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特表2022-535106改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(54)【発明の名称】改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220728BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220728BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220728BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220728BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220728BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220728BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220728BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C07K14/00 ZNA
A61K38/16
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K47/42
A61K47/64
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571939
(86)(22)【出願日】2020-06-03
(85)【翻訳文提出日】2022-02-01
(86)【国際出願番号】 EP2020065314
(87)【国際公開番号】W WO2020245171
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】19178282.0
(32)【優先日】2019-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515146556
【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】シリング， ヨハネス
(72)【発明者】
【氏名】ワルサー， マルセル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF65
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084NA03
4C084NA12
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C084ZC752
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA24
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン、特に改善された安定性を有するそのような設計されたアンキリン反復ドメインに関する。本発明は更に、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、そのような設計されたアンキリン反復ドメイン又はタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、及び疾患の治療におけるそのようなタンパク質又は医薬組成物の使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインであって、前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、前記設計されたアンキリン反復ドメインが、任意にそのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、任意に、最後から２番目の位置のＡが、Ｌで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡが、Ｎで置換されている、設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項2】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さない、請求項１に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項3】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない、請求項１又は２に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項4】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＸ１Ｘ２Ｇ（配列番号１３）を含み、式中、Ｘ１が、Ａ、Ｄ及びＩからなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、Ｘ２が、Ａ及びＤからなる群から選択されるアミノ酸残基を表す、請求項１～３のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項5】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項6】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は配列番号４を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項7】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項8】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号２からなる前記設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、改善された安定性を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項9】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号２からなる前記設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示し、前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項10】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（ｉ）配列番号２からなる前記設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示し、前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施され、かつ／又は（ｉｉ）配列番号２からなる前記設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示し、前記サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項11】
前記設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号２からなる前記設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示し、前記ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン。
【請求項12】
１つ又は２つの、請求項１～１１のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質。
【請求項13】
前記組換え結合タンパク質が、血清アルブミンに対する結合特異性を有する前記設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質と比べて、改善された安定性を有する、請求項１２に記載の組換え結合タンパク質。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメイン若しくは組換え結合タンパク質、又は請求項１４に記載の核酸、並びに任意に、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、欧州特許庁に２０１９年６月４日出願の欧州特許出願公開第１９１７８２８２号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願第１９１７８２８２号の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、欧州特許庁に２０１９年６月４日出願の欧州特許出願公開第１９１７８２８２号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願第１９１７８２８２号の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明の分野
本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン、特に改善された安定性を有するそのような設計されたアンキリン反復ドメインに関する。本発明は更に、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、そのような設計されたアンキリン反復ドメイン又はタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、及び疾患の治療におけるそのようなタンパク質又は医薬組成物の使用に関する。
本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン、特に改善された安定性を有するそのような設計されたアンキリン反復ドメインに関する。本発明は更に、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、そのような設計されたアンキリン反復ドメイン又はタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、及び疾患の治療におけるそのようなタンパク質又は医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
活性成分が典型的にはタンパク質及び／又はポリペプチドである生物学的製剤の場合、分子立体配座の維持、したがって生物学的活性の維持は、非共有結合力並びに共有結合力に依存する。これらの製品は、温度変化、酸化、光、イオン含有量、及び剪断などの環境要因に特に敏感である。生物学的活性の維持を確実にするために、そのような製剤の活性成分は、製造、輸送、及び貯蔵中に曝露される条件に耐えることが重要である。分解及び他の形態の分子変化を可能な限り回避する必要がある。したがって、安定した活性成分の開発は、市販製品の開発の成功に重要である。
【0004】
血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインが記載されており、それらは、延長された終末相半減期を有する組換え結合タンパク質の作製のために特に有用である（例えば、国際公開第２０１２／０６９６５４号を参照されたい）。血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含まないタンパク質と比較して、血漿中のそのような半減期の増加は、治療用途に非常に有益である。例えば、国際公開第２０１６／１５６５９６号は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む治療的に有用なアンキリン反復タンパク質を記載している。
【0005】
血清アルブミンに対する結合特異性を有するそのような設計されたアンキリン反復ドメインの開発にもかかわらず、一般に今日の医薬品及び特に血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの安定性特性、特に貯蔵安定性特性を改善するための必要性及び課題が依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインが、更に改善された安定性特性、特に改善された貯蔵安定性特性を提供することを見出した。したがって、本発明者らは、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインが、液体製剤における貯蔵安定性の改善だけでなく、そのような液体製剤中の高温、例えば６０℃での熱処理中に有益な安定性特性をもたらすことを見出した。後者は特に、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質の精製を可能にするのに有益である。更に、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインは、高温でのｐＨシフト中に改善された安定性を示し、これは、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を精製する場合にも非常に有益である。本発明の設計されたアンキリン反復ドメインの安定性の改善は、特に、高温及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析でのインキュベーション後に、分解生成物であると想定されるより少ない程度の特定されたより低い分子量種によって明らかである。ひいては、先行技術の生成物と比べて、より高い分子量種の増量、したがって、より少ない量の想定される分解生成物が、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質をより低いｐＨで保存した後のサイズ排除クロマトグラフィーによって特定された。より低いｐＨでの組換え結合タンパク質の貯蔵は、多くの場合、望ましくない低分子量種の発生をもたらし得る。加えて、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインの安定性の改善は、血清アルブミンに対するそれらの結合特異性を低下させないことに留意されたい。
【0007】
したがって、一態様では、本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを提供し、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さない。別の態様では、本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインに関し、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【0008】
更なる態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つ、典型的には、かつ好ましくは１つ又は２つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供する。
【0009】
別の態様では、本発明は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【0010】
更なる態様では、本発明は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメイン、本発明の組換え結合タンパク質、又は本発明の核酸、並びに任意に薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【0011】
本発明の更なる態様及び実施形態は、発明を実施するための形態において明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインの配列アライメント。配列番号３及び４は、血清アルブミンに対する結合特異性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを表す。残基番号は、上記配列に示されている。
【図2】配列番号２の配列モチーフにアライメントされた、血清アルブミンに対する結合特異性を有する異なる設計されたアンキリン反復ドメインの残基番号７７～７９での配列モチーフ。それぞれのタンパク質の配列番号は、アライメントの左側に示されている。
