプルにおいてｉｎ ｓｉｔｕで検出することができる；および／または
ｉｉｉ．特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を誘導することができる。
ポリペプチドが免疫原性であるかどうかを決定するのに適切な方法も、以下の実施例の項で説明される。
【0028】
本発明のポリペプチドは、配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなるヒトＴＧＦｂ１（配列番号１）の免疫原性断片である。
【0029】
配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列は、ＴＧＦｂ１のＳＰドメインの少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列、例えば、配列番号２の少なくとも９５個の連続したアミノ酸の配列に対応し得る。
【0030】
配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列は、ＴＧＦｂ１のＬＡＰドメインの少なくとも９個のアミノ酸の配列、例えば、配列番号３の少なくとも９個の連続したアミノ酸に対応し得る。
【0031】
配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列は、配列番号１のアミノ酸の１２１および１６０位に結合したＬＡＰサブ領域内に位置する少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列、例えば、配列番号６５の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列に対応し得る。
【0032】
配列番号１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列は、成熟ＴＧＦｂ１ポリペプチドの少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列、例えば、配列番号４の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列に対応し得る。
【0033】
ポリペプチドは、配列番号１の最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含んでもよいまたはそれからなってもよい。
【0034】
ポリペプチドは、配列番号２および５～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなってもよい。
【0035】
ポリペプチドは、配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、６３、５、７～９、４３～４５、１３～１５、２４～２６、２９～３１、５０～５２、５６～５８、６４、６５、２、６６、６または５のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなってもよい。配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、６３、６６、６７または５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなるポリペプチドが好ましい。
【0036】
ポリペプチドは、配列番号６６、２８～３１、６７、５～９、４２～４５、１２～１５、５５～５８、２３～２６、４９～５２、６３、６４、６５または２のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよいまたはそれからなる。配列番号６６、２８、６７、５、６、４２、１２、５５、２３、４９または６３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるポリペプチドが、特に好ましい。
【0037】
ポリペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の最大長を有してもよい。ポリペプチドのＣ末端アミノ酸は、対応するアミドに置換されてもよい。ポリペプチドは、単離されてもよい。
【0038】
特に好ましいポリペプチドは、配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、または６３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号６６、２８、６７、５、６、４２、１２、５５、２３、４９または６３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。これらの配列を組み込む配列番号１のより長いポリペプチド断片も好ましい。
【0039】
ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを含んでもよい。好ましくは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープは、配列番号６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。配列番号６６のアミノ酸配列からなるＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを含む好ましいペプチドは、配列番号２８～３１または６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなるペプチドである。あるいは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープは、好ましくは、配列番号６７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。配列番号６７のアミノ酸配列からなるＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを含む好ましいペプチドは、配列番号５、８、９または２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなるペプチドである。
【0040】
本明細書に記載の任意のポリペプチドにおいて、修飾配列を有するポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、ＴＧＦｂ１に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、アミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個、または５個（すなわち、最大５個）の付加、欠失または置換によって修飾されてもよい。「同等」とは、修飾配列のポリペプチドが、非修飾配列のポリペプチドと比較して、ＴＧＦｂ１に対する有意に低減した免疫原性を示さないことであると理解されるべきである。配列間の免疫原性のいずれの比較も、同じアッセイを使用して実施すべきである。特に断りのない限り、ポリペプチド配列に対する修飾は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換では、アミノ酸が、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸と置き換えられる。導入されたアミノ酸は、置き換わるアミノ酸と、類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換では、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は、当技術分野で周知であり、下記の表Ａ１に定義される２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択してもよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２におけるアミノ酸側鎖に関する疎水性親水性指標を参照することによって、決定することができる。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
本明細書に開示される任意のポリペプチドにおいて、ポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、ＴＧＦｂ１に対する同等または増大した免疫原性を示すならば、生理化学的特性（例えば、安定性）を改善するために、以下の修飾のうちいずれか１つ以上を行ってもよい：
Ｃ末端アミノ酸の対応するアミドとの置換（カルボキシペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
Ｎ末端アミノ酸の対応するアシル化アミノ酸との置換（アミノペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
１つ以上のアミノ酸の対応するメチル化アミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）；および／または
１つ以上のアミノ酸のＤ－立体配置の対応するアミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）。
Ｃ末端アミノ酸の対応するアミドとの置換（カルボキシペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
Ｎ末端アミノ酸の対応するアシル化アミノ酸との置換（アミノペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
１つ以上のアミノ酸の対応するメチル化アミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）；および／または
１つ以上のアミノ酸のＤ－立体配置の対応するアミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）。
【0044】
本明細書に開示される任意のポリペプチドは、前記ポリペプチドが、さらなる部分を欠くポリペプチドと比較して、ＴＧＦｂ１に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、溶解性、安定性を改善するため、および／または製造／単離の一助となるために、少なくとも１つの付加的な部分をＮおよび／またはＣ末端に付着させてもよい。適切な部分としては、親水性アミノ酸が挙げられる。例えば、アミノ酸配列ＫＫ、ＫＲまたはＲＲを、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加させてもよい。他の適切な部分としては、アルブミンまたはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が挙げられる。
【0045】
