特表 2022-535458 Ｂ型肝炎ウイルス特異的なＴ細胞応答

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-08

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルス特異的なＴ細胞応答

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/29 20060101AFI20220801BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220801BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 15/51 20060101ALI20220801BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220801BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20220801BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220801BHJP

   C07K 14/02 20060101ALN20220801BHJP

【ＦＩ】

A61K39/29

C12N15/86 Z ZNA

C12N5/0783

C12N5/10

C12N15/51

A61K35/17 Z

A61P31/20

A61P37/04

C07K14/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021572596

(86)(22)【出願日】2020-06-05

(85)【翻訳文提出日】2022-02-04

(86)【国際出願番号】 US2020036480

(87)【国際公開番号】W WO2020247858

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/858,764

(32)【優先日】2019-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512208051

【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】フルー、クラウス ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ピッカー、ルイス ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ブルビッツ、ベンジャミン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ハンセン、スコット ジー．

(72)【発明者】

【氏名】サチャ、ジョナー ビー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA96Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA03

4C085BA89

4C085CC08

4C085CC32

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG06

4C085GG08

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA02

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【解決手段】本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療または予防のための免疫応答を生じる方法に関する。本開示はまた、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療または予防のためのＭＨＣ－Ｅおよび／またはＭＨＣ－ＩＩ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法にも関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を生じる方法であって、ＨＢＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターを対象に投与することを含み、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である方法。

【請求項2】

対象における慢性のＨＢＶ感染を治療する方法であって、ＨＢＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターを対象に投与することを含み、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である方法。

【請求項3】

対象におけるＨＢＶに対する免疫応答を生じるのに使用するための、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターであって、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）であるＣＭＶベクター。

【請求項4】

対象における慢性のＨＢＶ感染の治療に使用するための、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターであって、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）であるＣＭＶベクター。

【請求項5】

対象におけるＨＢＶに対する免疫応答を生じるのに使用するための薬剤の製造における、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターの使用であって、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である使用。

【請求項6】

慢性のＨＢＶ感染の治療のための薬剤の製造におけるＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターの使用であって、前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現せず、前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である使用。

【請求項7】

前記Ｂ型肝炎ウイルス抗原はＢ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、Ｘ、またはポリメラーゼ抗原である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項8】

前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項７に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項9】

Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である請求項８に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項10】

前記Ｂ型肝炎抗原はＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項８に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項11】

前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ－Ｅまたはそのオーソログ、またはＭＨＣ－ＩＩまたはそのオーソログによって拘束される請求項１～６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項12】

前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％がＭＨＣ－Ｅまたはそのオーソログ、またはＭＨＣ－ＩＩまたはそのオーソログによって拘束される請求項１１に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項13】

ＭＨＣ－Ｅによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識する請求項１１に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項14】

前記ＭＨＣ－ＥスーパートープはＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項１３に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項15】

前記ＭＨＣ－ＥスーパートープはＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である請求項１３に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項16】

前記ＭＨＣ－ＥスーパートープはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項１３に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項17】

前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％未満が、ＭＨＣ－クラスｌａまたはそれらのオーソログによって拘束される請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項18】

ＭＨＣ－Ｅによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞の一部が、ベクターによって免疫された他の対象の少なくとも９０％によって共有されるエピトープを認識する請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項19】

ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＭＨＣ－Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを生成するのに有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない組み換えＣＭＶベクターを第１の対象に投与するステップと、
（ｂ）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する第１のＣＤ８＋ＴＣＲをＣＤ８＋Ｔ細胞のセットから同定するステップと、
（ｃ）第２の対象から１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、
（ｄ）第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列と、第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターとを含む発現ベクターによって１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞をトランスフェクトして、ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞生成するステップと、を含む方法。

【請求項20】

ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＭＨＣ－Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを生成するのに有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない組み換えＣＭＶベクターを投与されている第１の対象からＣＤ８＋Ｔ細胞の第１のセットを単離するステップと、
（ｂ）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する第１のＣＤ８＋ＴＣＲをＣＤ８＋Ｔ細胞の第１のセットから同定するステップと、
（ｃ）第２の対象からＣＤ８＋Ｔ細胞の第２のセットを単離するステップと、
（ｄ）第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列および第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターを含む発現ベクターによってＣＤ８＋Ｔ細胞の第２のセットをトランスフェクトして、ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞生成するステップと、を含む方法。

【請求項21】

組み換えＣＭＶベクターが組み換えヒトＣＭＶベクターまたは組み換えアカゲザルＣＭＶベクターである請求項１９または請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｂ型肝炎ウイルス抗原はＢ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、またはポリメラーゼ抗原である請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項２２に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項24】

Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である請求項２３に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項25】

前記Ｂ型肝炎抗原はＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項２３に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項26】

前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の第１のセットは、Ｂ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、Ｘ、またはベクターによって免疫された他の対象の少なくとも９０％によって共有されるポリメラーゼ抗原ペプチドのスーパートープである特異的なＢ型肝炎ウイルス抗原を認識する請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である請求項２６に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項29】

前記Ｂ型肝炎抗原はＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項２６に記載の方法、使用のためのＣＭＶベクター、または製造におけるＣＭＶベクターの使用。

【請求項30】

前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の第２のセットは、ベクターによって免疫された他の対象の少なくとも９０％によって共有されるＢ型肝炎ウイルス抗原スーパートープを認識する請求項１９～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

Ｂ型肝炎抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記Ｂ型肝炎抗原はＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のＣＤ８＋ＴＣＲはＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定によって同定される請求項１９～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列は、前記第１のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列と同一である請求項１９～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記第１の対象および／または前記第２の対象はヒトまたは非ヒト霊長類である請求項１９～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１の対象は非ヒト霊長類であり、前記第２の対象はヒトであり、前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、非ヒト霊長類ＣＤＲ３αと前記第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βとを含むキメラ非ヒト霊長類－ヒトＣＤ８＋ＴＣＲである請求項１９～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、非ヒト霊長類ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む請求項１９～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列は、第１のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列と同一である請求項１９～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲはキメラＣＤ８＋ＴＣＲである請求項１９～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む請求項１９～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記ＣＭＶベクターを第１の対象に投与するステップは、第１の対象へのＣＭＶベクターの静脈内、筋肉内、腹腔内、または経口投与を含む請求項１９～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

ＨＢＶ感染を治療するか、または防ぐために、トランスフェクトしたＣＤ８＋Ｔ細胞を前記第２の対象に投与するステップをさらに含む請求項１９～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

請求項１９～４４のいずれか１項に記載の方法によって生成したＣＤ８＋Ｔ細胞。

【請求項46】

対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法であって、Ｂ型肝炎感染の治療または予防を必要とする対象に請求項４５に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含む方法。

【請求項47】

Ｂ型肝炎感染の治療または予防を必要とする対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法に使用するための請求項４５に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞。

【請求項48】

Ｂ型肝炎感染の治療または予防を必要とする対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法での使用のための薬剤の製造における請求項４５に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／８５８，７５６号の利益を主張するものであるが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する声明
本発明は、国立がん研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＡＩ１２９７０３、Ｒ０１ ＡＩ１４０８８８、およびＰ５１ＯＤ０１１０９２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

【0003】

電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称４１５３＿０１１ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：４，２８８バイト；作成日２０２０年６月５日）における電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

慢性のＢ型肝炎ウイルス感染（ＣＨＢ）は主要な世界的健康懸念であり、世界中で２億４７００万人に影響を及ぼし、８８７，０００人が毎年死亡している。有効な予防ワクチン利用可能である一方で、１０～１５％の人が適切にワクチン接種に反応せず、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染から保護されない（Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ ｅｄ．ｐ．４６８．）。ＣＨＢは、進行性肝臓機能不全、硬変、および一部のケースでは肝細胞がんをもたらし得る。ペグＩＦＮaおよび逆転写酵素阻害剤を含めたＣＨＢに対する多数の治療選択肢（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｄ．，ａｎｄ Ｃ．Ｌ．Ｔｈｉｏ．２０１０．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５１：１２０１－１２０８．）があるが、これらの治療はめったに治癒するものではない（Ｚｈａｎｇら，２０１６．ＨＢｓＡｇ ｓｅｒｏｃｌｅａｒａｎｃｅまたはｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｅｇ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅまたはａｄｅｆｏｖｉｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｒｅｖ Ｅｓｐ Ｅｎｆｅｒｍ Ｄｉｇ １０８：２６３－２７０．）。

【0005】

急性ＨＢＶ感染成人の９０～９５％が、広く高度に機能的なＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答およびその後の明確な感染を示すことによって、ＣＨＢに対する細胞免疫治療戦略の開発が支持されている（Ｍａｉｎｉら，１９９９．Ｄｉｒｅｃｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１７：１３８６－１３９６； Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，２０１０．ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：２８７－２９５； Ｆｉｓｉｃａｒｏら，２００９．Ｅａｒｌｙ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇｕｔ ５８：９７４－９８２．）。これに対して、ＣＨＢへの患者の進行は、狭く注目され、低い頻度の機能的に消耗したＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を示す（Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｃ．Ｆｅｒｒａｒｉ．２０１６．Ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ＨＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４：Ｓ７１－Ｓ８３；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ａ．Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ．２０１５．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６１：７１２－７２１；Ｋｕｒｋｔｓｃｈｉｅｖら，２０１４．Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ＢおよびＣ ａｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ａ ｌａｃｋ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｂｅｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１１：２０４７－２０５９．）。したがって、現在開発中の多くの免疫治療戦略が、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫の増強に注目している。

【0006】

現在研究中の免疫療法は、より良好な標的ＨＢＶ感染した肝細胞に対する免疫系を利用するように設計され、パターン認識受容体アゴニスト、チェックポイント阻害剤遮断、治療ワクチン、および養子Ｔ細胞治療による免疫刺激を含む（Ｇｉｌｌ，Ｕ．Ｓ．，ａｎｄ Ｐ．Ｔ．Ｆ．Ｋｅｎｎｅｄｙ．２０１７．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ＨＢＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６７：４１２－４１４．）。ＨＢＶ免疫療法に直面する共通のハードルはＴ細胞免疫寛容である（ Ｚｏｎｇら，２０１９．Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ＨＢｓＡｇ－ｔｇ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０：２２１； Ｋｏｎｇら，２０１４．γδＴ ｃｅｌｌｓ ｄｒｉｖｅ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３：１６４５－１６５３；Ｍｉｌｉｃｈ，Ｄ．Ｒ．２０１６．Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｓ Ａｌｉｖｅ ａｎｄ Ｗｅｌｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５１：８０１－８０４．）。急性ＨＢＶウイルス血をうまく除去する患者とそうでない患者とを区別する免疫寛容の最初のトリガーは完全に理解されていない。しかしながら、一部では、肝臓の免疫寛容な環境の結果である可能性が高い。したがって、ＣＨＢを免疫療法によってうまく除去するためには、Ｔ細胞免疫寛容を克服しなければならない。不運にも、今までどの免疫療法も一貫してこの目標を達成しておらず、ＣＨＢの生理学的に関連した動物モデルがないことによって、この現実を悪化させていた。

【0007】

ＣＨＢに対するＴ細胞ベースの免疫療法は、Ｔ細胞消耗の持続的な反転または持続したウイルス抑制をもたらさなければならない。ＣＨＢ患者における確立したＨＢＶ特異的Ｔ細胞の機能不全の反転の困難性を考えると、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を増大する最も有効な方法は、治療ワクチン接種または養子Ｔ細胞治療によってＴ細胞応答の完全に独特のセットを生じさせるか、または与えることであり得る。不運にも、生成するそのようなデノボ応答は、患者特異的なＨＬＡ発現および肝細胞表面にあるＨＢＶペプチドによって制限される。これに対して、普遍的に発現した場合、天然の急性ＨＢＶ特異的免疫応答に寄与しない非従来型のＭＨＣ－ＩｂＴ細胞制限エレメントが肝細胞表面条にＨＢＶ抗原を提示でき、ＨＢＶ感染において典型的に見られないＴ細胞応答の全く異なるセットを誘発するようにターゲットされ得る。したがって、ＨＢＶに対する治療法を至急および網羅的に開発する必要がある。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、対象においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を生じる方法であって、ＨＢＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターを対象に投与することを含み、ＣＭＶベクターは、活性なＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６およびＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない方法に関する。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0009】

