(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-09
(54)【発明の名称】ＭＲＮＡ送達のための合成脂質
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20220802BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220802BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220802BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220802BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220802BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20220802BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220802BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220802BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220802BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20220802BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220802BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220802BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20220802BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P3/00
A61P3/06
A61P9/00
A61P43/00 105
A61K9/14
A61K9/127
A61K9/51
A61K47/28
A61K47/20
A61K47/24
A61K31/7105
A61K38/46
C12N15/09 110
C12N15/12 ZNA
C12N15/57
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571709
(86)(22)【出願日】2020-06-04
(85)【翻訳文提出日】2022-01-20
(86)【国際出願番号】 US2020036085
(87)【国際公開番号】W WO2020247604
(87)【国際公開日】2020-12-10
(31)【優先権主張番号】62/857,111
(32)【優先日】2019-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】319009901
【氏名又は名称】トラスティーズ オブ タフツ カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】100139723
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 洋
(72)【発明者】
【氏名】シュィ，チアォビン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ミン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC11
4C076CC21
4C076DD55
4C076DD63
4C076DD70
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC22
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA38
4C084MA41
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC331
4C084ZC332
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA38
4C086MA41
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZB21
4C086ZC33
(57)【要約】
ヒトのリポタンパク質代謝障害または心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、脂質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリピドイドナノ粒子を投与することを含む方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトのリポタンパク質代謝障害または心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、脂質と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを含むリピドイドナノ粒子を投与することを含み、前記ｓｇＲＮＡは、シングルガイドアンジオポエチン様タンパク質３（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３）またはシングルガイドプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｓｇＰＣＳＫ９）であり、前記脂質は、式Ｉで表される、またはその薬学的に許容される塩である、方法。【化1】
【化2】
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｒ脂質、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで、ＲａとＲａ’またはＲａ’’とＲａ’’は、両方がＲ脂質であることはなく；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；
Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
【化3】
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ３０、またはＳＨであり；
Ｒ３およびＲ４は両方がＨであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成し；
Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＲ３０、またはＳであり；
Ｒ３０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、またはＣ１－６アルキニルであり；
ｍは１～３から選択される整数であり；
ｎは１～１４から選択される整数であり；
ｐは０または１であり；
ｑは１～１０から選択される整数であり；
ｔは０、１、または２である。]
【請求項2】
Ｒ頭部が、【化4】
【請求項3】
ＲａおよびＲａ’が、Ｒ脂質、Ｈ、またはＣ１－Ｃ２０アルキルである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
Ｒ頭部が、【化5】
【請求項5】
Ｒ１およびＲ２がＨである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ｒ１がＨであり；かつＲ２がＯＨである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
Ｒ３およびＲ４がＨである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
Ｒ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
Ｚが、ＣＨ２、Ｏ、またはＮＲ３０である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＺがＣＨ２である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ＺがＯである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
請ＺがＮＲ３０である、求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ｍが１または２である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ｎが４～１２から選択される整数である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ｎが６～１０から選択される整数である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ｐが０である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ｐが１である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ｑが２～８から選択される整数である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ｑが４～８から選択される整数である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ｔが０である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ｔが１である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
Ｒ脂質が、それぞれ独立して、【化6】
【請求項23】
前記脂質が、【化7】
【請求項24】
前記脂質とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比が約３：１～約１５：１である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記脂質とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比が約７．５：１である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記リピドイドナノ粒子がコレステロールをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記脂質とコレステロールの比が約１：１～約２：１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記リピドイドナノ粒子が、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＣと、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋとをさらに含み、ＤＳＰＣは以下の構造：
【化8】
ＤＯＰＥは以下の構造：
【化9】
ＤＯＰＣは以下の構造：
【化10】
ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋは以下の構造：
【化11】
【請求項29】
前記リピドイドナノ粒子が、ＤＯＰＣとＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記脂質とＤＯＰＣの比が約４：１～約６：１であり；かつ前記脂質とＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋの比が約４：１～約１００：１または約４：１～約２０：１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記リピドイドナノ粒子が、約２５ｎｍ～約１０００ｎｍの粒径を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記リピドイドナノ粒子が、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの粒径を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
ヒトのリポタンパク質代謝障害が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の機能喪失型変異と関連する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
心血管疾患が、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型遺伝子（ＰＣＳＫ９）と関連する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
ヒトのリポタンパク質代謝障害が、低レベルの血漿高密度リポタンパク質コレステロール、高レベルの血清低密度リポタンパク質コレステロール、または高レベルのトリグリセリドと関連する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
心血管疾患が、ホモ接合型家族性高コレステロール血症、および高コレステロール血症からなる群より選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
【化12】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０１９年６月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８５７，１１１号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【政府の支援】
【0002】
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号ＥＢ０２４０４１およびＴＲ００２６３６による政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
アンジオポエチン様タンパク質３（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ３）（ＡＮＧＰＴＬ３）は、血漿リポタンパク質濃度を調節する酵素である。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における自然に発生する機能喪失型変異により生じるＡＮＧＰＴＬ３欠損を有するヒトが存在する。これらの患者は、血中トリグリセリド（ＴＧ）および低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の低下を示すが、この欠損に起因する明らかな臨床的リスクや合併症はない。最近の遺伝学的および薬理学的研究により、この知見が検証され、ＡＮＧＰＴＬ３のノックダウンが何らかの保護効果をもたらす可能性が示されたことから、ＡＮＧＰＴＬ３はヒトのリポタンパク質代謝障害を治療するための魅力的な治療標的となっている。ＡＮＧＰＴＬ３に対する２つの異なる治療的阻害戦略が最近検証された。１つの臨床試験では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするモノクローナル抗体エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）が、健康なヒトボランティアにおいて、ＬＤＬ－ＣおよびＴＧレベルを効果的に低下させることが証明された。これらの結果は、ＡＮＧＰＴＬ３のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の投与がマウスにおいて脂質レベルの低下ならびにアテローム性動脈硬化の進行の抑制を達成したことを見出した研究と合致する。さらに、ヒトにおいても、アテローム形成性リポタンパク質レベルの低下が認められ、第Ｉ相無作為化臨床試験において重篤な有害事象は記録されなかった。これらの結果は、ＡＮＧＰＴＬ３の治療的拮抗作用が、脂質レベルを低下させ、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の発症を低減させるのに有効かつ安全であることを強く実証した。
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ［ＣＲＩＳＰＲ］／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）システムは、最も革新的なゲノム編集ツールの１つである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を標的化（配列特異的）様式で導入し、その後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（homology directed repair）（ＨＤＲ）によってＤＳＢを修復する。一過性である従来のＡＳＯまたは抗体療法と比較して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、編集された細胞に長期的な治療効果をもたらす永続的な機能喪失標的遺伝子変異を誘導することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はヒト疾患の治療のための有望な候補とされている。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構の安全で効率的かつ特異的な送達は、非常に大きな技術的課題として残っており、この技術の治療的適用を制限している。ウイルスベクター（アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスなど）の使用は、しばしば非常に高い編集効率をもたらすが、望ましくない挿入変異誘発および潜在的なバイオセーフティーの懸念に関する重大な安全性リスクを有するため、それらの適用が制限されている。比較して、より良好な安全性プロファイルを有する非ウイルスナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、金ナノ粒子、およびポリマーナノ粒子など）は、典型的には送達効率の低下を犠牲にして、ＣＲＩＳＰＲプラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の送達のために開発されている。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＲＮＰの各様式でのＣＲＩＳＰＲ送達は潜在的な強みを有するが、ｍＲＮＡ送達はｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集用途に特に有望であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一態様では、本開示は、ヒトのリポタンパク質代謝障害または心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、脂質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリピドイドナノ粒子を投与することを含み、
ｓｇＲＮＡは、シングルガイドアンジオポエチン様タンパク質３（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３）またはシングルガイドプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｓｇＰＣＳＫ９）であり；
脂質は、式Ｉ：
で表されるか、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒ頭部は、
であり；
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｒ脂質、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで、ＲａとＲａ’またはＲａ’’とＲａ’’は、両方がＲ脂質であることはなく；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；
Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
であり、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ３０、またはＳＨであり；
Ｒ３およびＲ４は両方がＨであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成し；
Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＲ３０、またはＳであり；
Ｒ３０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、またはＣ１－６アルキニルであり；
ｍは１～３から選択される整数であり；
ｎは１～１４から選択される整数であり；
ｐは０または１であり；
ｑは１～１０から選択される整数であり；
ｔは０、１、または２である。
ｓｇＲＮＡは、シングルガイドアンジオポエチン様タンパク質３（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３）またはシングルガイドプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｓｇＰＣＳＫ９）であり；
脂質は、式Ｉ：
【化1】
Ｒ頭部は、
【化2】
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｒ脂質、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで、ＲａとＲａ’またはＲａ’’とＲａ’’は、両方がＲ脂質であることはなく；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；
Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
【化3】
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ３０、またはＳＨであり；
Ｒ３およびＲ４は両方がＨであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成し；
Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＲ３０、またはＳであり；