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の適切な手段によって製造することができる。例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的な技法、例えば、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学または液相ペプチド合成を使用して、直接合成してもよい。あるいは、ポリペプチドは、細胞、通常は細菌細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターで形質転換することによって、製造してもよい。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびベクターを提供する。本発明はまた、このような核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0046】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの限定されない例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲の培地からのポリペプチドの実質的な、しかし完全ではない単離があり得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、それらの使用目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、例えば、発現ベクターにおける適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的で、このような核酸配列としては、限定されるものではないが、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡ由来のゲノム配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。
【0047】
ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)における例により説明されるように、当技術分野で周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入配列に動作可能に連結された調節配列を含み、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける本発明のポリペプチドの発現を可能とする発現カセットの形態で提供され得る。次に、これらの発現カセットは、通常は、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。このような発現カセットは、宿主対象に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを用いて調製および／または投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運び、本発明のポリペプチドの発現を可能とすることができる任意のベクターであり得る。
【0048】
したがって、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で慣例的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、例えば、本発明のペプチドの発現を可能とするために、必要であり得る、および正確な方向で位置するポリアデニル化シグナルの使用が関与し得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかであろう。この点に関するさらなる例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)を参照する。
【0049】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように改変されている細胞を包含する。このような細胞は、通常は、細菌細胞、例えば大腸菌などの原核細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを製造するために、慣用的な方法を用いて培養してもよい。
【0050】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。本発明のポリペプチドは、使用目的を妨げない担体、保存剤、もしくは希釈剤、および／またはアジュバントと混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、本発明のポリペプチドは、一般に、製剤中に少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％のタンパク質を含む。
【0051】
ポリペプチドを含む組成物
本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドおよび／または本発明の１つ以上のポリヌクレオチドと、任意で少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容可能な担体、保存剤および／または賦形剤とを含む組成物を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドおよび／または本発明の１つ以上のポリヌクレオチドと、任意で少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容可能な担体、保存剤および／または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【0052】
組成物は、本発明の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つの異なるポリペプチド、および任意で少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容可能な担体、保存剤および／または賦形剤を含み得る。
【0053】
組成物は、本発明の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つの異なるポリヌクレオチド、および任意で少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容可能な担体、保存剤および／または賦形剤を含み得る。
【0054】
担体、保存剤および賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、および組成物が投与される対象にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。通常は、すべての成分および最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、好ましくは、アジュバントを含み得る。アジュバントは、組成物へのその混合が、組成物により誘発される免疫応答を増大またはそうでなければ修飾する、任意の物質である。広く定義されるアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。アジュバントはまた、投与部位からの有効薬剤の緩徐かつ持続した放出ももたらすという点で、好ましくは、デポ効果を有し得る。アジュバントに関する一般的な考察は、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986) 61-63頁において提供されている。
【0055】
アジュバントは、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＤＭＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ノル－ＭＤＰともいう）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥともいう）、２％スクアレン／ツイーン－８０．ＲＴＭ．エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含むリポ多糖およびその種々の誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、およびブルセラ属のメンバーに認められる物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ５８７６７および５，５５４，３７２を参照のこと）、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ－５１およびＱＳ－２１からなる群から選択され得る。種々のサポニン抽出物も、免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）も、アジュバントとして使用してもよい。
【0056】
本発明とともに使用される好ましいアジュバントとしては、油／界面活性剤ベースのアジュバント、例えば、モンタニドアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ社、ベルギーから入手可能）、好ましくは、モンタニドＩＳＡ－５１が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントである。さらに他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、例えば、ポリＩ：Ｃである。ＧＭ－ＣＳＦおよびイミダゾキニリン（Imidazochiniline）も、好ましいアジュバントの例である。
【0057】
アジュバントは、最も好ましくは、モンタニドＩＳＡアジュバントである。モンタニドＩＳＡアジュバントは、好ましくは、モンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０である。
【0058】
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986)61-63頁において、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が不十分な場合、免疫原性担体へのカップリングが推奨されることも記載されている。したがって、本発明のポリペプチドを、担体にカップリングしてもよい。担体は、アジュバントと独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、活性もしくは免疫原性を増大させるため、安定性を付与するため、生物活性を増大させるため、または血清中半減期を増大させるために、ポリペプチド断片の分子量を増加させることであり得る。さらに、担体は、ポリペプチドまたはその断片をＴ細胞に提示する助けとなり得る。したがって、組成物において、ポリペプチドは、以下に記載するような担体と会合し得る。担体は、当業者に公知の任意の適切な担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）であり得る。担体タンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン等）、またはホルモン（インスリン等）またはパルミチン酸が挙げられる。あるいは、担体タンパク質は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドであり得る。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。担体は、ヒトに対して生理学的上許容可能であり、安全でなければならない。
【0059】
