特表 2022-535881 精製されたダブルネガティブＴ細胞およびその調製と応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-10

(54)【発明の名称】精製されたダブルネガティブＴ細胞およびその調製と応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20220803BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220803BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 11/14 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20220803BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220803BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 A

C12N5/0783

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/06

A61P37/08

A61P11/06

A61P11/14

A61P3/00

A61P9/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021572346

(86)(22)【出願日】2020-04-28

(85)【翻訳文提出日】2022-02-03

(86)【国際出願番号】 CN2020087606

(87)【国際公開番号】W WO2020244345

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】201910483156.2

(32)【優先日】2019-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521530299

【氏名又は名称】北京医明佳和生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲棟▼

(72)【発明者】

【氏名】朱 彦兵

(72)【発明者】

【氏名】▲楊▼ ▲ル▼

(72)【発明者】

【氏名】田 丹

(72)【発明者】

【氏名】王 ▲ソン▼

(72)【発明者】

【氏名】▲孫▼ ▲廣▼永

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA62

4C087ZB08

4C087ZB13

4C087ZB26

4C087ZB32

4C087ZC21

(57)【要約】

ＩＬ－１７分泌細胞が除去されたＤＮＴ細胞集団およびその調製方法およびその使用が提供される。当該ＤＮＴ細胞集団は、Ｔ細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する効果を有し、脂肪組織の炎症を阻害し、インスリン抵抗性を改善し、糖尿病を軽減し、脂肪性肝炎を緩和することができ、抗原特異的アレルギー性喘息の予防および治療にも使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞製剤であって、
前記細胞製剤は、ＤＮＴ細胞集団を含み、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上、好ましくは、９８％以上、より好ましくは、９９％以上、最も好ましくは、９９．９％以上を占める細胞は、ＩＬ－１７を分泌および発現しないことを特徴とする、前記細胞製剤。

【請求項2】

前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上を占める細胞は、表面抗原ＣＤ３＋およびＴＣＲαβを有することを特徴とする
請求項１に記載の細胞製剤。

【請求項3】

前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の５０％以上を占める細胞は、ＬＡＧ３遺伝子を高発現することを特徴とする
請求項１に記載の細胞製剤。

【請求項4】

請求項１に記載の細胞製剤を調製するための方法であって、
前記方法は、
（ａ）単核細胞集団（ＰＢＭＣｓ）を提供し、選別によってＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得る段階と、
（ｂ）第１の細胞亜集団からＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去した後、それらを増殖および培養することにより、第２の細胞亜集団を得る段階、または
第１の細胞亜集団を増殖および培養した後、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去することにより、第２の細胞亜集団を得る段階と、
（ｃ）選択可能に、第２の細胞亜集団内のＤＮＴ細胞をさらに選別することにより、第３の細胞亜集団を得る段階と、
（ｄ）第２のまたは第３の細胞亜集団を適切なベクターと混合することにより、請求項１に記載の細胞製剤を得る段階とを含むことを特徴とする、前記方法。

【請求項5】

段階（ａ）において、単核細胞集団内のＢ細胞、ＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、１型ＮＫＴおよび２型ＮＫＴ細胞を除去することにより、ＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得ることを特徴とする
請求項４に記載の方法。

【請求項6】

段階（ｂ）において、グループＡの発現タンパク質から選択される一つまたは複数の抗体を使用して、培養前にＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去し、ここで、グループＡは、Ｓ１００ａ６、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＣＸＣＲ６、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、ＡＣＴＮ２、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７（ＩＬ７ｒ）、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｈｋ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、Ｌｙ６ａ、ＢＬＫ、Ｌｓｐ１、Ｌｙ６ｅ、Ｉｔｇｂ７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｓ１００ａ１０、Ｌｙ６ｇ５ｂ、Ｔｈｙ１、ＣＤ４０Ｉｇ、Ｒａｍｐ３、Ｇｍ２ａまたはその組み合わせを含み、
好ましくは、グループＡは、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒまたはその組み合わせであることを特徴とする
請求項４に記載の方法。

【請求項7】

段階（ｂ）において、グループＢの発現タンパク質から選択される一つまたは複数の抗体を使用して、培養後にシステムからＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去し、ここで、グループＢは、ＩＬ－１７ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｔｎｆｒｓｆ４、ＡＡ４６７１９７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｔｈｙ１、Ｉｇｔｐ、Ａｒｌ６ｉｐ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｌｔｂ、Ｔｎｆｒｓｆ２５、Ｆｕｒｉｎ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｉｆｉ２７ｌ２ａ、Ｇｂｐ２、Ｅｍｐ３、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｔｓｐｏ、Ｃｓｔ３、Ｖｉｍ、ＣＤ２００またはその組み合わせを含み、
好ましくは、グループＢは、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｔｎｆｒｓｆ４、またはその組み合わせであることを特徴とする
請求項４に記載の方法。

【請求項8】

段階（ｂ）において、抗原提示細胞および／または抗原ペプチドの存在条件下で増殖培養することを特徴とする
請求項４に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載の細胞製剤の用途であって、
医薬組成物の調製に使用され、前記医薬組成物は、
腫瘍、感染性疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギー性喘息、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、脳卒中、またはその組み合わせからなる群から選択される疾患の治療に使用されることを特徴とする、前記用途。

【請求項10】

医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、請求項４に記載の方法によって調製された細胞製剤、および薬学的に許容されるベクター、希釈剤または賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医薬の分野に関し、より具体的には、精製されたダブルネガティブＴ細胞およびその調製と応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ダブルネガティブＴ細胞（Ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＤＮＴ細胞）は、表現型が独特なＴＣＲαβ＋Ｔリンパ球であり、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ等の細胞の特徴的な表面マーカーを発現しない。ＤＮＴ細胞は、ヒト、マウスの末梢血およびリンパ器官で総Ｔリンパ球の１％～３％しか占めていないが、ますます多くの研究では、このようなまれなＴ細胞集団が免疫系において重要で多様な調節的役割を果たしていることが証明された。

