特表 2022-535746 核酸配列における構成要素を同定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-10

(54)【発明の名称】核酸配列における構成要素を同定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20220803BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220803BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220803BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 Z

C12M1/00 A

C12N15/11 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570366

(86)(22)【出願日】2020-05-27

(85)【翻訳文提出日】2022-01-20

(86)【国際出願番号】 US2020034759

(87)【国際公開番号】W WO2020243207

(87)【国際公開日】2020-12-03

(31)【優先権主張番号】62/853,119

(32)【優先日】2019-05-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/861,675

(32)【優先日】2019-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521391748

【氏名又は名称】ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ペイミン

(72)【発明者】

【氏名】レイ， ミン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029BB20

4B029CC01

4B029FA15

4B029GA08

4B029GB09

4B029GB10

4B063QA13

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR42

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX04

(57)【要約】

本発明は、ポリメラーゼ合成に基づいて単一分子レベルで電子的にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を同定または配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、上記ナノ構造体に結合され、上記ナノ構造体には、ＤＮＡプライマーおよび配列決定されるべき標的から構成される二重鎖、および続いて、ヌクレオシド三リン酸またはｄＮＴＰの混合物が供給される。金属イオンの存在下では、上記ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰを、ワトソン－クリック塩基対合規則に従ってＤＮＡプライマーへと組み込み、各組み込み工程は、センサーにおいて記録される電子スパイクを誘起する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体ポリマーの同定、特徴付けまたは配列決定のためのシステムであって、前記システムは、
（ａ）非伝導性基材；
（ｂ）前記非伝導性基材上で互いに対して隣に配置される第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップ；
（ｃ）前記ナノギャップに匹敵する寸法を有し、かつ化学的結合を通じて、一方の端部を前記第１の電極へとおよびもう一方の端部を前記第２の電極へと結合させることによって前記ナノギャップを架橋するように構成されるナノ構造体；
（ｄ）前記ナノ構造体に結合されかつ生体ポリマー合成反応を行うように構成されたＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ；
（ｅ）前記生体ポリマー合成反応を促進する反応混合物；
（ｆ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加されるバイアス電圧；
（ｇ）前記ナノ構造体に結合された前記ポリメラーゼによって開始されるコンホメーション変化によって引きおこされる前記ナノ構造体内の歪みから生じる前記ナノ構造体を経る電流変動を記録するデバイス；ならびに
（ｈ）前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するデータ分析のためのソフトウェア、
を含み；
ここで前記生体ポリマーは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、もしくはオリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせのいずれかであり、かつ２本鎖もしくは１本鎖、直線状もしくは環状、天然の、改変されている、または合成されている、およびこれらの組み合わせのいずれかである、システム。

【請求項2】

前記非伝導性基材は、以下：ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラス、二酸化ハフニウム、他の金属酸化物、任意の非伝導性ポリマーフィルム、酸化ケイ素もしくは窒化ケイ素または他の非伝導性コーティングを有するケイ素、窒化ケイ素コーティングを有するガラス、他の非伝導性有機物質、および／あるいは任意の非伝導性無機物質を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記ナノ構造体は、以下：
（ａ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるデオキシリボ核酸から作製されるＤＮＡナノ構造体；
（ｂ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるリボ核酸から作製されるＲＮＡナノ構造体；
（ｃ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるアミノ酸から作製されるペプチドナノ構造体；および
（ｄ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかである任意の伝導性生体ポリマー（複数可）から作製される分子ワイヤ、
のうちの１つまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載のシステム。

【請求項4】

前記ナノ構造体は、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、タングステン（Ｗ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、チタン（Ｔｉ）、タンタル（Ｔａ）、クロム（Ｃｒ）、ＴｉＮ、ＴｉＮｘ、ＴａＮ、ＴａＮｘ、銀（Ａｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、および他の金属、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される金属材料から作製される固体ナノワイヤを含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項5】

前記ナノ構造体は、単層もしくは多層またはこれらの組み合わせのいずれかのカーボンナノチューブまたはグラフェンシートを含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項6】

前記ナノ構造体は、前記ポリメラーゼであり、ここで前記ポリメラーゼは、２つの前記電極に直接付着され、前記ナノギャップを架橋し、前記電流を通過させる、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

前記ＤＮＡポリメラーゼは、天然の、変異されたか、発現されたか、または合成されたかのいずれか、およびこれらの組み合わせである、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｙ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、およびＰｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α（アルファ）、Ｐｏｌ β（ベータ）、Ｐｏｌ σ（シグマ）、Ｐｏｌ λ（ラムダ）、Ｐｏｌ δ（デルタ）、Ｐｏｌ ε（エプシロン）、Ｐｏｌ μ（ミュー）、Ｐｏｌ Ι（イオタ）、Ｐｏｌ κ（カッパ）、ｐｏｌ η（エータ）、ならびに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、テロメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、天然の、変異されたか、発現されたか、または合成されたかのいずれか、およびこれらの組み合わせである、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスＲＮＡポリメラーゼ；ならびにＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶを含む真核生物ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに古細菌ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項9】

ゲート電極として機能するように構成された第３の電極をさらに含み、ここで前記第１の電極および前記第２の電極と一緒に、前記電極は、ＦＥＴタイプナノギャップデバイスを形成する、請求項１に記載のシステム。

