特表 2022-535421 配列類似ペプチドを使用した対抗選択による選別

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-08

(54)【発明の名称】配列類似ペプチドを使用した対抗選択による選別

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220801BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220801BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20220801BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20220801BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220801BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20220801BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C12Q1/02 ZNA

C12Q1/70

C40B40/10

C12N15/13

C12N5/10

C12N5/078

G01N33/53 D

G01N33/536 D

G01N33/536 E

G01N33/53 Y

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021571964

(86)(22)【出願日】2020-06-04

(85)【翻訳文提出日】2021-12-03

(86)【国際出願番号】 EP2020065567

(87)【国際公開番号】W WO2020245326

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/858,167

(32)【優先日】2019-06-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】102019129341.3

(32)【優先日】2019-10-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(71)【出願人】

【識別番号】520184664

【氏名又は名称】イマティクス ユーエス，アイエヌシー．

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(74)【代理人】

【識別番号】100224786

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 卓之

(74)【代理人】

【識別番号】100225015

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 彩夏

(72)【発明者】

【氏名】ブンク，セバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】マウラー，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】シュイマック，ギーゼラ

(72)【発明者】

【氏名】シュスター，ヘイコ

(72)【発明者】

【氏名】ワグナー，クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】ユスフ，サラ

(72)【発明者】

【氏名】アルパート，アミール

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ10

4B063QQ13

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR77

4B063QR79

4B063QR80

4B063QS32

4B063QS33

4B063QS38

4B063QX01

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AA98X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を使用した対抗選択を適用しながら、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質をその表面に発現する細胞またはウイルスを選択する方法に関する。さらに、本発明は、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸の配列を決定するための方法、および抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を発現する細胞を産生するための方法を提供する。本発明はまた、選択された細胞集団を用いて対象を治療するための方法にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）細胞集団またはウイルス集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団または前記ウイルス集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団または前記ウイルス集団と、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）前記第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する、少なくとも１つの細胞またはウイルスを選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）特異的および／または選択的に結合する抗原結合タンパク質をその表面に発現する、細胞またはウイルスを選択するための方法であって、
前記ＳＰＡのアミノ酸配列が、前記ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、前記第２のＡＣが検出可能標識Ｂを含んでなり；または前記ＳＰＡと検出可能標識Ｂ、または前記ＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
前記検出可能標識Ａと前記検出可能標識Ｂが、互いに検出可能に異なる、方法。

【請求項2】

前記選択された（ｉ）細胞が免疫細胞、好ましくはＴ細胞、好ましくはＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞；またはＢ細胞；または異種抗原結合タンパク質を発現する哺乳類または酵母細胞であり；または（ｉｉ）前記選択されたウイルスがバクテリオファージである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれらの抗原結合断片、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）またはそれらの抗原結合断片、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれらの抗原結合断片を含んでなる群から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

（ａ）前記細胞集団が、
（ｉ）好ましくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である免疫細胞、Ｔ細胞受容体ライブラリ、健常対象の末梢血、罹患対象の末梢血、またはそれらの免疫細胞富化画分；または
（ｉｉ）異種の抗原結合タンパク質のライブラリを発現する、好ましくは哺乳類細胞または酵母細胞である真核細胞
を含んでなり、または
（ｂ）前記ウイルス集団が、異種抗原結合タンパク質のライブラリを発現するウイルスを含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫細胞富化画分が、幹細胞；Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８Ｔ細胞またはＣＤ４Ｔ細胞；Ｂ細胞；プラズマ細胞胞に富む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルスタンパク質または細菌タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記罹患対象が、免疫疾患、腫瘍性疾患、ウイルスによって引き起こされる疾患、または細菌によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患に罹患している、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記免疫細胞富化画分が、１つまたは複数の免疫細胞特異的表面マーカーを検出可能に標識することによって選択される、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

好ましくはサイトカインからなる群から選択される、増殖および／または分化因子の存在下で、前記細胞集団をインキュベートするさらなるステップを含んでなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＡＣが、抗原提示細胞であり、または粒子、前記ＰＡＩ、および前記検出可能標識Ａ；または前記ＳＰＡおよび前記検出可能標識Ｂを含んでなる複合体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ａ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＰＡＩおよび（前記細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと、検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ａと検出可能に異なり、検出可能標識Ｄが存在する場合は、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ａおよび検出可能標識Ｄと検出可能に異なる）検出可能標識Ｃを含んでなる第３の抗原複合体（第３のＡＣ）とを接触させるステップ；および／または
（ｂ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＰＡＩおよび（前記細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと、検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ａと検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ａおよび前記検出可能標識Ｃと検出可能に異なる）検出可能標識Ｄを含んでなる第４の抗原複合体（第４のＡＣ）とを接触させるステップ；および／または
（ｃ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＳＰＡおよび（前記細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと、検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ｂと検出可能に異なり、検出可能標識Ｆが存在する場合は、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ｂおよび検出可能標識Ｆと検出可能に異なる）検出可能標識Ｅを含んでなる第５の抗原複合体（第５のＡＣ）とを接触させるステップ；および／または
（ｄ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＳＰＡおよび（前記細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと、検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ｂと検出可能に異なり、好ましくは少なくとも前記検出可能標識Ｂおよび前記検出可能標識Ｅと検出可能に異なる）検出可能標識Ｆを含んでなる第６の抗原複合体（第６のＡＣ）とを接触させるステップ；および／または
（ｅ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、（それぞれが、前記第２のＡＣの前記ＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なるＳＰＡを含んでなり、それぞれのさらなるＡＣは、１つまたは複数の標識を含んでなり、前記１つまたは複数の標識は、前記第２のＡＣの１つまたは複数の標識と同じであるか、または検出可能に異なる）１つまたは複数のさらなる抗原複合体（ＡＣ）とを接触させるステップと
のさらなるステップの１つまたは複数を含んでなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（ｉ）前記第１のＡＣが、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、前記第２のＡＣが、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、それらは同一であるかまたは異なり；および／または
（ｉｉ）前記１つまたは複数のさらなるＡＣが、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり；前記少なくとも１つのさらなる標識が、前記第１のＡＣを前記第２のＡＣおよび前記１つまたは複数のさらなるＡＣから区別することを可能にするように選択される、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記検出可能標識が、好ましくは、キサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル染料、クマリン、ポルフィン、金属リガンド錯体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレン、およびフタロシアニンからなる群から選択される蛍光標識から独立して選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のＡＣが、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩとＰＡＩとの複合体であり、前記ＰＡＩが、標的ペプチド（ＴＰ）、好ましくは腫瘍特異的標的ペプチドであり、および／または前記第２のＡＣが、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩと前記ＳＰＡの複合体であり、前記ＳＰＡが、標的類似ペプチド（ＴＳＰ）であり、前記ＴＳＰが、前記ＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも１つのＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ａ）健常組織上の前記ＴＳＰの提示；
（ｂ）ＨＬＡタイプの起源に由来；および
（ｃ）前記それぞれのＨＬＡへの結合
の基準の１つまたは複数によって選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＴＳＰのアミノ酸配列が８～１６アミノ酸長を有する、請求項１４または１５に記載の方法であって、
（１）前記ＴＰが８アミノ酸長を有する場合、前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_８は、前記ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３、およびＸ_７、およびＸ_９は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_７およびＸ_８（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_６は、前記ＴＰと同一または類似している）で、
前記ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８
と異なり；または
（２）前記ＴＰが８～９アミノ酸アミノ酸長を有する場合、前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_９は、前記ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_９は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_９は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_６は、前記ＴＰと同一または類似している）で、
前記ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９
と異なり；または
（３）前記ＴＰが８～１０アミノ酸アミノ酸長を有する場合、前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１０は、前記ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１０は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１０は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、前記ＴＰと同一または類似している）で、
前記ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０
と異なり；または
（４）前記ＴＰが８～１１アミノ酸アミノ酸長を有する場合、前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１１は、前記ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１１は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１１は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、およびＸ_１１（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｖ）位置Ｘ_９、Ｘ_１０、およびＸ_１１（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_８は、前記ＴＰと同一または類似している）で、
前記ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０Ｘ_１１
と異なり；または
（５）前記ＴＰが８～１２アミノ酸アミノ酸長を有する場合、前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１２は、前記ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１２は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１２は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、およびＸ_１２（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、前記ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｖ）位置Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、およびＸ_１２（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_８は、前記ＴＰと同一または類似している）で、
前記ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２
と異なる、方法。

【請求項17】

前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、前記ＴＰとは異なる長さを有する、請求項１６記載の方法。

【請求項18】

前記ＳＰＡまたは前記ＴＳＰのアミノ酸配列が、前記ＰＡＩまたはＴＰと、９５％未満のアミノ酸同一性、９０％未満のアミノ酸同一性、または８５％未満のアミノ酸同一性を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

ステップ（ｉ）の前記細胞集団が、それぞれが異なる類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含んでなる、１０個以下の抗原複合体（ＡＣ）と接触され、９つ以下の異なるＳＰＡ、８つ以下の異なるＳＰＡ、７つ以下の異なるＳＰＡ、６つ以下の異なるＳＰＡ、５つ以下の異なるＳＰＡ、４つ以下の異なるＳＰＡ、３つ以下の異なるＳＰＡ、３つ以下の異なるＳＰＡ、または１つ以下のＳＰＡが使用される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＳＰＡがＴＳＰである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記異なるＴＳＰの数が１～１０の間；２～８の間；３～５または１～３の間であり、好ましくは３つのＴＳＰが使用される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

請求項１のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）および／または請求項１０のステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ）が、引き続いて、任意の順序でまたは組み合わせでまたは同時進行で実行される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ステップ（ｉｖ）が、
ａ）前記第１のＡＣ、第１および第３のＡＣ、または第１、第３、および第４のＡＣに結合した細胞を正に選択する（選択）ステップ、および／または
ｂ）前記第２のＡＣ、前記第２および第５、または前記第２、第５、および第６のＡＣに結合した細胞を負に選択する（除外）ステップ
を含んでなる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記標識が、フローサイトメトリー分析、好ましくはＭＡＣＳ分析、ＦＡＣＳ分析または分取選別分析によって検出される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

ステップｉ）の前記集団に含まれる前記細胞が、Ｔ細胞および／またはＢ細胞であり、表現型同定されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

Ｔ細胞の前記表現型決定が、１つ以上のＴ細胞マーカーの判定からなる、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

Ｂ細胞の前記表現型決定が、１つまたは複数のＢ細胞マーカーの判定を含んでなる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなる無関係の抗原複合体（ＩＡＣ）とを接触させるステップ
をさらに含んでなり、前記ＰＡＩのアミノ酸配列と整列されたときに、前記ＩＰＡのアミノ酸配列が２つ以下のアミノ酸位置で前記ＰＡＩと同一であり、前記ＩＡＣが、前記検出可能標識Ａと検出可能に異なる、検出可能標識Ｇを含んでなる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

少なくとも１つのＩＰＡのアミノ酸配列が、
（ａ）健常組織上のＩＰＡの提示；
（ｂ）ＨＬＡタイプの起源に由来；
（ｃ）前記それぞれのＨＬＡへの結合
の基準の１つまたは複数によって選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＩＰＡのアミノ酸配列、または前記ＩＰＡに含まれる少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列が、前記ＰＡＩに対して３０％未満のアミノ酸同一性、２０％未満のアミノ酸同一性、または１０％未満のアミノ酸同一性を有する、請求項２８～２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＩＡＣが、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩと無関係のペプチド（ＩＰ）の複合体であり、前記ＩＰのアミノ酸配列が、前記ＴＰのアミノ酸配列と整列されたときに、１つまたは皆無のアミノ酸位置で前記ＴＰと同一である、請求項２８～３０に記載の方法。

【請求項32】

（ｉ）請求項１～２６に従って選択された前記細胞から、前記抗原結合タンパク質または前記その抗原結合部分をコード化する前記核酸を単離するステップと；
（ｉｉ）前記核酸の配列を決定するステップと
を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸の配列を決定するための方法。

【請求項33】

（ｉ）本発明の第１の態様の方法で選択された前記細胞から、前記抗原結合タンパク質または前記その抗原結合部分をコード化する前記核酸配列を提供するステップと；
（ｉｉ）任意選択的に発現制御要素の制御下で、ステップ（ｉ）で提供される核酸配列を含んでなる前記核酸ベクターを生成するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記核酸ベクターを宿主細胞に導入するステップと
を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を発現する細胞を生成するための方法。

【請求項34】

前記抗原結合タンパク質が、ＴＣＲまたはその断片；ＢＣＲまたはその断片、または抗体またはその断片である、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＴＣＲ、前記ＢＣＲ、または前記抗体のアミノ酸配列が、６つのＣＤＲ配列を含んでなる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

（ｉ）前記対象の細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなる前記ＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、ＳＰＡを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）前記第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと；
（ｖ）培養によって、前記少なくとも１つの選択された細胞の数を増加させるステップと；
（ｖｉ）前記培養された細胞を前記対象に再導入するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象を治療するための方法であって、
前記ＳＰＡのアミノ酸配列が、前記ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、前記第２のＡＣが検出可能標識Ｂを含んでなり、または前記ＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
前記検出可能標識Ａと前記検出可能標識Ｂが、互いに検出可能に異なる、方法。

【請求項37】

前記それを必要とする対象が、免疫疾患または腫瘍性疾患、ウイルスによって引き起こされる疾患、または細菌によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患に罹患しているか、または罹患するリスクがある、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

（ｉ）免疫細胞を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなる前記ＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、ＳＰＡを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）前記第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと
を含んでなる、免疫疾患または腫瘍性疾患、ウイルスによって引き起こされる疾患、細菌によって引き起こされる疾患の治療に使用するための、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的および／または選択的に結合する抗原結合タンパク質をその表面上に発現する選択された免疫細胞であって、
前記ＳＰＡのアミノ酸配列が、前記ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、前記第２のＡＣが検出可能標識Ｂを含んでなり；または前記ＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
前記検出可能標識Ａと前記検出可能標識Ｂが、互いに検出可能に異なり；前記腫瘍性疾患が、好ましくはがんである、免疫細胞。

【請求項39】

（ｉ）免疫細胞を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、前記ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなる前記ＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記細胞集団と、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）前記第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質をその表面に発現する免疫細胞を選択するための方法であって、
前記ＰＡＩのアミノ酸配列と整列されたときに、前記ＩＰＡのアミノ酸配列が２つ以下のアミノ酸位置で前記ＰＡＩと同一であり、前記ＩＡＣが検出可能標識Ｇを含んでなり；または前記ＩＰＡと検出可能標識Ｇを含み；
前記検出可能標識Ａと前記検出可能標識Ｇが、互いに検出可能に異なる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を使用した対抗選択を適用しながら、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質をその表面に発現する細胞またはウイルスを選択する方法に関する。さらに、本発明は、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸の配列を決定するための方法、および抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を発現する細胞を産生するための方法を提供する。本発明はまた、選択された細胞集団を用いて対象を治療するための方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

養子細胞移植（ＡＣＴ）の分野は、がん、ウイルス感染症、その他の免疫調節疾患を治療するための最も有望かつ革新的なアプローチの１つになっている。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞のより広範な臨床応用を支持するためには、好ましくは前臨床レベルで、リスクが適切に特定され軽減され得ることが重要である。ＴＣＲ修飾Ｔ細胞の投与により現在までに観察された毒性は、標準的なＡＣＴの際に観察されたものと同様であり、リンパ枯渇製剤レジメンによる毒性、サイトカイン関連毒性、および免疫関連毒性の３つの主要なグループに大きく分けられ得る。免疫関連毒性は、いわゆる「腫瘍外／オンターゲット」効果と、「腫瘍外／オフターゲット」効果の２つのサブカテゴリーに分類され得る。最適な遺伝子操作されたＴ細胞療法の標的抗原は、腫瘍細胞上にのみ存在し、健康な細胞には存在しないものである；しかし、ほとんどの場合、選択された腫瘍標的抗原は、正常細胞中に様々な程度程度で存在してもよい、過剰発現または異常発現タンパク質である（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ ２００９；１１４：５３５－４６）。

【0003】

「腫瘍外／オンターゲット」毒性
したがって、遺伝子操作されたＴ細胞療法は、標的抗原を低レベルで発現する細胞に対してさえ、正常細胞に対する強力な細胞性免疫応答を引き起こしてもよい。このタイプの毒性は「腫瘍外／オンターゲット」として知られており、例えば、操作されたＴ細胞が正常細胞と標的抗原を発現するがん細胞とを区別できないことに起因するす。メランＡ（ＭＬＡ；「Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原」（ＭＡＲＴ－１）とも称される）の標的化は、顕著な「腫瘍外／オンターゲット」の副作用に関連付けられている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｂｌｏｏｄ ２００９，１１４：５３５－４６；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＪＨ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ Ｆａｔａｌ Ｓｅｒｉｏｕｓ Ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ ｕｐｏｎ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＭＡＲＴ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５；２３：１５４１－５０）。具体的には、ＭＡＲＴ－１特異的ＴＣＲによる形質導入Ｔ細胞の転移性黒色腫患者への投与の３日後における、致命的な重篤な有害事象を記述する症例報告が発表されている。注入されたＴ細胞は、血液、気管支肺胞洗浄液、腹水、腫瘍部位、および心臓組織から回収され、修飾Ｔ細胞の３Ｄ拍動心筋細胞培養に対する交差反応性は観察されなかったが、著者らは、同種異系のＭＨＣ－ペプチド複合体との交差反応性の可能性を除外できなかった。さらに、多臓器不全は、オンターゲットサイトカイン放出が原因であることが認められた。腫瘍に対して治療的に有効な用量の適用時に許容可能な毒性をもたらすのに十分に低い腫瘍外発現を示す、標的抗原を選択することによって、腫瘍外／オンターゲットの毒性が回避され得る。

【0004】

「腫瘍外／オフターゲット」毒性
ほとんどの腫瘍抗原は自己タンパク質に由来するため（腫瘍関連抗原）、高親和性の腫瘍特異的Ｔ細胞の分離は、胸腺選択によって効果的に除外される。それにもかかわらず、ＴＣＲ親和性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内の特定の領域の変異を通じて、大幅に増強され得る。このアプローチは、ＴＣＲの縮重のために、修飾Ｔ細胞の有効性を促進するのに有用であるが、ＴＣＲが交差反応性を通じて、正常組織上に存在するその他の関連ペプチド抗原を認識するかもしれないというリスクがある。これまでに発表された結果では、前臨床試験で交差反応が予測されていなかったにもかかわらず、筋肉タンパク質であるタイチンのペプチドと交差反応する、黒色腫関連抗原Ａ３（ＭＡＧＥ－Ａ３）を標的化するＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を注入された２人の患者において、致死的な毒性が示されている（Ｌｉｎｅｔｔｅ，ＧＰ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｔｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２：８６３－７１；Ｃａｍｅｒｏｎ，ＢＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｉｔｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＨＬＡ－Ａ１－ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ａ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＭＡＧＥ－Ａ３ ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１３；５：１９７－１０３）。これらの患者は、ＴＣＲで操作されたＴ細胞が、重篤かつ容易に予測できないオフターゲットおよび臓器特異的な毒性を有し得ることを実証し、操作されたＴＣＲの特異性を定義するための改善された方法に対する必要性が強調された。したがって、ペプチドスキャンニングおよびより複雑な細胞構造の使用などのストラテジーが、将来の臨床研究査におけるオフターゲット毒性のリスクを軽減するために、前臨床試験で推奨される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、腫瘍外／オフターゲットの低毒性を有するＴＣＲを開発するという、なおも満たされていない医学的ニーズがある。本発明は、特にそれらの標的抗原に特異的かつ選択的に結合するＴＣＲである、抗原結合分子を迅速に同定するための方法を提供し、ひいては強化された安全性プロファイルを提供し、特に、健常組織上の類似配列ペプチドである標的抗原類似配列への交差反応性を低減する。本発明の迅速な、好ましくは１ステップの選択方法は、所望の抗腫瘍活性を有するＴＣＲを発現する患者由来のＴ細胞の同定において特に有用である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１の態様は、
（ｉ）細胞またはウイルス集団を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団またはウイルス集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団またはウイルス集団と、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する、少なくとも１つの細胞またはウイルスを選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的および／または選択的に結合する抗原結合タンパク質をその表面上に発現する、細胞またはウイルスを選択するための方法に関し、
ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは検出可能標識Ｂを含んでなり；またはＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｂは、互いに検出可能に異なる。

【0007】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）本発明の第１の態様の方法で選択された細胞から、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を単離するステップと；
（ｉｉ）核酸の配列を決定するステップと
を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸の配列を決定するための方法にさらに関する。

【0008】

本発明の第３の態様は、
（ｉ）本発明の第１の態様の方法で選択された細胞から、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸配列を提供するステップと；
（ｉｉ）任意選択的に発現制御要素の制御下で、ステップ（ｉ）で提供される核酸配列を含んでなる核酸ベクターを生成するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の核酸ベクターを宿主細胞に導入するステップと
を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を発現する細胞を生成するための方法に関する。

【0009】

本発明の第４の態様は、
（ｉ）免疫細胞を含んでなる対象の細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＳＰＡを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと；
（ｖ）（ｉｖ）で選択された少なくとも１つの選択された細胞の数を増加させるステップと；
（ｖｉ）培養された細胞を対象に再導入するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象を治療するための方法に関し、
ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは検出可能標識Ｂを含んでなり；
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｂは、互いに検出可能に異なる。

