特表 2022-535960 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）でのフコシル化オリゴ糖の生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-10

(54)【発明の名称】バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）でのフコシル化オリゴ糖の生産

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20220803BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20220803BHJP

   C12P 19/00 20060101ALI20220803BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20220803BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20220803BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20220803BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12N1/00 P

C12P19/00

C12P19/04 C

A23L33/10

C12P1/04 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021573425

(86)(22)【出願日】2020-06-08

(85)【翻訳文提出日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 EP2020065835

(87)【国際公開番号】W WO2020249512

(87)【国際公開日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】19179803.2

(32)【優先日】2019-06-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】511149751

【氏名又は名称】クリスチャン．ハンセン・ハー・エム・オー・ゲー・エム・ベー・ハー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イェネバイン，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ワルテンベルク，ディルク

(72)【発明者】

【氏名】ハーバーセッツァー，シュテファーニエ

【テーマコード（参考）】

4B018

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B018LB07

4B018MD31

4B018ME14

4B018MF13

4B064AF04

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD09

4B064DA10

4B065AA15X

4B065AA19X

4B065AA26Y

4B065AA99Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BA02

4B065BA03

4B065BA23

4B065BB15

4B065BB16

4B065BD36

4B065CA21

4B065CA41

(57)【要約】

フコシル化オリゴ糖の生産のための非芽胞形成バチルス細胞並びにフコシル化オリゴ糖を生産するための方法が開示され、ここで、前記バチルス細胞はラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路及びフコシルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フコシル化オリゴ糖の生産のための非芽胞形成バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であって、ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路及びフコシルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている細胞。

【請求項2】

芽胞形成が、Ｓｐｏ０Ａ、ｓｉｇｍａＥ及びｓｉｇｍａＦをコードする遺伝子のうちの１つ以上の欠失又は機能的不活化により損なわれている、請求項１に記載のバチルス細胞。

【請求項3】

ラクトースパーミアーゼが、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬａｃＹ又はその機能的変異体である、請求項１又は２に記載のバチルス細胞。

【請求項4】

ＧＤＰ－フコース生合成経路が、デノボＧＤＰ－フコース生合成経路及び／又はサルベージ経路である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバチルス細胞。

【請求項5】

フコシルトランスフェラーゼが、ラクトース受容フコシルトランスフェラーゼ、好ましくは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの群から選択されるフコシルトランスフェラーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載のバチルス細胞。

【請求項6】

任意のβ－ガラクトシダーゼ活性を欠いているか又は同じ種の野生型前駆体バチルス細胞と比べてβ－ガラクトシダーゼ活性が低下している、請求項１～５のいずれか一項に記載のバチルス細胞。

【請求項7】

ｙｅｓＺ又はｇａｎＡからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失又は機能的不活化により遺伝子操作されている、請求項６に記載のバチルス細胞。

【請求項8】

バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載のバチルス細胞。

【請求項9】

フコシル化オリゴ糖の生産のための、請求項１～８のいずれか一項に記載のバチルス細胞の使用。

【請求項10】

－ 請求項１～８のいずれか一項に定義される非芽胞形成バチルス細胞を提供し；
－ 培地において、フコシル化オリゴ糖の生産に許容的である条件下でバチルス細胞を培養し；並びに、任意選択的に、
－ 培地及び／又はバチルス細胞からフコシル化オリゴ糖を回収する
フコシル化オリゴ糖の生産のための方法。

【請求項11】

培地がラクトースを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

培地がＬ－フコースを含有する、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法により生産されるフコシル化オリゴ糖。

【請求項14】

栄養組成物の、好ましくは、調整粉乳の製造のための、請求項１３に記載のフコシル化オリゴ糖の使用。

【請求項15】

請求項１３に記載のフコシル化オリゴ糖を含有する栄養組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子操作の技術分野に関し、特に、フコシル化オリゴ糖の生産のためのバチルス細胞の遺伝子操作、及び前記遺伝子操作されたバチルス細胞を使用するフコシル化オリゴ糖の微生物生産に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト母乳は幼児に対して最適な栄養特性を有する。ヒト母乳中に存在する糖類は、脂肪及びタンパク質を差し置いて、ヒト乳の主成分となっている。エネルギー源として働くラクトースに加えて、ヒト母乳は、複合糖分子、すなわち、オリゴ糖を１リットル当たり約５～２５グラム含有する。これらのオリゴ糖はヒト乳にのみかなりの濃度で見出され、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）と総称される。

【0003】

およそ２００の構造的に異なるＨＭＯが現在まで同定されている。前記ＨＭＯは二糖ラクトース（グルコース（Ｇｌｃ）部分とガラクトース（Ｇａｌ）部分からなる）に基づいており、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸（ＮｅｕＮＡｃ）、及びガラクトース（Ｇａｌ）に基づいている追加の単糖残基を有する。ヒト乳中のＨＭＯの濃度及び組成は、個体間及び授乳期の間に初乳中の最大２０ｇ／Ｌ～成熟乳中の５～１０ｇ／Ｌまで変動する。

【0004】

いわゆる「分泌型表現型」に属する女性の乳は、α－１，２－フコシル化ＨＭＯを高含量で含有する。これらの女性は、いわゆる「フコシルトランスフェラーゼ２」をコードするＦＵＴ２遺伝子を発現する。彼女たちの乳中最も豊富なＨＭＯは、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ；Ｆｕｃ（α１－２）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオース－Ｉ（ＬＮＰＦ－Ｉ；Ｆｕｃ（α１－２）Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）である。

【0005】

ヒト乳オリゴ糖は、幼児の腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）の中を通過中は消化されない。幼児の腸（ｇｕｔ）でのその持続性のために、オリゴ糖は有益な効果を示す。より具体的には、ＨＭＯは、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）及びラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）という片利共生微生物にとって炭素源として働くので、プレバイオティックであることが示されている。したがって、ＨＭＯは、幼児の腸中でのこれらの微生物の増殖を支えている。

【0006】

ヒト乳オリゴ糖は、それが腸粘膜表面上のグリカン構造体への病原菌の付着を妨げる点で、前記病原菌による幼児の腸への定着も直接低減させる。ＨＭＯは、上皮表面グリカンとのその構造的類似性のためにデコイとして機能し、病原菌の侵入を阻害し、それによって感染症のリスクを低減する。

【0007】

アルファ－１，２－フコシル化ＨＭＯは、非常に一般的な細菌性下痢の原因物質である、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）での感染症に対して防御的であることが示されている。α－１，２－フコシル化ＨＭＯは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の熱安定毒素により引き起こされる下痢に対する防御にも関連している。その上、下痢媒介カリシウイルスでの感染症リスクは、母乳中の高含量のα－１，２－フコシル化ＨＭＯにより低減される。ＨＭＯ、特にフコシル化ＨＭＯラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ；Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）は、院内下痢の最も一般的な原因であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の毒素Ａの炭水化物結合部位に結合する。このようにして、ＨＭＯは、クロストリジウム・ディフィシル由来の毒素Ａと細胞受容体との相互作用を妨げると思われる。

【0008】

さらに、上皮細胞へのシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着は、２’－ＦＬ及び３－フコシルラクトース（３－ＦＬ；Ｇａｌ（β１－４）［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）により有意に阻害された。急性胃腸炎の主原因であるノロウイルス（ノーウォーク様ウイルス、ＮＬＶ）の組織血液型抗原への結合は、α－１，２－フコシル化ＨＭＯにより及びα－１，３－フコシル化ＨＭＯにより妨げられる。これは、宿主受容体グリカンへのノロウイルスカプシド結合を阻害するこれらのＨＭＯの潜在力を示している。

【0009】

ＨＭＯの、特に、フコシル化ＨＭＯの公知の利点のために、これらのオリゴ糖又はこれらのオリゴ糖の少なくとも一部が乳児用調整粉乳用の栄養補助剤として利用可能になるように、その合成のための経済的に価値のある工程が望まれる。

【0010】

個々のヒト乳オリゴ糖の供給は限られておりその純粋な画分を入手するのが困難であるために、これらの複合分子の一部を合成する化学的経路が開発された。しかし、化学合成も生体触媒アプローチも商業的に持続可能にはならなかった。さらに、特に、ヒト乳オリゴ糖の化学合成は、いくつかの有害な化学物質の使用を伴い、この化学物質は最終製品を汚染するリスクをもたらすこととなる。