本開示はまた、対象における慢性のＨＢＶ感染を治療する方法であって、ＨＢＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターを対象に投与することを含み、ＣＭＶベクターは、活性なＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６およびＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない方法にも関する。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0010】

本開示はまた、対象におけるＨＢＶに対する免疫応答を生じるのに使用するための、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターにも関し、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0011】

本開示はまた、ＨＢＶ抗原を発現する対象における慢性のＨＢＶ感染の治療に使用するためのＣＭＶベクターにも関し、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0012】

本開示はまた、対象におけるＨＢＶに対する免疫応答を生じるのに使用するための薬剤の製造における、ＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターの使用にも関し、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0013】

本開示はまた、慢性のＨＢＶ感染の治療のための薬剤の製造におけるＨＢＶ抗原を発現するＣＭＶベクターの使用にも関し、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。一実施形態では、ＨＢＶ抗原はＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0014】

一実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、Ｘ、またはポリメラーゼ抗原である。一部の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は、ＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。一部の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は、ＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。

【0015】

別の実施形態では、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ－Ｅまたはそのオーソログ、またはＭＨＣ－ＩＩまたはそのオーソログによって拘束される。別の実施形態では、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７５％がＭＨＣ－Ｅまたはそのオーソログ、またはＭＨＣ－ＩＩまたはそのオーソログによって拘束される。別の実施形態では、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％未満がＭＨＣ－クラスｌａまたはそのオーソログによって拘束される。別の実施形態では、いくつかのＭＨＣ－Ｅによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ベクターで免疫された他の対象の少なくとも９０％が共有するペプチドを認識する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｅによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｅスーパートープは、ＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｅスーパートープは、ＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。

【0016】

本開示はまた、ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法にも関し、該方法は、（ａ）ＭＨＣ－Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを生成するのに有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を含み、活性なＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６およびＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない組み換えＣＭＶベクターを第１の対象に投与するステップと、（ｂ）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する第１のＣＤ８＋ＴＣＲをＣＤ８＋Ｔ細胞のセットから同定するステップと、（ｃ）第２の対象から１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、（ｄ）第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列および第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターを含む発現ベクターによって１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞をトランスフェクトして、ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞生成するステップと、を含む。

【0017】

本開示はまた、ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法にも関し、該方法は、を含む：（ａ）ＭＨＣ－Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを生成するのに有効な量で、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない組み換えＣＭＶベクターを投与されている第１の対象からＣＤ８＋Ｔ細胞の第１のセットを単離するステップと、（ｂ）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する第１のＣＤ８＋ＴＣＲをＣＤ８＋Ｔ細胞の第１のセットから同定するステップと、（ｃ）第２の対象からＣＤ８＋Ｔ細胞の第２のセットを単離するステップと、（ｄ）第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列および第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターを含む発現ベクターによってＣＤ８＋Ｔ細胞の第２のセットをトランスフェクトして、ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞生成するステップと、を含む。

【0018】

一実施形態では、組み換えＣＭＶベクターが組み換えヒトＣＭＶベクターまたは組み換えアカゲザルＣＭＶベクターである。別の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原がＢ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、またはポリメラーゼ抗原である。一部の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は、ＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。一部の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は、ＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性を有する。

【0019】

一実施形態では、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞は特異的なＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識する。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞は特異的なＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識する。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＥスーパートープはＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）またはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＥスーパートープはＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ（配列番号１７）である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＥスーパートープはＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ（配列番号１８）である。

【0020】

別の実施形態では、第１のＣＤ８＋ＴＣＲはＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定によって同定される。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列は、第１のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列と同一である。

【0021】

一実施形態では、第１の対象はヒトまたは非ヒト霊長類である。別の実施形態では、対象は非ヒト霊長類であり、第２の対象はヒトであり、第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、非ヒト霊長類ＣＤＲ３αと第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βとを含むキメラ非ヒト霊長類－ヒトＣＤ８＋ＴＣＲである。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、非ヒト霊長類ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列は、第１のＣＤ８＋ＴＣＲをコードする核酸配列と同一である。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲはキメラＣＤ８＋ＴＣＲである。別の実施形態では、第２のＣＤ８＋ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、および第１のＣＤ８＋ＴＣＲのＣＤＲ３βを含む。

【0022】

一実施形態では、ＣＭＶベクターを第１の対象に投与することは、第１の対象へのＣＭＶベクターの静脈内、筋肉内、腹腔内、または経口投与を含む。別の実施形態では、ＨＢＶ感染を治療するか、または防ぐために、トランスフェクトしたＣＤ８＋Ｔ細胞を第２の対象にさらに投与する。

【0023】

本開示はまた、本明細書に記載の方法によって生成したＣＤ８＋Ｔ細胞にも関する。

【0024】

本開示はまた、対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法にも関し、該方法は、その治療または予防を必要とする対象に本明細書に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含む。本開示はまた、Ｂ型肝炎感染の治療または予防を必要とする対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法に使用するためのＣＤ８＋Ｔ細胞にも関する。本開示はまた、Ｂ型肝炎感染の治療または予防を必要とする対象におけるＢ型肝炎感染を治療または予防する方法での薬剤の製造におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の使用にも関する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】ＨＢＶコア、表面、およびポリメラーゼ抗原（ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶ６８－１）を発現する株６８－１ＲｈＣＭＶを接種した４匹のアカゲザル（ＲＭ）のＨＢＶ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の頻度を示す図である。

【図1B】ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の個々のペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す図である。各ＨＢｃＡｇ １５量体は、ＭＨＣ拘束を示すように色分けされ、ボックスによって示されている。

【図1C】ＨＢｃＡｇペプチドを添加したときの、ＨＬＡ－ＥまたはＭａｍｕ－ＥのいずれかでトランスフェクトしたＫ５６２細胞への接種したＲＭから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す図である。

【図2A】ＭＨＣを導入した細胞株のＭＨＣ－Ｅ特異的抗体４Ｄ１２による染色を示す図である。４Ｄ１２染色は、ＩｇＧ－アイソタイプ対照に一致するものと比較した。さらに、細胞は汎ＭＨＣ－Ｉ特異的抗体Ｗ６／３２で染色された。

【図2B】肝臓灌流およびプレーティングの１日後に、ヒトおよびＲＭ初代肝細胞の４Ｄ１２染色を示す図である。マウスＩｇＧ１アイソタイプは、初代肝細胞による非特異的な抗体結合をコントロールするために使用された。

【図2C】図２ＢからのＭＨＣ－Ｅ＋初代肝細胞のパーセントの定量化を示す図である。

【図2D】ＨＢＶ感染後４日目のヒトドナー初代肝細胞の表面ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｅ、またはＭＨＣ－ＩＩと細胞内ＨＢｃＡｇの共染色を示す図である。

【図2E】図２ＤからのＨＢＶ＋初代肝細胞のパーセントの定量化を示す図である。

【図3A】２人の無関係なＲＭドナー（ＲＭ８及びＲＭ９）からのＨＢＶナイーブ又はＨＢＶ感染ＰＨとインキュベートしたときのＲＭ１及びＲＭ２からの脾臓細胞及びＣＤ８β分類エフェクターにおけるＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ及びＭＨＣ－Ｅにより拘束されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す図である。応答したＴ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＩＦＮ－γの染色によって同定された。応答したＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＨＣ拘束は、以下のＭＨＣブロッキング剤を用いて同定した。Ｗ６／３２抗体（ｐａｎ ＭＨＣ－Ｉ）、ＶＬ９ペプチド（ＭＨＣ－Ｅ）、ＣＬＩＰ（ＭＨＣ－ＩＩ）、またはＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＭＨＣ－ＩＩ）。

【図3B】ヒトドナー（ＨＤ１及びＨＤ２）からのＨＢＶナイーブ又はＨＢＶ感染初代肝細胞とインキュベートしたＲＭ１及びＲＭ２からの脾臓細胞またはＣＤ８β分類エフェクターからのＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ及びＭＨＣ－Ｅにより拘束されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。応答したＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３、Ｃｄ８、ＩＦＮ－γによって同定された。また、応答したＣＤ８＋ Ｔ細胞のＭＨＣ拘束は、以下のＭＨＣブロッキング剤で同定した。Ｗ６／３２抗体（ｐａｎ ＭＨＣ－Ｉ）、ＶＬ９ペプチド（ＭＨＣ－Ｅ）、ＣＬＩＰ（ＭＨＣ－ＩＩ）、またはＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＭＨＣ－ＩＩ）。

【図4】全世界のＨＢＶ株におけるＨＢＶコア抗原のＭＨＣ－Ｅ結合型スーパートープの保存性を示す棒グラフである。すべての既知のＨＢＶ遺伝子型にまたがる６，２０３個の全ゲノムＨＢＶ配列を翻訳し、Ｃｏｒｅ７（図４Ａ）およびＣｏｒｅ１４（図４Ｂ）に対してアミノ酸をアラインメントした。

【発明を実施するための形態】

【0026】

Ｉ．用語
特に明記しない限り、技術用語は慣用的な用法に従って使用される。

【0027】

本明細書で引用されるか、または２０１９年７月７日出願の米国仮特許出願番号６２／８５８，７６４を含む出願データシートに記載されているすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）は、個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または受託番号／データベース配列が参照によりそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0028】

文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、オープンで包括的な意味で、すなわち「限定されないが、～を含む」と解釈されるべきである。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ～）」は、本明細書に開示される他の成分および実質的な方法工程の微量元素を上回る元素を除外することを意味するものとする。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ～）」という語は、特定の材料もしくは工程、または特許請求の範囲の発明の基本的な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに特許請求の範囲を限定する。例えば、本明細書で規定された元素から本質的になる組成物から、単離および精製方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの医薬的に許容され得る担体は排除されない。同様に、タンパク質がタンパク質の長さの最大２０％に寄与し、タンパク質の活性に実質的に影響を及ぼさない（例えば、タンパク質の活性を変化させる割合は５０％以下である）追加のアミノ酸を含む場合、タンパク質は特定のアミノ酸配列から本質的になる。各移行句によって規定される実施形態は、本発明の範囲内に含まれる。

【0029】

本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は例を示したものにすぎず、限定することを意図するものではない。本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語について以下の説明を提供する。

【0030】

抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」または「免疫原」という用語は、対象において免疫応答を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質を指すために互換的に使用される。この用語はまた、（直接的に、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはベクターを対象に投与することによって）対象に投与されると、タンパク質が、そのタンパク質に対する体液型および／または細胞型の免疫応答を誘発することができるという意味で免疫学的に活性のあるタンパク質を指す。

【0031】

抗原特異的Ｔ細胞：特定の抗原を認識するＣＤ８^＋リンパ球またはＣＤ４^＋リンパ球。概して、抗原特異的Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子によって提示される特定の抗原に特異的に結合するが、同じＭＨＣによって提示される他の抗原には結合しない。

【0032】

投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、何らかの有効な経路によって、有効量の外因性抗原を含むＣＭＶベクターを含む組成物などの薬剤を対象に提供または与えることを意味する。具体例としての投与経路には、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内）、経口、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