組成物が賦形剤を含む場合、賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、およびそのレシピエントにとって有害ではないという意味で、「薬学上許容可能」でなければならない。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが、賦形剤中に存在してもよい。これらの賦形剤および補助物質は、一般に、組成物を投与される個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与することができる医薬品である。薬学上許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノール等の液体が挙げられる。薬学上許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も含まれ得る。薬学上許容可能な賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の完全な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手可能である。
【0060】
適切な組成物の処方は、標準的な医薬処方化学および方法（これらはすべて、当業者にとって容易に入手可能である）を用いて、実施することができる。このような組成物は、ボーラス投与または連続投与にとって適切な形態で、調製、包装、または販売され得る。注射用組成物は、単位投与形、例えば、アンプルまたは場合により保存剤を含有する多回投与容器で、調製、包装、または販売され得る。組成物としては、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および埋込み型徐放性製剤または生分解性製剤が挙げられる。組成物の一つの実施形態において、有効成分は、再構成された組成物の投与前に、適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するために、乾燥（例えば、粉末または顆粒）形態で提供される。組成物は、無菌注射用の水性または油性の懸濁液または溶液の形態で、調製、包装、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って処方され得、有効成分に加えて、本明細書に記載のアジュバント、賦形剤および補助物質等の追加の成分を含み得る。このような無菌注射用製剤は、例えば、水または１，３－ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤および溶媒としては、限定されるものではないが、リンゲル液、等張食塩水、および、合成モノまたはジグリセリド等の固定油が挙げられる。有用な他の組成物としては、微結晶形で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として、有効成分を含む組成物が挙げられる。徐放または埋込みのための組成物は、薬学上許容可能なポリマー性または疎水性材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩を含み得る。あるいは、組成物の有効成分は、カプセル化され得る、粒子状担体に吸着され得る、または粒子状担体と会合し得る。適切な粒子状担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来する担体、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）に由来するＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。他の微粒子系およびポリマー、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンなどのポリマー、およびこれらの分子のコンジュゲートも使用することができる。
【0061】
使用方法
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは組成物、またはそれらの組合せは、対象における疾患または病態を治療または予防する方法において使用してもよい。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは組成物、またはそれらの組合せは、対象における疾患または病態を治療または予防する方法における使用のための薬剤の製造において使用してもよい。方法は、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記組成物、または前記組合せを前記対象に投与することを含む。投与は、それを必要とする対象に対する治療上または予防上有効な量の前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記組成物、または前記組合せの投与であってもよい。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは組成物、またはそれらの組合せは、対象における疾患または病態を治療または予防する方法において使用してもよい。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは組成物、またはそれらの組合せは、対象における疾患または病態を治療または予防する方法における使用のための薬剤の製造において使用してもよい。方法は、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記組成物、または前記組合せを前記対象に投与することを含む。投与は、それを必要とする対象に対する治療上または予防上有効な量の前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記組成物、または前記組合せの投与であってもよい。
【0062】
疾患または病態は、ＴＧＦｂ１の不適切なまたは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とし得る。疾患または病態は、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の不適切なまたは過剰な発現を少なくとも部分的に特徴とし得る。疾患または病態は、癌、好ましくは、ＴＧＦｂ１を発現する、ならびに／あるいはＴＧＦｂ１の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能および／またはＩＬ－４および／もしくはＩＬ－１３の不適切なもしくは過剰な発現と関連する癌であり得る。癌は、乳癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌もしくは膵臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、黒色腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、または前立腺癌であり得る。癌は、ＴＧＦｂ１の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能ならびに／またはＩＬ－４および／もしくはＩＬ－１３の不適切なもしくは過剰な発現を特徴とするＡＭＬであり得る。癌は、ＴＧＦｂ１の不適切なまたは過剰な免疫抑制機能ならびにＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の不適切なまたは過剰な発現を特徴とするＡＭＬであり得る。
【0063】
方法は、追加の癌療法との同時投与または逐次投与を含んでもよい。追加の癌療法は、ＴＧＦｂ（例えば、ＴＧＦｂ１）およびＰＤ－Ｌ１の二重特異性阻害剤であり得る。前記二重特異性阻害剤は、ＴＧＦｂおよびＰＤ－Ｌ１に同時に結合する、および／またはそれらの活性を阻害することが可能であり得る。前記二重特異性阻害剤は、抗ＴＧＦｂ部分および抗ＰＤ－Ｌ１部分を含む融合タンパク質であってもよく、場合によりここで、抗ＰＤ－Ｌ１部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むもしくはそれからなり、かつ／または抗ＴＧＦｂ部分は、ＴＧＦｂに対する受容体もしくはその部分、例えば、ＴＧＦｂ受容体ＩＩもしくはその部分を含むもしくはそれからなる。
【0064】
追加の癌療法は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質、遺伝子療法、または抗体から選択され得る。
【0065】
抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシズマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、ドゥリゴツマブ、デュピルマブ、ドゥシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルピリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（＝トレメリムマブ）、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（＝アトリズマブ）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブまたはゾリモマブアリトクスであり得る。
【0066】
好ましい抗体としては、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アレファセプト、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、エクリズマブ、オマリズマブ、カナキヌマブ、メポリズマブ、レスリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブおよびベドチンが挙げられる。
【0067】
本発明の方法において使用され得る特に好ましい抗体としては、ダラツムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブおよびオファツムマブが挙げられる。
【0068】
併用する癌療法は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンからなる群から選択され得る。
【0069】
本発明のポリペプチドおよび／または少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む本発明の組成物は、細胞を前記ポリペプチドおよび／または前記組成物に接触させることを含む、ＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する方法においても使用され得る。方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。細胞は、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、例えば、腫瘍サンプル中に存在し得る。
【0070】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、保護の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。前述の説明および以下の実施例に開示される特徴は、両方とも別々に、またその任意の組合せにおいて、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【実施例】
