特表 2022-535107 組換え４－１ＢＢ結合タンパク質及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-04

(54)【発明の名称】組換え４－１ＢＢ結合タンパク質及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220728BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20220728BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220728BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220728BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220728BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220728BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220728BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/435 ZNA

C07K19/00

C12N15/62 Z

A61K48/00

A61K31/7088

A61P35/00

A61P43/00 105

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021571940

(86)(22)【出願日】2020-06-03

(85)【翻訳文提出日】2022-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2020065319

(87)【国際公開番号】W WO2020245175

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】19178280.4

(32)【優先日】2019-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515146556

【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ライヒェン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】リンク， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ヘップ， ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】レヴィツキー， ヴィクトル

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA02

4C084BA21

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZB21

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び４－１ＢＢを発現する細胞において４－１ＢＢを活性化する方法での、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用、例えば、腫瘍局在性Ｔリンパ球、及びヒトを含む哺乳動物におけるがんといった疾患の治療又は診断のための使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインは、４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５８～７１と、
（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質。

【請求項2】

前記アンキリン反復モジュールが、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、６９と、
（２）配列番号５８、５９、６７、６８、６９のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。

【請求項3】

前記アンキリン反復モジュールが、第１のアンキリン反復モジュールであり、かつ（１）配列番号５８と、
（２）配列番号５８における最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号５９と、
（２）配列番号５９の最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復モジュールを更に含む、請求項１に記載の結合タンパク質。

【請求項4】

前記第１のアンキリン反復モジュールが、前記アンキリン反復ドメイン内の前記第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する、請求項３に記載の結合タンパク質。

【請求項5】

アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインは、４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号１～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳが、任意選択的に欠損しており、
並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮが、
Ａにより任意選択的に置換されている、組換え結合タンパク質。

【請求項6】

前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
前記アンキリン反復ドメインの位置１に置けるＧ及び／又は位置２におけるＳが、任意選択的に欠損している、請求項５に記載の結合タンパク質。

【請求項7】

前記アンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項8】

前記組換え結合タンパク質が、４－１ＢＢに対する結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項9】

前記結合タンパク質が、ローカライザ分子を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする核酸。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項１０に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。

【請求項12】

ヒトを含む哺乳動物における４－１ＢＢ発現細胞中の４－１ＢＢの局所的活性化の方法であって、請求項９に記載の結合タンパク質を前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。

【請求項13】

医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量である請求項９に記載の結合タンパク質を投与する工程を含む、方法。

【請求項14】

前記４－１ＢＢ発現細胞が、腫瘍中に位置する、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記医学的状態が、がんである、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、欧州特許庁に２０１９年６月０４日出願の欧州特許出願公開第ＥＰ１９１７８２８０号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願公開第ＥＰ１９１７８２８０の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（開示の分野）
本発明は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び４－１ＢＢを発現する細胞において４－１ＢＢを活性化する方法での、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用、例えば、腫瘍局在性Ｔリンパ球、及びヒトを含む哺乳動物におけるがんといった疾患の治療又は診断のための使用に関する。

【背景技術】

【0003】

免疫チェックポイント阻害剤は多くのがん治療に革命をもたらしたが、その有用性を広げるために有意な改善が必要である。チェックポイント阻害（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１を標的化）は、一部の患者において持続的な臨床的利益を有し非常に効果的であるが、ほとんどの患者（７０～８０％）は、全く利益が得られないか、又は最小限の利益しか得られないようである。Ｔ細胞共刺激は、応答者の割合、及び長期的な利益を有する患者の数を増加させるための有望なアプローチと考えられている（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、「Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ」（２０１６年）、第９巻第８９～１０４頁；Ａｌｓａａｂら、「Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（２０１７年）第８巻第５６１頁）。

【0004】

ＴＮＦ受容体（TNF receptor：ＴＮＦＲ）ファミリーメンバー４－１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳＦ９）は、重要な共刺激受容体であり、そのリガンドによって、又はアゴニスト抗体によって連結される場合、特定のリンパ球応答の制御に関与する。例えば、４－１ＢＢのライゲーションは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞において活性化シグナルを誘導し、増殖の増加、炎症性サイトカイン分泌、細胞溶解機能、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらす。加えて、４－１ＢＢは、Ｔ細胞メモリプールの確立及び維持を促進し、制御性Ｔ細胞（regulatory T-cell：Ｔｒｅｇ）の機能的活性に対して阻害効果を有することが示唆されている（Ｗａｎｇら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００９年）第２２９巻第１号第１９２～２１５頁；Ｃｒｏｆｔら、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２００９年）第９巻第２７１～２８５頁）。また、活性化された正常Ｂ細胞では、Ｂ細胞受容体の連結時に４－１ＢＢとそのリガンドとの相互作用が増殖を刺激し、生存を増強する（Ｚｈａｎｇ Ｘら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２０１０年）第１８４巻第２号第７８７～７９５頁）。

【0005】

これらの共刺激特性と一致して、４－１ＢＢは、抗ウイルス性Ｔ細胞応答（Ｌｉｎら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００９年）第１８２巻第２号第９３４～４７頁）、及び抗腫瘍性Ｔ細胞応答（Ｌｙｎｃｈら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００８年）第２２巻第２７７～２８６頁；Ｃｕｒｒａｎら、「ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．」（２０１１年）第６巻第４号第ｅ１９４９９頁）の両方を促進する。

【0006】

４－１ＢＢ（すなわち、４－１ＢＢＬ）を刺激するリガンドは、活性化した抗原提示細胞（antigen-presenting cell：ＡＰＣ）、骨髄系前駆細胞、及び造血幹細胞上で発現される。４－１ＢＢは、細胞応答を刺激するためにその三量体リガンド（４－１ＢＢＬ）に結合すると、受容体三量形成をされると考えられている（Ｂｉｔｒａ Ａら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（２０１８年）第２９３巻第４号第１３１７～１３２９頁；Ｃｈｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」（２０１８年）第９巻第４６７９頁）。

【0007】

前臨床モデルでのアゴニスト分子による４－１ＢＢ活性化は、腫瘍増殖の制御を促進する。例えば、リツキシマブを有するＢリンパ腫細胞及びＮＫ細胞のインビトロ培養物に４－１ＢＢアゴニストを添加すると、リンパ腫の死滅が増加した（Ｋｏｈｒｔら、「Ｂｌｏｏｄ」（２０１１年）第１１７巻第８号第２４２３～２４３２頁）。更に、４－１ＢＢアゴニストｍＡｂは共刺激分子発現を増加させ、細胞溶解性Ｔリンパ球応答を著しく増強し、様々なモデルにおける抗腫瘍効果をもたらすことが示されている。これにより、４－１ＢＢアゴニストｍＡｂは、予防及び治療の設定で有効性を実証し、単独療法に関連する腫瘍モデルにおいて、他の免疫調節分子（ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＯＸ４０、ＰＤ－１／ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３）、放射線療法、化学療法、又は腫瘍特異的ワクチン接種と組み合わせて適用した場合に、耐久性のある抗腫瘍保護Ｔ細胞メモリ応答を確立した（Ｃｈｅｓｔｅｒら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ」（２０１６年）第６５巻第１２４３～１２４８頁、Ｌｙｎｃｈら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００８年）第２２２号第２７７～２８６頁）。４－１ＢＢアゴニストはまた、様々な自己免疫モデルにおいて自己免疫反応を阻害する。例えば、４－１ＢＢは、一連の動物モデルにおける自己免疫を改良することが見出されている（Ｖｉｎａｙら、「Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．」（２００６年）第８４巻第９号第７２６～７３６頁）（コラーゲン誘発関節炎（Ｓｅｏら、（２００４年）「Ｎａｔ Ｍｅｄ．」第１０巻第１０号第１０８８～９４頁）、及び全身性エリテマトーデス（Ｓｕｎら、（２００２年）「Ｎａｔ Ｍｅｄ．」第８巻第１２号第１４０５～１３頁）を含む）。

【0008】

マウス腫瘍モデルにおけるそれらの強力な活性のために、４－１ＢＢを標的とするアゴニスト抗体は、とりわけメラノーマ及びリンパ腫の臨床試験に入っている。しかしながら、前臨床的な有望性を患者への臨床的利益に変換することは未だ達成されておらず、実際に、進歩は期待外れなものである。臨床学への最近の参入は、二重特異性ＨＥＲ２－ＣＤ１３７標的化分子（抗体－アンチカリン（anticalin）コンジュゲート）であるＰＲＳ－３４３であり、その潜在的活性は、ＨＥＲ２陽性がんに限定される。２つの４－１ＢＢ抗体であるウトミルマブ（Utomilumab）及びウレルマブ（Urelumab）は、臨床的に最も進歩した４－１ＢＢ活性化治療候補である。これら２つの４－１ＢＢアゴニスト抗体は、いくつかの臨床試験で調査されており、ウレルマブによる肝毒性の産生、及び両方に対する不充分な治療有効性データは期待外れであった。ウレルマブによって引き起こされる肝毒性は全身の４－１ＢＢ活性化に起因し得、この低い治療有効性は、腫瘍における４－１ＢＢの活性化の効力が低いことに起因する可能性が高い。ウレルマブが第１相単独療法研究の初期で用量制限肝毒性を引き起こしたことで、その後の研究では、安全であるが潜在的に最適ではない用量を使用した（Ｓｅｇａｌら、（２０１６年）「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」第２３巻第８号第１９２９～３６頁）。効力の低い（約１０倍）ウトミルマブは、副作用が少なく肝毒性は無かったが、第１相単独療法研究では説得力のある抗腫瘍活性も有しなかった（Ｃｈｅｓｔｅｒら、（２０１８年）「Ｂｌｏｏｄ」第１３１巻第１号第４９～５７頁；Ｓｅｇａｌら、（２０１８年）「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」第２４巻第８号第１８１６～１８２３頁）。

【0009】

したがって、がんを含む疾患の治療及び特徴付けのための治療的及び診断的アプローチが依然として必要であり、４－１ＢＢ特異的結合及び活性化に有益である。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質を提供する。更に、結合タンパク質による４－１ＢＢのクラスタリング媒介活性化を促進する、１つ以上のローカライザ分子に結合したそのような結合タンパク質が提供される。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、及びそのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、４－１ＢＢ発現細胞又は腫瘍組織などの組織における４－１ＢＢの局所的活性化、及びヒトを含む哺乳動物におけるがんなどの疾患を治療及び診断するための方法における、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用を提供する。

【0011】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質を提供し、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のアンキリン反復ドメインのいずれか１つと少なくとも７５％～最大１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の当該アンキリン反復ドメインの最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一例として、特定の一実施形態では、本発明の４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一態様では、本発明は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質を提供し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５８～７１のアンキリン反復モジュールのいずれか１つと少なくとも８０％～最大１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復モジュールを含む。一例として、特定の一実施形態では、本発明の４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５８及び５９から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む。特定の一実施形態では、本発明の４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュール及び配列番号５９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む。

【0013】

別の態様では、本発明は、そのような４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、ローカライザ分子を更に含む。ローカライザ分子は、異なる構造的及び機能的クラスの分子から選択されてもよい。例えば、ローカライザは、ポリペプチド結合ドメイン、細胞表面受容体リガンド、又はそのフラグメント若しくはバリアント、抗体若しくはそのフラグメント若しくはバリアント、又は足場に基づく抗体様タンパク質であってもよい。本発明の一態様では、ローカライザ分子は、４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質に共有結合している。共有結合は、融合タンパク質をもたらす、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質とローカライザペプチド又はポリペプチドとの間のペプチド結合であってもよい。あるいは、ローカライザ分子は、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質に共有結合してもよい。

【0014】

特定の一実施形態では、本発明の４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、例えば腫瘍関連抗原などのがん生物学に関連するローカライザ標的タンパク質に対して結合特異性を有する、ローカライザに融合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。例として、特定の一実施形態では、本発明の４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、フィブロネクチン・エキストラ・ドメインＢ（extra domain B：ＥＤ－Ｂ）、腫瘍抗原Ａ（Tumor Antigen A：ＴＡＡ）、上皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）、又はヒト上皮増殖因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2：ＨＥＲ２）に対して結合特異性を有する、別のアンキリン反復ドメインに融合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

