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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-10
(54)【発明の名称】細胞におけるＬＵＸ発現と使用の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20220803BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220803BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220803BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N5/10
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571416
(86)(22)【出願日】2020-05-29
(85)【翻訳文提出日】2022-01-28
(86)【国際出願番号】 US2020035442
(87)【国際公開番号】W WO2020243660
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/854,758
(32)【優先日】2019-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521521057
【氏名又は名称】４９０ バイオテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100134832
【弁理士】
【氏名又は名称】瀧野 文雄
(74)【代理人】
【識別番号】100165308
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 俊明
(74)【代理人】
【識別番号】100115048
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 康弘
(72)【発明者】
【氏名】クロース ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】リップ スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】セイラー ギャリー
(72)【発明者】
【氏名】コンウェイ マイケル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ01
4B063QR72
4B063QS38
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、自家生物発光表現型を有する幹細胞を含む細胞に関するものであり、この細胞によって、外因性の発光刺激因子がない場合に発光シグナルが放出される。発光シグナルは、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的であり得る。細胞は、合成的に操作された細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）カセット、すなわちｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子カセットを発現する。細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを含み得る。細胞はそれぞれ、ｌｕｘＡとｌｕｘＢとを組み合わせた発現レベルよりも１０倍～４０倍大きいｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを組み合わせた発現レベルを発現し得る。さらに、本明細書では、自家生物発光表現型を含む細胞を作製および使用する方法を開示する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
外因性発光刺激因子の非存在下での発光シグナルを含む自家生物発光表現型を有する幹細胞。
【請求項1】
請求項１の幹細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む、幹細胞。
【請求項2】
請求項１～１のいずれか一項に記載の幹細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸をさらに含む、幹細胞。
【請求項3】
請求項１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、前記発光シグナルが構成的に放出される、幹細胞。
【請求項4】
請求項３の幹細胞であって、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する、幹細胞。
【請求項5】
請求項５の幹細胞であって、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸はそれぞれ、構成的プロモータに連動する、幹細胞。
【請求項6】
請求項４の幹細胞であって、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動する、幹細胞。
【請求項7】
請求項７の幹細胞であって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動する、幹細胞。
【請求項8】
自律発光表現型を有する幹細胞を生成するためのキットであって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つのベクターを含む、キット。
【請求項9】
自律的かつ構成的な発光を有する幹細胞を作製する方法であって、幹細胞を提供すること、ならびに、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をトランスフェクトすることを含む、方法。
【請求項10】
請求項８または９のいずれか一項に記載のキットまたは方法であって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む第６のベクターを含み、
前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに連動する、キットまたは方法。
【請求項11】
請求項８または９のいずれか一項に記載のキットまたは方法であって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、前記前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、前記核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターとを含む、キットまたは方法。
【請求項12】
請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つのベクターによる前記幹細胞のトランスフェクションの後に、前記幹細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
【請求項13】
少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズをリアルタイムにモニタリングする方法であって、構成的発光シグナルを生成するために前記少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
前記少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、前記測定された構成的発光シグナルに基づいて、前記少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズを評価することを含む、方法。
【請求項14】
請求項１３の方法であって、前記細胞集団サイズを２つ以上の時点にわたってトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項15】
少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、構成的発光シグナルを生成するために前記少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、前記測定された構成的発光シグナルにもとづいて前記少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
【請求項16】
請求項１５の方法であって、２つ以上の時点にわたって前記少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項17】
請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記構成的発光シグナルの測定が前記少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率と相関する、方法。
【請求項18】
少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の効果を測定する方法であって、構成的発光シグナルを生成するために前記少なくとも１つの幹細胞を操作すること、前記少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させること、
前記少なくとも１つの幹細胞と前記薬剤との接触の後に、前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
前記測定された構成的発光シグナルに基づいて前記薬剤の効果を決定することを含む、方法。
【請求項19】
請求項１８の方法であって、２つ以上の時点にわたって前記薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項20】
請求項１８または１９のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞が構成的発光シグナルの生成を停止するとき、前記少なくとも１つの幹細胞にとって前記薬剤が致命的であると判断する、方法。
【請求項21】
請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
【請求項22】
請求項２１の方法であって、前記対照集団から放出される前記構成的発光シグナルと比較した前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記測定された構成的発光シグナルの減少は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
【請求項23】
請求項２２の方法であって、前記薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
【請求項24】
請求項２１の方法であって、前記対照集団から放出される前記構成的発光シグナルと比較した前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記測定された構成的発光シグナルの増加は、前記少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
【請求項25】
請求項２４の方法であって、前記薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
【請求項26】
請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法であって、前記薬剤が創薬に関して評価される、方法。
【請求項27】
請求項１３～２６のいずれか一項に記載の方法であって、該方法が高スループットで実行される、方法。
【請求項28】
少なくとも１つの幹細胞を薬剤フリー・インビボイメージングする方法であって、外因的に添加された基質の非存在下で、構成的発光シグナルを生成するために前記少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
前記少なくとも１つの幹細胞を生物に注入すること、ならびに、
該生物の少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルをイメージングすることを含む、方法。
【請求項29】
請求項２８の方法において、構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、前記測定された構成的発光シグナルに基づいてインビボで存在する前記少なくとも１つの幹細胞の総数を決定することをさらに含む、方法。
【請求項30】
請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法において、前記生物には動物が含まれ、前記少なくとも１つの幹細胞が前記生物に静脈内、皮内、または皮下注入される、方法。
【請求項31】
請求項３０の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞が前記動物に注入された後、前記動物内の少なくとも１つの幹細胞の動きをトラッキングすることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法であって、前記外因的に添加された基質がアルデヒド官能基を含む、方法。
【請求項33】
請求項１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、前記前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、前記核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターとを含む、方法。
【請求項34】
請求項１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含む第６のベクターを含み、
前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに連動する、方法。
【請求項35】
請求項１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、前記発光シグナルが組織特異的である、幹細胞。
【請求項36】
請求項３６の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターを含み、前記核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する、幹細胞。
【請求項37】
組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成する方法であって、幹細胞を提供すること、ならびに、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をトランスフェクトすることを含み、前記核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する、方法。
【請求項38】
請求項３６～３７のいずれか一項に記載の幹細胞であって、前記組織特異的プロモータを発現する組織細胞へ前記幹細胞が分化する場合、前記組織特異的細胞はｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し、かつ自律発光シグナルを放出する、幹細胞。
【請求項39】
組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を用いるリアルタイム分化報告の方法であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含む、前記少なくとも１つの幹細胞を提供することを含み、前記核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動しており、また、前記組織特異的プロモータが発現される少なくとも１つの組織細胞に前記少なくとも１つの幹細胞が分化する場合、少なくとも１つの組織細胞は発光シグナルを放出し、さらに、
前記発光シグナルが放出されるとき、前記組織細胞から放出される発光シグナルを測定して、前記少なくとも１つの組織細胞への前記少なくとも１つの幹細胞の分化をトラッキングする、方法。
【請求項40】
請求項３９の方法であって、２つ以上の時点にわたって、前記少なくとも１つの組織細胞への前記少なくとも１つの幹細胞の前記分化をトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項41】
請求項３９または４０のいずれか一項に記載の方法であって、前記発光シグナルの放出は、前記少なくとも１つの組織細胞への前記少なくとも１つの幹細胞の前記分化の開始を報告する、方法。
【請求項42】
請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法であって、前記発光シグナルの前記測定に基づいて前記少なくとも１つの組織細胞の総数を評価することをさらに含む、方法。
【請求項43】
請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法であって、前記発光シグナルの前記測定に基づいて、少なくとも１つの組織細胞に分化した前記少なくとも１つの幹細胞を決定することをさらに含む、方法。
【請求項44】
組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成するキットであって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、前記核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する、キット。
【請求項45】
請求項３６～４４に記載の幹細胞またはキットであって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸が組織特異的プロモータに連動する、第１のベクターと、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターとを含む、キットまたは方法。
【請求項46】
請求項３６～４４のいずれか一項に記載の幹細胞またはキットであって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が組織特異的プロモータに連動する、幹細胞またはキット。
【請求項47】
請求項３６～４７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記組織特異的プロモータは、ＴＮＮプロモータを含む、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項48】
請求項３８～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記組織細胞または前記少なくとも１つの組織細胞は、心筋細胞を含む、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項49】
請求項１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項50】
請求項１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項51】
請求項１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項52】
請求項１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項53】
請求項１～２のいずれか一項の幹細胞であって、前記発光シグナルが分析物に反応する、幹細胞。
【請求項54】
請求項５３の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動する、幹細胞。
【請求項55】
請求項５４の幹細胞であって、前記幹細胞は、分析物に曝されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子をさらに含み、前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の前記少なくとも１つの転写を引き起こす、幹細胞。
【請求項56】
請求項５４に記載の幹細胞であって、前記幹細胞は、分析物に曝されると前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子をさらに含み、前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の前記少なくとも１つの非転写をもたらす、幹細胞。
【請求項57】
分析物の存在下で自律誘導性発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより前記幹細胞をコトランスフェクトすること、
前記分析物に曝されると前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより前記幹細胞をコトランスフェクトすること、を含み、
前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸のうちの前記少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
【請求項58】
分析物の存在下で、自律的かつ抑制的な発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより前記幹細胞をコトランスフェクトすること、ならびに、
前記分析物に曝されると前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより前記幹細胞をコトランスフェクトすることを含み、
前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸のうちの前記少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
【請求項59】
少なくとも１つの幹細胞での遺伝子発現をモニタリングする方法であって、請求項５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の前記幹細胞の少なくとも１つを生成すること、前記少なくとも１つの幹細胞を前記分析物と接触させること、ならびに、
前記少なくとも１つの幹細胞を前記分析物と接触させた後に前記少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすることを含む、方法。
【請求項60】
請求項５９に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記発光シグナルを測定することをさらに含む、方法。
【請求項61】
請求項５９または６０のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記発光シグナルの前記測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することによって、遺伝子発現を評価することをさらに含む、方法。
【請求項62】
試料中の分析物の存在を決定する方法であって、請求項５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の前記幹細胞の少なくとも１つを生成すること、前記少なくとも１つの幹細胞を前記試料に接触させること、前記少なくとも１つの幹細胞を前記分析物と接触させた後に前記少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすること、ならびに、
前記発光シグナルの前記測定に基づいて、前記試料中の分析物の存在を評価することを含む、方法。
【請求項63】
請求項６２の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞から放出される前記発光シグナルの前記測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
【請求項64】
分析物によって誘導的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
前記分析物に曝されると前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
【請求項65】
分析物によって抑制的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
前記分析物に曝されると前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
【請求項66】
請求項５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答エレメントを含み、好ましくは、前記分析物は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンの類似体を含む、方法。
【請求項67】
請求項５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、前記少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因または前記少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、構成的プロモータに連動し、好ましくは、前記構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである、幹細胞、方法、またはキット。
【請求項68】
請求項５４～６７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動しない前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の前記少なくとも１つは、構成的プロモータに連動する。
【請求項69】
幹細胞に由来する自律発光細胞であって、自律発光幹細胞から分化した自律発光真核細胞を含み、前記分化した自律発光真核細胞と前記自律発光幹細胞とはどちらも、外因性発光刺激因子の非存在下で構成的発光シグナルを発現する、幹細胞に由来する自律発光細胞。
【請求項70】
自律発光幹細胞から幹細胞に由来する自律発光細胞を生成する方法であって、自律発光幹細胞を構築すること、ならびに、
前記自律発光幹細胞を前記幹細胞に由来する自律発光細胞に分化させることを含み、前記幹細胞に由来する自律発光細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で発光シグナルを放出する、方法。
【請求項71】
請求項７０の方法であって、前記分化が小分子方法によって実行される、方法。
【請求項72】
少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞由来の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を提供すること、
前記少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出される前記構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
前記測定された構成的発光シグナルにもとづいて、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
【請求項73】
請求項７２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率を２つ以上の時点にわたってトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項74】
請求項７２または７３のいずれか一項に記載の方法であって、構成的発光シグナルの測定は、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率と相関する、方法。
【請求項75】
少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞における薬剤の効果を決定する方法であって、構成的発光シグナルを生成するために前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を操作すること、
前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を薬剤に接触させること、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を前記薬剤に曝した後に、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
前記測定された構成的発光シグナルにもとづいて前記薬剤の効果を決定すること、を含む方法。
【請求項76】
請求項７５に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって前記薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
【請求項77】
請求項７６の方法であって、前記薬剤の効果が安定する時点を決定することをさらに含む、方法。
【請求項78】
請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞が構成的発光シグナルの生成を停止したとき、前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞にとって前記薬剤が致命的であると決定する、方法。
【請求項79】
請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出される前記構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される前記構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
【請求項80】
請求項７９に記載の方法であって、前記対照集団から放出される前記構成的発光シグナルと比較した前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される前記測定された構成的発光シグナルの減少は、前記薬剤に曝すことに起因する前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
【請求項81】
参照元が見つからないエラー記載の方法であって、前記薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
【請求項82】
請求項７９に記載の方法であって、前記対照集団から放出される前記構成的発光シグナルと比較した前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される前記測定された構成的発光シグナルの増加は、前記薬剤に曝すことに起因する前記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
【請求項83】
請求項８２に記載の方法であって、前記薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
【請求項84】
請求項６９～８２のいずれか一項に記載の自律発光細胞または方法であって、前記自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、前記核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに作動可能に連結され、さらに、前記自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
【請求項85】
請求項８４に記載の自律発光細胞または方法であって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、前記前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、前記核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む方法。
【請求項86】
請求項８４に記載の自律発光細胞または方法であって、前記少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数は、構成的プロモータに連動する、自律発光細胞または方法。
【請求項87】
請求項１～８６のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記幹細胞に由来する自律発光細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターを発現することで、前記幹細胞に由来する自律発光細胞が外因性発光刺激因子の非存在下で発光する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項88】
請求項１～８７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項89】
請求項１～８８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の２０倍から３０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項90】
請求項１～８９のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンスの対応する核酸と８０％を超える配列同一性を有する。
【請求項91】
請求項１～９０のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンスの対応する核酸と１００％の配列同一性を有する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項92】
請求項１～９１のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記幹細胞は、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の転写を介して前記発光シグナルを放出する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項93】
請求項１～９２のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の転写量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸の転写量の１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項94】
請求項１～９３のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の転写量は、前記ｌｕｘＡ核酸および前記ｌｕｘＢ核酸の転写量の２０倍から３０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項95】
請求項１～９４のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする核酸ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする前記核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の１０倍から４０倍の総量で存在する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項96】
請求項１～９５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする前記核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の２０倍から３０倍の総量で存在する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項97】
請求項１～９６のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記幹細胞または前記少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項98】
請求項１～９７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記幹細胞または前記少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項99】
請求項１～９８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項100】
請求項１～９９のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成レベルの１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項101】
請求項１～１００のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項102】
請求項１～１０１のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの合計レベルの１０倍から４０倍の合計レベルで存在する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項103】
請求項１～１０２のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの合計レベルの２０倍から３０倍の合計レベルで存在する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項104】
請求項１～１０３のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを含む前記幹細胞または前記少なくとも１つの幹細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で自律的に発光する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項105】
請求項１～１０４のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項106】
請求項１～１０５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記第１の構成的プロモータおよび前記第２の構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである。
【請求項107】
請求項１～１０６のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記ｌｕｘＡ核酸、前記ｌｕｘＢ核酸、前記ｌｕｘＣ核酸、前記ｌｕｘＤ核酸、前記ｌｕｘＥ核酸、および前記フラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つのリンカーに連動する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項108】
請求項１～１０７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記少なくとも１つのリンカー領域がウイルス２Ａペプチドを含む、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項109】
請求項１～１０８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、駆除剤、除草剤、または肥料を含む、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項110】
請求項１～１１０のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記幹細胞または前記少なくとも１つの幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、または非胚性幹細胞である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項111】
請求項１～１１０のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、外因性発光刺激因子が蛍光刺激シグナルである、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【請求項112】
請求項１～１１０のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞であって、前記外因性発光刺激因子は化学発光因子であり、好ましくは前記化学発光因子は、アルデヒド官能基を含む、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
これは、テネシー州ノックスビルに居住する米国市民のダニエル・クローズ博士、テネシー州ノックスビルに居住する米国市民のスティーブン・リップ博士、マサチューセッツ州メドフォードに居住する米国市民のマイケル・コンウェイ博士、およびブレインに居住する米国市民のゲイリー・セイラー博士により、「細胞におけるｌｕｘ発現と使用の方法」の開示に関して、発明のために出願された国際（ＰＣＴ）特許出願である。
関連出願との相互参照
関連出願との相互参照
【0002】
この出願は、２０２０年５月３０日に出願され現在係属中の米国特許出願第６２／８５４，７５８号の優先権を主張するものである。米国特許出願第６２／８５４，７５８号の全体を本明細書では援用する。
米連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
米連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
【0003】
本発明は、米国立衛生研究所から授与された助成金第ＮＩＨ ＮＩＧＭＳ２Ｒ４２ＧＭ１１６６２２－０２号および第ＮＩＨ ＮＩＥＨＳ１Ｒ４３ＥＳ０２６２６９－０１号の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0004】
この文脈において、「政府」とは、アメリカ合衆国政府を意味する。
開示分野
開示分野
【0005】
本開示は、自律発光表現型を含む細胞に関する。より具体的には、本開示は、幹細胞および特殊細胞において合成的に操作された細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）カセット（すなわち、新たな比率のｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子カセット）の発現と、該細胞を作製および使用する方法とに関する。
【背景技術】
【0006】
再生医療は、従来の医学的治療および治療目標の転換を意味する。再生医療は、単に無数の症状を治療するのではなく、損傷した細胞の修復または再生を通じて病状の根本原因を修復することに焦点を当てる。再生医療の最前線には、幹細胞ベースの治療法がある。幹細胞は、自己複製の可能性と他の細胞型に分化する能力とを備えているため、再生医療に革命を起こすことが期待される。
【0007】
しかしながら、現在、臨床診療における幹細胞ベースの治療の実施に直面している多くの重大な障害が依然として存在する。具体的には、幹細胞の移動および運命は、臨床的に理解できない方法（例えば、死後分析）または高コストのために一般には利用できない方法（例えば、陽電子放射断層撮影法および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）も用いてしばしば研究される。さらに、現在のインビボイメージングアプローチは、これらのアプローチが一般に被験者を麻酔し、イメージングセッション間での対象の回復することを必要とするので、頻繁なイメージングセッションを実施することはできない。その結果、幹細胞の生存率、移動、および運命に関する情報の多くは、イメージングセッション間で失われる。従って、細胞注入の非侵襲的誘導および検証、細胞遊走の追跡、ならびに幹細胞の長期統合および生存のモニタリングのための、インビトロモダリティ下のもとでのおよびインビボモダリティ下のもとでの両方を含む新規技術が明らかに必要とされている。このような技術の開発は、幹細胞ベースの治療法の臨床的実施と利用とを改善する上で最も重要である。
【発明の概要】
【0008】
上記の問題および他の問題は、以下の実施形態によって対処されるが、本開示のすべての実施形態が上記の問題のそれぞれに対処するわけではないことを理解すべきである。実施形態のさらなる利点、特徴、および詳細は、特許請求の範囲、以下の好ましい実施形態の説明、ならびに図面から推測することができる。
【0009】
自律発光表現型とも呼ばれる、自家生物発光表現型を含む幹細胞が開示される。自家生物発光表現型は、外因性発光刺激因子の非存在下で、自家生物発光シグナルとも呼ばれる自律生物発光シグナルを放出することを含む。外因性発光刺激因子は、蛍光刺激シグナルまたは化学発光因子であり得る。化学発光因子は、例えば、アルデヒド官能基を含み得る。
【0010】
幹細胞によって放出される自家生物発光シグナルは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）、誘導的（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）、抑制的（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）、または組織特異的（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）のいずれかであり得る。実施形態において、自家生物発光シグナルは構成的であり、幹細胞は継続的に自家生物発光シグナルを放出する。実施形態において、自家生物発光シグナルは誘導性であり、幹細胞は刺激（例えば、分析物）に曝されると自家生物発光シグナルを放出する。実施形態において、自家生物発光シグナルは抑制的であり、刺激に曝されると幹細胞は自家生物発光シグナルの放出を停止する。自家生物発光シグナルは、幹細胞が組織細胞に分化するときにのみ自家生物発光シグナルが放出されるように、組織特異的であり得る。
【0011】
幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼタンパク質をさらに含み得る。幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸をさらに含み得る。
【0012】
ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸のうちの少なくとも１つ含む幹細胞の実施形態において、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、少なくとも１つのリンカー領域に連動し得る。少なくとも１つのリンカー領域は、ウイルス２Ａペプチドまたは内部リボソーム侵入部位エレメントを含み得る。
【0013】
幹細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在するいくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総計レベルよりも１０倍から４０倍高い総計レベルで存在する。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総計レベルよりもお２０倍から３０倍高い総計レベルで存在する。
【0014】
いくつかの実施形態において、自家生物発光シグナルは構成的であり、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する。いくつかの実施形態において、前述の核酸のそれぞれは、別個の構成的プロモータに連動する。他の実施形態では、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動し、さらに、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動する。第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータはそれぞれ、ニワトリベータアクチンプロモータを含み得る。
【0015】
実施形態において、自家生物発光シグナルは、分析物に応答して誘導的であり、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動し得る。分析物は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合して、それを活性化することが可能である任意の分析物であり得る。
【0016】
幹細胞は、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子をさらに含み得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、分析物の存在下で少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化し得る。
【0017】
実施形態において、自家生物発光シグナルは分析物に応答して抑制的であり、幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連動する少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを含み得る。幹細胞は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子を含み得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。分析物は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子に結合し得る任意の分析物であり得る。
【0018】
少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化することができる。しかしながら、分析物の存在下では、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントをもはや活性化しない。
【0019】
実施形態において、自家生物発光シグナルは組織特異的であり、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸の少なくとも１つは組織特異的プロモータに連動する。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、組織特異的プロモータに連動し得るものであり、その結果、組織特異的プロモータが活性化されている組織細胞のタイプに幹細胞が分化する場合にのみ、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢが発現される。ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、ニワトリベータアクチンプロモータといった第１の構成的プロモータに連動し得る。組織特異的自家生物発光シグナルを有する実施形態において、自家生物発光シグナルの放出は、組織特異的プロモータが発現される、すなわち自家生物発光シグナルが組織特異的であるタイプへの分化の開始と一致する。