【0071】
実施例１ － 材料と方法
患者およびドナー
匿名の血液ドナー由来のバフィーコートを、Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ、コペンハーゲン、デンマークにおける血液バンクから得た。癌患者由来のバフィーコートを、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｒｌｅｖ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ヘアレウ、デンマークから得た。全参加者が、ヘルシンキ宣言に従って、試験登録前にインフォームドコンセントを提供した。ＰＢＭＣをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ社、オスロ、ノルウェー）を用いて単離し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含有するウシ胎仔血清中で凍結させた。
患者およびドナー
匿名の血液ドナー由来のバフィーコートを、Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ、コペンハーゲン、デンマークにおける血液バンクから得た。癌患者由来のバフィーコートを、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｒｌｅｖ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ヘアレウ、デンマークから得た。全参加者が、ヘルシンキ宣言に従って、試験登録前にインフォームドコンセントを提供した。ＰＢＭＣをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ社、オスロ、ノルウェー）を用いて単離し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含有するウシ胎仔血清中で凍結させた。
【0072】
ペプチド
ペプチドは、Ｐｅｐｓｃａｎ社（レリスタット、オランダ）により提供され、１０ｍＭの濃度のＤＭＳＯに溶解した。ＴＧＦβ１リードエピトープの同定後、これらのペプチドは、ＫＪ Ｒｏｓｓ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ社（クランペンボー、デンマーク）によって、より高い純度（＞９０％）で提供された。これらの実験に使用したペプチドの配列は、「配列」という表題の項に示す。ペプチドは、配列番号、名称、またはヒトＴＧＦｂ１の全長前駆体のアミノ酸配列内の各ペプチド配列の開始位置および終了位置の参照により記載している。各表示は、以下の「配列」の項に記載の表に示されるように、互換的に使用され得る。例えば、配列番号６のペプチドは、これに代えて名称ＴＧＦｂ－０２（またはＴＧＦＢ０２）と表示されてもよいし、またはこれに代えてＴＧＦｂ１１１－３０（１１の開始位置および３０の終了位置より）と表示されてもよい。各場合における意図する参照は、文脈から明らかとなるであろう。
ペプチドは、Ｐｅｐｓｃａｎ社（レリスタット、オランダ）により提供され、１０ｍＭの濃度のＤＭＳＯに溶解した。ＴＧＦβ１リードエピトープの同定後、これらのペプチドは、ＫＪ Ｒｏｓｓ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ社（クランペンボー、デンマーク）によって、より高い純度（＞９０％）で提供された。これらの実験に使用したペプチドの配列は、「配列」という表題の項に示す。ペプチドは、配列番号、名称、またはヒトＴＧＦｂ１の全長前駆体のアミノ酸配列内の各ペプチド配列の開始位置および終了位置の参照により記載している。各表示は、以下の「配列」の項に記載の表に示されるように、互換的に使用され得る。例えば、配列番号６のペプチドは、これに代えて名称ＴＧＦｂ－０２（またはＴＧＦＢ０２）と表示されてもよいし、またはこれに代えてＴＧＦｂ１１１－３０（１１の開始位置および３０の終了位置より）と表示されてもよい。各場合における意図する参照は、文脈から明らかとなるであろう。
【0073】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴに関して、癌患者および健常ドナー由来のＰＢＭＣを、２４ウェルプレート中で、２０μＭのＴＧＦβ由来ペプチド（または対照としてペプチドなし）および１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２で７～１０日間パルスした後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。細胞を、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、ＭＳＩＰＮ４Ｗ５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に播種した。ＴＧＦβペプチドを加え、終濃度５μＭとし、対照刺激（ＤＭＳＯ、ＨＩＶまたはスクランブルペプチド）を対照ウェルに加え、プレートを３７℃で１６～２０時間インキュベートする。インキュベーションの後、細胞を洗い流し、二次ビオチン化Ａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３４２０－６－１０００）を室温で２時間加えた。非結合二次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３３１０－１０）を室温で１時間加えた。非結合複合酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６５０－１０）を加えることにより、アッセイを展開した。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ５．１を用いて、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、ＴＧＦβペプチドで刺激したウェルおよびペプチド添加なしのウェルにおけるスポットの平均数間の差として報告した。特に断りのない限り、総ての実験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで実施し、総ての実験は、三重反復で実施した。統計解析は、分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法を用いて、かつＭｏｏｄｉｅら(Cancer Immunol Immunother 2010; 59: 1489-1501)により記載されたより古典的なＤＦＲ２ｘ法を用いて行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴに関して、癌患者および健常ドナー由来のＰＢＭＣを、２４ウェルプレート中で、２０μＭのＴＧＦβ由来ペプチド（または対照としてペプチドなし）および１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２で７～１０日間パルスした後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。細胞を、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、ＭＳＩＰＮ４Ｗ５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に播種した。ＴＧＦβペプチドを加え、終濃度５μＭとし、対照刺激（ＤＭＳＯ、ＨＩＶまたはスクランブルペプチド）を対照ウェルに加え、プレートを３７℃で１６～２０時間インキュベートする。インキュベーションの後、細胞を洗い流し、二次ビオチン化Ａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３４２０－６－１０００）を室温で２時間加えた。非結合二次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３３１０－１０）を室温で１時間加えた。非結合複合酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６５０－１０）を加えることにより、アッセイを展開した。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ５．１を用いて、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、ＴＧＦβペプチドで刺激したウェルおよびペプチド添加なしのウェルにおけるスポットの平均数間の差として報告した。特に断りのない限り、総ての実験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで実施し、総ての実験は、三重反復で実施した。統計解析は、分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法を用いて、かつＭｏｏｄｉｅら(Cancer Immunol Immunother 2010; 59: 1489-1501)により記載されたより古典的なＤＦＲ２ｘ法を用いて行った。
【0074】
ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
癌患者または健常ドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ培地（任意で：１μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを添加）中で２４ウェルプレートにおいて一晩静置する。翌日、細胞を計数し、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、ＭＳＩＰＮ４Ｗ５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移す。ＴＧＦβペプチドを加え、終濃度５μＭとし、対照刺激（ＤＭＳＯ、ＨＩＶまたはスクランブルペプチド）を対照ウェルに加え、プレートを３７℃で２４～７２時間インキュベートする。プレートを二次抗体で染色し、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴプロトコールに従って展開プロトコールを実施する。
癌患者または健常ドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ培地（任意で：１μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを添加）中で２４ウェルプレートにおいて一晩静置する。翌日、細胞を計数し、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＩＰ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、ＭＳＩＰＮ４Ｗ５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移す。ＴＧＦβペプチドを加え、終濃度５μＭとし、対照刺激（ＤＭＳＯ、ＨＩＶまたはスクランブルペプチド）を対照ウェルに加え、プレートを３７℃で２４～７２時間インキュベートする。プレートを二次抗体で染色し、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴプロトコールに従って展開プロトコールを実施する。