【請求項10】

前記反応混合物は、以下：
（ａ）少なくとも１種の天然に存在するヌクレオシド三リン酸；
（ｂ）電子供与性基または電子求引性基のいずれかを含む少なくとも１種の天然に存在するヌクレオシドγ－置換三リン酸；
（ｃ）前記天然に存在するヌクレオシド三リン酸のβ，γ－架橋Ｏの代わりになるＸ部分を有する、天然に存在するヌクレオシド三リン酸の少なくとも１種のβ，γ－Ｘアナログ；
（ｄ）少なくとも１種のα－チオ－ｄＮＴＰまたはα－チオ－ＮＴＰ；
（ｅ）少なくとも１種のα－ボラノ－ｄＮＴＰまたはα－ボラノ－ＮＴＰ；
（ｆ）少なくとも１種のα－ボラノ－α－チオ－ｄＮＴＰまたはα－ボラノ－α－チオ－ＮＴＰ；
（ｇ）少なくとも１種のα－セレノ－ｄＮＴＰまたはα－セレノ－ＮＴＰ；
（ｈ）少なくとも１種のデオキシリボヌクレオシドα－Ｒ－ホスホニル－β，γ－ジホスフェート；
（ｉ）少なくとも１種のβ，γ－Ｘ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ類似物またはβ，γ－Ｘ－α－Ｚ－ＮＴＰ類似物；および
（ｊ）少なくとも１種のγ－Ｒ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ類似物またはγ－Ｒ－α－Ｚ－ＮＴＰ類似物、
のヌクレオシド三リン酸混合物のうちの少なくとも１つまたはこれらの組み合わせを含み、ここで前記ｄＮＴＰは、ＤＮＡ合成のために構成され、前記ＮＴＰは、ＲＮＡ合成のために構成される、請求項１に記載のシステム。

【請求項11】

前記反応混合物は、以下：
（ａ）改変された糖を含み、ここで糖環における酸素は、異なる電気陰性度を有する原子によって置き換えられているｄＮＴＰまたはＮＴＰ；
（ｂ）人工遺伝子ポリマーゼノ核酸（ＸＮＡ）を含むヌクレオシドユニットを含むｄＮＴＰまたはＮＴＰ；
（ｃ）電子求引性基、電子供与性基、エチル基、エチレン基、およびアセチレン基、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で改変され、前記分子に対して官能基が結合される５位を有するピリミジン塩基を含む、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ；ならびに
（ｄ）電子求引性基、電子供与性基、エチル基、エチレン、およびアセチレン基、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で改変され、前記分子に対して官能基が結合される７位を有するプリン塩基を含む、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ、
のうちの少なくとも１つまたはこれらの組み合わせを含み、ここで前記ｄＮＴＰは、ＤＮＡ合成のために構成され、前記ＮＴＰは、ＲＮＡ合成のために構成される、請求項１に記載のシステム。

【請求項12】

複数のナノギャップセンサーを含み、ここで各ナノギャップセンサーは、１対の電極、ナノ構造体、ポリメラーゼ、反応混合物、および単一ナノギャップと関連付けられた任意の特徴を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項13】

前記複数のナノギャップセンサーは、約１０個～約１０億個のナノギャップ、好ましくでは、約１０，０００～約１００万個の間のナノギャップのアレイを含む、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

生体ポリマーを同定する、特徴づける、または配列決定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）非伝導性基材を提供する工程；
（ｂ）第１の電極および第２の電極を提供し、前記電極を互いに対して隣に配置して、前記非伝導性基材上にナノギャップを形成する工程；
（ｃ）前記ナノギャップに匹敵する寸法を有しかつ化学的結合を通じて、一方の端部を前記第１の電極へとおよびもう一方の端部を前記第２の電極へと結合させることによって、前記ナノギャップを架橋するように構成されたナノ構造体を提供する工程；
（ｄ）前記ナノ構造体に結合されかつ生体ポリマー合成反応を行うように構成されたＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを提供する工程；
（ｅ）前記生体ポリマー合成反応を促進する反応混合物を提供する工程；
（ｆ）前記第１の電極と前記第２の電極との間でバイアス電圧を印加する工程；
（ｇ）前記ナノ構造体に結合された前記ポリメラーゼによって開始されるコンホメーション変化によって引きおこされる前記ナノ構造体内の歪みから生じる前記ナノ構造体を経る電流変動を記録する工程；ならびに
（ｈ）前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するデータ分析のためのソフトウェアを提供する工程、
を包含し、ここで前記生体ポリマーは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、もしくはオリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせのいずれかであり、かつ２本鎖もしくは１本鎖、直線状もしくは環状、天然の、改変されている、または合成されている、およびこれらの組み合わせのいずれかである、方法。