【0011】

ヒト乳オリゴ糖の化学合成に関連する課題があるために、ＨＭＯを生産するための発酵アプローチが開発された。今日、主に遺伝子操作されたエシェリキア・コリ株を使用する、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯの微生物生産が開示されている。

【0012】

現在では、組換えエシェリキア・コリ細胞が工業規模でのＨＭＯの微生物生産に使用されている。しかし、エシェリキア・コリ属は病原性メンバーも非病原性メンバーも含む。非病原性エシェリキア・コリ株はＨＭＯの微生物生産に用いられているにもかかわらず、そのような非病原性エシェリキア・コリは、種々の管轄においてヒト消費を目的とする製品の製造に対して安全であるとは認識されていない。したがって、前記管轄における商品化に対して前記製品の規制上の承認を得るためには、そのような管轄において安全であると認識されている属の微生物細胞がヒト消費を目的とする化合物の製造に必要とされる。

【0013】

この問題は、ヒト消費に対して安全であると認識され、フコシル化オリゴ糖を生産することができるバチルス属の細菌細胞を使用することにより解決される。

【0014】

バチルス属の細菌は、好気性又は通性に嫌気性種のグラム陽性、桿状、内生芽胞形成微生物細胞である。バチルス属はファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門に属する。バチルス属のメンバーのゲノムは、そのコドン使用においてＡ－Ｔ塩基対に向かうバイアスを有する。バチルス種は自然界にほぼ一様に存在している。バチルス種は、例えば、土壌中に見出される（バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））が、高ｐＨ（バチルス・アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ））、高温（バチルス・サーモフィラス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、又は高塩濃度（バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））などの極端な環境にも存在する。

【0015】

バチルス属は、自由生活性種並びに寄生病原性種を含む２６６の名称付きの種を含む。２つのバチルス種は医学的に重要であると見なされており、バチルス・アンシラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は炭疽病を引き起こし、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）は食中毒を引き起こす。第３の種、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は、昆虫を殺傷する毒素を産生する重要な昆虫病原菌である。したがって、この細菌は害虫を制御する殺虫剤として使用されている。

【0016】

そのＧＲＡＳ（一般に安全だと認められている）ステータスのために、いくつかのバチルス種、例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・サブチリスは、食品及び製薬業において使用される種々のタンパク質及び化合物のバイオテクノロジー生産において使用されている。

【0017】

バチルス・アミロリケファシエンスは制限酵素ＢａｍＨＩの供給源であり、天然の抗生物質タンパク質バルナーゼも合成する。さらに、バチルス・アミロリケファシエンスは、バチルス・アンシラシスに対する選択活性を有する抗生物質であるプランタゾリシンを産生する。バチルス・アミロリケファシエンス由来のアルファ－アミラーゼはデンプン加水分解に使用されることが多い。バチルス・アミロリケファシエンスはサブチリシンの供給源でもあり、これはタンパク質の分解を触媒する。

【0018】

バチルス・アミロリケファシエンスは、農業、水産養殖及び水性栽培においていくつかの植物根病原菌と闘うために使用される根定着細菌である。なぜならば、バチルス・アミロリケファシエンスは細菌及び真菌病原体に対して作用し、競争的排除又は望ましくない病原菌を打ち負かすことにより感染を予防しうるからである。

【0019】

アルカリセリンプロテアーゼを分泌する能力が高いために、バチルス・リケニフォルミスは、産業的酵素生産において最も重要な細菌の１つとなっている。バチルス・リケニフォルミスにより分泌されるサブチリシンカールスバーグは洗浄プロテアーゼとして使用され、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）の商品名で販売されている。

【0020】

バチルス・サブチリスは、土壌並びに反芻動物及びヒトの消化管に見出されるカタラーゼ陽性細菌である。バチルス・サブチリス及びこのエンドトキシンフリー細菌由来の物質は、食物中でのその安全で有益な使用について異なる当局機関により評価されてきた。アメリカ合衆国では、バチルス・サブチリス由来のカルボヒドラーゼ及びプロテアーゼ酵素は米国食品安全性管理（ＦＤＡ）により一般的に安全である（ＧＲＡＳ）と認められている。バチルス・サブチリスは、欧州食品安全機関により「安全性適格推定」ステータスとも認められてきた。

【0021】

さらに、バチルス・サブチリス株の無毒性及び無病原性株は食品に一般的に使用された。例えば、納豆の形態の発酵ダイズ豆は、日本で広く消費されているが、１グラム当たり１０^８もの生存可能なバチルス・サブチリス細胞を含有する。発酵豆は、健康な腸内フローラ及びビタミンＫ_２摂取へのその寄与が認められている。納豆製品及びその主成分としてのバチルス・サブチリス・ナットー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｎａｔｔｏ）は、健康の維持に効果的であると日本厚生労働省に認可されたＦＯＳＨＵ（特定保健用食品）である。

【0022】

バチルス・サブチリスは扱いやすく、成長が速く培養条件が簡単である。組換えバチルス・サブチリス株は、ポリヒドロキシアルカノエート、ヒアルロン酸並びにアミラーゼ及びプロテアーゼなどの種々の酵素の生産に使用されている。

【0023】

バチルス・サブチリスの野生型天然単離菌は、変異誘発及び選択の順化工程を経ている実験室株と比べて、扱いが難しい。これらの順化株は、天然のコンピテント発達（環境ＤＮＡの取込み及び組込み）、成長、及び「野生の状態で」必要とされる能力の喪失を経験する能力が改善されていることが多い。バチルス・サブチリスでは、直鎖状ＤＮＡ並びに多量体形態のプラスミドＤＮＡは、天然のコンピテント細胞により積極的に吸収される。

【0024】

ある特定の生理条件下では、バチルス・サブチリス細胞の小下位集団はコンピテントになる。バチルス・サブチリスでは、天然のコンピテンスは複雑な制御ネットワークにより制御されている。このネットワークでの重要な制御因子は、とりわけ、コンピテンスの主要制御因子ＣｏｍＫ及び芽胞形成の転写主要制御因子Ｓｐｏ０Ａである。バチルス・サブチリス細胞の形質転換効率及びおそらくそのゲノム中にＤＮＡを組み込む効力は遺伝子操作により改善することが可能である。これは、制御されたプロモーター（例えば、マンニトール誘導性Ｐ_ｍｔｌＡプロモーター）並びに遺伝子ｃｏｍＫ及びｃｏｍＳを含む発現カセットをバチルス・サブチリスのゲノム中に異所的に組み込むことにより達成することができる。さらに、この戦略により、複合培地（例えば、ＬＢ）を使用する天然のコンピテンスによるバチルス・サブチリスの形質転換が可能になる。

【0025】

フコシル化糖の生産では、バチルス・サブチリスは種々の方法により遺伝的に改変することが可能である。

【0026】

遺伝子組込み及び／又は破壊若しくは欠失による（同時の）遺伝子不活化は、相同組換えにより達成することができる。効率的な相同組換えには、バチルス・サブチリスにおいて少なくとも４００～５００ｂｐの相同アームが必要である。

【0027】

標的にされたゲノム操作のための別の方法は、最新のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムである。この迅速でマーカーレスのゲノム編集ツールは、大規模ゲノム欠失、小さな及び大きなＤＮＡ挿入、停止コドンの導入による遺伝子サイレンシング並びに点突然変異の導入に使用することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による痕跡を残さないゲノム編集には以前のゲノム改変を必要としない。

【0028】

遺伝子のランダムな染色体組込み及び挿入変異は、改変ｍａｒｉｎｅｒ由来トランスポゾンを使用して実施することができる。このシステムは、バチルス・サブチリスではホットポットへの偏りはなく、一方、ランダムな異所的組込みにおいて高い効率を示す。

【0029】

バチルス種は酵素の工業規模の生産に使用されているが、バチルス細胞は、現在まで、オリゴ糖の、特に、フコシル化オリゴ糖の工業規模での生産のための実施に供されたことがない。

