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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-05
(54)【発明の名称】リーダー配列
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220729BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220729BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220729BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20220729BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220729BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220729BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220729BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220729BHJP
C12N 15/74 20060101ALI20220729BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/70 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/74 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021572387
(86)(22)【出願日】2020-06-05
(85)【翻訳文提出日】2022-01-31
(86)【国際出願番号】 GB2020051380
(87)【国際公開番号】W WO2020245611
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】1908155.3
(32)【優先日】2019-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＲＥＸ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508320561
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ウォリック
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ウォーターフィールド，ニコラス アール．
(72)【発明者】
【氏名】ヒーリー，ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ハペシー，アレクシア
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA47
4B065CA48
(57)【要約】
本発明は、フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット（ＰＶＣ）エフェクターリーダー配列の、ペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージするための使用、及びパッケージされたＰＶＣニードル複合体を製造する関連方法を提供する。ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり、リーダー配列及びペイロードは、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別されるエフェクター融合物を形成する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット（ＰＶＣ）エフェクターリーダー配列の、ペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージするための使用であって；前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
前記リーダー配列及び前記ペイロードは、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別されるエフェクター融合物を形成する
使用。
【請求項2】
前記リーダー配列は、ＰＶＣエフェクターのアミノ酸残基１～５０を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記リーダー配列は、配列番号４７～配列番号９２から選択される配列の１つ以上の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項4】
前記ＰＶＣエフェクターは、配列番号１～配列番号４６から選択される１つ以上の配列のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
前記ＰＶＣエフェクターは、配列番号４、配列番号２２、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号４６から選択される配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項6】
前記リーダー配列は、前記ペイロードに共有結合的に、好ましくは、前記ペイロードのＮ末端において融合している、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
ペイロードを含むＰＶＣニードル複合体を製造する方法であって：ａ．ＰＶＣニードル複合体を、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含むエフェクター融合物と接触させることを含み；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｃ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法。
【請求項8】
前記接触を、細胞内で、細胞溶解物中で、又は精製細胞溶解物中で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ペイロードを細胞中に送達するインビトロ及び／又はエクスビボ方法であって：ａ．細胞を、エフェクター融合物を含むＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．前記エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｄ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法。
【請求項10】
有害生物を抑制する方法であって：ａ．有害生物、又は有害生物を含む標的区域を、エフェクター融合物を含むＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．前記エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｄ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法。
【請求項11】
治療方法における使用のためのＰＶＣニードル複合体であって；ａ．前記ＰＶＣニードル複合体は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含むエフェクター融合物を含み；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｃ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
ＰＶＣニードル複合体。
【請求項12】
エフェクター融合物を含むＰＶＣニードル複合体であって；ａ．前記エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｃ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
ＰＶＣニードル複合体。
【請求項13】
ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含むエフェクター融合物であって；ａ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｂ．前記エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
エフェクター融合物。
【請求項14】
単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項15】
前記リーダー配列は、ＰＶＣエフェクターのアミノ酸残基１～５０を含む、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法、使用のためのＰＶＣニードル複合体、ＰＶＣニードル複合体、エフェクター融合物、又は単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項16】
前記リーダー配列は、配列番号４７～配列番号９２から選択される１つ以上の配列と約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７～１５のいずれか一項に記載の方法、使用のためのＰＶＣニードル複合体、ＰＶＣニードル複合体、エフェクター融合物又は単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項17】
前記ＰＶＣエフェクターは、配列番号１～配列番号４６から選択される１つ以上の配列のアミノ酸配列を含む、請求項７～１６のいずれか一項に記載の方法、使用のためのＰＶＣニードル複合体、ＰＶＣニードル複合体、エフェクター融合物又は単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項18】
前記ＰＶＣエフェクターは、配列番号４、配列番号２２、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号４６から選択される配列を含む、請求項７～１７のいずれか一項に記載の方法、使用のためのＰＶＣニードル複合体、ＰＶＣニードル複合体、エフェクター融合物又は単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項19】
前記リーダー配列は、ペイロードに共有結合的に融合している、請求項７～１８のいずれか一項に記載の方法、使用のためのＰＶＣニードル複合体、ＰＶＣニードル複合体、エフェクター融合物又は単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列。
【請求項20】
請求項１４～１９のいずれか一項に記載の単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項21】
請求項２０に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項22】
請求項２０に記載の単離核酸分子、又は請求項２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項23】
哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、及び／又は植物細胞から選択される１つ以上であり；好ましくは、前記細菌細胞は、大腸菌（E.coli）細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項24】
フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項25】
前記フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に結合しているフォトラブダス属（Photorhabdus）ＰＶＣオペロンを含む、請求項２４に記載の宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リーダー配列、及び分子をタンパク質複合体中にパッケージするためのリーダー配列の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
生物学的分子（例えば、ペプチド、タンパク質及び核酸）は、広く適用可能な治療薬としての大きな潜在性を有する。実際、近年、製薬産業について、「小分子」薬物から、より複雑な巨大分子治療薬（別称「生物剤」）に移行する傾向が存在する。このような生物剤としては、タンパク質ベース治療薬（特に抗体、ホルモン、成長因子及びサイトカイン）及び核酸ベース治療薬（例えば、短鎖干渉ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチン及び遺伝子療法）が挙げられる。
【0003】
生物剤市場は、近年顕著に発展している一方、有効な送達系（及びそのような送達系を製造する実施可能な方法）の低い利用可能性は、特に標的が細胞質である場合、そのような生物治療薬の分子標的の多様性を限定している。実際、市販の承認ペプチド治療薬の大多数は、細胞外構成成分、例えば、膜受容体又は分泌分子（例えば、間質腔中に存在する）を標的化することにより作用する。例えば、humira（最も成功した治療モノクローナル抗体）は、細胞外で分泌されるサイトカインＴＮＦαを標的化する。インスリンは、細胞膜上に存在するそのコグネイト受容体に結合することにより作用する（同じことが他のホルモンペプチド治療薬に当てはまる）。
【0004】
同様の課題は農薬産業にも存在し、タンパク質ベース殺有害生物剤は典型的には、有害生物の細胞の細胞外構成成分を標的化するはずの毒素である。例として、バシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）毒素は、膜受容体に結合して毒性効果を発揮するはずの、一般に使用される天然殺有害生物剤である。
【0005】
生物学的分子の細胞質送達の方法は実験室での研究で開発されており、それは一般に、細胞の細胞膜と融合する脂質ビヒクル内の分子を送達してからそのペイロードを細胞質中に出すことを含む。しかしながら、そのような方法は、例えば、それらが分子を細胞に送達する非特異的性質に起因して医薬及び獣医薬における使用が限定される。
【0006】
細菌分泌系は、分子を標的細胞中に分泌する（又はより特定すると「インジェクトする」）その天然能力を考慮して、潜在的な送達系として探索されている。最も研究されたこのような分泌系は、いくつかのグラム陰性細菌に見出される「タンパク質アペンデージ」のＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）である。しかしながら、これらの系の顕著な欠点は、それらが常に細菌膜と会合したままであり、送達系としての実際の細菌細胞（分泌系を含む）の使用を要求することである。したがって、（目的生物剤が過剰発現される場合であっても）細菌から標的細胞にどの分子が移されるかを完全に制御することが困難である。それというのも、それらの分泌系は細菌の細胞質と標的細胞の細胞質との間の連結（又はチャネル）を提供することにより機能し、（宿主に潜在的に有害な）他の構成成分がそれを流動し得るためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
したがって、改善された送達系だけでなく、広範なサイズ及び分子特性を有する分子（ペイロード）と適合性であるそのような系を産生する手段も必要とされる。
【0008】
本発明は、上記課題の１つ以上を解決する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、フォトラブダス属（Photorhabdus）細菌の毒素原性フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット（Virulence Cassette）（ＰＶＣ）エフェクタータンパク質が、これまで未知の「リーダー配列」（又は「リーダーペプチド」）を含み、それが、ＰＶＣエフェクターをいわゆるＰＶＣニードル複合体（例えば、「ナノシリンジ」）中にパッケージ（又は「ロード」）するように機能し、続いてそれがＰＶＣエフェクターを標的細胞に送達し、そこでそれがその毒素原性効果を発揮する（ＰＶＣエフェクターはそのようなナノシリンジのペイロードを表す）という驚くべき知見を前提とする。さらに、本発明者らは、そのようなリーダー配列を実際に利用してそれに結合しているペイロードを、フォトラブダス属（Photorhabdus）の十分に特徴付けされた分子送達系のＰＶＣニードル複合体（及び関連／相同複合体）中にパッケージさせることを指向することができることを見出した。したがって、新たに発見されたリーダー配列は、驚くべきことに、ＰＶＣニードル複合体に分子ペイロード（又は「反応部位」をロードするように機能する。
【0010】
この知見に加え、本発明者らは、「異種」ペイロード（例として、非フォトラブダス属（Photorhabdus）分子）をＰＶＣニードル複合体中に、異種ペイロードのサイズにも分子特性にも起源にも関係なくパッケージ／ロードするためのそのようなリーダー配列についての有利な実際的な有用性を発展させた。
【発明を実施するための形態】
【0011】
第１の態様において、本発明は、フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット（ＰＶＣ）エフェクターリーダー配列の、ペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージするための使用であって；
ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
リーダー配列及びペイロードは、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別されるエフェクター融合物を形成する
使用を提供する。
ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
リーダー配列及びペイロードは、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別されるエフェクター融合物を形成する
使用を提供する。
【0012】
一態様において、本発明の態様は、ペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージするためのＰＶＣエフェクターリーダー配列の使用であって；
ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
リーダー配列及びペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される融合物を形成する
使用を提供する。
ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
リーダー配列及びペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される融合物を形成する
使用を提供する。
【0013】
換言すると、本発明は、一態様において、ペイロードを、ＰＶＣニードル複合体中にＰＶＣエフェクターリーダー配列を用いてパッケージする方法であって、（エフェクター）融合物をＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み、ペイロードは、ポリペプチド、核酸、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；リーダー配列及びペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される（エフェクター）融合物を形成する方法を提供する。
【0014】
用語「融合物」及び「エフェクター融合物」は、リーダー配列及びペイロードにより形成される（及び野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される）（エフェクター）融合物の文脈において、本明細書において互換的に使用される。
【0015】
（リーダー配列の）この使用は、実施例において概説されるとおり、（検出標識でタグ付けされた）エフェクター融合物及びＰＶＣニードル複合体を細胞（例えば、宿主細菌細胞）中で発現させ、そこでエフェクター融合物をＰＶＣニードル複合体中に（リーダー配列を介して）パッケージし、ＰＶＣニードル複合体を単離し、次いでＰＶＣニードル複合体（例えば、その破砕型）内のペイロードの存在又は不存在を検出標識のウェスタンブロット検出を介して検出することにより実証された。ペイロードの存在は、リーダー配列に融合している場合のみ検出されるが、ペイロードがリーダー配列を欠く場合は検出されない。
【0016】
用語「ＰＶＣエフェクターリーダー配列」は、ペイロード（例えば、エフェクター）をＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得、好ましくは、ＰＶＣエフェクターのアミノ酸１～５０、又は開始メチオニンを排除した場合、アミノ酸２～５０であるＰＶＣエフェクターポリペプチドからのリーダー領域（ポリペプチド領域）を意味する。本発明者らは、リーダー配列が多数の同定されたＰＶＣエフェクターポリペプチド配列のアミノ酸１～５０内に包含される（又は本質的にそれからなり得る）ことを実証した。しかしながら、代替長さを有し、ＰＶＣエフェクター内に位置するリーダー配列が包含されることが意図される（例えば、前記リーダー配列がペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得ることを条件とする）。
【0017】
ＰＶＣエフェクターの残りの（非リーダー配列）部分は、本明細書において「エフェクター部分」（例えば、ペイロード）と称される。エフェクター部分は、好ましくは、ＰＶＣエフェクタータンパク質のアミノ酸５１～Ｃ末端を含み、又は本質的にそれからなる。
【0018】
したがって、一実施形態において、ＰＶＣエフェクターリーダー配列は、ＰＶＣエフェクターポリペプチドのアミノ酸１～５０又は２～５０（好ましくは、１～５０）内に包含される。
【0019】
実施形態において、ＰＶＣエフェクターリーダー配列は、ＰＶＣエフェクターポリペプチドのアミノ酸１～５０又は２～５０（好ましくは、１～５０）を含む（又は本質的にそれからなる）。
【0020】
用語「野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質」は、用語「内因性ＰＶＣエフェクタータンパク質」、又は単に「ＰＶＣエフェクタータンパク質」と同義的に使用され、エフェクター部分（例えば、ペイロード、好ましくは、ＰＶＣエフェクタータンパク質のアミノ酸５１～Ｃ末端）と会合している内因性リーダー配列（即ち、所与のＰＶＣエフェクターに対して内因性、好ましくは、ＰＶＣエフェクターのアミノ酸１～５０）を有する（例えば、インタクト）ＰＶＣエフェクター配列を指す。野生型ＰＶＣエフェクターの例は、配列番号１～配列番号４６から選択される１つ以上の配列のアミノ酸配列を含み得る（又は本質的にそれからなり得る）。したがって、本明細書に記載の本発明の融合物／エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される。それというのも、リーダー配列は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質の場合にはそれが融合され得るエフェクター部分に融合していないためである。例として、融合物／エフェクター融合物は、ｈｖｎＡ（遺伝子Ｐｌｕ１６４９）ＰＶＣエフェクタータンパク質のエフェクター部分（例えば、配列番号４６のアミノ酸５１～２９５）に融合している「Ｐｎｆ」ＰＶＣエフェクタータンパク質のリーダー配列（例えば、配列番号７８のリーダー）を含み得るが、Ｐｎｆ ＰＶＣエフェクタータンパク質のエフェクター部分（例えば、配列番号３２のアミノ酸５１～３４０）に融合している「Ｐｎｆ」ＰＶＣエフェクタータンパク質のリーダー配列（例えば、配列番号７８のリーダー）を指すことを意図しない。
【0021】
他方、融合物／エフェクター融合物は、例えば、非エフェクター部分、例えば、非フォトラブダス属（Photorhabdus）タンパク質、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに融合している「Ｐｎｆ」ＰＶＣエフェクタータンパク質のリーダー配列（例えば、配列番号７８のリーダー）を含み得る。したがって、リーダー配列は、広範な、例えば、異種（非野生型）薬剤のＰＶＣニードル複合体中へのパッケージにおいて有用であり、天然エフェクターだけでなく、「非天然」ペイロードも細胞に送達するためのモジュール式の多様な送達系として初めてＰＶＣニードル複合体を使用する可能性を開く。したがって、選択されるペイロードを有するＰＶＣニードル複合体を製造することが可能である。
【0022】
本発明の別の態様は、ペイロードを含むＰＶＣニードル複合体を製造する方法（例えば、換言すると、パッケージされたＰＶＣニードル複合体を製造する方法）であって：
ａ．（例えば、宿主細胞内で）ＰＶＣニードル複合体を、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含むエフェクター融合物と接触させることを含み；
ｂ．ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
ａ．（例えば、宿主細胞内で）ＰＶＣニードル複合体を、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含むエフェクター融合物と接触させることを含み；
ｂ．ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
【0023】
本発明の一態様は、ペイロードを含むＰＶＣニードル複合体を製造する方法（例えば、換言すると、パッケージされたＰＶＣニードル複合体を製造する方法）であって：
ａ．（例えば、宿主細胞内で）ＰＶＣニードル複合体を融合物と接触させ、融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み、リーダー配列及びペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される融合物を形成することを含み；
ｂ．ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）である
方法を提供する。
ａ．（例えば、宿主細胞内で）ＰＶＣニードル複合体を融合物と接触させ、融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み、リーダー配列及びペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される融合物を形成することを含み；
ｂ．ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）である
方法を提供する。
【0024】
一実施形態において、前記接触は、細胞（例えば、細菌宿主細胞）内で、細胞溶解物中で、又は精製細胞溶解物中で（好ましくは、細胞内で）行うことができる。一実施形態において、前記接触は、無細胞発現系内で行うことができる。同様に、本明細書に記載の使用は、細胞（例えば、細菌宿主細胞）内で、細胞溶解物、無細胞発現系中で、又は精製細胞溶解物中で（好ましくは、細胞、より好ましくは、細菌宿主細胞内で）行う（融合物／エフェクター融合物とＰＶＣニードル複合体との間の）接触ステップを含み得る。
【0025】
ＰＶＣニードル複合体をコードするカセット（オペロン）を第１のプロモーターに作動可能に結合させることができ、融合物／エフェクター融合物（ペイロード）をコードする遺伝子を第２の（好ましくは、異なる）プロモーターに作動可能に結合させることができる。一実施形態において、前記第１及び／又は第２のプロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、アラビノース誘導性プロモーター、例えば、ｐＢＡＤ、及び／又はＩＰＴＧ誘導性プロモーター）である。したがって、本発明は、ＰＶＣをコードするオペロンが第１のベクター／プラスミド内に存在し（任意選択で第１のプロモーターに作動可能に結合している）、エフェクター融合物（ペイロードに融合しているリーダー配列）をコードする配列が第２の（好ましくは、異なる）プラスミド内に存在する（任意選択で第２のプロモーターに結合している）発現系を包含する。
【0026】
一実施形態において、ＰＶＣニードル複合体及び／又は（好ましくは、及び）エフェクター融合物は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び／又は哺乳類細胞から選択される１つ以上の宿主中で発現させることができる。好ましい実施形態において、ＰＶＣニードル複合体及びエフェクター融合物は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞から選択される宿主細胞（好ましくは、細菌細胞）中で一緒に発現させることができる。好適な哺乳類細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞及び／又はＣＨＯ細胞が挙げられる。
【0027】
ＰＶＣニードル複合体及び／又は（好ましくは、及び）エフェクター融合物（ペイロード）は、異種細菌発現系（好ましくは、大腸菌（E.coli））中で発現させることができる。一実施形態において、ＰＶＣニードル複合体及び／又は（好ましくは、及び）ＰＶＣエフェクターは、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞中で発現させることができ、任意選択で、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞のＰＶＣオペロンは、細胞に対して内因性である（及び任意選択で、ＰＶＣオペロンは、遺伝子操作を介してゲノム中に取り込んでＰＶＣオペロンに作動可能に結合させることができる誘導性プロモーターに作動可能に結合している）。例えば、誘導性プロモーターは、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞のゲノム中に５’からＰＶＣ（オペロン）で、好ましくは、実施例（例えば、実施例３）に記載のとおり組み換えることにより導入することができる。
【0028】
ペイロードは、例えば、ＰＶＣニードル複合体が医学的治療において有用になるように治療ペイロードであり得る。
【0029】
さらなる態様において、本発明は、治療の方法における使用のための（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体であって；