【0010】

本発明の第５の態様は、
（ｉ）免疫細胞を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質をその表面上に発現する免疫細胞を選択するための方法に関し、
ＰＡＩのアミノ酸配列と整列させた場合のＩＰＡのアミノ酸配列は、２つ以下のアミノ酸位置でＰＡＩと同一であり、ＩＡＣは検出可能標識Ｇを含み；またはＩＰＡおよび検出可能標識Ｇを含み、
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｇは、互いに検出可能に異なる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

以下では、本明細書に含まれる図の内容を説明する。これに関連して、上記および／または下記の発明の詳細な説明も参照されたい。

【図1】本発明の２つの例示的な用途の概略図を示す。図の上の経路は、個々のＴ細胞培養ステップを受けたプライミングされたＴ細胞に適用された場合のゲーティングストラテジーの使用を表し、図の下の部分は、直接選別アプローチでのゲーティングストラテジーの使用を示し、ここで、天然レパートリーから得られた不均一なＴ細胞集団は、ゲーティングストラテジーを使用して、標的特異的Ｔ細胞が富化されている。双方の例において、正に選別された細胞画分は、それらの表面上に、目的のタンパク質抗原に特異的および／または選択的に結合する抗原結合タンパク質を発現する、免疫細胞を発現する。図で使用されている略語：ＳＰＡ：類似タンパク質抗原、ＰＡＩ：目的のタンパク質抗原、ＡＰＣ：抗原提示細胞。

【図2】増幅されていない標的特異的Ｔ細胞の例示的なゲーティングストラテジーを示す。試験サンプル中の低頻度標的特異的Ｔ細胞の頻度を高めるために、細胞は蛍光色素四量体特異的磁気ビーズ分離によって富化されている。引き続いて、細胞は表面マーカーについて染色され、フローサイトメトリーによって評価される。個々の２Ｄ着色四量体の組み合わせを使用して、標的特異的Ｔ細胞および類似ペプチド特異的Ｔ細胞が染色された。この例では、１．６５％のＣＤ８Ｔ細胞が標的ペプチド四量体に結合し、それらの標的特異的ＣＤ８Ｔ細胞の２９．４％が、３つの異なる類似ペプチドＨＬＡで構成される類似ペプチド四量体（標的^＋／ＳＩＭ^＋）にも結合する。選別手順に類似ペプチド四量体を含めることによって、交差反応性Ｔ細胞（標的^＋／ＳＩＭ^＋）の高い割合が除外され得る。

【図3-1】プライミングされたＴ細胞集団の例示的なゲーティングストラテジーを示す。個々のＴ細胞培養物は、標的ペプチドＨＬＡで被覆された人工提示細胞で繰り返し刺激され、低頻度の標的特異的ＣＤ８Ｔ細胞が増強された。４週間の培養後、これらのプライミングされたＴ細胞培養物は、表面マーカーについて染色され、個々の２Ｄ着色四量体組み合わせは、標的ＨＬＡと３つの類似ペプチド－ＨＬＡについて染色された。上側パネルは、標的ペプチドと類似ペプチドの双方の四量体（標的^＋／ＳＩＭ^＋）に結合する、モノクローナルに富むＴ細胞集団を示す。下側パネルは、標的にのみ結合し、類似ペプチド四量体には結合しない、モノクローナル富化Ｔ細胞集団を示す。染色手順に類似ペプチド四量体を含めることにより、交差反応性Ｔ細胞（標的^＋／ＳＩＭ^＋）が選別から除外され得る。

【図3-2】同上

【図4-1】標的ペプチド四量体のみを使用して選別されたＴ細胞からのＴＣＲが、標的類似ペプチドと交差反応し得ることを示す。標的ペプチド四量体を使用して同定されたＴＣＲは、健常ドナーＴ細胞へのｍＲＮＡ電気穿孔後に、１０個の標的類似ペプチドに対する交差反応性について評価された。反応性の尺度として、ペプチド負荷Ｔ２細胞との共培養時のＩＦＮγ分泌が評価された。この例の全てのＴＣＲは、標的ペプチド（陽性対照）に対して反応するが、関係ない／無関係のペプチドが負荷されたＴ２細胞、未負荷Ｔ２細胞、またはエフェクター単独の細胞である、対照に対しては反応しない。しかし、図４Ａおよび図４ＢのＴＣＲはまた、類似ペプチド、すなわち、図４ＡのＴＣＲの類似ペプチド１および１０、そして図４ＢのＴＣＲの類似ペプチド９および１０に対する反応性を示す。図４ＣのＴＣＲのみが交差反応性を示さず、したがってさらなる特性評価のために選択されている。

【図4-2】同上

【図5-1】標的ペプチド四量体のみに結合するＴ細胞から単離されたＴＣＲ（ＴＣＲ ＰＡＩ＋／ＳＰＡ－）、ならびに対照ペプチドに特異的な対照ＴＣＲ（「対照ペプチド」）、およびＴＣＲなし対照（「ペプチドなし」）の機能評価を示す。この目的のために、ＴＣＲ－ｍＲＮＡが、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼＪｕｒｋａｔレポーター細胞中に電気穿孔され、ペプチド／標的類似ペプチド（「ＳＩＭ１、ＳＩＭ２、およびＳＩＭ３」）が負荷されたＴ２抗原提示細胞との共培養後に、それらの活性化が評価された。ＰＡＩ＋／ＳＰＡ－で選別されたＴ細胞に由来するＴＣＲは、標的ペプチド負荷Ｔ２細胞と共培養された場合にのみ、活性化を誘発する。対照ＴＣＲは、対照ペプチドの存在下で反応性を示し、ＴＣＲ ｍＲＮＡ電気穿孔なしのＪｕｒｋａｔ細胞は、ペプチド負荷Ｔ２細胞に応答しない。この例は、標的ペプチド四量体に結合するＴＣＲまたも、機能レベルでそれらのペプチドに対して反応性を示すことを示す。

【図5-2】同上

【図6】ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ質量分析データに基づく、標的類似ペプチド１（ＴＳＰ１）（図６）、ＴＳＰ２（図７）、および実施例４の無関係のペプチド（ＩＰ；図８）のペプチド提示プロファイルを示す。上部：技術的反復測定からの相対ＭＳシグナル強度の中央値が、その上でペプチドが検出された単一ＨＬＡ－Ａ^＊０２正常サンプルの色付きの点としてプロットされている。正常サンプルは、起源の臓器に従ってグループ化されている。箱ひげ図は、複数のサンプルにわたる正規化されたシグナル強度を表し、対数空間で定義されている。箱は、中央値、２５パーセンタイル値、および７５パーセンタイル値を示す。ひげは、下位四分位数の１．５四分位間範囲（ＩＱＲ）内にある最低データポイントまで伸び、上位四分位数の１．５ ＩＱＲ内にある最高データポイントまで伸びる。下部：全ての臓器におけるペプチド検出頻度が、棒グラフで示される。パネルの下の数字は、各臓器について分析されたサンプルの総数のうち、ペプチドが検出されたサンプルの数を示す（全ての臓器にわたる正常なサンプルの場合、Ｎ≧６２８）。ペプチドがサンプル上で検出されたが、技術的理由で定量化され得なかった場合、サンプルは、この検出頻度表示に含まれるが、図の上部に点は示されない。ａｄｉｐｏｓｅ：脂肪組織；ａｄｒｅｎａｌｇｌ：副腎；ｂｌａｄｄｅｒ：膀胱；ｂｌｏｏｄｖｅｓｓ：血管；ｅｓｏｐｈ：食道；ｇａｌｌｂｌ：胆嚢；ｉｎｔｅｓｔ．ｌａ：大腸；ｉｎｔｅｓｔ．ｓｍ：小腸；ｎｅｒｖｅｃｅｎｔ：中枢神経；ｎｅｒｖｅｐｅｒｉｐｈ：末梢神経；ｐａｒａｔｈｙｒ：副甲状腺；ｐｅｒｉｔ：腹膜；ｐｉｔｕｉｔ：下垂体；ｓｋｅｌ．ｍｕｓ：骨格筋。

【図7】同上

【図8】同上

【0012】

選択された配列の一覧
配列番号１：Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８、式中、Ｘ_１～Ｘ_８は、８アミノ酸長の標的ペプチド中のアミノ酸位置であり、Ｘはいずれの場合も任意のアミノ酸であり；
配列番号２：Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９、式中、Ｘ_１～Ｘ_９は、９アミノ酸長の標的ペプチド中のアミノ酸位置であり、Ｘはいずれの場合も任意のアミノ酸であり；
配列番号３：Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０、式中、Ｘ_１～Ｘ_１０は、１０アミノ酸長の標的ペプチド中のアミノ酸位置であり、Ｘはいずれの場合も任意のアミノ酸であり；
配列番号４：Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１、式中、Ｘ_１～Ｘ_１１は、１１アミノ酸長の標的ペプチド中のアミノ酸位置であり、Ｘはいずれの場合も任意のアミノ酸であり；
配列番号５：Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１－Ｘ_１２、式中、Ｘ_１～Ｘ_１２は、１２アミノ酸長の標的ペプチド中のアミノ酸位置であり、Ｘはいずれの場合も任意のアミノ酸である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬が変動してもよいことから、本発明はこれらに限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0014】

本明細書全体を通じて、いくつかの文献が引用されている。本明細書で引用される各文書（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様、説明書などをはじめとする）は、上記または下記を問わず、その内容全体が本明細書に参照により援用される。本明細書のいかなる部分も本発明が、先行発明のおかげでそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される文書のいくつかは、「参照により援用される」として特徴付けられている。このような組み込まれた参考文献の定義または教示と、本明細書に記載されている定義または教示との間に矛盾がある場合、本明細書のテキストが優先される。

【0015】

以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態と共に列挙されているが、それらは、追加的な実施形態を作成するために、任意の方法および任意の数で組み合わせられてもよいものと理解されるべきである。様々に説明された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明される実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明される実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願で説明されている全ての要素の並べ替えおよび組み合わせは、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。

【0016】

定義
本発明を実施するために、別段の指示がない限り、化学、生化学、および組換えＤＮＡ技術の従来法が使用され、これらは、この分野の文献で説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照されたい）。

【0017】

以下に、本発明を特徴付けるために本明細書で頻繁に使用される用語のいくつかの定義が提供される。これらの用語は、本明細書の残りの部分で、その使用の各例において、それぞれ定義された意味と好ましい意味を有する。

【0018】

本明細書および添付の特許請求の範囲の用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容上例外が明記されていない限り、複数の指示対象を含む。

【0019】

「アミノ酸」という用語は、本発明の文脈において、置換または非置換アミノ基、置換または非置換カルボキシ基、および１つまたは複数の側鎖または基、またはこれらの基のいずれかの類似体を含んでなる、任意のモノマー単位を指す。例示的な側鎖としては、例えば、チオール、セレン含有、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。その他の代表的なアミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤を含んでなるアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、その他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用するアミノ酸、光ケージおよび／または光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含んでなるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１つまたは複数の有毒部分を含んでなるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書の用法では「アミノ酸」という用語には、以下の２０個の天然または遺伝的にコード化されたαミノ酸が含まれる：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として解釈されるべきである。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Ｓｔｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２００２）に示されている。セレノシステインおよびピロリシンなどの追加的なアミノ酸もまた、遺伝的にコード化され得る（Ｓｔａｄｔｍａｎ（１９９６）”Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，”Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：８３－１００、およびＩｂｂａ ｅｔ ａｌ．（２００２）”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ，”Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１２（１３）：Ｒ４６４－Ｒ４６６）。「アミノ酸」という用語はまた、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、修飾された側鎖および／または骨格を有する）、およびアミノ酸類似体もまた含む。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）”Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（２４）：８８８２－８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）”Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（２０）：７５６６－７５７１；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１６（９）：６９９－７０６；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）”Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３５）：９６４－９６７；Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）”Ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１４（１２）：９８３－９９１；Ｋｏｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）”Ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ａｍｂｅｒ ａｎｄ ｏｃｈｒｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２５）：１４３１０－１４３１５；Ｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）”Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ａｎ Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ Ｔｏｘｉｃ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１８）：５４１４－５４２５；Ｈａｍａｎｏ－Ｔａｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）”Ａ Ｍｕｔａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔｙｒｏｓｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｕｔｉｌｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｏｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（５１）：４０３２４－４０３２８；およびＢｕｄｉｓａ ｅｔ ａｌ．（２００１）”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｛ｂｅｔａ｝－（ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）ａｌａｎｉｎｅｓ ａｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１０（７）：１２８１－１２９２を参照されたい。アミノ酸はまた、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に一体化させ得る。本明細書の用法では、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。これは、タンパク質と同じ化学（ペプチド）結合を有するが、一般的に長さがより短い。最短のペプチドは、単一のペプチド結合によって連結された２つのアミノ酸からなるジペプチドである。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどもあり得る。典型的には、ペプチドは、最大８、１０、１２、１５、１８または２０アミノ酸長を有する。ペプチドは、環状ペプチドでない限り、アミノ末端とカルボキシル末端を有する。

【0020】

「ウイルス」という用語は、本発明の文脈において、小さな偏性細胞内内寄生体を指し、これは、定義上、保護タンパク質コート、すなわちカプシドに囲まれたＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのどちらかを含有する。ウイルスのゲノムは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）、直鎖または環状であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡからなってもよい。全ゲノムは、１つの核酸分子（単分節ゲノム）またはいくつかの核酸セグメント（多分節ゲノム）のどちらかを占有してもよい。ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくはミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくはアネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）；二本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）；マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくはレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；二本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくはカリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）であり得る。

【0021】

「バクテリオファージ」（または「ファージ」）という用語は、本発明の文脈において、細菌および古細菌に感染して自己複製するウイルスを指す。バクテリオファージは、典型的には細菌である宿主生物に依存して自己複製し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）をカプセル化するタンパク質で構成されるゲノムを宿主生物の細胞質内に注入する。生物工学で使用されるバクテリオファージの顕著な例は、バクテリオファージＴ４ラムダ（Ｔ４λ）ファージ、Ｔ７ファージ、ｆｄ繊維状ファージ、特に繊維状Ｍ１３ファージであり、これらは全て特定の利点と欠点を有する。

【0022】

「ウイルス集団」という用語は、本発明の文脈において、それらの表面上で発現される抗原結合タンパク質をコード化する遺伝情報が異なる、多数のウイルスを指す。したがって、ウイルス集団は、異種抗原結合タンパク質のライブラリを発現し得る。

【0023】

「ファージディスプレイ」または「ファージライブラリ」という用語は、本発明の文脈において、タンパク質相互作用の高スループットスクリーニングに使用されるシステムを指す。簡潔に述べると、目的のタンパク質をコード化する遺伝子をバクテリオファージコートタンパク質遺伝子に挿入し、バクテリオファージに、そのＤＮＡまたはＲＮＡ中の目的のタンパク質をコード化る遺伝子を維持しながら、その表面上にタンパク質を「ディスプレイ」、すなわち表示させる。その結果、遺伝子型と表現型が結びつくことになる。バクテリオファージの表面上に提示されるタンパク質は、引き続いて、その他のタンパク質、ペプチド、またはＤＮＡ配列に対してスクリーニングされ、提示される分子とスクリーニングされる分子との間の相互作用が研究され得る。このような分子は、抗体またはその断片、ＴＣＲまたはその断片、ＢＣＲまたはその断片、またはＣＡＲまたはその断片であり得る。ＴＣＲの断片は、α可変ドメインおよびβ可変ドメインを含んでなってもよい。本発明の文脈における断片は、以下でもまた詳細に定義される。

【0024】

「細胞」という用語は、本発明の文脈において、核および細胞小器官を含み、原生動物、真菌、植物および動物に見いだされ得る真核細胞を指す。動物は、哺乳類細胞を含んでなり得る。哺乳類細胞は、とりわけ、ヒト細胞、マウスまたはラット細胞などの齧歯類細胞、サル細胞、ブタ細胞、またはイヌ細胞を含んでる。真菌細胞は、とりわけ酵母細胞を含んでなる。例えば、酵母表面ディスプレイなどの生物工学で使用される典型的な酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。

【0025】

「酵母表面ディスプレイ」または「酵母ディスプレイ」または「酵母ライブラリ」という用語は、本発明の文脈において、目的の組換えタンパク質を発現し、これらのタンパク質をそれらの細胞壁に組み込む酵母細胞を使用する、タンパク質工学技術を指す。これにより、タンパク質、特に抗体またはその断片、ＴＣＲまたはその断片、ＢＣＲまたはその断片、またはＣＡＲまたはその断片の単離および操作が可能になる。詳細には、酵母表面ディスプレイでは、選択の単位は、目的のタンパク質の数万のコピーで修飾され、そのタンパク質をコード化するプラスミドを保有する酵母細胞である。プラスミドは、ディスプレイと選別のためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と、ＤＮＡ調製および分子生物学のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の間でシャトルされ得る。Ｗｉｔｔｒｕｐグループ（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）によって先駆的に開発された酵母ディスプレイの形態では、各^１０Ｆｎ３変異型は、細胞壁に見られる天然酵母タンパク質であるＡｇａ２ｐとの遺伝子融合体として発現される。Ａｇａ２ｐは、凝集素接合因子である天然酵母のドメインであり；典型的には、それは^１０Ｆｎ３変異型をコード化する配列の上流にクローン化される。さらに、ｃ－ｍｙｃおよびＶ５などのエピトープタグは、^１０Ｆｎ３変異型をコード化する配列のすぐ下流で操作される。誘導されると、交配因子分泌シグナルペプチドは、融合タンパク質を細胞から移出するように指示し；それは、その結合パートナーであるＡｇａ１ｐによって酵母細胞壁の表面上に捕捉され、２つのジスルフィド結合を形成する。その結果、各酵母細胞が、１０，０００～１００，０００コピーの単一^１０Ｆｎ３変異型をディスプレイする培養物が得られる。平均して、変異型の熱安定性が高いほど、酵母表面上のその分子の数が多くなる（Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0026】

「免疫細胞」という用語は、本発明の文脈において、免疫系の細胞を指す。免疫系は、最終的にＢリンパ球、Ｔリンパ球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に分化するリンパ系幹細胞を含んでなる前駆細胞、および最終的に顆粒球と単球、ならびに完全に分化した白血球に分化する骨髄芽細胞などの異なる細胞タイプを含んでなる。分化した白血球は、胸腺、脾臓、骨髄、またはリンパ節由来の細胞であり、顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および単球、マクロファージ、肥満細胞、および樹状細胞の主要なグループに分類され得る。顆粒球はさらに、好中球、好酸球、好塩基球に分類され、血液循環中の細菌、ウイルス、または真菌を貪食する。Ｂリンパ球は、プラズマ細胞とＢメモリー細胞の前駆体である。Ｔ細胞のグループは、調節性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞を含んでなる。Ｔヘルパー細胞はプラズマ細胞とナチュラルキラー細胞を活性化する一方で、調節性Ｔ細胞はＢ細胞およびその他のＴ細胞の機能を阻害するため、免疫応答を遅延させる。Ｔメモリー細胞は長寿命で特異的抗原に対する記憶を保有し、細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍抗原または攻撃された細胞の抗原と相互作用することによって、腫瘍細胞またはウイルスによって攻撃された細胞を認識し殺滅する。Ｔ細胞の例と、それぞれのＴ細胞の特異的表面マーカーによって記述されるそれらの表面表現型を以下の表１に示す（Ｄｏｎｇ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０による）：

【0027】

【表1】

【0028】

「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）という用語は、本発明の文脈において、腫瘍に向かって移動し、腫瘍間質または腫瘍自体にしばしば見いだされ得る、Ｔ細胞およびＢ細胞を指す。ＴＩＬは典型的には、ＡＣＴまたは自系細胞治療で使用されてもよい、白血球の細胞集団を含んでなる。このような治療法は、例えば、様々な臨床試験で、転移性黒色腫の患者において、既に有望な結果を示している（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．；”Ｒｅｃｅｎｔ ｕｐｄａｔｅｓ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１（２），２０１８－６５－７４）。ＡＣＴの文脈にでは、ＴＩＬは、外科的に切除された腫瘍から、または腫瘍断片から分離された単一細胞懸濁液から、生体外で増殖される。ＴＩＬは、例えば、ＩＬ－２などの高用量のサイトカイによって増殖される。次に、最良の腫瘍反応性を示した選択されたＴＩＬ株が、「急速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）でさらに増殖され、これは、典型的に２週間にわたり、抗ＣＤ３活性化を使用する。最終的なＲＥＰ後のＴＩＬが、患者に注入され戻される。このプロセスには、養子移入ＴＩＬに、腫瘍部位を取り囲むのに十分なアクセスを提供するために、内因性リンパ球を枯渇させるための、予備的な化学療法レジメンもまた伴い得る。