【0030】

中国特許出願ＣＮ １０８ ４１０ ７８７ Ａは、ラクチル－Ｎ－ネオテトラオースを合成する組換えバチルス・サブチリス細胞を開示している。前記組換えバチルス・サブチリス細胞は、細胞ゲノム中に組み込まれているラクトースパーミアーゼ遺伝子を有する。さらに、前記バチルス細胞は、ベータ－１，３－Ｎ－グルコサミントランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを有している。バチルス・サブチリス細胞は外因性ラクトースの存在下で培養することができ、約１ｇ／Ｌまでの力価でラクチル－Ｎ－ネオテトラオースを合成するが、この量では経済的に合理的な工業規模の生産には少なすぎる。

【0031】

多種多様な特許出願がバチルスをラクチル－Ｎ－ネオテトラオースなどのオリゴ糖の生産に適している属として言及しているが、おそらく、バチルスにおいてＨＭＯ生産に必要な生合成経路を実行するためには代謝工学的操作でのかなりの努力が必要とされるために、フコシル化オリゴ糖の、特に、フコシル化ヒト乳オリゴ糖の生産のためのバチルスの商業的使用はまだ実行されたことがなかった。ＬＮｎＴの生産用の上述のバチルス・サブチリスは、バチルス・サブチリス細胞中に天然に存在するドナー基質に頼っているが、バチルスでのフコシル化オリゴ糖の生産には、必要とされるドナー基質であるＧＤＰ－フコースを提供するための異種代謝経路の細胞中での実行が必要である。

【0032】

中国特許出願ＣＮ１０９ ７３５ ４７９ Ａは、２’－フコシルラクトースを合成するための組換えバチルス・サブチリス細胞を開示しており、そこではラクトース輸送酵素の発現は増強されており、その細胞はフコースキナーゼ、リン酸グアニントランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼを発現する。発酵培地での２’－フコシルラクトースの収量は、０．４２４ｇ／Ｌ～１．０４２ｇ／Ｌであると報告されていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0033】

【特許文献1】中国特許出願公開第１０８４１０７８７号明細書

【特許文献2】中国特許出願公開第１０９７３５４７９号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0034】

それにもかかわらず、フコシル化オリゴ糖の生産のためにバチルス属の細菌細胞を提供することが本発明の目的であった。

【課題を解決するための手段】

【0035】

この目的は、細胞中への外因性ラクトースの移入のためのラクトースパーミアーゼを有するバチルス細胞、ＧＤＰ－フコースを提供するためのデノボＧＤＰ－フコース生合成経路、及びＧＤＰ－フコースからラクトースへのフコース部分の輸送のためのフコシルトランスフェラーゼを提供することにより達成された。前記バチルス細胞は、フコシル化オリゴ糖を生産するように外因性ラクトースの存在下で培養することができる。

【0036】

（発明の要旨）
第１の態様によれば、フコシル化オリゴ糖の生産のためのバチルス属の非芽胞形成細菌細胞が提供され、バチルス細胞は、ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路、及びフコシルトランスフェラーゼを有する。

【0037】

第２の態様によれば、フコシル化オリゴ糖の生産のための第１の態様に従ったバチルス属の非芽胞形成細菌細胞の使用が提供される。

【0038】

第３の態様によれば、フコシル化オリゴ糖の生産のための方法であって、
－ バチルス属の非芽胞形成細菌細胞を提供することであって、前記バチルス細胞はラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路、及びラクトース受容フコシルトランスフェラーゼを有すること；
－ ラクトースを含有する培養培地において、バチルス細胞がフコシル化オリゴ糖を生産することに許容的である条件下で、バチルス細胞を培養すること；並びに
－ 任意選択的に、培養培地及び／又はバチルス細胞からフコシル化オリゴ糖を回収すること
を含む方法が提供される。

【0039】

第４の態様によれば、ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路及びフコシルトランスフェラーゼを有するバチルス細胞により生産されたフコシル化オリゴ糖が提供される。

【0040】

第５の態様によれば、栄養組成物の製造のためにラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路及びフコシルトランスフェラーゼを有するバチルス細胞により生産されたフコシル化オリゴ糖の使用が提供される。

【0041】

第６の態様によれば、ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路及びフコシルトランスフェラーゼを有するバチルス細胞により生産された少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖を含有する栄養組成物が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本発明は、フコシル化オリゴ糖の生産のためのバチルス細胞、ラクトースを含有する培養培地において、及び前記バチルス細胞による前記フコシル化オリゴ糖の生産に許容的である条件下で前記バチルス細胞を培養することによりフコシル化オリゴ糖を生産するためのその使用及び方法に関する。

【0043】

フコシル化オリゴ糖を生産することができるためには、バチルス細胞は、フコシルトランスフェラーゼがフコシル部分をドナー基質から前記アクセプター基質に移動させ、それによってフコシル化オリゴ糖を生成することができるように、フコシル部分を含むドナー基質及び二糖又はオリゴ糖であるアクセプター基質をフコシルトランスフェラーゼに提供しなければならない。

【0044】

フコシル化オリゴ糖（前記バチルス細胞が生産するよう意図されている）が、所望のフコシル化オリゴ糖であり、所望のフコシル化オリゴ糖の生産中にフコシルトランスフェラーゼが無差別的であるために生成される場合がある他のフコシル化オリゴ糖は望ましくないフコシル化オリゴ糖又は副産物と見なされることは理解されるべきである。適切なドナー基質はＧＤＰ－Ｌ－フコースであり、フコシルラクトースを生成するのに適したアクセプター基質は二糖ラクトースである。こうして得られた所望のフコシル化オリゴ糖は、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース又は２’，３－ジフコシルラクトースである。

【0045】

野生型バチルス細胞はラクトースを細胞内で合成しないし、外因性ラクトースを内部移行も代謝もしない。しかし、ラクトースは、一部のフコシル化オリゴ糖の形成におけるラクトース受容フコシルトランスフェラーゼによるフコース部分に対するアクセプター基質である。したがって、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース又は２’，３－ジフコシルラクトースなどのフコシル化オリゴ糖を生産することができるためには、バチルス細胞は、ラクトースを細胞内で生成することにより及び／又は外因性ラクトースを内部移行することにより、ラクトースをラクトース受容フコシルトランスフェラーゼに提供できる能力を持たなければならない。

【0046】

ある実施形態では、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、ラクトースパーミアーゼを有することにより外因性ラクトースを内部移行することができる。本明細書で使用されるラクトースに関する用語「外因性」とは、バチルス細胞を起源としない、すなわち、バチルス細胞により細胞内で合成されないラクトースであるが、バチルス細胞以外を起源とし、フコシル化オリゴ糖を生産するようにバチルス細胞を生育している培養培地に添加されるラクトースのことである。

【0047】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、外因性ラクトースを内部移行させることができる、すなわち、ラクトースパーミアーゼを有するように遺伝子操作されている。したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、異種ラクトースパーミアーゼを有する。適切なラクトースパーミアーゼは、エシェリキア・コリＬａｃＹ又はその機能的変異体である。

【0048】

タンパク質、ポリペプチド、酵素及びトランスポーターに関して、しかし、核酸分子及び／又はヌクレオチド配列に関しても本明細書で使用される用語「異種の」とは、前記分子を含有する細胞の種にとってノンネイティブである分子のことである。用語「ノンネイティブ」は、前記分子が、バチルス細胞の、天然に存在するか又は野生型の前駆細胞、すなわち、自然界に非常に一般的に存在する同じ種の細胞に存在しないことを示す。

【0049】

酵素及び／又は輸送分子に関して本明細書で使用される用語「機能的変異体」とは、参照酵素又はトランスポーターと同じ活性（酵素的、触媒的又は移動させる）を有するが、参照酵素又はトランスポーター分子とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドのことである。したがって、タンパク質／ポリペプチドの典型的な変異体はアミノ酸配列が参照タンパク質／ポリペプチドと異なる。変異タンパク質／ポリペプチドと参照タンパク質／ポリペプチドは、アミノ酸配列において１つ以上の置換、付加、及び／又は欠失がいかなる組合せでも異なりうる。したがって、用語「機能的変異体」は、参照タンパク質／ポリペプチドと同じ活性を有する参照タンパク質／ポリペプチドの切詰めバージョンを含む。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたアミノ酸残基でもよくそうでなくてもよい。タンパク質／ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異型などの天然に存在する変異体でもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体でもよい。タンパク質／ポリペプチドの天然に存在しない変異体は、変異誘発技法により、直接的合成により、及び当業者には公知である他の組換え法により作製しうる。本開示の範囲内では、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、又はそれよりも多いアミノ酸の領域にわたって、参照ポリペプチドに対して、約６０％アミノ酸配列同一性よりも大きな、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はそれよりも大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列／核酸配列を有するタンパク質及び種間相同体も用語「変異体」に含まれる。