Ｒ３０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、またはＣ１－６アルキニルであり；
ｍは１～３から選択される整数であり；
ｎは１～１４から選択される整数であり；
ｐは０または１であり；
ｑは１～１０から選択される整数であり；
ｔは０、１、または２である。
【0006】
別の態様では、本開示は、以下からなる群より選択される脂質を提供する。
【化4】
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1A】ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ｍＲＮＡ送達の概略図であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集送達のための生体還元性脂質／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡナノ粒子の形成を示す。
【図1B】脂質合成に使用されるアミンの合成経路、脂質命名法および化学構造を示す概略図である。
【図2A】ルシフェラーゼｍＲＮＡ単独（１６０ｎｇ／ｍＬ）または異なる脂質ナノ粒子のナノ複合体の形態で処理したＡ３７５細胞のルシフェラーゼ発現を示す棒グラフである。
【図2B】ＲＦＰ ｍＲＮＡ単独（３２０ｎｇ／ｍＬ）またはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子の形態でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を示すＣＬＳＭ画像である。スケールバー：２０μｍ。
【図2C】濃度を高めたＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡで処理したＨｅＬａ細胞のｍＲＮＡ用量依存的なＲＦＰ発現を示す棒グラフである。ｍＲＮＡ送達の２４時間後にＲＦＰの発現プロファイルを定量した。
【図3A】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢおよびＢＡＭＥＡ－Ｏ１６の化学構造を示す。
【図3B】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込み効率を示す棒グラフである。
【図3C】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃｙ３－ＲＮＡまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６／Ｃｙ３－ＲＮＡナノ粒子で処理したＨｅＬａ細胞のＣＬＳＭ画像である。送達のために指示された比で１０ｎＭのＣｙ３－ＲＮＡを脂質と複合体化させてＨｅＬａ細胞に送達させ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ＠Ｇｒｅｅｎを用いてエンドソームを共染色した（スケールバー：２０μｍ）。
【図3D】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ｍＲＮＡ送達が、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ナノ粒子の送達よりも高められたＨｅＬａ細胞でのＲＦＰ発現を示したことを表すプロットである。
【図4A】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰ単独またはＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子で処理したＨＥＫ－ＧＦＰ細胞のＣＬＳＭ画像である。スケールバー：２０μｍ。
【図4B】迅速かつ効率的なゲノム編集のためのＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子の送達を示す棒グラフである。ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞を、異なる用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＧＦＰ（１３ｎＭ）で処理し、送達後の様々な時点でＧＦＰ発現を定量した。
【図4C】ＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子を用いたｓｇＲＮＡ配列特異的ゲノム編集およびＧＦＰノックアウトを示すプロットである。ＧＦＰ－ＨＥＫ細胞をＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰまたはＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／スクランブルｓｇＲＮＡナノ粒子で処理し、ｍＲＮＡ送達の４８時間後にＧＦＰノックアウト効率を測定した。
【図4D】ＢＡＭＥＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＨＰＶ１８ナノ粒子の送達が、ＨｅＬａ細胞の成長を効率的かつ選択的に阻害したことを示すプロットである。
【図5A】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡナノ粒子（右）またはＣａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡ（遊離）を注射したマウスの組織の生物発光画像である。
【図5B】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子を注射したマウスの肝臓の蛍光画像であり、肝細胞へのｍＲＮＡの効率的な送達を示した。スケールバー：２０μｍ。
【図5C】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＰＣＳＫ９ナノ粒子処理が、マウスの血清ＰＣＳＫ９を効果的に低減させたことを示す棒グラフである。ＤＰＢＳ対照を注射したものに対して、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡナノ粒子処理の血清ＰＣＳＫ９レベルを正規化した。
【図6A】送達の２４時間後のＡｌａｒｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを用いたＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ、ＰＰＰＤＡ－Ｎ１６Ｂ、ＬＰＦ２ＫまたはそれらのｍＲＮＡナノ複合体の細胞毒性アッセイを示す棒グラフである。
【図6B】送達の２４時間後のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを用いたＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ、ＰＰＰＤＡ－Ｎ１６Ｂ、ＬＰＦ２ＫまたはそれらのｍＲＮＡナノ複合体の細胞毒性アッセイを示す棒グラフである。
【図7】ＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ／ｍＲＮＡ複合体からのＧＳＨ誘発ｍＲＮＡ放出を示すアガロースゲル電気泳動画像である。
【図8】ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞をＣａｓ９ ｍＲＮＡ（１６０ｎｇ／ｍＬ）およびｓｇＧＦＰ（１３ｎＭ）の様々な脂質ナノ粒子のナノ複合体で処理した後のＧＦＰサイレンシングを示す棒グラフであり、ＧＦＰ発現をｍＲＮＡ送達の４８時間後に定量した。
【図9】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡナノ粒子の走査電子顕微鏡画像である。スケールバー：２００ｎｍ。
【図10】ＨＥＫ細胞に対するＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡナノ粒子の細胞毒性アッセイを示す棒グラフである。ＨＥＫ細胞を、５μｇ／ｍＬの脂質および増加する濃度のＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡから構成されるナノ複合体で１０時間処理した後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して細胞生存率を測定した。
【図11】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｌｕｃｉ ｍＲＮＡナノ粒子（右）または遊離ｍＲＮＡ（左）を注射したマウスの組織の生物発光画像である。
【図12】注射後２日目の肝臓のヘマトキシリン・エオジン染色による組織学的分析結果である。スケールバー：２０μｍ。
【図13】ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＰＣＳＫ９を注射したマウスの肝機能検査の結果を示す棒グラフである。
【図14】ＡＮＧＰＴＬ３の機能喪失型変異を誘導して血中脂質レベルを低下させるための非ウイルス性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースゲノム編集を示す概略図である。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３特異的シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＡｎｇｐｔｌ３）をＬＮＰに封入し、肝臓の肝細胞に送達させて、ＡＮＧＰＴＬ３の標的遺伝子座でのゲノム編集を行い、その後、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）およびトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを低下させる。
【図15A】尾部分岐生体還元性（tail-branched bioreducible）リピドイドの化学構造である。
【図15B】０．５ｍｇ／ｋｇのホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）ｍＲＮＡ用量で投与の６時間後にＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）において測定した、生体還元性ＬＮＰ対ＭＣ３ ＬＮＰの全身ルシフェラーゼ生物発光強度（ｆｌｕｘ）を示す棒グラフである。処方：脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５０／３８．５／１０／１．５（モル比）、脂質／ｍＲＮＡ＝１２．５／１（重量比）。
【図15C】ｆＬｕｃ ｍＲＮＡを配合した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰのサイズおよび分布を示す動的光散乱グラフである。
【図16A】３つの異なるリン脂質の化学構造である。
【図16B】コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ、および異なるリン脂質であるＤＳＰＣまたはＤＯＰＥまたはＤＯＰＣを用いて形成したｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰの有効性を示す棒グラフである。
【図16C】コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ、および異なるリン脂質であるＤＳＰＣまたはＤＯＰＥまたはＤＯＰＣを用いて形成したｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰの生体内分布を示す画像である。
【図16D】コレステロール、ＤＯＰＣ、ＤＭＧ－ＰＥＧを７つの異なるモル比で配合したＬＮＰの処方パラメータを示すグラフである。
【図16E】Ｂａｌｂ／ｃマウスにｆＬｕｃ ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した６時間後の異なる製剤の全身ルシフェラーゼ生物発光強度（ｆｌｕｘ）を示す棒グラフである。
【図16F】３０６－Ｏ１２Ｂ／ｍＲＮＡの重量比を変えて、コレステロール、ＤＯＰＣ、ＤＭＧ－ＰＥＧをモル比５０／３８．５／１０／１．５で配合したＬＮＰについて、０．５ｍｇ／ｋｇのｆＬｕｃ ｍＲＮＡの注射の６時間後の全身ルシフェラーゼ生物発光強度（ｆｌｕｘ）を示す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図17A】３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを用いた、遺伝子操作されたｔｄＴｏｍａｔｏレポーターＡｉ１４マウスへのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびＬｏｘＰ標的化シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＬｏｘＰ）の共送達の概略図である。
【図17B】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＬｏｘＰ（１／１．２、重量）を封入したＬＮＰを総ＲＮＡ用量１．６５ｍｇ／ｋｇで投与したＡｉ１４マウスから採取した臓器のＥｘ ｖｉｖｏ画像である。ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光をＩＶＩＳイメージングシステムで検出した。
【図17C】ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが主に肝臓の肝細胞において発現されたことを示す肝臓切片の共焦点蛍光顕微鏡画像である（スケールバー：２０μｍ）。
【図18A】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＡｎｇｐｔｌ３を２：１、１：１．２、および１：２の質量比で配合した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの注射後のインデル（挿入欠失）の割合を示すグラフである（ｎ＝５）。
【図18B】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＡｎｇｐｔｌ３を２：１、１：１．２および１：２の質量比で配合した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの注射後の血清ＡＮＧＰＴＬ３レベルを示すグラフである（ｎ＝５）。
【図19A】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＡｎｇｐｔｌ２を共ロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを３．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投与した７日後のマウスの肝臓におけるインデルの次世代シーケンシング解析結果と、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、トリグリセリド、およびＬＤＬ－Ｃレベルの血清分析結果を示すグラフである。ＭＣ－３ ＬＮＰを陽性対照として使用した（ｎ＝５または６）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図19B】各処置群で最も編集されたマウスにおける特定の編集された対立遺伝子の編集頻度を示す。
【図19C】上位９つの予測オフターゲット部位における編集頻度を示す。
【図20A】ｆＬｕｃ ｍＲＮＡと配合する前の３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの代表的なＴＥＭ画像である（スケールバー：５００ｎｍ）。
【図20B】ｆＬｕｃ ｍＲＮＡと配合した後の３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの代表的なＴＥＭ画像である（スケールバー：５００ｎｍ）。
【図21】ｆＬｕｃ ｍＲＮＡをロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰおよびＭＣ－３ ＬＮＰを注射したマウスのｉｎ ｖｉｖｏ画像である。注射の６時間後にＩＶＩＳイメージングシステムにより画像を撮影した。
【図22】ｆＬｕｃ ｍＲＮＡに対する３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの封入効率を示す棒グラフである。
【図23A】ｓｇＬｏｘＰを封入した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを０．７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与したＡｉ１４／Ｃａｓ９マウスから採取した臓器のｅｘ ｖｉｖｏ画像であり、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光をＩＶＩＳイメージングシステムで検出した。
【図23B】肝臓切片の共焦点蛍光顕微鏡検査であり、ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが主に肝臓の肝細胞で発現していることを示す（スケールバー：２０μｍ）。
【図24】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３を共ロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰのサイズ分布を示す動的光散乱グラフである。
【図25】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３を共ロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰおよびＭＣ－３ ＬＮＰを投与された７日後に採取したマウスの肝臓サンプルからのゲノムＤＮＡを用いて行ったＴ７Ｅ１アッセイのゲル電気泳動画像である。矢印は、Ｔ７Ｅ１アッセイに起因する切断産物を示す。
【図26】注射の２日後に測定したＡＳＴ、ＡＬＴおよびＴＮＦ－αの血清レベルを示すグラフである（ｎ＝５）。
【発明を実施するための形態】
【0008】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの効率的かつ非常に迅速なゲノム編集のために、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを同時に生体還元性脂質ナノ粒子に封入することによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を系統的に送達するための新しいアプローチが開示される。ｍＲＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集のためのジスルフィド結合含有疎水性尾部から構成される生体還元性脂質ナノ粒子も開示される（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【0009】
本開示において、生体還元性脂質は、スクリーニングおよび最適化アプローチにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でレポーターｍＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ複合体を送達することが特定される。生体還元性脂質は、ジスルフィド結合交換機構を介して還元的化学シグナルに応答して細胞内にｍＲＮＡを放出する一方で、静電相互作用を介してｍＲＮＡを封入してナノ粒子を組み立てることができる（図１Ａ）。
【0010】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの同時送達は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞のＧＦＰ発現を高効率でノックアウトし、有効な遺伝子ノックアウトはＣａｓ９ ｍＲＮＡ送達後さらに急速に観察され、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏゲノム編集効率の点でＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ送達と比較して有意な増強である。生体還元性脂質ナノ粒子の静脈内注射は、非処置マウスと比較して非常に低いレベルまでマウス血清プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を効果的にノックダウンした。生体還元性脂質は、これまでに報告された最も効率的な非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集送達の１つに相当する。
【0011】
一態様では、本開示は、ヒトのリポタンパク質代謝障害または心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、脂質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むリピドイドナノ粒子を投与することを含み、
ｓｇＲＮＡは、シングルガイドアンジオポエチン様タンパク質３（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３）またはシングルガイドプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｓｇＰＣＳＫ９）であり；
脂質は、式Ｉ：
で表されるか、またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒ頭部は、
であり；
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｒ脂質、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで、ＲａとＲａ’またはＲａ’’とＲａ’’は、両方がＲ脂質であることはなく；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；
Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
であり；
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ３０、またはＳＨであり；
Ｒ３とＲ４は両方がＨであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成し；
Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＲ３０、またはＳであり；
Ｒ３０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、またはＣ１－６アルキニルであり；
ｍは１～３から選択される整数であり；
ｎは１～１４から選択される整数であり；
ｐは０または１であり；
ｑは１～１０から選択される整数であり；
ｔは０、１、または２である。
ｓｇＲＮＡは、シングルガイドアンジオポエチン様タンパク質３（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３）またはシングルガイドプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｓｇＰＣＳＫ９）であり；
脂質は、式Ｉ：
【化5】
式中、
Ｒ頭部は、
【化6】
Ｒａ、Ｒａ’、Ｒａ”、およびＲａ”’は、それぞれ独立して、Ｒ脂質、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで、ＲａとＲａ’またはＲａ’’とＲａ’’は、両方がＲ脂質であることはなく；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ２０二価脂肪族ラジカル、Ｃ１－Ｃ２０二価ヘテロ脂肪族ラジカル、二価アリールラジカル、または二価ヘテロアリールラジカルであり；
Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
【化7】
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ３０、またはＳＨであり；
Ｒ３とＲ４は両方がＨであるか、またはＲ３とＲ４が一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成し；
Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＲ３０、またはＳであり；
Ｒ３０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、またはＣ１－６アルキニルであり；
ｍは１～３から選択される整数であり；
ｎは１～１４から選択される整数であり；
ｐは０または１であり；
ｑは１～１０から選択される整数であり；
ｔは０、１、または２である。
【0012】
ある実施形態では、Ｒ頭部は、
である。
【化8】
【0013】
ある実施形態では、ＲａおよびＲａ’は、Ｒ脂質、Ｈ、またはＣ１－Ｃ２０アルキルである。
【0014】
ある実施形態では、Ｒ頭部は、
からなる群より選択される化合物に由来する。
【化9】
【0015】
ある実施形態では、Ｒ１およびＲ２はＨである。ある実施形態では、Ｒ１はＨであり；Ｒ２はＯＨである。
【0016】
ある実施形態では、Ｒ３およびＲ４はＨである。ある実施形態では、Ｒ３とＲ４は一緒になってオキソ（＝Ｏ）基を形成する。
【0017】
ある実施形態では、Ｚは、ＣＨ２、Ｏ、またはＮＲ３０である。ある実施形態では、ＺはＣＨ２である。ある実施形態では、ＺはＯである。ある実施形態では、ＺはＮＲ３０である。
【0018】
ある実施形態では、ｍは１または２である。
【0019】
ある実施形態では、ｎは、４～１２から選択される整数である。ある実施形態では、ｎは、６～１０から選択される整数である。
【0020】
ある実施形態では、ｐは０である。ある実施形態では、ｐは１である。
【0021】
ある実施形態では、ｑは、２～８から選択される整数である。ある実施形態では、ｑは、４～８から選択される整数である。
【0022】
ある実施形態では、ｔは０である。ある実施形態では、ｔは１である。
【0023】
ある実施形態では、Ｒ脂質は、それぞれ独立して、
からなる群より選択される。
【化10】
【0024】
ある実施形態では、脂質は、
からなる群より選択される。
【化11】
【0025】
ある実施形態では、脂質とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比は、約３：１～約１５：１である。ある実施形態では、脂質とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比は、約７．５：１である。
【0026】
ある実施形態では、リピドイドナノ粒子は、コレステロールをさらに含む。
【0027】
ある実施形態では、脂質とコレステロールの比は、約１：１～約２：１である。
【0028】
ある実施形態では、リピドイドナノ粒子は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、またはＤＯＰＣ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含み、
ＤＳＰＣは、以下の構造；
を有し、
ＤＯＰＥは、以下の構造：
を有し、
ＤＯＰＣは、以下の構造：
を有し、
ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋは、以下の構造：
を有する。
ＤＳＰＣは、以下の構造；
【化12】
ＤＯＰＥは、以下の構造：
【化13】
ＤＯＰＣは、以下の構造：
【化14】
ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋは、以下の構造：
【化15】
【0029】
ある実施形態では、リピドイドナノ粒子は、ＤＯＰＣおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋをさらに含む。
【0030】
ある実施形態では、脂質とＤＯＰＣの比は約４：１～約６：１であり、脂質とＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋの比は、約４：１～約１００：１、または約４：１～約２０：１である。
【0031】
ある実施形態では、リピドイドナノ粒子は、約２５ｎｍ～約１０００ｎｍの粒径を有する。ある実施形態では、リピドイドナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍの粒径を有する。
【0032】
ある実施形態では、ヒトのリポタンパク質代謝障害は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の機能喪失型変異と関連する。
【0033】
ある実施形態では、心血管疾患は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型遺伝子（ＰＣＳＫ９）と関連する。
【0034】
ある実施形態では、ヒトのリポタンパク質代謝障害は、血漿高密度リポタンパク質コレステロールの低下、血清低密度リポタンパク質コレステロール、またはトリグリセリドレベルと関連する。
【0035】
ある実施形態では、ヒトのリポタンパク質代謝障害は、低レベルの血漿高密度リポタンパク質コレステロール、高レベルの血清低密度リポタンパク質コレステロール、または高レベルのトリグリセリドと関連する。
【0036】
ある実施形態では、心血管疾患は、ホモ接合体家族性高コレステロール血症、および高コレステロール血症からなる群より選択される。
【0037】
別の態様では、本開示は、以下からなる群より選択される脂質を提供する。
【化16】
【0038】
定義
本明細書で特に定義されていない限り、本出願で使用される科学技術用語は、当業者が一般的に理解している意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載されている、化学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞および癌生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬理学、遺伝学、およびタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。
本明細書で特に定義されていない限り、本出願で使用される科学技術用語は、当業者が一般的に理解している意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載されている、化学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞および癌生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬理学、遺伝学、およびタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。
【0039】
本開示の方法および技術は、特に示されない限り、一般的に、当技術分野でよく知られておりかつ本明細書を通して引用および考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。例えば、“Principles of Neural Science”, McGraw-Hill Medical, New York, N.Y. (2000); Motulsky, “Intuitive Biostatistics”, Oxford University Press, Inc. (1995); Lodish et al., “Molecular Cell Biology, 4th ed.”, W. H. Freeman & Co., New York (2000); Griffiths et al., “Introduction to Genetic Analysis, 7th ed.”, W. H. Freeman & Co., N.Y. (1999); およびGilbert et al., “Developmental Biology, 6th ed.”, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (2000)を参照されたい。
【0040】
本明細書で使用される化学用語は、本明細書で別途定義されていない限り、“The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms”, Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985)に例示されているように、当該技術分野における従来の使用方法に従って使用される。
【0041】
本明細書で使用される「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、および説明が、事象または状況が生じる場合だけでなく生じない場合も含むことを意味する。例えば、「任意選択で置換されたアルキル」とは、アルキルが置換されていてもよく、またアルキルが置換されていない場合も含むことを意味する。
【0042】
本発明の化合物の置換基および置換パターンは、当業者によって容易に入手可能な出発物質から当技術分野において公知の技術ならびに以下に記載される方法によって容易に合成され得る化学的に安定な化合物をもたらすために当業者が選択できることが理解される。置換基自体が複数の基で置換されている場合、安定した構造が得られる限り、これら複数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことが理解される。
【0043】
本明細書で使用される場合、「任意選択で置換された」という用語は、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、ハロゲン、アルキル、ニトロ、シリル、アシル、アシルオキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アミノ、アミノアルキル、シアノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、－ＯＣＯ－ＣＨ２－Ｏ－アルキル、－ＯＰ（Ｏ）（Ｏ－アルキル）２または－ＣＨ２－ＯＰ（Ｏ）（Ｏ－アルキル）２を含むがそれらに限定されない指定された置換基のラジカルでの所与の構造中の１～６個の水素ラジカルの置換を指す。好ましくは、「任意選択で置換された」とは、上記の置換基での所与の構造中の１～４個の水素ラジカルの置換を指す。より好ましくは、１～３個の水素ラジカルが上記の置換基で置換される。置換基はさらに置換されていてもよいことが理解される。
【0044】
「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、採用されるか、または関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在するか、採用されるか、または関連する実施形態を包含する。本発明は、群のメンバーの２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、採用されるか、または関連する実施形態を包含する。
【0045】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、Ｃ１－Ｃ１０直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ１０分岐鎖アルキル基を含むがこれらに限定されない飽和脂肪族基を指す。好ましくは、「アルキル」基は、Ｃ１－Ｃ６直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ６分枝鎖アルキル基を指す。最も好ましくは、「アルキル」基は、Ｃ１－Ｃ４直鎖アルキル基またはＣ１－Ｃ４分枝鎖アルキル基を指す。「アルキル」の例としては、メチル、エチル、１－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、１－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ネオペンチル、１－ヘキシル、２－ヘキシル、３－ヘキシル、１－ヘプチル、２－ヘプチル、３－ヘプチル、４－ヘプチル、１－オクチル、２－オクチル、３－オクチルまたは４－オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。なお、「アルキル」基は、任意選択で置換されていてもよい。
【0046】
「アシル」という用語は、技術的に認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）－、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）－で表される基を指す。
【0047】
「アシルアミノ」という用語は、技術的に認識されており、アシル基で置換されたアミノ基を意味し、例えば、式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）ＮＨ－によって表すことができる。
る。
る。
【0048】
用語「アシルオキシ」は、当該技術分野で認識されており、一般式ヒドロカルビルＣ（Ｏ）Ｏ－、好ましくはアルキルＣ（Ｏ）Ｏ－によって表される基を指す。
【0049】
用語「アルコキシ」は、それに結合した酸素を有するアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシなどが挙げられる。
【0050】
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、一般式アルキル－Ｏ－アルキルで表すことができる。
【0051】
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基を指す。好ましい実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合はＣ１－３０、分枝鎖の場合はＣ３－３０）を有し、より好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。
【0052】
さらに、本明細書、実施例、および特許請求の範囲全体で使用されている用語「アルキル」は、非置換および置換アルキル基の両方を含むことが意図されており、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指し、トリフルオロメチルおよび２，２，２－トリフルオロエチルなどのハロアルキル基を含む。
【0053】
「Ｃｘ－ｙ」または「Ｃｘ－Ｃｙ」という用語は、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシなどの化学的部分と組み合わせて使用される場合、鎖中にｘ～ｙ個の炭素を含む基を含むことを意味する。Ｃ０アルキルは、基が末端部分にある場合は水素を、内部にある場合は結合を指す。例えば、Ｃ１－６アルキル基は、鎖中に１～６個の炭素原子を含む。
【0054】
本明細書で使用される用語「アルキルアミノ」は、少なくとも１つのアルキル基で置換されたアミノ基を指す。
【0055】
本明細書で使用される用語「アルキルチオ」は、アルキル基で置換されたチオール基を指し、一般式アルキルＳ－で表すことができる。
【0056】
本明細書で使用される用語「アミド」は、以下の基を指す：
式中、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表すか、あるいはＲ９およびＲ１０はそれらが結合しているＮ原子と一緒になって、環構造中に４～８個の原子を有する複素環を完成させる。
【化17】
【0057】
「アミン」および「アミノ」という用語は、当技術分野で認識されており、非置換および置換アミンの両方、ならびにそれらの塩を指し、例えば、次式により表すことができる部分を指す：
式中、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１０’は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表すか、あるいは、Ｒ９およびＲ１０はそれらが結合しているＮ原子と一緒になって、環構造中に４～８個の原子を有する複素環を完成させる。
【化18】
【0058】
本明細書で使用される用語「アミノアルキル」は、アミノ基で置換されたアルキル基を指す。
【0059】
本明細書で使用される用語「アラルキル」は、アリール基で置換されたアルキル基を指す。
【0060】
本明細書で使用される用語「アリール」には、環の各原子が炭素である、置換または非置換の単環芳香族基が含まれる。好ましくは、環は５～７員環であり、より好ましくは６員環である。用語「アリール」には、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通する２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、それら環の少なくとも１つが芳香族であるものも含まれ、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであり得る。アリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが挙げられる。
【0061】
用語「カルバメート」は、当技術分野で認識されており、次の基を指す：
式中、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビル基を表す。
【化19】
【0062】
本明細書で使用される用語「カルボシクリルアルキル」は、カルボシクリル（炭素環）基で置換されたアルキル基を指す。
【0063】
用語「炭素環」には、５～７員の単環式環および８～１２員の二環式環が含まれる。二環式炭素環の各環は、飽和、不飽和および芳香族環から選択され得る。炭素環には、２つの環の間で１つ、２つまたは３つ以上の原子が共有されている二環式分子も含まれる。「縮合炭素環」は、各環が他の環と２つの隣接する原子を共有する二環式炭素環を指す。縮合炭素環の各環は、飽和、不飽和および芳香族環から選択され得る。例示的な実施形態では、芳香族環、例えばフェニルが、飽和または不飽和環、例えばシクロヘキサン、シクロペンタン、またはシクロヘキセンに融合し得る。価数が許す限り、飽和、不飽和および芳香族二環式環の任意の組み合わせが、炭素環の定義に含まれる。例示的な「炭素環」には、シクロペンタン、シクロヘキサン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、１，５－シクロオクタジエン、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン、ビシクロ［４．２．０］オクタ－３－エン、ナフタレンおよびアダマンタンが含まれる。例示的な縮合炭素環には、デカリン、ナフタレン、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン、ビシクロ［４．２．０］オクタン、４，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－インデンおよびビシクロ［４．１．０］ヘプタ－３－エンが含まれる。「炭素環」は、水素原子を有することができる任意の１つまたは複数の位置で置換されていてもよい。
【0064】
本明細書で使用される用語「カルボシクリルアルキル」は、カルボシクリル（炭素環）基で置換されたアルキル基を意味する。
【0065】
「炭酸塩（カルボナート）」という用語は、当技術分野で認識されており、基－ＯＣＯ２－を指す。
【0066】
本明細書では、「カルボキシ」という用語は、式－ＣＯ２Ｈで表される基を指す。
【0067】
本明細書で使用される用語「エステル」は、基－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９を指し、式中Ｒ９はヒドロカルビル基を表す。
【0068】
本明細書で使用される用語「エーテル」は、酸素を介して別のヒドロカルビル基に結合したヒドロカルビル基を指す。したがって、ヒドロカルビル基のエーテル置換基は、ヒドロカルビル－Ｏ－であり得る。エーテルは、対称であっても非対称であってもよい。エーテルの例としては、複素環－Ｏ－複素環およびアリール－Ｏ－複素環が挙げられるが、これらに限定されない。エーテルには、一般式アルキル－Ｏ－アルキルで表すことができる「アルコキシアルキル」基が含まれる。
【0069】
本明細書で使用される用語「ハロ」および「ハロゲン」は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。
【0070】
本明細書で使用される用語「ヘタラルキル（hetaralkyl）」および「ヘテロアラルキル」は、ヘタリール（hetaryl）基で置換されたアルキル基を指す。
【0071】
