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特表2022-535420宿主細胞によって産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役させるための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-08
(54)【発明の名称】宿主細胞によって産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役させるための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/52 20060101AFI20220801BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20220801BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20220801BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20220801BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20220801BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20220801BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20220801BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20220801BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220801BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220801BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220801BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220801BHJP
【ＦＩ】
C12N15/52 Z ZNA
C12N15/53
C12N15/54
C12N15/55
C12N9/00
C12N9/02
C12N9/12
C12N9/16 B
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571961
(86)(22)【出願日】2020-06-05
(85)【翻訳文提出日】2022-02-02
(86)【国際出願番号】 US2020036417
(87)【国際公開番号】W WO2020247816
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】62/858,152
(32)【優先日】2019-06-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/034,883
(32)【優先日】2020-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】511289736
【氏名又は名称】アミリス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュア ペネロペ アール．
(72)【発明者】
【氏名】ラーマン ジョシュア アダム
(72)【発明者】
【氏名】シェルバート トーマス ジョン
(72)【発明者】
【氏名】タッカー チャンドレッシュ
(72)【発明者】
【氏名】ツォン アニー エニン
(72)【発明者】
【氏名】チアン ハンシアオ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD04
4B050EE10
4B050LL05
4B050LL10
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA27
4B065CA60
(57)【要約】
宿主細胞によって産生されるイソプレノイド化合物の収率と生産性とを脱共役するための組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態において、クエン酸回路（ＴＣＡ）におけるフラックスが減少するように宿主細胞を遺伝子改変することで、収率と生産性とを脱共役する。他の態様において、宿主細胞内のＡＴＰのレベルを低下させることで、収率と生産性とを脱共役する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非分解生化合物を産生可能な宿主細胞によって産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役する方法であって、発酵時のＡＴＰの利用を減少させることを含む、方法。
【請求項2】
前記ＡＴＰの利用が、１種以上のＡＴＰ除去剤の添加によって減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１種以上のＡＴＰ除去剤が、弱有機酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記弱有機酸が、ソルビン酸、酢酸、安息香酸、およびプロピオン酸から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記弱有機酸が安息香酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＴＰの利用が、１種以上のＡＴＰ消費酵素の過剰発現によって減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記１種以上のＡＴＰ消費酵素がSaccharomyces cerevisiaeのＳＳＢ１およびＡＴＰジホスホヒドロラーゼから選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＴＰの利用が、１種以上のＡＴＰ脱共役酵素の過剰発現によって減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記１種以上のＡＴＰ脱共役酵素が、ＮＡＤＨ酸化酵素（ＮＯＸ）および代替酸化酵素（ＡＯＸ）から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＴＰのレベルが、宿主細胞内の無益回路の発現によって減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記無益回路が、ホスホフルクトキナーゼとフルクトース－１、６－ビスホスファターゼとの同時過剰発現、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼとピルビン酸カルボキシキナーゼとの同時過剰発現から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記非分解生化合物が、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイドおよびポリケチドからなる群より選ばれる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記非分解生化合物がイソプレノイドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群より選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記イソプレノイドが、アビタジエン、アモルファジエン、カレン、α－ファルネセン、β－ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β－ピネン、サビネン、γ－テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群より選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記イソプレノイドがβ－ファルネセンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記宿主細胞が、細菌細胞、植物細胞、および酵母細胞から選ばれる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記酵母細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
イソプレノイド化合物を産生可能な宿主細胞によって産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役させるための方法であって、宿主細胞のクエン酸回路（ＴＣＡ回路）における炭素フラックスを減少させることを含む、方法。
【請求項21】
前記ＴＣＡ回路内の炭素フラックスが、１種以上のＴＣＡ酵素の阻害によって減少される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記１種以上のＴＣＡ酵素の発現が下方制御される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＴＣＡ酵素が、クエン酸シンターゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、サクシニルＣｏＡリガーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸カルボキシキナーゼから選ばれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ＴＣＡ酵素が、ピルビン酸カルボキシキナーゼおよびクエン酸シンターゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記非分解生化合物が、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイド、およびポリケチドからなる群より選ばれる、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記非分解生化合物がイソプレノイドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群より選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記イソプレノイドが、アビタジエン、アモルファジエン、カレン、α－ファルネセン、β－ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β－ピネン、サビネン、γ－テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンから選ばれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記イソプレノイドがβ－ファルネセンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記宿主細胞が、細菌細胞、植物細胞、および酵母細胞から選ばれる、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記酵母細胞がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、非分解生化合物を産生する宿主細胞による発酵時の、非分解生化合物の産生における収率と生産性とを脱共役させる（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）ための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
いかなるバイオマニュファクチャリング・プロセスにおいても、収率と生産性は、２つの主たる原価差要因である。イソプレノイド等の非分解生化合物のバイオマニュファクチャリングにおいて、生産性と収率は、糖および／または酸素の消費といった他の細胞速度の作用によることが多い。最小の製造費で生産性と収率の最適な組み合わせを達成する発酵プロセスの設計には、この関係性の詳細な特徴付けが必要である。標準的な発酵条件下におけるイソプレノイドの産生において、収率は、酸素および糖の取り込みの細胞比速度、転じて生産性、と常に逆相関する、即ち、イソプレノイド産生細胞による酸素および糖の取り込むが速いほど、イソプレノイド収率は低下する。このような関係性は「速度－収率共役（ｒａｔｅ－ｙｉｅｌｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」と呼ばれている。イソプレノイド製造において収率と生産性は２つの重要な原価差要因であることから、この収率と生産性の逆向きの共役（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）は問題である。速度－収率共役故に、酸素および／または糖の転移速度を増加させて生産性を向上させるいかなる試みも、付随する収率の減少となり、向上した生産性による費用効果が打ち消される。収率と生産性との逆相関を取り除くことは、高収率と高生産性とを同時に達成することを可能せしめるため有益であり、その結果、イソプレノイド製造効率が最大化される（発酵の費用当たりの産生されるイソプレノイド製品が最大化される）。
【発明の概要】
【0003】
一態様において、本発明は、非分解生化合物を産生可能な宿主細胞内で産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役させる（ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）ための方法であって、発酵時のＡＴＰの利用を減少させることを含む、方法を提供する。
【0004】
一実施形態において、ＡＴＰの利用は１種以上のＡＴＰ除去剤の添加によって減少される。別の実施形態においては、１種以上のＡＴＰ除去剤は弱有機酸である。一定の実施形態においては、弱有機酸はソルビン酸、酢酸、安息香酸、およびプロピオン酸から選ばれる。好ましい実施形態においては、弱有機酸は安息香酸である。
【0005】
本発明の他の態様において、ＡＴＰの利用は１種以上のＡＴＰ消費酵素の過剰発現によって減少される。一実施形態において、１種以上のＡＴＰ消費酵素はSaccharomyces cerevisiaeのＳＳＢ１およびＡＴＰジホスホヒドロラーゼから選ばれる。別の実施形態において、ＡＴＰの利用は１種以上のＡＴＰ脱共役酵素の過剰発現によって減少される。特定の実施形態においては、１種以上のＡＴＰ脱共役酵素はＮＡＤＨ酸化酵素（ＮＯＸ）および代替酸化酵素（ＡＯＸ）から選ばれる。
【0006】
本発明のさらなる態様において、ＡＴＰのレベルは宿主細胞内の無益回路の発現によって減少される。一定の実施形態においては、無益回路は、ホスホフルクトキナーゼとフルクトース－１，６－ビスホスファターゼとの同時過剰発現、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼとピルビン酸カルボキシキナーゼとの同時過剰発現から選ばれる。
【0007】
本発明の方法の一実施形態において、非分解生化合物は、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイドおよびポリケチドからなる群より選ばれる。一定の実施形態においては、非分解生化合物はイソプレノイドである。特定の実施形態においては、イソプレノイドは、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群より選ばれる。他の態様においては、イソプレノイドは、アビタジエン、アモルファジエン、カレン、α－ファルネセン、β－ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β－ピネン、サビネン、γ－テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群より選ばれる。好ましい実施形態においては、イソプレノイドはβ－ファルネセンである。
【0008】
本発明の方法の一実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、植物細胞、および酵母細胞から選ばれる。一定の実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。好ましい実施形態においては、酵母細胞はSaccharomyces cerevisiaeである。
【0009】
本発明の他の態様において、本発明は、イソプレノイド化合物を産生可能な宿主細胞によって産生される非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役させるための方法であって、宿主細胞のクエン酸回路（ＴＣＡ）における炭素フラックスを減少させることを含む方法を提供する。
【0010】
本発明の方法の一実施形態において、ＴＣＡ回路内の炭素フラックスは、１種以上のＴＣＡ酵素の阻害によって減少される。別の実施形態においては、１種以上のＴＣＡ酵素の発現が下方制御される。さらなる実施形態においては、ＴＣＡ酵素は、クエン酸シンターゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、サクシニルＣｏＡリガーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸カルボキシキナーゼから選ばれる。好ましい実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ピルビン酸カルボキシキナーゼおよびクエン酸シンターゼである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図6】図６は、ＡＴＰの潜在的な吸収源（ｓｉｎｋ）としての加水分解または無益回路を除去することによって、産物の収率に対するＡＴＰ産生の影響をモデル化することを可能にするゲノムスケールのモデルに対する改変を示す図である。（ＮＧＡＭは「非成長関連改変」である。）
【図7】図７は、ｑＳに対する関数としてのファルネセン収率のシミュレーションで得たデータを、ＴＣＡ回路の異なる推定フラックスに対してプロットしたグラフである。実際の実験データは、シミュレーション値に重ねて黒い丸でプロットした。
【図8】図８は、比糖取り込み（ｑＳ）（上パネルのＹ軸）、成長速度（上から２番目のパネルのＹ軸）、比ファルネセン生産性（ｑＰ）（上から３番目のパネルのＹ軸）、および産物収率の計算値（ｑＰ／ｑＳ）（下パネルのＹ軸）に対する、異なる安息香酸濃度（Ｘ軸＝ｍＭの安息香酸）の影響を示す、一組のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書で使用するように、イソプレノイド製品のバイオマニュファクチャリングに関連して使用する「生産性」または「ｑＰ」という用語は、乾燥細胞重量のグラム当たり、１時間に産生される、イソプレノイド製品のモル数を意味する。
【0013】
本明細書で使用するように、イソプレノイド製品のバイオマニュファクチャリングに関連して使用する「収率」または「ＹＰ／Ｓ」という用語は、糖消費の速度に対するイソプレノイド製品の形成速度を意味する。
【0014】
本明細書で使用するように、「ｑＳ」または「糖消費」という用語は、乾燥細胞重量のグラム当たり、１時間に消費される糖のモル数で表した、発酵の際の糖消費速度を意味する。
【0015】
本明細書で使用するように、「ｑＯ２」または「酸素消費」という用語は、乾燥細胞重量のグラム当たり、１時間に消費されるＯ２のモル数で表した、発酵の際の酸素消費速度を意味する。
【0016】
本明細書で使用するように、「速度－収率共役」という用語は、イソプレノイドの発酵による産生の際の、収率と生産性との逆相関を意味する。
【0017】
本明細書で使用するように、「弱有機酸」または「（ＷＯＡ）」という用語は、ｐＫａが４．０以上の有機酸を意味する。ＷＯＡの非限定的な具体例には、ソルビン酸、酢酸、安息香酸およびプロピオン酸が含まれる。
【0018】
本明細書で使用するように、「無益回路」という用語は、少なくとも２つの代謝回路または経路であって、逆向きに同時に走らせたときに、ＡＴＰの加水分解によるエネルギーの消失以外の効果を示さないものを意味する。
【0019】
本明細書で使用するように、「ＡＴＰ消失反応」という用語は、いかなる生理学的プロセスにもエネルギーを使用することなく、ＡＴＰを加水分解する生化学反応を意味する。
【0020】
本明細書で使用するように、「ＡＴＰ脱共役反応」という用語は、ＮＡＤＨ酸化反応またはプロトン輸送を、ＡＴＰ産生から脱共役させる生化学反応を意味する。
【0021】