【0033】

有効量：本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、ＭＨＣ－Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体、ＭＨＣ－ＩＩ／異種抗原由来ペプチド複合体、またはＭＨＣ－Ｉ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する異種抗原またはトランスフェクトＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＭＶベクターなどの、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状を軽減もしくは排除する、または抗原に対する免疫応答を誘導するなどの所望の応答を生じさせるのに十分である薬剤の量を指す。いくつかの例において、「有効量」は、障害または疾患のいずれかの１つ以上の症状および／または根本原因を（予防を含め）治療する量である。有効量は、特定の疾患または状態の１つ以上の徴候または症状、例えば感染性疾患に関連する１つ以上の徴候または症状の発症を防止する量を含む治療有効量であり得る。

【0034】

異種抗原：本明細書で使用される場合、「異種抗原」という用語は、ＣＭＶに由来しない任意のタンパク質またはその断片を指す。異種抗原は、ＨＢＶに由来するいずれの抗原であり得る。

【0035】

免疫原性ペプチド：対立遺伝子特異的なモチーフまたは他の配列、例えばＮ末端の繰り返しを含むものであって、ペプチドはＭＨＣ分子に結合し、細胞毒性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答、または免疫原性ペプチドが由来する抗原に対するＢ細胞応答（例えば抗体産生）を誘導することになる。

【0036】

一実施形態では、免疫原性ペプチドは、当技術分野で既知のニューラルネットまたは多項式決定など、配列モチーフまたは他の方法を使用して特定される。典型的には、アルゴリズムを使用してペプチドの「結合閾値」を決定し、ある特定の親和性で結合する高い確率をもたらし、免疫原性となるスコアを有するペプチドを選択する。アルゴリズムは、特定の位置における特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果、特定の位置における特定のアミノ酸の抗体結合に対する効果、またはモチーフ含有ペプチドにおける特定の置換基の結合に対する効果のいずれかに基づく。免疫原性ペプチドの関連の中で、「保存された残基」は、ペプチドにおける特定の位置でのランダムな分布によって予想されるよりも有意に高い頻度で現れる残基である。一実施形態では、保存された残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る残基である。

【0037】

突然変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、正常配列、共通配列または「野生型」配列との核酸またはポリペプチド配列の何らかの差異を指す。突然変異体は、突然変異を含む何らかのタンパク質または核酸配列である。さらに、突然変異を有する細胞または生物を突然変異体と称することもあり得る。いくつかのタイプのコード配列突然変異には、点突然変異（個々のヌクレオチドまたはアミノ酸の差異）、サイレント突然変異（アミノ酸変化をもたらさないヌクレオチドの差異）、欠失（遺伝子のコード配列全体およびそれ以下の欠失を含め、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が欠損している場合の差異）、フレームシフト突然変異（３で割り切れない数のヌクレオチドの欠失がアミノ酸配列の変化をもたらす場合の差異）が含まれる。アミノ酸の差異をもたらす突然変異はまた、アミノ酸置換突然変異と呼ばれることもある。アミノ酸置換突然変異は、アミノ酸配列の特定の位置での野生型との比較におけるアミノ酸変化によって説明され得る。

【0038】

ヌクレオチド配列または核酸配列：「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または合成核酸を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指す。核酸は、一本鎖、または部分的もしくは完全な二本鎖（デュプレックス）であり得る。デュプレックス核酸は、ホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスであり得る。

【0039】

機能し得るように連結された：「機能し得るように連結された」という用語が本明細書で使用される場合、第１の核酸配列が第２の核酸配列に影響を及ぼすように第１の核酸配列が配置されているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能し得るように連結されている。機能し得るように連結されたＤＮＡ配列は、連続していてもよく、またはそれらはある距離をおいて機能し得る。

【0040】

プロモーター：本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示するいくつかの核酸制御配列のいずれかを指し得る。典型的には、真核生物プロモーターは、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含み、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントまたは１つ以上の転写因子によって認識される何らかの他の特定のＤＮＡ配列を含む。プロモーターによる発現は、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントによってさらに調節され得る。プロモーターの数多くの例が利用可能であり、当業者に周知である。特定のポリペプチドをコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターを含む核酸は、発現ベクターと呼ばれ得る。

【0041】

組換え（の）：本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関する場合の「組換え」という用語は、天然に存在しない配列を有するか、または配列の２つ以上の他の方法で分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものを指し、例えば異種抗原を含むＣＭＶベクターがある。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には、例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成される。組換えポリペプチドはまた、ポリペプチドの天然供給源ではない宿主生物に移入された組換え核酸（例えば、異種抗原を含むＣＭＶベクターを形成するポリペプチドをコードする核酸）を含む、組換え核酸を使用して作製されたポリペプチドを指し得る。

【0042】

医薬的に許容され得る担体：本明細書で使用される場合、使用される「医薬的に許容され得る担体」は慣用的なものである。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，イーストン、ペンシルベニア、１９９５年、第１９版には、本明細書に開示される組成物の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。一般に、担体の性質は、採用されている特定の投与様式次第で異なることになる。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの医薬的および生理学的に許容され得る流体を賦形剤として含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）の場合、慣用的非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。

【0043】

ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーを指す。ポリヌクレオチドは４つの塩基、すなわちアデニン、シトシン、グアニンおよびチミン／ウラシル（ウラシルはＲＮＡで使用される）から構成される。核酸からのコード配列は、核酸によってコードされるタンパク質の配列を示す。

【0044】

ポリペプチド：「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「アミノ酸配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝状であり得、修飾アミノ酸またはアミノ酸類似体を含み得、アミノ酸以外の化学部分によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、または介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識もしくは生物活性成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。

【0045】

タンパク質のオーソログは、典型的には、デフォルトパラメータに設定されたＡＬＩＧＮを使用して、特定のタンパク質のアミノ酸配列との完全長アラインメントにわたってカウントされた７５％を超える配列同一性を有することを特徴とする。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性など、同一性パーセンテージの増加を示すことになる。さらに、配列同一性を、開示されたペプチドの特定のドメインの全長にわたって比較することができる。

【0046】

配列同一性／類似性：本明細書で使用される場合、２つもしくはそれ以上の核酸配列または２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列の間の同一性／類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、同一性パーセントという観点で測定され得、パーセンテージが高いほど、配列の同一性はより高くなる。配列類似性は、（保存的アミノ酸置換を考慮に入れた）同一性または類似性のパーセンテージという観点で測定され、パーセンテージが高いほど、配列はより類似している。かなりの量の配列同一性を有し、互いに同一または同様に機能するポリペプチドまたはそのタンパク質ドメイン（例えば、異なる種またはタンパク質の機能またはその規模を変化させないタンパク質の変異形態において同じ機能を果たすタンパク質）は、「ホモログ」と呼ばれ得る。

【0047】

比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２，４８２（１９８１）；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８，４４３（１９７０）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３，２３７－２４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５，１５１－１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６，１０８８１－１０８９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ，８，１５５－１６５（１９９２）；ならびにＰｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ Ｂｉｏ ２４，３０７－３３１（１９９４）に記載されている。さらに、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５、４０３－４１０（１９９０）は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示している。

【0048】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）前出）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連させて使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ、Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５、ベセスダ、メリーランド２０８９４）およびインターネット上を含むいくつかの情報源から入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見つけることができる。

【0049】

ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性領域を整列させた配列として提示することになる。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは、整列させた配列を提示しないことになる。

【0050】

整列が完了すると、マッチの数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を数えることによって決定される。配列同一性パーセントは、マッチの数を、同定された配列に示された配列の長さまたは連結された長さ（例えば、同定された配列に示された配列からの１００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で割った後、得られた値に１００を掛けることによって決定される。例えば、１１５４個のヌクレオチドを有する試験配列と整列させた場合に１１６６のマッチを有する核酸配列は、試験配列と７５．０％同一である（１１６６÷１５５４×１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は、小数点第一位を四捨五入する。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は７５．１に切り捨てられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数となる。別の例では、以下のように同定された配列からの２０個の連続するヌクレオチドと合致する２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、その同定された配列と７５％の配列同一性を共有する領域を含む（すなわち、１５÷２０×１００＝７５）。

【0051】

約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数が使用される、（ギャップ存在コストは１１、残基あたりのギャップコストは１）。ホモログは、典型的には、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｂｌａｓｔ ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐをｎｒデータベース、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース、および特許配列データベースなどのデータベースと共に使用して、アミノ酸配列との完全長アラインメントにわたってカウントされた少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする。ｂｌａｓｔｎプログラムで検索されたクエリは、ＤＵＳＴ（ＨａｎｃｏｃｋおよびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ １０、６７－７０（１９９４）でフィルターにかけられた。他のプログラムはＳＥＧを使用する。さらに、手動アライメントを行ってもよい。さらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、タンパク質に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性など、同一性パーセンテージの増加を示すことになる。

【0052】

短いペプチド（約３０未満のアミノ酸）をアラインメントする場合、アラインメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを採用して、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して行われる。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、タンパク質に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性など、同一性パーセンテージの増加を示すことになる。配列同一性について配列全体よりも短いものが比較されている場合、ホモログは、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも７５％の配列同一性を有することになり、参照配列に対するそれらの同一性に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、ＮＣＢＩウェブサイトに記載されている。

【0053】

２つの核酸分子が密接に関連していることの１つの指標は、上記のように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。それにもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列は、遺伝暗号の縮重のために、同一または類似した（保存された）アミノ酸配列をコードし得る。核酸配列の変化は、この縮重を使用して行われ、すべてが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を生成し得る。そのような相同性核酸配列は、例えば、タンパク質をコードする核酸と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。

【0054】

対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物である生物を指す。

【0055】

スーパートープ：本明細書で使用される場合、「スーパートープ」または「スーパートープペプチド」という用語は、ＭＨＣハプロタイプとは関係なく、すなわち所与のＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、またはＭＨＣ－Ｅ対立遺伝子の存在下または非存在下で、ヒト集団の約９０％超においてＴ細胞によって認識されるエピトープまたはペプチドを指す。

【0056】

治療：本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、疾患または病理学的状態の徴候または症状を改善する介入を指す。本明細書で使用される場合、疾患、病理学的状態または症状に関連する「治療」、「治療する」および「治療している」という用語はまた、治療の何らかの観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部または全部の臨床症状の重症度の低下、疾患の進行の遅延、疾患の再発数の減少、対象の全体的な健康もしくは健全性の改善、または特定の疾患に特異的な当技術分野で周知の他のパラメータによって証明され得る。予防的治療は、病変を発症するリスクを低下させる目的で、疾患の徴候を示さないかまたは初期の徴候のみを示す対象に施される治療である。治療的治療は、疾患の徴候および症状が発生した後に対象に施される治療である。

【0057】

ワクチン：疾患または他の病理学的状態に対する能動免疫などの免疫を付与するために、ヒトなどの哺乳動物に投与することができる免疫原性組成物。ワクチンは予防的または治療的に使用することができる。したがって、ワクチンを使用して、疾患（腫瘍または病理学的感染など）を発症する可能性を低下させるか、または疾患もしくは状態の症状の重症度を低下させるか、疾患もしくは状態（腫瘍または病理学的感染など）の進行を制限するか、または疾患もしくは状態（腫瘍など）の再発を制限することができる。特定の実施形態において、ワクチンは、ＨＢＶ抗原を発現する複製欠損ＣＭＶである。

【0058】

ベクター：特定の配列の核酸分子をベクターに組み込み、次いで前記ベクターを宿主細胞に導入し、それによって形質転換宿主細胞を作製することができる。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、１つ以上の選択マーカー遺伝子および核酸発現を指示するプロモーターエレメントを含む、当技術分野で既知の他の遺伝子エレメントを含み得る。ベクターは、ＣＭＶベクターなどのウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスを含む野生型または弱毒化ウイルスから構築され得る。

【0059】

ＩＩ．型肝炎感染の治療および予防方法
Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療または予防方法が本明細書では開示されている。該方法は、少なくとも１つの異種抗原を含む有効量の少なくとも１つの組み換えＣＭＶベクターを対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原を含む。