【0029】

「免疫細胞富化画分」という用語は、本発明の文脈において、例えば、血液などの天然に存在する細胞集団に由来する細胞集団を指し、その中では、免疫細胞の相対存在量は、天然に存在する細胞混合物におけるそれらの存在量と比較して増加している。健常人対象の１ｍｌの血液は、例えば、４７０～６１０万個（男性）、４２０～５４０万個（女性）の赤血球、４０００～１１，０００個の白血球、および２０万～５０万個の血小板を含んでなる。したがって、血液中の免疫細胞は、血球の総数の０．０６％～０．２５％のみを構成する。したがって、血液の免疫細胞富化画分は、０．２５％を超え、より好ましくは１０％を超え、さらにより好ましくは５０％を超え、さらにより好ましくは８０％を超え、最も好ましくは９０％を超える免疫細胞を含んでなってもよい。免疫細胞富化画分は、免疫細胞の１つまたは複数のサブタイプについて富化されてもよい。例えば、免疫細胞富化画分は、リンパ系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞、またはそれらの組み合わせについて富化されてもよい。通常、免疫細胞富化画分中の免疫細胞は、目的の免疫細胞の表面マーカーに特異的に結合する１つまたは複数の蛍光標識抗体を使用して選択される。Ｔ細胞のグループ内のＴ細胞または細画分を選択するための適切な表面マーカーは、上記の表１に示される。細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ８に特異的に結合する抗体を使用することによって、またはＣＤ８およびＣＤ３に特異的に結合する抗体を使用することによって、選択され得る。

【0030】

「細胞集団」という用語は、本発明の文脈において、均質または不均質であってもよい複数の細胞、すなわち、異なる特徴の細胞の混合物を指す。血液は、異なる細胞の混合物である細胞集団の一例である。均質な細胞集団は、特定のサブタイプの選択によって、またはクローン増殖によって得られ得る。

【0031】

「抗原結合タンパク質」という用語は、本発明の文脈において、抗原に特異的に結合するパラトープ（あるいは「抗原結合部位」と称される）を含んでなる、１つのポリペプチドまたは２つ以上のポリペプチドの複合体を指す。抗原結合タンパク質の例は、一本鎖抗体、一本鎖ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、抗原結合複合体の例は、抗体、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、またはＴＣＲである。

【0032】

本発明の文脈における「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ；キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体としても知られている）は、免疫エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞に任意の特異性を付与した、操作された受容体を指す。細胞は、複合膜受容体分子であるＣＡＲを遺伝的に備えており、標的特異性とＴ細胞活性化の双方を提供する。ＣＡＲの最も一般的な形態は、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ３の膜貫通ドメインおよびエンドドメインとを融合させたものである。ＣＡＲは、細胞外部分の抗体由来の結合ドメインを通じて、Ｔ細胞を所望の細胞標的に標的化し、Ｔ細胞活性化は、標的に遭遇したときに細胞内部分シグナル伝達ドメインを介して行われる。これらの受容体のコード配列の適切な細胞、特にＴ細胞への移入は、一般にレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって促進される。受容体は、異なる起源からのパーツで構成されているため、キメラと称される。

【0033】

「エピトープ」という用語は、本発明の文脈において、抗原の機能的エピトープを指す。機能的エピトープは、抗原結合タンパク質のパラトープと抗原の間の非共有相互作用に寄与する残基、典型的にはアミノ酸または多糖を含んでなる。非共有相互作用は、静電力、ファンデルワールス力、水素結合、および疎水性相互作用を含んでなる。機能的エピトープは、抗原結合タンパク質の構造エピトープを構成する残基のサブグループである。構造エピトープは、抗原結合タンパク質によって覆われる全ての残基、すなわち、抗原結合タンパク質のフットプリントを含んでなる。典型的には、抗体が結合する抗原の機能的エピトープは、４～１０個のアミノ酸を含んでなる。同様に、提示されるＭＨＣであるペプチドの機能的エピトープは、典型的には、４～８個のアミノ酸を含んでなる。

【0034】

「発現」という用語は、本発明の文脈において、タンパク質またはペプチド、特にヒト組織におけるＰＡＩまたはＳＰＡの存在を指す。タンパク質またはペプチドの発現という用語は、細胞のリボソーム機構におけるタンパク質生合成の過程で、その核酸配列からそのアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。発現されたタンパク質は、細胞内または細胞外に、例えば、細胞の表面上に位置し得る。その中でタンパク質が発現されるヒト組織は、健常組織または罹患組織であってもよい。

【0035】

「目的のタンパク質抗原」（ＰＡＩ）という用語は、本発明の文脈において、抗原結合タンパク質のパラトープに特異的に結合するエピトープを含んでなる、タンパク質またはタンパク質の部分またはタンパク質複合体を指す。ＰＡＩは典型的には、天然に存在するタンパク質であり、任意の長さであり得る。ＰＡＩが、少なくとも２５個のアミノ酸を含んでなることが好ましい。したがって、ＰＡＩがＴＣＲに特異的に結合する場合、ＰＡＩの長さは８～１２アミノ酸であることが好ましい。ＰＡＩは、腫瘍関連標的抗原（ＴＡＡ）、ウイルスタンパク質、または細菌タンパク質であってもよい。ＰＡＩは、典型的には、例えば、腫瘍治療において特異的に標的化される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0036】

「ヒト化マウス」という用語は、本発明の文脈において、それらの生物学的機能を発揮する、例えば、それらの生物学的機能に関して無傷である、ヒト遺伝子、細胞、組織および／または臓器を保有する遺伝子改変マウスを指す。典型的には、免疫不全マウスは、宿主免疫を欠くために、異種細胞または組織を比較的容易に受け入れ得るので、ヒト細胞または組織のレシピエントとして使用される。ヒト化マウスの例は、ヌードマウス、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス、ＮＣＧマウス、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγ^ｎｕｌｌ）マウス、またはＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ γ）マウスである。ヒトバージョンの遺伝子をそれぞれのマウス遺伝子座に受け入れるマウスは、「ノックイン」マウスと称される。Ｂ細胞およびＴ細胞は、ヒト化マウスから単離され、本発明の方法で使用され得る。

【0037】

「Ｔ細胞受容体ライブラリ」という用語は、本発明の文脈において、多数の異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質またはその断片を含む、各ＴＣＲタンパク質またはその断片が異なるライブラリを指す。

【0038】

本発明の文脈における「ウイルス抗原ペプチド」は、典型的には罹患細胞である抗原提示細胞の表面上で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるウイルスタンパク質のより短い断片である。ウイルス抗原ペプチドはウイルス起源であり、すなわち、細胞は典型的には、前記ウイルスに感染している。本発明の文脈におけるウイルス抗原ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原ペプチド、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原ペプチド、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原ペプチド、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原ペプチド；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原ペプチド；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原ペプチド、インフルエンザ抗原ペプチド；好ましくはＨＩＶ、ＨＢＶ、インフルエンザ、およびＨＣＭＶ抗原ペプチドからなる群から選択される抗原ペプチドであってもよい。ウイルス抗原ペプチドは、本明細書に記載される方法および実施形態で使用され得て、例えば、下の表２に記載されるようなウイルス抗原ペプチドが挙げられる。一態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用されるウイルス抗原ペプチドは、配列番号６～配列番号８のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、またはそれからなる、少なくとも１つのウイルス抗原ペプチドを含んでなる。

【0039】

【表2】

【0040】

本発明の文脈における「細菌抗原ペプチド」は、典型的には罹患細胞である抗原提示細胞の表面上で、ＭＨＣ分子によって提示される細菌タンパク質のより短い断片である。細菌抗原ペプチドは細菌起源であり、すなわち、細胞は典型的には、細菌に感染している。このような細菌性抗原ペプチドは、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からの感染の状況で発見されている。したがって、本発明の文脈における細菌抗原ペプチドは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原ペプチドであってもよい。

【0041】

「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）という用語は、本発明の文脈において、腫瘍細胞によって優先的または排他的に発現される、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する自己細胞抗原を指す。ＴＡＡは、異常に発現された自己抗原、変異した自己抗原、および腫瘍特異的抗原に大まかに分類され得る。腫瘍細胞によって優先的に発現されるＴＡＡは、正常組織にもまた見られる。しかし、それらの発現は、腫瘍におけるそれらの発現の程度、それらの正常な対応物と比較したそれらのタンパク質構造の変化、またはそれらの腫瘍細胞内のそれらの異常な細胞内局在によって、正常組織の発現とは異なる。本明細書に記載の方法および実施形態で使用され得るＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０、および米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書が挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。さらに、本発明の文脈におけるＴＡＡは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドである。

【0042】

一態様では、本発明の方法によって選択される抗原結合タンパク質は、上に列挙される特許および刊行物の１つまたは複数に記載されているＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。別の態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用されてもよいＴＡＡペプチドは、配列番号９～１６４のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、少なくとも１つのＴＡＡを含む。一態様では、本発明の方法によって選択される抗原結合タンパク質は、ＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞に選択的に結合し、ここで、ＴＡＡペプチドは、配列番号１～１６４のアミノ酸配列を含んでなり、またはそれからなる。さらなるＴＡＡの例は、表３に列挙される。

【0043】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0044】

さらに、本発明の文脈におけるＴＡＡ抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドである。

【0045】

「腫瘍特異的抗原」という用語は、本発明の文脈において、腫瘍細胞上で排他的に発現される抗原を指す。それらとしては、例えば、点突然変異またはフレームシフト変異などの腫瘍細胞における変異によって生じる新抗原が挙げられる。腫瘍特異的抗原の例は、ｐ５３またはＢＣＲ－ＡＢＬである。

【0046】

「ＭＨＣ」という用語は、本発明の文脈において、「主要組織適合遺伝子複合体」という語句句の略語を指す。ＭＨＣは細胞表面受容体の組であり、脊椎動物の変性天然または外来タンパク質に対する獲得免疫を確立する上で必須の役割を有し、それは次に組織内の組織適合性を決定する。ＭＨＣ分子の主な機能は、変性タンパク質または病原体に由来する抗原に結合し、それらを細胞表面上にディスプレイして適切なＴ細胞に認識させることである。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体またはＨＬＡとも称される。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴＣＲを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴＣＲの同定および特性評価は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。

【0047】

「ＭＨＣ－Ｉ」という用語は、本発明の文脈において、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣ－Ｉを指す。ＭＨＣ Ｉ分子は、ＭＨＣ Ｉ重鎖とも称されるα鎖と、β２ミクログロブリン分子を構成するβ鎖とからなる。α鎖は、３つのαドメイン、すなわち、α１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含んでなる。α１およびα２ドメインは、主にペプチドポケットの形成に寄与して、ペプチドリガンドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を生成する。ＭＨＣ－Ｉ典型的には、細胞質ゾル抗原性タンパク質に由来するペプチドに結合するが、それは、ユビキチン化後にプロテアソームによって分解され、引き続いて抗原処理（ＴＡＰ）に関連する特定のトランスポーターを通じて細胞質ゾルルから小胞体（ＥＲ）に輸送される。ＭＣＨＩは、典型的には、８～１２アミノ酸長のペプチドに結合する。

【0048】

「ＭＨＣ－ＩＩ」という用語は、本発明の文脈において、ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＭＨＣ－ＩＩを指す。ＭＨＣ－ＩＩ分子は、α鎖とβ鎖からなり、α鎖は、２つのαドメイン、α１ドメイン、α２ドメインを含んでなり、β鎖は、２つのβドメイン、βドメイン１およびβドメイン２を含んでなるＭＨＣ ＩＩは典型的にはＥＲ中折りたたまれて不変鎖と称されるタンパク質と複合体形成し、次に、後期エンドソームコンパートメントに輸送され、そこで、不変鎖はカテプシンプロテアーゼによって切断され、短い断片は、クラスＩＩ関連不変鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）と称されるＭＨＣ ＩＩのペプチド結合溝に結合したままである。次に、このプレースホルダーペプチドは通常は、エンドサイトーシスコンパートメント内で利用可能なタンパク質分解タンパク質に由来する親和性の高いペプチドと交換される。ＭＨＣ－ＩＩは、典型的には、１０～３０アミノ酸長のペプチド、または１３～２５アミノ酸長のペプチドに結合する。

【0049】

「ＨＬＡ」という用語は、本発明の文脈において、異なるヒト間でアミノ酸配列が異なる分子を指す。しかし、ＨＬＡは、ＨＬＡの国際的に合意された命名法であるＩＭＧＴ命名法によって同定され得る。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は第６染色体の短腕上に位置し、ＨＬＡ－Ａのより大きなα鎖の構成物をコード化する。ＨＬＡ－Ａα鎖の多様性は、ＨＬＡ機能の鍵である。この多様性は、集団の遺伝的多様性を促進する。各ＨＬＡは特定の構造のペプチドに対して異なる親和性を有することから、ＨＬＡの種類が多いほど、細胞表面に「提示」される抗原の種類も多くなる。各個人は、それぞれの親から１種類ずつ、最大２種類のＨＬＡ－Ａを発現し得る。一部の個人は、両親から同一のＨＬＡ－Ａを継承し、個々のＨＬＡの多様性を減少させる。しかし、大多数の個人は、ＨＬＡ－Ａの２つの異なるコピーを受け継ぐ。全てのＨＬＡ群が、同じパターンに従う。換言すれば、全ての人間は、現在１７４０の活性タンパク質をコードする２４３２の既知のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうち、１つまたは２つだけを発現する。ＨＬＡ－Ａ^＊０２は特定のＨＬＡ対立遺伝子を表し、ここで文字Ａは対立遺伝子が属するＨＬＡ遺伝子を表わし、接頭辞「^＊０２接頭辞」はＡ２血清型を示す。ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応では、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できる必要があるだけでなく、特定のＴＣＲを有するＴ細胞によって認識される必要もある。

【0050】

「標的ペプチド」（ＴＰ）という用語は、本発明の文脈において、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）のより短いペプチド、部分または断片を指す。標的ペプチドのアミノ酸配列は、典型的には、８～１２アミノ酸長、８～１１アミノ酸長、または８～１０アミノ酸長を含んでなる。好ましくは、標的ペプチドのアミノ酸配列は、典型的には８～１１アミノ酸長を含んでなる。標的ペプチドは、ＭＨＣ－Ｉ分子またはＭＨＣ－ＩＩ分子に結合してもよい。標的ペプチドがＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ分子に結合するかどうかは、標的ペプチドの天然起源、すなわち、細胞質で合成されてプロテアソームでプロセスされるか、エンドサイトーシスによって吸収され引き続いてプロセスされるかに依存する。さらに、それがＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ分子の結合溝に結合するかどうかは、標的ペプチドの長さに依存する。一例では、８～１２、８～１１、または８～１０アミノ酸長の標的ペプチドは、典型的には、ＭＨＣ－Ｉに結合している。別の例では、標的ペプチドのアミノ酸配列は、１３～２３アミノ酸長、好ましくは１３～１８アミノ酸長を含んでなってもよい。１３～２５または１３～１８アミノ酸長の標的ペプチドは、典型的には、ＭＨＣ－ＩＩに結合している。

【0051】

「抗原複合体」（ＡＣ）と言う用語は、本発明の文脈において担体の表面に、例えば、ＭＨＣまたはそのペプチド結合部を通じて直接的または間接的に結合した抗原、または可溶性多量体化ＭＨＣまたはそのペプチド結合部分を含んでなる、複合体を指す。このような担体は、細胞または合成材料であり得る。抗原が細胞に付着する場合、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくはヒトＡＰＣであってもよい。担体の合成材料は、ビーズまたは粒子、好ましくはマイクロビーズ、微粒子またはナノ粒子であり得る。このようなビーズは、磁性または常磁性ビーズであり得る。ビーズまたは微粒子は通常ポリマーでできており、共役残基対の第１の構成員で、共有結合的にまたは非共有結合的に被覆され得る。共役残基対の第２の構成員は、ＭＨＣまたはそのペプチド結合部分に、共有結合的にまたは非共有結合的に共役している。第１および第２の共役残基の好ましい対は、ストレプトアビジンおよびビオチン構成員を含んでなる。当業者は、共役残基のその他の対を承知している。したがって、好ましい実施形態では、担体は、ビオチン部分を含んでなるＭＨＣ分子またはそのペプチド結合部分の固定化を可能にする、ストレプトアビジンで被覆されてもよい。逆に、ビオチンで被覆された担体は、ストレプトアビジン部分を含んでなるＭＨＣ分子またはそのペプチド結合部分の固定化を可能する。可溶性多量体化ＭＨＣまたはそのペプチド結合部分は、２つ以上のＭＨＣを含んでなってもよく、ここで、それぞれは、共有結合的にまたは非共有結合的に、好ましくは共有結合的に、共役残基対の第３の構成員および共役残基対第４の構成員に共役し、ここで、第４の構成員は、第３の構成員に対して、少なくとも２つの結合部位、好ましくは３、４、５、６、７、または８つの結合部位、特に好ましくは４つの結合部位を有する。ビオチンは、共役残基対の好ましい第３の構成員であり、ストレプトアビジンは、共役残基対の好ましい第４の構成員である。ストレプトアビジンは、ビオチンに対して４つの結合部位を有する。したがって、ビオチンを含んでなるＭＨＣペプチド複合体がストレプトアビジンと接触すると、その中で４つのペプチド負荷ＭＨＣ（またはそのペプチド結合断片）がストレプトアビジンに非共有結合している、可溶性四量体が形成される。したがって、好ましい実施形態では、可溶性多量体化ＭＨＣまたはそのペプチド結合断片は、４つのＭＨＣペプチド複合体を含んでなる複合体であり、ここで、ＭＨＣペプチド複合体のそれぞれは、１つのビオチンに共有結合的に付着し、これは次にストレプトアビジンに非共有結合的に結合する。

【0052】

「共役残基対」という用語は、高親和性で互いに特異的かつ非共有結合的に結合する、２つの実体を指す。好ましくは、Ｋ_ｄは、１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは１０^－１１ｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは１０～１２ｍｏｌ／Ｌ未満、なおもより好ましくは１０^－１３ｍｏｌ／Ｌ未満である。好ましくは、結合対の構成員の少なくとも１つは、５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。このような分子は、ＴＣＲと相互作用するＭＨＣの能力を妨げることなく、ＭＨＣまたはそのペプチド結合断片の１つの鎖に共有結合的に付着し得る。好ましい共役残基対は、ビオチン－ストレプトアビジン、およびビオチン－アビジンである。代案としては、共役残基対の１つの構成員は、ＭＨＣの１つの鎖に融合されたタンパク質であり得る。例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓｔｒｅｐタグのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｔ７タグおよびＮＥタグが挙げられる。対のもう一方の構成員は、それぞれのタンパク質タグ、すなわち、キチン、マルトース、ビオチン、グルタチオン、例えば、Ｎｉマトリックスなどの金属マトリックス）、またはＶ５－、Ｍｙｃ－、ＨＡ－、Ｓｐｏｔ－、Ｔ７－、またはＮＥ－タグに特異的に結合する抗体によって決定される。

【0053】

「類似タンパク質抗原」（ＳＰＡ）という用語は、本発明の文脈において、抗原結合タンパク質のパラトープが結合するエピトープを含んでなる、タンパク質またはタンパク質の部分またはタンパク質複合体を指す。ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩによって決定される。ＳＰＡのアミノ酸配列は、所与のＰＡＩ、すなわち目的のＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なる。それは、ＰＡＩと同時にＳＰＡに結合する、すなわち、ＰＡＩに対して所望の特異性および／または選択性を示さない、抗原結合タンパク質を同定する目的を果たす。このような抗原結合タンパク質は、腫瘍外／オフターゲット毒性を誘発することがある。所与のＰＡＩと抗原結合タンパク質の組み合わせについて、ＳＰＡは次の３つのカテゴリーのいずれかに分類される：
（１）類似アミノ酸配列、同一エピトープ：
ＰＡＩと異なるＳＰＡのアミノ酸が、所与のＰＡＩ特異的抗原結合タンパク質が結合するエピトープに寄与しない場合、抗原結合タンパク質は、ＰＡＩとＳＰＡの双方に同一の親和性で結合する。この特性を有する抗原結合タンパク質は、本発明の方法によって対抗選択されるであろう。
（２）類似アミノ酸配列、類似エピトープ：
ＰＡＩと異なるＳＰＡのアミノ酸の少なくとも１つが、ＰＡＩ特異的抗原結合タンパク質が結合するエピトープに寄与する場合、次に抗原結合タンパク質は、ＰＡＩとＳＰＡに異なる親和性で結合する。ＰＡＩよりもＳＰＡに対して有意に低い結合を示す抗原結合タンパク質が、本発明の方法によって選択されてもよい。この点において有意により低い結合は、ＰＡＩおよびＳＰＡへの結合の違いが、同一濃度のＰＡＩおよびＳＰＡで、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍であることを意味する。
（３）類似アミノ酸配列、異なるエピトープ：
分岐したアミノ酸が、所与のＰＡＩ特異的抗原結合タンパク質が結合するエピトープに寄与する位置にある場合、その抗原結合タンパク質はＳＰＡに全く結合しなくてもよい。この特性を有する抗原結合タンパク質は、本発明の方法によって選択されるであろう。