【0003】

ほとんどの研究は、ＤＮＴ細胞が体の抗原特異的免疫恒常性を維持することで重要な役割を果たしていることを示す。ＤＮＴ細胞は、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイムＢ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）およびＦａｓＬを高発現し、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞およびＮＫ細胞等に対して、強力な免疫阻害活性を示して、体の過剰な免疫応答をダウンレギュレートすることにより、移植拒絶反応を阻害し、移植片対宿主病の発生を避免し、自己免疫性疾患の発生および発症を効果的に制御することを達成することができる。ＤＮＴ細胞は、グランザイムおよびパーフォリン等の細胞殺傷関連タンパク質を高発現するため、腫瘍細胞の殺傷治療にも使用されることができる。これらの発見に基づいて、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性疾患、さらに腫瘍の予防および治療に使用されるＤＮＴ細胞のインビトロ増殖に関する多くの研究があり、これらの研究では、主にヒト末梢血またはマウス脾臓細胞から単核細胞を抽出し、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６（ヒト）／ＮＫ１．１（マウス）を除去した後に増殖させ、増殖させた細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６（ヒト）／ＮＫ１．１（マウス）をさらに除去した後に養子移入療法に使用される。

【0004】

研究によると、ＤＮＴ細胞は、移植拒絶反応および自己免疫性糖尿病の標的に予防および治療等、抗原特異的免疫阻害を有することが分かっているが、ＤＮＴ細胞がＭＨＣ－ＩＩ分子を識別するのを助ける重要な分子であるＣＤ４分子が足りないため、ＤＮＴ細胞がＭＨＣ－ＩＩ抗原の特異的識別をどのように保持するかはまだ不明である。従って、この分野において、ＤＮＴ細胞およびその応用に関するさらなる詳細な研究が緊急に必要とされる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、精製されたダブルネガティブＴ細胞およびその調製と応用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１の態様は、細胞製剤を提供し、前記細胞製剤は、ＤＮＴ細胞集団を含み、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上、好ましくは、９８％以上、より好ましくは、９９％以上、最も好ましくは、９９．９％以上を占める細胞は、ＩＬ－１７を分泌および発現しない。

【0007】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上を占める細胞は、表面抗原ＣＤ３＋およびＴＣＲαβを有する。

【0008】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団内の細胞ＣＤ３の発現は、正常または低であり、ＴＣＲαβの発現は、正常または低である。

【0009】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上を示す細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）、またはその組み合わせからなる群から選択される表面マーカーを発現しない。

【0010】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％以上を示す細胞は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、Ｂ２２０、ＦａｓＬ、ＮＫＧ２Ｄ、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂ、またはその組み合わせからなる群から選択される遺伝子を発現する。

【0011】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上を占める細胞は、ＬＡＧ３遺伝子を高発現する。

【0012】

別の好ましい例において、前記高発現とは、前記細胞ＬＡＧ３遺伝子の発現量Ｇ１と正常なＣＤ４ Ｔ細胞ＬＡＧ３遺伝子の発現量Ｇ０との比率、即ち、Ｇ１／Ｇ０≧１．２、好ましくは≧１．５、より好ましくは≧２を指す。

【0013】

別の好ましい例において、前記低発現とは、前記細胞内の特定の遺伝子の発現量Ｒ１と正常なＣＤ４ Ｔ細胞における対応する遺伝子の発現量Ｒ０との比率、即ち、Ｒ１／Ｒ０≦１、好ましくは≦０．８、より好ましくは≦０．５を指す。

【0014】

別の好ましい例において、前記ＤＮＴ細胞集団内の細胞は、抗原特異性を有する。

【0015】

別の好ましい例において、前記細胞製剤は、前記ＤＮＴ細胞集団および薬学的に許容されるベクターからなる。

【0016】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に記載の細胞製剤を調製するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）単核細胞集団（ＰＢＭＣｓ）を提供し、選別によってＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得る段階と、
（ｂ）第１の細胞亜集団からＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去した後、それらを増殖および培養することにより、第２の細胞亜集団を得る段階、または
第１の細胞亜集団を増殖および培養した後、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去することにより、第２の細胞亜集団を得る段階と、
（ｃ）選択可能に、第２の細胞亜集団内のＤＮＴ細胞をさらに選別することにより、第３の細胞亜集団を得る段階と、
（ｄ）第２または第３の細胞亜集団を適切なベクターと混合することにより、本発明の第１の態様に記載の細胞製剤を得る段階とを含む。

【0017】

別の好ましい例において、段階（ａ）において、単核細胞集団内のＢ細胞、ＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、１型ＮＫＴおよび２型ＮＫＴ細胞を除去することにより、ＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得る。

【0018】

別の好ましい例において、段階（ａ）において、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ－γδ、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）、ａＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄおよびＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体（またはＴＣＲＶα２４－Ｊα１８抗体）を使用してＰＢＭＣを標識し、次にそれらをネガティブ選別することにより、ＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得る。

【0019】

別の好ましい例において、前記ネガティブ選別は、磁気ビーズ選別、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ， ＦＡＣＳ）および密度勾配遠心分離からなる群から選択される。

【0020】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、グループＡの発現タンパク質から選択される一つまたは複数の抗体を使用して、培養前にＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去し、ここで、グループＡは、Ｓ１００ａ６、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＣＸＣＲ６、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、ＡＣＴＮ２、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７（ＩＬ７ｒ）、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｈｋ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、Ｌｙ６ａ、ＢＬＫ、Ｌｓｐ１、Ｌｙ６ｅ、Ｉｔｇｂ７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｓ１００ａ１０、Ｌｙ６ｇ５ｂ、Ｔｈｙ１、ＣＤ４０Ｉｇ、Ｒａｍｐ３、Ｇｍ２ａまたはその組み合わせを含み、
好ましくは、グループＡは、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒまたはその組み合わせである。