【図3】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインの安定性を比較するＳＤＳ－ＰＡＧＥ。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２、３、及び４からなり、更にＮ末端に配列番号１を有する）を、実施例２に記載されるように生成し、続いて、実施例３に記載されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で６０℃（参照試料については－８０℃）にて１週間インキュベートし、続いて、実施例４に記載されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して貯蔵安定性評価を行った。３つのＳＤＳ ＰＡＧＥの写真は、それぞれのゲルの上に示されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５での測定値を表す。タンパク質は、それらの配列番号によって示される。Ｏ：－８０℃インキュベートした参照試料。Ｉ：６０℃インキュベートした試料。Ｍｗ：左側に示されたｋＤａ値を有する分子量マーカー。
【図4】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインの安定性のＬａｂＣｈｉｐ分析。タンパク質＃２、＃３、＃４、＃５、及び＃６（それぞれ、配列番号２～６からなり、更に全てがＮ末端に配列番号１を有する）を、実施例２に記載されるように生成し、続いて、実施例３に記載されるように、ｐＨ６、ｐＨ７．４、及びｐＨ８．５で６０℃にて１週間インキュベートし、続いて、実施例５に記載されるように、ＬａｂＣｈｉｐを使用して貯蔵安定性評価を行った。ＬａｂＣｈｉｐデータは、３つの異なるｐＨ値の３つの群で表示されている。分子量マーカーレベルは、各群の左右に（ｋＤａで）示されている。
【図5a】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのサイズ排除クロマトグラフィー。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２、３、及び４からなり、更にＮ末端に配列番号１を有する）を、実施例２に記載されるように生成し、続いて、実施例３に記載されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で６０℃（参照試料については－８０℃）にて１週間インキュベートし、続いて、実施例６に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィー分析を使用して貯蔵安定性評価を行った。６０℃及び－８０℃にて各タンパク質について得られたクロマトグラムのオーバーレイは、図５ａにｐＨ７．４について示されている。空隙容量は２．１８分で溶出し、総体積は５．２８分である。ＯＤ：２８０ｎｍにおける光学密度（３６０ｎｍにおける光学密度で参照）［ｍＡｕ］、ｔ：時間［分］。
【図5b】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのサイズ排除クロマトグラフィー。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２、３、及び４からなり、更にＮ末端に配列番号１を有する）を、実施例２に記載されるように生成し、続いて、実施例３に記載されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で６０℃（参照試料については－８０℃）にて１週間インキュベートし、続いて、実施例６に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィー分析を使用して貯蔵安定性評価を行った。６０℃及び－８０℃にて各タンパク質について得られたクロマトグラムのオーバーレイは、図５ｂではｐＨ６について示されている。空隙容量は２．１８分で溶出し、総体積は５．２８分である。ＯＤ：２８０ｎｍにおける光学密度（３６０ｎｍにおける光学密度で参照）［ｍＡｕ］、ｔ：時間［分］。
【図5c】血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのサイズ排除クロマトグラフィー。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２、３、及び４からなり、更にＮ末端に配列番号１を有する）を、実施例２に記載されるように生成し、続いて、実施例３に記載されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で６０℃（参照試料については－８０℃）にて１週間インキュベートし、続いて、実施例６に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィー分析を使用して貯蔵安定性評価を行った。６０℃及び－８０℃にて各タンパク質について得られたクロマトグラムのオーバーレイは、図５ｃではｐＨ５について示されている。空隙容量は２．１８分で溶出し、総体積は５．２８分である。ＯＤ：２８０ｎｍにおける光学密度（３６０ｎｍにおける光学密度で参照）［ｍＡｕ］、ｔ：時間［分］。
【図6a】１ｍｇ／ｋｇで静脈内で与えられた血清アルブミンに対する結合特異性を有する、設計されたアンキリン反復ドメインのマウスの薬物動態プロファイル。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２～４からなり、すべて更にＮ末端に配列番号１を有し、図に示される記号）を実施例２に記載されるように生成し、マウスの薬物動態プロファイルを実施例９に記載されるように決定した。３匹のマウス又は２匹のサルからの、それぞれの標準偏差を含む平均タンパク質濃度が示されている。Ｃ：濃度［ｎＭ］、ｔ：時間［時］。
【図6b】１ｍｇ／ｋｇで静脈内で与えられた血清アルブミンに対する結合特異性を有する、設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルの薬物動態プロファイル。タンパク質＃２、＃３、及び＃４（それぞれ、配列番号２～４からなり、すべて更にＮ末端に配列番号１を有し、図に示される記号）を実施例２に記載されるように生成し、マウスの薬物動態プロファイルをカニクイザルの薬物動態プロファイルを実施例１０に記載されるように決定した。２匹のサルからの、それぞれの標準偏差を含む平均タンパク質濃度が示されている。Ｃ：濃度［ｎＭ］、ｔ：時間［時］。
【図7a】１ｍｇ／ｋｇで静脈内で与えられた血清アルブミンに対する結合特異性を有する、設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質のマウスにおける薬物動態プロファイル。タンパク質＃７、＃９、及び＃１１（それぞれ、配列番号７～１２からなり、すべて更にＮ末端に配列番号１を有し、図に示される記号）を実施例２に記載されるように生成し、マウスの薬物動態プロファイルを実施例１１に記載されるように決定した。３匹のマウスからの、標準偏差を含む平均タンパク質濃度が示されている。比較を容易にするために、タンパク質＃７、＃９、及び＃１１は、グラフで表示される。Ｃ：濃度［ｎＭ］、ｔ：時間［時］。
【図7b】１ｍｇ／ｋｇで静脈内で与えられた血清アルブミンに対する結合特異性を有する、設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質のマウスにおける薬物動態プロファイル。タンパク質＃８、＃１０、及び＃１２（それぞれ、配列番号７～１２からなり、すべて更にＮ末端に配列番号１を有し、図に示される記号）を実施例２に記載されるように生成し、マウスの薬物動態プロファイルを実施例１１に記載されるように決定した。３匹のマウスからの、標準偏差を含む平均タンパク質濃度が示されている。比較を容易にするために、タンパク質＃８、＃１０、及び＃１２は、グラフで表示される。Ｃ：濃度［ｎＭ］、ｔ：時間［時］。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン、そのような設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、及びそのような設計されたアンキリン反復ドメイン及び組換え結合タンパク質をコードする更なる核酸、並びに設計されたアンキリン反復ドメイン、結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患の治療におけるそのような組換え結合タンパク質又は医薬組成物の使用を提供する。
【0014】
したがって、一態様では、本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを提供し、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。
【0015】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さない。
【0016】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さない。したがって、一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む。
【0017】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。したがって、一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。
【0018】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にセリン（Ｓ）を有さない。したがって、一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にセリン（Ｓ）を有さない。
【0019】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置でアスパラギン（Ｎ）を有さず、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置でグルタミン酸（Ｅ）を有さない。したがって、一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。
【0020】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＸ１Ｘ２Ｇ（配列番号１３）を含み、式中、Ｘ１は、Ａ、Ｄ及びＩからなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、Ｘ２は、Ａ及びＤからなる群から選択されるアミノ酸残基を表す。好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0021】
一実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸（Ｄ）である。一実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、アラニン（Ａ）である。一実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸（Ｄ）であり、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸（Ｄ）であり、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４とは、最大で９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸が異なる。
【0022】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＸ１Ｘ２Ｇ（配列番号１３）を含み、式中、Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立して、Ａ及びＤからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、好ましくは、Ｘ１とＸ２とは、等しくない。好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0023】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0024】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＡＤＧ（配列番号１４）又はＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＤＡＧ（配列番号１５）を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＡＤＧ（配列番号１４）を含む。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＦＡＧＫＴＰＬＨＬＡＡＤＡＧ（配列番号１５）を含む。好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９３％、また更に好ましくは少なくとも９５％、及びなお更に好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0025】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３～６からなる群から選択される、又は好ましくは配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号３～６、好ましくは配列番号３及び配列番号４の最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸が、他のアミノ酸で置換されている。アミノ酸のそのような置換は、好ましくは、それらが、設計されたアンキリン反復ドメインの機能、好ましくは、血清アルブミンへの特異的結合に有意に影響を及ぼさないようなものである。そのようなアミノ酸置換は、例えば、国際公開第２０１２／０６９６５５号に記載されるように、反復ドメインをキャッピングするためのものなどの、設計されたアンキリン反復ドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸を置換する場合、任意の他のアミノ酸を置換アミノ酸と見なすことができる。好ましくは、そのような他のアミノ酸は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹからなる群から選択される。好ましくは、そのような他のアミノ酸は、Ｃ、Ｇ、又はＰではない。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号３～６からなる群から選択される、又は好ましくは配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む設計されたアンキリン反復ドメインのＫＤ値と比べて、ヒト血清アルブミンへの結合のＫＤ値を、１０００倍を超えて、１００倍を超えて、又は１０倍を超えて変化させない。ある特定の実施形態では、置換は、表Ｘによる保存的置換である。ある特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファ－ヘリックスに連結するベータループ内で行われる。ある特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われる。
【0026】
【表1】
【0027】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号３、及び（２）配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号３の位置１～７６及び７９～１２４から選択されるいずれかの位置における配列番号３の最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって交換されている。
【0028】
一実施形態では、本発明は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインに関し、設計されたアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号４、及び（１）配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号４の位置１～７６及び７９～１２４から選択されるいずれかの位置における配列番号４の最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって交換されている。
【0029】