【0060】

Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原は、ウイルス病原体のいずれの部分にも由来し得る。Ｂ型肝炎抗原として、コアタンパク質、エンベロープタンパク質、表面タンパク質、Ｘタンパク質、およびポリメラーゼタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６、およびＵＬ１４７またはそれらのホモログ、またはそれらのオーソログ（他の種に感染するＣＭＶの相同遺伝子）をコードする核酸配列に突然変異が存在するため、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質を発現しない。突然変異は、活性タンパク質の発現の欠如をもたらすものであればいかなる突然変異でもあり得る。前述の突然変異には、点突然変異、フレームシフト突然変異、タンパク質をコードする配列の全体よりも短い配列の欠失（切断突然変異）、またはタンパク質をコードする核酸配列のすべての欠失、または任意の他の突然変異が含まれ得る。

【0062】

さらなる例において、ＣＭＶベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６、およびＵＬ１４７タンパク質の発現を阻害するアンチセンスまたはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含むベクター中の核酸配列の存在により、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質を発現しない。突然変異および／またはアンチセンスおよび／またはＲＮＡｉを任意の組み合わせで使用して、活性ＵＬ１２８活性、活性ＵＬ１３０、活性ＵＬ１４６、および活性ＵＬ１４７を欠くＣＭＶベクターを生成することができる。

【0063】

一部の実施形態では、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ－Ｅによって提示されるＨＢＶエピトープを指向したものであることを特徴とする。ＣＤ８＋Ｔ細胞のさらなる例では、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣ－Ｅによって拘束される。一部の実施形態では、ＨＢＶ特異的ＭＨＣ－Ｅによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ベクターで免疫された他の対象の少なくとも９０％が共有するペプチドを認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣ－Ｅによって提示されるＨＢＶスーパートープに対するものである。一部の実施形態では、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ－ＩＩによって提示されるエピトープを指向したものであることを特徴とする。さらなる例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣ－ＩＩによって拘束される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩによって拘束されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＢＶベクターで免疫された他の対象の少なくとも９０％が共有するペプチドを認識する。一部の実施形態では、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ－ＩＩによって提示されるＨＢＶスーパートープに対するものである。

【0064】

一部の実施形態では、本方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を特定することをさらに含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、本方法は、ＨＢＶのＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をさらに含む。

【0065】

一部の実施形態では、本方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を特定することをさらに含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ－ＩＩ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、本方法は、ＨＢＶのＭＨＣ－ＩＩスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をさらに含む。

【0066】

ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する方法も本明細書に開示される。この方法は、ＣＭＶベクターを生成するのに有効な量でＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを第１の対象（または動物）に投与することを含む。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードする第１の核酸配列を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原はＢ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、またはポリメラーゼ抗原であり得る。

【0067】

この方法は、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をＣＤ８＋Ｔ細胞のセットから特定することをさらに含み、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、この方法は、第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターとを含む発現ベクターによって、１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞をトランスフェクトし、それによって、ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する１つ以上のトランスフェクトしたＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することをさらに含み得る。発現ベクターによるトランスフェクションのための１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞は、第１の対象または第２の対象から単離され得る。

【0068】

一部の実施形態では、本方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を特定することをさらに含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、本方法は、ＭＨＣ－Ｅスーパートープを認識するＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をさらに含む。

【0069】

（１）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶペプチド複合体を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のセットを生成するのに有効な量で、少なくとも１つのＨＢＶ抗原を含む組み換えＣＭＶベクターを第１の対象に投与するステップと、（２）ＭＨＣ－Ｅ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をＣＤ８＋Ｔ細胞のセットから特定するステップと、（３）第１の対象または第２の対象から１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、（４）発現ベクターによって第１の対象または第２の対象単離した１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞をトランスフェクトし、それによって、ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶペプチド複合体を認識するトランスフェクトしたＴ細胞を生成するステップと、を含む方法によって調製された、ＭＨＣ－Ｅ－ＨＢＶペプチド複合体を認識するトランスフェクトしたＣＤ８＋Ｔ細胞も開示される。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つのＨＢＶ抗原をコードする第１の核酸配列を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質、活性ＵＬ１３０タンパク質、活性ＵＬ１４６タンパク質、および活性ＵＬ１４７タンパク質またはそれらのオーソログを発現しない。発現ベクターは、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列に機能し得るように連結されたプロモーターとを含み、第２のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体は第１のＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを含む。Ｂ型肝炎抗原はＢ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、またはポリメラーゼ抗原であり得る。

【0070】

一部の実施形態では、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％がＭＨＣ－ＩＩによって提示されるＨＢＶエピトープを指向したものであることを特徴とする。さらなる例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％がＭＨＣ－ＩＩによって拘束される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＢＶベクターで免疫された他の対象の少なくとも９０％が共有するペプチドを認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ－ＩＩによって提示されるＨＢＶスーパートープに対するものである．

【0071】

一部の実施形態では、本方法は、ＣＭＶ／ＨＢＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞受容体を特定することをさらに含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣ－ＩＩ／ＨＢＶ抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体はＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態では、本方法は、ＭＨＣ－ＩＩ制限ＨＢＶスーパートープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞受容体をさらに含む。

【0072】

ヒトまたは動物ＣＭＶベクターは、ベクターとして使用する場合、ヒトなどの選択した対象において先天的に非病原性である。一部の実施形態では、ＣＭＶベクターは、選択した対象において非病原性（宿主内または宿主から宿主への蔓延ができない）となるように改変されている。

【0073】

ＨＢＶ抗原は、本明細書に記載の通り、いずれのＨＢＶタンパク質またはこれらの断片でもあり得る。

【0074】

本明細書に開示されている組み換えＣＭＶベクターは、ヒトサイトメガロウイルスベクター、アカゲザルサイトメガロウイルスベクター、またはカニクイザルベクターに由来し得る。

【0075】

本明細書に開示されている組み換えＣＭＶベクターは、組み換えＣＭＶウイルスまたはベクターと、医薬的に許容され得る担体または希釈剤とを含む免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物として使用され得る。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含有する免疫学的組成物は、局所的または全身的な免疫学的応答を誘発する。応答は防御的であり得るが、防御的である必要はない。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含有する免疫原性組成物も同様に、防御的であり得るが防御的である必要はない局所的または全身的免疫学的応答を誘発する。ワクチン組成物は、局所的または全身的な防御応答を誘発する。したがって、「免疫学的組成物」および「免疫原性組成物」という用語は、（２つの用語が防御的組成物であり得るので）「ワクチン組成物」を含む。

【0076】

本明細書に開示されている組換えＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルスまたはベクターおよび医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫学的応答を誘導する方法において使用され得る。

【0077】

本明細書に開示されている組換えＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルスまたはベクター、および医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物において使用され得る。本明細書に開示されているＣＭＶベクターは、ＨＢＶ抗原をコードする配列を含むＤＮＡをＣＭＶゲノムの必須または非必須領域に挿入することによって調製され得る。この方法は、ＣＭＶゲノムから１つ以上の領域を欠失させることをさらに含み得る。この方法は、インビボ組換えを含み得る。したがって、この方法は、ＣＭＶゲノムの一部と相同なＤＮＡ配列に隣接する異種ＤＮＡを含むドナーＤＮＡの存在下において細胞適合性培地中でＣＭＶ ＤＮＡを細胞にトランスフェクトすることを含み得、それによって異種ＤＮＡがＣＭＶのゲノムに導入され、次いで、場合によりインビボ組換えによって改変されたＣＭＶを回収することも含み得る。この方法はまた、ＣＭＶ ＤＮＡを切断して切断されたＣＭＶ ＤＮＡを得ること、異種ＤＮＡを切断されたＣＭＶ ＤＮＡに連結してハイブリッドＣＭＶ－異種ＤＮＡを得ること、ハイブリッドＣＭＶ－異種ＤＮＡで細胞をトランスフェクトすること、次いで場合によりＨＢＶＤＮＡの存在によって改変されたＣＭＶを回収してもよいことを含み得る。インビボ組換えが含まれるため、結果的にこの方法はまた、ＣＭＶにとって外来のポリペプチドをコードするＣＭＶに天然には存在しないドナーＤＮＡを含むプラスミドも提供し、ドナーＤＮＡは、ＣＭＶの必須または非必須領域からのＤＮＡがドナーＤＮＡに隣接するように、ＣＭＶゲノムの必須または非必須領域とそれ以外は共線状であるＣＭＶ ＤＮＡのセグメント内にある。ＨＢＶＤＮＡをＣＭＶに挿入することで、そのＤＮＡの安定した組込みおよびその発現をもたらす任意の配向で組換えＣＭＶを生成することができる。

【0078】

組換えＣＭＶベクター中のＨＢＶ抗原をコードするＤＮＡはまた、プロモーターを含み得る。プロモーターは、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）、アカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）、マウス、または他のＣＭＶプロモーターなどの内因性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むヘルペスウイルスなどのいずれの供給源に由来し得る。プロモーターはまた、ＥＦ１αプロモーターなどの非ウイルスプロモーターであり得る。プロモーターは切断型転写活性プロモーターであり得、これは、ウイルスによって提供されるトランス活性化タンパク質でトランス活性化された領域と、切断型転写活性プロモーターが由来する完全長プロモーターの最小プロモーター領域とを含む。プロモーターは、最小プロモーターおよび上流調節配列に対応するＤＮＡ配列の会合体から構成され得る。最小プロモーターは、ＣＡＰ部位＋ＡＴＡボックス（転写の基本レベルの最小配列；転写の非調節レベル）から構成され、「上流制御配列」は、複数の場合もある上流エレメントおよび複数の場合もあるエンハンサー配列から構成される。さらに、用語「切断型（の）」は、完全長プロモーターが完全な状態では存在していないこと、すなわち、完全長プロモーターの一部が除去されていることを示す。また、切断型プロモーターは、ＭＣＭＶまたはＨＣＭＶなどのヘルペスウイルス、例えばＨＣＭＶ－ＩＥまたはＭＣＭＶ－ＩＥに由来し得る。塩基対に基づくと、完全長プロモーターから最大４０％、さらには最大９０％のサイズ縮小があり得る。プロモーターはまた、改変された非ウイルスプロモーターであり得る。ＨＣＭＶプロモーターに関しては、米国特許第５，１６８，０６２号明細書および第５，３８５，８３９号明細書を参照されたい。細胞から発現させるためにプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることに関しては、Ｆｅｉｇｎｅｒら（１９９４），Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０－２５６１に記載されている。また、様々な感染症に対するワクチン接種の簡単で効果的な方法としてのプラスミドＤＮＡの直接注射に関しては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５－４９，１９９３を参照されたい。したがって、ベクターがベクターＤＮＡの直接注入によって使用され得ることは、本開示の範囲内に含まれる。

【0079】

また、切断型転写活性プロモーターを含む組換えウイルスまたはプラスミドに挿入され得る発現カセットも開示されている。発現カセットは、機能的切断型ポリアデニル化シグナル、例えば、切断されているが機能的であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。天然ではより大きなシグナルが提供されることを考慮すると、切断型ポリアデニル化シグナルが機能的であることは実に驚くべきことである。切断型ポリアデニル化シグナルは、ＣＭＶなどの組換えウイルスの挿入サイズ制限問題に対処している。発現カセットはまた、それが挿入されるウイルスまたは系に関連するＨＢＶＤＮＡを含み得、ＤＮＡは、本明細書に記載のＨＢＶＤＮＡであり得る。

【0080】

ワクチンまたは免疫学的組成物に使用するためのＨＢＶ抗原については、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（第２４版、１９８２年）、例えばワクチンの定義（ワクチン製剤に使用される抗原のリストについて）も参照されたい。そのような抗原またはそれらの抗原からの目的のエピトープが使用され得る。ＨＢＶ抗原に関して、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸および対応するＤＮＡ配列の知識から、ならびに特定のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷など）およびコドン辞書から、抗原およびそのコードＤＮＡを選択し得るはずである。典型的な抗原として、Ｂ型肝炎ウイルスコア、エンベロープ、表面、Ｘ、またはポリメラーゼ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