用語「ヘテロアリール」および「ヘタリール」には、置換または非置換の芳香族単環構造、好ましくは５～７員環、より好ましくは５～６員環が含まれ、その環構造は、少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１～４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子を含む。「ヘテロアリール」および「ヘタリール」という用語には、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通している２つ以上の環式環を有する多環式環系であって、それら環の少なくとも１つがヘテロ芳香族環であるものも含まれ、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／または複素環であり得る。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基、ピラジン基、ピリダジン基、ピリミジン基などが挙げられる。
【0072】
本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、および硫黄である。
【0073】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクリルアルキル」は、複素環基で置換されたアルキル基を指す。
【0074】
「ヘテロシクリル」、「複素環」、および「複素環式」という用語は、置換または非置換の非芳香族環構造、好ましくは３～１０員環、より好ましくは３～７員環を指し、その環構造は少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１～４個のヘテロ原子、より好ましくは１または２個のヘテロ原子を含む。また、「ヘテロシクリル」および「複素環式」という用語には、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通する２つ以上の環を有する多環式環系であって、それら環の少なくとも１つが複素環であるものも含まれ、例えば、他の環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであり得る。ヘテロシクリル基としては、例えば、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタムなどが挙げられる。
【0075】
本明細書で使用される用語「ヒドロカルビル」は、＝Ｏまたは＝Ｓの置換基を有さない炭素原子を介して結合している基を指し、典型的には、少なくとも１つの炭素－水素結合および主に炭素骨格を有するが、任意選択でヘテロ原子を含んでいてもよい。したがって、メチル、エトキシエチル、２－ピリジル、さらにはトリフルオロメチルのような基は、本願の目的上、ヒドロカルビルであると考えられるが、アセチル（連結炭素に＝Ｏの置換基を有する）やエトキシ（炭素ではなく酸素を介して連結されている）のような置換基はそうではない。ヒドロカルビル基には、アリール、ヘテロアリール、炭素環、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0076】
本明細書で使用される用語「ヒドロキシアルキル」は、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基を指す。
【0077】
「低級」という用語は、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシなどの化学的部位と組み合わせて使用される場合、置換基中の原子数が１０個以下、好ましくは６個以下の基を含むことを意味する。例えば、「低級アルキル」とは、１０個以下、好ましくは６個以下の炭素原子を含むアルキル基を指す。ある実施形態では、本明細書で定義されるアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシ置換基は、それらが単独で現れるか、またはヒドロキシアルキルおよびアラルキル（この場合、例えば、アルキル置換基中の炭素原子を数える際にアリール基内の原子は数えられない）のように他の置換基と組み合わせて現れるかにかかわらず、それぞれ低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、または低級アルコキシである。
【0078】
「ポリシクリル」、「多環」、および「多環式」という用語は、２つ以上の原子が２つの隣接する環に共通している２つ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリル）を指し、例えば、環は「縮合環」である。多環の各環は、置換されていても置換されていなくてもよい。ある実施形態では、多環の各環は、環内に３～１０個の原子を含み、好ましくは５～７個の原子を含む。
【0079】
用語「硫酸塩（スルフェート）」は、当該技術分野で認識されており、基－ＯＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容される塩を指す。
【0080】
用語「スルホンアミド」は、当該技術分野で認識されており、次の一般式で表される基を指す：
式中、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビルを表す。
【化20】
【0081】
用語「スルホキシド」は当技術分野で認識されており、基－Ｓ（Ｏ）－を指す。
【0082】
用語「スルホネート」は、当該技術分野で認識されており、基ＳＯ３Ｈ、またはその薬学的に許容される塩を指す。
【0083】
用語「スルホン」は当技術分野で認識されており、基－Ｓ（Ｏ）２－を指す。
【0084】
用語「置換された」は、骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有する部分を指す。「置換」または「で置換された」は、そのような置換が、置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、さらに置換が、例えば、転位、環化、脱離などによる変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を含むことが理解されるであろう。本明細書中で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが企図される。広い態様において、許容される置換基には、有機化合物の非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物について、１つまたは複数であり、同じでも異なっていてもよい。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載の有機化合物の任意の許容される置換基を有し得る。置換基には、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートなど）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切な場合、それら自体が置換されていてもよいことが当業者によって理解されるであろう。
【0085】
本明細書で使用される用語「チオアルキル」は、チオール基で置換されたアルキル基を指す。
【0086】
「チオエステル」という用語は、本明細書では、基－Ｃ（Ｏ）ＳＲ９または－ＳＣ（Ｏ）Ｒ９を指し、ここで、Ｒ９はヒドロカルビルを表す。
【0087】
本明細書で使用される用語「チオエーテル」は、酸素が硫黄に置き換えられたエーテルと同等のものである。
【0088】
用語「尿素」は、当該技術分野で認識されており、次の一般式で表すことができる：
式中、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、水素またはヒドロカルビルを表す。
【化21】
【0089】
本明細書で使用される「調節する」という用語には、機能または活性（細胞増殖など）の阻害または抑制、ならびに機能または活性の増強が含まれる。
【0090】
「薬学的に許容される」という語句は、当技術分野で認識されている。ある実施形態において、この用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症がなく、合理的な利益／リスク比に見合って、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している、組成物、賦形剤、アジュバント、ポリマー、ならびに他の材料および／または剤形を含む。
【0091】
「塩」は、本明細書において、酸付加塩または塩基付加塩を指すために使用される。
【0092】
本開示の方法および組成物において有用な化合物の多くは、その構造中に少なくとも１つの立体中心を有する。この立体中心は、ＲまたはＳの配置で存在することができ、前記ＲおよびＳの表記は、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４５，１１－３０に記載される規則に対応して使用される。本開示は、化合物、塩、プロドラッグまたはそれらの混合物のエナンチオマーおよびジアステレオアイソマーのようなすべての立体異性体（立体異性体のすべての可能な混合物を含む）を企図する。例えば、国際公開第０１／０６２７２６号を参照されたい。
【0093】
さらに、アルケニル基を含む特定の化合物は、Ｚ（ツザメン）またはＥ（エントゲーゲン）異性体として存在し得る。それぞれの場合において、本開示は、混合異性体と個々の異性体の両方を含む。
【0094】
化合物のいくつかは、互変異性体の形態で存在し得る。このような形態は、本明細書に記載されている式で明示はされていないが、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【0095】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府や州政府の規制機関、または米国以外の国の対応機関によって承認されているまたは承認可能であるか、あるいは動物、特にヒトへの使用に関して米国薬局方やその他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
【0096】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理活性を有する本発明の化合物の塩を指す。特に、そのような塩は非毒性であり、無機または有機の酸付加塩および塩基付加塩であり得る。具体的には、以下のような塩が挙げられる：（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸を用いて形成される；または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクタ－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸を用いて形成される、酸付加塩；あるいは（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、またはアルミニウムイオンなどで置換されたとき；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミンなどの有機塩基と配位したときに形成される塩。塩にはさらに、単なる例示として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど；ならびに、化合物が塩基性官能基を有する場合には、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの非毒性の有機酸または無機酸の塩が含まれる。
【0097】
「薬学的に許容されるカチオン」は、酸性官能基の許容されるカチオン性対イオンを指す。このようなカチオンとして、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムカチオンなどが例示される（例えば、Berge, et al., J. Pharm. Sci. 66 (1):1-79 (January 77）を参照されたい。
【0098】
「薬学的に許容されるビヒクル」は、それを用いて本発明の化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。
【0099】
「薬学的に許容される代謝的に切断可能な基」は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断され、本明細書で示される構造式の親分子を得ることができる基を指す。代謝的に切断可能な基の例としては、－ＣＯＲ、－ＣＯＯＲ、－ＣＯＮＲＲおよび－ＣＨ２ＯＲラジカルが挙げられ、ここで、Ｒは、各出現で独立して、アルキル、トリアルキルシリル、炭素環式アリール、あるいはアルキル、ハロゲン、ヒドロキシもしくはアルコキシのうちの１つまたは複数で置換された炭素環式アリールから選択される。代表的な代謝的に切断可能な基の具体例としては、アセチル基、メトキシカルボニル基、ベンゾイル基、メトキシメチル基、およびトリメチルシリル基などが挙げられる。
【0100】
「プロドラッグ」は、本発明の化合物の誘導体を含めて、切断可能な基を有し、かつ加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、生体内で薬学的に活性な本発明の化合物になる化合物を指す。このような例には、コリンエステル誘導体など、Ｎ－アルキルモルホリンエステルなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物の他の誘導体は、それらの酸形態および酸誘導体形態の両方において活性を有するが、酸感受性形態において、しばしば、哺乳動物生物における溶解性、組織適合性、または遅延放出の利点を提供する（Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985を参照されたい）。プロドラッグには、当業者によく知られた酸誘導体が含まれ、例えば、親酸と適切なアルコールとの反応により調製されたエステル、親酸化合物と置換または非置換のアミンとの反応により調製されたアミド、酸無水物、または混合無水物などが挙げられる。本発明の化合物にペンダントされた酸性基に由来する単純な脂肪族または芳香族エステル、アミドおよび無水物は、特定のプロドラッグである。場合によっては、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルなどのダブルエステル型のプロドラッグを調製することが望ましい。特に、本発明の化合物のＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ２－Ｃ８アルケニル、Ｃ２－Ｃ８アルキニル、アリール、Ｃ７－Ｃ１２置換アリール、およびＣ７－Ｃ１２アリールアルキルエステルである。
【0101】
「溶媒和物」は、通常、加溶媒分解反応によって、溶媒または水と会合した化合物の形態を指す（「水和物」とも呼ばれる）。この物理的会合には水素結合も含まれる。従来の溶媒として、水、エタノール、酢酸などが挙げられる。本発明の化合物は、例えば、結晶形態で調製され、溶媒和または水和され得る。適切な溶媒和物には、水和物などの薬学的に許容される溶媒和物が含まれ、さらに化学量論的溶媒和物と非化学量論的溶媒和物の両方が含まれる。特定の例では、「溶媒和物」は、例えば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれている場合に、分離することが可能となる。「溶媒和物」は、溶液相および分離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物として、水和物、エタノール和物、メタノール和物などが挙げられる。
【0102】
投与が想定される「対象」には、ヒト（任意の年齢層の男性または女性、例えば、小児対象（例えば、乳児、小児、青年）または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、高齢成人））、および／または非ヒト動物、例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類、ネコ、および／またはイヌなどの哺乳類が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、対象はヒトである。ある実施形態では、対象は非ヒト動物である。「ヒト」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【0103】
「有効量」は、疾患を治療または予防するために対象に投与されたときに、そのような治療または予防をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。「有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療対象の年齢、体重などに応じて変動し得る。「治療有効量」は、治療的処置のための有効量を指す。また、「予防有効量」は、予防的処置のための有効量を指す。
【0104】
「予防する」または「予防」または「予防的処置」は、疾患または障害を獲得または発症するリスクの低減（すなわち、疾患の発症に先立ち、疾患を引き起こす物質にまだ曝露されていないかまたは疾患にかかりやすい対象において、疾患の臨床症状の少なくとも１つを発症させないこと）を指す。
【0105】
「防御（Prophylaxis）」という用語は、「予防（prevention）」に関連し、病気の治療や治癒ではなく、予防を目的とした手段や処置を指す。予防手段の非限定的な例には、ワクチンの投与；体を動かさないために血栓症のリスクがある入院中の患者への低分子ヘパリンの投与；およびマラリアが風土病であるかマラリアに罹患するリスクが高い地域への訪問に先立って行われるクロロキン等の抗マラリア剤の投与が含まれ得る。
【0106】
任意の疾患または障害の「治療する（treating）」または「治療（treatment）」または「治療的処置（therapeutic treatment）」は、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患を停止すること、またはその臨床症状の少なくとも１つの徴候、程度もしくは重症度を軽減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」または「治療」は、少なくとも１つの身体パラメータを改善することを指し、それは対象により認識されなくてよい。さらに別の実施形態では、「治療する」または「治療」は、身体的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方で、疾患または障害を調節することを指す。さらなる実施形態では、「治療する」または「治療」は、疾患の進行を遅らせることに関する。
【0107】
本明細書では、「同位体バリアント」という用語は、そのような化合物を構成する１つまたは複数の原子において、不自然な比の同位体を含む化合物を指す。例えば、化合物の「同位体バリアント」は、例えば重水素（２ＨまたはＤ）、炭素１３（１３Ｃ）、窒素１５（１５Ｎ）などの１つまたは複数の非放射性同位体を含むことができる。このような同位体置換が行われた化合物では、存在する場合、以下の原子が異なっていてよく、例えば、任意の水素が２Ｈ／Ｄであってよく、任意の炭素が１３Ｃであってよく、または任意の窒素が１５Ｎであってよく、そのような原子の存在および配置は、当業者の技能の範囲内で決定され得ることが理解されるであろう。同様に、本発明は、例えば、得られた化合物が薬物および／または基質の組織分布研究に使用され得る場合には、放射性同位体を用いた同位体バリアントの調製を含むことができる。放射性同位元素であるトリチウム（３Ｈ）および炭素１４（１４Ｃ）は、組み込みが容易であり、検出が容易であるという観点から、この目的に特に有用である。さらに、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎなどの陽電子放出同位体で置換された化合物を調製することもでき、それは基質受容体の占有率を調べるための陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）研究に有用である。本明細書に提供される化合物のすべての同位体バリアントは、放射性物質であるか否かにかかわらず、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【0108】
また、同じ分子式を有するが、原子の結合の性質や順序、空間におけるそれら原子の配置が異なる化合物は「異性体」と称されることも理解されたい。空間における原子の配置が異なる異性体は「立体異性体」と呼ばれる。
【0109】
互いに鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像であるものは「エナンチオマー（鏡像異性体）」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば４つの異なる基に結合する場合、一対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置によって特徴づけられ、ＣａｈｎおよびＰｒｅｌｏｇのＲ－とＳ－の配列決定規則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記載され、右旋性または左旋性（すなわち、それぞれ（＋）－または（－）－異性体である）として指定される。キラル化合物は、個々のエナンチオマーとしてまたはその混合物として存在することができる。同じ比率のエナンチオマーを含む混合物は「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【0110】
「互変異性体」は、特定の化合物構造の交換可能な形態であり、水素原子および電子の変位が異なる化合物を指す。したがって、２つの構造は、電子および原子（通常はＨ）の移動によって平衡状態になり得る。例えば、エノールとケトンは、酸または塩基のいずれかで処理することによって迅速に相互変換されるため、互変異性体である。互変異性の別の例は、フェニルニトロメタンのアシ－およびニトロ－形態であり、これらは同様に酸または塩基での処理によって形成される。互変異性体は、目的の化合物の最適な化学反応性および生物学的活性の達成に関連し得る。
【0111】
本明細書では、純粋なエナンチオマー化合物は、その化合物の他のエナンチオマーまたは立体異性体を実質的に含まない（すなわち、エナンチオマー過剰である）。言い換えれば、化合物の「Ｓ」形態は、化合物の「Ｒ」形態を実質的に含まず、したがって、「Ｒ」形態のエナンチオマー過剰である。「エナンチオマー的に純粋」または「純粋なエナンチオマー」という用語は、化合物が９５重量％超、９６重量％超、９７重量％超、９８重量％超、９８．５重量％超、９９重量％超、９９．２重量％超、９９．５重量％超、９９．６重量％超、９９．７重量％超、９９．８重量％超、または９９．９重量％超のエナンチオマーを含むことを意味する。ある実施形態では、重量は、化合物のすべてのエナンチオマーまたは立体異性体の総重量に基づく。