上記の本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのすべてにおいて、最後から２番目の位置は「Ａ」又は「Ｌ」であり得、かつ／又は最後の位置は「Ａ」又は「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、任意に、最後から２番目の位置のＡが、Ｌで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡが、Ｎで置換されている。したがって、例示的な一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号の３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、任意に、最後から２番目の位置のＡが、Ｌで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡが、Ｎで置換されている。別の例示的な実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号の３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、任意に、最後から２番目の位置のＡが、Ｌで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡが、Ｎで置換されている。
【0030】
加えて、上記の本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのすべては、任意に、「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列をそのＮ末端に更に含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメイン（ｉ）は、配列番号３又は４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、かつ（ｉｉ）そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、かつ設計されたアンキリン反復ドメインが、そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。別の例示的な実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、かつ設計されたアンキリン反復ドメインが、そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。別の例示的な実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は設計されたアンキリン反復ドメインが、配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さず、設計されたアンキリン反復ドメインが、任意にそのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳを更に含み、任意に、最後から２番目の位置のＡが、Ｌで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡが、Ｎで置換されている。
【0031】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３又は配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。
【0032】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、９０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、８０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、７０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、６０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。
【0033】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、改善された安定性を有する。
【0034】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示す。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0035】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示す。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示し、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0036】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示す。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0037】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示し、かつ／又は（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示す。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施され、かつ／又は（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示し、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0038】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示す。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示し、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される。
【0039】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、
（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、
（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、
（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び
（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、好ましくは、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、
からなる群から選択される。
（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、
（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、
（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び
（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、好ましくは、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、
からなる群から選択される。
【0040】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、
（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、
（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、
（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び
（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、
からなる群から選択される。
（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、
（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、
（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び
（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、
からなる群から選択される。
【0041】
一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、１ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＢＳＴ－Ｃ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、２０ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＢＳＴ－Ｃ中でカニクイザル血清アルブミンに結合する。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、３０ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＢＳＴ－Ｃ中でマウス血清アルブミンに結合する。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、１００ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＢＳＴ－Ｃ中で、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、及びマウス血清アルブミンに結合する。
【0042】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインのマウスにおける終末相半減期は、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインのマウスにおける終末相半減期の少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、最も好ましくは９７％である。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインのマウスにおける終末相半減期は、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインのマウスにおける終末相半減期とは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、最も好ましくは３％だけ異なる。好ましくは、マウスの終末相半減期は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈への静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇの用量で設計されたアンキリン反復ドメインを適用することによって決定される。
【0043】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルにおける終末相半減期は、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルにおける終末相半減期の少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、最も好ましくは９２％である。一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルにおける終末相半減期は、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルにおける終末相半減期とは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、最も好ましくは８％異なる。好ましくは、カニクイザルの終末相半減期は、設計されたアンキリン反復ドメインを１ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間の静脈内注射で適用することによって決定される。
【0044】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、典型的には及び好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインの６０℃にて１週間インキュベートした際の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析における高分子量生成物のより少ない発生である。好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0045】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析における「高分子量生成物」という用語は、典型的には、及び好ましくは、予想される分子量よりも高い分子量に移動するゲル上のバンドを指す。一実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析における高分子量生成物は、２１．５ｋＤａより高い分子量に移動するゲル上のバンドを指す。図３では、ｐＨ５、６、又は７．４で１週間６０℃にてインキュベートしたタンパク質＃２は、約１４ｋＤａに移動する予想されるバンドよりも高い見かけの分子量に移動するＳＤＳ－ＰＡＧＥ中のそのような高分子量生成物を示す。一実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析におけるより少ない高分子量生成物は、６０℃にて１週間インキュベートする際に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、最も好ましくは５０％の高分子量生成物の低減を指す。
【0046】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、典型的には及び好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインの６０℃にて１週間インキュベートした際の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析における低分子量生成物のより少ない発生である。好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される。
【0047】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析における「低分子量生成物」という用語は、典型的には、及び好ましくは、予想される分子量よりも低い分子量に移動するゲル上のバンドを指す。図３では、ｐＨ５、６、又は７．４で１週間６０℃にてインキュベートしたタンパク質＃２は、約１４ｋＤａに移動する予想されるバンドよりも低い見かけの分子量に移動するＳＤＳ－ＰＡＧＥ中のそのような低分子量生成物を示す。一実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析におけるより少ない低分子量生成物は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、最も好ましくは５０％の低分子量生成物の低減を指す。
【0048】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、典型的には及び好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインの６０℃にて１週間インキュベートした際の、ＬａｂＣｈｉｐ分析における高分子量生成物のより少ない発生である。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析における高分子量生成物は、クロマトグラム上で予想される分子量よりも高い分子量に移動するバンドを指す。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析における高分子量生成物は、３０ｋＤａより高い分子量に移動するクロマトグラム上のバンドを指す。図４では、ｐＨ６又は７．４で１週間６０℃にてインキュベートしたタンパク質＃２は、約１５ｋＤａ～２０ｋＤａに移動する予想されるバンドよりも高い見かけの分子量に移動するＬａｂＣｈｉｐ分析におけるそのような高分子量生成物を示す。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析におけるより少ない高分子量生成物は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、最も好ましくは５０％の高分子量生成物の低減を指す。