【0075】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
ＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ペプチド刺激の最初の１時間の後に加えた）の存在下でＴＧＦβ由来ペプチドで５時間刺激した（または対照としてペプチドなしでインキュベートした）後、細胞培養物の細胞内染色を行った。ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（カタログ番号５５５８０１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）抗体を、インキュベーションの最初に加える。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に関して蛍光標識抗体で染色し、その後、製造業者の説明書に従って、固定／透過処理富化物および希釈剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３および００－５２２３－５６）の混合物を使用して、透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに関して蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。使用した抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ（カタログ番号３４１１１７）、ＴＮＦα－４５５ ＢＶ４２１（カタログ番号５６２７８３）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４７４１３）またはＣＤ４－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７０）、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７４）またはＣＤ８－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４５７７２）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（カタログ番号５６０２７５）（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。死細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で染色した。活性型Ｔ細胞を同定する別の方法として、Ｔ細胞を抗原または標的細胞のいずれかで一晩刺激した。刺激の１８～２４時間後、細胞を、抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥおよび抗ＣＤ１３７－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）での染色とともに、上記の表面抗原特異的抗体およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎで染色した。適切なアイソタイプ対照を用いた抗ＨＬＡ－Ａ２－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）での染色により、ドナーＰＢＭＣをＨＬＡ－Ａ２に関して分析した。
ＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ペプチド刺激の最初の１時間の後に加えた）の存在下でＴＧＦβ由来ペプチドで５時間刺激した（または対照としてペプチドなしでインキュベートした）後、細胞培養物の細胞内染色を行った。ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（カタログ番号５５５８０１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）抗体を、インキュベーションの最初に加える。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に関して蛍光標識抗体で染色し、その後、製造業者の説明書に従って、固定／透過処理富化物および希釈剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３および００－５２２３－５６）の混合物を使用して、透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに関して蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。使用した抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ（カタログ番号３４１１１７）、ＴＮＦα－４５５ ＢＶ４２１（カタログ番号５６２７８３）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４７４１３）またはＣＤ４－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７０）、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７４）またはＣＤ８－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４５７７２）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（カタログ番号５６０２７５）（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。死細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で染色した。活性型Ｔ細胞を同定する別の方法として、Ｔ細胞を抗原または標的細胞のいずれかで一晩刺激した。刺激の１８～２４時間後、細胞を、抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥおよび抗ＣＤ１３７－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）での染色とともに、上記の表面抗原特異的抗体およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎで染色した。適切なアイソタイプ対照を用いた抗ＨＬＡ－Ａ２－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）での染色により、ドナーＰＢＭＣをＨＬＡ－Ａ２に関して分析した。
【0076】
急速増幅プロトコール
いくつかの実験において、少なくとも３例の異なる健常ドナー由来の同種異系照射末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ社またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）および高用量のＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ）を用いた急速増幅プロトコール（ＲＥＰ）を使用して、Ｔ細胞を増幅した。
いくつかの実験において、少なくとも３例の異なる健常ドナー由来の同種異系照射末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ社またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）および高用量のＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ）を用いた急速増幅プロトコール（ＲＥＰ）を使用して、Ｔ細胞を増幅した。
【0077】
生細胞のＦＡＣＳ
初代ＰＢＭＣ培養物からの特異的Ｔ細胞の富化のために、ＥＬＩＳＰＯＴにおける分析用の細胞培養物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法を採用した（上記参照）。次に、細胞を抗原で一晩刺激し、翌日、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）、抗ＣＤ４－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥおよび抗ＣＤ１３７－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で３０分間染色した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、適切なアプリケーション設定およびコンペンセーションコントロールを用いたＦＡＣＳ ＡＲＩＡフローサイトメーターで、細胞をソーティングした。セルソーティングは、純度設定を用いて行った。ソーティングの後、細胞を２つの画分に分け、富化細胞の半分は、急速増幅プロトコールを用いて増幅し、細胞のもう半分は、３個／ウェルの播種による、限界希釈を用いてクローン化した。クローン化した細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。
初代ＰＢＭＣ培養物からの特異的Ｔ細胞の富化のために、ＥＬＩＳＰＯＴにおける分析用の細胞培養物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法を採用した（上記参照）。次に、細胞を抗原で一晩刺激し、翌日、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）、抗ＣＤ４－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥおよび抗ＣＤ１３７－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で３０分間染色した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、適切なアプリケーション設定およびコンペンセーションコントロールを用いたＦＡＣＳ ＡＲＩＡフローサイトメーターで、細胞をソーティングした。セルソーティングは、純度設定を用いて行った。ソーティングの後、細胞を２つの画分に分け、富化細胞の半分は、急速増幅プロトコールを用いて増幅し、細胞のもう半分は、３個／ウェルの播種による、限界希釈を用いてクローン化した。クローン化した細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。
【0078】
磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）
ＭＡＣＳを用いて、初代培養物およびすでに富化された培養物の両方に由来する抗原特異的Ｔ細胞を富化した。初代ＰＢＭＣ培養物に由来する特異的Ｔ細胞の富化には、ＥＬＩＳＰＯＴにおける分析用の細胞培養物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法を採用した（上記参照）。次に、細胞を抗原で一晩刺激し、翌日、製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＣＳ ＣＤ１３７富化キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いて富化した。富化細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。記載されている場合、富化細胞のいくつかを限界希釈によりクローン化した。クローン化した細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。