【0020】
別の態様では、幹細胞由来自律的生物発光細胞が開示される。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、自律的に生物発光する幹細胞から分化した自律的生物発光真核細胞であり得る。自律的生物発光幹細胞は、本明細書に開示される自律的生物発光表現型を含む幹細胞の任意の実施形態を含み得る。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、幹細胞由来自律的生物発光細胞が由来する自律的生物発光表現型を含む幹細胞の任意の実施形態の特徴を継承し得る。
【0021】
幹細胞由来自律的生物発光細胞および自律的に発光する幹細胞は、アルデヒド基質等の外因性発光刺激因子の非存在下で、自家生物発光シグナルを発現し得る。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの発現を介して、自律型生物発光シグナルを放出する。
【0022】
別の態様では、自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示され、ここでは、幹細胞が構成的自家生物発光シグナルを放出する。本方法は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含む。１つまたは複数の核酸は、１つまたは複数の構成的プロモータに連動し得る。発現を促進するべく、１つまたは複数の核酸がリンカー領域によって連結され得る。
【0023】
例えば、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のそれぞれが、異なるベクター上に存在する（すなわち、合計６つのベクターに関してベクターごとに１つ）。前述の核酸のそれぞれは、構成的プロモータに連動し得る。そのような実施形態では、本方法は、幹細胞を６つのベクターでトランスフェクトすることを含み得る。
【0024】
他の実施形態では、ｌｕｘオペロンは２つのベクトルに分割される。そのような実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。第１のベクターは、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み得る。ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、内部リボソーム侵入部位またはウイルス２Ａペプチド等の少なくとも１つのリンカー領域によって連結され得る。ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動し得る。
【0025】
第２のベクターは、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み得る。ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数は、内部リボソーム侵入部位またはウイルス２Ａペプチド等の発現を促進するために、少なくとも１つのリンカー領域によって連結され得る。ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動し得る。
【0026】
本方法は、第１のベクターの量よりも１０倍から４０倍多い、または第１のベクターの量よりも２０から３０倍多い量の第２のベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。
【0027】
自律発光表現型を含む幹細胞を作製するためのキットが開示される。幹細胞は構成的自家生物発光シグナルを放出する。キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法において上記に開示された任意のベクターを含み、幹細胞は構成的自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意の個数の構成を含む任意個数（例えば、１、２、３、４、５、または６）のベクターを含み得る。例として、２つのベクターシステムは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含む第１のベクターと、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれを含む第２のベクターとを含み得る。
【0028】
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示され、幹細胞が分析物に曝されると、誘導性の自家生物発光シグナルを放出する。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含む。少なくとも１つの核酸のうちの１つまたは複数は、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。
【0029】
本方法は、幹細胞を任意の個数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの分析物に連動したｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞を少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントにトランスフェクトすることを含み得る。
【0030】
他の実施形態では、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクトルがあり得、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれる（すなわち、前述のそれぞれは一義のベクターから表現される）。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結され得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない核酸はどれでも、構成的プロモータに連結され得る。
【0031】
別の実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。第１のベクターは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得る。第１のベクターは、分析物応答性応答エレメントに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。実施形態のいずれかにおいて、発現を促進するために、核酸のうちの１つまたは複数がリンカー領域によって連結され得る。少なくとも１つのリンカー領域は、内部リボソーム侵入部位またはウイルス２Ａペプチドであり得る。
【0032】
実施形態のいずれにおいても、分析物は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化することができる。活性化された少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、それが連動する核酸の転写において調節（例えば、アップレギュレーション）を引き起こす。調節がアップレギュレーションである実施形態では、これは、自家生物発光シグナルを生成する対応するタンパク質の産生をもたらす。
【0033】
本方法は、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含むベクターで幹細胞を形質転換することをさらに含み得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、構成的プロモータに連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、分析物の存在下で少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化し得る。
【0034】
誘導性自家生物発光を有する幹細胞を作製するためのキットが開示される。キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法において上記に開示された任意のベクターを含み、幹細胞は誘導性の自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意個数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する。
【0035】
キットは、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含むベクターをさらに含み得る。分析物に曝されると、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。
【0036】
キットは、ある量の分析物を含み得る。分析物は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合して、それを活性化することが可能である任意の分析物であり得、そのことにより、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合させて、誘導性自家生物発光シグナルをもたらす。
【0037】
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示され、分析物への曝露によって抑制的自家生物発光シグナルを幹細胞が放出する。
【0038】
本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。活性化されると、分析物応答性応答エレメントは、それが連動する核酸の翻訳を開始する。発現を促進するために、１つまたは複数の核酸をリンカー領域によって連結され得る。少なくとも１つのリンカー領域は、内部リボソーム侵入部位またはウイルス２Ａペプチドであり得る。
【0039】
本方法は、幹細胞を任意個数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの分析物に連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞を少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントにトランスフェクトすることを含み得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクトルがあり得、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれる（すなわち、前述のそれぞれは一義のベクターから表現される）。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結され得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない核酸はどれでも、構成的プロモータに連結され得る。
【0041】
さらなる実施形態において、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。第１のベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連動する少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得る。例えば、そのような実施形態では、第１のベクターは、分析物応答性応答エレメントに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。
【0042】
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子を含むベクターで幹細胞を形質転換することを含み得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、構成的プロモータに連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化することができる。そのような実施形態では、幹細胞が分析物に曝されると、分析物は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子に結合する。結果として、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない。従って、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、それが連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始することができず、それにより、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸の少なくとも１つを発現しない。その結果、自家生物発光シグナルが抑制され得る。
【0043】
抑制的自家生物発光を有する幹細胞を作製するためのキットが開示される。キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法において上記に開示された任意のベクターを含み、幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意の数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する。
【0044】
別の態様において、組織特異的自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、核酸の少なくとも１つは、組織特異的プロモータに連動する。発現を促進するために、１つまたは複数の核酸は、少なくとも１つのリンカー領域によって、同じベクター上の他のどの核酸に連結され得る。少なくとも１つのリンカー領域は、例えば、内部リボソーム侵入部位またはウイルス２Ａペプチドであり得る。
【0045】
本方法は、幹細胞を任意個数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、組織特異的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。そのような実施形態において、単一のベクターでのトランスフェクション後、幹細胞が、組織特異的プロモータが活性であるタイプの組織細胞（例えば、心臓または神経）に分化するとき、幹細胞は、自家生物発光シグナルを生成し得る。
【0046】
さらなる実施形態において、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクトルがあり得、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれる（すなわち、前述のそれぞれは一義のベクターから表現される）。核酸の少なくとも１つは、組織特異的プロモータに連結され得る。組織特異的プロモータに連結されていない核酸はどれでも、構成的プロモータに連結され得る。
【0047】
さらに別の実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。第１のベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得る。
【0048】
いくつかの実施形態において、第１のベクターは、心筋細胞に特異的である、ＴＮＮＴ２プロモータ等の組織特異的プロモータに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。上記実施形態では、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは、幹細胞が心筋細胞に分化するときにのみ発現される。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。従って、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の連続的な発現がある。その結果として、ＴＮＮＴ２プロモータの場合、幹細胞が心筋細胞に分化すると、組織特異的自家生物発光シグナルが放出され、それがイメージングされることで幹細胞の心筋細胞への分化が生物的に示され得る。このプロセスを利用することで、他の細胞型および他の組織特異的プロモータにおける組織特異的分化を検出することができる。
【0049】
本方法は、第１のベクターの量よりも１０倍から４０倍多い量の第２のベクターで幹細胞を形質転換することを含み得る。好ましくは、本方法は、第１のベクターの量よりも２０倍から３０倍多い量の第２のベクターで幹細胞を形質転換することを含み得る。
【0050】
組織特異的自律発光表現型を含む幹細胞を作製するキットが開示される。抑制的自家生物発光を有する幹細胞を作製するキットが開示される。キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法において上記に開示された任意のベクターを含み，幹細胞は組織特異的自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意個数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。核酸の少なくとも１つは、少なくとも組織特異的プロモータに連動する。
【0051】
別の態様では、自律発光幹細胞から幹細胞に由来する自律発光細胞を作製する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示される自律発光幹細胞の任意の実施形態を作製することを含む。本方法は、自律発光幹細胞を幹細胞に由来する自律発光細胞に分化させることをさらに含む。幹細胞に由来する自律発光細胞は、任意の所望の機能的特殊化細胞であり得る。そのような実施形態において、幹細胞に由来する自律発光細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で、生物発光シグナルを放出する。
【0052】
幹細胞に由来する自律発光細胞は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢよりも高いレベルのｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し得る。幹細胞に由来する自律発光細胞は、ｌｕｘＡとｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも１０倍から４０倍高い範囲のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの組み合わせレベルを含み得る。好ましくは、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの範囲の組み合わせレベルは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも２０倍から３０倍大きい。
【0053】
別の態様では、自律的生物発光表現型を含む幹細胞を使用する方法、および幹細胞に由来する自律的発光細胞を使用する方法が開示される。本明細書に開示される方法は、非常にスケーラブルであり、従って、低スループットまたは高スループットのアプリケーションに対応する。さらに、本明細書に開示される方法は、リアルタイムでの幹細胞の代謝状態の直接的な証拠を提供する。さらにまた、開示された方法は、自律的生物発光表現型を含む幹細胞ならびに幹細胞由来自律的生物発光細胞の連続的かつ自動化された分析を可能にする。
【0054】
いくつかの態様において、構成的自家生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞を使用する方法が開示される。そのような方法のそれぞれについて、本方法は、構成的発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞を生成することを含み得る。少なくとも１つの幹細胞は、そのような幹細胞を生産するために、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞は、構成的にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し、その結果、少なくとも１つの幹細胞が構成的発光シグナルを自律的に放出する。
【0055】
少なくとも１つの幹細胞の集団の細胞集団サイズをリアルタイムモニタリングする方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを含む。本方法は、構成的発光シグナルの測定に基づいて細胞集団の大きさを評価することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞集団サイズを測定することを含む。測定は、任意数の時点で実施され得る。
【0056】
別の態様では、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法が提供される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを含む。本方法は、構成的発光シグナルの測定に基づいて、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を評価することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞生存率を測定することを含む。測定は、任意数の時点で実施され得る。
【0057】
別の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞における薬剤の効果（例えば、細胞毒性または治療的）を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させることを含む。薬剤は、少なくとも１つの幹細胞に対して細胞毒性および／または治療的効果を有し得る。
【0058】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞が薬剤に曝された後に少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することを含み得る。そのような実施形態において、本方法は、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少が、薬剤との接触から生じる少なくとも１つの細胞生存率の負の変化を示すことを決定することを含み得る。さらに、そのような実施形態では、本方法は、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定することを含み得る。本方法は、少なくとも１つの幹細胞が構成的発光シグナルの生成を停止したときに、少なくとも１つの幹細胞にとって薬剤が致命的であると決定することを含み得る。
【0059】
他の実施形態では、本方法は、上記対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、薬剤との接触から生じる少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示すことを決定することを含み得る。そのような実施形態において、本方法は、薬剤の効果が治療的であることを決定することを含み得る。
【0060】
本方法は、ある範囲の濃度の薬剤に少なくとも１つの幹細胞を供することを含み得る。本方法は、２つ以上の時点にわたる薬剤の効果を評価することを含み得る。本方法は、薬剤の効果を、例えばそれが安定するときを、決定することを含み得る。
【0061】
本方法は、創薬のための薬剤を評価することを含み得る。すなわち、細胞毒性および／または治療結果は、創薬で検討する複数の薬剤のランク付けと、生物への投与後のそれらの運命および効果の予測とに寄与し得る。
【0062】
別の態様では、少なくとも１つの幹細胞の薬剤フリーインビボイメージングの方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞構成的発光シグナルを生物に注入することを含む。本方法は、少なくとも１つの幹細胞の注入後、生体内の少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルをイメージングすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、測定された構成的発光シグナルに基づいてインビボで存在する少なくとも１つの幹細胞の総数を決定することをさらに含む。
【0063】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞が生物に注入された後、生物内の少なくとも１つの幹細胞の動きをトラッキングすることを含み得る。これは、自律発光シグナルの位置について生物をイメージングすることによって実行され得、それにより、注入部位に対する少なくとも１つの幹細胞の移動を決定する。あるいは、例えば、自律発光シグナルがインビボで深部組織から浸透するのに十分には強くない場合、生物を犠牲にして解剖することによって追跡することで、自律発光シグナルの位置をイメージングできるようにすることも可能である。
【0064】
他の態様では、分析物に曝されたときに誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を使用する方法もまた、本明細書に開示される。本方法は、自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生成することを含み、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。
【0065】
誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞における遺伝子発現のリアルタイムモニタリングのための方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させることを含む。分析物は、幹細胞に自家生物発光シグナルを放出または抑制するように誘導する任意の適切な分析物であり得る。本方法は、少なくとも１つの幹細胞が分析物と接触された（例えば、曝露された）後に、少なくとも１つの幹細胞から放出される自家生物発光シグナルを測定することを含む。本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される自家生物発光シグナルの測定を、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較することを含み得る。
【0066】
実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は誘導性自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示す。従って、そのような実施形態において、方法は、対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも測定された自家生物発光シグナルが強い場合に、分析物に応答して、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の活性化を決定することを含み得る。
【0067】
実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの減少は、分析物への曝露を示す。従って、そのような実施形態において、方法は、対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも測定された自家生物発光シグナルが弱い場合に、分析物に応答して、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の抑制を決定することを含み得る。
【0068】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞をある範囲の濃度の分析物に供することをさらに含む。
【0069】
本方法は、２つ以上の時点にわたる遺伝子発現に対する分析物の効果を評価することを含み得る。幹細胞は自律的に発光するので、分析物の影響を継続的に監視することができる。
【0070】
別の態様では、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞を使用して、試料中の分析物の存在を決定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を試料に接触させることを含む。本方法は、少なくとも１つの幹細胞と薬剤との接触の後に、少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルを測定することを含む。本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較すること含み得る。
【0071】
実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は誘導性自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの増加は、分析物との接触を示す。従って、そのような実施形態において、本方法は、測定された自家生物発光シグナルが対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも強い場合に、試料中の分析物の存在を決定することを含み得る。
【0072】
実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの減少は、分析物に曝すことの結果として示される。従って、そのような実施形態において、本方法は、対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも測定された自家生物発光シグナルが少ない場合に、試料中の分析物の存在を決定することを含み得る。
【0073】
別の態様において、組織特異的シグナルを含む少なくとも１つの幹細胞を用いるリアルタイム分化報告の方法が開示される。本方法は、組織特異的な自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を提供することを含む。少なくとも１つの幹細胞は、本明細書に開示される任意の実施形態を含み得るもので、自家生物発光シグナルは組織特異的である。
【0074】
本方法は、少なくとも１つの組織細胞から放出される生物発光シグナルを測定することを含む。本方法は、２つ以上の時点にわたって、上記少なくとも１つの組織細胞への上記少なくとも１つの幹細胞の上記分化をトラッキングすることを含み得る。生物発光シグナルの放出は、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化の開始を報告するを報告し得る。本方法は、生物発光シグナルの測定に基づいて、少なくとも１つの組織細胞の細胞集団サイズを評価することを含み得る。
【0075】
別の態様では、幹細胞由来自律的生物発光細胞を使用する方法が本明細書に開示される。上記方法のそれぞれは、構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を作製することを含む。少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、そのような細胞を作製するための本明細書に開示される方法のいずれかにもとづいて、作製され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、構成的にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し得、その結果、上記細胞は、構成的生物発光シグナルを自律的に放出する。
【0076】
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の集団の細胞集団サイズをリアルタイムモニタリングする方法が提供される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを含む。本方法は、構成的生物発光シグナルの測定にもとづいて細胞集団のサイズを評価することを含む。本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞集団サイズを測定することを含み得る。この測定は、任意数の時点で実施され得る。
【0077】
別の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法が提供される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを含む。本方法は、構成的発光シグナルの測定に基づいて、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率を評価することを含む。
【0078】
本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞生存率を測定することを含み得る。この測定は、任意の時点数で実施され得る。
【0079】
別の態様では、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を使用して薬剤の効果を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を薬剤と接触させることを含む。そのような実施形態においては、薬剤は、少なくとも１つの幹細胞に対して治療的および／または細胞毒性効果を有し得る。本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞を薬剤に曝した後に、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される構成的発光シグナルを測定することを、さらに含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出される構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することを含み得る。そのような実施形態では、方法は、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した上記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少が、薬剤との接触から生じる少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示すことを決定することを含み得るそのような実施形態では、本方法は、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定することを含み得る。本方法は上記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞が構成的発光シグナルの生成を停止したときに、上記少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞にとって薬剤が致命的であると決定することを含み得る。
【0081】
他の実施形態では、本方法は、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率の正の変化を示すことを決定することを、含み得る。そのような実施形態において、本方法は、薬剤の効果が治療的であることを決定することを含み得る。
【0082】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞をある範囲の濃度の薬剤に供することを含み得る。本方法は、２つ以上の時点にわたる薬剤の効果を評価することを含み得る。本方法は、創薬のための薬剤を評価することを含み得る。
【0083】
上記は、請求された主題のいくつかの態様の基本的な理解を提供するために、簡略化された要約を提示する。この要約は、広範な概要ではない。主要なエレメントまたは重要なエレメントを特定したり、クレームされた主題の範囲を描写したりすることを意図したものではない。その唯一の目的は、後で提示されるより詳細な説明の前置きとして、概念を簡略化された形式で提示することである。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図2A】図２Ａ～２Ｄは、ｌｕｘＡＢに対するｘＣＤＥＦのモル比を変化させると、テストした細胞タイプで自家生物発光出力が得られることを示す図である。図２Ａは、同量のｌｕｘＡＢと増加量のｌｕｘＣＤＥＦとを発現する同一の細胞と比較して、スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ｎｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびｎａｎｏｇ－ｚｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）を１：１のモル比で一時的に発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を示す図である。各ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢ比の上に示されるヒートマップ画像は、３つの複製物を表す。
【図2B】図２Ａ～２Ｄは、ｌｕｘＡＢに対するｘＣＤＥＦのモル比を変化させると、テストした細胞タイプで自家生物発光出力が得られることを示す図である。図２Ｂは、同量のｌｕｘＡＢと増加量のｌｕｘＣＤＥＦとを発現する同一の細胞と比較して、スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ｎｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびｎａｎｏｇ－ｚｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）を１：１のモル比で一時的に発現するヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＭＳＣ）を示す図である。各ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢ比の上に示されるヒートマップ画像は、３つの複製物を表す。
【図2C】図２Ａ～２Ｄは、ｌｕｘＡＢに対するｘＣＤＥＦのモル比を変化させると、テストした細胞タイプで自家生物発光出力が得られることを示す図である。図２Ｃは、同量のｌｕｘＡＢ（ルシフェラーゼ遺伝子）と増加量のｌｕｘＣＤＥＦ（ルシフェリン遺伝子）とを発現する同一の細胞と比較して、スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ｎｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびｎａｎｏｇ－ｚｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）を１：１のモル比で一時的に発現するＬＮ２２９細胞を示す図である。
【図2D】図２Ａ～２Ｄは、ｌｕｘＡＢに対するｘＣＤＥＦのモル比を変化させると、テストした細胞タイプで自家生物発光出力が得られることを示す図である。図２Ｄは、同量のｌｕｘＡＢ（ルシフェラーゼ遺伝子）を発現しているけれどもｌｕｘＣＤＥＦ（ルシフェリン遺伝子）の量が増加している同一の細胞と比較して、スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ｎｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびｎａｎｏｇ－ｚｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）を１：１のモル比で一時的に発現するＵ８７細胞を示す図である。
【図3】図３Ａ～３Ｃは、本開示の実施形態による、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において自家生物発光を生成するために使用されるｌｕｘオペロン構成の概略図である。図３Ａは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモータによって駆動され、トランスポゾン媒介ゲノム統合（ＴＥ）を促進するために配列ＬＥＮＳが隣接するウイルス２Ａセグメント化ポリシストロンルクスオペロンの概略図である。ｎａｎｏｇプロモータ（ｎａｎｏｇ）は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を駆動して、Ｇ４１８選択インテグレーションを提供する。図３Ｂおよび図３Ｃは、２つの別々のベクター間で分割されたポリシストロンルクスオペロンを示す。図３Ｂは、単一の２Ａエレメントによって分離され、かつニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモータに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢを含むベクターの概略図である。ベクターは、ｎａｎｏｇプロモータ駆動のネオマイシン耐性遺伝子を保持する。図３Ｃは、少なくとも１つの２Ａエレメントリンカー領域によって分離され、かつニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびｌｕｘＦを含むベクターの概略図である。このベクターは、ｎａｎｏｇプロモータ駆動ゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）を利用する。両方のベクターは、ゲノム統合のための隣接ＴＥをさらに含み得る。
【図4】図４は、ｑＰＣＲにより、培養時間を延長した後のｉＰＳＣ－ＡＢＧＤＥＦゲノムＤＮＡのルクスオペロン遺伝子比が確認されることを示す。スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ネオマイシン－ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびｎａｎｏｇ－ゼオシン－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）およびポリシストロンテトラサイクリン抑制性ルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ネオマイシン－ｉｅｉＯ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦおよびｎａｎｏｇ－ゼオシン－ＣＢＡ－ｆＴＡ）を有する継代１１（培養で約３か月）のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統由来のゲノムＤＮＡを、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＤのｑＰＣＲによって探索することで、遺伝子が約１：１以上の比率で発生したか否かを判断した。
【図5】図５Ａ～５Ｃは、本開示の一実施形態によれば、ｌｕｘオペロンを発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株が、多能性に関連するタンパク質マーカーを保持することを示す図である。図５Ａは、約３か月間培養された野生型ｉＰＳＣを固定し、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、およびＳｓｅａ－４について免疫組織化学的に標識したことを示す。１００ｘの赤色の円は、４００ｘで表示される領域を示す。図５Ｂは、スプリットルクスオペロン（ｐＮＡＮＯＧ－ネオマイシン－ｐＣＢＡ－ＬＵＸＡＢおよびｐＮＡＮＯＧ－ゼオシン－ｐＣＢＡ－ＬＵＸＣＤＥＦ）のｉＰＳＣ株へのトランスポゾンを介したゲノム統合、それに続くクローン作成および１１継代（約３か月）培養することで、野生型と同様の多能性のマーカーが発現することを示す。図５Ｃは、テトラサイクリンリプレッシブルラックスオペロン（ｐＮＡＮＯＧ－ネオマイシン－ｔｅｔＯ－ＬＵＸＣＤＡＢＥＦおよびｐＮＡＮＯＧ－ゼオシン－ＣＢＡ－ｔＴＡ）を含むｉＰＳＣ株でも多能性マーカーの発現が観察されたことを示す。
【図6】図６Ａ～６Ｂは、本開示の一実施形態によれば、培養期間が延長された後も、ｌｕｘオペロンを発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株が正常な核型を保持することを示す。図６Ａは、スプリットルクスオペロン（ｐＮＡＮＯＧ－ネオマイシン－ｐＣＢＡ－ＬＵＸＡＢおよびｐＮＡＮＯＧ－ゼオシン－ｐＣＢＡ－ＬＵＸＣＤＥＦ）のｉＰＳＣ株へのトランスポゾンを介したゲノム統合、それに続くクローン作成および１１継代（約３か月）培養することで、正常な４６、ＸＸ核型が保持されたことを示す。図６Ｂは、核型の安定性は、テトラサイクリン抑制性ルクスオペロン（ｐＮＡＮＯＧ－ネオマイシン－ｔｅｔＯ－ＬＵＸＣＤＡＢＥＦおよびｐＮＡＮＯＧ－ゼオシン－ＣＢＡ－ｔＴＡ）のゲノム統合を除いて、図６Ａのように処理されたｉＰＳＣ系統についても観察されたことを示す。
【図7】図７Ａ～７Ｂは、ＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ、ＭｅｐＧ２、およびＭＣＦ７細胞に、２Ａ結合細菌ルシフェラーゼ遺伝子を発現する単一のベクターまたは６つの細菌ルシフェラーゼ遺伝子の１つをそれぞれ発現する６つの個別のベクターをトランスフェクトしたことを示す。各細胞タイプからの光出力は、トランスフェクションの４８時間後に測定された。図７Ａは、単一ベクターアプローチから生成されたものと比較した、６ベクター発現アプローチから生成された自家生物発光の倍率変化が、すべての試験された細胞株についてプロットされている図である。図７Ｂは、各細胞株の倍率変化値が示されている図である。
【図8】図８は、（１）６つの２Ａ結合細菌ルシフェラーゼ遺伝子すべてを発現する単一のベクター、（２）１つ目がｌｕｘＡＢを発現し、２つ目がｌｕｘＣＤＥｆｒｐを発現する２つのベクター、（３）１つ目がｌｕｘＡＢを発現し、２つ目がｌｕｘＣＤＥを発現し、さらに３つ目がｆｒｐを表現する３つのベクター、または（４）それぞれが６つの細菌ルシフェラーゼ遺伝子の１つを発現する６つの個別のベクターのいずれかを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたことを示す。３７℃に保持された細胞でトランスフェクションの４８時間後に、光出力を測定した。
【図9】図９Ａ～９Ｃは、本開示の一実施形態によれば、統合されたＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ分割オペロンを発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から放出される構成的自家生物発光が、細胞個数およびＭＴＴアッセイと強く相関したことを示す図である。図９Ａは、ゲノムに統合されたＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦを含むｉＰＳＣを、示された細胞密度で播種し、播種の２４時間後にイメージングしたことを示す図である。画像は６つの複製の典型的な１つである。図９Ｂは、初期播種細胞密度（Ｒ２＝０．９３）に対してプロットされたバックグラウンドに対する放射自家生物発光の倍率変化を示す。図９Ｃは、バックグラウンド（Ｒ２＝０．９８）に対するＭＴＴ吸光度（５７０ｎｍ）の倍率変化に対してプロットされた、バックグラウンドに対する放射自家生物発光の倍率変化を示す。
【図10】図１０は、さまざまなドキソルビシン濃度でｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦラインを処理すると、細胞生存率に用量依存的な変化が生じたことを示す図である。細胞生存率の変化を示す自律発光シグナル出力を使用した生存率測定は、ＭＴＴ吸光度（５７０ｎｍ）の変化を使用した同じ測定と強く相関した（Ｒ２＝０．９９）。
【図11】図１１は、本開示の一実施形態によれば、ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢのゲノム統合により、細胞数と強く相関する自律発光を発現する安定な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）クローン系統が生成されたことを示す。
【図12】図１２Ａ～１２Ｂは、自家生物発光ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＭＳＣ）のインビボイメージングを示す。図１２Ａは、ゲノムに統合されたＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦスプリットオペロンを含むｈＡＤＭＳＣの数を増やして、ＦＶＢ近交系マウスの赤色の円で示された位置（部位に注入された細胞個数は赤い円の下に示される）に腹腔内注射し、１０分後にイメージングしたことを示す。図１２Ｂは、得られた平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の変化倍率を、注入された総細胞数に対してプロットした図である。ｈＡＤＭＳＣから放出される平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）は、注入された細胞個数と強く相関した（Ｒ２＝０．９９）。
【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、本開示の一実施形態にもとづいて、尾静脈注射後の自家生物発光ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＭＳＣ）を肺までトラッキングすることを示す。図１３Ａは、ゲノムに統合されたＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦスプリットオペロンを備えた２００万個のｈＡＤＭＳＣを、ＦＶＢ近交系マウスの尾静脈に注射し、注射の１時間後にイメージングしたことを示す。図１３Ｂは、犠牲および解剖の後に自家生物発光が肺内で観察できることを示す。図１３Ｃは、図１３Ｃは、図１の解剖されたＦＶＢ近交系マウスを示す画像である。
【図14】図１４は、本開示の実施形態にもとづく、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における誘導性または抑制性の自家生物発光の生成に使用されるｌｕｘオペロン構成の概略図である。ウイルスの２Ａセグメント化されたポリシストロンｌｕｘオペロンは、修飾されたテトラサイクリン応答エレメント（ＴＥＴ°）によって駆動され、かつ配列エレメントが隣接することで、トランスポゾンを介したゲノム統合（ＴＥ）を促進する。ｎａｎｏｇプロモータ（ｎａｎｏｇ）は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を駆動して、Ｇ４１８選択インテグレーションを提供する。トランス活性化因子（ｔＴＡ）または逆トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）は、ニワトリのベータアクチンプロモータ（ＣＢＡ）によって駆動される。ＣＢＡ駆動型トランス活性化因子（ｔＴＡ）は、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下でオフになる構成的ｌｕｘ発現をもたらす。対照的に、ＣＢＡ駆動逆トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）は、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で、ｌｕｘを発現する。