【0049】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、典型的には及び好ましくは、設計されたアンキリン反復ドメインの６０℃にて１週間インキュベートした際の、ＬａｂＣｈｉｐ分析における低分子量生成物のより少ない発生である。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析における低分子量生成物は、クロマトグラム上で予想される分子量よりも低い分子量に移動するバンドを指す。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析における低分子量生成物は、約７ｋＤａの分子量に出現するクロマトグラム上のバンドを指す。図４では、ｐＨ６で１週間６０℃にてインキュベートしたタンパク質＃２は、約１５ｋＤａ～２０ｋＤａに移動する予想されるバンドよりも低い見かけの分子量に移動するＬａｂＣｈｉｐ分析におけるそのような低分子量生成物を示す。一実施形態では、ＬａｂＣｈｉｐ分析におけるより少ない低分子量生成物は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、最も好ましくは２５％の低分子量生成物の低減を指す。
【0050】
一実施形態では、設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、典型的には及び好ましくは、ｐＨ５で６０℃にて１週間インキュベートした際の、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるより低い量の高分子量生成物の発生である。一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにおける「高分子量生成物」という用語は、典型的には及び好ましくは、予想分子量生成物の前に溶出する生成物を指す。図５Ｃでは、ｐＨ５で１週間６０℃にてインキュベートされたタンパク質＃２は、サイズ排除クロマトグラフィーで４．１分で溶出するより高分子量生成物を示し、一方予想される分子量生成物は、ほぼ４．６分後に溶出する。一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるより低い量の高分子量生成物は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、曲線下総面積の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、最も好ましくは２５％の曲線下総面積の割合の減少を指す。
【0051】
一実施形態では、インキュベーションは、ｐＨ８．５、７．４、６、又は５でのインキュベーションを指す。一実施形態では、インキュベーションは、ｐＨ８．５でのインキュベーションを指す。一実施形態では、「インキュベーション」という用語は、ｐＨ７．４でのインキュベーションを指す。一実施形態では、インキュベーションは、ｐＨ６でのインキュベーションを指す。一実施形態では、インキュベーションは、ｐＨ５でのインキュベーションを指す。一実施形態では、ｐＨ８．５でのインキュベーションは、リン酸塩／クエン酸塩／ホウ酸塩緩衝液中のインキュベーションを指す。一実施形態では、ｐＨ７．４でのインキュベーションは、ＰＢＳ中のインキュベーションを指す。一実施形態では、ｐＨ６でのインキュベーションは、リン酸塩／クエン酸塩緩衝液ｐＨ６におけるインキュベーションを指す。一実施形態では、ｐＨ５でのインキュベーションは、リン酸塩／クエン酸緩衝液ｐＨ５におけるインキュベーションを指す。
【0052】
別の態様では、本発明は更に、少なくとも１つの、血清アルブミンに対する結合特異性を有する本発明の設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供する。本発明の設計されたアンキリン反復ドメインについて上記及び本明細書に記載の好ましい実施形態及び特徴は、少なくとも１つの、本発明の血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む本発明の組換え結合タンパク質を含む、本発明の任意及び全ての態様に適用される。
【0053】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの３つを含む。
【0054】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれが、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれが、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれが、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号３又は４の位置７７に対応する位置にアスパラギン（Ｎ）を有さず、かつ／又は配列番号３又は４の位置７８に対応する位置にグルタミン酸（Ｅ）を有さない。
【0055】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、配列番号３又は４のアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性は、少なくとも９３％、更に好ましくは少なくとも９５％、及び再び更に好ましくは少なくとも９８％である。
【0056】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0057】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む。
【0058】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、９０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、８０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、７０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、６０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。
【0059】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、少なくとも２つの、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有する。配列番号９～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。一実施形態では、本発明は、２つ、好ましくは厳密には２つの、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有する。配列番号９～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。
【0060】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、２つ、好ましくは厳密には２つの、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号３からなる。配列番号９～１０は、そのような組換え結合タンパク質の例である。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、２つ、好ましくは厳密には２つの、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号４からなる。配列番号１１～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。
【0061】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、９０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、８０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、７０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、６０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。
【0062】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、９０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、８０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、７０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、６０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。
【0063】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合し、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、からなる群から選択される。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合し、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、からなる群から選択される。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合し、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて改善された安定性を有し、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べての改善された安定性が、（ｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない分解バンドを示すこと、（ｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すことであって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でより少ない高分子量バンドを示すこと、（ｉｉｉ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すことであって、サイズ排除クロマトグラフィーが、ｐＨ５．０で６０℃にて１００マイクロモルで１週間インキュベートした後に実施される、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてより少ない高分子量ピークを示すこと、及び（ｉｖ）配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインと比べて、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すことであって、ＬａｂＣｈｉｐ分析が、ｐＨ６．０又は７．４で６０℃にて１００マイクロモルでインキュベートした後に実施される、ＬａｂＣｈｉｐ分析において少なくとも１０％少ない高分子量バンドを示すこと、からなる群から選択される。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、９０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、８０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、７０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、６０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中でヒト血清アルブミンに結合する。
【0064】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質と比べて、改善された安定性を有する。配列番号９～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。
【0065】
配列番号９又は１１からなる組換え結合タンパク質は、それぞれ、配列番号２からなる、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む、配列番号７からなる組換え結合タンパク質と比べて改善された安定性を示すそのような組換え結合タンパク質の例である。配列番号１０又は１２からなる組換え結合タンパク質は、それぞれ、配列番号２からなる、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む、配列番号８からなる組換え結合タンパク質と比べて改善された安定性を示すそのような組換え結合タンパク質の例である。
【0066】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0067】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ又は２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に１つ又は厳密に２つを含み、１つ又は２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインのうちの厳密に２つを含み、２つのアンキリン反復ドメインのそれぞれは、独立して、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0068】
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、配列番号９～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。一実施形態では、組換え結合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
【0069】
一実施形態では、組換え結合タンパク質のマウスの終末相半減期は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質のマウスの終末相半減期の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、最も好ましくは少なくとも９０％である。一実施形態では、組換え結合タンパク質のマウスの終末相半減期は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質のマウスの終末相半減期とは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％未満、最も好ましくは１０％未満だけ異なる。好ましくは、マウスの終末相半減期は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈への静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇの用量で組換え結合タンパク質を適用することによって決定される。
【0070】