【0015】

別の態様では、本発明は、本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質をコードする核酸と、本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質又は核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物と、を提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、哺乳動物における４－１ＢＢ発現細胞又は組織中の４－１ＢＢの局所的活性化の方法を提供し、この方法は、ローカライザ分子を含む本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質を当該哺乳動物に投与することを含む。特定の一実施形態では、そのような方法は、４－１ＢＢ発現細胞又は腫瘍組織中で４－１ＢＢの局所的活性化をもたらす、４－１ＢＢ発現細胞又は組織を含む腫瘍を有するヒト患者を含む哺乳動物に、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質を投与することを含む。特定の実施形態では、そのような４－１ＢＢ特異的結合タンパク質は、配列番号１若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は同等の４－１ＢＢ結合特異性を有する配列番号１若しくは配列番号５の配列変異体のアミノ酸配列を含む。

【0017】

別の態様では、本発明は、ヒト患者における医学的状態を治療するための方法を提供し、この方法は、ローカライザ分子に共有結合しているか又はローカライザ分子を含む本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質を当該患者に投与することを含み、このローカライザ分子は、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質によって４－１ＢＢの局所活性化を媒介する。特定の一実施形態では、医学的状態は、がんであり、ここで、がん又は腫瘍組織は４－１ＢＢを発現する細胞を含み、ローカライザ分子は当該がん又は腫瘍組織において過剰発現された標的に結合する。特定の一実施形態では、当該標的は、当該がん又は腫瘍組織において発現又は過剰発現される細胞表面タンパク質の細胞外ドメインである。一実施形態では、当該がんは、結腸直腸がん、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、肺がん、浸潤性膀胱がん、膵がん、脳頭頸部扁平上皮細胞がんの転移性がん、食道扁平上皮細胞がん、肺扁平上皮細胞がん、皮膚扁平上皮細胞がん、メラノーマ、乳腺がん、肺腺がん、子宮頸部扁平上皮細胞がん、膵臓扁平上皮細胞がん、結腸扁平上皮細胞がん、若しくは胃扁平上皮細胞がん、前立腺がん、骨肉腫、又は軟部組織肉腫及び良性腫瘍から選択される。一実施形態では、そのようながんは、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、及び乳がん、並びに骨及び軟部組織肉腫を含む、上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）から選択される。

【0018】

本発明は更に、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を含む、キットを提供する。本発明は更に、本発明の組換え結合タンパク質を生成するための方法を提供し、この方法は、（ｉ）細菌中の当該組換え結合タンパク質を発現する工程、及び（ｉｉ）クロマトグラフィを用いて当該組換え結合タンパク質を精製する工程を含む。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ヒト４－１ＢＢ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番に対して結合特異性を有する、２つの選択されたアンキリン反復タンパク質の精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍはタンパク質サイズマーカに対応する。マーカタンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。レーン１：１４．４ｋＤａの分子量を有する対照アンキリン反復タンパク質；レーン２：精製されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番；レーン３：精製されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番。

【図2A】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番（図２Ａ）に例証される、ヒト４－１ＢＢに結合するアンキリン反復タンパク質の表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）分析。様々な濃度（０．６、１．９、５．６、及び１６．７ｎＭ）の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オンレート及びオフレート測定のために不動化したヒト４－１ＢＢを有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質－４－１ＢＢ相互作用を決定した。ＲＵ：共鳴単位（Resonance Unit）；ｓ、秒数での時間。

【図2B】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番（図２Ｂ）に例証される、ヒト４－１ＢＢに結合するアンキリン反復タンパク質の表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）分析。様々な濃度（０．６、１．９、５．６、及び１６．７ｎＭ）の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オンレート及びオフレート測定のために不動化したヒト４－１ＢＢを有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質－４－１ＢＢ相互作用を決定した。ＲＵ：共鳴単位（Resonance Unit）；ｓ、秒数での時間。

【図3】４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質が細胞内で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力を試験するためのアッセイの概略図。

【図4A】図３に示すような細胞レポータアッセイで示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧ４）を、比較として試験した。図４Ａは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第９番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１３番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１７番、及び抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の曲線を示す。

【図4B】図３に示すような細胞レポータアッセイで示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧ４）を、比較として試験した。図４Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１０番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１１番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１４番、及び抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の曲線を示す。

【図4C】図３に示すような細胞レポータアッセイで示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧ４）を、比較として試験した。図４Ｃは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１２番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１８番、及び抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の曲線を示す。

【図4D】図３に示すような細胞レポータアッセイで示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧ４）を、比較として試験した。図４Ｄは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第８番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１９番、及び抗４－１ＢＢモノクローナル抗体の曲線を示す。

【図5】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番に例証されるような、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の活性化Ｔリンパ芽球細胞（イオノマイシン／ＰＭＡ刺激ＣＥＭ細胞）との結合。これらのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の濃度依存性結合曲線は、バックグラウンドに対する蛍光強度の中央値（median fluorescence intensity：ＭＦＩ）シグナルの決定された比に関連して示される。

【図6A】ＴＡＡ被覆ビーズの存在下において培養された４－１ＢＢ発現細胞に示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図６Ａは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番の曲線を示す。図６Ａはまた、ＴＡＡ被覆ビーズの不在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の結果も示す。

【図6B】ＴＡＡ被覆ビーズの存在下において培養された４－１ＢＢ発現細胞に示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図６Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番（ただし、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２番は除く）の曲線を示し、ＴＡＡ特異的ローカライザ分子を含む。

【図7A】ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞で示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図７Ａは、ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞（集団１）の存在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番の曲線を示す。図６Ａはまた、いかなるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質も存在しない場合の細胞の発光値も示す。

【図7B】ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞で示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図７Ｂは、ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞の別の集団（集団２）の存在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番の曲線を示す。図６Ｂはまた、いかなるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質も存在しない場合の細胞の発光値も示す。

【図8A】活性化Ｔリンパ芽球細胞（イオノマイシン／ＰＭＡ刺激ＣＥＭ細胞）との、様々なアンキリン反復タンパク質の結合。アンキリン反復タンパク質の濃度依存性結合曲線は、バックグラウンドに対する蛍光強度の中央値シグナルの決定された比に関連して示される。図８Ａは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５４番の曲線を示す。

【図8B】活性化Ｔリンパ芽球細胞（イオノマイシン／ＰＭＡ刺激ＣＥＭ細胞）との、様々なアンキリン反復タンパク質の結合。アンキリン反復タンパク質の濃度依存性結合曲線は、バックグラウンドに対する蛍光強度の中央値シグナルの決定された比に関連して示される。図８Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５２番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５５番の曲線を示す。

【図8C】活性化Ｔリンパ芽球細胞（イオノマイシン／ＰＭＡ刺激ＣＥＭ細胞）との、様々なアンキリン反復タンパク質の結合。アンキリン反復タンパク質の濃度依存性結合曲線は、バックグラウンドに対する蛍光強度の中央値シグナルの決定された比に関連して示される。図８Ｃは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５３番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５６番の曲線を示す。

【図9A】ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞又は野生型ＣＨＯ細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞で示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、ＮＦ－κＢ制御レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図９Ａは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５４番の曲線を示す。

【図9B】ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞又は野生型ＣＨＯ細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞で示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、ＮＦ－κＢ制御レポータ遺伝子活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図９Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５２番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５５番の曲線を示す。

【図10A】腫瘍間質におけるＥＤ－Ｂ発現は、免疫組織化学（図１０Ａ）によって示され、技術分野で既知の標準的な方法を用いてフローサイトメトリによって示される。

【図10B】腫瘍間質におけるＥＤ－Ｂ発現は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲ発現（図１０Ｂ）は、技術分野で既知の標準的な方法を用いてフローサイトメトリによって示される。

【図10C】腫瘍間質におけるＥＤ－Ｂ発現は、ＢＴ４７４細胞におけるＨＥＲ２発現（図１０Ｃ）は、技術分野で既知の標準的な方法を用いてフローサイトメトリによって示される。

【図11A】ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２発現細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞、又は組換えＥＤ－Ｂの存在下において示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子の活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図１１Ａは、組換えＥＤ－Ｂの存在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５７番、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５９番の曲線を示す。

【図11B】ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２発現細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞、又は組換えＥＤ－Ｂの存在下において示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子の活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図１１Ｂは、ＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞の存在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番の曲線を示す。

【図11C】ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２発現細胞と共培養された４－１ＢＢ発現細胞、又は組換えＥＤ－Ｂの存在下において示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、レポータ遺伝子の活性を反映する、決定された発光（ＡＵ）に関連して示される。図１１Ｃは、ＨＥＲ２発現ＢＴ４７４細胞の存在下における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５９番の曲線を示す。

【図12A】ＥＧＦＲ被覆プレート（図１２Ａ）の存在下における４－１ＢＢ発現初代ＣＤ８＋Ｔ細胞中に示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、４－１ＢＢシグナル伝達によって誘導される、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）の決定された分泌に関連して示されている。曲線は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５９番を表す。

【図12B】ＨＥＲ２被覆プレート（図１２Ｂ）の存在下における４－１ＢＢ発現初代ＣＤ８＋Ｔ細胞中に示される、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による４－１ＢＢシグナル伝達の活性化。濃度依存性曲線は、４－１ＢＢシグナル伝達によって誘導される、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）の決定された分泌に関連して示されている。曲線は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５９番を表す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書に開示及び例証されるように、本開示は、４－１ＢＢを特異的に標的化するアンキリン反復タンパク質を提供する。設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリ（国際公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第２２巻第５７５～５８２頁（２００４年）；Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」第１３巻第６９５～７０１頁（２００８年））は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計されたアンキリン反復タンパク質とは、モノクローナル抗体の制限を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規の治療アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」第１３巻第６９５～７０１頁（２００８）；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る、小さなタンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１つのタンパク質中の２つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、拮抗薬及び／又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクタ機能、例えば細胞傷害性薬剤又は半減期延長剤を運ぶように操作することができ、完全に新しい薬物形式を可能にする。まとめると、設計アンキリン反復タンパク質とは、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次の世代の例である。

【0021】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が所有する商標である。

【0022】

一態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、当該アンキリン反復ドメインは、４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置（framework positions）に生じる。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８～７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置に生じる。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列、又は配列番号５８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５９のアミノ酸配列、又は配列番号５９中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６７のアミノ酸配列、又は配列番号６７中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６８のアミノ酸配列、又は配列番号６８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６９のアミノ酸配列、又は配列番号６９中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。

【0025】

一実施形態では、本明細書で説明され、参照される当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。フレームワーク位置におけるそのような置換の実施形態は、そのような置換が明示的に記載されているかどうかに関係なく、全ての実施形態に適用されるものとする。

【0026】

一実施形態では、本明細書で説明され、参照される当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全てが、配列番号５８～６６及び６８～７１の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。

【0027】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0028】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール、及び第２のアンキリン反復モジュール、及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0029】

一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。

【0030】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９における最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置に生じる。

【0031】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置に生じる。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。

【0032】

一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。したがって、一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置に生じる。更に、一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ここで、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0033】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール、及び第２のアンキリン反復モジュール、及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大６個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大５個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大４個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、配列番号６８及び６９の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。

【0034】

一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、ここで、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。したがって、一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、配列番号６８及び６９の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。更に、一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0035】

一実施形態では、上記の当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全てが、フレームワーク位置で、並びに配列番号５８～６６及び６８～７１の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。典型的には、モジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。

【0036】

別の態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、当該アンキリン反復ドメインは、４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0037】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0038】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0039】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0040】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２８～３８から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号２８～３８のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0041】

一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、配列番号３１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0042】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインの潜在的な相互作用残基は、配列番号１～２７のアンキリン反復ドメインのいずれか１つにおける対応する位置と同一である。