【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、ｌｕｘオペロンが遺伝子発現のレポーターとして機能することを示す。図１５Ａは、１テトラサイクリン応答性プロモータ（ｔｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦ）および個別に統合されたニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）駆動逆トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）の制御下で、ゲノムに統合されたポリシストロンｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣＤＡＢＥＦ）を有するＦｌｕｍａｎ人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が４時間および２４時間にわたって、増量のドキシサイクリンに曝されることを示す図である。自家生物発光測定は、増加する量のドキシサイクリンへの曝露に応答した自家生物発光出力の増加を、概して示す。図１５Ｂは、統合され、ＣＢＡ駆動型トランス活性化因子（ｔＴＡ）を発現するｉＰＳＣｔｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦ系統からの自家生物発光測定は、＜０．１ｐｇ／ｍＬドキシサイクリンと比較して、＞０．１ｐｇ／ｍＬドキシサイクリンの曝露に応答した自家生物発光出力の減少が示されることを示す。
【図16】図１６は、テトラサイクリン応答性プロモータ（ｔｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦ）および個別に統合されたＣＢＡ駆動型トランスアクチベーター（ｔＴＡ）の制御下で、ゲノムに統合されたポリシストロンｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣＤＡＢＥＦ）を持つヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を心筋細胞（ＣＭ）に分化させたことを示す。約１．５週間成熟させた後、ＣＭをドキソルビシンに曝した。イメージングの前に１８時間、指定された濃度範囲のドキソルビシンにＣＭを曝した。推定ＥＣ５０は０．４１～０．７４ｕＭである。
【図17】図１７は、本開示の一実施形態にもとづく、組織特異的自家生物発光を発現するｉＰＳＣ由来心筋細胞を示す。野生型ｉＰＳＣおよびｉＰＳＣ由来心筋細胞に、ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢ（構成的）またはＴＮＮＴ２－／ｕｘＡＳ（心臓特異的）のいずれかを２０：１で一過性にトランスフェクトし、２４時間後に自家生物発光出力を測定した。自家生物発光は、野生型ｉＰＳＣと、ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥｆｒｐおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢ（構成的）を共発現するｉＰＳＣ由来心筋細胞との両方で、観察された。さらに、一過性にトランスフェクトされた野生型ｉＰＳＣ由来心筋細胞において心臓特異的ＴＮＮＴ２－／ｕｘＡＳをＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥｆｒｐと共発現させた場合、自家生物発光発現が観察された。ただし、ｉＰＳ細胞にトランスフェクトした場合、そのような自家生物発光の発現は観察されなかった。
【図18】図１８は、脂肪組織特異的ヒトＡＰ２プロモータの制御下にあるｌｕｘＣＤＡＢＥＦオペロンを有するヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、分化前および脂肪細胞（脂肪生成）、軟骨細胞（軟骨形成）、または骨細胞（骨形成）への分化後のバックグラウンド光検出（Ｓ／Ｂ）と比較した自家生物発光生成についてアッセイした。組織特異的プロモータは、脂肪組織タイプへの分化時にのみ、外部刺激なしで自家生物発光の生成を開始した。非標的系統への分化後、有意な自家生物発光シグナルは検出されず、このことは分化報告が非常に特異的であることを示唆した。
【図19】図１９Ａ～１９Ｃは、本開示の一実施形態にもとづいて、ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦオペロンを有するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が心筋細胞に分化したときに自家生物発光表現型を維持することを示す。図１９Ａでは、代表的な画像が、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｘＣＤＥＦがゲノムに統合されたｉＰＳ細胞からの自家生物発光シグナル（左）と、同じく自己生体発光シグナルを示す親ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦライン（右）から分化した心筋細胞（ＣＭ）（右）とを示す。図１９Ｂは、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦおよびＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞系統のプレート細胞あたりの正規化された平均自家生物発光輝度を示す。図１９Ｃは、自家生物発光ＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統を、さまざまなドキソルビシン（ｕＭ）濃度で処理し、２４時間の処理後に自家生物発光出力を測定したことを示す図である。
【図20】図２０Ａ～２０Ｃは、自家生物発光心筋細胞が３０時間にわたって継続的なドキソルビシン毒性モニタリングを可能にしたことを示す。図２０Ａは、ＣＢＡ－ｌｕｘＡＢおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦスプリットオペロンを発現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の心筋細胞から放出される自家生物発光を、３０時間にわたって１０分間隔で測定したことを示す。処置なしで５時間モニタリングした後、心臓毒性物質ドキソルビシン（ｕＭ）の用量を増やして追加し（白い矢印）、モニタリングを継続した。データは、少なくとも３回の繰り返しの平均値を表す。図２０Ｂは、図２０Ａに示される時系列にわたる２．５時間間隔での自家生物発光シグナルの代表的なヒートマップを示す。図２０Ｃは、実験の時間経過にわたって計算され、時間に対してプロットされたＩＣ５０値を示す。
【発明を実施するための形態】
【0085】
ここで、本開示の実施形態を詳細に参照する。本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬等は、当業者によって変更され得るものであることから、本発明を限定するものではないと理解される。本明細書で使用される用語は、特定の例示的な実施形態を説明する目的でのみ使用され、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。図面に示されている特徴は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、本開示の範囲から逸脱することなく、一実施形態の特徴は、当業者が認識するように、たとえ本明細書中に明示的に記載されていない場合であっても、他の実施形態とともに使用され得ることに留意されたい。例えば、一実施形態の一部として図示または説明された特徴は、別の実施形態と併用されて、さらなる実施形態をもたらすことができる。本開示の実施形態を不必要に曖昧にしないために、周知の構成エレメントおよび処理技術の説明は省略され得る。
【0086】
従って、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内に入るような修正および変形も含むことが意図される。本開示の他の目的、特徴、および態様は、以下の詳細な説明に開示されている、またはそれから自明である。本開示は例示的な実施形態の説明にすぎず、本開示のより広い態様を限定することを意図するものではないことは、当業者によって理解されるべきである。
【0087】
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本開示の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本明細書中で明示的にそのように定義される場合を除いて、明細書の文脈での意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想的または過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。周知の機能または構造については簡潔または明確にする詳細な説明がなされない場合もある。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本開示の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本明細書中で明示的にそのように定義される場合を除いて、明細書の文脈での意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想的または過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。周知の機能または構造については簡潔または明確にする詳細な説明がなされない場合もある。
【0088】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数形の言及も含まれることに留意されたい。従って、例えば、「細胞」への言及は、当業者に知られている１つまたは複数の細胞およびその同等物への言及である。
【0089】
「生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）」および「発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）」という用語および類似の句は、交換使用され得る。さらに、「自家生物発光（自家生物発光）」、「自律的生物発光（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）」、および「自律的発光（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）」という用語、ならびに同様の句は、交換使用され得る。細胞は、例えばルシフェラーゼ（ｌｕｘ）カセットの発現を通じて、発光シグナルの生成に必要なすべての基質を自己合成する場合、自家生物発光性（ａｕｔｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）であるか、または自家生物発光（ａｕｔｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を有する。つまり、発光シグナル（生物発光シグナルとも呼ばれる）を生成する機序は、自律的かつリアルタイムで動作し、生物発光シグナル出力に連動する細胞および分子機序を示す。自家生物発光を有する細胞および細胞を作製および使用する方法は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第７，３００，７９２号に記載される。
【0090】
「コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、クローン化された遺伝子内のコドン（宿主細胞翻訳システムによって一般的に使用されないコドン）が、合成されたタンパク質のアミノ酸を変更せずに、突然変異誘発または他の適切な手段によって宿主生物の好ましいコドンに変更される戦略を包含する。
【0091】
「コードする（「ｅｎｃｏｄｅｓ」および「ｅｎｃｏｄｉｎｇ」）」という用語は、定義されたヌクレオチド配列（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列、およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有し、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡといった、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列に固有な特性のことをいう。従って従って、遺伝子によって生成されたｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系でタンパク質を生成する場合、その遺伝子がタンパク質をコードする。
【0092】
「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、核酸のタンパク質への翻訳のことをいう。タンパク質は、発現されて細胞内に留まる、細胞表面膜の成分になる、または細胞外マトリックスもしくは培地に分泌され得る。
【0093】
「ｌｕｘカセット（ｌｕｘ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語は、５つの遺伝子、すなわちｌｕｘＣ遺伝子、ｌｕｘＤ遺伝子、ｌｕｘＡ遺伝子、ｌｕｘＢ遺伝子、およびｌｕｘＥ遺伝子を含む細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子カセットのことをいう。これらの５つの遺伝子は、相乗的に相互作用して、補助基質を追加せずに生物発光の光を生成するタンパク質産物をコードする。さらに、フラビンレダクターゼとして機能する追加の遺伝子であり、内因性フラビンモノヌクレオチドを前述の生物発光反応に必要なＦＭＮＨ２共基質に循環させるのを助けるフラビンレダクターゼ遺伝子（「ｆｒｐ」または「Ｆ」と呼ばれる）が存在する。これらの遺伝子は、省略表記で呼ばれることもある。例えば、ｌｕｘカセットの５つの遺伝子すべてを称する場合、省略表記をｌｕｘＣＤＡＢＥとすることが可能である。上記遺伝子のサブセットのみのことに言及する場合、省略表記は、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｘＣＤＥ、または他の任意の組み合わせであってもよい。フラビンレダクターゼ遺伝子のことを言及する場合にも省略表記を用いても構わない。例えば、ｌｕｘカセットでフラビンレダクターゼ遺伝子を参照する場合、省略表記はｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐまたはｌｕｘＣＤＡＢＥＦのいずれかであり得る。ｌｕｘＣ遺伝子、ｌｕｘＤ遺伝子、ｌｕｘＡ遺伝子、ｌｕｘＢ遺伝子、ｌｕｘＥ遺伝子、およびｆｒｐはそれぞれ、別表１に記載されるように、野生型配列、コドン最適化配列、ならびにそれらの変異、誘導、および修飾を有し得る。特に明記しない限り、ｌｕｘＣ遺伝子、ｌｕｘＤ遺伝子、ｌｕｘＡ遺伝子、ｌｕｘＢ遺伝子、ｌｕｘＥ遺伝子、およびｆｒｐへの言及は、野生型配列およびコドン最適化配列（例えば、別表１に提供される野生型およびコドン最適化配列を包含する）、ならびにそれらの変異、誘導、および修飾を包含する。
【0094】
本明細書で一般的に使用されるように、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）」とは、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーのことをいう。核酸という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含み、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。核酸を、鎖状、環状、またはより高次のトポロジー（例えば、スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡ）とすることができる。ＤＮＡは、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、および人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらのグループの派生物の形をとり得る。ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、（干渉）二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、リボザイム、キメラ配列、またはこれらのグループの誘導体の形をとり得る。核酸を、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖（ｄｓＤＮＡ）、三本鎖（ｔｓＤＮＡ）、または四本鎖（ｑｓＤＮＡ）のＤＮＡとすることができる。ＲＮＡを、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とすることができる。核酸という用語は、一本鎖分子だけでなく、二本鎖または三本鎖核酸を包含する。
【0095】
核酸という用語はまた、その化学修飾、例えばメチル化および／またはキャッピングによるものを、包含する。核酸修飾として、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、および機能性を個々の核酸塩基または核酸全に取り込む化学基の追加を挙げることができる。そのような修飾には、塩基修飾、骨格修飾、異常な塩基対の組み合わせ等が含まれてもよい。
【0096】
核酸は、固相媒介化学合成等の完全な化学合成プロセスから、核酸を生成する任意の種からの単離等による生物学的供給源から、またはＤＮＡ複製、ＰＣＲ増幅、逆転写等の分子生物学ツールによる核酸の操作を伴うプロセスから、またはこれらのプロセスの組み合わせから、得ることができる。
【0097】
本明細書で使用される場合、「連動する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という表現および類似の句は、核酸に関して使用される場合、互いに機能的関係に置かれた核酸配列の連動のことをいう。例えば、プロモータがコード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード配列は、プロモータに連動する（またはその制御下にある）と見なすことができる。この機能的関係が維持されている限り、プロモータとコード領域との間に介在配列が存在してもよい。
【0098】
「プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、適切な転写に必要であるＲＮＡポリメラーゼおよび他の因子による認識を提供することによって、目的のヌクレオチド配列の発現を指示および／または制御する、通常は目的のヌクレオチド配列の上流（５プライム）のヌクレオチド配列のことをいう。本明細書で使用される場合、「プロモータ」という用語には、ＴＡＴＡボックスと転写開始の部位を特定するのに役立つ他の配列とから構成される短いＤＮＡ配列であるプロモータ（ただしこれに限定されない）が含まれ、調整または応答エレメントが発現の制御のために追加される。「プロモータ」という用語はまた、プロモータに加えて、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができる調節または応答エレメントを含むヌクレオチド配列のことをいう。このタイプのプロモータ配列は、近位およびより遠位の上流エレメントから成り、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと呼ばれる。「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」という用語は、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの生来のエレメント、またはプロモータのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得るＤＮＡ配列のことをいう。エンハンサーは、両方の方向（通常または反転）で動作することができ、プロモータの上流または下流に移動した場合でも機能することができる。エンハンサーと他の上流プロモータエレメントとの両方が、それらの効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。
【0099】
プロモータは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または自然界に見られる異なるプロモータに由来する異なるエレメントから構成されるか、または合成ＤＮＡセグメントからさえも構成されることができる。プロモータはまた、生理学的または発達的条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むことができる。本開示に従って使用される特定のプロモータには、例えば、これらに限定されないが、ニワトリベータアクチン（「ＣＢＡ」）プロモータ、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）プロモータ、および神経特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）プロモータが含まれる。
【0100】
「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）」プロモータは、ほとんどの環境条件下および発生または細胞分化の状態の下で、継続的に発現を駆動する。構成的プロモータは、プロモータが連動する核酸の継続的な転写を可能にする任意の適切なプロモータであり得る。構成的プロモータは、細胞型特異的プロモータまたは細胞型とは無関係に発現されるプロモータを含み得る。例えば、構成的プロモータには、ＣＢＡプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＥＦ－１ａプロモータ、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【0101】
あるいは、プロモータを、「誘導性」プロモータ（例えば、化学的または物理的に調節されたプロモータ）とすることができる。化学的に調節されるプロモータは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモータは、例えば、温度や光等の環境要因によって調節され得る。
【0102】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、長さまたは翻訳後修飾、例えば、グリコシル化またはリン酸化に関係なく、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【0103】
本明細書で使用される場合、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、活発に分裂および循環する成熟し、分化し、かつ機能的である細胞の系統に対して適切な刺激を与えることによって発現する比較的未分化の細胞のことをいう。幹細胞は、任意のタイプの幹細胞、例えば、成体幹細胞（例えば、組織特異的幹細胞）、胚性（または多能性）幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。「幹細胞」という用語には、任意の子孫も含まれる。複製中に突然変異が起こる可能性があるため、すべての子孫が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。
【0104】
本明細書で使用される場合、「選択可能なマーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）」という表現は、細胞内に存在する場合、選択可能なマーカー形質を発現しない他の細胞からのそれらの細胞の選択または分離を可能にする属性または表現型をもたらすマーカーのことをいう。選択可能なマーカーとしてさまざまな遺伝子が使用され、例えば、薬剤耐性または栄養要求性レスキューをコードする遺伝子が広く知られている。例えば、カナマイシン（ネオマイシン）耐性は、細菌のカナマイシン耐性をコードする遺伝子（例えば、酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）を保有するプラスミドを取り込んだ細菌を選択するための形質として使用され得る。トランスフェクトされていない細胞は、培養物をネオマイシンまたは同様の抗生物質で処理すると、最終的には死滅する。
【0105】
ベクター等の外来核酸が導入された細胞、組織、または生物は、「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」、または「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」と見なされる。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物（例えば、幹細胞）はまた、細胞または生物の子孫を含む。例えば、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、またはｌｕｘＥのトランスジェニック幹細胞は、それぞれｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、またはｌｕｘＥ核酸が導入された幹細胞である。
【0106】
さらに、本明細書で使用される場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）」、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）」等の用語は、ベクターまたは他の核酸を標的細胞に挿入する方法を定義するために広く使用される。これは、例えば、ベクターを標的細胞にトランスフェクトすることによって達成することができる。トランスフェクション法は日常的に行われるものであり、多くのトランスフェクション法が本発明で使用される。これらにはリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、脂質ベースの方法、カチオン性ポリマートランスフェクション、直接核酸注入、微粒子銃粒子注入、および遺伝子操作されたウイルスキャリアとソノポレーションを使用したウイルス形質導入（例えば、操作された単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルスを使用した形質導入と呼ばれる）が含まれる。これらの方法のいずれも、本開示で使用される。
【0107】
トランスフェクションは、安定したトランスフェクションと一過性のトランスフェクションとの２つのカテゴリーに分けられる。安定したトランスフェクションは、ベクターが細胞内へのベクターの恒久的導入をもたらすものであり、抗生物質耐性等の選択可能なマーカーを使用して達成され得る。一過性のトランスフェクションにより、ベクターが一時的に細胞に導入される。あるいは、ベクターがウイルスベクターである場合、それを宿主細胞にトランスフェクトしてウイルスを産生し、ウイルスを採取して、ベクターを標的細胞に形質導入するために使用することができる。トランスフェクションおよび形質導入プロトコルは当技術分野で既知である。
【0108】
本明細書で使用される場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、増殖することができるとともに核酸セグメントを生物に移すために使用され得る任意の組換えポリヌクレオチド分子について、使用される。ベクターは、概して、ベクターの増殖および操作を媒介する部分（例えば、１つまたは複数の複製起点、薬物または抗生物質耐性を付与する遺伝子、複数のクローニング部位、クローニングされた遺伝子の発現を可能にする連動するプロモータ／エンハンサーエレメント等）を含む。ベクターは、細胞に選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性を与えることができるマーカー遺伝子を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、送達された後は発現されているかどうかを判断するために使用される。適切な選択可能なマーカーの例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、およびピューロマイシンが含まれるが、これらに限定されない。そのような選択可能なマーカーが幹細胞に成功裏に移されると、形質転換された幹細胞は、選択圧下に置かれるならば生き残ることができる。
【0109】
ベクターは、該ベクターのタイプまたは用途のタイプに応じて、線状分子または環状の形態であり得る。一部の環状核酸ベクターは、細胞内への送達に先だって意図的に線形化され得る。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ファージ、または二本鎖または一本鎖の線状または環状の二本鎖ベクターを含み、自己伝達性または可動性である場合とそうでない場合があり、細胞ゲノムに組み込まれるか、または染色体外に存在することによって、真核生物の宿主細胞を形質転換し得るもの（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）と定義される。ベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。別のタイプのベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれるものである。ベクターは、該ベクターが連結されている核酸を自律的複製および／または発現させることができるものであってもよい。そのようなベクターを入手して使用するためのプロトコルは、当業者に公知である。
【0110】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのベクター」という用語は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれの態様に対応する１つまたは複数のベクター（例えば、前述の遺伝子のそれぞれが異なるベクターから発現される６つのベクター）あるいはｌｕｘカセットの態様に対応する１つまたは複数のベクター（例えば、５つのベクター）を含み得る。任意の特定のベクターは、他の任意の核酸に加えて、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのうちの１つまたは複数の核酸を含み得る。ベクターには、１つまたは複数のｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの核酸以外の核酸が含まれなくてもよい。
【0111】
本発明の開示された実施形態の任意の所与のエレメントは、単一の構造、単一のステップ、単一の物等で具体化され得ることが理解されるべきである。同様に、開示された実施形態の所与のエレメントは、複数の構造、ステップ、物質等で具体化され得る。
【0112】
ＩＩ．自家生物発光表現型を含む幹細胞
例えば、幹細胞の生存能力、遊走、および運命を検査するための現在の限定された技術によって課せられる制限を横断する手段は、生物発光レポーター遺伝子を幹細胞に実装して、生物発光幹細胞の非侵襲的光学イメージングを可能にすることである。ただし、ほとんどの生物発光レポーターシステムでは、ホタル、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ等の光生成を活性化するための基質を投与する必要がある。結果として、これらのシステムは、基質の品質、取り込み速度、または曝露時間の変動により、データ取得の可能性が大幅に制限される。さらに、そのようなシステムのインビボ分析において、活性化基質の必要な注射は、動物保護に悪影響を及ぼし、それは、不可能ではないにしても潜在的な治療法の探索を困難にする。
例えば、幹細胞の生存能力、遊走、および運命を検査するための現在の限定された技術によって課せられる制限を横断する手段は、生物発光レポーター遺伝子を幹細胞に実装して、生物発光幹細胞の非侵襲的光学イメージングを可能にすることである。ただし、ほとんどの生物発光レポーターシステムでは、ホタル、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ等の光生成を活性化するための基質を投与する必要がある。結果として、これらのシステムは、基質の品質、取り込み速度、または曝露時間の変動により、データ取得の可能性が大幅に制限される。さらに、そのようなシステムのインビボ分析において、活性化基質の必要な注射は、動物保護に悪影響を及ぼし、それは、不可能ではないにしても潜在的な治療法の探索を困難にする。
【0113】
従って、自律的生物発光表現型とも呼ばれる自家生物発光表現型を含む幹細胞を開示する。自家生物発光表現型は、外因性発光刺激因子の非存在下で、自家生物発光シグナルとも呼ばれる生物発光シグナルを放出することを含み、すなわち、このシグナルが「自律的に（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ）」生成される。外因性発光刺激因子は、蛍光刺激シグナルであってもよい。外因性発光刺激因子は、化学的発光活性剤であってもよい。いくつかの実施形態において、化学発光因子は、ルシフェリンまたはルシフェリン類似体を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、化学物質は、少なくとも、アルデヒド官能基を含み得る。他の実施形態では、化学発光因子は、例えば、Ｄ－ルシフェリン（２－（４－ヒドロキシベンゾチアゾール－２－イル）－２－チアゾリン酸）、３－ヒドロキシ－ヒスピジン、セレンテラジン、または任意の他のルシフェリン基質を含み得る。
【0114】
幹細胞は、任意のタイプの幹細胞、例えば、成体幹細胞（例えば、組織特異的幹細胞）、胚性（または多能性）幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。
【0115】
幹細胞は、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）カセットシステム、すなわち、ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子カセットを含み得る。バクテリアルシフェラーゼ（ｌｕｘ）カセットシステムは、外因性インベスティゲータ相互作用（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）なしに、そのルシフェラーゼと関連するルシフェリン生成タンパク質生成物の両方を自律的に生成することができる。幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼタンパク質を含み得る。さらに、これらのタンパク質の変異型またはこれらのタンパク質の変異型が使用され得る。変異体の例として、限定されるものではないが、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれのフラグメント、類似体、誘導体、および相同体が挙げられる。ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの組換え型も使用され得る。
【0116】
幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、任意の生物または株に由来し得る。例えば、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥは、Ｐ．ルミネセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、ビブリオ・ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ）、クセノラブズス・ルミネスケンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、フォトバクテリウム・レイオグナチ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）、および／またはシューワネラ・ハネダイ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｎｅｄａｉ）に由来し得る。さらに、フラビンレダクターゼは、例えば、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、および／またはヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ）に由来し得る。核酸のいずれも、ＲＮＡの形態、またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。核酸のいずれも、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、および／またはフラビンレダクターゼの変異型および／または変異体をコードし得る。例として、本明細書の核酸は、天然のｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、および／またはフラビンレダクターゼとは１つまたは複数の塩基が異なるヌクレオチド配列を含み得る。そのような実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、天然のｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、および／またはフラビンレダクターゼと比較して、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の欠失、付加、または置換を含み得る。
【0117】
ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、染色体に組み込まれた核酸であってもよい。染色体組込は、遺伝子発現の長期的な安定性をもたらす可能性がある。ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸を幹細胞染色体に組み込むために、いくつかの方法を採用することが可能である。ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を、任意の個数の発現ベクター（例えば、１、２、３、４、５、または６つのベクター）から発現させることが可能である。例えば、前述のそれぞれは、別個の発現ベクター上で発現され得るか、またはいくつかの核酸は、単一の発現ベクター上で提供され得る。核酸を幹細胞に挿入する方法は、当技術分野で公知である。
【0118】
例として、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含む幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを介して生物発光シグナルを自律的に生成する。内因性ミリスチン酸、内因性フラビンモノヌクレオチド、および分子状酸素と相乗的に作用して、生物発光シグナルを生成する（図１）。具体的には、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢはヘテロ二量体ルシフェラーゼを形成するけれども、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥはそれぞれ、細胞内化合物の変換を通じてアルデヒド基質を再生する脂肪酸レダクターゼ複合体を形成するレダクターゼ、トランスフェラーゼ、およびシンターゼである。フラビンレダクターゼは、必要なＦＭＮｈｈ共基質に内因性フラビンモノヌクレオチドを循環させるのに役立つ。これらの成分は、分子状酸素とともに、約４９０ｎｍで生物発光シグナルを生成するために必要なすべての生成物を酵素に供給する。ルシフェラーゼ酵素は、ＦＭＮＨ２および酸素の存在下で、アルデヒド基質の酸化を触媒し、それによって副産物として約４９０ｎｍのピーク波長の光を生成する。全体的な反応を次のようにまとめることができる。すなわち、ＦＭＮＨ２＋ＲＣＨＯ＋Ｏ２→ＦＭＮ＋Ｈ２Ｏ＋ＲＣＯＯＨ＋ｈｖ４９０ｎｍである。
【0119】
酸素およびＦＭＮＨ２は細胞内で天然に存在し、さらにｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥから生じる脂肪酸レダクターゼ複合体は、アルデヒド基質のインビボ生成をもたらす。従って、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの共発現により、幹細胞は完全に自律的な方法で（すなわち、外因性試薬を添加せずに）生物発光シグナルを生成することができる。結果として、いくつかの実施形態において、自律生物発光表現型を含む幹細胞は、４９０ｎｍのピーク波長で生物発光シグナルを放出する。
【0120】
さらに、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、および／またはフラビンレダクターゼの存在量が増加することは、生物発光産生にとって有益であろう。従って、いくつかの実施形態において、１つまたは複数の核酸は、幹細胞での発現のためにコドンが最適化され得る。例えば、１つまたは複数の核酸は、該１つまたは複数の核酸から合成されたタンパク質のアミノ酸を変更することなく、突然変異誘発によって幹細胞の好ましいコドンに変更され得る。そのようなコドン最適化は、それが、より多くのコドン最適化核酸の１つによってコードされるｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、および／またはフラビンレダクターゼの量の増加をもたらす可能性があるという点で有利である。
【0121】
さらに、いくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする１つまたは複数の核酸は、転写を促進および／または促進するために１つまたは複数の調節エレメントに連動する。連動する核酸配列は、隣接することができ、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を結合するために、リーディングフレーム内にある。連動する核酸配列はまた、非隣接的であり得る。調節エレメントの例には、プロモータ、エンハンサー、開始部位、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）テール、応答エレメント、および終結シグナルが含まれる。
【0122】
本明細書に開示されるすべての実施形態において、１つまたは複数のｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、少なくとも１つのリンカー領域に連動し得る。少なくとも１つのリンカー領域の存在は、それが連動する少なくとも１つの核酸の発現を促進し得るという点で有利である。具体的には、少なくとも１つのリンカー領域は、複数のタンパク質が単一の転写物から翻訳されることを可能にし得るもので、このことが機能性を増加させると考えられる。少なくとも１つのリンカー領域は、偽ポリシストロン発現のために個々の遺伝子が一緒に連結し得る。
【0123】
少なくとも１つのリンカー領域は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含み得る。ＩＲＥＳエレメントは、リボソームがＡＵＧ開始コドンに直接結合できるという点で有利である。さらに、ＩＲＥＳは翻訳の内部開始をもたらす可能性があり、その結果、モノシストロン性ｍＲＮＡは本質的にマルチシストロン性になり得る。従って、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントをｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸に作動可能に結合させると、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのポリシストロン合成が促進され得る。
【0124】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリンカー領域は、ウイルス２Ａペプチドを含む。適切なウイルス２Ａペプチドの例として、ＴＳＡ（Ｓｅｑ．ＧｌｕＧｌｙＡｒｇＧｌｙＳｅｒＬｅｕＬｅｕＴｈｒＣｙｓＧｌｙＡｓｐＶａｌＧｌｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＧｌｙＰｒｏ）、Ｐ２Ａ（ＡｌａＴｈｒＡｓｎＰｈｅＳｅｒＬｅｕＬｅｕＬｙｓＧｌｎＡｌａＧｌｙＡｓｐＶａｌＧｌｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＧｌｙＰｒｏ）、Ｅ２Ａ（ＧｌｎＣｙｓＴｈｒＡｓｎＴｙｒＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＡｓｐＶａｌＧｌｕＳｅｒＡｓｎＰｒｏＧｌｙＰｒｏ）、および／またはＦ２Ａ（ＶａｌＬｙｓＧＩｎＴｈｒＬｅｕＡｓｎＰｈｅＡｓｐＬｅｕＬｅｕＬｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＡｓｐＶａｌＧｌｕＳｅｒＡｓｎＰｒｏＧｌｙＰｒｏ）が挙げられる。必要に応じて、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ配列がウイルス２ＡペプチドのＮ末端に付加されてもよい。ＩＲＥＳエレメントと同様に、ウイルス２Ａペプチドにより、単一の転写産物から複数のタンパク質を翻訳することが可能である。しかし、ＩＲＥＳエレメントと比較して、ウイルス２Ａペプチドにより転写効率が向上し得る。このことは、ウイルスの２Ａペプチドが、ヒト化ポリシストロン発現に対してより適した作用機序を使用しているためであると考えられている。具体的には、２Ａペプチド配列によってリボソームの出口トンネルに与えられた立体障害によって、２Ａペプチド配列のＣ末端での最後のペプチド結合がスキップされる。ただし、リボソームは翻訳を継続できるため、二次の独立したタンパク質産物が生成される。さらに、ウイルスの２Ａペプチドは二次構造の形成に依存しないため、ＩＲＥＳエレメントよりも短くなる。その結果、ウイルスの２Ａペプチドは、転写および翻訳効率の低下に悩まされる可能性が低くなる。
【0125】
上記の実施形態のいずれかにおいて、幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み、幹細胞によって放出される自家生物発光シグナルは、以下でさらに開示されるように、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的のいずれかであってもよい。
【0126】
１．構成的自家生物発光シグナル
実施形態において、自家生物発光シグナルは構成的であり、幹細胞が継続的に自家生物発光シグナルを放出する。そのような実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する。本明細書に記載の任意の構成的プロモータ（以下に述べる第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータを含む）は、構成的発光シグナルの生成に十分なレベルでの継続的な転写を可能にする任意の適切なプロモータを含み得る。例えば、構成的プロモータとして、限定されるものではないが、ニワトリベータアクチン、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト伸長因子１ａ、シミアンウイルス４０初期、ヒトｂ－アクチン、およびニューロン特異的エノラーゼプロモータを挙げることが可能である。
実施形態において、自家生物発光シグナルは構成的であり、幹細胞が継続的に自家生物発光シグナルを放出する。そのような実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する。本明細書に記載の任意の構成的プロモータ（以下に述べる第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータを含む）は、構成的発光シグナルの生成に十分なレベルでの継続的な転写を可能にする任意の適切なプロモータを含み得る。例えば、構成的プロモータとして、限定されるものではないが、ニワトリベータアクチン、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト伸長因子１ａ、シミアンウイルス４０初期、ヒトｂ－アクチン、およびニューロン特異的エノラーゼプロモータを挙げることが可能である。
【0127】
いくつかの実施形態において、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のそれぞれは、構成的プロモータに連動し得る。すなわち、そのような実施形態において、前述の核酸は、６つの構成的プロモータに連動する。これら６つの構成的プロモータは、同じプロモータまたは異なるプロモータであってもよい。
【0128】
他の実施形態では、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動し得る。さらに、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動し得る。２つの別個の構成的プロモータの作用下に核酸を有することの利点は、この構成が、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸に対するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸の様々な比率の容易な実施を可能にすることである。
【0129】
第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータは、同じプロモータまたは異なるプロモータであってもよい。例えば、第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータは、それぞれ、ニワトリベータアクチンプロモータを含み得る。ニワトリβ－アクチンプロモータが有利なのは、それがさまざまな幹細胞タイプにわたって機能を維持し、かつ強力な転写活性を付与するだけでなく、長い転写ユニットの発現を促進できるという点である（以下の実施例１の説明を参照）。
【0130】
例として、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸が少なくとも１つの構成的プロモータに連動される実施形態（第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータを有する実施形態を含む）において、各構成的プロモータが連動する核酸の連続発現があり得る。従って、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれが継続的に産生される。この継続的産生により、構成的な生物発光シグナルが放出される。さらに、この構成的発光シグナルは、幹細胞によって完全に自己生成され、かつ自己誘導されるので、外因的に添加された基質（例えば、アルデヒド官能基を有する基質）は発光シグナルの生成に必要ではない。
【0131】
２．誘導性自家生物発光シグナル
実施形態において、自家生物発光シグナルは誘導性であり、幹細胞は外部刺激に曝されると自家生物発光シグナルを放出する。外部刺激は、例えば、分析物、環境条件（例えば、温度および／または光）、あるいは転写活性化および／または１つまたは複数の核酸の非活性化を含み得る。
