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特表2022-535234等温増幅を使用したデジタル生体分子検出および／または定量化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-05
(54)【発明の名称】等温増幅を使用したデジタル生体分子検出および／または定量化
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20220729BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220729BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20220729BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220729BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571415
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2022-01-12
(86)【国際出願番号】 EP2020064771
(87)【国際公開番号】W WO2020239874
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】19305669.4
(32)【優先日】2019-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】504301959
【氏名又は名称】インスティテュート ナティオナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル（インセルム）
(71)【出願人】
【識別番号】517124642
【氏名又は名称】エコール シュペリュール ドゥ フィジーク エ ドゥ シミ アンドゥストゥリエール ドゥ ラ ヴィーユ ドゥ パリ
(71)【出願人】
【識別番号】521520968
【氏名又は名称】パリ シアンス エ レトゥル
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100183379
【弁理士】
【氏名又は名称】藤代 昌彦
(72)【発明者】
【氏名】ロンデレーズ ヤニック
(72)【発明者】
【氏名】ギネス ギヨーム
(72)【発明者】
【氏名】リマ デ カストロ メネゼス ロベルタ
(72)【発明者】
【氏名】タリー ヴァレリー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR10
4B063QR14
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、試料中の少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、前記生体分子は、等温増幅に基づき、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質から選択される、デジタル方法に関する。本発明は、デジタル方法の様々な応用およびキットにさらに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、ａ）前記試料を、緩衝液、酵素、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドを含む混合物と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を幾つかの区画に分配し、前記区画の一部が前記標的生体分子を含まないステップ、
ｃ）前記標的生体分子をシグナルへと変換し、前記シグナルは好ましくはＤＮＡ一本鎖であるステップ、
ｄ）前記シグナルを増幅するステップ、および
ｅ）各区画における前記シグナルを検出および／または測定するステップ
を含むデジタル方法。
【請求項2】
前記標的生体分子は、核酸またはタンパク質であり、前記タンパク質は好ましくは酵素である、請求項１に記載のデジタル方法。
【請求項3】
前記標的生体分子は、核酸であり、好ましくは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを含む群から選択され、より好ましくは、前記核酸はマイクロＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ステップａ）で使用される酵素は、ポリメラーゼ、ニッキング酵素または制限酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のオリゴヌクレオチドは、ニッキング酵素認識部位を含む部分的反復構造を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドに沿って、重合の産物に結合し、それらを伸長し、不活性化し、ゆっくりと放出することができ、それにより閾値効果を誘導する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
リポートプローブである第４のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含み、好ましくは、前記リポートプローブは蛍光プローブである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
２種またはそれよりも多くの生体分子を検出および／または定量化するための交差阻害性オリゴヌクレオチドである第５のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ステップａ）で得られる混合物は、ステップｂ）において液滴へと、好ましくは油中水型エマルジョン液滴へと分配される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記液滴のサイズは、０．００１～１００ｐＬ、好ましくは０．０１～１０ｐＬ、より好ましくは０．１～５ｐＬ、または０．１～８ｐＬの間に含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記シグナルは、標識されており、好ましくは蛍光により標識されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記シグナルを検出および／または測定するステップｄ）は、蛍光を発する前記区画を検出および／または計数することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
試験された生物学的試料中の前記標的生体分子の絶対濃度を測定するために、蛍光シグナルを受け取っている区画および非蛍光の区画が計数され、それらの比が算出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記標的生体分子は、バイオマーカーとして使用される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項15】
生物的ストレス、好ましくは感染性および／もしくは寄生虫性原因により引き起こされる疾患、または非生物的ストレス、好ましくは栄養欠乏および／もしくは不利な環境により引き起こされる疾患
を含む群から選択される疾患の農学的診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
請求項１～１３のいずれか１項に記載のデジタル方法を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項16】
少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのキットであって、ａ）好ましくは、ポリメラーゼ、ニッキング酵素または制限酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される、酵素の混合物、
ｂ）増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチド、および任意に、リポートプローブである第４のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、ならびに
ｃ）分配剤、好ましくは油中水型エマルジョン
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特異的分子設計を有する等温増幅に基づき、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などの生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法に関する。本発明は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断するための方法、ならびに農学的診断のための方法にさらに関する。また、本発明は、食品農業食品分野のおよび環境中のバイオマーカー（生体分子）を検出するための方法にも関する。こうした診断および検出方法はすべて、本発明のデジタル方法を使用することを含む。また、本発明は、少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのキットであって、酵素、オリゴヌクレオチド、および分配剤を含むキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの幾つかの生体分子は、魅力的な診断、予後、または予測バイオマーカーとして使用される。こうした分子および特に核酸は、種々の疾患（がん、神経または心血管疾患、糖尿病など）に密接に関連するという臨床的証拠が蓄積されている。さらに、こうした分子および特に核酸は、体液中に存在するため、低侵襲性液体生検（血清、血漿、尿）を介してアクセス可能である。循環バイオマーカーは繰り返して評価することができるため、治療および再発の定期的な経過観察、大規模集団スクリーニング、または早期診断が可能になる。
臨床目的で使用するためには、得られる結果が正確でなければならないため、こうした生体分子の検出は難しい作業であることが多い。そのため、そのようなバイオマーカーを正確に測定することが重大なボトルネックになっており、高感度で特異的な定量的検出技術の開発が促されている。
臨床目的で使用するためには、得られる結果が正確でなければならないため、こうした生体分子の検出は難しい作業であることが多い。そのため、そのようなバイオマーカーを正確に測定することが重大なボトルネックになっており、高感度で特異的な定量的検出技術の開発が促されている。
【0003】
タンパク質の高感度検出に最もよく使用される技法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、核酸の場合は、ＤＮＡを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＲＮＡを検出するための逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）である。こうした技法はすべて、特異的で高感度な検出を可能にするが、幾つかの制限があり、改良の必要がある。
例えば、現在、ＰＣＲおよび関連方法によるＤＮＡの検出は、標的核酸の増幅を必要とする。これは、検出方法の特異性および感度を減少させる非特異的または不良なシグナル増幅を起こし易い可能性がある。
ＲＮＡ検出に関しては、ＲＴ－ｑＰＣＲは感度が高いにも関わらず、この技法には幾つかの欠点がある。ＲＴステップは、定量化に著しいバイアスを導入することが知られており（Bustin et al., 2015）、各標的ごとにプライマーおよびプローブを設計しなければならず、標的の長さが短いため、洗練された設計に依存する必要があり、サーモサイクルプロトコールを各アッセイごとに最適化すべきであり、標的自体が増幅されるため、持ち越し夾雑の有害原因であり（Aslanzadeh et al., 2004）、ＰＣＲ反応は生物学的試料中で阻害されることが知られている（Opel et al. 2010）。加えて、この手順は、増幅のリアルタイム追跡に依存しており、標準較正が必要であるため、生体分子の量の定性的推定値しか得られない。
例えば、現在、ＰＣＲおよび関連方法によるＤＮＡの検出は、標的核酸の増幅を必要とする。これは、検出方法の特異性および感度を減少させる非特異的または不良なシグナル増幅を起こし易い可能性がある。
ＲＮＡ検出に関しては、ＲＴ－ｑＰＣＲは感度が高いにも関わらず、この技法には幾つかの欠点がある。ＲＴステップは、定量化に著しいバイアスを導入することが知られており（Bustin et al., 2015）、各標的ごとにプライマーおよびプローブを設計しなければならず、標的の長さが短いため、洗練された設計に依存する必要があり、サーモサイクルプロトコールを各アッセイごとに最適化すべきであり、標的自体が増幅されるため、持ち越し夾雑の有害原因であり（Aslanzadeh et al., 2004）、ＰＣＲ反応は生物学的試料中で阻害されることが知られている（Opel et al. 2010）。加えて、この手順は、増幅のリアルタイム追跡に依存しており、標準較正が必要であるため、生体分子の量の定性的推定値しか得られない。
【0004】
上述の欠点は、小さな区画内に単一核酸分子を単離して分析することに基づくデジタル手順を使用することにより部分的に克服することができる。
デジタル技法には、特に、幾つかの利点がある：
ｉ）エンドポイントアッセイと適合性であり、反応の継続的なモニタリングを必要としないこと、
ｉｉ）較正標準物質を用いずに絶対的定量化を提供すること、
ｉｉｉ）究極的な感度を提供すること、
ｉｖ）特に、複雑なバックグラウンド内の稀少標的の場合、アッセイの感度および特異性も向上すること。
デジタル技法には、特に、幾つかの利点がある：
ｉ）エンドポイントアッセイと適合性であり、反応の継続的なモニタリングを必要としないこと、
ｉｉ）較正標準物質を用いずに絶対的定量化を提供すること、
ｉｉｉ）究極的な感度を提供すること、
ｉｖ）特に、複雑なバックグラウンド内の稀少標的の場合、アッセイの感度および特異性も向上すること。
【0005】
しかしながら、アッセイをデジタル方式に移行できるのは、そのバルク感度が、１区画当たりの単一標的に対応する濃度よりも既に高い場合のみである。例えば、デジタル手順に使用される区画の内部容積が約１ナノリットルである場合、そのような区画内の単一分子の濃度はフェムトモル程度であり、デジタルアッセイには、検出限界がフェムトモルよりも低い増幅技術が必要とされることになる。検出限界がフェムトモルよりも高い増幅法は、この状況では使用することができないことになる。ＰＣＲは、一般に高感度という要件を満たし、生体分子、特に核酸を精密におよび絶対的に定量化するための強力な方法を提供するが、デジタル方式で評価するには、ＲＴ－ｑＰＣＲの弱点がそのまま残されている（Campomenosi et al., 2016）。
【0006】
より単純な１段階プロトコールに依存し、サーモサイクルを必要とせず、逆転写反応から解放されている等温代替法（Zhao et al., 2015）が提案されている（ＥＸＰＡＲ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＨＣＲなど）。感度はふさわしいにも関わらず、こうした技法は、非特異的な増幅反応に悩まされており、そのためデジタル読出しには適していない。例えば、Ｚｈａｎｇら（Zhang et al., 2015）は、高速な非特異的増幅を起こし易いことが周知の方法であるＥＸＰＡＲ（指数関数的増幅反応）に関して、こうした制限があることを明確に示した。著者らは、デジタル方式に適応させると、標的含有液滴のわずか数分後に空液滴が増幅されることを示した。したがって等温核酸増幅法は、バルクで良好な感度を示すものの、ロバストなデジタル方式に移行させることができないことを示した。
このように、酵素および核酸、特にマイクロＲＮＡをデジタル測定するためのロバストな方法は、現在のところ利用可能ではない。
このように、酵素および核酸、特にマイクロＲＮＡをデジタル測定するためのロバストな方法は、現在のところ利用可能ではない。
【0007】
本発明の目的は、生体高分子、特に核酸および酵素など、バイオマーカーとして使用される生体分子を検出する際に、絶対的定量化およびより高い感度を可能にする方法であって、特異的等温増幅法のデジタル化に基づくが、上記で挙げられている欠点を有さない方法を提供することである。さらに、本発明は、１つの系で容易に実施することができるそのような方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【0008】
本発明の発明者らは、核酸を検出するためのバックグラウンド増幅を排除するための方法を以前に開発した（国際公開第２０１７１４０８１５号パンフレット）。本発明の発明者らは、驚くべきことに、バイオマーカーとして使用される生体分子の検出感度を増加させること、増幅反応の継続的モニタリングまたは検量線の使用を必要とせずに、バルク測定においてそれらの１種を正確に定量化することを可能にするデジタル方法を得るために、このアナログ法をデジタル化することに成功し得ることを見出した。
したがって、第１の態様によると、本発明は、試料中の少なくとも１種の生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、
ａ）前記試料を、緩衝液、酵素、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチド（leak absorption oligonucleotide）である第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドを含む混合物と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を幾つかの区画に分配し、区画の一部は標的生体分子を含まないステップ、
ｃ）標的生体分子をシグナルへと変換し、前記シグナルは好ましくはＤＮＡ一本鎖であるステップ、
ｄ）シグナルを増幅するステップ、および
ｅ）各区画における増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップ
を含むデジタル方法に関する。
したがって、第１の態様によると、本発明は、試料中の少なくとも１種の生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、
ａ）前記試料を、緩衝液、酵素、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチド（leak absorption oligonucleotide）である第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドを含む混合物と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を幾つかの区画に分配し、区画の一部は標的生体分子を含まないステップ、
ｃ）標的生体分子をシグナルへと変換し、前記シグナルは好ましくはＤＮＡ一本鎖であるステップ、
ｄ）シグナルを増幅するステップ、および
ｅ）各区画における増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップ
を含むデジタル方法に関する。
【0009】
この方法の主な利点は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などの生体分子を迅速で選択的に検出すること、ならびにこうした生体分子の絶対的定量化も可能になることである。
特に、ＲＮＡを検出および／または定量化する場合、ＲＴ－ＰＣＲアナログ法と比較した本発明の方法の利点は、１）アッセイの定量性を妨げる可能性がある逆転写ステップを必要としないこと、２）ＰＣＲステップに必要な高温および温度サイクルが必要ではないこと、３）等温増幅は、粗試料に見出される可能性があり、ＰＣＲ反応を阻害することが示されている多数の化学物質に対してロバストであり（Huggett et al. 2008）、標的生体分子が増幅されないため、交差夾雑問題が回避されることである。
特に、ＲＮＡを検出および／または定量化する場合、ＲＴ－ＰＣＲアナログ法と比較した本発明の方法の利点は、１）アッセイの定量性を妨げる可能性がある逆転写ステップを必要としないこと、２）ＰＣＲステップに必要な高温および温度サイクルが必要ではないこと、３）等温増幅は、粗試料に見出される可能性があり、ＰＣＲ反応を阻害することが示されている多数の化学物質に対してロバストであり（Huggett et al. 2008）、標的生体分子が増幅されないため、交差夾雑問題が回避されることである。
【0010】
また、本発明者らは、本発明の方法を使用して、生体分子を含む任意のタイプの試料、例えば、血液試料および他の生物学的流体から、生体分子を直接的に検出することができることを実証した。
この方法の特異性、単純性、および迅速性は、医学的診断方法、特に、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患などの疾患の診断に、この方法を使用することを可能にする。
また、第２の態様によると、本発明は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本デジタル方法を使用することを含む診断方法に関する。
この方法の特異性、単純性、および迅速性は、医学的診断方法、特に、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患などの疾患の診断に、この方法を使用することを可能にする。
また、第２の態様によると、本発明は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本デジタル方法を使用することを含む診断方法に関する。
【0011】
本発明のデジタル方法の特異性、感度、単純性、および迅速性は、特に、感染性および寄生虫性疾患などの生物的ストレスにより引き起こされる疾患、または栄養欠乏もしくは不利な環境などの非生物的ストレスにより引き起こされる疾患を診断するための農学的診断法に、本発明のデジタル方法を使用することを可能にする。
また、第３の態様によると、本発明は、
生物的ストレスにより、好ましくは感染性および／もしくは寄生虫性原因（origin）により引き起こされる疾患、または
非生物的ストレスにより、好ましくは栄養欠乏および／もしくは不利な環境により引き起こされる疾患
を含む群から選択される疾患の農学的診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
本発明のデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明の方法を実施するためのキットも提供される。
また、第３の態様によると、本発明は、
生物的ストレスにより、好ましくは感染性および／もしくは寄生虫性原因（origin）により引き起こされる疾患、または
非生物的ストレスにより、好ましくは栄養欠乏および／もしくは不利な環境により引き起こされる疾患
を含む群から選択される疾患の農学的診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
本発明のデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明の方法を実施するためのキットも提供される。
【0012】
したがって、第４の態様によると、本発明は、少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのキットであって、
ａ）好ましくは、ポリメラーゼ、ニッキング酵素または制限酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される酵素の混合物、
ｂ）増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチド、および任意に、リポートプローブ（reporting probe）である第４のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、ならびに
ｃ）分配剤、好ましくは油中水型エマルジョン
を含むキットに関する。
ａ）好ましくは、ポリメラーゼ、ニッキング酵素または制限酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される酵素の混合物、
ｂ）増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチド、および任意に、リポートプローブ（reporting probe）である第４のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、ならびに
ｃ）分配剤、好ましくは油中水型エマルジョン
を含むキットに関する。
【発明を実施するための形態】
【0013】
上記に示されているように、本発明は、最近のバックグラウンドフリー増幅化学（background-free amplification chemistry）をデジタル読出しに適応させ、したがって生体分子標的の絶対的定量化を提供することに関する。
特に、生体分子標的、特に核酸標的の等温増幅におけるバックグラウンド増幅を排除することを含む適応型バックグラウンドフリー増幅化学は、本発明の発明者の一部により実施され、国際公開第２０１７１４０８１５号パンフレットに開示されているものである。
したがって、第１の態様によると、本発明は、試料中の少なくとも１種の生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、
ａ）前記試料を、緩衝液、酵素、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドを含む混合物と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を幾つかの区画に分配し、区画の一部は標的生体分子を含まないステップ、
ｃ）標的生体分子をシグナルへと変換し、前記シグナルは好ましくはＤＮＡ一本鎖であるステップ、
ｄ）シグナルを増幅するステップ、および
ｅ）各区画における増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップ
を含むデジタル方法に関する。
特に、生体分子標的、特に核酸標的の等温増幅におけるバックグラウンド増幅を排除することを含む適応型バックグラウンドフリー増幅化学は、本発明の発明者の一部により実施され、国際公開第２０１７１４０８１５号パンフレットに開示されているものである。
したがって、第１の態様によると、本発明は、試料中の少なくとも１種の生体分子を検出および／または定量化するためのデジタル方法であって、
ａ）前記試料を、緩衝液、酵素、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドを含む混合物と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を幾つかの区画に分配し、区画の一部は標的生体分子を含まないステップ、