本明細書で使用するように、「異種」という用語は、通常は天然に見られないものを意味する。「異種ヌクレオチド配列」という用語は、ある細胞から天然では通常は見つからないヌクレオチド配列を意味する。よって、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）宿主細胞にとって外来である（即ち、細胞にとって「外因性」である）、（ｂ）宿主細胞に天然で見られる（即ち、「内因性」である）が、細胞内に不自然な量で存在する（即ち、宿主細胞に天然で見られる量よりも多いまたは少ない）、あるいは（ｃ）宿主細胞に天然で見られるが、天然とは異なる遺伝子座に位置するもののいずれでもよい。
【0022】
本明細書で使用するように、標的遺伝子、例えば、ＴＣＡ経路の１種以上の遺伝子の「機能的に破壊されている」または「機能的破壊」は、宿主細胞において、標的遺伝子のコードするタンパク質の活性が低下するように標的遺伝子が改変されていることを意味する。いくつかの実施形態においては、宿主細胞内の標的遺伝子のコードするタンパク質の活性が除去されている。他の態様においては、宿主細胞内の標的遺伝子のコードするタンパク質の活性が減少している。標的遺伝子の機能的破壊は、遺伝子発現が排除または減少されるように、あるいは遺伝子産物の活性が排除または減少されるように、遺伝子の全てまたは一部を欠失させることで達成され得る。標的遺伝子の機能的破壊は、発現が排除または減少されるように、遺伝子の制御エレメント、例えば、遺伝子のプロモーター、を変異させること、あるいは遺伝子産物の活性が排除または減少されるように、遺伝子のコード配列を変異させることでも達成され得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の機能的破壊は、標的遺伝子の完全なオープンリーディングフレームの除去をもたらす。
【0023】
本明細書で使用するように、「親細胞」という用語は、本明細書で開示する宿主細胞と同一の遺伝的背景を有するが、特定の異種ヌクレオチド配列を含まず、当該異種ヌクレオチド配列を導入するための出発点として機能し、本明細書で開示する宿主細胞の産生に繋がる細胞を意味する。
【0024】
本明細書で使用するように、「生合成酵素」という用語は、生合成経路において機能し、天然起源の分子の産生をもたらす酵素を意味する。
【0025】
イソプレノイドを産生する遺伝子改変微生物
宿主細胞
本発明の実施において有用な宿主細胞には、古細菌、原核細胞、または真核細胞が含まれる。
宿主細胞
本発明の実施において有用な宿主細胞には、古細菌、原核細胞、または真核細胞が含まれる。
【0026】
適切な原核性宿主には、種々のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、またはグラム不定細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示には以下の属に属する細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない：Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Bacillus属、Brevibacterium属、Chromatium属、Clostridium属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Mesorhizobium属、Methylobacterium属、Microbacterium属、Phormidium属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Rhodococcus属、Salmonella属、Scenedesmun属、Serratia属、Shigella属、Staphlococcus属、Strepromyces属、Synnecoccus属、およびZymomonas属。原核細胞株の例示には以下の株が含まれるが、これらに限定されるものではない：Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum、Clostridium beigerinckii、Enterobacter sakazakii、Escherichia coli、Lactococcus lactis、Mesorhizobium loti、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonas pudica、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodospirillum rubrum、Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、およびStaphylococcus aureus。特定の実施形態において、宿主細胞はEscherichia coli細胞である。
【0027】
適切な古細菌宿主には以下の属に属する細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない：Aeropyrum属、Archaeglobus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Methanobacterium属、Pyrococcus属、Sulfolobus属、およびThermoplasma属。古細菌株の例示には以下の株が含まれるが、これらに限定されるものではない：Archaeoglobus fulgidus、Halobacterium sp.、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、およびAeropyrum pernix。
【0028】
適切な真核細胞の宿主には、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、本発明の方法に有用な酵母には、微生物寄託機関（例：ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託され、以下の属に属するものが、他の酵母と共に含まれる：Aciculoconidium属、Ambrosiozyma属、Arthroascus属、Arxiozyma属、Ashbya属、Babjevia属、Bensingtonia属、Botryoascus属、Botryozyma属、Brettanomyces属、Bullera属、Bulleromyces属、Candida属、Citeromyces属、Clavispora属、Cryptococcus属、Cystofilobasidium属、Debaryomyces属、Dekkara属、Dipodascopsis属、Dipodascus属、Eeniella属、Endomycopsella属、Eremascus属、Eremothecium属、Erythrobasidium属、Fellomyces属、Filobasidium属、Galactomyces属、Geotrichum属、Guilliermondella属、Hanseniaspora属、Hansenula属、Hasegawaea属、Holtermannia属、Hormoascus属、Hyphopichia属、Issatchenkia属、Kloeckera属、Kloeckeraspora属、Kluyveromyces属、Kondoa属、Kuraishia属、Kurtzmanomyces属、Leucosporidium属、Lipomyces属、Lodderomyces属、Malassezia属、Metschnikowia属、Mrakia属、Myxozyma属、Nadsonia属、Nakazawaea属、Nematospora属、Ogataea属、Oosporidium属、Pachysolen属、Phachytichospora属、Phaffia属、Pichia属、Rhodosporidium属、Rhodotorula属、Saccharomyces属、Saccharomycodes属、Saccharomycopsis属、Saitoella属、Sakaguchia属、Saturnospora属、Schizoblastosporion属、Schizosaccharomyces属、Schwanniomyces属、Sporidiobolus属、Sporobolomyces属、Sporopachydermia属、Stephanoascus属、Sterigmatomyces属、Sterigmatosporidium属、Symbiotaphrina属、Sympodiomyces属、Sympodiomycopsis属、Torulaspora属、Trichosporiella属、Trichosporon属、Trigonopsis属、Tsuchiyaea属、Udeniomyces属、Waltomyces属、Wickerhamia属、Wickerhamiella属、Williopsis属、Yamadazyma属、Yarrowia属、Zygoascus属、Zygosaccharomyces属、Zygowilliopsis属、およびZygozyma属。
【0029】
いくつかの実施形態において、宿主微生物はSaccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Dekkera bruxellensis、Kluyveromyces lactis（以前はSaccharomyces lactisと呼ばれていた）、Kluveromyces marxianus、Arxula adeninivorans、またはHansenula polymorpha（今ではPichia angustaとして知られる）である。いくつかの実施形態において、宿主微生物はCandida属の株、例えば、Candida lipolytica、Candida guilliermondii、Candida krusei、Candida pseudotropicalis、またはCandida utilisである。
【0030】
特定の実施形態において、宿主微生物はSaccharomyces cerevisiaeである。いくつかの実施形態において、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ－１９０４、ＴＡ、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１、Ｍ－２６、Ｙ－９０４、ＰＥ－２、ＰＥ－５、ＶＲ－１、ＢＲ－１、ＢＲ－２、ＭＥ－２、ＶＲ－２、ＭＡ－３、ＭＡ－４、ＣＡＴ－１、ＣＢ－１、ＮＲ－１、ＢＴ－１、およびＡＬ－１からなる群より選ばれるSaccharomyces cerevisiaeの株である。いくつかの実施形態において、宿主微生物は、ＰＥ－２、ＣＡＴ－１、ＶＲ－１、ＢＧ－１、ＣＲ－１、およびＳＡ－１からなる群より選ばれるSaccharomyces cerevisiaeの株である。特定の実施形態において、Saccharomyces cerevisiaeの株はＰＥ－２である。特定の実施形態において、Saccharomyces cerevisiaeの株はＣＡＴ－１である。特定の実施形態において、Saccharomyces cerevisiaeの株はＢＧ－１である。
【0031】
いくつかの実施形態において、宿主微生物は、工業的発酵、例えば、バイオエタノールの発酵、に適した微生物である。特定の実施形態において、微生物は、工業発酵環境のストレス条件として認識されている、高溶媒濃度、高温、拡張された基質利用、栄養素の限定、糖および塩による浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩や細菌の混入、またはこれらの組み合わせにおいて生存するよう馴化されている。
【0032】
ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲ
他の態様において、本願は、イソプレノイドを生産可能な遺伝子改変宿主細胞であって、アセチル化するアセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ、ＥＣ １．２．１．１０）をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列と、イソプレノイドの生合成経路の１種以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列とを含み、当該生合成経路の１種以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用酵素を含む細胞を提供する。論理に縛られるものではないが、アセチル－ＣｏＡのアセトアルデヒドへの変換によってＡＤＡの産生したＮＡＤＨの増加した細胞内プールは、ＮＡＤＨ使用生合成酵素によって使用され、そうすることで、アセチル－ＣｏＡ誘導産物の収率を増加させながら、細胞内酸化還元バランスを戻すと考えられる。
他の態様において、本願は、イソプレノイドを生産可能な遺伝子改変宿主細胞であって、アセチル化するアセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ、ＥＣ １．２．１．１０）をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列と、イソプレノイドの生合成経路の１種以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列とを含み、当該生合成経路の１種以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用酵素を含む細胞を提供する。論理に縛られるものではないが、アセチル－ＣｏＡのアセトアルデヒドへの変換によってＡＤＡの産生したＮＡＤＨの増加した細胞内プールは、ＮＡＤＨ使用生合成酵素によって使用され、そうすることで、アセチル－ＣｏＡ誘導産物の収率を増加させながら、細胞内酸化還元バランスを戻すと考えられる。
【0033】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用酵素は、生合成経路に本来含まれない酵素である。例えば、ＮＡＤＨ使用酵素は、生合成経路に本来含まれるＮＡＤＰＨ使用酵素を置き換えることができる。他の態様において、ＮＡＤＨ使用酵素は、生合成経路に本来含まれるＮＡＤＰＨ使用酵素と共発現される。いくつかの実施形態において遺伝子改変宿主細胞は、ＮＡＤＨのみを補因子として使用可能なＨＭＧＲを含む。
【0034】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞はイソプレノイドを産生可能であり、細胞は、イソペンテニルピロリン酸を製造するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含み、当該１種以上の酵素は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）を含む。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒し、クラスＩ ＨＭＧｒおよびクラスＩＩ ＨＭＧｒの２つのクラスによって構成される。クラスＩは真核細胞および大部分の古細菌の酵素を含み、クラスＩＩは一部の原核細胞および古細菌のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを含む。配列の多様性に加え、２つのクラスの酵素は、それらの補因子特異性も異なる。ＮＡＤＰＨのみを使用するクラスＩの酵素とは異なり、クラスＩＩのＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとを区別する能力に差がある。例えば、Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004)を参照。選択されたクラスＩＩのＨＭＧＲの補因子特異性を次に提供する。
【0035】
【表1】
【0036】
本願で提供する組成物および方法において有用なＨＭＧＲは、ＮＡＤＨを補因子として使用可能なＨＭＧＲ、例えば、P. mevalonii、A. fulgidusまたはS. aureusのＨＭＧＲである。特定の実施形態において、ＨＭＧＲは、ＮＡＤＨのみを補因子として使用可能な、例えば、P. mevalonii、S. pomeroyiまたはD. acidovoransのＨＭＧＲである。
【0037】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲはPseudomonas mevalonii由来である。ＨＭＧＲ（ＥＣ １．１．１．８８）をコードするPseudomonas mevaloniiの野性型ｍｖａＡ遺伝子の配列は既に報告されている。Beach and Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)を参照。Pseudomonas mevaloniiの代表的なｍｖａＡヌクレオチド配列にはＧｅｎｂａｎｋ識別番号Ｍ２４０１５および本願で提供するの配列番号３が含まれる。Pseudomonas mevaloniiの代表的なＨＭＧＲタンパク質配列にはＧｅｎｂａｎｋ識別番号ＡＡＡ２５８３および本願で提供する配列番号４が含まれる。
【0038】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲはSilicibacter pomeroyi由来である。Silicibacter pomeroyiの代表的なＨＭＧＲヌクレオチド配列には、本願で提供する配列番号５が含まれる。Silicibacter pomeroyiの代表的なＨＭＧＲタンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ識別番号ＹＰ＿１６４９９４および本願で提供する配列番号６が含まれる。
【0039】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲはDelftia acidovorans由来である。Delftia acidovoransの代表的なＨＭＧＲヌクレオチド配列には、本願で提供する配列番号７が含まれる。Delftia acidovoransの代表的なＨＭＧＲタンパク質配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ識別番号ＹＰ＿００１５６１３１８および本願で提供する配列番号８が含まれる。
【0040】
本願で提供する組成物および方法において有用なＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲには、本明細書に記載のいずれかのＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲ、例えば、P. mevalonii、S. pomeroyiおよびD. acidovoransの「誘導体」と言われる分子が含まれる。このような「誘導体」は以下の特徴を有する：（１）本明細書に記載のいずれかのＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲに対して、実質的な相同性を有する、そして（２）ＮＡＤＨを補因子として使用して、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒することができる。ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％と同一であることをもって、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲに対して実質的な相同性を有すると言える。
【0041】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲは、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して選択的である。いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲは、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して、Ｋｍ
ＮＡＤＨ：Ｋｍ
ＮＡＤＰＨ比が少なくとも１：２、１：３、１：４、１：５または１：５超となるほど選択的である。いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲは、ＮＡＰＤＨよりもＮＡＤＨに対して選択的になるように、例えば、補因子結合ポケットの部位特異的変異によって、組み換えられている。ＮＡＤＨ選択性を変更する方法は、Watanabe et al., Microbiology 153:3044－3054 (2007)に記載されており、ＨＭＧＲの補因子特異性を決定するための方法は、Kim et al., Protein Sci. 9:1226-1234 (2000)に記載されており、これらの内容は本参照をもってその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【0042】