実施形態において、自家生物発光シグナルは誘導性であり、幹細胞は外部刺激に曝されると自家生物発光シグナルを放出する。外部刺激は、例えば、分析物、環境条件（例えば、温度および／または光）、あるいは転写活性化および／または１つまたは複数の核酸の非活性化を含み得る。
【0132】
実施形態において、外部刺激は分析物を含み、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つが少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、例えば、モジュラーエンハンサーユニットまたは応答エレメントを含み得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、分析物の存在によって調節することができる任意の応答エレメントであり得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの例として、限定されるものではにが、エストロゲン応答エレメント、アンドロゲン応答エレメント、金属応答エレメント、芳香族炭化水素応答エレメント、親電性応答エレメント、レチノイン酸およびレチノイドＸ応答エレメント、抗酸化応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、カルシウム応答エレメント、甲状腺ホルモン応答エレメント、ならびに成長ホルモン応答エレメントが挙げられる。
【0133】
分析物は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化することができる任意の分析物であり得る。例として、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントがホルモン応答エレメント（例えば、エストロゲンまたはアンドロゲン応答性）を含む場合、分析物は、ホルモン応答エレメントを活性化し得る適切な環境または天然ホルモン、例えばエストロゲンまたはアンドロゲンを含み得る。同様に、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントが芳香族炭化水素応答エレメントを含む場合、分析物は、ダイオキシンまたはベンゾピレン等の内分泌撹乱物質を含み得る。
【0134】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸に連動し得る。そのような実施形態では、幹細胞を分析物に曝すことで、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントが、それが連動する各核酸の転写をアップレギュレートする。言い換えれば、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化によって、自家生物発光シグナルを生成するために必要な対応するタンパク質のそれぞれが生成される。
【0135】
他の実施形態では、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連動する。すなわち、自家生物発光シグナルの生成に必要な核酸の少なくとも１つのサブセットは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに作動可能に連結され得る。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、単一の核酸のみに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸のみが、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動し得る。従って、上記実施形態では、幹細胞が分析物に曝されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントが活性化され、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸の転写を開始する。
【0136】
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない残りの少なくとも１つの核酸は、少なくとも１つの核酸が構成的に発現されるように、構成的プロモータに連動し得る。例えば、上記の例を続けると、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントである残りの核酸（すなわち、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸）は、構成的プロモータに連動し得る。すなわち、そのような実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼが連続的に生成され、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは、幹細胞の環境における分析物の存在に応答してのみ生成される。従って、幹細胞が分析物に曝されると、自家生物発光を生成するために必要な各タンパク質が生成され、その結果、幹細胞が自家生物発光シグナルを放出する。従って、上記の実施形態のそれぞれにおいて、自家生物発光シグナルの存在は、幹細胞の環境における分析物の存在を示す。
【0137】
さらに、幹細胞は、外因性エフェクター分子によるｌｕｘ発現の制御を可能にする調節機序を含み得る。調節機序は、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ等の発現を誘導することができるテトラサイクリン制御発現システムであってもよい。調節機序は、それが自家生物発光シグナルのより大きな遺伝的誘導を生成し得るという点で有利である。
【0138】
実施形態において、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動され、幹細胞は、少なくとも１つの分析物応答性逆トランスアクチベーターを含み得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、分析物の存在下で、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化し得る。活性化されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始する。
【0139】
例として、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含み得、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、逆テトラサイクリン制御されたトランス活性化因子を含み得る。そのような実施形態では、ＴＲＥは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連結され得る。
【0140】
逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、テトラサイクリン、またはドキシサイクリンのようなその類似体の１つの存在下でＴＲＥに結合し、それによってＴＲＥを活性化し得る。この活性化は、ＴＲＥに連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始させる。例えば、実施形態において、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードするすべての核酸がＴＲＥに連動されており、対応する各タンパク質が生成される。その結果、幹細胞は自家生物発光シグナルを放出する。従って、そのような実施形態では、幹細胞は、幹細胞の環境におけるテトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在に応答して、自家生物発光シグナルを放出する。
【0141】
３．抑制的自家生物発光シグナル
実施形態において、自家生物発光シグナルは抑制的であり、幹細胞は外部刺激に曝されると自家生物発光シグナルの放出を停止する。外部刺激は、例えば、分析物、環境条件（例えば、温度、放射、および／または光）、あるいは１つまたは複数の核酸の転写活性化および／または非活性化を含み得る。
実施形態において、自家生物発光シグナルは抑制的であり、幹細胞は外部刺激に曝されると自家生物発光シグナルの放出を停止する。外部刺激は、例えば、分析物、環境条件（例えば、温度、放射、および／または光）、あるいは１つまたは複数の核酸の転写活性化および／または非活性化を含み得る。
【0142】
実施形態において、外部刺激は分析物を含み、幹細胞は、外因性エフェクター分子によるｌｕｘ発現の制御を可能にする調節機序を含み得る。調節機序は、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ等の発現を誘導することができるテトラサイクリン制御発現システムであり得る。調節機序は、抑制的自家生物発光シグナルを生成し得るという点で有利である。
【0143】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを含み得る。先に詳述したように、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連動し得る。例えば、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、上記核酸のすべてに連動し得る。他の実施形態では、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸（すなわち、前述の核酸の１つ、２つ、３つ等）に連動し得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない上記核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの核酸が構成的に発現されるように、構成的プロモータに連動し得る。例えば、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸が少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合している場合、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸は構成的プロモータに結合し得る。
【0144】
幹細胞は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによってそれを活性化することができる少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子を含み得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、構成的プロモータ、例えば、ニワトリベータアクチンプロモータに連動され得、その結果、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子が連続的に産生される。そのような実施形態において、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化し、次に、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始する。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動されていない任意の少なくとも１つの核酸は、構成的プロモータに連結され得る。従って、そのような実施形態では、幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の発現を介して自家生物発光シグナルを放出することができる。
【0145】
しかしながら、分析物の存在下では、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントにもはや結合せず、それによって活性化する。代わりに、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子が分析物に結合する。分析物は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子に結合し得、従って、この少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子が少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化するのを妨ぐことができる任意の適切な分析物であり得る。
【0146】
従って、分析物の存在下で、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化することができない。結果として、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始しない。その結果、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸の少なくとも１つは発現されない。それ故に、自家生物発光シグナルが抑制され得る。すなわち、幹細胞は、分析物の存在下で、より堅牢でないか、または自家生物発光シグナルを放出しない可能性がある。
【0147】
例として、上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含み得、そして少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、テトラサイクリン制御トランス活性化因子を含む。そのような実施形態において、テトラサイクリン制御されたトランス活性化因子は、ＴＲＥに結合し、それによって、ＴＲＥを活性化する。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸は、ＴＲＥに連動し得る。従って、ＴＲＥの活性化は、ＴＲＥに連動する各核酸の転写を開始し、最終的に、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれの構成的産生をもたらす。その結果、幹細胞は自家生物発光シグナルを放出し得る。他の実施形態では、前述の核酸のサブセット（すなわち、１、２、３等）のみが作動可能にＴＲＥに連結され、そのような場合、ＴＲＥの活性化は、ＴＲＥが連動する核酸のみの転写を開始する。
【0148】
しかしながら、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で、テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、ＴＲＥではなく、テトラサイクリンまたはその類似体の１つに結合する。結果として、ＴＲＥに連動する核酸の転写が減少し、それにより、自家生物発光シグナルが減少する。従って、そのような実施形態では、自家生物発光シグナルは、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で抑制され得る。
【0149】
４．組織特異的自家生物発光シグナル
実施形態において、自家生物発光シグナルは組織特異的であり、自家生物発光シグナルは幹細胞が組織細胞に分化したときにのみ放出される。組織細胞は、筋肉、神経、骨細胞等の特殊な機能を実行できるようにする組織固有の構造を持つ特殊な（すなわち、分化した）細胞である。組織細胞は、例えば、任意の筋細胞、ニューロン、神経膠細胞、破骨細胞、骨細胞、または破骨細胞を含み得る。
実施形態において、自家生物発光シグナルは組織特異的であり、自家生物発光シグナルは幹細胞が組織細胞に分化したときにのみ放出される。組織細胞は、筋肉、神経、骨細胞等の特殊な機能を実行できるようにする組織固有の構造を持つ特殊な（すなわち、分化した）細胞である。組織細胞は、例えば、任意の筋細胞、ニューロン、神経膠細胞、破骨細胞、骨細胞、または破骨細胞を含み得る。
【0150】
上記実施形態において、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸の少なくとも１つは、組織特異的プロモータに連動する。組織特異的プロモータは、組織依存的に遺伝子発現を制御する任意のプロモータであり得る。すなわち、このプロモータは、特定の組織細胞型においてのみ活性化されている。例えば、組織特異的プロモータは、心筋細胞特異的プロモータＴＮＮＴ２、ヒト脂肪組織特異的プロモータｈＡＰ２、または任意の他の組織特異的プロモータを構成し得る。
【0151】
上記実施形態において、組織特異的プロモータが連動する少なくとも１つの核酸は、幹細胞が、組織特異的プロモータが活性化されているタイプの組織細胞に分化する場合にのみ発現される。すなわち、少なくとも１つの核酸の組織特異的転写があり得る。組織特異的プロモータに連動されていない、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸のいずれかは、少なくとも１つの核酸が連動されかつ継続的に発現される構成的プロモータに、連動し得る。
【0152】
例えば、組織特異的自家生物発光シグナルを放出することができる幹細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、組織特異的プロモータに連動し得る。従って、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは、幹細胞が組織特異的プロモータが活性化されていることを示すタイプの組織細胞に分化した場合にのみ、発現される。そのような構成によって、自家生物発光に必要なルシフェラーゼ成分の組織特異的発現が存在するように、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の組織特異的転写がもたらされ得る。
【0153】
組織特異的プロモータは、例えば、心筋細胞特異的プロモータであるＴＮＮＴ２プロモータを含み得る。幹細胞の分化に先だって、ＴＮＮＴ２プロモータは不活性のままであり、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは発現されない。幹細胞が心筋細胞に分化すると、ＴＮＮＴ２プロモータが活性化し、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の転写が開始される。その結果、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢが発現される。
【0154】
上記実施形態において、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、構成的プロモータに連動し得る。従って、上記実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の連続発現があり、それにより、自家生物発光をもたらす化学反応のためのルシフェリン成分およびＦＭＮＦ共基質の連続生成がもたらされる。
【0155】
従って、そのような実施形態では、組織特異的プロモータが活性化されると、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの発現が存在する。その結果、自家生物発光シグナルを放出するために必要なすべてのタンパク質の発現がある。しかし、組織特異的プロモータの活性化なしで、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの発現のみが発生し、これは、自家生物発光シグナルを放出するには不十分である。結果として、自家生物発光シグナルの放出は、組織特異的プロモータが発現されるタイプの組織細胞への分化の開始と一致する。言い換えれば、自家生物発光シグナルが組織特異的であるということである。
【0156】
最終的に、ｌｕｘシステムを介して構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的自家生物発光シグナルを放出する幹細胞の上記の実施形態は、インビトロおよび／またはインビボモダリティ下での幹細胞の基質を含まない自家生物発光イメージングを可能にし得ものであり、例えば、ハイスループットな方法である。自家生物発光シグナルがリアルタイムで放出されることで、生物発光出力に連動する細胞および分子機序が生物指標（ｂｉｏｉｎｄｉｃａｔｅ）となる。さらに、自家生物発光表現型があるために、幹細胞は、生物発光の開始について研究者が協力し合うことなしに継続的に調査可能であることから、単一の試料からのシグナル持続時間および強度ダイナミクスの両方を評価することが可能となる。さらに、幹細胞の自家生物発光表現型は、限定されるものではないが、リアルタイム、非侵襲的、連続的、および基質フリーでの追跡、識別、ならびに／または幹細胞の生存率、遊走、運命、および／または系統特異的な分化の測定を可能にし得る。さらに、真核生物の細菌ルシフェラーゼシステムの新機能もまた有効になり得、例えば、動物モデルにおける、単一細胞イメージング（Ｃ．Ｇｒｅｇｏｒら、「細菌生物発光システムを用いた単一哺乳類細胞の自律生物発光イメージング（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第１１６巻、５２号、２０１９年）を参照）、オルガネラのタグ付け、フローサイトメトリーを使用して細胞を分類するための生物発光の使用、および少数の細胞の視覚化が可能になる。従って、開示された実施形態は、臨床診療における幹細胞ベースの治療の実施を妨げる重要な障害の多くを効果的に改善することが可能であり、再生医療分野にとって重要な資産となるであろう。
【0157】
ＩＩＩ．自家生物発光表現型を含む特殊な細胞
幹細胞由来自律的生物発光細胞が開示される。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、自律的生物発光幹細胞から分化した自律的生物発光真核細胞を含む。
幹細胞由来自律的生物発光細胞が開示される。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、自律的生物発光幹細胞から分化した自律的生物発光真核細胞を含む。
【0158】
幹細胞由来自律的生物発光細胞は、特定の機能に特化するようになった、または特殊化された任意の細胞を含み得る。例えば、特定の機能に特化した細胞には、初期の細胞型のものとは異なる１つまたは複数の形態学的特徴および／または機能を獲得した細胞が一例として挙げられる。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、構成的自家生物発光シグナルを放出する。
【0159】
自律的生物発光幹細胞は、本明細書に開示される自律的生物発光表現型を含む幹細胞の任意の実施形態を含み得る。さらに、幹細胞由来自律的生物発光細胞は、幹細胞由来自律的生物発光細胞が由来する自律的生物発光表現型を含む幹細胞の任意の実施形態の特徴を継承し得る。
【0160】
幹細胞由来自律的生物発光細胞およびそれが由来する自律的生物発光幹細胞の両方とも、アルデヒド基質等の外因性発光刺激因子の非存在下で、自家生物発光シグナルを発現する。幹細胞由来自律的生物発光細胞は、本明細書に開示される化学反応を介したｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの産生を介して自律的生物発光シグナルを放出する。
【0161】
幹細胞由来自律的生物発光細胞は、幹細胞由来自律的生物発光細胞が由来する自律的生物発光幹細胞から放出される自家生物発光シグナルのレベルとほぼ同レベルの自家生物発光シグナルを放出し得る。
【0162】
幹細胞由来自律的生物発光細胞は、例えば、インビトロおよび／またはインビボ条件下で、特殊化された、または分化中／分化後の細胞の基質を含まない自家生物発光イメージングをハイスループットで可能にし得るという点で、有利である。研究者が外因性基質を追加する必要なしに生物発光を生成する幹細胞由来自律的生物発光細胞の能力を考えると、該細胞の用途として、例えば、リアルタイム、非侵襲的、連続的、および基質フリーでの、追跡、細胞の生存率、移動、および／または運命の識別、および／または測定がある。
【0163】
ＩＶ．ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの過剰発現を含む細胞
自律表現型を含む幹細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つが、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも１０倍から４０倍高い組み合わせレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも２０倍から３０倍大きい組み合わせレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも１５倍から２０倍高い組み合わせレベルで存在し得る。
自律表現型を含む幹細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つが、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも１０倍から４０倍高い組み合わせレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも２０倍から３０倍大きい組み合わせレベルで存在し得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの組み合わせレベルよりも１５倍から２０倍高い組み合わせレベルで存在し得る。
【0164】
有利には、これらの実施形態のそれぞれは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢと比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの過剰産生をもたらす。実際、驚くべきことにかつ予想外に、自律表現型を含む幹細胞の生物発光シグナルを最大化するために、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ（ｌｕｘカセットのルシフェラーゼ産生部分）のそれぞれをコードする核酸と比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ（ルシフェリン産生部分）のそれぞれをコードする核酸を過剰発現させる必要があることを発見した（実施例１を参照）。
【0165】
さらに、予期せず発見されたことは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸に対するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の過剰発現の公比が、一貫して最高レベルの自律発光を生成することである。すなわち、約２０：１～３０：１の比率で、人工多能性幹細胞とヒト脂肪由来間葉系幹細胞との自律発光出力が最大化される（それぞれ図２Ａおよび図２Ｂ）。このような結果は、細胞タイプ間に生理機能および代謝活性の違いがあることからして、驚くべき予想外の結果である。基礎酸化状態およびルシフェリン生成に必要な代謝資源への利用可能性が各細胞型で異なることからして、この比率は細胞型ごとに必然的に大きく異なることが予想される。
【0166】
ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸と比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を過剰発現することの利点は、直観に反し、少なくとも２つの理由で予想外である。まず、システムによって生成されるルシフェリン化合物は、高レベルで細胞毒性を持つ長鎖アルデヒドである。ｌｕｘカセットのルシフェリン産生部分の過剰発現は、長鎖アルデヒドの蓄積をもたらし、それによって細胞毒性効果のリスクを高める可能性がある。これらの効果は、幹細胞の健康に悪影響を及ぼし、自家生物発光の低下を引き起こし得る。
【0167】
第二に、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ遺伝子は、細胞内の代謝および酸化／還元プロセスの両方から、代謝産物を経路変更する。従って、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸と比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の過剰発現は、長鎖アルデヒドの蓄積および／または代謝活性の妨害から生じるいずれかの細胞毒性のために、細胞の健康、成長、および生理に悪影響を与えると予想される。細胞の健康が低下すると、自律発光出力が低下する。
【0168】
従って、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の過剰発現が最も強力な生物発光出力を生成すると予期する理由はない。しかし、驚くべきことに、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢと比較してｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの過剰産生を示す自律表現型を含む幹細胞は、正常な生理学および代謝活性レベルを示し続けながら、予想外に増加した自律発光を放出した（実施例１を参照）。
【0169】
従って、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのｌｕｘＡおよびｌｕｘＢへの開示された過剰産生を含む幹細胞の実施形態は、ロバストな自家生物発光シグナルを生成することが可能であり、このことは、シグナルの検出、イメージング、測定、および／または定量化に有益であろう。そのような実施形態は、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、および／または少なくとも１０００倍の生物発光シグナルを放出し得る。ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼと比較して、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢを過剰発現していない自家生物発光細胞から放出される生物発光シグナルよりも強い。
【0170】
Ｖ．別個のベクターから発現されたｌｕｘカセットを含む細胞
自律表現型を含む細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれは、６つの別個のプラスミド等の別個のベクターから独立して発現される。そのような実施形態では、ベクターのそれぞれは、誘導性であろうと構成的であろうと、ベクター上に存在する遺伝子の発現を駆動するプロモータを有し得る。上記実施形態において、幹細胞は、上記のように、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢと比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを有益に過剰発現し得る。
自律表現型を含む細胞のいくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれは、６つの別個のプラスミド等の別個のベクターから独立して発現される。そのような実施形態では、ベクターのそれぞれは、誘導性であろうと構成的であろうと、ベクター上に存在する遺伝子の発現を駆動するプロモータを有し得る。上記実施形態において、幹細胞は、上記のように、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢと比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを有益に過剰発現し得る。
【0171】
有利には、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれが６つのベクターから発現されることで、ロバストな自家生物発光表現型が得られる。実際、驚くべきことに、予想外に、前述の遺伝子のそれぞれを別々のプラスミドから独立して発現させると、本明細書に開示される自家生物発光細胞の生物発光シグナルが著しく増加することを発見した。実際、実施例１でさらに詳しく説明されているように、６つのベクターによるアプローチ（ｓｉｘ ｖｅｃｔｏｒ ａｐｐｒｏａｃｈ）では、遺伝子のフルセットが複数のプラスミドで発現している場合、単一のプラスミドから複数の遺伝子を発現する場合または単一のプロモータから複数の遺伝子を発現する場合と比較して、光の生成が大幅に増加する。
【0172】
６つのベクターによるアプローチの成功は、直観に反し、予想外である。実際、文献は、少なくとも、別々のプラスミドまたは別々のプロモータからｌｕｘＡおよびｌｕｘＢを発現させることを直接教示する。具体的には、以前の研究では、（１）異なるプラスミド、（２）同じプラスミド上の異なるプロモータ、または（３）単一のプロモータの制御下で単一のタンパク質を形成する融合のいずれかに由来するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子の発現は、すべて、ヒト細胞における単一のプロモータに由来する融合されていない共発現と比較して、光生成が減少した（例えば、Ｓ． Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、「哺乳類細胞での発現のための細菌ルシフェラーゼの最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」、博士論文、テネシー大学、２００３を参照）。ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢポリペプチドは折り畳み中にモルテングロビュール形状に移行し、機能的なヘテロダイマーに正しく組み立てるために共同足場として互いに必要とするため、これらの前述の戦略は多くの光出力を生成できなかったと長い間説明されてきた（Ｇ．Ｃ Ｆｌｙｎｎ、「細菌のルシフェラーゼの個々のサブユニットは溶融グロビュールおよび分子シャペロンとの相互作用（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｒｅ ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、１０８２６～１０８３０頁、１９９３年１１月を参照）。さらに、この文献によれば、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢポリペプチドが同じプロモータから共発現されない場合、それらのポリペプチド配列は、細胞内で同時に折り畳みプロセスを開始しない(同文献）。ポリペプチド配列が独立して折りたたまれると、２つは機能的ルシフェラーゼを形成できず、正しい方向に沿って再度折りたたむことができない（同文献）。従って、６ベクターアプローチが非常にロバストな生物発光出力を生成することを期待する理由はなかった。
【0173】
それにもかかわらず、長年の文献とは対照的に、別々のプラスミドからのｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの発現は、実際、同じプラスミドからの２つを発現するものを超えるロバストな光生成をもたらすことが見出された（実施例１を参照）。従って、本明細書では、別個のベクターから独立して発現されるｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれを含む幹細胞の実施形態が開示される。さらに、６ベクターアプローチは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ（ｌｕｘカセットのルシフェラーゼ産生部分）のそれぞれをコードする核酸と比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびｆｌａｖｉｎのそれぞれをコードするＤＮＡの過剰発現の前述の有益な比率の実施を容易にする。最終的には、個々のプラスミドでの遺伝子発現が有利な比率で生じることによる光生成の増加により、真核生物の細菌ルシフェラーゼシステムの新しい機能、例えば、単一細胞イメージング（Ｃ．Ｇｒｅｇｏｒ他、細菌生物発光システムを用いた単一哺乳類細胞の自律発光イメージング、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第１１６巻、５２号、２０１９年を参照）、細胞小器官のタグ付け、フローサイトメトリーを使用して細胞を選別するための生物発光の利用、動物モデルでの少数の細胞を視覚化が可能になる。
【0174】
ＶＩ．自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法とキット
本明細書に開示されるのは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法およびキットである。幹細胞は、任意のタイプの幹細胞であり得る。例えば、幹細胞は、成体幹細胞（例えば、組織特異的幹細胞）、胚性（もしくは多能性）幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。複製中に突然変異が起こる可能性があるため、すべての子孫が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。
本明細書に開示されるのは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法およびキットである。幹細胞は、任意のタイプの幹細胞であり得る。例えば、幹細胞は、成体幹細胞（例えば、組織特異的幹細胞）、胚性（もしくは多能性）幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。複製中に突然変異が起こる可能性があるため、すべての子孫が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。
【0175】
１．構成的自家生物発光シグナル
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。幹細胞は、構成的自家生物発光シグナルを放出する。
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。幹細胞は、構成的自家生物発光シグナルを放出する。
【0176】
本方法は、幹細胞を、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸でトランスフェクトすることを含む。幹細胞が上記核酸でトランスフェクトされた後、幹細胞は構成的にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し、その結果、幹細胞は構成的発光シグナルを放出する。
【0177】
いくつかの実施形態では、本方法は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含む。すなわち、本方法は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの構成を含む任意の数のベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。
【0178】
例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、幹細胞を６つのベクターでトランスフェクトすることを含み、ここで、各ベクターは、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの１つを含む（すなわち、ベクターごとに１つ）。各核酸は、構成的プロモータに連動され得る。そのような実施形態は、自家生物発光をもたらす化学反応に必要な成分の構成的発現が存在するように、前述の核酸のそれぞれの継続的な転写をもたらす可能性がある。
【0179】
代替の実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含む。そのような実施形態において、第１のベクターは、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み得る。ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動され得る。結果として、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の継続的な転写があり、その結果、自家生物発光をもたらす化学反応に必要なルシフェラーゼ成分の構成的発現があり得る。
【0180】
上記実施形態において、第２のベクターは、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み得る。ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、第２の構成的プロモータに連動され得る。第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータは、同じプロモータまたは異なるプロモータを含み得る。このような構成は、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の連続的な転写をもたらす可能性があり、その結果、アルデヒド基質および自家生物発光に必要なＦＭＮＨ２共基質が連続的に発現する。
【0181】
トランスフェクション後、幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を構成的に発現し得るもので、このことにより、発光シグナル産生に必要なすべての基質の連続的な自己合成をもたらし得る。この産生は、自律的かつリアルタイムで動作し得る。結果として、幹細胞は、生物発光出力に結合された細胞および分子機序を生物指標とするべく、イメージングされ得る構成的自家生物発光シグナルを放出し得る。
【0182】
本明細書に開示される６ベクターシステムおよび２ベクターシステムは、ロバストな自家生物発光シグナルを生成するために非常に有利である。第一に、ｌｕｘカセットに関して、転写活性は、プロモータの遠位に位置する核酸の方が低いと考えられている。従って、ｌｕｘ核酸を複数の独立したベクターに分離すると、すべての核酸を単一のベクターに配置する場合と比較して、一部の核酸とプロモータとの間の距離が必然的に短くなるため、問題が軽減される。
【0183】
第二に、６ベクターシステムおよび２ベクターシステムは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸と、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸との比を変化させることを可能にし、その利点については本明細書中に先に開示されている。従って、いくつかの実施形態では、方法は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の量よりも１０～４０倍多い量のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸で幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。好ましくは、本方法は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の量よりも２０～３０倍である量のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸で幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。例えば、開示された２ベクターシステムにおいて、本方法は、好ましくは、第１のベクターの量の２０～３０倍である量の第２のベクターをトランスフェクトすることを含み得る。これらの量の核酸をトランスフェクトすると、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸とｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸との前述の有利な比率が達成され、それにより、ロバストな自律発光表現型が得られる。
【0184】
構成的自家生物発光シグナルを放出する細胞を作製するキットが開示される。このキットは、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする物品の組み合わせを参考にして使用される。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含む。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの構成をいくつでも含む任意個数のベクターを含み得る。
【0185】
例えば、いくつかの実施形態では、キットは、６つのベクターシステムによる６つのベクター、または２ベクターシステムによる２つのベクターを含み得る。いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸を有するベクターは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸を有するベクターの量よりも１０～４０倍となる量でキット中に存在する。より好ましくは、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸を有するベクターは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸を有するベクターの量よりも２０～３０倍となる量で存在し得る。本明細書に詳述されるように、そのような比率は、最大の発光シグナルを生成する上で有利である。従って、上記量を含むキットは、キットの使用者がロバストな自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を開発することができるという点で、特に有利であろう。
【0186】
いくつかの実施形態では、キットは、方法に必要とされる化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびに任意の他の構成エレメントを含み得る。例えば、キットは、ユーザが自律発光表現型を含む幹細胞を産生することができるように、少なくとも１つのベクターで幹細胞を形質転換するために必要な試薬およびツールを含み得る。このような実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのベクターでトランスフェクトされると、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を発現し、アルデヒド等の外因的に添加された基質の非存在下で、幹細胞が自律的な構成的生物発光シグナルを生成する。
【0187】
キットはまた、該キットを使用する方法を説明する書面による指示を含み得る。例えば、指示書は、少なくとも１つのベクターで幹細胞を形質転換する方法を含む、キットの使用方法に関係し得る。そのような指示書は、該指示説明によりユーザがキットをより容易に使用することができるようになるという点で、有利である。
【0188】
２．誘導性自家生物発光シグナル
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。幹細胞が分析物に曝されると、誘導性の自家生物発光シグナルを放出する。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、ここで、核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。
自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。幹細胞が分析物に曝されると、誘導性の自家生物発光シグナルを放出する。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、ここで、核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。
【0189】
少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントは、分析物の存在によって調節することができる任意の応答エレメントであり得る。分析物応答性調節エレメントの例として、限定されるものではないが、エストロゲン応答エレメント、アンドロゲン応答エレメント、金属応答エレメント、芳香族炭化水素応答エレメント、求電子性応答エレメント、レチノイン酸およびレチノイドＸ応答エレメント、抗酸化応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、カルシウム応答エレメント、甲状腺ホルモン応答エレメント、および成長ホルモン応答エレメントが挙げられる。分析物は、分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化することができる任意の分析物であり得る。
【0190】
本方法は、幹細胞を任意の数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの分析物に連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞を少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントにトランスフェクトすることを含み得る。そのような実施形態において、単一のベクターでトランスフェクトされると、幹細胞は、分析物の存在下で自家生物発光シグナルを生成し得る。すなわち、分析物は、分析物応答性応答エレメントに結合し、それによって活性化することが可能である。活性化された分析物応答性応答エレメントは、それが連動する核酸、すなわち、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の転写におけるアップレギュレーションを引き起こす。これは、最終的に自家生物発光シグナルを生成する対応するタンパク質の生成をもたらす。
【0191】
他の実施形態では、例えば、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクターがあり、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれ得る（すなわち、前述のそれぞれは固有のベクターから発現される）。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結され得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない任意の核酸は、構成的プロモータに連結され得る。
【0192】
他の実施形態では、本方法は、幹細胞に第１のベクターおよび第２のベクターをトランスフェクトすることを含み得る。例えば、そのような実施形態において、第１のベクターは、分析物応答性応答エレメントに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。幹細胞が第１のベクターと第２のベクターとによりトランスフェクトされると、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼが継続的に生成され、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは幹細胞の環境における分析物の存在に応答してのみ生成される。従って、幹細胞が分析物に曝されると、自家生物発光を生成するために必要なタンパク質が生成され、その結果、幹細胞が自家生物発光シグナルを放出する。
【0193】