ａ．ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）エフェクター融合物を含み（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
ＰＶＣニードル複合体を提供する。
ａ．ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）エフェクター融合物を含み（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
ＰＶＣニードル複合体を提供する。
【0030】
本発明のさらなる態様は、治療の方法における使用のための（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体であって；
ａ．ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）融合物を保持し（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
ＰＶＣニードル複合体を提供する。
ａ．ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）融合物を保持し（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
ＰＶＣニードル複合体を提供する。
【0031】
一態様において、本発明は、対象を治療する方法であって、（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体を対象（例えば、患者）に投与することを含み；
ａ．ＰＶＣニードル複合体は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）エフェクター融合物を含み（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
ａ．ＰＶＣニードル複合体は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）エフェクター融合物を含み（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
【0032】
換言すると、本発明の一態様は、対象を治療する方法であって、（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体を対象（例えば、患者）に投与することを含み；
ａ．ＰＶＣニードル複合体は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）融合物を保持し（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
ａ．ＰＶＣニードル複合体は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）融合物を保持し（例えば、それでパッケージされており）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
【0033】
好ましい実施形態において、ペイロードは、ポリペプチドである。
【0034】
対象は、哺乳類対象、好ましくは、ヒト対象であり得る。
【0035】
用語「ＰＶＣニードル複合体はエフェクター融合物を保持する」及び「エフェクター融合物を含むＰＶＣニードル複合体」は、パッケージされたエフェクター融合物を有するＰＶＣニードル複合体、又は換言すると、エフェクター融合物でパッケージされたＰＶＣニードル複合体を意味する。
【0036】
用語「パッケージされたエフェクター融合物」、「融合物」及び「エフェクター融合物」（例えば、融合物／エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される）は、ＰＶＣニードル複合体中へのパッケージ後に接触したままである（例えば、融合している）ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードの組み合わせ（例えば、リーダー配列はペイロードから開裂されていない）、並びにもはや直接接触していないＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードの組み合わせ（例えば、ペイロードからのリーダー配列の開裂後に例えば、もはや融合していない）を包含する。
【0037】
本明細書において使用される用語「治療する」又は「治療すること」は、予防的治療（例えば、疾患の発症を予防するため）並びに中和治療（既に疾患を罹患している対象の治療）を包含する。好ましくは、本明細書において使用される用語「治療する」又は「治療すること」は、中和治療を意味する。用語「治療する」又は「治療すること」は、疾患及びその症状の両方を治療することを包含する。一部の実施形態において、「治療する」又は「治療すること」は、疾患の症状を指す。
【0038】
したがって、ＰＶＣニードル複合体は、治療有効量又は予防有効量で対象に投与することができる。
【0039】
「治療有効量」は、単独で又は組み合わせ（例えば、別の治療薬と、並行して又は順次投与され、相加的又は相乗的に作用する）で対象に疾患（又はその症状）を治療するために投与された場合に疾患、又はその症状のそのような治療を生じさせるために十分な（パッケージされた／負荷された）ＰＶＣニードル複合体の任意の量である。
【0040】
「予防有効量」は、単独で又は組み合わせ（例えば、別の治療薬と、並行して又は順次投与され、相加的又は相乗的に作用する）で対象に投与された場合に疾患（又はその症状）の発症又は再発を阻害し、又は遅延させる（パッケージされた／負荷された）ＰＶＣニードル複合体の任意の量である。一部の実施形態において、予防有効量は、疾患の発症又は再発を完全に予防する。発症を「阻害すること」は、疾患発症（又はその症状）の見込みを低下させ、又は発症を完全に予防することを意味する。
【0041】
関連態様において、エフェクター融合物を含む（例えば、それを保持する／それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体であって；
ａ．前記エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体が提供される。
ａ．前記エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｃ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体が提供される。
【0042】
換言すると、本発明の一態様は、融合物を保持する（例えば、それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体であって；
ａ．前記融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体を提供する。
ａ．前記融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｂ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｃ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体を提供する。
【0043】
好ましい実施形態において、（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体は、単離（例えば、非天然）ＰＶＣニードル複合体である。
【0044】
以下に説明されるとおり、ＰＶＣニードル複合体は、典型的には、本来、毒素原性ＰＶＣエフェクターを昆虫標的に送達するように機能する。ＰＶＣニードル複合体中にパッケージすることができるペイロードの数及び種類を大幅に拡大することにより、本発明は、標的化し、殺傷することができる無脊椎動物（例えば、有害生物）、例えば、アメーバ、線虫、蠕虫及び昆虫の数及び種類を同時に拡大する。
【0045】
本発明のさらなる態様において、有害生物を抑制する方法であって：
ａ．有害生物、又は有害生物を含む標的区域を、エフェクター融合物を含む（例えば、それを保持する／それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法が提供される。
ａ．有害生物、又は有害生物を含む標的区域を、エフェクター融合物を含む（例えば、それを保持する／それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法が提供される。
【0046】
本発明の一態様は、有害生物を抑制する方法であって：
ａ．有害生物、又は有害生物を含む標的区域を、融合物を保持する（例えば、それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
ａ．有害生物、又は有害生物を含む標的区域を、融合物を保持する（例えば、それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
【0047】
用語「ＰＶＣニードル複合体はエフェクター融合物を保持する」及び「エフェクター融合物を含むＰＶＣニードル複合体」は、パッケージされたエフェクター融合物を有するＰＶＣニードル複合体を意味する。
【0048】
用語「標的区域」は、有害生物が存在する及び／又は有害生物が存在し得る（例えば、存在すると予測され、又は存在すると疑われる）区域を指す。
【0049】
したがって、一実施形態において、標的区域は、有害生物が存在する前、及び／又は存在する時に接触させることができる。標的区域は、有害生物付近に（例えば、それにごく接近して）あり得る。或いは、標的区域は、使用者が有害生物から保護することを望む区域であり得る。例えば、標的区域は、植物及び／又は植物生産物を含み得る。
【0050】
用語「有害生物を抑制すること」は、「有害生物防除」、「有害生物の成長を阻害すること」、「有害生物の増殖を阻害すること」、及び／又は「有害生物の死滅」を包含する。
【0051】
このような有害生物の例としては、１つ以上の昆虫、ダニ、ワラジムシ、ダンゴムシ、ムカデ、軟体動物、ヤスデ、原生生物、真菌（真菌）、蠕虫及び／又は血液感染性寄生虫が挙げられる。有害生物は、発生の任意の段階のものであり得、例えば、幼体及び／又は成体有害生物（例えば、成虫）であり得る。
【0052】
本発明は、種々の農業、工業、家庭及び園芸有害生物を標的化するために使用することができる。
【0053】
一実施形態において、有害生物は、昆虫、ダニ、ワラジムシ、ダンゴムシ、ムカデ、軟体動物及び／又はヤスデである。好適には、有害生物は、昆虫及び／又はダニ（好ましくは、昆虫）であり得る。
【0054】
好適な昆虫の例としては、チョウ目、コウチュウ目、ハエ目、ゴキブリ目、ハチ目、シロアリ目、バッタ目、シミ目、及び／又はハサミムシ目の昆虫が挙げられる。一実施形態において、チョウ目の昆虫は、ガ及び／又はチョウの１つ以上であり得る。好適なガとしては、タバコスズメガ（Manduca Sexta）及び／又はハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）が挙げられる。
【0055】
一実施形態において、コウチュウ目の昆虫は、ヨーロピアンシェーファー（European chafer）幼虫、ノザンマスクドシェーファー（northern masked chafer）幼虫、サザンマスクドシェーファー（southern masked chafer）幼虫、マメコガネ幼虫、コガネムシ幼虫、キンケクチブトゾウムシ、イチゴクチブトゾウムシ、クレイカラードウィービル（clay-colored weevil）、コロラドハムシ、及び／又はコメツキムシの１つ以上であり得る。別の実施形態において、ハエ目の昆虫は、レザージャケット（例えば、ガガンボの幼体）、タマネギバエ、ギャベツバエ、ニンジンサビバエ、キノコバエ、及び／又はカの１つ以上であり得る。別の実施形態において、ゴキブリ目の昆虫は、ゴキブリ、好適には、ワモンゴキブリ、及び／又はチャバネゴキブリから選択される１つ以上のゴキブリであり得る。
【0056】
一実施形態において、ハチ目の昆虫は、アリであり得る。好適に、アリは、オオアリ、悪臭性のイエアリ、舗装アリ、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、黄褐色クレージーアント、収穫アリ、ヒアリ、サザンファイアーアント（Southern fire ant）、キイロクシケアリ及び／又はコカミアリの１つ以上であり得る。別の実施形態において、ハチ目の昆虫は、イエロージャケットであり得る。
【0057】
一実施形態において、シロアリ目の昆虫は、シロアリであり得る。好適には、シロアリは、湿材シロアリ、乾材シロアリ、及び／又は地下シロアリの１つ以上であり得る。別の実施形態において、バッタ目の昆虫は、コオロギ、バッタ、及び／又はイナゴの１つ以上であり得る。一実施形態において、シミ目の昆虫は、セイヨウシミであり得る。別の実施形態において、ハサミムシ目の昆虫は、ハサミムシであり得る。
【0058】
好適な軟体動物の例としては、ナメクジ及び／又はカタツムリが挙げられる。
【0059】
一実施形態において、有害生物は、原生生物である。一実施形態において、前記原生生物は、カオス・カロリネンス（Chaos carolinense）、アメーバ・プロテウス（Amoeba proteus）、フォーラーネグレリア（Naegleria fowleri）、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、ブラストシスチス・ホミニス（Blastocystis hominis）、リーシュマニア属種（Leishmania Spp.）、及びランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）から選択される１つ以上である。一実施形態において、前記原生生物は、フォンティキュラ・アルバ（Fonticula alba）、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、クリトモナス・パラメジウム（Crytomonas paramedium）、ポーリネラ・クロマトフォラ（Paulinella chromatophora）、ナンノクロロプシス・ガジタナ（Nannochloropsis gaditana）、及び／又はテトラヒメナ属種（Tetrahymena Spp.）から選択される１つ以上である。
【0060】
一実施形態において、有害生物は、真菌である。一実施形態において、前記真菌は、エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoan cuniculi）、ナセマ・アピス（Nasema apis）、ナメマ・セラナエ（Namema ceranae）、ビタフォルマ・カルネアエ（Vittaforma carneae）、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Enterocytosoan bieneusi）、スプラグエア・ロフィイ（Spraguea lophii）、バブラ・クルクリス（Vavra culiculis）、エドハーザージア・アエデス（Edharzardia aedes）、ネマトシダ・パリシイ（Nematocida parisii）、ラゼラ属種（Razella Spp.）、パラシテラ・パラシティカ（Parasitella parasitica）、リクテイミア・ラモセ（Lichteimia ramose）、黒穂病菌（Sporisorium scitamineum）、カワラタケ（Trametes versicolor）、及び／又はケシワウロコタケ（Punctularia strigosozonata）から選択される１つ以上の真菌である。
【0061】
一実施形態において、前記真菌は、カンジダ属種（Candida spp.）である。前記カンジダ属種（Candida spp.）は、Ｃ．アルビカンス（C.albicans）、Ｃ．アスカラフィダルム（C.ascalaphidarum）、Ｃ．アンフィキシアエ（C.amphixiae）、Ｃ．アンタークティカ（C.Antarctica）、Ｃ．アルゲンテア（C.argentea）、Ｃ．アトランティカ（C.atlantica）、Ｃ．アトモスフェリカ（C.atmosphaerica）、Ｃ．アウリス（C.auris）、Ｃ．ブラッタエ（C.blattae）、Ｃ．ブロメリアセアルム（C.bromeliacearum）、Ｃ．カルポフィラ（C.carpophila）、Ｃ．カルバジャリス（C.carvajalis）、Ｃ．セラムビシダルム（C.cerambycidarum）、Ｃ．シャウリオデス（C.chauliodes）、Ｃ．コリダリス（C.corydalis）、Ｃ．ドッセイイ（C.dosseyi）、Ｃ．デュブリネンシス（C.dubliniensis）、Ｃ．エルガテンシス（C.ergatensis）、Ｃ．フルクタス（C.fructus）、Ｃ．グラブラタ（C.glabrata）、Ｃ．フェルメンタティ（C.fermentati）、Ｃ．ギリエルモンディイ（C.guilliermondii）、Ｃ．ハエムロニイ（C.haemulonii）、Ｃ．フミリス（C.humilis）、Ｃ．インセクタメンス（C.insectamens）、Ｃ．インセクトルム（C.insectorum）、Ｃ．インテルメディア（C.intermedia）、Ｃ．ジェフレシイ（C.jeffresii）、Ｃ．ケフィル（C.kefyr）、Ｃ．ケロセネアエ（C.keroseneae）、Ｃ．クルセイ（C.krusei）、Ｃ．ルシタニアエ（C.lusitaniae）、Ｃ．リクソソフィラ（C.lyxosophila）、Ｃ．マルトセ（C.maltose）、Ｃ．マリナ（C.marina）、Ｃ．メンブラニファシエンス（C.membranifaciens）、Ｃ．モギイ（C.mogii）、Ｃ．オレオフィラ（C.oleophila）、Ｃ．オレゴネンシス（C.oregonensis）、Ｃ．パラプシロシス（C.parapsilosis）、Ｃ．クエルシトルサ（C.quercitrusa）、Ｃ．ルゴセ（C.rugose）、Ｃ．サケ（C.sake）、Ｃ．シェハテア（C.shehatea）、Ｃ．テムノキラエ（C.temnochilae）、Ｃ．テヌイス（C.tenuis）、Ｃ．テアエ（C.theae）、Ｃ．トレランス（C.tolerans）、Ｃ．トロピカリス（C.tropicalis）、Ｃ．ツチヤエ（C.tsuchiyae）、Ｃ．シノラボランティウム（C.sinolaborantium）、Ｃ．ソジャエ（C.sojae）、Ｃ．スブハシイ（C.subhashii）、Ｃ．ビスワナチイ（C.viswanathii）、Ｃ．ウティリス（C.utilis）、Ｃ．ウバツベンシス（C.ubatubensis）、及び／又はＣ．ゼンプリニナ（C.zemplinina）から選択される１つ以上であり得る。好適には、前記カンジダ属種（Candida spp.）は、Ｃ．アルビカンス（C.albicans）であり得る。
【0062】
別の実施形態において、有害生物は、蠕虫である。前記蠕虫は、環形動物門（Annelida）、扁形動物門（Platyhelminthes）、線形動物門（Nematoda）及び／又は鉤頭動物門（Acanthocephala）から選択される１つ以上であり得る。一実施形態において、前記蠕虫は、寄生性扁形動物である。前記寄生性扁形動物は、条虫綱（Cestoda）、吸虫綱（Trematoda）及び／又は単生綱（Monogenea）から選択される１つ以上であり得る。一実施形態において、前記蠕虫は、寄生性線虫である。前記寄生性線虫は、回虫（カイチュウ属（Ascaris））、フィラリア、鉤虫、蟯虫（ギョウチュウ属（Enterobius））、及び／又は鞭虫（Trichuris trichiura）から選択される１つ以上であり得る。
【0063】
一実施形態において、有害生物は、血液感染性寄生虫である。前記血液感染性寄生虫は、トリパノソーマ属種（Trypanosoma Spp）（例えば、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）及び／又はクルーズトリパノソーマ（T.cruzi））、バベシア属種（Babesia Spp）（例えば、バベシア・ミクロティ（Babesia microti））、リーシュマニア属種（Leishmania Spp）、プラスモジウム属種（Plasmodium Spp）（例えば、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum））、及び／又はトキソプラズマ属種（Toxoplasma Spp.）（例えば、トキソプラズマ・コンジイ（Toxoplasma gondii））から選択される１つ以上であり得る。
【0064】
有害生物防除のためのＰＶＣニードル複合体は、好適には、環境的に安全（例えば、環境的に安全な殺有害生物組成物）である。
【0065】
他の有利な有用性としては、例えば、実験室での研究の間、ペイロードを細胞に送達することが挙げられる。このような細胞はインビトロ細胞系の一部であり得、又は動物（例えば、研究動物モデル）の細胞であり得る。さらに又は或いは、細胞は、エクスビボ系、例えば、オルガノイド内に含まれ得る。
【0066】
本発明の別の態様は、ペイロードを細胞中に送達するインビトロ（及び／又はエクスビボ）方法であって：
ａ．細胞を、エフェクター融合物を含む（例えば、それを保持する／それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
ａ．細胞を、エフェクター融合物を含む（例えば、それを保持する／それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．エフェクター融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記エフェクター融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．エフェクター融合物は、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
方法を提供する。
【0067】
本発明の一態様は、ペイロードを細胞中に送達するインビトロ（及び／又はエクスビボ）方法であって：
ａ．細胞を、融合物を保持する（例えば、それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
ａ．細胞を、融合物を保持する（例えば、それでパッケージされた）（パッケージされた）ＰＶＣニードル複合体と接触させることを含み；
ｂ．融合物は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含み（又は本質的にそれからなり）（又は換言すると、前記融合物は、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される）；
ｃ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｄ．融合物は、ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
方法を提供する。
【0068】
一態様において、本発明は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）エフェクター融合物（又は換言すると、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成されるエフェクター融合物）であって；
ａ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｂ．野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
エフェクター融合物を提供する。
ａ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり；
ｂ．野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別される
エフェクター融合物を提供する。
【0069】
本発明の一態様は、ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）融合物（又は換言すると、ＰＶＣエフェクターリーダー配列及びペイロードにより形成される融合物）であって；
ａ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｂ．ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
融合物を提供する。
ａ．前記ペイロードは、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上（好ましくは、ポリペプチド）であり；
ｂ．ＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、野生型ＰＶＣエフェクタータンパク質）と区別される
融合物を提供する。
【0070】
一実施形態において、融合物／エフェクター融合物は、単離融合物／エフェクター融合物（例えば、単離された天然に存在しない融合物／エフェクター融合物）である。
【0071】
本発明は、融合物／エフェクター融合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び／又は前記核酸を含む発現ベクターを包含する。前記核酸及び／又は発現ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【0072】
上記のとおり、本発明者らは、本明細書に記載のリーダー配列を初めて発見し、実際に利用した。
【0073】
したがって、本発明の別の態様は、単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列（例えば、この単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列は、ペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得る）を提供する。
【0074】
関連態様において、ＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸が提供される。
【0075】
単離ＰＶＣエフェクターリーダー配列は、組換え体、合成物、及び／又は精製物であり得る。ＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードする単離核は、組換え体、合成物、及び／又は精製物であり得る。
【0076】
本発明の背景に関するさらなる詳細、及び本明細書において使用される用語は、以下に提供される。
【0077】
フォトラブダス属（Photorhabdus）は、腸内細菌科（Enterobacteriacae）の属の細菌であり、３つの以前に（これまで）認識された種、即ちＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）、及びＰ．テンペラタ（P.temperata）により代表される。重要な株としては、Ｐ．アシンビオティカ亜種アウストラリス（P.asymbiotica subsp.australis）、及びＰ．ルミネスセンス亜種ラウモンジイ（P.luminescens subsp laumondii）が挙げられる。現在利用可能なゲノム配列は、GenBank上で利用可能である（フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）ATCC43949完全ゲノム－GenBankアクセッション番号FM162591.1；フォトラブダス・ラウモンジイ亜種ラウモンジイ（Photorhabdus laumondii subsp.laumondii）株ＴＴ０１染色体、完全ゲノム－GenBankアクセッション番号：CP024901.1）。
【0078】
「フォトラブダス・ルミネスセンス亜種ラウモンジイ（Photorhabdus luminescens subsp.laumondii）」への言及は、本明細書において「フォトラブダス・ルミネスセンス亜種ラウモンジイ（Photorhabdus luminescens subsp.laumondii）ＴＴ０１」、「フォトラブダス・ルミネスセンス亜種ラウモンジイ（Photorhabdus laumondii subsp.laumondii）株ＴＴ０１」、及び「Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１」と互換的に使用することができる。
【0079】
Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）、即ち、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）Kingscliffのさらなる株についてのゲノム配列は、参照により本明細書に組み込まれるWilkinson et.al.(FEMS Microbiology Letters,Volume 309,Issue 2,August 2010,Pages 136-143)に記載されている。さらなるゲノム配列は、参照により本明細書に組み込まれるThanwisai et.al.(PLoS ONE 7(9):e43835)に記載されている。
【0080】
これらの種のそれぞれは、本明細書において「ナノシリンジ」と称することができるＰＶＣニードル複合体をコードするフォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット（ＰＶＣ）オペロンとして公知の少なくとも１つのオペロンを含む。フォトラブダス属（Photorhabdus）が典型的には、（共生）昆虫病原性ヘテロラブディティス種（Heterorhabditis sp.）線虫からの逆流後に殺昆虫細菌として本来見出される（例えば、食料及び昆虫からの資源についての競合を回避するため）ことを考慮すると、ＰＶＣニードル複合体は本来、昆虫を抑制するように機能することが理解される。実際、（天然エフェクター毒素、例えば、Ｐｎｆを保持する／それでパッケージされた）単離ＰＶＣニードル複合体を使用して昆虫幼体を殺傷することができることが示された、実施例２参照。フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセットは、フォトラブダス属（Photorhabdus）の少なくとも４つの十分に特徴付けされた毒素送達系の１つを表す。フォトラブダス属（Photorhabdus）タンパク質殺昆虫毒素の他の主要なクラスとしては、「毒素複合体（Ｔｃ）」、「バイナリーＰｉｒＡＢ毒素」、及び「メイクスキャタピラーズフロッピー（makes caterpillars floppy）」（Ｍｃｆ）毒素が挙げられる。
【0081】