【0054】

ＳＰＡのアミノ酸配列は、一般に、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に基づいており、これは、このようなタンパク質が、腫瘍患者の健常組織上で発現されてもよいためである。好ましくは、ＳＰＡは、天然に存在するタンパク質またはその断片である。特に、ＳＰＡはＰＡＩと同一種に存在する。したがって、本発明の方法に含まれるＳＰＡは、カテゴリー（１）および（２）の抗原結合タンパク質の同定および逆選択を可能にするアミノ酸配列を有することが望ましい。ＳＰＡは、そのアミノ酸配列がＰＡＩのアミノ酸配列と密接に関連している場合にのみ、不適切な抗原結合タンパク質の逆選択を可能にする可能性が高い。したがって、本発明の方法で使用されるＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の類似性を有することが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、ＳＰＡは、ＰＡＩのアミノ酸配列と１～２０個、より好ましくは２～１０個のアミノ酸が異なる。ＳＰＡ、特に本発明の方法で使用される標的類似ペプチド（ＴＳＰ）は、好ましくは細胞あたり１０を超えるコピー数、好ましくは細胞あたり２０を超えるコピー数、好ましくは細胞あたり５０を超えるコピー数、および好ましくは細胞あたり１００を超えるコピー数で、健常組織上で発現されることが好ましい。発現の相対強度は、蛍光標識された抗原結合タンパク質を用いた健常細胞および罹患細胞のＦＡＣＳ分析、または質量分析をはじめとする、様々な当該技術分野で知られている方法によって判定され得る。遺伝子発現解析はまた、ＲＮＡ配列決定アプローチを使用して実施され得る。本発明の方法で使用されるＳＰＡを選択するための別の基準は、初代正常組織上でのその提示頻度である。頻度は、所与の健常組織、例えば、細胞のＳＰＡの数を定義するコピー数とは対照的に、ＳＰＡがどの程度の頻度で正常組織、すなわち健常組織上で提示されるかを記述する。コピー数と共に、頻度は、所与のＰＡＩのＳＰＡを選択するための重要な基準である。ＰＡＩとの類似性が高いほど、そして正常組織上の提示頻度と細胞あたりのコピー数（ＣｐＣ）が高いほど、ＳＰＡの類似性が高くなる。

【0055】

「標的類似ペプチド」（ＴＳＰ）という用語は、本発明の文脈において、ＳＰＡのより短いペプチド、部分または断片を指す。ＴＳＰのアミノ酸配列は、典型的には、８～１６アミノ酸長を含んでなる。ＴＳＰは、典型的にはＭＨＣ提示型である。ＳＰＡと同様に、ＴＳＰは、ＴＰのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の類似性を有する。ＴＳＰは、典型的には、８～１２、好ましくは８～１１アミノ酸長などの８～１６アミノ酸長を有する。特に、ＴＳＰはＭＨＣ－Ｉに結合するときに、８～１１または８～１２アミノ酸長を有する。別の例では、ＴＳＰはＭＨＣ－ＩＩに結合するときに、典型的には、１３～２５アミノ酸長を有する。ＴＳＰは、上記の類似性スコアを満たす限り、ＴＰと１つまたは複数のアミノ酸が異なっていてもよく、それは以下に説明するように判定されてもよい。したがって、８アミノ酸長のＴＳＰのアミノ酸配列を所与のＴＰと整列させたとき、それは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～８個のアミノ酸を含んでなってもよい。その他のアミノ酸は、ＴＰと同一または異なってもよい。したがって、９アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～９個のアミノ酸を含んでなってもよく；１０アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１０個のアミノ酸を含んでなってもよく；１１アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１１個のアミノ酸を含んでなってもよく；１２アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１２個のアミノ酸を含んでなってもよい。ＴＳＰがＭＨＣ ＩＩに結合している場合、それは典型的には１３～２５アミノ酸長を有し、１３アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１３個のアミノ酸を含んでなってもよく；１４アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１４個のアミノ酸を含んでなってもよく；１５アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１５個のアミノ酸を含んでなってもよく；１６アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１６個のアミノ酸を含んでなってもよく；１７アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１７個のアミノ酸を含んでなってもよく；１８アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１８個のアミノ酸を含んでなってもよく；１９アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～１９個のアミノ酸を含んでなってもよく；２０アミノ酸長のＴＳＰは、ＴＰの対応するアミノ酸に類似した１～２０個のアミノ酸を含んでなってもよい。本発明の方法で使用されるＴＳＰを選択するための別の基準は、初代正常組織上でのその提示頻度である。提示頻度は、所与の健常組織の異なるサンプル上のＴＳＰの数を定義するコピー数とは対照的に、ＴＳＰがどの程度の頻度で正常組織、すなわち健常組織上で提示されるかを記述し、例えば、脂肪組織の１２サンプルのうち６サンプルで特定のＴＳＰが検出された場合、その頻度は５０％である。所与のＴＳＰの提示頻度は、実施例４で使用されるようなＭＳ分析をはじめとする当該技術分野で知られている方法によって判定され得る（３つの異なるＴＳＰの提示頻度を示す、図６～８を参照されたい）。したがって、少なくとも１つの健常組織で少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１つの健常組織で少なくとも２０％。少なくとも１つの健常組織で少なくとも３０％の提示頻度を有するＴＳＰが、本発明の方法で使用されることが好ましい。好ましくは、選択されたＴＳＰは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの健常組織に提示される。これらの組織は、図６および図７で、ＴＳＰ１およびＴＳＰ２の発現について分析されたものから選択されるのが好ましい。

【0056】

コピー数と共に、頻度は、所与のＴＰのＴＳＰを選択するための重要な基準である。ＴＰとの類似性が高ほど、そして正常組織上の提示頻度とＣｐＣが高いほど、ＴＳＰの関連性が高くなる。

【0057】

「無関係の抗原複合体」（ＩＡＣ）という用語は、本発明の文脈において、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなるＡＣを指す。このようなＡＣは、例えば、ＡＰＣ、または可溶性である多量体化ＭＨＣ－ペプチド複合体、または担体上に固定化されたＭＨＣ－ペプチド複合体であり得る。無関係のタンパク質抗原は、以下で定義される。

【0058】

「無関係のタンパク質抗原」（ＩＰＡ）という用語は、本発明の文脈において、選択されたＴＣＲが結合しないタンパク質抗原を指す。ＴＣＲは、それぞれの標的ペプチドの結合についてスクリーニングされる。ＴＣＲがその標的ペプチドに結合すると、所望の免疫反応またはＴ細胞媒介免疫応答が引き起こされる。無関係のペプチドにはスクリーニング中にＴＣＲが結合しないので、このような所望の免疫応答は、無関係のペプチドによって引き起こされないであろう。ＩＰＡは、ハウスキーピング遺伝子によってコード化されるタンパク質であってもよい。典型的には、ＩＰＡは、ＴＰのアミノ酸配列と、少なくとも５０％未満、少なくとも４０％未満、少なくとも３０％未満、少なくとも２０％未満、少なくとも１０％未満の類似性を有する。

【0059】

「無関係のペプチド」（ＩＰ）という用語は、本発明の文脈において、ＩＰＡのより短いペプチド、部分または断片を指す。ＩＰのアミノ酸配列は、典型的には８～１６アミノ酸長を含んでなる。このようなＩＰは、典型的にはＭＨＣ－Ｉに結合している。いくつかの例では、ＩＰがＭＨＣ－ＩＩに結合している場合、ＩＰは１３～２５アミノ酸長を含んでなってもよい。ＭＨＣ－ＩＩに結合している場合、ＩＰはまた、１３～１８アミノ酸長を含んでなってもよい。ＩＰは、ハウスキーピング遺伝子によってコードされてもよい。

【0060】

「ハウスキーピング遺伝子」は、本発明の文脈において、典型的には、基本的な細胞機能の維持に必要とされる構成的遺伝子であり、正常および病態生理学的条件下で生物の全ての細胞で発現される。一部のハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの非病理学的状況で比較的一定の速度で発現するが、その他のハウスキーピング遺伝子の発現は、実験条件によって変動してもよい。ハウスキーピング遺伝子はゲノム内の活性遺伝子の大部分を占めており、それらの発現は明らかに生存に不可欠である。ハウスキーピング遺伝子の発現レベルは、様々な組織の代謝要件を満たすように微調整されている。ハウスキーピング遺伝子の例としては、以下が挙げられる（網羅的ではない）。転写因子、翻訳因子、リプレッサー分子、ＲＮＡスプライシング分子、ＲＮＡ結合タンパク質、リボソームタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質プロセシング遺伝子、熱ショックタンパク質、ヒストン、細胞周期、アポトーシス、発がん遺伝子、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製；例えば、炭水化物代謝、クエン酸サイクル、脂質代謝、アミノ酸代謝に関与する遺伝子などの代謝に関与する遺伝子；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、チトクロームＣオキシダーゼ、ＡＴＰアーゼ、リソソーム、プロテアソーム、リボヌクレアーゼ、チオレダクターゼ、受容体、チャネル、トランスポーター、ＨＬＡ／免疫グロブリン／細胞認識、キナーゼ、細胞骨格、増殖因子、腫瘍壊死因子α。ＩＰＡと同様に、ＩＰは、ＴＰのアミノ酸配列と、少なくとも５０％未満、少なくとも４０％未満、少なくとも３０％未満、少なくとも２０％未満、少なくとも１０％未満、好ましくは少なくとも３０％未満、少なくとも２０％未満、少なくとも１０％未満の類似性を有する。

【0061】

「アミノ酸配列同一性」という用語は、本発明の文脈において、配列同一性の百分率を指し、比較ウィンドウ全体にわたって２つの最適に整列させた配列を比較することによって判定され、ここで、比較ウィンドウ内の配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでなり得る。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウインドウ中の位置総数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。

【0062】

「同一」という用語は、２つ以上のポリペプチドまたは核酸配列の文脈において、同一の、すなわち、アミノ酸または核酸の同一配列を含む２つ以上の配列または部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて、または手動のアライメントと目視検査による測定で、比較ウィンドウ、または指定された領域全体にわたる最大の一致のために比較され、アライメントされた場合に、配列が同一アミノ酸残基の指定された百分率（例えば、指定された領域にわたり、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性）を有する場合、それらは互いに「実質的に同一」である。また、これらの定義はまた、試験配列の相補性も指す。したがって、「少なくとも８０％の配列同一性」という用語は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較に関して、本明細書全体を通して使用される。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチドまたはそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を指す。

【0063】

「配列比較」という用語は、本発明の文脈において、１つの配列が参照配列の役割を果た用し、それに対して試験配列が比較されるプロセスを指す。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力されて、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが一般に使用され、または代案のパラメータが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、標準配列と比較して、試験配列のパーセント配列同一性または類似性を計算する。２つの配列が比較され、配列同一性百分率が計算される比較において参照配列が指定されていない場合、配列同一性は、特に明記されていない限り、比較される２つの配列のうちより長い方を参照して計算される。参照配列が示されている場合、配列同一性は、特に明記されていない限り、配列番号によって示される参照配列の全長に基づいて判定される。

【0064】

配列アラインメントにおいて、「比較ウィンドウ」という用語は、同数の位置を有する配列の連続した位置の参照ストレッチと比較された、配列の連続した位置のストレッチである。好ましくはＴＰであるＰＡＩの全長が、それぞれＳＰＡおよびＴＳＰとのアライメントにおいて、比較ウィンドウとして使用されることが好ましい。ＴＰが例えば、１０アミノ酸長のＭＨＣ Ｉ提示ペプチドである場合、類似性は１０アミノ酸の比較ウィンドウ内で判定される。この場合、１つのアミノ酸の不一致がある９アミノ酸長のＳＰＡは、所与のＴＰに対して８０％の同一性を有する。

【0065】

比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９７０）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗいｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動のアライメントと目視検査によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）実施され得る。パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、またはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。累積アラインメントスコアが増加する限り、ワードヒットは各配列に沿って双方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアの報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、重み行列を用いて累積スコアが計算される。各方向へのワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、最大達成値から数量Ｘだけ低下し；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になり；または、いずれか配列の末端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および双方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期設定として、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２重み行列５０（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、双方の鎖の比較を使用する。

【0066】

２つのアミノ酸配列の「類似性」という用語は、所与の位置にある２つのアミノ酸の関連性を考慮に入れる（例えば、以下の表４を参照されたい）。例えば、ＴＰとＴＳＰなどの２つのアミノ酸配列の類似性は、２つの配列間の類似性の統計解析を遂行するＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて判定され得る（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－８７，１９９３を参照されたい）。このようなアライメントのための好ましい設定は：ワード長３および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２またはＰＭＢＥＣ重み行列（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００９ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）の使用であり、好ましくは類似性の判定には、ＰＭＢＥＣ重み行列が用いられる。これらの行列は、例えば、アミノ酸間の進化的または機能的類似性に基づいて、アミノ酸類似性を定量化するが、これは、物理化学的パラメーターによる類似性と良好に相関する。所与のＴＰ配列のアミノ酸の置換毎に、これらの行列を用いてスコア（１０進値）が計算され得るが、これは、ＴＰ配列のアミノ酸とＴＳＰ配列の置換アミノ酸との類似性を示す。ＴＰ配列内の個々の置換の効果（スコア）を合計することによって、複数の置換が検討され得る。定義上、ＴＳＰで達成され得る最大スコアが、非置換ＴＰ配列によって提供される一方で、ＴＳＰをもたらす置換は、重み行列でペナルティが課せられ、最終的にＴＳＰのスコアが低くなる。ただしこの最大スコアはＴＰの長さとアミノ酸配列に依存する（すなわち、異なるＴＰ配列は異なる最大スコアを有する）。一般的に、アミノ酸配列が長いほど、スコアは高くなる。ただしＴＰのスコアは、それを構成するアミノ酸に割り当てられたスコアに依存する。異なるＴＰ配列の最大スコアの違いを考慮せず、ＴＰを基準としたＴＳＰの類似性を計算および比較できるようにするために、Ｐを基準としたＴＳＰの類似性ＴＳＰのを計算した結果であるそれぞれの１０進値が百分率スコアに変換され、したがって、ＴＰ配列の最大スコアは常に１００％になる。

【0067】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される、類似性の別の尺度は、最少確率和（Ｐ（Ｎ））であり、これは、アミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験アミノ酸と参照アミノ酸との比較における最少確率和が、約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、アミノ酸は参照配列に類似していると見なされる。アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換されている、半保存的、特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間、または芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的な半保存的および保存的置換が、以下の表４に示される。

【0068】

【表4】

【0069】

新規システインが遊離チオールとして残留する場合、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、またはＹからＣへの変化は、半保存的である。さらに、当業者であれば、立体的に要求の厳しい位置にあるグリシンを置換すべきではなく、αらせん状のまたはβシート構造を有するタンパク質の部分に、Ｐが導入されるべきではないことを理解するであろう。

【0070】

「検出可能標識」と言う用語は、本発明の文脈において、標識が発揮する性質または具体的特性により、この異なる分子を選択できるようにすることで、異なる分子または細胞を標識する分子を指す。標識に適格な分子は、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはビーズなどの合成材料、またはその他の適切な材料である。タンパク質については、ビオチン、レポーター酵素、フルオロフォア、磁気標識、放射性同位体などの異なる分子と、標的タンパク質またはペプチドまたはヌクレオチド配列とを共有結合させる、標識ストラテジーがある。単一細胞は、短いＤＮＡまたはＲＮＡバーコード「タグ」を使用して標識され、配列決定実験で同一細胞に由来する読み取りが同定され得る。標識は、例えば、キサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル染料、クマリン、ポルフィン、金属リガンド錯体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレンおよびフタロシアニン、フィコエリトリン（ＳＡ－ＰＥ）、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＳＡ－ＡＰＣ）、またはストレプトアビジン－ブリリアント－バイオレット４２１（ＳＡ－ＢＶ４２１）などの蛍光標識；ＲＮＡバーコードまたはＤＮＡバーコード、または放射性標識であってもよい。放射性標識は、典型的には、１つまたは複数の原子が放射性対応物、すなわち放射性同位体によって置き換えられている分子である。タンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、放射性に標識されてもよい。磁気標識は、例えば、特定の表面抗原に対する抗体で被覆され得る、磁性ビーズまたは磁性ナノ粒子を含んでなってもよい。磁気標識は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）で使用されてもよい。

【0071】

「検出可能に異なる」という用語は、本発明の文脈において、２つの標識が存在するが、それらが発するシグナルのみが異なってもよいシナリオを指す。例えば、２つの細胞は蛍光標識で標識されてもよく、したがって標識自体の特性、すなわち蛍光によって区別することはできない。しかし、一方の細胞に付着した蛍光標識は赤色シグナルを送ってもよく、他方の細胞に付着した蛍光標識は緑色シグナルを送ってもよい。したがって、例示された細胞の２つの標識は、検出可能に異なる。

【0072】

「フローサイトメトリー分析」という用語は、本発明の文脈において、サンプル中の特定の細胞集団または細胞亜集団の化学的および物理的特性の測定を含んでなる選別技術を指す。サンプルは通常、懸濁液であり、典型的にはフルオロフォアを励起するレーザービームと光検出器である、検出装置を通じて、一度に１つの細胞が流れるように調節される。例えば、細胞の流れによって散乱された光などの検出されたシグナルは、細胞、すなわちその構成要素に特徴的である。この技術によって、複数の細胞が短時間で分析され得る。フローサイトメトリーの日常的な用途は、細胞カウント、細胞選別、細胞の特性と機能の判定、例えば、がんなどの疾患の診断、バイオマーカーの検出、または微生物の検出である。一般的なフローサイトメトリー技術は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。ＦＡＣＳ技術は、特定の細胞集団の個々の標識プロファイルに基づいた細胞選別を可能にする、蛍光染料タグまたは標識で標的細胞を標識する能力を利用する。

【0073】

「磁気活性化細胞選別」（ＭＡＣＳ）という用語は、特定の細胞表面抗原に対応する抗体にコンジュゲートされた機能的なミクロ粒子またはナノ粒子を利用する選別技術を指す。磁場勾配の適用下で、磁気的に標的化された細胞は、使用される抗原に関して正の様式または負の様式のどちらかで分離され得る。当業者は、異なる種類の選別分析を良く承知している。

【0074】

「特異的に結合する」という用語は、本発明の文脈において、標的が特異的結合部位と非特異的結合部位を含んでなる場合に、例えば、抗体またはその断片、ＴＣＲまたはその断片などの抗原結合タンパク質またはその断片が、その標的の特異的結合部位に結合することを指す。しかし、密接に関連するタンパク質へのタンパク質結合が避けられない場合、標的への実際の結合は特異的であっても、タンパク質は、意図された標的結合に関して非特異的であると見なされることがある。本発明の抗原結合タンパク質またはその断片は、ＲＴで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたときに、１０^－５Ｍ以下のＫ_ｄで抗原に結合する場合、所与の抗原に特異的に結合すると考えられる。結合部分が特異的に結合する標的の解離定数（Ｋ_ｄ）は、例えば、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくは標的類似ペプチド（ＴＳＰ）などの、抗原結合タンパク質の結合部分またはその断片が特異的に結合しない標的の解離定数（Ｋ_ｄ）の少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７分の１、１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは少なくとも５０分の１、なおもより好ましくは少なくとも１００分の１、２００分の１、５００分の１または１０００分の１である

【0075】

典型的には、所与のＴＰに特異的に結合する本発明の抗原結合タンパク質がＴＣＲまたはその断片である場合、それは、３×１０^－５～１×１０^－７、２×１０^－５～５×１０^－７、１×１０^－５～１×１０^－６ｏｒ５×１０^－６～１×１０^－６の範囲のＫ_ｄを有する。この状況では、抗原結合タンパク質が、同時にＴＰに対して、例えば、ＴＳＰなどの、それに対して抗原結合タンパク質の結合部分が特異的に結合しない標的に対するＫ_ｄの少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７分の１、１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは少なくとも５０分の１、なおもより好ましくは少なくとも１００分の１、２００分の１、５００分の１または１０００分の１であるＫ_ｄを有することが好ましく、したがって、例えば、選択されたＴＣＲは、１×１０^－６のＫ_ＤでＴＰに、１×１０^－５のＫ_ＤでＴＳＰに、結合してもよい。

【0076】

典型的には、所与のＴＰに特異的に結合する本発明の抗原結合タンパク質が、親和性成熟ＴＣＲまたはその断片であるか、またはＴＣＥＲ（登録商標）分子またはその断片などの二重特異性形態の可溶性分子またはその断片である場合、Ｋ_Ｄは、９×１０^－９～１×１０^－１２、８×１０^－９～５×１０^－１２、７×１０^－９～１×１０^－１１、６×１０^－９～２×１０^－１１、５×１０^－９～５×１０^－１１、４×１０^－９～８×１０^－１１、３×１０^－９～１×１０^－１０の範囲である。この状況では、抗原結合タンパク質が、同時にＴＰに対して、例えば、ＴＳＰなどの、それに対して抗原結合タンパク質の結合部分が特異的に結合しない標的に対するＫ_ｄの少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７分の１、１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは少なくとも５０分の１、なおもより好ましくは少なくとも１００分の１、２００分の１、５００分の１または１０００分の１であるＫ_ｄを有することが好ましく、本明細書で「ＴＣＥＲ（登録商標）」分子または「ＴＣＥＲ（登録商標）」と称される二重特異性形態の分子は、典型的には、Ｔ細胞上の表面分子に特異的に結合する第１のポリペプチドと、ＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する第２のポリペプチドとを含んでなる。

【0077】

典型的には、本発明の抗原結合タンパク質が、抗体またはその断片、または所与のＰＡＩに特異的に結合するＢ細胞である場合、Ｋ_Ｄは、９×１０^－９～１×１０^－１２、８×１０^－９～５×１０^－１２、７×１０^－９～１×１０^－１１、６×１０^－９～２×１０^－１１、５×１０^－９～５×１０^－１１、４×１０^－９～８×１０^－１１、３×１０^－９～１×１０^－１０の範囲である。この状況では、抗原結合タンパク質が、同時にＰＡＩに対して、例えばＳＰＡなどの、それに対して抗原結合タンパク質の結合部分が特異的に結合しない標的に対するＫ_ｄの少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、少なくとも７分の１、１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは少なくとも５０分の１、なおもより好ましくは少なくとも１００分の１、２００分の１、５００分の１または１０００分の１であるＫ_ｄを有することが好ましい。