ＭＡＣＳを用いて、初代培養物およびすでに富化された培養物の両方に由来する抗原特異的Ｔ細胞を富化した。初代ＰＢＭＣ培養物に由来する特異的Ｔ細胞の富化には、ＥＬＩＳＰＯＴにおける分析用の細胞培養物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法を採用した（上記参照）。次に、細胞を抗原で一晩刺激し、翌日、製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＣＳ ＣＤ１３７富化キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いて富化した。富化細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。記載されている場合、富化細胞のいくつかを限界希釈によりクローン化した。クローン化した細胞は、急速増幅プロトコールを用いて増幅した。
【0079】
クロム５１細胞傷害性アッセイおよび標的細胞のサイトカイン刺激
クロム５１細胞傷害性アッセイを用いて、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＭＨら(J Immunol 1999; 163: 3812-3818)に記載の通りに、特異的Ｔ細胞の殺傷能を評価した。いくつかの癌細胞株におけるＴＧＦβの発現を操作するために、癌細胞株を、ＩＬ－４（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－１３（２０Ｕ／ｍＬ）、およびＴＧＦβ１（２．ｅ５ｎｇ／ｍＬ）（総てＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ロッキー・ヒル、ニュージャージー州、米国）を単独でまたは組み合わせてのいずれかで、アッセイ前に４８時間刺激した。
クロム５１細胞傷害性アッセイを用いて、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＭＨら(J Immunol 1999; 163: 3812-3818)に記載の通りに、特異的Ｔ細胞の殺傷能を評価した。いくつかの癌細胞株におけるＴＧＦβの発現を操作するために、癌細胞株を、ＩＬ－４（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－１３（２０Ｕ／ｍＬ）、およびＴＧＦβ１（２．ｅ５ｎｇ／ｍＬ）（総てＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ロッキー・ヒル、ニュージャージー州、米国）を単独でまたは組み合わせてのいずれかで、アッセイ前に４８時間刺激した。
【0080】
実施例２ － ２０ｍｅｒペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴスクリーニング
全長ＴＧＦｂ１前駆体に由来する３８個の重複する２０ｍｅｒペプチドのアレイを設計し、上記のように作製した。２０ｍｅｒペプチドの各々は、１０個のアミノ酸が重複している（図１４参照）。
全長ＴＧＦｂ１前駆体に由来する３８個の重複する２０ｍｅｒペプチドのアレイを設計し、上記のように作製した。２０ｍｅｒペプチドの各々は、１０個のアミノ酸が重複している（図１４参照）。
【0081】
６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、三重反復ウェルで、２０ｍｅｒペプチドのアレイに対する自発的免疫応答に関して評価した。これらのアッセイの結果を図１Ａ～Ｃに示す。最も強く、かつ最も統計学的に有意な応答を誘発したペプチドを、さらなるスクリーニング実験のために選択した。最もパフォーマンスの良いペプチドの識別番号を図１Ｄにまとめて記載し、全長配列内の前記ペプチドの位置を図１Ｅに示す。
【0082】
意外にも、免疫原性ペプチドは、単一の免疫原性「ホットスポット」内にクラスター化されている、または成熟ＴＧＦｂ１ペプチドのアミノ酸配列内に位置しているのではなく、ＴＧＦｂ１前駆体タンパク質の全長配列の至る所に位置していたことが認められた。注目すべきことに、免疫原性エピトープペプチドは、ＴＧＦｂ１の成熟活性型においては存在しないＴＧＦｂ１前駆体のシグナルペプチド領域およびＬＡＰペプチドと同定された。さらに、高頻度の免疫原性ペプチドを有するＬＡＰサブ領域、すなわち、配列番号１のアミノ酸１２１～１６０（配列番号６５に対応）が同定された。この領域は、免疫原性ペプチド：ＴＧＦｂ－１３およびＴＧＦｂ－１５を含む。
【0083】
８個の最も免疫原性のペプチド、すなわち、ＴＧＦｂ－０２、ＴＧＦｂ－２６、ＴＧＦｂ－０５、ＴＧＦｂ－１３、ＴＧＦｂ－１５、ＴＧＦｂ－３０、ＴＧＦｂ－３３、およびＴＧＦｂ－３８（それぞれ配列番号６、４２、１２、２３、２８、４９、５５、および６３に対応）を、さらなる検討のために選択した。
【0084】
実施例３ － ペプチド特異的免疫応答の検証
追加のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、最初の選別において同定された８個の選択されたエピトープペプチド（実施例２参照）に対する、追加の健常対象における応答を検証した。これらのアッセイの結果を図２に示す。試験したエピトープペプチドの総てに対する強力かつ高頻度の応答が認められ、ＴＧＦｂ－０２、ＴＧＦｂ－２６、ＴＧＦｂ－３３、および特にＴＧＦｂ－１５が、強力かつ高頻度の応答を示している（図２Ｂ）。
追加のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、最初の選別において同定された８個の選択されたエピトープペプチド（実施例２参照）に対する、追加の健常対象における応答を検証した。これらのアッセイの結果を図２に示す。試験したエピトープペプチドの総てに対する強力かつ高頻度の応答が認められ、ＴＧＦｂ－０２、ＴＧＦｂ－２６、ＴＧＦｂ－３３、および特にＴＧＦｂ－１５が、強力かつ高頻度の応答を示している（図２Ｂ）。
【0085】
健常対象および癌患者は、エピトープに対する免疫応答の異なるパターンを示し得るため、癌患者における選択されたエピトープの免疫原性能も検討した。８個の免疫原性ＴＧＦｂ１由来ペプチドに対するＰＢＭＣにおけるペプチド特異的免疫応答も、再度ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより応答を評価することによって、癌患者を調べることにより検証した。これらのアッセイの結果を図３に示す。ＴＧＦｂ－０２、ＴＧＦｂ－１５、ＴＧＦｂ－２６、およびＴＧＦｂ－３３が、患者において高度に免疫原性であることが認められた（図３Ｂ）。
【0086】
実施例４ － サイトカイン分析
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析を実施し、ＴＧＦｂ１エピトープに応答するＴ細胞の機能性をさらに特徴付けた。この例では、健常ドナー（ＢＣ－Ｍ－４１）由来のＰＢＭＣを、アッセイの１３日前に解凍し、ＴＧＦｂ－０２（配列番号６）で刺激した。培養を実施した１日後（１２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＣＳを実施する３日前（６０Ｕ／ｍＬ）に、ＩＬ－２を加えた。ＦＡＣＳ分析を実施し、生細胞集団をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞画分またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞画分に基づきゲーティングした。サイトカイン発現（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の発現量ならびに細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ）に関するマーカーを定量化した。サイトカイン分析に関するＦＡＣＳプロットを図４の左側に示し、一方、各集団のパーセンテージを、図４の右の階層表にまとめる。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析を実施し、ＴＧＦｂ１エピトープに応答するＴ細胞の機能性をさらに特徴付けた。この例では、健常ドナー（ＢＣ－Ｍ－４１）由来のＰＢＭＣを、アッセイの１３日前に解凍し、ＴＧＦｂ－０２（配列番号６）で刺激した。培養を実施した１日後（１２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＣＳを実施する３日前（６０Ｕ／ｍＬ）に、ＩＬ－２を加えた。ＦＡＣＳ分析を実施し、生細胞集団をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞画分またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞画分に基づきゲーティングした。サイトカイン発現（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の発現量ならびに細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ）に関するマーカーを定量化した。サイトカイン分析に関するＦＡＣＳプロットを図４の左側に示し、一方、各集団のパーセンテージを、図４の右の階層表にまとめる。
【0087】
ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞画分（ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞画分ではない）は、ＣＤ１０７ａの無／低発現を伴うＴＮＦα（単独でまたはＩＦＮγと組み合わせてのいずれか）の分泌により示されるように、ＴＧＦｂ－０２（配列番号６）に対して反応性であることが認められた。
【0088】
ＩＣＳも用いて、エピトープＴＧＦｂ－０５（配列番号１２）およびＴＧＦｂ－２６（配列番号４２）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（図５Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答（図５Ｂ）の両方を惹起したことを示した。磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）による特異的細胞の富化後に、リードエピトープのいくつかに対して強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答も検出され（図６）、ＴＧＦβにおけるいくつかのエピトープの高い免疫原性能が示された。
【0089】
実施例５ － ＴＧＦβエピトープに対するｅｘ ｖｉｖｏ応答の同定