【0081】

ＨＢＶ抗原のＴエピトープを決定する１つの方法は、エピトープマッピングを含む。異種抗原の重複ペプチドは、オリゴペプチド合成によって生成される。次いで、個々のペプチドを、天然タンパク質によって誘発される抗体に結合するか、またはＴ細胞もしくはＢ細胞の活性化を誘導するそれらの能力について試験する。このアプローチは、Ｔ細胞がＭＨＣ分子と複合体形成した短い線状ペプチドを認識するので、Ｔ細胞エピトープのマッピングに特に有用であった。

【0082】

ＨＢＶ抗原に対する免疫応答は、一般に以下のように生じる：Ｔ細胞は、タンパク質がより小さなペプチドに切断され、別の細胞の表面に位置する「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）」と呼ばれる複合体中に提示されたときのみ、タンパク質を認識する。ＭＨＣ複合体にはクラスＩおよびクラスＩＩの２つのクラスがあり、各クラスは多くの異なる対立遺伝子から構成される。異なる種、および個々の対象は、異なるタイプのＭＨＣ複合体対立遺伝子を有し、それらは異なるＭＨＣタイプを有すると言われる。ＭＨＣクラスＩ分子の１つのタイプは、ＭＨＣ－Ｅ（ヒトにおけるＨＬＡ－Ｅ、ＲＭにおけるＭａｍｕ－Ｅ、マウスにおけるＱａ－ｌｂ）と呼ばれる。

【0083】

ＨＢＶ抗原をコードする配列を含むＤＮＡは、それ自体がＣＭＶベクターにおける発現を駆動するためのプロモーターを含み得るか、またはＤＮＡは異種抗原のコードＤＮＡに限定され得ることが知られている。この構築物は、内因性ＣＭＶプロモーターに対して、プロモーターに機能し得るように連結され、それによって発現されるような配向で配置され得る。さらに、異種抗原をコードするＤＮＡの複数のコピー、または強いもしくは初期プロモーターもしくは初期および後期のプロモーターの使用、またはそれらの任意の組合せは、発現を増幅または増加させるために行われ得る。したがって、異種抗原をコードするＤＮＡは、ＣＭＶ内因性プロモーターに対して適切に配置され得るか、またはそれらのプロモーターは、異種抗原をコードするＤＮＡと共に別の位置に挿入されるように転座され得る。２つ以上の異種抗原をコードする核酸をＣＭＶベクターにパッケージングすることができる。

【0084】

開示されたＣＭＶベクターを含有する医薬組成物および他の組成物がさらに開示されている。前述の医薬組成物および他の組成物は、当技術分野で知られている任意の投与手順で使用されるように製剤化され得る。前述の医薬組成物は、非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内など）を介して投与され得る。投与はまた、粘膜経路、例えば、経口、経鼻、生殖器などを介してもよい。

【0085】

開示されている医薬組成物は、当業者に周知の標準的な技術に従って調製され得る。前述の組成物は、特定の患者の種族または種、年齢、性別、体重および状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、当業者に周知の投与量および技術によって投与され得る。組成物は、単独で投与されてもよく、または他のＣＭＶベクターと、または他の免疫学的組成物、抗原性組成物もしくはワクチン組成物もしくは治療用組成物と同時投与または逐次投与されてもよい。前述の他の組成物は、精製された天然の抗原もしくはエピトープまたは組換えＣＭＶベクターもしくは別のベクター系による発現からの抗原もしくはエピトープを含み得、上記要因を考慮して投与される。

【0086】

組成物の例としては、懸濁液、シロップまたはエリキシルなど、開口部、例えば経口、経鼻、肛門、生殖器、例えば膣などを経た投与のための液体調製物、および滅菌懸濁液またはエマルジョンなど、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例、注射可能液投与）のための調製物が挙げられる。前述の組成物において、組換え体は、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混合した状態であり得る。

【0087】

抗原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物は、典型的には、アジュバントと、所望の応答を誘発するためのある一定量のＣＭＶベクターまたは発現産物とを含み得る。ヒトへの適用では、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。研究および獣医学用途で使用されるサポニンおよびその精製成分Ｑｕｉｌ Ａ、フロイント完全アジュバントおよび他のアジュバントは、ヒトワクチンにおいてそれらを使用する可能性を制限する毒性を有する。化学的に規定された調製物、例えばムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、リン脂質コンジュゲート、例えばＧｏｏｄｍａｎ－Ｓｎｉｔｋｏｆｆら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０－４１５（１９９１）に記載されたもの、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９－１７４４（１９９２）に記載されたプロテオリポソーム内でのタンパク質の封入、およびＮｏｖａｓｏｍｅ脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ Ｖｅｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ、Ｎ．Ｈ．）などの脂質小胞へのタンパク質の封入も使用することができる。

【0088】

組成物は、非経口（例えば、筋肉内、皮内または皮下）投与または開口部投与、例えば、舌周囲（例えば、経口）投与、胃内投与、口腔内、肛門内、膣内などを含む粘膜投与による免疫化のための単一剤形に包装されてもよい。また同様に、有効な投薬量および投与経路は、組成物の性質、発現産物の性質、組換えＣＭＶが直接使用される場合は発現レベル、および宿主の種族または種、年齢、性別、体重、状態および性質などの既知の要因、ならびにＬＤ５０および既知であり過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によって決定される。発現産物の投与量は、数マイクログラム～数百マイクログラム、例えば５μｇ～５００μｇの範囲であり得る。ＣＭＶベクターは、これらの投与量レベルでの発現を達成するために任意の適切な量で投与され得る。非限定的な例では、ＣＭＶベクターは少なくとも１０^２ｐｆｕの量で投与され得、すなわち、ＣＭＶベクターは、少なくともこの量で投与され得るか、または約１０^２ｐｆｕ～約１０^７ｐｆｕの範囲の量で投与され得る。他の適切な担体または希釈剤は、保存剤の有無にかかわらず、水または緩衝生理食塩水であり得る。ＣＭＶベクターは、投与時に再懸濁するために凍結乾燥されてもよく、または溶解状態であってもよい。「約」は、定義した値の１％、５％、１０％または２０％内を意味し得る。

【0089】

本開示のタンパク質およびそれらをコードする核酸が、本明細書で具体例として示され、記載された正確な配列とは異なり得ることは言うまでもない。したがって、本開示は、配列が本開示の方法に従って機能する限り、示された配列に対する欠失、付加、切断および置換を考慮に入れている。これに関して、置換は、一般に、本質的に保存的であり、すなわち、アミノ酸の一ファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は一般に４つのファミリー：（１）酸性－アスパルタートおよびグルタマート、（２）塩基性－リジン、アルギニンおよびヒスチジン、（３）非極性－アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン、（４）非荷電極性－グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることがある。イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの単独置換、またはその逆、グルタマートによるアスパルタートの単独置換またはその逆、セリンによるトレオニンの単独置換またはその逆、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないことが合理的に予測可能である。したがって、記載されたタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的な影響を及ぼすことがない軽微なアミノ酸置換を有するタンパク質は、本開示の範囲内に含まれる。

【0090】

本開示のヌクレオチド配列は、コドン最適化されていてもよく、例えば、コドンは、ヒト細胞における使用のために最適化されていてもよい。例えば、いかなるウイルスまたは細菌配列でもそのように改変され得る。ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスでは、多数の稀少コドンが用いられており、これらのコドンを所望の対象で一般的に使用されるコドンに対応するように改変することによって、Ａｎｄｒｅら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７－１５０３、１９９８に記載されているようにＨＢＶ抗原の発現増強が達成され得る。

【0091】

ＣＭＶベクターおよびその中に含まれる糖タンパク質の機能的および／または抗原的に等価なバリアントおよび誘導体をコードするヌクレオチド配列が検討される。これらの機能的に等価なバリアント、誘導体およびフラグメントは、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされたアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列の変化、ならびにアミノ酸残基の保存的置換、１つまたは少数のアミノ酸の欠失または付加、およびアミノ酸類似体によるアミノ酸残基の置換をもたらす変化は、コードされたポリペプチドの特性に大幅な影響を与えることはないものである。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／トレオニン／メチオニン、リジン／アルギニン、およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態において、バリアントは、目的の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチドまたはポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。

【0092】

配列同一性または相同性は、配列ギャップを最小化しながら重複および同一性を最大化するように整列させたときに配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、いくつかの数学的アルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：５８７３－５８７７の場合と同様に修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０；８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムである。

【0093】

配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの他の例として、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ １９８８；４：１１－１７のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４が使用され得る。局所的な配列類似性の領域を特定し、アライメントするためのさらに別の有用なアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８；８５：２４４４－２４４８に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。

【0094】

本開示による使用に好都合なのは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアである。いくつかのＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム用のＷＵ－ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラムは、ｆｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓからダウンロードすることができる。このプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、このバージョン１．４は、腫瘍において、パブリックドメインのＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいている。（ＡｌｔｓｃｈｕｌおよびＧｉｓｈ，１９９６，Ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－ ４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９０；２１５：４０３－４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ，１９９３；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６－２７２；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７、それらのすべてが参照によって本開示に含まれるものとする）。

【0095】

本開示の様々な組換えヌクレオチド配列ならびに抗体および／または抗原は、標準的な組換えＤＮＡおよびクローニング技術を使用して作製される。そのような技術は当業者に周知である。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を参照されたい。

【0096】

本開示のヌクレオチド配列は「ベクター」に挿入され得る。「ベクター」は、当業者によって幅広く使用され、理解されており、本明細書で「ベクター」は、当業者にとってそれが意味するものに沿って使用される。例えば、「ベクター」は、１つの環境から別の環境への核酸分子の移動を可能もしくは促進するか、または核酸分子の操作を可能もしくは促進する媒体を指すものとして当業者によって慣用されている。

【0097】

本開示のウイルスの発現を可能にするいずれのベクターも、本開示に従って使用され得る。特定の実施形態において、開示されたウイルスは、コードされた異種抗原（例えば、病原特異的抗原、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎抗原、および抗体）を製造するためにインビトロで（例えば、無細胞発現系を使用して）および／またはインビトロで増殖させた培養細胞で使用され得、次いで、タンパク質性ワクチンの製造などの様々な用途に使用され得る。前述の用途の場合、インビトロおよび／または培養細胞におけるウイルスの発現を可能にするものであればいかなるベクターでも使用することができる。

【0098】

開示された異種抗原を発現させるために、異種抗原のタンパク質コード配列は、タンパク質の転写および翻訳を指示する調節配列または核酸制御配列に「機能し得るように連結された」状態であるべきである。本明細書で使用される場合、コード配列と核酸制御配列またはプロモーターが、コード配列の発現または転写および／または翻訳を核酸制御配列の影響下または制御下に置くような形で共有結合されている場合にそれらは「機能し得るように連結された」と言われる。「核酸制御配列」は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、およびそれに機能し得るように連結された核酸配列またはコード配列の発現を指示する本明細書に記載される他のエレメントなど、いずれかの核酸エレメントであり得る。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りに集中しており、本開示のタンパク質コード配列に機能し得るように連結されたときに、コードされたタンパク質の発現を誘導する一群の転写制御モジュールを指す。本開示の導入遺伝子の発現は、限定されないが、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、または重金属などの何らかの特定の外部刺激因子にさらされた場合にのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。プロモーターはまた、特定の細胞型、組織または臓器に特異的であり得る。多くの適切なプロモーターおよびエンハンサーが当技術分野では既知であり、いずれかのかかる適切なプロモーターまたはエンハンサーが、本開示の導入遺伝子の発現のために使用され得る。例えば、適切なプロモーターおよび／またはエンハンサーは、真核生物プロモーターデータベース（ＥＰＤＢ）から選択され得る。