【0112】
本明細書で使用される場合、他に示されない限り、「エナンチオマー的に純粋なＲ化合物」という用語は、少なくとも約９５重量％のＲ－化合物および最大で約５重量％のＳ－化合物、少なくとも約９９重量％のＲ－化合物および最大で約１重量％のＳ－化合物、または少なくとも約９９．９重量％のＲ－化合物および最大で約０．１重量％のＳ－化合物を指す。ある実施形態では、重量は化合物の総重量に基づく。
【0113】
本明細書で使用される場合、他に示されない限り、「エナンチオマー的に純粋なＳ化合物または「Ｓ化合物」という用語は、少なくとも約９５重量％のＳ－化合物および最大で約５重量％のＲ－化合物、少なくとも約９９重量％のＳ－化合物および最大で約１重量％のＲ－化合物、または少なくとも約９９．９重量％のＳ－化合物および最大で約０．１重量％のＲ－化合物を指す。ある実施形態では、重量は化合物の総重量に基づく。
【0114】
本明細書では、エナンチオマー的に純粋な化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグは、他の活性成分または不活性成分とともに存在することができる。例えば、エナンチオマー的に純粋なＲ化合物を含む医薬組成物は、例えば、約９０％の賦形剤および約１０％のエナンチオマー的に純粋なＲ化合物を含むことができる。ある実施形態では、このような組成物中のエナンチオマー的に純粋なＲ化合物は、例えば、化合物の総重量に対して、少なくとも約９５重量％のＲ化合物、および最大約５重量％のＳ化合物を含み得る。例えば、エナンチオマー的に純粋なＳ－化合物を含む医薬組成物は、例えば、約９０％の賦形剤と約１０％のエナンチオマー的に純粋なＳ化合物を含むことができる。ある実施形態では、このような組成物中のエナンチオマー的に純粋なＳ化合物は、例えば、化合物の総重量に対して、少なくとも約９５重量％のＳ化合物、および最大約５重量％のＲ化合物を含み得る。ある実施形態では、活性成分は、賦形剤または担体をほとんどまたは全く含まずに製剤化することができる。
【0115】
本発明の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を有し得る；したがって、そのような化合物は、個々の（Ｒ）－または（Ｓ）－立体異性体として、あるいはそれらの混合物として製造することができる。
【0116】
別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の記載または命名は、個々のエナンチオマーおよびその混合物（ラセミ体またはその他）の両方を含むことが意図されている。立体化学の決定および立体異性体の分離のための方法は、当技術分野でよく知られている。
【0117】
有機合成の当業者であれば、化学的に実現可能な安定した複素環式環に含まれるヘテロ原子の最大数は、それが芳香族であるか非芳香族であるかにかかわらず、環のサイズ、不飽和度、およびヘテロ原子の価数によって決まることを認識するであろう。一般に、複素環式環は、複素芳香族環が化学的に実現可能でかつ安定である限り、１～４個のヘテロ原子を有し得る。
【実施例】
【0118】
本明細書に記載された発明をより完全に理解するために、以下の実施例を示す。本願に記載された実施例は、本明細書で提供される化合物、組成物、材料、デバイス、および方法を説明するために提供されており、その範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【0119】
Ｉ．生体還元性脂質およびメッセンジャーＲＮＡナノ粒子によって可能とされるＩｎ ＶｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集
材料および方法
脂質合成に使用したすべての化学物質は、Ａｌａｄｄｉｎ社、ＴＣＩ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、受け取ったままで使用した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌ－７６０２）およびＣａｓ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（Ｌ－７６０６）は、Ｔｒｉ－Ｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。マウス血清ＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｉｎａ）を用いて決定した。細胞生存率は、Ａｌａｍａｒ ＢｌｕｅアッセイまたはＳＲＢ細胞増殖および細胞毒性アッセイキット（Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）を用いて決定した。Ｃｙ３－ＲＮＡ（４３ｎｔ）は、Ｂｉｏｓｙｎｔｅｃｈ社（Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉａｎ）から購入した。ＧＦＰを標的としたｇＲＮＡは、我々の以前の報告に従って調製し、マウスＰＣＳＫ９およびヒトＨＰＶ１８標的ｓｇＲＮＡは、報告されている方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて調製した。ＲＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１－ＲＦＰ（Ｙｉｎｇｒｕｎ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｃｈｉｎａ）を鋳型とするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法を用いて調製した。フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸで実施した。ＨｅＬａ、Ａ３７５、ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で維持した。すべての動物の世話および実験手順は、中国国立ナノ科学技術センター（ＮＣＮＴＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＵＣＡＣ）によって承認された。
材料および方法
脂質合成に使用したすべての化学物質は、Ａｌａｄｄｉｎ社、ＴＣＩ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、受け取ったままで使用した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌ－７６０２）およびＣａｓ９メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（Ｌ－７６０６）は、Ｔｒｉ－Ｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。マウス血清ＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃｈｉｎａ）を用いて決定した。細胞生存率は、Ａｌａｍａｒ ＢｌｕｅアッセイまたはＳＲＢ細胞増殖および細胞毒性アッセイキット（Ｙｅａｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）を用いて決定した。Ｃｙ３－ＲＮＡ（４３ｎｔ）は、Ｂｉｏｓｙｎｔｅｃｈ社（Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉａｎ）から購入した。ＧＦＰを標的としたｇＲＮＡは、我々の以前の報告に従って調製し、マウスＰＣＳＫ９およびヒトＨＰＶ１８標的ｓｇＲＮＡは、報告されている方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて調製した。ＲＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１－ＲＦＰ（Ｙｉｎｇｒｕｎ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｃｈｉｎａ）を鋳型とするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法を用いて調製した。フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸで実施した。ＨｅＬａ、Ａ３７５、ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で維持した。すべての動物の世話および実験手順は、中国国立ナノ科学技術センター（ＮＣＮＴＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＵＣＡＣ）によって承認された。
【0120】
【表1】
【0121】
脂質ナノ粒子製剤
脂質は、我々のこれまでの報告（９）に従って記載された方法を用いて、アミンとアクリレートまたはアクリルアミドを加熱することによって合成し、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製した。ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子を作製するために、精製した脂質を、２ｍＬバイアルにおいてクロロホルム中１６：８：４：１の重量／重量比でコレステロール、ＤＯＰＥおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００と混合し、有機溶媒を真空下で蒸発させ、得られた混合物をさらに一晩乾燥させて薄層フィルム（薄膜）を形成した。この脂質膜をエタノール／酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ＝５．２）を用いて水和させ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００の水溶液に滴下した。得られたナノ粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析し、過剰なエタノールを除去した。
脂質は、我々のこれまでの報告（９）に従って記載された方法を用いて、アミンとアクリレートまたはアクリルアミドを加熱することによって合成し、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製した。ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子を作製するために、精製した脂質を、２ｍＬバイアルにおいてクロロホルム中１６：８：４：１の重量／重量比でコレステロール、ＤＯＰＥおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００と混合し、有機溶媒を真空下で蒸発させ、得られた混合物をさらに一晩乾燥させて薄層フィルム（薄膜）を形成した。この脂質膜をエタノール／酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ＝５．２）を用いて水和させ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００の水溶液に滴下した。得られたナノ粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析し、過剰なエタノールを除去した。
【0122】
ルシフェラーゼおよびＲＦＰ ｍＲＮＡの細胞内送達
ルシフェラーゼｍＲＮＡの送達に有効な脂質ナノ粒子をスクリーニングするために、実験の前日にＡ３７５細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり５０Ｋの密度で播種した。実験当日、１６０ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼｍＲＮＡを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中において３μｇ／ｍＬの異なる脂質ナノ粒子と混合し（全ての濃度は、細胞に添加された最終ＲＮＡおよび脂質濃度を指す）、その後、室温で１５分間インキュベートした。次に、得られたｍＲＮＡリポプレックスを細胞に添加し、さらに６時間細胞とインキュベートした後、細胞培養液をリフレッシュした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性アッセイキットを用いて、メーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）の指示に従って測定した。
ルシフェラーゼｍＲＮＡの送達に有効な脂質ナノ粒子をスクリーニングするために、実験の前日にＡ３７５細胞を２４ウェルプレートに１ウェルあたり５０Ｋの密度で播種した。実験当日、１６０ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼｍＲＮＡを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中において３μｇ／ｍＬの異なる脂質ナノ粒子と混合し（全ての濃度は、細胞に添加された最終ＲＮＡおよび脂質濃度を指す）、その後、室温で１５分間インキュベートした。次に、得られたｍＲＮＡリポプレックスを細胞に添加し、さらに６時間細胞とインキュベートした後、細胞培養液をリフレッシュした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性アッセイキットを用いて、メーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）の指示に従って測定した。
【0123】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子の細胞毒性アッセイでは、ゲノム編集効率研究と同様に、１６０ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子または異なる脂質ナノ粒子でＨＥＫ細胞を処理した。送達の２４時間後に、Ａｌａｍａｒ ＢｌｕｅまたはＳＲＢ細胞増殖および細胞毒性アッセイを用いて細胞生存率を決定した。
【0124】
ＲＦＰ ｍＲＮＡ送達のために、４８ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞（２５Ｋ細胞／ウェル）を、最適化条件でＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子で８時間処理した後、新しい細胞培養液を交換した。ＲＦＰの発現プロファイルは、ｍＲＮＡ送達の２４時間後に、オリンパスＦＶ－ＩＸ８１共焦点システムのＣＬＳＭを用いて画像化するか、またはベックマン・コールターＣｙｔｏＦＬＥＸでのフローサイトメトリーにより定量した。
【0125】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込みおよびエンドソーム脱出研究
還元的細胞内環境に応答するＲＮＡの放出を促進するように生体還元性脂質ナノ粒子を設計することの有効性を確認するために、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６を酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中においてＲＦＰ ｍＲＮＡと１５：１の重量比で複合体化し、その後、室温で１５分間インキュベートした。得られたナノ複合体を５ｍＭのＧＳＨで３７℃で４時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＧＳＨ処理を行わなかったｍＲＮＡナノ複合体と比較した。
還元的細胞内環境に応答するＲＮＡの放出を促進するように生体還元性脂質ナノ粒子を設計することの有効性を確認するために、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６を酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中においてＲＦＰ ｍＲＮＡと１５：１の重量比で複合体化し、その後、室温で１５分間インキュベートした。得られたナノ複合体を５ｍＭのＧＳＨで３７℃で４時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＧＳＨ処理を行わなかったｍＲＮＡナノ複合体と比較した。
【0126】
ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込み研究では、Ｃｙ３で標識した４３ヌクレオチドＲＮＡをＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ナノ粒子と３０：１の重量比で混合した後、ＨｅＬａ細胞に添加した。ＣＬＳＭイメージング研究では、ＨｅＬａ細胞をＣｙ３－ＲＮＡナノ粒子で８時間処理し、エンドソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて共染色した。ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６／ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込み効率の比較のために、異なる濃度の上記ＲＮＡナノ粒子で処理した細胞をフローサイトメトリーを用いて分析し、Ｃｙ３陽性細胞を定量した。
【0127】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの送達およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのゲノム編集
ＧＦＰを安定的に発現させたＨＥＫ細胞を、実験の前日に４８ウェルプレートに１ウェルあたり２５Ｋの密度で播種した。実験当日、１３ｎＭのＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中において、異なる用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび５μｇ／ｍＬのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ（すべての濃度は、細胞に添加した最終的なＲＮＡおよび脂質の濃度を示す）と混合し、その後、室温で１５分間インキュベートした。次に、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子を細胞に添加し、１０時間インキュベートした後、新鮮な細胞培養液を交換した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達後の異なる時点で、ＣＬＳＭを用いてＧＦＰの発現プロファイルを画像化するか、またはフローサイトメトリー分析を用いて定量し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰ送達なしの細胞に対して正規化し、ゲノム編集効率を決定した。さらに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰの送達による配列特異的なゲノム編集を確認するために、ｓｇＧＦＰをスクランブルｓｇＲＮＡに置き換え、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰ送達と同様にＨＥＫ－ＧＦＰ細胞に送達させた。
ＧＦＰを安定的に発現させたＨＥＫ細胞を、実験の前日に４８ウェルプレートに１ウェルあたり２５Ｋの密度で播種した。実験当日、１３ｎＭのＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡを、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．２）中において、異なる用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび５μｇ／ｍＬのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ（すべての濃度は、細胞に添加した最終的なＲＮＡおよび脂質の濃度を示す）と混合し、その後、室温で１５分間インキュベートした。次に、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子を細胞に添加し、１０時間インキュベートした後、新鮮な細胞培養液を交換した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達後の異なる時点で、ＣＬＳＭを用いてＧＦＰの発現プロファイルを画像化するか、またはフローサイトメトリー分析を用いて定量し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰ送達なしの細胞に対して正規化し、ゲノム編集効率を決定した。さらに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰの送達による配列特異的なゲノム編集を確認するために、ｓｇＧＦＰをスクランブルｓｇＲＮＡに置き換え、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰ送達と同様にＨＥＫ－ＧＦＰ細胞に送達させた。
【0128】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子の細胞毒性アッセイでは、ゲノム編集効率の研究と同様に、異なる濃度のＣａｓ９ ｍＲＮＡナノ粒子でＨＥＫ細胞を処理した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達の４８時間後に、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞の生存率を決定した。
【0129】
潜在的な遺伝子治療のために内在性遺伝子を編集するためのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達の有効性を確認するために、４８ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、ｓｇＨＰＶ１８またはＧＦＰノックアウト試験と同様のスクランブルＲＮＡ配列を含むＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ単独で処理し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達の４８時間後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを用いて細胞生存率を決定した。