ｃ）標的生体分子をシグナルへと変換し、前記シグナルは好ましくはＤＮＡ一本鎖であるステップ、
ｄ）シグナルを増幅するステップ、および
ｅ）各区画における増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップ
を含むデジタル方法に関する。
【0014】
本発明によるデジタル方法は、１種または複数種の生体分子を同時に検出および／または定量化することを可能にし、前記生体分子は、同じまたは異なる構造および機能を有する。
本発明の状況では、「生体分子」という用語は、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸などの大型巨大分子または生体高分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然産物などの小型分子に関する。本発明における生体分子は、通常は内因性であるが、外因性（例えば、生物医薬薬物）であってもよい。
本発明の１つの好ましい実施形態によると、生体分子は、タンパク質、好ましくは酵素を含む群から、または核酸から選択される。
本発明の状況では、「生体分子」という用語は、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸などの大型巨大分子または生体高分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然産物などの小型分子に関する。本発明における生体分子は、通常は内因性であるが、外因性（例えば、生物医薬薬物）であってもよい。
本発明の１つの好ましい実施形態によると、生体分子は、タンパク質、好ましくは酵素を含む群から、または核酸から選択される。
【0015】
本発明者らは、驚くべきことに、酵素活性を、デジタルバイオアッセイにおいてＤＮＡシグナルの閾値指数関数的増幅が実施される汎用分子回路とカップリングすることにより、当技術分野の他のデジタル酵素試験と比較して非常に高い感度で酵素の検出および／または定量化が可能になる（数種類の酵素の検出が可能になる）ことを見出した。この回路は、標的活性を短鎖ＤＮＡトリガーの生成に結び付けるモジュール、および検出可能な読出し、特に蛍光読出しを産生するＤＮＡ増幅系を含む。酵素触媒速度がシグナル生成から切り離されるため、この多用途フレームワークは、デジタル検出、特に、標準的なマイクロ区画、特にピコリットル範囲の内部容積を有するマイクロ流体液滴を使用した、幅広いＤＮＡプロセシング酵素の液滴デジタル検出を可能にする。したがって、本発明の方法は、単一酵素に関連付けられる弱い触媒活性を、検出可能なシグナルへと、特に、マイクロ区画、特にマイクロ液滴内での容易な検出に十分な強度の蛍光シグナルへと変換することを可能にする。
【0016】
本発明の状況では、「酵素」という用語は、触媒機能を有し、分子基質の変換を触媒することができるタンパク質を指す。本発明のデジタル方法により検出および／または定量化することができる酵素の群は、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびキナーゼなどの幅広い範囲の活性を有するＤＮＡ関連酵素、または非ＤＮＡ関連酵素から選択される。特に、酵素は、ニッキング酵素、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ、ＡＰ－エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＲＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、およびメチラーゼを含む群から選択される。より具体的には、本発明の方法は、ニッキング酵素および制限エンドヌクレアーゼを識別および／または定量化するために実施することができる。本発明の方法により検出および／または定量化することができる酵素の特定の例としては、これらに限定されないが、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＲＮＡｓｅＨ２． ＡＰＥ－エンドヌクレアーゼ１（ＡＰＥ－１）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アルキルアデニングリコシラーゼ（ＡＡＧ）、ＢｓｍＡＩ制限酵素、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）が挙げられる。
【0017】
本発明の状況では、「モジュール」という用語は、シグナル変換、増幅、リポートなどの特定の作用を実施するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの群に関する。核酸が検出される場合、モジュールは、オリゴヌクレオチド（鋳型）に相当する。酵素が検出される場合、モジュールは、オリゴヌクレオチドの群に相当する。
別の実施形態では、本発明の生体分子標的は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの核酸である。さらにより好ましくは、本発明の生体分子標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
本発明の状況では、「核酸」という用語は、ヌクレオチドで構成される生体高分子または小型生体分子に関し、ヌクレオチドは、３つの成分：５炭素糖、リン酸基、および含窒素塩基でできているモノマーである。糖が化合物リボースである場合、ポリマーはＲＮＡ（リボ核酸）であり、糖が、リボースに由来するデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である。
別の実施形態では、本発明の生体分子標的は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの核酸である。さらにより好ましくは、本発明の生体分子標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
本発明の状況では、「核酸」という用語は、ヌクレオチドで構成される生体高分子または小型生体分子に関し、ヌクレオチドは、３つの成分：５炭素糖、リン酸基、および含窒素塩基でできているモノマーである。糖が化合物リボースである場合、ポリマーはＲＮＡ（リボ核酸）であり、糖が、リボースに由来するデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である。
【0018】
上述のように、本発明のデジタル方法は、分子をコードするＤＮＡ分子または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を検出および／または定量化するために使用することができる。
さらにより好ましくは、本発明の方法は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子を検出および／または定量化するために使用される。
最も好ましい実施形態によると、本発明の方法は、マイクロＲＮＡ分子を検出および／または定量化するために使用することができる。
さらにより好ましくは、本発明の方法は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子を検出および／または定量化するために使用される。
最も好ましい実施形態によると、本発明の方法は、マイクロＲＮＡ分子を検出および／または定量化するために使用することができる。
【0019】
本発明の状況では、「マイクロＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現の転写後調節に関与する約２２ヌクレオチドの長さを有する、内因性の短鎖非コードＲＮＡ鎖を指す。
本発明の方法を実施するために、第１のステップ（ステップａ））では、バックグラウンド増幅の回避を可能にする分子プログラムを、標的生体分子を含む生物学的試料と混合することが必要である。
本明細書で使用される場合、「標的生体分子」または「生体分子標的」という用語は、本発明の方法により検出および／または定量化される、上記で定義された通りの生体分子に関する。
本発明の方法を実施するために、第１のステップ（ステップａ））では、バックグラウンド増幅の回避を可能にする分子プログラムを、標的生体分子を含む生物学的試料と混合することが必要である。
本明細書で使用される場合、「標的生体分子」または「生体分子標的」という用語は、本発明の方法により検出および／または定量化される、上記で定義された通りの生体分子に関する。
【0020】
こうした標的生体分子は試料内に存在する。前記試料は、任意のタイプのものであってもよい。例えば、前記試料は、試験する対象から得ることができ、前記対象は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。このような試料は、生物学的試料とも呼ばれる。
本発明の状況では、「生物学的試料」という用語は、生命体から得られる固体または流体の生物学的物質に関する。固体生物学的試料は、細胞、組織の一部（生検）、組織全体、または臓器などであってもよい。
好ましくは、本発明の方法で使用される試料は、流体試料である。
本発明の状況では、「生物学的流体の試料」または「流体試料」という用語は、生命体により産生される生物有機的流体から得られる任意の試料に関する。生物学的流体は、細胞外液、血管内液、間質液、リンパ液、および細胞透過液を含む群から選択される。
本発明の状況では、「生物学的試料」という用語は、生命体から得られる固体または流体の生物学的物質に関する。固体生物学的試料は、細胞、組織の一部（生検）、組織全体、または臓器などであってもよい。
好ましくは、本発明の方法で使用される試料は、流体試料である。
本発明の状況では、「生物学的流体の試料」または「流体試料」という用語は、生命体により産生される生物有機的流体から得られる任意の試料に関する。生物学的流体は、細胞外液、血管内液、間質液、リンパ液、および細胞透過液を含む群から選択される。
【0021】
特に、生物学的流体の試料は、血液および血液成分、尿、唾液などを含む群から選択される。
より好ましい実施形態では、生物学的流体の試料は、血液の試料または血液成分の試料である。「血液の試料」または「血液成分の試料」とは、特に、赤血球画分、白血球画分、血小板、血漿、または血清から選択される血液全体またはその成分の１種を意味する。
本発明の別の実施形態では、試料は、非生命体から得ることができる。例えば、試料は、空気、水、土壌、消化産物などから得ることができる。試料のタイプは、本発明のデジタル方法の応用に依存する。本発明によると、前記試料は、生体分子を含むかまたは含み易い。
上記に示されているように、標的生体分子を含む試料は、本発明のデジタル方法のステップａ）にて、分子プログラムと混合される。
より好ましい実施形態では、生物学的流体の試料は、血液の試料または血液成分の試料である。「血液の試料」または「血液成分の試料」とは、特に、赤血球画分、白血球画分、血小板、血漿、または血清から選択される血液全体またはその成分の１種を意味する。
本発明の別の実施形態では、試料は、非生命体から得ることができる。例えば、試料は、空気、水、土壌、消化産物などから得ることができる。試料のタイプは、本発明のデジタル方法の応用に依存する。本発明によると、前記試料は、生体分子を含むかまたは含み易い。
上記に示されているように、標的生体分子を含む試料は、本発明のデジタル方法のステップａ）にて、分子プログラムと混合される。
【0022】
本発明の方法で使用される分子プログラムは、国際公開第２０１７１４０８１５号に詳細に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の状況では、「分子プログラム」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで情報処理タスクを実施するための生体分子回路を設計することに関する。分子プログラムは、分子回路の合理的設計を可能にする固有のプログラム可能性をＤＮＡに付与する予測可能なワトソンおよびクリック塩基対合に基づく。
本発明の方法で使用される分子プログラムは、ＰＥＮ－ＤＮＡ ｔｏｏｌｂｏｘ（（ポリメラーゼエキソヌクレアーゼニッカーゼダイナミックネットワークアセンブリ（Polymerase Exonuclease Nickase-Dynamic Network Assembly））、Montagne et al., 2011）と称される多用途分子プログラミング言語によるものであり、本発明者らの一部が開発したものに基づく。ネットワークのトポロジーは、１セットの短鎖オリゴヌクレオチド（鋳型）により規定される。ネットワークは、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびニッカーゼ、または制限酵素）の混合物により解釈され、酵素は、ＤＮＡ鎖を産生および分解することにより情報流束を処理し、それによりひいてはネットワークの他のノードを活性化または阻害する。
本発明の状況では、「分子プログラム」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで情報処理タスクを実施するための生体分子回路を設計することに関する。分子プログラムは、分子回路の合理的設計を可能にする固有のプログラム可能性をＤＮＡに付与する予測可能なワトソンおよびクリック塩基対合に基づく。
本発明の方法で使用される分子プログラムは、ＰＥＮ－ＤＮＡ ｔｏｏｌｂｏｘ（（ポリメラーゼエキソヌクレアーゼニッカーゼダイナミックネットワークアセンブリ（Polymerase Exonuclease Nickase-Dynamic Network Assembly））、Montagne et al., 2011）と称される多用途分子プログラミング言語によるものであり、本発明者らの一部が開発したものに基づく。ネットワークのトポロジーは、１セットの短鎖オリゴヌクレオチド（鋳型）により規定される。ネットワークは、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびニッカーゼ、または制限酵素）の混合物により解釈され、酵素は、ＤＮＡ鎖を産生および分解することにより情報流束を処理し、それによりひいてはネットワークの他のノードを活性化または阻害する。
【0023】
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、ステップａ）の混合物中の酵素は、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、制限酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される。ポリメラーゼ、ニッキング酵素、および制限酵素は、等温増幅を駆動し、エキソヌクレアーゼは、系の飽和を回避することができる。
特に、本発明のデジタル方法で使用されるポリメラーゼは、Ｂｓｔ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ大型断片ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片（３’－＞５’ｅｘｏ-）（クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ-）またはクレノウポリメラーゼ）とも呼ばれる）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼを含む群から選択され、より具体的には、ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼである（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入）。本発明の方法の一実施形態によると、１種またはそれよりも多くのポリメラーゼを同時に使用することができる。好ましい実施形態によると、ポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウ断片（３’－＞５’ｅｘｏ-）が一緒に使用される。クレノウポリメラーゼとＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼとの同時使用は、特に検出される生体分子がＲＮＡである場合、増幅反応の速度増加を可能にする。速度の増加は、本質的にクレノウポリメラーゼによるものであるが、非特異的な増幅産物の出現を回避するために、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼの使用が依然として必要である。
特に、本発明のデジタル方法で使用されるポリメラーゼは、Ｂｓｔ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ大型断片ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片（３’－＞５’ｅｘｏ-）（クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ-）またはクレノウポリメラーゼ）とも呼ばれる）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼを含む群から選択され、より具体的には、ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼである（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入）。本発明の方法の一実施形態によると、１種またはそれよりも多くのポリメラーゼを同時に使用することができる。好ましい実施形態によると、ポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノウ断片（３’－＞５’ｅｘｏ-）が一緒に使用される。クレノウポリメラーゼとＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼとの同時使用は、特に検出される生体分子がＲＮＡである場合、増幅反応の速度増加を可能にする。速度の増加は、本質的にクレノウポリメラーゼによるものであるが、非特異的な増幅産物の出現を回避するために、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼの使用が依然として必要である。
【0024】
増幅反応の速度増加を得るために、クレノウポリメラーゼの濃度は、１～５０ｕ／ｍＬ、特に８～２５ｕ／ｍＬの間に含まれ、さらにより具体的には、この濃度は１６ｕ／ｍＬに制限される。
ニッキング酵素は、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｔＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩを含む群から選択され、特に、ニッキング酵素は、Ｎｂ．ＢｓｍＩおよび／またはＮｔ．ＢｓｔＮＢＩである（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入）。１種よりも多くのニッカーゼを同時に使用することができる。
本発明の方法の一実施形態によると、ニッキング酵素を制限酵素に置き換えてもよい。一本鎖を切断するニッキング酵素とは対照的に、制限酵素は二本鎖を切断する。したがって、ニッキング酵素の代わりに制限酵素を使用する場合、本発明の方法で使用される鋳型を保護する必要がある。この保護は、例えば、鋳型を化学修飾することにより得ることができる。そのような修飾は、ホスホロチオエート連結などの骨格修飾を含む。
ニッキング酵素は、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｔＩ、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩを含む群から選択され、特に、ニッキング酵素は、Ｎｂ．ＢｓｍＩおよび／またはＮｔ．ＢｓｔＮＢＩである（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入）。１種よりも多くのニッカーゼを同時に使用することができる。
本発明の方法の一実施形態によると、ニッキング酵素を制限酵素に置き換えてもよい。一本鎖を切断するニッキング酵素とは対照的に、制限酵素は二本鎖を切断する。したがって、ニッキング酵素の代わりに制限酵素を使用する場合、本発明の方法で使用される鋳型を保護する必要がある。この保護は、例えば、鋳型を化学修飾することにより得ることができる。そのような修飾は、ホスホロチオエート連結などの骨格修飾を含む。
【0025】
本発明のデジタル方法で使用されるエキソヌクレアーゼは、例えば、ＲｅｃＪf、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩから選択され、特に、エキソヌクレアーゼは、Ｙａｍａｇａｔａ（Yamagata et al., 2001）により記載のプロトコールに従って得られるｔｔＲｅｃＪエキソヌクレアーゼである。１種よりも多くのエキソヌクレアーゼを同時に使用することができる。
酵素およびオリゴヌクレオチドの混合物に使用される緩衝液は、選択されたオリゴヌクレオチド鋳型に適応するように構成されている。当業者であれば、従来の緩衝液を、特定の分子設計に適応するように構成することができるだろう。また、本出願の実験部分には、そのような緩衝液の例が示されている。例えば、好ましい実施形態では、反応緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．９、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／溶液）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、２００μｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む。
酵素およびオリゴヌクレオチドの混合物に使用される緩衝液は、選択されたオリゴヌクレオチド鋳型に適応するように構成されている。当業者であれば、従来の緩衝液を、特定の分子設計に適応するように構成することができるだろう。また、本出願の実験部分には、そのような緩衝液の例が示されている。例えば、好ましい実施形態では、反応緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．９、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／溶液）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、２００μｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む。
【0026】
一実施形態によると、特に、酵素が検出および／または定量化される場合、ステップａ）の混合物は、少なくとも１種のモジュールを使用することを含む。
本発明のデジタル方法のステップａ）の混合物の各オリゴヌクレオチドまたはモジュールは、最終的には、標的生体分子の変換、およびバックグラウンド増幅、つまり標的生体分子の非存在下で起こるシグナルの増幅反応を同時に誘導することなく、得られたシグナルの増幅を可能にする特異的な機能を有する。
したがって、この混合物は、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチドまたは第１のモジュール、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドまたは第２のモジュール、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドまたは第３のモジュールを含む。特に、混合物は、酵素を検出および／または定量化するための第３のモジュールを含む。
本発明のデジタル方法のステップａ）の混合物の各オリゴヌクレオチドまたはモジュールは、最終的には、標的生体分子の変換、およびバックグラウンド増幅、つまり標的生体分子の非存在下で起こるシグナルの増幅反応を同時に誘導することなく、得られたシグナルの増幅を可能にする特異的な機能を有する。
したがって、この混合物は、増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチドまたは第１のモジュール、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチドまたは第２のモジュール、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチドまたは第３のモジュールを含む。特に、混合物は、酵素を検出および／または定量化するための第３のモジュールを含む。
【0027】
本発明の状況では、「増幅オリゴヌクレオチド」または「自己触媒鋳型」または「ａＴ」という用語は、トリガー配列を指数関数的に増幅することができるオリゴヌクレオチドを指す。増幅オリゴヌクレオチドとして機能することができるオリゴヌクレオチドの例は、下記の表１に示されている。
本発明の状況では、「リーク吸収オリゴヌクレオチド」または「疑似鋳型」または「ｐＴ」という用語は、自己触媒鋳型よりも強力に、増幅された配列と結合するが、その３’末端に少数のヌクレオチドを付加するに過ぎず、したがって増幅された配列を、自己触媒鋳型に対するさらなるプライミングに関して不活性化する（その３’末端が自己触媒鋳型に対してもはやミスマッチであるため）オリゴヌクレオチドに関する。リーク吸収オリゴヌクレオチドは、本明細書では、バックグラウンド増幅（つまり、増幅されたシグナル配列の非存在下で生じる増幅）とも呼ばれる非特異的増幅の回避を可能にする。リーク吸収オリゴヌクレオチドは、リーキー反応（leaky reaction）から合成されるトリガーの不活性化を駆動する。疑似鋳型は、自己触媒鋳型とまったく同様に、分解から保護する必要がある。これは、５’末端における少数のホスホロチオエート修飾（またはビオチン－ストレプトアビジン修飾、反転または修飾ヌクレオチドなどの他のエキソヌクレアーゼ遮断能力）を使用して行われる。リーク吸収オリゴヌクレオチドの例は、下記の表１に示されている。
本発明の状況では、「リーク吸収オリゴヌクレオチド」または「疑似鋳型」または「ｐＴ」という用語は、自己触媒鋳型よりも強力に、増幅された配列と結合するが、その３’末端に少数のヌクレオチドを付加するに過ぎず、したがって増幅された配列を、自己触媒鋳型に対するさらなるプライミングに関して不活性化する（その３’末端が自己触媒鋳型に対してもはやミスマッチであるため）オリゴヌクレオチドに関する。リーク吸収オリゴヌクレオチドは、本明細書では、バックグラウンド増幅（つまり、増幅されたシグナル配列の非存在下で生じる増幅）とも呼ばれる非特異的増幅の回避を可能にする。リーク吸収オリゴヌクレオチドは、リーキー反応（leaky reaction）から合成されるトリガーの不活性化を駆動する。疑似鋳型は、自己触媒鋳型とまったく同様に、分解から保護する必要がある。これは、５’末端における少数のホスホロチオエート修飾（またはビオチン－ストレプトアビジン修飾、反転または修飾ヌクレオチドなどの他のエキソヌクレアーゼ遮断能力）を使用して行われる。リーク吸収オリゴヌクレオチドの例は、下記の表１に示されている。