【0021】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、グループＢの発現タンパク質から選択される一つまたは複数の抗体を使用して、培養後にシステムからＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去し、ここで、グループＢは、ＩＬ－１７ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｔｎｆｒｓｆ４、ＡＡ４６７１９７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｔｈｙ１、Ｉｇｔｐ、Ａｒｌ６ｉｐ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｌｔｂ、Ｔｎｆｒｓｆ２５、Ｆｕｒｉｎ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｉｆｉ２７ｌ２ａ、Ｇｂｐ２、Ｅｍｐ３、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｔｓｐｏ、Ｃｓｔ３、Ｖｉｍ、ＣＤ２００またはその組み合わせを含み、；
好ましくは、グループＢは、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｔｎｆｒｓｆ４、またはその組み合わせである。

【0022】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、Ｔ細胞刺激剤の存在条件下で増殖培養し、前記Ｔ細胞刺激剤は、
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＩＰＰ、パミドロネート（Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、ＣＤ２抗体または磁気ビーズ標識抗体、ＣＤ３抗体または磁気ビーズ標識抗体、ＣＤ２８抗体または磁気ビーズ標識抗体、またはその組み合わせからなる群から選択される。

【0023】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、またはその組み合わせからなる群から選択されるサイトカインは、増殖培養中に加えられる。

【0024】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、抗原提示細胞および／または抗原ペプチドの存在条件下で増殖培養する。

【0025】

別の好ましい例において、前記抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、および／またはＢ細胞を含む。

【0026】

別の好ましい例において、前記抗原ペプチドは、ヒョウヒダニ抗原ペプチド、花粉抗原ペプチド、樹木紛抗原ペプチド等のアレルゲンに関する抗原ポリペプチドを含む。

【0027】

別の好ましい例において、前記抗原ペプチドは、自己免疫性疾患に関する自己抗原ペプチドを含む。

【0028】

別の好ましい例において、前記抗原ペプチドは、
（ｉ）喘息に関するアレルゲンポリペプチド、
（ｉｉ）１型糖尿病に関するＧＡＤ６５抗原ペプチドおよびインスリン抗原ペプチド、
（ｉｉｉ）リウマチ性免疫疾患に関するＥＮＡポリペプチド、核タンパク質抗原ポリペプチド、細胞質タンパク質抗原ポリペプチド、および
（ｉｖ）自己免疫性肝疾患に関するミトコンドリア抗原ペプチドおよび肝抗原ペプチドからなる群から選択される。

【0029】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、前記増殖培養の時間は、１４～２１日である。

【0030】

別の好ましい例において、段階（ｂ）において、前記増殖培養は、インビトロで行われる

【0031】

別の好ましい例において、段階（ｃ）において、第２の細胞亜集団内のＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞を除去することにより、第３の細胞亜集団を得る。

【0032】

別の好ましい例において、段階（ｃ）において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）抗体を使用して、第２の細胞亜集団内のＤＮＴ細胞を標識し、次にそれらをネガティブ選別することにより、第３の細胞亜集団を得る。

【0033】

別の好ましい例において、段階（ｄ）において、前記ベクターは、等張液である。

【0034】

別の好ましい例において、段階（ｄ）において、前記ベクターは、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、生理食塩水、乳酸ナトリウムリンゲル液、血漿、血清アルブミンを含む等張液、無血清細胞保存液、またはその組み合わせからなる群から選択される。

【0035】

別の好ましい例において、前記単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。

【0036】

別の好ましい例において、前記段階（ａ）において、前記単核細胞集団は、末梢血または脾臓から分離された単核細胞である。

【0037】

本発明の第３の態様は、医薬組成物の調製に使用される、本発明の第１の態様に記載の細胞製剤の用途を提供し、前記医薬組成物は、腫瘍、感染性疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギー性喘息、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、脳卒中、またはその組み合わせからなる群から選択される疾患の治療に使用される。

【0038】

別の好ましい例において、前記メタボリックシンドロームは、肥満、インスリン抵抗、２型糖尿病、脂肪性肝炎、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、またはその組み合わせを含む。

【0039】

別の好ましい例において、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、シェーグレン症候群、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性腎症、またはその組み合わせを含む。

【0040】

本発明の第４の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の第２の態様に記載の方法によって調製された細胞製剤、および薬学的に許容されるベクター、希釈剤または賦形剤を含む。

【0041】

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体製剤である。

【0042】

在本発明的第５の態様は、Ｔ細胞増殖を阻害するための、および／またはＴ細胞アポトーシスを誘導するための方法を提供し、前記方法は、必要とする対象に、本発明の第１の態様に記載の組成物、または前記組成物を有効成分として含む薬物を投与する段階を含む。

【0043】

別の好ましい例において、前記方法は、脂肪組織の炎症を阻害し、インスリン抵抗性を改善することもできる。

【0044】

別の好ましい例において、前記方法は、喘息の抗原特異的予防および治療を有することができる。

【発明の効果】

【0045】

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】ダブルネガティブＴ細胞の精製およびフローサイトメトリーのダイアグラムを示す（従来の方法でＴＣＲ－γδ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ１．１陽性細胞のみを除去した場合でも、残りのＴＣＲαβ＋ＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ１．１－のＤＮＴ細胞には、依然として６％近くのＮＫＴ細胞が混合されている）。

【図2】ｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞の単細胞亜集団に対する分析を示す（ＩＬ－１７を分泌および発現する亜集団が存在し、初期ＤＮＴ細胞の総数の約５．８％を占める）。

【図3】インビトロで刺激、活性化および増殖した精製されたＤＮＴ細胞の単細胞亜集団の分析を示す（ＩＬ－１７分泌亜集団が存在し、比率は、増殖した細胞総数の１５．５％に達することができる）。

【図4】ＩＬ－１７を分泌するｎａｉｖｅＤＮＴ細胞亜集団における細胞膜タンパク質遺伝子の発現レベルを示す。

【図5】ＩＬ－１７を分泌する活性化されたＤＮＴ細胞亜集団における細胞膜タンパク質遺伝子の発現レベルを示す。

【図6】細胞の各グループのインビトロ刺激実験の結果を示す。具体的には、精製された総ｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞およびＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去した後の他のＤＮＴ細胞に対して、それぞれＣＤ３／ＣＤ２８抗体を使用して、インビトロで刺激および増殖する。三日後のＰＣＲ検証によると、総ＤＮＴ（Ｔｏｔａｌ ＤＮＴ）が活性化および増殖された後ＩＬ－１７が発現され、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞（ＩＬ－１７ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＤＮＴ）が増殖された後、ＩＬ－１７の分泌は、総ＤＮＴグループよりも有意に高かったが、事前にＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＤＮＴ）を除去し、活性化および増殖された後、ＩＬ－１７の分泌発現を検出できないことが分かる。