【0043】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満、又は１０^－８Ｍ未満、又は５×１０^－９Ｍ未満、又は３×１０^－９Ｍ未満、又は１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、５×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、３×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0044】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～３８のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0045】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～２７の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、及び２５～２７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～２７のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、及び２５～２７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、５×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～１４及び１６～２７の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１４、１６～１９、及び２５～２７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、５×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１４、１６～１９、及び２５～２７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0046】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、３×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～１４及び１６～２６の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１４、１６～１９、及び２５～２６の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２７のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、３×１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～１４及び１６～２６のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１４、１６～１９、及び２５～２６の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0047】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２、７～１４、１７、及び２６の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１、２、５、７～１４、１７、２０～２４、及び２６のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２、７～１４、１７、及び２６の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0048】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号７～１１、１４、及び１７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、７～１１、１４、１７、２０～２２、及び２４のいずれか１つの位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号７～１１、１４、及び１７の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0049】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0050】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0051】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による４－１ＢＢに対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に説明されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の４－１ＢＢに対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の４－１ＢＢに対する当該結合特異性は、実施例２に記載のように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。

【0052】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対する結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８～７１と、（２）配列番号５８～７１のいずれかにおける最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、配列番号５８～６６及び６８～７１の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５８～７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。

【0053】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大３個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大２個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９と、（２）配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９のいずれかにおける最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、配列番号５８、５９、６８及び６９の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５８、５９、６７、６８、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。

【0054】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５８のアミノ酸配列、又は（２）配列番号５８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号５９のアミノ酸配列、又は（２）配列番号５９中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号６７のアミノ酸配列、又は（２）配列番号６７中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、（１）配列番号６８のアミノ酸配列、又は（２）配列番号６８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、（１）配列番号６９のアミノ酸配列、又は（２）配列番号６９中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列、を含むアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全てはフレームワーク位置で生じ、典型的には、このモジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。一実施形態では、当該アミノ酸置換の全ては、配列番号５８、５９、６８及び６９の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５、又は配列番号６７の当該アンキリン反復モジュールのランダム化位置３、５、７、１５、及び１６以外の位置で生じる。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。

【0055】

一実施形態では、本明細書で説明され、参照される当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置で生じる。フレームワーク位置におけるそのような置換の実施形態は、そのような置換が明示的に記載されているかどうかに関係なく、全ての実施形態に適用されるものとする。

【0056】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。

【0057】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0058】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８と、（２）配列番号５８における最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５９と、（２）配列番号５９の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0059】

更に、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、そして、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0060】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール、第２のアンキリン反復モジュール、及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0061】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール、第２のアンキリン反復モジュール、及び第３のアンキリン反復モジュールを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６７と、（２）配列番号６７における最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６８と、（２）配列番号６８の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号６９と、（２）配列番号６９の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0062】

更に、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、第１のアンキリン反復モジュール、第２のアンキリン反復モジュール、及び第３のアンキリン反復モジュールを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、そして、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0063】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。

【0064】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0065】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを正確に含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを正確に含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0066】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを正確に含む。一実施形態では、２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0067】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５１、５２、５４、及び５５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１、５２、５４、及び５５の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５４、及び５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、２つ又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0068】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。

【0069】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、１０^－９Ｍ未満、又は１０^－１０Ｍ未満、又は５×１０^－１１Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、５×１０^－１１Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合する。

【0070】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0071】

したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0072】

したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、５×１０^－１１Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0073】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ローカライザ分子を更に含む。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ若しくは３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインに、結合、コンジュゲート、融合、又は別様に物理的結合される。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ若しくは３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインに共有結合される。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、ペプチドリンカにより、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ若しくは３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインに共有結合される。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ若しくは３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインに共有結合される。

【0074】

実施例４～６に示すように、本発明の１つ、２つ、又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、例えばローカライザ媒介クラスタリングを介して、組換え結合タンパク質によって４－１ＢＢの局所的活性化を促進することができるローカライザに結合され得る。例えば腫瘍組織を標的とするこのような局所的活性化は、４－１ＢＢの全身活性化、及び結果として生じる肝毒性の回避又は低減に、非常に有益であり得る。そのような実施形態は、例えば、標的組織の細胞において選択的に発現される分子の細胞外ドメインに特異的に結合し、それによって４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン又はドメイン（複数）をクラスタリングして近傍の４－１ＢＢ発現細胞において４－１ＢＢ活性化を達成する、当該ローカライザ分子を介して、４－１ＢＢの活性化を特定の組織に局在化又は送達することを可能にする。更なる例として、多数の膜貫通タンパク質は、様々な種類のがんにおける腫瘍組織中で特異的に発現又は過剰発現されることが知られている。このような腫瘍特異的タンパク質として、非制限的に、アンカタンパク質、受容体、酵素、及び輸送タンパク質、例えばＮＤＣ１（ＴＭＥＭ４８）、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ９７、アノクタミン－１（anoctamin-1）（ＴＭＥＭ１６Ａ）、ＴＭＥＭ１４０、ＴＭＥＭ４５Ｂ、αｖβ３、インテグリン、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－２、ＨＥＲ２、Ｅｍｍｐｒｉｎ、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、フィブロネクチン・エキストラ・ドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソセリン、ｃＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、ｕＰＡＲが挙げられる（Ｓｃｈｍｉｔ Ｋ及びＭｉｃｈｉｅｌｓ Ｃ、「Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（２０１８年）第９巻第１３４５頁；Ｂｏｏｎｓｔｒａ ＣＭら、「Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ」（２０１６年）第８巻第１１９～１３３頁）。

【0075】

一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。

【0076】

一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、フィブロネクチン・エキストラ・ドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）、腫瘍抗原Ａ（ＴＡＡ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、又はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する結合特異性を有する、アンキリン反復ドメインである。

【0077】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号２～４、６～１９、２５～２７、３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0078】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有する結合タンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0079】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有する結合タンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0080】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0081】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0082】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0083】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0084】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0085】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質であり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、アンキリン反復ドメインである。

【0086】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0087】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。したがって、一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0088】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0089】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0090】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0091】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び２８～３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び２８～３８の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号３３～３８の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。

【0092】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して、好ましくは腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカで互いに結合されている。一実施形態では、当該ローカライザ特異的アンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。

【0093】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該組換え結合タンパク質は、１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカで互いに結合されている。一実施形態では、当該ローカライザ特異的アンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。

【0094】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該組換え結合タンパク質は、１０^－９Ｍ未満又は１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカで互いに結合されている。一実施形態では、当該ローカライザ特異的アンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。

【0095】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して、好ましくは腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該ポリペプチドは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該ポリペプチドのＮ末端に位置する。

【0096】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカにより結合した４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該ポリペプチドは、１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中のヒト４－１ＢＢに結合し、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損しており、並びに配列番号５１の当該アンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び／又は最後の位置におけるＮは、Ａにより任意選択的に置換されている。したがって、一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そして、更なる一実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該ポリペプチドのＮ末端に位置する。

【0097】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び３１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。

【0098】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１、５、及び３１のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１、５、及び３１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、腫瘍組織中に発現された細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有する当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及び当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカにより互いに結合される。一実施形態では、腫瘍組織中に発現された細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。

【0099】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含み、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の位置１におけるＧ及び／又は位置２におけるＳは、任意選択的に欠損している。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該ペプチドリンカは、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカである。一実施形態では、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザ分子は、配列番号５７のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカで互いに結合されている。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該組換え結合タンパク質内の当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。

【0100】

一実施形態では、本発明の当該４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む。一実施形態では、本発明の当該４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。一実施形態では、本発明の当該４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち一方は、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置し、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち他方は、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＣ末端に位置する。一実施形態では、本発明の当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち一方は、当該４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置し、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち他方は、当該２つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのＣ末端に位置する。血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、本発明の組換えタンパク質のインビボ半減期を増加させることができる。

【0101】

一実施形態では、本発明の当該４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグとは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列を指し、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であるか、又は当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善するか、又は当該アミノ酸配列はエフェクタ機能を保有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは当該技術分野で周知であり、当業者には充分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、若しくはＳｔｒｅｐタグといった小さなポリペプチド配列、又は当該ポリペプチド／タンパク質の検出を可能にする酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）などのポリペプチド、又は標的分子（免疫グロブリン又はそのフラグメントなど）及び／若しくはエフェクタ分子として使用できるポリペプチドである。

【0102】

一実施形態では、本発明の当該４－１ＢＢ特異的組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカを更に含む。ペプチドリンカは、例えば、２つのタンパク質ドメインを、ポリペプチドタグとタンパク質ドメインとを、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非タンパク質性化合物又はポリマーとを、タンパク質ドメインと生物学的に活性な分子とを、タンパク質ドメインとローカライザとを、又は２つの配列タグを結合することができる、アミノ酸配列である。ペプチドリンカは当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。そのようなリンカの特定の例は、可変長のグリシン－セリンリンカ及びプロリン－スレオニンリンカである。グリシン－セリンリンカの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号４０のアミノ酸配列であり、プロリン－スレオニンリンカの例は、配列番号３９及び配列番号５７のアミノ酸配列である。

【0103】

別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態において、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１～３８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号５、配列番号３１、配列番号５１、及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクタに関する。核酸は当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌（E.coli）で産生するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号４１により提供され、これは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。

【0104】

一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインを含む医薬組成物、並びに／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤に関する。

【0105】

一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質を含む医薬組成物、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤に関する。

【0106】

薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、以下でより詳細に説明する。また更に、上述の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン並びに／又は核酸、特に本発明の組換え結合タンパク質及び／又は核酸のうち１つ以上を含む、診断用組成物が提供される。

【0107】

医薬組成物は、本明細書に記載のような、組換え結合タンパク質、及び／又は設計アンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは組換え結合タンパク質及び／又は核酸、並びに例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含む。

【0108】

当業者に既知の好適な担体、賦形剤、又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中５％デキストロース、等張性及び化学安定性を増強する物質、緩衝剤、並びに保存料が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗がん剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生理活性化合物などの、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。

【0109】

インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。

【0110】

本発明の一実施形態は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、医薬組成物を製造するための血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む、本発明の組換え結合タンパク質の使用に関し、当該組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含むが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは含まない対応する組換え結合タンパク質と比較して、増加した終末相半減期、好ましくは少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の増加した終末相半減期を呈する。本発明の一実施形態では、組換え結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。

【0111】

一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換え結合タンパク質、並びに非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、リン酸緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、このような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。

【0112】

別の態様では、本発明は、哺乳動物における４－１ＢＢ発現細胞又は組織中の４－１ＢＢの局所的活性化の方法を提供し、この方法は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含む、本発明の組換え結合タンパク質を当該哺乳動物に投与する工程を含む。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、４－１ＢＢとは異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質である。一実施形態では、当該哺乳動物は、ヒトであり、当該４－１ＢＢ発現細胞又は組織は、原発腫瘍、転移、及び／又は腫瘍間質を含む、腫瘍中に位置する。

【0113】

別の態様では、本発明は、医学的状態の治療方法を提供し、この方法は、このような治療を必要とする患者に、ローカライザ分子を含む本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含む。別の態様では、本発明は。医学的状態の治療方法を提供し、この方法は、このような治療を必要とする患者に、ローカライザ分子を含む本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含み、当該ローカライザ分子は当該結合タンパク質を標的組織に局在化させるのに有効であり、当該結合タンパク質の当該局在化は標的組織中の４－１ＢＢ発現細胞における４－１ＢＢの活性化をもたらす。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍中で発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有する結合タンパク質であり、当該細胞表面タンパク質は、４－１ＢＢとは異なる。一実施形態では、当該４－１ＢＢ発現細胞又は組織は、原発腫瘍、転移、及び／又は腫瘍間質を含む、腫瘍中に位置する。これらの実施形態は、したがって、腫瘍への本発明の組換え結合タンパク質により４－１ＢＢの活性化を局在化することによって、腫瘍中のローカライザの限定発現の利用を可能にする。