用語「フォトラブダス属（Photorhabdus）ビルレンスカセット」（ＰＶＣ）（本明細書において用語「ＰＶＣオペロン」と同義的に使用される）は、発現された場合、アセンブルして巨大分子ＰＶＣニードル複合体を提供するポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子を含むフォトラブダス属（Photorhabdus）ゲノムの区別されるオペロンを意味する。これらのカセットの分子アーキテクチャは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるThe Molecular Biology of Photorhabdus Bacteria(Springer International Publishing AG 2017,ISBN:978-3-319-52714-7,Chapter 10,pages 159-177）に十分に特徴付けされ、記載されている。ＰＶＣ（オペロン）は、典型的には、アセンブルして「ＰＶＣニードル複合体」を提供する構造タンパク質をコードするおよそ１６個の遺伝子（ｐｖｃ１～ｐｖｃ１６）と、典型的にはそれに続く毒性活性を有する（及び典型的には、典型的なＴ３ＳＳ様エフェクターの相同体である）ＰＶＣエフェクター遺伝子をコードする３’末端における１つ以上の遺伝子とを含む。フォトラブダス属（Photorhabdus）ゲノムは、典型的には、異なるエフェクターペイロード、又はさらには複数のエフェクターペイロードと会合していることが多い複数のそのようなカセット（例えば、少なくとも４つ）を含む。
【0082】
ＰＶＣ構造オペロン（クラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）の３つのクラスは、フォトラブダス属（Photorhabdus）、及び他の属のメンバーのゲノムで観察されている。それぞれのクラス内のＰＶＣは、それらが含有する構造タンパク質をコードする遺伝子の数及びタイプに関して類似する（図１（Ｂ）参照）。より詳細には、クラスＩ ＰＶＣ（本明細書において「原型ＰＶＣ」と称することができる）は、１６個の保存遺伝子（ｐｖｃ１～１６）を含む。クラスＩＩはｐｖｃ１３宿主細胞結合線維を欠き、（理論により拘束されないが）本発明者らが考えるｐｖｃ３は、ｐｖｃ１３線維タンパク質をＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）上に付着させるマイナー特殊化鞘サブユニットであり得る。したがって、このクラスは「非特異的」であり得、ペイロードを複数の（潜在的なあらゆる）細胞タイプ中にインジェクトすると考えられる。クラスＩＩＩはクラスＩと類似するが、（未知機能の）オペロンの開始における追加のＰｖｃ０遺伝子及び「侵入」タイプタンパク質遺伝子と類似するｐｖｃ１３とｐｖｃ１４との間でコードされる２つの追加の遺伝子を有する。このクラスは、典型的には、フォトラブダス属（Photorhabdus）のヒト臨床単離株に見られ、本発明者らは、その株（ＰＶＣクラスＩＩＩオペロンをコードするＰＶＣオペロンを保有する）を３７℃において成長させ、ヒト血清に曝露させた場合にＰＶＣクラスＩＩＩの最適な転写が生じ得ることを示し、このクラスがＰＶＣニードル複合体の哺乳類適合型であり得ることを示唆する。
【0083】
一例のカセット（ＰＶＣ）を図１（Ｄ）に示し、それは、フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）ATCC43949（ATCCから入手可能、アクセッション番号：ATCC43949）のモデル「クラスＩ」ＰＶＣオペロンのマップを示し、前記オペロンは、下流エフェクター遺伝子「ＰＡＵ＿０３３３２」（Ｐｎｆタンパク質エフェクター、例えば、配列番号３２をコードする）と会合している。このモデルオペロンは、ＰａＡＴＣＣ４３９４９ＰＶＣｐｎｆと称される。このオペロンは、１６個の構造遺伝子（ｐｖｃ１～１６）と、エフェクターをコードする２つの遺伝子（３’末端）（この場合、Ｒｈｓ様エフェクターをコードするｐｖｃ１７／Ｒｈｓ様、及びＰｎｆエフェクターをコードするｐｖｃ２１）とを含む。前記遺伝子ｐｖｃ１～１６は、GenBankアクセッション番号FM162591.1の配列の遺伝子ＰＡＵ＿０３３５３からＰＡＵ＿０３３３８に対応し、配列番号９３の配列により表される。
【0084】
一例のＰＶＣオペロン（例えば、構造遺伝子をコードするが、ＰＶＣエフェクターをコードしない）は配列番号９３（図１（Ｄ）に模式的に示されるオペロンをコードする）に提供され、他の例は配列番号９４及び配列番号９５である。これらの配列は、ＰＶＣカセット／オペロンの最初の構造遺伝子（ｐｖｃ１）のＡＴＧ開始コドンにおいて始まり、及び最後の構造遺伝子（ｐｖｃ１６）のＴＡＡ終止コドンにおいて終わる。
【0085】
クラスＩ～ＩＩＩのいずれか１つからのＰＶＣニードル複合体は、種々の用途に使用することができる。しかしながら、あるクラスのＰＶＣニードル複合体は、規定の細胞タイプへの送達に特に好適である。例えば、哺乳類細胞へのペイロードの送達のためのＰＶＣニードル複合体は、好適には、クラスＩＩＩのメンバーであり得る。昆虫細胞（例えば、昆虫）へのペイロードの送達のためのＰＶＣニードル複合体は、好適には、クラスＩのメンバー（例えば、コスミドクローンから大腸菌（E.coli）中で発現される、例えば、配列番号９３によりコードされるＰ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ＰＶＣｐｎｆ）であり得る。
【0086】
したがって、当業者により理解されるとおり、用語「ＰＶＣニードル複合体」（本明細書において用語「ＰＶＣニードル複合体送達系」及び「ナノシリンジ」と同義的に使用される）は、フォトラブダス属（Photorhabdus）細菌のＰＶＣ（オペロン）によりコードされるポリペプチドサブユニットを含む巨大分子タンパク質複合体を意味する。ＰＶＣニードル複合体は、抗菌Ｒ型ピオシンと（表面的に）類似する物理的構造を有するナノシリンジ構造にアセンブルされる（実施例３参照）。機能及び分子試験は、ＰＶＣニードル複合体がＰＶＣエフェクタータンパク質でパッケージ（ロード）され（即ち、ＰＶＣエフェクタータンパク質はその中又はその上にパッケージされ）、パッケージされたＰＶＣニードル複合体が細菌から放出され、次いでＰＶＣエフェクターを標的細胞中にインジェクトし、その結果、ＰＶＣエフェクタータンパク質が毒性を発揮し得ることを示した。
【0087】
用語「ＰＶＣニードル複合体」は、好ましくは、フォトラブダス属（Photorhabdus）ＰＶＣオペロンの遺伝子と相同の遺伝子を含むオペロンによりコードされるＰＶＣニードル複合体様構造／複合体を包含する。ＰＶＣ様エレメントはフォトラブダス属（Photorhabdus）に制限されず、十分に特徴付けされた（ＰＶＣオペロンに対して）相同のオペロンが、昆虫病原性細菌セラティア・エントモフィラ（Serratia entomophila）のｐＡＤＡＰプラスミド上に存在する。さらに、類似、及び（少なくとも部分的に）相同のＰＶＣ様「インジェクトソーム」ニードル複合体系は、細菌シュードアルテロモナス・ルテオビオラセア（Pseudoalteromonas luteoviolacea）により用いられる（例えば、海産虫カサネカンザシ（Hydroides elegans）の変態を制御するために使用される）。ＰＶＣオペロンと相同性を有するオペロンによりコードされる構造は他の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（例えば、エルシニア属種（Yersinia Spp.））に存在し、本明細書に記載のリーダー配列と共に使用することができる。これらの（ＰＶＣ様）構造のそれぞれは、本明細書において使用される用語「ＰＶＣニードル複合体」により包含される。
【0088】
したがって、ＰＶＣニードル複合体は、ＰＶＣニードル複合体内で、又はその末端（チップ）においてパッケージ（ロード）されているエフェクター遺伝子によりコードされる、したがってＰＶＣニードル複合体の「ペイロード」又は「反応部位」を表すポリペプチドとの「ナノシリンジ」複合体である。本発明者らは、（依然としてペイロードが負荷された）ＰＶＣニードル複合体自体がフォトラブダス属（Photorhabdus）細胞から自由に放出（例えば、分泌）されてから標的細胞の膜と相互作用し、ペイロードをその細胞の細胞質中にインジェクトすることを実証した。実際、本発明者らは、異種発現系中でＰＶＣニードル複合体を良好に発現させ、ロードしてからＰＶＣニードル複合体を単離／精製し、それらを使用して昆虫幼体を抑制（例えば、殺傷）した（実施例２参照）。したがって、ＰＶＣニードル複合体はロングレンジタンパク質送達系として作用する。
【0089】
一実施形態において、ＰＶＣニードル複合体は、配列番号９３、配列番号９４、及び配列番号９５から選択される配列（例えば、配列番号９３）と少なくとも７５％の配列同一性（好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性；より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性）を有する配列によりコードされる。
【0090】
一実施形態において、ＰＶＣニードル複合体は、配列番号９３、配列番号９４、及び配列番号９５から選択される配列（例えば、配列番号９３）によりコードされる。
【0091】
リーダー／シグナル配列は、典型的にはペプチドであり、分泌経路に向かうことになる大多数の（新たに）発現されるタンパク質のＮ末端に存在する（例えば、前記タンパク質を細胞膜上のタンパク質伝導チャネルに指向するための）１０～３０アミノ酸長のものが多い。多くのタンパク質は、ゴルジ又は小胞体侵入のためのシグナル配列を要求する。
【0092】
本明細書において「ＰＶＣエフェクターリーダー配列」の文脈で使用される用語「リーダー配列」（本明細書において用語「リーダーペプチド」、「シグナル配列」、「標的化シグナル」、「局在化シグナル」、「局在化配列」、及び「輸送ペプチド」と互換的に使用される）は、ＰＶＣエフェクターをＰＶＣニードル複合体の内部、又は末端（チップ）中に指向するように機能するポリペプチド配列を意味し、したがって、リーダー配列は、ＰＶＣエフェクターをＰＶＣニードル複合体中にパッケージするように機能する。続いて、ＰＶＣニードル複合体は、ＰＶＣエフェクターを標的細胞中に送達（例えば、インジェクト）し得る。ＰＶＣニードル複合体は、アセンブルしたＰＶＣニードル複合体であり得る。用語「ＰＶＣニードル複合体」は、ＰＶＣニードル複合体の断片を指し得る（例えば、リーダー配列は前記断片に接触し、任意選択で、ＰＶＣニードル複合体はリーダー配列－ペイロード「エフェクター融合物」周囲でアセンブルする）。
【0093】
ＰＶＣリーダー配列は、典型的には、ＰＶＣエフェクター又はその相同体の（最初の５０アミノ酸により特徴付けされ、又はそれに包含される）Ｎ末端に存在する。しかしながら、本発明は、そのようなＰＶＣエフェクター／相同体のＮ末端領域以外の領域中（例えば、Ｃ末端領域中）に見出すことができるＰＶＣエフェクター及びＰＶＣエフェクター相同体のリーダー配列を包含する。
【0094】
一実施形態において、リーダー配列は、ＰＶＣエフェクター（例えば、ＰＶＣエフェクタータンパク質）のアミノ酸残基１～５０を含む（又は本質的にそれからなる）。「アミノ酸残基１～５０」への言及は、Ｎ末端メチオニンが排除される、例えば、開裂された「アミノ酸残基２～５０」を包含する。リーダー配列は、ＰＶＣエフェクターのＮ末端５０個のアミノ酸の断片（例えば、≦４５、≦３５、≦２５、又は≦１５個のアミノ酸を含み又は本質的にそれからなる断片）であり得、但し、断片がペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得ることを条件とする。
【0095】
一実施形態において、本発明のリーダー配列（例えば、単離リーダー配列）は、配列番号４７～配列番号９２から選択される１つ以上の配列（好ましくは、配列番号５０、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、又は配列番号９２）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み（又は本質的にそれからなり）、例えば、リーダー配列がペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得ることを条件とする。好ましい実施形態において、リーダー配列は、配列番号４７～配列番号９２から選択される１つ以上の配列（好ましくは、配列番号５０、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、又は配列番号９２）と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み（又は本質的にそれからなり）、例えば、リーダー配列がペイロードをＰＶＣニードル複合体中にパッケージし得ることを条件とする。より好ましい実施形態において、リーダー配列は、配列番号４７～配列番号９２から選択される１つ以上のアミノ酸配列（好ましくは、配列番号５０、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、又は配列番号９２）を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号４７～配列番号９２から選択されるアミノ酸配列（好ましくは、配列番号５０、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、又は配列番号９２）を含む（又は本質的にそれからなる）。
【0096】
一実施形態において、リーダー配列は、配列番号５０、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、及び配列番号９２から選択されるアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。
【0097】
一実施形態において、リーダー配列は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。
【0098】
理論により拘束されないが、リーダー配列は、アミノ酸特性に基づく「化学組成コンセンサス（chemical composition consensus）」を共有すると考えられる。より特定すると、リーダー配列は類似の電荷パターンを含み、そのパターンは、２つの負電荷領域と、そのそれぞれに続く正電荷領域（例えば、［－ｖｅ］［＋ｖｅ］［－ｖｅ］［＋ｖｅ］）を含む、図９参照。これは、［＋ｖｅ］［疎水性］［＋ｖｅ］［Ｃ］の電荷／特性パターンを含む２型分泌系の毒素のリーダー配列と一致する。さらなる理論は、リーダー配列が典型的な「ヘリックス－ターン－ヘリックス」構造を共有することを仮定する。別の理論は、リーダー配列が、ＰＶＣニードル複合体の内部中、又は末端（例えば、チップ）に存在するＡＴＰアーゼ酵素により認識される構造（例えば、図１（Ｄ）のモデルオペロン中の遺伝子ＰＡＵ＿０３３３９（ｐｖｃ１５））によりコードされる）を形成することである。
【0099】
用語「ＰＶＣエフェクター」（用語「ＰＶＣオペロンコードエフェクター」、及び「ＰＶＣエフェクタータンパク質」と同義的に使用される）は、フォトラブダス属（Photorhabdus）ＰＶＣオペロン、より特定すると（及び典型的には）、前記オペロンの構造遺伝子のすぐ下流（３’）（好ましくは、ｐｖｃ１６のすぐ又は直近の下流、及び典型的には５ｋｂ内）に見出されるものによりコードされるエフェクターポリペプチドを意味する。用語「ＰＶＣエフェクター」は、好ましくは、その相同体を包含する。したがって、リーダー配列は、ＰＶＣエフェクターをコードする遺伝子の相同体である遺伝子によりコードされるポリペプチドからのものでもあり得、そのような相同体については表１参照。実際、ＰＶＣエフェクターの同定は、既知の毒素ポリペプチド（例えば、前記毒素ポリペプチドをコードする遺伝子）とのｐｖｃ１６の下流遺伝子の相同性を検出することにより補助される。当業者により理解されるとおり、用語「相同体」は、好ましくは、同じ祖先の遺伝子に由来し、類似の機能を共有する遺伝子を意味し、そのような遺伝子（又はそれによりコードされるポリペプチド）は、ＰＶＣエフェクターをコードする遺伝子と相同である。相同体は、フォトラブダス属（Photorhabdus）種のゲノムから、又はフォトラブダス属（Photorhabdus）種以外の種からのものであり得る。好適な相同体の例は、表１に概説される。
【0100】
本発明者らは、フォトラブダス属（Photorhabdus）の３つの最も一般的な（最良に特徴付けされた）株、並びにＰ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）Thai株ＰＢ６８．１中のこれらのＰＶＣニードル複合体のＰＶＣエフェクターをコードする遺伝子を解明し、詳細に特徴付けした。これは、オペロンのＰＶＣ構造遺伝子の３’末端への遺伝子連鎖の近接性、及びエフェクター（例えば、既知エフェクター／毒素タンパク質の相同体）のタンパク質配列の予測される機能を分析することに基づき実施した。より詳細には、ＰＶＣエフェクター（例えば、ＰＶＣエフェクターをコードする遺伝子）を、典型的には、既知の毒素ポリペプチド（例えば、表１に概説される相同体）をコードする遺伝子との相同性を有し、典型的には、ＰＶＣオペロンの最後の構造遺伝子（例えば、ｐｖｃ１６）の下流１キロベースから５キロベース（ｋｂ）の距離内（例えば、１ｋｂ内）に存在する（典型的には数個の介在遺伝子があり、又は介在遺伝子なし）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と同定した。典型的には、オペロンの末端（ＰＶＣニードル複合体をコードする）と、ＰＶＣエフェクター遺伝子との間に「非毒素様」ＯＲＦは存在しない。（例えば、１つ、又は２つの）他の小さい予測遺伝子がそれらの領域中に存在し得るが、それらの他の遺伝子はＰＶＣエフェクターと割り当てない（上記の既知のエフェクター／毒素遺伝子との相同性の欠落に起因）。
【0101】
推定ＰＶＣエフェクター遺伝子（例えば、ＰＶＣオペロンの最後の構造遺伝子の下流５ｋｂの距離内、例えば、１ｋｂ内のＯＲＦ）をＰＶＣエフェクター遺伝子として割り当てるため、本発明者らは、BlastP及びHHPRED（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hhpred）の組み合わせを使用した。推定ＰＶＣエフェクター遺伝子を、既知の毒素コード遺伝子との直接相同性、毒素タンパク質ファミリーとの類似性、ＰＶＣオペロンとの近接性（例えば、ＰＶＣオペロンの最後の構造遺伝子、ｐｖｃ１６の下流１～５ｋｂ内）に基づき、及び／又は既知毒素との予測二次構造のドメイン類似性に基づきＰＶＣエフェクター遺伝子として割り当てた。
【0102】
したがって、ＰＶＣエフェクター（遺伝子）は、（ｉ）ｐｖｃ１６を同定すること（例えば、既知ｐｖｃ１６との配列相同性を介して）、（ｉｉ）ｐｖｃ１６に対するＯＲＦ３’を同定すること、好ましくは、ｐｖｃ１６の下流≦５ｋｂ）、及び（ｉｉｉ）毒素ポリペプチド（例えば、「相同体」と標識された表１の欄に記載の毒素タンパク質）をコードする既知遺伝子との配列相同性の同定を介して前記ＯＲＦがＰＶＣエフェクターをコードすることを確認することにより同定することができる（フォトラブダス属（Photorhabdus）ゲノム内で）。
【0103】
例として、ＰＶＣエフェクター遺伝子ＰＡＵ＿０３３３７（本明細書においてビルレントｓｅｐ遺伝子との相同性に起因して「ｓｅｐＣ」と称される）は、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949に見出される本明細書においてＰＶＣｐｎｆ（例えば、配列番号９３のもの）と称されるＰＶＣオペロンのｐｖｃ１６（ＰＡＵ＿０３３３８）の下流３２５塩基対（ｂｐ）に位置する。即ち、ＰＡＵ＿０３３３７の開始コドンは、ＰＡＵ＿０３３３８の停止コドンの終わりの下流３２５ｂｐで始まる。
【0104】
これは、GenBankアクセッション番号FM162591.1を介してアクセス可能なＰ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949完全ゲノムへの言及により説明することができ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるWilkinson et al,BMC Genomics volume 10,article number:302(2009)も参照）、エフェクター遺伝子ＰＡＵ＿０３３３７は以下のとおりゲノム中に位置するとアノテートされる：相補鎖側（３９１３２３７．．３９１４２４７）－即ち、ヌクレオチド位置３９１３２３７．．３９１４２４７において；及びＰＡＵ＿０３３３８は以下のとおりゲノム中に位置するとアノテートされる：相補鎖側（３９１４５７３．．３９１５４５４）。他のＯＲＦ（エフェクター又はそうでないものをコードする）は、それら２つの遺伝子間に見出されない。
【0105】
本明細書において（例えば、配列番号９３の）ＰＶＣｐｎｆと称されるＰＶＣオペロンと会合するさらなるＰＶＣエフェクター遺伝子、即ち、ＰＡＵ＿０３３３２（本明細書において「ｐｎｆ」と称される）は、ｐｖｃ１６（ＰＡＵ＿０３３３８）の下流３５３５ｂｐに位置する。
【0106】
ＰＶＣエフェクター遺伝子ＰＡＵ＿０２０９５（本明細書において、ビルレントＲｈｓ毒素遺伝子との相同性に起因して「Ｒｈｓ様毒素エフェクター」と称される）は、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949に見出される本明細書においてＰＶＣｌｏｐＴ（例えば、配列番号９４のもの）と称されるＰＶＣオペロンのｐｖｃ１６（ＰＡＵ＿０２０９９）の下流３９６１ｂｐに位置する。即ち、ＰＡＵ＿０２０９５の開始コドンは、ＰＡＵ＿０２０９９の終止コドンの終わりの下流３９６１ｂｐで始まる。
【0107】
さらなる例において、遺伝子ＰＡＵ＿０２００９（本明細書において細胞周期阻害因子／ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質としての予測機能に起因して「ｃｉｆ」と称される）のＰＶＣエフェクターは、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949に見出される本明細書においてＰＶＣｃｉｆと称される会合ＰＶＣオペロンのｐｖｃ１６（ＰＡＵ＿０２００８）の下流１５７ｂｐに位置する。
【0108】
いっそうさらなる例において、本明細書においてＰＶＣｕｎｉｔ４オペロンと称されるＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１のＰＶＣオペロンに関して、ＰＶＣエフェクター遺伝子「ｐｖｃ１７」（例えば、「ｐｌｕ１６５１」）はｐｖｃ１６（遺伝子「ｐｌｕ１６５５」）の下流１０４ｂｐに位置し；本明細書においてＰＶＣｃｉｆオペロンと称されるフォトラブダス・テンペラタ亜種テンペラタ（Photorhabdus temperata subsp.temperata）Ｍｅｇ１のＰＶＣオペロンに関して、ＰＶＣエフェクター遺伝子「ＣＩＦ毒素エフェクター」（例えば、ＭＥＧ１ＤＲＡＦＴ＿０３５２９）は、関連ｐｖｃ１６遺伝子の下流４２１６ｂｐに位置する。
【0109】
これらの例は、ＰＶＣエフェクターをコードする遺伝子が、典型的には、ＰＶＣオペロンの（例えば、ｐｖｃ１６の）最後の遺伝子の下流≦５ｋｂの距離内、より典型的には、ＰＶＣオペロンの最後の遺伝子の下流≦１ｋｂの距離内に位置することを説明する。
【0110】
まとめると、これら４つの株において同定された４６個のＰＶＣエフェクターが存在する（現在利用可能な配列データに基づく）（表１参照）。これらのＰＶＣエフェクターのそれぞれの最初の５０個のアミノ酸はそれらの内因性リーダー配列を表し（又は包含する）、本発明者らは、リーダー配列をクローニングし、ＰＶＣニードル複合体中にパッケージすべき種々のペイロードに融合することができることを実証した、実施例３及び４参照。したがって、（翻訳されたままの）ＰＶＣエフェクターは、少なくとも２つの主要ドメイン：リーダー配列（アミノ酸１から５０）及び実際のエフェクターポリペプチド（アミノ酸５１からＣ末端アミノ酸）を含み、本明細書においてその後者を「エフェクター」（例えば、「エフェクター部分」）又は「ペイロード」と称することができる。
【0111】
フォトラブダス属（Photorhabdus）ゲノム配列は修正され続けているが、ＰＶＣエフェクター遺伝子のこの統合リストはそのようなエフェクターの包括的な説明を表し、最も一般的な（最良に特徴付けされた）フォトラブダス属（Photorhabdus）株の現在利用可能な配列データに基づき、当業者に用語「ＰＶＣエフェクター」及びそれらのＰＶＣエフェクターの配列の理解（及び例えば、代替（ゲノム）配列中のさらなるＰＶＣエフェクターをどのように検索／マイニングするか）を提供する。上記のとおり、本発明者らは、ＰＶＣエフェクタータンパク質が、ＰＶＣニードル複合体中へのＰＶＣエフェクタータンパク質（例えば、ペイロード）のパッケージ／ロードを指向するために必要な（及び十分な）リーダー配列を含むことを見出した。
【0112】
【表1】
【0113】
【表2】
【0114】
【表3】
【0115】
表１に提供されるアクセッション番号は例示目的のために提供され、本明細書に記載のＰＶＣエフェクターの（又はそれと高い類似性を有する）例示のアミノ酸配列を提供する。前記アクセッション番号の配列は、GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）を介してアクセスすることができる。
【0116】
ローカスタグ（「ＰＡＵ」又は「Ｐｌｕ」で始まる）は、上記GenBankを介して利用可能なゲノム配列中のエフェクターに割り当てられたローカスタグに対応する。「ＰＡＴ」（株Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）Thai株PB68.1を指す）及び「ＰＡＫ」（株Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）Kingscliffを指す）で始まるローカスタグは、前記株のゲノム内のＰＶＣエフェクター遺伝子の同定時に（公的に利用可能な配列のローカスタグと一致する様式で）本発明者らにより割り当てられた。
【0117】
このローカスタグは、本明細書において対応するＰＶＣエフェクターポリペプチドを指すために使用することができる。
【0118】
一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＫ＿１９８５（配列番号１）、ＰＡＫ＿１９８７（配列番号２）、ＰＡＫ＿１９８８（配列番号３）、ＰＡＫ＿２０７５（配列番号４）、ＰＡＫ＿２０７７（配列番号５）、ＰＡＫ＿２８９２（配列番号６）、ＰＡＫ＿２８９３（配列番号７）、ＰＡＫ＿２８９４（配列番号８）、ＰＡＫ＿３５２５（配列番号９）、ＰＡＴ＿００１４８（配列番号１０）、ＰＡＴ＿００１４９（配列番号１１）、ＰＡＴ＿００１５０（配列番号１２）、ＰＡＴ＿００１５２（配列番号１３）、ＰＡＴ＿０２３０８（配列番号１４）、ＰＡＴ＿０２３０９（配列番号１５）、ＰＡＴ＿０２３１０（配列番号１６）、ＰＡＴ＿０２９５６（配列番号１７）、ＰＡＴ＿０２９５７（配列番号１８）、ＰＡＴ＿０３１７１（配列番号１９）、ＰＡＴ＿０３１７２（配列番号２０）、ＰＡＴ＿０３１７７（配列番号２１）、ＰＡＵ＿０２００９（配列番号２２）、ＰＡＵ＿０２０１０（配列番号２３）、ＰＡＵ＿０２０９５（配列番号２４）、ＰＡＵ＿０２０９６（配列番号２５）、ＰＡＵ＿０２０９７（配列番号２６）、ＰＡＵ＿０２０９８（配列番号２７）、ＰＡＵ＿０２２３０（配列番号２８）、ＰＡＵ＿０２８０５（配列番号２９）、ＰＡＵ＿０２８０６（配列番号３０）、ＰＡＵ＿０２８０７（配列番号３１）、ＰＡＵ＿０３３３２（配列番号３２）、ＰＡＵ＿０３３３７（配列番号３３）、Ｐｌｕ１６５１（配列番号３４）、Ｐｌｕ１６７１（配列番号３５）、Ｐｌｕ１６７２（配列番号３６）、Ｐｌｕ１６９０（配列番号３７）、Ｐｌｕ１６９１（配列番号３８）、Ｐｌｕ１７１２（配列番号３９）、Ｐｌｕ１７１３（配列番号４０）、Ｐｌｕ１７１４（配列番号４１）、Ｐｌｕ２４００（配列番号４２）、Ｐｌｕ２４０１（配列番号４３）、Ｐｌｕ２５１４（配列番号４４）、Ｐｌｕ２５１５（配列番号４５）、Ｐｌｕ１６４９（配列番号４６）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の遺伝子（括弧中のコードされるＰＶＣエフェクタータンパク質の配列番号を有する）によりコードされる。
【0119】
一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＵ＿０２００９（配列番号２２）、ＰＡＵ＿０２０１０（配列番号２３）、ＰＡＵ＿０２０９５（配列番号２４）、ＰＡＵ＿０２０９６（配列番号２５）、ＰＡＵ＿０２０９７（配列番号２６）、ＰＡＵ＿０２０９８（配列番号２７）、ＰＡＵ＿０２２３０（配列番号２８）、ＰＡＵ＿０２８０５（配列番号２９）、ＰＡＵ＿０２８０６（配列番号３０）、ＰＡＵ＿０２８０７（配列番号３１）、ＰＡＵ＿０３３３２（配列番号３２）、ＰＡＵ＿０３３３７（配列番号３３）、Ｐｌｕ１６５１（配列番号３４）、Ｐｌｕ１６７１（配列番号３５）、Ｐｌｕ１６７２（配列番号３６）、Ｐｌｕ１６９０（配列番号３７）、Ｐｌｕ１６９１（配列番号３８）、Ｐｌｕ１７１２（配列番号３９）、Ｐｌｕ１７１３（配列番号４０）、Ｐｌｕ１７１４（配列番号４１）、Ｐｌｕ２４００（配列番号４２）、Ｐｌｕ２４０１（配列番号４３）、Ｐｌｕ２５１４（配列番号４４）、Ｐｌｕ２５１５（配列番号４５）、Ｐｌｕ１６４９（配列番号４６）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の遺伝子（括弧中のコードされるＰＶＣエフェクタータンパク質の配列番号を有する）によりコードされる。これらの遺伝子名は、上記のとおりGenBankを介してアクセス可能なフォトラブダス属（Photorhabdus）ゲノム配列中のＰＶＣエフェクター遺伝子の「ローカスタグ」に対応する。ＰＡＴ及びＰＡＫローカスタグは、用語が公的に利用可能なゲノム配列のＰＡＵ及びＰｌｕローカスタグと一致するように本発明者らにより生成された。
【0120】
したがって、ＰＶＣエフェクターは上記に列挙される１つ以上の遺伝子によりコードされ得る。
【0121】
一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＫ＿０２０７５（配列番号４）、ＰＡＵ＿０２００９（配列番号２２）、ＰＡＵ＿０２０９６（配列番号２５）、ＰＡＵ＿０２８０６（配列番号３０）、ＰＡＵ＿０３３３２（配列番号３２）、Ｐｌｕ１６５１（配列番号３４）、Ｐｌｕ１６４９（配列番号４６）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の遺伝子（括弧中のコードされるＰＶＣエフェクターの配列番号を有する）によりコードされる。
【0122】
好ましい実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＵ＿０２８０６（配列番号３０）、ＰＡＵ＿０３３３２（配列番号３２）、Ｐｌｕ１６５１（配列番号３４）、Ｐｌｕ１６４９（配列番号４６）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の遺伝子（括弧中のコードされるＰＶＣエフェクターの配列番号を有する）によりコードされる。
【0123】