【0028】
本発明の状況では、「標的特異的変換オリゴヌクレオチド」または「変換鋳型」または「ｃＴ」という用語は、標的生体分子をユニバーサルトリガー配列（または本明細書では「シグナル」または「シグナル配列」とも呼ばれる）へと変換するオリゴヌクレオチドに関する。変換鋳型は、自己触媒鋳型と同様に、分解から保護されていてもよくまたは保護されていなくともよい。「変換モジュール」という用語は、本明細書で定義されている通りの変換オリゴヌクレオチドの群に関する。
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチドは、ニッキング酵素認識部位を含む部分的反復構造を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに沿って、重合の産物に結合し、それらを伸長し、不活性化し、ゆっくりと放出し、それにより閾値を誘導することができる。
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチドは、ニッキング酵素認識部位を含む部分的反復構造を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに沿って、重合の産物に結合し、それらを伸長し、不活性化し、ゆっくりと放出し、それにより閾値を誘導することができる。
【0029】
本発明のデジタル方法の別の実施形態によると、特に、標的がＤＮＡまたはＲＮＡ配列である場合、第３のオリゴヌクレオチドの３’側は、標的配列に結合することができ、第３のオリゴヌクレオチドは、重合およびニッキング時に、第２のオリゴヌクレオチドの濃度を制御することにより調整される閾値を上回る第１のオリゴヌクレオチドを活性化することができる配列を出力する。
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は、増幅された配列に対する親和性の低減を示す。
さらに別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端は、第１のオリゴヌクレオチドにより増幅される配列と相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端は、増幅された配列に不活性化テールを付加するための鋳型としての役目を果たす。
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は、増幅された配列に対する親和性の低減を示す。
さらに別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端は、第１のオリゴヌクレオチドにより増幅される配列と相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端は、増幅された配列に不活性化テールを付加するための鋳型としての役目を果たす。
【0030】
本デジタル方法を実施するための一実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドの濃度は、第１のオリゴヌクレオチドの反応が、高濃度の増幅された配列での第２のオリゴヌクレオチドの反応よりも速いが、第２のオリゴヌクレオチドに対する反応が、低濃度の増幅された配列での第１のオリゴヌクレオチドの反応よりも速く、それにより刺激閾値を超えない限り増幅が効果的に排除されるように選択される。
別の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド（変換鋳型またはモジュール）は、検出および／または定量化される生体分子の性質に応じて異なる様式に設計することができる。特に、酵素を検出する場合、変換鋳型（モジュール）は、検出しようとする酵素の性質に応じて異なる様式に設計することができる。例えば、ＲＮＡＳｅ ＨおよびＡＰ－エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ－１）は、感知鋳型のステム構造に、それぞれリボヌクレオチドおよび脱塩基部位（ＡＰ）を導入することにより検出することができる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、例えば、ＡＰ部位をデオキシリボウリジン部分で置換することにより検出することができる。制限酵素の検出は、感知鋳型の５’部分に認識部位を追加することにより達成することができる。変換鋳型は、標的酵素の基質としての役目を果たすように設計することができ、特定の配列、またはリン酸修飾、修飾核酸塩基、糖または骨格部分、ゆらぎ、ミスマッチ、平滑なまたは突出した端部、ｆｌａｐ配列などの構造的特徴などの１種または複数種の化学修飾を含む。
別の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチド（変換鋳型またはモジュール）は、検出および／または定量化される生体分子の性質に応じて異なる様式に設計することができる。特に、酵素を検出する場合、変換鋳型（モジュール）は、検出しようとする酵素の性質に応じて異なる様式に設計することができる。例えば、ＲＮＡＳｅ ＨおよびＡＰ－エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ－１）は、感知鋳型のステム構造に、それぞれリボヌクレオチドおよび脱塩基部位（ＡＰ）を導入することにより検出することができる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、例えば、ＡＰ部位をデオキシリボウリジン部分で置換することにより検出することができる。制限酵素の検出は、感知鋳型の５’部分に認識部位を追加することにより達成することができる。変換鋳型は、標的酵素の基質としての役目を果たすように設計することができ、特定の配列、またはリン酸修飾、修飾核酸塩基、糖または骨格部分、ゆらぎ、ミスマッチ、平滑なまたは突出した端部、ｆｌａｐ配列などの構造的特徴などの１種または複数種の化学修飾を含む。
【0031】
さらに別の実施形態では、特に、酵素を検出および／または識別するために、１種よりも多くの変換オリゴヌクレオチドを使用することができる。こうした鋳型は、上記に記載のように設計することができる。２種またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドで構成されるモジュールの使用は、例えば、標的酵素が二本鎖ＤＮＡ基質に特異的である場合、または標的酵素が基質として複数の核酸鎖を使用する場合に可能である。こうした酵素としては、一部のＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼもしくはキナーゼ、トランスポサーゼ、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレアーゼが挙げられる。加えて、標的酵素が、最終的にトリガーの産生、増幅の開始に結び付く修飾のカスケードを誘発するように、変換モジュールを設計することが可能である。例として、酵素であるポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）は、２種のオリゴヌクレオチドを使用して検出および定量化することができる。第１のオリゴヌクレオチドはポリアデニル化の基質としての役目を果たし、第２のオリゴヌクレオチドは、新たに重合されるポリ（Ａ）テールを入力として使用してトリガー出力を産生するための鋳型としての役目を果たす。
【0032】
本発明のデジタル方法の一実施形態によると、リポートプローブである第４のオリゴヌクレオチドが添加される。
本発明の状況では、「リポートプローブ」または「リポート鋳型」または「ｒＴ」という用語は、トリガー配列の存在を検出可能なシグナルへと変換するオリゴヌクレオチドに関する。そのような検出可能なシグナルは、例えば、粒子凝集、培地ゼリー化、電気化学的シグナル、または化学発光シグナル、好ましくは蛍光シグナルを指す。したがって、リポートプローブは、好ましくは蛍光プローブである。
一実施形態では、リポートプローブは、増幅オリゴヌクレオチドにより増幅されたシグナル鎖を検出する。
本発明の状況では、「リポートプローブ」または「リポート鋳型」または「ｒＴ」という用語は、トリガー配列の存在を検出可能なシグナルへと変換するオリゴヌクレオチドに関する。そのような検出可能なシグナルは、例えば、粒子凝集、培地ゼリー化、電気化学的シグナル、または化学発光シグナル、好ましくは蛍光シグナルを指す。したがって、リポートプローブは、好ましくは蛍光プローブである。
一実施形態では、リポートプローブは、増幅オリゴヌクレオチドにより増幅されたシグナル鎖を検出する。
【0033】
さらに別の実施形態では、リポートプローブは、フルオロフォアおよび／またはクエンチャーにより両端部が修飾された自己相補的ＤＮＡ鎖である。本明細書で使用される場合、「自己相補的」という用語は、同じ分子の２つの異なる部分が、塩基相補的（Ａ－ＴおよびＧ－Ｃ）であるために互いにハイブリダイズすることができることを意味する。本発明の場合、一本鎖プローブの２つの端部（３’および５’部分の少数のヌクレオチド）は、互いにハイブリダイズし、クエンチャーによるフルオロフォアのクエンチングを誘導することができる。増幅された配列は、リポート鋳型の部分に結合することができ、ステム－ループ構造の開環に結び付き、したがって蛍光シグナルが増強される。
また、リポートプローブは、ニッキング認識部位を含むループを含んでいてもよい。
また、リポートプローブは、ニッキング認識部位を含むループを含んでいてもよい。
【0034】
各標的ごとに設計（配列）および最適化（長さ）しなければならない従来技術で使用されるＰＣＲプローブ（検出のために使用される）と比較して、本発明の方法で使用されるリポートプローブはモジュール式であり、これは、本発明の方法で使用されるリポートプローブが、適正な双安定モジュール（自己触媒鋳型＋疑似鋳型）によるシグナル変換によりあらゆる標的に使用することができることを意味する。
本発明のデジタル方法のステップａ）で使用される様々なオリゴヌクレオチド（鋳型）の例は、下記の表１に示されており、本出願の実施例セクションにも示されている場合がある。
本発明のデジタル方法のステップａ）で使用される様々なオリゴヌクレオチド（鋳型）の例は、下記の表１に示されており、本出願の実施例セクションにも示されている場合がある。
【0035】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0036】
上記の表１において、ビオチンおよびｂｉｏｔｅｇは、それぞれ、アミノエトキシ－エトキシエタノールリンカーおよびより長いトリエチレングリコールリンカーを使用したビオチン化シントンを指す。「*」は、ホスホロチオエート骨格修飾を示し、「ｐ」は、３’リン酸修飾を示す。配列番号１６～２３および３０では、鋳型上のトリガーの重合化産物のニッキングを回避するために、チミジン（Ｔ）がデオキシウリジン（Ｕ）に置き換えられている。Ａｔｔｏ６３３、ＦＡＭ、Ｃｙ５、Ｈｅｘ、Ｃｙ３．５、ＢＭＮ３は、フルオロフォアであり、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＭＮＱ５３０は、クエンチャーである。
【0037】
上記に列挙されている配列および本明細書に記載の例に基づき、鋳型の種々の組合せを使用して、本発明のデジタル方法を実施することができる。当業者であれば、本明細書およびヌクレオチド設計に関する一般知識から開始して、任意の目的の標的に対して本発明の方法を実施するために、他の鋳型および他の組合せを決定することができるだろう。
【0038】
特に、鋳型の配列の選択は、作用温度、使用される酵素、特にニッカーゼの速度および特異性のような実験パラメーターに依存する。好ましくは、Ｎｂ．ＢｓｍＩニッカーゼ部位を含む増幅鋳型、およびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩで作用する鋳型を使用することができる。
本発明の方法の一実施形態によると、鋳型、好ましくは４種の鋳型（自己触媒鋳型、変換鋳型、疑似鋳型、およびリポート鋳型）は、増幅された配列である「ユニバーサルトリガー」の配列により連結される。
図３は、本発明のデジタル方法で好ましく使用される分子プログラムにおける回路の接続性の一実施形態を示す。ユニバーサルシグナル増幅部分は、双安定ノード、つまり、２つの状態：トリガーの非存在下における非生産的状態およびトリガーの濃度が所与の閾値を超えると増幅が開始される生産的状態を可能にする増幅系を生成する。この双安定ノードは、２種の鋳型：好ましくは１２量体オリゴヌクレオチドの指数関数的複製を触媒する二重リピート配列で構成されている自動触媒鋳型（ａＴ）；自己触媒鋳型での非特異的反応に起因するリーク産物を吸収し、それによりバックグラウンド増幅を回避する疑似鋳型（ｐＴ）で構成されている。変換鋳型（ｃＴ）は、ａＴの上流に接続されており、標的がｃＴの入力部分に結合すると、変換鋳型は、複数の出力鎖の産生を触媒し、出力鎖は、ひいてはａＴでの自己触媒反応を誘発する。ａＴの下流において、リポート鋳型（ｒＴ）は、増幅されたシグナル鎖を捕捉して、蛍光シグナルを生成する。本発明の方法の好ましい実施形態による詳細な反応ネットワークは、図２に示されている。
本発明の方法の一実施形態によると、鋳型、好ましくは４種の鋳型（自己触媒鋳型、変換鋳型、疑似鋳型、およびリポート鋳型）は、増幅された配列である「ユニバーサルトリガー」の配列により連結される。
図３は、本発明のデジタル方法で好ましく使用される分子プログラムにおける回路の接続性の一実施形態を示す。ユニバーサルシグナル増幅部分は、双安定ノード、つまり、２つの状態：トリガーの非存在下における非生産的状態およびトリガーの濃度が所与の閾値を超えると増幅が開始される生産的状態を可能にする増幅系を生成する。この双安定ノードは、２種の鋳型：好ましくは１２量体オリゴヌクレオチドの指数関数的複製を触媒する二重リピート配列で構成されている自動触媒鋳型（ａＴ）；自己触媒鋳型での非特異的反応に起因するリーク産物を吸収し、それによりバックグラウンド増幅を回避する疑似鋳型（ｐＴ）で構成されている。変換鋳型（ｃＴ）は、ａＴの上流に接続されており、標的がｃＴの入力部分に結合すると、変換鋳型は、複数の出力鎖の産生を触媒し、出力鎖は、ひいてはａＴでの自己触媒反応を誘発する。ａＴの下流において、リポート鋳型（ｒＴ）は、増幅されたシグナル鎖を捕捉して、蛍光シグナルを生成する。本発明の方法の好ましい実施形態による詳細な反応ネットワークは、図２に示されている。
【0039】
別の実施形態によると、増幅されたシグナルの読出しは、リポート鋳型を使用することによってではなく、例えば、ＤＮＡ二本鎖インサート（ＥｖａｇｒｅｅｎまたはＳＹＢＲグリーン）により、ナノ粒子を凝集させることにより、または特定のＤＮＡ構造、ＤＮＡザイムを形成することなどにより実施することができる。
本発明のデジタル方法のステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物を、区画の一部が標的生体分子を含まないように幾つかの区画に分配することにより実施される。
試料の分配は、デジタル定量化法の基本である。デジタル定量化は、ごく少数の標的生体分子、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、さらにより好ましくは０～２個、さらになおより好ましくは１個の分子が、区画のほとんどに存在するように、標的生体分子がランダムに分布されるような、増幅混合物を含む試料の分配に依存する。ランダム分配プロセスは、ポアソンの法則に従う、１区画当たりの標的生体分子の数の分布を生成する。デジタル定量法は、少なくとも一部の区画が標的生体分子を一切含まない場合に適用することができる。この空区画の割合は、１％より高く、好ましくは１０％よりも高いべきである。したがって、本発明によると、区画のほとんどは、少なくとも１つの標的生体分子を含むが、こうした区画のすべてが含むわけではない。
本発明のデジタル方法のステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物を、区画の一部が標的生体分子を含まないように幾つかの区画に分配することにより実施される。
試料の分配は、デジタル定量化法の基本である。デジタル定量化は、ごく少数の標的生体分子、好ましくは０～１０個、より好ましくは０～５個、さらにより好ましくは０～２個、さらになおより好ましくは１個の分子が、区画のほとんどに存在するように、標的生体分子がランダムに分布されるような、増幅混合物を含む試料の分配に依存する。ランダム分配プロセスは、ポアソンの法則に従う、１区画当たりの標的生体分子の数の分布を生成する。デジタル定量法は、少なくとも一部の区画が標的生体分子を一切含まない場合に適用することができる。この空区画の割合は、１％より高く、好ましくは１０％よりも高いべきである。したがって、本発明によると、区画のほとんどは、少なくとも１つの標的生体分子を含むが、こうした区画のすべてが含むわけではない。
【0040】
言い換えれば、ステップａ）で得られる混合物の幾つかの区画への分配は、標的生体分子の分布が、少なくとも１つの生体分子を受け取った区画の数を区画の総数の１００％未満にするように実施される。
本明細書で使用される場合、「デジタル方法」または「デジタル増幅法」という用語は、標的生体分子を含む試験試料が、幾つかのマイクロ区画に分配され、標的がポアソン分布に従って区画内にランダムに単離されている検出方法を指す。その後、各々個々の区画で反応が実施され、個別の事象の直接計数および絶対標的定量化が可能になる。
試料の分配は、微細加工チャンバー（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｌｉｐＣｈｉｐまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄなど）または微小液滴（例えば、ＢｉｏｒａｄのＱＸ２００システムまたはＳｔｉｌｌａ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｉｃａシステムなど）などの幾つかの手段により実施することができる。
本発明のデジタル方法の好ましい実施形態によると、試験試料は、２つの非混和性液体：試料水性相；およびウンデカン－１－オール、シリコン油、鉱物油、より好ましくは、水との非混和性が高く、生体適合性であり、低粘度であり、透明であり、マイクロ流体デバイスと一般に適合性であるため全フッ素置換油などの連続疎水性相を組み合わせることにより製作される数百万個の油中水型液滴内に分配される。
本明細書で使用される場合、「デジタル方法」または「デジタル増幅法」という用語は、標的生体分子を含む試験試料が、幾つかのマイクロ区画に分配され、標的がポアソン分布に従って区画内にランダムに単離されている検出方法を指す。その後、各々個々の区画で反応が実施され、個別の事象の直接計数および絶対標的定量化が可能になる。
試料の分配は、微細加工チャンバー（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｌｉｐＣｈｉｐまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄなど）または微小液滴（例えば、ＢｉｏｒａｄのＱＸ２００システムまたはＳｔｉｌｌａ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｉｃａシステムなど）などの幾つかの手段により実施することができる。
本発明のデジタル方法の好ましい実施形態によると、試験試料は、２つの非混和性液体：試料水性相；およびウンデカン－１－オール、シリコン油、鉱物油、より好ましくは、水との非混和性が高く、生体適合性であり、低粘度であり、透明であり、マイクロ流体デバイスと一般に適合性であるため全フッ素置換油などの連続疎水性相を組み合わせることにより製作される数百万個の油中水型液滴内に分配される。
【0041】
液滴の平均サイズは、アッセイの実施可能性、アッセイの実施に必要な時間（単一標的を含む液滴を増幅するのに必要な時間に相当する）、およびアッセイのダイナミックレンジ（アッセイの感度の下限と、液滴の相当部分がオンにならない最も高い濃度との間で構成される濃度の範囲である）を決定するため、非常に重要である。実際、デジタル方式では、１つの液滴に封入された標的の単一コピーに対応する濃度が、バルクでの検出限界を上回る値に達するように、液滴のサイズを調整する必要がある。液滴が大き過ぎると、標的が単に希釈され過ぎてバックグラウンドと区別可能なシグナルを誘発しないため、アッセイの典型的な感度では検出されないだろう。また、液滴のサイズを十分に小さくして（したがって、液滴内の単一分子の濃度を十分に大きくして）、標的陽性液滴に対して妥当な時間（典型的には、数時間）で増幅が確実に誘発されるようにする必要がある。液滴が小さいほど、アッセイは高速になるだろう。最後に、上記の２つの条件に適切な液滴のサイズが決まると、デジタルアッセイのダイナミックレンジは、オンになる液滴の割合が陰性対照よりも著しく高い、より低いバルク標的濃度と、著しい割合の液滴がオンにならない濃度との間で構成される。より小さな液滴は、ダイナミックレンジをより高い濃度へとシフトさせ、より大きな液滴は、アッセイと適合性である場合、そのダイナミックレンジをより低い濃度へとシフトさせる。
【0042】
加えて、一部の技術的制約が、区画または液滴のサイズに適用される。より小さな単分散液滴は、生成がより困難であり得るが、典型的には、高温インキュベーションまたはサイクル中、より安定的である。
当技術分野のＰＣＲベースデジタルアッセイのほとんどでは、直径が２０～１００マイクロメートル（つまり、４～５００ｐＬ）の液滴が用いられている。これは、ＰＣＲ増幅法の感度が高いためであり、それにより、この方法は、非常に低い初期標的濃度に適合性である。等温技法は感度がより低いため、より小さなサイズの液滴により良好に適している。目的の標的に応じて、本明細書に記載のアッセイは、一般には１ｐＭよりも良好であり、酵素検出などの一部の場合では、１ｆＭを達成することができる感度を、液滴分配を行わずに達成する。したがって、核酸検出、特にマイクロＲＮＡ検出のためには比較的小さく、酵素検出のためにはより大きくてもよい液滴を使用することが好ましい。アッセイのダイナミックレンジをシフトさせるために、液滴のサイズを変更することもさらに可能である。
一実施形態では、液滴のサイズは、１つの区画の容積に封入された標的の単一コピーが、ピコモル程度の値に到達するように調整される。また、これにより、標的陽性液滴の場合は妥当な時間（典型的には、数時間）で増幅が誘発されることも保証される。区画が大き過ぎる場合、標的が単に希釈され過ぎているため、アッセイの典型的な感度では増幅が可能にならないだろう。
当技術分野のＰＣＲベースデジタルアッセイのほとんどでは、直径が２０～１００マイクロメートル（つまり、４～５００ｐＬ）の液滴が用いられている。これは、ＰＣＲ増幅法の感度が高いためであり、それにより、この方法は、非常に低い初期標的濃度に適合性である。等温技法は感度がより低いため、より小さなサイズの液滴により良好に適している。目的の標的に応じて、本明細書に記載のアッセイは、一般には１ｐＭよりも良好であり、酵素検出などの一部の場合では、１ｆＭを達成することができる感度を、液滴分配を行わずに達成する。したがって、核酸検出、特にマイクロＲＮＡ検出のためには比較的小さく、酵素検出のためにはより大きくてもよい液滴を使用することが好ましい。アッセイのダイナミックレンジをシフトさせるために、液滴のサイズを変更することもさらに可能である。
一実施形態では、液滴のサイズは、１つの区画の容積に封入された標的の単一コピーが、ピコモル程度の値に到達するように調整される。また、これにより、標的陽性液滴の場合は妥当な時間（典型的には、数時間）で増幅が誘発されることも保証される。区画が大き過ぎる場合、標的が単に希釈され過ぎているため、アッセイの典型的な感度では増幅が可能にならないだろう。
【0043】
反応区画を小型化すると（チューブ内のマイクロリットル規模から液滴内のピコリットル規模へと）、増幅反応に確率論的効果（液滴内の鋳型および酵素分布、表面効果、生体分子と界面活性剤との相互作用、温度の不均一性に起因する）が加わる。こうした現象は、液滴の増幅開始時間の分散を意味する（つまり、単一標的を含む液滴がすべて、正確に同時に増幅するわけではないだろう）。サーモサイクルプロセスは、すべての区画間で複製サイクルを同期させるため、この分散は、ＰＣＲベースの反応ではあまり見られない。等温反応はオン時間分散がより大きいため、すべての標的含有液滴がオンになるまで、空液滴がオフのままであることが重要である。古典的な等温法（ＥＸＰＡＲ、ＲＣＡ、ＨＣＲなど）は、バルクでは良好な感度を呈するが、この制約に対処することはできない。等温デジタル手法では、このサイズの１つの区画に存在する標的生体分子の単一コピーが、言及されている目標濃度に到達するように、精密に選択されたサイズの区画と共に、標的濃度に十分な時間窓を提供する方法を使用する必要がある。
【0044】
一実施形態によると、本発明のデジタル方法で使用される液滴は、０．００１ｐＬ～１００ｐＬ、好ましくは０．１ｐＬ～１０ｐＬ、より好ましくは０．５～５ｐＬ、または０．５～８ｐＬの間に含まれるサイズを有する。好ましくは、本発明の方法が酵素を決定および／または定量化するために使用される場合、液滴のサイズは、５～８ｐＬの間に含まれ、好ましくはこの場合の液滴のサイズは、７．２ｐＬである。
別の実施形態によると、本発明の方法が酵素の検出および／または定量化に使用される場合、液滴のサイズは、０．５～１００ｐＬ、特に５～５０ｐＬ、より具体的には６～１０ｐＬの間に含まれていてもよい。
上記に示されているように、本発明の方法の主な利点は、標的生体分子が、直接的には検出されないが、シグナル配列へと変換されることである。これにより、標的生体分子の直接検出により引き起こされる感度および特異性の問題を回避することが可能になり、持ち越し夾雑のリスクも制限される。
別の実施形態によると、本発明の方法が酵素の検出および／または定量化に使用される場合、液滴のサイズは、０．５～１００ｐＬ、特に５～５０ｐＬ、より具体的には６～１０ｐＬの間に含まれていてもよい。
上記に示されているように、本発明の方法の主な利点は、標的生体分子が、直接的には検出されないが、シグナル配列へと変換されることである。これにより、標的生体分子の直接検出により引き起こされる感度および特異性の問題を回避することが可能になり、持ち越し夾雑のリスクも制限される。
【0045】
したがって、本発明の方法では、ステップｂ）にて混合物を分配した後、標的生体分子の配列は、ステップｃ）にて、好ましくは変換鋳型によりシグナルへと変換される。
本明細書で使用される場合、「シグナル」または「シグナル配列」という用語は、標的生体分子、好ましくは核酸分子、より好ましくはマイクロＲＮＡの配列を、増幅され得る配列へと変換することにより得られる核酸配列、好ましくは一本鎖ＤＮＡに関する。
次いで、変換されたシグナル配列は、本発明の方法のステップｄ）にて増幅される。
一実施形態によると、ステップｄ）でのシグナル配列の増幅は、３５～６０℃、より好ましくは３７～５５℃、さらにより好ましくは４５～５０℃の範囲の一定の作用温度で実施される。