【0078】

場合によっては、特にＴＣＲの文脈において、本発明の抗原結合タンパク質が所与のＴＰに特異的に結合するかどうかは、例えば、ＩＦＮγ－放出アッセイなどのＴＣＲ活性化アッセイにおいて、機能アッセイを用いて決定されるかもしれない。したがって、特異的結合は、ＴＰに対して検出されるシグナルなどの応答が、このようなアッセイでＴＳＰに対して得られる応答、すなわちシグナルの３０％を超え、４０％を超え、５０％を超え、６０％を超え、７０％を超え、８０％を超え、９０％を超え、１００％を超えることで特徴付けられてもよい。

【0079】

「選択的結合」という用語は、本発明の文脈において、好ましくは１つの特異的エピトープのみを選択的に認識または結合し、好ましくは別のエピトープ、ペプチドまたはタンパク質との結合がないか、実質的にない（交差反応性がない）、ＴＣＲまたは抗体などの抗原結合タンパク質の特性を指す。フローサイトメトリーによるエピトープ結合の閾値の評価は、非四量体染色対照を使用して評価され得る。ゲートは、０．０１％未満の細胞がこのゲートに現れるように、非四量体染色対照に応じて設定され得る。このゲートは、目的の四量体で染色された同一ドナーからのサンプルに適用され得る。このゲートに現れる細胞は、目的のエピトープに選択的に結合すると考えられている。

【0080】

「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）という用語は、本発明の文脈において、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質に関連する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質を指す。ＴＣＲはαβおよびγδ形態で存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置とおそらくは機能を有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は、それぞれ２つのポリペプチドを含有し、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のループを含有する。ＴＣＲ遺伝子治療の使用は、いくつかの現在のハードルを克服する。それは、対象（患者）自身のＴ細胞に所望の特異性を与えて、十分な数のＴ細胞を短期間で生成できるようにし、それらの枯渇を回避する。ＴＣＲは強力なＴ細胞（例えば、中央メモリーＴ細胞または幹細胞特性を有するＴ細胞）に形質導入され、それは移入時に良好な持続性、保存、および機能を確実にしてもよい。ＴＣＲ操作Ｔ細胞は、化学療法または照射によってリンパ球減少症になったがん患者に注入され、効率的な生着ができるようにするが、免疫抑制は阻害する。天然α－βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。各α鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と見なされる。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域またはＣ領域は、それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣと称される（Ｌｅｆｒａｎｃ，（２００１），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ａｐｐｅｎｄｉｘ １０）。本明細書でα可変ドメインおよびβ可変ドメイン称される各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つの「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含んでなり、１つはＣＤＲ３と命名された超可変領域である。α可変ドメインＣＤＲは、ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３と称され、β可変ドメインＣＤＲは、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３と称される。それらのフレームワークによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数種類のα鎖可変（Ｖα）領域および数種類のβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖαタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＡＶ番号によって参照され、Ｖβタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＢＶ番号によって参照される（Ｆｏｌｃｈ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（１）：４２－５４；Ｓｃａｖｉｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（２）：８３－９６；ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，（２００１），”Ｔ－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。免疫グロブリン抗体とＴＣＲ遺伝子の詳細については、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標），Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３－２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を参照されたい。従来のＴＣＲ抗原結合部位には、通常、αおよびβ鎖可変領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含んでなる、６つのＣＤＲが含まれ、ここで、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列は、ＭＨＣタンパク質に結合するペプチド抗原の認識および結合に関連し、ＣＤＲ２配列は、ＭＨＣタンパク質の認識および結合に関連する。抗体と類似して、ＴＣＲは、ＣＤＲの間に、すなわち、異なるＴＣＲ間で比較的保存されているＴＣＲα鎖およびβ鎖可変領域の部分に、挿入されたアミノ酸配列であるフレームワーク領域を含んでなる。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ４つのＦＲを有しており、本明細書で、それぞれＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、ＦＲ４－ｂと称される。したがって、α鎖可変ドメインは、このように（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－１）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）と称されてもよく、β鎖可変ドメインは、このように（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）と称されてもよい。

【0081】

「ウイルスまたは細菌によって引き起こされる疾患」はまた、ウイルスまたは細菌感染症と称されてもよい。本発明の文脈において、疾患を引き起こすウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス感染（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から構成される群から選択されてもよい。本発明の文脈において、疾患を引き起こす細菌は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であってもよい。したがって、この細菌によって引き起こされる疾患は結核である。当業者であれば、抗原結合タンパク質が、例えば、ＨＩＶペプチドなどのウイルス抗原ペプチドを標的化する場合、抗原結合タンパク質がＨＩＶの治療に使用されてもよいことを理解するであろう。したがって、ウイルスまたは細菌の抗原性ペプチドＴＡ－Ｃを標的化する抗原結合タンパク質は、前記抗原性ウイルスまたは細菌の抗原性ペプチドがそれに由来する、ウイルスまたは細菌の治療に使用するのに適する。

【0082】

「免疫疾患」という用語は、本発明の文脈において、免疫系によって引き起こされる疾患を指す。「疾患」と言う用語は、組織、臓器、または個体がその機能を効率的に果たせなくなった異常な状態、特に疾患または傷害などの医学的な異常状態を指す。対照的に、異常な状態が存在せず、組織、臓器、または個体に病理学的所見がない場合に、本明細書で健康な組織、臓器、または個体と言及される。健常組織では、細胞のランダムな遊走は見られず、細胞は組織を特徴付ける構造で互いに接着し、その機能を支援する。健常組織には、転移がない。典型的には、必ずしもそうとは限らないが、疾患は、そのような疾患の存在を示す特定の症状または徴候に関連している。したがって、このような症状または徴候の存在は、組織、臓器、または個人が、疾患に罹患していることを示唆してもよい。これらの症状または徴候の変化は、このような疾患の進行を示唆してもよい。疾患の進行は、このような症状または徴候の増加または減少によって特徴付けられ、これは典型的には、疾患の「悪化」または「改善」を示唆してもよい。疾患の「悪化」は、組織、臓器、または生物が、その機能を効率的に果たす能力の低下によって特徴付けられる一方、疾患の「改善」は、典型的には、組織、臓器、または個人が、その機能を効率的に果たす能力の増加によって特徴付けられる。疾患の「発症リスク」のある組織、臓器、個人は、健康な状態にあるが、疾患を発症する可能性がある状態を示す。典型的には、疾患を発症するリスクは、そのような疾患の初期のまたは弱い徴候または症状に関連する。このような場合でも、治療によって疾患の発症がなおも予防されてもよい。疾患の例としては、これらに限定されるものではないが、感染症、外傷性疾患、炎症性疾患、皮膚疾患、内分泌疾患、腸疾患、神経障害、関節疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、および様々なタイプのがんが挙げられる。本明細書で定義される健常組織は、通常、健常細胞を含むか、またはそれからなる。

【0083】

「腫瘍性疾患」という用語は、本発明の文脈において、腫瘍としても知られている、細胞の異常な増殖によって特徴付けられる疾患を指す。腫瘍性疾患は、腫瘍の増殖を引き起こす病状である。悪性腫瘍はがん性であり、緩慢にまたは急速に増殖し、転移または複数の組織および臓器への拡散のリスクを伴い得る。「腫瘍」とは、急速な無制御の細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始した刺激がなくなった後も成長を続ける、異常な細胞または組織のグループを意味する。腫瘍は、正常組織との構造的組織化および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は明瞭な組織の塊を形成しており、良性または悪性のどちらかである。腫瘍性疾患は、がんを引き起こしてもよく、例示的ながんタイプの疾患としては、これらに限定されるものではないが、基底細胞がん腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道がん、網膜芽細胞腫、胃がん、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、胸膜肺芽腫、前立腺がん、咽喉がん、甲状腺がん、および尿道がんが挙げられる。

【0084】

「治療する」または「治療」という用語は、本発明の文脈において、例えば、それを必要とする対象、すなわち、疾患または障害に罹患している対象のための治療的使用を指し、このような疾患、障害または病状の１つまたは複数の症状の進行を逆転、緩和、阻害することを意味する。したがって、治療は、疾患の完全な治癒をもたらす治療だけでなく、疾患の進行を遅らせ、および／または対象の生存を延長する治療も指す。

【0085】

「免疫細胞特異的表面マーカー」という用語は、本発明の文脈において、免疫細胞の同定および分類を助けるためのモノグラムとして機能する、細胞表面抗原を指す。異なるＴ細胞サブタイプを特徴付けるこのようなマーカーの例は、上記の表１に示される。免疫細胞特異的表面マーカーのほとんどは、細胞の原形質膜内の分子または抗原である。これらの分子はマーカーとして機能するだけでなく、重要な機能的役割も有する。

【0086】

「増殖因子」または「分化因子」という用語は、本発明の文脈において同義的に使用され、細胞成長、細胞増殖、および細胞分化を刺激し、複数の細胞プロセスを調節できる分子を指す。増殖因子は通常、タンパク質またはステロイドホルモンである。優勢な分子の例を以下に列挙する（網羅的ではない列挙）。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの増殖因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；インスリン；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）；インターロイキン；ニューレグリン；ニューロトロフィン；Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。

【0087】

「核酸」という用語は、本発明の文脈において、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基、またはその双方の一本鎖または二本鎖オリゴまたはポリマーを指す。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたは２’－デオキシリボースなどであるがこれらに限定されるものではない）、および１～３つのリン酸基からなる。典型的には、核酸は、個々のヌクレオチドモノマー間のリン酸ジエステル結合を通じて形成されるが、本発明の文脈において、核酸という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むがこれらに限定されず、その他の連結体からなる核酸の合成形態も含む（例えば、ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７－１５００，１９９１）。典型的には、核酸は一本鎖または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドからなる。核酸の一本鎖の描写はまた、（少なくとも部分的に）相補鎖の配列を画定する。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の双方の部分を含有してもよい。例示された二本鎖核酸分子は、３’または５’のオーバーハングを有し得て、したがって、それらの全長にわたって完全に二本鎖である必要はなく、または想定もされない。本発明の核酸は、生物学的、生化学的、化学的合成法によって、または増幅法、およびＲＮＡの逆転写法をはじめとするがこれらに限定されるものではない、当技術分野で知られている方法のいずれかによって得られてもよい。核酸という用語は、染色体または染色体のセグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含んでなる。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得て、その長さは特に限定されない。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された任意の配列に加えて、相補的な配列を含んでなりまたはそれをコード化する。

【0088】

本発明の文脈において、「ベクター」という用語は、関心のあるタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、またはポリペプチドと関心のあるタンパク質をコード化するポリヌクレオチドとを含んでなる混合物を指し、この混合物は、細胞内に導入されることができ、またはそれが含んでなるタンパク質および／または核酸を細胞内に導入できる。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターを使用して、例えば、外来性または異種ＤＮＡなどの関心のある遺伝子産物が宿主細胞に導入される。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律複製を容易にする「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有してもよい。外来性ＤＮＡは異種ＤＮＡとして定義され、これはベクター分子を複製し、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコード化し、または導入遺伝子をコード化する、宿主細胞内で天然に見られないＤＮＡである。宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立してまたは同時に自己複製し得て、ベクターおよびその挿入ＤＮＡの複数のコピーが生成され得る。さらに、ベクターは、挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするのに、さもなければ挿入されたＤＮＡをＲＮＡの複数のコピーに複製させるのに、必要な要素もまた含み得る。ベクターは、関心のある遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」をさらに包含してもよい。典型的には、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、またはリプレッサーなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。関心のある１つまたは複数の遺伝子産物をコード化する２つ以上のポリヌクレオチドを含んでなるベクターにおいて、発現は、１つまたは複数の発現制御配列によって一緒にまたは別々に制御されてもよい。より具体的には、ベクターに含まれる各ポリヌクレオチドは、別個の発現制御配列によって制御されてもよく、またはベクターに含まれる全てのポリヌクレオチドは、単一の発現制御配列によって制御されてもよい。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクターに含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成してもよい。一部の発現ベクターは、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含有し、それは発現されたｍＲＮＡの半減期を延長し、および／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳ができるようにする。したがって、挿入されたＤＮＡによってコード化されるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多数の分子が、迅速に合成され得る。このようなベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでなり、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こし、または指示してもよい。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３）などが挙げられる。ヒト抗体Ｃ領域をコード化する遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１）、ｐＳＧ１ β ｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）などが挙げられる。プラスミドのその他の例としては、複製起点を含んでなる自己複製プラスミド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの統合プラスミドが挙げられる。

【0089】

本発明の文脈における「抗原結合部分」または「または抗原結合断片」という用語は、長さが親タンパク質より短いが、親タンパク質の結合特異性および／または選択性に関与する必須アミノ酸配列を依然として含むので、その結合特異性および／または選択性を保持する分子、特にアミノ酸鎖を指す。「抗原結合部分」または「または抗原結合断片」は、以下に概説するように測定された親タンパク質の標的に対するＫ_ｄが、親タンパク質のＫ_ｄよりも、少なくとも１０倍以下高く、５倍以下高く、３倍以下高く、２倍以下高く、またはそれと同一である場合は、結合特異性を保持していると見なされる。ＴＣＲの抗原結合断片は、例えば、α鎖およびβ鎖の可変ドメインであり、抗体の抗原結合部分は、可変の軽鎖および重鎖である。ＴＣＲ、ＢＣＲ、または抗体の抗原結合部分は、α鎖およびβ鎖または軽鎖および重鎖のそれぞれの可変領域内に配置されているＣＤＲである。したがって、例えば、抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、またはそれらの免疫学的に機能的な部分または断片などの抗原結合タンパク質の結合性および／または特異性の評価は、例えば、ＴＣＲとその標的ペプチドとの、または抗体とその抗原との結合親和性測定によって実行され得る。本明細書で使用される「断片」という用語は、天然に存在する断片（例えば、スプライス変異型またはペプチド断片）、ならびに人工的に構築された断片、特に遺伝子技術的手段によって得られる断片を指す。

【0090】

「Ｋ_ｄ」という用語（「ｍｏｌ／Ｌ」で測定される、「Ｍ」と略記されることもある）は、本発明の文脈において、結合部分（例えば、抗体またはその断片）と標的分子（例えば、抗原またはそのエピトープ）との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指す。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ））をはじめとするが、これらに限定されるものではない、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に抗原に緩慢に結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高親和性抗体は一般に抗原により迅速に結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で公知であり、それらのいずれも本発明の目的のために使用され得る。本開示を通して様々な抗原結合タンパク質について示されるＫ_ｄは、ＳＰＲによって室温、すなわち２０℃で測定されている。

【0091】

「Ｂ細胞受容体」（ＢＣＲ）という用語は、Ｂ細胞の表面上に存在する抗原様構造を有する受容体を指す。Ｂ細胞は、その受容体に結合する抗原（その「同族抗原」）との最初の遭遇によって活性化され、細胞は増殖および分化して、抗体分泌プラズマＢ細胞およびメモリーＢ細胞を生じる。ＢＣＲは、生化学的シグナル伝達、および抗原提示細胞との免疫シナプスからの抗原の物理的獲得によって、Ｂ細胞の活性化を制御し、抗原との相互作用時に２つの重要な機能を有する。１つの機能は、受容体のオリゴマー化の変化を伴うシグナル伝達である。２つ目の機能は、抗原の引き続くプロセシングと、ヘルパーＴ細胞へのペプチドの提示のための内部移行を媒介することである。抗原を認識するＢＣＲの部分は、Ｖ、Ｄ、およびＪと称される３つの完全に異なる遺伝子領域で構成され、免疫系に固有の組み合わせプロセスにおいて遺伝子レベルでスプライシングおよび再結合される。１型膜貫通受容体タンパク質を形成する免疫グロブリン分子は、通常、Ｂリンパ球の外表面上に位置する。構造的に、ＢＣＲは、１つのイソタイプ（ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥ）の膜結合免疫グロブリン分子と、シグナル伝達部分であるＡＩｇ－α／Ｉｇ－β（ＣＤ７９）ヘテロダイマーとを含んでなり、ジスルフィド架橋によって連結される。二量体の各構成員は原形質膜に広がり、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を保有する細胞質尾部を有する。

【0092】

本発明の文脈における「抗体」という用語は、膜貫通領域を欠き、したがって血流および体腔に放出され得る、分泌された免疫グロブリンを指す。ヒト抗体は、それらが保有する重鎖に基づいて異なるイソタイプにグループ化される。ギリシャ文字で表記されるヒトＩｇ重鎖には、α、γ、δ、ε、およびμの５つのタイプがある。存在する重鎖のタイプは、抗体のクラスを定義し、すなわち、これらの鎖は、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体に見られ、それぞれが異なる役割を果たし、異なるタイプの抗原に対して適切な免疫応答を指示する。異なる重鎖は、サイズと組成が異なり；およそ４５０個のアミノ酸を含んでなってもよい（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。ＩｇＡは、腸、気道、および泌尿生殖路などの粘膜領域、ならびに唾液、涙、母乳に見られ、病原体によるコロニー形成を防ぐ（Ｕｎｄｅｒｄｏｗｎ ＆ Ｓｃｈｉｆｆ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３８９－４１７）。ＩｇＤは主に、抗原に曝露されていないＢ細胞の抗原受容体として機能し、好塩基球と肥満細胞を活性化して、抗菌因子を産生することに関与する（Ｇｅｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１８：４２９－４３７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：８８９－８９８）。ＩｇＥは、アレルゲンへの結合を介してアレルギー反応に関与し、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンの放出を誘発する。ＩｇＥは寄生虫からの保護にも関与する（Ｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）。ＩｇＧは、侵入する病原体に対する抗体ベースの免疫の大部分を提供し、胎盤を通過して胎児に受動免疫を与えることができる唯一の抗体イソタイプである（Ｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）。ヒトでは、４つの異なるＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、および４）があり、血清中の存在量の順に命名され、ＩｇＧ１が最も豊富であり（約６６％）、ＩｇＧ２（約２３％）、ＩｇＧ３（約７％）、およびＩｇＧ（約４％）がそれに続く。異なるＩｇＧクラスの生物学的プロファイルは、それぞれのヒンジ領域の構造によって決定される。ＩｇＭは、Ｂ細胞の表面に単量体型と、非常に高い結合力を有する分泌型の５量体型で発現される。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前に、Ｂ細胞媒介（体液性）免疫の初期段階で病原体を除外することに関与する（Ｇｅｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１８：４２９－４３７）。抗体は単量体として見られるだけでなく、２つのＩｇ単位の二量体（例えば、ＩｇＡ）、４つのＩｇ単位の四量体（例えば、硬骨魚のＩｇＭ）、または５つのＩｇ単位の五量体（例えば、哺乳類ＩｇＭ）を形成することも知られている。抗体は、典型的には、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を含んでなる４つのポリペプチド鎖から構成され、これらはジスルフィド結合を介して連結され、「Ｙ」字型の高分子に類似している。各鎖はいくつかの免疫グロブリンドメインを含んでなり、そのうちのいくつかは定常ドメインであり、その他は可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、２枚のシートに配置された７～９本の逆平行ストランドの２層サンドイッチからなる。典型的には、抗体の重鎖は４つのＩｇドメインを含んでなり、そのうちの３つは定常（ＣＨドメイン：ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインであり、その１つは可変ドメイン（ＶＨ）である。軽鎖は、典型的には、１つの定常Ｉｇドメイン（ＣＬ）および１つの可変Ｉｇドメイン（ＶＬ）を含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに細分化され得て、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域がその中に散在する。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）をはじめとする、宿主組織または要素との結合を媒介してもよい。抗体という用語はまた、本明細書の用法では、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体も包含する。

【0093】

抗体、ＴＣＲ、またはＢＣＲ、またはＣＡＲの「抗原結合断片」（または「結合部分」または「断片」）という用語は、本明細書の用法では、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体ＴＣＲ、ＢＣＲ、またはＣＡＲのつまたは複数の断片を指す。抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、またはＣＡＲの抗原結合機能は、完全長抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、またはＣＡＲの断片によって実行され得ることが示されている。「抗体、ＢＣＲまたはＣＡＲの抗原結合部分」という用語にに包含される抗体の結合断片の例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片：ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含んでなる二価の断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片：ＶＨおよびＣＨドメインからなる；（ｉｖ）Ｆｖ断片：抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる；（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）：ＶＨドメインからなる；（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｖｉｉ）任意選択的に合成リンカーによって連結されていてもよい、２つ以上の単離ＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖ断片であるＶＬとＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは組換え法を使用して、その中でＶＬおよびＶＨ領域が対合し、その中で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている一価の分子を形成する単一タンパク質鎖になるようにする、合成リンカーによって連結され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。このような一本鎖抗体もまた、抗体、ＢＣＲまたはＣＡＲの「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図される。「ＴＣＲの抗原結合部分」という用語は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の少なくともＣＤＲ１およびＣＤＲ３、好ましくはαおよびβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。これらのＣＤＲは、それらの天然のフレームワーク領域に含まれるのが好ましい一方で、それらはまた、それらがαおよび／またはβ鎖に配置されるのと同様の様式で、それらを互いに配置する別のタンパク質（いわゆるタンパク質スキャフォールド）に含まれてもよい。ＴＣＲの抗原結合部分は、好ましくはα鎖およびβ鎖の可変ドメインを含んでなる。抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、またはＣＡＲの抗原結合断片は、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体タンパク質複合体に含まれ、このような複合体に１つまたは複数の異なる抗原結合特異性を提供し得る。さらに、Ｆｖ断片であるＶＬとＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、その中でＶＬおよびＶＨ領域が対合し、その中で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている一価の分子を形成する単一タンパク質鎖になるようにする、合成リンカーによって連結され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図される。抗体の抗原結合を使用して一価、二価、または多価の結合分子を作成するさらなる形態は、当該技術分野で公知であり、二重特異性抗体、四重特異性抗体、およびナノボディと称される。同様に、ｓｃＦＶの一本鎖ＴＣＲは、リンカーによって連結された１つのタンパク質鎖上のα鎖およびβ鎖の可変ドメインを含んでなる。