ＰＶＣエフェクターは、配列番号１～配列番号４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性；より好ましくは、１００％の配列同一性）を有する配列を有し得る。例えば、ＰＶＣエフェクターは、配列番号２２～４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性；より好ましくは、１００％の配列同一性）を有する配列を有し得る。
【0124】
本発明者らは、ｇｏｇＢ１（ＰＡＵ＿０２８０６）及びＰｎｆ（ＰＡＵ＿０３３３２）ＰＶＣエフェクターのリーダー配列がＰＶＣニードル複合体中への（融合）ペイロードのパッケージにおいて特に効率的であると同定した。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＵ＿０２８０６（例えば、配列番号３０のアミノ酸配列を有する）によりコードされる。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、ＰＡＵ＿０３３３２（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列を有する）によりコードされる。
【0125】
一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号１～配列番号４６（例えば、配列番号２２～配列番号４６）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。例えば、ＰＶＣエフェクターは、配列番号４、配列番号２２、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号４６から選択される配列を含み得る（又は本質的にそれからなり得る）。
【0126】
一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号４のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。一実施形態において、ＰＶＣエフェクターは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む（又は本質的にそれからなる）。
【0127】
用語「パッケージ」（用語「トランスパッケージ」及び「ロード」と同義的に使用される）は、ＰＶＣニードル複合体が続いて標的細胞中へのペイロードの送達（例えば、インジェクト）のために構成されるようなアセンブルＰＶＣニードル複合体の内部、又は末端（チップ）中への、本発明のリーダー配列（ペイロードが結合／融合している）によるペイロードの指向を意味する。したがって、ペイロードは、ＰＶＣニードル複合体内でパッケージすることができ、又はＰＶＣニードル複合体の末端（又はチップ）においてパッケージすることができる（例えば、ペイロードの少なくとも一部は、ＰＶＣニードル複合体の外側であり得る）。
【0128】
用語「ペイロード」（本明細書において用語「反応部位」と同義的に使用される）は、アセンブルＰＶＣニードル複合体の内部、又は末端（チップ）中にパッケージされ、続いて（標的）細胞中に送達（例えば、インジェクト）される分子を意味する。野生型フォトラブダス属（Photorhabdus）において、ペイロードは、ＰＶＣオペロンの構造遺伝子の下流（３’）の遺伝子により（上記のとおり）コードされるＰＶＣエフェクター（より特定すると、前記ＰＶＣエフェクターのエフェクター部分）である。例えば、アデニレートシクラーゼエフェクターをコードするエフェクター遺伝子ＰＡＵ＿０３３３７（ＰＶＣｐｎｆ１７として列挙）（例えば、配列番号３３）；及びＰｎｆエフェクターをコードするＰＡＵ＿０３３３２（ＰＶＣｐｎｆ２１として列挙）（例えば、配列番号３２）を有する図１（Ｄ）のモデルＰＶＣオペロン参照。
【0129】
本発明のリーダー配列及びペイロードは、「（例えば、野生型）ＰＶＣエフェクター（例えば、表１に概説される遺伝子の１つによりコードされるポリペプチド）と区別」される「エフェクター融合物」（又は単に「融合物」）を形成する。例えば、エフェクター融合物は、第２の（異なる）ＰＶＣエフェクター（のエフェクター部分）（好ましくは、前記第２のＰＶＣエフェクターのアミノ酸５１からＣ末端アミノ酸）に融合している第１のＰＶＣエフェクターからのリーダー配列から形成されるキメラであり得、前記第１のＰＶＣエフェクター及び前記第２のＰＶＣエフェクターは異なる。エフェクター融合物は、非ＰＶＣエフェクターポリペプチドに融合している本明細書に記載のリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）キメラであり得る。エフェクター融合物は、非フォトラブダス属（Photorhabdus）ポリペプチドに融合している本明細書に記載のリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）キメラであり得る。エフェクター融合物は、核酸に融合している本明細書に記載のリーダー配列を含むリーダー配列－核酸融合物（好ましくは、コンジュゲート）であり得る。
【0130】
エフェクター融合物は、毒性ペイロードに融合しているリーダー配列を含む融合物複合体に限定されない（例えば、リーダーは治療ペイロードに融合させることができた）。したがって、「エフェクター融合物」の文脈で使用される用語「エフェクター」は、ＰＶＣニードル複合体（種々の効果、例として、毒素原性及び／又は治療効果を提供し得た）中にパッケージされるペイロードを意味する。したがって、用語「エフェクター融合物」は、本明細書において用語「融合物」と互換的に使用することができる。
【0131】
用語「エフェクター融合物」は、用語「リーダー配列－ペイロード融合物」、及び／又は「リーダー配列－ペイロード複合体」と同義的に使用することができる。
【0132】
或いは又はさらに、ペイロードは、ＰＶＣエフェクタータンパク質と区別することができる（例えば、ＰＶＣエフェクターのアミノ酸５１からＣ末端アミノ酸と区別することができる）。例えば、ペイロードは、野生型フォトラブダス属（Photorhabdus）細菌に見出されないポリペプチド又は核酸であり得る。
【0133】
フォトラブダス属（Photorhabdus）によりコードされる種々の天然ＰＶＣエフェクターペイロードのサイズ（例えば、ポリペプチド長さ）及び構造の分析は広範な異なるＰＶＣエフェクターの長さ及び構造が存在することを示し、本発明のＰＶＣニードル複合体送達系の適用可能性が目的ペイロードのサイズによっても特性によっても限定されないことを実証する。まとめると、特定の二次構造も、生物物理学的特性も、積み荷の長さも要求されず、ＰＶＣニードル複合体を多用途多機能送達ビヒクルとして利用することができることを裏付ける。
【0134】
ペイロードは、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドペイロード）、核酸（例えば、核酸ペイロード）、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上であり得る。好ましい実施形態において、ペイロードは、ポリペプチドである。
【0135】
ポリペプチドペイロードの例としては、抗体（例えば、抗ＭＤＭ抗体）、ナノボディ、ペプチドワクチン（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）ペプチドワクチン）、核内因子－κＢ阻害剤、Ｔ３ＳＳペイロード（例えば、ＮＦ－ｋＢ及び／又はＭＡＰＫ経路を阻害するＴ３ＳＳペイロード）、抗アポトーシスペプチド（例えば、ＢＨ４）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドキノン内部オキシドレダクターゼ（Ｎｄｉ１）、ＰＨＯＸ複合体サブユニット、ミオチュブラリン、核酸（好ましくは、ＤＮＡ）改変酵素、又はそれらの組み合わせが挙げられる。好適な核酸改変酵素の例としては、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）、トランスポザーゼ、Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９）、及び／又はＭａｄ７（好ましくは、Ｍａｄ７、より好ましくは、Ｃｒｅリコンビナーゼ）が挙げられる。ペイロードは、例えば、ｔＢｉｄ（配列番号１０９）及び／又はＢａｘＢＨ３ペプチド（ａａ５９～７３）（配列番号１１１）であり得る。
【0136】
酵素活性を有する任意のポリペプチドは、ペイロードであり得る。
【0137】
核酸ペイロードは、本発明のリーダー配列にコンジュゲート／架橋させることができる。例えば、銅フリーのクリックケミストリー（例えば、歪み促進型アルキンアジド付加環化（ＳＰＡＡＣ））を使用して核酸をリーダー配列に架橋させることができる。核酸ペイロードの例としては、プライマー、ｍＲＮＡ、核酸類似体、アプタマー、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ治療阻害剤（抗ｍｉＲ）、マイクロＲＮＡ治療模倣体（プロｍｉＲ）、長鎖非コーディングＲＮＡモジュレーター、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【0138】
リーダー配列は、ペイロードに直接的又は間接的に（例えば、スペーサーにより）融合させることができる。リーダー配列は、ペイロードに共有結合的又は非共有結合的に融合させることができる。好ましい実施形態において、リーダー配列は、ペイロードに共有結合的に融合している。例えば、融合物／エフェクター融合物は、（ポリペプチド）ペイロードに融合しているＰＶＣエフェクターリーダー配列を含む（又は本質的にそれからなる）（組換え）融合物タンパク質であり得る。
【0139】
本発明の別の態様は、本発明のＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。本発明の別の態様は、本発明のエフェクター融合物（例えば、融合物）をコードするヌクレオチド配列、及び任意選択で、ＰＶＣニードル複合体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【0140】
本発明の別の態様は、本発明のＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（好ましくは、単離核酸）を含む発現ベクターを提供する。本発明の別の態様は、本発明のエフェクター融合物（例えば、融合物）をコードするヌクレオチド配列、及び任意選択で、ＰＶＣニードル複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（好ましくは、単離核酸）を含む発現ベクターを提供する。
【0141】
本発明の別の態様は、単離核酸を含む宿主細胞であって、単離核酸は、本発明のＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。本発明の別の態様は、単離核酸を含む宿主細胞であって、単離核酸は、本発明のエフェクター融合物（例えば、融合物）をコードするヌクレオチド配列、及び任意選択で、ＰＶＣニードル複合体をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
【0142】
用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に使用することができる。
【0143】
本発明の別の態様は、発現ベクターを含む宿主細胞であって、発現ベクターは、本発明のＰＶＣエフェクターリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。本発明の別の態様は、発現ベクターを含む宿主細胞であって、発現ベクターは、本発明のエフェクター融合物（例えば、融合物）をコードするヌクレオチド配列、及び任意選択で、ＰＶＣニードル複合体をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。
【0144】
前記宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌（E.coli））、又は植物細胞であり得る。好ましい実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞（好ましくは、大腸菌（E.coli））である。
【0145】
一実施形態において、宿主細胞は、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞であり、任意選択で、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞は、誘導性プロモーターに作動可能に結合しているＰＶＣオペロンを含む（例えば、実施例３参照）。ＰＶＣオペロンは、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞に対して内因性であり得る（例えば、ＰＶＣオペロンは、ＰＶＣｕ４であり得る）。好適には、フォトラブダス属（Photorhabdus）細胞は、ATCCからアクセッション番号ATCC29999のもと入手可能であり得る。
【0146】
本発明の配列（例えば、リーダー配列及び／又は核酸配列）は、天然に存在する環境から取り出された配列、組換え体又はクローニング（例えば、ＤＮＡ）単離物、及び化学合成された類似体又は異種系により生物学的に合成された類似体を含む。
【0147】
本発明のリーダー配列及び／又はポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の手段により調製することができる。例えば、大量のリーダー配列及び／又はポリヌクレオチドを、好適な宿主細胞中での複製及び／又は発現により産生することができる。所望の断片をコードする天然又は合成ＤＮＡ断片は、典型的には、原核又は真核細胞中への導入及びその中で複製が可能な組換え核酸構築物、典型的には、ＤＮＡ構築物中に取り込まれる。通常、ＤＮＡ構築物は、単細胞宿主、例えば、酵母又は細菌中での自己複製に好適であるが、培養された細菌、昆虫、哺乳類、植物又は他の真核細胞系のゲノムへの導入及び組込みも意図され得る。
【0148】
本発明のリーダー配列及び／又はポリヌクレオチドは化学合成により産生することもでき、例えば、ホスホラミダイト法又はトリエステル法によるポリヌクレオチドであり、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置上で実施することができる。二本鎖（例えば、ＤＮＡ）断片は、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を一緒にアニールすることにより、又は適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を添加することにより化学合成の一本鎖産物から得ることができる。
【0149】
リーダー配列又は核酸配列に適用される場合、本発明の文脈における用語「単離」は、リーダー配列及び／又はポリヌクレオチド配列がその天然遺伝子環境から除去され、したがって他の余分な又は不所望なコード配列を有さず（しかし、天然に存在する５’及び３’非翻訳領域、例えば、プロモーター及び終結因子を含み得る）、遺伝子操作タンパク質産生系内の使用に好適な形態であることを示す。このような単離分子は、その天然環境から分離されたものである。
【0150】
配列相同性
種々の配列アラインメント法のいずれか、例として、限定されるものではないが、グローバル法、ローカル法及びハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法などを使用して同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコルは、当業者の技能の範囲内の定型的な手順である。グローバル法は、配列を分子の初めから終わりまで配列をアラインし、個々の残留ペアのスコアを加算することにより、及びギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、以下が挙げられる、CLUSTAL W、例えば、Julie D.Thompson et al.,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)参照；及び反復リファインメント、例えば、Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)参照。ローカル法は、入力配列の全てにより共有される１つ以上の保存モチーフを同定することにより配列をアラインする。非限定的な方法としては、例えば、以下が挙げられる、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)参照；ギブスサンプリング、例えば、C.E.Lawrence et al.,Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)参照；Align-M、例えば、Ivo Van WaIIe et al.,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)参照。
種々の配列アラインメント法のいずれか、例として、限定されるものではないが、グローバル法、ローカル法及びハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法などを使用して同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコルは、当業者の技能の範囲内の定型的な手順である。グローバル法は、配列を分子の初めから終わりまで配列をアラインし、個々の残留ペアのスコアを加算することにより、及びギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、以下が挙げられる、CLUSTAL W、例えば、Julie D.Thompson et al.,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)参照；及び反復リファインメント、例えば、Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)参照。ローカル法は、入力配列の全てにより共有される１つ以上の保存モチーフを同定することにより配列をアラインする。非限定的な方法としては、例えば、以下が挙げられる、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)参照；ギブスサンプリング、例えば、C.E.Lawrence et al.,Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)参照；Align-M、例えば、Ivo Van WaIIe et al.,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)参照。
【0151】
したがって、配列同一性パーセントは慣用の方法により決定される。例えば、Altschul et al.,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986及びHenikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19,1992参照。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列をアラインして以下に示されるとおり（アミノ酸は標準的な１文字コードにより示される）ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、及びHenikoff and Henikoff（前記箇所）の「blosum 62」スコア行列を使用してアラインメントスコアを最適化する。
【0152】
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列により共有される同一位置の数の関数である。したがって、％同一性は、同一のヌクレオチド／アミノ酸の数をヌクレオチド／アミノ酸の総数により割り、１００を掛けた数として計算することができる。％配列同一性の計算は、２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入を必要とするギャップの数、及びそれぞれのギャップの長さも考慮し得る。２つ以上の配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、既定の数学的アルゴリズム、例えば、当業者が精通しているBLASTを使用して実施することができる。
【化1】
【0153】
次いで、同一性パーセントは、
として計算される。
【数1】
として計算される。
【0154】
実質的に相同のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を有すると特徴付けされる。これらの変化は、好ましくはマイナーな性質のものであり、それは、保存的アミノ酸置換（以下参照）及びポリペプチドのフォールディングにも活性にも有意に影響を与えない他の置換；小さい欠失、典型的には１から約３０個のアミノ酸のもの；並びに小さいアミノ又はカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、約２０～２５残基までの小さいリンカーペプチド、又は親和性タグである。
【0155】
保存的アミノ酸置換
塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸
極性：グルタミン、アスパラギン
疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン
芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小分子：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン
塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸
極性：グルタミン、アスパラギン
疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン
芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小分子：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン
【0156】
２０個の標準的アミノ酸に加え、非標準的アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリジン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン及びα－メチルセリン）を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換することができる。限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、ポリペプチドアミノ酸残基について置換することができる。本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基も含み得る。
【0157】
天然に存在しないアミノ酸としては、限定されるものではないが、トランス－３－メチルプロリン、２，４－メタノ－プロリン、シス－４－ヒドロキシプロリン、トランス－４－ヒドロキシ－プロリン、Ｎ－メチルグリシン、アロ－トレオニン、メチル－トレオニン、ヒドロキシ－エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ－システイン、ニトロ－グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニル－アラニン、４－アザフェニル－アラニン、及び４－フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に取り込むいくつかの方法が当該技術分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用してナンセンス突然変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は、当該技術分野において公知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌（E.coli）Ｓ３０抽出物並びに市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系中で実施する。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Robertson et al.,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991;Ellman et al.,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung et al.,Science 259:806-9,1993；及びChung et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993）参照。第２の方法において、翻訳は、ツメガエル属（Xenopus）卵母細胞中で突然変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより実施する（Turcatti et al.,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996）。第３の方法では、大腸菌（E.coli）細胞を、置き換えるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不存在下及び所望の天然に存在しないアミノ酸（例えば、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニルアラニン、４－アザフェニルアラニン、又は４－フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然相当物に代わってポリペプチド中に取り込まれる。Koide et al.,Biochem.33:7470-6,1994参照。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾は、部位特異的突然変異誘発と組み合わせて置換の範囲をさらに拡大することができる（Wynn and Richards,Protein Sci.2:395-403,1993）。
【0158】
限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換することができる。
【0159】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該技術分野において公知の手順、例えば、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunningham and Wells,Science 244:1081-5,1989）に従って同定することができる。生物学的相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学的分析、電子線回折又は光親和性標識などの技術により、推定接触部位アミノ酸の突然変異と共に決定されるとおり構造の物理的分析により決定することもできる。例えば、de Vos et al.,Science 255:306-12,1992；Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver et al.,FEBS Lett.309:59-64,1992参照。必須アミノ酸の同一性は、本発明のポリペプチドの関連構成成分（例えば、トランスロケーション又はプロテアーゼ構成成分）との相同性の分析から推定することもできる。
【0160】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7,1988)又はBowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)により開示されているものを使用して作製し、検査することができる。簡潔に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能ポリペプチドを選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドをシーケンシングしてそれぞれの位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用することができる他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al.,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner et al.、米国特許第５，２２３，４０９号；Huse、国際公開第９２／０６２０４号）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al.,Gene 46:145,1986；Ner et al.,DNA7:127,1988）が挙げられる。
【0161】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7,1988)又はBowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)により開示されているものを使用して作製し、検査することができる。簡潔に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能ポリペプチドを選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドをシーケンシングしてそれぞれの位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用することができる他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al.,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner et al.、米国特許第５，２２３，４０９号；Huse、国際公開第９２／０６２０４号）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al.,Gene 46:145, 1986；Ner et al.,DNA 7:127,1988）が挙げられる。
【0162】
特に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,20 ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)、及びHale & Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)は、本開示において使用される用語の多くの一般知識を当業者に提供する。