本明細書で使用される場合、「シグナル」または「シグナル配列」という用語は、標的生体分子、好ましくは核酸分子、より好ましくはマイクロＲＮＡの配列を、増幅され得る配列へと変換することにより得られる核酸配列、好ましくは一本鎖ＤＮＡに関する。
次いで、変換されたシグナル配列は、本発明の方法のステップｄ）にて増幅される。
一実施形態によると、ステップｄ）でのシグナル配列の増幅は、３５～６０℃、より好ましくは３７～５５℃、さらにより好ましくは４５～５０℃の範囲の一定の作用温度で実施される。
【0046】
本発明によると、ステップｃ）およびｄ）の化学反応は、同時に生じる。ステップｃ）およびｄ）は、インキュベーションステップとして設計することもできる。
増幅されたシグナル配列を検出および／または測定するためには、前記分子を標識する必要がある。好ましくは、標識は、量子ドット、粒子凝集などの有機色素または無機色素で標識された蛍光プローブを使用することにより実施される。当業者であれば、従来の標識手段を本発明のデジタル方法に適合させることができるであろう。
本発明のデジタル方法の好ましい実施形態によると、使用される標識は蛍光シグナルである。ステップｄ）にてシグナル配列を増幅するためにインキュベーションを行っている間に、標的生体分子は、その封入液滴にてシグナル増幅を誘発する。したがって、インキュベーション後、液滴は、陽性蛍光シグナルを呈する。
したがって、本発明のデジタル方法の一実施形態によると、増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップｅ）は、強い蛍光を発する区画を検出および／または計数することを含む。
増幅されたシグナル配列を検出および／または測定するためには、前記分子を標識する必要がある。好ましくは、標識は、量子ドット、粒子凝集などの有機色素または無機色素で標識された蛍光プローブを使用することにより実施される。当業者であれば、従来の標識手段を本発明のデジタル方法に適合させることができるであろう。
本発明のデジタル方法の好ましい実施形態によると、使用される標識は蛍光シグナルである。ステップｄ）にてシグナル配列を増幅するためにインキュベーションを行っている間に、標的生体分子は、その封入液滴にてシグナル増幅を誘発する。したがって、インキュベーション後、液滴は、陽性蛍光シグナルを呈する。
したがって、本発明のデジタル方法の一実施形態によると、増幅された前記シグナルを検出および／または測定するステップｅ）は、強い蛍光を発する区画を検出および／または計数することを含む。
【0047】
一実施形態では、本発明のデジタル方法を使用して、試験生体試料中の標的生体分子の絶対濃度を測定する場合、標的生体分子を受け取った区画である強い蛍光を示す区画、および非蛍光区画を計数し、それらの比を算出する。
好ましくは、蛍光顕微鏡による画像化は、陽性／陰性液滴の計数を可能にし、したがって、初期試料中の正確な標的生体分子濃度の算出が可能になる。
別の実施形態によると、別の従来法、例えばフローサイトメトリーを使用して、陽性／陰性液滴を計数してもよい。
好ましい実施形態によると、本発明のデジタル方法は、以下のように実施される：分子プログラム（緩衝液、上述の酵素、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびエキソヌクレアーゼ、ならびに上述の４種のオリゴヌクレオチド鋳型）および標的生体分子含有試料を含む混合物を、標準的なマイクロ流体技法を使用して、ピコリットルサイズ（約０．１～５ｐＬ）の油中水型液滴内に分配する。標的は、ポアソンの法則に従って、液滴にランダムに分布される。次いで、標的生体分子のシグナルへの変換を可能にし、シグナルを増幅するために、エマルジョンを一定の作用温度（４２～５５℃の範囲）でインキュベートする。シグナルが増幅され、分配ステップ中に少なくとも１つの標的生体分子を受け取った液滴で蛍光がオンになる。同時に、空液滴は低い蛍光レベルのままである。液滴は、最終的には蛍光顕微鏡を使用して画像化される（蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）またはフローサイトメトリーなどの他の読出しを使用してもよい）。したがって、試験管実験に必要なリアルタイムモニタリングとは対照的に、読出しはエンドポイント測定に依存する。陽性／陰性液滴の比（または「オン／オフ」比とも呼ばれる）は、較正標準物質を参照せずに、初期試料中の正確な標的濃度の算出を可能にする。
好ましくは、蛍光顕微鏡による画像化は、陽性／陰性液滴の計数を可能にし、したがって、初期試料中の正確な標的生体分子濃度の算出が可能になる。
別の実施形態によると、別の従来法、例えばフローサイトメトリーを使用して、陽性／陰性液滴を計数してもよい。
好ましい実施形態によると、本発明のデジタル方法は、以下のように実施される：分子プログラム（緩衝液、上述の酵素、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびエキソヌクレアーゼ、ならびに上述の４種のオリゴヌクレオチド鋳型）および標的生体分子含有試料を含む混合物を、標準的なマイクロ流体技法を使用して、ピコリットルサイズ（約０．１～５ｐＬ）の油中水型液滴内に分配する。標的は、ポアソンの法則に従って、液滴にランダムに分布される。次いで、標的生体分子のシグナルへの変換を可能にし、シグナルを増幅するために、エマルジョンを一定の作用温度（４２～５５℃の範囲）でインキュベートする。シグナルが増幅され、分配ステップ中に少なくとも１つの標的生体分子を受け取った液滴で蛍光がオンになる。同時に、空液滴は低い蛍光レベルのままである。液滴は、最終的には蛍光顕微鏡を使用して画像化される（蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）またはフローサイトメトリーなどの他の読出しを使用してもよい）。したがって、試験管実験に必要なリアルタイムモニタリングとは対照的に、読出しはエンドポイント測定に依存する。陽性／陰性液滴の比（または「オン／オフ」比とも呼ばれる）は、較正標準物質を参照せずに、初期試料中の正確な標的濃度の算出を可能にする。
【0048】
上述の生体分子は、すべてのタイプの試料に存在し得る。例えば、上述の生体分子は、非生命体から得られる試料（例えば、土壌試料、水試料、空気試料、食品試料など）または生命体から得られる試料、例えば、細胞、体液、または組織に存在してもよい。
本発明の方法の一実施形態によると、本発明のデジタル方法により検出および／または測定される標的生体分子は、バイオマーカーとして使用される。
本発明の状況では、「バイオマーカー」という用語は、天然に存在する分子、好ましくはそれにより特定の病理学的もしくは生理学的プロセス、疾患などを識別することができる生体分子、遺伝子、または特質に関する。
本発明の方法の一実施形態によると、本発明のデジタル方法により検出および／または測定される標的生体分子は、バイオマーカーとして使用される。
本発明の状況では、「バイオマーカー」という用語は、天然に存在する分子、好ましくはそれにより特定の病理学的もしくは生理学的プロセス、疾患などを識別することができる生体分子、遺伝子、または特質に関する。
【0049】
こうしたバイオマーカーは、植物、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトなどの生命体の疾患を検出するために使用することができる。
さらに、こうしたバイオマーカーは、１種もしくは複数種の異常の検出に、ならびに食品および農業食品産業のために、または環境において使用することができる。
バイオマーカーは、例えば、すべての体液に存在し得、したがって、低侵襲液体生検（血清、血漿、尿、涙、唾液、汗など）を介してアクセス可能である。
好ましくは、それらは、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を検出するためのバイオマーカーとして使用される。
さらに、こうしたバイオマーカーは、１種もしくは複数種の異常の検出に、ならびに食品および農業食品産業のために、または環境において使用することができる。
バイオマーカーは、例えば、すべての体液に存在し得、したがって、低侵襲液体生検（血清、血漿、尿、涙、唾液、汗など）を介してアクセス可能である。
好ましくは、それらは、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を検出するためのバイオマーカーとして使用される。
【0050】
本発明の状況では、「検出」という用語は、上記で定義されている通りの試料中の標的生体分子の検出を一般的な様式で定義するために使用される。
また、本明細書で使用される場合、「検出」という用語は、上記で挙げられている疾患の１つもしくは幾つかまたはそれらの症状の診断または予後に関する。また、検出は、上記疾患の１つもしくは幾つかを予測すること、または対象がこうした疾患の１つもしくは幾つかを発症するリスクを予測することを含む。
さらに、「検出」という用語は、農学的診断、つまり、植物病理、特に本発明で定義される通りの生物的または非生物的起源を有する植物病理の診断にさらに関する。
本発明の状況では、「がん」という用語は、調節解除されたかまたは制御されていない細胞増殖により特徴付けられる悪性新生物を指す。特に、「がん細胞」は、調節解除されたかまたは制御されていない細胞増殖を示す細胞を指す。
また、本明細書で使用される場合、「検出」という用語は、上記で挙げられている疾患の１つもしくは幾つかまたはそれらの症状の診断または予後に関する。また、検出は、上記疾患の１つもしくは幾つかを予測すること、または対象がこうした疾患の１つもしくは幾つかを発症するリスクを予測することを含む。
さらに、「検出」という用語は、農学的診断、つまり、植物病理、特に本発明で定義される通りの生物的または非生物的起源を有する植物病理の診断にさらに関する。
本発明の状況では、「がん」という用語は、調節解除されたかまたは制御されていない細胞増殖により特徴付けられる悪性新生物を指す。特に、「がん細胞」は、調節解除されたかまたは制御されていない細胞増殖を示す細胞を指す。
【0051】
「がん」という用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が、元の腫瘍の部位以外の対象の体内の部位に移動していないもの）および二次性悪性腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位へと腫瘍細胞が移動することから生じるもの）を含む。そのようながんは、特に、固形がんの群および／または造血器がんの群から選択してもよい。
【0052】
本発明の一実施形態では、がんは、以下のものから選択される：骨溶解症、骨の肉腫（骨肉腫、ユーイング肉腫、骨巨細胞腫瘍）、骨転移、神経膠芽細胞腫および脳がん、肺がん、聴神経腫、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（単球性、骨髄芽球性、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、骨髄性単球性、および前骨髄球性）、急性Ｔ細胞白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱がん、乳がん、気管支原性癌、頸部がん、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭癌、嚢胞腺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、増殖異常性変化（異形成および化生）、胚性癌、子宮内膜がん、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、上衣腫、上皮癌、赤白血病、食道がん、エストロゲン受容体陽性乳がん、本態性血小板血症、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、胚細胞精巣がん、神経膠腫、重鎖病、血管芽細胞腫、肝細胞腫、肝細胞がん、ホルモン非感受性前立腺がん、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺がん、リンパ管内皮肉腫（lymphagioendotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、膀胱、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、および子宮の悪性腫瘍および過剰増殖性障害、Ｔ細胞またはＢ細胞起源のリンパ性悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、髄質癌、髄芽細胞腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、骨髄腫、粘液肉腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、乏突起膠腫、口腔がん、骨形成性肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭状腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、脂腺癌、セミノーマ、皮膚がん、小細胞肺癌、固形腫瘍（癌腫および肉腫）、小細胞肺がん、胃がん、扁平上皮癌、滑膜腫、汗腺癌、甲状腺がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、精巣腫瘍、子宮がん、ならびにウィルムス腫瘍。
【0053】
本発明の状況では、「神経疾患」という用語は、脳、脊髄、脳神経、末梢神経、神経根、自律神経系、神経筋接合部、および筋肉を含む中枢神経系および末梢神経系の疾患を指す。神経疾患は、神経発達疾患、神経変性疾患、または精神疾患から選択される。神経疾患には、てんかん、アルツハイマー病および他の認知症、脳卒中、片頭痛、および他の頭痛障害を含む脳血管疾患、多発性硬化症、パーキンソン病、神経感染症、脳腫瘍、頭部外傷による神経系の外傷性障害などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「心血管疾患」は、冠状動脈性心疾患：心筋に供給する血管の疾患；脳血管疾患：脳に供給する血管の疾患；末梢動脈疾患：腕および脚に供給する血管の疾患；リウマチ性心疾患：連鎖球菌により引き起こされるリウマチ熱による心筋および心臓弁の損傷；先天性心疾患：出生時に存在する心臓構造の奇形、および深部静脈血栓症、および肺塞栓症：剥離して心臓および肺に移動し得る脚静脈の血栓を含む心不全または血管不全に関する。
本明細書で使用される場合、「心血管疾患」は、冠状動脈性心疾患：心筋に供給する血管の疾患；脳血管疾患：脳に供給する血管の疾患；末梢動脈疾患：腕および脚に供給する血管の疾患；リウマチ性心疾患：連鎖球菌により引き起こされるリウマチ熱による心筋および心臓弁の損傷；先天性心疾患：出生時に存在する心臓構造の奇形、および深部静脈血栓症、および肺塞栓症：剥離して心臓および肺に移動し得る脚静脈の血栓を含む心不全または血管不全に関する。
【0054】
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」は、好ましくは、急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；悪液質／食欲不振；喘息；アテローム性動脈硬化症；慢性疲労症候群、発熱；糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）；糸球体腎炎；移植片対宿主拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏、炎症性腸疾患；変形性関節炎、乾癬性関節炎、および関節リウマチを含む関節の炎症状態；脳虚血を含む虚血性傷害（例えば、外傷、てんかん、出血、または脳卒中の結果としての脳傷害、これらの各々は神経変性に結び付き得る）；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；骨髄性（例えば、ＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病；ミオパチー（例えば、特に敗血症における筋タンパク質代謝）；骨粗鬆症；パーキンソン病；疼痛；早期陣痛；乾癬；再灌流傷害；敗血症性ショック；放射線療法、側頭下顎関節疾患、腫瘍転移の副作用；または挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染症、もしくは他の疾患プロセスに起因する炎症状態を指す。
【0055】
本発明の状況では、「自己免疫疾患」は、対象の身体が、対象自身の組織および細胞に対する抗体を産生する状態であると定義される。自己免疫疾患の例は、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡などである。
【0056】
ウイルス感染または細菌感染による疾患は、病原性ウイルスまたは細菌菌株により引き起こされる。そのような疾患の例は、ＡＩＤＳ、回虫症；水虫；細菌性赤痢、水痘；コレラ、風邪、デング熱、下痢、ジフテリア、フィラリア症、淋病、ヘルペス、鉤虫症、インフルエンザ風邪、ハンセン病、はしか、おたふく風邪、東洋瘤腫、蟯虫疾患、ペスト、肺炎、灰白髄炎、狂犬病、白癬、敗血性咽頭痛、睡眠病、天然痘、梅毒、破傷風、腸チフス、膣炎、ウイルス性脳炎、百日ぜきなどである。
「皮膚疾患」は、例えば、以下のものなど、皮膚に影響を及ぼす状態である：にきび、円形脱毛症、基底細胞癌、ボーエン病、先天性赤血球生成性ポルフィリン症、接触性皮膚炎、ダリエー病、播種性表在性光線性汗孔角化症、ジストロフィー型表皮水疱症、湿疹（アトピー性湿疹）、乳房外パジェット病、単純性表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、爪の真菌感染症、ヘイリーヘイリー病、単純ヘルペス、化膿性汗腺炎、多毛症、多汗症、魚鱗癬、膿痂疹、ケロイド、毛孔性角化症、扁平苔癬、硬化性苔癬、メラノーマ、黒皮症、粘膜類天疱瘡、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、苔癬状粃糠疹、毛孔性紅色粃糠疹、足底疣贅（疣贅）、多形日光疹、乾癬性壊疽性膿皮症、酒さ、疥癬、帯状疱疹、扁平上皮癌、スイート症候群、蕁麻疹、および血管浮腫、白斑。
「皮膚疾患」は、例えば、以下のものなど、皮膚に影響を及ぼす状態である：にきび、円形脱毛症、基底細胞癌、ボーエン病、先天性赤血球生成性ポルフィリン症、接触性皮膚炎、ダリエー病、播種性表在性光線性汗孔角化症、ジストロフィー型表皮水疱症、湿疹（アトピー性湿疹）、乳房外パジェット病、単純性表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、爪の真菌感染症、ヘイリーヘイリー病、単純ヘルペス、化膿性汗腺炎、多毛症、多汗症、魚鱗癬、膿痂疹、ケロイド、毛孔性角化症、扁平苔癬、硬化性苔癬、メラノーマ、黒皮症、粘膜類天疱瘡、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、苔癬状粃糠疹、毛孔性紅色粃糠疹、足底疣贅（疣贅）、多形日光疹、乾癬性壊疽性膿皮症、酒さ、疥癬、帯状疱疹、扁平上皮癌、スイート症候群、蕁麻疹、および血管浮腫、白斑。
【0057】
本明細書で使用される場合、「骨格筋疾患」は、骨、筋肉（ミオパチー）、および骨格筋接合部の疾患に関する。例えば、そのような疾患は、背痛、滑液嚢炎、線維筋痛症、線維性骨異形成症、成長軟骨板傷害、遺伝性結合組織障害、マルファン症候群、骨形成不全症、骨壊死、骨粗鬆症、骨パジェット病、脊柱側弯症、脊柱管狭窄症、腱炎などから選択される。
本明細書で使用される場合、「歯科疾患」は、歯および口の問題に関する。そのような疾患の例は、歯腔、歯周（歯ぐき）疾患、口腔がん、口腔感染性疾患、傷害による外傷、および遺伝性病変などである。
本明細書で使用される場合、「出生前疾患」は、以下のものなどの妊娠または胎児発育に影響を及ぼし得る疾患に関する：ＡＩＤＳ、羊水、妊娠中の出血、子宮頸部障害、妊娠糖尿病、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、子宮外妊娠、胎児赤芽球症、胎児発育問題、妊娠中の高血圧、ＨＥＬＬＰ症候群、胞状奇胎、妊娠悪阻、子宮内胎児発育遅延、胎児発育過剰（ＬＧＡ）、流産、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤機能不全、羊水過多症、出生前検査、妊娠損失、早期陣痛および出産、風疹、胎児発育遅延（ＳＧＡ）、全身性紅斑性狼瘡、トキソプラズマ症、双胎間輸血症候群、双子、三つ子、多子出産、妊娠中の膣出血。
本明細書で使用される場合、「歯科疾患」は、歯および口の問題に関する。そのような疾患の例は、歯腔、歯周（歯ぐき）疾患、口腔がん、口腔感染性疾患、傷害による外傷、および遺伝性病変などである。
本明細書で使用される場合、「出生前疾患」は、以下のものなどの妊娠または胎児発育に影響を及ぼし得る疾患に関する：ＡＩＤＳ、羊水、妊娠中の出血、子宮頸部障害、妊娠糖尿病、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、子宮外妊娠、胎児赤芽球症、胎児発育問題、妊娠中の高血圧、ＨＥＬＬＰ症候群、胞状奇胎、妊娠悪阻、子宮内胎児発育遅延、胎児発育過剰（ＬＧＡ）、流産、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤機能不全、羊水過多症、出生前検査、妊娠損失、早期陣痛および出産、風疹、胎児発育遅延（ＳＧＡ）、全身性紅斑性狼瘡、トキソプラズマ症、双胎間輸血症候群、双子、三つ子、多子出産、妊娠中の膣出血。
【0058】
したがって、本発明のデジタル方法は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法に使用することができる。
したがって、第２の態様では、本発明は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明によるデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
したがって、第２の態様では、本発明は、がん、神経疾患、心血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染または細菌感染による疾患、皮膚疾患、骨格筋疾患、歯科疾患、および出生前疾患を含む群から選択される疾患を診断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明によるデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0059】
一実施形態によると、上記診断法は、
対象から得られる試料を準備するステップ、および
本発明のデジタル方法を使用することにより、上記疾患の１つまたは複数の存在または非存在を検出するステップ
を含む。
本発明のデジタル方法の特異性、感度、単純性、および迅速性は、農学的診断方法、特に感染性および寄生虫性疾患などの生物的ストレスにより引き起こされる疾患、または栄養欠乏もしくは不利な環境などの非生物的ストレスにより引き起こされる疾患の診断に、本発明のデジタル方法を使用することを可能にする。
対象から得られる試料を準備するステップ、および
本発明のデジタル方法を使用することにより、上記疾患の１つまたは複数の存在または非存在を検出するステップ
を含む。
本発明のデジタル方法の特異性、感度、単純性、および迅速性は、農学的診断方法、特に感染性および寄生虫性疾患などの生物的ストレスにより引き起こされる疾患、または栄養欠乏もしくは不利な環境などの非生物的ストレスにより引き起こされる疾患の診断に、本発明のデジタル方法を使用することを可能にする。
【0060】
また、第３の態様によると、本発明は、
生物的ストレス、好ましくは感染性および／もしくは寄生虫性原因により引き起こされる疾患、または
非生物的ストレス、好ましくは栄養欠乏および／もしくは不利な環境により引き起こされる疾患
を含む群から選択される疾患の農学的診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
本発明のデジタル方法を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
一実施形態によると、農学的診断方法は、
植物の部分のいずれか１つから得られる試料を準備するステップ、および
本発明のデジタル方法を使用することにより、上記疾患の１つまたは複数の存在または非存在を検出するステップ
を含む。
生物的ストレス、好ましくは感染性および／もしくは寄生虫性原因により引き起こされる疾患、または
非生物的ストレス、好ましくは栄養欠乏および／もしくは不利な環境により引き起こされる疾患
を含む群から選択される疾患の農学的診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
本発明のデジタル方法を使用することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
一実施形態によると、農学的診断方法は、
植物の部分のいずれか１つから得られる試料を準備するステップ、および
本発明のデジタル方法を使用することにより、上記疾患の１つまたは複数の存在または非存在を検出するステップ
を含む。
【0061】
本発明の状態では、「農学的診断」という用語は、植物病理の診断に関し、前記診断は、真菌、ウイルス、細菌、線虫、および生物的ストレスを引き起こす任意の他の生命体を識別するために、ならびに／またはそれらの存在が非生物的ストレスによる生体分子を識別するために、植物試料の分析を実施することを含む。
本発明の状況では、「植物病理」または「植物疾患」という用語は、生物的または非生物的ストレスによる植物の形態学的特徴、生理学的特徴、または挙動の変化により顕在化する植物異常に関する。
本明細書で使用される場合、「生物的ストレス」という用語は、生命体により引き起こされるストレスまたは疾患にも関する。生物的ストレスは、いかなる生命体により引き起こされるものであってもよいが、好ましくは、感染性および／または寄生虫性原因を有し、真菌、ウイルス、細菌、および線虫から選択される生物により引き起こされるものであってもよい。
本発明の状況では、「植物病理」または「植物疾患」という用語は、生物的または非生物的ストレスによる植物の形態学的特徴、生理学的特徴、または挙動の変化により顕在化する植物異常に関する。
本明細書で使用される場合、「生物的ストレス」という用語は、生命体により引き起こされるストレスまたは疾患にも関する。生物的ストレスは、いかなる生命体により引き起こされるものであってもよいが、好ましくは、感染性および／または寄生虫性原因を有し、真菌、ウイルス、細菌、および線虫から選択される生物により引き起こされるものであってもよい。
【0062】
一実施形態によると、本発明の農学的診断方法は、真菌により引き起こされる疾患の診断に使用することができ、前記疾患は、炭疽病、黒節病、胴枯れ病、栗胴枯れ病（葉枯れ病など）、がん腫病、根こぶ病、立ち枯れ病、ニレ立ち枯れ病、麦角病、フサリウム萎凋病、パナマ病、葉水疱（leaf blister）、白カビ（べと病およびウドンコ病など）、カシ萎凋病、腐敗病（基部腐敗、灰色カビ腐れ、心腐れなど）、さび病（発疹さび病、シダーアップルさび病、およびコーヒーさび病）、瘡痂病（リンゴ瘡痂病など）、黒穂病、ムギ黒穂病、トウモロコシ黒穂病、雪腐れ病、すす病、およびバーティシリウム萎凋病から選択される。