【0094】

本明細書の用法では、「対象」という用語は、明細書で同義的に使用され、本発明から利益を得てもよい任意の哺乳類を指す、「個体」、「対象」、または「患者」に関する。特に、「個体」はヒトである。対象は、健常対象であり得る。

【0095】

「それを必要とする対象」という用語は、本発明の文脈において、例えば、増殖性疾患または障害、ウイルスによって引き起こされる疾患、または細菌によって引き起こされる疾患などの疾患に罹患している、または罹患するリスクがある対象を指す。例ば、がんなどのこのような増殖性疾患または障害は、細胞の無制御のおよび／または不適切な増殖を伴う。増殖性障害または疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞における、ＴＡＡの発現、より具体的にはＴＡＡによって特徴付けられる、腫瘍疾患であってもよい。

【0096】

したがって、特に好ましいがんは、ＴＡ陽性がん、特にＴＡＡ陽性がんである。

【0097】

【表5】

【0098】

実施形態
以下では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、相反することが明示されない限り、任意のその他の態様と組み合わされてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であるとして示される任意のその他の特徴または複数の特徴と組み合わされてもよい。

【0099】

免疫療法は、興味深い急速に進歩する分野であり、遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、所望の特異性のＴリンパ球集団を生成し得ることを実証し、抗原特異的Ｔ細胞療法の新しい機会を提供する。全体として、ＴＣＲ修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞の正常な生物学的性質を通じて、多種多様な自己および非自己標的を標的化する能力を有する。しかし、「腫瘍外／オンターゲット」または「腫瘍外／オフターゲット」効果は、免疫関連毒性の極めて望ましくない効果をもたらし得る。ＴＣＲの同定の段階で既に類似タンパク質抗原（類似ペプチド）を含めることによって、本発明者らは、特性評価プロセスの前に交差反応性Ｔ細胞の割合を除外でき、それによってＴＣＲ発見プロセス全体の効率を向上できる。その目的のために、１Ｄ標識または２Ｄ標識された類似ペプチド多量体が染色パネルに含まれている。社内データベースは、本発明者らが、正常なヒト組織上に見られる関連性の高い標的配列類似ペプチドを同定することを可能にした。このような標的配列類似ペプチドは、臨床使用に向けて開発されることが想定されているＴＣＲによって認識された場合、安全上のリスクをもたらす。したがって、本発明者らは、標的類似ペプチドの公共および社内のゲノムデータベース検索と、社内データベースからの健常組織上の実際のＭＳ検出ペプチドの結果とを組み合わせる、社内検索アルゴリズムを開発した。本発明者らは、ＴＣＲ同定の初期に標的類似ペプチドのセットを使用して、交差反応性ＴＣＲの早期の選択解除を可能にする。この目的のために、蛍光色素（ストレプトアビジン）で標識された、ペプチド主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）四量体が、標的ペプチドについて、ならびに少なくとも１つの異なる蛍光色素で区別可能な標的類似ペプチドについて生成される。標的ペプチドならびに類似ペプチドの双方に陽性の細胞は、下流のＴＣＲ同定のためのＴ細胞選別から除外される。

【0100】

この驚くべき発見は、とりわけ、技術に対する優位性を提供する：（ｉ）健常組織上の類似ペプチドとの選択されたＴＣＲの交差反応性の低下；（ｉｉ）選択されたＴＣＲの安全性プロファイルの向上；（ｉｉｉ）標的特異的ＴＣＲの初期段階の選択による、ＴＣＲの効率的かつ迅速な同定と特性評価；（ｖ）選別中の類似ペプチド結合の除外による特異的ＴＣＲ選択；（ｖｉ）オフターゲットおよび腫瘍外細胞傷害性の低下を発揮するＴＣＲ；および（ｖｉｉ）改善された特異的で選択的かつ安全なＴＣＲの提供。

【0101】

本発明の第１の態様は、
（ｉ）細胞集団またはウイルス集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団またはウイルス集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団またはウイルス集団と、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する、少なくとも細胞またはウイルスを選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的および／または選択的に結合する抗原結合タンパク質をその表面上に発現する、細胞またはウイルスを選択するための方法に関し、
ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは検出可能標識Ｂを含んでなり；またはＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｂは、互いに検出可能に異なる。

【0102】

本発明の第１の態様の一実施形態では、細胞は、好ましくは罹患組織上で発現される腫瘍抗原（ＴＰ）のＭＨＣ提示の短鎖ペプチドは、検出可能標識で標識され、健常組織上で発現される類似配列（ＴＳＰ）のペプチドは、検出可能標識で標識されるという逆選択の原理に基づいて選択される。このアプローチで使用される標識は、検出可能に異なる。好ましくはＴ細胞である細胞と、ＴＰおよびＴＳＰとを接触させると、細胞は、ＴＰまたはＴＳＰのどちらかに、またはＴＰとＴＳＰの双方に結合し、または全く結合せず、正の選択基準または負の選択基準のどちらかに基づいて選択される。従来の選別アプローチでは、それぞれの検出可能な細胞シグナルを有する、次の細胞が同定され得る：ＴＰの標識のシグナル、すなわち細胞がＭＨＣ提示ペプチドに結合している場合の目的のペプチドを検出することによって、１つの細胞が検出され得る。別の細胞は、ＴＰの標識、すなわち免疫細胞がＭＨＣ提示ペプチドに結合している場合の目的のペプチドの検出、およびＴＳＰの標識の検出によってシグナル伝達し得る。第３の細胞は、ＴＳＰの標識の検出によってのみシグナル伝達し得る。細胞がＴ細胞である場合、これはＭＨＣ提示ペプチドに結合できる目的のＴＣＲを有する細胞であるため、ＴＰの標識によって検出可能な細胞のみが正に選択される。逆選択（または負の選択）は、次のように説明され得る：２つの標識、すなわちＴＰとＴＳＰの標識によって検出された細胞は、ＴＰへの結合以外にＴＳＰに結合するため、負に選択される。ＴＳＰの標識によってのみ検出される細胞もまた、健常組織上で発現されるＴＳＰにのみ結合するために負に選択され、一般的に、オフターゲットの影響を低下させるためにＴＳＰへの結合は、避けなければならない。多くの場合、所与の細胞と、所与のＰＡＩとの、好ましくはＴＰおよび１つまたは複数のＳＰＡとの、好ましくはＴＳＰとの結合は、全か無かではない。したがって、選択はまた、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、およびＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの結合の相対的差異に基づいてもよい。細胞は、同一濃度のＰＡＩおよびＳＰＡで、それらの結合が、同一濃度のＰＡＩおよびＳＰＡで、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、ａｔｌｅａｓｔ１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍強力であれば、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに特異的に結合すると見なされる。好ましくは、結合は、本発明の方法で使用される１つまたは複数のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのいずれかよりも、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに対して少なくとも１０倍強力である。さらにより好ましくは、結合は少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍強力である。所与の細胞、例えば、Ｔ細胞またはそのＴＣＲ、またはＢ細胞の結合または親和性の強度は、様々なアッセイによって判定され得て、一般にはＴＣＲの解離定数（Ｋ_ｄ）として示される。ただし、本発明の方法の目的のためには、所与のＰＡＩに、好ましくはＴＰおよび１つまたは複数のＳＰＡに、好ましくはＴＳＰに対する、細胞のＫ_ｄの正確な判定は必要でない。相対的結合強度を判定することで十分であり、これは、例えば、その中で、所与のＴＰの蛍光シグナルが１つまたは複数のＴＳＰの蛍光シグナルと比較される、細胞のＦＡＣＳ分析によって判定され得る。このような判定では、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および１つまたは複数のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの相対的なモル量が考慮されなければならない。ＴＰおよびＴＳＰが同一モル量で細胞に添加され、使用されるそれぞれの標識の蛍光強度の違いが考慮される場合、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの等モルベースの場合、細胞は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに特異的に結合し、ＳＰＡよりも、好ましくはＴＳＰよりも、ＰＡＩに、好ましくはＴＰに帰せられる少なくとも１０倍強力な蛍光を示す。当業者は、ゲーティングを適宜適合させることによって、細胞を選択する際に、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の細胞集団と接触するＰＡＩ、好ましくはＴＰ、およびＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのモル比の変化が考慮され得ることを理解している。

【0103】

本発明の第１の態様の一実施形態では、選択された細胞は、異種抗原結合タンパク質を発現する哺乳類細胞、または異種抗原結合タンパク質を発現する酵母細胞である。哺乳類細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、好ましくは、ヒト化マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞、サル細胞、またはイヌ細胞などの任意の哺乳類細胞であり得る。典型的には、哺乳類細胞は、任意の抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。好ましくは、哺乳類細胞はヒト細胞である。特に、哺乳類細胞は、ＴＣＲまたはその断片、またはＢＣＲまたはその断片、またはＣＡＲまたはその断片、または抗体またはその断片などの異種抗原結合タンパク質を発現するように操作される。選択された細胞が異種抗原結合タンパク質を発現する酵母細胞である場合、このような酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞であることが好ましい。特に、酵母細胞は、ＴＣＲまたはその断片、またはＢＣＲまたはその断片、またはＣＡＲまたはその断片、または抗体またはその断片などの異種抗原結合タンパク質を発現するように操作される。

【0104】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、この方法はウイルスを選択する。選択されウイルスが、二本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくはミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＤＮＡウイルス、好ましくはアネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）；二本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）；マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくはレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；二本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、好ましくはカリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択される、任意のウイルスであり得る。より好ましくは、選択されたウイルスはバクテリオファージである。バクテリオファージは、好ましくは、バクテリオファージＴ４ラムダ（Ｔ４λ）ファージ、Ｔ７ファージ、ｆｄ繊維状ファージ、好ましくは繊維状ファージＭ１３からなる群から選択される。例えば、ファージなどの選択されたウイルスは、例えば、連続磁気選別に適した磁気ビーズなどのビーズに結合させ得る。この実施形態では、標識Ａおよび標識Ｂなどの標識は、バーコード標識、好ましくは本明細書中で上に記載されたＲＮＡバーコードまたはＤＮＡバーコードであることが好ましい。

【0105】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、細胞を選択するための方法は、ステップ（ｉ）において細胞集団を提供することを含んでなる。好ましくは、細胞集団は真核細胞を含んでなる。より好ましくは、真核細胞は、異種抗原結合タンパク質のライブラリを発現する哺乳類細胞、または異種抗原結合タンパク質のライブラリを発現する酵母細胞である。したがって、本発明の第１の態様の方法は、例えば、酵母ディスプレイのために使用され得る。

【0106】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ウイルスを選択するための方法は、ステップ（ｉ）においてウイルス集団を提供することを含んでなる。好ましくは、ウイルス集団は、異種抗原結合タンパク質のライブラリを発現するウイルスを含んでなる。好ましい実施形態では、ウイルス集団はバクテリオファージを含んでなり、したがって、本発明の第１の態様の方法は、例えば、ファージディスプレイで使用され得る。

【0107】

本発明の第１の態様の別の実施形態は、
（ｉ）免疫細胞を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する、少なくとも１つの免疫細胞を選択するステップと
を含んでなる、その表面上に抗原結合タンパク質を特異的発現し、および／または目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に選択的に結合する、免疫細胞を選択するための方法に関し、
ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは検出可能標識Ｂを含んでなり；またはＳＰＡと検出可能標識Ｂを含み；
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｂは、互いに検出可能に異なる。

【0108】

本発明の第１の態様の一実施形態では、免疫細胞は、好ましくは罹患組織上で発現される腫瘍抗原（ＴＰ）のＭＨＣ提示の短鎖ペプチドは、検出可能標識で標識され、健常組織上で発現される類似配列（ＴＳＰ）のペプチドは、検出可能標識で標識されるという逆選択の原理に基づいて選択される。このアプローチで使用される標識は、検出可能に異なる。好ましくはＴ細胞である免疫細胞と、ＴＰおよびＴＳＰとを接触させると、免疫細胞は、ＴＰまたはＴＳのどちらかに、またはＴＰとＴＳＰの双方に結合し、または全く結合せず、正の選択基準または負の選択基準のどちらかに基づいて選択される。従来の選別アプローチでは、それぞれの検出可能な細胞シグナルを有する、次の細胞が同定され得る：ＴＰの標識のシグナル、すなわち免疫細胞がＭＨＣ提示ペプチドに結合している場合の目的のペプチドを検出することによって、１つの細胞が検出され得る。別の細胞は、ＴＰの標識、すなわち免疫細胞がＭＨＣ提示ペプチドに結合している場合の目的のペプチドの検出、およびＴＳＰの標識の検出によってシグナル伝達し得る。第３の細胞は、ＴＳＰの標識の検出によってのみシグナル伝達し得る。免疫細胞がＴ細胞である場合、これはＭＨＣ提示ペプチドに結合できる目的のＴＣＲを有する細胞であるため、ＴＰの標識によって検出可能な細胞のみが正に選択される。逆選択（または負の選択）は、次のように説明され得る：２つの標識、すなわちＴＰとＴＳＰの標識によって検出された細胞は、ＴＰへの結合以外にＴＳＰに結合するため、負に選択される。ＴＳＰの標識によってのみ検出される細胞もまた、健常組織上で発現されるＴＳＰにのみ結合するために負に選択され、一般的に、オフターゲットの影響を低下させるためにＴＳＰへの結合は避けなければならない。多くの場合、所与の免疫細胞と、所与のＰＡＩとの、好ましくはＴＰおよび１つまたは複数のＳＰＡとの、好ましくはＴＳＰとの結合は、全か無かではない。したがって、選択はまた、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、およびＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの結合の相対的差異に基づいてもよい。免疫細胞は、同一濃度のＰＡＩおよびＳＰＡで、それらの結合が、同一濃度のＰＡＩおよびＳＰＡで、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、ａｔｌｅａｓｔ１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍強力であれば、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに特異的に結合すると見なされる。好ましくは、結合は、本発明の方法で使用される１つまたは複数のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのいずれかよりも、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに対して少なくとも１０倍強力である。さらにより好ましくは、結合は少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍強力である。例えば、Ｔ細胞およびそのＴＣＲなどの所与の免疫細胞の結合または親和性の強度は、様々なアッセイによって判定され得て、一般にはＴＣＲの解離定数（Ｋ_ｄ）として示される。ただし、本発明の方法の目的のためには、所与のＰＡＩに、好ましくはＴＰおよび１つまたは複数のＳＰＡに、好ましくはＴＳＰに対する、免疫細胞のＫ_ｄの正確な判定は必要でない。相対的結合強度を判定することで十分であり、これは、例えば、その中で、所与のＴＰの蛍光シグナルが１つまたは複数のＴＳＰの蛍光シグナルと比較される、免疫細胞のＦＡＣＳ分析によって判定され得る。このような判定では、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および１つまたは複数のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの相対的なモル量が考慮されなければならない。ＴＰおよびＴＳＰが同一モル量で免疫細胞に添加され、使用されるそれぞれの標識の蛍光強度の違いが考慮される場合、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰの等モルベースの場合、免疫細胞は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰに特異的に結合し、ＳＰＡよりも、好ましくはＴＳＰよりも、ＰＡＩに、好ましくはＴＰに帰せられる少なくとも１０倍強力な蛍光を示す。当業者は、ゲーティングを適宜適合させることによって、細胞を選択する際に、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の細胞集団と接触するＰＡＩ、好ましくはＴＰ、およびＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのモル比の変化が考慮され得ることを理解している。

【0109】

一実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第３の抗原複合体（第３のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第４の抗原複合体（第４のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第５の抗原複合体（第５のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第６の抗原複合体（第６のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第７の抗原複合体（第７のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第８の抗原複合体（第８のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第９の抗原複合体（第９のＡＣ）、ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる、少なくとも第５の抗原複合体（第１０のＡＣ）と接触される。したがって、１０個以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、９つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、８つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、７つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、６つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、５つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、４つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、３つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、２つ以下のＳＰＡ、好ましくはＴＳＰが使用され、または１つ以下のＳＰＡ、好ましくは１つのＴＳＰが使用されることが好ましい。したがって、本発明の方法では、１～１０個の異なるＴＳＰ、好ましくは２～８つの異なるＴＳＰ、より好ましくは３～５つの異なるＴＳＰが使用されることが好ましい。なおもより好ましい実施形態では、３つのＴＳＰが使用される。

【0110】

一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、免疫細胞を選択する。好ましくはこの免疫細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ４Ｔ細胞である。なおもより好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８Ｔ細胞である。シグナル伝達ドメインは、好ましくはＣＤ３を含んでなる。本発明の第１の態様の別の実施形態では、免疫細胞は、その表面上に抗原結合タンパク質を発現する。選択された免疫細胞がＴＣＲである場合、抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞またはその抗原結合断片であることが好ましい。選択された免疫細胞がＢＣＲである場合、抗原結合タンパク質は、Ｂ細胞またはその抗原結合断片であることが好ましい。このような抗原認識または抗原結合部位は、好ましくは一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、好ましくはＴＡＡであるＰＡＩを標的化する。共刺激ドメインは、好ましくはＣＤ２８または４－１ ＢＢを含んでなる。シグナル伝達ドメインは、好ましくはＣＤ３を含んでなる。選択された免疫細胞がＣＡＲである場合、抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞またはその抗原結合断片であることもまた好ましい。

【0111】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、免疫細胞を選択するための方法は、ステップ（ｉ）において、免疫細胞を含む細胞集団を提供することを含んでなる。免疫細胞を含んでなる細胞集団は、健常対象の末梢血に由来する。別の実施形態では、細胞集団は、罹患対象の末梢血に由来する免疫細胞を含んでなる。好ましくは、免疫細胞を含んでなる細胞集団は、健常対象または罹患対象の末梢血の免疫細胞富化画分に由来する。好ましくは、免疫細胞富化画分は、幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはプラズマ細胞に富む。免疫細胞富化画分が、ＣＤ４Ｔ細胞および／またはＣＤ８Ｔ細胞に富んでいることがなおもより好ましい。別の実施形態では、免疫細胞を含んでなる細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＴＣＲライブラリに由来し得る。好ましくは、ＴＣＲライブラリは、多数の異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質またはその断片を含み、ここで、各ＴＣＲタンパク質またはその断片は異なる。

【0112】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、免疫細胞富化画分中の免疫細胞は、１つまたは複数の免疫細胞特異的表面マーカーを検出可能に標識することによって選択される。免疫細胞表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ１９からなる群から選択されることが好ましい。

【0113】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、さらなるステップにおいて、増殖因子および／またはサイトカインインの存在下でインキュベートされ得る。好ましくは、サイトカインはインターロイキンである。より好ましくは、インターロイキンは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３からなる群から選択される。最も好ましくは、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１と共にインキュベートされる。

【0114】

別の実施形態では、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルスタンパク質、または細菌タンパク質である。ＰＡＩが標的ペプチド、すなわちＰＡＩのより短い断片である場合、標的ペプチドはウイルス抗原ペプチドまたは細菌抗原ペプチドであることが好ましい。本発明の第１の態様の別の実施形態では、罹患対象は、免疫疾患、腫瘍性疾患、ウイルスによって引き起こされる疾患、または細菌によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。好ましくは腫瘍性疾患はがんである。好ましくは、ウイルスによって引き起こされる疾患はウイルス感染症であり；細菌によって引き起こされる疾患は細菌感染症である。好ましくは、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＣＭＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。より好ましくはウイルス感染は、ＨＩＶによって引き起こされる。好ましくは、細菌感染は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる。このような疾患は、結核である。

【0115】

第１の態様の別の好ましい実施形態では、方法は、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、またはＰＡＩおよび検出可能標識Ａとを接触させるステップを含んでなる。ＰＡＩおよび標識Ａを含んでなる第１のＡＣは、好ましくは抗原提示細胞である。別の好ましい実施形態では、第１のＡＣは、粒子、ＰＡＩ、および検出可能標識Ａを含んでなる複合体である。より好ましくは、粒子はナノビーズまたはマイクロビーズである。ＭＨＣ分子が、ナノビーズまたはマイクロビーズに連結されていることもまた好ましい。別の好ましい実施形態では、第１のＡＣは、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａからなる。別の実施形態では、第１のＡＣは、粒子、ＳＰＡ、および検出可能標識Ｂを含んでなる複合体である。より好ましくは、粒子はナノビーズまたはマイクロビーズである。ＭＨＣ分子が、ナノビーズまたはマイクロビーズに連結されていることもまた好ましい。別の好ましい実施形態では、第１のＡＣは、ＳＰＡおよび検出可能標識Ｂからなる。

【0116】

代案としては、ＰＡＩは検出可能標識を含んでなってもよい。ＰＡＩがアミノ酸鎖であり、標識がこのアミノ酸鎖に共有結合している場合、これは好ましい実施形態である。例は、ＧＦＰまたはＥＧＦＰとしての蛍光標識または蛍光タンパク質である。後者の場合、蛍光タンパク質がペプチド結合によってＰＡＩに連結されていることが好ましい。