さらに、本方法は、外因性エフェクター分子によるｌｕｘ発現の制御を可能にする調節機序で幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの実施形態において、調節機序は、発現を誘導することができるテトラサイクリン制御発現シ幹細胞、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎであってもよい。そのような調節機序は、それが自家生物発光シグナルのより大きな遺伝的誘導を生成し得るという点で有利である。
【0194】
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、幹細胞を、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含むベクターでトランスフェクトすることを含み得る。少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、分析物の存在下で少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化することができるだろう。活性化されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始する。少なくとも１つの分析物応答性逆トランスアクチベーターは、少なくとも１つの分析物応答性逆トランスアクチベーターの連続生産を確実にするために、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。
【0195】
一例として、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含み得、さらに、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子は、テトラサイクリン制御逆トランス活性化因子を含み得る。いくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ＴＲＥに連動する。そのような実施形態において、逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、テトラサイクリン、またはドキシサイクリンのようなその類似体の１つの存在下で、ＴＲＥに結合し、それによってＴＲＥを活性化する。この活性化は、ＴＲＥに機能的に連結された核酸の転写を開始し、最終的には自家生物発光シグナルの生成をもたらす。従って、そのような実施形態において、幹細胞は、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で自家生物発光シグナルを放出する。
【0196】
誘導性自家生物発光を有する細胞を作製するキットも同様に開示される。このキットは、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする物品の組み合わせを参考にして使用される。
【0197】
キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法においてに開示された任意のベクターを含み、ここで、幹細胞は誘導性自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意個数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。
【0198】
いくつかの実施形態では、キットは、ある量の分析物を含み得る。分析物は、分析物応答性応答エレメントに結合し、従って、それを活性化することができる任意の分析物であってもよい。分析物は、分析物応答性逆トランス活性化因子に結合し、それによって分析物応答性応答エレメントに結合させ、それによって誘導性自家生物発光シグナルをもたらすことができる任意の分析物であってもよい。
【0199】
いくつかの実施形態では、キットは、方法に必要とされる化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびに任意の他の構成エレメントを含み得る。例えば、キットは、幹細胞をベクターで形質転換するために必要な試薬およびツールを含み得、その結果、ユーザは、分析物の存在下で自家生物発光シグナル、すなわち誘導性シグナルを放出する幹細胞を生産することが可能である。キットはまた、該キットを使用する方法を説明する書面による指示を含み得る。例えば、指示書は、ベクターで幹細胞を形質転換する方法を含む、キットを使用する方法に関係し得る。そのような指示説明は、該インストラクションによりユーザがキットをより容易に使用することができるようになるという点で、有利である。
【0200】
３．抑制的自家生物発光シグナル
分析物に曝されることで抑制的自家生物発光シグナルを幹細胞が放出する、自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。活性化されると、分析物応答性応答エレメントは、それが連動する核酸の翻訳を開始する。上に開示したように、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントは、分析物の存在によって調節することができる任意の応答エレメントであり得る。
分析物に曝されることで抑制的自家生物発光シグナルを幹細胞が放出する、自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントに連動する。活性化されると、分析物応答性応答エレメントは、それが連動する核酸の翻訳を開始する。上に開示したように、少なくとも１つの分析物応答性調節エレメントは、分析物の存在によって調節することができる任意の応答エレメントであり得る。
【0201】
本方法は、幹細胞を任意個数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの分析物に連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞を少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントにトランスフェクトすることを含み得る。
【0202】
いくつかの実施形態では、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクターがあり得、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれる（すなわち、前述のそれぞれは一義のベクターから発現される）。核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結され得る。少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連結されていない任意の核酸は、構成的プロモータに連結され得る。
【0203】
複数のベクターを使用する実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、第１のベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つに連動する少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み得る。例えば、そのような実施形態において、第１のベクターは、分析物応答性応答エレメントに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。
【0204】
当該実施形態のいずれかにおいて、本方法は、外因性エフェクター分子によるｌｕｘ発現の減少を可能にする調節機序で幹細胞をトランスフェクトすることを含む。調節機序は、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｆｔ等の発現を抑制することができるテトラサイクリン制御発現システムであってもよい。
【0205】
そのような実施形態において、本方法は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子を含むベクターで幹細胞を形質転換することを含み得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに結合し、それによってそれを活性化することができ得る。少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子の連続生産を確実にするために、ニワトリベータアクチンプロモータ等の構成的プロモータに連動し得る。
【0206】
しかし、そのような実施形態において、分析物の存在は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子の少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントへの結合に影響を与える。すなわち、幹細胞が分析物に曝されると、分析物は少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子に結合し、それが少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化するのを防ぐ。従って、分析物の存在下で、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化することができない。結果として、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、それが連動する少なくとも１つの核酸の転写を開始しない。それにより、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸の少なくとも１つは発現されない。その結果、自家生物発光シグナルが抑制され得る。すなわち、幹細胞は、分析物の存在下で、よりロバストでないか、または自家生物発光シグナルを放出し得ない。
【0207】
一例として、の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含み得、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子は、テトラサイクリン制御トランス活性化因子を含み得る。いくつかの実施形態では、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ＴＲＥに連動する。
【0208】
そのような実施形態において、テトラサイクリン制御されたトランス活性化因子は、ＴＲＥに結合し、それにより、ＴＲＥを活性化する。この活性化は、ＴＲＥに機能的に連結された核酸の転写を開始し、最終的には自家生物発光シグナルの生成をもたらす。しかし、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で、テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、ＴＲＥではなくテトラサイクリンまたはその類似体の１つに結合する。結果として、そのような実施形態がテトラサイクリンまたはドキシサイクリンのようなその類似体の１つに曝されると、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の転写が減少し、自家生物発光シグナルが減少する。
【0209】
さらに、抑制的自家生物発光を有する細胞を作製するキットが同様に開示される。このキットは、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする物品の組み合わせを参考にして使用される。
【0210】
キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を産生する方法においてに開示された任意のベクターを含み、幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出する。キットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意個数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。
【0211】
いくつかの実施形態では、キットは、ある量の分析物をさらに含み得る。分析物は、少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子に結合し、それによって活性化することができ、それによって抑制的自家生物発光シグナルをもたらすことができる任意の分析物であり得る。
【0212】
いくつかの実施形態では、キットは、方法に必要とされる化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびに任意の他の構成エレメントを含み得る。例えば、キットは、ベクターで幹細胞を形質転換するために必要な試薬およびツールを含み得、その結果、ユーザは、分析物の存在下で抑制的自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を産生し得る。キットはまた、該キットを使用する方法を説明する書面による指示を含み得る。例えば、指示書は、ベクターを用いて幹細胞を形質転換する方法を含む、キット使用方法に関係し得る。そのような指示書は、該指示書によりユーザがキットをより容易に使用することができるようになるという点で、有益である。
【0213】
４．組織特異的自家生物発光シグナル
自家生物発光シグナルが組織特異的である、自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。すなわち、自家生物発光シグナルは幹細胞が組織細胞に分化したときにのみ放出される。組織細胞は、筋肉、神経、骨細胞等の特殊な機能を実行できるようにする組織固有の構造を有する特殊な（すなわち、分化した）細胞である。組織細胞は、例えば、任意の筋細胞、ニューロン、神経膠細胞、破骨細胞、骨細胞、または破骨細胞を含み得る。
自家生物発光シグナルが組織特異的である、自律発光表現型を含む幹細胞を作製する方法が開示される。すなわち、自家生物発光シグナルは幹細胞が組織細胞に分化したときにのみ放出される。組織細胞は、筋肉、神経、骨細胞等の特殊な機能を実行できるようにする組織固有の構造を有する特殊な（すなわち、分化した）細胞である。組織細胞は、例えば、任意の筋細胞、ニューロン、神経膠細胞、破骨細胞、骨細胞、または破骨細胞を含み得る。
【0214】
本方法は、幹細胞を少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすることを含む。少なくとも１つのベクターは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つを含み、該核酸の少なくとも１つは、組織特異的プロモータに連動する。組織特異的プロモータは、組織依存的に遺伝子発現を制御する任意のプロモータであり得、すなわち、それは、特定の組織細胞型においてのみ活性化される。従って、それが連動する少なくとも１つの核酸は、組織特異的プロモータが活性であるタイプの組織細胞に幹細胞が分化するときにのみ、発現される。すなわち、そのような実施形態において、少なくとも１つの核酸の組織特異的転写があり得る。
【0215】
本方法は、幹細胞を任意の数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、組織特異的プロモータに連動するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードするすべての核酸を含む単一のベクターで幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。そのような実施形態において、単一のベクターでトランスフェクトされると、幹細胞が、組織特異的プロモータが活性であるタイプの組織細胞に分化するときに、幹細胞は自家生物発光シグナルを生成し得る。
【0216】
他の実施形態では、本方法は、幹細胞を複数のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、６つのベクターがあり得、各ベクターには、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の１つが含まれる（すなわち、前述のそれぞれは一義のベクターから発現される）。核酸の少なくとも１つは、組織特異的プロモータに連結され得る。組織特異的プロモータに連結されていない任意の核酸は、構成的プロモータに連結され得る。
【0217】
さらに他の実施形態では、本方法は、幹細胞を第１のベクターおよび第２のベクターでトランスフェクトすることを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１のベクターは、心筋細胞特異的プロモータであるＴＮＮＴ２プロモータ等の組織特異的プロモータに連動するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸を含み得る。従って、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢは、幹細胞が心筋細胞に分化したときにのみ発現する。そのような構成は、自家生物発光に必要なルシフェラーゼ成分の組織特異的発現が存在するように、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の組織特異的転写をもたらし得る。
【0218】
上記の２ベクター実施形態において、第２のベクターは、構成的プロモータに連動するｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸を含み得る。従って、上記実施形態では、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の連続発現があり、それにより、自家生物発光をもたらす化学反応のためのルシフェリン成分およびＦＭＮＨ２共基質の連続生成をもたらす。
【0219】
一例として、トランスフェクション後、幹細胞は、組織特異的自家生物発光シグナルを放出し得る。幹細胞の分化前は、ＴＮＮＴ２プロモータは不活性のままであり、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸は発現されない。しかし、幹細胞が心筋細胞に分化すると、ＴＮＮＴ２プロモータが活性化され、それによってｌｕｘＡ核酸とｌｕｘＢ核酸の転写が開始される。その結果、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢが生成される。
【0220】
例示的な例として２ベクターシステムを取り上げると、それらの発現は構成的プロモータによって駆動されるため、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの連続的な発現がある。従って、組織特異的プロモータがｌｕｘＡおよびｌｕｘＢが存在するように活性化されると、幹細胞は、本明細書に開示される化学反応を介して組織特異的自家生物発光シグナルを放出し得る。そのような実施形態において、組織特異的な生物発光シグナルは、自律的かつリアルタイムで生成される。
【0221】
しかし、組織特異的プロモータが不活性である場合、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのみが生成され、これは、自家生物発光シグナルを放出するには不十分である。結果として、自家生物発光シグナルの放出は、組織特異的プロモータが発現されるタイプの組織細胞への分化の開始を生物的に示すものであり、すなわち、自家生物発光シグナルは組織特異的である。
【0222】
本明細書に開示される２ベクターシステムは、６ベクターシステムほどロバストではないけれども、ロバストな自家生物発光シグナルを生成するのに有利である。第一に、ｌｕｘカセットに関して、転写活性は、プロモータの遠位に位置する核酸の方が低いと考えられている。従って、ｌｕｘ核酸を２つの独立したベクター、すなわち第１のベクターと第２のベクターとに分離すると、すべての核酸を単一のベクターに配置する場合と比較して、一部の核酸とプロモータとの間の距離が必然的に短くなるため、問題が軽減される。第二に、２ベクターシステムにより、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸に対するｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸の比率を変えることができる。この方策は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ核酸とｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼ核酸との比率が約２０：１～３０：１であることによってロバストな自律発光表現型がもたらされるということが、予期せず発見されたため、有利である（図２Ａ～２Ｄ）。実験的試験は、試験されたすべての細胞型にわたって、この前述の比率がロバストな発光シグナルをもたらしたことを示した。本明細書に詳述するように、このような発見は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのそれぞれをコードする核酸と比較して、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の過剰発現が、細胞の増殖および生理に損傷を負わせるとともに発光シグナルの低下をもたらすと予想されるため、驚くべきことである。それにもかかわらず、この比率は予想外にロバストな自家生物発光シグナルをもたらす。
【0223】
本明細書で先に論じたように、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢと比較したｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの過剰発現は、ロバストな自家生物発光表現型の生成にとって望ましい。従って、いくつかの実施形態では、方法は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の量よりも１０～４０倍となる量のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸で幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。好ましくは、本方法は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の量よりも２０～３０倍である量のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをコードする核酸で幹細胞をトランスフェクトすることを含み得る。例えば、開示された２ベクターシステムにおいて、本方法は、好ましくは、第１のベクターの量の２０～３０倍である量の第２のベクターをトランスフェクトすることを含み得る。これらの量の核酸をトランスフェクトすると、前述の有利な比率が達成され、それによってロバストな光出力がもたらされる。
【0224】
組織特異的自律発光表現型を含む細胞を作製するキットが開示される。このキットは、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする物品の組み合わせを参考にして使用される。
【0225】
キットは、自律発光表現型を含む幹細胞を生産する方法においてに開示された任意のベクターを含むもので、幹細胞が組織特異的自家生物発光シグナルを放出する。このキットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の少なくとも１つの任意個数の構成を含む任意個数のベクター（例えば、１、２、３等）を含み得る。そのような実施形態において、ひとたびベクターによりトランスフェクトされると、幹細胞は、組織特異的自家生物発光シグナルを生成し得る。
【0226】
いくつかの実施形態において、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現するベクターは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢを発現するベクターの量よりも１０～４０倍となる量でキット中に存在し得る。より好ましくは、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現するベクターは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢを発現するベクターの量よりも２０～３０倍である量で存在し得る。本明細書に詳述されるように、そのような比率は、最大の発光シグナルを生成する上で有利である。従って、上記量のベクターを含むキットは、該キットのユーザが強力な自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を開発することができるという点で、特に有利であろう。いくつかの実施形態では、方法に必要とされる化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびに任意の他の構成エレメントを含み得る。例えば、キットは、ユーザが組織特異的な自律発光表現型を含む幹細胞を生産できるように、ベクターで幹細胞を形質転換するために必要な試薬およびツールを含み得る。キットはまた、該キットを使用する方法を説明する書面による指示を含み得る。例えば、指示書は、ベクターを用いて幹細胞を形質転換する方法を含む、キット使用方法に関係し得る。そのような説明書は、該指示説明によりユーザがキットをより容易に使用することができるようになるという点で、有利である。
【0227】
ＶＩＩ．自律発光表現型を含む特殊な細胞を生産する方法
自律的生物発光幹細胞から幹細胞由来自律的生物発光細胞を作製する方法が開示される。
自律的生物発光幹細胞から幹細胞由来自律的生物発光細胞を作製する方法が開示される。
【0228】
本方法は、本明細書に開示される任意の方法によって、自家生物発光表現型を含む幹細胞を生産することを含み得る。本方法は、自家生物発光表現型を含む幹細胞を、任意の所望の機能的特殊化細胞であり得る幹細胞由来自律的生物発光細胞に分化させることを含み得る。すなわち、幹細胞由来自律的生物発光細胞は、例えば、神経、筋肉、または骨細胞を含み得る。
【0229】
分化は、細胞が特定の機能に特化するようになる発達過程を指し、例えば、細胞は、１つまたは複数の形態学的特徴および／または初期の細胞型のものとは異なる機能を獲得する。分化には、分化系列決定と最終分化プロセスとの両方が含まれる。未分化または分化の状態は、例えば、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学、または当業者に公知の他の手順を使用して、系統マーカーの存在または不在をモニタリングすることによって評価することができる。さらに、分化は、例えば、小分子法、シグナル阻害、成長因子の添加、共培養環境、または当業者に知られている他の手順を含む、任意の適切なプロセスによって実施することができる。
【0230】
さらに、幹細胞由来自律的生物発光細胞は、幹細胞由来自律的生物発光細胞が由来する自律的生物発光表現型を含む幹細胞の任意の実施形態の特徴を継承し得る。すなわち、幹細胞に由来する自律発光細胞は、幹細胞に由来する自律発光細胞は、生物発光シグナルの生成のためにすべての基質を自己合成するために、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生する能力を継承する。
【0231】
幹細胞に由来する自律発光細胞が、自家生物発光表現型を含む幹細胞に由来する場合、幹細胞は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量よりも大きい総生成量でｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し、幹細胞由来自律発光細胞は、同様に、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量よりも大きい総生成量でｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し得る。そのような実施形態において、幹細胞に由来する自律発光細胞は、例えば、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量よりも１０～４０倍となる範囲のｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量を含み得る。好ましくは、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量の範囲は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量よりも２０～３０倍である。このような比率により、ロバストな生物発光シグナルがもたらされるであろう。
【0232】
幹細胞由来自律的生物発光細胞は、例えば、インビトロおよび／またはインビボ条件下で、特殊化された、または分化中／分化後の細胞の基質フリー自家生物発光イメージングを高スループットで可能にし得るという点で、有利である。研究者が外因性基質を追加する必要なしに生物発光を生成する幹細胞由来自律的生物発光細胞の能力を考えると、該細胞の用途として、例えば、リアルタイム、非侵襲的、連続的、および基質フリーでの、追跡、細胞の生存率、移動、および／または運命の識別、および／または測定がある。
【0233】
ＶＩＩＩ．自律生物発光表現型を含む幹細胞を使用する方法
本明細書に開示される実施形態のいずれかによる自律生物発光表現型を含む幹細胞を使用する方法が本明細書に開示される。本明細書に開示されるすべての使用方法について、生物発光シグナルの自律的性質のために、本方法は、破壊することなく、幹細胞を繰り返しまたは連続的なアッセイまたは分析評価を含み得る。有利なことに、これにより、各方法のために準備しなければならない細胞が減少し、試料間のばらつきが減少し得る。
本明細書に開示される実施形態のいずれかによる自律生物発光表現型を含む幹細胞を使用する方法が本明細書に開示される。本明細書に開示されるすべての使用方法について、生物発光シグナルの自律的性質のために、本方法は、破壊することなく、幹細胞を繰り返しまたは連続的なアッセイまたは分析評価を含み得る。有利なことに、これにより、各方法のために準備しなければならない細胞が減少し、試料間のばらつきが減少し得る。
【0234】
本明細書に開示される方法は、同様に非常に拡張性があり、すべてのプレートフォーマットで視覚化が可能である。本明細書に開示される自家生物発光表現型を含む幹細胞を使用するすべての方法について、該方法は、例えば、６ウェル～１５３６ウェルに及ぶマルチウェルプレート、すなわち６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート等の少なくとも１つのウェルに幹細胞を播種することを含み得る。このようなスケーラビリティは、研究者が各方法を低スループットまたは高スループットで適用できるという点で非常に有利である。
【0235】
１．構成的自家生物発光シグナル
本明細書に開示されるのは、自律発光表現型を含む幹細胞を使用する方法であり、幹細胞は構成的自家生物発光シグナルを放出する。上記方法の各々は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生成することを含み得る。幹細胞は構成的発光シグナルを放出する。構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞は、そのような幹細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞は、構成的にｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し、その結果、少なくとも１つの幹細胞は、構成的生物発光シグナルを自律的に放出する。
本明細書に開示されるのは、自律発光表現型を含む幹細胞を使用する方法であり、幹細胞は構成的自家生物発光シグナルを放出する。上記方法の各々は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生成することを含み得る。幹細胞は構成的発光シグナルを放出する。構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞は、そのような幹細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞は、構成的にｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し、その結果、少なくとも１つの幹細胞は、構成的生物発光シグナルを自律的に放出する。
【0236】
ｉ．細胞集団サイズおよび生存率の測定
細胞集団サイズのリアルタイムモニタリングの方法が開示される。本方法は、フォトカウンタイメージング、本明細書に開示される任意の適切な、電荷結合、本明細書に開示される任意の適切なカメラベースの機器、シンチレーションカウンタ、ルミノメータ、プレートリーダ、または写真フィルムによって、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的自己生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。このような装置として、ＣＣＤベースのＭＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）またはＰＭＴベースのＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）が挙げられる。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
細胞集団サイズのリアルタイムモニタリングの方法が開示される。本方法は、フォトカウンタイメージング、本明細書に開示される任意の適切な、電荷結合、本明細書に開示される任意の適切なカメラベースの機器、シンチレーションカウンタ、ルミノメータ、プレートリーダ、または写真フィルムによって、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的自己生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。このような装置として、ＣＣＤベースのＭＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）またはＰＭＴベースのＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）が挙げられる。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0237】
本方法は、構成的生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて細胞集団サイズを評価することを含み得る。有利なことに、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞の集団によって放出される構成的発光シグナルの測定は、少なくとも１つの幹細胞の総数と強く相関する（Ｒ２＝０．９３）（図９Ｂおよび実施例２の説明を参照）。従って、この相関関係により、細胞集団サイズの正確な評価が可能になり得る。
【0238】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点で細胞集団サイズを測定することを含む。構成的生物発光シグナルは完全に自己生成され、少なくとも１つの幹細胞によって自己誘導されるため、２つ以上の時点で細胞集団サイズを測定すると、少なくとも１つの幹細胞の増殖または死を正確に縦軸方向に表すことが可能である。
【0239】
いくつかの実施形態では、本方法は、構成的生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングおよび／または評価することを含み得る。有利なことに、ｌｕｘカセットは内因性細胞代謝に直接関連していると考えられている。従って、本方法は、少なくとも１つの幹細胞の生存能力の速度論的モニタリングを有益に可能にし得る。
【0240】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞生存率を測定することを含む。構成的発光シグナルは、少なくとも１つの幹細胞によってリアルタイムで完全に自己生成され、かつ自己誘導されるため、細胞の生存率を経時的に測定することで、少なくとも１つの幹細胞の増殖または死を正確に縦軸方向に表すことが可能である。
【0241】
有利なことに、細胞集団のサイズおよび生存率を測定するこれらの方法は、幹細胞における連続的な外因性基質に依存しない自己生成生物発光シグナルを使用して細胞集団のサイズと生存率とをレポートする最初の方法である。
【0242】
ｉｉ．薬剤効果の測定
少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の効果を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、既知の毒性を有する化合物であってもよい。例えば、実施形態において、薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、害虫駆除剤、除草剤、肥料、または任意の他の化合物を含み得る。他の実施形態では、薬剤は、既知の治療効果を有する化合物であってもよい。任意の適切な手順によって、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させることが可能である。例えば、ディッシュ、フラスコ、または培養プレート内の薬剤に、少なくとも１つの幹細胞を曝すことが可能である。
少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の効果を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、既知の毒性を有する化合物であってもよい。例えば、実施形態において、薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、害虫駆除剤、除草剤、肥料、または任意の他の化合物を含み得る。他の実施形態では、薬剤は、既知の治療効果を有する化合物であってもよい。任意の適切な手順によって、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させることが可能である。例えば、ディッシュ、フラスコ、または培養プレート内の薬剤に、少なくとも１つの幹細胞を曝すことが可能である。
【0243】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞が薬剤と接触された後に少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルを、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示される任意の装置によって、検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0244】
いくつかの実施形態では、本方法は、構成的生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を評価することを含み得る。有利なことに、自律的生物発光表現型を含む幹細胞はまた、細胞の健康状態が陰性または陽性に応答して自律的生物発光シグナルが変化するときに、薬剤との接触に起因する細胞生存率の変化をレポートすることができる。具体的には、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルは、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率と強く相関している（図１０）。従って、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルの接触後測定を使用して、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を正確に評価することが可能である。
【0245】
いくつかの実施形態では、本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの対照幹細胞を含む対照集団を生成することを含み得るもので、幹細胞は構成的発光シグナルを放出する。対照集団は、薬剤とは非接触であり、そうでなければ薬剤と接触される少なくとも１つの幹細胞と同様に処理、または実質的に同様に処理される。
【0246】
上記実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルの測定値を、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較することを含み得る。対照集団によって、細胞生存率の負または正の変化を決定することの容易さと正確さとを高めることが可能である。
【0247】
例えば、そのような実施形態において、この方法は、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的生物発光シグナルの減少が薬剤との接触に起因する少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の負の変化を示すことを、決定することを含み得る。上記実施形態では、この方法は、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定することを含み得る。この方法は、少なくとも１つの幹細胞が構成的生物発光シグナルの生成を停止したときに、薬剤が少なくとも１つの幹細胞にとって致命的であると決定することを含み得る。有利なことに、この方法は、薬剤の細胞毒性効果の有益な評価を可能にする。
【0248】
他の実施形態では、本方法は、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較して、薬剤との接触に起因する少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化が、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的生物発光シグナルの増加を示すこと、を決定することを含み得る。実施形態では、本方法は、薬剤の効果が治療的であることを決定することを含み得る。従って、本方法によって、少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の有益な効果の貴重な評価が得られる。
【0249】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞をある範囲の濃度の薬剤で処理することを含み得る。これは、ある範囲の濃度が、少なくとも１つの幹細胞における用量依存的変化の評価を可能にし得るという点で、有益である。用量依存性の変化のチャートは、薬剤曝露と細胞生存率との関係を理解するために必要な部分であるという点で、有益である。例えば、薬剤が細胞毒性である場合、用量依存的な変化によって、薬剤の毒性を解明することが可能である（例えば、ＥＣ５０、ＩＣ５０、ＬＤ５０、ＬＣ５０、および他の同様の細胞毒性の測定値を決定する）。
【0250】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤の効果をリアルタイムで評価することを含み得る。
有利なことに、レポータータンパク質の合成、排泄、および細胞外収集に遅延がないため、薬剤の効果の直接的な証拠をリアルタイムで評価することが可能である。
有利なことに、レポータータンパク質の合成、排泄、および細胞外収集に遅延がないため、薬剤の効果の直接的な証拠をリアルタイムで評価することが可能である。
【0251】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたる薬剤の効果を評価することを含み得る。有利なことに、少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させた直後にそれを調べ、数分間から数日間までの任意の時間スケールにわたる薬剤の効果を決定することが可能である。さらに、幹細胞は自律的に生物発光し、該生物発光が細胞の生存能力と相関するため、細胞生存率に基づいて継続的に薬剤の作用をモニタリングすることが可能であり、このことによって薬剤の効果の開始ならびに該効果の持続時間に関する貴重な情報が提供される。効果が安定するときといった、薬剤の効果についての知識が深まると、薬剤の毒性および／または治療能力をより確実に評価できる可能性がある。
【0252】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤の効果を評価することに基づいて、創薬のための薬剤を評価することを含み得る。薬剤の細胞毒性および／または治療的効果を評価することは、創薬にとって特に価値がある。評価は、創薬において考慮するための薬剤のランク付け、および人体への投与後の該薬剤の運命を予測することに、有益に貢献し得る。
【0253】
自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞における薬剤の効果を測定するための本明細書に開示される方法は、薬剤の毒性および／または治療的効果を状況に合わせてより良く理解することにつながる。薬剤の効果を測定するこれらの方法は、例えば、リアルタイムの高スループット・アッセイにおいて、薬剤の細胞毒性および／または治療的効果を評価する手段を有益に提供し得る。
【0254】
ｉｉｉ．インビボイメージング
少なくとも１つの幹細胞の試薬を含まないインビボイメージングの方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を生物に注入することを含む。生物として、これらに限定されるものではないが、ヒトまたはヒト以外の動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ネズミ、ネズミ、スナネズミ、カエル、ヒキガエル、昆虫、ミバエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｒａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）等）、魚（ゼブラ・ダニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）等）、回虫（例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。「生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、生物の生命のすべての段階を網羅する（例えば、出生前発達から高度な成体期に到るまで、その間のすべての段階を含む）。例えば、この用語には、胚（接合子、胚盤胞等を含む）、胎仔、新生仔、乳仔、青年期、および成体が含まれるが、これらに限定されない。この用語は、雄または雌、あるいはその両方を指定する場合もあれば、または女性を除外する場合もある。
少なくとも１つの幹細胞の試薬を含まないインビボイメージングの方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞を生物に注入することを含む。生物として、これらに限定されるものではないが、ヒトまたはヒト以外の動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ネズミ、ネズミ、スナネズミ、カエル、ヒキガエル、昆虫、ミバエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｒａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）等）、魚（ゼブラ・ダニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）等）、回虫（例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。「生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、生物の生命のすべての段階を網羅する（例えば、出生前発達から高度な成体期に到るまで、その間のすべての段階を含む）。例えば、この用語には、胚（接合子、胚盤胞等を含む）、胎仔、新生仔、乳仔、青年期、および成体が含まれるが、これらに限定されない。この用語は、雄または雌、あるいはその両方を指定する場合もあれば、または女性を除外する場合もある。
【0255】
少なくとも１つの幹細胞は、任意の方法で、例えば、腹腔内、静脈内、皮内、または皮下で、生物に注射され得る。少なくとも１つの幹細胞の注入後、本方法は、生体内の少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルをイメージングすることを含む。構成的生物発光シグナルは、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するために、本明細書に開示される任意の適切な装置によってイメージングされ得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0256】
いくつかの実施形態では、本方法は、構成的生物発光シグナルを測定し、インビボで存在する少なくとも１つの幹細胞の総数を決定することを含み得る。有利なことに、放出された構成的発光シグナルは、注入された細胞個数と強く相関する（図１２Ｂ）。従って、この相関関係は、インビボで存在する少なくとも１つの幹細胞の総数を正確に決定する際に使用され得る。本方法は、インビボで少なくとも１つの幹細胞の増殖または死を有益に明らかにし得る。
【0257】
本方法は、生物内の少なくとも１つの幹細胞の動きを追跡することを含み得る。
そのような実施形態において、本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される自律生物発光シグナルの少なくとも１つの位置について生物を画像化することを含み得、それにより、注射部位に対する少なくとも１つの幹細胞の移動を決定する。少なくとも１つの幹細胞が生物内の複数の場所に定着する可能性があるため、少なくとも１つの幹細胞が移動したすべての場所を決定するべく、自律的な生物発光シグナルの複数の場所について生物を画像化することが有益と思われる。
そのような実施形態において、本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される自律生物発光シグナルの少なくとも１つの位置について生物を画像化することを含み得、それにより、注射部位に対する少なくとも１つの幹細胞の移動を決定する。少なくとも１つの幹細胞が生物内の複数の場所に定着する可能性があるため、少なくとも１つの幹細胞が移動したすべての場所を決定するべく、自律的な生物発光シグナルの複数の場所について生物を画像化することが有益と思われる。
【0258】
有利には、本方法は、生物における薬剤フリー・インビボイメージングを可能にする。このような方法は、繰り返し針を刺さずにデータを取得できるようにすることで、生物の福祉を改善し、ストレス反応および注射部位の炎症に関する懸念を取り除く。本方法は、非侵襲的光学イメージングが生物の生涯にわたって継続的に実施されることを可能にし得る。従って、本方法は、インビボ幹細胞活性の断続的なスナップショットしかキャプチャできない現在の生物発光イメージング技術に比べて、大きな利点を提供する。確かに、現在ある他の方法には、現在のところ、インビボで基質フリーの連続的なイメージングが可能なものはない。最終的に、本方法は、非侵襲的な誘導および細胞注入の検証、細胞移動の追跡、ならびに移植された幹細胞の長期的な統合および生存のモニタリング等の利点を提供し得る。