【0130】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの送達およびｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集
ｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達のために、雌の胸腺欠損ヌードマウスにＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｌｕｃｉ－ｍＲＮＡナノ粒子を０．６ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ用量で、または同用量の遊離ｍＲＮＡを尾静脈から注射した。ナノ粒子または遊離ｍＲＮＡの注射の２４時間後、ＩＶＩＳスペクトルＩｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）での生物発光イメージングのためにマウスを屠殺して様々な組織を採取した。肝細胞へのｍＲＮＡの送達を調べるために、ルシフェラーゼｍＲＮＡの送達と同様に、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。ナノ粒子送達の２４時間後、蛍光イメージング研究のためにマウスを屠殺して肝臓を採取した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達のために、雌の胸腺欠損ヌードマウスにＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｌｕｃｉ－ｍＲＮＡナノ粒子を０．６ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ用量で、または同用量の遊離ｍＲＮＡを尾静脈から注射した。ナノ粒子または遊離ｍＲＮＡの注射の２４時間後、ＩＶＩＳスペクトルＩｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）での生物発光イメージングのためにマウスを屠殺して様々な組織を採取した。肝細胞へのｍＲＮＡの送達を調べるために、ルシフェラーゼｍＲＮＡの送達と同様に、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。ナノ粒子送達の２４時間後、蛍光イメージング研究のためにマウスを屠殺して肝臓を採取した。
【0131】
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡ送達のために、雌の胸腺欠損ヌードマウスに、９ｍｇ／ｋｇのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ、０．６ｍｇ／ｋｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、０．８ｍｇ／ｋｇのＣｙ３－ＲＮＡの用量で、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡナノ粒子を、または同じ用量の遊離ｍＲＮＡを尾静脈から注射した。ナノ粒子または遊離ｍＲＮＡの注射の６時間後、ＩＶＩＳスペクトルＩｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）での生物発光イメージングのためにマウスを屠殺してさまざまな組織を採取した。
【0132】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ｍＲＮＡ送達およびＰＣＳＫ９遺伝子編集のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＰＣＳＫ９、またはスクランブルｓｇＲＮＡ配列を有するＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡを、９ｍｇ／ｋｇのＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ、０．６ｍｇ／ｋｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび０．８ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡの用量で尾静脈から注射した。ナノ粒子の注射の２日後にマウスを屠殺して、ＰＣＳＫ９および肝毒性アッセイのためにマウス血清を取り出した。一方、Ｈ＆Ｅ染色のために肝組織を採取し、ナノ粒子注射による肝障害の可能性を調べた。
【0133】
実施例１．ｍＲＮＡ送達に有効な脂質の合成およびスクリーニング
図２Ａ～２Ｃは、ルシフェラーゼおよびＲＦＰｍＲＮＡの細胞内送達を示すグラフおよび画像である。
図２Ａ～２Ｃは、ルシフェラーゼおよびＲＦＰｍＲＮＡの細胞内送達を示すグラフおよび画像である。
【0134】
我々の以前の報告に従って、アミンと、ジスルフィド結合を有するアクリルレートまたはアクリルアミドとを加熱することにより、生体還元性脂質を合成した（図１Ａ）。アミン番号または名称の後にＯ１６ＢまたはＮ１６Ｂを付けて脂質を命名し、それぞれアクリルレートまたはアクリルアミドの使用を区別した（図１Ｂ）。精製したままの脂質を、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００と共に配合し、本研究のすべての細胞送達実験に用いた（詳細は「材料および方法」を参照されたい）。ｍＲＮＡの送達に有効な脂質のスクリーニングを容易にするために、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを様々な脂質と１：１５の重量比で組み合わせ、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされたＡ３７５細胞のルシフェラーゼ発現を測定し、ルシフェラーゼｍＲＮＡのみ、あるいは市販のトランスフェクション脂質であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＬＰＦ２Ｋ）と複合体形成したルシフェラーゼｍＲＮＡで処理した細胞と比較した。図２Ａに示すように、ｍＲＮＡ単独で処理した細胞は検出可能なルシフェラーゼ発現を示さず、ｍＲＮＡ単独では細胞内に侵入できないことが示されたが、一方、ｍＲＮＡと脂質の複合体で処理した細胞は、脂質のアミンおよび尾部構造に依存して変化するルシフェラーゼ発現を示した。２つの生体還元性脂質であるＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ（アミン１１）およびＰＰＰＤＡ－Ｎ１６Ｂ（アミン１３）は、ＬＰＦ２Ｋと同等の効率でルシフェラーゼｍＲＮＡを送達した。２つの脂質の生体適合性のさらなる研究は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢおよびＰＰＰＤＡ－Ｎ１６ＢのｍＲＮＡリポプレックスが、ＬＰＦ２Ｋよりも低い細胞毒性であったことを示し（図６Ａおよび図６Ｂ）、このことは、ｍＲＮＡ送達のための効率的でしかも生体適合性のナノキャリアを発見するためのコンビナトリアル脂質ナノ粒子を設計する利点および必要性を強調した。代表的な脂質であるＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂを、詳細なｍＲＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集研究のために選択する。
【0135】
代表的な脂質であるＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードするｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達するその能力および高い効率によって証明されるように、ｍＲＮＡ送達のための一般的なナノキャリアである。ＢＡＭＥＡ－０１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子でのヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）の処理は、効率的なＲＦＰ発現をもたらした（図２Ｂ）。フローサイトメトリー分析（図２Ｃ）は、ＲＦＰ陽性細胞がｍＲＮＡ用量に依存し、１６０ｎｇ／ｍＬのＲＦＰ ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達した場合、トランスフェクション効率は９０％にも達し得ることを示した。まとめると、ルシフェラーゼｍＲＮＡおよびＲＦＰ ｍＲＮＡの送達の両方が、効率的で安全なｍＲＮＡ送達に関してＢＡＭＥＡ－０１６Ｂナノ粒子の有効性を実証した。
【0136】
実施例２．ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６を用いたｍＲＮＡ送達
図３Ａ～３Ｄは、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込みおよびエンドソーム脱出研究を示すグラフおよび画像である。
図３Ａ～３Ｄは、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＮＡナノ粒子の細胞取り込みおよびエンドソーム脱出研究を示すグラフおよび画像である。
【0137】
図４Ａ～４Ｄは、培養細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達およびゲノム編集である。
【0138】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂへのジスルフィド結合の導入が、細胞内ｍＲＮＡ放出を促進して、ｍＲＮＡトランスフェクション効率を高めることをさらに詳しく説明するために、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂに類似する化学構造を有するが、ジスルフィド結合を欠く対照脂質を合成し、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６と名付けた（図３Ａ）。アガロースゲル電気泳動研究は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢとＢＡＭＥＡ－Ｏ１６が同等のｍＲＮＡ封入効率を示したことを表す（図７）。興味深いことに、グルタチオン（ＧＳＨ）処理（５ｍＭ）は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ｍＲＮＡ複合体からのｍＲＮＡの効率的な放出をもたらしたが、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６／ｍＲＮＡ複合体からの放出はもたらさなかった。動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって明らかにされるように、２つのｍＲＮＡ複合体の同等のサイズおよびゼータ電位によって、同様のｍＲＮＡ封入能力を有することがさらに確認された（表２）。
【0139】
【表2】
【0140】
また、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６が同等のＲＮＡ送達効率を示したことも注目に値する。ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢまたはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６の蛍光標識ＲＮＡ複合体（１０ｎＭ）でのＨｅＬａ細胞の処理は、全ての脂質とＲＮＡの異なる比で９０％より高いＲＮＡ取り込み効率をもたらした（図３Ｂ）。しかしながら、ＨｅＬａ細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）イメージングは、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＮＡ処理細胞が、ＢＡＭＥＡ－０１６／ＲＮＡ処理よりも高いエンドソーム脱出効率を示すことを表し（図３Ｃ）、これは主に、還元的な細胞内環境に応答して、ＲＮＡの放出をより効率的に促進するＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂの生体還元性の性質によるものである。さらに、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂナノ粒子を使用したＲＦＰ ｍＲＮＡ送達は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６促進ｍＲＮＡ送達よりも高い、ＨｅＬａ細胞におけるＲＦＰ発現をもたらした。例えば、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂを使用した１６０ｎｇ／ｍＬのＲＦＰ ｍＲＮＡの送達は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ナノ粒子を使用した場合よりも４倍増強されたＲＦＰ発現をもたらした（図３Ｄ）。
【0141】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢをレポーターｍＲＮＡ送達に使用することの有効性を実証し、次に、ゲノム編集のためにＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを同時に送達するＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂの能力を調べた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは約４，５００ヌクレオチドのサイズであり、ルシフェラーゼまたはＲＦＰ ｍＲＮＡ（約１，０００ｎｔ）よりもはるかに長いため、細胞内送達が非常に困難である。そこで、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達およびゲノム編集のための生体還元性のライブラリーの有効性をさらに詳述するために、ＧＦＰを安定的に発現するＨＥＫ細胞を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子で処理し、ｍＲＮＡ送達前後のＧＦＰ発現量の変化を監視した。オンターゲットＧＦＰゲノム編集は、ＧＦＰ遺伝子のリーディングフレームのシフトを誘発し、それによってＧＦＰの発現を妨げることができることがわかった。図８に示すように、３２種類の脂質のうち７種類の脂質が、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを効率的に送達して、ＨＥＫ細胞のＧＦＰ発現をノックダウンすることができ、中でも脂質ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂが最も高いゲノム編集およびＧＦＰノックアウト効率を示した。ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６ＢとＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの静電相互作用により、２３０ｎｍ程度のサイズのよく分散したナノ粒子が組み立てられることがわかった（表２、図９）。一方、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡナノ複合体は、ゲノム編集の送達に適した高い生体適合性を有している。異なる濃度のＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡナノ複合体で処理したＨＥＫ細胞は、いずれも９０％以上の生存率を維持しており、これはＬＰＦ２Ｋ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡナノ複合体で処理したＨＥＫ細胞よりも高い（図１０）。
【0142】
ＣＬＳＭイメージングは、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＧＦＰナノ粒子での処理が、ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰ蛍光の完全な消失をもたらしたが、遊離Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡでの処理は、同様のＧＦＰノックアウト効果を示さなかったことを表す（図４Ａ）。ＨＥＫ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰ発現の定量分析は、細胞に送達されるＣａｓ９ ｍＲＮＡの濃度が２０ｎｇ／ｍＬから１６０ｎｇ／ｍＬに増加するにつれて、ＧＦＰノックアウト効率は３５％から９０％超に上昇したことを示した（図４Ｂ）。一方、ｓｇＧＦＰをスクランブルｓｇＲＮＡで置き換えた場合、効果的なゲノム編集および細胞のＧＦＰ損失は観察されなかった（図４Ｃ）。ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ処理が、タンパク質レベルで非常に速くＧＦＰ発現をノックアウトしたことは注目に値する（図４Ｂ）。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達の２４時間後に早くも４０％のＧＦＰノックアウトが観察され、この割合はＣａｓ９ ｍＲＮＡ送達の３６時間後には９０％まで増加したが、送達時間をさらに延長してもゲノム編集効率は上昇しなかった。
【0143】
実施例３．ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ媒介Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達は内在性遺伝子発現を調節することができる
図５Ａ～５Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ送達およびゲノム編集を示すグラフおよび画像である。
図５Ａ～５Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ送達およびゲノム編集を示すグラフおよび画像である。
【0144】
さらに、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ媒介Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達は、内在性遺伝子発現を調節することができるため、新規な遺伝子治療を開発する大きな可能性を有することが示された。ヒト子宮頸がんの進行を促進する必須遺伝子であるヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ１８）を研究対象として選択した。ＨＰＶ１８を標的とするＳｇＲＮＡを、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂを用いてＣａｓ９ ｍＲＮＡと共にＨｅＬａ細胞に送達し、処理後のＨｅＬａ細胞の生存率を測定し、スクランブルｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡでの処理の生存率と比較した。図４Ｄに示すように、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＨＰＶ１８処理は、スクランブルｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達と比較して、ＨｅＬａの成長を有意に抑制した（図４Ｄ）。例えば、３２０ｎｇ／ｍＬのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２６ｎＭのｓｇＨＰＶ１８の送達は、ＨｅＬａ細胞の生存率を３０％まで低下させたが、ｓｇＨＰＶ１８をスクランブルｓｇＲＮＡに置き換えると、ＨｅＬａ細胞の成長を妨げることに対する同様の効果を示さなかった。
【0145】
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ送達およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集のためのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂナノ粒子の可能性をさらに実証するために、肝細胞から分泌され、コレステロールのホメオスタシスに関与する酵素であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を研究対象として選択した。ＰＣＳＫ９は、肝臓の低密度リポタンパク質コレステロール受容体（ＬＤＬ－Ｒ）の密度を調節することにより、脂質代謝において重要な役割を果たしており、遺伝子研究は、ＰＣＳＫ９の喪失が心血管疾患のリスク低下に関連することを明らかにする。
【0146】
ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達のためのＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂナノ粒子の生体内分布をまず検討した。この目的のために、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子または蛍光標識ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡナノ粒子を処方し、０．６ｍｇ／ｋｇまたは０．８ｍｇ／ｋｇのｓｇＲＮＡのｍＲＮＡ投与量でマウスに尾静脈から静脈内注射し、その後、組織器官の生物発光または蛍光イメージングを行ってナノ粒子の生体内分布を調べた。図１１および図５Ａに示すように、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ルシフェラーゼｍＲＮＡナノ粒子を注射すると、マウスの肝臓でルシフェラーゼの効果的な発現がもたらされ、一方、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／Ｃｙ３－ＲＮＡナノ粒子を投与すると、マウスの肝臓で蛍光シグナルの効果的な蓄積が示された。ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子を送達させることによる詳細な細胞局在化研究は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／ＲＦＰ ｍＲＮＡナノ粒子が主に肝細胞に蓄積されることを明らかにし（図５Ｂ）、これは、後述するように、肝細胞でのＰＣＳＫ９ゲノム編集に利用できる。
【0147】
ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂナノ粒子をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した後、血清ＰＣＳＫ９レベルを定量して、ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集効果を評価することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集のためのＢＡＭＥＡ－０１６Ｂナノ粒子の可能性および有効性を調べた。図５Ｃに示すように、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＰＣＳＫ９ナノ粒子を静脈内注射すると、マウスの血清ＰＣＳＫ９は、ＤＰＢＳを注射した場合またはＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／スクランブルｓｇＲＮＡナノ粒子を注射した場合の２０％まで低下した（図５Ｃ）。一方、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡナノ粒子処置後のマウスの肝臓のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いた組織学的検査は、炎症の兆候を示さなかった（図１２）。さらに、ナノ粒子の注射は、すべての注射を受けたマウスの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、および総ビリルビンの変化が最小限であることから明らかであるように、明らかな肝細胞障害を誘発しなかった（図１３）。上記の結果は、ＢＡＭＥＡ－Ｏ１６Ｂナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集に高い有効性および生体適合性を有することを明らかに実証した。
【0148】
ＩＩ．ＡＮＧＰＴＬ３のｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子媒介送達
材料および方法
ＬＮＰ製剤
我々の以前の報告に従ってリピドイドを合成した。ＬＮＰは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体システム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて調製した。簡単に説明すると、リピドイド、コレステロール（Ｓｉｇｍａ社）、リン脂質（ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）、ならびにＤＭＧ－ＰＥＧ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を、最終リピドイド濃度１０ｍｇ／ｍＬで、５０／３８．５／１０／１．５のモル比で１００％エタノールに溶解させた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３またはｓｇＬｏｘＰのいずれか）を、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．２）中において適切な重量比で混合した。ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液をそれぞれ３：１の比でＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体デバイスに注入すると、デバイスは２つの成分の迅速な混合、したがってＬＮＰの自己集合をもたらした。さらに、製剤を透析カセットでＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。製剤の粒径は、ＺｅｔａＰＡＬＳ ＤＬＳ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。ＲＮＡ封入効率は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって評価した。
材料および方法
ＬＮＰ製剤
我々の以前の報告に従ってリピドイドを合成した。ＬＮＰは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体システム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて調製した。簡単に説明すると、リピドイド、コレステロール（Ｓｉｇｍａ社）、リン脂質（ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）、ならびにＤＭＧ－ＰＥＧ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を、最終リピドイド濃度１０ｍｇ／ｍＬで、５０／３８．５／１０／１．５のモル比で１００％エタノールに溶解させた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ（ｓｇＡＮＧＰＴＬ３またはｓｇＬｏｘＰのいずれか）を、酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．２）中において適切な重量比で混合した。ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液をそれぞれ３：１の比でＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体デバイスに注入すると、デバイスは２つの成分の迅速な混合、したがってＬＮＰの自己集合をもたらした。さらに、製剤を透析カセットでＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。製剤の粒径は、ＺｅｔａＰＡＬＳ ＤＬＳ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。ＲＮＡ封入効率は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって評価した。
【0149】
Ｉｎ ｖｉｖｏ ＬＮＰ送達
動物実験のすべての手順は、Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物のケアおよび使用のためのガイドラインに従って実施した。動物はすべてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から取り寄せた。雌のＢａｌｂ／ｃマウス（６～８週）を、ｉｎ ｖｉｖｏでのホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）封入ＬＮＰのスクリーニングおよび製剤の最適化に用いた。簡単に説明すると、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰを０．５ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡの用量でマウスに静脈内注射した。所与の時点で、マウスに１００μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄｂｉｏ）溶液（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬ）を注射し、イソフルラン麻酔で麻酔をかけ、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。
動物実験のすべての手順は、Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物のケアおよび使用のためのガイドラインに従って実施した。動物はすべてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から取り寄せた。雌のＢａｌｂ／ｃマウス（６～８週）を、ｉｎ ｖｉｖｏでのホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）封入ＬＮＰのスクリーニングおよび製剤の最適化に用いた。簡単に説明すると、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰを０．５ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡの用量でマウスに静脈内注射した。所与の時点で、マウスに１００μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄｂｉｏ）溶液（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬ）を注射し、イソフルラン麻酔で麻酔をかけ、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。
【0150】
Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＬｏｘＰ送達
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＬｏｘＰ標的化シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＬｏｘＰ、配列：５’－ＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰに共ロードし、１．６５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡの用量で雌のＡｉ１４マウスに静脈内注射した。注射後７日目にマウスの臓器を採取し、ＩＶＩＳで画像を撮影してｔｄＴｏｍａｔｏの発現を検出した。肝臓組織をさらに切片化した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＬｏｘＰ標的化シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＬｏｘＰ、配列：５’－ＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰに共ロードし、１．６５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡの用量で雌のＡｉ１４マウスに静脈内注射した。注射後７日目にマウスの臓器を採取し、ＩＶＩＳで画像を撮影してｔｄＴｏｍａｔｏの発現を検出した。肝臓組織をさらに切片化した。
【0151】
免疫染色
組織サンプルをＯＣＴで包埋した後、液体窒素で完全に凍結させ、切片作成の準備が整うまで－８０℃で保存した。凍結組織ブロックを、クライオトームを用いて所望の厚さ（１０μｍ）に切片化し、免疫蛍光染色に適したスライドガラスに載せた。組織切片を予め冷却したアセトン（－２０℃）で１０分間固定した後、ＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。固定した組織切片を室温（ｒ．ｔ．）で１０％ＢＳＡブロッキングバッファー中において１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。肝細胞特異的一次抗体（１％ＢＳＡ緩衝液で１：１００に希釈したもの、抗肝細胞特異的抗原（ＨｅｐＰａｒ１）、Ｎｏｖｕｓ社製）をスライド上の切片に添加し、加湿チャンバーにおいて４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで５分ずつ２回交換してすすぎ、ｅＦｌｏｕｒ６６０結合Ｆ（ａｂ’）２－ヤギ抗マウス二次抗体（１：５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色し、遮光した加湿チャンバーにおいて室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する蛍光マウンティングメディウムを使用して、スライドをカバースリップした。Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて切片を分析した。
組織サンプルをＯＣＴで包埋した後、液体窒素で完全に凍結させ、切片作成の準備が整うまで－８０℃で保存した。凍結組織ブロックを、クライオトームを用いて所望の厚さ（１０μｍ）に切片化し、免疫蛍光染色に適したスライドガラスに載せた。組織切片を予め冷却したアセトン（－２０℃）で１０分間固定した後、ＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。固定した組織切片を室温（ｒ．ｔ．）で１０％ＢＳＡブロッキングバッファー中において１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。肝細胞特異的一次抗体（１％ＢＳＡ緩衝液で１：１００に希釈したもの、抗肝細胞特異的抗原（ＨｅｐＰａｒ１）、Ｎｏｖｕｓ社製）をスライド上の切片に添加し、加湿チャンバーにおいて４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで５分ずつ２回交換してすすぎ、ｅＦｌｏｕｒ６６０結合Ｆ（ａｂ’）２－ヤギ抗マウス二次抗体（１：５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色し、遮光した加湿チャンバーにおいて室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する蛍光マウンティングメディウムを使用して、スライドをカバースリップした。Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて切片を分析した。
【0152】
ＡＮＧＰＴＬ３のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列は、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇソフトウェアを用いて設計した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３標的化シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＡｎｇｐｔｌ３、配列：５’－ＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＧＧＴＣＡ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を共ロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを、１．０、２．０、および３．０ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡの用量で雌の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与した。ＰＢＳを投与したマウスを陰性対照とした。注射後７日目にマウスを屠殺し、ＥＬＩＳＡによる循環ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質および血中脂質の定量のために血液を採取し、またＤＮＡ抽出および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析のために肝臓組織を内側および外側左葉（median and left lateral lobe）から採取した。また、ｉｎ ｖｉｖｏ毒性および免疫反応を評価するために、注射の２日後にマウスの血液を採取し、血清に処理した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を、ＡＳＴ（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＬＴ（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のアッセイキットを用いてメーカーのプロトコールに従って測定した。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列は、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇソフトウェアを用いて設計した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３標的化シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＡｎｇｐｔｌ３、配列：５’－ＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＧＧＴＣＡ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を共ロードした３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを、１．０、２．０、および３．０ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡの用量で雌の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与した。ＰＢＳを投与したマウスを陰性対照とした。注射後７日目にマウスを屠殺し、ＥＬＩＳＡによる循環ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質および血中脂質の定量のために血液を採取し、またＤＮＡ抽出および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析のために肝臓組織を内側および外側左葉（median and left lateral lobe）から採取した。また、ｉｎ ｖｉｖｏ毒性および免疫反応を評価するために、注射の２日後にマウスの血液を採取し、血清に処理した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を、ＡＳＴ（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＬＴ（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のアッセイキットを用いてメーカーのプロトコールに従って測定した。
【0153】
ＮＧＳシーケンシング解析
市販の抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ）を用いて、肝臓の内側および外側左葉からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲプライマーは、Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子の標的部位の周辺領域、または予測されるオフターゲット部位の周辺領域を増幅するように設計した（表Ｓ１）。オフターゲット部位は、Ｃａｓ Ｏｆｆ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェア（ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）を用いて予測した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｔｕｆｔｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でのシーケンシングのためにＰＣＲアンプリコンを調製した。シーケンシングデータはＯｕｔＫｎｏｃｋｅｒ２ソフトウェア（ｏｕｔｋｎｏｃｋｅｒ．ｏｒｇ／ｏｕｔｋｎｏｃｋｅｒ２．ｈｔｍ）を用いて解析した。
市販の抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ）を用いて、肝臓の内側および外側左葉からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲプライマーは、Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子の標的部位の周辺領域、または予測されるオフターゲット部位の周辺領域を増幅するように設計した（表Ｓ１）。オフターゲット部位は、Ｃａｓ Ｏｆｆ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェア（ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）を用いて予測した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｔｕｆｔｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でのシーケンシングのためにＰＣＲアンプリコンを調製した。シーケンシングデータはＯｕｔＫｎｏｃｋｅｒ２ソフトウェア（ｏｕｔｋｎｏｃｋｅｒ．ｏｒｇ／ｏｕｔｋｎｏｃｋｅｒ２．ｈｔｍ）を用いて解析した。
【0154】
血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）の分析
抗凝固剤を使用せずにマウスの血液を採取し、室温（ｒ．ｔ．）で２時間凝固させた後、室温で１５～２０分間２０００×ｇで遠心分離してマウス血清を採取した。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＬＤＬ－Ｃ、およびＴＧの血清レベルを、マウスアンジオポエチン様タンパク質３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＬＤＬ－コレステロールキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）、トリグリセリド比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、それぞれメーカーのプロトコールに従って測定した。
抗凝固剤を使用せずにマウスの血液を採取し、室温（ｒ．ｔ．）で２時間凝固させた後、室温で１５～２０分間２０００×ｇで遠心分離してマウス血清を採取した。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＬＤＬ－Ｃ、およびＴＧの血清レベルを、マウスアンジオポエチン様タンパク質３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＬＤＬ－コレステロールキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）、トリグリセリド比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、それぞれメーカーのプロトコールに従って測定した。
【0155】
Ｔ７Ｅ１切断アッセイ