【0117】

別の好ましい実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、細胞集団と、さらなるＰＡＩおよびさらなる検出可能標識を含んでなるさらなるＡＣとを接触させるステップ、およびさらなるＳＰＡおよびさらなる検出可能標識を含んでなるさらなるＡＣとを接触させるステップの１つまたは複数をさらに含んでなる。さらなるＰＡＩと検出可能標識Ｃを含んでなる第３のＡＣと、さらなるＳＰＡと検出可能標識Ｄを含んでなる第４のＡＣとを使用することで、いわゆる２Ｄ多量体多重化（２ＤＭＭ）アプローチを反映し、細胞を非常に節約しながら高感度（０．０００１％）で特定の希少細胞を検出できるようになる。特異性毎に異なる蛍光色素で標識された２つの多量体（ペプチドＭＨＣ）により、９種の異なる蛍光色素を使用して、１つのサンプル中で最大３６の異なる特異性の同定が可能になる。好ましい一実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩと検出可能標識Ｃ（これは、細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと検出可能に異なる）とを含んでなる、第３の抗原複合体（第３のＡＣ）と接触される。少なくとも検出可能標識Ａと検出可能に異なり、検出可能標識Ｄが存在する場合は好ましくは少なくとも検出可能標識Ａおよび検出可能標識Ｄと検出可能に異なる。ステップ（ｉ）の細胞集団が、ＰＡＩと検出可能標識Ｄ（これは、細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと検出可能に異なる）とを含んでなる、第４の抗原複合体（第４のＡＣ）と接触される場合、検出可能標識Ｄが存在する。検出可能標識Ｄは、好ましくは少なくとも検出可能標識Ａとは検出可能に異なる。検出可能標識Ｄが、少なくとも検出可能標識Ａおよび検出可能標識Ｃとは検出可能に異なることもまた好ましい。一実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＳＰＡと検出可能標識Ｅ（これは、細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと検出可能に異なる）とを含んでなる、第５の抗原複合体（第５のＡＣ）と接触される。標識Ｅは、少なくとも検出可能標識Ｂとは検出可能に異なることが好ましい。検出可能標識Ｆが存在する場合、検出可能標識Ｅは、少なくとも検出可能標識Ｂおよび検出可能標識Ｆとは検出可能に異なることが好ましい（６）。ステップ（ｉ）の細胞集団が、ＳＰＡと検出可能標識Ｆ（これは、細胞集団と接触されるその他のＡＣのその他の検出可能標識の１つまたは複数または全てと検出可能に異なる）とを含んでなる、第６の抗原複合体（第６のＡＣ）とさらに接触される場合、検出可能標識Ｆが存在する。標識Ｆは、少なくとも検出可能標識Ｂとは検出可能に異なることが好ましい。検出可能標識Ｆが、少なくとも検出可能標識Ｂおよび検出可能標識Ｅとは検出可能に異なることもまた好ましい。

【0118】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなる）；および１～１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、好ましくは２～４、最も好ましくは２つのさらなる抗原複合体（ＡＣ）（それぞれは、第２のＡＣのＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なる、異なるＳＰＡ、好ましくは異なるＴＳＰを含んでなり、それぞれのさらなるＡＣは、１つまたは複数の標識を含んでなり、１つまたは複数の標識は、第２のＡＣの１つまたは複数の標識と検出可能に異なる）と接触される。第１のＡＣは、第２のＡＣの１つまたは複数の標識およびさらなるＡＣの１つまたは複数の標識と検出可能に異なる、さらなる第２の標識を含んでなることが好ましい。細胞集団がＴ細胞集団であることもまた好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0119】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、検出可能標識Ｂを含んでなる）；および１～１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、好ましくは２～４、最も好ましくは２つのさらなる抗原複合体（ＡＣ）（それぞれは、第２のＡＣのＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なる、異なるＳＰＡ、好ましくは異なるＴＳＰを含んでなり、それぞれのさらなるＡＣは、１つまたは複数の標識を含んでなり、１つまたは複数の標識は、第２のＡＣの１つまたは複数の標識と同一である）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることもまた好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0120】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなり、第１のＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、第２のＡＣは、同一の少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含む）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることが好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0121】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）、（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなり、第１のＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、第２のＡＣは、異なる少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含む）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることが好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0122】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなり、第１のＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、第２のＡＣは、同一の少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含む）と接触され、ステップ（ｉ）の細胞集団は、１つまたは複数のさらなる抗原複合体（ＡＣ）（それぞれは、第２のＡＣのＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なるＳＰＡを含んでなり、１つまたは複数のさらなるＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり；少なくとも１つのさらなる標識が、第１のＡＣを第２のＡＣおよび１つまたは複数のさらなるＡＣから区別することを可能にするように選択される）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることが好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0123】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなり、第１のＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、第２のＡＣは、異なる少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含む）と接触され、ステップ（ｉ）の細胞集団は、１つまたは複数のさらなる抗原複合体（ＡＣ）（それぞれは、第２のＡＣのＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なるＳＰＡを含んでなり、１つまたは複数のさらなるＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり；少なくとも１つのさらなる標識が、第１のＡＣを第２のＡＣおよび１つまたは複数のさらなるＡＣから区別することを可能にするように選択される）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることが好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0124】

別の実施形態では、ステップ（ｉ）の細胞集団は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰ、および検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）；および類似タンパク質抗原（ＳＰＡ）、好ましくはＴＳＰを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）（ＳＰＡ、好ましくはＴＳＰのアミノ酸配列は、ＰＡＩ、好ましくはＴＰのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、第２のＡＣは、標識Ａと検出可能に異なる検出可能標識Ｂを含んでなり、第１のＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり、第２のＡＣは、同一の少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含む）と接触され、ステップ（ｉ）の細胞集団は、１～１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、好ましくは２～４、より好ましくは２つのさらなる抗原複合体（ＡＣ）（それぞれは、第２のＡＣのＳＰＡのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸配列が異なる、異なるＳＰＡ、好ましくは異なるを含んでなり、１つまたは複数のさらなるＡＣは、少なくとも１つのさらなる検出可能標識を含んでなり；少なくとも１つのさらなる標識が、第１のＡＣを第２のＡＣおよび１つまたは複数のさらなるＡＣから区別することを可能にするように選択される）と接触される。細胞集団がＴ細胞集団であることが好ましい。第１のＡＣに特異的および／または選択的に結合する選択された免疫細胞が、Ｔ細胞であることがさらに好ましい。ＰＡＩに特異的および／または選択的に結合する、選択されたＴ細胞の表面上の抗原結合タンパク質がＴＣＲであることもまた好ましい。

【0125】

上記の実施形態のそれぞれにおいて、ＳＰＡのそれぞれ、特にＴＳＰのそれぞれは、ＰＡＩのアミノ酸配列、特にＴＰのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の類似性を有することが好ましい。

【0126】

別の実施形態では、検出可能標識が提供される。当業者は、目的のタンパク質抗原、標的ペプチド、類似タンパク質抗原または目的の標的類似ペプチドをどのように標識するかを良く承知している。上記のＡ～Ｆで指定された検出可能標識は、磁気標識、蛍光標識、ＲＮＡ－バーコード；ＤＮＡバーコード；または放射性標識からなる群から独立して選択される。好ましくは磁気標識は、例えば、特定の表面抗原に対する抗体で被覆され得る、磁性ビーズまたは磁性ナノ粒子を含んでなってもよい。磁気標識は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）で使用されてもよい。好ましくは、検出可能標識は、キサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル染料、クマリン、ポルフィン、金属リガンド錯体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレン、およびフタロシアニンからなる群から選択される、蛍光標識である。検出可能標識Ａ～Ｆの蛍光標識として、フィコエリスリン（ＳＡ－ＰＥ）、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＳＡ－ＡＰＣ）、ストレプトアビジン－ブリリアント－バイオレット４２１（ＳＡ－ＢＶ４２１）の使用もまた好ましい。別の好ましい実施形態では、第１のＡＣは、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩとＰＡＩとの複合体であり、ＰＡＩは、標的ペプチド（ＴＰ）である。ＴＰがＴＡＡであることが好ましい。それに加えてまたは代案として、第２のＡＣはＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩとＳＰＡとの複合体であり、ＳＰＡは標的類似ペプチド（ＴＳＰ）である。さらなる好ましい実施形態では、第１のＡＣおよび第２のＡＣは、可溶性の多量体化ＭＨＣ－ペプチド複合体である。

【0127】

ＰＡＩとＳＰＡの機能的な相違点と類似点：
上述したように、好ましくは健常人組織で発現されるＳＰＡとは対照的に、ＰＡＩは好ましくは罹患組織上で発現され、したがって健常組織上の発現に基づいて選択される。本発明者らは、健常組織上で提示されることが以前に認められたペプチドを含んでなる、大規模な免疫ペプチドームデータベースを含む、社内の高スループット技術プラットフォーム（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ）を開発した。ＳＰＡは、好ましくはＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ起源からのものであり、すなわち、ＳＰＡはそれぞれのＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ分子に結合できる。これは、免疫細胞がＴ細胞であり、Ｔ細胞がＨＬＡ提示ＳＰＡを認識できるように、ＨＬＡ分子に結合したＴ細胞にＳＰＡが提示される場合に必要である。したがって、ＰＡＩと同じＨＬＡアロタイプ上で提示されることが知られているＳＰＡを選択することが好ましい。好ましくは、細胞あたり１０コピーを超え、好ましくは細胞あたり２０コピーを超え、好ましくは細胞あたり５０コピーを超え、さらにより好ましくは細胞あたり１００コピーを超えて、健常組織の細胞上で発現されるＳＰＡが、本発明の方法で使用される。このような比較的豊富なＳＰＡに結合することができ、同時にＰＡＩに結合することができるＴ細胞の逆選択は、オフターゲット／腫瘍外毒性を回避するために望ましい。

【0128】

ＴＳＰの数：
Ｔ細胞のＴＣＲは、所与のＴＰ内のアミノ酸のサブグループ、すなわちＴＣＲのエピトープを認識する。したがって、あまりにも多くの異なるＴＳＰを使用した場合、主にまたは排他的にＴＰに結合するが、ＴＳＰには結合しないＴＣＲが、存在しない可能性が高い。したがって、１０個以下のＴＳＰが使用され、９つ以下のＴＳＰが使用され、つ以下のＴＳＰが使用され、７つ以下のＴＳＰが使用され、６つ以下のＴＳＰが使用され、５つ以下のＴＳＰが使用され、４つ以下のＴＳＰが使用され、３つ以下のＴＳＰが使用され、２つ以下のＴＳＰが使用され、１つ以下のＴＳＰが使用されることが好ましい。したがって、本発明の方法では、１～１０個の異なるＴＳＰ、２～８つの異なるＴＳＰ、３～５つの異なるＴＳＰ、または１～３つの異なるＴＳＰが使用されることが好ましい。好ましい実施形態では、３つのＴＳＰが使用される。ＴＳＰはＳＰＡの断片であり、上記のＳＰＡで概説したのと同じ基準に基づいて選択される。同様に、健常組織織で強く発現されるＴＳＰが選択される。したがって、本発明の方法に含まれるべきＴＳＰは、上記で定義されたように高い配列類似性を有するものであり、すなわち、ＳＰＡのそれぞれ、特にＴＳＰのそれぞれが、ＰＡＩのアミノ酸配列、特にＴＰのアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の類似性を有することが好ましく、それは健常組織上で最も高い発現を示す。

【0129】

ＴＰおよびＴＳＰの長さ：
一実施形態では、ＴＰは８～１１アミノ酸長を含んでなる。ＴＰは、１２個のアミノ酸を含んでなってもよい。一実施形態では、ＴＰは１３～２５アミノ酸長を含んでなる。別の実施形態では、ＴＰは１３～１８アミノ酸長を含んでなる。典型的には、ＴＳＰは、所与のＴＰと同じ長さになるように選択される。しかし、代案としては、ＴＳＰの長さは、ＴＰよりも１～３アミノ酸だけ長くてもまたは短くてもよい。その中でＴＰがＭＨＣ提示される実施形態では、１つまたは複数のＴＳＰの長さは、それらがＭＨＣ提示されることもできるように選択される。例えば、ＴＰが８アミノ酸長を含んでなる場合、ＴＳＰは、７アミノ酸長以下または８アミノ酸長以上のどちらかを有することが好ましい。より好ましくは、異なるアミノ酸長の配列を含んでなるＴＳＰの混合物が使用される。ＴＰがＭＨＣ－Ｉに結合している実施形態では、ＴＰは８～１２アミノ酸長を含んでなる。ＴＰがＭＨＣ－Ｉに結合している別の実施形態では、ＴＰは８～１１アミノ酸長を含んでなる。ＴＰがＭＨＣ－Ｉに結合している実施形態では、ＴＰは８～１０アミノ酸長を含んでなる。ＴＰがＭＨＣ－ＩＩに結合している実施形態では、ＴＰは１３～２３アミノ酸長を含んでなる。ＴＰがＭＨＣ－ＩＩに結合している好ましい実施形態では、ＴＰは１３～１８アミノ酸長を含んでなる。

【0130】

ＴＰとＴＳＰの構造の違い／類似性：
別の実施形態では、ＴＳＰは、ＴＰとの高い配列類似性（類似性ＢＬＡＳＴ検索）に基づいて、健常組織提示ＨＬＡ結合ペプチドのＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベースから選択される。ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベースは、健常組織または罹患組織上で異なるＨＬＡアロタイプによって提示されるペプチドを含んでなる。ＴＳＰとＴＰが、同一ＨＬＡアロタイプによって提示されることが好ましい。ＴＳＰおよびＴＰを提示するＨＬＡアロタイプは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｋ、ＨＬＡ－Ｌからなる群から選択され得る。好ましくはＨＬＡ－Ａタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、およびＨＬＡ－Ａ１１からなる群から選択される。好ましいＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１；ＨＬＡ－Ａ^＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０３：０１またはＨＬＡ－Ａ^＊２４：０２である。好ましいＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７：０２；ＨＬＡ－Ｂ^＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ^＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ^＊３５：０１またはＨＬＡ－Ｂ^＊４４：０５である。

【0131】

一般に、上に列挙されるＨＬＡアロタイプのほとんどでは、所与のＭＨＣ提示ペプチドの２番目のアミノ酸（Ｎ末端から数える場合）およびＣ末端アミノ酸は、そのペプチドに特異的に結合するＴＣＲによって認識される、そのペプチドのエピトープに含まれない。

【0132】

別の実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は８～１６アミノ酸長を有し、ＴＰは８アミノ酸長を有し、ＴＳＰのアミノ酸配列は、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_８は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３、およびＸ_７、およびＸ_８は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_７およびＸ_８（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_６は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で、
ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８（配列番号１）
と異なる。

【0133】

好ましい実施形態では、位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_８は、ＴＰと比較して同一である）は、ＴＳＰにおいて変異する。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３、およびＸ_７、およびＸ_８は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、ＴＳＰ中の位置Ｘ_７およびＸ_８は変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_６はＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、ＴＳＰ中の位置Ｘ_７およびＸ_８は変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_６はＴＰと同一である。

【0134】

別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｉｉ）のＴＳＰ混合物、すなわち、異なる変異パターンを有するＴＳＰが、本発明の第１の態様の方法で使用される。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｉｉ）のＴＳＰ混合物、すなわち、変異パターンが異なり、アミノ酸配列の長さが異なるＴＳＰが使用される。このようなＴＳＰの混合物の使用は、ＴＰに結合する免疫細胞の迅速かつ効率的な正の選択と、１つまたは複数のＴＳＰに結合する免疫細胞の負の選択とを可能にする。

【0135】

別の好ましい実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は８～１６アミノ酸長を有し、ＴＰは９アミノ酸長を有し、ＴＳＰのアミノ酸配列は、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_９は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_９は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_９は、ＴＰと同一である）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_６は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で、
ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９（配列番号２）
と異なる。

【0136】

好ましい実施形態では、位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_９は、ＴＰと比較して同一である）は、ＴＳＰにおいて変異する。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６、およびＸ_７はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３、および位置Ｘ_８、およびＸ_９は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_７～Ｘ_９はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_６はＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、ＴＳＰ中の位置Ｘ_７～Ｘ_９は変異され、位置Ｘ_１～Ｘ_６はＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、異なる変異パターンを有するＴＳＰが、本発明の第１の態様の方法で使用される。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、変異パターンが異なり、アミノ酸配列の長さが異なるＴＳＰが使用される。

【0137】

別の好ましい実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は８～１６アミノ酸長を有し、ＴＰは１０アミノ酸長を有し、ＴＳＰのアミノ酸配列は、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１０は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１０は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１０は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で、
ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０（配列番号３）
と異なる。

【0138】

好ましい実施形態では、位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１０は、ＴＰと比較して同一である）は、ＴＳＰにおいて変異する。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_７は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３、および位置Ｘ_８、およびＸ_１０は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_６は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１０は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_８～Ｘ_１０は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、異なる変異パターンを有するＴＳＰが、本発明の第１の態様の方法で使用される。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、変異パターンが異なり、アミノ酸配列の長さが異なるＴＳＰが使用される。

【0139】

別の好ましい実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は８～１６アミノ酸長を有し、ＴＰは１１アミノ酸長を有し、ＴＳＰのアミノ酸配列は、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１１は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１１は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１１は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、およびＸ_１１（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で；または
（ｖ）位置Ｘ_９、Ｘ_１０、およびＸ_１１（式中、Ｘ_１～Ｘ_８は、ＴＰと同一または類似、好ましくは同一である）で、
ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号４）
と異なる。

【0140】

好ましい実施形態では、位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１１は、ＴＰと比較して同一である）は、ＴＳＰにおいて変異する。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_７は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１１は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_６は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１１は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_８～Ｘ_１１はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_９～Ｘ_１１はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_８は、ＴＰと同一である。

【0141】

別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、異なる変異パターンを有するＴＳＰが、本発明の第１の態様の方法で使用される。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、変異パターンが異なり、アミノ酸配列の長さが異なるＴＳＰが使用される。

【0142】

別の好ましい実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は８～１６アミノ酸長を有し、ＴＰは１２アミノ酸長を有し、ＴＳＰのアミノ酸配列は、
（ｉ）位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３（式中、位置Ｘ_４～Ｘ_１２は、ＴＰと同一または類似している）で；
（ｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１２は、ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｉｉ）位置Ｘ_４、Ｘ_５、およびＸ_６（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１２は、ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｉｖ）位置Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、およびＸ_１２（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一または類似している）で；または
（ｖ）位置Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、およびＸ_１２（式中、位置Ｘ_１～Ｘ_８は、ＴＰと同一または類似している）で、
ＴＰのアミノ酸配列
Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２（配列番号５）
と異なる。

【0143】

好ましい実施形態では、位置Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、ＴＳＰにおいて変異し、ここで位置Ｘ_４～Ｘ_１２は、ＴＰと比較して同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_７は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_８～Ｘ_１２は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_４～Ｘ_６は、ＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_３および位置Ｘ_７～Ｘ_１２は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_８～Ｘ_１２はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_７は、ＴＰと同一である。別の好ましい実施形態では、位置Ｘ_９～Ｘ_１２はＴＳＰにおいて変異し、位置Ｘ_１～Ｘ_８は、ＴＰと同一である。

【0144】

別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、異なる変異パターンを有するＴＳＰが、本発明の第１の態様の方法で使用される。別の好ましい実施形態では、上記の（ｉ）～（ｉｖ）のＴＳＰ混合物、すなわち、変異パターンが異なり、アミノ酸配列の長さが異なるＴＳＰが使用される。

【0145】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ＳＰＡのアミノ酸配列、またはＳＰＡに含まれる少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の類似性を有する。別の実施形態では、ＳＰＡのアミノ酸配列、またはＳＰＡに含まれる少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、ＰＡＩと、９０％以下、８９％以下、８８％以下、８７％以下、または８６％以下のアミノ酸同一性を有する。別の実施形態では、ＳＰＡのアミノ酸配列、またはＳＰＡに含まれる少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、ＰＡＩと、８５％以下、８４％以下、８３％以下、８２％以下、８１％以下、または８０％以下のアミノ酸同一性を有する。

【0146】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は、ＴＰに対して９６％以下、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、または９１％以下のアミノ酸同一性を有する。別の実施形態では、ＴＳＰのアミノ酸配列は、ＴＰに対して９０％未満、または８９％以下、８８％以下、８７％以下、または８６％以下のアミノ酸同一性を有する。別の実施形態ではＴＳＰのアミノ酸配列は、ＴＰと、８５％以下、８４％以下、８３％以下、８２％以下、８１％以下、または８０％以下のアミノ酸同一性を有する。