【請求項15】

前記非伝導性基材は、以下：ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラス、二酸化ハフニウム、他の金属酸化物、任意の非伝導性ポリマーフィルム、酸化ケイ素もしくは窒化ケイ素または他の非伝導性コーティングを有するケイ素、窒化ケイ素コーティングを有するガラス、他の非伝導性有機物質、および／あるいは任意の非伝導性無機物質を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ナノ構造体は、以下：
（ａ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるデオキシリボ核酸から作製されるＤＮＡナノ構造体；
（ｂ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるリボ核酸から作製されるＲＮＡナノ構造体；
（ｃ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかであるアミノ酸から作製されるペプチドナノ構造体；および
（ｄ）天然の、改変された、または合成されたかのいずれかである任意の伝導性生体ポリマー（複数可）から作製される分子ワイヤ、
のうちの１つまたはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記ナノ構造体は、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、タングステン（Ｗ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、チタン（Ｔｉ）、タンタル（Ｔａ）、クロム（Ｃｒ）、ＴｉＮ、ＴｉＮｘ、ＴａＮ、ＴａＮｘ、銀（Ａｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、および他の金属、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される金属材料から作製される固体ナノワイヤを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記ナノ構造体は、単層もしくは多層またはこれらの組み合わせのいずれかのカーボンナノチューブまたはグラフェンシートを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

前記ナノ構造体は、前記ポリメラーゼであり、ここで前記ポリメラーゼは、２つの前記電極に直接付着され、前記ナノギャップを架橋し、前記電流を通過させる、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記ＤＮＡポリメラーゼは、天然の、変異されたか、発現されたか、または合成されたかのいずれか、およびこれらの組み合わせである、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｙ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、ならびにＰｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α（アルファ）、Ｐｏｌ β（ベータ）、Ｐｏｌ σ（シグマ）、Ｐｏｌ λ（ラムダ）、Ｐｏｌ δ（デルタ）、Ｐｏｌ ε（エプシロン）、Ｐｏｌ μ（ミュー）、Ｐｏｌ Ι（イオタ）、Ｐｏｌ κ（カッパ）、ｐｏｌ η（エータ）、ならびに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、テロメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、天然の、変異されたか、発現されたか、または合成されたかのいずれか、およびこれらの組み合わせである、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルスＲＮＡポリメラーゼ；ならびにＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶを含む真核生物ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに古細菌ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項22】

ゲート電極として機能するように構成された第３の電極を提供する工程であって、ここで前記第１の電極および前記第２の電極と一緒に、前記電極は、ＦＥＴタイプナノギャップデバイスを形成する、工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。

【請求項23】

前記反応混合物は、以下：
（ａ）少なくとも１種の天然に存在するヌクレオシド三リン酸；
（ｂ）電子供与性基または電子求引性基のいずれかを含む少なくとも１種の天然に存在するヌクレオシドγ－置換三リン酸；
（ｃ）前記天然に存在するヌクレオシド三リン酸のβ，γ－架橋Ｏの代わりになるＸ部分を有する、天然に存在するヌクレオシド三リン酸の少なくとも１種のβ，γ－Ｘアナログ；
（ｄ）少なくとも１種のα－チオ－ｄＮＴＰまたはα－チオ－ＮＴＰ；
（ｅ）少なくとも１種のα－ボラノ－ｄＮＴＰまたはα－ボラノ－ＮＴＰ；
（ｆ）少なくとも１種のα－ボラノ－α－チオ－ｄＮＴＰまたはα－ボラノ－α－チオ－ＮＴＰ；
（ｇ）少なくとも１種のα－セレノ－ｄＮＴＰまたはα－セレノ－ＮＴＰ；
（ｈ）少なくとも１種のデオキシリボヌクレオシドα－Ｒ－ホスホニル－β，γ－ジホスフェート；
（ｉ）少なくとも１種のβ，γ－Ｘ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ類似物またはβ，γ－Ｘ－α－Ｚ－ＮＴＰ類似物；および
（ｊ）少なくとも１種のγ－Ｒ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ類似物またはγ－Ｒ－α－Ｚ－ＮＴＰ類似物、
のヌクレオシド三リン酸混合物のうちの少なくとも１つまたはこれらの組み合わせを含み、ここで前記ｄＮＴＰは、ＤＮＡ合成のために構成され、前記ＮＴＰは、ＲＮＡ合成のために構成される、請求項１４に記載の方法。

【請求項24】

前記反応混合物は、以下：
（ａ）改変された糖を含み、ここで糖環における酸素は、異なる電気陰性度を有する原子によって置き換えられているｄＮＴＰまたはＮＴＰ；
（ｂ）人工遺伝子ポリマーゼノ核酸（ＸＮＡ）を含むヌクレオシドユニットを含むｄＮＴＰまたはＮＴＰ；
（ｃ）電子求引性基、電子供与性基、エチル基、エチレン基、およびアセチレン基、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で改変され、前記分子に対して官能基が結合される５位を有するピリミジン塩基を含む、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ；ならびに
（ｄ）電子求引性基、電子供与性基、エチル基、エチレン基、およびアセチレン基からなる群より選択される分子で改変され、前記分子に対して官能基が結合される７位を有するプリン塩基を含む、ｄＮＴＰまたはＮＴＰ、
のうちの少なくとも１つまたはこれらの組み合わせを含み、ここで前記ｄＮＴＰは、ＤＮＡ合成のために構成され、前記ＮＴＰは、ＲＮＡ合成のために構成される、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２７日出願の米国仮特許出願第６２／８５３，１１９号および２０１９年６月１４日出願の米国仮特許出願第６２／８６１，６７５号（これらの全体の開示は、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。