【0114】

別の態様では、本発明は、患者の医学的状態を診断する方法を提供し、この方法は、ヒト４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の組換え結合タンパク質を、当該診断を必要とする患者へ、又は当該診断を必要とする患者の体液若しくは組織試料へ投与する工程を含む。一実施形態では、当該体液は、血漿又はその誘導体である。一実施形態では、当該体液は、血清である。一実施形態では、当該組織は、腫瘍組織である。一実施形態では、当該医学的状態は、がんである。別の実施形態では、当該医学的状態は、自己免疫疾患である。

【0115】

一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質の、疾患の治療のための使用に関する。そのため、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的（parental）投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。

【0116】

更に、上述の医薬組成物又は組換え結合タンパク質のいずれかは、障害の治療について考慮される。

【0117】

一実施形態では、当該組換え結合タンパク質又は本明細書に記載のこのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口適用のため、組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。

【0118】

一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含む。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む。一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物の、疾患の治療のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療において使用するための医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための核酸に関する。一実施形態では、本発明は、疾患を治療するための薬剤としての、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、薬剤を製造するための、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患を治療するための薬剤の製造のための、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子の使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患を治療するための薬剤を製造するためのプロセスに関し、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子は、薬剤の有効成分である。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子を用いる疾患の治療のプロセスに関する。

【0119】

特に、本発明は、本発明の医薬組成物を用いた医学的状態の治療に関し、当該医学的状態は、がんである。

【0120】

本発明の組換え結合タンパク質、又はがん疾患を治療するための当該医薬組成物の使用はまた、当該技術分野において既知の１つ以上の他の療法と組み合わせることができる。用語「と組み合わせた使用」とは、本明細書で使用する場合、所与のレジメンの下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。

【0121】

更なる一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質の、医学的状態、好ましくは腫瘍性疾患、より好ましくはがんの治療に使用される薬剤の製造のための使用に関する。

【0122】

一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の、腫瘍性疾患、特にがんであり得る、医学的状態の治療に使用される薬剤の製造のための使用に関する。

【0123】

一実施形態では、本発明は、上述のアンキリン反復ドメインのいずれかを含む組換え結合タンパク質に関する。

【0124】

一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質、及び／又は当該組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又は当該医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１又は配列番号５を含む組換え結合タンパク質、及び／又は４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１又は配列番号５を含む組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又は４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１又は配列番号５を含む組換え結合タンパク質を含む医薬組成物及び／又は４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１又は配列番号５を含む組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。

【0125】

一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生する方法に関する。一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）細菌中の当該組換え結合タンパク質を発現する工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィを用いて当該組換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む方法に関する。当該方法は、追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質を産生するこのような方法は、実施例１に記載されている。

【0126】

本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に限定されない。

【0127】

本明細書は、「Ｐ５７２５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられた本明細書のアミノ酸配列リストのいくつかのアミノ酸配列を参照し、配列リストのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0128】

定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。

【0129】

本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。このようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

【0130】

組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば、遺伝子合成によって作製）を細菌発現プラスミド（例えば、ｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、このような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli））へ挿入した場合、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチド（複数可）を産生することができる。対応して産生されるポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。

【0131】

本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」とは、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、当該結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

【0132】

更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知である、追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカ、結合特異性を用いた他のタンパク質性ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、若しくはアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、及び抗生物質などとのカップリングなど）を含んでもよい。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。

【0133】

用語「結合ドメイン」とは、標的に対して結合特異性を呈するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、当該結合ドメインは、組換え結合ドメインである。

【0134】

用語「標的」とは、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、若しくは任意の他の天然由来の分子（そのような個々の分子の任意の一部を含む）などの個々の分子、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は、天然由来若しくは非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は化学修飾、例えば、天然由来若しくは非天然のリン酸化反応、アセチル化反応、若しくはメチル化反応を含有するポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、４－１ＢＢ並びに４－１ＢＢ発現細胞及び組織は、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質及びローカライザ標的タンパク質の標的であり、細胞及び組織は、ローカライザの標的である。

【0135】

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」とはまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって一緒に結合されたアミノ酸の複数の鎖も包む。ポリペプチドは、当業者に周知である。

【0136】

特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号、及びＦｏｒｒｅｒら（２００３）（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．、Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．、Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００３）「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」第５３９巻第２～６頁）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はポリペプチドリンカを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。

【0137】

用語「反復ドメイン」とは、構造単位として２つ以上の連続した反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、当該反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確に説明すると、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。このような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．、Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．、Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．、Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．、Ｒｅｇａｎ，Ｌ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」第１１巻第５号第４９７～５０８頁（２００３年））、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第ＷＯ２００９／０４０３３８号）の例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインは反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なり、反復されるアミノ酸配列ごとに、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができることは、当業者には更に周知である。

【0138】

設計反復タンパク質及び設計反復ドメインなどで使用される用語「設計」とは、そのような反復タンパク質及び反復ドメインは、それぞれ、人工であり、自然界には発生しないという性質を指す。本発明の結合タンパク質は、設計反復タンパク質であり、これらは少なくとも１つの設計アンキリン反復ドメインを含む。

【0139】

用語「標的相互作用残基」とは、標的との直接相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。

【0140】

用語「フレームワーク残基」とは、折畳みトポロジ（folding topology）に寄与する、すなわち当該反復モジュールの折畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する、反復モジュールのアミノ酸残基を指す。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はαヘリックス若しくはβシートで見られるようなポリペプチド骨格コンフォメーションへの影響、又は線状ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。

【0141】

そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ、及び／若しくはＣＤスペクトル測定などの物理化学的方法によって得られた構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくは生物情報学における従事者に周知である既知及び関連する構造情報との比較によって、特定されてもよい。

【0142】

用語「反復モジュール」とは、天然由来の反復タンパク質の反復単位から元々由来する、設計反復ドメインの反復アミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然由来の反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えばアンキリン反復タンパク質のファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば実施例１に記載されるような標的上で選択された反復ドメインから得られた相同反復モジュールから推定され、同じ標的特異性を有する、「反復配列モチーフ」を含んでもよい。

【0143】

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」とは、天然由来のアンキリン反復タンパク質の反復単位から元々由来する、反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は当業者に周知である。

【0144】

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的でライブラリ内にてランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）、及び標的特異的反復ドメインを選択する目的でライブラリ内にてランダム化されているアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含んでもよい。非ランダム化位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、反復モジュールのアミノ酸位置が許容された２つ以上のアミノ酸を意味し、例えば、通常の２０個の天然由来アミノ酸のいずれかが許容されるか、又はシステイン以外のアミノ酸若しくはグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸といった、２０個の天然由来アミノ酸のほとんどが許容される。この特許出願の目的のために、配列番号５８～６６及び６８～７１のアミノ酸残基３、４、６、１４、及び１５、並びに配列番号６７のアミノ酸残基３、５、７、１５、及び１６は、本発明のアンキリン反復モジュールのランダム化位置である。

【0145】

用語「反復配列モチーフ」とは、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

【0146】

用語「反復単位」とは、１つ以上の天然由来タンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーにおいて見出され、タンパク質の倍率を決定する全ての当該モチーフに一般的な定義された折畳みトポロジを呈する。そのような反復単位の例としては、ロイシンリッチ反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンリッチバリアント反復単位が挙げられる。

【0147】

用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的」、又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌（E.coli）マルトース結合タンパク質（maltose binding protein：ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、より低い解離定数で標的にＰＢＳ中において結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋ_Ｄ」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０^２倍、より好ましくは少なくとも１０^３倍、より好ましくは少なくとも１０^４倍、又はより好ましくは少なくとも１０^５倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry：ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用の測定されたＫ_Ｄ値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）において測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋ_Ｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準液、及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による４－１ＢＢに対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に説明されている。

【0148】

用語「約」とは、言及された値＋／－２０％を意味し、例えば「約５０」とは、４０～６０を意味するものとする。

【0149】

用語「ＰＢＳ」とは、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含有し、ｐＨ７．４である、リン酸緩衝水溶液を意味する。

【0150】

用語「マウス血清アルブミン」とは、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわち、カニクイザル（macaca fascicularis））とは、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」とは、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６８を指す。

【0151】

好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後最大４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算し、又はカニクイザルでは１日目～５日目で計算する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、で行う。動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことが、当業者には理解される。好ましくは、薬物動態の測定に使用される用量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｋｇから選択される。

【0152】

用語「４－１ＢＢ」及び「４－１ＢＢ受容体」とは、本出願で互換的に使用され、４－１ＢＢ受容体の任意の形態、並びに４－１ＢＢ受容体の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（species homolog）を指す。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種から４－１ＢＢに結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒト４－１ＢＢに完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を呈しなくともよい。ヒト４－１ＢＢに対する特定の参照によってなど異なる指示が無い限り、４－１ＢＢは、天然配列４－１ＢＢ、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列ＮＰ＿００１５５２、及び配列番号７６に示されている。カニクイザル及びマウス４－１ＢＢのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７７及び７８に提供される。４－１ＢＢは、シグナル配列、続いて細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内ドメインを含む（Ｃｈｅｕｋ ＡＴＣら（２００４年）「Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」第１１巻第２１５～２２６頁）。受容体は、免疫応答を刺激するためにその三量体リガンド（４－１ＢＢＬ）に結合すると、受容体三量形成をされると考えられている（Ｂｉｔｒａ Ａら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（２０１８年）第２９３巻第４号第１３１７～１３２９頁；Ｃｈｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」（２０１８年）第９巻第４６７９頁）。４－１ＢＢの代替名又は同義語は、ＣＤ１３７及びＴＮＦＲＳＦ９を含む。ヒト、カニクイザル、及びマウス４－１ＢＢの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７９、８０、及び８１に示されている。ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１に示されている。

【0153】

本明細書で使用する場合の「４－１ＢＢアゴニスト」とは、４－１ＢＢに結合した際、（１）４－１ＢＢを刺激若しくは活性化する、（２）４－１ＢＢの活性、機能、若しくは存在を増強、増加、促進、誘導、若しくは延長する、又は（３）４－１ＢＢの発現を増強、増加、促進、若しくは誘導する、任意の化学化合物又は生体分子を意味する。ヒト個体が治療されている本発明の治療方法、薬剤、医薬組成物、及び使用のいずれにおいても、４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢ媒介応答を増加させる。本発明の治療方法、薬剤、医薬組成物、及び使用のいくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、細胞傷害性Ｔ細胞応答を著しく増強することで、様々なモデルにおける抗腫瘍活性をもたらす。

【0154】

本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質に含まれる「ローカライザ分子」又は「ローカライザ」の文脈において、本明細書で互換的に使用される用語「局在化」又は「送達」とは、哺乳動物のローカライザ標的細胞又は組織に対し、結合タンパク質がローカライザを含まない場合と比較して、ローカライザを含むそのような４－１ＢＢ特異的結合タンパク質の局在化の増加を指す。この用語はまた、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質を、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位に標的化することを指し、４－１ＢＢ特異的結合タンパク質は、ローカライザを含む。この用語は、好ましくは、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位での、ローカライザを含む４－１ＢＢ特異的結合タンパク質の蓄積及び／又は保持を更に包含する。この用語はまた、好ましくは、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位に、又はその近くにあるローカライザを含む、本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質によって誘導された４－１ＢＢ発現細胞における４－１ＢＢの局所的活性化を包含する。そのような局所的活性化は、例えば、ローカライザを含む４－１ＢＢ特異的結合タンパク質の結合時に４－１ＢＢのクラスタリングを介して起こってもよく、クラスタリングは、その標的細胞又は組織へのローカライザの結合によって媒介される。この段落で使用される場合、「哺乳動物」は、ヒトを包含する。「局在化」の結果は、当業者に周知の様々な手段によって測定されてもよい。一例として、「局在化」は、技術分野で周知の方法に従って、ローカライザに結合された本発明の結合タンパク質の臓器対血中比を決定することによって測定されてもよい。本発明の一実施形態では、ローカライザを含む４－１ＢＢ特異的結合タンパク質の「局在化」に対するローカライザの効果は、ローカライザを含まない対応する４－１ＢＢ特異的結合タンパク質と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は３００％の増加した臓器対血中比によって提示される。