別の実施形態によると、本発明の農学的診断方法は、ウイルスにより引き起こされる疾患の診断に使用することができ、前記疾患は、萎縮病、モザイク病、ソローシス、および黄化壊疽病から選択される。
別の実施形態によると、本発明の農学的診断方法は、ウイルスにより引き起こされる疾患の診断に使用することができ、前記疾患は、萎縮病、モザイク病、ソローシス、および黄化壊疽病から選択される。
【0063】
さらに別の実施形態によると、本発明の農学的診断方法は、細菌により引き起こされる疾患の診断に使用することができ、前記疾患は、アスター萎黄病、青枯れ病、胴枯れ病（火傷病および米斑点細菌病など）、がん腫病、クラウンゴール、腐敗病、基部腐敗、および瘡痂病から選択される。
また、本発明の農学的診断方法は、ネコブ線虫（メロイドギン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）など）、シスト線虫（ヘテロデラ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）およびグロボデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）など）、根病変線虫（プラチレンクス種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）など）、穿孔線虫（ラドホルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）など）、ジチレンクス・ジプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツ材線虫（ブルサフェレンクス・キシロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）など）、レニフォーム線虫（ロチレンクルス・レニホルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など）、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ニセネコブセンチュウ（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、イネシンガレセンチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）から選択される線虫により引き起こされる疾患の診断に使用することができる。
また、本発明の農学的診断方法は、ネコブ線虫（メロイドギン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）など）、シスト線虫（ヘテロデラ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）およびグロボデラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）など）、根病変線虫（プラチレンクス種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）など）、穿孔線虫（ラドホルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）など）、ジチレンクス・ジプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツ材線虫（ブルサフェレンクス・キシロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）など）、レニフォーム線虫（ロチレンクルス・レニホルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など）、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ニセネコブセンチュウ（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、イネシンガレセンチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）から選択される線虫により引き起こされる疾患の診断に使用することができる。
【0064】
一実施形態によると、本発明の農学的診断方法は、「非生物的ストレス」により引き起こされる疾患を診断するために使用され、「非生物的ストレス」という用語は、生命体により引き起こされるものではない疾患を規定する。こうした疾患は、好ましくは、栄養欠乏および／または不利な環境により引き起こされる。例えば、非生物的ストレスは、不適切なｐＨ、水利用可能性（干ばつストレス）、温度（熱ストレスおよび寒冷ストレス）、酸素および／または気体利用可能性、ミネラル欠乏（塩分ストレス）、および毒性化合物（汚染物質など）により引き起こされ得る。
また、本発明のデジタル方法の特異性、感度、単純性、および迅速性は、食品、農業食品産業の分野のおよび環境中の生体分子を検出するための方法に、本発明のデジタル方法を使用することを可能にする。特に、本発明のデジタル方法は、食品、農業食品、および環境の異常を検出するために使用される。この検出は、上記異常に関するバイオマーカーであるとみなすことができる生体分子を検出するための本発明のデジタル方法を使用することにより実施される。
また、本発明のデジタル方法の特異性、感度、単純性、および迅速性は、食品、農業食品産業の分野のおよび環境中の生体分子を検出するための方法に、本発明のデジタル方法を使用することを可能にする。特に、本発明のデジタル方法は、食品、農業食品、および環境の異常を検出するために使用される。この検出は、上記異常に関するバイオマーカーであるとみなすことができる生体分子を検出するための本発明のデジタル方法を使用することにより実施される。
【0065】
そのような生体分子は、例えば、生命体の一部であってもよく、または生命体の活性により産生されてもよく、または人工生体分子であってもよい。こうした生体分子（またはバイオマーカー）は、生体高分子、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、および酵素を含む群から選択される。
前記生体分子は、農業食品および食品における元のおよび／または変換された産物中に存在する。
また、生体分子は、環境中に、例えば、空気中、水中、および／または土壌中に存在してもよい。
したがって、一態様によると、本発明は、農業食品、食品産業、および／または環境中の生体分子（バイオマーカー）を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明のデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関する。
前記生体分子は、農業食品および食品における元のおよび／または変換された産物中に存在する。
また、生体分子は、環境中に、例えば、空気中、水中、および／または土壌中に存在してもよい。
したがって、一態様によると、本発明は、農業食品、食品産業、および／または環境中の生体分子（バイオマーカー）を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明のデジタル方法を使用することを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関する。
【0066】
本発明の状況では、「食品」という用語は、工業プロセスを使用せずに、またはそのようなプロセスを使用することにより生産される、基本的なまたは変換されたすべての食品に関する。
本発明の状況では、「農業食品」という用語は、農業食品産業、つまり農業経営による食品の商業的生産に関する。
「環境」または「環境の」という用語は、自然環境、つまり、すべての植物、微生物、土壌、岩石、大気、ならびにそれらの境界および性質内で生じる自然現象を含む、大規模な文明化された人間の介入がない自然系として機能する生態学的単位に関する。こうした用語は、人間が作り出すことができる非自然または人工環境にも関する。一態様によると、本発明は、本発明のデジタル方法を使用して、食品および農業食品産業および／または環境中の異常を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関する。
本発明の状況では、「農業食品」という用語は、農業食品産業、つまり農業経営による食品の商業的生産に関する。
「環境」または「環境の」という用語は、自然環境、つまり、すべての植物、微生物、土壌、岩石、大気、ならびにそれらの境界および性質内で生じる自然現象を含む、大規模な文明化された人間の介入がない自然系として機能する生態学的単位に関する。こうした用語は、人間が作り出すことができる非自然または人工環境にも関する。一態様によると、本発明は、本発明のデジタル方法を使用して、食品および農業食品産業および／または環境中の異常を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関する。
【0067】
好ましくは、上記方法は、
食品から、農業食品から、または環境から得られる試料を準備すること、
本発明のデジタル方法により、前記試料中の試験生体分子（バイオマーカー）を検出すること
を含む。
食品から、農業食品から、または環境から得られる試料を準備すること、
本発明のデジタル方法により、前記試料中の試験生体分子（バイオマーカー）を検出すること
を含む。
【0068】
また、本発明者らは、本発明の方法を使用して、異なる試料に由来する異なる標的生体分子を同時にまたは並行して検出および／または定量化することができることを実証した。そのために、一実施形態では、試料を、例えば、蛍光染料でバーコード化してもよく、その結果、各液滴のバーコード蛍光強度を初期試料の各々に割り当てることが可能になる。バーコードプロトコールは、例えば、Brouzes et al. (2009)およびGenot et al. (2016)に開示されている。このバーコード手順のおかげで、複数の試料を同時に乳化、収集、インキュベート、および分析することができるため、検出時間およびコストの削減が可能になる。
したがって、第４の態様によると、本発明のデジタル方法は、１つよりも多くの試料、または試料中の１種よりも多くの標的生体分子を並行してアッセイするために使用することもできる。
したがって、第４の態様によると、本発明のデジタル方法は、１つよりも多くの試料、または試料中の１種よりも多くの標的生体分子を並行してアッセイするために使用することもできる。
【0069】
好ましい実施形態によると、提供されるシグナルが弱い場合でも、１つまたは１つよりも多くの異なる試料中の１種よりも多くの生体分子を直接的に検出および／または定量化するために、本発明者らは、驚くべきことに、クロストーク阻害性オリゴヌクレオチド（本明細書では「キラーオリゴヌクレオチド」または「キラー鋳型」と呼ばれる）である第５のオリゴヌクレオチドを使用すると、本方法の特異性を著しく向上させることが可能になることを見出した。この実施形態は、分子クロストークが、マルチプレックス化検出チャネル間の望ましくない通信を発生させるという事実のため、非特異的シグナル増幅を抑制するＤＮＡコード化阻害剤と相互接続された標的特異的ＤＮＡ回路（ａＴ、ｃＴ、ｐＴ、および／またはｒＴを含む）に依存する。
したがって、本発明の状況では、「キラーオリゴヌクレオチド」または「キラー鋳型」または「ｋＴ」は、逆スイッチの疑似鋳型（ｐＴ）を産生することができ、それにより増幅の交差阻害剤として作用し、非特異的クロストークを軽減するオリゴヌクレオチドに関する。キラー鋳型の配列の例は、下記の表１Ａに示されている。
したがって、本発明の状況では、「キラーオリゴヌクレオチド」または「キラー鋳型」または「ｋＴ」は、逆スイッチの疑似鋳型（ｐＴ）を産生することができ、それにより増幅の交差阻害剤として作用し、非特異的クロストークを軽減するオリゴヌクレオチドに関する。キラー鋳型の配列の例は、下記の表１Ａに示されている。
【0070】
【表2】
【0071】
阻害反応の強度を制御するために、１ｐＭおよび１００ｎＭ、好ましくは１０ｐＭ～２０ｎＭ、さらにより好ましくは１００ｐＭ～１０ｎＭ。したがって、この実施形態によると、本発明の生体分子を検出および／または識別するためのデジタル方法は、２種またはそれよりも多くの生体分子を検出および／または定量化するために、交差阻害性オリゴヌクレオチドである第５のオリゴヌクレオチドを添加することをさらに含む。
また、本発明は、本発明の方法に従って標的生体分子を検出および／または定量化するために使用することができるキットに関する。
また、本発明は、本発明の方法に従って標的生体分子を検出および／または定量化するために使用することができるキットに関する。
【0072】
一態様によると、本発明は、少なくとも１種の標的生体分子を検出および／または定量化するためのキットであって、
ａ）好ましくは、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される酵素の混合物、
ｂ）増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチド、および任意に、リポートプローブである第４のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの混合物、ならびに
ｃ）分配剤、好ましくは油中水型エマルジョン
を含むキットに関する。
ａ）好ましくは、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、およびエキソヌクレアーゼを含む群から選択される酵素の混合物、
ｂ）増幅オリゴヌクレオチドである第１のオリゴヌクレオチド、リーク吸収オリゴヌクレオチドである第２のオリゴヌクレオチド、および標的特異的変換オリゴヌクレオチドである第３のオリゴヌクレオチド、および任意に、リポートプローブである第４のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの混合物、ならびに
ｃ）分配剤、好ましくは油中水型エマルジョン
を含むキットに関する。
【0073】
キットの部品、つまり、酵素、オリゴヌクレオチド、および分配剤は、上記で定義されているものと同様である。
また、本発明のキットは、使用説明書を含んでいてもよい。
本発明の特定の実施形態は、下記の実施例および図から明らかになるだろう。
また、本発明のキットは、使用説明書を含んでいてもよい。
本発明の特定の実施形態は、下記の実施例および図から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0074】
【図1】マイクロ流体チップ設計（縮尺バーは１００μｍを表す）。
【図2】液滴分析。ａ）油中水型液滴を２枚の疎水性スライドガラスの間に挟み、落射蛍光顕微鏡で画像化した。ｂ）Ａｔｔｏ６３３蛍光チャネル。ｃ）明視野チャネル、ｄ）１０μｍオフセットで焦点をぼかした明視野チャネル。この設定により、液滴輪郭が強調され、液滴区分化が容易になる。ｅ）明視野画像（ｄ）を２値化し、ｆ）形態学的成分コマンド（morphological component command）を使用してすべての液滴を区分化する。ｇ）液滴を、それらのサイズおよび真円度に従ってフィルタリングする。ｈ）各液滴の蛍光を、半径ｒ（３＜ｒ＜６ピクセル）および中心ｘｙ（ｘｙは、選択した成分の重心に対応する）の円板から抽出する。ｉ）陽性液滴は、設定閾値（ここでは、閾値＝７）を超える蛍光を有する液滴に対応する。液滴容積が既知であれば、濃度は、ポアソンの法則から算出される。
【図3】マイクロＲＮＡの検出に特化した分子プログラム。ａ）４鋳型ＤＮＡ回路は、分子プログラムの接続性をコードし、その反応は、１セットの酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ）により触媒される：変換鋳型（ｃＴ）は、標的マイクロＲＮＡをユニバーサルトリガー配列へと変換する；自己触媒鋳型（ａＴ）は、トリガー配列を指数関数的に増幅する；非特異的増幅を回避するために（マイクロＲＮＡの非存在下での）、疑似鋳型（ｐＴ）は、リーキー反応から合成されたトリガーの不活性化を駆動する；リポート鋳型（ｒＴ）は、トリガー配列を使用して蛍光シグナルを発生させる。ｂ）漸増濃度のＬｅｔ－７ａの存在下における増幅反応のリアルタイムモニタリング。ｃ）増幅時間（Ｃｑ）とＬｅｔ－７ａ濃度との相関性。誤差バーは、３回の独立重複実験から算出した。
【図5】Ｌｅｔ－７ａのバルク検出。ａ）完全な分子プログラム、ｂ）コンバーター鋳型（converter template）を有しない分子プログラム、またはｃ）疑似鋳型（ｐＴ）を有しない分子プログラム。増幅反応をリアルタイムでモニターし、増幅時間（Ｃｑ）をＬｅｔ－７ａ濃度の関数としてプロットする。
【図6】マイクロＲＮＡの液滴デジタル検出。ａ）試料を、分子プログラムと混合し、数百万個の単分散液滴へと分配し、それにより区画全体にわたるマイクロＲＮＡ標的のランダム分布がもたらされる。インキュベーション後、液滴を蛍光顕微鏡により画像化する。少なくとも１つの標的を受け取った液滴は陽性蛍光シグナルを呈し（１）、他の液滴は陰性のままである（０）。ｂ）増幅後に漸増濃度のＬｅｔ－７ａでスパイクした乳化試料の蛍光スナップショット。ｃ）３００００個の液滴の分析。ｄ）予想される標的濃度（理論濃度）と実験的に測定された標的濃度（測定濃度）との間の線形関係性のプロット。ｅ）コンバーター鋳型を適応させることによる他のマイクロＲＮＡアッセイ。ｆ）Ｌｅｔ７ｃ（１つのミスマッチ）およびＬｅｔ７ｂ（２つのミスマッチ）に対するＬｅｔ７ａの交差反応性から評価した本発明の方法の特異性。
【図7】Ｌｅｔ７ａの検出に対する疑似鋳型濃度およびＮｂ．ＢｓｍＩ濃度の効果。規定濃度のｐＴ（０～１５ｎＭ）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．１～０．４ｕ／μＬ）を含む試料を、０または１ｐＭのＬｅｔ－７ａでスパイクし、増幅反応をリアルタイムでモニターした。ａ）Ｃｑを、ｐＴ濃度およびＮｂ．ＢｓｍＩ濃度の関数としてプロットする。ＭＤＳを、ｂ）疑似鋳型濃度およびｃ）Ｎｂ．ＢｓｍＩ濃度の関数としてプロットする。
【図8】Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ濃度の最適化。０または１ｐＭのＬｅｔ７ａでスパイクした試料を、様々な濃度のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下でインキュベートする。Ｃｑを、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ濃度の関数としてプロットする。
【図9】偽陽性液滴率を低減するための分子プログラム。様々な濃度の疑似鋳型（ｐＴ）を有する無標的試料を液滴へと分配する。エマルジョンの蛍光をリアルタイムでモニターする。
【図10】非特異的増幅反応の排除。０または１５ｎＭのｐＴを有する分子プログラムを、分配前に、０または１ｐＭの合成Ｌｅｔ－７ａでスパイクした。液滴を５０℃でインキュベートし、バルク蛍光（エマルジョン平均）を継続的にモニターする（実線）。異なる時点でインキュベーションを中止し、液滴を蛍光顕微鏡で画像化して、陽性区画（ひし形）のパーセンテージを抽出する。
【図11】生物学的試料からのマイクロＲＮＡ検出。ａ）Ｈ１９７５細胞株からのＬｅｔ７ａ検出。ｂ）ヒト結腸全ＲＮＡからのＬｅｔ７ａおよびｍｉｒ－３９ｃｅ検出。
【図12】Ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの検出に対するクレノウ（ｅｘｏ-）の効果。ａ）０または１０ｐＭのＬｅｔ７ａおよび様々な濃度のクレノウ（ｅｘｏ-）の存在下でのリアルタイム増幅反応。ｂ）クレノウ（ｅｘｏ-）濃度の関数としての増幅時間（Ｃｑ）。ｃ）実験条件。
【図13】クレノウ（ｅｘｏ-）およびＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）の混合物を使用したＬｅｔ７ａのデジタル検出。ａ）スパイクイン予想濃度の関数としての測定濃度。ｂ）実験条件。ミックスＡ（酵素を含む）およびミックスＢ（鋳型を含む）を、３インレットフローフォーカシングデバイス（3-inlet flow focusing device）を使用してチップ上で混合する。液滴を５０℃で２００分間インキュベートする。
【図14】血漿試料中のｃｅｌ－ｍｉＲ３９の検出。健康ドナーからヒト血液試料を収集し、遠心分離により血漿を得た。０または１ｐＭのｃｅｌ－ｍｉＲ３９を、５％血漿（容積／容積）およびＲＮＡｓｅ阻害剤で補完された増幅混合物にスパイクする。プロットに報告されている測定濃度は、５％血漿中の外因性マイクロＲＮＡが完全に回収されたことを示す。
【図15】変換モジュール設計および酵素活性のバルク検出（標準偏差は少なくとも３つの独立データポイントから算出）。ａ）Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ｂ）ＲＮＡｓｅＨ２。ｃ）ＡＰＥ－エンドヌクレアーゼ１（ＡＰＥ－１）。ｄ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）。ｅ）アルキルアデニングリコシラーゼ（ＡＡＧ）。ｆ）ＢｓｍＡＩ制限酵素。ｇ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）。ｈ）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ。ｉ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）。
【図16】酵素のデジタル検出。ａ）６つの異なる濃度のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ酵素の２Ｄ液滴アレイの顕微鏡スナップショット。ｂ）様々な酵素のスパイクイン濃度（ｕ／ｍＬ）の関数としての測定濃度（ｆＭ）。線形関係性は、デジタル読出しにより絶対的定量性が提供されることを示す。誤差バーは、測定の９５％信頼区間に対応する。
【図17】小型（０．９５ｐＬ）液滴および大型（７．２ｐＬ）液滴でのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩのデジタルアッセイ定量化の比較。両実験で算出された濃度は一致していた。誤差バーは、測定の９５％信頼区間に対応する。
【図18】２つの交差阻害性双安定スイッチで構築された四安定系（tetrastable system）。（ａ）四安定ＤＮＡ回路の概略図。２つのマイクロＲＮＡ感知回路（ｃＴ、ａＴ、ｐＴ、ｒＴ）は、望ましくない交差活性化を抑制するキラー鋳型αｋβおよびβｋαにより相互接続されている。（ｂ）５種類の鋳型の詳細な機構（ｐｏｌ．＝Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）、ニック１＝Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ニック２＝Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＲＥ＝ＢｓｍＩ、ｅｘｏ＝ｔｔＲｅｃＪ）。変換鋳型（ｃＴ）は、相補的マイクロＲＮＡ標的をシグナル鎖（αまたはβ）に変換する。自己触媒性鋳型（ａＴ）は、シグナル鎖を指数関数的に増幅する。疑似鋳型は、シグナル鎖の一部を不活性化することにより、生化学的ノイズに起因するバックグラウンド増幅を抑制する。リポート鋳型（ｒＴ）は、分子シグナル（αまたはβ）を検出可能な蛍光シグナルへと転換する（緑色＝Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎフルオロフォア、赤色＝Ａｔｔｏ６３３フルオロフォア）。キラー鋳型（ｋＴ）は、α鎖またはβ鎖から、逆スイッチのｐＴを産生し、非特異的クロストークを軽減する。産生された鎖はすべて、エキソヌクレアーゼにより継続的に分解され、系のダイナミクスが維持される。ここには、四安定回路の半分のみが示されており、残りの半分は、αをβに置き換えることにより、およびその逆で得られる。
【図19】キラー鋳型効率。（ａ）ｍｉｒ３９の場合は１０ｐＭで誘発されるαスイッチは、キラー鋳型αｋβに接続され、様々な長さのｐＴβ（０～５つの範囲のアデニル酸部分の不活性化テールを有する）を産生する。（ｂ）ｋＴの濃度の関数としてのβスイッチの蛍光（ｔ＝１０００分）。
【図21】αスイッチとβスイッチとの間の交差活性化を抑制するためのｋＴ濃度の決定。（ａ）Ａおよびβ回路は、漸増濃度のαｋβおよびβｋαの存在下で、それぞれ０または１０ｐＭのｍｉｒ９２ａおよびｌｅｔ７ａで誘発される。（ｂ）αスイッチおよびβスイッチの増幅時間（Ｃｑ）。（ｃ）ｋＴ濃度の関数として色分けされたＣｑの表示。破線青色枠は、系が四安定性に到達するｋＴの濃度を表す。（ｄ）ｍｉｒ３９／ｍｉｒ７デュプレックスアッセイの増幅曲線（各標的０または１０ｐＭ）。（ｅ）７つの異なるデュプレックスアッセイで測定されたＣｑ。左の挿入図は、７つのアッセイの平均Ｃｑおよび標準偏差を表す。
【図22】デジタルデュプレックスアッセイの原理。（ａ）４つの試料（０ｐＭ ｍｉｒ３９／０ｐＭ ｌｅｔ７ａ、３ｐＭ ｍｉｒ３９／０ｐＭ ｌｅｔ７ａ、０ｐＭ ｍｉｒ３９／３ｐＭ ｌｅｔ７ａ、３ｐＭ ｍｉｒ３９／３ｐＭ ｌｅｔ７ａ）からマイクロ流体チップを用いて液滴を生成し、エマルジョンを顕微鏡で分析した。（ｂ）プローブの蛍光の２Ｄヒストグラム（αスイッチ＝緑色蛍光－ｍｉｒ３９、βスイッチ＝赤色蛍光－ｌｅｔ７ａ）。垂直および水平の破線は、それぞれαスイッチおよびβスイッチの陽性閾値を示す。（ｃ）測定標的濃度対予想標的濃度のヒストグラム。（ｄ）組成が異なる種々の試料のデジタルデュプレックスアッセイ（マイクロＲＮＡ標的および濃度）。
【図23】溶液中でのシングルプレックス対デュプレックスアッセイ。（ａ）増幅ミックスならびに０または３ｐＭのｌｅｔ７ａおよびｍｉｒ３９標的と共に別々にインキュベートしたα（上段）およびβ（下段）双安定回路の増幅曲線（シングルプレックスアッセイ）。（ｂ）完全な四安定回路に埋め込まれたαスイッチおよびβスイッチの増幅曲線（デュプレックスアッセイ）。（ｃ）重複実験で測定された増幅時間。こうしたデータから、キラー鋳型は、こうした条件では増幅時間にほとんど影響を与えないと結論付けた。
【図24】ブランクシングルプレックス対デュプレックスアッセイの限界。４つの試料を以下のようにアセンブリする：試料Ａ＝α回路のみ、０ｐＭ標的、試料Ｂ＝β回路のみ、０ｐＭ標的、試料Ｃ＝αおよびβ回路、０ｐＭ標的、試料Ｄ＝αおよびβ回路、１ｐＭ標的ｍｉｒ３９およびｌｅｔ７ｅ。（ａ）溶液中での４つの試料の増幅曲線。（ｂ）マイクロ流体チャンバーの部分の合成画像（明視野、緑色蛍光、および赤色蛍光）。（ｃ）液滴蛍光の２Ｄヒストグラム（αスイッチ＝緑色蛍光、βスイッチ＝赤色蛍光）。（ｄ）陽性液滴のパーセンテージ。偽陽性液滴のパーセンテージは、アッセイがシングルプレックスで実施されるかまたはデュプレックスで実施されるかに関わらず質的に類似している（シングルプレックスでは偽陽性α＝１．１％、デュプレックスでは１．１％、シングルプレックスでは偽陽性α＝０．２５％、デュプレックスでは０．２８％）。