【図7】細胞の各グループのインビトロ刺激実験の結果を示す。具体的には、まず総ｎａｉｖｅ ＤＮＴをＣＤ３／２８抗体で三日間刺激し、次にＩＬ－１７を分泌する活性化ＤＮＴ亜集団の細胞表面マーカーを使用して、それらを蛍光活性化細胞選別することによって精製される。研究によると、ＩＬ－１７を分泌する活性化ＤＮＴ亜集団には明らかなＩＬ－１７発現があるが、ＩＬ－１７を分泌する活性化ＤＮＴ亜集団を除去した後、残りのＤＮＴ細胞には、炎症性サイトカインであるＩＬ－１７の発現がないことが分かる。

【図8】マウスＤＮＴ細胞の最適化されたインビトロ増殖および培養システムに基づいて得られたＤＮＴ細胞は、Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞アポトーシスを誘導する有意な能力を有することを示す。

【図9】マウスＤＮＴ細胞の最適化されたインビトロ増殖および培養システムに基づいて得られたＤＮＴ細胞は、有意なインビボ免疫阻害機能を有し、食事による肥満、インスリン抵抗性および脂肪性肝炎に対して優れた予防および治療効果を発揮することができることを示す。ここで、図９のＡ部分は、実験プロセスを示す。具体的には、８週間の高脂肪食後、マウスに１回のＤＮＴ細胞注入投与し、８週間高脂肪食を与え続ける。図９のＢ部分は、ＤＮＴ注射後、マウスの体重増加が単純な高脂肪食グループの体重増加よりも有意に低下したことを示す。図９のＣ部分は、ＤＮＴ細胞治療グループのマウス肝脂肪液胞変性および炎症細胞蓄積が有意に改善されたことを示す。図９のＤ部分は、ＤＮＴ細胞治療グループのマウスの空腹時の血糖が高脂肪食を与えられたグループよりも有意に低下したことを示す。

【図10】総ＤＮＴ細胞（ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を事前に除去されない）を注射した治療グループのマウスにおける肝脂肪液胞変性および炎症細胞蓄積は、対照グループと比較して有意に改善されておらず、脂肪液胞および炎症細胞浸潤の現象が以前に存在することを示す。

【図11】ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドによって刺激および増殖されたＤＮＴ細胞が、ＯＶＡ抗原によって誘導された喘息に対して、有意な保護効果を有し、アレルギー性気道炎症および肺好酸球、リンパ球の蓄積が、有意に減少することを示す。ＯＶＡ非関連ポリペプチド（ＭＯＧ３５－５５）によって誘導されたＤＮＴ細胞は、マウスのＯＶＡによって誘導された喘息に対して保護効果がない。

【図12】ＣＤ４ Ｔ細胞と比較して、ＤＮＴ細胞がＬＡＧ３分子を高発現することを示す。

【図13】野生型ＤＮＴ細胞と比較して、ＬＡＧ３ノックアウトされたＤＮＴ細胞が、ＯＶＡによって誘導された喘息に対する予防および治療効果が有意に低下することを示す。

【図14】ＯＶＡによって刺激されたＤＮＴ細胞において、Ｉ－Ａｂ ＯＶＡ３２３－３３９テトラマー陽性細胞の頻度が、ＯＶＡによって刺激されたＬａｇ３ノックアウトＤＮＴ細胞またはＯＶＡによって刺激されたいない野生型ＤＮＴ細胞よりも有意に高いことを示す。

【図15】ＤＮＴ細胞（ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴを除去した後の精製されたＤＮＴ細胞）の注射が、肺リンパ球浸潤の症状を完全に緩和することができることを示す。しかしながら、同じ用量の総ＤＮＴ細胞（ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去していない）を注射した場合でも、肺胞の周囲に明らかなリンパ球浸潤が依然に見られ、喘息を完全に緩和する効果には達しない。

【図16】最適化されたヒトＤＮＴ細胞のインビトロ増殖および培養システムに基づいて得られたＤＮＴ細胞は、Ｔ細胞の増殖を有意に阻害する能力を有することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の後、ＤＮＴ細胞集団からのＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去した後、Ｔ細胞増殖を有意に阻害し、アポトーシスを誘導することができ、脂肪組織の炎症を阻害し、インスリン抵抗性を改善することもでき、喘息を抗原特異的予防および治療する効果を有する。

【0048】

ＤＮＴ細胞
ＤＮＴ細胞、即ち、ダブルネガティブＴ細胞（Ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、独特の表現型を有するＴＣＲαβ＋Ｔリンパ球の一つであり、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ等の細胞の特徴的な表面マーカーを発現せず、免疫系において核心かつ多様な調節的役割を果たす。

【0049】

本発明は、Ｔ細胞増殖を有意に阻害し、アポトーシスを誘導する効果を有し、脂肪組織の炎症を阻害し、インスリン抵抗性を改善することもできる、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去したＤＮＴ細胞集団を提供する。

【0050】

本明細書に使用されるように、ｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞という用語は、天然のＤＮＴ細胞を指す。

【0051】

ＤＮＴ細胞の精製および増殖
本発明において、ＤＮＴ細胞の精製は、培養および増殖前に、または培養および増殖後に行うことができ、前者は後者よりも抗体の使用量が大幅に少ないため、ＤＮＴ細胞を培養および増殖させる前に、ＩＬ－１７分泌ＤＮＴ細胞を事前に除去することが好ましい。具体的には、二つの精製方法は、次のとおりである。