【0155】

用語「ローカライザ分子」及び「ローカライザ」とは、本明細書で互換的に使用され、本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質に含まれ得、それを含む本発明のそのような４－１ＢＢ特異的結合タンパク質を、例えばヒトを含む哺乳動物における標的細胞又は組織に局在化又は送達することができる、任意の分子を包含することが意図され、ローカライザは、標的細胞又は組織に結合する。ローカライザは、本発明の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインに、結合、コンジュゲート、融合、又は別様に物理的に結合することができる。用語「ローカライザ分子」及び「ローカライザ」とは、ポリヌクレオチド、ペプチド／ポリペプチド、及び／又はこれらの特性を有する化学的若しくは生化学的薬剤を包含する。用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾された人工形態を含む。用語「ペプチド」とは、４～２００アミノ酸長などの、４～６００アミノ酸長のペプチド鎖を指し、したがって、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。この用語は、足場、免疫調節タンパク質等に基づく、任意の天然由来若しくは人工の結合タンパク質、結合ドメイン、増殖因子受容体、又はそのフラグメント若しくはリガンド、サイトカイン、ポリペプチドホルモン、抗体、抗体様タンパク質を包含する。更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、４～６００アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の天然由来又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい実施形態では、ローカライザは、標的特異的アンキリン反復ドメインである。

【0156】

用語「４－１ＢＢ発現細胞」とは、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞、例えばＣＤ８^＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＮＫ Ｔ細胞（NK T cell：ＮＫＴ）、好中球、顆粒球、単球、マスト細胞、好酸球、樹状細胞（dendritic cell：ＤＣ）、ナチュラルキラー（natural killer：ＮＫ）細胞、Ｂリンパ球及び白血球、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞などの非造血系起源の細胞を含むが、これらに限定されない、細胞表面上に４－１ＢＢを発現する任意の細胞を指す。

【0157】

用語「医学的状態」（又は、障害若しくは疾患）としては、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に、増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかは、このような障害、特に、自己免疫障害、炎症性障害、免疫不全、及び腫瘍性疾患からなる群から選択される障害の治療のための薬剤の調製に使用してもよい。「医学的状態」とは、不適切な細胞増殖を特徴とする状態であってもよい。医学的状態は、過剰増殖状態であってもよい。本発明は、特に、医学的状態の治療方法に関し、方法は、このような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む。好ましい実施形態では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」とは、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は新生物を特徴とする、細胞又は組織の異常な状況又は状態（state or condition）を指す。一実施形態では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、がんである。用語「治療有効量」とは、患者に対して所望の効果をもたらすのに充分な量を意味する。

【0158】

用語「抗体」とは、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及びバリアントも意味する。そのようなフラグメント及びバリアントもまた技術分野で周知であり、インビトロ及びインビボの両方で定期的に使用されている。したがって、用語「抗体」とは、インタクトな免疫グロブリン分子、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２などの抗体フラグメント、単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非慣例抗体（unconventional antibody）を包含する。

【0159】

用語「がん」及び「がん性」とは、本明細書では、典型的には未制御の細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はこれを説明するために使用される。がんは、固形腫瘍及び液体腫瘍、並びに原発腫瘍及び腫瘍転移を包含する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。固形腫瘍はまた、典型的には、腫瘍間質も含む。がんの例としては、原発性及び転移性がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、脳がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、明細胞腎臓がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、肺腺がん、肺扁平上皮細胞がん、悪性メラノーマ、非小細胞肺がん（non-small-cell lung cancer：ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎細胞がん、小細胞肺がん（small-cell lung cancer：ＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん、急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia：ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia：ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia：ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia：ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma：ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（Hodgkin's lymphoma：ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma：ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma：ＭＭ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome：ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma：ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮細胞がん（Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck：ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia：ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（small lymphocytic lymphoma：ＳＬＬ）、悪性中皮腫結腸直腸がん、又は胃がんが挙げられる。

【実施例】

【0160】

以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。

【0161】

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌（E.coli）発現株は、クローニング及びタンパク質産生に使用した。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）。ヒト４－１ＢＢ（ビオチン化又は非ビオチン化）の細胞外ドメインの組換えＦｃ融合タンパク質は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。カニクイザル４－１ＢＢの細胞外ドメインの組換えＦｃ融合タンパク質は、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧから購入した。

【0162】

分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。

【0163】

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリ
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚら、（２００３年）上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリを構築することができる。例えば、そのようなライブラリはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号４４、４５、又は４６のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号４７によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号４８、４９、又は５０の配列モチーフによる１つ以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号７２、７３、又は７４のＣ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号７５によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリは、アミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）、及び反復又はキャッピングモジュールのランダム化位置におけるＰのいずれかを有しないように組み立てられる。加えて、配列番号４８、４９、又は５０の配列モチーフによるランダム化反復モジュールは、位置１０及び／又は位置１７で更にランダム化することができた。配列番号４７の配列モチーフによるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュールは、位置７及び／又は位置９で更にランダム化することができた。そして、配列番号７５の配列モチーフによるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置１０、１１、及び／又は１７において更にランダム化することができた。

【0164】

更に、そのようなライブラリのそのようなランダム化モジュールは、ランダム化アミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリの補体決定領域（complement determining region：ＣＤＲ）ループライブラリである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第２３巻第３０号第３９２９～３９３８頁（２００４年））。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。

【0165】

アンキリン反復タンパク質ライブラリの任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフ（例えば、配列番号１の位置２１から２６に存在）を持ち、アンキリン反復タンパク質ライブラリの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮ、ＫＬＡ、又はＫＡＡモチーフ（例えば、配列番号１の最後の３個のアミノ酸に存在）を持つ。

【0166】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導されてもよい。そのような構造の例は、それらのタンパク質構造データバンク（Protein Data Bank：ＰＤＢ）固有の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって特定され、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

【0167】

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの設計アンキリン反復タンパク質ライブラリといった設計アンキリン反復タンパク質ライブラリの例が記載されている（米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚら、（２００３年）上記引用；Ｂｉｎｚら、（２００４年）上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。

【0168】

反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に対応する。

【0169】

全てのＤＮＡ配列をシーケンシングによって確認し、選択されたタンパク質の計算された分子量を、質量分析によって確認した。

【0170】

実施例１：４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒト４－１ＢＢ（ｈ４－１ＢＢ）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリから選択した。組換えヒト４－１ＢＢ標的に対する選択されたクローンの結合は、粗抽出物の均一時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）によって評価され、何百ものｈ４－１ＢＢ特異的結合タンパク質が首尾よく選択されたことを示した。例えば、配列番号１～２７のアンキリン反復ドメインは、ｈ４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ｈ４－１ＢＢに結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュールは、例えば、配列番号５８～７１に提供される。

【0171】

リボソームディスプレイによる４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ｈ４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメイン（配列番号７９）（単独、又はｈ４－１ＢＢＬとの複合体）を、標的タンパク質、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリ、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻第６９～７９頁（２００７年）参照）。各選択ラウンド後の逆転写（reverse transcription：ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、バインダの富化による収量に合わせて、連続して４５から２８に減少した。選択の最初の４ラウンドでは、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を低減させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、選択圧をラウンド１からラウンド４まで増加させた（Ｂｉｎｚら（２００４年）上記引用）。いくつかのプールについては、全てのリボソームディスプレイ選択ラウンドの洗浄工程中で、低塩濃度を使用した。高親和性４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフレート選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。これら最後の２つの選択ラウンドでは、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数は、３０で一定に保たれた。

【0172】

選択されたクローンは粗抽出物ＨＴＲＦにより示されるように４－１ＢＢへ特異的に結合する
溶液中の４－１ＢＢに特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質は、標準プロトコルを用いたアンキリン反復タンパク質発現大腸菌（Escherichia coli）細胞の粗抽出物を用いた、均一時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定された。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクタの誘導体（ｐＭＰＡＧ０６、ｐＭＰＡＳ２４２、又はｐＭＰＡＳ２４５のいずれか）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し、ＬＢ寒天（１％グルコース及びアンピシリン５０μｇ／ｍＬ含有）上にプレーティングし、次いで３７℃で一晩インキュベートした。ベクタｐＭＰＡＳ２４２又はｐＭＰＡＳ２４５を使用して、Ｎ末端及びＣ末端キャッピング反復を交換した。単一のコロニーを、１６０μＬの増殖培地（１％グルコース及びアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレート（単一ウェル内の各クローン）中に拾い上げ、３７℃で一晩インキュベートし、８００ｒｐｍで振盪した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ディープウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを、８．５μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁する前に－２０℃で一晩凍結し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

【0173】

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、２ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ヒト４－１ＢＢ、１：４００（最終濃度）の抗－６Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：２０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で７５分間インキュベートした。ＨＴＲＦは、３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを用いて、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００上で読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ヒト４－１ＢＢに特異的な数百の異なるアンキリン反復ドメインを明らかにした。ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号１～２７で提供されている。

【0174】

ヒト４－１ＢＢに対して結合特異性を有するこれらのアンキリン反復ドメイン、及びヒト４－１ＢＢに対して結合特異性を有しない陰性対照アンキリン反復ドメイン（配列番号４２）を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を提供するｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクタにクローニングして、以下に記載されるような単純なタンパク質精製を容易にする。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクタを構築した：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号４）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号５）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号６）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第７番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号７）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第８番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号８）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第９番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号９）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１０番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１０）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１１番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１１）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１２番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１２）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１３番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１３）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１４番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１４）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１５番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１５）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１６番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１６）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１７番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１７）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１８番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１８）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１９番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号１９）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２０番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２０）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２１番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２１）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２２番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２２）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２３番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２３）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２４番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２４）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２５番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２５）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２６番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２６）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２７番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２７）。

【0175】

ｈ４－１ＢＢに対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
更に、ｐＱＥベースの発現ベクタは、ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する以下のアンキリン反復タンパク質をコードして構築される：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２８番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２８）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第２９番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号２９）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３０番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３０）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３１番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３１）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３２番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３２）。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３３番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３３）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３４番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３４）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３５番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３５）。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３６番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３６）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３７番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３７）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第３８番（そのＮ末端に融合された、Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を有する配列番号３８）。

【0176】

配列番号２８～３８は、配列番号１の配列に基づいて操作される。配列番号２８～３８において、配列番号１の配列は、Ｎ末端キャッピングモジュールにおけるＲＥＬＬＫＡモチーフ（位置２１～２６）をＲＩＬＬＫＡ又はＲＩＬＬＡＡで置き換えることによって、Ｃ末端キャッピングモジュールにおけるバリン（位置１１６）をグルタミン酸で置き換えることによって、及び／又はＣ末端キャッピングモジュールにおけるＫＡＡモチーフ（位置１２４～１２６）をＫＬＮで置き換えることによって、修飾される。これらの修飾は、単独又は組合せで、配列番号１と比較して、配列番号２８～３８の有意に変化した構造又は機能的特性をもたらさない。

【0177】

４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の高レベルで可溶性の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的な４－１ＢＢ結合を示す選択されたクローンを、大腸菌（E.coli）細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。２５ｍＬの静置した一晩培養物（ＴＢ、１％グルコース、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌ、３７℃）を使用して、５００ｍＬの培養物（ＴＢ、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌ、３７℃）を播種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ_５００（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理工程の前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（最終濃度１％（ｖ／ｖ））及びイミダゾール（最終濃度２０ｍＭ）を、ホモジネートに添加した。タンパク質をＮｉ－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）カラムで精製し、続いて、当業者に知られている標準的なプロトコル及び樹脂による、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システムで分子ふるいクロマトグラフィを行った。あるいは、Ｈｉｓタグを欠く選択されたアンキリン反復ドメインは、大腸菌（E.coli）における高細胞密度発酵によって産生され、当業者に知られている標準的な樹脂及びプロトコルに従って、一連のクロマトグラフィ及び限外／ダイアフィルトレーション工程によって精製される。４－１ＢＢに対して結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質は、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される９５％超の純度で、大腸菌（E.coli）培養物から精製した（培養物１リットル当たり最大２００ｍｇのアンキリン反復タンパク質）。そのようなＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の代表的な例を、図１に示す。