【0002】

分野
本発明の実施形態は、酵素を使用して、核酸配列における個々のヌクレオチドを読み取るための電子的配列決定デバイスのための方法および生化学的材料に関する。

【背景技術】

【0003】

［０００１］
先行技術および背景
本出願を通じて、本発明が関わる種々の刊行物、特許、および特許出願が、参照されている。これらの刊行物のそれら全体における開示は、技術水準として記載される。また、本出願において、本発明は、主に、ＤＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼ合成とともに例証される。同じ機序、原理、および特徴が、わずかな改変（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）をヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）で置き換える、デオキシリボースをリボースで置き換えるなど）だけで、ＲＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ合成にも適用される。
［０００２］
先行技術（米国特許第９，８６２，９９８号および同第１０，２３３，４９３号）は、蛍光色素で標識されたＤＮＡポリメラーゼのコンホメーション変化をモニターすることによって、ＤＮＡへのヌクレオチド組み込みを検出する方法を開示する。その酵素および色素に依存して、異なるヌクレオチドは（天然に存在するものおよび改変されたものを含む）、蛍光発光について異なる大きさおよび持続時間を生じた。上記方法は、核酸分子の集合からヌクレオチド配列を決定する。
［０００３］
別の先行技術は、カーボンナノチューブ電荷センサー（図１）が、個々の天然に存在するヌクレオチドをＤＮＡプライマーにリアルタイムで組み込む単一のＤＮＡポリメラーゼのプロセスを電子的にモニターし得^１、その結果、このような電子的デバイスが、潜在的に、核酸ポリマーの配列決定において使用され得ることを示した。しかし、上記電子シグナル（スパイクとして現れる）は、個々に組み込まれるヌクレオチドを同定するために効果的に適用され得ない。以下の表（参考文献１から借用）に示されるように、天然に存在するヌクレオチドの中から相応に、ＤＮＡポリメラーゼ組み込みの重なり合いの電子シグナルに由来する特徴的パラメーター間の重なり合いが存在する。従って、τ_ｌｏ値も、τ_ｈｉ値も、Ｈ値も、いかなる程度の信頼性でも特定のｄＮＴＰの組み込みを同定するために十分でない。

【表1】

［０００４］
先行技術出願（ＷＯ ２０１６／１８３２１８）は、天然のヌクレオチド三リン酸のうちの１またはこれより多くが、区別可能な方法においてシグナル極性を変化させる非天然部分を有するアナログで、上記アナログが配列決定の間のテンプレート鎖中のその同族ヌクレオチドと塩基対合する能力を害することなく置き換えられる混合物を特許請求している。例として、α－チオ－ｄＡＴＰは、シグナル極性において負の変化を生じ、２－チオ－ｄＴＴＰは、シグナル極性において正の変化を生じるので、それらは、上記デバイスの電荷センサーによってテンプレートにおけるＴとＡとの間を区別するために使用され得る（それらの構造については図２を参照のこと）。しかし、Ｗｅｉｓｓおよび共同研究者らは、２－チオピリミジン－５’－トリホスフェート（２－チオ－ｄＮＴＰ）アナログが、ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）活性が１分間の間に負の偏倚運動を、およびもう１分間の間に正の偏倚運動を生じる、混合した挙動を生じることを報告した^２。それは、核酸塩基のワトソン－クリック塩基対合エッジに対する改変が、電子シグナルの不安定さを引きおこし、次には、核酸配列決定のためのヌクレオチド組み込みの決定に関して不安定さを生じることを示す。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第９，８６２，９９８号明細書

【特許文献2】米国特許第１０，２３３，４９３号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＤＮＡ鎖へのヌクレオシド三リン酸の酵素による組み込みは、図４に示されるように、ミスマッチのｄＮＴＰとマッチしたｄＮＴＰとの間で^３、同様に異なるＤＮＡポリメラーゼの間で^４類似の動力学的経路を有する。概して、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ重合は、動力学的に制御されたプロセスである。上記プロセスに関与するいくつかの主要工程が存在する：（１）コンホメーションの閉鎖、（２）ＤＮＡの３’末端へのトリホスフェートカップリング、ならびに（３）ＤＮＡトランスロケーションおよびコンホメーションの再開放（ここで上記カップリング反応は、律速工程である）。図４は、ミスマッチ塩基対が、ＤＮＡポリメラーゼの閉鎖および再開放にそれほど影響を及ぼさないが、酵素が触媒した遷移状態（ＴＳ）に影響を及ぼすことを示唆する。従って、天然に存在するヌクレオシドの非塩基対合セクションの改変は、それらの動力学的パラメーターを調整し、それらを電子的センサーによって区別可能にするはずである。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１： 酵素活性をリアルタイムでモニターするために、２つの電極（ソースおよびドレイン）に結合され、ＤＮＡポリメラーゼで官能化されたカーボンナノチューブから構成される先行技術のデバイス。

【0007】

【図2】図２： 改変されたヌクレオチドであるα－チオ－ｄＡＴＰおよび２－チオ－ｄＴＴＰの化学構造。

【0008】

【図3】図３： ２つの電極に結合されたナノ構造体、（ａ）ＤＮＡナノ構造体、（ｂ）ペプチドナノ構造体上のポリメラーゼを有する単一分子ＤＮＡ配列決定デバイスの模式的ダイアグラム。