【0099】

本開示に従って使用されるベクターは、本開示の抗原が発現され得るように、プロモーターまたはエンハンサーなどの適切な遺伝子調節領域を含み得る。

【0100】

本明細書に記載されたＣＭＶベクターは、宿主から宿主への伝播を妨げることができ、それにより、ウイルスが、免疫無防備状態の対象またはＣＭＶ感染の結果として合併症に直面し得る他の対象に感染することができないようにする突然変異を含み得る。本明細書に記載のＣＭＶベクターはまた、免疫優性エピトープおよび非免疫優性エピトープの提示ならびに非カノニカルＭＨＣ拘束をもたらす突然変異を含み得る。しかしながら、本明細書に記載のＣＭＶベクターにおける突然変異は、ＣＭＶに以前に感染したことがある対象を再感染させるベクターの能力に影響を及ぼさない。前述のＣＭＶ突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１３－０１３６７６Ｓ号明細書、第２０１０－０１４２Ｓ２３号明細書、２０１４－０１４１０３Ｓ号明細書、およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１４／１３Ｓ２０９号に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。

【0101】

開示されたＣＭＶベクターは、例えば、高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＭＨＣ－ＥまたはＭＨＣ－ＩＩ（またはそのホモログもしくはオーソログ）によって拘束されていることを特徴とする免疫応答を含む、ＣＤ８＋免疫応答を含む免疫原性応答を生じさせることを目的とする場合、インビボで投与され得る。例えば、いくつかの例では、ＲｈＣＭＶを使用した免疫原性組成物およびワクチンの前臨床試験を行うために、アカゲザルなどの実験動物において、開示されたＣＭＶベクターを使用することが望ましい場合がある。他の例では、臨床試験における場合およびＨＣＭＶを使用する免疫原性組成物の実際の臨床使用のためなど、開示されたＣＭＶベクターをヒト対象で使用することが望ましいことになる。

【0102】

そのようなインビボ適用のために、開示されたＣＭＶベクターは、医薬的に許容され得る担体をさらに含む免疫原性組成物の一成分として投与される。一部の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、病原特異的抗原を含む異種抗原に対する免疫応答を刺激するのに有用であり、病原性感染の予防、改善または治療のための病原特異的抗原に対する予防用または治療用ワクチンの１つ以上の成分として使用され得る。本開示の核酸およびベクターは、遺伝子ワクチン、すなわち本開示の抗原をコードする核酸をヒトなどの対象に送達するためのワクチンを提供するために特に有用であり、その結果、抗原が対象において発現されることで免疫応答が誘発される。

【0103】

免疫化スケジュール（またはレジメン）は、動物（ヒトを含む）について周知であり、特定の対象および免疫原性組成物について容易に決定され得る。したがって、免疫原を対象に１回または複数回投与することもあり得る。好ましくは、免疫原性組成物の個別の投与の間に設定された時間間隔がおかれる。この間隔は、対象ごとに異なるが、典型的には、１０日間～数週間の範囲であり、多くの場合、２週間、４週間、６週間または８週間である。ヒトの場合、間隔は典型的には２～６週間である。本開示の特に有利な実施形態では、間隔はより長く、有利には約１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、３２週間、３４週間、３６週間、３８週間、４０週間、４２週間、４４週間、４６週間、４８週間、５０週間、５２週間、５４週間、５６週間、５８週間、６０週間、６２週間、６４週間、６６週間、６８週間、または７０週間である。免疫化レジメンには、典型的には免疫原性組成物の１～６回の投与が含まれるが、わずか１回または２回または４回の投与が含まれることもある。免疫応答を誘導する方法はまた、免疫原と共にアジュバントを投与することを含み得る。場合によっては、年１回、年２回または他の長い間隔（５～１０年）のブースター免疫化により初期免疫化プロトコルが補完され得る。本方法はまた、様々なプライム－ブーストレジメンを含む。これらの方法では、１回以上のプライミング免疫化の後に１回以上のブースティング免疫化が続く。実際の免疫原性組成物は、各免疫化について同じであっても異なっていてもよく、免疫原性組成物のタイプ（例、タンパク質または発現ベクターを含む）、経路、および免疫原の製剤も変化し得る。例えば、発現ベクターがプライミングステップおよびブースティングステップに使用される場合、それは同じ型または異なる型（例えば、ＤＮＡまたは細菌もしくはウイルス発現ベクター）のいずれであってもよい。一つの有用なプライムブーストレジメンでは、４週間間隔で２回のプライミング免疫化が行われ、続いて最後のプライミング免疫化の４週間後および８週間後に２回のブースティング免疫化が行われる。プライミングレジメンおよびブースティングレジメンを実現させるために本開示のＤＮＡ発現ベクター、細菌発現ベクターおよびウイルス発現ベクターを使用して包含されるいくつかの順列および組合せが存在することも、当業者には自明の理であるはずである。ＣＭＶベクターは、異なる病原体に由来する異なる抗原を発現しながら繰り返し使用され得る。

【実施例】

【0104】

実施例１：ＲＨＣＭＶ／ＨＢＶ接種アカゲザルはＨＢＶ抗原に対するＭＨＣ－Ｅ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を行う
抗原標的を発現するように操作されたＲｈＣＭＶ６８－１株ベクターは、非古典分子ＭＨＣ－Ｅ、通常ＮＫ細胞シグナル伝達に関与する単形ＭＨＣクラスＩｂ分子、またはＭＨＣ－ＩＩのいずれかによって拘束された、広範なエフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）抗原を発現するＲｈＣＭＶワクチンベクターは、高病原性株ＳＩＶｍａｃ２３９の低用量直腸内および膣内反復チャレンジによりＲＭの５０％を保護した。

【0105】

ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶによって誘導された非従来型拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＨＢＶ感染肝細胞を認識するかどうかを明らかにした。これらのユニークなＣＤ８＋Ｔ細胞拘束分子を標的とすることは、ＨＢＶ感染治療の新しいパラダイムを構成すると考えられ、ヒトとサルの間でＭＨＣ－Ｅが極めて保存されていることから、理論的にはすべての患者に普遍的に適用することが可能である。（Ｗｕら，２０１８．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＭＨＣ－Ｅ ｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｉｓ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｏｎｇ ヒトｓ，Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ，ａｎｄ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：４９－６０）。

【0106】

４匹のアカゲザル（ＲＭ）に、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗコア、表面、及び／又はポリメラーゼ抗原を発現するＲｈＣＭＶ６８－１株を接種した。遺伝子型Ｄ、血清型ａｙｗＨＢＶコア、ポリメラーゼ、およびＳ Ａｇ遺伝子断片は、以前に記載されたプラスミドからＰＣＲによって単離された（Ｆｒａｎｋ Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。プラスミドｐＣＤＮＡ３－ＰＯＬ／ＥＮＶから得られたポリメラーゼのＮ末端の３３３アミノ酸（Ｋａｋｉｍｉ，Ｋ．ら，２００２．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ タンパク質：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ウイルス ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８６０９－８６２０）をＣ末端ＨＡ－エピトープでタグ付けし、ＰＣＲ媒介変異誘発によってプラスミドｐＣＭＶ－Ｓ２／Ｓから得られたＳ ＡｇのＣ末端の２２８アミノ酸に融合して（Ｍｉｃｈｅｌ，Ｍ．Ｌ．ら，１９９５．ＤＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｉｃｅ：ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｉｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ウイルス ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ヒトｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５３０７－５３１１．）融合Ｓ／ＰｏｌＮを生成した（左フォワードプライマー：
５９－ＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧ－３９（配列番号１）、左リバースプライマー：５９－ＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣ－３９（配列番号２）、右フォワードプライマー：５９－ＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣ－３９（配列番号３）、右リバースプライマー：５９－ＧＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧ－３９（配列番号４））。最終ＰＣＲ産物を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）リコンビニアリング用テンプレートであるようにｐＪｅｔベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはｐＯＲＩにｂｌｕｎｔ末端クローンニングして発現を評価した。プラスミドｐＣＤＮＡ３－ＰＯＬ／ＥＮＶから得られたポリメラーゼのＣ末端の４１６アミノ酸を（Ｋａｋｉｍｉ，Ｋ．ら，２００２．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８６０９－８６２０）ＰＣＲ媒介変異誘発によってＨＡ－エピトープでタグ付けし、ｐＯＲＩに挿入した（フォワードプライマー：５９－ＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧ－３９（配列番号５）、リバースプライマー：５９－ＴＣＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣ－３９（配列番号６））。Ｃｏｒｅをコードする遺伝子をプラスミドｐＣＤＮＡ－ＣＯＲＥ（２２）からＰＣＲ増幅し、ｐＯＲＩに挿入した（フォワードプライマー：５９－ＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧ－３９（配列番号７）、リバースプライマー：５９－ＣＴＡＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧ－３９（配列番号８））。その後、Ｃ末端のポリメラーゼ断片をＫｐｎＩおよびＳａｌＩを用いてＣｏｒｅの下流に挿入して、ＨＢＶコアおよびポリメラーゼのＣ末端の融合タンパク質（Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣ）を生成した。ＫｐｎＩ部位は、２－アミノ酸（ＧＴ）リンカーを２つのタンパク質の間に追加する。６８－１ＲｈＣＭＶ／Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣおよび６８－１ＲｈＣＭＶ／Ｓ／ＰｏｌＮを生成するために、６８－１ＲｈＣＭＶＢＡＣにおけるｐｐ７１をコードするＲｈ１１０遺伝子（Ｃｈａｎｇ，Ｗ．Ｌ．Ｗ．ら，２００３．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｒｈｅｓｕｓ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ａｓ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏ一部の ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ウイルス ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５０７３－５０８３）を、修飾ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）選択システム、望ましくない異種配列を導入せずにＤＮＡ修飾を可能にする２段階の方法を用いて置き換えた（Ｗａｒｍｉｎｇ，Ｓ．ら，２００５．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ３６）。Ｒｈ１１０の置換を使用して、健常者のＡｇ応答を誘発する一方で６８－１ＲｈＣＭＶベクターを弱毒化できることが最近実証された（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｅ．Ｅ．ら，２０１９．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｈｏｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１：ｅａａｗ２６０３ １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｗ２６０３）。