いくつかの実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲは、メバロン酸分解路を元々有する宿主種、例えば、メバロン酸を唯一の炭素源として異化する宿主種、に由来する。これらの実施形態において、本来の宿主細胞において内在化（Ｒ）－メバロン酸の（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡへの酸化的アシル化を通常は触媒するＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲは、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子改変宿主細胞において、逆反応、即ち、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化の触媒に使用される。メバロン酸を唯一の炭素源として生育可能な原核細胞が、Anderson et al., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989)、Beach et al., J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)、Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762、Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965)、Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962)、Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967)、およびTakatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.110:187-193 (1983)によって報告されており、これらの内容は本参照をもってその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【0043】
遺伝子改変細胞の作製方法
本願で提供する方法には、ＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素を含むように遺伝子組み換えされた宿主細胞の製造方法が含まれる。ＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素の宿主細胞による発現は、宿主細胞における発現を可能せしめる調節エレメントの制御下にＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸は染色体外プラスミドである。他の態様において核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞染色体に組み込むことのできる、染色体組み込み用ベクターである。
本願で提供する方法には、ＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素を含むように遺伝子組み換えされた宿主細胞の製造方法が含まれる。ＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素の宿主細胞による発現は、宿主細胞における発現を可能せしめる調節エレメントの制御下にＡＤＡおよび／またはＮＡＤＨ使用生合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することによって達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸は染色体外プラスミドである。他の態様において核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞染色体に組み込むことのできる、染色体組み込み用ベクターである。
【0044】
これらタンパク質をコードする核酸は、特に限定無しに、当業者に公知の方法によって宿主細胞導入することができる（例えば、Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292－3、Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376－3385、Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA、Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、およびAusubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照）。例示的な技術にはスフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ １０００仲介形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム仲介形質転換が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
宿主細胞内の酵素のコピー数は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することで変更してもよい。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数の改変（例えば、ヌクレオチド配列を含むより高いまたはより低いコピー数の発現ベクターの使用、または宿主細胞のゲノムへの追加のコピー数のヌクレオチド配列の導入、または宿主細胞のゲノム内のヌクレオチド配列の欠失または破壊による改変）、オペロンのポリシストロン性ｍＲＮＡ上のコード配列の順番の変更、またはオペロンのそれぞれが独自の制御エレメントを有する個別の遺伝子への分解、あるいはヌクレオチド配列が作動可能に連結されたプロモーターまたはオペレーターの強度の増加によって達成することができる。代わりに、あるいは加えて、宿主細胞内の酵素のコピー数は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳レベルを改変することで変更され得る。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性の改変、リボゾーム結合部位の配列の改変、リボゾーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離または配列の改変、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」または隣接する全シストロン間領域の改変、ヘアピンおよび特別な配列を使用したｍＲＮＡ転写産物の３’末端の安定化、酵素によるコドン利用の改変、酵素の生合成に用いられる珍しいコドンｔＲＮＡの発現の変更、および／または、コード配列の変異等による、酵素の安定性の増加によって達成することができる。
【0046】
宿主細胞内の酵素の活性は種々の方法で変更可能であり、そのような方法には、宿主細胞内での溶解度が増加または低下した酵素改変体の発現、酵素活性の阻害された、ドメインを欠いた酵素改変体の発現、高いかまたは低いＫｃａｔあるいは基質に対するＫｍがより低いかより高い酵素改変体の発現、あるいは経路内の他の分子によるフィードバック制御またはフィードフォワード制御による影響をより多くまたはより少なく受ける酵素の改変体の発現が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0047】
いくつかの実施形態において、宿主細胞を遺伝的に改変するために用いられる核酸は、形質転換された宿主細胞の選択および宿主細胞が外来ＤＮＡを保持するように選択圧をかけるために有用な１種以上の選択マーカーを含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、選択マーカーは抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの具体例には、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１－Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、およびＳＨ ＢＬＥの遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。E. coliのＢＬＡ遺伝子産物は、ベータ－ラクタム系抗生物質（例えば、狭域性セファロスポリン類、セファマイシン類、カルバペネム類（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）およびテモシリンを除く全抗グラム陰性細菌性ペニシリン類に対する耐性を付与し、S. nourseiのＮＡＴ１遺伝子産物はノーセオトリシンに対する耐性を付与し、S. viridochromogenes Tu94のＰＡＴ遺伝子産物はビアラホスに対する耐性を付与し、Saccharomyces cerevisiaeのＡＵＲ１－Ｃ遺伝子産物はオーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与し、ＰＤＲ４遺伝子産物はセルレニンに対する耐性を付与し、ＳＭＲ１遺伝子産物はスルホメツロンメチルに対する耐性を付与し、Ｔｎ９トランスポゾンのＣＡＴ遺伝子産物はクロランフェニコールに対する耐性を付与し、マウスｄｈｆｒ遺伝子産物はメトトレキサートに対する耐性を付与し、Klebsiella pneumoniaのＨＰＨ遺伝子産物はハイグロマイシンＢに対する耐性を付与し、E. coliのＤＳＤＡ遺伝子産物はＤ－セリンを唯一の窒素源としてプレート上で細胞が増殖することを可能にし、Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与し、そしてStreptoalloteichus hindustanusのＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物はゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する遺伝子改変宿主細胞が単離された後に、抗生物質耐性マーカーを欠失させる。
【0049】
いくつかの実施形態において、選択マーカーは遺伝子改変微生物の要求性（例えば、栄養素要求性）を解消する。このような実施形態においては、親微生物は、アミノ酸またはヌクレオチドの生合成経路において機能し、その機能不全が１種以上の栄養素の添加なしに親細胞が培地中で増殖することをできなくする、１種以上の遺伝子産物の機能的破壊を有する。このような遺伝子産物には、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。その後、要求性の表現型は、破壊された遺伝子産物の機能的なコピーをコードする発現ベクターまたは染色体組み込み構築物で親細胞を形質転換することによって解消することができ、親細胞の要求性の表現型の喪失に基づいて、作製された遺伝子改変宿主細胞を選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２遺伝子の選択マーカーとしての使用は、陽性および陰性の両方の選択が可能であるため、著しい利点がある。陽性の選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２変異の要求性の補完によって行われ、一方、陰性の選択は、原栄養性株の成長を防止するが、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２変異体のそれぞれの成長を可能せしめる特定の阻害剤、即ち、５－フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５－フルオロアントラニリン酸、およびアミノアジピン酸（ａＡＡ）のそれぞれに基づいて行われる。他の態様において、選択マーカーは、公知の選択方法によって同定することのできる、他の非致死的な欠陥または表現型を解消する。
【0050】
ＴＣＡ回路の酵素
クエン酸回路（ＣＡＣ）またはクレブス回路としても知られるトリカルボン酸回路（ＴＣＡ）は、炭水化物、脂肪およびタンパク質から誘導されたアセチル－ＣｏＡの酸化を介してＡＴＰとしてのエネルギーを産生するために使用される一連の生化学的反応である。ＴＣＡは、特定のアミノ酸のみならず、還元剤であるＮＡＤＨの産生のための前駆体も提供する。本発明の一実施形態においては、ＴＣＡ回路に直接または間接的に（例えば、ＴＣＡ回路に炭素を提供することで）参加する１種以上の酵素の活性を下方制御することで、イソプレノイド産生の速度と収率を脱共役させる。
クエン酸回路（ＣＡＣ）またはクレブス回路としても知られるトリカルボン酸回路（ＴＣＡ）は、炭水化物、脂肪およびタンパク質から誘導されたアセチル－ＣｏＡの酸化を介してＡＴＰとしてのエネルギーを産生するために使用される一連の生化学的反応である。ＴＣＡは、特定のアミノ酸のみならず、還元剤であるＮＡＤＨの産生のための前駆体も提供する。本発明の一実施形態においては、ＴＣＡ回路に直接または間接的に（例えば、ＴＣＡ回路に炭素を提供することで）参加する１種以上の酵素の活性を下方制御することで、イソプレノイド産生の速度と収率を脱共役させる。
【0051】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、クエン酸濃縮酵素、ＣｏＡ－アセチル化クエン酸オキサロ酢酸リアーゼ、クエン酸濃縮化酵素、シトロゲナーゼ、オキサロ酢酸トランスアセターゼ、ＣＩＴ１、ＣＩＴ３、（アミノ酸配列ＮＰ ０１５３２５．１またはＮＰ ０１４３９８．１を含む）、ＥＣ ２．３．３．１、ＥＣ ２．３．３．８およびＥＣ ２．３．３．３としても知られるクエン酸シンターゼである。クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸、アセチル－ＣｏＡと水の、クエン酸塩と補酵素Ａへの変換を触媒する。
【0052】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、シスアコニターゼ、アコニターゼ、ＡＣＯ１、（アミノ酸配列ＮＰ ０１３４０７．１を含む）、およびＥＣ ４．２．１．３としても知られるアコニット酸ヒドラターゼである。アコニット酸ヒドラターゼは、シス－アコニチン酸塩中間体を介した、クエン酸塩のイソクエン酸への変換を触媒する。
【0053】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＩＤＨ２、ＩＤＨ１、ＥＣ １．１．１．４２、ＥＣ １．１．１．４１、ＥＣ １．１．１．２８６、および（ＮＰ ０１４７７９．１またはＮＰ ０１４３６１．１のアミノ酸配列を含む）としても知られるＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼである。ＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、イソクエン酸の、２－オキソグルタレート、二酸化炭素とＮＡＤＨへのＮＡＤ依存性変換を触媒する。
【0054】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＫＧＤ２、ＫＧＤ１、ＬＰＤ１、ＥＣ １．２．４．２、ＥＣ ２．３．１．６１および（ＮＰ ０１０４３２．３、ＮＰ ０１２１４１．１、またはＮＰ １１６６３５．１のアミノ酸配列を含む）としても知られる２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体である。２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体は、２－オキソグルタル酸と補酵素Ａの、サクシニルＣｏＡ、二酸化炭素とＮＡＤＨへのＮＡＤ依存性変換を触媒する。
【0055】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＬＳＣ２、ＬＳＣ１、ＥＣ ６．２．１．４、ＥＣ ６．２．１．５、ＥＣ ２．８．３．１８、および（ＮＰ０１１６７０．３またはＮＰ ０１４７８５．３のアミノ酸配列を含む）としても知られるサクシニルＣｏＡリガーゼである。サクシニルＣｏＡリガーゼは、サクシニルＣｏＡ、ＡＤＰとリン酸の、コハク酸、ＡＴＰと補酵素Ａへの変換を触媒する。
【0056】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、ＳＤＨ４、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．３．５．４、ＥＣ １．３．５．１、および（ＮＰ ０１２７７４．１、ＮＰ０１３０５９．１、またはＮＰ０１２７８１．１のアミノ酸配列を含む）としても知られる、マイナーなコハク酸デヒドロゲナーゼである。コハク酸デヒドロゲナーゼは、コハク酸とユビキノンの、フマル酸とユビキノールへの変換を触媒する。
【0057】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＦＵＭ１、ＥＣ ４．２．１．２、および（ＮＰ０１５０６１．１のアミノ酸配列を含む）としても知られる）フマル酸ヒドラターゼである。フマル酸ヒドラターゼは、フマル酸と水の、リンゴ酸への変換を触媒する。
【0058】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＭＤＨ３、ミトコンドリア・リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＭＤＨ１、細胞基質リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＭＤＨ２、ＥＣ １．１．１．３７、ＥＣ １．１．５．４（、およびＮＰ０１０２０５．１、ＮＰ０１４５１５．２、またはＮＰ０１２８３８．１のアミノ酸配列を含む）としても知られるペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。ペルオキシソームリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、リンゴ酸とＮＡＤの、オキサロ酢酸とＮＡＤＨへの変換を触媒する。
【0059】
いくつかの実施形態において、ＴＣＡ酵素は、ＰＹＣ１、ＰＹＣ２、ＥＣ ４．１．１．３２、ＥＣ ４．１．１．４９（、およびＮＰ０１１４５３．１またはＮＰ０９７７７．１のアミノ酸配列を含む）としても知られるピルビン酸カルボキシキナーゼである。ピルビン酸カルボキシキナーゼは、ピルビン酸、重炭酸塩とＡＴＰの、リン酸、オキサロ酢酸とＡＤＰへの変換を触媒する。
【0060】
無益回路
本発明の一態様においては、イソプレノイドを産生する宿主細胞内のイソプレノイドの収率と生産性は、１種以上の無益回路を宿主細胞に導入することで、脱共役させることができる。無益回路は、少なくとも２つの代謝回路または経路であって、逆向きに同時に走らせたときに、ＡＴＰの加水分解によるエネルギーの消失以外の効果を示さないものである。よって、宿主細胞への１種以上の無益回路の導入は、細胞のＡＴＰレベルを低下させ、それによってイソプレノイド産生の収率と生産性とを脱共役させる。
本発明の一態様においては、イソプレノイドを産生する宿主細胞内のイソプレノイドの収率と生産性は、１種以上の無益回路を宿主細胞に導入することで、脱共役させることができる。無益回路は、少なくとも２つの代謝回路または経路であって、逆向きに同時に走らせたときに、ＡＴＰの加水分解によるエネルギーの消失以外の効果を示さないものである。よって、宿主細胞への１種以上の無益回路の導入は、細胞のＡＴＰレベルを低下させ、それによってイソプレノイド産生の収率と生産性とを脱共役させる。
【0061】
一実施形態において、無益回路は、ホスホフルクトキナーゼとフルクトース－１，６－ビスホスファターゼの過剰発現を含む。ホスホフルクトキナーゼは、Ｄ－フルクトース－６－リン酸のＤ－フルクトース－１，６－二リン酸への変換を触媒する。一方、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１１）は、Ｄ－フルクトース－１，６－二リン酸のＤ－フルクトース－６－リン酸への加水分解を１分子のＡＴＰを消費する反応によって触媒する。したがって、両方の酵素の同時発現はＡＴＰの消失をもたらす。例えば、本参照をもってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５０３２２４６１号明細書および第２０１２００８８２９０号明細書を参照。
【0062】