【0050】

本明細書で使用される用語「同じ活性」とは、質的方法によってのみ、タンパク質／ポリペプチドの酵素活性、触媒活性又は輸送活性のことである。したがって、「機能的変異体」は、参照タンパク質／ポリペプチドの活性と比べて増加した又は減少した活性を有する変異体も含む。

【0051】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、エシェリキア・コリ ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0052】

エシェリキア・コリ ラクトースパーミアーゼＬａｃＹは、エシェリキア・コリｌａｃＹ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１４８７７．１）のタンパク質コード領域（すなわち、オープンリーディングフレーム）によりコードされている。したがって、ある実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリ ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0053】

追加の及び／又は代替の実施形態では、異種ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用は、バチルスのコドン使用に適応されている。例えば、バチルス・サブチリスのコドン使用は、全ＧＣ含有量が約４５％未満であり、コドンの第１文字のＧＣ含有量は約５１％より大きく、コドンの第２文字のＣＧ含有量は約３６．１％未満であり、コドンの第３文字のＣＧ含有量は約４６％未満である点で独特である。

【0054】

ラクトースパーミアーゼの発現では、バチルス細胞は組換えラクトースパーミアーゼ遺伝子を含有しており、ここで、ラクトースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列はラクトースパーミアーゼオープンリーディングフレームの発現を媒介する発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0055】

本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」とは、核酸／遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列（典型的には「タンパク質コード領域」、「オープンリーディングフレーム」と呼ばれ、「遺伝子」とさえ呼ばれることもある）の間の機能的な連鎖を意味するものとし、ここで、発現制御配列は、第２の配列に従ってヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を引き起こす。したがって、用語「プロモーター」は、通常ＤＮＡポリマー中のオープンリーディングフレームに「先行し」、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供するＤＮＡ配列を指示する。「制御因子」ＤＮＡ配列は、通常は、所与のＤＮＡポリマー中のオープンリーディングフレームの「上流」（すなわち、先行する）であるが、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質に結合する。「プロモーター／制御因子」又は「制御」ＤＮＡ配列と総称されているが、機能的なＤＮＡポリマー中の選択されたオープンリーディングフレーム（又は一連のオープンリーディングフレーム）に先行するこれらの配列は協働して、オープンリーディングフレームの転写（及び最終的な発現）が起こるかどうかを決定する。ＤＮＡポリマー中の遺伝子「に続き」ｍＲＮＡへの転写の終結シグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。

【0056】

組換えラクトースパーミアーゼ遺伝子はバチルス染色体中に組み込まれている、又はバチルス細胞内のプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0057】

バチルス細胞での異種ラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現により、得られたバチルス細胞は培養培地から外因的に供給されるラクトースを内部移行することができる。次に、内部移行されたラクトースは、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質として働くことができる（本明細書の下を参照）。

【0058】

フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、フコシル部分をアクセプター基質に移動させるためのドナー基質を提供できなければならない。フコシル部分のドナー基質はＧＤＰ－フコースである。したがって、バチルス細胞は細胞内でＧＤＰ－フコースを生成することができなければならない。ＧＤＰ－フコースの細胞内生合成では、バチルス細胞はＧＤＰ－フコース生合成経路を有する。バチルスは、ＧＤＰ－フコース生合成経路を有するように遺伝子操作されている。ＧＤＰ－フコース生合成経路は、デノボＧＤＰ－フコース生合成経路でもよく及び／又はＧＤＰ－フコースサルベージ経路でもよい。

【0059】

ある実施形態では、バチルス細胞は、ＧＤＰ－フコースの細胞内生合成のためのデノボＧＤＰ－フコース生合成経路を有する。バチルス細胞は、デノボＧＤＰ－フコース生合成経路を有するように遺伝子操作されている。

【0060】

デノボＧＤＰ－フコース生合成経路は、以下の酵素：
１．フルクトース－６－リン酸イソメラーゼ；
２．ホスホマンノムターゼ；
３．ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ；
４．ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ；及び
５．ＧＤＰ－フコースシンターゼ
の活性を含む。

【0061】

したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼ（典型的には、マンノース－６－リン酸イソメラーゼとも呼ばれる）、ホスホマンノムターゼ、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ、及びＧＤＰ－フコースシンターゼを有する。

【0062】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ、及びＧＤＰ－フコースシンターゼを有するように遺伝子操作されている。

【0063】

ＧＤＰ－フコース生合成の新規経路は、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼにより触媒される反応であるフルクトース－６－リン酸からマンノース－６－リン酸への異性化から始まる。追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。適切なフルクトース－６－リン酸は、エシェリキア・コリＭａｎＡ又はその機能的変異体である。例となるヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリＭａｎＡをコードするヌクレオチド配列である。

【0064】

エシェリキア・コリ フルクトース－６－リン酸イソメラーゼＭａｎＡは、エシェリキア・コリｍａｎＡ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６１３０．３）のタンパク質コード領域によりコードされている。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＭａｎＡ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0065】

エシェリキア・コリ フルクトース－６－リン酸イソメラーゼＭａｎＡは、エシェリキア・コリｍａｎＡ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６１３０．３）のオープンリーディングフレームによりコードされている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリｍａｎＡ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。

【0066】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用は、バチルスのコドン使用に適応されている。

【0067】

他の適切なフルクトース－６－リン酸イソメラーゼは、バチルス・サブチリスＭａｎＡ並びにパラロガスタンパク質であるバチルス・サブチリスＧｍｕＦ（ＹｄｈＳ）及びバチルス・サブチリスＰｍｉ（Ｙｖｙｌ）又はその機能的変異体である。例となるヌクレオチド配列は、バチルス・サブチリスＭａｎＡ、バチルス・サブチリスＧｍｕＦ又はバチルス・サブチリスＰｍｉをコードするヌクレオチド配列である。バチルス・サブチリスフルクトース－６－リン酸イソメラーゼＭａｎＡは、バチルス・サブチリスｍａｎＡ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿３８９０８４．１）のオープンリーディングフレームによりコードされている。

【0068】

バチルス・サブチリスフルクトース－６－リン酸イソメラーゼＭａｎＡは、バチルス・サブチリスｍａｎＡ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿３８９０８４．１）のタンパク質コード領域によりコードされている。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、バチルス・サブチリスＭａｎＡ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、バチルス・サブチリスｍａｎＡ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。別の追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、バチルス・サブチリスｇｍｕＦ遺伝子若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列及び／又はバチルス・サブチリスｐｍｉ遺伝子若しくはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0069】

追加の及び／又は代替の実施形態では、天然のｍａｎＡ遺伝子、天然のｇｍｕＦ遺伝子及び／又は天然のｐｍｉ遺伝子の発現を増加させることができる。天然のｍａｎＡ遺伝子、天然のｇｍｕＦ遺伝子及び／又は天然のｐｍｉ遺伝子の発現は、天然のｍａｎＡ遺伝子、天然のｇｍｕＦ遺伝子及び天然のｐｍｉ遺伝子のうちの少なくとも１つの内因性プロモーターがもっと強力なプロモーター、すなわち、ｍａｎＡ遺伝子、ｇｍｕＦ遺伝子及びｐｍｉ遺伝子のそれぞれの天然のプロモーターと比べて、増加した発現を媒介するプロモーターで置き換えられる点で増加させることができる。別の追加の又は代替の実施形態では、天然のｍａｎＡ遺伝子、天然のｇｍｕＦ遺伝子及び／又は天然のｐｍｉ遺伝子の発現は、天然のｍａｎＡ遺伝子、天然のｇｍｕＦ遺伝子及び／又は天然のｐｍｉ遺伝子の追加のコピーがバチルス細胞で増殖される点で増強することができる。

【0070】

別の追加の又は代替の実施形態では、天然のｍａｎＡ遺伝子の発現は、天然のｍａｎＡ遺伝子の構成的発現をもたらすマンノーストランスポーターをコードするｍａｎＰ遺伝子の欠失又は機能的不活化により増強することができる。

【0071】

別の追加の又は代替の実施形態では、天然のｇｍｕＦ遺伝子の発現は、対応する転写リプレッサーをコードするｇｍｕＲ遺伝子の欠失又は機能的不活化により増強することができる。