【0163】
本開示は、本明細書において開示される例示的方法及び材料により限定されず、本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施形態の実施及び検査において使用することができる。数値範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。特に示されない限り、任意の核酸配列は左から右に５’から３’の向きで記述され；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの向きでそれぞれ記述される。
【0164】
本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様又は実施形態の限定ではない。
【0165】
アミノ酸は、本明細書においてアミノ酸の名称、３文字略記又は１文字略記を使用して言及される。本明細書において使用される用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書において使用される用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用の１文字及び３文字コードを使用することができる。IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるとおりのアミノ酸についての３文字コード。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によりコードさせることができることも理解される。
【0166】
用語の他の定義は、本明細書全体にわたり現れ得る。例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変動し得ることを理解すべきである。本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるため、本明細書において使用される用語は特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定するものと意図されないことも理解すべきである。
【0167】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限の間のそれぞれの介在値も、特に文脈が明確に示さない限り下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されることが理解される。任意の記述値又は記述範囲中の介在値と、任意の他の記述値又はその記述範囲中の介在値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その範囲に独立に含め、又は除くことができ、より小さい範囲に限界のいずれかが含まれ、いずれも含まれず、又は両方とも含まれる場合、記述範囲の具体的に除かれる限界に従ってそれぞれの範囲も本開示に包含される。記述範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除く範囲も本開示に含まれる。
【0168】
本明細書において使用されるとおり、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」、及び「the」は、特に文脈が明確に示さない限り複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「エフェクター」への言及は複数のそのようなエフェクターを含み、「エフェクター」への言及は１つ以上のエフェクター及び当業者に公知のその等価物への言及などを含む。
【0169】
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示について提供されるにすぎない。本明細書において、そのような刊行物が添付される特許請求の範囲に対して先行技術を構成するという許可として解釈すべきではない。
【0170】
本発明の実施形態を、例としてのみ、以下の図面及び実施例を参照して目下記載する。
【図面の簡単な説明】
【0171】
図面の簡単な説明
【図1A】ＰＶＣニードル複合体をコードする１つのＰＶＣオペロンレイアウト（起源ゲノムの変動領域中に存在する遺伝子クラスタ）の模式的表示を示す。
【図1B】クラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩ ＰＶＣオペロンレイアウトの模式的表示。これらのクラス間の相同サブユニットタイプは、類似の陰影（グレースケール）を有すると示される。
【図1C】アセンブルＰＶＣニードル複合体の説明。示されるナンバリングを使用して（Ａ）の遺伝子クラスタを（Ｃ）の構造のコードされるタンパク質の位置と相関させる（例えば、Ａのキャップ「１６」クラスタは、（Ｂ）の最も左側のキャップ領域の「１６」と示される）。
【図1D】ペイロード領域中の２つのエフェクター遺伝子（Ｒｈｓ様アデニレートシクラーゼ、及びＰＡＵ＿０３３３２）を示すモデルクラスＩ ＰａＡＴＣＣ４３９４９ＰＶＣｐｎｆオペロン（例えば、配列番号９３によりコードされる）のマップ。
【図2】オーバーラッピングＰＣＲに基づくＰＶＣニードル複合体発現プラスミドの調製のためのクローニング手順の概要を示す。ＰＣＲ断片（オーバーラッピング領域を有する）は、ＰＶＣオペロンを標的化する関連プライマーと共にＰ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ＡＴＣＣ４３９４９（ATCCからアクセッション番号ATCC43949のもと利用可能）のテンプレートｇＤＮＡから提供される。
【図3A】ＰＶＣニードル複合体（例えば、上記発現ベクターを有する細胞から調製）の（インビトロ）試料の透過型電子顕微鏡写真を示す。ＰＶＣニードル複合体は、区別される「ナノシリンジ」構造にアセンブルし、収縮構造としてのその役割と一致する。
【図3B】高分解単一粒子クライオＥＭ断層撮影構造に由来するＰＶＣニードル複合体の３Ｄレンダリングモデルを示す。
【図4A】抗Ｐｎｆ（イムノゴールド）抗体でのイムノゴールド染色後のＰｎｆペイロードを含むＰＶＣニードル複合体の透過型電子顕微鏡写真を示し、Ｐｎｆ－ペイロード毒素がＰＶＣニードル複合体と会合していることを裏付ける（ＰＶＣｐｎｆと称される）。ＰＶＣｐｎｆニードル複合体は、ＰＶＣｐｎｆオペロンをコードする大腸菌（E.coli）コスミドクローンの上清から調製した。Ｐｎｆ（ＴＧＱＫＰＧＮＮＥＷＫＴＧＲ、配列番号９６）エピトープに対する抗ペプチド抗体を使用してペイロード毒素タンパク質を局在化させた。Ｐｎｆ毒素は、破壊又は収縮したニードル複合体の末端においてのみ検出することができ、毒素が複合体内に含有されるという証拠を提供した（矢印）。
【図4B】ウェスタンブロット分析は、ＰＶＣニードル複合体が化学的又は物理的に破砕される場合、Ｐｎｆタンパク質（毒素）は抗ペプチド抗体を使用してのみ検出することができることを裏付ける。これらの調製物はＰａＡＴＣＣ４３９４９上清から採取した。清澄化上清中でＰｎｆを検出する不能性は、全てのタンパク質がＰＶＣニードル複合体濃縮調製物と会合していることを裏付ける。レーン１＋５；超音波処理試料、２＋６；１ＭのＮａＣｌ処理、３＋７；１％のＳＤＳ処理４＋８；１Ｍの尿素処理。ＰＶＣニードル複合体は１ＭのＮａＣｌ中で安定であると考えられることに留意されたい。
【図5A】大腸菌（E.coli）コスミドクローンにより異種的に産生されたＰａＡＴＣＣ４３９４９ＰＶＣｐｎｆニードル複合体（ナノシリンジ）の天然濃縮調製物が注射された５齢タバコスズメガ（Manduca sexta）からのエクスビボ血球（昆虫マクロファージ／好中球同等物）のクライオＳＥＭ画像を示す。対照処理から不存在のＰｎｆペイロード毒素の作用方式と一致するＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）（小さい矢印）及び膜ラッフリング効果（大きい矢印）に対応する豊富な線構造に留意されたい。スケールバー＝５０μｍ。２５ｋＶ；倍率４０Ｋ。
【図5B】大腸菌（E.coli）コスミドクローンにより異種的に産生されたＰａＡＴＣＣ４３９４９ＰＶＣｐｎｆニードル複合体（ナノシリンジ）の熱不活化濃縮調製物が注射された５齢タバコスズメガ（Manduca sexta）からのエクスビボ血球（昆虫マクロファージ／好中球同等物）のクライオＳＥＭ画像を示す。スケールバー＝５０μｍ。２５ｋＶ；倍率５０Ｋ。
【図6A】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。ＰｎｆロードＰＶＣニードル複合体を昆虫（ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）昆虫幼体）中に注射し、所与の用量（実施例に説明）について１５分以内に強力な活性を示した、致死率／罹病率は、典型的には、それらの死滅／瀕死昆虫における「メラニン化」免疫応答と関連することに留意されたい。
【図6B】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。動物中に注射された対照、変性（沸騰を介する）ＰｎｆロードＰＶＣニードル複合体は、活性を示さなかった。
【図6C】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。ＰＶＣニードル複合体を欠く精製Ｐｎｆ（ペイロード）（即ち、複合体中にパッケージされていないＰｎｆ）は、動物（左側）に対してもHeLa細胞系（右側）に対しても活性を示さなかった。
【図6D】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。タンパク質を含有する「BioPorter」リポソーム調製物を介してHeLa細胞の細胞質中への送達されたＰｎｆ（ペイロード）は、細胞中の多核化により証明されるとおり強力な活性／毒性を示した。
【図6E】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。適切なプラスミドでの形質移入後の細胞内発現によりHeLa細胞の細胞質中への送達されたＰｎｆ（ペイロード）は、細胞中の多核化により証明されるとおり強力な活性／毒性を示した。
【図6F】ＰＶＣニードル複合体との接触後の（毒性）細胞表現型が細胞内毒素送達に起因することを実証する実験結果を示す。レサズリンプレートリーダーアッセイにより測定されたＴＨＰ１由来ヒトマクロファージの呼吸率に対するＰＶＣｐｎｆ＋Ｐｎｆの効果。熱変性及び空のＰＶＣｐｎｆナノシリンジが強力な有害効果を示さなかったことに留意されたい。これらの同じ試料を、ガレリア属（Galleria）幼体中への注射により検査した。ＰＶＣｐｎｆ＋Ｐｎｆ試料は、数分以内におよそ５０％超の致死率を示した一方（下段の２つのパネルにおける暗色化した幼体）、熱変性及び空のＰＶＣｐｎｆ注射昆虫は全て健常のままであった（上段の２つのパネルにおける暗色化していない幼体）。
【図7A】種々のＰＶＣオペロンと会合する一連の内因性ペイロード（毒素）の（インシリコ）予測二次構造を示し、多種多様な構造タイプを実証する。
【図7B】予測等電点に対してプロットされた種々のペイロード（毒素）のアミノ酸長さ。
【図8A】本発明のリーダー配列（例えば、５０個のアミノ酸）がフォトラブダス属（Photorhabdus）中で発現されるＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）中へのペイロードタンパク質／ペプチドの（トランス）パッケージに必要であり、十分であるという裏付けを示す。１～６：Ｐｎｆ及び非天然ｃｒｅリコンビナーゼ及びＭｙｃタグを発現するものを含むキメラエフェクタータンパク質発現構築物（アラビノース誘導性ｐＢＡＤ３０ベクター中でトランス発現される）の模式的マップ。Ｃ末端Ｍｙｃタグエピトープを黒色矢印として示す。
【図8B】本発明のリーダー配列（例えば、５０個のアミノ酸）がフォトラブダス属（Photorhabdus）中で発現されるＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）中へのペイロードタンパク質／ペプチドの（トランス）パッケージに必要であり、十分であるという裏付けを示す。抗Ｍｙｃマウス抗体を使用するウェスタンブロット。試料は、（Ａ）に示されるトランスパッケージ発現構築物１～６を保有する染色体操作Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１から過剰発現された精製ＰＶＣ（ｕ４）ニードル複合体（ナノシリンジ）からのものである。ブランクｐＢＡＤ３０プラスミドを陰性対照として使用し、シグナルを示さなかった。矢印は、予測産物についての正確なバンドサイズを示す。
【図9】リーダー配列のアラインメントを示し、アミノ酸特性に基づくリーダー配列間の化学組成コンセンサスの存在を実証する。より特定すると、リーダー配列は、２つの負電荷領域と、そのそれぞれに続く正電荷領域［－ｖｅ］［＋ｖｅ］［－ｖｅ］［＋ｖｅ］の類似の電荷パターンを含む。
【図10A】粒子状調製物からのＰＶＣニードル複合体及びペイロードのウェスタンブロット分析を示す（材料及び方法に記載される塩化セシウム勾配及びモノリスＦＰＬＣ調製物）。［１］（ｐＢＡＤＰＶＣｐｎｆ、ナノシリンジのＰＶＣ１６はＦＬＡＧタグ付きであり、抗ＦＬＡＧ Ａｂで検出可能なＰＶＣ１６：：ＦＬＡＧを提供する）において、「ＰＶＣＰｎｆ」（Ｐｎｆペイロードを有するＰＶＣニードル複合体）のタグ付きキャップタンパク質からのシグナルを見ることができ、精製分画中のＰＶＣニードル複合体の存在を裏付ける。［２］（ｐＢＡＤＰＶＣｐｎｆ＋Ｃｒｅ：：Ｍｙｃ、抗Ｍｙｃ Ａｂで検出可能、ＣｒｅはＰｎｆリーダー、例えば、配列番号７８のＮ末端融合物を有する）において、（１）と同じ試料中の大量にパッケージされたＭｙｃタグ付きペイロードタンパク質からのシグナル、精製ＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）中のＣｒｅペイロードの存在を裏付ける。［３］（ＰＶＣＵ４＋Ｃｒｅ：：Ｍｙｃ、抗Ｍｙｃ Ａｂで検出可能、ＣｒｅはＰｎｆリーダー、例えば、配列番号７８のＮ末端融合物を有する）において、異なるＰＶＣニードル複合体シャーシ（「ＰＶＣＵ４」）精製物をＭｙｃタグ付きＣｒｅについてプロービングし、パッケージされた（パッケージされたＭｙｃタグ付きＣｒｅ）対応バンドを明らかにする。明確性のためにこれをブロットにおいて強調する。
【図10B】ＰＶＣニードル複合体の透過型電子顕微鏡写真は、野生型（Ｐｎｆペイロードを有する）ＰＶＣニードル複合体及び非定型（非天然）リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）ペイロードを有するＰＶＣニードル複合体の両方が、検査されたいずれのシャーシにおいてもＰＶＣニードル複合体の形態に影響を与えず、それらが異常にアセンブルされないことを確保することを示す。
【図10C】（Ａ）のものに対する追加／補足データを提供する。より詳細には、（Ｃ）は、大腸菌（E.coli）中で発現された精製ＰＶＣｐｎｆ中へのＣｒｅリコンビナーゼの（トランス）パッケージのウェスタンブロット分析を介するさらなる証拠を提供する。ウェスタンブロットは、所与の量の抗ＦＬＡＧ抗体ウェスタンシグナル（ＰＶＣ１６：：ＦＬＡＧの取り込みに起因するナノシリンジについての特異的プローブ）について、かなり多量のＣｒｅペイロードが検出される（抗Ｍｙｃタグ抗体を使用）ことを実証する。数字は２倍希釈物を示す。希釈時、ナノシリンジからの抗ＦＬＡＧシグナルが損失する一方、ペイロードはほとんどのレーンにおいて強いままであることに留意されたい。ＣｓＣｌは、塩化セシウム密度勾配遠心による精製を示す。「Ｍｏｎ」は、試料を「モノリス型」カラムを介してさらにアニオン交換したことを示す。「溶出後」、「インターフェーズ（interphase）」、「サブインターフェーズ（Sub-Interph.）」は、精製プロセスからシグナルが検出される液体分画を示す。
【図10D】大腸菌（E.coli）中でＰＶＣｐｎｆ中にトランスパッケージされたＣｒｅのウェスタンブロット分析。ペイロードを、ナノシリンジ－ペイロード複合体の精製後にそれらの取り込まれた「Ｍｙｃ」タグ（Ｃ末端融合物）についてプロービングする。粒子調製物のウェスタンブロット分析は、４つ全てのリーダーが外因性Ｃｒｅ酵素を効率的にトランスパッケージすることができたことを裏付ける。
【図10E】例示されるリーダー配列が全体にわたり十分に分布され、したがって多様性が最大に連続的であり、又はそれに近いことを実証する系統樹（実施例４．２参照）。
【図11】抗ＦＬＡＧ及び抗Ｍｙｃ抗体で同時にプロービングされた別個のプラスミドからの（Ｍｙｃタグ付き）Ｐｎｆの同時発現なし（１）及びあり（２）で発現されたＰＶＣニードル複合体のウェスタンブロット分析を示す。標識１のレーンにおいて、ＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）は、大腸菌（E.coli）内で「ペイロードプラスミド」（リーダー配列に結合しているペイロードタンパク質をコードする発現プラスミド）の存在なしで発現させ、精製した。これは、シリンジ（ＰＶＣニードル複合体）自体上に存在するＦＬＡＧタグにのみ対応するバンドをもたらす。レーン２について、同じアプローチを着手したが、タグ付きペイロード（Ｍｙｃ－Ｐｎｆ）を担持する（別個の）プラスミドも含む培養物を使用した。ＦＬＡＧ及びＭｙｃタグに対応するバンドを見ることができ、Ｐｎｆペイロードの存在を裏付ける（１及び２内の４つのレーンは塩化セシウム勾配からの単に異なる精製分画である）。
【図12】Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１ ＰＶＣｕ４過剰発現株におけるトランスパック実験のウェスタンブロット分析を示す。結果は、ｍｙｃタグ付きＰｖｃ１７（Ｐｌｕ１６５１ｗｈｏｌｅ：：Ｍｙｃ）のトランスパッケージを実証する。
【図13A】Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１ ＰＶＣｕｎｉｔ４過剰発現株におけるトランスパッケージ実験（実施例に説明される）のさらなるウェスタンブロット分析を示す。結果は、Ｐｎｆのリーダー（ＰＡＵ＿０３３３２リーダー）を使用するＭｙｃタグ付きＰｖｃ１７（Ｐｌｕ１６５１：：Ｍｙｃ）及びＭｙｃタグ単独のトランスパック、並びにそのリーダーが必要であることを実証する。（Ａ）レーン１は、Ｍｙｃタグに融合しているリーダー（ＰＡＵ＿０３３３２：：Ｍｙｃ）のパッケージを示し；レーン３は、リーダー配列が不存在の（Ｍｙｃ単独がパッケージされない）場合にパッケージの欠落を示し；レーン４は、リーダー配列が不存在の場合にＨｖｎＡ（天然エフェクター）のパッケージの欠落を示し；レーン６は、Ｍｙｃタグ付きＰＡＵ＿０３３３２：：Ｐｌｕ１６４９、即ち、ＰＡＵ＿０３３３２からのリーダー（即ち、ＰＡＵ＿０３３３２のアミノ酸１～５０）及びＰｌｕ１６４９からのエフェクター（即ち、アミノ酸５１～Ｃ末端）のキメラのパッケージを示す。レーン１及び６の高い強度のバンドは、Ｐｎｆ（ＰＡＵ＿０３３３２）リーダーがペイロードのパッケージに特に有効であることを実証する）。
【図13B】Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１ ＰＶＣｕｎｉｔ４過剰発現株におけるトランスパッケージ実験（実施例に説明される）のさらなるウェスタンブロット分析を示す。結果は、Ｐｎｆのリーダー（ＰＡＵ＿０３３３２リーダー）を使用するＭｙｃタグ付きＰｖｃ１７（Ｐｌｕ１６５１：：Ｍｙｃ）及びＭｙｃタグ単独のトランスパック、並びにそのリーダーが必要であることを実証する。（Ｂ）レーン１は、抗Ｍｙｃ抗体ウェスタンブロットを使用したＣ末端Ｍｙｃタグを有するＰｌｕ１６５１のパッケージを示す。
【図14】ＰＡＵ＿０２８０６（ＧｏｇＢ）リーダーを使用したＭｙｃタグ付きＰｎｆ（ＰＡＵ＿０３３３２：：Ｍｙｃ）の極めて高レベルのトランスパッケージを実証するさらなるウェスタンブロット分析を示す（２番目のレーン、ラダーレーンを含まない）。第１のレーンは、ＰＡＵ＿０３３３２エフェクターをパッケージするためのＰｌｕ１６４９リーダー（Ｍｙｃタグ付きＰｌｕ１６４９：：ＰＡＵ＿０３３３２）の使用を実証する。バンドは、第２のレーンにおけるバンドの相対強度に起因して弱いと考えられる。実験は、５０ｍＬの培養物のフィルター滅菌、ＰＶＣを分解するために添加された８Ｍ最終濃度の尿素を含んだ。試料を１０ｍＬ上清から回収した。
【図15】フォトラブダス属（Photorhabdus）から発現されたＰＶＣｕｎｉｔ４中への、図１３に記載されるＣ末端Ｍｙｃタグを有するＰｌｕ１６５１（ｐｖｃ１７）のトランスパッケージを実証するさらなるウェスタンブロット分析を示す。未加工は上清からの粒子状調製物を表し、Ｂｅ、Ｂ２及びＩＰは塩化セシウム勾配精製からの異なる「カット」を表す。
【図16A】（実施例６の）マウスオルガノイド実験におけるＣｒｅの図式的な作用機序の説明、及びどのように陽性対照（ＴＡＭ）がＣｒｅ活性化を促進するかを提供する。白色矢印は、ｔｄＴｏｍ蛍光レポーター遺伝子を発現する細胞の局在を示す。
【図16B】大腸菌（E.coli）から発現され、精製されたＰＶＣｐｎｆによるネズミ胆管オルガノイド中への活性トランスパッケージされたＣｒｅリコンビナーゼの送達の実証。白色丸は、蛍光レポーター遺伝子を発現する細胞の群の局在を示す。上段画像は、光学顕微鏡観察を介して得られた画像の直接のグレースケール変換を示す。下段画像は、偽色を増強した陽性細胞の対応画像を示し、それは前者のグレースケール変換内で影響を受けた細胞と周囲の影響を受けなかった細胞との間の差の同定を補助するために単に提供される。
【図17】ペイロード（Ｃａｓ９様タンパク質ＭＡＤ７）あり及びなしの両方でのナノシリンジ発現のドットブロット分析を示す。ＩＰＴＧ誘導性ＭＡＤ７のいくらかのリーキーな発現は、この発現系に一般的であるように誘導前（Ｔ１）に見られる。予測されたとおりいかなる時点でもＰＶＣ単独試料からのＭｙｃシグナルは存在せず、ＭＡＤ７シグナルは約２４時間周期にわたる発現全体にわたり成長する。強力なＭｙｃシグナルは他箇所に記載されるとおり超遠心分離を介する精製後に維持され、タンパク質がナノシリンジシャーシ系中に取り込まれることを示す。ＦＬＡＧシグナルはＭＡＤ７試料においてロバストであり、予測されるとおり誘導後に生じ、精製後に持続する。それというのも、このプロモーター系がリーキーな発現を低減させたためである。ナノシリンジ及びＭＡＤ７は発現に関して互いに適合性であること、並びにこれまで検査された最大タンパク質ＭＡＤ７をナノシリンジ系中にパッケージすることができることが結論付けられる。
【図18】大腸菌（E.coli）から発現された精製ＰＶＣｐｎｆ中へのアポトーシス促進性ｔＢｉｄタンパク質ドメイン及びＢａｘＢＨ３（両方、Ｎ末端に融合している配列番号７８のリーダー配列を有する）ペプチドのトランスパッケージを裏付けるウェスタンドットブロット分析を示す（７及び８）。そのコグネイト毒素「Ｐｎｆ」を有するナノシリンジを、陽性対照として２つの異なる方法（５及び６）により精製されたとおり示す。パネルの下段のブロットは、上記パネルの７及び８と同じ実施例を表す。これらのブロットは同じ構築物の別の精製から作製し、精製の再現性を実証した。この実験は、例えば、実施例９のアポトーシス送達系において使用される「ｔＢｉｄタンパク質ドメイン及びＢａｘＢＨ３ペプチド」パック試料（ナノシリンジ）を良好に調製することができることを実証した。
【図19A】パッケージされたナノシリンジに２０分間のみ曝露させた細胞からのＴＵＮＥＬ染色顕微鏡分析を示す。１番目の（左側）バー＝ＤＮアーゼＩ処理細胞（＋対照）；２番目のバー＝ＤＮアーゼＩ処理もナノシリンジ処理もなし（－対照）；３番目のバー＝細胞を、（Ｎ末端に融合している配列番号７８のリーダー配列を介して）ｔＢｉｄでパッケージされたナノシリンジに曝露させた；４番目の（右側）バー＝細胞を、（Ｎ末端に融合している配列番号７８のリーダー配列を介して）Ｂａｘ＿ＢＨ３ドメインでパッケージされたナノシリンジに曝露させた。
【図19B】ナノシリンジ及び対照での処理後のＰＢＭＣのＴＵＮＥＬ染色を示す、実施例９に記載の代表的な顕微鏡写真。ＰＢＭＣをｔＢＩＤ、Ｂａｘロードナノシリンジ、並びに陽性（ＤＮアーゼＩ処理細胞）及び陰性（ＤＮアーゼＩ処理なし）対照で室温において２０分間処理してから、ＴＵＮＥＬ染色を実施してアポトーシス応答を決定した。元の（非グレースケール）顕微鏡写真において：アポトーシス応答について陰性の細胞は、青色又は淡褐色染色を示す。青色染色（メチルグリーン）又は淡褐色染色は、アポトーシスシグナルが不存在である健常細胞を示す。暗褐色染色は、アポトーシスを受けている細胞を示す。
【実施例】
【0172】
実施例
材料及び方法
クローニング
当該技術分野において公知の標準的な分子技術を使用してＰＶＣニードル複合体をコードするプラスミドを調製した。簡潔に述べると、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ＡＴＣＣ４３９４９からのゲノムＤＮＡ（ATCCからアクセッション番号ATCC43949のもと入手可能）をＰＣＲ（適切なプライマーを用いる）において使用してＰＶＣオペロンの複数（例えば、４つ）のオーバーラッピング領域を増幅させた。オーバーラップ／伸長ＰＣＲを用いてオペロン全体を調製し、図１に詳述されるとおり適切な発現ベクター中に融合させた（ここでも、オーバーラッピングＰＣＲを使用）（配列番号１０１～配列番号１０６のプライマーを使用）。
材料及び方法
クローニング
当該技術分野において公知の標準的な分子技術を使用してＰＶＣニードル複合体をコードするプラスミドを調製した。簡潔に述べると、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ＡＴＣＣ４３９４９からのゲノムＤＮＡ（ATCCからアクセッション番号ATCC43949のもと入手可能）をＰＣＲ（適切なプライマーを用いる）において使用してＰＶＣオペロンの複数（例えば、４つ）のオーバーラッピング領域を増幅させた。オーバーラップ／伸長ＰＣＲを用いてオペロン全体を調製し、図１に詳述されるとおり適切な発現ベクター中に融合させた（ここでも、オーバーラッピングＰＣＲを使用）（配列番号１０１～配列番号１０６のプライマーを使用）。
【0173】
簡潔に述べると、ＰＶＣオペロン（例えば、配列番号９３のもの）をカバーする４つのオーバーラッピングＰＶＣ断片（配列番号１０１（Ｆ１）及び配列番号１０５（Ｒ１）；配列番号１０２（Ｆ２）及び配列番号１０６（Ｒ２）；配列番号１０３（Ｆ３）及び配列番号１０７（Ｒ３）；並びに配列番号１０４（Ｆ４）及び配列番号１０８（Ｒ４）のプライマーをそれぞれ用いて生成）を作製した。標的クローニングベクターを要求される挿入部位において切断した。次いで、これら５つのＤＮＡ断片をオーバーラッピングＰＣＲ（配列番号１０１及び配列番号１０８のプライマーを使用）によりアセンブルし、得られた断片をクローニングベクター中にライゲートした。産物を実験室大腸菌（E.coli）中に形質転換し、ベクターマーカー選択（例えば、アンピシリン耐性に起因）で回収した。
【0174】
オペロンは、典型的には、当該技術分野において公知のとおり誘導性プロモーター（例えば、アラビノース誘導性、及び／又はＩＰＴＧ誘導性）に作動可能に結合させる。これは一般に、ｐＢＡＤファミリープラスミド（アラビノースを介して誘導性）（Invitrogen、カタログ番号：V43001）及びｐＶＴＲａ（ＩＰＴＧを介して誘導性）（Biomedal,S.L.）ベクター（しかし、適合性発現ベクター系の任意の組み合わせが十分であるはず）中へのクローニングにより達成する。
【0175】
ＰＶＣニードル複合体は、ペイロード（毒素）とは独立に発現させることができ、その逆も同様である。別個の発現ベクター（例えば、異なる誘導性プロモーターを有する）は、ＰＶＣニードル複合体及びペイロードをそれぞれ保有し得る。
【0176】
大腸菌（E.coli）中でのＰＶＣニードル複合体の発現（例えば、実験室スケール発現）／精製
（適切な発現ベクター／コスミドで形質転換された）大腸菌（E.coli）発現株の１Ｌ培養物からＰＶＣニードル複合体を精製する典型的なプロセスは、以下のとおりである：
１－プレートからコロニーをピックし、１００ｍｌのＬＢ培地に植菌することにより、（ＰＶＣニードル複合体発現ベクターで形質転換された）細菌の一晩培養物を調製する。培養物を振盪させながら３７℃において成長させる。
ａ．典型的には、培地に定型的に０．２％のｄ－グルコースを補給して最適な細胞ヘルスのために遺伝子構築物の抑制を補助することができる。
ｂ．培地に、発現（ＰＶＣニードル複合体）ベクターの維持のための関連抗生物質も補給する。ペイロードベクターも使用している場合、そのベクターのための関連抗生物質も補給する。
２－翌日、１Ｌフラスコに一晩培養物からの１：１００比の希釈を介して植菌する。１Ｌフラスコについての培地は一晩培地と同一であるが、典型的にはグルコースを含有しない。
３－培養物をおよそ中期又は後期指数期（約０．８のＯＤ６００ｎｍ）に成長させ、その時点においてプラスミドを誘導する。
ａ．ＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）プラスミドについては、典型的には、０．２％のアラビノースを添加して発現を誘導する。ペイロードプラスミド（ペイロード、例えば、Ｐｎｆをコードするプラスミド）については、ＩＰＴＧ濃度を、典型的にはタンパク質基準で最適化することができ、０．１ｍＭの典型的な開始数が好ましい。
４－誘導後に培養物をインキュベーターに戻し、翌日まで１８℃において培養する。
５－培養物を遠心分離により適切な遠心分離機／ボトル／ロータ中で５０００×ｇにおいて３０分間ハーベストする。
６－次いで、細胞ペレットを溶解させてＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）を放出させる。
ａ．以下の溶解方法を使用することができる：
（ｉ）一晩のリゾチームインキュベーション。（ｉｉ）ニードル超音波処理装置での超音波処理（リゾチームでの最初の処理あり又はなし。（ｉｉｉ）細胞破砕装置／ホモジナイザー。
７－任意選択で、ＤＮアーゼ、及びプロテアーゼ阻害剤を溶解物に添加することができる。
８－細胞残屑を、高速遠心分離機中で２０分間の４℃、５０，０００×ｇにおける遠心分離により除去する。
９－１００，０００ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離カラムに通して溶解物を濃縮して容量を低減させ、小さいタンパク質を除去する。容量を管理可能な容量に下げたら、数回遠心分離し、保持溶液を適切な試料緩衝液、例えば、ＴＭ（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で置き換えて透析する。
（適切な発現ベクター／コスミドで形質転換された）大腸菌（E.coli）発現株の１Ｌ培養物からＰＶＣニードル複合体を精製する典型的なプロセスは、以下のとおりである：
１－プレートからコロニーをピックし、１００ｍｌのＬＢ培地に植菌することにより、（ＰＶＣニードル複合体発現ベクターで形質転換された）細菌の一晩培養物を調製する。培養物を振盪させながら３７℃において成長させる。
ａ．典型的には、培地に定型的に０．２％のｄ－グルコースを補給して最適な細胞ヘルスのために遺伝子構築物の抑制を補助することができる。