【0052】

１．精製してから増殖する：即ち、ＤＮＴを増殖する前に、ＩＬ－１７を分泌するｎａｉｖｅ ＤＮＴ亜集団を事前に除去する。

【0053】

無菌条件下でマウス脾臓またはヒト末梢血ＰＢＭＣを取得し、勾配遠心分離法によって単核細胞の懸濁液を取得する。ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ－γδ、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）、ａＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄおよびＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体（またはＴＣＲＶα２４－Ｊα１８抗体）を使用して単核細胞（それぞれＢ細胞、ＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、１型ＮＫＴおよび２型ＮＫＴ細胞を除去する）を標識し、ネガティブ選別（磁気ビーズ選別、蛍光活性化細胞選別または密度勾配遠心分離等の分離方式）によってＤＮＴ細胞を主とする細胞亜集団を取得し、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒ等の抗体のいずれか一つまたは組み合わせを同時に使用して、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団を除去し、次にインビトロでＤＮＴ細胞を刺激および増殖させ（コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＩＰＰ、パミドロネート（Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体または磁気ビーズ標識抗体の一つまたは複数の混合物等、ＤＮＴ細胞の増殖を刺激できる任意の試薬。複数の混合の場合、任意の比率で試薬を配合することができる）、ＤＮＴ細胞の増殖率を増加するために、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５等の様々なサイトカインまたは組み合わせを加えることができる。培養時間は、１４～２１日であり、期間中に培地の状況および細胞密度に応じて溶液を交換するかプレートを交換して培養する。培養終了後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）抗体磁気ビーズネガティブ選択を使用して、培養中に存在することができるＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞をさらに除去し、増殖および培養されたＤＮＴ細胞を取得して後続の治療に使用される。培養および増殖したＤＮＴ細胞の表現型は、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ±ＣＤ４－ＣＤ８－ ＮＫ１．１－（マウス）／ＣＤ５６－（ヒト）ＣＤ１９－ＴＣＲγδ±である。

【0054】

２．増殖してから精製する：即ち、まずＤＮＴ細胞亜集団を増殖した後、ＩＬ－１７を分泌する活性化されたＤＮＴ細胞を除去する。無菌条件下でマウス脾臓またはヒト末梢血ＰＢＭＣを取得し、勾配遠心分離法によって単核細胞の懸濁液を取得する。ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ－γδ、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）、ａＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄおよびＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体（またはＴＣＲＶα２４－Ｊα１８抗体）を使用して単核細胞を標識し、磁気ビーズネガティブ選別によってＤＮＴ細胞を取得する。次にインビトロでＤＮＴ細胞を刺激および増殖させ（コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＩＰＰ、パミドロネート（Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体または磁気ビーズ標識抗体の一つまたは複数の混合物等、ＤＮＴ細胞の増殖を刺激できる任意の試薬。複数の混合の場合、任意の比率で試薬を配合することができる）、ＤＮＴ細胞の増殖率を増加するために、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５等の様々なサイトカインまたは組み合わせを加えることができる。培養および増殖した後、増殖された総ＤＮＴ細胞を収集し、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０等の抗体のいずれか一つまたは組み合わせを使用して、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団を除去する。ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）抗体磁気ビーズネガティブ選択を同時に使用して、培養に存在することができるＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞をさらに除去し、増殖および培養されたＤＮＴ細胞を取得して後続の治療に使用される。培養および増殖したＤＮＴ細胞表現型は、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ±ＣＤ４－ＣＤ８－ ＮＫ１．１－（マウス）／ＣＤ５６－（ヒト）ＣＤ１９－ＴＣＲγδ±である。

【0055】

３．抗原特異的ＤＮＴ細胞の増殖および培養の方法は、次のとおりである。

【0056】

無菌条件下でマウス脾臓またはヒト末梢血ＰＢＭＣを取得し、勾配遠心分離法によって単細胞の懸濁液を取得する。ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ－γδ、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）、ａＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄおよびＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体（またはＴＣＲＶα２４－Ｊα１８抗体）を使用してマウスの脾臓細胞（それぞれＢ細胞、ＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、１型ＮＫＴおよび２型ＮＫＴ細胞を除去する）を標識し、ネガティブ選別（磁気ビーズ選別、蛍光活性化細胞選別または密度勾配遠心分離等の分離方式）によってＤＮＴ細胞を主とする細胞亜集団を取得し、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒ等の抗体のいずれか一つまたは組み合わせを同時に使用して、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団を除去し、次にインビトロでマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞等を抗原提示細胞として使用できる細胞と共培養し、同時に抗原特異性を増強させるために、特定の抗原ペプチドを加えることができる。培養中にＩＬ－２、ＩＬ－１５等の様々なサイトカインまたは組み合わせを加えることができる。インビトロでの増殖能力を増強させるために、ＣＤ３抗体を同時に加えることができる。７～１０日間培養した後、培養された細胞を収集し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１（マウス）／ＣＤ５６（ヒト）抗体磁気ビーズネガティブ選択を使用して、培養中に存在することができるＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ細胞をさらに除去する。ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１１ｃ磁気ビーズ抗体を同時に使用して、共培養システム内のＢ細胞、樹状細胞等の抗原提呈細胞を除去する。精製して得られたＤＮＴ細胞は、後続の治療に使用される。培養および増殖したＤＮＴ細胞表現型は、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ±ＣＤ４－ＣＤ８－ ＮＫ１．１－（マウス）／ＣＤ５６－（ヒト）ＣＤ１９－ＴＣＲγδ±である。

【0057】

医薬組成物および投与方法
本発明は、Ｔ細胞の増殖を阻害し、および／またはＴ細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍、感染性疾患、メタボリックシンドローム（肥満、インスリン抵抗、糖尿病、脂肪性肝炎、冠状動脈アテローム性動脈硬化症）、脳卒中、またはその組み合わせからなる群から選択される疾患の治療に使用されることができる、本発明の第１の態様に記載の細胞製剤を含む本発明の第４の態様に記載の医薬組成物をさらに提供する。前記疾患は、アレルギー性喘息、１型糖尿病、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、シェーグレン症候群、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変和硬化性胆管炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性腎症、器官移植拒絶反応、移植片対宿主病、またはその組み合わせをさらに含む。