【実施例】
【0075】
下記の実施例の目的は、本発明が、等温核酸増幅のアナログ法をデジタル化することにより高感度分子検出を可能にすることを実証することである。
【0076】
（実施例１）
本発明のデジタル方法によるマイクロＲＮＡの検出
方法および物質
化学物質：オリゴヌクレオチド（鋳型および合成マイクロＲＮＡ）はＢｉｏｍｅｒｓ（ドイツ）から購入した。配列をＨＰＬＣで精製し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析で確認した。鋳型は、Ｍｏｎｔａｇｎｅらにより記載の規則に従って設計した（Montagne et al, 2011およびMontagne et al., 2016）。自己触媒鋳型（ａＴ）、疑似鋳型（ｐＴ）、およびリポート鋳型（ｒＴ）は、５’ホスホロチオエート骨格修飾により、エキソヌクレアーゼによる分解から保護されている。非特異的重合を回避するため、３’ブロッキング部分（ａＴ、ｐＴ、ｃＴはリン酸基およびｒＴはクエンチャー）を使用する。下記の表２は、本発明の全体を通して使用されるすべて配列が要約されている。
本発明のデジタル方法によるマイクロＲＮＡの検出
方法および物質
化学物質：オリゴヌクレオチド（鋳型および合成マイクロＲＮＡ）はＢｉｏｍｅｒｓ（ドイツ）から購入した。配列をＨＰＬＣで精製し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析で確認した。鋳型は、Ｍｏｎｔａｇｎｅらにより記載の規則に従って設計した（Montagne et al, 2011およびMontagne et al., 2016）。自己触媒鋳型（ａＴ）、疑似鋳型（ｐＴ）、およびリポート鋳型（ｒＴ）は、５’ホスホロチオエート骨格修飾により、エキソヌクレアーゼによる分解から保護されている。非特異的重合を回避するため、３’ブロッキング部分（ａＴ、ｐＴ、ｃＴはリン酸基およびｒＴはクエンチャー）を使用する。下記の表２は、本発明の全体を通して使用されるすべて配列が要約されている。
【0077】
【表3】
【0078】
Ｎｂ．ＢｓｍＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢＳＡは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で補完された希釈液Ａ（ＮＥＢ）にストック酵素を溶解することにより、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの１０倍希釈物を調製した。エキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪは、Ｙａｍａｇａｔａにより発表されたプロトコール（Yamagata et al., 2001）に従って施設内培養で発現させ、クロマトグラフィーで精製した。酵素は、希釈液Ａ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中１．５３μＭで保管した。タンパク質はすべて－２０℃で保管した。
細胞培養。ヒト非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５細胞および結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞を、ｍｉＲＮＡ抽出に使用した。ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ＦＣＳ、１００単位／ｍＬペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。Ｈ１９７５細胞を、１０％（容積／容積）ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞は３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で増殖させた。
細胞培養。ヒト非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５細胞および結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞を、ｍｉＲＮＡ抽出に使用した。ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ＦＣＳ、１００単位／ｍＬペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。Ｈ１９７５細胞を、１０％（容積／容積）ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞は３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で増殖させた。
【0079】
マイクロＲＮＡ抽出：ヒト結腸全ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１３μｇ／ｍＬにアリコートし、使用するまで－２０℃で保管した。細胞抽出では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ＡＢＣ精製Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、キットの説明書に従って、約１×１０6細胞からマイクロＲＮＡを抽出した。手短に言えば、細胞を、５０μＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、１５０μＬの溶解緩衝液と混合した。細胞溶解ステップの後、２μＬの１ｎＭ外部対照ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｍｅｒｓ）を、調製した試料にスパイクし、ボルテックスして、抽出効率を評価する。磁気Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｅｌビーズを使用して標的マイクロＲＮＡを捕捉し、１００μＬの溶出緩衝液で溶出する。
反応混合物アセンブリ：すべての反応混合物を、２００μＬのＰＣＲチューブに４℃でアセンブリした。鋳型を反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．９、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／容積）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、すべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入）およびＢＳＡ（２００μｇ／ｍＬ）と混合した。ホモジナイズした後、酵素を添加する（３００ｕ／ｍＬ Ｎｂ．ＢｓｍＩ、１０ｕ／ｍＬ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、８０ｕ／ｍＬ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）、２３ｎＭ ｔｔＲｅｃＪ）。各試料をマイクロＲＮＡ標的でスパイクし、低結合ＤＮＡチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で系列希釈した。試料（バルクまたはエマルジョン）を、５０℃のｑＰＣＲサーモサイクラー（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ、Ｂｉｏｒａｄ）でインキュベートし、蛍光をリアルタイムで記録した。バルク実験では、時間トレースを正規化し、Ｃｑ（増幅開始時間）を最大蛍光シグナルの１０％として決定した。
反応混合物アセンブリ：すべての反応混合物を、２００μＬのＰＣＲチューブに４℃でアセンブリした。鋳型を反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．９、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／容積）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、すべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入）およびＢＳＡ（２００μｇ／ｍＬ）と混合した。ホモジナイズした後、酵素を添加する（３００ｕ／ｍＬ Ｎｂ．ＢｓｍＩ、１０ｕ／ｍＬ Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、８０ｕ／ｍＬ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）、２３ｎＭ ｔｔＲｅｃＪ）。各試料をマイクロＲＮＡ標的でスパイクし、低結合ＤＮＡチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で系列希釈した。試料（バルクまたはエマルジョン）を、５０℃のｑＰＣＲサーモサイクラー（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ、Ｂｉｏｒａｄ）でインキュベートし、蛍光をリアルタイムで記録した。バルク実験では、時間トレースを正規化し、Ｃｑ（増幅開始時間）を最大蛍光シグナルの１０％として決定した。
【0080】
液滴生成：ＳＵ－８フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州、米国）を使用して標準的なソフトリソグラフィー技法により４インチシリコンウェーハにパターン化した２インレット（１つはオイル用、もう１つは水性試料用）フローフォーカシングマイクロ流体金型（flow focusing microfluidic mold）を準備した。Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ ＰＤＭＳ樹脂（４０ｇ）／架橋剤（４ｇ）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ミシガン州、米国）の１０：１混合物を金型に注ぎ、真空下で脱気し、７０℃で２時間焼成する。硬化後、ＰＤＭＳをウェーハから剥がし、直径１．５ｍｍの入口穴および出口穴を生検パンチ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｍｉｌｔｅｘ、ペンシルベニア州、米国）で打ち抜いた。酸素プラズマ処理の直後に、ＰＤＭＳ層を１ｍｍ厚のスライドガラス（Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．Ｋ．Ｇ．、ドイツ）に固定した。最後に、チップに対して２００℃で５時間にわたる２回目の焼成を行って、チャネルを疎水性にした（Kaneda et al., 2012）。マイクロ流体チップの詳細は図１に示されている。水性試料相、および１％（質量／質量）フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州、米国）を含むフッ素化油（Ｎｏｖｅｃ－７５００、３Ｍ）で構成される連続相を、圧力ポンプコントローラーＭＦＣＳ－ＥＺ（Ｆｌｕｉｇｅｎｔ、フランス）、および直径２００μｍのＰＴＦＥチューブ（Ｃ．Ｉ．Ｌ．、フランス）を使用してチップ上で混合して、流体力学的フローフォーカシングにより０．５ｐＬ液滴を生成した。
【0081】
液滴画像化：インキュベーション後、液滴を蛍光顕微鏡により画像化した。底部スライド（７６×５２×１ｍｍスライドガラス）を、２００μＬのＣｙｔｏｐ ＣＴＬ－８０９Ｍ（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓ）でスピンコーティングし、１８０℃で２時間乾燥させた。エマルジョンを、Ａｑｕａｐｅｌで処理された厚さ０．１７ｍｍのカバーガラスで挟んだ。１０μｍのポリスチレン粒子（Polysciences, Inc.、ペンシルベニア州、米国）をスペーサーとして使用して上部スライドを支え、エマルジョンの圧縮を回避した。最終的に画像化チャンバーをエポキシ接着剤（Ｓａｄｅｒ）で密封し、電動ＸＹステージ（Ｎｉｋｏｎ）、カメラＮｉｋｏｎ ＤＳ－Ｑｉ２、アポクロマート１０×（Ｎ．Ａ．０．４５）（Ｎｉｋｏｎ）、およびＣｏｏｌＬｅｄ ｐＥ－４０００照明光源を備えた落射蛍光顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉを使用して画像を取得した。合成画像は、オープンソースのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して生成した。定量的データは、図２に詳述されている手順に従って、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａソフトウェア（Ｗｏｌｆｒａｍ）を使用して顕微鏡画像から抽出した。
【0082】
結果
国際公開第２０１７１４０８１５号パンフレットによるアナログ増幅法
本発明の発明者らは、以前に、ＰＥＮ－ＤＮＡツールボックス（ポリメラーゼエキソヌクレアーゼニッカーゼ動的ネットワークアセンブリ）と称する多用途分子プログラミング言語を開発した（Montagne et al., 2011およびBaccouche et l., 2014）。ネットワークのトポロジーは、１セットの短鎖オリゴヌクレオチド（鋳型）により規定される。ネットワークは、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびニッカーゼ）の混合物により解釈され、ＤＮＡ鎖が産生および分解されることで情報流束が処理され、それによりひいてはネットワークの他のノードが活性化または阻害される。
国際公開第２０１７１４０８１５号パンフレットによるアナログ増幅法
本発明の発明者らは、以前に、ＰＥＮ－ＤＮＡツールボックス（ポリメラーゼエキソヌクレアーゼニッカーゼ動的ネットワークアセンブリ）と称する多用途分子プログラミング言語を開発した（Montagne et al., 2011およびBaccouche et l., 2014）。ネットワークのトポロジーは、１セットの短鎖オリゴヌクレオチド（鋳型）により規定される。ネットワークは、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびニッカーゼ）の混合物により解釈され、ＤＮＡ鎖が産生および分解されることで情報流束が処理され、それによりひいてはネットワークの他のノードが活性化または阻害される。
【0083】
この１セットの反応モジュールを使用して、本発明者らは、以前に、マイクロＲＮＡの検出に特化した汎用分子プログラムを設計した。図３は、回路の接続性を示す。ユニバーサルシグナル増幅部分は、２種の鋳型で構成される双安定ノードに相当する。自己触媒鋳型（ａＴ）は、１２量体オリゴヌクレオチドの指数関数的複製を触媒する二重リピート配列で構成されており、疑似鋳型（ｐＴ）は、自己触媒鋳型での非特異的反応に起因するリーク産物を吸収し、したがってバックグラウンド増幅が回避される。変換鋳型（ｃＴ）は、ａＴの上流に接続されており、標的がｃＴの入力部分に結合すると、後者は、出力鎖の産生を触媒し、出力鎖は、ひいてはａＴでの自己触媒反応を誘発する。ａＴの下流において、リポート鋳型（ｒＴ）は、増幅されたシグナル鎖を捕捉して、蛍光シグナルを生成する。詳細な反応ネットワークは図４に示されている。
【0084】
図５ｂ～５ｃは、Ｌｅｔ－７ａのバルク検出に対するこのアプローチの感度の評価を示す。４種の鋳型を酵素プロセッサと一緒に混合し、０～１ｎＭ範囲の濃度の合成標的Ｌｅｔ－７ａでスパイクする。ｒＴの蛍光を、５０℃の一定温度に設定されたＰＣＲサーモサイクラーにてリアルタイムでモニターする。陰性対照（標的なし）は、２０時間よりも長期間にわたって陽性シグナルを生成しない。アッセイの感度は約１ｆＭであり、バルクでのダイナミックレンジは、１ｆＭ～１００ｐＭの範囲、つまり６桁である。ｐＴの非存在下では（図５ｂ）、感度は否定的な影響を受け、検出限界は１ｐＭである（陰性対照の平均増幅時間から３標準偏差であることから推定）。こうした結果は、増幅閾値を制御し、したがってバックグラウンド増幅を排除するためのこの能動的なリーク吸収機序の重要性を示している。ｃＴの非存在下では（図５ｃ）、増幅反応は観察されず、標的マイクロＲＮＡに対して分子プログラムが特異的であることが示されている。
【0085】
アナログ増幅法のデジタル化
アナログシグナルをデジタル読出しへと変換するために、本発明者らは、液滴に区画化された単一分子を検出する可能性の評価に移る。既知濃度のＬｅｔ－７ａでスパイクした分子プログラムを、フローフォーカシングマイクロ流体接合部を使用して、ピコリットルサイズの油中水型液滴に分配した。単分散エマルジョンを５０℃でインキュベートし、標的含有液滴を増幅した後、反応を停止させた。最後に、液滴を蛍光顕微鏡で画像化し、ポアソンの法則から濃度を再算出した。
図６は、２００分間のインキュベーション後のエマルジョンの顕微鏡スナップショットを示す。スパイクしたｍｉＲＮＡ濃度とポアソンの法則に従って測定された濃度との間に線形相関性が観察される。算出された検出限界は２．１ｆＭである。
アナログシグナルをデジタル読出しへと変換するために、本発明者らは、液滴に区画化された単一分子を検出する可能性の評価に移る。既知濃度のＬｅｔ－７ａでスパイクした分子プログラムを、フローフォーカシングマイクロ流体接合部を使用して、ピコリットルサイズの油中水型液滴に分配した。単分散エマルジョンを５０℃でインキュベートし、標的含有液滴を増幅した後、反応を停止させた。最後に、液滴を蛍光顕微鏡で画像化し、ポアソンの法則から濃度を再算出した。
図６は、２００分間のインキュベーション後のエマルジョンの顕微鏡スナップショットを示す。スパイクしたｍｉＲＮＡ濃度とポアソンの法則に従って測定された濃度との間に線形相関性が観察される。算出された検出限界は２．１ｆＭである。
【0086】
本系はモジュール式手法によるため、ユニバーサルシグナル増幅機序に依存する定量化に影響を及ぼすことなく、コンバーター鋳型（図６ｄ）のみを任意の目的の標的にハイブリダイズするように再設計することにより、分子プログラムを再利用することができる。
マイクロＲＮＡの定量化に関する主な懸念事項は、マイクロＲＮＡ標的間の配列相同性が高いことである。したがって、本発明者らは、Ｌｅｔ－７ファミリーに対する本検出法の特異性を評価した。図４ｅは、Ｌｅｔ－７ａ配列と、単一（Ｌｅｔ－７ｃ）または二重（Ｌｅｔ－７ｂ）ミスマッチ塩基を含むアナログとが非常に良好に区別されることを示す。
疑似鋳型（ｐＴ）およびヌクレアーゼ濃度の効果
また、本発明者は、疑似鋳型（ｐＴ）およびヌクレアーゼ濃度（Ｎｂ．Ｂｓｍｌ）の効果をアッセイした。
そのために、規定濃度のｐＴ（０～１５ｎＭ）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．１～０．４ｕ／μＬ）を含む試料を、０または１ｐＭのＬｅｔ－７ａでスパイクし、増幅反応をリアルタイムでモニターした。Ｃｑを、ｐＴおよびＮｂ．ＢｓｍＩ濃度の関数としてプロットする（図７ａ）。マイクロＲＮＡ検出スコア（ＭＤＳ）を、以下の式に従って各セットの濃度ごとに算出する。
マイクロＲＮＡの定量化に関する主な懸念事項は、マイクロＲＮＡ標的間の配列相同性が高いことである。したがって、本発明者らは、Ｌｅｔ－７ファミリーに対する本検出法の特異性を評価した。図４ｅは、Ｌｅｔ－７ａ配列と、単一（Ｌｅｔ－７ｃ）または二重（Ｌｅｔ－７ｂ）ミスマッチ塩基を含むアナログとが非常に良好に区別されることを示す。
疑似鋳型（ｐＴ）およびヌクレアーゼ濃度の効果
また、本発明者は、疑似鋳型（ｐＴ）およびヌクレアーゼ濃度（Ｎｂ．Ｂｓｍｌ）の効果をアッセイした。
そのために、規定濃度のｐＴ（０～１５ｎＭ）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．１～０．４ｕ／μＬ）を含む試料を、０または１ｐＭのＬｅｔ－７ａでスパイクし、増幅反応をリアルタイムでモニターした。Ｃｑを、ｐＴおよびＮｂ．ＢｓｍＩ濃度の関数としてプロットする（図７ａ）。マイクロＲＮＡ検出スコア（ＭＤＳ）を、以下の式に従って各セットの濃度ごとに算出する。
【0087】
【数1】
図７は、両パラメーターが、増幅反応を遅延させることを示す。疑似鋳型は、産生されたトリガーの一部を分解する能動的シンクの役目を果たす。Ｎｂ．ＢｓｍＩは、それ自体の産物（ニックされた未融解の二重鎖）により阻害されることが知られており、それが二重鎖切断後のトリガー放出を妨げることにより反応が遅延すると考えられる。なお、疑似鋳型濃度の増加は、陰性対照（ＮＣ）増幅を優先的に遅延させることにより検出スコアに肯定的な影響を及ぼし、標的により誘発される増幅に及ぼす影響の程度はより低い。一方、Ｎｂ．ＢｓｍＩは、標的濃度に関わりなく増幅時間に影響を及ぼすため、検出スコアに否定的な影響を及ぼす。この観察結果は、増幅方法がデジタル化されている場合であっても、バックグラウンド増幅を低減／消失させるために疑似鋳型が提供する能動的分解機序の重要性を示す。
【0088】
また、本発明者らは、ヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの最適濃度を調査した。そのために、０または１ｐＭのＬｅｔ７ａでスパイクした試料を、様々な濃度のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下でインキュベートする。Ｃｑを、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ濃度の関数としてプロットする。図８は、エンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの最適濃度が０．０１ｕ／μＬ付近にあることを示す。
【0089】
（比較例）
ほとんどの等温核酸増幅技法は、デジタル方式に移行させることができない。これは、一般に、Ｚｈａｎｇら（Zang et al., 2015）に記載のように、標的の存在に関わりなく最終的にすべての区画で増幅を誘発する非特異的反応に起因する。エンドポイント分析に依存するため、標的含有液滴（陽性シグナルを呈する）と無標的液滴とを区別するのに十分な時間窓を有することが重要になる。図９は、ｐＴおよび標的の非存在下では、すべての液滴が１時間未満でオンになることを示す。この結果は、２つの集団を分離するために必要な時間枠にかなりの影響を及ぼし、Ｚｈａｎｇら（Zhang et al., 2015）により記載の以前に記載されているＥＸＰＡＲ系と一致する。
ｐＴ濃度を増加させることにより、したがって増幅閾値を上昇させることにより、１５ｎＭのｐＴで完全に無効にされるまで自発的開始が遅延される。図１０は、０または１５ｎＭのｐＴを用いて１ｐＭのＬｅｔ－７ａを検出するための時間窓の比較である。ｐＴの非存在下では、標的含有試料と陰性対照とを区別することはほぼ不可能である。しかしながら、偽陽性液滴の原因となるリークを吸収することにより、標的含有液滴の増幅を妨げることなく、１６時間よりも長期間にわたってオフ状態の安定化が保証される。バックグラウンドが完全に排除されるおかげで、本発明の方法は、インキュベーション時間に関して比類のないロバスト性を示し、理論的に無限の時間窓を示す。
ほとんどの等温核酸増幅技法は、デジタル方式に移行させることができない。これは、一般に、Ｚｈａｎｇら（Zang et al., 2015）に記載のように、標的の存在に関わりなく最終的にすべての区画で増幅を誘発する非特異的反応に起因する。エンドポイント分析に依存するため、標的含有液滴（陽性シグナルを呈する）と無標的液滴とを区別するのに十分な時間窓を有することが重要になる。図９は、ｐＴおよび標的の非存在下では、すべての液滴が１時間未満でオンになることを示す。この結果は、２つの集団を分離するために必要な時間枠にかなりの影響を及ぼし、Ｚｈａｎｇら（Zhang et al., 2015）により記載の以前に記載されているＥＸＰＡＲ系と一致する。
ｐＴ濃度を増加させることにより、したがって増幅閾値を上昇させることにより、１５ｎＭのｐＴで完全に無効にされるまで自発的開始が遅延される。図１０は、０または１５ｎＭのｐＴを用いて１ｐＭのＬｅｔ－７ａを検出するための時間窓の比較である。ｐＴの非存在下では、標的含有試料と陰性対照とを区別することはほぼ不可能である。しかしながら、偽陽性液滴の原因となるリークを吸収することにより、標的含有液滴の増幅を妨げることなく、１６時間よりも長期間にわたってオフ状態の安定化が保証される。バックグラウンドが完全に排除されるおかげで、本発明の方法は、インキュベーション時間に関して比類のないロバスト性を示し、理論的に無限の時間窓を示す。
【0090】
さらに、以前に実施された他のデジタル増幅法（Zhang et al., 2015、Cohen et al., 2016、およびTian et al., 2016）と比較して、本発明の方法の選択性は、９７％よりも優れていると推定される。
本発明の方法によるヒト細胞からの内因性マイクロＲＮＡの検出
日常的な生物医学的手順としてのマイクロＲＮＡベース診断の成功は、マイクロＲＮＡ定量化のロバスト性および再現性に依存する。したがって、本発明者らは、ヒト細胞から内因性マイクロＲＮＡを検出する可能性を評価した。
マイクロＲＮＡを、細胞株Ｈ１９７５（腺癌）から抽出し、Ｌｅｔ－７ａを、ＲＮＡ抽出物の濃度を変化させて本発明の方法により定量化した。１％および１０％のＲＮＡ抽出物を含む試料の測定Ｌｅｔ－７ａ濃度は、それぞれ９０ｆＭおよび１ｐＭである（図１１ａ）。
本発明の方法によるヒト細胞からの内因性マイクロＲＮＡの検出
日常的な生物医学的手順としてのマイクロＲＮＡベース診断の成功は、マイクロＲＮＡ定量化のロバスト性および再現性に依存する。したがって、本発明者らは、ヒト細胞から内因性マイクロＲＮＡを検出する可能性を評価した。
マイクロＲＮＡを、細胞株Ｈ１９７５（腺癌）から抽出し、Ｌｅｔ－７ａを、ＲＮＡ抽出物の濃度を変化させて本発明の方法により定量化した。１％および１０％のＲＮＡ抽出物を含む試料の測定Ｌｅｔ－７ａ濃度は、それぞれ９０ｆＭおよび１ｐＭである（図１１ａ）。
【0091】
加えて、本発明者らは、ヒト結腸全ＲＮＡからＬｅｔ－７ａを定量化した。図１１ｂは、全ＲＮＡ濃度（０～４μｇ／ｍＬの範囲）と測定Ｌｅｔ－７ａ濃度との間の線形関係性を示す。陰性対照実験として、ヒトゲノムに存在しないｍｉｒ－３９ｃｅは、こうした試料では検出されなかった。これは、全体として、高度に複雑なバックグラウンド試料における本発明の方法の正確性およびそのロバスト性を実証する。
【0092】
（実施例２）
マイクロＲＮＡ誘発増幅を加速するためのクレノウ（３’－＞５’ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼの使用