ｂ．培地に、発現（ＰＶＣニードル複合体）ベクターの維持のための関連抗生物質も補給する。ペイロードベクターも使用している場合、そのベクターのための関連抗生物質も補給する。
２－翌日、１Ｌフラスコに一晩培養物からの１：１００比の希釈を介して植菌する。１Ｌフラスコについての培地は一晩培地と同一であるが、典型的にはグルコースを含有しない。
３－培養物をおよそ中期又は後期指数期（約０．８のＯＤ６００ｎｍ）に成長させ、その時点においてプラスミドを誘導する。
ａ．ＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）プラスミドについては、典型的には、０．２％のアラビノースを添加して発現を誘導する。ペイロードプラスミド（ペイロード、例えば、Ｐｎｆをコードするプラスミド）については、ＩＰＴＧ濃度を、典型的にはタンパク質基準で最適化することができ、０．１ｍＭの典型的な開始数が好ましい。
４－誘導後に培養物をインキュベーターに戻し、翌日まで１８℃において培養する。
５－培養物を遠心分離により適切な遠心分離機／ボトル／ロータ中で５０００×ｇにおいて３０分間ハーベストする。
６－次いで、細胞ペレットを溶解させてＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）を放出させる。
ａ．以下の溶解方法を使用することができる：
（ｉ）一晩のリゾチームインキュベーション。（ｉｉ）ニードル超音波処理装置での超音波処理（リゾチームでの最初の処理あり又はなし。（ｉｉｉ）細胞破砕装置／ホモジナイザー。
７－任意選択で、ＤＮアーゼ、及びプロテアーゼ阻害剤を溶解物に添加することができる。
８－細胞残屑を、高速遠心分離機中で２０分間の４℃、５０，０００×ｇにおける遠心分離により除去する。
９－１００，０００ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離カラムに通して溶解物を濃縮して容量を低減させ、小さいタンパク質を除去する。容量を管理可能な容量に下げたら、数回遠心分離し、保持溶液を適切な試料緩衝液、例えば、ＴＭ（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で置き換えて透析する。
【0177】
塩化セシウム密度勾配を介する後続の精製プロセスは、以下のとおりである：
１．以下のとおりＣｓＣｌ密度溶液を調製する：
（ａ）Ｈ２Ｏ中１．７ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ；（Ｂ）Ｈ２Ｏ中１．５ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ；（Ｃ）Ｈ２Ｏ中１．４５ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ
２．次いで、勾配（チューブの底部から頂部）を超遠心チューブ中で設定する、例えば、（１）（チューブの底部）－２ｍＬの密度、１．７ＣｓＣｌ；（２）－３ｍｌの密度、１．５ＣｓＣｌ；（３）－３ｍＬの密度、１．４５ＣｓＣｌ；（４）（チューブの頂部）－ＴＭ緩衝液中の試料。好適には、境界を事前の密度層とブレンドしないようにそれぞれの密度をチューブの側部に慎重にアプライする。
３．次いで、平衡化チューブを１５５，０００×ｇと同等のSW40Tiスイングバケットロータ中での３５，０００ＲＰＭにおける４℃の２時間の超遠心分離に供する。
４．正確な勾配分画は、出現する「青白色」ハローの真上の領域である。シリンジ及び針でのチューブの穿刺を介して分画を抽出する。
５．良好な純度のＰＶＣニードル複合体をこのように得、４℃において緩衝液中で貯蔵することができる。好適には、ＴＭ緩衝液中に再度透析してＣｓＣｌを除去する。
１．以下のとおりＣｓＣｌ密度溶液を調製する：
（ａ）Ｈ２Ｏ中１．７ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ；（Ｂ）Ｈ２Ｏ中１．５ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ；（Ｃ）Ｈ２Ｏ中１．４５ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ
２．次いで、勾配（チューブの底部から頂部）を超遠心チューブ中で設定する、例えば、（１）（チューブの底部）－２ｍＬの密度、１．７ＣｓＣｌ；（２）－３ｍｌの密度、１．５ＣｓＣｌ；（３）－３ｍＬの密度、１．４５ＣｓＣｌ；（４）（チューブの頂部）－ＴＭ緩衝液中の試料。好適には、境界を事前の密度層とブレンドしないようにそれぞれの密度をチューブの側部に慎重にアプライする。
３．次いで、平衡化チューブを１５５，０００×ｇと同等のSW40Tiスイングバケットロータ中での３５，０００ＲＰＭにおける４℃の２時間の超遠心分離に供する。
４．正確な勾配分画は、出現する「青白色」ハローの真上の領域である。シリンジ及び針でのチューブの穿刺を介して分画を抽出する。
５．良好な純度のＰＶＣニードル複合体をこのように得、４℃において緩衝液中で貯蔵することができる。好適には、ＴＭ緩衝液中に再度透析してＣｓＣｌを除去する。
【0178】
ＣｓＣｌ勾配精製に続き、又はそれに代えて、以下のとおりモノリスアニオン交換クロマトグラフィーを介してＰＶＣを抽出することができる（全てのステップを蠕動ポンプ若しくはシリンジ器具を用いて手作業で、又はＦ／ＨＰＬＣを介して実施することができることに留意されたい）：
１．既に行っていない限り、試料抽出物を、低濃度の塩（２０ｍＭのＮａＣｌ）を有する結合移動相（典型的には、ＴＭ緩衝液）中に透析する。
２．製造業者のガイドラインに従ってカラムを平衡化する、簡潔には：
ａ．少なくとも５カラム容量（ＣＶ）のｄＨ２Ｏ；
ｂ．少なくとも５ＣＶの結合緩衝液（ＴＭ、低濃度塩を有する）；
ｃ．少なくとも５ＣＶの溶出緩衝液（高濃度塩、＞＝１ＭのＮａＣｌを有するＴＭ）；
ｄ．もう１回、少なくとも１０ＣＶの結合緩衝液。
３．試料をカラムに低い流量（１～２ｍＬ／分）においてアプライする
４．カラムを最大２００ｍＭのＮａＣｌ含有ＴＭ緩衝液で洗浄する。
５．１ＭのＮａＣｌ含有ＴＭ緩衝液で溶出させる（或いは、ＦＰＬＣ装置を使用する場合、勾配溶出を使用する）。
６．ＰＶＣニードル複合体は溶出分画中に存在する。フラクションコレクターを使用する場合、正確な分画を同定するために後続のＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はその類似物が必要とされ得る。
１．既に行っていない限り、試料抽出物を、低濃度の塩（２０ｍＭのＮａＣｌ）を有する結合移動相（典型的には、ＴＭ緩衝液）中に透析する。
２．製造業者のガイドラインに従ってカラムを平衡化する、簡潔には：
ａ．少なくとも５カラム容量（ＣＶ）のｄＨ２Ｏ；
ｂ．少なくとも５ＣＶの結合緩衝液（ＴＭ、低濃度塩を有する）；
ｃ．少なくとも５ＣＶの溶出緩衝液（高濃度塩、＞＝１ＭのＮａＣｌを有するＴＭ）；
ｄ．もう１回、少なくとも１０ＣＶの結合緩衝液。
３．試料をカラムに低い流量（１～２ｍＬ／分）においてアプライする
４．カラムを最大２００ｍＭのＮａＣｌ含有ＴＭ緩衝液で洗浄する。
５．１ＭのＮａＣｌ含有ＴＭ緩衝液で溶出させる（或いは、ＦＰＬＣ装置を使用する場合、勾配溶出を使用する）。
６．ＰＶＣニードル複合体は溶出分画中に存在する。フラクションコレクターを使用する場合、正確な分画を同定するために後続のＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はその類似物が必要とされ得る。
【0179】
カラム（例えば、ステップ２のもの）は、CIMmultus(商標)第４級アミンアニオン交換カラム（BIA Separations d.o.o.）のものであった。例えば、１．３μｍのチャネルサイズ及び１ｍＬのカラム容量を有するモノリス型カラムであるCIMmultus(商標)QA-1。
【0180】
或いは、ＤＥＡＥ（弱アニオン交換体）カラムを使用することができる。
【0181】
或いは、フォトラブダス属（Photorhabdus）発現系との使用のため、ＰＶＣニードル複合体は細胞ペレットと／それに代えて上清から精製することができ、以下の追加／改変を伴う：
１．上記の標準的プロトコルからの細胞ハーベスト後、上清をpyrexボトルに移し、任意選択で、必要により１００，０００ＭＷＣＯカラムを介して濃縮することができる。
ａ．ＤＮアーゼ（０．２５Ｕ／ｍＬ）及びプロテアーゼ阻害剤を任意選択で添加することができる。
２．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度まで添加し、８０ｇ／ＬのＰＥＧ６０００も添加する。溶液を４℃において一晩混合する。
３．溶液を８０００×ｇ、４℃において３０分間遠心分離してＰＥＧ６０００をペレット化する。
４．ペレットを小容量（約５ｍＬ）のＴＭ緩衝液（又はその類似物）中で再懸濁させ、振盪させながら室温において２時間インキュベートする。
５．１３，０００×ｇにおける１０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を新たなチューブに回収する。選択される精製方法を続ける。
１．上記の標準的プロトコルからの細胞ハーベスト後、上清をpyrexボトルに移し、任意選択で、必要により１００，０００ＭＷＣＯカラムを介して濃縮することができる。
ａ．ＤＮアーゼ（０．２５Ｕ／ｍＬ）及びプロテアーゼ阻害剤を任意選択で添加することができる。
２．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度まで添加し、８０ｇ／ＬのＰＥＧ６０００も添加する。溶液を４℃において一晩混合する。
３．溶液を８０００×ｇ、４℃において３０分間遠心分離してＰＥＧ６０００をペレット化する。
４．ペレットを小容量（約５ｍＬ）のＴＭ緩衝液（又はその類似物）中で再懸濁させ、振盪させながら室温において２時間インキュベートする。
５．１３，０００×ｇにおける１０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を新たなチューブに回収する。選択される精製方法を続ける。
【0182】
ＰＶＣニードル複合体を精製する他の方法は、他箇所、例えば、参照により本明細書に組み込まれるYang et al（J Bacteriol.2006 Mar;188(6):2254-2261）に記載されている。
【0183】
Ｐ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１ ＰＶＣｕｎｉｔ４（遺伝子ｐｌｕ１６６７～ｐｌｕ１６５２によりコードされるシャーシ）のためのアラビノース誘導性過剰発現株の構築
染色体組換えを使用してアラビノース誘導性転写プロモーターの制御下で選択ＰＶＣ（オペロン）（一例として、ＰＶＣｕｎｉｔ４ニードル複合体をコードするオペロンをここで使用した）を置き、ＰＶＣニードル複合体を過剰発現するフォトラブダス属（Photorhabdus）株を調製した。次いで、組換え株を、エフェクター発現プラスミド（例えば、アラビノース誘導性発現ベクターｐＢＡＤ３０をベースとする）で遺伝子形質転換してアラビノース糖の添加を介するだけのＰＶＣニードル複合体過剰発現、ＰＶＣエフェクター発現、ＰＶＣエフェクタートランスパッケージ、及び完全複合体の分泌を促進した。
染色体組換えを使用してアラビノース誘導性転写プロモーターの制御下で選択ＰＶＣ（オペロン）（一例として、ＰＶＣｕｎｉｔ４ニードル複合体をコードするオペロンをここで使用した）を置き、ＰＶＣニードル複合体を過剰発現するフォトラブダス属（Photorhabdus）株を調製した。次いで、組換え株を、エフェクター発現プラスミド（例えば、アラビノース誘導性発現ベクターｐＢＡＤ３０をベースとする）で遺伝子形質転換してアラビノース糖の添加を介するだけのＰＶＣニードル複合体過剰発現、ＰＶＣエフェクター発現、ＰＶＣエフェクタートランスパッケージ、及び完全複合体の分泌を促進した。
【0184】
組換えフォトラブダス属(Photorhabdus)ＰＶＣ過剰発現株構築
テンプレートとしてのＰ．ルミネスセンス(P.luminescens)株ＤＪＣ（別称、株ＴＴ０１）からのゲノムＤＮＡを使用してプライマーＰＶＣｐｒｏｍＦ（５’－ＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧ－３’、配列番号９７）及びＰＶＣｐｒｏｍＲ（５’－ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣ－３’、配列番号９８）を使用してＰＶＣｕｎｉｔ４のプロモーター領域を増幅させた。好適なＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）株は、ATCCからアクセッション番号ATCC29999のもと入手可能である。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、キャリア株としての大腸菌(E.coli)ＤＨ５α λ－ｐｉｒ（Biomedal S.L.）を使用して自殺ベクターｐＣＥＰ（ThermoFisher、カタログ番号：V04450）中へのライゲーションにより導入した。得られたプラスミドを、フォトラブダス属(Photorhabdus)中へのコンジュゲーションのために大腸菌（E.coli）ドナー株Ｓ１７．１λ－ｐｉｒ(Biomedal S.L.)に移した。簡潔に述べると、Ｐ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣのドナー株及びリファンピシン耐性（ＲｉｆＲ）単離株の一晩培養物を１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給されたＬＢ中で希釈し、中期指数期（ＯＤ６００約０．５）まで成長させた。次いで、３ｍｌのそれぞれの培養物をハーベストし、２回洗浄し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給された１００μｌのＬＢ中で再懸濁させた。８０μｌのＰ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣ ＲｉｆＲを２０μｌのドナー細菌と混合し（４：１のレシピエントとドナーとの比をもたらす）、０．１％のピルビン酸塩及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給されたＬＢ寒天プレートの中央に置いた。プレートを３０℃において一晩インキュベートし、得られた成長物を１．５ｍｌのＬＢ中でハーベストした。リファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するプレート上にアリコートを置いてトランスコンジュガントを選択し、プレートを３０℃において３日間インキュベートした。考えられるトランスコンジュガントを再ストリークし、プライマーＰａｒａＩＮＦ（５’－ＧＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧ－３’、配列番号９９）及びｔＰＶＣｐＲ（５’－ＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣ－３’、配列番号１００）を使用するＰＣＲにより確認した。
テンプレートとしてのＰ．ルミネスセンス(P.luminescens)株ＤＪＣ（別称、株ＴＴ０１）からのゲノムＤＮＡを使用してプライマーＰＶＣｐｒｏｍＦ（５’－ＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧ－３’、配列番号９７）及びＰＶＣｐｒｏｍＲ（５’－ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣ－３’、配列番号９８）を使用してＰＶＣｕｎｉｔ４のプロモーター領域を増幅させた。好適なＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）株は、ATCCからアクセッション番号ATCC29999のもと入手可能である。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、キャリア株としての大腸菌(E.coli)ＤＨ５α λ－ｐｉｒ（Biomedal S.L.）を使用して自殺ベクターｐＣＥＰ（ThermoFisher、カタログ番号：V04450）中へのライゲーションにより導入した。得られたプラスミドを、フォトラブダス属(Photorhabdus)中へのコンジュゲーションのために大腸菌（E.coli）ドナー株Ｓ１７．１λ－ｐｉｒ(Biomedal S.L.)に移した。簡潔に述べると、Ｐ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣのドナー株及びリファンピシン耐性（ＲｉｆＲ）単離株の一晩培養物を１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給されたＬＢ中で希釈し、中期指数期（ＯＤ６００約０．５）まで成長させた。次いで、３ｍｌのそれぞれの培養物をハーベストし、２回洗浄し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給された１００μｌのＬＢ中で再懸濁させた。８０μｌのＰ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣ ＲｉｆＲを２０μｌのドナー細菌と混合し（４：１のレシピエントとドナーとの比をもたらす）、０．１％のピルビン酸塩及び１０ｍＭのＭｇＳＯ４が補給されたＬＢ寒天プレートの中央に置いた。プレートを３０℃において一晩インキュベートし、得られた成長物を１．５ｍｌのＬＢ中でハーベストした。リファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するプレート上にアリコートを置いてトランスコンジュガントを選択し、プレートを３０℃において３日間インキュベートした。考えられるトランスコンジュガントを再ストリークし、プライマーＰａｒａＩＮＦ（５’－ＧＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧ－３’、配列番号９９）及びｔＰＶＣｐＲ（５’－ＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣ－３’、配列番号１００）を使用するＰＣＲにより確認した。
【0185】
フォトラブダス属(Photorhabdus)からのＰＶＣニードル複合体過剰発現及び精製
Ｐ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣ ＰＶＣｕｎｉｔ４：：ｐＣＥＰの一晩培養物を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）が補給された２×２５０ｍｌのＬＢ中で希釈し、１８０ｒｐｍ、２８℃においてインキュベートした。２～３時間後、アラビノース（０．２％）を添加し、培養物をインキュベーターにさらに２６時間戻した。細胞を遠心分離（７０００ｇ、３０分間）によりペレット化し、上清を回収した。ＤＮアーゼＩを０．２５Ｕ／ｍｌの濃度において上清に添加していかなる細胞外ＤＮＡも分解した。室温での３０分間のインキュベーション後、ポリエチレングリコール８０００（８％）及びＮａＣｌ（０．５Ｍ）を添加してタンパク質を沈殿させた。上清を撹拌しながら４℃において一晩インキュベートした。次いで、沈殿させたタンパク質を８０００ｇにおける４℃の３０分間の遠心分離により回収した。ペレットを８ｍｌのＴＭ緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中で再懸濁させ、穏やかに振盪させながら室温において２時間インキュベートした。任意の残屑を１３０００ｇでの１０分間の遠心分離により除去し、ＰＶＣニードル複合体を含有する上清をＣｓＣｌ密度勾配にアプライし、Beckman coulter Optima L-90K又はXPN-80K超遠心分離機中で３５０００ｒｐｍにおいて２時間遠心分離した。ＣｓＣｌを含有するＴＭ緩衝液を、チューブの底部からそれぞれρ＝１．７（２ｍｌ）、１．５（３ｍｌ）、及び１．４５（３ｍｌ）において積層することによりＣｓＣｌ密度勾配を作製した。ＰＶＣニードル複合体を含有する分画を回収し、Ultracel-100K装置（Amicon）を使用してＣｓＣｌを除去し、緩衝液をＴＭＳ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）で交換した。CIMmultus（商標）第４級アミン２μｍ細孔アニオン交換カラム（BIAseparations）を使用してＰＶＣニードル複合体をさらに精製した。２００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ緩衝液によりカラムを洗浄し、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中でＰＶＣニードル複合体を溶出させた。Ultracel-100K装置を使用する緩衝液交換によりＮａＣｌを除去し、最終精製のために試料をCIMmultus（商標）ＤＥＡＥ２μｍ細孔カラム（BIA separations）にアプライした。２００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中でカラムを洗浄し、５００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中で試料を溶出させた。
Ｐ．ルミネスセンス(P.luminescens)ＤＪＣ ＰＶＣｕｎｉｔ４：：ｐＣＥＰの一晩培養物を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）が補給された２×２５０ｍｌのＬＢ中で希釈し、１８０ｒｐｍ、２８℃においてインキュベートした。２～３時間後、アラビノース（０．２％）を添加し、培養物をインキュベーターにさらに２６時間戻した。細胞を遠心分離（７０００ｇ、３０分間）によりペレット化し、上清を回収した。ＤＮアーゼＩを０．２５Ｕ／ｍｌの濃度において上清に添加していかなる細胞外ＤＮＡも分解した。室温での３０分間のインキュベーション後、ポリエチレングリコール８０００（８％）及びＮａＣｌ（０．５Ｍ）を添加してタンパク質を沈殿させた。上清を撹拌しながら４℃において一晩インキュベートした。次いで、沈殿させたタンパク質を８０００ｇにおける４℃の３０分間の遠心分離により回収した。ペレットを８ｍｌのＴＭ緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中で再懸濁させ、穏やかに振盪させながら室温において２時間インキュベートした。任意の残屑を１３０００ｇでの１０分間の遠心分離により除去し、ＰＶＣニードル複合体を含有する上清をＣｓＣｌ密度勾配にアプライし、Beckman coulter Optima L-90K又はXPN-80K超遠心分離機中で３５０００ｒｐｍにおいて２時間遠心分離した。ＣｓＣｌを含有するＴＭ緩衝液を、チューブの底部からそれぞれρ＝１．７（２ｍｌ）、１．５（３ｍｌ）、及び１．４５（３ｍｌ）において積層することによりＣｓＣｌ密度勾配を作製した。ＰＶＣニードル複合体を含有する分画を回収し、Ultracel-100K装置（Amicon）を使用してＣｓＣｌを除去し、緩衝液をＴＭＳ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）で交換した。CIMmultus（商標）第４級アミン２μｍ細孔アニオン交換カラム（BIAseparations）を使用してＰＶＣニードル複合体をさらに精製した。２００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ緩衝液によりカラムを洗浄し、１ＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中でＰＶＣニードル複合体を溶出させた。Ultracel-100K装置を使用する緩衝液交換によりＮａＣｌを除去し、最終精製のために試料をCIMmultus（商標）ＤＥＡＥ２μｍ細孔カラム（BIA separations）にアプライした。２００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中でカラムを洗浄し、５００ｍＭのＮａＣｌを含有するＴＭＳ中で試料を溶出させた。
【0186】
これを細胞の溶解（ＰＶＣニードル複合体を放出させるため）あり及びなしで実施することが可能である（例えば、ＰＶＣニードル複合体は生存細胞から分泌されると考えられるため、上清中で回収することができる）。
【0187】
透過型電子顕微鏡観察
透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）のため、微細炭素層でコートされたpioloform被覆３００メッシュ銅グリッドをタンパク質分画のための基材として使用した。好ましい水性陰性染色剤は、３％のタングステン酸メチルアミンである。コートグリッドを使用直前にＵＶ光に１６時間曝露させて基材の適切な湿潤を確保した。１０μｌの液滴をＴＥＭグリッドにアプライし、タンパク質を５分間沈降させた。液体をグリッド端部から濾紙で吸収させ、１０μｌの濾過陰性染色剤で直ちに置き換えた。液滴を濾紙で部分的に除去し、グリッドを完全に空気乾燥させてからそれらをJEOL1200EX透過型電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で８０ｋＶで操作して観察した。
透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）のため、微細炭素層でコートされたpioloform被覆３００メッシュ銅グリッドをタンパク質分画のための基材として使用した。好ましい水性陰性染色剤は、３％のタングステン酸メチルアミンである。コートグリッドを使用直前にＵＶ光に１６時間曝露させて基材の適切な湿潤を確保した。１０μｌの液滴をＴＥＭグリッドにアプライし、タンパク質を５分間沈降させた。液体をグリッド端部から濾紙で吸収させ、１０μｌの濾過陰性染色剤で直ちに置き換えた。液滴を濾紙で部分的に除去し、グリッドを完全に空気乾燥させてからそれらをJEOL1200EX透過型電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で８０ｋＶで操作して観察した。
【0188】
BioPORTERアッセイ及びアクチンストレスファイバー分析
BioPORTERアッセイ（Genlantis）のため、８０μｌの精製野生型及び突然変異Ｐｎｆタンパク質（５００μｇ ｍｌ－１）、又は陰性対照としてのＰＢＳを１つのBioPORTERチューブ（Genlantis）に添加し、９２０μｌのＤＭＥＭ中で再懸濁させた。試料を６ウェルプレート中で成長させたHeLa細胞に添加し、４時間インキュベートした。BioPORTER／タンパク質又はＰＢＳミックスを新鮮完全培地により置き換え、細胞を２０～４８時間インキュベートした。細胞形態及びアクチン細胞骨格を可視化するため、細胞を４％のＰＢＳ－ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．１％のTriton X-100で透過処理し、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）ファロイジン（Sigma）及びＤＡＰＩ二塩酸塩（Sigma）で染色した。画像をLSM510共焦点顕微鏡（Leica）で取得した。
BioPORTERアッセイ（Genlantis）のため、８０μｌの精製野生型及び突然変異Ｐｎｆタンパク質（５００μｇ ｍｌ－１）、又は陰性対照としてのＰＢＳを１つのBioPORTERチューブ（Genlantis）に添加し、９２０μｌのＤＭＥＭ中で再懸濁させた。試料を６ウェルプレート中で成長させたHeLa細胞に添加し、４時間インキュベートした。BioPORTER／タンパク質又はＰＢＳミックスを新鮮完全培地により置き換え、細胞を２０～４８時間インキュベートした。細胞形態及びアクチン細胞骨格を可視化するため、細胞を４％のＰＢＳ－ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．１％のTriton X-100で透過処理し、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）ファロイジン（Sigma）及びＤＡＰＩ二塩酸塩（Sigma）で染色した。画像をLSM510共焦点顕微鏡（Leica）で取得した。
【0189】
実施例１
ＰＶＣニードル複合体のクローニング及び発現
本発明者らは、宿主細菌、フォトラブダス属（Photorhabdus）から要求される発現遺伝子（例えば、配列番号９３、配列番号９４及び／又は配列番号９５内に含まれる）を良好に切り出し（クローニングし）、上記説明のとおり実験室大腸菌（E.coli）中の信頼性の高いスケーラブルな発現系を考案した。別個のプラスミド上のトランス発現がシリンジ中へのペイロード（例えば、Ｐｎｆ）の取り込みを可能とし、マルチプラスミド（モジュール式）プラットフォームを作出することが実証された。
ＰＶＣニードル複合体のクローニング及び発現
本発明者らは、宿主細菌、フォトラブダス属（Photorhabdus）から要求される発現遺伝子（例えば、配列番号９３、配列番号９４及び／又は配列番号９５内に含まれる）を良好に切り出し（クローニングし）、上記説明のとおり実験室大腸菌（E.coli）中の信頼性の高いスケーラブルな発現系を考案した。別個のプラスミド上のトランス発現がシリンジ中へのペイロード（例えば、Ｐｎｆ）の取り込みを可能とし、マルチプラスミド（モジュール式）プラットフォームを作出することが実証された。
【0190】
大腸菌（E.coli）からの精製後、電子顕微鏡観察分析は、精製ＰＶＣニードル複合体が正確な「ナノシリンジ」構造を保持することを実証した（図３参照）。さらに、ＰＶＣニードル複合体は、精製後にペイロード（例えば、Ｐｎｆ）と正確に会合したままであり（図４参照）、本発明者らが、細胞へのペイロード送達のための正確な構造を有するＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）を良好に調製したことを実証した。
【0191】
さらに、電子顕微鏡観察分析は、精製複合体が細胞の細胞表面に適切に局在化し、Ｐｎｆペイロードを有するＰＶＣニードル複合体（ＰＶＣｐｎｆ）がエフェクター（ＰＶＣ）の仮定機序と一致する表現型（ラッフリング）を誘導することを実証した、図５参照。
【0192】
実施例２
２．１ ＰＶＣニードル複合体がエフェクターの細胞内送達を介して効果を発揮することの実証
ポリペプチドＰｎｆを以下のとおりＰＶＣエフェクターとして同定した。これは、フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）ATCC43949完全ゲノム－GenBankアクセッション番号：FM162591.1内で同定した。
２．１ ＰＶＣニードル複合体がエフェクターの細胞内送達を介して効果を発揮することの実証
ポリペプチドＰｎｆを以下のとおりＰＶＣエフェクターとして同定した。これは、フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）ATCC43949完全ゲノム－GenBankアクセッション番号：FM162591.1内で同定した。
【0193】