一実施形態では、組換え結合タンパク質のカニクイザルの終末相半減期は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質のカニクイザルの終末相半減期の少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％未満、最も好ましくは９２％である。一実施形態では、組換え結合タンパク質のカニクイザルの終末相半減期は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれが、配列番号２からなる設計されたアンキリン反復ドメインで置換されていることを除いて、同一のアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質のカニクイザルの終末相半減期とは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％未満、最も好ましくは８％未満だけ異なる。好ましくは、カニクイザルの終末相半減期は、組換え結合タンパク質を１ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間の静脈内注射で適用することによって決定される。
【0071】
別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３～６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号９～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。更に、本発明は、核酸のうちのいずれかを含むベクターに関する。
【0072】
更なる一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメイン、又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。更にまた、本明細書で言及した組換え結合タンパク質及び／又は設計されたアンキリン反復ドメインのうちの１つ以上を含む、診断用組成物が提供される。
【0073】
医薬組成物は、上述したような結合タンパク質、及び例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。当業者に既知の、好適な担体、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤などの、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。
【0074】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
【0075】
医薬組成物は、当業者の知識内で任意の好適な方法によって投与され得る。好ましい投与経路は非経口である。非経口投与において、本発明の薬剤は、上記で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液又はエマルションなどの単位用量の注射剤形で配合される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。
【0076】
更に、上記の医薬組成物のいずれかは、疾患又は障害の治療について考慮される。本発明は更に、治療方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明の医薬組成物又は組換え結合タンパク質又は設計されたアンキリン反復ドメインを、それを必要とする患者に投与することを含む。
【0077】
更に、有効量の上述した医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、人を含む哺乳動物の病的状態を治療する方法が、提供される。
【0078】
本開示は、治療有効量の本明細書に記載の組換え結合タンパク質又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、癌は固形腫瘍である。配列番号９～１２は、癌を治療するそのような方法において有用である組換え結合タンパク質の例である。
【0079】
いくつかの実施形態では、癌は、脳癌、膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、子宮頸癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、唇及び経口癌、肝臓癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、口腔癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、肉腫、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌、又は甲状腺癌である。
【0080】
本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に限定されない。他の供給源を使用し、下記の概要に従って処理してもよい。
【0081】
本明細書は、「Ｐ５７５４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｔｘｔ」という名前の、本明細書のアミノ酸配列一覧の多数のアミノ酸配列を参照しており、配列プロトコルのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0082】
定義
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
【0083】
本発明の文脈において、用語「タンパク質」はポリペプチドを含む分子を指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内かつ／又は複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、及び／又は四次構造を形成することにより、明確な三次元配列を有する、又は、とることができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。個々に二次及び／又は三次構造を形成することにより、明確な三次元配列を有する、又は、とることができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。このようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【0084】
用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えポリペプチドなどで使用する場合、タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって作製されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって作製される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて産生されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
【0085】
本発明の文脈において、「結合タンパク質」という用語は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ以上の結合ドメインを含み得る。好ましくは、上記の結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。
【0086】
更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質性ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。
【0087】
「結合ドメイン」という用語は、標的に対する結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、上記の結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
【0088】
用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは非天然のポリペプチド又はタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド又はタンパク質である。例えば、本発明の文脈において、血清アルブミンは、開示された血清アルブミン特異的結合ドメイン及びタンパク質の標的である。
【0089】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も包含する。ポリペプチドは、当業者に周知である。
【0090】
特許出願第ＷＯ２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）は、反復タンパク質の機能と反復ドメインの機能、技術、及び用途の一般的な説明を含む。用語「反復タンパク質」は、１つ以上の反復ドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、反復タンパク質は、更なる非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ及び／又はペプチドリンカーを含む場合がある。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。
【0091】
「反復ドメイン」という用語は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確に説明すると、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７～５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
【0092】
設計された反復タンパク質、設計された反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも１つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む。
【0093】
用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。
【0094】
用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。
【0095】
そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて施術者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。
【0096】
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位から誘導される、設計された反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。
【0097】
したがって、「アンキリン反復モジュール」という用語は、天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位から元々由来する繰り返しモジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。
【0098】
反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。本特許出願の目的のために、配列番号２～６のアミノ酸残基３、４、６、１４及び１５は、本発明のアンキリン反復モジュールのランダム化位置である。
【0099】
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、反復モジュールは、同じ標的に対する結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。フレームワーク残基の位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、標的相互作用残基の位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。
【0100】
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全てのモチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンリッチバリアント反復単位が挙げられる。
【0101】
用語「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「標的に高い特異性で結合する」、「標的に対して特異的」又は「標的特異性」等は、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等の非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋｄ」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０２倍、より好ましくは少なくとも１０３倍、より好ましくは少なくとも１０４倍、又はより好ましくは少なくとも１０５倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫｄの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による血清アルブミンに対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋｄ）の典型的かつ好ましい決定は、実施例７に記載されている。
【0102】
用語「約」は、言及した値の＋／－２０％を意味し、例えば、「約５０」は、４０～６０を意味するものとする。
【0103】
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。これは、実施例３に例示される。「リン酸塩／クエン酸塩緩衝液ｐＨ６」という用語は、３７５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有し、５．７のｐＨを有する水性緩衝液を意味する。これは、実施例３に例示される。「リン酸塩／クエン酸塩緩衝液ｐＨ５」という用語は、３０ｍＭのクエン酸及び３０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４を含有し、４．７５のｐＨを有する水性緩衝液を意味する。これは、実施例３に例示される。「リン酸塩／クエン酸塩／ホウ酸塩緩衝液」という用語は、３０ｍＭのクエン酸、３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭのホウ酸を含み、ｐＨ８．５を有する水性緩衝液を意味する。これは、実施例３に例示される。
【0104】
用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６８を指す。
【実施例】
【0105】
実施例で使用されるタンパク質：
タンパク質＃２（配列番号２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃３（配列番号３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃４（配列番号４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃５（配列番号５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃６（配列番号６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃７（配列番号７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃８（配列番号８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃９（配列番号９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃１０（配列番号１０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃１１（配列番号１１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、タンパク質＃１２（配列番号１２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）。