抽出されたゲノムＤＮＡ鋳型、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および特異的プライマー（表３）を用いて、オンターゲット部位に隣接するゲノム領域を増幅した。
抽出されたゲノムＤＮＡ鋳型、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および特異的プライマー（表３）を用いて、オンターゲット部位に隣接するゲノム領域を増幅した。
【0156】
【表3】
【0157】
以下のサイクルを実行した：９８℃で３０秒、続いて９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、および７２℃で３０秒を３３サイクル、続いて７２℃で１０分。ＰＣＲ産物はＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物４００ｎｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中において、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で９５℃に５分間加熱し、続いて２℃／秒で８５℃まで、さらに０．１℃／秒で２５℃まで温度を下げることにより、ハイブリダイズさせた。アニーリングしたサンプルをＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃で１５分間消化した後、６５℃で５分間インキュベートして反応を停止させた。生成物をさらに精製し、４～２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動した。
【0158】
統計解析
データは平均値±ＳＤとして表した。すべてのデータはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。＊ｐ＜０．０５を有意とみなし、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を高度に有意とみなした。
データは平均値±ＳＤとして表した。すべてのデータはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。＊ｐ＜０．０５を有意とみなし、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を高度に有意とみなした。
【0159】
【0160】
ジスルフィド結合が組み込まれたアクリレート脂質尾部とアミン含有頭部との間のコンビナトリアル無溶媒マイケル付加反応を介して尾部分岐生体還元性リピドイドを調製した（図１５Ａ）。これら脂質のｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達効果は、まず、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ）をＬＮＰに封入し、このＬＮＰを雌の野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内送達することによって評価した。これらＬＮＰは、我々のイオン化可能な合成脂質に加えて、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＤＭＧ－ＰＥＧといった賦形剤化合物と共に製剤化した。ブランク（非ロード（unloaded））およびｆＬｕｃ ｍＲＮＡロードＬＮＰの代表的な透過型電子顕微鏡像を図２０Ａおよび図２０Ｂに示した。ゴールドスタンダードであるＭＣ－３ ＬＮＰを陽性対照として含めた。ｍＲＮＡ送達の６時間後、マウスにルシフェリン基質を腹腔内注射し、ＩＶＩＳ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて全身のｆＬｕｃ活性を測定した。図１５Ｂに示すように、３０６－Ｏ１２Ｂ、１１３－Ｏ１２Ｂ、および３０６－Ｏ１０Ｂ ＬＮＰを用いたｍＲＮＡ送達は、ＭＣ－３ ＬＮＰ送達と比較して、同等またはより高いルシフェラーゼ生物発光強度をもたらした。マウスのｉｎ ｖｉｖｏ画像は、ルシフェラーゼタンパク質が主に肝臓で発現されたことを明確に示した（図２１）。３０６－Ｏ１２Ｂをさらなる実験のための代表的な脂質として使用した。ｆＬｕｃ ｍＲＮＡは、約９８％の封入効率で３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰに効率的に封入された（図２２）。ｆＬｕｃ ｍＲＮＡの封入後、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰは、１１２ｎｍの平均直径を有していた（図１５Ｃ）。
【0161】
実施例５．３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ製剤の最適化
図１６Ａ～１６Ｆは、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ製剤の最適化を示す。
図１６Ａ～１６Ｆは、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ製剤の最適化を示す。
【0162】
ｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現をさらに高めるために、賦形剤リン脂質の同一性、ＬＮＰ製剤の４成分のモル組成比、およびｆＬｕｃ ｍＲＮＡ封入３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの脂質／ｍＲＮＡ重量比などの、これらＬＮＰの組み立てに使用される様々な処方パラメータを最適化した。
【0163】
まず、リン脂質賦形剤のｉｎ ｖｉｖｏルシフェラーゼ発現効果に及ぼす影響を評価するために、元のＤＳＰＣリン脂質と比較して、同様の構造を有するが、頭部基および尾部飽和度が異なる２つのリン脂質ＤＯＰＥおよびＤＯＰＣ（図１６Ａ）を選択した。ＤＯＰＣおよびＤＯＰＥはそれぞれ、炭素尾部に不飽和度１を含むが、ＤＳＰＣは完全に飽和している。さらに、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣはそれぞれ第４級アミン頭部基を含むのに対し、ＤＯＰＥは第１級アミン頭部基を含む。これらの特徴はそれぞれ、ＬＮＰ送達効率に影響を与えることが文献で報告されている。四級化アミン頭部基は、第一級アミン頭部よりも強いプロトンスポンジ効果を示すことが報告されており、これは、カーゴｍＲＮＡのエンドソームから細胞質への脱出を促進し、したがってｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を増加させることができる。さらに、脂質尾部の飽和度は、膜の流動性に影響を与えることが示されており、これもエンドソーム脱出に影響を与える可能性がある。不飽和脂質尾部は、より高い膜流動性をもたらし、それはＬＮＰの膜との融合時にエンドソーム膜の不安定化を介してエンドソーム脱出を向上させるのを助ける可能性もある。これらを総合すると、第４級アミンと不飽和尾部とを含むＤＯＰＣを用いて形成されたＬＮＰが、最も効率的なｆＬｕｃの送達を示すと仮定する。図１６Ｂおよび図１６Ｃに示すように、ＤＯＰＣを用いて製剤化したｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰは、ＤＯＰＥや元のＤＳＰＣリン脂質を用いて形成されたＬＮＰと比較して、肝臓での有意に高いルシフェラーゼ発現をもたらした。ＤＯＰＣ含有ＬＮＰで送達されたｆＬｕｃ ｍＲＮＡは、元のＤＳＰＣ含有ＬＮＰと比較して約４倍高い発光シグナルをもたらした。
【0164】
初期のスクリーニングでは、活性脂質と賦形剤成分を［脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧ］のモル比が［５０：３８．５：１０：１．５］となるように処方した。最適なリン脂質をＤＯＰＣと特定し、それに合わせて処方を調整した後、最適パラメータを特定するために、さまざまなモル比で配合したＬＮＰを試験した（図１６Ｄ）。図１６Ｅに示すように、元の製剤Ｏ（３０６－Ｏ１２Ｂ：コレステロール：ＤＯＰＣ：ＤＭＧ－ＰＥＧのモル比が５０：３８．５：１０：１．５）が最も高いルシフェラーゼ生物発光強度を示した；新規処方パラメータはいずれも元の処方を超えることはできなかった。
【0165】
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性をさらに高める努力の中で、４つの成分のこの最適比を有するＬＮＰを、５：１～２５：１の範囲の異なる重量比の活性脂質３０６－Ｏ１２Ｂ：ｍＲＮＡを用いて製剤化した。興味深いことに、重量比が７．５：１のときに最も高い有効性が達成されたことが見出された。この点を超えて脂質の量を増加させても、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の有効性に利益をもたらさないと思われる（図１６Ｆ）。まとめると、これらの結果は、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰの最適化製剤が、３０６－Ｏ１２Ｂ／ｍＲＮＡの重量比７．５／１で、５０％の３０６－Ｏ１２Ｂ、３８．５％のコレステロール、１０％のＤＯＰＣ、および１．５％のＤＭＧ－ＰＥＧのモル組成を有していたことを表す。
【0166】
実施例６．ｍＲＮＡ最適化ＬＮＰを用いたＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ肝細胞特異的送達
図１７Ａ～１７Ｃは、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＡｉ１４マウスでＣａｓ９／ｓｇＬｏｘＰ媒介ゲノム編集を可能にしたことを示す。
図１７Ａ～１７Ｃは、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＡｉ１４マウスでＣａｓ９／ｓｇＬｏｘＰ媒介ゲノム編集を可能にしたことを示す。
【0167】
図２３Ａ～２３Ｂは、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＡｉ１４／Ｃａｓ９交配マウスでｓｇＬｏｘＰ媒介ゲノム編集を可能にしたことを示す画像である。
【0168】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ ＬＮＰによって編集される特定の細胞タイプを同定することは、ＣＲＩＳＰＲ送達システムの潜在的な適用を予測する上で極めて重要である。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を制御するＬｏｘＰ－Ｆｌａｎｋｅｄ ＳＴＯＰカセットで遺伝子操作されたＡｉ１４レポーターマウス系統を用いた。このマウス系統は、Ｃｒｅリコンビナーゼと共によく使用されるが、ＬｏｘＰ隣接終止コドンのＣＲＩＳＰＲ媒介切除の成功はｔｄＴｏｍａｔｏの発現も誘導する。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を有する細胞を調べることにより、我々のＬＮＰ送達システムがうまく標的化し得る細胞タイプを特定することができる。
【0169】
このアプローチを検証するために、まず３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを用いて、Ａｉ１４構築物と構成的に発現されたＣａｓ９構築物の両方を発現するように操作されたマウス（Ａｉ１４＋／Ｃａｓ９＋マウスモデル）にＬｏｘＰ標的化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＬｏｘＰ）を送達した。図２３Ａおよび図２３Ｂに示すように、我々のＬＮＰシステムを用いたｓｇＬｏｘＰの送達は、肝臓で特異的に検出される赤色蛍光をもたらした。興味深いことに、さらなる組織学的分析は、ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが主に肝臓の肝細胞で観察されたことを明らかにし、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがこの治療に関連する細胞タイプにもｓｇＲＮＡを特異的に送達できることを示した。
【0170】
次に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＬｏｘＰを１つの単一ＬＮＰに共製剤化し、１．６５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量でＡｉ１４マウスに尾静脈から注射した（図１７Ａ）。送達の７日後に臓器を採取し、ＩＶＩＳシステムを用いてｅｘ ｖｉｖｏで画像を撮影した。ＩＶＩＳシステムにより解析したマウスの臓器のｅｘ ｖｉｖｏ画像は、このシステムが実際に赤色蛍光を誘導でき、それはｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ成分の両方の機能的共送達が成功したことを示し、さらにｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが主に肝臓で検出された（図１７Ｂ）ことを示した。さらに、肝細胞特異的バイオマーカーを用いた免疫蛍光染色を行い、共焦点画像は、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の大部分が肝細胞で発現されることを実証した（図１７Ｃ）。これらの知見は、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＣＲＩＳＰＲ機構を肝臓の肝細胞に特異的に運ぶことができることを強く示した。
【0171】
実施例７．ＡＮＧＰＴＬ３のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集
図１８Ａ～１８Ｂは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３の３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ媒介の有意レベルのｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集を示す。
図１８Ａ～１８Ｂは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３の３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ媒介の有意レベルのｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集を示す。
【0172】
図１９Ａ～１９Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのゲノム編集によるＡＮＧＰＴＬ３の機能喪失型変異の誘発において３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＭＣ－３ ＬＮＰよりも効率的であることを示す。
【0173】
次に、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを送達して機能的内在性遺伝子の発現を操作する能力を検証した。リポタンパク質リパーゼ活性および内皮リパーゼ活性の両方を阻害するリポタンパク質代謝の中心的な制御因子であるアンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）をコードするＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を研究対象として選択した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、ＡＮＧＰＴＬ３の非ウイルス性Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３ ＬＮＰ媒介ｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集について検討した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＡｎｇｐｔｌ３を３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰに同時に封入した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡという２つの要素を含むことから、これら２つの要素の比がｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集の効果に影響を与える可能性がある。そこで、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＡｎｇｐｔｌ３を異なる質量比２：１、１：１．２、および１：２で一緒に配合した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを総ＲＮＡ量３．０ｍｇ／ｋｇでマウスに注射した。注射後７日目に、血清を採取して血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルのＥＬＩＳＡ分析を行い、また肝臓組織サンプルを採取してＤＮＡ抽出およびＮＧＳシーケンシングを行って標的化Ｃａｓ９媒介ゲノム編集を特定した。すべてのＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３比において、マウス肝臓でのゲノム編集および血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低下が観察されたが、これらの群間で有意差は認められなかった（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。１：１．２のＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３比を以下の実験に用いた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＡｎｇｐｔｌ３を封入した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰは、平均サイズが１１０ｎｍであり、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ ＬＮＰと同様の特性を有していた（図２４）。
【0174】
有意なレベルの編集が見られたため、より詳細なｉｎ ｖｉｖｏ編集実験を計画し、実施した。ゴールドスタンダードとして、我々のＲＮＡ成分を封入した３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰを、全く同じＲＮＡ成分を封入したＦＤＡ承認の肝送達用脂質ＭＣ－３から構成されるＬＮＰ（ＭＣ３－ＬＮＰ）と比較した。３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰおよびＭＣ３－ＬＮＰの両方で同じ比率の賦形剤脂質が使用されたこと、およびこの特定の賦形剤の処方がＭＣ３－ＬＮＰでの使用について既に公開されていることに留意されたい。３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰまたはＭＣ－３－ＬＮＰを総ＲＮＡ用量３．０ｍｇ／ｋｇでマウスに投与した。投与後７日目に、Ｔ７Ｅ１アッセイを用いて肝臓の所望部位での編集が観察された（図２５）。さらに、肝臓サンプルにおけるＡＮＧＰＴＬ３標的部位の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、３０６－Ｏ１２Ｂ－ＬＮＰｓ媒介送達が、ＭＣ－３媒介送達（１４．６％）よりも有意に高い、３８．５％の中央編集率をもたらしたことを実証した（図１９Ａ）。より重要なことに、血清分析は、３０６－Ｏ１２Ｂ ＬＮＰ処置群における血清ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ＬＤＬ－Ｃ、およびＴＧレベル（それぞれ６５．２％、５６．８％、２９．４％の減少）が、ＭＣ－３ ＬＮＰ処置マウスのレベル（それぞれ２５％、１５．７％、１６．３％の減少）よりも有意に低いことを明らかにした（図１９Ａ）。ＮＧＳシーケンシング結果の詳細な解析は、最も頻繁な編集事象が、正確に予測Ｃａｓ９切断部位での１ｎｔの欠失であり、続いて同じ位置での１ｎｔの挿入であることを明らかにした（図１９Ｂ）。予想通り、ＭＣ３ ＬＮＰ処置肝臓および３０６－０１２Ｂ ＬＮＰ処置肝臓の両方において同じ編集事象が観察され、主な違いはこれらの事象の頻度であった。これは、観察された血清成分の減少が実際にＣａｓ９媒介ゲノム編集の結果であったことを表し、２つの脂質間の観察された結果の違いが、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの生来の活性の変化ではなく、単に送達効率の結果であったことを示唆する。
【0175】
いずれのＣＲＩＳＰＲ送達システムでも、オフターゲット編集事象や送達誘導毒性を回避するように注意しなければならない。最も可能性の高い上位９つのオフターゲットゲノム変異誘発部位をコンピュータで予測し、これら遺伝子座を、肝臓から抽出したＤＮＡのＮＧＳシーケンシングにより調べた。上位９つの予測オフターゲット変異誘発部位のいずれにも編集の証拠は観察されなかった（図１９Ｃ）。ｉｎ ｖｉｖｏ毒性および潜在的な免疫炎症反応を評価するために、肝機能マーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ならびに炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の血清レベルを測定した（図２６）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰでの処置後にこれらパラメータにおける有意な変化は検出されず、全身毒性が無視できることをさらに実証した。
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
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【図17A】
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【図18A】
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【図19C】
【図20A】
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【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【国際調査報告】