【0009】

【図4】図４：（ａ）種々のＤＮＡポリメラーゼ Ｐｏｌ β ＷＴ、Ｒ２５８Ａ変異体、ＫＦ、およびＰｏｌ Ｘによる単一ヌクレオチド組み込みの自由エネルギープロフィール；（ｂ）Ｉ２６０Ｑ変異体に対してＰｏｌ βによるマッチしたおよびミスマッチのｄＮＴＰ組み込みの定性的自由エネルギープロフィール。

【0010】

【図5】図５： ＤＮＡ鎖へとヌクレオチド基質を組み込むことにおける反応。

【0011】

【図6】図６： 天然に存在するヌクレオシド三リン酸の化学構造。

【0012】

【図7】図７： 天然に存在するヌクレオシドγ－置換三リン酸の化学構造。

【0013】

【図8】図８： 天然に存在するヌクレオシド三リン酸のβ，γ－Ｘ類似物（ａｎａｌｏｇｙ）の化学構造。

【0014】

【図9】図９： 天然に存在するヌクレオシドであるα－チオ－トリホスフェート（α－チオ－ｄＮＴＰ）の化学構造。

【0015】

【図10】図１０： 天然に存在するヌクレオシドであるα－ボラノ－トリホスフェート（α－ボラノ－ｄＮＴＰ）の化学構造。

【0016】

【図11】図１１： 天然に存在するヌクレオシドであるα－ボラノ－α－チオ－トリホスフェート（α－ボラノ－α－チオ－ｄＮＴＰ）の化学構造。

【0017】

【図12】図１２： 天然に存在するヌクレオシドであるα－セレノ－トリホスフェート（α－セレノ－ｄＮＴＰ）の化学構造。

【0018】

【図13】図１３： 天然に存在するデオキシリボヌクレオシドであるα－Ｒ－ホスホニル－β，γ－ジホスフェートの化学構造。

【0019】

【図14】図１４： 両方の酸素架橋が改変された天然に存在するヌクレオシド三リン酸（β，γ－Ｘ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ）の化学構造。

【0020】

【図15】図１５： γ－リンおよびα－リンの酸素のうちの一方が、他の原子または有機基によって置き換えられている天然に存在するヌクレオシド三リン酸の化学構造。

【0021】

【図16】図１６： それらの糖環酸素が他の原子によって置き換えられるヌクレオチドの化学構造。

【0022】

【図17】図１７： 代表的なゼノ核酸（ＸＮＡ）ヌクレオシドの化学構造。

【0023】

【図18】図１８： 本発明におけるワトソン－クリック塩基対および改変部位のダイアグラム。

【0024】

【図19】図１９： 改変されたピリミジン核酸塩基の化学構造。

【0025】

【図20】図２０： 改変されたプリン核酸塩基の化学構造。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、米国仮特許出願第６２／７９４，０９６号、同第６２／８１２，７３６号、同第６２／８３３，８７０号、および同第６２／８０３，１００号（これらは、それらの全体において本明細書に含まれる）に開示されるように、核酸配列決定のための電子的センサーとしてＤＮＡポリメラーゼとカップリングした生体ポリマーナノ構造体を含む（図３ａ、ＤＮＡナノ構造体、および図３ｂ、ペプチドナノ構造体を参照のこと）。図３に図示されるＤＮＡナノ構造体およびペプチドナノ構造体はともに、トンネリングおよびホッピングを介するある特定の条件下での電荷の導体である。ＤＮＡポリメラーゼは、各々、短い可撓性リンカーを通じて所定の位置においてナノ構造体に結合される。配列決定のために、上記ＤＮＡポリメラーゼは、先ず、「開放」コンホメーションで存在して標的－プライマー二重鎖と二成分複合体を形成し、それは次に、ワトソン－クリック塩基対合を介して正確なヌクレオシド三リン酸と三成分複合体を形成し得る。金属イオンの存在下では、その三成分複合体は、ＤＮＡポリメラーゼを「閉鎖」コンホメーションに変え、伸長反応を促進する。新たなホスホジエステル結合が形成されると、上記二重鎖の末端において新生塩基対が過剰に拡げられ、それは、最も近い隣りの塩基対とのスタッキング相互作用を誘発する。このようなプロセスは、ＤＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼを反対方向にシフトさせ、よって、次回の組み込みのための開放コンホメーションを生じる^５。コンホメーション変化およびＤＮＡトランスロケーションを含むこれらの機械的な動きの全ては、下にあるナノ構造体に対して力を及ぼし、その塩基対合およびスタッキングを妨害し、ヌクレオチド組み込みのシグナチャーとして電荷輸送の変動を生じる。