【0058】

本発明は、安全かつ有効な量の本発明の細胞製剤、および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む、医薬組成物をさらに提供する。このようなベクターは、食塩水、緩衝液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、粉末剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびその組み合わせを含む（これらに限定されない）。薬物製剤は、投与方法と一致している必要がある。本発明の医薬組成物は、注射剤の形態で調製されることができ、例えば、生理食塩水またはデキストロースおよび他の補助剤を含む水溶液を使用して、従来の方法によって調製する。有効成分の投与量は、治療有効量である。さらに、本発明の細胞製剤は、他の治療剤と一緒に使用されることができる。

【0059】

本発明の医薬組成物は、従来の方法で、必要とする対象（例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物）に投与することができる。代表的な投与方法には、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内、腹骨盤腔、くも膜下腔、副鼻腔、頭蓋内、様々な組織（例えば、腫瘍組織、炎症性疾患組織）等の様々な部位の注射等を含む(これらに限定されない)。

【0060】

本発明の主な利点は、次のとおりである。

【0061】

（ａ）本発明は、ＤＮＴ細胞のシステムを増殖および精製する。

【0062】

（ｂ）ＩＬ－１７は、重要な炎症因子であり、体の自己免疫応答および炎症反応を誘発することができる。本発明の精製されたＤＮＴ細胞は、ＩＬ－１７を分泌する能力を有さないため、細胞治療受容体の自己免疫応答および炎症反応を誘発するＩＬ－１７の副作用が回避される。

【0063】

（ｃ）本発明の精製されたＤＮＴ細胞の免疫阻害機能は、精製されていないＤＮＴの免疫阻害機能よりも強力であり、様々な自己免疫性疾患、アレルギー性喘息および及炎症関連疾患の治療に使用されることができる。

【0064】

以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量によって計算される。

【0065】

実施例１
単細胞シーケンシング
単細胞トランスクリプトームシーケンシング技術により、マウス脾臓のＤＮＴ細胞に対して、単細胞レベルの分析を行う。まず、蛍光活性化細胞選別技術（図１を参照する）を使用して、ＴＣＲαβ＋ＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ１．１－のダブルネガティブＴ細胞を取得し、ＣＤ１ｄテトラマー抗体染色技術を使用して、１型ＮＫＴ（αＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体陽性）および２型ＮＫＴ（ＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体陽性）細胞をさらに除去し、次に精製されたｎａｉｖｅ ＤＮＴに対して、単細胞トランスクリプトームシーケンシング分析を実行して、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団が存在するかどうかを検出する。

【0066】

単細胞シーケンシングおよびＰＣＲ検証の結果から、精製されたＤＮＴ細胞のいくつかの細胞亜集団におけるＩＬ－１７のｍＲＮＡ発現レベルが他のＤＮＴ細胞の発現レベルよりも有意に高いことを示し、このＤＮＴ細胞亜集団は、総ＤＮＴ細胞の約５．８％を示す（図２を参照する）。精製された総ＤＮＴ細胞をインビトロでＣＤ３／２８抗体で三日間刺激した後、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団の増殖が明らかであり、この時点で、ＩＬ－１７ｍＲＮＡを高発現するＤＮＴ細胞は、総ＤＮＴ細胞の１５．５％に達することができ（図３を参照する）、これは、インビトロでの刺激、活性化および増殖において、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞が他のＤＮＴ細胞よりも唯に増殖することを証明する。これらのＤＮＴ細胞を治療するために再注入されれと、受容体免疫活性化、さらに自己免疫応答を引き起こす可能性がある。

【0067】

このＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を書鉅するために、総ｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞をさらに分析する。結果は、これらのＩＬ－１７を分泌するｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞が様々な膜貫通タンパク質を高発現することを示し、ここで、他のＤＮＴ細胞と比較して、Ｓ１００ａ６、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＣＸＣＲ６、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、ＡＣＴＮ２、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７（ＩＬ７ｒ）、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｈｋ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、Ｌｙ６ａ、ＢＬＫ、Ｌｓｐ１、Ｌｙ６ｅ、Ｉｔｇｂ７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｓ１００ａ１０、Ｌｙ６ｇ５ｂ、Ｔｈｙ１、ＣＤ４０Ｉｇ、Ｒａｍｐ３、Ｇｍ２ａ等の発現は、０．５倍以上増加し、特に、他のDNT細胞と比較して、Ｓ１００ａ６、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＣＸＣＲ６、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、ＡＣＴＮ２、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７（ＩＬ７ｒ）等のタンパク質の発現は、１倍以上増加する（図４を参照する）。従って、上記示差タンパク質の抗体（Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒ等を含むが、これらに限定されない）は、ＩＬ－１７を分泌するｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞亜集団の精製および分離に使用されることができる。

【0068】

次に、まず総ｎａｉｖｅ ＤＮＴをＣＤ３／２８抗体で三日間刺激し、単細胞シーケンシングで活性化および増殖したＤＮＴ細胞を検出する。結果は、図５に示されたように、ＩＬ－１７を分泌する活性化されたＤＮＴ細胞亜集団は、ＩＬ－１７ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｔｎｆｒｓｆ４、ＡＡ４６７１９７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｔｈｙ１、Ｉｇｔｐ、Ａｒｌ６ｉｐ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｌｔｂ、Ｔｎｆｒｓｆ２５、Ｆｕｒｉｎ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｉｆｉ２７ｌ２ａ、Ｇｂｐ２、Ｅｍｐ３、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｔｓｐｏ、Ｃｓｔ３、Ｖｉｍ、ＣＤ２００等の分泌タンパク質および膜貫通タンパク質を高発現し、これらのタンパク質を使用する抗体は、ＩＬ－１７を分泌する活性化されたＤＮＴ細胞亜集団の選別に使用されることができる。

【0069】

実施例２
ＤＮＴ細胞の精製および有効性の検証
上記発見をさらに証明するために、まずマウスｎａｉｖｅ ＤＮＴを精製し、即ち、無菌条件下でマウス脾臓を取得し、赤血球を粉砕および溶解した後、単一の脾臓細胞の懸濁液を取得する。ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ－γδ、ＮＫ１．１、ａＧａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄおよびＬＰＣ－ＣＤ１ｄテトラマー抗体（またはＴＣＲＶα２４－Ｊα１８抗体）を使用して、マウスの脾臓細胞を標識し、磁気ビーズネガティブ選別によってＤＮＴ細胞を主とする細胞亜集団を取得し、同時にＳ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒ等の抗体のいずれかを使用して、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団を標識する。