他の実施形態においては、無益回路はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼとピルビン酸カルボキシキナーゼの同時過剰発現を含む。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、オキサロ酢酸のホスホエノールピルビン酸への変換を触媒し、一方、ピルビン酸カルボキシキナーゼは、逆反応を触媒する。それぞれの酵素は１つの反応に付き１つのＡＴＰ分子を加水分解する。しかし、回路全体も１つのＡＴＰ分子を産生する。よって、各回路の反応が全体で１つのＡＴＰ分子を消失させる。例えば、米国特許出願公開第２０１５０３２２４６１号明細書および第２０１２００８８２９０号明細書を参照。
【0063】
ＡＴＰ消費酵素
本発明の一態様においては、イソプレノイドを産生する宿主細胞内のイソプレノイドの収率と生産性は、ＡＴＰを消失させるが、他のいかなる生理学的効果も産生しない酵素の発現によって、脱共役させることができる。
本発明の一態様においては、イソプレノイドを産生する宿主細胞内のイソプレノイドの収率と生産性は、ＡＴＰを消失させるが、他のいかなる生理学的効果も産生しない酵素の発現によって、脱共役させることができる。
【0064】
一実施形態において、イソプレノイドを産生する宿主細胞におけるSaccharomyces cerevisaeのＳＳＢ１遺伝子またはその断片の過剰発現は、イソプレノイドの収率と生産性の脱共役をもたらす。ＳＳＢ１遺伝子は、初期の折りたたまれる前のタンパク質に結合してＡＴＰ分子を加水分解する、シャペロンタンパク質をコードする。よって、ＳＳＢ１またはその酵素的に活性な断片の過剰発現は、他のいかなる生理学的効果の発生も伴わないＡＴＰの消失をもたらす。例えば、米国特許出願公開第２０１５０３２２４６１号明細書および第２０１２００８８２９０号明細書を参照。
【0065】
他の実施形態において、イソプレノイドを産生する宿主細胞におけるＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼまたはその断片の過剰発現は、イソプレノイドの収率と生産性の脱共役をもたらす。ＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼは、ＡＤＰおよびのＡＴＰのβ－およびγ－リン酸の両方の加水分解を触媒する酵素である。よって、ＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼまたはその酵素的に活性な断片の過剰発現は、他のいかなる生理学的効果の発生も伴わないＡＴＰの消失をもたらす。例えば、米国特許出願公開第２０１５０３２２４６１号明細書および第２０１２００８８２９０号明細書を参照。
【0066】
他の実施形態において、イソプレノイドを産生する宿主細胞におけるＮＡＤＨ酸化酵素、ＥＣ １．６．３．４（ＮＯＸ）またはその機能的断片の過剰発現は、イソプレノイドの収率と生産性の脱共役をもたらす。ＮＯＸは、ＡＴＰを産生することなく、水素をＯ２に直接移動することで、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に還元する。ＮＯＸは、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化の際にＡＴＰを産生する本来の電子輸送鎖をバイパスすることによって、細胞内ＡＴＰ濃度を低下させる。よって、ＮＯＸまたはその機能的断片の過剰発現は、他のいかなる生理学的効果の発生も伴わないＡＴＰの消失をもたらす。
【0067】
他の実施形態において、イソプレノイドを産生する宿主細胞における代替酸化酵素（ＡＯＸ）またはその機能的断片の過剰発現は、イソプレノイドの収率と生産性の脱共役をもたらす。Ｏ２のＨ２Ｏへの還元をもたらす、ユビキノールからＡＯＸへの電子の流れは、プロトン輸送とは共役されておらず、したがって、ＡＴＰ産生のためにＡＴＰシンターゼが使用する輸送力を減少させる。よって、ＡＯＸまたはその機能的断片の過剰発現は、他のいかなる生理学的効果の発生も伴わないＡＴＰの消失をもたらす。
【0068】
ＡＴＰ除去剤
いくつかの実施形態において、宿主細胞内のＡＴＰのレベルは、１種以上のＡＴＰ除去剤の添加によって低下される。ＡＴＰ除去剤とは、ＡＴＰ除去剤を含む培地で宿主細胞を培養した際に、宿主細胞内のＡＴＰのレベルを低下させることのできる化合物または分子である。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ除去剤は、電子輸送をＡＴＰ産生から脱共役させるものである。好ましい実施形態において、ＡＴＰ除去剤は弱有機酸である。弱有機酸の非限定的な具体例は、酢酸、プロピオン酸、ソルビン酸、および安息香酸である。宿主細胞は、ＡＴＰレベルを低下させるのに十分な量（濃度）の弱有機酸を含む培地で培養して、非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役することができる。いくつかの実施形態において、弱有機酸の量は０．２５ｍＭ以上である。特定の実施形態において、宿主細胞培養培地は少なくとも０．２５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．４０ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．７０ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．９０ｍＭ、０．９５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ、５．０ｍＭ、６．０ｍＭ、７．０ｍＭ、８．０ｍＭ、９．０ｍＭ、または１０．０ｍＭを含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞内のＡＴＰのレベルは、１種以上のＡＴＰ除去剤の添加によって低下される。ＡＴＰ除去剤とは、ＡＴＰ除去剤を含む培地で宿主細胞を培養した際に、宿主細胞内のＡＴＰのレベルを低下させることのできる化合物または分子である。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ除去剤は、電子輸送をＡＴＰ産生から脱共役させるものである。好ましい実施形態において、ＡＴＰ除去剤は弱有機酸である。弱有機酸の非限定的な具体例は、酢酸、プロピオン酸、ソルビン酸、および安息香酸である。宿主細胞は、ＡＴＰレベルを低下させるのに十分な量（濃度）の弱有機酸を含む培地で培養して、非分解生化合物の収率と生産性とを脱共役することができる。いくつかの実施形態において、弱有機酸の量は０．２５ｍＭ以上である。特定の実施形態において、宿主細胞培養培地は少なくとも０．２５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．４０ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．７０ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．９０ｍＭ、０．９５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ、５．０ｍＭ、６．０ｍＭ、７．０ｍＭ、８．０ｍＭ、９．０ｍＭ、または１０．０ｍＭを含む。
【0069】
ＭＥＶ経路
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細胞基質イソプレノイドの産生のための生合成経路で機能する１種以上の異種酵素をさらに含む。上昇したレベルの細胞基質イソプレノイドの産生は、宿主細胞の標的化遺伝子組み換えによって実施することができる。細胞基質イソプレノイドの産生または細胞基質アセチル－ＣｏＡおよびその前駆体の使用において機能する数々の酵素が知られており、宿主細胞内の細胞基質イソプレノイドレベルを変化させるために、これら酵素のいずれか１つを操作することができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細胞基質イソプレノイドの産生のための生合成経路で機能する１種以上の異種酵素をさらに含む。上昇したレベルの細胞基質イソプレノイドの産生は、宿主細胞の標的化遺伝子組み換えによって実施することができる。細胞基質イソプレノイドの産生または細胞基質アセチル－ＣｏＡおよびその前駆体の使用において機能する数々の酵素が知られており、宿主細胞内の細胞基質イソプレノイドレベルを変化させるために、これら酵素のいずれか１つを操作することができる。
【0070】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１種以上の異種酵素を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種メバロン酸キナーゼを含む。他の態様において、宿主細胞は異種ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種ＩＰＰイソメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種ポリプレニルシンターゼを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種ＦＰＰシンターゼを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種テルペンシンターゼを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は異種ファルネセンシンターゼを含む。
【0071】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、２分子のアセチル－補酵素Ａを縮合してアセトアセチル－ＣｏＡを形成することのできる酵素、例えば、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（NC_000913 REGION: 2324131.2325315; Escherichia coli）、（D49362; Paracoccus denitrificans）および（L20428; Saccharomyces cerevisiae）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0072】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡの別の分子と縮合して３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）とすることのできる酵素、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（NC_001145. complement 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae）、（X96617; Saccharomyces cerevisiae）、（X83882; Arabidopsis thaliana）、（AB037907; Kitasatospora griseola）、（BT007302; Homo sapiens）、および（NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換することのできる酵素、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（NM_206548; Drosophila melanogaster）、（NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus）、（NM_204485; Gallus gallus）、（AB015627; Streptomyces sp. KO 3988）、（AF542543; Nicotiana attenuata）、（AB037907; Kitasatospora griseola）、（AX128213, providing the sequence encoding a truncated HMGR; Saccharomyces cerevisiae）、および（NC_001145: complement (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae)）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換することのできる酵素、例えば、メバロン酸キナーゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（L77688; Arabidopsis thaliana）、および（X55875; Saccharomyces cerevisiae）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換することのできる酵素、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（AF429385; Hevea brasiliensis）、（NM_006556; Homo sapiens）、および（NC_001145. complement 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0076】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５－ピロリン酸をＩＰＰに変換することのできる酵素、例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（X97557; Saccharomyces cerevisiae）、（AF290095; Enterococcus faecium）、および（U49260; Homo sapiens）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0077】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換することのできる酵素およびメバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換することのできる酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６以上の酵素をコードする１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【0078】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｃ５イソプレノイドを産生する。これら化合物は１つのイソプレン単位から誘導され、ヘミテルペンとも呼ばれる。ヘミテルペンの具体例はイソプレンである。他の態様において、イソプレノイドはＣ１０イソプレノイドである。これら化合物は２つのイソプレン単位から誘導され、モノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの具体例はリモネン、シトラネロール、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョン、およびミルセンである。他の態様において、イソプレノイドはＣ１５イソプレノイドである。これら化合物は３つのイソプレン単位から誘導され、セスキテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの具体例は、ペリプラノンＢ、ギンコライドＢ、アモルファジエン、アルテミシニン、アルテミシ酸、バレンセン、ノーカトン、エピセドロール、エピアリストロケン、ファルネソール、ゴシポール、サノニン（ｓａｎｏｎｉｎ）、ペリプラノン（ｐｅｒｉｐｌａｎｏｎｅ）、フォースコリン、およびパチュロール（パチュリアルコールとしても知られている）である。他の態様において、イソプレノイドはＣ２０イソプレノイドである。これら化合物は４つのイソプレン単位から誘導され、ジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの具体例は、カスベン、エリュテロビン、パクリタキセル、プロストラチン、シュードプテロシン、およびタキサジエンである。さらに別の実施形態において、イソプレノイドはＣ２０＋イソプレノイドである。これら化合物は４超のイソプレン単位から誘導され、アルブルシド、ブルセアチン、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシン、およびスクアラン等のトリテルペン（６つのイソプレン単位から誘導されたＣ３０イソプレノイド化合物）、β－カロテン等のテトラテルペン（８つのイソプレン単位から誘導されたＣ４０イソプレノイド化合物）、およびポリイソプレン等のポリテルペン（８つ超のイソプレン単位から誘導されたＣ４０＋イソプレノイド化合物）が含まれる。いくつかの実施形態において、イソプレノイドは、アビタジエン、アモルファジエン、カレン、α－ファルネセン、β－ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β－ピネン、サビネン、γ－テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選ばれる。イソプレノイド化合物には、カロテノイド類（リコペン、α－およびβ－カロテン、α－およびβ－クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ならびにルテイン等）、ステロイド化合物、および混合テルペン－アルカロイドやコエンザイムＱ１０等の他の化学基で修飾されたイソプレノイドで構成された化合物も含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0079】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して産生されたＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換することのできる酵素、例えば、ＩＰＰイソメラーゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli）、および（AF082326; Haematococcus pluvialis）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５超の炭素を含むポリプレニル化合物を形成することのできるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。