ＰＶＣオペロン（Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949ＰＶＣｐｎｆオペロン、配列番号９３の配列を有する）の最後の遺伝子、即ち、ｐｖｃ１６（例えば、ＰＡＵ＿０３３３８）を同定した。ＰＶＣローカスのｐｖｃ１６遺伝子の位置を図１（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）に説明する。ｐｖｃ１６のすぐ３’のＯＲＦ（例えば、ｐｖｃ１６の下流約５ｋｂ内）を同定し、１つのそのようなＯＲＦ（ＰＡＵ＿０３３３２）はｐｖｃ１６の下流３５３５ｂｐである。この推定エフェクターＯＲＦによりコードされるポリペプチド（配列番号３２の配列を有する）の予測機能は、BlastP及びHHPRED（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hhpred）の組み合わせにより得た。次いで、このＯＲＦを既知の細菌毒素（例えば、大腸菌（E.coli）からのＣＮＦ１ファミリーのもの）との直接相同性に基づきＰＶＣエフェクターとして割り当てることができた。
【0194】
次いで、ＰｎｆロードＰＶＣニードル複合体を実施例１に従って調製した。
【0195】
本発明者らは、これらのパッケージ（例えば、負荷）されたＰＶＣニードル複合体が、それらが担持する積み荷の起源と一致する細胞効果を発揮することを実証した。例として、細胞骨格毒素ＰｎｆでロードされたＰＶＣニードル複合体に曝露させた細胞及び完全昆虫動物は、細胞骨格毒性と一致する様式で細胞死を受ける。
【0196】
注射実験（昆虫幼体中への注射）を１０μｌの上清の注射により実施し、但し、Ｐｎｆを有するＰＶＣニードル複合体（ＰＶＣＰｎｆ）、例えば、配列番号３２のＰＶＣエフェクターでパッケージされた配列番号９３によりコードされるＰＶＣをコードするコスミドクローンを保有する大腸菌（E.coli）の培養物の一晩培養物（典型的には１Ｌ）の遠心分離（ペレット化）後とした。
【0197】
ＰＶＣニードル複合体がＰｎｆペイロードの細胞内送達（例えば、インジェクション）に起因して表現型を担うことを実証したため、同じタンパク質（Ｐｎｆ）を別の経路で提供して細胞の細胞質にアクセスさせる（発現プラスミドの形質移入及び発現、又はタンパク質を含有するリポソーム調製物を介する伝導）場合にのみ毒性効果を再構成することができた、図６参照。逆に、変性（沸騰を介する）ＰＶＣニードル複合体調製物、組織培養細胞上で重ねた毒素タンパク質又は完全動物中に注射された毒素タンパク質は、活性を示さなかった。
【0198】
２．２．培養ヒトマクロファージ中への毒性エフェクター酵素Ｐｎｆの送達の証拠
上記概説のデータを補うため、本発明者らは、培養ヒトマクロファージ中への毒性エフェクター酵素Ｐｎｆの送達のさらなる証拠を提供する追加の実験を実施した。
上記概説のデータを補うため、本発明者らは、培養ヒトマクロファージ中への毒性エフェクター酵素Ｐｎｆの送達のさらなる証拠を提供する追加の実験を実施した。
【0199】
概念：本発明者らは、天然Ｐｎｆ毒素で（トランス）パッケージされた大腸菌（E.coli）から発現させ、精製したＰＶＣｐｎｆを、培養ヒトＴＨＰ１由来マクロファージに対して検査した。昆虫モデルにおけるＰｎｆの致死効果とは異なり、事前のリポソーム媒介Ｐｎｆタンパク質形質移入実験は、ヒトHela細胞においてより捉えにくい表現型を示した。それらの実験において、細胞は、２４時間においてアクチンストレスファイバー形成、及び４８時間において多核化を示した。したがって、本発明者らは、レサズリン比色アッセイを使用してマクロファージ呼吸率に対する、Ｐｎｆ ＰＶＣエフェクターを保持する／それでパッケージされた精製ＰＶＣｐｎｆ（ナノシリンジ）の効果を検査した。
【0200】
方法：
レサズリンアッセイの背景。青色化合物レサズリンをアッセイにおける使用のために調査してマクロファージ（Ｍ０）に対するＰＶＣの活性を決定した。レサズリンは細胞ミトコンドリア中で代謝的に低減され、桃色及び高度に蛍光の化合物レソルフィンを産生する。マクロファージ代謝に対するＰＶＣの効果は、レサズリンを培養培地中に導入することにより決定することができる。ＰＶＣにより影響を受けるマクロファージの数は、測定された蛍光を細胞密度最適化曲線のものと比較することにより推定することができる（参照により本明細書に組み込まれるCzekanska,Methods in Molecular Biology,2011,740,27-32参照）。
レサズリンアッセイの背景。青色化合物レサズリンをアッセイにおける使用のために調査してマクロファージ（Ｍ０）に対するＰＶＣの活性を決定した。レサズリンは細胞ミトコンドリア中で代謝的に低減され、桃色及び高度に蛍光の化合物レソルフィンを産生する。マクロファージ代謝に対するＰＶＣの効果は、レサズリンを培養培地中に導入することにより決定することができる。ＰＶＣにより影響を受けるマクロファージの数は、測定された蛍光を細胞密度最適化曲線のものと比較することにより推定することができる（参照により本明細書に組み込まれるCzekanska,Methods in Molecular Biology,2011,740,27-32参照）。
【0201】
ＴＨＰ１由来マクロファージのためのレサズリンの使用の最適化。１８時間にわたるマクロファージの代謝を異なる播種密度で評価してＰＶＣを用いるこのアッセイの使用のための最適細胞密度を決定した。ＴＨＰ－１細胞の３０ｍＬ培養物を１０００ｒｐｍにおいて４分間ペレット化してから、２ｍＬのＲＰＭＩ培地（１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び２ｍＭのＬ－グルタミンも含有）中で再懸濁させた。細胞血球計算盤を使用して細胞を計数し、次いで培地中で２×１０６個の細胞ｍＬ－１の密度に希釈した。次いで、ＴＨＰ－１細胞をプレーティング直前にホルボール１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）で活性化させた。２００μＬの細胞を９６ウェルプレート中で４つ組でプレーティングし、２倍段階希釈を１．５６２５×１０３個の細胞ｍＬ－１の最終細胞密度に達するまで実施した。１２５μＬの出発細胞希釈物も、５倍段階希釈のため、０．３２×１０３個の細胞ｍＬ－１の細胞密度に達するまで同じプレート上で４つ組でプレーティングした。ＲＰＭＩ及びＰＭＡを含有する４つのブランクウェルも調製した。プレートを３７℃において５％のＣＯ２で４８時間インキュベートした。ウェルから培地を吸引し、新鮮ＲＰＭＩで置き換え、マクロファージをさらに２４時間インキュベートした。レサズリンタブレット（VWR）をＲＰＭＩ中で溶解させ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬをそれぞれのウェルに次々に添加した（１．２５ｍｇ／ｍＬのウェル濃度）。産生された蛍光をプレートリーダー上で３０分ごとに１８時間測定した（励起：５３０～５７０ｎｍ、蛍光：５８０～６２０ｎｍ、３７℃及び５％のＣＯ２において維持）。次いで、ＰＶＣを用いる使用のために経時的な最適な細胞密度を決定した。
【0202】
ＰＶＣ検査のためのアッセイの使用。１．２５×１０５個ｍＬ－１に希釈されたＴＨＰ－１細胞を活性化させ、９６ウェルプレート中で播種し、ウェルは１００μＬの細胞を１．２５×１０４個の細胞ｍＬ－１の最終ウェル密度において含有した。ＰＶＣ試料を有さない細胞を含有するブランクウェル、並びに培地及びＰＭＡのみを含有するウェルも４つ組で調製した。プレートを３７℃において５％のＣＯ２で４８時間インキュベートした。次いで、培地を新鮮ＲＰＭＩで置き換えてから、１０μＬのそれぞれのＰＶＣ試料を添加した。プレートをさらに２４時間インキュベートしてから、１０μＬのレサズリン（１２．５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれのウェルに添加し、蛍光を３０分ごとに１８時間測定した（励起：５３０～５７０ｎｍ、蛍光：５８０～６２０ｎｍ、３７℃及び５％のＣＯ２において維持）。
【0203】
結果：図６Ｆは、ＰＶＣｐｎｆ＋Ｐｎｆでのチャレンジは、マクロファージの呼吸率を実際に低下させた一方、熱変性又は空のＰＶＣｐｎｆナノシリンジは強力な有害効果を有さなかったことを示す。これにかかわらず、試料を添加しない対照細胞は、最良の呼吸率を依然として示した。マクロファージに対する効果を昆虫注射毒性アッセイと相関させた。この場合、２つのＰＶＣｐｎｆ＋Ｐｎｆ調製物は、昆虫コホートの半数を超える致死率を示した一方、熱変性及び空のＰＶＣｐｎｆ注射昆虫は全て健常のままであった。
【0204】
実施例３
リーダー配列はＰＶＣニードル複合体中へのペイロードパッケージを担うことの実証
驚くべきことに、本発明者らは、好ましくは、ペイロード（毒素）タンパク質のＮ末端上の「リーダー」ペプチド配列の想定が、ペイロードをＰＶＣ複合体に指向し、ＰＶＣニードル複合体中へのペイロードのパッケージを可能とし（例えば、トリガーし）得ることを見出した。本発明者らは、ＰＶＣエフェクタータンパク質のアミノ酸残基１～５０がリーダー配列である／を含むことを実証した。
リーダー配列はＰＶＣニードル複合体中へのペイロードパッケージを担うことの実証
驚くべきことに、本発明者らは、好ましくは、ペイロード（毒素）タンパク質のＮ末端上の「リーダー」ペプチド配列の想定が、ペイロードをＰＶＣ複合体に指向し、ＰＶＣニードル複合体中へのペイロードのパッケージを可能とし（例えば、トリガーし）得ることを見出した。本発明者らは、ＰＶＣエフェクタータンパク質のアミノ酸残基１～５０がリーダー配列である／を含むことを実証した。
【0205】
これを実証するため、発現構築物（染色体操作されたＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１中での過剰発現）を調製し、それにおいてＰｌｕ１６４９（図中「ｈｖｎＡ」と称され、配列番号４６の配列を有する）（検出目的のためにＭｙｃタグ付き）により発現されるペイロードがリーダー配列を欠くようにリーダー配列（Ｎ末端アミノ酸残基１～５０）を除いた（図８Ａ－構築物１参照）。ＰＶＣニードル複合体の発現（ペイロード及びＰＶＣニードル複合体の両方の）及び単離（及びゲル上の任意のパッケージされたペイロードを含むその構成成分のランニング）後、（Ｍｙｃタグ付き）Ｐｌｕ１６４９（「ｈｖｎＡ」）はＰＶＣニードル複合体内でウェスタンブロット分析を介して検出可能でなく、ペイロード（リーダー配列を欠く）が複合体中にパッケージされず（図８Ｂ、レーン１参照）、したがって単離複合体と会合しないことを実証した。しかしながら、リーダー配列を保持するｈｖｎＡについては良好なパッケージが見られた、レーン２参照（レーン３のバンドの相対強度に起因してバンドは弱いと考えられることに留意されたい）。
【0206】
驚くべきことに、Ｍｙｃタグ付きｈｖｎＡのウェスタンブロット検出により実証されたとおり、異なる（非ｈｖｎＡ）ＰＶＣエフェクターからのリーダー配列（即ち、ＰＡＵ＿０３３３２エフェクターからのＮ末端アミノ酸残基１～５０に対応）を有するｈｖｎＡ（図８Ａ、構築物３参照）は複合体中に正確にパッケージされ、単離／精製時にＰＶＣニードル複合体と会合したままであった（図８Ｂ、レーン３参照）。したがって、本発明者らは、ｈｖｎＡペイロード（即ち、ＰＡＵ＿０３３３２のものと異なるペイロード）をパッケージする「ＰＡＵ＿０３３３２」リーダー配列（異なるペイロードＰｎｆと会合している）の驚くべき能力を実証した。これは、ＰＶＣエフェクターのリーダー配列をスワップする能力を実証し、パッケージのための最適リーダー配列（最適パッケージ活性を有する）の使用を許容する。
【0207】
実施例４
４．１ リーダー配列が非定型／外因性ペイロードの（ＰＶＣニードル複合体中への）パッケージを指向することの実証
本発明の予測されない技術的効果において、本発明者らは、外因性（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ポリペプチド（好ましくは、Ｎ末端における）への本明細書に記載のリーダー配列の融合が、ＰＶＣニードル複合体中への前記外因性ポリペプチドのパッケージを可能とし、単離／精製時に外因性ポリペプチドがＰＶＣニードル複合体と会合したままであることを見出した。例として、非フォトラブダス属（Photorhabdus）「Ｍｙｃ」ポリペプチド（＜１０ｋＤａ）が、リーダー配列に融合させた場合、ＰＶＣニードル複合体中にパッケージされることを実証する図８Ｂ（レーン４）、及びかなりより大きい非フォトラブダス属（Photorhabdus）「Ｃｒｅリコンビナーゼ」ポリペプチド（＞３２ｋＤａ）も、本発明のリーダーポリペプチドに融合させた場合、ＰＶＣニードル複合体中に同様に適切にパッケージすることができることを実証するレーン６参照。
４．１ リーダー配列が非定型／外因性ペイロードの（ＰＶＣニードル複合体中への）パッケージを指向することの実証
本発明の予測されない技術的効果において、本発明者らは、外因性（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ポリペプチド（好ましくは、Ｎ末端における）への本明細書に記載のリーダー配列の融合が、ＰＶＣニードル複合体中への前記外因性ポリペプチドのパッケージを可能とし、単離／精製時に外因性ポリペプチドがＰＶＣニードル複合体と会合したままであることを見出した。例として、非フォトラブダス属（Photorhabdus）「Ｍｙｃ」ポリペプチド（＜１０ｋＤａ）が、リーダー配列に融合させた場合、ＰＶＣニードル複合体中にパッケージされることを実証する図８Ｂ（レーン４）、及びかなりより大きい非フォトラブダス属（Photorhabdus）「Ｃｒｅリコンビナーゼ」ポリペプチド（＞３２ｋＤａ）も、本発明のリーダーポリペプチドに融合させた場合、ＰＶＣニードル複合体中に同様に適切にパッケージすることができることを実証するレーン６参照。
【0208】
本発明者らは、フォトラブダス属（Photorhabdus）によりコードされる種々の天然ＰＶＣエフェクターペイロードのサイズ（例えば、ポリペプチド長さ）及び構造の詳細な分析を実施し（図７参照）、それは広範な異なる長さ及び構造を示し、本発明のＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）送達系の適用可能性が目的ペイロードタンパク質のサイズ又は特性により限定されないことを実証する。まとめると、特定の二次構造も、生物物理学的特性も、積み荷の長さも要求されず、ＰＶＣニードル複合体（ナノシリンジ）シャーシを多用途多機能送達ビヒクルとして利用することができることを裏付ける。
【0209】
さらに、外因性ポリペプチドのこのパッケージは、選択されるＰＶＣニードル複合体シャーシに無関係であり、例えば、「ＰＶＣｐｎｆ」シャーシ（配列番号９３）及び「ＰＶＣＵ４」（例えば、ＰＶＣｕｎｉｔ４）シャーシ（フォトラブダス属（Photorhabdus）過剰発現株に対して内因性）の両方を使用して達成された（図１０Ａ参照）。重要なことに、本発明者らは、いずれのシャーシにおける外因性ペイロードのパッケージもＰＶＣニードル複合体の形態に影響を与えず、それらが異常にアセンブルされないことを確保した（図１０Ｂ参照）。
【0210】
本明細書に示されるデータにおいて、ペイロードタンパク質は別個の遺伝子構築物に対して「トランス」で供給される。驚くべきことに、リーダー配列は、ＰＶＣニードル複合体ビヒクル中へのパッケージのためにそれらの別個に合成されたタンパク質を標的化するために十分である（図１１参照）。これは、シャーシ（ＰＶＣ）遺伝子自体もプラスミド上に存在する場合、大腸菌（E.coli）において当てはまり、宿主生物フォトラブダス属（Photorhabdus）の場合のようにシャーシ遺伝子は染色体中に組み込まれる。
【0211】
大腸菌（E.coli）中で発現されたＰＶＣｐｎｆナノシリンジ中への高レベルのＣｒｅ部位特異的リコンビナーゼのトランスパッケージのさらなる例示を図１０（Ｃ）に提供する。より詳細には、本発明者らは、（ｉ）例えば、配列番号９３のＰ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949ＰＶＣｐｎｆオペロン（Ｐｖｃ１６上のＣ末端ＦＬＡＧタグを例えば、配列番号９３の直近の３’で有する）のアラビノース誘導性発現プラスミドと、（ｉｉ）天然Ｐｎｆエフェクター５０アミノ酸リーダー配列（例えば、配列番号７８のリーダー）のＮ末端融合物及びＣ末端Ｍｙｃ－タグエピトープを有するＣｒｅリコンビナーゼを含有する第２のＩＰＴＧ誘導性発現プラスミドとを保有する実験室大腸菌（E.coli）発現株を構築した。ＰＶＣオペロン及びエフェクター（Ｃｒｅ＋リーダー配列）を２４時間同時誘導し、キメラナノシリンジを精製した。ウェスタンブロット分析を使用して精製後のＦＬＡＧタグ付きＰｖｃ１６キャップタンパク質（及びしたがってナノシリンジシャーシ）及びトランスパッケージされたＭｙｃタグ付きＣｒｅリコンビナーゼの存在を確認した。
【0212】
４．２ より大きい多様な配列スペースの機能性を実証する追加のリーダーを使用するトランスパッケージ
実施例３に概説されたデータを補うため、図１０Ｄは、以下の４つの追加のリーダー配列を使用するＰＶＣｐｎｆ（大腸菌（E.coli）中）中へのＣｒｅの（トランス）パッケージを実証する（したがってより大きい配列スペースの機能性を実証する）：
－ レーン１：ＰＡＵ＿０２０９６のリーダー（リーダー配列＝配列番号７１）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｌｏｐｔ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；
－ レーン２：ＰＡＫ＿０２０７５のリーダー（リーダー配列＝配列番号５０）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｃｎｆ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；
－ レーン３：ＰＡＵ＿０２００９のリーダー（リーダー配列＝配列番号６８）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｃｉｆ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；及び
－ レーン４：ＰＡＵ＿０２８０６のリーダー（リーダー配列＝配列番号７６）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｇｏｇ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験。
実施例３に概説されたデータを補うため、図１０Ｄは、以下の４つの追加のリーダー配列を使用するＰＶＣｐｎｆ（大腸菌（E.coli）中）中へのＣｒｅの（トランス）パッケージを実証する（したがってより大きい配列スペースの機能性を実証する）：
－ レーン１：ＰＡＵ＿０２０９６のリーダー（リーダー配列＝配列番号７１）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｌｏｐｔ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；
－ レーン２：ＰＡＫ＿０２０７５のリーダー（リーダー配列＝配列番号５０）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｃｎｆ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；
－ レーン３：ＰＡＵ＿０２００９のリーダー（リーダー配列＝配列番号６８）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｃｉｆ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験；及び
－ レーン４：ＰＡＵ＿０２８０６のリーダー（リーダー配列＝配列番号７６）、図１０Ｄの「ナノシリンジ＋ｇｏｇ５０：：ｃｒｅ：：Ｍｙｃ」と称される実験。
【0213】
これらの結果は、ペイロードの（トランス）パッケージについてのより大きい配列多様性を示すリーダー配列の有用性も実証する。実際、さらなる検証を提供するため、本発明者らは、リーダー配列のパネルのCLUSTALW配列比較を実施して多様性を決定した。ＰＶＣエフェクターは、ｐｖｃ１６構造遺伝子の直近の下流でコードされる認識可能毒素様ドメインをコードするタンパク質として同定される。それぞれのＰＶＣオペロンは、単一エフェクターのみ、又はタンデムアレイのいくつかの異なるエフェクター遺伝子をコードし得る。系統樹を図１０Ｅに示し、ペイロードタンパク質をナノシリンジ複合体中にパッケージするための本明細書に例示されるリーダー配列の同一性は、Ｐ．アシンビオティカ（P.asymbiotica）ATCC43949ＰＶＣｐｎｆオペロン（実線矢印）又はＰ．ルミネスセンス（P.luminescens）ＴＴ０１ ＰＶＣｕｎｉｔ４オペロン（点線矢印）のいずれか又はその両方により作出される。
【0214】
図１０Ｅのツリーから確認することができるとおり、例示されるリーダー配列は全体にわたり十分に分布され、したがって多様性が最大に連続的であり、又はそれに近い。
【0215】
実施例５
尾部ファイバー／結合ドメイン改変
ＰＶＣニードル複合体は、ＰＶＣ複合体の細胞タイプ特異的標的化を可能とすることが考えられる尾部ファイバー（３ＤレンダリングＰＶＣ構造、右端画像の左端のアスタリスク参照）を含むことが公知である。本発明者らは、非天然アミノ酸を取り込むための尾部ファイバー領域の改変（例えば、２０個の標準アミノ酸の代替アミノ酸での野生型配列中のアミノ酸の置換）が尾部ファイバーの発現に影響を与えないことを良好に実証した。
尾部ファイバー／結合ドメイン改変
ＰＶＣニードル複合体は、ＰＶＣ複合体の細胞タイプ特異的標的化を可能とすることが考えられる尾部ファイバー（３ＤレンダリングＰＶＣ構造、右端画像の左端のアスタリスク参照）を含むことが公知である。本発明者らは、非天然アミノ酸を取り込むための尾部ファイバー領域の改変（例えば、２０個の標準アミノ酸の代替アミノ酸での野生型配列中のアミノ酸の置換）が尾部ファイバーの発現に影響を与えないことを良好に実証した。
【0216】
実施例６
リーダー配列がパッケージされたＰＶＣニードル複合体を用いるエクスビボネズミオルガノイド中への活性（外因性）酵素／ペイロードの送達の実証
概念：哺乳類組織への外因性機能的酵素の送達についてのデータを得ること。本発明者らは、エクスビボマウス胆管オルガノイド中への「Ｃｒｅ」として公知のトランスパッケージされたバクテリオファージ由来リコンビナーゼタンパク質の送達を実証した。オルガノイドは、染色体コードされる赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）レポーターの発現が通常、Ｃｒｅ－リコンビナーゼのついてのｌｏｘＰ認識部位によりフランキングされた終止シグナルにより妨害されるマウス系に由来する。リコンビナーゼが存在する場合、終止シグナルは組換えられ、次いで細胞は続けてレポータータンパク質を発現する。この実験的実証の一般的原理を図１６Ａにまとめる。
リーダー配列がパッケージされたＰＶＣニードル複合体を用いるエクスビボネズミオルガノイド中への活性（外因性）酵素／ペイロードの送達の実証
概念：哺乳類組織への外因性機能的酵素の送達についてのデータを得ること。本発明者らは、エクスビボマウス胆管オルガノイド中への「Ｃｒｅ」として公知のトランスパッケージされたバクテリオファージ由来リコンビナーゼタンパク質の送達を実証した。オルガノイドは、染色体コードされる赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）レポーターの発現が通常、Ｃｒｅ－リコンビナーゼのついてのｌｏｘＰ認識部位によりフランキングされた終止シグナルにより妨害されるマウス系に由来する。リコンビナーゼが存在する場合、終止シグナルは組換えられ、次いで細胞は続けてレポータータンパク質を発現する。この実験的実証の一般的原理を図１６Ａにまとめる。
【0217】
方法：胆管オルガノイド調製：ネズミ初代胆管を単離し、Huch et al(Regen Med.2013 Jul;8(4):385-7.PMID:23826690；DOI:10.2217/rme.13.39)プロトコルに従って「BD拡大培地」を使用してmatrigel中でオルガノイドとして１２継代で拡大した。次いで、細胞を２Ｄ中でプレーティングし、BD拡大培地中で培養した。マウスゲノタイプ：Ｒｏｓａ２６ローカス中のＬＳＬ－Ｔｏｍレポーター＋アキシン２ＣｒｅＲＴ（４ＯＨＴ処理時に誘導性）。細胞を非コーディングポリスチレンプレート中で１０，０００個の細胞／ウェルの播種密度で培養した。ナノシリンジをＰＢＳ中３０％容量のシリンジ調製物＋７０％の培養培地として調製した。総容量はウェル当たり１００μｌ。陽性対照は、組換えのための陽性対照としての１：１０００（ｖ／ｖ）の５００ｎＭの４ＯＨＴ（エタノール中）を表した。陰性対照は、１：１０００（ｖ／ｖ）エタノール希釈物のみを表す。細胞を播種し、４８時間成長させ、ナノシリンジを添加し、次いでさらに２４時間培養してから固定（４％ＰＦＡ固定１５分間、室温）し、顕微鏡試験のために染色した。染色：Rocklandからの一次抗体の抗－ＲＦＰ（１：１０００）。二次抗ウサギ５６８（１：５００ｖ／ｖにおいて使用）。試料をレーザー共焦点顕微鏡上で可視化した。
【0218】
結果：図１６Ｂはこれらの実験からの代表的な顕微鏡写真を含み、それらは、ＲＦＰタンパク質についてのシグナルを、ＣｒｅがロードされたＰＶＣｐｎｆナノシリンジで処理した場合、多数の細胞において検出することができたことを実証する。これらは単純な細胞単層ではなくエクスビボオルガノイドであるため、投与される細胞の数におけるいくらかの偶然性が予測され、これは、小分子誘導剤（大きいタンパク質複合体でない）である陽性対照でも観察される。これらがオルガノイドであるため、ナノシリンジの結合特徴を変更し得る、存在するいくらかのレベルの細胞分化があることが予測される。この予備のランからのさらなる興味深い観察は、系に適用されるナノシリンジの総量に関する情報が依然として利用可能でない一方、本発明者らは、ＴＡＭ小分子誘導剤が認識可能にナノシリンジよりもかなり大きい組織浸透を有さないと考えられることを実証することであり、それらの分布能がそれらのサイズによってはそれほど妨げられないことを示唆する。
【0219】
追加の解釈：まとめると、本発明者らは、外因性酵素を細胞標的に送達（例えば、投与）する能力を実証した。さらに、この「ナノシリンジ＋Ｃｒｅ」実験は、形質転換細胞をもたらすＤＮＡ変化を提供する能力を実証することによる生物工学ツール／エイドについての概念の有望な証拠である。したがって、この実験は特に外因性ペイロード（細菌以外のウイルスのタンパク質）、及び核酸改変酵素の使用を実証する。Ｃｒｅ酵素は機能的に送達され、細胞内部を横断して核まで移動し、そのＤＮＡ改変変化に影響を与え得ることが明らかである。
【0220】
実施例７
大腸菌（E.coli）中で発現されたＰＶＣｐｎｆナノシリンジ中へのＭＡＤ７部位特異的リコンビナーゼ（外因性ペイロード）のトランスパッケージ
概念：（実施例６の）Ｃｒｅデータ、及び本明細書に提供されるパッケージされたペイロードの他の例に関して、本発明者らは、リーダー配列を介するナノシリンジ中へのＣａｓ様酵素ＭＡＤ７のパッケージを実証した。これは、本明細書に記載のペイロードの最大外因物の例（ＭＡＤ７＝１４７．９ｋＤａ）である。
大腸菌（E.coli）中で発現されたＰＶＣｐｎｆナノシリンジ中へのＭＡＤ７部位特異的リコンビナーゼ（外因性ペイロード）のトランスパッケージ
概念：（実施例６の）Ｃｒｅデータ、及び本明細書に提供されるパッケージされたペイロードの他の例に関して、本発明者らは、リーダー配列を介するナノシリンジ中へのＣａｓ様酵素ＭＡＤ７のパッケージを実証した。これは、本明細書に記載のペイロードの最大外因物の例（ＭＡＤ７＝１４７．９ｋＤａ）である。
【0221】
方法：簡潔に述べると、シャーシ遺伝子及びＭＡＤ７遺伝子（後者は、本明細書に記載の検出のためのＣ末端Ｍｙｃタグ、及びナノシリンジ取り込みのためのリーダー配列でタグ付けされている）を、大腸菌（E.coli）中で同時に発現させた（誘導時）。ナノシリンジ複合体のハーベスト及び精製時、ドットブロット分析（例えば、Ｍｙｃタグの検出のため）を介してペイロードパッケージをプロービングした。本明細書に記載の精製法（超遠心分離を使用）を用いて（例えば、非常に）高い分子量のタンパク質複合体／生物学的物質を選択することができ、ナノシリンジ及びそれらが担持する任意の積み荷（ペイロード）の回収を可能とする。「ルーズ」／非パッケージペイロードは溶液のままであり、十分な遠心力に供さず、したがってかなりより大きいナノシリンジ「シェル」内に含有（即ち、良好にパッケージされる場合）されない限り精製の間に損失する。ＭＡＤ７の良好なパッケージを図１７により実証する。
【0222】
実施例８
大腸菌（E.coli）中で発現されたＰＶＣｐｎｆ中へのアポトーシス誘導ペイロードのトランスパッケージ
図１０Ｃに記載の大腸菌（E.coli）ＰＶＣｐｎｆリーダー：：ペイロード：：Ｍｙｃトランスパッケージ系（ＰＶＣｐｎｆリーダー＝配列番号７８）を使用して、本発明者らは、少なくとも２つのアポトーシス促進性ヒト由来タンパク質配列又はペプチド（例えば、配列番号１０９及び配列番号１１１の配列）をトランスパッケージする能力を実証した。Ｐｎｆエフェクタータンパク質リーダー配列（例えば、配列番号７８）をＮ末端に融合させ、ＭｙｃエピトープタグをＣ末端に融合させた。ウェスタンドットブロット分析（実施例７のものと類似）は、精製ナノシリンジ中のそれらのヒト由来タンパク質の存在を裏付けた（図１８）。
大腸菌（E.coli）中で発現されたＰＶＣｐｎｆ中へのアポトーシス誘導ペイロードのトランスパッケージ
図１０Ｃに記載の大腸菌（E.coli）ＰＶＣｐｎｆリーダー：：ペイロード：：Ｍｙｃトランスパッケージ系（ＰＶＣｐｎｆリーダー＝配列番号７８）を使用して、本発明者らは、少なくとも２つのアポトーシス促進性ヒト由来タンパク質配列又はペプチド（例えば、配列番号１０９及び配列番号１１１の配列）をトランスパッケージする能力を実証した。Ｐｎｆエフェクタータンパク質リーダー配列（例えば、配列番号７８）をＮ末端に融合させ、ＭｙｃエピトープタグをＣ末端に融合させた。ウェスタンドットブロット分析（実施例７のものと類似）は、精製ナノシリンジ中のそれらのヒト由来タンパク質の存在を裏付けた（図１８）。
【0223】
実施例９
（トランス）パッケージされたアポトーシス促進性ヒトポリペプチドのナノシリンジ送達による、培養されたエクスビボヒト細胞中のアポトーシスの誘導の実証
予備検査は、大腸菌（E.coli）中で産生されたＰＶＣｐｎｆナノシリンジを使用してトランスパッケージされたヒトタンパク質配列（例えば、実施例８に従ってパッケージされた）を送達し、ヒトドナーからのエクスビボ循環ＰＢＭＣ細胞中でアポトーシスを誘導する能力を裏付けた。アッセイは、パッケージされたナノシリンジに２０分間のみ曝露させた細胞からのＴＵＮＥＬ染色顕微鏡分析である。結果を図１９Ａに示し、ｔＢｉｄ ｐ１５断片及びＢａｘＢＨ３ドメインの送達を実証する（アポトーシスの良好な誘導を介する）。