タンパク質＃２（配列番号２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃３（配列番号３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃４（配列番号４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃５（配列番号５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃６（配列番号６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃７（配列番号７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃８（配列番号８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃９（配列番号９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃１０（配列番号１０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、
タンパク質＃１１（配列番号１１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）、タンパク質＃１２（配列番号１２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号１）を有する）。
【0106】
別途記載されていない場合、実験は、当業者に周知の方法に従って実施した。いくつかの実施例についての実験条件は、国際公開第２０１２／０６９６５４号及び同第２０１６／１５６５９６号に更に記載されている。
【0107】
実施例１：血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインの構築
予想外に、配列番号２に対応するアミノ酸配列からなるタンパク質（元々国際公開第２０１６１５６５９６号に記載）が、血清アルブミンに対する結合特異性を有する以前に設計されたアンキリン反復ドメイン（国際公開第２０１２／０６９６５４号）と比べて改善された安定性を有するバリアントであるにもかかわらず、高温でのインキュベーションでは安定ではないと思われることを我々は観察した（実施例２～６を参照）。したがって、本発明の目的は、血清アルブミン結合及び薬物動態特性を維持しながら、高温でのインキュベーション時に改善された安定性を示す、配列番号２のバリアントを提供することである。複数の位置で数回の変化するアミノ酸を含む高反復プロセス（例えば、当業者に周知のアラニンスキャニングプロセスに匹敵する）を通して、インビトロ及びインビボで得られたタンパク質バリアントを特徴付け、最終的には、改善された安定性特性を示す４つのバリアントをもたらした。予想に反して、これらのバリアントはすべて、位置７７及び／又は位置７８のアミノ酸Ａｓｐを伴い、ポリペプチド鎖分解の起点にあることが知られているアミノ酸を含む。非常に驚くべきことに、これらのバリアントの多くは、特にポリペプチド鎖分解を起こしやすいことが知られているＡｓｐ－Ｇｌｙ配列モチーフを含む。したがって、このプロセスは、驚くべきことに予期せぬバリアントをもたらした。
予想外に、配列番号２に対応するアミノ酸配列からなるタンパク質（元々国際公開第２０１６１５６５９６号に記載）が、血清アルブミンに対する結合特異性を有する以前に設計されたアンキリン反復ドメイン（国際公開第２０１２／０６９６５４号）と比べて改善された安定性を有するバリアントであるにもかかわらず、高温でのインキュベーションでは安定ではないと思われることを我々は観察した（実施例２～６を参照）。したがって、本発明の目的は、血清アルブミン結合及び薬物動態特性を維持しながら、高温でのインキュベーション時に改善された安定性を示す、配列番号２のバリアントを提供することである。複数の位置で数回の変化するアミノ酸を含む高反復プロセス（例えば、当業者に周知のアラニンスキャニングプロセスに匹敵する）を通して、インビトロ及びインビボで得られたタンパク質バリアントを特徴付け、最終的には、改善された安定性特性を示す４つのバリアントをもたらした。予想に反して、これらのバリアントはすべて、位置７７及び／又は位置７８のアミノ酸Ａｓｐを伴い、ポリペプチド鎖分解の起点にあることが知られているアミノ酸を含む。非常に驚くべきことに、これらのバリアントの多くは、特にポリペプチド鎖分解を起こしやすいことが知られているＡｓｐ－Ｇｌｙ配列モチーフを含む。したがって、このプロセスは、驚くべきことに予期せぬバリアントをもたらした。
【0108】
配列番号２～６からなる設計されたアンキリン反復ドメインのそれぞれをコードするＤＮＡをｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクターにクローニングして、以下に記載されるように、Ｎ末端Ｈｉｓタグを提供して、単純なタンパク質精製を促進した。産生及び特性評価、並びにこれらの特に選択された配列の使用は、以下の実施例に記載されている。
【0109】
実施例２：タンパク質の発現及び精製
配列番号２～６からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を更に有するタンパク質、並びに配列番号７～１２からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を更に有するタンパク質を、大腸菌において産生し、均質に精製し、ＰＢＳ緩衝液中に保存した。明確にするために、タンパク質＃２～＃６は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインであり、タンパク質＃７～＃１２は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。タンパク質＃７及び＃８は、配列番号２の２回を含む。タンパク質＃９及び＃１０は、配列番号３を２回を含む。タンパク質＃１１及び＃１２は、配列番号４を２回を含む。タンパク質＃７は、国際公開第２０１６１５６５９６号の配列番号１３４から当業者において周知であり、タンパク質＃８は、国際公開第２０１８０５４９７１号の配列番号２１から当業者に周知である。したがって、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であるタンパク質＃７と比べて、タンパク質＃９及び＃１１は、（ｉ）血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ（ｉｉ）改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。同様に、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であるタンパク質＃８と比べて、タンパク質＃１０及び＃１２は、（ｉ）血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ（ｉｉ）改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。この段落に記載されるように発現及び精製されたタンパク質を、実施例３～１２の実験に使用した。
配列番号２～６からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を更に有するタンパク質、並びに配列番号７～１２からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を更に有するタンパク質を、大腸菌において産生し、均質に精製し、ＰＢＳ緩衝液中に保存した。明確にするために、タンパク質＃２～＃６は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインであり、タンパク質＃７～＃１２は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。タンパク質＃７及び＃８は、配列番号２の２回を含む。タンパク質＃９及び＃１０は、配列番号３を２回を含む。タンパク質＃１１及び＃１２は、配列番号４を２回を含む。タンパク質＃７は、国際公開第２０１６１５６５９６号の配列番号１３４から当業者において周知であり、タンパク質＃８は、国際公開第２０１８０５４９７１号の配列番号２１から当業者に周知である。したがって、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であるタンパク質＃７と比べて、タンパク質＃９及び＃１１は、（ｉ）血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ（ｉｉ）改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。同様に、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であるタンパク質＃８と比べて、タンパク質＃１０及び＃１２は、（ｉ）血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ（ｉｉ）改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質である。この段落に記載されるように発現及び精製されたタンパク質を、実施例３～１２の実験に使用した。
【0110】
あるいは、配列番号２～１２からなり、更にＮ末端にアミノ酸ＧＳを有するタンパク質を、大腸菌において産生し、均質に精製し、ＰＢＳ緩衝液中に保存する。アミノ酸ＧＳがＮ末端にある場合、発現ベクターによって更にコードされたＭｅｔ残基は、小さなＧｌｙ残基が開始Ｍｅｔに後続するため、大腸菌の細胞質中で、発現されたポリペプチドから、効率的に切断される。配列番号２～１２からなり、更に、Ｎ末端にアミノ酸ＧＳを有するタンパク質は、配列番号２～１２からなり、更にそれらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を有するタンパク質と、実施例３～１２で同等の結果を示す。
【0111】
実施例３：貯蔵安定性インキュベーション
実施例２のタンパク質を、６０℃にて１週間（７日間）、１００マイクロモルのタンパク質濃度で様々なｐＨで貯蔵安定性について試験した。使用した緩衝液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩及び２．７ｍＭのＫＣｌ）、又はリン酸塩／クエン酸塩（ｐＨ５．７、３７５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍクエン酸塩一水和物を使用してｐＨ調整した）、又はリン酸塩／クエン酸塩（ｐＨ４．７５、３０ｍＭのクエン酸及び３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ調整した）、又はリン酸塩／クエン酸塩／ホウ酸塩（ｐＨ８．５、３０ｍＭのクエン酸、３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭのホウ酸）であった。それぞれの緩衝液とタンパク質と混合すると、得られたｐＨ値は、それぞれｐＨ７．４、ｐＨ６、ｐＨ５、又はｐＨ８．５であった。６０℃でのインキュベーションと並行して、タンパク質のアリコートを対照として－８０℃にて１週間（７日間）インキュベートした。
実施例２のタンパク質を、６０℃にて１週間（７日間）、１００マイクロモルのタンパク質濃度で様々なｐＨで貯蔵安定性について試験した。使用した緩衝液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩及び２．７ｍＭのＫＣｌ）、又はリン酸塩／クエン酸塩（ｐＨ５．７、３７５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍクエン酸塩一水和物を使用してｐＨ調整した）、又はリン酸塩／クエン酸塩（ｐＨ４．７５、３０ｍＭのクエン酸及び３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ調整した）、又はリン酸塩／クエン酸塩／ホウ酸塩（ｐＨ８．５、３０ｍＭのクエン酸、３０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭのホウ酸）であった。それぞれの緩衝液とタンパク質と混合すると、得られたｐＨ値は、それぞれｐＨ７．４、ｐＨ６、ｐＨ５、又はｐＨ８．５であった。６０℃でのインキュベーションと並行して、タンパク質のアリコートを対照として－８０℃にて１週間（７日間）インキュベートした。
【0112】
異なるｐＨで６０℃でのインキュベーション中の安定性は、製造プロセスが、ポリペプチドがそのような条件に曝露される１つ以上のプロセスステップを含み得るため、設計されたアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質の製造に工業的に関連している。また、当業者は、高温でのインキュベーションの工程を含む、加速貯蔵安定性測定によって貯蔵安定性を決定する。
【0113】
実施例４：貯蔵安定性分析試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
実施例３のタンパク質の試料（各レーン１０マイクログラムのタンパク質）を、ＮｕＰＡＧＥ４－１２％ビス－トリス－ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で分析し、インスタント青色染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。結果を図３に示す。全てのタンパク質は、約１４．４ｋＤａの予想されるサイズに主バンドを示す。いくつかのタンパク質は、より低い分子量での追加のバンド（低分子量生成物）及び／又はより高分子量でのバンド（高分子量生成物）を示す。タンパク質＃３及び＃４は、タンパク質＃２と比べて、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５でより低い量の低分子量生成物を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、低分子量生成物の低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも１０％である。同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、低分子量生成物の量の低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも５０％である。同様に、タンパク質＃２は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも５０％以上のより低分子量生成物又はより低い分子量生成物バンドを示す。驚くべきことに、タンパク質＃２は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、より高い分子量バンドを示す。タンパク質＃３及び＃４は、より高い分子量バンドを示さないように見え、すなわち、改善された安定性を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、タンパク質＃２をタンパク質＃３及び＃４と比較するときのより高い分子量のバンド生成物のバンドの低減は、ｐＨ７．４で少なくとも５０％、ｐＨ６で少なくとも５０％、及びｐＨ５で少なくとも５０％である。同様に、タンパク質＃２は、ｐＨ７．４で少なくとも１０％、ｐＨ６で少なくとも２０％、ｐＨ５で少なくとも５０％に達する高分子量バンド及び／又は高分子量生成物の増加を示す。
実施例３のタンパク質の試料（各レーン１０マイクログラムのタンパク質）を、ＮｕＰＡＧＥ４－１２％ビス－トリス－ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で分析し、インスタント青色染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。結果を図３に示す。全てのタンパク質は、約１４．４ｋＤａの予想されるサイズに主バンドを示す。いくつかのタンパク質は、より低い分子量での追加のバンド（低分子量生成物）及び／又はより高分子量でのバンド（高分子量生成物）を示す。タンパク質＃３及び＃４は、タンパク質＃２と比べて、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５でより低い量の低分子量生成物を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、低分子量生成物の低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも１０％である。同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、低分子量生成物の量の低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも５０％である。同様に、タンパク質＃２は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも５０％以上のより低分子量生成物又はより低い分子量生成物バンドを示す。驚くべきことに、タンパク質＃２は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、より高い分子量バンドを示す。タンパク質＃３及び＃４は、より高い分子量バンドを示さないように見え、すなわち、改善された安定性を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの判定は、タンパク質＃２をタンパク質＃３及び＃４と比較するときのより高い分子量のバンド生成物のバンドの低減は、ｐＨ７．４で少なくとも５０％、ｐＨ６で少なくとも５０％、及びｐＨ５で少なくとも５０％である。同様に、タンパク質＃２は、ｐＨ７．４で少なくとも１０％、ｐＨ６で少なくとも２０％、ｐＨ５で少なくとも５０％に達する高分子量バンド及び／又は高分子量生成物の増加を示す。