【0027】

本発明は、生体ポリマー、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡを構成する個々の構成要素（またはユニットまたは塩基）を同定するための方法および化学物質を提供する。例えば、標的ＤＮＡ分子を配列決定するために、本発明者らは、それを、上記ナノ構造体配列決定デバイス上でＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。その標的ＤＮＡ分子とともに、ヌクレオシド三リン酸基質は、ワトソンクリック塩基対合規則に倣って成長中のＤＮＡ鎖へと組み込まれる。そのＤＮＡ配列は、そのヌクレオチド組み込みを読み取ることによって決定される。近年の研究は、第３の二価金属イオンがＤＮＡ合成中に存在し得る^７にも拘わらず、ＤＮＡ合成が、２個のＭｇ^２＋イオンが支援する段階的会合Ｓ_Ｎ２反応である^６ことを示した。さらに、上記Ｓ_Ｎ２反応から放出されたピロホスフェート（ＰＰｉ）基は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ合成の間に、ホスフェートへと加水分解される。ＤＮＡ重合の一般的機序は、図５に図示される。成長中の鎖の末端の３’酸素は、求核試薬として作用して、入来ｄＮＴＰのα－リン原子を攻撃し、ピロホスフェート（これは続いてホスフェートへと加水分解される）の放出を付随する、Ｐ－Ｏ共有結合を形成する。その反応機序に基づいて、本発明は、改変されたヌクレオチド基質であって、ポリメラーゼ酵素反応の動力学に、天然に存在するヌクレオチドとは異なる方法で影響を及ぼし、標的ＤＮＡが配列決定され得るように、標的ＤＮＡテンプレートにおける個々のヌクレオチドを区別するために使用され得るナノ構造体において区別可能な電子シグナルを生成する、改変されたヌクレオチド基質を提供する。

【0028】

本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、構造的相同性によってＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴのファミリーへと分類されたものが挙げられる。例えば、ファミリーＡにおけるものとしては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｐｏｌ Ｉが挙げられる；ファミリーＢにおけるものとしては、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＢ６９が挙げられる；ファミリーＣにおけるものとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ ＩＩＩが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ（逆転写酵素）ファミリーは、例えば、レトロウイルス逆転写酵素および真核生物テロメラーゼを含む。

【0029】

詳細な説明
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、上記ナノ構造体に結合され、上記ナノ構造体には、ＤＮＡプライマーおよび配列決定されるべき標的から構成される二重鎖、および続いて、ヌクレオシド三リン酸またはｄＮＴＰの混合物が供給される。金属イオンの存在下では、上記ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰを、ワトソン－クリック塩基対合規則に従ってＤＮＡプライマーへと組み込み、各組み込み工程は、センサーにおいて記録される電子スパイクを誘起する。

【0030】

上記のヌクレオシド三リン酸混合物は、以下を含む：
・０～４種の天然に存在するヌクレオシド三リン酸（図６）。
・０～４種の天然に存在するヌクレオシドγ－置換三リン酸（図７）。その置換基は、ＤＮＡポリメラーゼの活性に影響を及ぼし^８、ピロホスフェートからホスフェートへの加水分解にも影響を及ぼし得、変化した反応速度、および次に、電子シグナルを生じる電子供与性基または電子吸引性基のいずれかである。
・０～４種の天然に存在するヌクレオシド三リン酸のβ，γ－Ｘ類似物（図８）。同様に、Ｘ部分は、天然に存在するヌクレオシド三リン酸のβ，γ－架橋Ｏの代わりになり、それは、塩基対合に影響を及ぼすことなく、ビスホスホスホネート（ＢＰ）脱離基の立体電子特性を変化させる。結果として、これらのトリホスフェート類似物は、ＤＮＡポリメラーゼの組み込み速度を調節し、その速度は、脱離基によって影響を及ぼされる^９－１１。組み込みは、動力学的に制御されるプロセスであることから、その対応する電子シグナルは、応じて調節され得る。
・０～４種のα－チオ－ｄＮＴＰ（図９）。これらの改変されたトリホスフェートは、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡプライマーへと組み込まれる。デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド５’－Ｏ－（１－チオ－トリホスフェート）のＳ_ｐ－ジアステレオマーは、天然に存在するヌクレオチドのアナログであり、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって核酸へと容易に組み込まれる^{１２， １３}。
・０～４種のα－ボラノ－ｄＮＴＰ（図１０）。上記α－ボラノ－ｄＮＴＰおよびα－ボラノ－ＮＴＰは、ＤＮＡおよびＲＮＡの容易な酵素による合成を可能にする、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの良好な乃至優れた基質である^{１４， １５}。
・０～４種のα－ボラノ－α－チオ－ｄＮＴＰ（図１１）^１６。
・０～４種のα－セレノ－ｄＮＴＰ（図１２）。これらの改変されたｄＮＴＰは、ＤＮＡへと組み込まれ得る。しかし、α－セレノ－ｄＮＴＰでのＤＮＡ重合は、天然のｄＮＴＰでのものより遅い。上記α－セレノ－ｄＮＴＰは、ＤＮＡテンプレートの欠如下でのプライマー自己伸長を抑制する^１７。
・０～４種のデオキシリボヌクレオシドα－Ｒ－ホスホニル－β，γ－ジホスフェート（図１３）。これらの基質は、荷電されていない核酸骨格^１８を生成し、これは、異なる基質の組み込みから生じた電子シグナル間のさらなる区別を容易にする。
・０～４種のβ，γ－Ｘ－α－Ｚ－ｄＮＴＰアナログ（図１４）。これは、異なる基質の組み込みから生じた電子シグナル間のさらなる区別を容易にする。
・０～４種のγ－Ｒ－α－Ｚ－ｄＮＴＰ類似物（図１５）。これは、異なる基質の組み込みから生じた電子シグナル間のさらなる区別を容易にする。