【0072】

フルクトース－６－リン酸イソメラーゼの発現では、バチルス細胞は、組換えフルクトース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子を含有しており、ここで、フルクトース－６－リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0073】

組換えフルクトース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はバチルス細胞内でプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0074】

デノボＧＤＰ－フコース生合成の第２のステップでは、マンノース－６－リン酸は、ホスホマンノムターゼの酵素活性によりマンノース－１－リン酸に変換される。追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ホスホマンノムターゼをコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0075】

適切なホスホマンノムターゼは、エシェリキア・コリ ホスホマンノムターゼＭａｎＢである。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＭａｎＢ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0076】

エシェリキア・コリ ホスホマンノムターゼＭａｎＢは、エシェリキア・コリＭａｎＢ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５２．１）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列によりコードされている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＭａｎＢ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。

【0077】

追加の及び／又は代替の実施形態では、ホスホマンノムターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用は、バチルスのコドン使用に適応されている。

【0078】

ホスホマンノムターゼの発現では、バチルス細胞は、組換えホスホマンノムターゼ遺伝子を含有しており、ここで、ホスホマンノムターゼをコードするヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0079】

組換えホスホマンノムターゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はバチルス細胞中にプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0080】

ＧＤＰ－フコースのデノボ生合成経路での次のステップは、以下の反応：
α－Ｄ－マンノース－１－リン酸＋ＧＴＰ＋Ｈ^＋＝＞二リン酸＋ＧＤＰ－α－Ｄ－マンノース
によるＧＤＰ－マンノースの形成である。

【0081】

マンノース－１－リン酸のＧＤＰ－マンノースへの変換は、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼにより媒介される。したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、異種ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼを有する。適切なＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼはエシェリキア・コリＭａｎＣ又はその機能的変異体である。

【0082】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。例となるヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリＭａｎＣをコードするヌクレオチド配列である。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＭａｎＣ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0083】

エシェリキア・コリＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼＭａｎＣは、エシェリキア・コリＭａｎＣ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５３．１）のオープンリーディングフレームによりコードされている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＭａｎＣ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。

【0084】

追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0085】

ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼの発現では、バチルス細胞は、組換えＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有し、ここで、ＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0086】

組換えＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0087】

デノボＧＤＰ－フコース経路に引き続くステップでは、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼにより触媒されて、ＧＤＰ－Ｄ－マンノースは、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースに変換される。

【0088】

したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼを有する。適切なＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼはエシェリキア・コリＧｍｄである。

【0089】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。例となるヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリＧｍｄをコードするヌクレオチド配列である。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＧｍｄ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0090】

エシェリキア・コリＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼＧｍｄは、エシェリキア・コリｇｍｄ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５７．１）のオープンリーディングフレームによりコードされている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリｇｍｄ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。

【0091】

追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0092】

ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼの発現では、バチルス細胞は、組換えＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ遺伝子を含有し、ここで、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0093】

組換えＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0094】

デノボＧＤＰ－フコース生合成経路の最終反応では、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースは、２段階ＮＡＤＰＨ依存性反応によりＧＤＰ－フコースに変換される。この変換は、ＧＤＰ－フコースシンターゼにより媒介され、エピメラーゼ反応及びレダクターゼ反応を含む。前記エピメラーゼ反応はＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシマンノースをＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシガラクトースに変換し、次にＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシガラクトースはＧＤＰ－フコースに還元される。

【0095】

したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、ＧＤＰ－フコースシンターゼを有する。適切なＧＤＰ－フコースシンターゼはエシェリキア・コリＷｃａＧ又はその機能的変異体である。

【0096】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ＧＤＰ－フコースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。例となるヌクレオチド配列は、エシェリキア・コリＷｃａＧをコードするヌクレオチド配列である。したがって、追加の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＷｃａＧ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0097】

エシェリキア・コリＧＤＰ－フコースシンターゼＷｃａＧは、エシェリキア・コリｗｃａＧ遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５６．１）のオープンリーディングフレームによりコードされている。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、エシェリキア・コリｗｃａＧ遺伝子又はその機能的変異体を含有する。

【0098】

追加の及び／又は代替の実施形態では、ＧＤＰ－フコースシンターゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0099】

ＧＤＰ－フコースシンターゼの発現では、バチルス細胞は、組換えＧＤＰ－フコースシンターゼ遺伝子を含有し、ここで、ＧＤＰ－フコースシンターゼをコードするヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0100】

組換えＧＤＰ－フコースシンターゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0101】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ＧＤＰ－フコースの細胞内生合成のためのＧＤＰ－フコースサルベージ経路を有する。ＧＤＰ－Ｌ－フコースのサルベージ経路では、遊離のサイトゾルフコースはＬ－フコキナーゼによりリン酸化されてＬ－フコース－Ｌ－リン酸を形成し、次にＬ－フコース－Ｌ－リン酸はＧＤＰ－Ｌ－フコースにさらに変換される。

【0102】

ＧＤＰ－フコースの生合成のためのサルベージ経路は以下の酵素：
Ｉ．フコースキナーゼ；及び
ＩＩ．Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ
を含む。

【0103】

したがって、ＧＤＰ－フコースサルベージ経路を有するフコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、フコースキナーゼ及びＬ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼを有する。

【0104】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、フコースキナーゼ及びＬ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている。

【0105】

フコースキナーゼは、フコキナーゼ、ＡＴＰ：６－デオキシ－Ｌ－ガラクトース１－ホスホトランスフェラーゼ、ＡＴＰ：β－Ｌ－フコース１－ホスホトランスフェラーゼ又はＬ－フコキナーゼ活性、Ｌ－フコースキナーゼ活性とも呼ばれるが、反応Ｌ－フコース＋ＡＴＰ→β－Ｌ－フコース－１－リン酸＋ＡＤＰ＋２Ｈ^＋を触媒する。

【0106】

次に、Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ又はＧＤＰ－Ｌ－フコースピロホスホリラーゼは前記β－Ｌ－フコース－１－リン酸をＧＤＰ－Ｌ－フコースに変換する。

【0107】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、フコースキナーゼ又はその機能的変異体、及びＬ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0108】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコースキナーゼ及びＬ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼは単一のポリペプチドに組み合わされる。フコースキナーゼ、フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ及び／又は二機能性Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする形質転換に適した遺伝子は、バクテロイデス属、レンティスファエラ属（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ソリバクター属（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、オリザ属（Ｏｒｙｚａ）、フィスコミトレラ属（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、ビチス属（Ｖｉｔｉｓ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、ボス属（Ｂｏｓ）、エクウス属（Ｅｑｕｕｓ）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）、パン属（Ｐａｎ）、ホモ属（Ｈｏｍｏ）、ラッタス属（Ｒａｔｔｕｓ）、ムス属（Ｍｕｓ）及びゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）から得ることができる。二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼの例は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）に見出される。

【0109】

バクテロイデス・フラジリスでは、二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼＦｋｐは、バクテロイデス・フラジリスｆｋｐ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＹ８４９８０６）によりコードされている。

【0110】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、バクテロイデス・フラジリスＦｋｐ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0111】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコースキナーゼ、フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ及び／又は二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0112】

フコースキナーゼ及びフコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼの発現では、バチルス細胞は少なくとも１つの組換え遺伝子を含有し、ここで、フコースキナーゼ及びＬ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ及び／又は二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼフコースキナーゼをコードするタンパク質コード領域は、発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0113】

組換えフコースキナーゼ遺伝子、フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又は二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0114】

フコシルラクトースの細胞内形成では、バチルス細胞はフコシルトランスフェラーゼを有する。フコシルトランスフェラーゼの酵素活性は、フコシル部分をドナー基質からアクセプター基質へ移動させる。フコシルラクトースの生合成では、前記アクセプター基質はラクトースである。したがって、フコシルトランスフェラーゼは、ラクトース受容フコシルトランスフェラーゼである。

【0115】

フコシルトランスフェラーゼは、２’－フコシルラクトースの生合成のためのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び３－フコシルラクトースの生合成のためのα－１，３－フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。

【0116】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、フコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0117】