【0107】

Ｒｈ１１０を除くために、６８－１ＲｈＣＭＶ ＢＡＣを含むコンピテントＳＷ１０５細菌を、Ｒｈ１１０に対し５０－ｂｐの隣接相同性を有するｇａｌＫ／カナマイシンカセットを含むＰＣＲ生成物でエレクトロポレーションした。陽性選択のためにカナマイシン／クロラムフェニコールＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉアガーに３０℃で細菌を蒔いた。ｇａｌＫ／カナマイシンカセットをＨＢＶ融合遺伝子に置き換えるために、Ｒｈ１１０に対し同じ隣接相同性を有するＨＢＶＳ－ＰｏｌＮ融合またはＨＢＶＣｏｒｅ－ＰｏｌＣ融合を含むＰＣＲ生成物をエレクトロポレーションし、陰性選択のために、グリセロールを炭素源として有する２－デオキシ－ガラクト（イヌ）クロラムフェニコール最小培地プレートに細菌を蒔いた。相同組み換え用ＰＣＲプライマーは以下の通りである：Ｒｈ１１０ Ｓ／ＰｏｌＮフォワード：５９－ＧＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴ－３９（配列番号９）、Ｒｈ１１０ Ｓ／ＰｏｌＮリバース：５９－ＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＴＧＧＴＡＣＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴ－３９（配列番号１０）およびＲｈ１１０ Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣフォワード：５９－ＧＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴ－３９（配列番号１１）、Ｒｈ１１０ Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣリバース：５９－ＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＴＧＧＴＡＣＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴ－３９（配列番号１２）。６８－１ＲｈＣＭＶ／Ｃｏｒｅを生成するために、ｐＣＤＮＡ－ＣＯＲＥからＨＢＶコア遺伝子を増幅し、ＰＣＲによってＮ末端のＦＬＡＧ－タグを導入した（フォワードプライマー：５９－ＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧ－３９（配列番号１３）、リバースプライマー：５９－ＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧ－３９）（配列番号１４）。増幅産物を、ＥＦ１ａプロモーターの下流のｐＯＲＩにクローニングした。この発現カセットを、６８－１ＲｈＣＭＶのＲｈ２１１領域に、フリッパーゼ認識標的部位に隣接したＫａｎ耐性カセットと共に、相同組み換えによって、Ｒｈ２１１の領域と５０－ｂｐ相同性を有するプライマーを使用して挿入した（フォワードプライマー：５９－ＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＧＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧ－３９（配列番号１５）、リバースプライマー：５９－ＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＣＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＴＡＣＧＴＴＡＡＡＣ－３９（配列番号１６））。生体内組み換えおよびＫａｎ耐性選択した組換体のために、ＲｈＣＭＶ ６８－１ ＢＡＣを含むＥＬ２５０細菌にＰＣＲ断片をエレクトロポレーションした。Ｋａｎ耐性カセットを、温度によって誘発されたフリッパーゼ組み換えによって除去した。生じたＢＡＣを、制限消化、組み換え部位のＰＣＲ分析、およびＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒでの次世代配列決定によって分析した。この配列分析によって、Ｓ／ＰｏｌＮｔｈａｔの２つの点変異がＰＣＲ増幅中に導入され、Ｓ Ａｇのアミノ酸交換Ａ１１８ＴおよびＴ１２５Ｍを生じたことが明らかとなった。ＢＡＣ ＤＮＡを、ａｌｋａ株溶解、フェノール／クロロホルム抽出、およびイソプロパノール沈殿を用いて精製し、ＢＡＣ ＤＮＡの形質移入によって、テロメル化ｐｐ７１発現アカゲザル線維芽細胞または初代アカゲザル線維芽細胞のリポフェクタミン２０００（製造業者Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのプロトコルに従って）を用いて、ウイルスを再構成した（Ｗａｒｍｉｎｇ，Ｓ．ら，２００５．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ３６）。テロメル化ＲＭ線維芽細胞を６８－１ＲｈＣＭＶ／Ｓｕｒｆａｃｅ／ＰｏｌＮまたはＲｈＣＭＶ／Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣに感染させることによって、ＨＢＶ Ａｇｓの発現を確認した。十分な細胞変性効果で細胞を回収し、ＳＤ試料緩衝液に溶解した。ＨＡでタグ付けされたＨＢＶタンパク質を含むｐＯＲＩ発現プラスミドでトランスフェクトした（リポフェクタミン２０００）２９３Ｔ細胞は陽性対照として機能した。電気泳動分離後、イムノブロットを抗ＨＡＡＢＭＭＳ－１０１Ｐ（Ｃｏｖａｎｃｅ ＭＭＳ）を用いて実施した。

【0108】

２匹のＲＭ（ＲＭ１、ＲＭ２）に両方６８－１ＲｈＣＭＶ／表面／ＰｏｌＮおよび６８－１ＲｈＣＭＶ／Ｃｏｒｅ／ＰｏｌＣベクターの両方を接種し、２匹の追加のＲＭ（ＲＭ３、ＲＭ４）に、ＥＦ１ａプロモーターの下でＨＢＶ Ｃｏｒｅを発現した６８－１ＲｈＣＭＶベースのベクターを接種した。Ａｇｓのそれぞれに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、使用それぞれＡｇに対応する重複する１５量体ペプチドのプールを使用して、ＩＣＳによって長期的にモニターした。ワクチン接種したＲＭの血液におけるこれらの抗原に対する長期的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を観察した（図１Ａ）。

【0109】

これらの動物でのＨＢＶコア（ＨＢｃＡｇ）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答のＭＨＣ拘束は、以前に説明されている通りＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩおよびＭＨＣ－Ｅによって特異的に提示を阻害する試薬による細胞内サイトカイン染色によって特徴付けられた（Ｈａｎｓｅｎら，２０１６．Ｂｒｏａｄｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：７１４－７２０；Ｈａｎｓｅｎら，２０１３．Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ベクター ｖｉｏｌａｔｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒａｄｉｇｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０：１２３７８７４－１２３７８７４．）。ＳＩＶまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を発現するＲｈＣＭＶ株６８－１と同様に、ＲｈＣＭＶ株６８－１／ＨＢＶベクターが、ＨＢｃＡｇペプチドの広い配列を標的とするＨＢＶ特異的な、ＭＨＣ－Ｅ－およびＭＨＣ－ＩＩ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発したことが見られた（図１Ｂ）。

【0110】

ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶのＭＨＣ－Ｅ拘束が、観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じたことをさらに確認するために、ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶワクチン接種ＲＭからの脾細胞を、単一のヒト（ＨＬＡ）またはアカゲザル（Ｍａｍｕ）ＭＨＣ－Ｅ対立遺伝子を発現するように形質導入したＫ５６２細胞（ＭＨＣ－Ｎｕｌｌ）で刺激し、図１Ｂでのブロッキングによって拘束されたＭＨＣ－Ｅとして同定された３つの個別のＨＢｃＡｇ１５量体ペプチドのうちの１つで瞬間適用した。ＭＨＣ－Ｅを発現する細胞のみこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞にＨＢｃＡｇ１５量体を提示できる。ＨＢｃＡｇに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－ＥおよびＭａｍｕ－Ｅの両方に関連して提示されたそれらの同種抗原を認識した（図１Ｃ）。これらの結果は、ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶワクチン接種ＲＭにおけるＭＨＣ－Ｅ拘束ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を実証し、さらに、高機能な保存霊長類ＭＨＣ－Ｅ分子を支持する。

【0111】

実施例２：ＨＢＶ感染初代肝細胞はインビトロでＭＨＣ－Ｅを発現する
次に、初代肝細胞がＭＨＣ－Ｅを発現するかどうか決定した。初代肝細胞（ＰＨ）を、３匹の無関係のＲＭおよび３人の無関係のヒトドナー（ＨＤ）から単離した。ＲＭ初代肝細胞を単離するために、ＲＭ肝臓の単葉を、２００ｍＬの予灌流培地（０．５ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｂｉｏ－Ｗｏｒｌｄ，ｃａｔ＃：４０１２０１２８－１）、１０ＩＵ／ｍｌヘパリン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，ｃａｔ＃：Ｃ５０４７３０）、カルシウムおよびマグネシウムを有するＨＢＳＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃：２４－０２０－１１７））で灌流し、続いてカルシウムおよびマグネシウムがない２００ｍＬのＨＢＳＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃：ＳＨ３００３１０３）で灌流して、残存するＥＧＴＡを除去した。次に、４２℃に温めた１００ｍｌのコラゲナーゼ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃：１１３２０－０８２）、１ｍＭ塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ＃：Ｃ５６７０－１００Ｇ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，ｃａｔ＃：ＳＨ３０２３７．０１）、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ＃：Ｃ９７２２－５０ＭＧ））を単葉に灌流し、廃棄した。この後、４２℃で、３０分間～１時間、肝葉のサイズに応じて７５～１５０ｍＬ／ｍｉｎの速度で、肝葉へ１５０ｍｌコラゲナーゼ培地を再循環させた。コラゲナーゼ灌流後、肝臓を外科用メスで切り刻み、残存するコラゲナーゼ培地で洗浄し、培地を茶こし器でろ過した。ＰＨを洗浄培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ウシ増殖血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，ｃａｔ＃：ＳＨ３０５４１０３）、２３ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．６ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ，ｃａｔ＃：ＳＨ３００３４０１）、１ｘ抗生物質／抗真菌薬（ＨｙＣｌｏｎｅ，ｃａｔ＃：ＳＶ３００７９０１）、および０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（生命技術，ｃａｔ＃：１５７５０－０６０））中室温で３回洗浄し、それぞれの洗浄の間に５０ｘ ｇで３分間遠心分離した。３回目の洗浄回転の前に、ＰＨを７０μＭフィルターに通して単細胞懸濁液を確実にした。その後、ＰＨを５０ｍｌの三角フラスコ中２０ｍｌの３６％等張パーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃：１７－０８９１－０１）に、ＰＨ培地を希釈剤（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ウシ増殖血清、２３ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．６ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ抗生物質／抗真菌薬、および０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン）として使用して懸濁し、２００ｘ ｇで、７分間遠心した。その後、精製したＰＨペレットを室温のＰＨ培地に再懸濁し、計数した。肝細胞用コラーゲン添加プレートを、０．０１％酢酸中０．２ｍｇ／ｍＬコラーゲンＲ（Ｓｅｒｖａ，ｃａｔ＃：４７２５４）を用いて調製し、１ｍｌのＨＢＳＳで洗浄する前に少なくとも２０分間プレート上に置き、その後すぐに２ｘ１０^５ＰＨ／ウェルで１２ウェルプレートに蒔いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で置いた。次の日、ウェルをＨＢＳＳで２回洗浄し、残りの実験のために、１．８％ＤＭＳＯを添加した１ｍｌのＰＨ培地（ＤＭＳＯを含む初代肝細胞培地、ＰＨ－ＤＭＳＯ）で培養した。

【0112】

ヒトドナー初代肝細胞（ＨＤ ＰＨ）をマウスヒト化肝臓から単離し、Ｙｅｃｕｒｉｓ，Ｉｎｃから購入した。ヒト化マウスを、患者から回収した凍結保存初代肝細胞を用いて生成し、人口統計は以下の通りであった：ＨＤ１（１３歳、女性、ヒスパニック、ＨＢＶ未感作）、ＨＤ２（１３歳、女性、白人、ＨＢＶ未感作）、ＨＤ３（２７歳、男性、白人、ＨＢＶ未感作）。

【0113】

ＲＭおよびＨＤのＰＨ ＭＨＣ提示を、Ｗ６／３２クローンによるバルクＭＨＣ－Ｉの表面発現、ＨＬＡ－ＤＲ染色によるＭＨＣ－ＩＩの表面発現、および４Ｄ１２クローンによるＭＨＣ－Ｅの表面発現によって決定した。以前に、４Ｄ１２は、Ｍａｍｕ－Ｅおよび非古典的Ｍａｍｕ－Ｉａ分子を特異的に染色することが実証されていたものである。すべての３人のヒトドナーは、１つのＨＬＡ－Ａおよび１つのＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を共有した（表１）。したがって、手順の前に、ＭＨＣ－Ｅ特異的な４Ｄ１２クローンがＨＬＡ－Ｅのみ染色し、３つのＨＤの間で共有されるＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－－Ｃ分子を染色しないことを確認した（図２Ａ）。ＭＨＣ－Ｅの発現を染色によって調べ、両方の種からの初代肝細胞の大部分はＭＨＣ－Ｅを発現した（図２Ｂおよび２Ｃ）。
表 １．ＨＤ ＰＨのＭＨＣ遺伝子型

【表1】

【0114】

ＨＢＶ感染が初代肝細胞表面のＭＨＣ－Ｅの発現に影響を与えるかどうかを調べるために、同じＨＢＶ感染ヒトドナーから初代肝細胞を採取した。単離したアカゲザル初代肝細胞を蒔いてから１日後に、肝臓特異的なＴＴＲプロモーター下でヒトＮＴＣＰ（ＭＯＩ １０）を発現する複製不全アデノウイルスセロタイプ５を添加して、２日間培養した。２日目に、細胞に１ｍｌのＰＨ－ＤＭＳＯ培地を再供給した。アデノウイルス形質導入後４日目に、初代肝細胞を１ｍｌのＨＢＳＳで２回洗浄し、１００のＭＯＩのＨＢＶ含有培地（４％ＰＥＧ６０００を含有するＰＨ－ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ＃：８１２５３－２５０Ｇ）に重ね、一晩インキュベートした。翌朝、ウェルを１ｍｌのＨＢＳＳで３回洗浄した後、１ｍｌの初代肝細胞－ＤＭＳＯで残りの実験のために培養した。