【0114】
実施例５：貯蔵安定性分析試料のＬａｂＣｈｉｐ分析
実施例３のタンパク質の試料を、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従ってＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ機器を使用して分析した。簡単に説明すると、試料を変性溶液と混合し、７０℃にて１０分間変性させ、続いてＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐで分析した。機器のソフトウェアを使用して実施試験を分析した。結果を図４に示す。タンパク質＃３及び＃４は、タンパク質＃２と比べて、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５でより低い量の分解生成物又は低分子量生成物を示す。ＬａｂＣｈｉｐデータからの判定は、分解生成物バンド又は低分子量生成物バンドの低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも１０％である。タンパク質＃２は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、高分子量バンドを示し、一方、タンパク質＃３及び＃４は、高分子量バンドを示さない。ＬａｂＣｈｉｐデータから判定すると、高分子量バンド生成物バンドの低減は、ｐＨ７．４で少なくとも１０％、及びｐＨ６で少なくとも５０％である（表１を参照）。この実施例では、タンパク質＃２～＃４について、バンドは、２５ｋＤａよりも大きい場合、ＬａｂＣｈｉｐ分析において高分子量バンドと見なされる。この実施例では、タンパク質＃２～＃４について、バンドは、１０ｋＤａよりも小さい場合、ＬａｂＣｈｉｐ分析において低分子量バンドと見なされる。タンパク質調製物の高純度を仮定すると、そのような低分子量バンドは、分解生成物バンドと見なすことができる。
実施例３のタンパク質の試料を、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従ってＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ機器を使用して分析した。簡単に説明すると、試料を変性溶液と混合し、７０℃にて１０分間変性させ、続いてＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐで分析した。機器のソフトウェアを使用して実施試験を分析した。結果を図４に示す。タンパク質＃３及び＃４は、タンパク質＃２と比べて、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５でより低い量の分解生成物又は低分子量生成物を示す。ＬａｂＣｈｉｐデータからの判定は、分解生成物バンド又は低分子量生成物バンドの低減は、ｐＨ７．４、ｐＨ６、及び／又はｐＨ５で少なくとも１０％である。タンパク質＃２は、６０℃にて１週間インキュベートした際に、高分子量バンドを示し、一方、タンパク質＃３及び＃４は、高分子量バンドを示さない。ＬａｂＣｈｉｐデータから判定すると、高分子量バンド生成物バンドの低減は、ｐＨ７．４で少なくとも１０％、及びｐＨ６で少なくとも５０％である（表１を参照）。この実施例では、タンパク質＃２～＃４について、バンドは、２５ｋＤａよりも大きい場合、ＬａｂＣｈｉｐ分析において高分子量バンドと見なされる。この実施例では、タンパク質＃２～＃４について、バンドは、１０ｋＤａよりも小さい場合、ＬａｂＣｈｉｐ分析において低分子量バンドと見なされる。タンパク質調製物の高純度を仮定すると、そのような低分子量バンドは、分解生成物バンドと見なすことができる。
【0115】
【表2】
【0116】
実施例６：貯蔵安定性分析試料のサイズ排除クロマトグラフィー分析
実施例３の試料を、ＧＥ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １５０／５カラムで、０．５ｍｌ／分の流量でＰＢＳ中で、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムで分析した。各タンパク質のうち、１００マイクロモルの－８０℃対照試料及び６０℃のインキュベーション試料の各々の０．１ｍｌを分析した。サイズ排除クロマトグラム（３６０ｎｍの光学密度によって差し引かれた２８０ｎｍでの光学密度）を図５ａ（ｐＨ７．４）、図５ｂ（ｐＨ６）、及び図５ｃ（ｐＨ５）に示す。タンパク質＃３及び＃４は、－８０℃対照試料と６０℃のインキュベーション試料とのほぼ重複するクロマトグラムをｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で示す。タンパク質＃２は、－８０℃対照試料と６０℃のインキュベーション試料とのほぼ重複するクロマトグラムをｐＨ７．４、及びｐＨ６で示す。対照的に、タンパク質＃２は、ｐＨ５での－８０℃対照試料と比較して、６０℃のインキュベーション試料中のより高い見かけの分子量種の明確な増加を示した。６０℃のインキュベーション試料中のｐＨ５でのタンパク質＃２のより高い見かけの分子量種は、曲線下総面積の２５％に対応し、一方、ｐＨ５でのタンパク質＃２－８０℃対照試料は、より高い見かけの分子量種を示さない。この実施例におけるより高い見かけの分子量種は、約４．１分でピークで溶出する種である。予想される見かけの分子量種は、約４．６分でピークで溶出する種である。タンパク質＃３及び＃４は、ｐＨ５で６０℃のインキュベーション試料中により高い見かけの分子量種を示さない。
実施例３の試料を、ＧＥ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １５０／５カラムで、０．５ｍｌ／分の流量でＰＢＳ中で、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムで分析した。各タンパク質のうち、１００マイクロモルの－８０℃対照試料及び６０℃のインキュベーション試料の各々の０．１ｍｌを分析した。サイズ排除クロマトグラム（３６０ｎｍの光学密度によって差し引かれた２８０ｎｍでの光学密度）を図５ａ（ｐＨ７．４）、図５ｂ（ｐＨ６）、及び図５ｃ（ｐＨ５）に示す。タンパク質＃３及び＃４は、－８０℃対照試料と６０℃のインキュベーション試料とのほぼ重複するクロマトグラムをｐＨ７．４、ｐＨ６、及びｐＨ５で示す。タンパク質＃２は、－８０℃対照試料と６０℃のインキュベーション試料とのほぼ重複するクロマトグラムをｐＨ７．４、及びｐＨ６で示す。対照的に、タンパク質＃２は、ｐＨ５での－８０℃対照試料と比較して、６０℃のインキュベーション試料中のより高い見かけの分子量種の明確な増加を示した。６０℃のインキュベーション試料中のｐＨ５でのタンパク質＃２のより高い見かけの分子量種は、曲線下総面積の２５％に対応し、一方、ｐＨ５でのタンパク質＃２－８０℃対照試料は、より高い見かけの分子量種を示さない。この実施例におけるより高い見かけの分子量種は、約４．１分でピークで溶出する種である。予想される見かけの分子量種は、約４．６分でピークで溶出する種である。タンパク質＃３及び＃４は、ｐＨ５で６０℃のインキュベーション試料中により高い見かけの分子量種を示さない。
【0117】
実施例７：親和性測定
実施例２のタンパク質のヒト血清アルブミンへの親和性を、当業者に既知の標準的な手順に従ってＰＢＳ中のＰｒｏｔｅＯｎシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用したＳＰＲ測定によって決定した。決定された親和性を、表２に列挙する。血清アルブミンに対する結合特異性を有する全ての設計されたアンキリン反復ドメインは、＜１００ｎＭの解離定数ＫＤを示し、この解離定数は、同等の範囲内にある。
実施例２のタンパク質のヒト血清アルブミンへの親和性を、当業者に既知の標準的な手順に従ってＰＢＳ中のＰｒｏｔｅＯｎシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用したＳＰＲ測定によって決定した。決定された親和性を、表２に列挙する。血清アルブミンに対する結合特異性を有する全ての設計されたアンキリン反復ドメインは、＜１００ｎＭの解離定数ＫＤを示し、この解離定数は、同等の範囲内にある。
【0118】
【表3】
【0119】
実施例８：血清アルブミン種交差反応性
実施例２のタンパク質の試料を、国際公開第２０１６１５６５９６号に記載されているように、ＥＬＩＳＡ血清アルブミン交差反応性分析に供した。１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中２０ｎＭ血清アルブミンを、４℃にて一晩Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に固定化した。３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄後、ウェルを３００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ（０．２５％のカゼインを補充したＰＢＳＴ）で、Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００シェーカー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間ブロックした。上記のように５回洗浄した後、ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌ／ウェル又は５０μｌ／ウェルのタンパク質＃２、＃３、又は＃４（各タンパク質について１００ｎＭ～０．０１ｐＭの範囲の濃度）を加え、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。上記のように５回洗浄した後、タンパク質の結合を、１００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ中のウサギ抗設計されたアンキリン反復ドメインモノクローナル抗体を使用し、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間検出した。上記のように５回洗浄した後、結合した抗設計されたアンキリン反復ドメイン抗体を、１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ－Ｃ中のヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを使用し、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間検出した。上記のように５回洗浄した後、１００μｌの水中１：４で希釈したＢＭ可溶性ブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、ＥＬＩＳＡを実施した。反応は、５分後に、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して停止した。続いて、ＯＤ（ＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ）を記録した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して決定した（表３）。分析は、ヒト、カニクイザル、及びマウスの血清アルブミンが高親和性で結合していることを示す。ヒト血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について１ｎＭ未満である。カニクイザル血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について２０ｎＭ未満である。マウス血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について３０ｎＭ未満である。
実施例２のタンパク質の試料を、国際公開第２０１６１５６５９６号に記載されているように、ＥＬＩＳＡ血清アルブミン交差反応性分析に供した。１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中２０ｎＭ血清アルブミンを、４℃にて一晩Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に固定化した。３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄後、ウェルを３００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ（０．２５％のカゼインを補充したＰＢＳＴ）で、Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００シェーカー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間ブロックした。上記のように５回洗浄した後、ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌ／ウェル又は５０μｌ／ウェルのタンパク質＃２、＃３、又は＃４（各タンパク質について１００ｎＭ～０．０１ｐＭの範囲の濃度）を加え、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間インキュベートした。上記のように５回洗浄した後、タンパク質の結合を、１００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ中のウサギ抗設計されたアンキリン反復ドメインモノクローナル抗体を使用し、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間検出した。上記のように５回洗浄した後、結合した抗設計されたアンキリン反復ドメイン抗体を、１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ－Ｃ中のヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを使用し、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間検出した。上記のように５回洗浄した後、１００μｌの水中１：４で希釈したＢＭ可溶性ブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、ＥＬＩＳＡを実施した。反応は、５分後に、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して停止した。続いて、ＯＤ（ＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ）を記録した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して決定した（表３）。分析は、ヒト、カニクイザル、及びマウスの血清アルブミンが高親和性で結合していることを示す。ヒト血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について１ｎＭ未満である。カニクイザル血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について２０ｎＭ未満である。マウス血清アルブミン結合についての測定されたＥＣ５０値は、タンパク質＃２、＃３、及び＃４について３０ｎＭ未満である。
【0120】
【表4】
【0121】
実施例９：血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのマウスにおける薬物動態プロファイル