２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）を生産するためには、エシェリキア・コリＯ１２６由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬ及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のＦｕｃＴ２（ＥＰ ２ ４７９ ２６３ Ｂ１）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）Ｏ２２由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＷｂｌＡ、ヘリコバクター・ビリス（Ｈ．ｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ ４３７８７９由来のＦｕｔＤ 、ヘリコバクター・シネディ（Ｈ．ｃｉｎａｅｄｅ）ＣＣＵＧ １８８１８由来のＦｕｔＥ 、バクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）ＡＴＣＣ ８４８２由来のＦｕｔＮ、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）ＡＴＣＣ ８４８３由来のＦｕｔＯ、エシェリキア・コリＯ５５：Ｈ７由来のＷｂｇＮ、バクテロイデス・フラジリスＮＣＴＣ ９３４３由来のＢｆｔ１及びＢｆｔ３（ＷＯ ２０１４／０１８５９６ Ａ２）、並びにルイスＹ及びルイスＢ糖類の合成のためのヘリコバクター・ピロリ由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２（ＵＳ ６，６７０，１６０ Ｂ２）は記載されており、バチルス細胞での２’－ＦＬ生合成に適したα－１，２－フコシルトランスフェラーゼである。

【0118】

３－フコシルラクトースを生産するためには、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）由来のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼＡｍｕｃ、及びバクテロイデス・フラジリス由来のＦｕｃＴ６及びＦｕｃＴ７（ＥＰ ２ ４３９ ２６４ Ａ１）、ヘリコバクター・ピロリ由来のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＡ（ＵＳ ２０１４／０１２０６１１ Ａ１）は記載されており、バチルス細胞での３－ＦＬ生合成に適したα－１，３－フコシルトランスフェラーゼである。さらに、ＷＯ ２０１６／０４０５３１ Ａ１は、３－フコシルラクトース及びラクトジフコテトラオースの合成のためのバクテロイデス・ノルディ（Ｂ．ｎｏｒｄｉｉ）ＣＬ０２Ｔ１２Ｃ０５由来のα－１，３－フコシルトランスフェラーゼＣａｆＣ並びにＬＮｎＦＰ－ＩＩＩの生産のためのヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５１４４９由来のＣａｆＤを開示している。

【0119】

フコシル化糖類の生産のためバチルス細胞で発現させることができる追加のフコシルトランスフェラーゼはＷＯ ２０１９／００８８１３３ Ａ１に開示されており、前記特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0120】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0121】

フコシルトランスフェラーゼの発現では、バチルス細胞は少なくとも１つの組換え遺伝子を含有し、ここで、フコシルトランスフェラーゼをコードするタンパク質コード領域は、発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0122】

組換えフコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0123】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は、Ｌ－フコースを内部移行することができる。Ｌ－フコースを内部移行する能力は、ＧＤＰ－フコースサルベージ経路を有するバチルス細胞にとり有利である。

【0124】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、Ｌ－フコースの内部移行を可能にするか又は改善するように遺伝子操作されている。したがって、バチルス細胞は、異種Ｌ－フコースパーミアーゼを有する。適切なＬ－フコースパーミアーゼは、エシェリキア・コリＦｕｃＰ又はその機能的変異体である。

【0125】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、Ｌ－フコースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、エシェリキア・コリＦｕｃＰ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0126】

エシェリキア・コリＬ－フコースパーミアーゼは、エシェリキア・コリｆｕｃＰ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１７２８１．１）のタンパク質コード領域によりコードされている。したがって、バチルス細胞は、エシェリキア・コリＦｕｃＰ又はその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含有し発現するように遺伝子操作されている。

【0127】

追加の及び／又は代替の実施形態では、Ｌ－フコースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン使用はバチルスのコドン使用に適応されている。

【0128】

Ｌ－フコースパーミアーゼの発現では、バチルス細胞は組換えＬ－フコースパーミアーゼ遺伝子を含有し、ここで、Ｌ－フコースパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0129】

組換えＬ－フコースパーミアーゼ遺伝子は、バチルス染色体中に組み込まれているか又はプラスミド上のエピソームバージョンとして存在している場合もある。

【0130】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞は任意のβ－ガラクトシダーゼ活性を欠いているか又は同じ種の野生型バチルス細胞と比べてβ－ガラクトシダーゼ活性が減少している。

【0131】

フコシル化オリゴ糖の細胞内生合成には、ラクトース受容フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質としてのラクトースの移入を必要とする。内部移行されたラクトースを加水分解するいかなる細胞内酵素活性もフコシルラクトース形成の有効性に影響を及ぼすと考えられる。なぜならば、細胞内ラクトースのプールが減少すると考えられるからである。したがって、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞が、β－ガラクトシダーゼ活性を欠いているか又は、野生型バチルス細胞と比べた場合、少なくともβ－ガラクトシダーゼ活性が減少しているならば有利であると考えられる。

【0132】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、細胞のβ－ガラクトシダーゼ活性を消失しているか又は少なくとも減少しているように遺伝子操作されている。

【0133】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ｇａｎＡ遺伝子の欠失又は機能的不活化により遺伝子操作されている。別の実施形態では、バチルス細胞は、野生型バチルス細胞と比べた場合、ｇａｎＡ遺伝子の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている。

【0134】

バチルスｇａｎＡ遺伝子は、ｙｖｆＮ又はｌａｃＡとも呼ばれる。ガラクタンの利用に関与している酵素をコードする遺伝子を含有するのはＧａｎＲレギュロンの遺伝子である。ｇａｎＡ遺伝子は、バチルスのガラクタン利用に関与しているベータガラクトシダーゼをコードする。

【0135】

ｇａｎＡ遺伝子を欠失するか又は機能的に不活化すると、バチルス細胞においてＧａｎＡ媒介β－ガラクトシダーゼ活性は消失し、ｇａｎＡ発現が減少するとバチルス細胞でのＧａｎＡの量が低下し、したがって、フコシル化オリゴ糖の生合成を妨害するおそれがあるβ－ガラクトシダーゼ活性が低下する。

【0136】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ｙｅｓＺ遺伝子の欠失又は機能的不活化により遺伝子操作されている。バチルスｙｅｓＺ遺伝子は、植物細胞壁に由来するラムノガラクツロナンの分解で役割を果たしているベータガラクトシダーゼＹｅｓＺをコードする。バチルスｙｅｓＺ遺伝子の発現は、ラムノガラクツロナンＩにより誘導される。別の実施形態では、バチルス細胞は、野生型バチルス細胞と比べてｙｅｓＺ遺伝子の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている。

【0137】

ｙｅｓＺ遺伝子を欠失するか又は機能的に不活化すると、バチルス細胞においてｙｅｓＺ媒介β－ガラクトシダーゼ活性は消失し、ｙｅｓＺ発現が減少するとバチルス細胞でのｙｅｓＺの量が低下し、したがって、フコシル化オリゴ糖の生合成を妨害するおそれがあるβ－ガラクトシダーゼ活性が低下する。

【0138】

バチルス・サブチリスは、ポスト指数増殖期に入ると、多量の細胞外プロテアーゼを産生（し始める）する。外来性タンパク質は多くの場合プロテアーゼ感受性である。したがって、無エキソプロテアーゼ株は異種タンパク質の安定性を増加し、高レベルの外来性タンパク質を蓄積させるのに望ましい。バチルスのゲノムは、少なくとも８つの細胞外プロテアーゼ、すなわち、ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ及びｗｐｒＡをコードする。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、細胞外プロテアーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、好ましくは、ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ及びｗｐｒＡからなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つが欠失しているか又は機能的に不活化されている点で遺伝子操作されている。好ましくは、ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ及びｗｐｒＡからなる群から選択される遺伝子のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つが欠失しているか又は機能的に不活化されている。

【0139】

バチルス・サブチリスは、グルコース又はラクトースなどの炭水化物を含有する培地で成長する場合、プルケリミン酸を合成する。排出されたプルケリミン酸は、成長培地に鉄が存在すると、プルケリミン酸の塩である赤色色素のプリケリミン（鉄キレート）を形成する。発酵工程中のこの望ましくない副産物の形成は、遺伝子ｙｖｍＣ及び／又はｃｙｐＸの欠失又は破壊により回避する／消失させることができる。遺伝子ｙｖｍＣはシクロペプチドシンターゼをコードし、遺伝子ｃｙｐＸはシトクロームＰ４５０シクロ－ｌ－ロイシル－ｌ－ロイシルジペプチドオキシダーゼをコードする。