【0178】

実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定
ヒト４－１ＢＢ標的上の精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。

【0179】

簡単に説明すると、ビオチン化ヒト４－１ＢＢを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有）で希釈し、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、約３２０共鳴単位（ＲＵ）（シングルトレースＳＰＲ測定については６００ＲＵ）のレベルまで被覆した。次いで、アンキリン反復タンパク質とｈ４－１ＢＢとの相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定で５０ｎＭ～０．５ｎＭの範囲濃度又はシングルトレース測定について５０ｎＭの濃度をカバーする、アンキリン反復タンパク質の連続希釈液を含有する２００μＬの泳動用緩衝液（ＰＢＳ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するｐＨ７．４）を注入し（オンレート測定）、続いて１００μＬ／分の一定流量で少なくとも３０分間にわたり泳動用緩衝液流を注入することによって（オフレート測定）、測定した。再生は、３０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ２、続いて３０μＬの１２４ｍＭ Ｈ_３Ｐ０_４を用いて実施した。スポット間（interspots）のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、泳動用緩衝液のみ注入）を、アンキリン反復タンパク質（二重参照）の注入後に得られたＲＵトレースから差し引いた。オンレート及びオフレート測定から得られたＳＰＲトレースに基づいて、対応するアンキリン反復タンパク質－４－１ＢＢ相互作用のオンレート及びオフレートを決定した。

【0180】

代表的な例として、図２Ａ及び図２Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第１番及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５番について得られたＳＰＲトレースを示す。解離定数（Ｋ_Ｄ）は、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから計算された。ヒト４－１ＢＢによる選択されたアンキリン反復タンパク質の結合相互作用のＫ_Ｄ値を、２０ｐＭ～５ｎＭの範囲にあると決定した。表１は、例として、いくつかの選択されたアンキリン反復タンパク質のＫ_Ｄ値を提供する。本発明の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質もまた、カニクイザル４－１ＢＢに特異的に結合した。

【0181】

【表1】

【0182】

実施例３：４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質による細胞における４－１ＢＢシグナル伝達の活性化
４－１ＢＢに対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質が細胞内で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力を、ｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０レポータアッセイで試験した。

【0183】

ヒト４－１ＢＢ及びＮＦ－κβ制御ルシフェラーゼレポータ遺伝子を発現するＨＴ１０８０細胞の生成。線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１２１（商標））を、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（＃ＲＣ２００６６４）から入手したヒト４－１ＢＢ（Ｍｙｃ－ＤＤＫタグ付き）のｃＤＮＡを含むプラスミドで形質導入した。これは、ヒト４－１ＢＢの配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入Ｑ０７０１１又はＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１５６１）を、ＣＭＶ－プロモータ及びネオマイシン耐性遺伝子の制御下において含有する。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及びＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））を補充した、最小必須培地（Minimum Essential Medium：ＭＥＭ）α培地＋Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。４－１ＢＢ形質導入ＨＴ１０８０細胞を、マウス抗ヒト４－１ＢＢ抗体クローン４Ｂ４－１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、カタログ番号５５０８９０）を用いたフローサイトメトリによって、ヒト４－１ＢＢ発現について評価した。ＨＴ１０８０細胞を発現するｈ４－１ＢＢの集団を濃縮するために、トランスフェクトされた細胞を、同じ抗体を用いてフローサイトメトリによって選別した。ｈ４－１ＢＢ ＨＴ１０８０細胞を、ＮＦ－κＢ制御マウスインターフェロンβ最小プロモータ及びリポフェクタミンを用いたＺｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子の制御下において、分泌されたルシフェラーゼレポータ遺伝子を含有する、ＮＦ－κΒ－ルシフェラーゼレポータプラスミドｐＮｉＦｔｙ３－Ｎ－Ｌｕｃｉａ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコードｐｎｆ３－ｌｃ２）で更にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ａｎｔ－ｚｎ－１）、及びＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ａｎｔ－ｎｒ－１）を補充した、最小必須培地（ＭＥＭ）α培地＋Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。アッセイには、ｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０－Ｌｕｃｉａ細胞の集団を使用した。

【0184】

アッセイ設定：ＮＦ－κΒ－ルシフェラーゼヒト４－１ＢＢ ＨＴ１０８０細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００μｇ／ｍＬ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ、及び１００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎを補充した、ＭＥＭα培地＋Ｇｌｕｔａｍａｘ中に再懸濁した。９６ウェル平底プレートを、３０ｎＭ抗ペンタ－Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３４６６０）により、ＰＢＳ中において４℃で一晩被覆した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートを、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで１時間ブロックした後、プレート上でそれらを架橋するために、アンキリン反復タンパク質の濃度を上げながら室温で２時間インキュベートした。次に、ｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０ルシフェラーゼ細胞を添加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。上清を回収し、新しい９６ウェルプレートで遠心分離した。これらの細胞における４－１ＢＢシグナル伝達のトリガは、発光性の基質を用いて活性を監視することができるルシフェラーゼのＮＦκＢ媒介分泌をもたらす。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃルシフェラーゼ基質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｌｃ１）を上清と混合し、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００発光プレートリーダ上で発光を読み取った。アッセイ設定を図３に模式的に示す。可溶性（非架橋）抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（クローン２０Ｈ４．９－ＩｇＧ４）が対照として含まれた。

【0185】

結果：４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は、濃度依存的な様式で、ｈ４－１ＢＢ発現ＨＴ１０８０ルシフェラーゼ細胞において４－１ＢＢ媒介ＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化した（図４Ａ～図４Ｄ）。結果は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有する開示されたアンキリン反復タンパク質が、細胞における４－１ＢＢシグナル伝達を活性化できることを実証した。完全活性のＦｃ架橋を必要とすると考えられている抗４－１ＢＢモノクローナル抗体（クローン２０Ｈ４．９）は、可溶性形態で４－１ＢＢシグナル伝達をある程度活性化することができた。

【0186】

実施例４：ローカライザ分子に結合された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は細胞に結合し、ローカライザ媒介クラスタリングを介して４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する
細胞表面上の４－１ＢＢのアゴニスト媒介性クラスタリングは、４－１ＢＢシグナル伝達の効果的な活性化に必要であるか、又は少なくとも非常に有益であると考えられている。４－１ＢＢのそのようなクラスタリング及び活性化は、実施例３に示すように、抗体によって架橋された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質によって媒介され得る。４－１ＢＢのこのようなクラスタリング及び活性化はまた、ローカライザ分子に結合された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質によっても媒介され得るかどうかを試験するために、選択された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は、ローカライザ分子、腫瘍抗原Ａ（以下、「ＴＡＡ」と称する）を標的とするローカライザ、すなわちＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインの一例に、遺伝的に結合された。得られた構築物は、（１）Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）と、（２）ＴＡＡ特異的ローカライザ分子と、（３）ペプチドリンカを介してＴＡＡ特異的ローカライザ分子に接続され、構築物内のＴＡＡ特異的ローカライザ分子のＣ末端に位置した４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質と、を含んだ（「ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物」）。ＴＡＡの分子的同一性は、２０１９年６月４日に米国特許商標庁に出願され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧに譲渡された「Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する米国仮特許出願第６２／８５７，０３７号、及び米国特許第６２／８５７，０３７号から優先権を主張し、本ＰＣＴ出願の出願日に出願されたＰＣＴ国際特許出願において開示されている。

【0187】

ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、一価の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介して、発現ベクタ（ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメイン及びペプチドリンカ（配列番号ＮＯ：３９）をコードする配列、並びにタンパク質精製を容易にするためのＮ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）を提供する、ｐＭＰＣＭＥ２９８）中にクローニングすることによって生成され、ＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを介して切断された。ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を含有する、正しくシーケンシングされたベクタを、誘導性大腸菌（E.coli）細菌に形質転換し、ＴＢ培地１５０ｍＬ（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有、０．５ｍＭ ＩＰＴＧでＯＤ６００～１にて誘導し、３７℃で６時間インキュベートした）で発現させた。超音波処理を用いて細胞を溶解し、２つのｔｒｉｔｏｎ洗浄工程を備えたＩＭＡＣベンチトップ精製を用いてタンパク質を精製した。

【0188】

以下のＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を、更なる機能的試験のために生成した：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４４番（配列番号１を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４５番（配列番号２を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４６番（配列番号３を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４７番（配列番号４を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４８番（配列番号５を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第４９番（配列番号６を４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質として含む）。

【0189】

陰性対照として、ヒト４－１ＢＢに対して結合特異性を有しないアンキリン反復ドメイン（配列番号４２）を、ベクタにクローニングして、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５０番（４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの代わりに配列番号４２を含む）を得た。

【0190】

ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、４－１ＢＢ及びＴＡＡに高親和性で結合する
ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物をＳＰＲで調査して、ヒト４－１ＢＢ、カニクイザル４－１ＢＢ、及びヒトＴＡＡ標的について、正確な親和性データを得た。

【0191】

アッセイ設定：簡単に説明すると、ＳＰＲ測定は、上記のようにＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。ビオチン化したヒト及びカニクイザル４－１ＢＢ、並びにヒトＴＡＡを、それぞれ、６００ＲＵ、７００ＲＵ、及び２０００ＲＵに達するように、ＧＬＣチップ上で、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（約６０００ＲＵのプレコート）を介して直接的又は間接的のいずれかで不動化した。ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の被覆された標的への相互作用は、３０μＬ／分の一定流量を用いて、１２０秒の会合及び１８００秒の解離による、５０、１６．７、５．６、１．９、及び０．６ｎＭの連続希釈でＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子を注入することによって測定された。標的は、１０ｍＭグリシンｐＨ２と１２４ｍＭ Ｈ_３Ｐ０_４を用いて、個々の測定の間に再生された。シグナルは、泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ）処理対照レーンに対して、二重に参照された。

【0192】

スクリーニング：ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のＳＰＲ測定の結果を、表２に概説する。ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、ヒト４－１ＢＢについて０．４～１．５ｎＭ、カニクイザル４－１ＢＢについて１．１～２．９ｎＭ、及びヒトＴＡＡについて０．１～０．４ｎＭの結合親和性を示した。ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、ｈ４－１ＢＢよりも高い親和性でｈＴＡＡに結合した。カニクイザル４－１ＢＢへの交差反応性結合を、試験したＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の全てについて、ヒト４－１ＢＢと比較して、結合親和性において最大で約４倍の差で確認した。

【0193】

【表2】

【0194】

ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、４－１ＢＢ発現細胞に結合する
次いで、ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を、イオノマイシン／ＰＭＡ刺激ＣＥＭ細胞への結合について試験した。図５に示すように、全ての構築物はＣＥＭ細胞に結合する。

【0195】

アッセイ設定：細胞上における細胞膜結合ヒト４－１ＢＢへのアンキリン反復タンパク質結合は、４－１ＢＢを発現するためにイオノマイシン（ionomcycin）／ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート）で刺激された、Ｔリンパ芽球細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１１９（商標））を用いて、フローサイトメトリによって測定した。１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地で培養したＣＥＭ細胞を収集し、同じ培地＋ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いて９６ウェルＵ底プレートにおいて一晩刺激した。刺激した後、４－１ＢＢの発現を、マウス抗ヒト４－１ＢＢ抗体クローン４Ｂ４－１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、カタログ番号５５０８９０）を用いたフローサイトメトリによって確認した。刺激されたＣＥＭ細胞を収集し、次いで、３０，０００個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）中のＨｉｓタグ付きアンキリン反復タンパク質の濃度を増加させながら、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、抗ペンタ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８検出抗体（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３５３１０）により、氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ ｄｙｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、第Ｌ３４９５７番）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＡｔｔｕｎｅＮｘＴ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて分析した。

【0196】

結果：図５に示すように、組換え４－１ＢＢへの結合を示す全てのＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物はまた、活性化ＣＥＭ細胞上の細胞膜発現ヒト４－１ＢＢにも結合する。