【0147】

別の実施形態では、健常組織上のＴＳＰの絶対的な発現は、本発明の方法に含まれるＴＳＰの最も低い配列同一性と相関している。ＴＳＰが健常組織上で高度に発現される場合、ＴＳＰに低い親和性でのみ結合するＴＣＲは、それでもなお結合力効果のために、健常組織で発現されるＴＳＰに結合してもよい。したがって、所与のＴＳＰが健常組織上で低コピー数を有する場合、それがＴＰのと高い類似性を示す場合にのみ、それは本発明の方法に含まれる。相応して、所与のＴＳＰが健常組織上で高コピー数を有する場合、それは本発明の方法に含まれるが、ＴＰとの低類似性を有してもよい。例えば、ＴＳＰが健常細胞あたり１０以下のコピー数を有する場合、ＴＰと少なくとも９０％の配列類似性を有すれば、ＴＳＰは含まれる。ＴＳＰのコピー数が１～２５の場合、ＴＰと少なくとも８５％の配列類似性を有すれば、このようなＴＳＰも含まれる。ＴＳＰのコピー数が細胞あたり２５～１００の場合、ＴＰと少なくとも８０％の配列類似性を有すれば、このようなＴＳＰも含まれる。ＴＳＰのコピー数が細胞あたり１００～２５０の場合、ＴＰと少なくとも７５％の配列類似性を有すれば、このようなＴＳＰも含まれる。ＴＳＰのコピー数が細胞あたり２５０を超える場合、ＴＰと少なくとも５０％の配列類似性を有すれば、このようなＴＳＰも含まれる。

【0148】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、連続してまたは同時進行で実行される。本発明の第１の態様の別の実施形態では、上で概要を述べるたステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、連続してまたは同時進行で実行される。ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を組み合わせるかどうかは、検出可能標識で標識されたＡＣの使用数に依存する。

【0149】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、ステップ（ｉｖ）は、第１のＡＣ、第１および第３または第１のＡＣ、第３および第４のＡＣに結合している細胞を正に選択する（選択）ことを含んでなる。別の実施形態では、ステップ（ｉｖ）は、第２のＡＣ、第２および第５のＡＣ、または第２、第５、および第６のＡＣに結合している細胞を負に選択する（除外）ことを含んでなる。別の好ましい実施形態では、ステップ（ｉｖ）は、第１のＡＣ、第１および第３のＡＣ、または第１、第３、および第４のＡＣに結合している細胞を選択し、第２のＡＣ、第２および第５のＡＣ、または第２、第５、および第６のＡＣに結合している細胞を除外することを含んでなる。

【0150】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、検出可能標識は、フローサイトメトリー分析によって検出される。好ましい実施形態では、検出可能標識は、ＦＡＣＳ分析によって検出される。別の好ましい実施形態では、検出可能標識は、分取選別分析によって検出される。

【0151】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、本発明の第１の態様の方法のステップｉ）の集団に含まれる細胞はＴ細胞であり、表現型同定されている。別の実施形態では、ステップｉ）の集団に含まれる細胞はＢ細胞であり、表現型同定されている。

【0152】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、Ｔ細胞の表現型決定は、１つまたは複数のＴ細胞マーカーの判定を含んでなる。Ｔ細胞マーカーは、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＬ７Ｒ、およびテロマー長からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｔ細胞マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１９７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌである。ＣＤ６９およびＣＤ１３７をＴ細胞の表現型決定に使用することが、特に好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｂ細胞の表現型決定は、１つまたは複数のＢ細胞マーカーの判定を含んでなる。Ｂ細胞マーカーは、好ましくはＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ２１、ＣＤ４０、ＣＤ２０、ＣＤ３８、およびＣＤ８３からなる群から選択される。

【0153】

本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の細胞集団と、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなる無関係の抗原複合体（ＩＡＣ）とを接触させるステップをさらに含んでなり、ＰＡＩのアミノ酸配列と整列されたときに、ＩＰＡのアミノ酸配列が２つ以下のアミノ酸位置でＰＡＩと同一であり、ＩＡＣが、検出可能標識Ａと検出可能に異なる、検出可能標識Ｇを含んでなる。好ましくは、無関係のタンパク質抗原は、ハウスキーピング遺伝子の遺伝子産物である。ハウスキーピング遺伝子産物は、通常の状態および病態生理学的状態の下で、生物のあらゆる細胞で発現され、これは、通常、異なるまたは様々な細胞条件下で上方または下方制御されないことから、参照遺伝子として機能するのに適している。一般に、自然免疫細胞集団は、ハウスキーピング遺伝子またはそれに由来するペプチドに結合するいかなる免疫細胞も含んではならない。したがって、本発明の方法にＩＰＣを含めることで、これもまた望ましくないＡＣに非特異的に結合するＴ細胞を同定できるようになる。

【0154】

別の実施形態では、少なくとも１つのＩＰのアミノ酸配列は、以下の基準の１つまたは複数によって選択される：健常組織上のＩＰの提示；ＩＰはＨＬＡタイプの起源に由来する；またはそれぞれのＨＬＡへの結合。ＩＰのアミノ酸配列、またはＩＰＡに含まれる少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、ＰＡＩとの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２９％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満のアミノ酸同一性を有することが好ましい。別の実施形態では、ＩＡＣは、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩとＩＰとの複合体である。ＩＰのアミノ酸配列が、ＴＰのアミノ酸配列と整列されたときに、１つまたは皆無のアミノ酸位置でＴＰと同一であることが好ましい。好ましくは、ＩＰはハウスキーピング遺伝子によってコード化される。

【0155】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）本発明の第１の態様の方法で選択された細胞から、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を単離するステップと；
（ｉｉ）核酸の配列を決定するステップとを含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸の配列を決定するための方法にさらに関する。

【0156】

好ましい実施形態では、核酸は、選択された免疫細胞から、例えば、イミノ二酢酸基を含有するスチレン－ジビニルベンゼンコポリマーを含んでなる樹脂を使用する、例えば、有機抽出、固相抽出などの当該技術分野で周知の方法によって単離される。別の実施形態では、単離核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかである。別の実施形態では、単離後に核酸を増幅することが好ましい。好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施され得る。より好ましくは核酸は、ＰＣＲ（ＲＡＣＥ ＰＣＲ）を用いたｃＤＮＡ末端の迅速な増幅において増幅される。別の実施形態では、逆転写を介したＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ鋳型とＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーとを使用して、ＰＣＲの鋳型として直接使用され得る第１鎖ｃＤＮＡの合成を導く。別の実施形態では、単離核酸の配列は、例えば、各塩基が固有の蛍光シグナルを発することから、ＤＮＡ塩基を同時に同定し、それらを核酸鎖に付加する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定；ヌクレオチドがポリメラーゼによって新しいＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、これもまた蛍光を使用する、ピロリン酸放出を検出する技術であるピロシーケンスに基づくＲｏｃｈｅ４５４配列決定；またはＤＮＡポリメラーゼによる個々の塩基の取り込みからのプロトンの直接放出を測定する、イオントレント：陽子／ＰＧＭ配列決定のような、次世代の配列決定などの当該技術分野で公知の方法によって決定され得る。

【0157】

本発明の第３の態様は、
（ｉ）本発明の第１の態様の方法で選択された細胞から、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸配列を提供するステップと；
（ｉｉ）任意選択的に発現制御要素の制御下で、ステップ（ｉ）で提供される核酸配列を含んでなる核酸ベクターを生成するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の核酸ベクターを宿主細胞に導入するステップと
を含んでなる、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸を発現する細胞を生成するための方法に関する。

【0158】

一実施形態では、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分は、ベクターにクローン化される。

【0159】

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたはその抗原結合断片；ＢＣＲまたはその抗原結合断片または抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲであるか、またはその一部は、少なくともα鎖およびβ鎖の可変ドメインを含んでなる。好ましくは、ＴＣＲまたはその抗原結合部分の配列は、適切なベクターに挿入される。別の実施形態では、ＴＣＲ、ＢＣＲまたは抗体のアミノ酸配列は、６つのＣＤＲを含んでなる。別の実施形態では、同定されたＴＣＲの可変αドメインおよび／またはβドメインの２つまたは３つのＣＤＲが、フレームワークまたは別のＴＣＲまたは抗体に挿入される。好ましくは、ＴＣＲの可変αドメインの１つ、２つ、または３つのＣＤＲの遺伝子配列は、フレームワーク領域を含んでなる適切なベクターにクローン化される。発現ベクターは、軽鎖または重鎖またはα鎖およびβ鎖（またはその可変ドメイン）の双方をコード化する核酸（いわゆる「タンデム型」）を含んでなってもよく、またはそれらは別個のベクターに含まれる核酸によってコード化されてもよい。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターを使用することが好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４ Ｊａｎ．３；１６７（１－２）：２７１－８）。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例としては、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号パンフレット）、およびｐＥＥ１８が挙げられる。

【0160】

別の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のベクターが宿主細胞に導入される。一実施形態では、このような組換え宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質またはその一部の生産に使用され得る。好ましくは、宿主細胞は、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコード化する核酸および／またはベクターによって、形質転換、形質導入または形質移入される。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質部分をコード化する核酸による、宿主細胞の形質導入または形質移入は、例えば、米国特許第２０１９０２１６８５２号明細書に記載される方法などの当該技術分野で周知の方法を使用して実施される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分を含んでなる宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得るか、または例えば、細菌または原生動物などの原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えばヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着Ｔ細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。組換えＴＣＲまたはその断片などの抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質の一部を生成する目的のために、宿主細胞は、好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得て、任意の組織型に由来し得て、任意の発達段階であり得るもの、宿主細胞は、好ましくは末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＢ細胞である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、初代Ｔ細胞などの培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞；または例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などの培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞；または哺乳類から得られたＴ細胞、好ましくはヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体であり得る。哺乳類から得られた場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織または体液をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の起源から得られ得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、未感作Ｔ細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のＴ細胞型であり得て、任意の発達段階のものであり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、組換え発現のための任意の細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

【0161】

本発明の第４の態様は、
（ｉ）免疫細胞を含んでなる対象の細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＳＰＡを含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと；
（ｖ）培養によって、少なくとも１つの選択された細胞の数を増加させるステップと；
（ｖｉ）培養された細胞を対象に再導入するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象を治療するための方法に関し、
ここで、ＳＰＡのアミノ酸配列は、ＰＡＩのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、ここで、第２のＡＣは検出可能標識Ｂを含んでなり、
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｂは、互いに検出可能に異なる。

【0162】

このアプローチは、ＡＣＴアプローチである。好ましくは、選択された細胞は、遺伝子操作され、機能的に改善された後、対象に移入される。好ましくは、細胞は遺伝子操作された後に移入される対象に由来するものであり、すなわち、細胞のドナーと操作された細胞のレセプターは同一である。対象は、本明細書で上記に定義されるように、それを必要とする対象である。好ましくは、それを必要とする対象は、免疫疾患または腫瘍性疾患、ウイルスによって引き起こされる疾患、または細菌によって引き起こされる疾患からなる群から選択される疾患に罹患しているか、または罹患するリスクがある。腫瘍性疾患は、がんであることが好ましい。ウイルスによって引き起こされる疾患が、ＨＩＶであることが好ましい。細菌によって引き起こされる疾患は、結核であることが好ましい。

【0163】

本発明の第５の態様は、
（ｉ）免疫細胞を含んでなる細胞集団を提供するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、ＰＡＩおよび検出可能標識Ａを含んでなる第１の抗原複合体（第１のＡＣ）とを、または検出可能標識Ａを含んでなるＰＡＩとを接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の細胞集団と、無関係のタンパク質抗原（ＩＰＡ）を含んでなる少なくとも第２の抗原複合体（第２のＡＣ）とを接触させるステップと；
（ｉｖ）第１のＡＣに特異的に結合する、少なくとも１つの細胞を選択するステップと
を含んでなる、目的のタンパク質抗原（ＰＡＩ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質をその表面上に発現する免疫細胞を選択するための方法に関し、
ここで、ＰＡＩのアミノ酸配列と整列されたときに、ＩＰＡのアミノ酸配列は２つ以下のアミノ酸位置でＰＡＩと同一であり、ここで、ＩＡＣは検出可能標識Ｇを含んでなり；またはＩＰＡと検出可能標識Ｇを含み；
検出可能標識Ａと検出可能標識Ｇが、互いに検出可能に異なる。

【0164】

本発明の第５の態様による選択プロセスは、本発明の第１の態様について上で概説したように実行される。

【実施例】

【0165】

実施例１：事前の標的特異的増殖存在下および非存在下における標的ペプチド特異的Ｔ細胞の直接選別。
図２および３は、標的ペプチドおよび類似ペプチドを認識する交差反応性Ｔ細胞を温存しながら、標的特異的Ｔ細胞の選別をもたらす２つの異なるアプローチの比較を示す。方法１（図２）は、標的特異的Ｔ細胞の事前の増幅を必要としない。ＰＢＭＣを磁気ビーズ分離によって単離し、Ｔ細胞集団を富化する。Ｔ細胞集団を、蛍光色素コンジュゲート標的ペプチドおよび類似ペプチド四量体によって染色する。引き続いて、これらの細胞を、標的四量体の蛍光色素コンジュゲートの１つを標的化する磁気ビーズ分離を使用することによって、標的特異的Ｔ細胞についてさらに富化し得る。次に、標的ペプチド特異的Ｔ細胞集団を、ＣＤ４およびＣＤ８などの表面マーカーについて、ならびに死細胞を除外するための生存率マーカーについて染色する。フローサイトメトリー選別アプローチを使用することで、図２に示すように、標的＋類似ペプチド特異的Ｔ細胞を温存しながら、標的特異的Ｔ細胞を所望の表面マーカー発現について選別し得る。方法２（図３）は、標的ペプチドＨＬＡで被覆された人工抗原提示細胞による刺激を利用して、低頻度の標的特異的Ｔ細胞を増幅する。ここでは、富化されたＣＤ８Ｔ細胞を個々の容器内で培養し、モノクローナルまたはオリゴクローナルの標的ペプチド特異的Ｔ細胞集団の増殖を可能にする。人工抗原提示細胞による反復刺激後、個々のモノまたはオリゴクローナル集団を表面マーカーならびに標的ペプチドおよび類似ペプチド四量体（標的ペプチドおよび類似ペプチド四量体は、２Ｄ染色アプローチでそれぞれ異なる２つの蛍光色素で標識されている）で染色することで、図３に示すように、標的特異的なモノまたはオリゴクローナルＴ細胞集団と、交差反応性のモノまたはオリゴクローナルＴ細胞集団との区別が可能になる。

【0166】

実施例２：標的ペプチド多量体のみで選別されたＴ細胞に由来するＴ細胞受容体の機能評価。
標的多量体で選別することによって同定されたＴＣＲの機能性および特異性を評価するために、Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡを生体外転写によって生成し、引き続いて電気穿孔によって健常ドナーのＣＤ８陽性Ｔ細胞に形質移入するために使用する。次に、電気穿孔の１８時間後に、２０，０００個の形質移入されたＴ細胞を、標的ペプチド、異なる標的配列類似ペプチド、無関係のペプチド、または未負荷のＴ２細胞のいずれかと、１：１の比率で同時インキュベートする。共培養開始から２４時間後に上清を採取し、分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ法によって分析する。図４に示すように、サイトカイン分泌は、それぞれのＴ細胞の抗原認識および活性を実証する。図４Ａ、Ｂ、Ｃの全てのＴＣＲが、標的（陽性対照）を認識する一方で、図４Ａおよび図４ＢのＴＣＲは、正常組織上で発現される標的配列類似ペプチドに対しても交差反応性を示すことから、さらなる分析からは除外し、「クリーンな」ＴＣＲ（図４Ｃ）のみがさらなる特性評価のために選択される価値がある。（「標的」＝標的ペプチド；ＴＰ；「ＳＩＭ１～１０」＝標的類似ペプチド；ＴＳＰ１～１０）。

【0167】

この実施例で使用されるペプチド：
ＴＰおよびＳＩＭ１～ＳＩＭ１０は全て９量体である。
●アミノ酸２、５、８、および９位が異なるＴＰおよびＳＩＭ１；ＳＩＭ１は、２位にイソロイシン残基、５位にスレオニン残基、８位にロイシン残基、９位にバリン残基を有する。
●３、４、および７位が異なるＴＰおよびＳＩＭ２；ＳＩＭ２は、３位にイソロイシン残基、４位にグルタミン酸残基、７位にグルタミン残基を有する。
●２、７、８、および９位が異なるＴＰおよびＳＩＭ３；ＳＩＭ３は、３位にイソロイシン残基、７位および８位にグルタミン酸残基、９位にイソロイシン残基を有する。
●４、５、および８位が異なるＴＰおよびＳＩＭ４；ＳＩＭ４は４位にリジン残基、５位にアスパラギン残基、８位にチロシン残基を有する。
●４、７、および８位が異なるＴＰおよびＳＩＭ５；ＳＩＭ５は、４位にアスパラギン残基、７位にプロリン残基、８位にチロシン残基を有する。
●６、７、および８位が異なるＴＰおよびＳＩＭ６；ＳＩＭ６は、６位にバリン残基、７位および８位にロイシン残基を有する。
●５、６、および８位が異なるＴＰおよびＳＩＭ７；ＳＩＭ７は、５位にリジン残基、６位にグルタミン残基、８位にメチオニン残基を有する。
●３、５、７、および９位が異なるＴＰおよびＳＩＭ８；ＳＩＭ８は３位にセリン残基、５位にグルタミン酸残基、７位および９位にバリン残基を有する。
●２、４、５、および９位が異なるＴＰおよびＳＩＭ９；ＳＩＭ９は、２位にバリン残基、４位にグリシン残基、５位にアラニン残基、９位にバリン残基を有する。
●１、４、および６位が異なるＴＰおよびＳＩＭ１０；ＳＩＭ１０は、１位にバリン残基、４位にヒスチジン残基、９位にグルタミン残基を有する。
●４～９位が異なるＴＰおよび対照ペプチド；

【0168】

実施例３：標的ペプチドならびに標的および類似ペプチド特異的Ｔ細胞に由来するＴ細胞受容体の機能評価。
この目的を達成するために、Ｔ細胞受容体ｍＲＮＡを生体外転写を使用して生成し、引き続いて電気穿孔によってＮＦＡＴ－ルシフェラーゼＪｕｒｋａｔ細胞を形質移入するために使用する。形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞は、新しく導入されたＴＣＲをその表面に一過性に発現し始める。次に、電気穿孔の１８時間後に、５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞とＴ２細胞を１：１の比率で同時インキュベートし、選別のために使用される標的ペプチドまたは類似ペプチド、ならびに対照ペプチドまたはペプチドなしのいずれかを負荷する。ＴＣＲがその同族ペプチド－ＨＬＡに特異的に結合すると、シグナル伝達はＮＦＡＴの活性化をもたらし、それは次にルシフェラーゼの発現をもたらす。一晩のインキュベーション後、ルシフェラーゼ基質を添加し、Ｔ細胞が活性化されたときにルミネセンスシグナルが検出され得る。図５は、標的四量体結合Ｔ細胞に由来するＴＣＲが標的－ペプチド負荷Ｔ２細胞で刺激されると、機能的活性化をもたらすことを示す。（「標的」＝標的ペプチド；ＴＰ；「ＳＩＭ１～３」＝標的類似ペプチド；ＴＳＰ１～３）。

【0169】

この実施例で使用されるペプチド：
ＴＰおよびＳＩＭ１～ＳＩＭ３は全て９量体である。
●アミノ酸４、６、および７位が異なるＴＰおよびＳＩＭ１；ＳＩＭ１は、４位にグルタミン酸残基、６位にロイシン残基、７位にイソロイシン残基を有する。
●２、７、および８位が異なるＴＰおよびＳＩＭ２；ＳＩＭ２は、２位にメチオニン残基、７位にグルタミン酸残基、８位にリジン残基を有する。
●１、５、および６位が異なるＴＰおよびＳＩＭ３；ＳＩＭ３は、１位にフェニルアラニン残基、５位にグリシン残基、６位にセリン残基を有する。
●１位および４～９位が異なるＴＰおよび対照ペプチド。

【0170】

全体として、ＳＩＭ１はＴＰと７７％の類似性を有し、ＳＩＭ２はＴＰと７７％の類似性を有し、ＳＩＭ３はＴＰと７５％の類似性を有し、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＯＳＵＭ６２重み行列、ワード長３、期待値（Ｅ）１０を使用する。

【0171】

実施例４：所与の標的ペプチドに関連性のある標的類似ペプチドおよび無関係の標的類似ペプチド。
所与のＴＰに対するＴＳＰとしてのペプチドの関連性は、主にそのＴＰとの類似性によって判定されるが、さらに、初代正常組織上のその発現頻度ならびに定量的発現レベル（細胞毎コピー数（ＣｐＣ））によっても導かれ得る。ＴＰとの類似性が高ほど、そして正常組織上の提示頻度とＣｐＣが高いほど、ＴＳＰの関連性が高くなる。表６は、ＴＰ、２つの対応するＴＳＰ、ならびにＩＰの配列例を示す。ペプチド毎に、ＴＰと同一のアミノ酸（ａａ）の数、ＴＰ配列と比較したｐｍｂｅｃ位置重み行列に基づく類似性、および正常組織のＣｐＣ範囲が示される。図６、７、および８は、２つのＴＳＰならびにＩＰのペプチド提示プロファイルをさらに示す。ＴＳＰ（ＴＳＰ１）は、ＴＰと同じ４つのアミノ酸を有するが、標的ペプチドと比較して５つの同一のアミノ酸を有するＴＳＰ２と比較して、標的トとの全体的な類似性はより高い。どちらのＴＳＰも、ＴＰとの類似性および正常組織上の提示に基づいて、関連性があると見なされる（図６および７）。示されたＩＰは、正常組織ではさらに高い発現頻度を示し（図８）、一般には細胞あたりのコピー数もより高い。しかし、配列類似性ならびに同一アミノ酸の数はむしろ低い（１７％の類似性および０個の同一アミノ酸）。

【0172】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

2022535421000001.app

【国際調査報告】