【0070】

続いて、同じ数の総ｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞およびＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を除去した他のＤＮＴ細胞を使用して、それぞれＣＤ３／ＣＤ２８抗体でインビトロで刺激および増殖させる。

【0071】

結果は、図６に示されたように、三日間の刺激後、総ＤＮＴ活性化増殖グループにはＩＬ－１７発現があり、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞が増殖した後、ＩＬ－１７の分泌は、総ＤＮＴグループよりも有意に高く、ＩＬ－１７分泌細胞を事前に除去したＤＮＴ細胞は、インビトロでＣＤ３／２８刺激された後、活性化および増殖したＤＮＴ細胞にはＩＬ－１７の分泌および発現がない（事前除去の有効性が確認される）。上記結果は、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７またはＬｔｂ４ｒ陽性のＤＮＴ細胞を事前に除去することにより、ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞亜集団を効果的に除去し、それらのさらなる増殖を回避することができることを示す。

【0072】

次に、まずｎａｉｖｅ 総ＤＮＴをＣＤ３／２８抗体で三日間刺激し、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０またはＴｎｆｒｓｆ４等の抗体を使用して、このグループの細胞を分離および精製し、ＰＣＲ検証により、このグループの抗体によって分離および精製された活性化ＤＮＴ亜集団には、明らかなＩＬ－１７発現があり、ＩＬ－１７を分泌する活性化ＤＮＴ亜集団を除去した後、残りＤＮＴ細胞には、ＩＬ－１７の炎症性サイトカインの発現がないことが分かる（図７を参照する）。

【0073】

培養および増殖前および培養および増殖後のＤＮＴ細胞を精製する二つの方法と比較すると、第１のタイプで抗体を使用する量は、第２のタイプよりも明らかに少なく、その後の機能検証は、第１のタイプの条件、即ち、培養前にＤＮＴ細胞を増殖させる前、ＩＬ－１７分泌ＤＮＴ細胞を事前に除去する方法を使用する。

【0074】

実施例３
精製後のＤＮＴ細胞の機能検証
精製後のＤＮＴ細胞のインビトロ免疫阻害機能を検証するためである。精製および増殖したＤＮＴ細胞を、樹状細胞によって刺激および増殖された同じマウスのＴリンパ球と混合および培養する。

【0075】

結果は、図８に示されたように、精製後のＤＮＴ細胞は、Ｔ細胞増殖を有意に阻害し、アポトーシスを誘導する効果を有する。

【0076】

続いて、高脂肪食を使用して、マウス肥満、糖尿病および脂肪性肝炎モデルを誘導し、インビボでの炎症を阻害するＤＮＴ細胞の効果を研究する。マウスでの８週間の高脂肪食後、３～５×１０６ＤＮＴ細胞の単回注入、その後高脂肪食を８週間続ける（１６週間のフルコース）。

【0077】

結果は、図９に示されたように、ＤＮＴ細胞治療グループのマウスの体重、空腹時の血糖および脂肪肝の状況は、有意に改善され、これは、ＤＮＴ細胞による脂肪組織の炎症を阻害し、インスリン抵抗性の改善に関連する。

【0078】

しかしながら、総ＤＮＴ細胞を注射した場合（ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞を事前に除去されていない）、治療グループのマウスの肝脂肪液胞変性および炎症細胞の蓄積は、対照グループと比較して有意に改善されず、依然として脂肪液胞および炎症細胞浸潤の現象が存在する（図１０）。

【0079】

実施例４
抗原特異性を有するＤＮＴ細胞の培養
ＤＮＴの抗原特異的免疫阻害を研究するために、まずＯＶＡによって誘導されたマウスアレルギー性喘息モデルを初めて構築される。続いて、成熟したマウス樹状細胞および精製されたｎａｉｖｅ ＤＮＴ細胞をインビトロで混合培養する。刺激および増殖したＤＮＴ細胞の抗原特異的阻害効果をカンサスするために、培養中にＯＶＡ特異的ＯＶＡ３２３－３３９抗原ペプチドを加えるか、またはＯＶＡとは関係の内ＭＯＧ３３－５５抗原ペプチドを加える。

【0080】

結果は、図１１に示されたように、ＯＶＡ感作を２回行った後、ＯＶＡタンパク質は、アレルギー性喘息を刺激した後、ＯＶＡ３２３－３３９ポリペプチドを注入して刺激および増殖したＤＮＴ細胞は、喘息発作に対して優れた制御効果を有する。

【0081】

無関係のペプチド断片ＭＯＧ３３－５５によってインビトロで刺激されたＤＮＴ細胞は、ＯＶＡタンパク質によって誘発された喘息に対して優れた予防および治療効果を有さず、インビトロでの培養および増殖したＤＮＴが有意な抗原特異的免疫阻害効果を有することが証明される。

【0082】

ＣＤ４ Ｔ細胞と比較して、ＤＮＴは、より高いレベルの分子ＬＡＧ３を発現することが分かる（図１２を参照する）。Ｌａｇ３分子は、ＭＨＣ－ＩＩ分子に結合することができ、ＭＨＣ－ＩＩ分子に対するその親和性は、ＣＤ４分子よりもはるかに高くなる。

【0083】

ＯＶＡ３２３－３３９ポリペプチドを使用して、それぞれ野生型ＤＮＴ細胞およびＬＡＧ３ノックアウトＤＮＴ細胞をインビトロで刺激する。その後、ＯＶＡによって誘導されたアレルギー性喘息に対する予防および治療効果を観察する。結果は、図１３および図１４に示されたように、ＬＡＧ３ノックアウトＤＮＴ細胞の免疫保護効果は、明らかに低下する。ＯＶＡ特異的ＭＨＣ－ＩＩ分子で染色したテトラマー（Ｔｅｔｒａｍｅｒ）（Ｉ－Ａｂ ＯＶＡ_{３２３－３３９}テトラマー）染色によると、ＬＡＧ３ノックアウトＤＮＴ細胞がＩ－Ａ^ｂ ＯＶＡ_{３２３－３３９}テトラマーを認識する能力が大幅に低下して、ＤＮＴ細胞の抗原特異的免疫阻害能力が低下することが分かる。ＬＡＧ３分子がＤＮＴ細胞の抗原特異性を維持する上で重要な役割を果たしていることを証明する。