【0140】

したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、遺伝子ｙｖｍＣ及びｃｙｐＸのうちの少なくとも１つが欠失しているか又は機能的に不活化されている点で遺伝子操作されている。

【0141】

リゾバクテリウム（ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であるバチルス・サブチリスは、２０を超える抗生物質の合成のための遺伝子を有する。その中には、バチルス・サブチリスランチビオティクスのようなペプチド抗生物質及びランチビオティク様ペプチド（スブチリン、エリシン（ｅｒｉｃｉｎ）Ｓ、メルサシジン、スブランシン（ｓｕｂｌａｎｃｉｎ）１６８、サブチロシンＡ）並びに非リボソーム合成（ペプチド）抗生物質（サーファクチン、イツリン、バシロマイシン、ミコサブチリン、コリネバクチン（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｉｎ）／バチリバクチン、フェンギシンプリパスタチン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ）、ミコバシリン、ＴＬ－１１９、バシライシン（ｂａｃｉｌｙｓｉｎ）、バシリソシン（ｂａｃｉｌｙｓｏｃｉｎ）、アミクマシン（ａｍｉｃｏｕｍａｃｉｎ）、３，３’－ネオトレハロサジアミン（ｎｅｏｔｒｅｈａｌｏｓａｄｉａｍｉｎｅ）、ディフィシジン（ｄｉｆｆｉｃｉｄｉｎ）、リゾクチシン（ｒｈｉｚｏｃｔｉｃｉｎ））がある。

【0142】

フコシル化オリゴ糖を生産するため、抗生物質を生成しないバチルス細胞を使用することが好ましい。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、ランチビオティクス及びランチビオティク様ペプチド、例えば、スブチリン、エリシンＳ、メルサシジン、スブランシン１６８、サブチロシンＡ；非リボソーム合成（ペプチド）抗生物質、例えば、サーファクチン、イツリン、バシロマイシン、ミコサブチリン、コリネバクチン／バチリバクチン、フェンギシンプリパスタチン、ミコバシリン、ＴＬ－１１９、バシライシン、バシリソシン、アミクマシン、３，３’－ネオトレハロサジアミン、ディフィシジン及びリゾクチシンからなる群から選択される抗生物質の１つ以上を合成しない。バチルス細胞は、前記抗生物質の１つ以上を合成しないバチルス細胞を得るように遺伝子操作されていてもよい。

【0143】

野生型バチルス細胞は芽胞を形成することができる。細菌における芽胞形成、すなわち、芽胞を形成する過程は、異なる形態及び運命を有する娘細菌の形成をもたらす発生プログラムを開始する細菌細胞の反応だと見なされている。バチルスの芽胞形成は細胞分化の基本的モデルとして研究された。芽胞形成中、桿状バチルス細胞は非対称的に分裂し、それによって異なる形態及ぶ運命を有する２つの遺伝的に同一の細胞を生じる。

【0144】

しかし、工業生産では、細菌生産株が発酵中に芽胞形成するとすればそれは望ましいことではない。したがって、フコシル化オリゴ糖の生産のためには芽胞を形成できないバチルス細胞を使用することが好まれる。そのようなバチルス細胞は「非芽胞性」と呼ばれる。

【0145】

好ましくは、フコシル化オリゴ糖を生産することができる非芽胞性バチルス細胞は、表１に列挙されるバチルス・サブチリス株の１つを起源としていた。

【0146】

【表1】

【0147】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、Ｓｐｏ０Ａの欠失又は機能的不活化により遺伝子操作されている。Ｓｐｏ０Ａの適切な機能的不活化は、リン酸化部位の欠失を含み、ここでＳｐｏ０Ｆ及びＳｐｏ０ＢホスホトランスフェラーゼはＳｐｏ０Ａをリン酸化する。

【0148】

追加の及び／又は代替の実施形態では、バチルス細胞は、シグマ因子ＳｉｇＥ（ｓｉｇＥ）及び／又はシグマ因子ＳｉｇＦ（ｓｉｇＦ）をコードする遺伝子の欠失又は機能的不活化により遺伝子操作されている。

【0149】

本発明のバチルス細胞は、培地中においてラクトースの存在下、バチルス細胞がフコシル化オリゴ糖を生産するのに許容的である条件下で培養された場合、フコシル化オリゴ糖を生産することができる。

【0150】

第２の態様によれば、フコシル化オリゴ糖、好ましくは、２’－ＦＬ、３－ＦＬ又は２’，３－ＤｉＦＬなどのフコシル化ヒト乳オリゴ糖の生産のための本明細書で前に記載されたバチルス細胞の使用が提供される。

【0151】

バチルスは一般に安全であると認識されているので、フコシル化オリゴ糖を生産するためのバチルス細胞の変更がヒトの健康及び環境に関して生産株の安全性に影響を及ぼさないという条件で、一般に安全であると見なされている生産生物を利用するヒト消費のためのフコシル化オリゴ糖の生産も安全であると見なされるはずである。したがって、ヒト消費用のフコシル化オリゴ糖の、特に、ヒト消費用の、より具体的には、調整粉乳用の、本明細書に記載されるバチルス細胞を使用することにより生産されたフコシル化オリゴ糖からなるか又はこれを含有するフコシル化ヒト乳オリゴ糖の規制上の承認に影響を及ぼす懸念が少なくなると予想される。したがって、調整粉乳及び栄養組成物中の微生物的に生産されるフコシル化オリゴ糖についての規制当局での並びに消費者間での受け入れはもっと良くなるはずである。

【0152】

第３の態様によれば、フコシル化オリゴ糖の生産のための方法であって、
－ ラクトースパーミアーゼ、ＧＤＰ－フコース生合成経路、及びフコシルトランスフェラーゼを有するように遺伝子操作されている非芽胞性バチルス細胞を提供すること
－ ラクトースを含有する培養培地において、フコシル化オリゴ糖の生産に許容的である条件下でバチルス細胞を培養すること、並びに
－ 任意選択的に、フコシル化オリゴ糖を培養培地から及び／又はバチルス細胞から回収すること
を含む方法が提供される。

【0153】

提供される非芽胞性バチルス細胞は、本明細書に記載されるバチルス細胞である。

【0154】

追加の及び／又は代替の実施形態では、フコシル化オリゴ糖は、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、２’，３－ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ（ＬＮｎＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ（ＬＮｎＦＰ Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＨ Ｉ）及びラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤ）からなる群から選択される。

【0155】

追加の及び／又は代替の実施形態では、培養培地は、特に、フコシルトランスフェラーゼに対するドナー基質としてＧＤＰ－フコースを提供するためのＧＤＰ－フコースサルベージ経路を有するフコシル化オリゴ糖の生産用のバチルス細胞を培養するため、Ｌ－フコースを含有する。

【0156】

本発明は、バチルス細胞及び／又は本明細書に記載される方法により生産されたフコシル化オリゴ糖まで、栄養組成物、好ましくは、調整粉乳、栄養補助食品又は薬用食品の製造のための前記フコシル化オリゴ糖の使用までも広がる。さらに、本発明は、本明細書に記載されるバチルス細胞及び／又は方法により生産されたフコシル化オリゴ糖を含有する栄養組成物までも広がる。

【0157】

本発明は特定の実施形態に関して及び図面を参照して記載されるが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲にのみに限定される。さらに、記述中及び特許請求の範囲中の用語第１の、第２の及び同類のものは、類似する要素を区別するために使用され、必ずしも順番を時間的に、空間的に、ランクを付けて又は他のいかなる方法によっても記載するために使用されるものではない。そのようにして使用される用語は、適切な状況下で互換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は本明細書に記載されるか又は図解される以外の順番で実施可能であることは理解されるべきである。

【0158】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、特許請求の範囲で使用されるが、その後に列挙される手段に制限されると解釈されるべきではなく、他の要素又はステップを排除しないことは注目されるべきである。したがって、この用語は、述べられている特長、整数、ステップ又は言及される成分の存在を明示すると解釈されるべきであり、１つ以上の他の特長、整数、ステップ若しくは成分、又はその群の存在又は追加を排除しない。したがって、表現「手段Ａ及びＢを含む装置」の範囲は、成分ＡとＢのみからなる装置に限定されるべきではない。この表現は、本発明に関して、装置の唯一関連のある成分はＡ及びＢであることを意味する。