マイクロＲＮＡ標的化増幅を加速するために、本発明者らは、クレノウ（ｅｘｏ-）である別のＤＮＡポリメラーゼを添加することの効果を調査した。０または１０ｐＭのＬｅｔ７ａマイクロＲＮＡ標的でスパイクした増幅混合物（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼを含む）を、様々な濃度のクレノウ（ｅｘｏ-）で補完する。図１２は、クレノウ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼの非存在下では、約１００分で特異的増幅が生じるのに対して、陰性対照は１０００分以内では増幅しないことを示す。興味深いことに、１６ｕ／ｍＬのクレノウ（ｅｘｏ-）を用いると、比増幅は２０分間へと短縮されるが、陰性対照は影響を受けない。この濃度を上回った場合、本発明者らは、４０分間未満で陰性対照試料の望ましくない自己増幅を観察した。まとめると、こうした結果は、クレノウ（ｅｘｏ-）がＲＮＡプライマーの伸長を効率的に開始するため、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）に加えて最適濃度のクレノウ（ｅｘｏ-）を添加することは、増幅反応の加速に有益であることを示唆する。
マイクロＲＮＡ誘発増幅を加速するためのクレノウ（３’－＞５’ｅｘｏ-）ＤＮＡポリメラーゼの使用
マイクロＲＮＡ標的化増幅を加速するために、本発明者らは、クレノウ（ｅｘｏ-）である別のＤＮＡポリメラーゼを添加することの効果を調査した。０または１０ｐＭのＬｅｔ７ａマイクロＲＮＡ標的でスパイクした増幅混合物（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼを含む）を、様々な濃度のクレノウ（ｅｘｏ-）で補完する。図１２は、クレノウ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼの非存在下では、約１００分で特異的増幅が生じるのに対して、陰性対照は１０００分以内では増幅しないことを示す。興味深いことに、１６ｕ／ｍＬのクレノウ（ｅｘｏ-）を用いると、比増幅は２０分間へと短縮されるが、陰性対照は影響を受けない。この濃度を上回った場合、本発明者らは、４０分間未満で陰性対照試料の望ましくない自己増幅を観察した。まとめると、こうした結果は、クレノウ（ｅｘｏ-）がＲＮＡプライマーの伸長を効率的に開始するため、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）に加えて最適濃度のクレノウ（ｅｘｏ-）を添加することは、増幅反応の加速に有益であることを示唆する。
【0093】
次いで、本発明者らは、マイクロＲＮＡの液滴デジタル検出のための、ＤＮＡポリメラーゼの混合物の使用を調査した。クレノウ（ｅｘｏ-）は室温で無視できない活性を有するため、オリゴヌクレオチド（鋳型）および酵素を別々にアセンブリし（ミックスＡおよびミックスＢ）、液滴を分配する直前に、３インレットマイクロ流体デバイス（１つの入口は連続相用であり、２つの入口は増幅ミックスＡおよびＢの両方の一部のためのものである）を使用してチップ上で混合する。これにより、標的封入前に反応が開始することが防止される。測定濃度は、各試料のスパイクイン濃度と一致しており、このポリメラーゼ混合物を用いた標的マイクロＲＮＡの正確なデジタル定量化が実証される（図１３）。
【0094】
（実施例３）
血漿試料からの直接的マイクロＲＮＡ検出
また、本発明者らは、本発明のデジタル検出法を使用して、血漿試料中のマイクロＲＮＡの検出を評価した。
健康ドナー（ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶ陰性）からヒト血液試料を１０ｍＬ採血管（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌが供給するＳｔｒｅｃｋ管）に採取した。４℃にて１０分間２０００×ｇで遠心分離した後、４℃にて１５分間２０００×ｇで遠心分離することにより、血漿を得た。パスツールピペットを使用して血漿をきれいなポリプロピレンチューブにアリコートし、使用するまで－８０℃で保管した。０または１ｐＭのｃｅｌ－ｍｉＲ３９（Ｃ．エレガンス（Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ）に由来するマイクロＲＮＡ）を、５％血漿（容積／容積）および１ｕ／μＬマウスＲＮＡｓｅ阻害剤で補完された増幅混合物にスパイクする。プロットに報告されている測定濃度は、５％血漿中の外因性マイクロＲＮＡが完全に回収されたことを示す。この結果は、図１４に示されており、したがって粗血漿試料中のマイクロＲＮＡ濃度の定量的測定を実証する。
血漿試料からの直接的マイクロＲＮＡ検出
また、本発明者らは、本発明のデジタル検出法を使用して、血漿試料中のマイクロＲＮＡの検出を評価した。
健康ドナー（ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶ陰性）からヒト血液試料を１０ｍＬ採血管（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌが供給するＳｔｒｅｃｋ管）に採取した。４℃にて１０分間２０００×ｇで遠心分離した後、４℃にて１５分間２０００×ｇで遠心分離することにより、血漿を得た。パスツールピペットを使用して血漿をきれいなポリプロピレンチューブにアリコートし、使用するまで－８０℃で保管した。０または１ｐＭのｃｅｌ－ｍｉＲ３９（Ｃ．エレガンス（Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓ）に由来するマイクロＲＮＡ）を、５％血漿（容積／容積）および１ｕ／μＬマウスＲＮＡｓｅ阻害剤で補完された増幅混合物にスパイクする。プロットに報告されている測定濃度は、５％血漿中の外因性マイクロＲＮＡが完全に回収されたことを示す。この結果は、図１４に示されており、したがって粗血漿試料中のマイクロＲＮＡ濃度の定量的測定を実証する。
【0095】
（実施例４）
本発明のデジタル方法を使用することによる酵素の検出
オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｍｅｒｓまたはＥｕｒｏｆｉｎｓから得た（表３）。ニッキング酵素ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（Ｒ０６０７）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（Ｒ０７０６）、ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）（Ｍ０２５７）、クレノウ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼ、制限酵素ＢｓｍＡＩ（Ｒ０５２９）、ＡＰ－エンドヌクレアーゼＡＰＥ－１（Ｍ０２８２）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼＵＤＧ（Ｍ０２８０）、アルキルアデニングリコシラーゼｈＡＡＧ（Ｍ０３１３）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｍ０２７６）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｍ０２０２）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼＰＮＫ（Ｍ０２０１）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＲＮＡｓｅ Ｈ２酵素（１１－０３－０２－０２）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。エキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪは、以前に報告された手順（８）に従って自家精製した。すべてのオリゴヌクレオチドおよびタンパク質は、－２０℃で保管した。
本発明のデジタル方法を使用することによる酵素の検出
オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｍｅｒｓまたはＥｕｒｏｆｉｎｓから得た（表３）。ニッキング酵素ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（Ｒ０６０７）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（Ｒ０７０６）、ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）（Ｍ０２５７）、クレノウ（ｅｘｏ-）ポリメラーゼ、制限酵素ＢｓｍＡＩ（Ｒ０５２９）、ＡＰ－エンドヌクレアーゼＡＰＥ－１（Ｍ０２８２）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼＵＤＧ（Ｍ０２８０）、アルキルアデニングリコシラーゼｈＡＡＧ（Ｍ０３１３）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｍ０２７６）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｍ０２０２）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼＰＮＫ（Ｍ０２０１）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＲＮＡｓｅ Ｈ２酵素（１１－０３－０２－０２）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。エキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪは、以前に報告された手順（８）に従って自家精製した。すべてのオリゴヌクレオチドおよびタンパク質は、－２０℃で保管した。
【0096】
【表4】
【0097】
反応アセンブリ：すべての反応を、２００μＬのＰＣＲチューブに４℃でアセンブリした。鋳型および酵素（表４）を、反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．９、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／容積）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、これらはすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入）およびＢＳＡ（２００μｇ／ｍＬ）と混合した。試料を、ＢＳＡ（２００μｇ／ｍＬ）で補完された１×反応緩衝液を有する２００μＬのＰＣＲチューブ中で系列希釈した種々の濃度の標的酵素の１０％容積／容積でスパイクした。任意選択のプレインキュベーションステップに続いて、試料を、ＣＦＸ９６タッチサーモサイクラー機器で４８℃にてインキュベートする。詳細な実験条件は表４に示されている。
【0098】
【表5】
【0099】
デジタルアッセイ：デジタルアッセイの場合、酵素（ミックスＡ）および鋳型（ミックスＢ）を２つの別々のチューブの１×反応緩衝液中で混合して、単一の酵素を油中水型液滴に封入する前に反応が開始するのを防止した。アッセイのスループットを増加させるために、本発明者らは、以前に報告されている連続乳化戦略を使用した（Menezes et al., 2019）。様々な濃度の標的酵素を含むミックスＡを、３種の蛍光標識デキストラン（デキストランＴｅｘａｓ Ｒｅｄ７０，０００ＭＷ、デキストランＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ３，０００ＭＷ、およびデキストランＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ １０，０００ＭＷ リジン係留可能（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の様々な組合せでバーコード化する。ミックスＡ（加圧試料交換器に負荷）およびミックスＢを配合し、３インレットフローフォーカシングマイクロ流体ＰＤＭＳチップを使用してチップ上で連続乳化した。連続相は、１％（質量／質量）のフッ素系界面活性剤（ＲＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州、米国）を含むフッ素化油（Ｎｏｖｅｃ－７５００、３Ｍ）で構成されている。ＳＵ－８フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．マサチューセッツ州、米国）を使用して標準的なソフトリソグラフィー技術で４インチシリコンウェーハ上にパターン化されたマイクロ流体金型を準備し、ＭＪＢ４マスクアライナー（ＳＵＳＳ Ｍｉｃｒｏｔｅｃ）を使用して手動で位置合わせした。Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ ＰＤＭＳ樹脂（４０ｇ）／架橋剤（４ｇ）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ミシガン州、米国）の１０：１混合物を金型に注ぎ、真空下で脱気し、７０℃で２時間焼成する。硬化後、ＰＤＭＳをウェーハから剥がし、直径１．５ｍｍの入口穴と出口穴を生検パンチ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｍｉｌｔｅｘ、ペンシルベニア州、米国）で打ち抜いた。酸素プラズマ処理の直後に、ＰＤＭＳ層を１ｍｍ厚のスライドガラス（Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．Ｋ．Ｇ．、ドイツ）に固定した。最後に、チップに対して２００℃で５時間にわたる２回目の焼成を行って、チャネルを疎水性にした。
【0100】
液滴画像化および分析：液滴は、透過および落射蛍光顕微鏡で分析した。７０×５０×１ｍｍのスライドガラス（Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ，ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．Ｋ．Ｇ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、３ｍＬのＮｏｖｅｃ１７２０（３Ｍ）を注ぎ、加熱プレートで１分間１００℃にて焼成することにより疎水性にした。硬質球体スペーサーとして使用した１０μｍポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州、米国）をガラススライドにスポッティングし、蒸発のために１００℃で静置した。エマルジョンをガラススライドに堆積させ、Ｎｏｖｅｃ１７２０で処理した２２×２２ｍｍのカバースリップ（ＶＷＲ）で覆った。チャンバーをエポキシ接着剤（Ｓａｄｅｒ）で密封し、電動ＸＹステージ（Ｎｉｋｏｎ）、カメラＮｉｋｏｎ ＤＳ－Ｑｉ２、およびＣｏｏｌＬｅｄ ｐＥ－４０００照明光源、およびアポクロマート２０×（Ｎ．Ａ．０．７５、ＷＤ１．０）対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉを使用して画像を取得した。オープンソースのＩｍａｇｅＪソフトウェアで疑似カラー画像を生成した。
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａソフトウェア（Ｗｏｌｆｒａｍ）を使用し、蛍光バーコードを使用して画像を分析し、様々な試料集団を分類した。各試料の陰性および陽性液滴の数は、ポアソン統計により決定付けられる標的酵素濃度の算出を可能にする。
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａソフトウェア（Ｗｏｌｆｒａｍ）を使用し、蛍光バーコードを使用して画像を分析し、様々な試料集団を分類した。各試料の陰性および陽性液滴の数は、ポアソン統計により決定付けられる標的酵素濃度の算出を可能にする。
【0101】
結果
ニッキング酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩによる原理の証明
ここで使用される等温シグナル増幅系は、３種のコードデオキシリボオリゴヌクレオチドに基づく。第１のものは、自己触媒鋳型（配列Ｃｂｏ１２－２ＰＳ３ 配列番号７３）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-））およびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）を使用してトリガー鎖の指数複製を触媒する二重リピート配列である。第２の疑似鋳型モジュール（配列ｐＴＢｏＴ５ＰＳ３ 配列番号７４）は、トリガー鎖の一部を不活性化し、触媒ドレインとして振る舞い、リーク反応により引き起こされる非特異的標的非依存性増幅を回避する。第３のリポートモジュール（配列：ｒＴＢｏ－２ＢｓｍＩＣｙ５ 配列番号７５）は、前蛍光性ヘアピン型プローブであり、重合時に蛍光シグナルを発生させるトリガーにハイブリダイズする。こうした酵素成分および核酸成分が一緒になって、様々な超高感度バイオセンシング応用で使用することができる双安定分子回路が作出される。
ニッキング酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩによる原理の証明
ここで使用される等温シグナル増幅系は、３種のコードデオキシリボオリゴヌクレオチドに基づく。第１のものは、自己触媒鋳型（配列Ｃｂｏ１２－２ＰＳ３ 配列番号７３）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-））およびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）を使用してトリガー鎖の指数複製を触媒する二重リピート配列である。第２の疑似鋳型モジュール（配列ｐＴＢｏＴ５ＰＳ３ 配列番号７４）は、トリガー鎖の一部を不活性化し、触媒ドレインとして振る舞い、リーク反応により引き起こされる非特異的標的非依存性増幅を回避する。第３のリポートモジュール（配列：ｒＴＢｏ－２ＢｓｍＩＣｙ５ 配列番号７５）は、前蛍光性ヘアピン型プローブであり、重合時に蛍光シグナルを発生させるトリガーにハイブリダイズする。こうした酵素成分および核酸成分が一緒になって、様々な超高感度バイオセンシング応用で使用することができる双安定分子回路が作出される。
【0102】
原理の証明として、本発明者らは、ニッキング酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの活性を双安定増幅スイッチに接続するための第１の感知モジュール（配列：ｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２ 配列番号７６）を設計した（図１５ａ）。ヘアピン型鋳型は、ニック認識および切断サイトのすぐ上流にある、トリガー鎖に相補的な５’出力部位を含む。３’端部は自己相補的であり、ポリメラーゼにより鋳型に沿って伸長をプライミングする。二重鎖は、その二本鎖形態では、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩによりニックされ、トリガーを放出することができる。重合／ニッキングの触媒サイクルは、疑似鋳型により設定された濃度閾値を超えた後で増幅を開始するトリガー鎖の線形産生に結び付く。本発明者らは、漸増濃度のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下で反応をリアルタイムにモニターした。予想通り、濃度が高いほど、トリガーの産生が速くなるため、増幅が早くなる。バルクにおけるこの手法の感度は約５ｍｕ／ｍｌ（１ミリリットル当たりのミリ単位）であり、これは、前蛍光プローブの伝統的な切断アッセイを使用する場合よりも３桁低い。
【0103】
９種の酵素に対して実証された多用途性
こうした結果に基づき、本発明者らは、他のＤＮＡ関連酵素の超高感度検出のための様々な感知戦略を設計した。目的の酵素活性を特異的トリガー鎖の生成に関連させる反応カスケードを設計する。ヌクレアーゼの検出は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの構成的存在下でのトリガー産生の遮断に基づいていた。ＲＮＡｓｅＨ（ＲＮＡｓｅＨ２）およびＡＰ－エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ－１）は、感知鋳型のステム構造に、それぞれリボヌクレオチドおよび脱塩基部位（ＡＰ）を導入することにより検出した（図１５ａおよび１５ｂ、配列：ｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２（ｒＧ）配列番号７７、およびｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２ＡＰ 配列番号７８）。こうした設計では、突出３’ポリチミジル酸（polythimidylate）伸長を有する未処理基質の重合が遮断される。対応する酵素によるこうした基質のプロセシングは、ステムのエンドヌクレアーゼ切断を誘導し、重合／ニッキングサイクルによるトリガーの産生を回復させる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、ＡＰ部位をデオキシリボウリジン部分（配列：ｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２ＵＤＧ（２） 配列番号７９）で置換し、酵素カスケードにもう１つの段階を追加することにより検出した（図１５ｃ）。グリコシラーゼによるウラシル塩基の切除は、ＡＰＥ－１によりさらに切開される脱塩基部位を導入し、最終的にトリガーの産生を再活性化する。
こうした結果に基づき、本発明者らは、他のＤＮＡ関連酵素の超高感度検出のための様々な感知戦略を設計した。目的の酵素活性を特異的トリガー鎖の生成に関連させる反応カスケードを設計する。ヌクレアーゼの検出は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの構成的存在下でのトリガー産生の遮断に基づいていた。ＲＮＡｓｅＨ（ＲＮＡｓｅＨ２）およびＡＰ－エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ－１）は、感知鋳型のステム構造に、それぞれリボヌクレオチドおよび脱塩基部位（ＡＰ）を導入することにより検出した（図１５ａおよび１５ｂ、配列：ｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２（ｒＧ）配列番号７７、およびｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２ＡＰ 配列番号７８）。こうした設計では、突出３’ポリチミジル酸（polythimidylate）伸長を有する未処理基質の重合が遮断される。対応する酵素によるこうした基質のプロセシングは、ステムのエンドヌクレアーゼ切断を誘導し、重合／ニッキングサイクルによるトリガーの産生を回復させる。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、ＡＰ部位をデオキシリボウリジン部分（配列：ｎｂｉｔｏＢｏ－２＋２ＵＤＧ（２） 配列番号７９）で置換し、酵素カスケードにもう１つの段階を追加することにより検出した（図１５ｃ）。グリコシラーゼによるウラシル塩基の切除は、ＡＰＥ－１によりさらに切開される脱塩基部位を導入し、最終的にトリガーの産生を再活性化する。
【0104】
本発明者らは、別の単機能性ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ、アルキルアデニングリコシラーゼ（ＡＡＧ、図１５ｄ）を検出するための異なる戦略を試験した。イノシン残基（ヒポキサンチン核酸塩基、Ｈｘ）が、短鎖二本鎖オリゴヌクレオチドに組み込まれている（配列：Ａａｇｔｏｒｎａ－ｔｏｐ／Ａａｇｔｏｒｎａ－ｂｏｔ、配列番号８０／配列番号８１）。ＡＡＧによる切除時に、ＡＰ部位はＡＰＥ－１により切開される。ニックされた鎖の５’部分は解離して、第２のＮＢＩ依存性鋳型の入力部分に結合することができ、その出力はトリガー鎖である（配列：ｄｎａｔｏＢｏ－２＋２Ｐ配列番号８２）。
制限酵素の検出は、感知鋳型の５’部分に認識部位を追加することにより達成した（図１５ｅ）。標的酵素の非存在下では、重合／ニッキングの無益サイクルは、３’伸長部（制限部位を含む）を有する非生産的なトリガーを生成する。標的酵素の存在下では、二本鎖制限部位は、切断され、感知鋳型から伸長部が放出され、それによりひいてはトリガーが産生される。
制限酵素の検出は、感知鋳型の５’部分に認識部位を追加することにより達成した（図１５ｅ）。標的酵素の非存在下では、重合／ニッキングの無益サイクルは、３’伸長部（制限部位を含む）を有する非生産的なトリガーを生成する。標的酵素の存在下では、二本鎖制限部位は、切断され、感知鋳型から伸長部が放出され、それによりひいてはトリガーが産生される。
【0105】
ＲＮＡ鎖の３’端部へのポリアデニンテールの付加を触媒するポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）などの特定の活性を有するポリメラーゼも、この手法を使用して検出することができる（図１５ｆ）。ＲＮＡ鎖（配列：ｒｎａ 配列番号８４）のポリアデニル化後、ポリ（Ａ）テールは、感知鋳型（配列：ｐｏｌｙＡｔｏＢｏ－２＋２Ｐ 配列番号８５）のポリ（Ｔ）入力部位に結合し、それによりひいてはトリガーが出力される。
また、本発明者らは、この戦略をＤＮＡリガーゼの検出に適応させた（図１５ｄ）。感知モジュールは、３種の鋳型：５’リン酸部分が修飾されたヘアピン型鋳型（配列：ｌｉｇ２Ｐ 配列番号８７）；５’側が活性化因子配列に相補的な線状鋳型（配列：ｌｉｇ１ｔｏＢｏ 配列番号８６）；他の鎖の両方に部分的にハイブリダイズするスプリント鎖（splint strand）（配列：ｌｉｇ３Ｐ 配列番号８８）で構成されている。得られる三重鎖はニックを含み、ニックは、ＡＴＰをエネルギー源とするＴ４ ＤＮＡリガーゼにより封鎖することができる。結果として、スプリント鎖は、ＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換され、活性化因子鎖の機能的供給源を回復させる。ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）の検出は、非リン酸化形態のヘアピン型鋳型（ｓｅｑ：ｌｉｇ２ｎｏＰ 配列番号８９）を使用することにより可能になった。ライゲーションに必要なそのリン酸化後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはニックを封鎖し、活性化因子鎖の産生をレスキューする。
また、本発明者らは、この戦略をＤＮＡリガーゼの検出に適応させた（図１５ｄ）。感知モジュールは、３種の鋳型：５’リン酸部分が修飾されたヘアピン型鋳型（配列：ｌｉｇ２Ｐ 配列番号８７）；５’側が活性化因子配列に相補的な線状鋳型（配列：ｌｉｇ１ｔｏＢｏ 配列番号８６）；他の鎖の両方に部分的にハイブリダイズするスプリント鎖（splint strand）（配列：ｌｉｇ３Ｐ 配列番号８８）で構成されている。得られる三重鎖はニックを含み、ニックは、ＡＴＰをエネルギー源とするＴ４ ＤＮＡリガーゼにより封鎖することができる。結果として、スプリント鎖は、ＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換され、活性化因子鎖の機能的供給源を回復させる。ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）の検出は、非リン酸化形態のヘアピン型鋳型（ｓｅｑ：ｌｉｇ２ｎｏＰ 配列番号８９）を使用することにより可能になった。ライゲーションに必要なそのリン酸化後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはニックを封鎖し、活性化因子鎖の産生をレスキューする。