【0259】
２．誘導性または抑制性の自家生物発光シグナル
本明細書に開示されるのは、分析物に曝されると誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を使用する方法である。
本明細書に開示されるのは、分析物に曝されると誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する幹細胞を使用する方法である。
【0260】
上記方法のそれぞれにおいて、本方法は、自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生成することを含み得るもので、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞は、分析物に曝されると誘導性自家生物発光シグナルを放出する。分析物に曝されると誘導性自家生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞は、そのような幹細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産され得る。実施形態において、分析物に曝されると、少なくとも１つの幹細胞は、少なくとも１つの幹細胞が自家生物発光シグナルを放出するように、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを産生し得る。従って、そのような実施形態において、分析物への曝露は、遺伝子発現を直接誘導し得る。
【0261】
他の実施形態では、幹細胞は、分析物に曝されると、抑制的自家生物発光シグナルを放出する。分析物に曝されると抑制的自家生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞は、そのような幹細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産され得る。上記実施形態において、分析物に曝されると、少なくとも１つの幹細胞は、抑制的自家生物発光シグナルを少なくとも１つの幹細胞が放出するように、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の発現を低下させ得る。従って、そのような実施形態において、分析物に曝すことで、遺伝子発現が直接抑制され得る。
【0262】
ｉ．遺伝子発現のモニタリング
具体的には、少なくとも１つの幹細胞における遺伝子発現のリアルタイムモニタリングのための方法が開示される。本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生産することを含み、ここで、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。
具体的には、少なくとも１つの幹細胞における遺伝子発現のリアルタイムモニタリングのための方法が開示される。本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生産することを含み、ここで、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。
【0263】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させることを含み得る。分析物は、幹細胞に自家生物発光シグナルを放出または抑制するように誘導する任意の適切な分析物であり得る。すなわち、少なくとも１つの幹細胞の組成によって分析物の選択が促される。例えば、少なくとも１つの幹細胞がテトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で自家生物発光シグナルを放出する場合、分析物はテトラサイクリンまたはその類似体の１つであってもよい。
【0264】
少なくとも１つの幹細胞は、任意の適切な機序によって分析物と接触され得る。例えば、少なくとも１つの幹細胞は、ディッシュ、フラスコ、または培養プレートに存在し得る。ディッシュ、フラスコ、または培養プレート中に置かれている間、少なくとも１つの幹細胞が分析物と接触され得る。
【0265】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞が分析物と接触させられた後に少なくとも１つの幹細胞から放出される自己生物発光シグナルを、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示された任意の装置によって、検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0266】
いくつかの実施形態では、本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの対照幹細胞を含む対照集団を生成することを含み得るもので、幹細胞は、誘導性または抑制性の発光シグナルを放出する。対照集団は、薬剤と非接触であり、そうでなければ薬剤と接触される少なくとも１つの幹細胞と同様に処理、または実質的に同様に処理される。
【0267】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される自家生物発光シグナルの測定値を、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較することを含み得る。実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は誘導性自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの増加は、分析物への曝露を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、測定された自家生物発光シグナルが対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも大きい場合に、分析物に応答して、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸の転写の活性化を決定することをさらに含み得る。
【0268】
他の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの減少は、分析物への曝露を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、測定された自家生物発光シグナルが対照集団から放出される自家生物発光シグナルよりも小さい場合に、分析物に応答するｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの抑制を決定することをさらに含み得る。対照集団は、分析物との接触の結果としての自家生物発光シグナルの変化を決定することの容易さおよび正確さを高めることができるという点で有利である。
【0269】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞をある範囲の濃度の分析物で処理することを含み得る。これは、ある範囲の濃度が、少なくとも１つの幹細胞における用量依存的変化の評価を可能にし得るという点で、有益である。用量依存性の変化のチャートは、分析物の曝露と遺伝子発現との関係を理解するために必要な部分であるという点で、有益である。
【0270】
本方法は、２つ以上の時点にわたる遺伝子発現に対する分析物の影響を評価することを含み得る。有利なことに、レポータータンパク質の合成、排泄、および細胞外収集の遅延がないか、ほとんどないため、本方法により、遺伝子発現に対する分析物の影響の直接的な証拠がリアルタイムで提供される。幹細胞を分析物と接触させ、すぐに調べることで、数分間から数日間までの任意の時間スケールにわたる分析物の効果を決定することが可能である。幹細胞は自律的に発光するため、分析物の影響を継続的にモニタリングすることが可能であり、これにより、遺伝子発現または抑制の開始、およびその影響の持続時間に関する貴重な情報が得られる。
【0271】
ｉｉ．分析物の存在の決定
試料中の分析物の存在を決定する方法が開示される。本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生産することを含み、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。
試料中の分析物の存在を決定する方法が開示される。本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を生産することを含み、幹細胞は、分析物に曝されると、誘導性または抑制性の自家生物発光シグナルを放出する。
【0272】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞を試料と接触させることを含み得る。少なくとも１つの幹細胞は、任意の適切な機序によって試料と接触させることができる。例えば、少なくとも１つの幹細胞は、ディッシュ、フラスコ、または培養プレート等の容器内に存在し得る。容器内にある間、少なくとも１つの幹細胞を試料と接触させることが可能である。試料には、ある濃度の分析物が含まれる場合と含まれない場合がある。分析物は、誘導性または抑制性シグナルをそれぞれが放出する少なくとも１つの幹細胞の自家生物発光シグナルの誘導または抑制を引き起こす任意の化合物または官能基を含み得る。
【0273】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞が試料と接触した後に、該少なくとも１つの幹細胞から放出される自家生物発光シグナルを、本明細書に開示される任意の装置によって、検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0274】
いくつかの実施形態では、本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの対照幹細胞を含む対照集団を生成することを含み得るもので、幹細胞は、誘導性または抑制性の発光シグナルを放出する。対照集団は、試料とは接触されないが、そうでなければ、試料と接触される少なくとも１つの幹細胞と同様にまたは実質的に、同様に処理される。
【0275】
そのような実施形態において、本方法は、少なくとも１つの幹細胞から放出される自家生物発光シグナルの測定値を、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較することを含み得る。実施形態において、少なくとも１つの幹細胞は誘導性自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの増加は、分析物との接触を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、測定された自家生物発光シグナルが対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも大きい場合に、試料中の分析物の存在を決定することを含み得る。
【0276】
さらに別の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞は抑制的自家生物発光シグナルを放出し、対照集団から放出される自家生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された自家生物発光シグナルの減少は、分析物との接触を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、測定された自家生物発光シグナルが対照集団から放出された自家生物発光シグナルよりも少ない場合に、試料中の分析物の存在を決定することを含み得る。対照集団の存在は、分析物との接触または接触の欠如の結果としての自家生物発光シグナルの変化を決定することの容易さおよび正確さを高めることができるという点で有利である。
【0277】
本方法は、分析物の存在について多数の試料を迅速にスクリーニングする際の貴重なツールとなり得る。有利なことに、レポータータンパク質の合成、排泄、および細胞外収集が遅延することはないことから、従って、リアルタイムでの少なくとも１つの幹細胞に対する試料の影響について、直接的な証拠がある。少なくとも１つの幹細胞に対する試料の影響は、数分から数日までの任意の時間スケールで観察され得る。
【0278】
３．組織特異的自家生物発光シグナル
組織特異的自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を使用するリアルタイム分化レポートの方法が開示される。すなわち、ｌｕｘ発現は、自家生物発光シグナルの放出が組織特異的プロモータの発現と一致し得るように、組織特異的プロモータに結び付けられ得る（図１８）。
組織特異的自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を使用するリアルタイム分化レポートの方法が開示される。すなわち、ｌｕｘ発現は、自家生物発光シグナルの放出が組織特異的プロモータの発現と一致し得るように、組織特異的プロモータに結び付けられ得る（図１８）。
【0279】
本方法は、組織特異的な自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を提供することを含む。少なくとも１つの幹細胞は、本明細書に開示される任意の実施形態を含み得る。自家生物発光シグナルは組織特異的であり、すなわち、自家生物発光シグナルは、少なくとも１つの幹細胞が少なくとも１つの組織細胞に分化したときにのみ放出される。少なくとも１つの幹細胞が、組織特異的プロモータが発現される少なくとも１つの組織細胞に分化する場合、少なくとも１つの組織特異的細胞は、自律生物発光シグナルを放出する。
【0280】
本方法は、少なくとも１つの幹細胞および／または少なくとも１つの組織細胞から放出される自家生物発光シグナルを、検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示される任意の、本明細書に開示される任意の適切なによって検出、測定、および／または定量化することを含み得る。生物発光シグナル、検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で発生する可能性がある。
【0281】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたって、少なくとも１つの幹細胞の少なくとも１つの組織細胞への分化を追跡することを含み得る。有利には、自家生物発光シグナルの放出は、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化の開始と一致し得る。従って、本方法は、少なくとも１つの幹細胞の分化状態に関する直接的な情報を提供する。
【0282】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点で少なくとも１つの幹細胞および／または少なくとも１つの組織細胞からの自家生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。有利なことに、生物発光シグナルは、少なくとも１つの組織細胞によって完全に自己生成され、自己誘導されるので、２つ以上の時点での生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化は、少なくとも１つの幹細胞から少なくとも１つの組織細胞へ分化の正確な縦方向の表現を生成し得る。本方法は、少なくとも１つの幹細胞が少なくとも１つの組織細胞に分化する時点に関する直接的な情報を提供し得る。
【0283】
本方法は、自家生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて、少なくとも１つの組織細胞の細胞集団サイズを評価することを含み得る。有利には、少なくとも１つの組織細胞から放出される組織特異的生体発光シグナルの測定および／または定量化は、少なくとも１つの組織細胞の総数と相関する（図１８および実施例７）。従って、この相関関係を使用して、少なくとも１つの組織細胞の細胞集団サイズを評価することが可能である。そのような評価は、少なくとも１つの組織特異的細胞に分化した少なくとも１つの幹細胞の集団の割合に関する情報を提供し得る。
【0284】
この方法は、幹細胞の分化をリアルタイムで追跡するために自家生物発光を使用する第１の方法であることを意味する。
【0285】
ＩＸ．自律生物発光表現型を含む特殊な細胞を使用する方法
幹細胞由来自律的生物発光細胞を使用する方法が本明細書に開示されている。上記方法のそれぞれは、構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を生成することを含み得る。少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、そのような細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って産生され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、構成的にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し得、その結果、細胞は、構成的生物発光シグナルを自律的に放出する。
幹細胞由来自律的生物発光細胞を使用する方法が本明細書に開示されている。上記方法のそれぞれは、構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を生成することを含み得る。少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、そのような細胞を生産するための本明細書に開示される方法のいずれかに従って産生され得る。従って、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞は、構成的にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し得、その結果、細胞は、構成的生物発光シグナルを自律的に放出する。
【0286】
１．細胞集団のサイズと生存率の測定
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の集団の細胞集団サイズをリアルタイムモニタリングする方法が提供される。本方法は、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示される任意の装置によって、少なくとも１つの少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される自己生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の集団の細胞集団サイズをリアルタイムモニタリングする方法が提供される。本方法は、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示される任意の装置によって、少なくとも１つの少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される自己生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0287】
本方法は、自家生物発光シグナルの測定に基づいて細胞集団サイズを評価することを含み得る。有利には、自家生物発光表現型を含む幹細胞の集団によって放出される自家生物発光シグナルであって、自律発光表現型は、構成的発光シグナルを放出することを含み、図９Ｂに見られるように、集団のサイズ（Ｒ２＝０．９３）と強く相関する。さらに、上記幹細胞が特殊化された細胞に分化するとき、特殊化された細胞は、自家生物発光表現型を保つ。実際、特殊化された細胞は、自律生物発光表現型を含む幹細胞とほぼ同様のレベルの自家生物発光を生成するものであり（図１９Ｂ）、自家生物発光表現型が細胞型の変化によって根本的に変化しないことが示唆される。従って、幹細胞由来自律的生物発光細胞の集団によって放出される平均的な生物発光シグナルは、同様に、集団のサイズと強く相関すると考えられている。従って、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の細胞集団サイズは、相関関係を使用して迅速かつ容易に評価され得る。
【0288】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたる細胞集団サイズを検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、２つ以上の時点でなされてもよい。有利なことに、自己生物発光シグナルは、少なくとも１つの幹細胞由来の自律的生物発光細胞によって完全に自己生成され、自己誘導されるので、細胞集団のサイズを経時的に測定することで、少なくとも１つの幹細胞の増殖または死を正確に縦軸方向に表すことが可能である。
【0289】
いくつかの実施形態では、本方法は、自家生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の細胞生存率のリアルタイムモニタリングを含む。有利なことに、ｌｕｘカセットの発現は内因性細胞代謝に直接関連している。従って、構成的生物発光シグナルを放出する少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の能力は、細胞集団サイズに加えて、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞の生存率の速度論的モニタリングを可能にする。
【0290】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたって細胞生存率を測定することを含み得る。測定は、２つ以上の時点で行ってもよい。有利なことに、自家生物発光シグナルは、リアルタイムで少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞によって完全に自己生成され、自己誘導されるので、経時的な細胞生存率を測定することにより、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の増殖または死を正確に縦軸方向に表すことが可能である。
【0291】
細胞集団および生存率を測定する開示された方法は、幹細胞由来自律的生物発光細胞において連続的で外因性の基質に依存しない自己生成生物発光シグナルを使用して細胞集団のサイズおよび生存率をレポートするための最初の方法である。
【0292】
２．薬剤の効果を測定
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を使用して薬剤の効果を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を薬剤と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、既知の毒性を有する化合物であってもよい。例えば、実施形態において、薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、駆除剤、除草剤、肥料、または任意の他の化合物を含み得る。他の実施形態では、薬剤は、既知の治療効果を有する化合物であり得る。任意の適切な手順によって、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を薬剤と接触させることが可能である。例えば、ディッシュ、フラスコ、または培養プレート内の薬剤に、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を曝すことが可能である。
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を使用して薬剤の効果を測定する方法が開示される。本方法は、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を薬剤と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、既知の毒性を有する化合物であってもよい。例えば、実施形態において、薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、駆除剤、除草剤、肥料、または任意の他の化合物を含み得る。他の実施形態では、薬剤は、既知の治療効果を有する化合物であり得る。任意の適切な手順によって、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を薬剤と接触させることが可能である。例えば、ディッシュ、フラスコ、または培養プレート内の薬剤に、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を曝すことが可能である。
【0293】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞が薬剤と接触された後に少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルを、生物発光シグナルを検出、測定、および／または定量化するための本明細書に開示される任意の装置によって、検出、測定、および／または定量化することを含み得る。検出、測定、および／または定量化は、１つまたは複数の時点で実施可能である。
【0294】
いくつかの実施形態では、本方法は、自家生物発光シグナルの検出、測定、および／または定量化に基づいて、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率を評価することを含み得る。有利なことに、幹細胞由来自律的生物発光細胞は、正および／または負の細胞の健康に応答して自律的生物発光シグナルが変化するときに、薬剤との接触に起因する細胞生存率の変化をレポートすることができる。具体的には、少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的生物発光シグナルは、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率と強く相関している（図１９Ｃ）。結果として、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される自家生物発光シグナルの接触後の測定を使用して、細胞の生存能力を正確に評価することができる。
【0295】
いくつかの実施形態では、本方法は、自律生物発光表現型を含む少なくとも１つの対幹細胞に由来する自律発光細胞を生成することを含み得るもので、対照集団は、薬剤とは非接触であり、そうでなければ薬剤と接触される少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞と同様に処理、または実質的に同様に処理される。
【0296】
上記実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される構成的生物発光シグナルの測定値を、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較することを含み得る。対照集団は、細胞生存率の負および／または正の変化を決定することの容易さと正確さとを高め得る。
【0297】
そのような実施形態において、この方法は、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較して、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される測定された構成的生物発光シグナルの減少が薬剤との接触に起因する少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率の負の変化を示すこと、を決定することを含み得る。実施形態では、この方法は、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定することを含み得る。この方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞が構成的生物発光シグナルの生成を停止したときに、薬剤が少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞にとって致命的であると決定することを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞が構成的生物発光シグナルの生成を停止しない場合に、薬剤が少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞に致命的ではないことを決定することを含み得る。有利なことに、本方法は、薬剤の細胞毒性効果の貴重な評価を可能にする。
【0298】
本方法は、対本方法は、対照集団から放出される構成的生物発光シグナルと比較して、薬剤との接触に起因する少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞の細胞生存率の正の変化が、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞から放出される測定された構成的生物発光シグナルの増加を示すこと、を決定することを含み得る。実施形態では、本方法は、薬剤の効果が治療的であることを決定することを含み得る。従って、本方法によって、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞に対する薬剤の有益な効果の貴重な評価が得られる。
【0299】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞をある範囲の濃度の薬剤で処理することを含み得る。これは、ある範囲の濃度が、少なくとも１つの幹細胞に由来する自律発光細胞における用量依存的変化の評価を可能にし得るという点で、有益である。用量依存性の変化のチャートは、薬剤曝露と細胞生存率との関係を理解するために必要な部分であるという点で、有益である。例えば、薬剤が細胞毒性である場合、用量依存的な変化によって、薬剤の毒性を解明することが可能である（例えば、ＥＣ５０、ＩＣ５０、ＬＤ５０、ＬＣ５０、および他の同様の細胞毒性の測定値を決定する）。
【0300】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤の効果をリアルタイムで評価することを含み得る。有利なことに、レポータータンパク質の合成、排泄、および細胞外収集に遅延がないため、薬剤の効果の直接的な証拠をリアルタイムで評価することが可能である。
【0301】
いくつかの実施形態では、本方法は、２つ以上の時点にわたる薬剤の効果を評価することを含み得る。有利なことに、少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞を薬剤と接触させた直後にそれを調べ、数分間から数日間までの任意の時間スケールにわたる薬剤の効果を決定することが可能である。さらに、幹細胞由来の自律的生物発光細胞は自律的に生物発光し、上記生物発光は細胞の生存率と相関するため、薬剤の効果は、細胞生存率に基づいて継続的にモニタリングすることができ、これは、薬剤の効果の開始ならびに効果の持続時間に関する貴重な情報を提供する。効果が安定するとき等、薬剤の効果についての知識が深まると、薬剤の毒性および／または治療能力をより確実に評価できる可能性がある。
【0302】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤の効果を評価することに基づいて、創薬のための薬剤を評価することを含み得る。薬剤の細胞毒性および／または治療的効果を評価することは、創薬にとって特に価値がある。評価は、創薬における考慮のための薬剤のランク付け、および人体への投与後のそれらの運命を予測することに有利に寄与する可能性がある。
【0303】
少なくとも１つの幹細胞由来自律的生物発光細胞における薬剤の効果を測定するための本明細書に開示される方法は、治療法開発および非治療的化学的リスク評価にとって非常に有利である。例えば、心毒性をテストする画面では、ｉＰＳＣ由来心筋細胞を、通常は細胞破壊性のエンドポイントスタイルのアッセイ（ＭＴＴ、ＡＴＰベースのルシフェラーゼ－ルシフェリンアッセイ等）と組み合わせて使用することが増えているため、１つの時点での測定が１回で済む。細胞を継続的にモニタリングすることが可能である（例、インピーダンスプレート）。ただし、設備および消耗品のコストが高くなる。これらの様式では、動態毒性データをキャプチャするために複製を調整することには費用がかかり、規模がわずかに増加しても実験的変動が生ずる。
【0304】
これらの問題に対処するために、自家生物発光幹細胞に由来する自律的生物発光心筋細胞を使用して、心毒性をモニタリングすることが可能である。上記心筋細胞は、長期間にわたるリアルタイムの継続的な心毒性モニタリングを提供し得る。さらに、コストが低く、実験による変動のリスクが少なくなるであろう。従って、本明細書に開示される方法は、細胞毒性および／または治療的効果を状況に合わせてより良く理解することにつながる。
【0305】
実施例
実施例１－継続的に自家生物発光するヒトｉＰＳＣ株の開発。
例えば、幹細胞の生存率、移動、位置、および運命を調べるための現在の技術によって課せられた制限を詳しく検討するべく、実験を実施して、自律的な生物発光レポーター遺伝子を幹細胞に実施して、インビトロおよび／またはインビボモダリティの下で、幹細胞の基質を含まない自己生物発光イメージングを可能にした。具体的には、幹細胞を操作して構成的自己生物発光を放出させるべく、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＥ、およびｆｒｐ（ｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ）遺伝子を幹細胞に実施することが求められた。
実施例１－継続的に自家生物発光するヒトｉＰＳＣ株の開発。
例えば、幹細胞の生存率、移動、位置、および運命を調べるための現在の技術によって課せられた制限を詳しく検討するべく、実験を実施して、自律的な生物発光レポーター遺伝子を幹細胞に実施して、インビトロおよび／またはインビボモダリティの下で、幹細胞の基質を含まない自己生物発光イメージングを可能にした。具体的には、幹細胞を操作して構成的自己生物発光を放出させるべく、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＥ、およびｆｒｐ（ｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ）遺伝子を幹細胞に実施することが求められた。
【0306】
上記細胞系統を開発することを試みる際に、細胞系統において単にｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子を発現させること実際の目的には十分ではないことが見出された。実際には、日常的なトランスフェクション手順から予想されるように、遺伝子の直接的な発現は、大多数の細胞系統で十分な自律発光出力を生成せず、一部の細胞タイプ、例えば幹細胞で、自律発光出力を生成できないことが見出された。実際、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でのこのカセットの発現は、ｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子のゲノム統合を確認するｑＰＣＲベースの分析にもかかわらず、測定可能な自律発光を示すクローン株を生成できなかった。従って、幹細胞でｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子を発現させるだけでは、幹細胞で機能レベルの自律発光を生成するには不十分である。
【0307】
ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢの開発
従って、ｌｕｘ遺伝子の発現を同時に駆動することができるプロモータの同定が求められた。しかし、すべてのプロモータが複数のｌｕｘ遺伝子の発現を同時に駆動できるわけではない。不死化細胞系統での作業において、公開されているさまざまなプロモータ配列を評価し、さらに、自律発光出力と、単一遺伝子レポーターシステム（ホタルルシフェラーゼまたはＧＦＰ）を駆動するためのプロモータの公表された活性との間に相関関係は存在しないと判断した。この問題は、合成ｌｕｘオペロンを幹細胞に移行させようとしたときに特に明確になった。例えば、以下のプロモータ、すなわちＣＭＶ、ＥＦ１α、Ｕｂｃ、ＰＧＫ１、ＤＮＭＴ３、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＡｃｔＢ、ＳＶ４０は、経験的に決定された理想的な遺伝子発現比（以下で説明）を使用した場合でも、ｉＰＳＣで自律発光出力をサポートできないことが驚くべことに発見された。さらに、予期せぬことに、Ｅｌｌｉｓラボ（ＰｕｂＭｅｄ：１９４０４２５４に記述）によってｉＰＳＣでの強力な発現のために以前に開発された合成プロモータでは、ｉＰＳＣでの自律発光出力のサポートができなかった。
従って、ｌｕｘ遺伝子の発現を同時に駆動することができるプロモータの同定が求められた。しかし、すべてのプロモータが複数のｌｕｘ遺伝子の発現を同時に駆動できるわけではない。不死化細胞系統での作業において、公開されているさまざまなプロモータ配列を評価し、さらに、自律発光出力と、単一遺伝子レポーターシステム（ホタルルシフェラーゼまたはＧＦＰ）を駆動するためのプロモータの公表された活性との間に相関関係は存在しないと判断した。この問題は、合成ｌｕｘオペロンを幹細胞に移行させようとしたときに特に明確になった。例えば、以下のプロモータ、すなわちＣＭＶ、ＥＦ１α、Ｕｂｃ、ＰＧＫ１、ＤＮＭＴ３、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＡｃｔＢ、ＳＶ４０は、経験的に決定された理想的な遺伝子発現比（以下で説明）を使用した場合でも、ｉＰＳＣで自律発光出力をサポートできないことが驚くべことに発見された。さらに、予期せぬことに、Ｅｌｌｉｓラボ（ＰｕｂＭｅｄ：１９４０４２５４に記述）によってｉＰＳＣでの強力な発現のために以前に開発された合成プロモータでは、ｉＰＳＣでの自律発光出力のサポートができなかった。
【0308】
最終的に、試験されたプロモータの公表された活性とは反対に、この研究により、幹細胞で機能レベルの自律発光を得るためには、強力な転写活性を与えるだけでなく、長い転写ユニットの発現を促進できるプロモータと遺伝子とを注意深く組み合わせる必要が、予想外にも明らかになった。従って、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモータにより、機能レベルの自律発光がもたらされ、さまざまな細胞タイプにわたって機能し続けることが経験的に決定された。図３Ａは、この新規なコンストラクトであるＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢを示すもので、転写効率を高めるべく各ｌｕｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子間のリンカー領域としてウイルス２Ａエレメント（２Ａ）が使用された。さらに、ｎａｎｏｇプロモータはネオマイシン選択マーカーを駆動する（図３Ａ）。現在、ＣＢＡプロモータは、新しい細胞型に移行する際のｌｕｘシステムのデフォルトプロモータとして採用されている。次に、代替プロモータ活性を系統ごとにスクリーニングする。
【0309】
２ベクターｌｕｘシステムの開発
ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢのトランスフェクションは弱かったけれども、測定可能な自律発光出力をもたらした（データ示さず）。それにもかかわらず、それは依然として効率的なクローン選択をサポートすることができず、２４～７２時間以上自律発光表現型を維持することができなかった。このようなデータは、ｉＰＳ細胞におけるｌｕｘオペロンの発現が自律発光をサポートできることを示唆しているが、一部またはすべてのｌｕｘシステムコンポーネントは効率的な自律発光生成をサポートするために十分に発現されなかった。ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢコンストラクトのプロモータの遠位にある遺伝子の転写活性が低下している可能性がある。
ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢのトランスフェクションは弱かったけれども、測定可能な自律発光出力をもたらした（データ示さず）。それにもかかわらず、それは依然として効率的なクローン選択をサポートすることができず、２４～７２時間以上自律発光表現型を維持することができなかった。このようなデータは、ｉＰＳ細胞におけるｌｕｘオペロンの発現が自律発光をサポートできることを示唆しているが、一部またはすべてのｌｕｘシステムコンポーネントは効率的な自律発光生成をサポートするために十分に発現されなかった。ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦＡＢコンストラクトのプロモータの遠位にある遺伝子の転写活性が低下している可能性がある。
【0310】
従って、すべてのシステム構成エレメントが十分に確実に発現されるために、図３Ｂおよび３Ｃに示されるように、ｌｕｘオペロンを、その構成エレメントサブセクションであるルシフェラーゼ生成ｌｕｘＡＢ遺伝子およびｌｕｘＣＤＥｆｒｐルシフェリン生成遺伝子に、分割した。単一のプロモータの操作下でｌｕｘシステム全体を配置する場合と比較して特定の遺伝子とプロモータとの間の距離を短くするために、コンポーネントを２つのベクター上に分けた。
【0311】
次に、これらのコンポーネントを、ｉＰＳ細胞において、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢを１：１とするモル比からｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢを４０：１とするモル比まで様々なモル比の範囲内で、２つの独立したベクター（図３Ｂ～３Ｃ）から一時的に共発現、すなわちルシフェラーゼ生成遺伝子と比較してルシフェリン生成遺伝子の膨大な過剰発現を生じさせた。図２Ａに示されるように、スプリットルクスオペロン（ｎａｎｏｇ－ｎｅｏ－ＣＢＡ－／ｕｘＡＳおよびｎａｎｏｇ－ｚｅｏ－ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦ）を１：１のモル比で一時的に発現するｉＰＳＣおよびｈＡＤＭＳＣから放出される平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を、同量のｌｕｘＡＢと増加量のｌｕｘＣＤＥＦとを発現する同一の細胞と比較して、グラフ化した。
【0312】
図２Ａに示されるように、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢの１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、および４０：１のモル比を試験した。発光出力は、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢのモル比が２０：１でピークに達した（６×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。２０：１の比率を下回ると、発光出力はほとんどまたはまったく観察されなかった。具体的には、１０：１の比率では２０：１の比率の約半分の出力が得られ、１：１および５：１のモル比では、発光出力はほとんどまたはまったく観測されなかった。２０：１の比率を超えると、発光出力は安定した状態を保った。３０：１および４０：１の両方で、それぞれ約４×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒと５×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒのかなりの発光出力が得られた。
【0313】
これらの結果が他の細胞系統にも当てはまるかどうかを判断するために、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢのモル比を変えて、２ベクタールクスシステムをヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＭＳＣ）、ＬＮ２２９細胞系統、およびＵ８７細胞系統に対して実施した。ｈＡＤＭＳＣの場合、この傾向はほぼ当てはまっていた。この細胞系統では、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢのモル比１：１、１０：１、２０：１、３０：１、および４０：１で試験した。図２Ｂに示されるように、発光出力は、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢのモル比３０：１でピークに達した（約９×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。２０：１および４０：１の比率では、それぞれ約８×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒおよ６×１０３ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒという同様にロバストな出力が生じた。１：１および１０：１の比率に関連した出力は、ほとんどまたはまったく観測されなかった。
【0314】
ＬＮ２２９細胞系統およびＵ８７細胞系統について同様の結果が得られた。さまざまな比率から生成された結果の光生成（ｐ／ｓ）を、両方の細胞系統で測定した。ｉＰＳＣおよびｈＡＤＭＳＣで得られた結果と同様に、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢが約１６：１～３０：１である過剰発現は、図２Ｃおよび２Ｄに示されるように、最もロバストな生物発光出力をもたらした。Ｕ８７細胞系統では、予想外にも、４８：１～９６：１の比率で光の生成が増加することが判明した。しかし、１６：１～２４：１の比率で発生した光生成の増加とは異なり、これらのより高い比率は、光生成が細胞系統にとって持続可能ではないような細胞罹患率をもたらした。
【0315】
ルシフェラーゼ生成遺伝子と比較したルシフェリン生成遺伝子の過剰発現に関するこれらの予期しない発見に従い、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐおよびｌｕｘＡＢベクターを２０：１の比率でコトランスフェクトして、ロバストな自己生物発光表現型を生成することによって、安定した自己発光ｉＰＳＣ系統を生成した。抗生物質耐性クローン系統を選択し、次に、連続的な自律発光シグナルを最も多く生成する系統を選択した。この系統をｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦと呼ぶこととした。
【0316】
ゲノムｑＰＣＲベースの分析は、図４に示されるように、ｌｕｘＣＤＥＦおよびｌｕｘＡＢ成分の２０：１の標的比を確認した。この系統の長期培養（＞３ヶ月）では、野生型親系統（図示せず）と比較して増殖速度に影響があったかが明らかにされず、また、この間中、細胞は野生型多能性マーカー（図５Ｂ）と核型（図６Ａ）との両方を保持したことから、スプリットｌｕｘオペロンの統合が多能性を乱さなかったことが示唆された。
【0317】
従って、ヒトｉＰＳＣにおける連続的で外因性の基質非依存性の自己生成生物発光の光を、ｘＣＤＡＢＥｆｒｐ遺伝子をｉＰＳＣに実装することによって、生じさせた。細胞系統の自家生物発光は、リアルタイムで放出される。さらに、自家生物発光表現型により、幹細胞は、研究者が干渉することなく、継続的にインテロゲートされて生物発光を開始することが可能であり、従って、単一の試料からのシグナル持続時間および強度ダイナミクスの両方の評価を可能にする。さらに、幹細胞の自家生物発光表現型は、リアルタイム、非侵襲的、連続的、および基質フリーの追跡、識別、および／または幹細胞の生存率、遊走、運命、および／または系統特異的な分化を含むがこれらに限定されない、様々な用途における非侵襲的連続光学イメージングを可能にし得る。従って、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統は、臨床診療における幹細胞ベースの治療の実施を妨げる重大な障害の多くを効果的に改善する可能性があり、再生医療分野にとって重要な資産となり得る。
【0318】
ルシフェリン生成遺伝子の過剰発現に関する考察
最終的には、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の分化において、非常に予想外であったことは、ルシフェラーゼ産生部分（ｌｕｘＡＢ遺伝子）と比較した細菌ルシフェラーゼ遺伝子カセットのルシフェリン産生部分（ｌｕｘＣＤＥｆｒｐ遺伝子）の過剰発現によって最もロバストなシグナルが生成されたことである。実際、この過剰発現は、以前のすべての自律発光細胞系統のモル比とは著しく異なるもので、これらはすべて、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐとｌｕｘＡＢとの比率が１：１であった。
最終的には、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の分化において、非常に予想外であったことは、ルシフェラーゼ産生部分（ｌｕｘＡＢ遺伝子）と比較した細菌ルシフェラーゼ遺伝子カセットのルシフェリン産生部分（ｌｕｘＣＤＥｆｒｐ遺伝子）の過剰発現によって最もロバストなシグナルが生成されたことである。実際、この過剰発現は、以前のすべての自律発光細胞系統のモル比とは著しく異なるもので、これらはすべて、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐとｌｕｘＡＢとの比率が１：１であった。
【0319】
実際、この結果は、少なくとも２つの理由で直感に反し、予想外である。第一に、システムによって生成されるルシフェリン化合物は、高レベルで細胞毒性を有する長鎖アルデヒドである。ｌｕｘカセットのルシフェリン産生部分の過剰発現は、長鎖アルデヒドの蓄積をもたらし、それによって細胞毒性効果のリスクを高める可能性がある。これらの影響は、幹細胞の健康に悪影響を及ぼし、自家生物発光の低下を引き起こすと予想される。
【0320】
第二に、これらの遺伝子は、細胞内の代謝および酸化／還元プロセスの両方から代謝産物を別の経路に切り替える。従って、ｌｕｘＡＢと比較したｌｕｘＣＤＥｆｒｐの過剰発現は、長鎖アルデヒドの蓄積に起因する細胞毒性および／または代謝活性の妨害のいずれかにより、細胞の健康、増殖、および生理学に悪影響を与えると予想される。細胞の健康が低下すると、自律発光出力が低下する。従って、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐ遺伝子の過剰発現が最も強力な生物発光出力を生成すると予想する理由はない。しかし、驚くべきことに、この研究の結果により、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐの過剰発現を示すｉＰＳＣ細胞が、正常な生理学および代謝活性レベルを示し続けながら、増加した自律発光を放出することが、予想外にも明らかになった。
【0321】