薬物動態分析を、実施例２に記載されるように生成されたタンパク質＃２、＃３、及び＃４を使用して、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスで行った。タンパク質を、尾静脈への静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇで適用した。各タンパク質について、３匹のマウスごとの２つの群に分けた６匹のマウスを使用した。全てのタンパク質について、１つの群の注射後５分、２４時間、７２時間、１６８時間、及び３６０時間のマウスから、及び他の群の注射後４時間、４８時間、１４４時間、及び１６８時間のマウスから血液を採取した。血液試料を室温で放置し、遠心分離し、当業者に周知の手順を使用して血清を生成し、続いて－８０℃にて保存して、分析を待った。タンパク質＃２、＃３、＃４の血清濃度を、ウサギモノクローナル抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を捕捉試薬として、及び高ＲＧＳ－Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲートを検出試薬として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、標準曲線を使用して測定した。モノクローナル抗ＤＡＲＰｉｎ抗体は、当業者に周知の従来のウサギ免疫化及びハイブリドーマ生成技術を使用して生成され、モノクローナル抗体のタンパク質＃２～＃１６への結合は、濃度決定実験前に検証された。簡単に言うと、１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１０ｎＭのヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、４℃にて一晩Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に固定化した。３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄後、ウェルを３００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ（０．２５％のカゼインを補充したＰＢＳＴ）で、Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００シェーカー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間ブロックした。上記のように５回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ－Ｃ中の５ｎＭウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間添加した。上記のように５回洗浄した後、ＰＢＳＴ－Ｃで希釈した血清試料又は参照基準の異なる希釈物を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間添加した。上記のように５回洗浄した後、５０μｌの、ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００ｎｇ／ｍｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲート（ＱＩＡｇｅｎ）を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間添加した。上記のように５回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ基質を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。反応は、５分後に、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して停止した。続いて、ＯＤ（ＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ）を記録した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＵＳＡ））又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））等の標準的なソフトウェア及び非コンパートメント解析等の標準的な解析（全て、当業者に周知である）を使用して測定した。得られた薬物動態プロファイルを図６ａに示す。測定値から導出した薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表４に列挙する。
薬物動態分析を、実施例２に記載されるように生成されたタンパク質＃２、＃３、及び＃４を使用して、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスで行った。タンパク質を、尾静脈への静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇで適用した。各タンパク質について、３匹のマウスごとの２つの群に分けた６匹のマウスを使用した。全てのタンパク質について、１つの群の注射後５分、２４時間、７２時間、１６８時間、及び３６０時間のマウスから、及び他の群の注射後４時間、４８時間、１４４時間、及び１６８時間のマウスから血液を採取した。血液試料を室温で放置し、遠心分離し、当業者に周知の手順を使用して血清を生成し、続いて－８０℃にて保存して、分析を待った。タンパク質＃２、＃３、＃４の血清濃度を、ウサギモノクローナル抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を捕捉試薬として、及び高ＲＧＳ－Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲートを検出試薬として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、標準曲線を使用して測定した。モノクローナル抗ＤＡＲＰｉｎ抗体は、当業者に周知の従来のウサギ免疫化及びハイブリドーマ生成技術を使用して生成され、モノクローナル抗体のタンパク質＃２～＃１６への結合は、濃度決定実験前に検証された。簡単に言うと、１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１０ｎＭのヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、４℃にて一晩Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に固定化した。３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄後、ウェルを３００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ（０．２５％のカゼインを補充したＰＢＳＴ）で、Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００シェーカー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で１時間ブロックした。上記のように５回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ－Ｃ中の５ｎＭウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間添加した。上記のように５回洗浄した後、ＰＢＳＴ－Ｃで希釈した血清試料又は参照基準の異なる希釈物を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間添加した。上記のように５回洗浄した後、５０μｌの、ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００ｎｇ／ｍｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲート（ＱＩＡｇｅｎ）を、４５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間添加した。上記のように５回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ基質を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。反応は、５分後に、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して停止した。続いて、ＯＤ（ＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ）を記録した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＵＳＡ））又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））等の標準的なソフトウェア及び非コンパートメント解析等の標準的な解析（全て、当業者に周知である）を使用して測定した。得られた薬物動態プロファイルを図６ａに示す。測定値から導出した薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表４に列挙する。
【0122】
【表5】
【0123】
実施例１０：血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインのカニクイザルにおける薬物動態プロファイル
薬物動態分析は、３０分の静脈内注入投与を介して投与された１ｍｇ／ｋｇの各タンパク質についての２匹の雄カニクイザルで行った。すべてのタンパク質について、注射後、５分、６時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、３３６時間、４０８時間、５０４時間、及び６７２時間に全ての動物から血液を採取した。血液試料を室温で放置し、遠心分離し、当業者に周知の手順を使用して血清を生成し、続いて－８０℃にて保存して、分析を待った。タンパク質＃２、＃３、及び＃４の血清濃度を、実施例９に記載のように、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＵＳＡ））又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））等の標準的なソフトウェア及び非コンパートメント解析等の標準的な解析（全て、当業者に周知である）を使用して測定した。得られた薬物動態プロファイルを図６ｂに示す。測定値から導出した薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表５に列挙する。
薬物動態分析は、３０分の静脈内注入投与を介して投与された１ｍｇ／ｋｇの各タンパク質についての２匹の雄カニクイザルで行った。すべてのタンパク質について、注射後、５分、６時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、３３６時間、４０８時間、５０４時間、及び６７２時間に全ての動物から血液を採取した。血液試料を室温で放置し、遠心分離し、当業者に周知の手順を使用して血清を生成し、続いて－８０℃にて保存して、分析を待った。タンパク質＃２、＃３、及び＃４の血清濃度を、実施例９に記載のように、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。薬物動態パラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＵＳＡ））又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ））等の標準的なソフトウェア及び非コンパートメント解析等の標準的な解析（全て、当業者に周知である）を使用して測定した。得られた薬物動態プロファイルを図６ｂに示す。測定値から導出した薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表５に列挙する。
【0124】
【表6】
【0125】
実施例１１：血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを使用する組換え結合タンパク質の生成及び特性評価
血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を、組換えＤＮＡ技術によって生成した。配列番号７～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。タンパク質＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１、及び＃１２（配列番号７～１２からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を有する、実施例２を参照）を、実施例３に記載されるように産生した。同様に、配列番号７～１２からなり、それぞれがＮ末端にアミノ酸ＭＧＳを更に担持しているタンパク質（Ｎ末端メチオニンは、小さなＧｌｙ残基が開始Ｍｅｔに後続するため、発現されたポリペプチドから大腸菌の細胞質において効率的に切断される）を大腸菌で産生し、従来の方法を使用して精製され得る。
血清アルブミンに対する結合特異性を有し、かつ改善された貯蔵安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を、組換えＤＮＡ技術によって生成した。配列番号７～１２は、そのような組換え結合タンパク質の例である。タンパク質＃７、＃８、＃９、＃１０、＃１１、及び＃１２（配列番号７～１２からなり、それらのＮ末端に融合させたＨｉｓタグの配列番号１を有する、実施例２を参照）を、実施例３に記載されるように産生した。同様に、配列番号７～１２からなり、それぞれがＮ末端にアミノ酸ＭＧＳを更に担持しているタンパク質（Ｎ末端メチオニンは、小さなＧｌｙ残基が開始Ｍｅｔに後続するため、発現されたポリペプチドから大腸菌の細胞質において効率的に切断される）を大腸菌で産生し、従来の方法を使用して精製され得る。
【0126】
組換え結合タンパク質を、実施例３～６に従って、安定性の改善について評価する。配列番号９及び１１からなる組換え結合タンパク質は、配列番号７からなる組換え結合タンパク質よりも高い安定性を示す。同様に、配列番号１０及び１２からなる組換え結合タンパク質は、配列番号８からなる組換え結合タンパク質よりも高い安定性を示す。
【0127】
実施例１２：血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質のマウスにおける薬物動態プロファイル
薬物動態分析を、全て実施例２に記載されるように生成されたタンパク質＃７、＃９、及び＃１１を使用して、並びにタンパク質＃８、＃１０、及び＃１２を使用して、マウスで行った。試験を、タンパク質当たり３匹のマウスを使用し、注射後５分、４時間、４８時間、及び９６時間に血液を採取して、実施例９に記載されるように本質的に実施した。濃度測定及び薬物動態パラメータの濃度測定を、実施例９に記載されるように実施した。タンパク質＃７、＃９、及び＃１１の比較のために、薬物動態トレースを図７ａに示し、全てのタンパク質の測定値から導出した、薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表６に列挙する。タンパク質＃８、＃１０、及び＃１２の比較のために、薬物動態トレースを図７ｂに示し、全てのタンパク質の測定値から導出した、薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表７に列挙する。
薬物動態分析を、全て実施例２に記載されるように生成されたタンパク質＃７、＃９、及び＃１１を使用して、並びにタンパク質＃８、＃１０、及び＃１２を使用して、マウスで行った。試験を、タンパク質当たり３匹のマウスを使用し、注射後５分、４時間、４８時間、及び９６時間に血液を採取して、実施例９に記載されるように本質的に実施した。濃度測定及び薬物動態パラメータの濃度測定を、実施例９に記載されるように実施した。タンパク質＃７、＃９、及び＃１１の比較のために、薬物動態トレースを図７ａに示し、全てのタンパク質の測定値から導出した、薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表６に列挙する。タンパク質＃８、＃１０、及び＃１２の比較のために、薬物動態トレースを図７ｂに示し、全てのタンパク質の測定値から導出した、薬物動態パラメータの曲線下面積、クリアランス、分布の体積、及び半減期を表７に列挙する。
【0128】
【表7】
【0129】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【配列表】
【国際調査報告】