【0031】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、改変された糖を含む。図１６は、糖環における酸素が別の原子によって置き換えられる改変の１つの形態を示す。これらの原子は、異なる電気陰性度を有し、これは、隣りの３’－ＯＨのｐＫ_ａに、次には、その求核性に影響を及ぼす。例えば、２’－デオキシ－４’－チオリボヌクレオシド５’－トリホスフェート（ｄＳＮＴＰ）（ここでＸ＝Ｓ、Ｒ＝Ｈ、塩基＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（改変されていないトリホスフェートを有する）である）は、ＤＮＡポリメラーゼの基質として使用され得る^１９。ｄＳＮＴＰは、その対応する天然のｄＮＴＰとは異なる反応速度および効率を示した。

【0032】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、リボース糖（図１６、Ｒ＝ＯＨ）を含む。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）は、ＲＮＡ配列決定のために上記ＤＮＡナノ構造体デバイスに結合される。上記酵素は、ポリオウイルスＲｄＲＰなどである。

【0033】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、天然に見出されるものとは異なる骨格構造を有し、ＤＮＡ核酸塩基と特異的に塩基対合し得る一連の核酸ポリマーである人工遺伝子ポリマー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）ゼノ核酸（ＸＮＡ）を含むヌクレオシドユニットを有する（図１７）。ＸＮＡのうちのあるものは、可撓性のまたは剛性のコンホメーションの糖ユニットを有し、他のものは、それらの天然に存在する対応物とは異なる構成および構造を有する。これらは、酵素における標的へのそれらの結合をそれらの天然に存在する対応物とは異なるものにする。また、いくつかのＸＮＡは、その天然に存在する対応物と比較して、その隣りのＯＨを多かれ少なかれ求核性にする電子供与性基または電子求引性基を有する。例えば、ＴＮＡは、古細菌の超好熱性種であるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（Ｋｏｄ）から単離された複製性Ｂファミリーポリメラーゼに由来する実験室で進化させたポリメラーゼによってＤＮＡプライマーへと組み込まれ得る^{２０， ２１}。これらのＸＮＡ基質は、特定のＤＮＡヌクレオチドを、ＤＮＡ標的におけるそれらの残りから区別するために有用である。

【0034】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列決定のために上記生体ポリマーナノ構造体センサーに結合されるＲＮＡポリメラーゼとしては、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）；真核生物ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶ）；および古細菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。センサーに結合されるＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ配列を読み取るために、標準のリボヌクレオシド三リン酸の混合物とともに供給される。

【0035】

いくつかの実施形態において、上記混合物は、以下を含む：
・０～４種の標準のリボヌクレオシド三リン酸。
・０～４種の、それらのトリホスフェートが改変されているリボヌクレオチド（図１６、Ｒ＝ＯＨ）。
・０～４種の、図１６に示されるとおりの一般化された構造を有する改変されたリボヌクレオシド三リン酸（ここでＲ＝ＯＨである）。
・０～４種のＸＮＡトリホスフェート（図１７）。

【0036】

本発明は、改変された塩基をさらに提供して、それらの反応性のためにＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの両方をさらに調節する。ポリメラーゼの忠実度を維持するために、本発明者らは、図１８に示されるように、ＷＣエッジを、改変された塩基に関して変化されないままにする。これらの化合物は、ワトソン－クリック塩基対合規則に倣ってテンプレートと相互作用するために正確な入来ヌクレオチドを挿入するための保存されたワトソン－クリック水素結合エッジ、およびポリメラーゼが副溝からの塩基対と相互作用する水素結合アクセプター部位の共通する特徴を有する^{２２， ２３}。従って、上記改変は、上記酵素の忠実度を乱さない。

【0037】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、一連の電子求引性基、電子供与性基、ならびにエチル、エチレン、およびアセチレンで改変され、これらに対して種々の官能基が結合される５位を有するピリミジン塩基から構成される（図１９）。これらの改変は、本発明者らが、酵素反応の遷移状態を調節することを可能にする。

【0038】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、一連の電子求引性基、電子供与性基、ならびにエチル、エチレン、およびアセチレンで改変され、これらに対して種々の官能基が結合される７位を有するプリン塩基から構成される（図２０）。これらの改変は、本発明者らが、酵素反応の遷移状態を調節することを可能にする。

【0039】

いくつかの実施形態において、上記ヌクレオシド三リン酸は、上記改変された塩基、改変された糖または糖類似物、および改変されたトリホスフェートまたはトリホスフェート類似物から構成される。

【0040】

いくつかの実施形態において、複数のナノ構造体センサーが、核酸配列を並行して読み取るために使用される。複数のナノ構造体センサーは、固体表面上にまたはウェルの中に、１０～１０^９の、好ましくは１０^３～１０^７の、またはより好ましくは１０^４～１０^６のナノ構造体センサー数を有するアレイフォーマットで製作され得る。