【0081】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、１分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合して１分子のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）を形成することのできる酵素、例えば、ＧＰＰシンターゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（AF513111; Abies grandis）、（AF513112; Abies grandis）、（AF513113; Abies grandis）、（AY534686; Antirrhinum majus）、（AY534687; Antirrhinum majus）、（Y17376; Arabidopsis thaliana）、（AE016877, Locus AP11092; Bacillus cereus; ATCC 14579）、（AJ243739; Citrus sinensis）、（AY534745; Clarkia breweri）、（AY953508; Ips pini）、（DQ286930; Lycopersicon esculentum）、（AF182828; Mentha x piperita）、（AF182827; Mentha x piperita）、（MPI249453; Mentha x piperita）、（PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens）、（AY866498; Picrorhiza kurrooa）、（AY351862; Vitis vinifera）、および（AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0082】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、２分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合するか、１分子のＩＰＰを１分子のＧＰＰに付加して、１分子のファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）を形成することのできる酵素、例えば、ＦＰＰシンターゼ、をコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（ATU80605; Arabidopsis thaliana）、（ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana）、（AAU36376; Artemisia annua）、（AF461050; Bos taurus）、（D00694; Escherichia coli K－12）、（AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586）、（GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi）、（CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H）、（AF019892; Helianthus annuus）、（HUMFAPS; Homo sapiens）、（KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis）、（LAU15777; Lupinus albus）、（LAU20771; Lupinus albus）、（AF309508; Mus musculus）、（NCFPPSGEN; Neurospora crassa）、（PAFPS1; Parthenium argentatum）、（PAFPS2; Parthenium argentatum）、（RATFAPS; Rattus norvegicus）、（YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae）、（D89104; Schizosaccharomyces pombe）、（CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes）、（CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes）、（NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270）、（NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096）、（NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750）、（MZEFPS; Zea mays）、（AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5）、（NM_202836; Arabidopsis thaliana）、（D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis）、（U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110）、（BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus）、（NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP）、（L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20）、（J05262; Homo sapiens）、（YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K）、（NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1－130）、（AB003187; Micrococcus luteus）、（NC_002946, Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090）、（U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234）、（J05091; Saccharomyces cerevisae）、（CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS－3）、（AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6）、および（NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temecula1）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0083】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰとを結合してゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成することのできる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例には、（ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana）、（BT005328; Arabidopsis thaliana）、（NM_119845; Arabidopsis thaliana）、（NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sq1563）、（CRGGPPS; Catharanthus roseus）、（NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256）、（GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi）、（AY371321; Ginkgo biloba）、（AB055496; Hevea brasiliensis）、（AB017971; Homo sapiens）、（MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus）、（AB016044; Mus musculus）、（AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa）、（NCU20940; Neurospora crassa）、（NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551）、（AB118238; Rattus norvegicus）、（SCU31632; Saccharomyces cerevisiae）、（AB016095; Synechococcus elongates）、（SAGGPS; Sinapis alba）、（SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius）、（NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB）、（NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ES114）、（NM_112315; Arabidopsis thaliana）、（ERWCRTE; Pantoea agglomerans）、（D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis）、（X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus）、（AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides）、および（NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0084】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイド、または修飾イソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列さらに含む。
【0085】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはカレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AF461460, REGION 43.1926; Picea abies）および（AF527416, REGION: 78.1871; Salvia stenophylla）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0086】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはゲラニオールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AJ457070; Cinnamomum tenuipilum）、（AY362553; Ocimum basilicum）、（DQ234300; Perilla frutescens strain 1864）、（DQ234299; Perilla citriodora strain 1861）、（DQ234298; Perilla citriodora strain 4935）、および（DQ088667; Perilla citriodora）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0087】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはリナロールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AF497485; Arabidopsis thaliana）、（AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana）、（AY059757; Arabidopsis thaliana）、（NM_104793; Arabidopsis thaliana）、（AF154124; Artemisia annua）、（AF067603; Clarkia breweri）、（AF067602; Clarkia concinna）、（AF067601; Clarkia breweri）、（U58314; Clarkia breweri）、（AY840091; Lycopersicon esculentum）、（DQ263741; Lavandula angustifolia）、（AY083653; Mentha citrate）、（AY693647; Ocimum basilicum）、（XM_463918; Oryza sativa）、（AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa）、（XM_463918, Locus XP_463918; Oryza sativa）、（AY917193; Perilla citriodora）、（AF271259; Perilla frutescens）、（AY473623; Picea abies）、（DQ195274; Picea sitchensis）、および（AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar No. 79）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0088】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはリモネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（＋）－リモネンシンターゼ（AF514287, REGION: 47.1867; Citrus limon）および（AY055214, REGION: 48.1889; Agastache rugosa）および（－）－リモネンシンターゼ（DQ195275, REGION: 1.1905; Picea sitchensis）、（AF006193, REGION: 73.1986; Abies grandis）、および（MHC4SLSP, REGION: 29.1828; Mentha spicata）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0089】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはミルセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（U87908; Abies grandis）、（AY195609; Antirrhinum majus）、（AY195608; Antirrhinum majus）、（NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10）、（NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS－CIN）、（NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS－CIN）、（AF271259; Perilla frutescens）、（AY473626; Picea abies）、（AF369919; Picea abies）、および（AJ304839; Quercus ilex）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0090】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはオシメンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AY195607; Antirrhinum majus）、（AY195609; Antirrhinum majus）、（AY195608; Antirrhinum majus）、（AK221024; Arabidopsis thaliana）、（NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS－CIN）、（NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS－CIN）、（NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03）、（NM_001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03）、（NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10）、（AB110642; Citrus unshiu CitMTSL4）、および（AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0091】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはα－ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（＋）α－ピネンシンターゼ（AF543530, REGION: 1.1887; Pinus taeda）、（－）α－ピネンシンターゼ（AF543527, REGION: 32.1921; Pinus taeda）、および（＋）／（－）α－ピネンシンターゼ（AGU87909, REGION: 6111892; Abies grandis）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0092】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはβ－ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（－）β－ピネンシンターゼ（AF276072, REGION: 1.1749; Artemisia annua）および（AF514288, REGION: 26.1834; Citrus limon）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0093】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはサビネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AF051901, REGION: 26.1798 from Salvia officinalis）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【0094】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはγ－テルピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AF514286, REGION: 30.1832 from Citrus limon）および（AB110640, REGION 1.1803 from Citrus unshiu）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0095】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはテルピノレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（AY693650 from Oscimum basilicum）および（AY906866, REGION: 10.1887 from Pseudotsuga menziesii）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0096】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはアモルファジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号明細書の配列番号３７のヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0097】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはα－ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Pyrus communis cultivar d’AnjouのＤＱ３０９０３４（洋ナシ、遺伝子名ＡＦＳ１）およびMalus domesticaのＡＹ１８２２４１（リンゴ、遺伝子ＡＦＳ１）、Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0098】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはβ－ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Mentha x piperita（ペパーミント、遺伝子Ｔｓｐａ１１）のＧｅｎＢａｎｋ識別番号ＡＦ０２４６１５、およびPicaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005)のArtemisia annuaのＡＹ８３５３９８が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0099】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Zea maysのＧｅｎＢａｎｋ識別番号ＡＦ５２９２６６、およびSong, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006)のSaccharomyces cerevisiae（遺伝子Ｐｈｏ８）のＹＤＲ４８１Ｃが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0100】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはネロリドールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Zea mays（トウモロコシ、遺伝子ｔｐｓ１）のヌクレオチド配列ＡＦ５２９２６６が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0101】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはパチュリロールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Pogostemon cablinのAY508730 REGION: 1.1659が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0102】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはノートカトンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には、Citrus sinensisのAF441124 REGION: 1.1647およびPerilla frutescensのAY917195 REGION: 1.1653が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0103】
いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチドはアビタジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の具体例には（Ｕ５０７６８、Abies grandis）および（ＡＹ４７３６２１、Picea abies）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0104】
イソプレノイドの製造方法
遺伝子改変宿主細胞がＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列を含むいくつかの実施形態において、当該遺伝子改変宿主細胞は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列を含まないが、それ以外は遺伝的に同一な宿主細胞と比べて、より多量のイソプレノイド化合物を産生する。いくつかの実施形態において、より多量とは、測定値を、例えば、１リットルの細胞培養物当たりのグラム、１グラムの乾燥細胞重量当たりのミリグラム、細胞培養物１単位容量当たり、乾燥細胞重量１単位当たり、単位時間当たりの細胞培養物１単位容量当たり、または単位時間当たりの乾燥細胞重量１単位当たりで表したときに、少なくとも１０％である。
遺伝子改変宿主細胞がＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列を含むいくつかの実施形態において、当該遺伝子改変宿主細胞は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列を含まないが、それ以外は遺伝的に同一な宿主細胞と比べて、より多量のイソプレノイド化合物を産生する。いくつかの実施形態において、より多量とは、測定値を、例えば、１リットルの細胞培養物当たりのグラム、１グラムの乾燥細胞重量当たりのミリグラム、細胞培養物１単位容量当たり、乾燥細胞重量１単位当たり、単位時間当たりの細胞培養物１単位容量当たり、または単位時間当たりの乾燥細胞重量１単位当たりで表したときに、少なくとも１０％である。
【0105】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞がＡＤＡをコードする異種ヌクレオチド配列と、ＡＤＡおよびＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列の両方を含むとき、遺伝子改変宿主細胞は、下記と比べて、より多量のイソプレノイド化合物を産生する：（ｉ）ＡＤＡをコードする異種ヌクレオチド配列を含まないが、それ以外は遺伝的に同一な宿主細胞、（ｉｉ）ＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種ヌクレオチド配列を含まないが、それ以外は遺伝的に同一な宿主細胞、または（ｉｉｉ）ＡＤＡをコードする異種ヌクレオチド配列またはＮＡＤＨ使用ＨＭＧＲをコードする異種配列を含まないが、それ以外は遺伝的に同一な宿主細胞。いくつかの実施形態において、より多量とは、測定値を、例えば、１リットルの細胞培養物当たりのグラム、１グラムの乾燥細胞重量当たりのミリグラム、細胞培養物１単位容量当たり、乾燥細胞重量１単位当たり、単位時間当たりの細胞培養物１単位容量当たり、または単位時間当たりの乾燥細胞重量１単位当たりで表したときに、少なくとも１０％である。
【0106】
当該方法は、通常、宿主細胞を、炭素源を含む適切な培地中、適切な条件下で成長させることを含む。微生物を成長させるための適切な条件および適切な培地は当業界で知られている。いくつかの実施形態において、炭素源は単糖（単純な糖）、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはこれらの１種以上の組み合わせである。適切な単糖の非限定的な例には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な二糖の非限定的な例には、ショ糖、乳糖、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な多糖の非限定的な例には、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な非発酵性炭素源の非限定的な例には、酢酸およびグリセロールが含まれる。いくつかの実施形態において、適切な培地には１種以上の追加の薬剤、例えば、誘導性化合物（例：遺伝子産物をコードする１種以上のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にあるとき）、抑制化合物（例：遺伝子産物をコードする１種以上のヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの制御下にあるとき）、または選択剤（例：遺伝子改変を含む微生物を選択するための抗生物質）が添加されている。
【実施例】
【0107】
実施例１： 収率は細胞比速度の関数である
１２５ｍｌのフラスコ中の、２％のショ糖、１％のマルトース、２ｇ／ＬのリシンＬＧＭを含む１５ｍｌの５０ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．０、に単一コロニーを接種し、２８℃、２００ｒ．ｐ．ｍ．の振盪下、ＯＤ６００が４～９で、残存グルコースが３～６ｇ／ｌになるまで培養した。濃度が２０％になるように５０％のグリセロールを培養物に添加し、次に、細胞懸濁液の１ｍｌのバイアルを－８０℃で保存した。１～２バイアルの細胞を融解し、３ｇ／ｌの酵母エキス、７ｇ／ｌのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）、４％のショ糖、２％のマルトース、２ｇ／Ｌのリシン、およびトレース量の金属とビタミン溶液を含む培地で２４時間培養し、同じ培地でＯＤ６００が０．１になるまで２４時間継代培養した。１５ｇ／ｌのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、２０ｇ／ｌの糖蜜由来の完全還元糖（ＴＲＳ）（ウエストパームビーチ、Ｆｌｏｒｉｄａ Ｃｒｙｓｔａｌｓ社）、およびトレース量の金属とビタミン溶液を含む２２５ｍｌの発酵培地の入った０．５リットルの発酵器（ドイツ国、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に接種するために、２５ｍｌの培養物を使用した。発酵器は温度３０～３４℃で循環し、ｐＨはＮＨ４ＯＨの添加で５．０に維持した。初期のバッチ相においては、発酵器を０．５容量／容量／分（ＶＶＭ）で通気し、３０％の溶存酸素量を維持するために撹拌に勾配を付けた。初期の糖が消費されたら、溶存酸素の上昇を引き金として、フロリダ社製糖蜜（Ｆｌｏｒｉｄａ ｃａｎｅ ｓｙｒｕｐ）（リットル当たり約８００ｇのグルコース等量、（完全還元糖（ＴＲＳ）とも知られる））を、リットル当たり１０ｇのＴＲＳの用量によるパルスで、１０ｇのＴＲＳ／リットル／ｈｒを供給した。パルスの間には、供給速度を１～５ｇのＴＲＳ／リットル／ｈｒに低下させた。残存炭素の枯渇を示す溶存酸素のスパイクが生じたときに高供給速度を再開し、決められた量の糖が添加された後に高供給速度を終了した。細胞密度が上昇するにつれ、溶存酸素は０％に達するようにし、パルス用量を５０ｇのＴＲＳ／リットルに増やした。容量が増えるにつれて攪拌を調節することで、酸素移動速度を特定の速度に維持した。これ以降、高供給速度と低供給速度の間で変化させるアルゴリズム（供給速度アルゴリズム）を用いて、要求を満たすように供給速度を動的に調節した。低供給速度の際は、細胞は糖と高供給速度の際に蓄積した任意の余剰代謝産物とを消費した。そして溶存酸素の上昇は、高供給速度の再開の引き金となる。低供給速度に費やした時間の長さは、以前の高供給速度パルスによって細胞が栄養不良または栄養過剰であった程度を反映し、この情報をモニタリングして、高供給速度の上昇または低下の調節に使用し、低供給速度を既定範囲内に維持する。この期間にわたり、供給速度は細胞の糖要求と合致した。供給速度アルゴリズムは、ファルネセン、バイオマス、およびＣＯ２以外の発酵産物の最小総蓄積を確実にする。プロセスは８～１３日間継続した。発酵槽は充填と抜き取りを経る。蓄積した培地を毎日抜き取り、バイオマスおよびファルネセンの濃度を分析した。濃度を一定に維持するために、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の濃縮溶液、トレース量の金属とビタミン類を定期的に添加した。
１２５ｍｌのフラスコ中の、２％のショ糖、１％のマルトース、２ｇ／ＬのリシンＬＧＭを含む１５ｍｌの５０ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．０、に単一コロニーを接種し、２８℃、２００ｒ．ｐ．ｍ．の振盪下、ＯＤ６００が４～９で、残存グルコースが３～６ｇ／ｌになるまで培養した。濃度が２０％になるように５０％のグリセロールを培養物に添加し、次に、細胞懸濁液の１ｍｌのバイアルを－８０℃で保存した。１～２バイアルの細胞を融解し、３ｇ／ｌの酵母エキス、７ｇ／ｌのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）、４％のショ糖、２％のマルトース、２ｇ／Ｌのリシン、およびトレース量の金属とビタミン溶液を含む培地で２４時間培養し、同じ培地でＯＤ６００が０．１になるまで２４時間継代培養した。１５ｇ／ｌのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、２０ｇ／ｌの糖蜜由来の完全還元糖（ＴＲＳ）（ウエストパームビーチ、Ｆｌｏｒｉｄａ Ｃｒｙｓｔａｌｓ社）、およびトレース量の金属とビタミン溶液を含む２２５ｍｌの発酵培地の入った０．５リットルの発酵器（ドイツ国、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に接種するために、２５ｍｌの培養物を使用した。発酵器は温度３０～３４℃で循環し、ｐＨはＮＨ４ＯＨの添加で５．０に維持した。初期のバッチ相においては、発酵器を０．５容量／容量／分（ＶＶＭ）で通気し、３０％の溶存酸素量を維持するために撹拌に勾配を付けた。初期の糖が消費されたら、溶存酸素の上昇を引き金として、フロリダ社製糖蜜（Ｆｌｏｒｉｄａ ｃａｎｅ ｓｙｒｕｐ）（リットル当たり約８００ｇのグルコース等量、（完全還元糖（ＴＲＳ）とも知られる））を、リットル当たり１０ｇのＴＲＳの用量によるパルスで、１０ｇのＴＲＳ／リットル／ｈｒを供給した。パルスの間には、供給速度を１～５ｇのＴＲＳ／リットル／ｈｒに低下させた。残存炭素の枯渇を示す溶存酸素のスパイクが生じたときに高供給速度を再開し、決められた量の糖が添加された後に高供給速度を終了した。細胞密度が上昇するにつれ、溶存酸素は０％に達するようにし、パルス用量を５０ｇのＴＲＳ／リットルに増やした。容量が増えるにつれて攪拌を調節することで、酸素移動速度を特定の速度に維持した。これ以降、高供給速度と低供給速度の間で変化させるアルゴリズム（供給速度アルゴリズム）を用いて、要求を満たすように供給速度を動的に調節した。低供給速度の際は、細胞は糖と高供給速度の際に蓄積した任意の余剰代謝産物とを消費した。そして溶存酸素の上昇は、高供給速度の再開の引き金となる。低供給速度に費やした時間の長さは、以前の高供給速度パルスによって細胞が栄養不良または栄養過剰であった程度を反映し、この情報をモニタリングして、高供給速度の上昇または低下の調節に使用し、低供給速度を既定範囲内に維持する。この期間にわたり、供給速度は細胞の糖要求と合致した。供給速度アルゴリズムは、ファルネセン、バイオマス、およびＣＯ２以外の発酵産物の最小総蓄積を確実にする。プロセスは８～１３日間継続した。発酵槽は充填と抜き取りを経る。蓄積した培地を毎日抜き取り、バイオマスおよびファルネセンの濃度を分析した。濃度を一定に維持するために、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の濃縮溶液、トレース量の金属とビタミン類を定期的に添加した。
【0108】
酸素送達は典型的には１００～１２０ｍＭｏｌ／Ｌ／ｈｒであり、これは酸素移動速度またはＯＴＲとも呼ばれる。発酵中の異なる酸素移動速度（２０、１１０、１８０、２２５）は、変化する撹拌速度、気流および供給速度の組み合わせにより達成された。一旦、製造相でピーク・バイオマス・レベルが達成されたら（グラムの乾燥細胞重量またはｇＤＣＷ）、細胞は微好気条件を経験し、溶存酸素（ｄＯ２）はゼロに近い、言い換えれば、そこでは酸素取り込み速度（ＯＵＲ）は酸素移動速度（ＯＴＲ）に等しい。
【0109】
発酵収率： ファルネセン収率（Ｙｓｐ）は、産生されたファルネセンの重量／重量の量を発酵器に添加した総還元糖の量（ＴＲＳ、またはグルコース等量）で除した値として計算される。産生されたファルネセンのグラム数を添加した総還元糖量で除した値をパーセンテージで表したものを、単純に「収率」とも呼ぶ。ｇＤＷまたはｇＤＣＷは、は発酵器内の細胞性バイオマスまた細胞量の測定値である、乾燥重量のグラム数として参照される。
【0110】
比酸素取り込み速度（ｑＯ２）は、発酵器内のバイオマスによる酸素消費の比速度を、ｍＭｏｌ／Ｏ２／ｇＤＣＷ／ｈで表したものである。比酸素使用速度（ｓＯＵＲ）としても知られる。
【0111】
比糖取り込み速度（ｑＳ）は、発酵器内のバイオマスによる糖消費の比速度を、ｍＭｏｌ／ＴＲＳ／ｇＤＣＷ／ｈで表したものである。
【0112】
ファルネセンは過去に報告された方法（Sandoval, C. M. et al. (2014) Metab Eng vol. 25, pp. 215-226）で定量した。
【0113】
いかなるバイオマニュファクチャリング工程においても、収率と生産性は、２つの主たる原価差要因である。非分解生化合物のバイオマニュファクチャリングにおいて、生産の細胞比速度（ｑＰ、モル産物／グラム乾燥細胞重量／ｈｒを単位とする）および収率（ＹＰ／Ｓ、産物形成の速度／糖消費の速度）は、比成長速度（１／時間）または（時間－１）、ｑＳ（モル糖消費／グラム乾燥細胞重量／ｈｒ）またはｑＯ２（モルＯ２消費／グラム乾燥重量／ｈｒ）といった他の細胞速度の作用によることが多い。最小の製造費で生産性と収率の最適な組み合わせを達成する発酵プロセスの設計には、この関係性の詳細な特徴付けが必要である。
【0114】
イソプレノイドの産生において収率（ＹＰ／Ｓ）は、酸素および糖の取り込みの細胞比速度、転じて容積生産性、と常に逆相関する。言い換えれば、本細胞による酸素および糖の取り込みが速いほど、イソプレノイド収率は低下する。このような関係性を「速度－収率共役」と称する。図１から図３は、異なる酸素移動速度（バイオリアクターに酸素が送達され、細胞により取り込まれる速度）下で増殖された単一ファルネセン産生株のこの現象を示す。細胞の比糖取り込み、酸素取り込み、および生産性が増加するほど、収率は減少する。図４は、供給速度アルゴリズムを使用すると、糖取り込み速度は酸素取り込み速度に直接比例することを示す。
【0115】
図３の示す収率と生産性との逆相関は、生産性と収率が非分解生化合物の産生における２つのカギとなる原価差要因であるため、非分解生化合物、例えば、イソプレノイドであるファルネセン、の工業的生産にとって問題である。速度－収率共役が存在すると、細胞への酸素移動速度および／または糖の移動速度を増加させて容積生産性を増加させるいかなる試みも、同時に収率低下を伴い、生産性向上の費用効果が相殺される。速度－収率共役を除くことができれば、高収率と高生産性を同時に達成することも可能になる。
【0116】
実施例２： 計算論的モデリングおよびメタボロミクス測定は、ＡＴＰが速度と収率の共役を駆動し得ることを示唆する
速度－収率共役の可能性のある機械論的原因を評価するために、単一株の低ＯＴＲ（３０ミリモルのＯ２／Ｌ／ｈｒ）または高ＯＴＲ（１８０ミリモルのＯ２／Ｌ／ｈｒ）のいずれかにおける発酵サンプルについて、解糖系、ＴＣＡ回路、ペントースリン酸経路、およびイソプレノイド経路の中心代謝産物の絶対濃度を解析した。バイオリアクターからのサンプリングは、代謝状態を捕捉するために、タンクから取り出したサンプルを直ちに冷却するラピッド・サンプリングプロトコルを用いて実施した。中心代謝産物の大部分について低および高ＯＴＲ条件で同様の絶対濃度が測定されたが、２種の代謝産物（イソクエン酸およびアルファ－ケトグルタレート）は非常に異なる濃度である点が突出していた（図５参照）。興味深いことに、これら２種の代謝産物はＴＣＡ回路の連続した工程を表している、即ち、酵素であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性によって、イソクエン酸はアルファ－ケトグルタレートに変換することができる。低ＯＴＲ条件と比べて高ＯＴＲ条件においては、イソクエン酸濃度は低下し、アルファ－ケトグルタレート濃度は上昇することを観察し、他の工程と比べて、この工程を通じてフラックス速度は高ＯＴＲ条件で上昇することをこれは示唆していた。
速度－収率共役の可能性のある機械論的原因を評価するために、単一株の低ＯＴＲ（３０ミリモルのＯ２／Ｌ／ｈｒ）または高ＯＴＲ（１８０ミリモルのＯ２／Ｌ／ｈｒ）のいずれかにおける発酵サンプルについて、解糖系、ＴＣＡ回路、ペントースリン酸経路、およびイソプレノイド経路の中心代謝産物の絶対濃度を解析した。バイオリアクターからのサンプリングは、代謝状態を捕捉するために、タンクから取り出したサンプルを直ちに冷却するラピッド・サンプリングプロトコルを用いて実施した。中心代謝産物の大部分について低および高ＯＴＲ条件で同様の絶対濃度が測定されたが、２種の代謝産物（イソクエン酸およびアルファ－ケトグルタレート）は非常に異なる濃度である点が突出していた（図５参照）。興味深いことに、これら２種の代謝産物はＴＣＡ回路の連続した工程を表している、即ち、酵素であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性によって、イソクエン酸はアルファ－ケトグルタレートに変換することができる。低ＯＴＲ条件と比べて高ＯＴＲ条件においては、イソクエン酸濃度は低下し、アルファ－ケトグルタレート濃度は上昇することを観察し、他の工程と比べて、この工程を通じてフラックス速度は高ＯＴＲ条件で上昇することをこれは示唆していた。
【0117】
分解経路で産生された過剰なＡＴＰは、バイオプロセスの速度および収率にとって有害であると、以前は確立されていた。これは、速度については上昇したＡＴＰ濃度が解糖系阻害的であるためである。しかし、過剰なＡＴＰはバイオマス形成を駆動することもでき、次にバイオマスは産物収率を低下させる炭素の吸収源として機能するため、過剰なＡＴＰはバイオプロセスの収率を低下させることもできる。この反応の概ねの化学量論では、形成される１モルのバイオマスについて、１．５モルの過剰ＡＴＰが排除または除去される。
【0118】
高ＯＴＲでのＴＣＡ回路内のより高いフラックスがより低いファルネセン収率の原因となり得るかを決定するために、総括的ゲノムスケール代謝モデルに基づく、ＡＴＰ形成の影響を評価するための新規な計算論的モデリング・フレームワーク（図６参照）を開発した。典型的なゲノムスケールモデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで発生し得る無益反応を通じて過剰なＡＴＰを加水分解または「浪費」することを可能にするが、我々の新規モデルは、一般に経験的に観察されるように、少量のＡＴＰが非成長関連維持（またはＮＧＡＭ、０．４ミリモルのｇＤＷ－１ｈ－１と推定）に配分され、残りはバイオマス形成と厳密に共役されるように組み立てられた。無益回路は許可されず、１．５モルのＡＴＰが１モルのバイオマス形成に必要であると推定した。