これらの驚くべき結果は、追加の予想外の発見につながった。すなわち、ホストとして機能する細胞系統とは関係なく、ｌｕｘＣＤＥｆｒｐとｌｕｘＡＢとの公比があり、一貫して最大レベルの自律発光出力を生成する。試験したすべての細胞型について、約２０：１～３０：１の比率が最大の発現をもたらした（図２Ａ～２Ｄ）。このような結果は、生理機能および代謝活性が細胞型間で違いがあることを考えると、驚くべき予想外の結果である。各細胞型が異なる基礎酸化状態およびルシフェリン生成に必要な代謝資源への利用可能性を有することを考えると、この比率は細胞型ごとに必然的に大きく異なることが予想される。
【0322】
従って、この研究は、少なくとも２つの非常に予想外の結論をもたらした。第一に、ルシフェリン生成遺伝子の過剰発現により、幹細胞を含む、試験したすべての細胞系統で予想外に大きな自家生物発光シグナルが生成されることである。第二に、２０：１～３０：１の比率で、試験したすべての細胞系統で最大の発現が得られたことである。
【0323】
６ベクターｌｕｘ系の開発
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の開発後、個々のプラスミドからのｌｕｘ遺伝子の発現が高レベルの生物発光をもたらすかどうかを評価するべく、実験を実施した。この評価を行うために、各ｌｕｘＡＢＣＤＥＦを合成し、６つの異なる発現ベクターに別々にクローニングした。次に、６つの発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。生物発光出力を評価する際に、予期せず発見されたことは、ｌｕｘ遺伝子のフルセットが複数のプラスミドで発現している場合に、単一のプラスミドからの複数のルクス遺伝子または単一のプロモータからの複数のルクス遺伝子のいずれかを発現する場合と比較して、ユニークなプラスミドから独立して各ルクス遺伝子を発現させると、光生成が大幅に増加するということである。実際、このアプローチによって、広く使用されているホタルルシフェラーゼと同様の生物発光レベルが得られた。
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の開発後、個々のプラスミドからのｌｕｘ遺伝子の発現が高レベルの生物発光をもたらすかどうかを評価するべく、実験を実施した。この評価を行うために、各ｌｕｘＡＢＣＤＥＦを合成し、６つの異なる発現ベクターに別々にクローニングした。次に、６つの発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。生物発光出力を評価する際に、予期せず発見されたことは、ｌｕｘ遺伝子のフルセットが複数のプラスミドで発現している場合に、単一のプラスミドからの複数のルクス遺伝子または単一のプロモータからの複数のルクス遺伝子のいずれかを発現する場合と比較して、ユニークなプラスミドから独立して各ルクス遺伝子を発現させると、光生成が大幅に増加するということである。実際、このアプローチによって、広く使用されているホタルルシフェラーゼと同様の生物発光レベルが得られた。
【0324】
その後、複数の細胞型にわたって６ベクター発現アプローチを検証した。具体的には、ＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、およびＭＣＦ７細胞に、２Ａ結合細菌ルシフェラーゼ遺伝子を発現する単一のベクターまたは６つの細菌ルシフェラーゼ遺伝子の１つをそれぞれ発現する６つの個別のベクターをトランスフェクトした。次に、前述の各細胞タイプからの光出力を、トランスフェクションの４８時間後に測定した（３回実行）。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、６ベクター発現アプローチにより、ＨＣＴ１１６細胞の光出力の７８倍の変化から、ＨｅｐＧ２細胞からの光出力の１８３８倍の変化まで、試験したすべての細胞タイプで光出力が増加した。
【0325】
さらに、この６ベクター発現アプローチはまた、生物発光シグナルの熱安定性を改善する。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞に対して、（１）６つすべての２Ａ結合細菌ルシフェラーゼ遺伝子を発現する単一のベクター、（２）１つはｌｕｘＡＢを表現し、もう１つはｌｕｘＣＤＥｆｒｐを表現する２つベクター、（３）１つはｌｕｘＡＢを表現し、２つ目はｌｕｘＣＤＥを表現し、３つ目はｆｒｐを表現する３つのベクター、または（４）それぞれが６つの細菌ルシフェラーゼ遺伝子の１つを発現する６つの個別のベクターを、トランスフェクトした。光出力の測定は、３７℃に保持された細胞でトランスフェクションの４８時間後に実施した（３回実行）。図８に示されるように、６ベクター発現アプローチは、他のアプローチ（約１５，０００ＲＬＵから３５，０００ＲＬＵの範囲の光出力を生成する）と比較して、増加した光出力（約３．５×１０７ＲＬＵ）をもたらした。従って、６ベクター発現アプローチは、より少ない個数のベクターを利用する他の発現アプローチと比較して、生物発光シグナルの熱安定性を有意に改善した。
【0326】
最後に、ルシフェラーゼ生成遺伝子と比較したルシフェリン生成遺伝子の前述の過剰発現が、６つのベクター系に対して最も強い自家生物発光表現型を生成することがさらに確認された。具体的には、トランスフェクトされたプラスミドの比率は、ｌｕｘＡＢと比較してＩｕｘＣＤＥｆｒｐの量が増加するように変化させた。脂肪酸レダクターゼ成分が過剰になると、光出力が増加することが確認された。
【0327】
従って、前述の研究を通じて、驚くべきことに、特定の予期しない比率（ｌｕｘＡＢに比べてｌｕｘＣＤＥｆｒｐが過剰発現されるように）での個々のプラスミドからのｌｕｘ遺伝子の発現が、複数の細胞型にわたって強力な熱安定性自家生物発光をもたらすことが発見された。有利なことに、個々のプラスミドでの遺伝子発現に起因する光産生の増加は、真核生物の細菌ルシフェラーゼ系の新たな能力、例えば、単一細胞イメージング（Ｃ．Ｇｒｅｇｏｒ他、細菌生物発光システムを用いた単一哺乳類細胞の自律生物発光イメージング、ＰＮＡＳ、Ｖｏｌ.１１６、Ｎｏ．５２、２０１９を参照）、細胞小器官のタグ付け、フローサイトメトリーを使用した細胞の選別のための生物発光の使用、および動物モデルでの少数の細胞の視覚化、を可能にする。
【0328】
実施例２－ｉＰＳＣ細胞集団のサイズおよび生存率の自家生物発光測定
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の開発後、上記細胞系統が細胞集団サイズをレポートすることができるかどうかを評価するための実験を実施した。まず、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞の集団から放出される発光シグナルが集団の総細胞数に比例するかどうかを評価するために、一定量の培地中のｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞をウェルプレートに所定の細胞密度で播種した。培地のプレーティングとともに、トランスフェクトされていない細胞の同一のプレーティングを実施して、ポジティブおよびネガティブ対照群とした。細胞を標準的な増殖条件下で２４時間インキュベートした。この期間の後、図９Ａに示されるように、発光出力についてプレートをイメージングした。生物発光の読み取り値は、ＭＳルミナイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して取得した。このプロセスを６回繰り返して、６つの生物学的レプリケートを得た。すべての測定について、培地のみの対照群から得られたバックグラウンド値を差し引いて、バックグラウンド補正された平均を得た。発光出力を平均し、その平均値を使用して、各アッセイの平均の標準誤差を決定した。
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の開発後、上記細胞系統が細胞集団サイズをレポートすることができるかどうかを評価するための実験を実施した。まず、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞の集団から放出される発光シグナルが集団の総細胞数に比例するかどうかを評価するために、一定量の培地中のｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞をウェルプレートに所定の細胞密度で播種した。培地のプレーティングとともに、トランスフェクトされていない細胞の同一のプレーティングを実施して、ポジティブおよびネガティブ対照群とした。細胞を標準的な増殖条件下で２４時間インキュベートした。この期間の後、図９Ａに示されるように、発光出力についてプレートをイメージングした。生物発光の読み取り値は、ＭＳルミナイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して取得した。このプロセスを６回繰り返して、６つの生物学的レプリケートを得た。すべての測定について、培地のみの対照群から得られたバックグラウンド値を差し引いて、バックグラウンド補正された平均を得た。発光出力を平均し、その平均値を使用して、各アッセイの平均の標準誤差を決定した。
【0329】
バックグラウンドに対する結果として生じる平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の倍率変化を、初期播種細胞密度に対してプロットした。図９Ｂに示されるように、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞から放出される平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）は、プレーティングされた細胞の個数（Ｒ２＝０．９３）と強く相関すると判断した。この結果から、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞の集団によって放出される平均発光シグナルが総細胞個数と比例かつ相関し、それによって平均放出シグナルに基づく細胞集団サイズの定量化を可能であると判断した。
【0330】
さらに、上記細胞系統が細胞生存率をレポートすることができるかどうかを評価するべく実験を実施した。まず、ある量の培地中のｉＰＳＣーｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞をウェルプレートに所定の細胞密度で播種した。培地のプレーティングとともに、トランスフェクトされていない細胞の同一のプレーティングを実施して、ポジティブおよびネガティブ対照群とした。細胞を標準的な増殖条件下で２４時間インキュベートした。この期間の後、発光出力についてプレートをイメージングした。生物発光の読み取り値は、ＭＳルミナイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して取得した。
【0331】
この読み取りに続いて、製造業者のインストラクションに従って、プレートを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）を用いた生存率分析にかけた。ＳｙｎｅｒｇｙＩＩプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して５７０ｎｍでの吸光度値としてＭＴＴアッセイ値を取得し、未処理の対照細胞に対する吸光度のパーセント割合としレポートした。すべての測定について、培地のみの対照群から得られたバックグラウンド吸光度値を差し引いて、バックグラウンド補正平均を得た。このプロセスを６回繰り返して、６つの生物学的レプリケートを取得した。吸光度の値を平均し、その平均値を使用して、各アッセイの平均の標準誤差を決定した。
【0332】
バックグラウンドに対する結果として生じる平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の倍率変化を、バックグラウンドに対するＭＴＴ吸光度（５７０ｎｍ）の倍率変化に対してプロットした。結果として高い相関（Ｒ２＝０．９８）が得られ、ｌｕｘオペロンがｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の細胞生存率を正確にレポートしていることが示唆される（図９Ｃ）。
【0333】
従って、この研究は、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞から放出された平均自家生物発光出力が細胞の個数と強く相関し、細胞生存率を正確にレポートすることを検証した。相関関係は、内因性細胞代謝へのｌｕｘシステム連結から生ずる。組み合わせて、これらのデータは、ヒトｉＰＳＣにおいて、連続的で外因性の基質に依存しない、自己生成された生物発光光、すなわち、さらに、確立されたアッセイと同等の細胞集団サイズと生存率をレポートすることができるものを、明らかにしている。
【0334】
実施例３－自律発光出力による化合物毒性の追跡
上で詳述したように、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞からの自律発光出力は、細胞集団のサイズと生存率の両方を忠実にレポートする。従って、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が、既知の毒性の化合物での処理に応答して細胞生存率の変化をレポートできるかどうかを判断するための実験を実施した。
上で詳述したように、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞からの自律発光出力は、細胞集団のサイズと生存率の両方を忠実にレポートする。従って、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が、既知の毒性の化合物での処理に応答して細胞生存率の変化をレポートできるかどうかを判断するための実験を実施した。
【0335】
最初に、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞を２つの別々のマルチウェルプレート内の一定量の培地に播種した。培地のプレーティングとともに、トランスフェクトされていない細胞の同一のプレーティングを実施して、ポジティブおよびネガティブ対照群とした。第１のプレートには、細胞を細胞毒性化合物ドキソルビシンの濃度を上げながら処理した。第２のプレートには、細胞に細胞毒性化合物ロテノンの濃度を上げながら処理した。次に、細胞を標準的な増殖条件下で２４時間インキュベートした。この期間の後、発光出力についてプレートをイメージングした。Ｓｙｎｅｒｇｙｌｌプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して生物発光の読み取り値を取得した。
【0336】
この読み取りに続いて、プレートを、製造業者のインストラクションに従って、ＭＴＴアッセイによる生存率分析にかけた。Ｓｙｎｅｒｇｙｌｌプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して５７０ｎｍでの吸光度値として、ＭＴＴアッセイ値を取得し、未処理の対照群細胞に対する吸光度のパーセンテージとしてレポートした。すべての測定について、培地のみの対照群から得られたバックグラウンド吸光度値を差し引いて、バックグラウンド補正平均を得た。各処理レベルからの吸光度値を平均し、各プレートの平均値を使用して、各アッセイの平均の標準誤差を決定した。
【0337】
ある範囲のドキソルビシン濃度でのｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の処理は、細胞生存率の変化を示す自律発光シグナル出力への用量依存的変化をもたらし、これはまた、ＭＴＴによって実施された測定と強く相関した（Ｒ２＝０．９９）（図１０）。
【0338】
要約すると、これらのデータは、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が化合物曝露に起因する細胞生存率の変化をレポートすることができ、自律発光シグナルが細胞ストレスおよび死に応答して変化することを示している。
実施例４－自律発光ｈＡＤＭＳＣのインビボイメージング。
実施例４－自律発光ｈＡＤＭＳＣのインビボイメージング。
【0339】
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞系統を樹立した後、ｉＰＳＣ用に開発された同じｌｕｘオペロンベクター、すなわちＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢを使用して発光シグナルを自律的に生成する多能性間葉系幹細胞を操作する実験を実施した。
【0340】
最初に、の実施例１で詳しく説明したように、ｌｕｘＣＤＥＦ：ｌｕｘＡＢのモル比を１：１、１０：１、２０：１、３０：１、および４０：１という様々なものとしてｈＡＤＭＳＣ細胞で試験した。図２Ｂに示されるように、発光出力は、ｉＰＳＣで観察されたものとほぼ同じである２０：１～３０：１のモル比でピークに達した（比較のため図２Ｂを参照）。ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ細胞系統と同様に、この比率でのＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥＦとＣＢＡ－ｌｕｘＡＢとのゲノム統合により、自律発光を発現する安定したＭＳＣクローン株が生成された。ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の自己生物発光出力と集団サイズとの相関を評価するべく実施例２で説明した方法と同様の方法を使用したところ、自己生物発光ｈＡＤＭＳＣ細胞系統によって放出されるシグナルは、図１１に示されるように、細胞個数と同様に強く相関する（Ｒ２＝０．９８）ことが同様に見出された。従って、これらの結果は、細胞集団のサイズをレポートすることができる、ｈＡＤＭＳＣにおける連続的で外因性の基質に依存しない自己生成生物発光の光の発達を示す。
【0341】
次に、自律発光を発現するＭＳＣがインビボでイメージングされ得るかどうかを決定するべく実験を実施した。最初に、３つの異なる総量の自律発光ＭＳＣを調製した。これらの調製物を、ＦＩＧ．１２Ａ中に円で示される位置でＦＶＢ近交系マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。次に、麻酔下でマウスをイメージングした。得られた平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の倍率変化を、注入された総細胞個数に対してプロットした（図１２Ｂ）。（図１２Ｂ）に見られるように、ＭＳＣから放出される平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）は、注入された細胞個数（Ｒ２＝０．９９）と強く相関することが見出された。
【0342】
この結果は、重要な意味を持っている。第一に、ＭＳＣベースの自律発光をインビボ細胞イメージングに使用できることを示している。第二に、ＭＳＣベースの自律発光を使用してインビボで総細胞個数をモニタリングできることを示している。従って、マウスモデルでのこの試薬フリーのインビボイメージングは、繰り返しの針刺しなしでデータ取得を可能にすることにより、ストレス応答および注射部位の炎症に関する懸念を取り除く。さらに、この細胞系統は、非侵襲的な光学イメージングが動物の生涯にわたって継続的に発生することを可能にする。
【0343】
次に、自律的に生物発光するＭＳＣのインビボ細胞移動を追跡することができるかどうかを評価するための実験を実施した。最初に、２００万の自律発光ＭＳＣを、尾注射を介してＦＶＢマウスに送達した。次に、注射後１時間で、自律発光出力について背側の側面をイメージングした。自律発光シグナルは観測されなかった（図１３Ａ）。
【0344】
それにもかかわらず、肺における自律発光ＭＳＣの細胞蓄積は、犠牲および解剖の後に容易に検出可能であった（図１３Ｂ）。この結果は、インビボで深部組織（すなわち、肺）から浸透するのに十分に強いシグナルを生成しないにもかかわらず、自律発光ＭＳＣが循環系を通過して生き残り、肺への蓄積を明らかにしたことを示唆しており、これにより、自律発光ＭＳＣのインビボ細胞移動を追跡できることが示される。
【0345】
実施例５－ｌｕｘオペロンを用いたｉＰＳ細胞および心筋細胞における遺伝子発現モニタリング
ｌｕｘオペロンの発現は、その活性が全体的な自家生物発光出力に直接影響を与えるプロモータによって遺伝的に制御される。この特性は、以前はエストロゲン等のさまざまな化合物の存在を知らせるｌｕｘベースのバイオレポーターを生成するために活用されてきた。従って、ｌｕｘオペロンがｉＰＳ細胞で構成的に発現できることを確認した後、細胞生存率とは対照的に遺伝子発現の変化をレポートできるレポーターベースの遺伝子構成を開発するための実験が実施された。
ｌｕｘオペロンの発現は、その活性が全体的な自家生物発光出力に直接影響を与えるプロモータによって遺伝的に制御される。この特性は、以前はエストロゲン等のさまざまな化合物の存在を知らせるｌｕｘベースのバイオレポーターを生成するために活用されてきた。従って、ｌｕｘオペロンがｉＰＳ細胞で構成的に発現できることを確認した後、細胞生存率とは対照的に遺伝子発現の変化をレポートできるレポーターベースの遺伝子構成を開発するための実験が実施された。
【0346】
それにもかかわらず、ｌｕｘベースのバイオレポーターを開発するための従来方法は、幹細胞における遺伝子活性化イベントのレポーターとして機能するためのｌｕｘ発現シ幹細胞の採用には不十分であることが証明された。すなわち、レポーターベースの遺伝子構成に一般的に使用される利用可能なプロモータオプションは、有意な自家生物発光出力をもたらさなかった。実際、利用可能なプロモータオプションを使用すると、誘導後の自家生物発光出力はほとんどまたはまったく生じなかった。
【0347】
この予想外の問題は、幹細胞における自家生物発光遺伝子発現を制御するための合成遺伝子増幅回路を開発することによって克服された。この予想外の問題を、幹細胞における自己生物発光遺伝子発現を制御するための合成遺伝子増幅回路を開発することによって、克服した。この合成遺伝子増幅回路を開発するには、テトラサイクリンプロモータ（ドキシサイクリン応答性）を、ポリシストロンｌｕｘＣＤＡＢＥＦオペロン（ｔｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦと呼ばれる）の上流にクローニングし、ＣＢＡ駆動型トランス活性化因子（ｔＴＡ）を運ぶベクターまたはＣＢＡ駆動型逆トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を運ぶベクターのいずれかを使用して、ｉＰＳＣにゲノム的に共統合した（図１４）。
【0348】
ゲノムに組み込まれたｒｔＴＡ（ドキシサイクリン誘導性）を有するＴｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦＩＰＳＣを、量を増やしながらドキシサイクリンに４時間および２０時間曝した。ＭＳルミナイメージングシステムを使用して生物発光測定を実施した。バックグラウンドに対する結果として生じる平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の倍率変化を、対応するドキシサイクリンの線量に対してプロットした。図１５Ａに示されるように、細胞系統は、ドキシサイクリンに応答して自家生物発光誘導の明確なパターンを示したことから、遺伝子発現をモニタリングすることができるｌｕｘベースの幹細胞バイオレポーターの開発が確認された。
【0349】
対照的に、ゲノムに組み込まれたｔＴＡ（ドキシサイクリン抑制性）を有するＴｅｔ－ｌｕｘＣＤＡＢＥＦＩＰＳＣを、同様にして、増量しながらドキシサイクリンに曝した。ＭＳルミナイメージングシステムを使用して生物発光測定を実施した。バックグラウンドに対する結果として生じる平均放射発光（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の倍率変化を、対応するドキシサイクリンの線量に対してプロットした。得られたデータは、ドキシサイクリンへの曝露後に細胞系統の連続的な自家生物発光が遮断されたことを示した（図１５Ｂ）。
【0350】
さらに、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統と同様に、ルシフェリン産生部分（ｌｕｘＣＤＥｆｒｐ）の増幅により、ロバストな自己生物発光出力が得られる。再び、上述のように、アルデヒドルシフェリン成分の過剰産生は細胞毒性効果を有するか、または細胞代謝に悪影響を与えると予想されることから、この結果は完全に予想外である。
【0351】
さらに、テトラサイクリン抑制性細胞系統の長期培養（＞３ヶ月）は、野生型親系統と比較した成長率（非図示）への影響を明らかにせず、また、細胞は、この間、野生型多能性マーカー（図５Ｃ）と核型（図６Ｂ）の両方を保持していたことから、スプリットｌｕｘオペロンの統合が多能性を乱さなかったことが示唆される。
【0352】
これらのデータは、ポリシストロンルクスベースの自己生体発光がｉＰＳＣで可能であるが、強力な遺伝的誘導が必要とされることを示す。これらの結果はまた、ｌｕｘオペロンを使用して遺伝子発現をモニターできることを示しており、ここで、自己生物発光は遺伝子活性化の代用として機能する。最後に、図１６に示されているように、両方のｔｅｔ応答性ｉＰＳＣ系統は、心毒性をレポートできる心筋細胞に分化したときに、自家生物発光の発現が可能であった。
【0353】
これらのバイオレポーターは、シグナル開始の開始を決定するために自動化された方法で継続的にモニタリングすることができるので、これは非常に有利な開発である。さらに、ルシフェリンの追加を必要とするレポーターシステムとは異なり、ここでのシグナル生成は完全に自己生成される。すなわち、バイオレポーターは相互作用を必要とせずに継続的にモニタリングされ得る。従って、シグナルの持続時間および強度は、ルシフェリン処理の影響を考慮することなく、単一の試料から決定され得る。
【0354】
実施例６－心臓特異的ｌｕｘオペロン発現
ｌｕｘオペロンが遺伝子活性化イベントをレポートできることを確認した後、発現系が組織特異的発現のレポーターとして役立つことができるかどうかを決定するために実験を実施した。具体的には、組織特異的自家生物発光を発現するように設計されたｉＰＳＣ由来心筋細胞の開発が求められた。
ｌｕｘオペロンが遺伝子活性化イベントをレポートできることを確認した後、発現系が組織特異的発現のレポーターとして役立つことができるかどうかを決定するために実験を実施した。具体的には、組織特異的自家生物発光を発現するように設計されたｉＰＳＣ由来心筋細胞の開発が求められた。
【0355】
最初に、心臓組織特異的発現を可能にするべく、自家生物発光出力をＴＮＮＴ２プロモータにリンクさせた。ＴＮＮＴ２プロモータは、さまざまな光学イメージングおよび耐性マーカーを駆動できる心筋細胞特異的プロモータとして確立されている。
【0356】
次に、野生型ｉＰＳＣおよびｉＰＳＣ由来心筋細胞に、ＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥｆｒｐおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢ（構成的）またはＴＮＮＴ２－／ｕｘＡＳ（心臓特異的）のいずれかを、２０：１の比率で、一過性にトランスフェクトした。上で詳述したように、ｌｕｘＡＢとｌｕｘＣＤＥｆｒｐの予想外の最適な比率を固守するために、２０：１の比率で観測した。２４時間後、自家生物発光出力を測定した。
【0357】
最終的に、野生型ｉＰＳＣおよびＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥｆｒｐおよびＣＢＡ－ｌｕｘＡＢ（構成的）を共発現するｉＰＳＣ由来心筋細胞の両方で、自家生物発光が観察された（図１７）。さらに、ＴＮＮＴ２をｌｕｘＡＢの上流にクローニングして一過性にトランスフェクトさせた野生型ｉＰＳＣ由来心筋細胞でＣＢＡ－ｌｕｘＣＤＥｆｒｐと共発現させた場合、自家生物発光の発現が観測された。しかし、図１７に示されるように、ｉＰＳＣにトランスフェクトさせた場合、そのような自家生物発光発現は観測されなかった。ＴＮＮＴ２駆動の自己発光はＣＢＡ駆動の自己発光よりも約２．５（±０．５）倍少なく、ＴＮＮＴ２プロモータが心筋細胞のＣＢＡと同程度に活性化されていないことを示唆する。それにもかかわらず、これらのデータは依然として組織特異的自家生物発光の発現を示している。
【0358】
実施例７－組織特異的自家生物発光コンストラクトを使用した分化レポート。
組織特異的自家生物発光構築物が、分化レポートが可能であるかどうかを決定するために、２モジュール合成増幅回路を使用して自家生物発光発現を制御するカセットのバージョンを構築した。第１のモジュールは、ヒト脂肪組織特異的プロモータであるｈＡＰ２を使用して、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写因子の２つの転写モチーフとからなるＧａｌ４ｔｆ融合遺伝子の発現を制御する。第２のモジュールは、酵母上流活性化配列（ＵＡＳ）の５つのタンデムリピートと最小プロモータの制御下にあるｌｕｘＣＤＡＢＥＦ遺伝子とを含む。この２モジュール回路は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にトランスフェクトされ、安定的に選択された。このバージョンのカセットを発現する細胞は、脂肪組織への分化時にのみ自家生物発光生成を開始できるはずである。
組織特異的自家生物発光構築物が、分化レポートが可能であるかどうかを決定するために、２モジュール合成増幅回路を使用して自家生物発光発現を制御するカセットのバージョンを構築した。第１のモジュールは、ヒト脂肪組織特異的プロモータであるｈＡＰ２を使用して、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインと単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写因子の２つの転写モチーフとからなるＧａｌ４ｔｆ融合遺伝子の発現を制御する。第２のモジュールは、酵母上流活性化配列（ＵＡＳ）の５つのタンデムリピートと最小プロモータの制御下にあるｌｕｘＣＤＡＢＥＦ遺伝子とを含む。この２モジュール回路は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にトランスフェクトされ、安定的に選択された。このバージョンのカセットを発現する細胞は、脂肪組織への分化時にのみ自家生物発光生成を開始できるはずである。
【0359】
これを検証するために、親ＭＳＣ系統を脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞系統に分化させ、分化の前後の両方で自家生物発光出力を測定した。分化前の親ＭＳＣ系統からの測定された自家生物発光シグナルは、バックグラウンド光検出と同様であった（図１８）。分化後、標的脂肪細胞系統からの自家生物発光生成は、バックグラウンドより５．５９倍大きく、自家生物発光表現型の開始を示している。軟骨細胞または骨細胞分化細胞系統からの自家生物発光シグナルは存在しなかった（バックグラウンドに対してそれぞれ１．３１倍および１．３５倍）（図１８）。
【0360】
これらのデータにより、自家生物発光を使用して標的ＭＳＣから脂肪細胞への分化を追跡すること、および研究中の試料を混乱させる必要なしに分化追跡を示すためのその使用が実証される。
【0361】
実施例８－ＩＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ由来の心筋細胞は、自家生物発光表現型を維持する。
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統から分化した特殊な細胞が自家生物発光表現型を保存するかどうかを決定するために実験を実施した。ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の小分子標的心臓分化は、以前に記載されたように（ｐｕｂｍｅｄ ＩＤ２２６４５３４８）、ＣＨＩＲ９９０２１およびＩＷＰ－２／４を使用したＷｎｔシグナル伝達の時間的調節を介して実行された。これにより、自家生物発光性のＣＢＡ駆動のｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞が産生された（図１９Ａ）。この系統をＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦとして示した。
ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統から分化した特殊な細胞が自家生物発光表現型を保存するかどうかを決定するために実験を実施した。ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統の小分子標的心臓分化は、以前に記載されたように（ｐｕｂｍｅｄ ＩＤ２２６４５３４８）、ＣＨＩＲ９９０２１およびＩＷＰ－２／４を使用したＷｎｔシグナル伝達の時間的調節を介して実行された。これにより、自家生物発光性のＣＢＡ駆動のｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞が産生された（図１９Ａ）。この系統をＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦとして示した。
【0362】
次に、プレーティングされた細胞あたりの正規化された平均自家生物発光放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を、ＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦおよびＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦの両方について決定した。図１９Ｂに示されるように、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統とほぼ同様のレベルの自家生物発光を自家生物発光性ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ由来の心筋細胞により生成されることが観測された。
【0363】
これらの結果は、ｉＰＳＣ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が自家生物発光表現型を保つ心筋細胞に分化したことを示している。データは、自家生物発光表現型が細胞型の変化によって根本的に変化しないことを示している。このデータは、ｌｕｘオペロンを使用してｉＰＳＣ由来心筋細胞で試薬無しの生物発光を生成できることを示す。
【0364】
実施例９－自家生物発光ｉＰＳＣ由来心筋細胞を用いた継続的な心臓毒性モニタリング。
現在の心毒性スクリーニングの限界に対処するために（例えば、高コスト、破壊的なエンドポイントスタイルのアッセイの必要性等）、ドキソルビシンに応じた心毒性をレポートするためのＣＢＡ駆動のｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞の有用性を検証するべく実験を実施するとともに、それに関連して、上記細胞を使用することでドキソルビシン治療に応じたリアルタイムの継続的心毒性モニタリングを提供した。
現在の心毒性スクリーニングの限界に対処するために（例えば、高コスト、破壊的なエンドポイントスタイルのアッセイの必要性等）、ドキソルビシンに応じた心毒性をレポートするためのＣＢＡ駆動のｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞の有用性を検証するべく実験を実施するとともに、それに関連して、上記細胞を使用することでドキソルビシン治療に応じたリアルタイムの継続的心毒性モニタリングを提供した。
【0365】
最初に、ＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が、既知の心毒性化合物であるドキソルビシンに応答して心毒性をレポートできるかどうかを評価した。さまざまなドキソルビシン濃度でＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統を処理し、２４時間の処理後に自家生物発光出力を測定した。対照群と比較した平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の変化率を、対応するドキソルビシン（ｕＭ）処理に対してプロットした。結果は、心筋細胞からの自家生物発光が、線量と相関する強度の減少を示したことを示した（図１９Ｃ）。これらのデータは、ドキソルビシンに曝露されたｉＰＳＣ由来心筋細胞について以前にレポートされたものと同様の０．２９ｕＭドキソルビシンのＩＣ５０をもたらした（Ｐｕｂｍｅｄ ＩＤ２８２０２７７２）。従って、ＣＢＡ駆動のｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞は、ドキソルビシンに応答して心毒性を忠実にレポートした。
【0366】
第二に、ＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ系統が、長期間にわたるドキソルビシン治療に応答して、リアルタイムの継続的な心毒性モニタリングを提供できるかどうかを評価した。ＣＭ－ｌｕｘＡＢ／ＣＤＥＦ心筋細胞を３０時間継続的にモニターし、自家生物発光を１０分ごとに測定した。最初の５時間は、ベースラインシグナルを確立するために、治療なしで自家生物発光をモニターした。次に、５時間で、心筋細胞のサブセットに、心臓毒性物質のドキソルビシンの用量を増やしてチャレンジした（図２０Ａの白い矢印）。次の２５時間にわたって継続的に自己発光出力を測定した。
【0367】
データは、ドキソルビシンの濃度の増加が自家生物発光出力の減少をもたらしたことを示し、このことがリアルタイムで明らかになった（図２０Ａ）。連続データが明確に示している傾向は、異なる濃度が３０時間後にほぼ同じレベルの細胞の自家生物発光出力に分解されるにもかかわらず、高濃度のドキソルビシンが低用量よりも速く毒性効果を発揮するということである。この傾向は、同じ期間の２時間半の間隔を調べた場合でも明らかである（図２０Ｂ）。
【0368】
実験の時間経過にわたってＩＣ５０値を計算し、時間に対してプロットした。ＩＣ５０濃度の明らかな減少が時間経過にわたって観測された（図２０Ｃ）。このような結果は、ドキソルビシンのような既知の心毒性化合物に期待される。ただし、動的ＩＣ５０値によって提供されるのは任意の単一時点測定の前後関係である。従って、このデータにより、ＩＣ５０で測定される化合物の効果がいつ安定するかを判断できるため、毒性をより確実に評価することができる。ドキソルビシンの場合、３０時間近い曝露でこのことが発生した。このデータは、継続的に自家生物発光するｉＰＳＣ由来心筋細胞が、リアルタイムで長期的な毒性追跡を提供できることを示す。
例示的実施形態の一覧
実施形態１：外因性発光刺激剤の非存在下での発光シグナルを含む自己生物発光表現型を有する幹細胞。
実施形態２：実施形態１に記載の幹細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む、幹細胞。
実施形態３：１．実施形態１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸をさらに含む、幹細胞。
実施形態４：１．実施形態１～３のいずれに記載の幹細胞であって、
発光シグナルが構成的に放出される。
実施形態５：１．実施形態４に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態６：実施形態５に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸はそれぞれ、構成的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態７：実施形態５に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動する幹細胞。
実施形態８：実施形態７に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動する幹細胞。
実施形態９：自律発光表現型を有する幹細胞を生産するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを備える、キット。
実施形態１０：自律的かつ構成的な発光を有する幹細胞を作製するための方法であって、幹細胞を提供すること、ならびに、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを幹細胞にトランスフェクトすることを含む、方法。
実施形態１１：実施形態８または９のいずれか一項に記載の方法であって、
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに作動的に連結される、方法。
実施形態１２：実施形態８または９のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態１３：実施形態９～１２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つのベクターによる幹細胞のトランスフェクションの後に、幹細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
実施形態１４：少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズをリアルタイムにモニタリングする方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、
ならびに、
測定された構成的発光シグナルに基づいて、少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズを評価することを含む、方法。
実施形態１５：実施形態１３の方法であって、細胞集団サイズを２つ以上の時点にわたってトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態１６：少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、測定された構成的発酵シグナルにもとづいて少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
実施形態１７：実施形態１５の方法であって、２つ以上の時点にわたって少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態１８：実施形態１３～１６のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルの測定が少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率と相関する、方法。
実施形態１９：少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の効果を測定する方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させること、
少なくとも１つの幹細胞と薬剤との接触の後に、少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発酵シグナルに基づいて薬剤の効果を決定することを含む、方法。
実施形態２０：実施形態１８の方法であって、２つ以上の時点にわたって薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態２１：実施形態１８または１９のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞が構成的発光シグナルの生成を停止するとき、薬剤が少なくとも１つの幹細胞にとって致命的であると判断する、方法。
実施形態２２：実施形態１３～２０のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態２３：実施形態２１の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
実施形態２４：実施形態２２の方法であって、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
実施形態２５：実施形態２１の方法であって、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
実施形態２６：実施形態２４の方法であって、薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
実施形態２７：実施形態１８～２５のいずれか一項に記載の方法であって、薬剤が創薬に関して評価される、方法。
実施形態２８：実施形態１３～２６のいずれか一項に記載の方法であって、該方法が高スループットで実行される、方法。
実施形態２９：少なくとも１つの幹細胞を薬剤フリー・インビボイメージングするための方法であって、
外因的に添加された基質の非存在下で、構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞を生物に注入すること、ならびに、
該生物の少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルをイメージングすることを含む、方法。
実施形態３０：実施形態２８の方法において、
構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、測定された構成的発光シグナルに基づいてインビボで存在する少なくとも１つの幹細胞の総数を決定することをさらに含む、方法。
実施形態３１：実施形態２８または２９のいずれか一項に記載の方法において、
生物には動物が含まれ、少なくとも１つの幹細胞が生物に静脈内、皮内、または皮下注入される、方法。
実施形態３２：実施形態３０の方法であって、少なくとも１つの幹細胞が動物に注入された後、動物内の少なくとも１つの幹細胞の動きをトラッキングすることをさらに含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３３：実施形態２８～３１のいずれか一項に記載の方法であって、
外因的に添加された基質がアルデヒド官能基を含む、方法。
実施形態３４：実施形態１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞は、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態３５：実施形態１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞は、
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、
およびフラビンレダクターゼ核酸を含む第６のベクターを含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに作動的に連結される、方法。
実施形態３６：実施形態１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、
発光シグナルが組織特異的である、幹細胞。
実施形態３７：実施形態３６の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態３８：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成する方法であって、
幹細胞を提供すること、ならびに、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動する、方法。
実施形態３９：実施形態３６～３７のいずれか一項に記載の幹細胞であって、組織特異的プロモータを発現する組織細胞へ幹細胞が分化する場合、組織特異的細胞はｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し、かつ自律発光シグナルを放出する、幹細胞。
実施形態４０：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を用いるリアルタイム分化報告の方法であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含む、
少なくとも１つの幹細胞を提供することを含み、
核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動しており、また、
組織特異的プロモータが発現される少なくとも１つの組織細胞に少なくとも１つの幹細胞が分化する場合、少なくとも１つの組織細胞は発光シグナルを放出し、さらに、
発光シグナルが放出されるとき、組織細胞から放出される発光シグナルを測定して、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化をトラッキングする、方法。
実施形態４１：実施形態３９の方法であって、２つ以上の時点にわたって、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態４２：実施形態３９または４０のいずれか一項に記載の方法であって、
発酵シグナルの放出は、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化の開始を報告する、方法。
実施形態４３：実施形態３９～４１のいずれか一項に記載の方法であって、発光シグナルの測定に基づいて少なくとも１つの組織細胞の総数を評価することをさらに含む、方法。
実施形態４４：実施形態３９～４２のいずれか一項に記載の方法であって、発光シグナルの測定に基づいて、少なくとも１つの組織細胞に分化した少なくとも１つの幹細胞を決定することをさらに含む、方法。
実施形態４５：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成するキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動する、キット。
実施形態４６：実施形態３６～４４に記載の幹細胞またはキットであって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が組織特異的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、幹細胞またはキット。
実施形態４７：実施形態３６～４４のいずれか一項に記載の幹細胞またはキットであって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が組織特異的プロモータに連動する、幹細胞またはキット。
実施形態４８：実施形態３６～４７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
組織特異的プロモータは、ＴＮＮプロモータを含む、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態４９：実施形態３６～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
組織細胞または少なくとも１つの組織細胞は、心筋細胞を含む、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５０：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５１：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、 ｌｕｘＡ核酸 ａｎｄ ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５２：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸、およびｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５３：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５４：実施形態１～２のいずれか一項の幹細胞であって、発光シグナルが分析物に反応する、幹細胞。