健常対象および癌患者の両方に由来するＰＢＭＣによるいくつかのエピトープに対するｅｘ ｖｉｖｏ応答。細胞を解凍し、播種の前に一晩静置し、次いで、４８時間刺激した。健常対象細胞および患者細胞の両方とも、有意な量のＩＦＮ－γを放出し（図７Ａ）、健常対象および癌患者に由来する細胞の両方には、大量の自由に循環するＴＧＦβ特異的Ｔ細胞が有ることが示された。最も意外なことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、エピトープＴＧＦｂ－１５による刺激のわずか５時間後に、前立腺癌を有する患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ播種ＰＢＭＣにおいて検出された（図７Ｂ）。この所見は、この患者が、循環するＴＧＦβ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の高い画分を有することを示唆するものであった。ＴＧＦｂ－１５に対するこの強力な応答を考慮し、ＴＧＦｂ－１５に対する特異的Ｔ細胞培養物を、この患者由来のＰＢＭＣを用いて構築した。まず、ＣＤ１３７は、このドナー由来の特異的Ｔ細胞をソーティングするための活性化マーカーとして使用できることが確立された。次いで、患者ＰＢＭＣをＴＧＦｂ－１５で刺激し、細胞を培養下で１４日間維持した後、ＰＢＭＣをＴＧＦｂ－１５で１８時間再刺激し、次いで、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ１３７およびＣＤ１０７ａの発現に関して分析した。この実験から、ＣＤ８＋Ｔ細胞の１６．６％がペプチドによる刺激後にＣＤ１３７＋であったことを考慮すると、ＣＤ１３７は特異的Ｔ細胞を富化するための好適なマーカーであることが示された（図８Ａ）。
健常対象および癌患者の両方に由来するＰＢＭＣによるいくつかのエピトープに対するｅｘ ｖｉｖｏ応答。細胞を解凍し、播種の前に一晩静置し、次いで、４８時間刺激した。健常対象細胞および患者細胞の両方とも、有意な量のＩＦＮ－γを放出し（図７Ａ）、健常対象および癌患者に由来する細胞の両方には、大量の自由に循環するＴＧＦβ特異的Ｔ細胞が有ることが示された。最も意外なことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、エピトープＴＧＦｂ－１５による刺激のわずか５時間後に、前立腺癌を有する患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ播種ＰＢＭＣにおいて検出された（図７Ｂ）。この所見は、この患者が、循環するＴＧＦβ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の高い画分を有することを示唆するものであった。ＴＧＦｂ－１５に対するこの強力な応答を考慮し、ＴＧＦｂ－１５に対する特異的Ｔ細胞培養物を、この患者由来のＰＢＭＣを用いて構築した。まず、ＣＤ１３７は、このドナー由来の特異的Ｔ細胞をソーティングするための活性化マーカーとして使用できることが確立された。次いで、患者ＰＢＭＣをＴＧＦｂ－１５で刺激し、細胞を培養下で１４日間維持した後、ＰＢＭＣをＴＧＦｂ－１５で１８時間再刺激し、次いで、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ１３７およびＣＤ１０７ａの発現に関して分析した。この実験から、ＣＤ８＋Ｔ細胞の１６．６％がペプチドによる刺激後にＣＤ１３７＋であったことを考慮すると、ＣＤ１３７は特異的Ｔ細胞を富化するための好適なマーカーであることが示された（図８Ａ）。
【0090】
ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ ＣＤ１３７富化キットを用いて富化し、これを用いて、ＴＧＦｂ－１５に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含有する培養物を構築した（図８Ｂ）。ＴＧＦβ特異的Ｔ細胞応答を、この培養物を用いて評価した。
【0091】
実施例６ － ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞は癌細胞を認識し、殺傷し得る
限界希釈を用いて、ＣＤ８＋ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞クローンを、実施例５に記載のＴＧＦβから構築した。ＣＤ８＋ＴＧＦｂ－１５特異的クローンは、ＴＧＦｂ－１５に対して高い反応性を示した（図９）。ＨＬＡ－Ａ２＋特異的抗体でこの患者由来のＰＢＭＣを染色した結果、ドナーはＨＬＡ－Ａ２＋であることが明らかとなった（データ示さず）。次に、標準的なクロム５１細胞傷害性アッセイを実施し、特異的Ｔ細胞がペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋標的細胞を溶解することができたかどうかを調べた。ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｔ２細胞は、特異的Ｔ細胞により容易に溶解されたが、非パルスＴ２細胞は死滅されなかった（図１０Ａ）。
限界希釈を用いて、ＣＤ８＋ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞クローンを、実施例５に記載のＴＧＦβから構築した。ＣＤ８＋ＴＧＦｂ－１５特異的クローンは、ＴＧＦｂ－１５に対して高い反応性を示した（図９）。ＨＬＡ－Ａ２＋特異的抗体でこの患者由来のＰＢＭＣを染色した結果、ドナーはＨＬＡ－Ａ２＋であることが明らかとなった（データ示さず）。次に、標準的なクロム５１細胞傷害性アッセイを実施し、特異的Ｔ細胞がペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋標的細胞を溶解することができたかどうかを調べた。ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｔ２細胞は、特異的Ｔ細胞により容易に溶解されたが、非パルスＴ２細胞は死滅されなかった（図１０Ａ）。
【0092】
Ｔ２細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋だけではないため、これらの細胞の死滅は、別のＨＬＡアレルの一致により媒介された可能性があった。このため、Ｋ５６２細胞を標的として用いて、さらなる実験を行った。元のＫ５６２株はＨＬＡ欠損であるが、これらの実験は、ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ３を安定発現するように遺伝子改変された２つの株を用いて行った。これにより、各細胞が発現したＨＬＡアレルはこれらのアレルのみであったことが保証された。ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞のみが、ＴＧＦｂ－１５特異的クローンにより死滅したが、非パルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞およびペプチドパルスＨＬＡ－Ａ３＋Ｋ５６２細胞は認識されなかった（図１０Ｂ）。
【0093】
ほぼ総ての細胞が、腫瘍抑制環境の創出に大きく関与するＴＧＦβを分泌し得る。このため、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞がＨＬＡ－Ａ２＋癌細胞株を認識し得るかどうかを検討した。２つのＨＬＡ－Ａ２＋メラノーマ細胞株（ＷＭ８５２およびＦＭ８８）ならびにＫ５６２細胞およびＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞とともに、総てが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者由来の細胞株ＵＫＥ－１、ＳＥＴ－２、およびＴＨＰ－１を標的細胞として使用した。ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞を、エフェクター：標的比３：１で、各標的細胞で一晩刺激した。特異的Ｔ細胞は、２つの癌細胞株ＴＨＰ－１およびＵＫＥ－１を認識したが、他の細胞株は、Ｔ細胞を活性化しなかった（図１０Ｃ）。さらに、クロム５１細胞傷害性実験から、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞は、ＵＫＥ－１細胞およびＴＨＰ－１細胞の両方を死滅させたことが明らかとなった（図１０Ｄ）。
【0094】
ＴＨＰ－１細胞株は、比較的未分化な株であり、異なるサイトカインでの処理は、これらの細胞における遺伝子発現に影響を及ぼし得る。インターロイキン（ＩＬ）－４は、Ｔｈ２応答の発生において礎となるサイトカインである。したがって、ＩＬ－４によるＴＨＰ－１細胞の処理は、これらの細胞によるＴＧＦβ発現を増大させ得ると推測された。さらに、ＴＧＦβは、その細胞内産生に関して正のフィードバックループを生成することから、ＴＧＦβによるＴＨＰ－１細胞の処理も、ＴＧＦβ発現を誘導すると推測された。注目すべきことに、標的エピトープＴＧＦｂ－１５は、ＴＧＦβ前駆体タンパク質のＬＡＰペプチド部分において発現するが、ＴＧＦβの成熟活性型においては発現しない（図１Ｅ参照）。よって、活性型ＴＧＦβによるＴＨＰ－１細胞の前処理は、認識されたエピトープをＴＨＰ－１細胞に付加せず、ＴＧＦβの細胞内産生を増大させるのみであろう。
【0095】
ＩＬ－４またはＴＧＦβのいずれかで４８時間処理したＴＨＰ－１細胞を用いて、ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を１８時間刺激した。サイトカイン処理ＴＨＰ－１細胞は、非刺激ＴＨＰ－１細胞と比較して、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞のより大きな活性化を誘導することが示された（図１０Ｅ）。最終的に、ＩＬ－４またはＴＧＦβによるＴＨＰ－１細胞のサイトカイン刺激は、溶解細胞の数を増加させることが示された（図１０Ｆ）。
【0096】
実施例７ － 最小ＴＧＦβエピトープ配列の同定
ＴＧＦｂ－１５エピトープは２０－ｍｅｒであるため、ＨＬＡ－Ｉ分子上ではその全長で存在することができない。したがって、さらなる実験を行い、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞により認識される最小エピトープ配列を決定した。具体的には、ＴＧＦｂ－１５エピトープ配列を、８個の重複するアミノ酸を有する９ｍｅｒペプチドライブラリーに分け、１２個の９ｍｅｒペプチドを生成した。ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを生成するために使用したＴＧＦｂ－１５特異的バルク培養物由来のＴ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴに播種し、９ｍｅｒペプチドの各々で刺激した。結果は、ＴＧＦｂ－１５配列内の最小エピトープは、配列ＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬ（ＴＧＦｂ－１５ｓｈｏｒｔ；配列番号６６）であったことが示された（図１１参照）。