【0119】
このモデルを使用して、イソプレノイドに対するトリカルボン酸回路（ＴＣＡ）フラックスの推定される影響をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検討した。我々のモデリングは、ＴＣＡ回路のフラックスの２０から１８０ ＯＴＲへの増加が、観察された速度－収率共役効果を実際に担うことができることを示した。言い換えれば、ＴＣＡ回路によってより速い速度で産生されるＡＴＰは、１モルのバイオマス当たり１．５モルのＡＴＰがバイオマス中に「吸収された（ｓｕｎｋ）」（約５．６６７モルのＡＴＰ／ＴＣＡ回路に入る１モルのＰＹＲという控えめな見積もりを想定）と推定すると、速度－収率共役効果を説明することができる。
【0120】
この結論に至るための上記でプロットした関連シミュレーションの特性は以下のとおりである。
・ １８０ ＯＴＲのときのＰＴＡを通る比率ｑＳの１３Ｃ解析によって計算した９５％信頼区間（またはＣＩ）を外れたシミュレーションは排除した（＊ＯＴＲによって大きくは変化しないと推定した）。
・ ＴＣＡ回路の活性は入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）ｑＳに対して２５％以下である。１８０ ＯＴＲのときの入ってくるｑＳに対する比率としてのＴＣＡ回路フラックスの我々の最適概算値は約１２％（ｑＳが約１．４の近傍）である。
・ １８０ ＯＴＲのときのＰＴＡを通る比率ｑＳの１３Ｃ解析によって計算した９５％信頼区間（またはＣＩ）を外れたシミュレーションは排除した（＊ＯＴＲによって大きくは変化しないと推定した）。
・ ＴＣＡ回路の活性は入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）ｑＳに対して２５％以下である。１８０ ＯＴＲのときの入ってくるｑＳに対する比率としてのＴＣＡ回路フラックスの我々の最適概算値は約１２％（ｑＳが約１．４の近傍）である。
【0121】
実施例２の材料と方法
代謝産物濃度のラピッド・サンプリングおよび絶対値の定量
定義：１３Ｃ ＩＤＭＳは炭素１３アイソトープ質量分析を意味し、ＭＳＴＦＡはＮ－トリメチルシリル－Ｎ－メチルトリフルオロアセタミドを意味し、ＭＲＭモードは複数反応モニタリングモードを意味する。
代謝産物濃度のラピッド・サンプリングおよび絶対値の定量
定義：１３Ｃ ＩＤＭＳは炭素１３アイソトープ質量分析を意味し、ＭＳＴＦＡはＮ－トリメチルシリル－Ｎ－メチルトリフルオロアセタミドを意味し、ＭＲＭモードは複数反応モニタリングモードを意味する。
【0122】
イソクエン酸およびα－ケトグルタレートの細胞内絶対濃度は、Canelas and Wahlが初めに記載した方法に従って得た。簡単に説明すると、特注のラピッド・サンプリング用のデバイスを用いてタンク中の培養液を－８０℃のメタノールにサンプリングし、ボルテックスに付し、重さを計測した。バイオマスを高速濾過装置に注ぎ１００％の－８０℃のメタノールで洗浄した。濾液を、３０ｍＬの７５％（ｖ／ｖ）のエタノールおよび２００μＬの「１３Ｃ ＩＤＭＳ」内部標準抽出物の入った５０ｍＬの遠心管に加えた。混合物を９５℃で３分間煮沸し、ドライアイス上に戻した。抽出物の入ったチューブはＣｅｎｔｒｉＶａｐ内で乾燥するまで蒸発させ、６００μＬの水に再懸濁した。「ＭＳＴＦＡ」の誘導および解析の前に、水をろ過し、凍結乾燥によって再び乾燥させた。
【0123】
イソクエン酸およびα－ケトグルタレートの細胞内絶対定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ７０００三段四重極ＧＣ／ＭＳの「ＭＲＭモード」で、サンプル抽出物のシグナル比を真正の標準（Ｓｉｇｍａ）と比較することで達成した。絶対濃度は、（抽出時に計量した）乾燥細胞重量に対して正規化した。
【0124】
モデリング：
酵母の代謝を示すゲノムスケールモデルは標準的手法に従って作製した。公知の再構成ｉＴＯ９７７の全ての反応を開始モデルに取り込んだ。さらに、下記の６反応を含む「第二世代」のファルネセン経路も加えた。
＊ 代替ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（またはＮＡＤＨ ＨＭＧＲ）
・ ‘s_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coa_c + 2.0 nadh_c <=> 2.0 nad_c + r_mevalonate_c + coenzyme_a_c’
＊ アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（またはＡＤＡ）
‘nad_c + coenzyme_a_c + acetaldehyde_c --> acetyl_coa_c + nadh_c’
＊ Ｆ６Ｐに対して作用するホスホケトラーゼ（またはＰＫ－ｆ６ｐ）
・ ‘phosphate_c + beta_d_fructofuranose_6_phosphate_c --> h2o_c + acetyl_phosphate_c + d_erythrose_4_phosphate_c’
＊ Ｘ５Ｐに対して作用するホスホケトラーゼ（またはＰＫ－ｘ５ｐ）
・ ‘phosphate_c + d_xylulose_5_phosphate_c --> h2o_c + acetyl_phosphate_c + d_glyceraldehyde_3_phosphate_c’
＊ ホスホトランスアセチラーゼ（またはＰＴＡ）
・ ‘coenzyme_a_c + acetyl_phosphate_c <=> phosphate_c + acetyl_coa_c’
＊ ファルネセンシンターゼ（またはＦＳ）
・ ‘_2_trans6_trans_farnesyl_diphosphate_c --> diphosphate_c + beta_farnesene_c’
酵母の代謝を示すゲノムスケールモデルは標準的手法に従って作製した。公知の再構成ｉＴＯ９７７の全ての反応を開始モデルに取り込んだ。さらに、下記の６反応を含む「第二世代」のファルネセン経路も加えた。
＊ 代替ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（またはＮＡＤＨ ＨＭＧＲ）
・ ‘s_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coa_c + 2.0 nadh_c <=> 2.0 nad_c + r_mevalonate_c + coenzyme_a_c’
＊ アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（またはＡＤＡ）
‘nad_c + coenzyme_a_c + acetaldehyde_c --> acetyl_coa_c + nadh_c’
＊ Ｆ６Ｐに対して作用するホスホケトラーゼ（またはＰＫ－ｆ６ｐ）
・ ‘phosphate_c + beta_d_fructofuranose_6_phosphate_c --> h2o_c + acetyl_phosphate_c + d_erythrose_4_phosphate_c’
＊ Ｘ５Ｐに対して作用するホスホケトラーゼ（またはＰＫ－ｘ５ｐ）
・ ‘phosphate_c + d_xylulose_5_phosphate_c --> h2o_c + acetyl_phosphate_c + d_glyceraldehyde_3_phosphate_c’
＊ ホスホトランスアセチラーゼ（またはＰＴＡ）
・ ‘coenzyme_a_c + acetyl_phosphate_c <=> phosphate_c + acetyl_coa_c’
＊ ファルネセンシンターゼ（またはＦＳ）
・ ‘_2_trans6_trans_farnesyl_diphosphate_c --> diphosphate_c + beta_farnesene_c’
【0125】
モデルは、最大理論収率が約２９．５％（ｇのファルネセン／ｇの糖）のファルネセンを産生することを立証した。プロセス中に、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの未制御の自由なサイクル化を防止するために、以下の反応を不活化した。
＊ nadp_specific_glutamate_dehydrogenase_1
＊ methylenetetrahydrofolate_dehydrogenase_nad_
＊ nadp_specific_glutamate_dehydrogenase_1
＊ methylenetetrahydrofolate_dehydrogenase_nad_
【0126】
ＡＴＰからＡＤＰへの加水分解を単純に表す「atp_drain_flux_for_constant_maintanence_requirements」と命名された反応を加え、０．４ミリモル ｇＤＷ－１ｈ－１の一定値に限定した。
【0127】
ｃｏｂｒａｐｙモジュール・バージョン０．３．２．のモデル・オブジェクトと共に働くようにＰｙｔｈｏｎによって書かれたカスタム関数を適応することで、デフォルトの環境条件をセットした。成長培地は「glucose_aerobic_minimal」にセットし、これは機能的には、１ミリモルのｇＤＷ－１ｈ－１の速度のグルコース取り込みおよび無制限のｏ２、ｎｈ３、リン酸、硫酸およびｈ２ｏの取り込みを可能にした。
【0128】
次に、ＣＯＲＥファルネセン生合成経路として参照される一組の反応を定義した。これら反応は以下を含む。
‘acetyl_coa_acetyltransferase’、‘glucokinase_glk1’、‘inorganic_pyrophosphatase’、‘dimethylallyltranstransferase’、‘atp_drain_flux_for_constant_maintanence_requirements、geranyltranstransferase’、‘phosphomevalonate_kinase’、‘hydroxymethylglutaryl_coa_synthase’、‘isopentenyl_diphosphate_delta_isomerase’、‘diphosphomevalonate_decarboxylase’、‘galactose_transporter’、‘farnesene_synthase’、‘exchange_of_betafarnesene_c’、‘exchange_of_phosphate_e’、‘exchange_of_alphadglucose_e’、‘exchange_of_h2o_e’; ‘glucose_6_phosphate_isomerase、phosphofructokinase_1’、‘fructose_bisphosphate_aldolase’、‘triosephosphate_isomerase’、‘enolase_1’、‘transport_of_h2o_extracellular’、‘phosphoglycerate_kinase’、‘phosphoglycerate_mutase_1_1’、‘pyruvate_kinase_1’、‘pyruvate_decarboxylase_isozyme_1’、‘acetaldehyde_dehydrogenase_acetylating_’、‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1’、‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1_NADH’、‘mevalonate_kinase’、‘exchange_of_co2_e’、‘phosphoketolase_f6p’、‘phosphoketolase_x5p’、‘phosphotransacetylase’、‘transaldolase’、‘transketolase_1’、‘glucose_6_phosphate_1_dehydrogenase’、‘probable_6_phosphogluconolactonase_1’、‘_6_phosphogluconate_dehydrogenase_decarboxylating_1’、‘transketolase_1_1’、‘ribose_5_phosphate_isomerase’、‘ribulose_phosphate_3_epimerase’、‘transport_of_carbon_dioxide_extracellular’、および‘glyceraldehyde_3_phosphate_dehydrogenase_1’。
‘acetyl_coa_acetyltransferase’、‘glucokinase_glk1’、‘inorganic_pyrophosphatase’、‘dimethylallyltranstransferase’、‘atp_drain_flux_for_constant_maintanence_requirements、geranyltranstransferase’、‘phosphomevalonate_kinase’、‘hydroxymethylglutaryl_coa_synthase’、‘isopentenyl_diphosphate_delta_isomerase’、‘diphosphomevalonate_decarboxylase’、‘galactose_transporter’、‘farnesene_synthase’、‘exchange_of_betafarnesene_c’、‘exchange_of_phosphate_e’、‘exchange_of_alphadglucose_e’、‘exchange_of_h2o_e’; ‘glucose_6_phosphate_isomerase、phosphofructokinase_1’、‘fructose_bisphosphate_aldolase’、‘triosephosphate_isomerase’、‘enolase_1’、‘transport_of_h2o_extracellular’、‘phosphoglycerate_kinase’、‘phosphoglycerate_mutase_1_1’、‘pyruvate_kinase_1’、‘pyruvate_decarboxylase_isozyme_1’、‘acetaldehyde_dehydrogenase_acetylating_’、‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1’、‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1_NADH’、‘mevalonate_kinase’、‘exchange_of_co2_e’、‘phosphoketolase_f6p’、‘phosphoketolase_x5p’、‘phosphotransacetylase’、‘transaldolase’、‘transketolase_1’、‘glucose_6_phosphate_1_dehydrogenase’、‘probable_6_phosphogluconolactonase_1’、‘_6_phosphogluconate_dehydrogenase_decarboxylating_1’、‘transketolase_1_1’、‘ribose_5_phosphate_isomerase’、‘ribulose_phosphate_3_epimerase’、‘transport_of_carbon_dioxide_extracellular’、および‘glyceraldehyde_3_phosphate_dehydrogenase_1’。
【0129】
代替ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（またはＮＡＤＨ ＨＭＧＲ）を表す次の反応は、０フラックスに限定された。これは、フラックスの大部分が、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＨを使用するネイティブなＳｃ．ＨＭＧＲによって実施されると証拠が示しているためである。
‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1_NADH’
‘_3_hydroxy_3_methylglutaryl_coenzyme_a_reductase_1_NADH’
【0130】
これらコア反応以外でフラックスが発生することは許可しなかった。
【0131】
コア反応以外でフラックスが発生することは許可されないため、過剰なＮＡＤＨはシミュレーションを実行不能にする。そこで、産生された余分なＮＡＤＨがＡＴＰに変換される以下の反応（推定化学量論は１：１）を加えた。
NADH + PI + ADP → NAD+ ATP + H2O
NADH + PI + ADP → NAD+ ATP + H2O
【0132】
さらに、上位ファルネセン産生反応内に存在する異種酵素であるため、ｕｄｈＡ反応であるNADPH + NAD <=> NADP + NADHによって、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの制御された自由なサイクリングを許可した。これは、過剰なＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換し、次にすでに説明した反応を用いてＡＴＰに変換できることを意味する。
【0133】
ＴＣＡ回路へのピルビン酸の損失をシミュレーションする次の反応も導入した。
‘PYR_leak_to_TCA’:
PYR + 5.6667 ADP + 5.6667 Pi = 3 CO2 + 5.6667 ATP + 5.6667 H2O
‘PYR_leak_to_TCA’:
PYR + 5.6667 ADP + 5.6667 Pi = 3 CO2 + 5.6667 ATP + 5.6667 H2O
【0134】
最後に、「ＣＵＳＴＯＭ＿ＮＧＡＭ」反応と呼ばれる、ＡＴＰを加水分解するさらに別の下記反応も加えた。
ATP + H2O → Pi + ADP
ATP + H2O → Pi + ADP
【0135】
一度この制限されたモデルが完全に構成されたら、同じ酵母ゲノムスケール代謝モデルの別の（ＡＮＯＴＨＥＲ）コピーに隣接させたが、このコピーでは、１つの臨界的な例外を除き全ての反応に制限がない。重要な点は、ＣＵＳＴＯＭ＿ＮＧＡＭ反応を通じたフラックスが、第１のモデルの（ＡＴＰ、およびその物質のためにＡＴＰに変換されたＮＡＤＨの唯一可能な排出が）第２の（全体的に制限なしの）モデルにおけるバイオマス形成反応と厳密に共役されていたことである。（第２のモデルの）デフォルトのバイオマス反応は、「バイオマス＿１０６０＿バイオマス」に設定された。この反応中のフラックスはｍｕまたは成長速度として報告された、その単位は１／ｈであった。モデルがどのように組み立てられ相互作用するかを可視化した画像については、図６を参照。両方のモデルが１ミリモル ｇＤＷ－１ｈ－１の割り当てた最大グルコース取り込みを分けあう（ＳＨＡＲＥ）ため、第１のモデルによって産生された過剰なエネルギーが存在した場合、それを成長（バイオマス形成）に「吸収させる（ｓｕｎｋ）」ためには、いくつかの糖を第２のモデルに送るという代償が発生する。
【0136】
共役の制限は以下のとおりである。
（未制限）モデルにおける成長 ≧ CUSTOM_NGAM* (1./1000.)*(1./mol_atp_per_c_mol_biomass)*12.0107*2
式中、
＊ （未制限）モデルにおける成長の単位： ｈ－１
＊ CUSTOM_NGAMの単位： ミリモルのＡＴＰ ｇＤＷ－１ｈ－１
＊ 用語「（１．／１０００．）」は、ミリモルをモルに変換するため、この用語を適応した後の単位は、モルのＡＴＰ ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ mol_atp_per_c_mol_biomas ＝１．４６４７（単位無し）であり、この用語を適応した後の単位は、ｃｍｏｌのバイオマス ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ １２．０１０７は炭素の原子質量（１２．０１０７ｇ／１ｃｍｏｌ）であり、この用語を適応した後の単位は、ｇの炭素 ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ 細胞の炭素含有量がその乾燥重量の約５０％であると推定すると（ＰＭＩＤ １０４８２７８３）、約２ｇのＤＣＷが１ｇの炭素から形成されるため、数値「２」を最後の用語として含める。この用語を適応した後には、ｇＤＷ ｇＤＷ－１ｈ－１が得られ、ｇＤＷは打ち消されて、ｈ－１が残る（ｍｕまたは成長速度の式の左側の単位と一致する）。