【0084】

しかしながら、同じ用量の総ＤＮＴ細胞を注射した場合でも（ＩＬ－１７を分泌するＤＮＴ細胞が除去されない）、肺胞の周囲に明らかなリンパ球浸潤が見られ、喘息を完全に緩和することはできない（図１５）。

【0085】

実施例５
ヒトＤＮＴ細胞の機能検証
精製されたヒトＤＮＴ細胞のインビトロ免疫阻害機能をさらに検証するために、実施例２の方法を使用してヒトＤＮＴ細胞を精製および増殖し、それらを樹状細胞（ＤＣ）によって刺激および増殖されたＴリンパ球を混合培養する。

【0086】

結果は、図１６に示されたように、精製されたＤＮＴ細胞がＴ細胞の増殖を有意に阻害する効果を示す。

【0087】

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【手続補正書】

【提出日】2022-02-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞製剤であって、前記細胞製剤は、ＤＮＴ細胞集団を含み、前記ＤＮＴ細胞集団において、ＩＬ－１７を分泌および発現しない細胞が、総細胞数の９５％超、好ましくは９８％超、より好ましくは９９％超、最も好ましくは９９．９％超である、細胞製剤。

【請求項2】

前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の９５％超の細胞が、表面抗原ＣＤ３＋およびＴＣＲを有する、請求項１に記載の細胞製剤。

【請求項3】

前記ＤＮＴ細胞集団において、総細胞数の５０％超の細胞が、ＬＡＧ３遺伝子を高発現する、請求項１に記載の細胞製剤。

【請求項4】

請求項１に記載の細胞製剤を調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）単核細胞集団（ＰＢＭＣ）を提供し、前記細胞集団を選別し、それによって、ＤＮＴ細胞を主とする第１の細胞亜集団を得る段階と、
（ｂ）前記第１の細胞亜集団からＩＬ－１７を産生するＤＮＴ細胞を除去し、残りの第１の細胞亜集団を増殖培養し、それによって、第２の細胞亜集団を得る段階、または
前記第１の細胞亜集団を増殖培養した後、ＩＬ－１７を産生するＤＮＴ細胞を除去し、それによって、第２の細胞亜集団を得る段階と、
（ｃ）任意選択的に、前記第２の細胞亜集団内のＤＮＴ細胞をさらに選別し、それによって、第３の細胞亜集団を得る段階と、
（ｄ）前記第２のまたは第３の細胞亜集団を適切な担体と混合し、それによって、請求項１に記載の細胞製剤を得る段階と
を含む、方法。

【請求項5】

段階（ａ）において、前記単核細胞集団からＢ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、１型ＮＫＴ細胞、ならびに２型ＮＫＴ細胞が除去され、それによって、ＤＮＴ細胞を主とする前記第１の細胞亜集団を得る、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

段階（ｂ）において、グループＡから選択される発現タンパク質を標的とする一つまたは複数の抗体を使用することによって、前記ＩＬ－１７を産生するＤＮＴ細胞が培養前に除去され、ここで、グループＡは、Ｓ１００ａ６、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、ＣＸＣＲ６、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｇａｌｓ３、ＡＣＴＮ２、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７（ＩＬ７ｒ）、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｈｋ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、Ｌｙ６ａ、ＢＬＫ、Ｌｓｐ１、Ｌｙ６ｅ、Ｉｔｇｂ７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｓ１００ａ１０、Ｌｙ６ｇ５ｂ、Ｔｈｙ１、ＣＤ４０Ｉｇ、Ｒａｍｐ３、Ｇｍ２ａおよびその組み合わせからなり、
好ましくは、グループＡは、Ｓ１００ａ６、ＣＸＣＲ６、ＩＣＯＳ、ＣＣＲ２、ＣＤ８２、ＣＤ１２７、Ｌｔｂ４ｒおよびその組み合わせからなる、
請求項４に記載の方法。

【請求項7】

段階（ｂ）において、グループＢから選択される発現タンパク質を標的とする一つまたは複数の抗体を使用することによって、前記ＩＬ－１７を産生するＤＮＴ細胞が培養後に培養系から除去され、ここで、グループＢは、ＩＬ－１７ａ、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｒａｍｐ１、Ｔｍｅｍ１７６ｂ、Ｔｎｆｒｓｆ４、ＡＡ４６７１９７、Ｉｔｍ２ｂ、Ｔｈｙ１、Ｉｇｔｐ、Ａｒｌ６ｉｐ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｌｔｂ、Ｔｎｆｒｓｆ２５、Ｆｕｒｉｎ、Ｔｍｅｍ１７６ａ、Ｉｆｉ２７ｌ２ａ、Ｇｂｐ２、Ｅｍｐ３、Ｌｔｂ４ｒ１、Ｔｓｐｏ、Ｃｓｔ３、Ｖｉｍ、ＣＤ２００およびその組み合わせからなり、
好ましくは、グループＢは、Ｌｇａｌｓ１、Ｌｙ６ａ、ＣＸＣＲ６、Ｓ１００ａ６、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｔａ、ＩＣＯＳ、Ｓ１００ａ１０、Ｔｎｆｒｓｆ４およびその組み合わせからなる、
請求項４に記載の方法。

【請求項8】

段階（ｂ）において、抗原提示細胞および／または抗原ペプチドの存在下で前記増殖培養が行われる、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

腫瘍、感染性疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギー性喘息、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、脳卒中、およびその組み合わせからなる群から選択される疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、請求項１に記載の細胞製剤の使用。

【請求項10】

医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項４に記載の方法によって調製される細胞製剤、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。

【国際調査報告】