ＴＧＦｂ－１５エピトープは２０－ｍｅｒであるため、ＨＬＡ－Ｉ分子上ではその全長で存在することができない。したがって、さらなる実験を行い、ＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞により認識される最小エピトープ配列を決定した。具体的には、ＴＧＦｂ－１５エピトープ配列を、８個の重複するアミノ酸を有する９ｍｅｒペプチドライブラリーに分け、１２個の９ｍｅｒペプチドを生成した。ＴＧＦｂ－１５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを生成するために使用したＴＧＦｂ－１５特異的バルク培養物由来のＴ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴに播種し、９ｍｅｒペプチドの各々で刺激した。結果は、ＴＧＦｂ－１５配列内の最小エピトープは、配列ＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬ（ＴＧＦｂ－１５ｓｈｏｒｔ；配列番号６６）であったことが示された（図１１参照）。
【0097】
実施例８ － ＴＧＦβのシグナルペプチドにおける十量体エピトープは特異的Ｔ細胞の標的である
ＴＧＦβ配列内のいくつかの２０－ｍｅｒエピトープに対する高頻度のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を考慮し、本発明者らは、他のＨＬＡ－Ａ２拘束性十量体エピトープの同定を試みた。ＲａｍｍｅｎｓｅｅらのＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのデータベース；www.syfpeithi.de.；２０１４年１０月３０日アクセス）を用いて、ＨＬＡ－Ａ２に対する高結合親和性を有する十量体エピトープのために、全ＴＧＦβ配列を検索した。ペプチド配列ＬＬＬＬＬＰＬＬＷＬ（ＴＧＦｂ－Ａ２－０１；配列番号６７）が、最上位の結合十量体エピトープとして現れ、結合親和性スコアは３０であった。次いで、健常対象由来のＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣによるＴＧＦｂ－Ａ２－０１エピトープに対する自発的Ｔ細胞応答を検討した。意外にも、大部分のＰＢＭＣが、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１エピトープに対する応答を示した（図１２Ａ）。ＩＣＳを用いて、これらの応答はＣＤ８＋Ｔ細胞由来であることを確認した（図１２Ｂ）。
ＴＧＦβ配列内のいくつかの２０－ｍｅｒエピトープに対する高頻度のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を考慮し、本発明者らは、他のＨＬＡ－Ａ２拘束性十量体エピトープの同定を試みた。ＲａｍｍｅｎｓｅｅらのＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのデータベース；www.syfpeithi.de.；２０１４年１０月３０日アクセス）を用いて、ＨＬＡ－Ａ２に対する高結合親和性を有する十量体エピトープのために、全ＴＧＦβ配列を検索した。ペプチド配列ＬＬＬＬＬＰＬＬＷＬ（ＴＧＦｂ－Ａ２－０１；配列番号６７）が、最上位の結合十量体エピトープとして現れ、結合親和性スコアは３０であった。次いで、健常対象由来のＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣによるＴＧＦｂ－Ａ２－０１エピトープに対する自発的Ｔ細胞応答を検討した。意外にも、大部分のＰＢＭＣが、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１エピトープに対する応答を示した（図１２Ａ）。ＩＣＳを用いて、これらの応答はＣＤ８＋Ｔ細胞由来であることを確認した（図１２Ｂ）。
【0098】
次に、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的Ｔ細胞を健常対象（ＢＣ３６３）から単離し、前記対象由来のＰＢＭＣの１回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を行い、次いで、１４日間培養したところ、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１に対する堅固な応答が示された。次に、ＰＢＭＣをＴＧＦｂ－Ａ２－０１で一晩刺激した。次いで、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１３７＋細胞に対するゲーティングを伴うＦＡＣＳを用いて、特異的Ｔ細胞を富化した。富化細胞を、実施例１に記載の通りに増幅した。培養の１４日後、いくつかの細胞株が、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１ペプチドに対して高い特異性を示した（図１３）。
【0099】
ＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的Ｔ細胞のペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２標的細胞を溶解する能力を、標準的なＣｒ５１細胞傷害性アッセイにおいて試験した。ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞は溶解されたが、非パルスＨＬＡ－Ａ２＋およびペプチドパルスＨＬＡ－Ａ３＋標的細胞は溶解されなかった（図１２Ｃ）。
【0100】
上記のＴＧＦｂ－１５特異的Ｔ細胞は、ＡＭＬ細胞株ＵＫＥ－１およびＴＨＰ－１を死滅させたため、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的クローンもこれらの標的癌細胞を死滅させ得るかどうかを試験した。ＵＫＥ－１およびＴＨＰ－１癌細胞は、ＴＧＦｂ－Ａ２－０１特異的Ｔ細胞により容易に死滅した（図１２ＤおよびＥ参照）。さらに、ＩＬ－１３、ＴＧＦβまたはＩＬ－１３およびＴＧＦβの両方の組合せでのＴＨＰ－１細胞の刺激は、死滅標的細胞の画分を増加させた（図１２Ｅ）。
【0101】
結論
ＴＧＦｂ１は、免疫ホメオスタシスおよび寛容の決定的な要因（enforcer）であり、免疫系の多くの成分の増幅および機能を阻害する。ＴＧＦｂ１シグナル伝達における混乱は、炎症性疾患の根底にあり、腫瘍の発生を促進する。ＴＧＦｂ１は、腫瘍微小環境内の免疫抑制にとっても中心的であり、最近の試験は、腫瘍免疫回避および癌免疫療法に対する応答不良における役割を明らかにしている。ＴＧＦｂ１の発現は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および骨髄由来免疫抑制細胞の両方の主な特徴である。ＴＧＦｂ１発現細胞は、腫瘍部位におけるエフェクターリンパ球の増殖を防止することから、免疫阻害微小環境の発生においても主要な役割を果たす。したがって、例えば、ワクチン接種によるＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞の活性化は、腫瘍部位におけるＴ細胞浸潤を引き起こすはずである。
ＴＧＦｂ１は、免疫ホメオスタシスおよび寛容の決定的な要因（enforcer）であり、免疫系の多くの成分の増幅および機能を阻害する。ＴＧＦｂ１シグナル伝達における混乱は、炎症性疾患の根底にあり、腫瘍の発生を促進する。ＴＧＦｂ１は、腫瘍微小環境内の免疫抑制にとっても中心的であり、最近の試験は、腫瘍免疫回避および癌免疫療法に対する応答不良における役割を明らかにしている。ＴＧＦｂ１の発現は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および骨髄由来免疫抑制細胞の両方の主な特徴である。ＴＧＦｂ１発現細胞は、腫瘍部位におけるエフェクターリンパ球の増殖を防止することから、免疫阻害微小環境の発生においても主要な役割を果たす。したがって、例えば、ワクチン接種によるＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞の活性化は、腫瘍部位におけるＴ細胞浸潤を引き起こすはずである。
【0102】
初めて、ＴＧＦｂ１特異的エフェクターＴ細胞は、ＴＧＦｂ１発現細胞を特異的に標的とするために利用できることが見出された。特に、本発明者らは、ＴＧＦｂ１の全アミノ酸配列を網羅するペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、癌患者および健常ドナーの両方において天然に存在する末梢ＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞を同定した。興味深いことに、ＴＧＦｂ１は、ＴＧＦｂ１配列の異なる領域において分散する、末梢Ｔ細胞により高頻度に認識される複数のエピトープを含むことが発見された。
【0103】
ＴＧＦｂ１に対する高頻度のＴ細胞応答が認められ、このことは、ＴＧＦｂ１が高度に免疫原性であるという意外な所見を強調するものである。ＴＧＦｂ１が免疫抑制にとって非常に中心的であることを考慮すると、ＴＧＦｂ１が本発明者らにより観察された程度まで高度に免疫原性であろうことは、特に予想外である。このことに加え、特に強力な免疫応答を生成することができるＴＧＦｂ１の領域が同定され、これらは、ペプチドベースのワクチン接種アプローチでの使用に理想的であろう。
【0104】
本発明者らの所見は、免疫系の抑制、例えば、ＴＭＥにおけるＴＧＦｂ１の役割を考慮すると意外なものであるが、固形腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を有するほとんどの患者においてＴＧＦｂ１特異的な免疫応答をブーストすることが可能であることを示唆する。
【0105】
多くの異なる治療戦略は、免疫抑制細胞を枯渇させるもしくは初期化（reprogram）すること、またはこれらの細胞により分泌される機能的メディエーターを標的とすることを目的として、免疫抑制腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的とすることに焦点を当てている。上記で考察した意外な結果は、ＴＧＦｂ１を標的とした免疫調節ワクチン接種は、ＴＭＥにおける免疫抑制細胞を標的とする有効な方法であろうことを示している。他の臨床戦略とは対照的に、この独特なアプローチは、癌細胞を含む免疫抑制細胞の枯渇（細胞傷害性Ｔ細胞による直接的な殺傷を通じて）および免疫抑制細胞集団の初期化（炎症性サイトカイン（pro-inflammatory）を免疫抑制微小環境に導入することによる）の両方を組み合わせている。ＴＧＦｂ１発現は、免疫抑制細胞の表現型に対する主要な寄与因子であるため、ＴＧＦｂ１特異的Ｔ細胞は、免疫抑制細胞に対して特異的に反応し得る。微小環境を再度均衡させるＴＧＦｂ１ワクチンは、Ｔ細胞増強薬、例えば、抗ＰＤ１抗体のようなチェックポイント遮断薬の効果を増大させるはずである。したがって、ＴＧＦｂ１ワクチンとチェックポイント遮断抗体との併用療法は、療法に反応可能な患者の数を増加させるはずである。
【0106】
結論として、上記で考察した実験結果は、癌を有するほとんどの患者における免疫応答の欠如に関する主要な寄与因子：ＴＧＦｂ１を直接標的とするための有用なアプローチを提供するものである。
【0107】
配列表
全長ヒトＴＧＦｂ１プレタンパク質（ＮＰ＿０００６５１．３）(配列番号１)
全長ヒトＴＧＦｂ１プレタンパク質（ＮＰ＿０００６５１．３）(配列番号１)
【0108】
特に指示のない限り、下の表１において、「開始位置」および「終了位置」は、全長ヒトＴＧＦｂ１プレタンパク質（配列番号１）における位置を指す。
表１
表１
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】