【0041】

上記アレイにおけるナノ構造体センサーの全ては、１つのタイプの核酸ポリメラーゼまたは異なるタイプの核酸ポリメラーゼで構成される。

【0042】

標的サンプルは、２本鎖もしくは１本鎖、直線状もしくは環状のＤＮＡであり得る。標的サンプルはまた、２本鎖もしくは１本鎖、直線状もしくは環状のＲＮＡであり得る。配列決定するためのプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの結合体、または改変されたヌクレオシドを含むＤＮＡであり得る。

【0043】

ポリメラーゼは、以前の仮特許出願（米国仮特許出願第６２／７９４，０９６号、同第６２／８１２，７３６号、同第６２／８３３，８７０号、および同第６２／８０３，１００号を参照のこと）に提供される結合化学現象を使用して、所定の位置（複数可）において生体ポリマーナノ構造体センサーに結合され得る。多くの実施形態において、ＤＮＡナノ構造体は、所定のＤＮＡヌクレオシドまたはヌクレオシドにおいて、有機官能基で官能化される。対して、ＤＮＡポリメラーゼは、クリック反応のためにＤＮＡナノ構造体におけるものに対する機能を有する非天然のアミノ酸を含むように生体工学で操作される。

【0044】

いくつかの実施形態において、全ての上記の記載における生体ポリマーナノ構造体は、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、タングステン（Ｗ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、チタン（Ｔｉ）、タンタル（Ｔａ）、クロム（Ｃｒ）、ＴｉＮ、ＴｉＮｘ、ＴａＮ、ＴａＮｘ、銀（Ａｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、および他の金属、好ましくはＰｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ｔｉ、およびＴｉＮの群から選択される材料から作製される固体ナノワイヤ（ｓｏｌｉｄ ｎａｎｏｗｉｒｅ）によって置き換えられる。上記ナノワイヤは、長さが３ｎｍ～１０μｍ、好ましくは２０ｎｍ～１μｍ；幅が５ｎｍ～５０ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～２０ｎｍ；および厚みが３ｎｍ～５０ｎｍ、好ましくは４ｎｍ～１０ｎｍである。全てのヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオシド三リン酸の設計、改変、バリエーション、天然または非天然の、ポリメラーゼとのそれらの相互作用、それらの使用方法、および個々のヌクレオチドを区別する原理は、ポリメラーゼ－ナノワイヤにカップリングされたＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定システムに適用される。いくつかの他の実施形態において、上記ナノワイヤは、単層または多層の、ナノワイヤに類似の寸法を有するカーボンナノチューブまたはグラフェンシートである。

【0045】

いくつかの実施形態において、全ての上記の記載におけるナノ構造体は、分子ワイヤ（例えば、特許出願、ＷＯ２０１８２０８５０５、ＵＳ２０１８０３０５７２７Ａ１、およびＷＯ２０１８１３６１４８Ａ１に開示されるもの）によって置き換えられる。全てのヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオシド三リン酸の設計、改変、バリエーション、天然または非天然の、ポリメラーゼとのそれらの相互作用、それらの使用方法、および個々のヌクレオチドを区別する原理は、ポリメラーゼ－分子ワイヤにカップリングされたＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定システムに適用される。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、２つの電極に直接付着され、その２つの電極間のナノギャップを架橋し、電子または電流を通過させる（例えば、特許出願、ＷＯ２０１８２０８５０５、ＵＳ２０１８０３０５７２７Ａ１およびＷＯ２０１８１３６１４８Ａ１に開示されるもの）。ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定の目的のために、上述のヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオシド三リン酸の設計、改変、バリエーション、天然または非天然の、ポリメラーゼとのそれらの相互作用、それらの使用方法、および個々のヌクレオチドを区別する原理は、ポリメラーゼのみのＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定システムに適用される。

【0047】

いくつかの実施形態において、上述の全てのナノギャップ架橋構成（例えば、生体ポリマーナノ構造体、分子ワイヤ、ナノワイヤおよび電極のナノギャップに直接接触するポリメラーゼ）は、ＦＥＴタイプのポリメラーゼ配列決定システム（例えば、米国仮特許出願第６２／８３３，８７０号に開示されるもの）を形成するために、ゲート電極と組み合わされ得る。上記ナノギャップを通過する電子シグナルに影響を及ぼすポリメラーゼのコンホメーション変化の機序は、幾分異なるが、上記ヌクレオシド三リン酸およびリボヌクレオシド三リン酸の設計、改変、バリエーション、天然または非天然の、ポリメラーゼとのそれらの相互作用、それらの使用方法、および個々のヌクレオチドを区別する原理は、ＦＥＴタイプのポリメラーゼＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定システムにも適用される。

【0048】

総論：
特許または特許出願は、それらが本文中で言及される場所に参考として援用される。引用された雑誌刊行物は、引用文献中に列挙される。
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味をもつ。本発明は、種々の実施形態の記載によって例証され、これらの実施形態はかなり詳細に記載されているが、本出願の範囲を制限するかまたは何らかの方法で限定することは、出願人の意図ではない。さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、本発明は、その広い局面において、示され、記載される特定の詳細、代表的なデバイス、装置および方法、ならびに例証的な例に限定されない。よって、出願人の包括的な発明の概念の趣旨から逸脱することなく、このような詳細からの発展がなされ得る。
引用文献：

【化1】

【化2】

【化3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【国際調査報告】