【0115】

蒔いてから１日後、ヒトドナー初代肝細胞を、１００のＭＯＩのＨＢＶ含有培地（４％ＰＥＧ６０００を含有するＰＨ－ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ＃：８１２５３－２５０Ｇ）に重ね、一晩インキュベートした。翌朝、ウェルを１ｍｌのＨＢＳＳで３回洗浄した後、１ｍｌ初代肝細胞－ＤＭＳＯで残りの実験のために培養した。

【0116】

ヒトドナー初代肝細胞のＨＢＶ感染を、細胞の染色前に上清のＨＢＶエンベロープ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを測定することによって確認した。初代肝細胞を、ＨＢＶ感染後４日目に細胞ＨＢｃＡｇと共に４ＭＨＣマーカー（ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｅ、およびＭＨＣ－ＩＩ）で共染色した。これは、細胞内ＨＢｃＡｇが初めて検出された時点であったためである。４Ｄ１２抗体による強い染色がＨＢＶ感染ＰＨおよびＨＢＶ未感作の両方で観察され、ＭＨＣ－Ｅの高い発現を示した（図２Ｄおよび２Ｅ）。これに対して、ＨＬＡ－ＤＲ発現は、すべての３つのヒトドナー初代肝細胞試料で最小限か、またはなかった。これは、以前に発表された結果と一致している（Ｓｅｎａｌｄｉら，１９９１． Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｌｉｖｅｒｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ４４： １０７－１１４．）。表面ＭＨＣレベルを評価する前に、初代肝細胞の生体外操作が、これらの細胞の一部にＭＨＣ－Ｅ発現を失わせることを誘発した可能性がある。それにもかかわらず、これらの結果は、ＨＢＶ感染初代肝細胞がＭＨＣ－Ｅを発現し、ＭＨＣ－Ｅが潜在的なＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拘束エレメントとなる可能性があることを示した。

【0117】

実施例３：ＭＨＣ－Ｅ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞ＦＲＯＭＲＨＣＭＶ／ＨＢＶ接種アカゲザルは、ＨＢＶ感染同種および異種初代肝細胞を認識する
ＭＨＣ研究により、ＨＢＶ感染にかかわらず、ヒトドナーおよびアカゲザルの初代肝細胞に高レベルのＭＨＣ－Ｅ発現があることが明らかとなった。したがって、霊長類におけるＭＨＣ－Ｅの高い機能保存性を考えると、ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶを接種したアカゲザルのＣＤ８＋Ｔ細胞は、同種異系のＨＢＶ感染したアカゲザル初代肝細胞を認識するであろうという仮説が立てられた。この仮説を裏付けるように、ＲＭ１とＲＭ２のＣＤ８＋Ｔ細胞（バルク脾臓細胞および精製ＣＤ８β＋Ｔ細胞）は、血縁関係のない２匹のアカゲザルドナーからのＨＢＶ感染初代肝細胞を認識したが、ＨＢＶ未感染初代肝細胞には反応しなかった（図３Ａ）。

【0118】

ＨＢＶ感染初代肝細胞標的を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＨＣ拘束をより包括的に決定するために、図１に示すＭＨＣ特異的ブロッキング試薬を用いて、一連の認識実験を行った。

【0119】

ＨＢＶ感染前に、ベースラインとして１ウェルの初代肝細胞を採取し、染色を行った。感染後２日目から、ＨＢＶ感染およびＨＢＶナイーブの初代肝細胞の各１ウェルを０．５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃：ＳＨ３０２３６．０１）で回収し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃：ＳＨ３０２５６ＦＳ，１０％ウシ胎児血清を含む）で２回洗浄した。細胞を抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（クローン：４Ｄ１２、Ｏｒｉｇｅｎｅ，ｃａｔ＃：ＬＳ－Ｃ１７９７４２）と共に３０分間４℃でインキュベートし、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、Ｆ（ａｂ）２－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＬ）－ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃：Ａ１０５３９）と共に３０分間４℃でインキュベートした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄、ｐａｎ－ＭＨＣ－Ｉ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン：Ｗ６／３２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ.，ｃａｔ＃：３１１４１９）、抗ＨＬＡ－ＤＲ Ａｌｅｘａ７００（クローン：Ｌ２４３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ＃：５６０７４３）、およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｙｅｌｌｏｗ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃：Ｌ－３４９５９）と共に３０分間４℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃：００－５５２３－００）を用いて室温で１時間固定した。固定前に、すべての洗浄スピンを３５０ｘ ｇ、３分間で実施した。固定後、細胞を透過化緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃：００－８３３３－５６）に懸濁した。固定後のすべての洗浄スピンを８３０ｘ ｇ、３分間で実施した。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ Ｒ－ＰＥキット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ＃：７０３－０００５）を用いて、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したＢ型肝炎ウイルスコア抗原抗体（クローン：１３Ａ９，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ＃：ＭＡ１－７６０６）と共に初代肝細胞を４℃で１時間インキュベートした。透過化緩衝液で細胞を３回洗浄した後、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ＬＳＲ－ＩＩで回収した。解析をＦｌｏｗＪｏ Ｘ（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ.）で実施した。すべての解析で、大きく複雑なＰＨの光散乱シグネチャーにゲーティングし、その後、特異的なＭＨＣおよびＨＢＶマーカーを評価した。

【0120】

ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶワクチン接種ＲＭの脾臓からの単核細胞調製物において、フローサイトメトリーＩＣＳによって測定した。簡単に言えば、脾臓細胞又は単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＢＶ感染又はＨＢＶナイーブ初代肝細胞標的及び共刺激分子ＣＤ２８及びＣＤ４９ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に１時間インキュベートし、その後、ブレフェルジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに８時間添加した。初代肝細胞標的共培養を行わない共刺激は、バックグラウンドコントロールとした。応答のＭＨＣ拘束を、標的初代肝細胞との共培養前に、ｐａｎ抗ＭＨＣ－Ｉ抗体（２５mｇ／ｍｌ、クローン：Ｗ６－３２）、ＶＬ９ペプチド（２０ｕＭ）、ＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ－ＩＩ関連不変鎖、アミノ酸８９～１００、１０mｇ／ｍｌ）、または抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（１０mｇ／ｍｌ、クローン：Ｌ２４３）の存在下で、室温で１時間ＰＨ標的を予めインキュベートすることによって決定した。刺激した細胞を固定、透過、染色し、ＬＳＲ－ＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。解析はＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。小型リンパ球の光散乱シグネチャーのゲーティングに続いて、ＣＤ３＋集団、次にＣＤ４－／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの順でゲーティングを行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の抗原特異的反応頻度は、ＩＦＮ－γの細胞内発現によってルーチンに決定された。

【0121】

ＨＢＶ感染標的またはＨＢＶナイーブ標的をＨＢＶ感染後６日目（ＭＯＩ＝１００）に回収し、ブロッキング剤Ｗ６／３２抗体（ｐａｎ ＭＨＣ－Ｉ）、ＶＬ９ペプチド（ＭＨＣ－Ｅ）、ＣＬＩＰ（ＭＨＣ－ＩＩ）またはＨＬＡ－ＤＲ抗体（ＭＨＣ－ＩＩ）とインキュベートし、脾細胞または単離したＣＤ８β＋Ｔ細胞と一晩共培養をした。共培養後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＦＮ－γとＴＮＦ－αで細胞内染色し、標的の認識を評価した。ＨＢＶ感染ＲＭ ＰＨのＣＤ８＋Ｔ細胞認識は、Ｗ６／３２抗体とＶＬ９ペプチドでブロックされたが、ＣＬＩＰやＨＬＡ－ＤＲではブロックされず、ＨＢＶ感染標的に対する応答の全体がＭＨＣ－Ｅ拘束されていることが示された（図３Ａ）。

【0122】

ＭＨＣ－Ｅは霊長類間で機能的に保存されているので、ＲｈＣＭＶ／ＨＢＶを接種したＲＭからのＣＤ８＋Ｔ細胞もＨＢＶ感染ＨＤ初代肝細胞を認識するであろうという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、同じＲｈＣＭＶ／ＨＢＶを接種したサル（ＲＭ１およびＲＭ２）の脾臓細胞および精製ＣＤ８＋Ｔ細胞とＨＢＶ感染ヒトドナー初代肝細胞とをインキュベートして、同様の認識実験を行った。仮説通り、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＢＶに感染した異種ヒトドナー初代肝細胞を認識した（図３Ｂ）。アカゲザル初代肝細胞標的共培養実験について上述したように、ＨＢＶ感染ヒトドナー初代肝細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞認識は、ＭＨＣ－Ｅ結合ＶＬ９ペプチドによって完全に阻害された。これらの結果は、ＨＢＶ感染初代肝細胞がＭＨＣ－Ｅと関連してＨＢＶ抗原を提示することを決定的に示し、この経路を利用してＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＢＶ感染細胞へ誘導できることを示している。

【0123】

次に、ＨＢＶコア抗原における２つの１５量体ペプチド、コア７（ＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）およびコア１４（ＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）のＭＨＣ－Ｅ結合スーパートープの保存性を検討した。既知のすべてのＨＢＶ遺伝子型にまたがるＨＢＶの全ゲノム配列６，２０３個をＴｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅから検索し、翻訳し、コア７（図４Ａ）およびコア１４（図４Ｂ）とアミノ酸配列のアライメントを行った。すべての動物でＭＨＣ－Ｅ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を起こした２つの１５量体ペプチドには高い保存性があった（スーパートープ）。重要なことは、高度に保存されていない２つの位置（コア７の位置３とコア１４の位置１５）において、この位置にはＨＢＶ株間でグローバルに支配的なアミノ酸が１つだけ追加されていることである。したがって、既知のグローバル配列の９８％以上が、これらの位置に２つのアミノ酸のうちの１つを発現していることになる。

【0124】

これらの結果は、ＨＢＶに対する全く新しいＣＤ８＋Ｔ細胞応答のセットを同定し、革新的なＨＢＶ治療薬の開発への道を開くものである。ＭＨＣ－Ｅ制限のＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、及びＨＣＶの自然ウイルス感染で同定されているが（Ｊｏｏｓｔｅｎら，２０１６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＨＬＡ－Ｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６： １－１１）、ＨＢＶに対するＭＨＣ－Ｅ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の報告はない。そのため、ＨＢＶに感染した肝細胞がＭＨＣ－Ｅの文脈でＨＢＶ抗原を提示するかどうかは不明であった。これらの結果は、ＭＨＣ－ＥがＨＢＶ感染細胞の表面にＨＢＶ抗原を提示すること、そして全く異なる霊長類のＣＤ８＋Ｔ細胞がこれらのＭＨＣ－Ｅ：ペプチド複合体を認識することを示している。

【0125】

ＨＢＶに対する完全にユニークなタイプのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を表す以外に、ＨＢｃＡｇ内で標的とされるエピトープの広さは、ＣＭＶ／ＨＢＶベクターによる治療ワクチン接種が、広く標的とされたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。このような広範な標的化は、これまでにもＳＩＶ、結核菌、マラリアに対して示されているが、ＨＢＶゲノムの大部分は、ほとんど非可塑性の重複リーディングフレームのみで構成されていることから、特にＨＢＶに対して有効であると考えられる。これらの結果から、ＭＨＣ－Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ワクチン療法や養子免疫療法を通じて、慢性ＨＢＶ感染症の治療に利用できることが初めて明らかになった。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】