・ｔＢｉｄ ｐ１５断片（配列番号１０９）は、正常ヒトアポトーシス調節経路の一部である。細胞効果：Ｂｃｌ－２ファミリーのアポトーシス促進メンバー。ＢｉｄのＣ末端部分（ｔＢｉｄ）はミトコンドリアにトランスロケートし、そこでそれはシトクロムｃの放出を誘導する。Ｂｉｄは通常、その潜在性細胞質全長プロＢｉｄ形態からカスパーゼ８により開裂される。
・ＢａｘＢＨ３（ａａ５９～７３）（配列番号１１１）は、規定のＢａｘ ＢＨ３ドメインの重要な１５個の残基を含む最小ＢＨ３ドメイン合成ペプチドである。細胞効果：これら１５個の残基は、Ｂｃｌ－ｘＬに結合し、それを機能的にアンタゴナイズするために、及びＢａｘ／Ｂａｋを特異的に誘導するために十分な情報を含有する。Ｂａｋ／Ｂｃｌ－２相互作用を停止させ、アポトーシス促進因子を開放すると考えられる。
（トランス）パッケージされたアポトーシス促進性ヒトポリペプチドのナノシリンジ送達による、培養されたエクスビボヒト細胞中のアポトーシスの誘導の実証
予備検査は、大腸菌（E.coli）中で産生されたＰＶＣｐｎｆナノシリンジを使用してトランスパッケージされたヒトタンパク質配列（例えば、実施例８に従ってパッケージされた）を送達し、ヒトドナーからのエクスビボ循環ＰＢＭＣ細胞中でアポトーシスを誘導する能力を裏付けた。アッセイは、パッケージされたナノシリンジに２０分間のみ曝露させた細胞からのＴＵＮＥＬ染色顕微鏡分析である。結果を図１９Ａに示し、ｔＢｉｄ ｐ１５断片及びＢａｘＢＨ３ドメインの送達を実証する（アポトーシスの良好な誘導を介する）。
・ｔＢｉｄ ｐ１５断片（配列番号１０９）は、正常ヒトアポトーシス調節経路の一部である。細胞効果：Ｂｃｌ－２ファミリーのアポトーシス促進メンバー。ＢｉｄのＣ末端部分（ｔＢｉｄ）はミトコンドリアにトランスロケートし、そこでそれはシトクロムｃの放出を誘導する。Ｂｉｄは通常、その潜在性細胞質全長プロＢｉｄ形態からカスパーゼ８により開裂される。
・ＢａｘＢＨ３（ａａ５９～７３）（配列番号１１１）は、規定のＢａｘ ＢＨ３ドメインの重要な１５個の残基を含む最小ＢＨ３ドメイン合成ペプチドである。細胞効果：これら１５個の残基は、Ｂｃｌ－ｘＬに結合し、それを機能的にアンタゴナイズするために、及びＢａｘ／Ｂａｋを特異的に誘導するために十分な情報を含有する。Ｂａｋ／Ｂｃｌ－２相互作用を停止させ、アポトーシス促進因子を開放すると考えられる。
【0224】
エクスビボ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中へのアポトーシス促進性ヒトペプチドの送達のより詳細な検査を目下記載する。本試験の目的は、アポトーシス促進性ペプチドがロードされたＰＶＣナノシリンジがエクスビボヒト末梢血単核細胞中でアポトーシスを誘導し得るか否かを調査することであった。トリパンブルー色素排除アッセイを使用して最初に任意の即時細胞毒性について、次いでＴＵＮＥＬアッセイを使用することによりアポトーシス応答についてナノシリンジを評価した。
【0225】
細胞生存率についてのトリパンブルー排除検査：トリパンブルーは、死滅組織又は細胞を選択的に着色するために一般に使用されるジアゾ色素であり、したがって顕微鏡下で死滅細胞は区別可能な青色として示される一方、インタクト細胞膜を有する生存細胞又は組織は非着色のままである。生存細胞は染色から排除されるため、この染色法は色素排除法としても記載される。トリパンブルーは、組織又は細胞生存率の評価に一般に使用される。好適な数の細胞（２×１０５個）をナノシリンジ及び空のナノシリンジに２０分間曝露させた。好適な容量の細胞（３０μＬ）を等容量の０．４％のトリパンブルーに添加し、血球計算盤を使用して生存（非染色）及び死滅（染色）細胞の数を計数した。それぞれの化合物を３つの濃度において検査した。２人の独立したヒトドナーからの血球をそれぞれの化合物についてそれぞれの濃度において検査し、それぞれの試料を２つ組で検査した。
【0226】
顕微鏡観察のための細胞の処理及び調製：２人の独立した健常ヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生存率を、２つの独立検査での３つの検査濃度での２つのキメラナノシリンジ（例えば、外因性アポトーシス促進性ペプチドでロードされた）での２０分間の処理後に決定した。ＰＢＭＣを遠心分離によりハーベストし、培地中で１×１０６個の細胞／ｍｌにおいて再懸濁させた。細胞を２．５％のホルマリン中で固定し、室温で２０分間インキュベートした。７０％のエタノールを噴霧し、放置して空気乾燥させることによりポリ－Ｌ－リジンコートスライドを調製した。細胞を３０秒間遠心分離した。上清を除去し、細胞を２００μｌのｄＨ２Ｏ中で再懸濁させた。５μｌの細胞懸濁液をそれぞれのスライド／固定物に添加した。スライドごとに２回の固定を実施して２つ組の染色の実施を可能とした。細胞懸濁液を放置して空気乾燥させた。
【0227】
ＰＢＭＣ細胞生存率アッセイの結果：トリパンブルー生存率アッセイは、ＰＶＣ調製物が、健常ヒトドナーから採取されたＰＢＭＣに対してそれ自体で直ちに毒性でないことを裏付けた（表２）。ナノシリンジ処理は＞６０％の生存率を示し、最大用量濃度において低い毒性を示した（表２）。次いで、本発明者らは続いてアポトーシスを誘導するキメラナノシリンジの能力を検査した。
【0228】
【表4】
【0229】
ＴＵＮＥＬアッセイを使用するキメラナノシリンジ誘導アポトーシスについての検査：次いで、ＴＵＮＥＬアッセイを使用してスライド上で固定された単一細胞懸濁液中でアポトーシス核を同定した。このアッセイにおいて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）がアポトーシスシグナル因子に応答して生成されるＤＮＡ断片の露出された３’－ＯＨ末端に結合する。これは順次、ストレプトアビジン－セイヨウワサビペルオキシド（ＨＲＰ）コンジュゲートを使用して検出することができるビオチン標識デオキシヌクレオチドの付加を触媒する。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）はＨＲＰ標識試料と反応してＤＮＡ断片化の部位において不溶性褐色基質を生成する。メチルグリーン対比染色は、正常及びアポトーシス細胞の可視化を可能とする。
【0230】
ナノシリンジへのヒトＰＢＭＣの曝露後のアポトーシスの誘導を決定した。ＴＵＮＥＬアッセイキット（Abcam）をアポトーシス細胞の検出に使用した。アッセイは製造業者の説明書に従って実施した。簡潔に述べると、スライドを１００μＬのプロテイナーゼＫ溶液で又は５分間被覆し、スライドを１×ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でリンスした。ナノシリンジ又はＤＮアーゼＩ陽性キット対照の処理を室温において２０分間実施した。スライドをＴＢＳでリンスした。次いで、スライドをＴｄＴ平衡緩衝液と３０分間インキュベートしてからＴｄＴ標識反応ミックスを添加した。スライドを３７℃において１９分間インキュベートした。次いで、スライドをＴＢＳで洗浄してから停止緩衝液を適用し、室温において５分間インキュベートした。スライドをＴＢＳで再度洗浄してから遮断緩衝液を室温において１０分間添加した。検出は、３０分間の試料へのコンジュゲートの適用により実施した。スライドをＴＢＳでリンスしてからＤＡＢ溶液を１５分間適用した。スライドをｄＨ２Ｏでリンスし、次いでメチルグリーンで対比染色した。スライドを１００％のエタノール、次いでキシレン中で脱水し、ガラスカバースリップでマウントした。全ての染色を２つ組で実施した。アポトーシス検出アッセイにおける陽性染色を示すアポトーシスエンドポイントは、暗褐色（ＤＡＢ）シグナルにより表される。より明るい褐色の陰影及び／又は青色／緑色から緑色／褐色の陰影は、アポトーシスについての非反応性陰性細胞を示す。
【0231】
スライド上で細胞の５回のランダム部分を選択することにより分析を実施し、陽性染色細胞（暗褐色）及び陰性染色細胞（青色又は淡褐色）を計数し、アポトーシス体を示す細胞の割合を決定した。
【0232】
陽性対照を生成するため、以下に詳述するプロテイナーゼＫ処理ステップ後にスライドを１μｇ／μｌのＤＮアーゼＩ（キット陽性対照）で室温において２０分間処理した。ＤＮアーゼＩ処理は、正常細胞中のＤＮＡを断片化してアポトーシスの間に生成されるものと同一のフリー３’ＯＨ基を生成する。処理ステージの間に反応ミックス中のＤＮアーゼＩをｄＨ２Ｏで置換することにより陰性対照を生成した。
【0233】
ＰＢＭＣアポトーシスアッセイの結果：インタクトｔＢＩＤ及びＢａｘがロードされたナノシリンジでの処理後にＰＢＭＣを使用するＴＵＮＥＬ染色を適切な陽性及び陰性キット対照を用いて実施した。処理を２０分間実施してナノシリンジがアポトーシスシグナルを誘発するか否かを決定した。陽性対照（ＤＮアーゼＩ処理）及び陰性対照（ＤＮアーゼＩ処理なし）を含めた。結果は、ｔＢＩＤ又はＢａｘのいずれかを含有するナノシリンジの両方が、ＰＢＭＣに対して強力なアポトーシスシグナル（それぞれ８９％及び７８％陽性）を示すことを示した。陽性対照は、強力なアポトーシスシグナル（７９％）を示した一方、陰性対照はアポトーシスシグナルを示さなかった（１００％陰性）。ナノシリンジ処理試料中の付着細胞の数の有意な損失も観察され、これは急速で包括的なアポトーシス応答、及び洗浄後の保持の不成功を示すと考えられた。この効果はキット陽性対照よりもかなり傑出しており、より急速な応答を示唆することに留意されたい。代表的な顕微鏡写真を図１９Ｂに示す。
【0234】
結論：ｔＢＩＤ及びＢａｘがロードされたナノシリンジは、ヒト末梢血単核細胞中で広範なアポトーシスを急速に誘導し得ることが結論付けられる。さらに、トリパンブルー色素排除アッセイは、それらのキメラナノシリンジが急速な致死溶解も細胞の広範な膜損傷も引き起こさないことを裏付けた。
【0235】
実施例１０
リーダー配列及びＰＶＣニードル複合体の実際的な有用性の例証－非定型（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ペイロードの細胞内送達
（１）抗－ＭＤＭ（ｐ５３阻害剤）抗体を本明細書に記載のリーダー配列に結合させ、パッケージのためにＰＶＣニードル複合体と一緒に発現させる。単離ＰＶＣニードル複合体（抗体ペイロードを含む）を、抗体の細胞内送達のために腫瘍と接触させる（前記腫瘍細胞は、ＭＤＭ阻害のためにｐ５３活性の高いＭＤＭ抑制を有することにより特徴付けされている）。腫瘍は抗ＭＤＭ抗体の活性により抑制される。
（２）ＰＶＣニードル複合体を使用して抗腫瘍ペプチドワクチンを（細胞内）送達してＭＨＣ－１依存性細胞毒性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）応答を活性化させる。チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）ペプチドワクチンをＣＴＬに交差提示の向上のために送達し、ＴＲＰ２発現腫瘍に対する抗腫瘍効果が生じる。腫瘍はペプチドワクチンの活性により抑制される。
（３）ＰＶＣニードル複合体を使用して核因子－ｋＢ阻害剤（炎症性障害、例えば、関節リウマチの制御に使用される）を細胞に（細胞内）送達する。続いて、細胞は炎症促進性サイトカインの発現の低減を実証する。
（４）ＰＶＣニードル複合体を使用してＴ３ＳＳペイロード（ＮＦ－ｋＢ及びＭＡＰＫ経路を阻害する）を（細胞内）送達する。これは、単離（精製）ＰＶＣニードル複合体で完了させ、ＰＶＣニードル複合体はそれが由来する細菌細胞と会合したままであることを全く必要としない。
（５）ＰＶＣニードル複合体を使用して細胞に、抗アポトーシスペプチド、例として、ＢＨ４、Ｂｃｌ－ｘＬ－タンパク質、及び／又はｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼのペプチド阻害剤（虚血性損傷（細胞代謝に必要とされる酸素及びグルコースの不足を引き起こす組織への血液供給の制限）から心臓及び脳を保護し得る）を（細胞内）送達する。例えば、ＪＵＮキナーゼの２０個のアミノ酸結合モチーフを介するＪｕｎ－キナーゼ阻害が十分である。例えば、細胞中のシトクロムｃの放出が阻害される。
（６）ＰＶＣニードル複合体を使用してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドキノン内部オキシドレダクターゼ（Ｎｄｉ１）、複合体Ｉの単一サブユニット酵母類似体（有意な心臓保護効果を提供する）を複合体Ｉ欠損突然変異細胞に（細胞内）送達する。Ｎｄｉ１タンパク質は、ミトコンドリア内膜のマトリックス側に正確に標的化され、複合体Ｉ欠損細胞に対するＮＡＤＨオキシダーゼ活性を回復させる。
（７）ＰＶＣニードル複合体を使用してＰＨＯＸ複合体の必須サブユニット（慢性肉芽腫性疾患におけるＲＯＳの産生を回復させるために酵素置換療法で使用される）の２つの一方を慢性肉芽腫性疾患細胞に送達する。ＲＯＳの産生の回復が観察される。
（８）ＰＶＣニードル複合体を使用してミオチュブラリン（Ｘ連鎖ミオチュブラーミオパチー患者における局所及び遠位筋性能を改善するために使用される）を（細胞内）（例えば、筋肉内）送達する。ホスファチジルイノシトール３リン酸及びホスファチジルイノシトール（３，５）二リン酸のミオチュブラリン脱リン酸化が観察される。
（９）ＰＶＣニードル複合体を使用してリコンビナーゼ「Ｃｒｅ」（規定の遺伝子カセットを切り出し得る）を、ゲノムがｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子上流の終止シグナルをフランキングするｌｏｘＰ組換え部位を有するマウス細胞系中に（細胞内）送達する。Ｃｒｅペイロードは組換え部位を切り出し、終止シグナルを除去し、細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現を可能とする。
（１０）ＰＶＣニードル複合体を使用して細胞内構成成分についての親和性を有する約１５ｋＤａナノボディ（抗体断片）を（細胞内）送達する。ナノボディ－細胞内複合体が検出される。
（１１）ＰＶＣニードル複合体を使用して昆虫作物有害生物及び動物寄生虫のための非定型（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ポリペプチド毒素を細胞内送達する（例えば、昆虫細胞中に）。有害生物の抑制が観察される。
（１２）ＰＶＣニードル複合体を使用してヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９及び／又はＭａｄ７）を、ガイドＲＮＡを含む標的細胞中に（細胞内）送達する。ヌクレアーゼは部位特異的遺伝子不活性化を実行する。
リーダー配列及びＰＶＣニードル複合体の実際的な有用性の例証－非定型（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ペイロードの細胞内送達
（１）抗－ＭＤＭ（ｐ５３阻害剤）抗体を本明細書に記載のリーダー配列に結合させ、パッケージのためにＰＶＣニードル複合体と一緒に発現させる。単離ＰＶＣニードル複合体（抗体ペイロードを含む）を、抗体の細胞内送達のために腫瘍と接触させる（前記腫瘍細胞は、ＭＤＭ阻害のためにｐ５３活性の高いＭＤＭ抑制を有することにより特徴付けされている）。腫瘍は抗ＭＤＭ抗体の活性により抑制される。
（２）ＰＶＣニードル複合体を使用して抗腫瘍ペプチドワクチンを（細胞内）送達してＭＨＣ－１依存性細胞毒性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）応答を活性化させる。チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）ペプチドワクチンをＣＴＬに交差提示の向上のために送達し、ＴＲＰ２発現腫瘍に対する抗腫瘍効果が生じる。腫瘍はペプチドワクチンの活性により抑制される。
（３）ＰＶＣニードル複合体を使用して核因子－ｋＢ阻害剤（炎症性障害、例えば、関節リウマチの制御に使用される）を細胞に（細胞内）送達する。続いて、細胞は炎症促進性サイトカインの発現の低減を実証する。
（４）ＰＶＣニードル複合体を使用してＴ３ＳＳペイロード（ＮＦ－ｋＢ及びＭＡＰＫ経路を阻害する）を（細胞内）送達する。これは、単離（精製）ＰＶＣニードル複合体で完了させ、ＰＶＣニードル複合体はそれが由来する細菌細胞と会合したままであることを全く必要としない。
（５）ＰＶＣニードル複合体を使用して細胞に、抗アポトーシスペプチド、例として、ＢＨ４、Ｂｃｌ－ｘＬ－タンパク質、及び／又はｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼのペプチド阻害剤（虚血性損傷（細胞代謝に必要とされる酸素及びグルコースの不足を引き起こす組織への血液供給の制限）から心臓及び脳を保護し得る）を（細胞内）送達する。例えば、ＪＵＮキナーゼの２０個のアミノ酸結合モチーフを介するＪｕｎ－キナーゼ阻害が十分である。例えば、細胞中のシトクロムｃの放出が阻害される。
（６）ＰＶＣニードル複合体を使用してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドキノン内部オキシドレダクターゼ（Ｎｄｉ１）、複合体Ｉの単一サブユニット酵母類似体（有意な心臓保護効果を提供する）を複合体Ｉ欠損突然変異細胞に（細胞内）送達する。Ｎｄｉ１タンパク質は、ミトコンドリア内膜のマトリックス側に正確に標的化され、複合体Ｉ欠損細胞に対するＮＡＤＨオキシダーゼ活性を回復させる。
（７）ＰＶＣニードル複合体を使用してＰＨＯＸ複合体の必須サブユニット（慢性肉芽腫性疾患におけるＲＯＳの産生を回復させるために酵素置換療法で使用される）の２つの一方を慢性肉芽腫性疾患細胞に送達する。ＲＯＳの産生の回復が観察される。
（８）ＰＶＣニードル複合体を使用してミオチュブラリン（Ｘ連鎖ミオチュブラーミオパチー患者における局所及び遠位筋性能を改善するために使用される）を（細胞内）（例えば、筋肉内）送達する。ホスファチジルイノシトール３リン酸及びホスファチジルイノシトール（３，５）二リン酸のミオチュブラリン脱リン酸化が観察される。
（９）ＰＶＣニードル複合体を使用してリコンビナーゼ「Ｃｒｅ」（規定の遺伝子カセットを切り出し得る）を、ゲノムがｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子上流の終止シグナルをフランキングするｌｏｘＰ組換え部位を有するマウス細胞系中に（細胞内）送達する。Ｃｒｅペイロードは組換え部位を切り出し、終止シグナルを除去し、細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現を可能とする。
（１０）ＰＶＣニードル複合体を使用して細胞内構成成分についての親和性を有する約１５ｋＤａナノボディ（抗体断片）を（細胞内）送達する。ナノボディ－細胞内複合体が検出される。
（１１）ＰＶＣニードル複合体を使用して昆虫作物有害生物及び動物寄生虫のための非定型（非フォトラブダス属（Photorhabdus））ポリペプチド毒素を細胞内送達する（例えば、昆虫細胞中に）。有害生物の抑制が観察される。
（１２）ＰＶＣニードル複合体を使用してヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９及び／又はＭａｄ７）を、ガイドＲＮＡを含む標的細胞中に（細胞内）送達する。ヌクレアーゼは部位特異的遺伝子不活性化を実行する。
【0236】
上記明細書に挙げられる全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載される方法及び系の種々の改変及び変動は、本発明の範囲及び主旨から逸脱せずに当業者に明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と共に記載してきたが、特許請求される本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及び生物工学又は関連分野における当業者に明らかな本発明を実施するために記載される方式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【0237】
配列
最初のＭｅｔアミノ酸残基又は対応する最初のコドンが以下の配列番号のいずれかで示される場合、前記残基／コドンは任意選択であり得る。
最初のＭｅｔアミノ酸残基又は対応する最初のコドンが以下の配列番号のいずれかで示される場合、前記残基／コドンは任意選択であり得る。
【0238】
配列番号１（ＰＡＫ＿１９８５）
【化2】
【0239】
配列番号２（ＰＡＫ＿１９８７）
【化3】
【0240】
配列番号３（ＰＡＫ＿１９８８）
【化4】
【0241】
配列番号４（ＰＡＫ＿２０７５）
【化5】
【0242】
配列番号５（ＰＡＫ＿２０７７）
【化6】
【0243】
配列番号６（ＰＡＫ＿２８９２）
【化7】
【0244】
配列番号７（ＰＡＫ＿２８９３）
【化8】
【0245】
配列番号８（ＰＡＫ＿２８９４）
【化9】
【0246】
配列番号９（ＰＡＫ＿３５２５）
【化10】
【0247】
配列番号１０（ＰＡＴ＿００１４８）
【化11】
【0248】
配列番号１１（ＰＡＴ＿００１４９）
ＭＩＦＫＭＬＮＬＡＶＦＹＬＬＧＮＩＦＨＹＬＩＣＱＫＦＩＣＹＦＣＳＶＬＫＳＶＴＭＦＬＴＫＶＡＶＱＩＡＬＹＬＮＩＬＰＴＭＡＧＩＡＧＬＨＡＥＶＱＡＬＮＮＬＦＩＳＧＤＲＧＴＥＫＲＥＮＷＫＹＩＲＮＭＬＥＳＴＩＦＴＱＲＬＴＡＧＱＡＧＫＤＦＡＡＣＨＮＣＳＧＩＬＳＳＰＶＮＶＩＴＧＫＶＥＳＡＧＧＮＦＦＩＮＩＩＳＩ
ＭＩＦＫＭＬＮＬＡＶＦＹＬＬＧＮＩＦＨＹＬＩＣＱＫＦＩＣＹＦＣＳＶＬＫＳＶＴＭＦＬＴＫＶＡＶＱＩＡＬＹＬＮＩＬＰＴＭＡＧＩＡＧＬＨＡＥＶＱＡＬＮＮＬＦＩＳＧＤＲＧＴＥＫＲＥＮＷＫＹＩＲＮＭＬＥＳＴＩＦＴＱＲＬＴＡＧＱＡＧＫＤＦＡＡＣＨＮＣＳＧＩＬＳＳＰＶＮＶＩＴＧＫＶＥＳＡＧＧＮＦＦＩＮＩＩＳＩ
【0249】
配列番号１２（ＰＡＴ＿００１５０）
【化12】
【0250】
配列番号１３（ＰＡＴ＿００１５２）
【化13】
【0251】
配列番号１４（ＰＡＴ＿０２３０８）
【化14】
【0252】
配列番号１５（ＰＡＴ＿０２３０９）
【化15】
【0253】
配列番号１６（ＰＡＴ＿０２３１０）
【化16】
【0254】
配列番号１７（ＰＡＴ＿０２９５６）
【化17】
【0255】
配列番号１８（ＰＡＴ＿０２９５７）
【化18】
【0256】
配列番号１９（ＰＡＴ＿０３１７１）
【化19】
【0257】
配列番号２０（ＰＡＴ＿０３１７２）
【化20】
【0258】
配列番号２１（ＰＡＴ＿０３１７７）
【化21】
【0259】
配列番号２２（ＰＡＵ＿０２００９）
【化22】
【0260】
配列番号２３（ＰＡＵ＿０２０１０）
【化23】
【0261】
配列番号２４（ＰＡＵ＿０２０９５）
【化24】
【0262】
配列番号２５（ＰＡＵ＿０２０９６）
【化25】
【0263】
配列番号２６（ＰＡＵ＿０２０９７）
【化26】
【0264】
配列番号２７（ＰＡＵ＿０２０９８）
【化27】
【0265】
配列番号２８（ＰＡＵ＿０２２３０）
【化28】
【0266】
配列番号２９（ＰＡＵ＿０２８０５）
【化29】
【0267】
配列番号３０（ＰＡＵ＿０２８０６）
【化30】
【0268】
配列番号３１（ＰＡＵ＿０２８０７）
【化31】
【0269】
配列番号３２（ＰＡＵ＿０３３３２）
【化32】
【0270】
配列番号３３（ＰＡＵ＿０３３３７）
【化33】
【0271】
配列番号３４（Ｐｌｕ１６５１）
【化34】
【0272】
配列番号３５（Ｐｌｕ１６７１）
【化35】
【0273】
配列番号３６（Ｐｌｕ１６７２）
【化36】
【0274】
配列番号３７（Ｐｌｕ１６９０）
【化37】
【0275】
配列番号３８（Ｐｌｕ１６９１）
【化38】
【0276】
配列番号３９（Ｐｌｕ１７１２）
【化39】
【0277】
配列番号４０（Ｐｌｕ１７１３）
【化40】
【0278】
配列番号４１（Ｐｌｕ１７１４）
ＭＫＫＴＤＥＫＹＧＱＹＥＹＫＤＥＤＩＴＳＹＰＩＡＷＴＮＰＤＮＧＫＩＹＩＧＩＮＳＰＥＹＳＨＬＮＮＫＧＥＳＥＬＮＬＡＫＩＩＳＴＩＩＨＥＳＬＨＡＳＳＨＱＨＫＧＬＱＳＱＴＤＴＧＡＤＮＬＮＹＤＥＹＶＴＤＹＦＡＲＥＶＹＫＱＩＬＰＤＫＤＹＶＡＮＣＦＴＫＧＬＧＧＥＮＫＩＷＧＧＮＩＶＥＦＭＩＱ
ＭＫＫＴＤＥＫＹＧＱＹＥＹＫＤＥＤＩＴＳＹＰＩＡＷＴＮＰＤＮＧＫＩＹＩＧＩＮＳＰＥＹＳＨＬＮＮＫＧＥＳＥＬＮＬＡＫＩＩＳＴＩＩＨＥＳＬＨＡＳＳＨＱＨＫＧＬＱＳＱＴＤＴＧＡＤＮＬＮＹＤＥＹＶＴＤＹＦＡＲＥＶＹＫＱＩＬＰＤＫＤＹＶＡＮＣＦＴＫＧＬＧＧＥＮＫＩＷＧＧＮＩＶＥＦＭＩＱ
【0279】
配列番号４２（Ｐｌｕ２４００）
【化41】
【0280】
配列番号４３（Ｐｌｕ２４０１）
【化42】
【0281】
配列番号４４（Ｐｌｕ２５１４）
【化43】
【0282】
配列番号４５（Ｐｌｕ２５１５）
【化44】
【0283】
配列番号４６（Ｐｌｕ１６４９）
【化45】
【0284】
【表5】
【0285】
配列番号９３（フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）株ATCC43949ＰＶＣＰｎｆオペロン、ｐｖｃ１～ｐｖｃ１６；例えば、GenBankアクセッション番号FM162591.1の配列の遺伝子ＰＡＵ＿０３３５３からＰＡＵ＿０３３３８に対応）
【化46】
【化47】
【化48】
【化49】
【化50】
【0286】
配列番号９４（フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）株ATCC43949ＰＶＣｌｏｐＴオペロン、ｐｖｃ１～ｐｖｃ１６；例えば、GenBankアクセッション番号FM162591.1の配列の遺伝子ＰＡＵ＿０２１１２からＰＡＵ＿０２０９９に対応）
【化51】
【化52】
【化53】
【化54】
【0287】
配列番号９５（フォトラブダス・アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica）株ATCC43949ＰＶＣＰａＴｏｘオペロン、ｐｖｃ１～ｐｖｃ１６）
【化55】
【化56】
【化57】
【化58】
【化59】
【0288】
配列番号９６（Ｐｎｆエピトープ）
ＴＧＱＫＰＧＮＮＥＷＫＴＧＲ
ＴＧＱＫＰＧＮＮＥＷＫＴＧＲ
【0289】
配列番号９７（ＰＶＣｐｒｏｍＦ）
ＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧ
ＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧ
【0290】
配列番号９８（ＰＶＣｐｒｏｍＲ）
ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣ
ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣ
【0291】
配列番号９９（ＰａｒａＩＮＦ）
ＧＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧ
ＧＧＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧ
【0292】
配列番号１００（ＰａｒａＩＮＦ）
ＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣ
ＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣ
【0293】
配列番号１０１（Ｆ１プライマー）
ＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＣＧ
ＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＣＧ
【0294】
配列番号１０２（Ｆ２プライマー）
ＧＡＣＴＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＧＧ
ＧＡＣＴＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＧＧ
【0295】
配列番号１０３（Ｆ３プライマー）
ＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＣ
ＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＣ
【0296】
配列番号１０４（Ｆ４プライマー）
ＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＡＴＣ
ＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＡＴＣ
【0297】
配列番号１０５（Ｒ１プライマー）
ＴＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＴＣＴＧ
ＴＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＴＣＴＧ
【0298】
配列番号１０６（Ｒ２プライマー）
ＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧ
ＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧ
【0299】
配列番号１０７（Ｒ３プライマー）
ＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＴＧＧＴＴＧ
ＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＴＧＧＴＴＧ
【0300】
配列番号１０８（Ｒ４プライマー）
ＴＴＡＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＴＴＴ
ＴＴＡＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＴＴＴ
【0301】
配列番号１０９（ｔＢｉｄアミノ酸配列）
ＲＳＳＨＳＲＬＧＲＩＥＡＤＳＥＳＱＥＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩＰＰＧＬＶＮＧＬＡＬＱＬＲＮＴＳＲＳＥＥＤＲＮＲＤＬＡＴＡＬＥＱＬＬＱＡＹＰＲＤＭＥＫＥＫＴＭＬＶＬＡＬＬＬＡＫＫＶＡＳＨＴＰＳＬＬＲＤＶＦＨＴＴＶＮＦＩＮＱＮＬＲＴＹＶＲＳＬＡＲＮＧＭＤ
ＲＳＳＨＳＲＬＧＲＩＥＡＤＳＥＳＱＥＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲＳＩＰＰＧＬＶＮＧＬＡＬＱＬＲＮＴＳＲＳＥＥＤＲＮＲＤＬＡＴＡＬＥＱＬＬＱＡＹＰＲＤＭＥＫＥＫＴＭＬＶＬＡＬＬＬＡＫＫＶＡＳＨＴＰＳＬＬＲＤＶＦＨＴＴＶＮＦＩＮＱＮＬＲＴＹＶＲＳＬＡＲＮＧＭＤ
【0302】
配列番号１１０（大腸菌（E.coli）配列最適化ｔＢｉｄ塩基）
【化60】
【0303】
配列番号１１１（ＢａｘＢＨ３ペプチド（ａａ５９～７３））
ＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮ
ＬＳＥＳＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮ
【0304】
配列番号１１２（大腸菌（E.coli）配列最適化ＢａｘＢＨ３塩基）
ＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴ
ＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴ
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【配列表】
【国際調査報告】