【0106】
本発明者らは、コグネート設計（cognate design）を使用して、バルク溶液中の各酵素の検出を別々に実施した。図１５は、リアルタイムで記録された蛍光時間トレースから抽出された増幅時間（Ｃｑ）を示す。各酵素について、本発明者らは、Ｃｑと標的酵素の濃度との間の反比例的関係性を、μＵ～ｍＵ／ｍＬの低濃度範囲まで観察した。これは、多用途ＤＮＡ増幅機序を使用した酵素活性の特異的および高感度な検出を実証するものである。
【0107】
単一酵素のデジタル計数
この手法の感度をさらに実証するため、本発明者らは、マイクロ流体液滴に単離された単一酵素のデジタル計数を実施した。バルクアッセイに関しては、原理の証明は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの検出回路で実現させた。様々な濃度のＮＢＩでスパイクした２系列の試料を準備し、フローフォーカシングマイクロ流体チップを使用してピコリットルサイズの液滴（約０．９５ｐＬ）に個々に乳化した。液滴を４８℃で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で分析した（図１６ａ）。図１６ｂ（上段、左パネル）は、スパイクされたＮＢＩ濃度と、ポアソンの法則から算出された測定濃度との間の線形相関性を示す（Ｒ2＞０．９９）。図１６ｂは、ＲＮＡｓｅＨ２、ＡＰＥ－１、ＵＤＧ、ＢｓｍＡＩ、ＰＡＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ ＰＮＫを含む、他の酵素のデジタル液滴アッセイの結果を示す。同様に、スパイクイン濃度と測定濃度との間の関係性が比例関係であることは、この手法が、こうした酵素のデジタル計数に成功したことを証明している。
この手法の感度をさらに実証するため、本発明者らは、マイクロ流体液滴に単離された単一酵素のデジタル計数を実施した。バルクアッセイに関しては、原理の証明は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの検出回路で実現させた。様々な濃度のＮＢＩでスパイクした２系列の試料を準備し、フローフォーカシングマイクロ流体チップを使用してピコリットルサイズの液滴（約０．９５ｐＬ）に個々に乳化した。液滴を４８℃で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で分析した（図１６ａ）。図１６ｂ（上段、左パネル）は、スパイクされたＮＢＩ濃度と、ポアソンの法則から算出された測定濃度との間の線形相関性を示す（Ｒ2＞０．９９）。図１６ｂは、ＲＮＡｓｅＨ２、ＡＰＥ－１、ＵＤＧ、ＢｓｍＡＩ、ＰＡＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ ＰＮＫを含む、他の酵素のデジタル液滴アッセイの結果を示す。同様に、スパイクイン濃度と測定濃度との間の関係性が比例関係であることは、この手法が、こうした酵素のデジタル計数に成功したことを証明している。
【0108】
より大きな液滴（７．２ｐＬ）を使用して、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩのデジタル検出を実施した（図１７）。小さな液滴と比較して、非常に類似した濃度が算出された。スパイク濃度と標的の測定濃度との比例関係は、異なる液滴サイズで得られた結果が一貫していることと相まって、活性酵素の直接的な絶対的定量化を明確に実証する。
【0109】
（実施例５）
マイクロＲＮＡのマルチプレックス検出
物質：ＨＰＬＣで精製したオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｍｅｒｓまたはＥｕｒｏｆｉｎｓから購入し、長期保管のために１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ ｐＨ７．５に１００μＭで再懸濁した。鋳型は、上記の実施例１に記載のプロトコールに従って設計した。鋳型配列ａＴ、ｐＴ、ｒＴ、およびｋＴは、３つの５’ホスホロチオエート骨格修飾を付加することにより、ｔｔＲｅｃＪの５’－＞３’エキソヌクレアーゼ活性から保護した。鋳型ａＴ、ｐＴ、ｃＴ、およびｋＴは、３’リン酸部分を追加することにより、望ましくない重合を遮断した。ａＴは、リーキー反応により産生されるシグナル鎖のｐＴによる非活性化を促進するために、対応する入力（αまたはβ）の最後の１０塩基にのみハイブリダイズするように設計した。ｋＴは、シグナル鎖の競合的結合を低減するために、同じ短縮入力結合部位を提示する。これにより、標的により誘発される増幅前にｋＴが非特異的に活性化されることが防止される。表５には、このアッセイ全体で使用したすべての配列が要約されている（配列番号１０４、１０６、１０８、および１０９は、それぞれ、配列番号５４、５５、５６、および５７としても引用されている）。
マイクロＲＮＡのマルチプレックス検出
物質：ＨＰＬＣで精製したオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｍｅｒｓまたはＥｕｒｏｆｉｎｓから購入し、長期保管のために１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ ｐＨ７．５に１００μＭで再懸濁した。鋳型は、上記の実施例１に記載のプロトコールに従って設計した。鋳型配列ａＴ、ｐＴ、ｒＴ、およびｋＴは、３つの５’ホスホロチオエート骨格修飾を付加することにより、ｔｔＲｅｃＪの５’－＞３’エキソヌクレアーゼ活性から保護した。鋳型ａＴ、ｐＴ、ｃＴ、およびｋＴは、３’リン酸部分を追加することにより、望ましくない重合を遮断した。ａＴは、リーキー反応により産生されるシグナル鎖のｐＴによる非活性化を促進するために、対応する入力（αまたはβ）の最後の１０塩基にのみハイブリダイズするように設計した。ｋＴは、シグナル鎖の競合的結合を低減するために、同じ短縮入力結合部位を提示する。これにより、標的により誘発される増幅前にｋＴが非特異的に活性化されることが防止される。表５には、このアッセイ全体で使用したすべての配列が要約されている（配列番号１０４、１０６、１０８、および１０９は、それぞれ、配列番号５４、５５、５６、および５７としても引用されている）。
【0110】
【表6】
【0111】
ニッキング酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩおよびＮｔ．ｂｓｔＮＢＩ、制限酵素ＢｓｍＩ、ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ-）、ＢＳＡ、ならびにｄＮＴＰは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から得た。サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＪエキソヌクレアーゼは、以前に発表されたプロトコールに従って自家産生した（Yamagata et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29 (22), 4617-4624）。塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩、ネトロプシン、ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４は、Ｍｅｒｃｋ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。
【0112】
反応混合物アセンブリ：すべての反応混合物を、２００μＬのＰＣＲチューブに４℃でアセンブリした。鋳型および酵素を、まず反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．９、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、各５０μＭのｄＮＴＰ、０．１％（質量／容積）ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０４、２μＭネトロプシン、および２００ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）と混合した。最適化された鋳型濃度は以下の通りである：ａＴα＝５０ｎＭ、ａＴβ、５０ｎＭ、ｐＴα＝１５ｎＭ、ｐＴβ＝１１ｎＭ、ｒＴα＝４０ｎＭ、ｒＴβ＝４０ｎＭ、ｃＴ（各）＝０．５ｎＭ、αｋβ＝１ｎＭ、およびβｋα＝２．５ｎＭ。酵素濃度は、Ｎｂ．ＢｓｍＩ＝３００ｕ／ｍＬ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ＝１０ｕ／ｍＬ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-）＝６０ｕ／ｍＬ、ＢｓｍＩ＝６０ｕ／ｍＬ、ｔｔＲｅｃＪ＝２３ｎＭだった。ホモジナイズした後、試料をマイクロＲＮＡ溶液でスパイクし、低結合ＤＮＡチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液で系列希釈した。試料（バルクまたはエマルジョン）は、ｑＰＣＲ機械ＣＦＸ９６ ｔｏｕｃｈ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で５０℃にてインキュベートした。
【0113】
マイクロ流体液滴の生成：２インレットフローフォーカシングデバイスを、標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して準備した。手短に言えば、４インチのシリコンウェーハをＳＵ－８フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏ－Ｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）でコーティングし、ＵＶ露光時に網状にすることによりマイクロ流体金型を得た。イソプロパノールで金型を注意深く洗浄した後、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ ＰＤＭＳ樹脂（４０ｇ）／硬化剤（４ｇ）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１０：１混合物を金型に注ぎ、真空下で脱気し、７０℃で２時間焼成した。ＰＤＭＳスラブを金型から外して積み上げ、直径１．５ｍｍの生検パンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｍｉｌｔｅｘ）で入口および出口を打ち抜いた。ＰＤＭＳスラブを、酸素プラズマ活性化直後に１ｍｍ厚のスライドガラス（Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ）に固定した。チップに対して２００℃で５時間にわたる焼成を行って、チャネルを疎水性にした。－圧力ポンプコントローラーＭＦＣＳ－ＥＺ（Ｆｌｕｉｇｅｎｔ）および内径２００μｍのＰＴＦＥチューブ（Ｃ．Ｉ．Ｌ．）を使用して、水性試料および連続相（フッ素化油Ｎｏｖｅｃ７５００、３Ｍ＋１％（ｗ／ｗ）ｆｌｕｏｓｕｒｆ、Ｅｍｕｌｓｅｏ）をチップ上で混合することにより、単分散油中水型液滴を生成した。
【0114】
液滴の画像化および分析：インキュベーション後、エマルジョンを顕微鏡で画像化した。液滴圧縮を回避するために、液滴の単層を、１０μｍのポリスチレン粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で離間された２枚のガラススライド（厚さ１ｍｍの底部スライド、Ｐａｕｌ Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、厚さ０．１７ｍｍの上部スライド、ＶＷＲ）の間に挟んだ。チャンバーをエポキシ接着剤（Ｓａｄｅｒ）で密封した。電動ＸＹステージ（Ｎｉｋｏｎ）、カメラＮｉｋｏｎ ＤＳ－Ｑｉ２、アポクロマート１０×対物レンズ（Ｎ．Ａ．０．４５、Ｎｉｋｏｎ）、およびＣｏｏｌＬｅｄ ｐＥ－４０００照明光源を備えた落射蛍光顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉで画像を取得した。合成画像は、オープンソースソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて生成した。液滴は、上記の実施例に記載の手順に従って、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａソフトウェア（Ｗｏｌｆｒａｍ）を使用して分析した。マイクロＲＮＡの濃度は、以下の式で算出される。
【0115】
【数2】
【0116】
結果
キラー鋳型カウンタースイッチ交差活性化（Killer templates counter switch cross activation）
本発明者らは、２つの並列双安定スイッチを四安定生化学回路に変換した。理論的根拠は、４つの代替状態の各々が、各標的の存在／非存在に関連付けられる４つの考え得る化学的「状態」（０：０、０：１、１：０、および１：１）に起因し得るため、各々の場合において適切な分類が可能であるということである。その目標のために、本発明者らは、２つのスイッチを双方向に接続する交差阻害性鋳型（キラー鋳型、ｋＴ）を設計した（図１８）。コグネート入力（cognate input）（αまたはβ）により活性化されると、ｋＴは、逆スイッチの疑似鋳型を産生し、それにより増幅の交差阻害剤として作用する。系が４つの状態を可能にするためには、阻害剤は、状態１：０および０：１（２つのスイッチの一方のみがオンである）を安定化するのに十分な程度に強力であるが、状態１：１（両スイッチがオンである）の存在を可能にするほど強力過ぎないことが必要である。したがって、本発明者らは、キラー鋳型の強度に対する不活性化５’テールの長さにより決定される、内因性ｐＴの長さの効果を評価した。図１９は、５ｎＭのｃｅｌ－ｍｉｒ－３９および種々のｐＴβを産生する漸増濃度のαｋβにより誘発されるαスイッチの存在下における単純なβスイッチの増幅反応を示す。系は、αｋβの非存在下では、約１００分間でβスイッチが自発的にオンになるように設定されている（図２０）。
キラー鋳型カウンタースイッチ交差活性化（Killer templates counter switch cross activation）
本発明者らは、２つの並列双安定スイッチを四安定生化学回路に変換した。理論的根拠は、４つの代替状態の各々が、各標的の存在／非存在に関連付けられる４つの考え得る化学的「状態」（０：０、０：１、１：０、および１：１）に起因し得るため、各々の場合において適切な分類が可能であるということである。その目標のために、本発明者らは、２つのスイッチを双方向に接続する交差阻害性鋳型（キラー鋳型、ｋＴ）を設計した（図１８）。コグネート入力（cognate input）（αまたはβ）により活性化されると、ｋＴは、逆スイッチの疑似鋳型を産生し、それにより増幅の交差阻害剤として作用する。系が４つの状態を可能にするためには、阻害剤は、状態１：０および０：１（２つのスイッチの一方のみがオンである）を安定化するのに十分な程度に強力であるが、状態１：１（両スイッチがオンである）の存在を可能にするほど強力過ぎないことが必要である。したがって、本発明者らは、キラー鋳型の強度に対する不活性化５’テールの長さにより決定される、内因性ｐＴの長さの効果を評価した。図１９は、５ｎＭのｃｅｌ－ｍｉｒ－３９および種々のｐＴβを産生する漸増濃度のαｋβにより誘発されるαスイッチの存在下における単純なβスイッチの増幅反応を示す。系は、αｋβの非存在下では、約１００分間でβスイッチが自発的にオンになるように設定されている（図２０）。
【0117】
本発明者らは、ｋＴの濃度を増加させると、予想通り、増幅前の遅延が増長されたことを観察した。加えて、より短いｐＴを産生するαｋβがより強力な阻害剤であることは明らかである：αスイッチの増幅を完全に防止するには、１００ｐＭ未満のｋＴ αｋβＡ１（得られるｐＴβは、α鎖の３’末端に１つのチミジンヌクレオチドのみを追加することになることを意味する）が必要であるが、αｋβＡ４で同じ効果を観察するには、１００倍よりも多くが必要とされる（図１８ｃ）。興味深いことに、αｋβＡ５では、試験した濃度範囲で阻害は観察されなかった。同様に、αｋβＡ０（αから触媒伸長活性のない相補鎖を産生する）は、βスイッチの増幅に効果を示さず、疑似鋳型の触媒機序が確認される。
【0118】
こうした測定に続いて、本発明者らは、濃度を調整することにより阻害強度を容易に調節することができる、４ヌクレオチド伸長部を有するｐＴを産生するｋＴを選択した。
次に、本発明者らは、それらのコグネート標的（cognate target）に対する感度を保持しながら、αスイッチとβスイッチとの間の交差反応性を抑制するｋＴの能力を評価した。２つのマイクロＲＮＡ感知回路を、種々の濃度のαｋβおよびβｋαの両方の存在下の０または１０ｐＭのｍｉｒ９２ａ（αスイッチ）およびｌｅｔ７ａ（βスイッチ）でスパイクする（図２１）。図２１ｂおよび２１ｃは、両スイッチの増幅時間を示す。こうした実験条件では、２．５～１０ｎＭのβｋαおよび０．６３～１．３ｎＭのαｋβで四安定性が達成される。この濃度範囲のｋＴでは、標的の非存在は、増幅の非存在をもたらし（Ｃｑ＞１０００分間、状態０：０）；１種のマイクロＲＮＡ標的のみが存在する場合、対応するスイッチのみが蛍光シグナルを増幅し（Ｃｑ 約２００分間、状態１：０および０：１）；最後に、両マイクロＲＮＡが注入されると、２つのスイッチがオンになった（状態１：１）。
次に、本発明者らは、それらのコグネート標的（cognate target）に対する感度を保持しながら、αスイッチとβスイッチとの間の交差反応性を抑制するｋＴの能力を評価した。２つのマイクロＲＮＡ感知回路を、種々の濃度のαｋβおよびβｋαの両方の存在下の０または１０ｐＭのｍｉｒ９２ａ（αスイッチ）およびｌｅｔ７ａ（βスイッチ）でスパイクする（図２１）。図２１ｂおよび２１ｃは、両スイッチの増幅時間を示す。こうした実験条件では、２．５～１０ｎＭのβｋαおよび０．６３～１．３ｎＭのαｋβで四安定性が達成される。この濃度範囲のｋＴでは、標的の非存在は、増幅の非存在をもたらし（Ｃｑ＞１０００分間、状態０：０）；１種のマイクロＲＮＡ標的のみが存在する場合、対応するスイッチのみが蛍光シグナルを増幅し（Ｃｑ 約２００分間、状態１：０および０：１）；最後に、両マイクロＲＮＡが注入されると、２つのスイッチがオンになった（状態１：１）。
【0119】
本発明者は、他のマイクロＲＮＡを検出するための本戦略の一般化を試験した。このプログラム可能なＤＮＡ回路はモジュール式設計であるため、原理的には、コンバーター鋳型入力ドメインのみを適応させることにより、既知の３’－ヒドロキシル末端を有する任意の核酸鎖（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の検出が可能になる。デュプレックス回路（つまり、ａＴ、ｐＴ、ｒＴ、およびｋＴの両方）配列の残りおよび濃度はそのままである。こうした実験では、本発明者らは、５種のマイクロＲＮＡを使用した：ｈａｓ－ｍｉｒ－９２ａ－５ｐ、ｃｅｌ－ｍｉｒ－３９、ｈｓａ－ｍｉｒ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ（それぞれ、ｍｉｒ９２ａ、ｍｉｒ３９、ｍｉｒ７、ｌｅｔ７ａ、およびｌｅｔ７ｅと略記される）。図２１ｅには、０または１０ｐＭのマイクロＲＮＡ標的を検出するための、溶液中での７つの異なるデュプレックス実験の増幅時間（Ｃｑ）が示されている。予想通り、系は、各々の場合で四安定生化学回路として振る舞う。重要なことには、各スイッチの増幅時間は、標的配列に依存しない（Ｃｑα＝１７８±４４分間、Ｃｑβ＝１４９±１９分間）。したがって、これにより、交差阻害回路が望ましくない交差反応性を抑制し、プログラム可能な標的検出を可能にすることが確認される。
【0120】
マイクロＲＮＡのデュプレックスデジタル検出。
本発明者らは、最終的に、このマルチプレックスアッセイを、液滴マイクロ流体を使用するデジタル読出しに移行させた（図２２）。試料混合物を、フローフォーカシングマイクロ流体デバイスを使用して数千個のピコリットルサイズ液滴に分配する。その結果、標的マイクロＲＮＡは、油中水型液滴内にランダムに分布し、ポアソン分布に従って占有する。液滴蛍光が、初期含有量に応じて緑色、赤色、またはオレンジ色のいずれかに変わることを可能にするインキュベーション後、液滴を落射蛍光顕微鏡で画像化する。液滴サイズおよび各色の陽性液滴の割合を知ることにより、元の試料の２つのマイクロＲＮＡの濃度を算出した。本発明者らは、四安定回路が、シングルプレックスアッセイ（図２４）と比較して、ブランクの検出（図２３）および限界に影響を及ぼさないことを実証した。より良好に実証するため、本発明者らは、０または３ｐＭのマイクロＲＮＡ ｍｉｒ３９（αスイッチ）およびｌｅｔ７ａ（βスイッチ）でスパイクした４つの試料を調製した。各試料を、２種の蛍光デキストランバーコードの組合せでバーコード化し、自作の試料交換器を使用して連続乳化する。インキュベーション後、液滴を蛍光顕微鏡により画像化する（図２２ｂ～２２ｄ）。少数の偽陽性事象が記録されたが、１２％±６％誤差内（これは、部分的に、標的の系列希釈による濃度不確実性によるものであり得る）で２種のマイクロＲＮＡの正確な定量化が達成された。この技法の再現性を評価するため、本発明者らは、異なる組成（種々のマイクロＲＮＡの種々の濃度）の試料について、この実験を繰り返した。１５個の試料について、本発明者らは、スパイクインマイクロＲＮＡの予想濃度と測定濃度との間に良好な相関関係があることを観察した（図２２ｄ）。最後に、本発明者らは、二重陽性液滴（緑色および赤色両方の液滴）の割合が、２つの標的のポアソン分布から予想される割合に相当することを確認した（Ｆo＝Ｆg．Ｆr、式中Ｆo、Ｆg、およびＦrは、オレンジ色、緑色、および赤色の液滴の割合である）。
本発明者らは、最終的に、このマルチプレックスアッセイを、液滴マイクロ流体を使用するデジタル読出しに移行させた（図２２）。試料混合物を、フローフォーカシングマイクロ流体デバイスを使用して数千個のピコリットルサイズ液滴に分配する。その結果、標的マイクロＲＮＡは、油中水型液滴内にランダムに分布し、ポアソン分布に従って占有する。液滴蛍光が、初期含有量に応じて緑色、赤色、またはオレンジ色のいずれかに変わることを可能にするインキュベーション後、液滴を落射蛍光顕微鏡で画像化する。液滴サイズおよび各色の陽性液滴の割合を知ることにより、元の試料の２つのマイクロＲＮＡの濃度を算出した。本発明者らは、四安定回路が、シングルプレックスアッセイ（図２４）と比較して、ブランクの検出（図２３）および限界に影響を及ぼさないことを実証した。より良好に実証するため、本発明者らは、０または３ｐＭのマイクロＲＮＡ ｍｉｒ３９（αスイッチ）およびｌｅｔ７ａ（βスイッチ）でスパイクした４つの試料を調製した。各試料を、２種の蛍光デキストランバーコードの組合せでバーコード化し、自作の試料交換器を使用して連続乳化する。インキュベーション後、液滴を蛍光顕微鏡により画像化する（図２２ｂ～２２ｄ）。少数の偽陽性事象が記録されたが、１２％±６％誤差内（これは、部分的に、標的の系列希釈による濃度不確実性によるものであり得る）で２種のマイクロＲＮＡの正確な定量化が達成された。この技法の再現性を評価するため、本発明者らは、異なる組成（種々のマイクロＲＮＡの種々の濃度）の試料について、この実験を繰り返した。１５個の試料について、本発明者らは、スパイクインマイクロＲＮＡの予想濃度と測定濃度との間に良好な相関関係があることを観察した（図２２ｄ）。最後に、本発明者らは、二重陽性液滴（緑色および赤色両方の液滴）の割合が、２つの標的のポアソン分布から予想される割合に相当することを確認した（Ｆo＝Ｆg．Ｆr、式中Ｆo、Ｆg、およびＦrは、オレンジ色、緑色、および赤色の液滴の割合である）。
【0121】
結論
本発明者らは、ＭＰベースの等温増幅戦略が、バックグラウンド増幅を完全に消失する能力を有することを以前に実証した。本発明では、本発明者らは、この特徴を活用して、アナログ読出し（リアルタイム蛍光モニタリング）をデジタル方式（エンドポイント区画分析）へと変換する。したがって、本発明の方法は、標的生体分子、特に酵素および核酸、より具体的にはマイクロＲＮＡの高感度で特異的な定量的測定を可能にする。１段階手順に基づき、本発明の方法は、試料操作を低減し、したがって持ち越し夾雑のリスクを低減する。系が標的配列複製ではなくシグナル増幅機序に依存するという事実により、夾雑の問題はさらにより低減される。
多用途ＤＮＡベース回路は、対応する変換鋳型を設計することにより、任意の目的の生体分子に流用することができる。マイクロＲＮＡに関しては、すべての他の回路部分がすべてのマイクロＲＮＡで共通しているため、プライマーおよびプローブの設計が不要になり、アッセイコストが低減されることに留意されたい。
本発明者らは、ＭＰベースの等温増幅戦略が、バックグラウンド増幅を完全に消失する能力を有することを以前に実証した。本発明では、本発明者らは、この特徴を活用して、アナログ読出し（リアルタイム蛍光モニタリング）をデジタル方式（エンドポイント区画分析）へと変換する。したがって、本発明の方法は、標的生体分子、特に酵素および核酸、より具体的にはマイクロＲＮＡの高感度で特異的な定量的測定を可能にする。１段階手順に基づき、本発明の方法は、試料操作を低減し、したがって持ち越し夾雑のリスクを低減する。系が標的配列複製ではなくシグナル増幅機序に依存するという事実により、夾雑の問題はさらにより低減される。
多用途ＤＮＡベース回路は、対応する変換鋳型を設計することにより、任意の目的の生体分子に流用することができる。マイクロＲＮＡに関しては、すべての他の回路部分がすべてのマイクロＲＮＡで共通しているため、プライマーおよびプローブの設計が不要になり、アッセイコストが低減されることに留意されたい。
【0122】
さらに、上記の結果は、ＤＮＡ回路アーキテクチャが、酵素、特に幅広い範囲の活性を有するＤＮＡ関連酵素（ヌクレアーゼ、ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびキナーゼ）の検出に適応され得ることを実証している。本発明の感度は、ピコリットルサイズの区画に単離された個々の酵素の直接デジタル計数を可能にする。また、上記方法は、精製プロセス後の活性酵素の定量化のために、および単一酵素レベルでの酵素活性に対する物理的（温度）または化学的処理の効果を決定するために使用することができる。
また、上記の例は、本発明の方法が、検出をより高感度様式でマルチプレックス化することに適応され得ることを実証している。
また、上記の例は、本発明の方法が、検出をより高感度様式でマルチプレックス化することに適応され得ることを実証している。
【0123】
参照文献
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】