実施形態５５：実施形態５３の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動する、幹細胞。
実施形態５６：実施形態５４の幹細胞であって、
幹細胞は、分析物に曝露されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子をさらに含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つの転写を引き起こす、幹細胞。
実施形態５７：実施形態５４に記載の幹細胞であって、
幹細胞は、分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子をさらに含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つの非転写をもたらす、幹細胞。
実施形態５８：分析物の存在下で自律誘導性発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、
幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすること、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすることを含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
実施形態５９：分析物の存在下で、自律的かつ抑制的な発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、
幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすること、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすることを含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
実施形態６０：少なくとも１つの幹細胞での遺伝子発現をモニタリングする方法であって、
実施形態５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の幹細胞の少なくとも１つを生成すること、少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させること、ならびに、
少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させた後に少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすることを含む、方法。
実施形態６１：実施形態５９に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定することをさらに含む、方法。
実施形態６２：実施形態５９または６０のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの幹細胞から放出された発光シグナルの測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することによって、遺伝子発現を評価することをさらに含む、方法。
実施形態６３：試料中の分析物の存在を決定する方法であって、
実施形態５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の幹細胞の少なくとも１つを生成すること、
少なくとも１つの幹細胞を試料に接触させること、
少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させた後に少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすること、ならびに、
発光シグナルの測定に基づいて、試料中の分析物の存在を評価することを含む、方法。
実施形態６４：実施形態６２の方法であって、少なくとも１つの幹細胞から放出された発光シグナルの測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態６５：分析物によって誘導的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
実施形態６６：分析物によって抑制的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
実施形態６７：実施形態５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答エレメントを含み、好ましくは、分析物は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンの類似体を含む、方法。
実施形態６８：実施形態５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、少なくとも１の分析物応答性トランス活性化因または少なくとも１の分析物応答性逆トランス活性化因子は、構成的プロモータに連動し、好ましくは、構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態６９：実施形態５４～６７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動しないｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、構成的プロモータに連動する。
実施形態７０：幹細胞由来の自律発光細胞であって、
自律発光幹細胞から分化した自律発光真核細胞を含み、分化した自律発光真核細胞と自律発光幹細胞とはどちらも、外因性発光刺激因子の非存在下で構成的発光シグナルを発現する、幹細胞由来の自律発光細胞。
実施形態７１：自律発光幹細胞から幹細胞由来の自律発光細胞を生成する方法であって、
自律発光幹細胞を構築すること、ならびに、
自律発光幹細胞を幹細胞由来の自律発光細胞に分化させることを含み、幹細胞由来の自律発光細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で発光シグナルを放出する、方法。
実施形態７２：実施形態７０の方法であって、分化が小分子方法によって実行される、方法。
実施形態７３：自律発光細胞から誘導された少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を提供すること、
少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発光シグナルにもとづいて、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
実施形態７４：実施形態７２に記載の方法であって、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率を２つ以上の時点にわたって追跡することをさらに含む、方法。
実施形態７５：実施形態７２または７３のいずれか一項に記載の方法であって、構成的発光シグナルの測定は、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率と相関する、方法。
実施形態７６：少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞における薬剤の効果を決定する方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を薬剤に接触させること、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を薬剤に曝した後に少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発酵シグナルにもとづいて薬剤の効果を決定することを含む、方法。
実施形態７７：実施形態７５に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態７８：実施形態７６の方法であって、薬剤の効果が安定する時点を決定することをさらに含む、方法。
実施形態７９：実施形態７５～７７のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞が構成的発光シグナルの生成を停止したとき、薬剤が少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞にとって致命的であると決定する、方法。
実施形態８０：実施形態７２～７８のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出された構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態８１：実施形態７９に記載の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少は、薬剤に曝すことに起因する少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
実施形態８２：実施形態７９に記載の方法であって、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
実施形態８３：実施形態７９に記載の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、薬剤に曝すことに起因する少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
実施形態８４：実施形態８２に記載の方法であって、
薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
実施形態８５：実施形態６９～８２のいずれか一項に記載の自律発光細胞または方法であって、
自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに連動し、さらに、自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
実施形態８６：実施形態８４に記載の自律発光細胞または方法であって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態８７：実施形態８４に記載の自律発光細胞または方法であって、
少なくとも１つのベクター
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数は、構成的プロモータに連動する、自律発光細胞または方法。
実施形態８８：実施形態１～８６のいずれか一項に記載の自律発光細胞であって、
幹細胞由来の自律発光細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターを発現することで、幹細胞由来の自律発光細胞が外因性発光刺激因子の非存在下で発光する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
実施形態８９：実施形態１～８７のいずれか一項に記載の自律発光細胞であって、
ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
実施形態９０：実施形態１～８８のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の２０倍から３０倍の範囲である。
実施形態９１：実施形態１～８９のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）の対応する核酸と８０％を超える配列同一性を有する。
実施形態９２：実施形態１～９０のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンスの対応する核酸と１００％の配列同一性を有する。
実施形態９３：実施形態１～９１のいずれか一項に記載の幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写を介して発光シグナルを放出する。
実施形態９４：実施形態１～９２のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の転写量の１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態９５：実施形態１～９３のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の転写量の２０倍から３０倍の範囲である。
実施形態９６：実施形態１～９４のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の１０倍から４０倍の総量で存在する。
実施形態９７：実施形態１～９５のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の２０倍から３０倍の総量で存在する。
実施形態９８：実施形態１～９６のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む。
実施形態９９：実施形態１～９７のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する。
実施形態１００：実施形態１～９８のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態１０１：実施形態１～９９のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成レベルの１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態１０２：実施形態１～１００のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在する。
実施形態１０３：実施形態１～１０１のいずれか一項に記載、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総レベルの１０倍から４０倍の総レベルで存在する。
実施形態１０４：実施形態１～１０２のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総レベルの２０倍から３０倍の総レベルで存在する。
実施形態１０５：実施形態１～１０３のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを含む幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で自律的に発光する。
実施形態１０６：実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである。
実施形態１０７：実施形態１～１０５のいずれか一項に記載の第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである。
実施形態１０８：実施形態１～１０６のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つのリンカーに連動する。
実施形態１０９：実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのリンカー領域はウイルス２Ａペプチドを含む。
実施形態１１０：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、殺虫剤、除草剤、または肥料を含む。
実施形態１１１：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、または非胚性幹細胞である。
実施形態１１２：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の外因性発光刺激因子は蛍光刺激シグナルである。
実施形態１１３：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の外因性発光刺激因子は化学発光因子であり、好ましくは、化学発光因子は、アルデヒド官能基を含む。
例示的実施形態の一覧
実施形態１：外因性発光刺激剤の非存在下での発光シグナルを含む自己生物発光表現型を有する幹細胞。
実施形態２：実施形態１に記載の幹細胞であって、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む、幹細胞。
実施形態３：１．実施形態１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸をさらに含む、幹細胞。
実施形態４：１．実施形態１～３のいずれに記載の幹細胞であって、
発光シグナルが構成的に放出される。
実施形態５：１．実施形態４に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つの構成的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態６：実施形態５に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸はそれぞれ、構成的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態７：実施形態５に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸は、第１の構成的プロモータに連動する幹細胞。
実施形態８：実施形態７に記載の幹細胞であって、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、第２の構成的プロモータに連動する幹細胞。
実施形態９：自律発光表現型を有する幹細胞を生産するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを備える、キット。
実施形態１０：自律的かつ構成的な発光を有する幹細胞を作製するための方法であって、幹細胞を提供すること、ならびに、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを幹細胞にトランスフェクトすることを含む、方法。
実施形態１１：実施形態８または９のいずれか一項に記載の方法であって、
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに作動的に連結される、方法。
実施形態１２：実施形態８または９のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態１３：実施形態９～１２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つのベクターによる幹細胞のトランスフェクションの後に、幹細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
実施形態１４：少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズをリアルタイムにモニタリングする方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、
ならびに、
測定された構成的発光シグナルに基づいて、少なくとも１つの幹細胞の細胞集団サイズを評価することを含む、方法。
実施形態１５：実施形態１３の方法であって、細胞集団サイズを２つ以上の時点にわたってトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態１６：少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、測定された構成的発酵シグナルにもとづいて少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
実施形態１７：実施形態１５の方法であって、２つ以上の時点にわたって少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態１８：実施形態１３～１６のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルの測定が少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率と相関する、方法。
実施形態１９：少なくとも１つの幹細胞に対する薬剤の効果を測定する方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞を薬剤と接触させること、
少なくとも１つの幹細胞と薬剤との接触の後に、少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発酵シグナルに基づいて薬剤の効果を決定することを含む、方法。
実施形態２０：実施形態１８の方法であって、２つ以上の時点にわたって薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態２１：実施形態１８または１９のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞が構成的発光シグナルの生成を停止するとき、薬剤が少なくとも１つの幹細胞にとって致命的であると判断する、方法。
実施形態２２：実施形態１３～２０のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞から放出された構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態２３：実施形態２１の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
実施形態２４：実施形態２２の方法であって、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
実施形態２５：実施形態２１の方法であって、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
実施形態２６：実施形態２４の方法であって、薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
実施形態２７：実施形態１８～２５のいずれか一項に記載の方法であって、薬剤が創薬に関して評価される、方法。
実施形態２８：実施形態１３～２６のいずれか一項に記載の方法であって、該方法が高スループットで実行される、方法。
実施形態２９：少なくとも１つの幹細胞を薬剤フリー・インビボイメージングするための方法であって、
外因的に添加された基質の非存在下で、構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞を生物に注入すること、ならびに、
該生物の少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルをイメージングすることを含む、方法。
実施形態３０：実施形態２８の方法において、
構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、測定された構成的発光シグナルに基づいてインビボで存在する少なくとも１つの幹細胞の総数を決定することをさらに含む、方法。
実施形態３１：実施形態２８または２９のいずれか一項に記載の方法において、
生物には動物が含まれ、少なくとも１つの幹細胞が生物に静脈内、皮内、または皮下注入される、方法。
実施形態３２：実施形態３０の方法であって、少なくとも１つの幹細胞が動物に注入された後、動物内の少なくとも１つの幹細胞の動きをトラッキングすることをさらに含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３３：実施形態２８～３１のいずれか一項に記載の方法であって、
外因的に添加された基質がアルデヒド官能基を含む、方法。
実施形態３４：実施形態１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞は、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態３５：実施形態１３～３２のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞は、
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、
およびフラビンレダクターゼ核酸を含む第６のベクターを含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が構成的プロモータに作動的に連結される、方法。
実施形態３６：実施形態１～２のいずれか一項に記載の幹細胞であって、
発光シグナルが組織特異的である、幹細胞。
実施形態３７：実施形態３６の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに連動する、幹細胞。
実施形態３８：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成する方法であって、
幹細胞を提供すること、ならびに、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をトランスフェクトすることを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動する、方法。
実施形態３９：実施形態３６～３７のいずれか一項に記載の幹細胞であって、組織特異的プロモータを発現する組織細胞へ幹細胞が分化する場合、組織特異的細胞はｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現し、かつ自律発光シグナルを放出する、幹細胞。
実施形態４０：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む少なくとも１つの幹細胞を用いるリアルタイム分化報告の方法であって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含む、
少なくとも１つの幹細胞を提供することを含み、
核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動しており、また、
組織特異的プロモータが発現される少なくとも１つの組織細胞に少なくとも１つの幹細胞が分化する場合、少なくとも１つの組織細胞は発光シグナルを放出し、さらに、
発光シグナルが放出されるとき、組織細胞から放出される発光シグナルを測定して、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化をトラッキングする、方法。
実施形態４１：実施形態３９の方法であって、２つ以上の時点にわたって、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態４２：実施形態３９または４０のいずれか一項に記載の方法であって、
発酵シグナルの放出は、少なくとも１つの組織細胞への少なくとも１つの幹細胞の分化の開始を報告する、方法。
実施形態４３：実施形態３９～４１のいずれか一項に記載の方法であって、発光シグナルの測定に基づいて少なくとも１つの組織細胞の総数を評価することをさらに含む、方法。
実施形態４４：実施形態３９～４２のいずれか一項に記載の方法であって、発光シグナルの測定に基づいて、少なくとも１つの組織細胞に分化した少なくとも１つの幹細胞を決定することをさらに含む、方法。
実施形態４５：組織特異的シグナルを含む自律発光表現型を含む幹細胞を生成するキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、核酸の少なくとも１つが組織特異的プロモータに対して連動する、キット。
実施形態４６：実施形態３６～４４に記載の幹細胞またはキットであって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が組織特異的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、幹細胞またはキット。
実施形態４７：実施形態３６～４４のいずれか一項に記載の幹細胞またはキットであって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数が組織特異的プロモータに連動する、幹細胞またはキット。
実施形態４８：実施形態３６～４７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
組織特異的プロモータは、ＴＮＮプロモータを含む、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態４９：実施形態３６～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
組織細胞または少なくとも１つの組織細胞は、心筋細胞を含む、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５０：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５１：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、 ｌｕｘＡ核酸 ａｎｄ ｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５２：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸、およびｌｕｘＢ核酸含むトランスフェクトされたベクターの総量の１０倍から４０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５３：実施形態１０～４８のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含むトランスフェクトされたベクターの総量の２０倍から３０倍の量で存在する、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態５４：実施形態１～２のいずれか一項の幹細胞であって、発光シグナルが分析物に反応する、幹細胞。
実施形態５５：実施形態５３の幹細胞であって、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動する、幹細胞。
実施形態５６：実施形態５４の幹細胞であって、
幹細胞は、分析物に曝露されると、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子をさらに含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つの転写を引き起こす、幹細胞。
実施形態５７：実施形態５４に記載の幹細胞であって、
幹細胞は、分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性トランス活性化因子をさらに含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つの非転写をもたらす、幹細胞。
実施形態５８：分析物の存在下で自律誘導性発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、
幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすること、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすることを含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
実施形態５９：分析物の存在下で、自律的かつ抑制的な発光シグナルを放出するように構成された幹細胞を構築する方法であって、
幹細胞を提供すること、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすること、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターにより幹細胞をコトランスフェクトすることを含み、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントの活性化は少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動する、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つの転写を引き起こす、方法。
実施形態６０：少なくとも１つの幹細胞での遺伝子発現をモニタリングする方法であって、
実施形態５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の幹細胞の少なくとも１つを生成すること、少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させること、ならびに、
少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させた後に少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすることを含む、方法。
実施形態６１：実施形態５９に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定することをさらに含む、方法。
実施形態６２：実施形態５９または６０のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの幹細胞から放出された発光シグナルの測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することによって、遺伝子発現を評価することをさらに含む、方法。
実施形態６３：試料中の分析物の存在を決定する方法であって、
実施形態５３、５４、５５、または５６のいずれか一項に記載の幹細胞の少なくとも１つを生成すること、
少なくとも１つの幹細胞を試料に接触させること、
少なくとも１つの幹細胞を分析物と接触させた後に少なくとも１つの幹細胞から放出される発光シグナルを測定して、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の発現をモニターすること、ならびに、
発光シグナルの測定に基づいて、試料中の分析物の存在を評価することを含む、方法。
実施形態６４：実施形態６２の方法であって、少なくとも１つの幹細胞から放出された発光シグナルの測定を、対照集団から放出される発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態６５：分析物によって誘導的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化する、少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
実施形態６６：分析物によって抑制的な自律発光シグナルを放出する幹細胞を生成するためのキットであって、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つが分析物応答性応答エレメントに連動するものであり、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含む少なくとも１つのベクターと、ならびに、
分析物に曝されると少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントを活性化しない少なくとも１つの分析物応答性逆トランス活性化因子を含む第２のベクターとを含む、キット。
実施形態６７：実施形態５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントは、テトラサイクリン応答エレメントを含み、好ましくは、分析物は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンの類似体を含む、方法。
実施形態６８：実施形態５４～６５のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、少なくとも１の分析物応答性トランス活性化因または少なくとも１の分析物応答性逆トランス活性化因子は、構成的プロモータに連動し、好ましくは、構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである、幹細胞、方法、またはキット。
実施形態６９：実施形態５４～６７のいずれか一項に記載の幹細胞、方法、またはキットであって、
少なくとも１つの分析物応答性応答エレメントに連動しないｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、構成的プロモータに連動する。
実施形態７０：幹細胞由来の自律発光細胞であって、
自律発光幹細胞から分化した自律発光真核細胞を含み、分化した自律発光真核細胞と自律発光幹細胞とはどちらも、外因性発光刺激因子の非存在下で構成的発光シグナルを発現する、幹細胞由来の自律発光細胞。
実施形態７１：自律発光幹細胞から幹細胞由来の自律発光細胞を生成する方法であって、
自律発光幹細胞を構築すること、ならびに、
自律発光幹細胞を幹細胞由来の自律発光細胞に分化させることを含み、幹細胞由来の自律発光細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で発光シグナルを放出する、方法。
実施形態７２：実施形態７０の方法であって、分化が小分子方法によって実行される、方法。
実施形態７３：自律発光細胞から誘導された少なくとも１つの幹細胞の細胞生存率をリアルタイムでモニタリングする方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を提供すること、
少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出された構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発光シグナルにもとづいて、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率を評価することを含む、方法。
実施形態７４：実施形態７２に記載の方法であって、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率を２つ以上の時点にわたって追跡することをさらに含む、方法。
実施形態７５：実施形態７２または７３のいずれか一項に記載の方法であって、構成的発光シグナルの測定は、少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率と相関する、方法。
実施形態７６：少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞における薬剤の効果を決定する方法であって、
構成的発光シグナルを生成するために少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を操作すること、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を薬剤に接触させること、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞を薬剤に曝した後に少なくとも１つの幹細胞から放出される構成的発光シグナルを測定すること、ならびに、
測定された構成的発酵シグナルにもとづいて薬剤の効果を決定することを含む、方法。
実施形態７７：実施形態７５に記載の方法であって、２つ以上の時点にわたって薬剤の効果をトラッキングすることをさらに含む、方法。
実施形態７８：実施形態７６の方法であって、薬剤の効果が安定する時点を決定することをさらに含む、方法。
実施形態７９：実施形態７５～７７のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞が構成的発光シグナルの生成を停止したとき、薬剤が少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞にとって致命的であると決定する、方法。
実施形態８０：実施形態７２～７８のいずれか一項に記載の方法であって、
少なくとも１つの幹細胞由来自律発光細胞から放出された構成的発光シグナルの測定を、対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較することをさらに含む、方法。
実施形態８１：実施形態７９に記載の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの減少は、薬剤に曝すことに起因する少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率の負の変化を示す、方法。
実施形態８２：実施形態７９に記載の方法であって、薬剤の効果が細胞毒性であることを決定する、方法。
実施形態８３：実施形態７９に記載の方法であって、
対照集団から放出される構成的発光シグナルと比較した少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞から放出される測定された構成的発光シグナルの増加は、薬剤に曝すことに起因する少なくとも１つの幹細胞由来の自律発光細胞の細胞生存率の正の変化を示す、方法。
実施形態８４：実施形態８２に記載の方法であって、
薬剤の効果が治療的であることを決定する、方法。
実施形態８５：実施形態６９～８２のいずれか一項に記載の自律発光細胞または方法であって、
自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのベクターを含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸は、少なくとも１つの構成的プロモータに連動し、さらに、自律発光幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する、方法。
実施形態８６：実施形態８４に記載の自律発光細胞または方法であって、
少なくとも１つのベクターは、
ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸を含み、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸が第１の構成的プロモータに連動する、第１のベクターと
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸が第２の構成的プロモータに連動する、第２のベクターと、を含む、方法。
実施形態８７：実施形態８４に記載の自律発光細胞または方法であって、
少なくとも１つのベクター
ｌｕｘＡ核酸を含む第１のベクター、
ｌｕｘＢ核酸を含む第２のベクター、
ｌｕｘＣ核酸を含む第３のベクター、
ｌｕｘＤ核酸を含む第４のベクター、
ｌｕｘＥ核酸を含む第５のベクター、および
フラビンレダクターゼ核酸を含み、
ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の１つまたは複数は、構成的プロモータに連動する、自律発光細胞または方法。
実施形態８８：実施形態１～８６のいずれか一項に記載の自律発光細胞であって、
幹細胞由来の自律発光細胞がｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターを発現することで、幹細胞由来の自律発光細胞が外因性発光刺激因子の非存在下で発光する、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
実施形態８９：実施形態１～８７のいずれか一項に記載の自律発光細胞であって、
ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である、幹細胞、方法、キット、または自律発光細胞。
実施形態９０：実施形態１～８８のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の２０倍から３０倍の範囲である。
実施形態９１：実施形態１～８９のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）の対応する核酸と８０％を超える配列同一性を有する。
実施形態９２：実施形態１～９０のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥのそれぞれをコードする１つまたは複数の核酸は、フォトラブダス・ルミネッセンスの対応する核酸と１００％の配列同一性を有する。
実施形態９３：実施形態１～９１のいずれか一項に記載の幹細胞は、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写を介して発光シグナルを放出する。
実施形態９４：実施形態１～９２のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の転写量の１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態９５：実施形態１～９３のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の転写量は、ｌｕｘＡ核酸およびｌｕｘＢ核酸の転写量の２０倍から３０倍の範囲である。
実施形態９６：実施形態１～９４のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の１０倍から４０倍の総量で存在する。
実施形態９７：実施形態１～９５のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼのそれぞれをコードする核酸は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする核酸の総量の２０倍から３０倍の総量で存在する。
実施形態９８：実施形態１～９６のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼをさらに含む。
実施形態９９：実施形態１～９７のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを発現する。
実施形態１００：実施形態１～９８のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成量の１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態１０１：実施形態１～９９のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの総生成量は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総生成レベルの１０倍から４０倍の範囲である。
実施形態１０２：実施形態１～１００のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼの少なくとも１つは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの少なくとも１つのレベルよりも高いレベルで存在する。
実施形態１０３：実施形態１～１０１のいずれか一項に記載、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総レベルの１０倍から４０倍の総レベルで存在する。
実施形態１０４：実施形態１～１０２のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの総レベルの２０倍から３０倍の総レベルで存在する。
実施形態１０５：実施形態１～１０３のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、ｌｕｘＥ、およびフラビンレダクターゼを含む幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、外因性発光刺激因子の非存在下で自律的に発光する。
実施形態１０６：実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである。
実施形態１０７：実施形態１～１０５のいずれか一項に記載の第１の構成的プロモータおよび第２の構成的プロモータはニワトリベータアクチンプロモータである。
実施形態１０８：実施形態１～１０６のいずれか一項に記載の、ｌｕｘＡ核酸、ｌｕｘＢ核酸、ｌｕｘＣ核酸、ｌｕｘＤ核酸、ｌｕｘＥ核酸、およびフラビンレダクターゼ核酸の少なくとも１つは、少なくとも１つのリンカーに連動する。
実施形態１０９：実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのリンカー領域はウイルス２Ａペプチドを含む。
実施形態１１０：実施形態１～１０８のいずれか一項に記載の薬剤は、化学療法剤、抗生物質、殺虫剤、殺虫剤、除草剤、または肥料を含む。
実施形態１１１：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の幹細胞または少なくとも１つの幹細胞は、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、または非胚性幹細胞である。
実施形態１１２：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の外因性発光刺激因子は蛍光刺激シグナルである。
実施形態１１３：実施形態１～１１０のいずれか一項に記載の外因性発光刺激因子は化学発光因子であり、好ましくは、化学発光因子は、アルデヒド官能基を含む。
【0369】
前述の説明は、本開示のプロセス、製造、物質の組成、および他の教示を例示および説明する。さらに、本開示は、開示されたプロセス、製造、物質の組成、および他の教示の特定の実施形態のみを示し説明しているが、本開示の教示は、他の様々な組み合わせ、修正、および環境で使用することができること、ならびに、関連技術において通常の技能を有する人の技能および／または知識に見合った、本明細書で発現される教示の範囲内での変更または修正が可能であることを、理解されたい。ここで記述された実施形態はさらに、本開示のプロセス、製造、物質の組成、および他の教示を実施することが知られている特定の最良のモードを説明すること、ならびに、当業者が、そのような、または他の実施形態において、特定の用途または使用によって必要とされる様々な修正を伴って、本開示の教示を利用できるようにすることを、意図している。従って、本開示のプロセス、製造、組成物、および他の教示は、本明細書に開示される正確な実施形態および例を限定することを意図するものではない。本明細書中の各セクションの見出しは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７７の提案との一貫性を保つため、または組織的列（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌ ｑｕｅｕｅｓ）を提供するためにのみ提供され、そうでなければ、これらの見出しは、本明細書中に示される（複数の）発明を制限せず或いは特徴付けない。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】