【0197】

ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、ローカライザ誘導クラスタリングによって媒介された４－１ＢＢ発現細胞中の４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する
次いで、ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される４－１ＢＢ発現細胞中の４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力について、更に試験した。ＴＡＡ被覆ビーズの存在下において共培養されたヒト４－１ＢＢを発現する、ＨＴ１０８０細胞におけるＮＦ－κＢレポータ遺伝子活性化を測定するアッセイを使用した。

【0198】

アッセイ設定：ＨＴ１０８０細胞発現ヒト４－１ＢＢ及びＮＦ－κΒ－ルシフェラーゼレポータ遺伝子（実施例３を参照）を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００μｇ／ｍＬ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ、及び１００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎを補充した、ＭＥＭα培地＋Ｇｌｕｔａｍａｘ中に再懸濁した。９６ウェルプレートを用いて、１０，０００個のｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０ルシフェラーゼ細胞を、ヒトＴＡＡ被覆ビーズと一緒に、ＴＡＡ－ビオチン被覆ストレプトアビジンビーズの存在下においてＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の濃度を増加させながらプレーティングした。プレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で、２０時間でインキュベートした。次いで、上清を回収し、新しい９６ウェルプレートで遠心分離した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｌｃ１）を上清と混合し、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００発光プレートリーダ上で発光を読み取った。ＥＣ_５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０２）を用いて、４パラメータロジスティック適合モデルにデータを適合させることによって、決定した。

【0199】

結果：このｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０ルシフェラーゼレポータアッセイは、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインがＴＡＡ特異的ローカライザに結合している場合（ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のように）、開示された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質が、ＴＡＡ被覆ビーズの存在下において４－１ＢＢアゴニズムを示すことを実証した（図６Ａ及び図６Ｂを参照）。４－１ＢＢアゴニズムは、ＴＡＡ被覆ビーズの非存在下において又は４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質に結合されたローカライザの非存在下において、アゴニズムが観察されなかったため、ローカライザ媒介クラスタリングに依存した。表３は、例として、選択されたＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のＥＣ_５０値を提供する：

【0200】

【表3】

【0201】

ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を、ＴＡＡ発現細胞の存在下において共培養された４－１ＢＢ発現ＨＴ１０８０細胞におけるＮＦ－κＢレポータ遺伝子活性化を測定するアッセイを用いて、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される４－１ＢＢ発現細胞において４－１ＢＢシグナル伝達を活性化するこれらの能力について、更に試験した。

【0202】

ヒトＴＡＡを発現するＣＨＯ細胞の作成
簡単に言えば、発現ベクタ（ｐＭＰＭＰＡ１３）は、ヒトＴＡＡをコードするｃＤＮＡを用いて、標準的な分子生物学技術によって生成された。チャイニーズハムスタ卵巣（Chinese hamster ovary：ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１２１（商標））を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて発現ベクタでトランスフェクトした。選択圧は、異なる濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８０９１）を用いて適用された。ｈＴＡＡの発現を、抗ＴＡＡ抗体を用いてフローサイトメトリによって分析した。ＣＨＯ－ＴＡＡトランスフェクタントの２つの異なる集団（集団１及び集団２）を、更なる実験のために選択した。ＦＡＣＳ分析は、野生型ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｗｔ）ではなくＣＨＯ－ＴＡＡ細胞が、細胞表面上にｈＴＡＡを発現することを実証した（データ示さず）。

【0203】

アッセイ設定：ｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０ルシフェラーゼ細胞及びＣＨＯ－ＴＡＡ細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００μｇ／ｍＬ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、及び１００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎ（商標）を補充した、ＭＥＭα培地＋Ｇｌｕｔａｍａｘ中に再懸濁した。９６ウェルプレートを用いて、４０，０００個のｈ４－１ＢＢ－ＨＴ１０８０－ルシフェラーゼ細胞及び４０，０００個のＣＨＯ－ＴＡＡ細胞をプレーティングし、ＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の濃度を上げながら細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２０時間後、上清を回収し、新しい９６ウェルプレートで遠心分離した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｌｃ１）を上清と混合し、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００発光プレートリーダ上で発光を読み取った。ＥＣ_５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０２）を用いて、４パラメータロジスティック適合モデルにデータを適合させることによって、決定した。

【0204】

結果：図７Ａは、ＴＡＡ発現細胞（集団１）の存在下において、全てのＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物が、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介され、４－１ＢＢ発現細胞中で４－１ＢＢシグナル伝達を同程度に誘導したことを示す。４－１ＢＢに結合しないＤＡＲＰｉｎタンパク質第５０番は、４－１ＢＢシグナル伝達に影響を及ぼさなかった。表４は、例として、選択されたＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のＥＣ_５０値を提供する：

【0205】

【表4】

【0206】

同様の結果が、ＴＡＡ発現細胞の第２の集団（集団２）で得られた（図７Ｂ）。表５は、例として、選択されたＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のＥＣ_５０値を提供する：

【0207】

【表5】

【0208】

結論として、全ての試験されたＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物が、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される４－１ＢＢ発現細胞中の４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができた。

【0209】

実施例５：タンパク質中の２つ又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの存在は、活性化４－１ＢＢシグナル伝達におけるその効力を増強する。
（ただ１つの代わりに）タンパク質中の２つ又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインの存在が、活性化４－１ＢＢシグナル伝達におけるタンパク質の効力に影響を及ぼすかどうかを試験するために、多価アンキリン反復タンパク質構築物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリベースのアプローチを用いてＤＮＡレベルで組み立て、ｐＭＰＡＧ０６にクローニングした。次に、正しく組み立てられた構築物を誘導性大腸菌（E．coli）細胞に形質転換し、上記のように、２つのｔｒｉｔｏｎ洗浄工程を伴うＩＭＡＣベンチトップ精製を用いて、発現及び精製した。

【0210】

以下の二価及び三価の４－１ＢＢアンキリン反復タンパク質構築物（及び対応する陰性対照構築物）を生成した：
配列番号５１（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、２つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメイン（各々配列番号１に由来）を含む））；
配列番号５２（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、２つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメイン（各々配列番号２に由来）を含む））；
配列番号５３（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、結合特異性を有しない２つの対照アンキリン反復ドメイン（各々配列番号４２に由来）を含む））；
配列番号５４（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメイン（各々配列番号１に由来）を含む））；
配列番号５５（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメイン（各々配列番号２に由来）を含む））；及び
配列番号５６（ＰＴリッチリンカ（配列番号５７）によって接続された、結合特異性を有しない３つの対照アンキリン反復ドメイン（各々配列番号４２に由来）を含む））。

【0211】

これらの二価及び三価の４－１ＢＢアンキリン反復構築物（及び対応する陰性対照構築物）は、細胞における活性化４－１ＢＢシグナル伝達のそれらの効力を試験するために、ローカライザ分子へ遺伝子接続された。以下の多価アンキリン反復タンパク質を生成し、試験した：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５１に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５２番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５２に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５３番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５３に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５４番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５４に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５５番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５５に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）；及び、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５６番（ペプチドリンカ（配列番号５７）によってそのＣ末端で配列番号５６に接続された、ＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインを含む）。

【0212】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５１番～ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）第５６番はまた、単純なタンパク質精製を容易にするような、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）も含んだ。

【0213】

多価アンキリン反復タンパク質を、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激ＣＥＭ細胞への結合のために、対応する４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを（結合されたローカライザあり又はなしで）１つのみ含む、結合タンパク質と一緒に試験した。アッセイは、実施例４に記載されているものと同様に実施した。図８Ａ～図８Ｃに示されるように、配列番号１に対応する１つ、２つ、又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含むアンキリン反復タンパク質の全て、及び配列番号２に対応する１つ、２つ、又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含むアンキリン反復タンパク質の全ては、ＣＥＭ細胞に結合するが、一方で４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを欠く陰性対照タンパク質は、いずれも細胞に結合しない。

【0214】

細胞中で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化するこれらのアンキリン反復タンパク質の能力を、ＴＡＡ発現ＣＨＯ細胞の存在下におけるｈ４－１ＢＢ発現ＨＴ１０８０細胞中のＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポータアッセイによって、決定した。アッセイは、実施例４に記載されているものと同様に実施した。発光シグナルは、４－１ＢＢシグナル伝達経路活性化の相対的な尺度を提供した。

【0215】

図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、２つ又は３つの４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質は、１つの対応する４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインのみを含む結合タンパク質よりも強い４－１ＢＢシグナル伝達を活性化した。驚くべきことに、３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質は、２つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質よりも強く４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しなかった。

【0216】

したがって、ＮＦ－ｋＢルシフェラーゼレポータアッセイによって測定されるように、最大の４－１ＢＢシグナル伝達活性を得るためには、少なくとも２つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインが必要である。第３の４－１ＢＢアンキリン反復ドメインの添加は、結合タンパク質に対してより高い効力を付与しない。

【0217】

配列番号１に対応する１つ、２つ、又は３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質は、ＴＡＡ陽性細胞（ＣＨＯ－ＴＡＡ）及びＴＡＡ媒介クラスタリングの存在下でのみ、４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化した。ＴＡＡ陰性細胞（ＣＨＯ－ｗｔ）の存在下において、したがってＴＡＡ媒介クラスタリングの非存在下において、これらの結合タンパク質は、４－１ＢＢ経路を活性化しなかった（図９Ａ）。配列番号２に対応する２つ又は３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質は、は、ＴＡＡ陰性細胞の存在下において、より高い濃度でいくらかの弱い活性化を示した。しかしながら、ＴＡＡ陽性細胞の存在下における活性化は、はるかに高かった（図９Ｂ）。陰性対照タンパク質は、いかなる活性も示さなかった（データ示さず）。

【0218】

結論として、４－１ＢＢ発現細胞における４－１ＢＢシグナル伝達を活性化するための４－１ＢＢアンキリン反復タンパク質の効力は、タンパク質中の２つ又は更に３つの４－１ＢＢアンキリン反復ドメインを含むことによって、増加させることができる。

【0219】

実施例６：ローカライザ分子に結合された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍中のヒトＣＤ８ Ｔ細胞の密度を選択的に増加させる
Ｔ細胞を刺激し、インビボで腫瘍増殖を阻害するためにローカライザ分子に結合された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の能力を、ヒト末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell：ＰＢＭＣ）で再構成されたＨＴ－２９結腸がん異種移植モデルで試験した（ＭｉＸｅｎｏ）。このヒト化マウスモデルは、免疫チェックポイント、及びアゴニスト抗４－１ＢＢ抗体などの共刺激薬の免疫刺激効果を試験するのに好適であると記載されている。このモデルにおける抗４－１ＢＢ ｍＡｂウレルマブによる治療は、腫瘍増殖を有意に遅くするのに充分である。しかしながら、未治療マウスと比較して早期死亡をもたらす、加速した移植片対宿主病（graft versus host disease：ＧＶＨＤ）及び肝臓Ｔ細胞浸潤などの強い全身効果もまた誘導される。モデルを使用して、４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメイン及びローカライザ分子を含む本発明の結合タンパク質が、腫瘍内Ｔ細胞浸潤を増加させ、非標的４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体である抗４－１ＢＢ ｍＡｂウレルマブによって生成された非腫瘍効果のいくつかを回避しながら、腫瘍の増殖を遅らせたかどうかを評価した。実験に使用される結合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番）は、配列番号５１を含んだ。ここで、配列番号５１に含まれた２つのアンキリン反復ドメインの各々の最後から第２番目の位置におけるＬ及び最後の位置におけるＮは、Ａにより置換され、そのＮ末端で、ペプチドリンカ（配列番号５７）によって、ローカライザとしてＴＡＡ特異的アンキリン反復ドメインに接続される。

【0220】

材料及び方法：
腫瘍実験：免疫不全ＮＯＧマウスに、ＨＴ－２９腫瘍細胞（３．５×１０^６）を右脇腹領域に皮下接種した。次に、２人の健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（３．５×１０^６細胞／マウス）を注射することにより、マウスをヒト化した。試験物を、表６に示すように所定のレジメンに従って、担がんマウスへ投与した。