（未制限）モデルにおける成長 ≧ CUSTOM_NGAM* (1./1000.)*(1./mol_atp_per_c_mol_biomass)*12.0107*2
式中、
＊ （未制限）モデルにおける成長の単位： ｈ－１
＊ CUSTOM_NGAMの単位： ミリモルのＡＴＰ ｇＤＷ－１ｈ－１
＊ 用語「（１．／１０００．）」は、ミリモルをモルに変換するため、この用語を適応した後の単位は、モルのＡＴＰ ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ mol_atp_per_c_mol_biomas ＝１．４６４７（単位無し）であり、この用語を適応した後の単位は、ｃｍｏｌのバイオマス ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ １２．０１０７は炭素の原子質量（１２．０１０７ｇ／１ｃｍｏｌ）であり、この用語を適応した後の単位は、ｇの炭素 ｇＤＷ－１ｈ－１となる。
＊ 細胞の炭素含有量がその乾燥重量の約５０％であると推定すると（ＰＭＩＤ １０４８２７８３）、約２ｇのＤＣＷが１ｇの炭素から形成されるため、数値「２」を最後の用語として含める。この用語を適応した後には、ｇＤＷ ｇＤＷ－１ｈ－１が得られ、ｇＤＷは打ち消されて、ｈ－１が残る（ｍｕまたは成長速度の式の左側の単位と一致する）。
【0137】
最終結果を生成するためには、第１の（制限された）モデルにおけるファルネセン収率をｑＳの以下のパラメーター値に対して最適化した。
ｑＳ（２０から１８０ ＯＴＲ内で等間隔）：［０．５、０．９２、１．３４、１．７６、２．１８、２．６］
ｑＳ（２０から１８０ ＯＴＲ内で等間隔）：［０．５、０．９２、１．３４、１．７６、２．１８、２．６］
【0138】
各ｑＳにおいて、ＴＣＡ回路への可能なすべてのフラックス・スプリット（ＴＣＡ回路への０フラックスから最大値まで）のシミュレーションを実施した（図７参照）。追加の変数（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を生成するために、各固定されたｑＳにおける０から最大値までの未知のホスホトランスアセチラーゼ（第２世代ファルネセン経路）フラックスおよびＴＣＡ回路フラックスもシミュレーションした。図７に示したように、実験データは、ＴＣＡ回路内のフラックス（ｑＳの関数として）が増加しなければならないことを示した。
【0139】
実施例３． 無益なＡＴＰ燃焼がバイオマスに対する産物収率を増加させる
過剰なＡＴＰにとってバイオマスが好ましい吸収源である場合、過剰なＡＴＰは速度－収率共役に影響し得ると仮定した。細胞維持のためのＡＴＰ消費は、ＡＴＰ産生の比速度に関わらず、一定である。よって、低い細胞比速度においては、より少ない割合のＡＴＰがバイオマスまたは非分解生化合物の産生のために利用可能であり、一方、高い細胞比速度においては、より多い割合のＡＴＰがバイオマスまたは非分解生化合物に使用可能である。細胞にとって最も効率的な過剰ＡＴＰの消費方法がバイオマスに吸収させることであれば、より少ない炭素が非分解生化合物の産生のために利用可能であり、高い細胞比速度では収率は低下する。反対に、低い細胞比速度では、バイオマス形成を行うための過剰なＡＴＰが少なく、割合としてより多くの炭素を非分解生化合物の産生に回すことができる。この仮定は、そうしなければバイオマスに吸収される過剰なＡＴＰを除くためのＡＴＰレベルの減少は、ファルネセン等の非分解生化合物へのより好ましい炭素の分配を可能にすることを予測する。
過剰なＡＴＰにとってバイオマスが好ましい吸収源である場合、過剰なＡＴＰは速度－収率共役に影響し得ると仮定した。細胞維持のためのＡＴＰ消費は、ＡＴＰ産生の比速度に関わらず、一定である。よって、低い細胞比速度においては、より少ない割合のＡＴＰがバイオマスまたは非分解生化合物の産生のために利用可能であり、一方、高い細胞比速度においては、より多い割合のＡＴＰがバイオマスまたは非分解生化合物に使用可能である。細胞にとって最も効率的な過剰ＡＴＰの消費方法がバイオマスに吸収させることであれば、より少ない炭素が非分解生化合物の産生のために利用可能であり、高い細胞比速度では収率は低下する。反対に、低い細胞比速度では、バイオマス形成を行うための過剰なＡＴＰが少なく、割合としてより多くの炭素を非分解生化合物の産生に回すことができる。この仮定は、そうしなければバイオマスに吸収される過剰なＡＴＰを除くためのＡＴＰレベルの減少は、ファルネセン等の非分解生化合物へのより好ましい炭素の分配を可能にすることを予測する。
【0140】
安息香酸は、ベンゾイルカチオンによって細胞質に移動した過剰なプロトンをくみ出すためにＡＴＰを使用するように細胞を強制することで、細胞内のＡＴＰを除去するために使用することができる。ファルネセン産生株を異なる濃度の安息香酸で処理し、比糖取り込み速度（ｑＳ）、比ファルネセン産生速度（ｑＰ）、および比成長速度（ｍｕ）に対するその影響を測定した。収率（ｑＰ／ｑＳ）は、測定した比糖取り込み速度および比ファルネセン産生速度から計算した。
【0141】
安息香酸の効果を図８に示した。興味深いことに、安息香酸濃度の増加に伴い比成長速度が直線的に低下するのに対し、比生産性は変化せず、中間濃度では増加さえした。増加した安息香酸濃度（および関連する増加したＡＴＰの消耗）は、計算収率（ｑＰ／ｑＳ）の増加に反映されるように、より好ましい炭素のファルネセンへの分配と関連していた。このデータは興味深く、我々にＡＴＰ産生を減少させるように遺伝子改変された株の速度－収率共役を直接測定させた。
【0142】
実施例３の方法
単一コロニーをＣＳＭアガープレート上で培養し、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）および２％のショ糖＋１％のマルトース＋２ｇ／Ｌのリシンを添加した３６０μｌの限定液体培養培地（ＬＧＭ、実施例１で参照、Westfall et al, 2012）を含む滅菌済みの９６ウェルのマイクロタイタープレート（作業容量は１．１ｍＬ、Ａｘｙｇｅｎ）にコロニーを加え、２８℃で７２時間培養した。１４μＬを、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）と表示した量の安息香酸を含む３６０μＬの新鮮限定ＬＧＭで継代培養し、次に３３．５℃で７２時間培養した。３日目に終濃度８％のショ糖でスパイクし、６時間のインキュベーション後、８％のショ糖と異なる濃度の安息香酸を含む生産プレートで（早期対数増殖期の）培養物を２６倍に希釈し、これによって遅滞期を避けた。対数増殖期（２点、即ち、Ｔ１およびＴ２）のファルネセン、バイオマス、および総残存糖を測定することは、比生産性、成長速度、および比糖取り込み速度の決定を可能にする。ファルネセンは、イソプロパノールによる全ウェルの抽出（ｆｕｌｌ－ｗｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）と、標準曲線に参照する２２０ｎｍのＵＶ吸光度による定量によって測定した。バイオマスは、励起波長２９０ｎｍ、検出波長３５０ｎｍ（ＵＶＯＤ）における、細胞内トリプトファンの蛍光シグナルの解析によって測定した。このトリプトファンシグナルと実際のバイオマスとの関係は株依存性であり、分析した株ごとに実験的に決定した。我々はＵＶＯＤとバイオマスの吸光度（ＯＤ）の両方を産生プレートの開始直前に測定することでこれを実施し、ウェル当たりのＯＤ／ＵＶＯＤ変換因子を次に産生工程の終了時のＵＶＯＤシグナルをバイオマスに戻すために使用した。バイオマスの決定のために実施しなければならない別の変換は、光学密度（ＯＤ）の乾燥細胞重量への変換であり、これも実験的に決定された。ファルネセンエマルションのＯＤシグナルへの関与を排除するために、培養物を２０％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ２０、２０％（ｖ／ｖ）のエタノール、２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４の溶液で希釈した。ＬＮ（ＯＤ）対時間に対して直線回帰を適応することで成長速度を決定した。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの販売するような種々の市販のキットを用いて、３４０ｎＭにおけるＮＡＤＨの吸光度を出力する、ショ糖、フルクトース、およびグルコースの酵素決定を用いて、総還元糖を測定した。
単一コロニーをＣＳＭアガープレート上で培養し、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）および２％のショ糖＋１％のマルトース＋２ｇ／Ｌのリシンを添加した３６０μｌの限定液体培養培地（ＬＧＭ、実施例１で参照、Westfall et al, 2012）を含む滅菌済みの９６ウェルのマイクロタイタープレート（作業容量は１．１ｍＬ、Ａｘｙｇｅｎ）にコロニーを加え、２８℃で７２時間培養した。１４μＬを、５０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）と表示した量の安息香酸を含む３６０μＬの新鮮限定ＬＧＭで継代培養し、次に３３．５℃で７２時間培養した。３日目に終濃度８％のショ糖でスパイクし、６時間のインキュベーション後、８％のショ糖と異なる濃度の安息香酸を含む生産プレートで（早期対数増殖期の）培養物を２６倍に希釈し、これによって遅滞期を避けた。対数増殖期（２点、即ち、Ｔ１およびＴ２）のファルネセン、バイオマス、および総残存糖を測定することは、比生産性、成長速度、および比糖取り込み速度の決定を可能にする。ファルネセンは、イソプロパノールによる全ウェルの抽出（ｆｕｌｌ－ｗｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）と、標準曲線に参照する２２０ｎｍのＵＶ吸光度による定量によって測定した。バイオマスは、励起波長２９０ｎｍ、検出波長３５０ｎｍ（ＵＶＯＤ）における、細胞内トリプトファンの蛍光シグナルの解析によって測定した。このトリプトファンシグナルと実際のバイオマスとの関係は株依存性であり、分析した株ごとに実験的に決定した。我々はＵＶＯＤとバイオマスの吸光度（ＯＤ）の両方を産生プレートの開始直前に測定することでこれを実施し、ウェル当たりのＯＤ／ＵＶＯＤ変換因子を次に産生工程の終了時のＵＶＯＤシグナルをバイオマスに戻すために使用した。バイオマスの決定のために実施しなければならない別の変換は、光学密度（ＯＤ）の乾燥細胞重量への変換であり、これも実験的に決定された。ファルネセンエマルションのＯＤシグナルへの関与を排除するために、培養物を２０％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ２０、２０％（ｖ／ｖ）のエタノール、２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４の溶液で希釈した。ＬＮ（ＯＤ）対時間に対して直線回帰を適応することで成長速度を決定した。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの販売するような種々の市販のキットを用いて、３４０ｎＭにおけるＮＡＤＨの吸光度を出力する、ショ糖、フルクトース、およびグルコースの酵素決定を用いて、総還元糖を測定した。
【0143】
安息香酸、酢酸、ソルビン酸、乳酸、およびプロピオン酸は、全てが（異なるレベルで添加されたときに）バイオマス収率の減少／ＡＴＰ浪費の実行に使用することができる。多くの他のカルボン酸もバイオマス収率の減少（またはＡＴＰ浪費の実行）が可能なはずである。ＡＴＰ浪費の程度は、通常、どちらも分子の膜透過性に影響を与える酸のｐＫａおよびオクタノール－水分配係数（ｌｏｇＰ）と関連する。低い細胞外ｐＨにおいて弱酸は、その大部分が、比較的高い膜透過性を有する未解離の形態で存在するはずである。静的な拡散によって細胞内に侵入したら、細胞基質の高ｐＨが酸の解離を誘導し、細胞を酸化させてプロトンのＡＴＰ依存性フラックスを開始させる。続いて、弱酸は、最低でも細胞内ＡＴＰレベルの一時的な減少を起こすことができる。高濃度では、ＡＴＰの枯渇、細胞質の酸性化、およびプロトン輸送力の消失が起こり得る。この「弱酸脱共役」機構は、弱有機酸毒性を裏打ちする主たる機構として慣例的には引用されている。細胞ＡＴＰレベルの除去に使用することのできる弱酸の例を下記表１に示した。
【0144】
【表2】
【0145】
実施例４． ＡＴＰレベルを低下させる遺伝子改変は、発酵槽中の速度－収率共役を減少させる
ファルネセン産生株を、ＴＤＨ３プロモーターの制御下でＮＯＸ（ＮＡＤＨ酸化酵素）を過剰発現するように改変した。ＮＯＸによるＮＡＤＨの酸化は、ミトコンドリア内のＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ合成の電子供与体としてＮＡＤＨが使用されるのを防止する。よって、ＮＯＸの過剰発現は、細胞内ＡＴＰレベルを低下させる。このＹ３１６５５株と、ＮＯＸが組み換えられていない対照株（Ｙ２１９０１、Ｙ２２０２１）を、個別に異なるＯＴＲにセットした発酵槽で培養した。比ＯＵＲ（ｑＯ２）は、ＯＴＲを層内の総バイオマスで除した値の関数である。各層の条件における比酸素取り込み速度に対して産物収率をプロットすることで速度－収率共役の効果を測定した。図９においては、収率と比速度との関係を、対照株は２種の異なるグレーの濃淡で、ＮＯＸ過剰発現株は黒で示した。速度－収率共役の勾配は、対照に対してＮＯＸ過剰発現株において有意に（半分に）減少した。この実験は、ＡＴＰレベルが速度－収率共役に影響すること、減少した細胞内ＡＴＰレベルが収率と比速度との共役の減少と関連することを示す。これは、バイオマスに吸収された過剰なＡＴＰが、ファルネセン産生から炭素を引き抜きながら、速度－収率共役を駆動するという仮説と一致していた。
ファルネセン産生株を、ＴＤＨ３プロモーターの制御下でＮＯＸ（ＮＡＤＨ酸化酵素）を過剰発現するように改変した。ＮＯＸによるＮＡＤＨの酸化は、ミトコンドリア内のＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ合成の電子供与体としてＮＡＤＨが使用されるのを防止する。よって、ＮＯＸの過剰発現は、細胞内ＡＴＰレベルを低下させる。このＹ３１６５５株と、ＮＯＸが組み換えられていない対照株（Ｙ２１９０１、Ｙ２２０２１）を、個別に異なるＯＴＲにセットした発酵槽で培養した。比ＯＵＲ（ｑＯ２）は、ＯＴＲを層内の総バイオマスで除した値の関数である。各層の条件における比酸素取り込み速度に対して産物収率をプロットすることで速度－収率共役の効果を測定した。図９においては、収率と比速度との関係を、対照株は２種の異なるグレーの濃淡で、ＮＯＸ過剰発現株は黒で示した。速度－収率共役の勾配は、対照に対してＮＯＸ過剰発現株において有意に（半分に）減少した。この実験は、ＡＴＰレベルが速度－収率共役に影響すること、減少した細胞内ＡＴＰレベルが収率と比速度との共役の減少と関連することを示す。これは、バイオマスに吸収された過剰なＡＴＰが、ファルネセン産生から炭素を引き抜きながら、速度－収率共役を駆動するという仮説と一致していた。
【0146】
材料および方法
バイオリアクターの条件の詳細については実施例１を参照。
バイオリアクターの条件の詳細については実施例１を参照。
【0147】
Lactococcus lactisのＮＡＤＨ酸化酵素のコード配列（ＮＡＤＨ酸化酵素遺伝子の開始コドンから停止コドンに至るヌクレオチド配列と定義）に対して、その５’末端に本来のS. cerevisiaeのＴＤＨ３プロモーター、その３’末端に本来のS. cerevisiaeのＴＤＨ３遺伝子のターミネーターを融合した。ＴＤＨ３プロモーターはＴＤＨ３遺伝子の開始コドンのすぐ上流の約８３０ｂｐのヌクレオチド配列と定義される。ＴＤＨ３ターミネーターは、ＴＤＨ３遺伝子の停止コドンのすぐ下流の約３００ｂｐのヌクレオチド配列と定義される。ＴＤＨ３プロモーター－ＮＯＸ－ＴＤＨ３ターミネーター構築物は、標準酵母分子遺伝学技術を用いて、ＧＡＳ４遺伝子の約５００ｂｐ上流、および５００ｂｐ下流の隣接相補性配列を使用し、本来のＧＡＳ４遺伝子座に統合された。
【0148】
実施例５． ＴＣＡ回路へのフラックスの減少は、速度－収率共役を減少させる
ミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成のための主たる電子源であるＴＣＡ回路へのフラックスの減少が速度－収率共役に与える影響を決定するために、ＰＹＣ１またはＣＩＴ１が単体でまたは組み合わせで下方制御されている株を作製した。Ｐｙｃ１は細胞質ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換し、その後ミトコンドリアに輸送されてＴＣＡ回路に入ることができる。Ｃｉｔ１は、ＴＣＡ回路の律速酵素である。これ酵素の両方の下方制御はＴＣＡ回路への炭素フラックスを有意に減少し、ミトコンドリアのＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ産生を減少させるはずである。本来のプロモーターを、マルトースの存在下（例えば、種子構成条件下）では活性であるが、マルトースの非存在下（例えば、産生条件下）では不活性のプロモーターで置換することによって、ＣＩＴ１またはＰＹＣ１の下方制御を設計した。以下のファルネセン産生株における速度－収率共役を測定した：Ｙ２７６６２（ＰＹＣ１を下方制御するように改変）、Ｙ３９６６６（ＣＩＴ１を下方制御するように改変）、Ｙ２９４３８（ＣＩＴ１およびＰＹＣ１の両方を下方制御するように改変）、および非改変対照であるＹ２１６０１。驚くべきことに、ＰＹＣ１およびＣＩＴ１の両方が下方制御された株（Ｙ２９４３８）においては、速度はほぼ完全に収率から脱共役されたように見えた。この観察結果は、速度が収率から脱共役可能であることを立証し、大規模産生に適応可能な、高収率と高速度の両方を維持可能な株を構築するための解決策を同定する。この解決策は、生合成反応に転換される炭素の運命を決定する主な因子が過剰なＡＴＰであることを示したモデリングによる観察と実験的立証（全ての詳細を上述した）の集大成である。
ミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成のための主たる電子源であるＴＣＡ回路へのフラックスの減少が速度－収率共役に与える影響を決定するために、ＰＹＣ１またはＣＩＴ１が単体でまたは組み合わせで下方制御されている株を作製した。Ｐｙｃ１は細胞質ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換し、その後ミトコンドリアに輸送されてＴＣＡ回路に入ることができる。Ｃｉｔ１は、ＴＣＡ回路の律速酵素である。これ酵素の両方の下方制御はＴＣＡ回路への炭素フラックスを有意に減少し、ミトコンドリアのＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ産生を減少させるはずである。本来のプロモーターを、マルトースの存在下（例えば、種子構成条件下）では活性であるが、マルトースの非存在下（例えば、産生条件下）では不活性のプロモーターで置換することによって、ＣＩＴ１またはＰＹＣ１の下方制御を設計した。以下のファルネセン産生株における速度－収率共役を測定した：Ｙ２７６６２（ＰＹＣ１を下方制御するように改変）、Ｙ３９６６６（ＣＩＴ１を下方制御するように改変）、Ｙ２９４３８（ＣＩＴ１およびＰＹＣ１の両方を下方制御するように改変）、および非改変対照であるＹ２１６０１。驚くべきことに、ＰＹＣ１およびＣＩＴ１の両方が下方制御された株（Ｙ２９４３８）においては、速度はほぼ完全に収率から脱共役されたように見えた。この観察結果は、速度が収率から脱共役可能であることを立証し、大規模産生に適応可能な、高収率と高速度の両方を維持可能な株を構築するための解決策を同定する。この解決策は、生合成反応に転換される炭素の運命を決定する主な因子が過剰なＡＴＰであることを示したモデリングによる観察と実験的立証（全ての詳細を上述した）の集大成である。
【0149】
材料および方法。ＮＯＸ実験と同じ。
【0150】
宿主の本来の相同組み換え機構を用いて酵母ゲノム中にＤＮＡ配列を置換または挿入するための標準的な酵母分子遺伝学技術を使用し、各遺伝子の本来のプロモーターを、マルトースの不在時にはオフになる合成プロモーターと置き換えることで、ＰＹＣ１および／またはＣＩＴ１による下方制御が達成された。
【0151】
本明細書において引用した全ての出版物、特許、および特許出願は、出版物または特許出願を詳細且つ個別には参照によって組み込まれると特定したかのように、本参照をもって本願に組み込まれたものとする。上記発明は、理解を明確にする目的で、実例および例示によっていくらか詳細に説明したが、当業界の通常の技術を持つものにとって、本発明の開示に鑑みれば、添付の請求項の精神に逸脱することなく、ある程度の変更および改変は可能であることを理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】