【0221】

【表6】

【0222】

腫瘍細胞及びＰＢＭＣ接種の日付を０日目として示した。腫瘍増殖を３～４日ごとにモニタした。実験の１８日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を除去し、フローサイトメトリ及び定量的免疫蛍光法（quantitative immunofluorescence：ＱＩＦ）によって研究した。腫瘍増殖分析は、マウスがこの時間後に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の兆候を示し始めたため、１８日に制限された。

【0223】

フローサイトメトリ：生のＦＣＳファイルからのデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。細胞を、ヒト表面マーカＣＤ４５、ＣＤ４、及びＣＤ８を発現する生きたリンパ球でゲーティングした。死細胞は、生死標識色素（live-dead labelling dye）７－ＡＡＤの組み込みを介して分析から除外された。血液中で検出された全ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合としての、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の割合が示されている。

【0224】

免疫組織化学：組織を剖検時にマウスから回収し、最適な切断温度化合物（Ｓａｋｕｒａ）に埋め込み、事前に固定せずに凍結させた。ＯＣＴ埋込み凍結保存標本を７μｍの切片に切断し、スライドガラス上に取り付けた。スライドを冷アセトンで固定した。複数の蛍光免疫染色を、以下の抗体で行った：抗ＣＤ４（Ｇｏａｔ Ｐａｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、＃ＡＦ－３７９－ＮＡ）、抗ＣＤ８（Ｒａｂｂｉｔ ＰＡｂ、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ４０５５５）、及び抗ＣＤ４５（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０４００２）。これらの抗体は、それぞれ、抗Ｓｈｅｅｐ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１４４８）、抗ウサギＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）－Ｘ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃７１１－２９６－１５２）、及び抗マウスＩｇＧ１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５－５４５－２０５）により検出された。画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナで取得した。画像をＺｅｎ ｂｌｕｅソフトウェアで転送し、ＩｍａｇｅＪ １．５１ｎソフトウェアを用いて、ＦＩＪＩパッケージにより分析して、ヒトＣＤ４５、ＣＤ８、及びＣＤ４ Ｔ細胞の数を定量化した。

【0225】

統計分析：統計分析はＰｒｉｓｍ ７．０．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により行った。腫瘍増殖及び体重データを、反復測定二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン７．０２）を用いて統計学的有意差について分析した。生存曲線はカプラン・マイヤー法で分析され、ログ・ランク検定で比較された。試験終了時のフローサイトメトリデータを、一元配置分散分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン７．０２）を用いて分析した。両側Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。

【0226】

結果
腫瘍増殖：腫瘍増殖は時間の経過と共に個別に追跡された。独立標本ｔ検定を用いて腫瘍接種後１８日目に得られたデータに対して行われる統計分析に加えて、反復測定二元配置分散分析、続いてテューキーの多重比較検定を用いることによって、腫瘍増殖データを統計学的有意差について分析した。腫瘍増殖阻害を表７に概説する。

【0227】

【表7】

【0228】

腫瘍増殖曲線全体の分析は、研究終了時の最終腫瘍体積のみの分析と比較して、分析により高い解析力を与える。２つの分析はよく相関する。腫瘍増殖は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番治療群（ｐ＜０．００１）で遅延した。投与されたビヒクルは、腫瘍増殖に有意な影響を及ぼさなかった。要約すると、試験物質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番は、皮下ＨＴ－２９ヒト結腸がんＭｉＸｅｎｏモデルにおいて、有意な抗腫瘍活性を実証した。

【0229】

血液及び腫瘍の免疫表現型検査：フローサイトメトリによって得られた結果を確認するために、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔリンパ球密度を、１８日目に切除された腫瘍における組織学によって分析した。組織学的検査は、群当たり５匹のマウスの組織を用いて行った（データ示さず）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番による治療は、ビヒクル群と比較して、ヒトＣＤ８ Ｔリンパ球のより高密度の浸潤をもたらした。差は有意に達した（Ｐ＜０．０１）。一方で、ＣＤ４腫瘍浸潤リンパ球の数は、群全体で有意に異なってはいなかった。

【0230】

肝臓Ｔ細胞浸潤の組織学的分析：１８日目に切除された肝臓の組織学検査を、群当たり５匹のマウスからの組織を用いて行った。小、中、及び大きな表面積に分類される浸潤物の定量化は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番による処理が、肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を誘発しなかったことを示した。これは、抗４－１ＢＢ ｍＡｂウレルマブの投与がＮＯＧマウスにおけるヒトＰＢＭＣによる肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を誘発したことを示す、公表された結果とは対照的である。

【0231】

結論
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番は、皮下ＨＴ－２９ヒト結腸がんＭｉＸｅｎｏモデルにおいて、抗腫瘍活性を実証した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番による治療により、ビヒクル治療マウスと比較して、腫瘍中のヒトＣＤ８ Ｔ細胞の密度が増加した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第６０番による治療は、忍容性が良好であり、体重減少又は生存の減少にはつながらず、ビヒクル群と比較して肝臓Ｔ細胞浸潤の増加は生じなかった。

【0232】

実施例７：様々なローカライザに結合された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は、４－１ＢＢ発現細胞中の４－１ＢＢに結合し、これを活性化する
細胞内で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する本発明の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質の能力が、実施例４及び実施例５で例として使用されるＴＡＡ特異的ローカライザに依存しないことを実証するために、他のいくつかのローカライザ－４－１ＢＢアンキリン反復タンパク質構築物が生成され、試験された。

【0233】

いくつかの異なるローカライザ分子は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリアプローチを用いることによって、本発明の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質に遺伝的に結合された。正しいベクタを誘導性大腸菌（E.coli）発現細胞に形質転換し、Ｎｉ－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）カラムで発現及び精製し、続いて、上記のようにＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システムで分子ふるいクロマトグラフィを行った。これらの構築物は、フィブロネクチン・エキストラ・ドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、又はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対して結合特異性を有するローカライザアンキリン反復ドメインを含み、それぞれ、ＰＴリッチペプチドリンカにより配列番号５１に接続された。以下の局所化－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物を、前の実施例に記載のＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物に加えて生成した：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５７番（ＰＴリッチペプチドリンカによってそのＣ末端で配列番号５１に接続された、ＥＤ－Ｂ特異的アンキリン反復タンパク質を含む）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５８番（ＰＴリッチペプチドリンカによってそのＣ末端で配列番号５１に接続された、ＥＧＦＲ特異的アンキリン反復タンパク質を含む）；及び
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５９番（ＰＴリッチペプチドリンカによってそのＣ末端で配列番号５１に接続された、ＨＥＲ２特異的アンキリン反復タンパク質を含む）。

【0234】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質第５７番～第５９番はまた、単純なタンパク質精製を容易にするような、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号４３）も含んだ。

【0235】

実施例４及び実施例５で使用されるＴＡＡ特異的ローカライザと同様に、これらのローカライザアンキリン反復ドメインは、各々、標的（ＥＤ－Ｂ、ＥＧＦＲ、又はＨＥＲ２）に結合し、これは、ある特定の腫瘍タイプで過剰発現し、したがって腫瘍局在化に使用することができる。それぞれのローカライザ標的へのローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の特異的結合は、ＳＰＲ測定（前の実施例で説明したように実行）によって実証され、各々が、そのそれぞれの組換え標的タンパク質に対して１０^－８Ｍ未満の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を示した（データ示さず）。表８は、様々なローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物のヒト４－１ＢＢへの結合親和性（Ｋ_Ｄ）提示する。

【0236】

【表8】

【0237】

ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される４－１ＢＢ発現細胞中で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化するローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の能力を、実施例４のＴＡＡ－４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物について記載されたのと同様に又は組換えＥＤ－Ｂの存在下において、ローカライザ標的ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を発現する細胞と共培養した４－１ＢＢ発現レポータ細胞を用いて、アッセイ中に試験した。

【0238】

腫瘍間質（ＥＤ－Ｂ）中のローカライザ標的ＥＤ－Ｂ、ＥＧＦＲ、及びＨＥＲ２、又は共培養（Ａ４３１細胞／ＥＧＦＲ及びＢＴ４７４細胞／ＨＥＲ２）に使用されるそれぞれの腫瘍細胞の発現は、図１０Ａ～図１０Ｃに示される。様々なローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物による４－１ＢＢ発現レポータ細胞における４－１ＢＢシグナル伝達のローカライザ標的特異的活性化を、図１１Ａ～図１１Ｃに示す。実験の各々において、ローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物は、共培養腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質としてローカライザの特定の標的が存在した場合、４－１ＢＢ発現細胞において４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができた（図１１Ｂ（ＥＧＦＲ）及び図１１Ｃ（ＨＥＲ２）、又は組換えタンパク質として（図１１Ａ（ＥＤ－Ｂ））。例えば、ＥＧＦＲ標的化ローカライザを含むＤＡＲＰｉｎタンパク質第５８番は、ＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞と共培養された場合には４－１ＢＢ発現細胞において４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができたが、ＢＴ４７４細胞と共培養された場合又はＥＤ－Ｂの存在下における場合には活性化することができなかった。これらのデータは、開示された４－１ＢＢ特異的アンキリン反復ドメインが、異なるローカライザ分子に結合され、それらの表面上のローカライザ標的（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２）を発現する細胞の存在に依存するか、又はローカライザ媒介クラスタリング（ＥＤ－Ｂ）を誘導することができる細胞外タンパク質としてのローカライザ標的の存在に依存する４－１ＢＢ発現細胞において、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する機能的ローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物をもたらすことができることを実証する。

【0239】

ローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する能力もまた、４－１ＢＢ発現初代ＣＤ８＋Ｔ細胞で試験された。

【0240】

材料及び方法：
ＥＧＦＲクラスタリングを用いたインビトロヒトＴ細胞ＩＦＮγ放出アッセイ：バフィコートは、チューリッヒ献血センター（Zurich blood donation centre）から入手し、ＰＢＳで希釈した。次いで、ＰＢＭＣを、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブを用いた密度遠心分離によって単離した。いくつかの洗浄工程後、製造者の推奨に従い陰性選択ヒトＣＤ８ Ｔ細胞単離キットを用いて、ＣＤ８ Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。ＣＤ８ Ｔ細胞（１×１０^５／ウェル）を、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３クローンＯＫＴ－３及びＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎで事前に被覆された９６ウェルプレート上に播種し、続いて様々な濃度のローカライザ４－１ＢＢ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）構築物の存在下においてビオチン化ＥＧＦＲを播種した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ_２で９６時間インキュベートした後、上清を新しい９６ウェルプレートに取り出し、分析まで－２０℃で保存した。上清のＩＦＮγ濃度は、製造者の指示に従いヒトＩＦＮ－γ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡを用いて検出した。

【0241】

ＨＥＲ２クラスタリングを用いたインビトロヒトＴ細胞ＩＦＮγ放出アッセイ：このアッセイは、ビオチン化ＥＧＦＲの代わりにビオチン化ＨＥＲ２を使用したことを除いて、ＥＧＦＲクラスタリングについて上記のように実施した。

【0242】

図１２Ａに示すように、ＥＧＦＲ標的ローカライザを含むＤＡＲＰｉｎタンパク質第５８番は、ＥＧＦＲ被覆プレートの存在下においてインターフェロン－γ分泌を誘導したが、一方でＨＥＲ２標的ローカライザを含むＤＡＲＰｉｎタンパク質第５９番は、これらの状況では一切の影響を及ぼさなかった。図１２Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ第５９番がＨＥＲ２被覆プレートの存在下においてインターフェロン－γ分泌を誘導したのに対し、ＤＡＲＰｉｎタンパク質第５８番が、これらの状況では有意な影響を一切及ぼさなかったことを示す。

【0243】

結果は、ローカライザを含む本発明の４－１ＢＢ特異的結合タンパク質が、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される初代Ｔ細胞において、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化できることを実証する。結論として、本発明の４－１ＢＢ特異的アンキリン反復タンパク質は、多種多様なローカライザ分子に結合されて、ローカライザを介したクラスタリングによって媒介される４－１ＢＢ発現細胞において４－１ＢＢシグナル伝達に結合し、これを活性化するタンパク質を生成することができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【配列表】

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【国際調査報告】