【0159】

本明細書全体を通じて「一実施形態」又は「ある実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特長、構造又は特徴は本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて種々の場所での語句「一実施形態では」又は「ある実施形態では」の出現は必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではないが、そうであってもよい。さらに、当業者には本開示から明らかになると考えられるように、１つ以上の実施形態において、特定の特長、構造又は特徴はいかなる適切な方法で組み合わせてもよい。

【0160】

同様に、本発明の例となる実施形態の説明において、開示を簡素化し種々の発明の態様のうちの１つ以上の理解に役立つ目的で、本発明の種々の特長が単一の実施形態、図、又はその記述にまとめられることがあることは認識されるべきである。しかし、この開示方法が、請求されている発明がそれぞれの請求において明確に列挙されているよりも多くの特長を必要としているという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が示すように、発明の態様は、単一の先の開示された実施形態のすべての特長よりも少なく存在する。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲はこれによってこの詳細な説明中に明確に組み込まれ、それぞれの請求は本発明の別々の実施形態として自立している。

【0161】

さらに、本明細書に記載される一部の実施形態は、いくつかの特長を含むが他の実施形態に含まれる他の特長は含まないが、当業者であれば理解すると考えられるように、異なる実施形態の特長の組合せは本発明の範囲内にあることが意図されており、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲では、特許請求されている実施形態のいずれもいかなる組合せでも使用することができる。

【0162】

さらに、実施形態の一部は、コンピュータシステムの処理装置により又はその機能を実行する他の手段により実施することができる方法又は方法の要素の組合せとして本明細書に記載されている。したがって、そのような方法又は方法の要素を実行するのに必要な指示を含む処理装置は、方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置実施形態の本明細書に記載される要素は、本発明を実行する目的で要素によって実施される機能を実行するための手段の例である。

【0163】

本明細書で提供される記述及び図面において、数多くの特定の詳細が表明されている。しかし、本発明の実施形態はこれらの特定の詳細なしで実行しうることは理解される。他の例では、周知の方法、構造及び技法は、理解を不明瞭にしないように、詳細を示してはいない。本発明は、この時点で、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明により記載される。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術的な教えから逸脱することなく当業者の知識に従って設計できることは明らかであり、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。

【実施例】

【0164】

［実施例１］ バチルス・サブチリスの形質転換
バチルス・サブチリスは種々の技法により遺伝子操作することができる。バチルス・サブチリスの形質転換では、コンピテント細胞は２ステップ法の改変プロトコルにより調製した（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．及びＳｐｉｚｉｚｅｎ，Ｊ．（１９６１）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ８１（５）：７４１～７４６頁）。一晩培養物をＭＧ１培地で接種し、３７℃で振盪した。ＭＧ１培地はＳｐｉｚｉｚｅｎ最少培地であり、この培地は０．５％のグルコース、５ｍＭのＭｇＳＯ_４及び０．０２％のカザミノ酸を補充している（任意選択的に、ビオチン及び／又はＬ－トリプトファンをさらに補充される）。次の日の朝、この培養物は１対２０で新鮮なＭＧ１培地に希釈し、３７℃でおよそ６時間インキュベートした。１ｍｌの培養物を８ｍｌのＭＧ２培地に希釈したが、この培地はカザミノ酸の濃度がＭＧ１培地とは異なっている（０．０２％の代わりに０．０１％）。短縮したプロトコルで、一晩培養物はＭＧ２培地に直接希釈する。さらに９０分間の接種後、培養物の１ｍｌ部分を１～３μｇの多量体プラスミドＤＮＡ又は直鎖状ＤＮＡと混合し、振盪しながら３７℃で３０～６０分間インキュベートした。多量体プラスミドＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの増殖用にエシェリキア・コリ株ＮＭ５３８を使用することにより又はシングルカッター制限酵素での消化によるプラスミドの線状化により入手した。この制限酵素は骨格内で切断し、続いてＴ４ ＤＮＡリガーゼで再ライゲーションする。

【0165】

その後、細胞は適切な抗生物質を含有する２×ＹＴ寒天プレート上に広げた。抗生物質は以下の濃度：５μｇ・ｍＬ^－１のエリスロマイシン、５μｇ・ｍＬ^－１のクロラムフェニコール、１０μｇ・ｍＬ^－１のカナマイシン、１００μｇ・ｍＬ^－１のスペクチノマイシンで添加した。

【0166】

あるいは、プロトプラスト形質転換では（Ｒｏｍｅｒｏ，Ｄ．ら、（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ－ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：５５６～５５９頁）、細胞は成長の定常期の開始まで３７℃で２０ｍｌのペナッセイブロス（ＰＡＢ）において成長させた（ＯＤ_６００＝１．７～２）。次に、細胞はペレット化し、１０ｍｌのＳＭＰＰ培地（０．３％のウシ血清アルブミン、５％の２Ｍサクロース、２５％の４×ＰＡＢ、５０％の２×ＳＭＭ）に再懸濁し、２×ＳＭＭの組成は１Ｍのサクロース、０．０４Ｍのマレイン酸二ナトリウム塩水和物及び０．０４ＭのＭｇＣｌ_２（ｐＨ６．５）であった。リゾチーム（１０ｍｇ・ｍｌ^－１）及びムタノリシン（７５Ｕ・ｍｌ^－１）を添加後、混合液は振盪しながら３７℃でインキュベートし、プロトプラストを生成した。プロトプラスト形成は顕微鏡的にチェックした。次に、プロトプラストは、５２００×ｇで４℃、５分間の遠心分離により慎重に収穫し、氷冷洗浄電気的形質転換バッファー（１×ＳＭＭ）で２度洗浄し、最後にこの溶液に懸濁した。プラスミドＤＮＡ（１～３μｇ）を１２０μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、混合液を氷上に少なくとも５分間保持した。形質転換混合液を０．２ｃｍのキュベットに移し、単回エレクトロポレーションパルスを２５μＦ、４００Ω及び０．７ｋＶで適用した。エレクトロポレーションショックの直後、１ｍｌの回収培地（等容積の４×ＰＡＢ及び２×ＳＭＭ、使用前に新たに調製する）をキュベットに添加した。次に、形質転換反応液を２ｍｌのチューブに移し、振盪しながら３７℃で１２時間インキュベートした。再生のため、細胞懸濁液をＤＭ３寒天プレート上に広げ（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．及びＣｏｈｅｎ，Ｓ．（１９７９）ＭＧＧ １６８（１）：１１１～１１５頁）、３７℃で４８時間インキュベートした。ＤＭ３再生培地は、リットルあたり以下の無菌溶液：２００ｍｌの４％寒天、１００ｍｌの５％カザミノ酸、５０ｍｌの１０％酵母エキス、１００ｍｌの３．５％Ｋ_２ＨＰＯ_４及び１．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、２５ｍｌの２０％グルコース、２０ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、５００ｍｌの０．５Ｍソルビトール並びに５ｍｌのフィルター無菌化２％ウシ血清アルブミンを含有し（温度が５５℃より低くなったら混合液に添加した）、適切な抗生物質を補充されていた。

【0167】

バチルス・サブチリスのエレクトロポレーションは、Ｚｈａｎｇら、（２０１１）由来の、ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨにより提供された改変プロトコルに従って行った（Ｚｈａｎｇ，Ｇ．、Ｂａｏ，Ｐ．、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｄｅｎｇ，Ａ．、Ｃｈｅｎ，Ｎ．及びＷｅｎ，Ｔ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４０９：１３０～１３７頁）。２×ＹＴ一晩培養物は新鮮な２×ＹＴ培地で１００倍に希釈し、培養物は回転式振盪器上、３７℃で２のＯＤ_６００まで成長させた。次に、培養物には１％のＤＬ－スレオニン、２％のグリシン、０．１％のトリプトファン及び０．０３％のＴｗｅｅｎ８０を補充した。さらに６０分間の培養後、細胞懸濁液は氷上で２０分間冷却し、５０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離し、エレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍのトレハロース、０．５Ｍのソルビトール、０．５Ｍのマンニトール、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、０．５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４、フィルター濾過し凍結保存した）で２度洗浄した。最後に、細胞は最初の培養容積の１／１００でエレクトロポレーションバッファーに再懸濁し、１００μｌの細胞懸濁液をＤＮＡと混ぜ合わせた。形質転換混合液は０．１ｃｍのキュベットに移し、エレクトロポレーションは、１．８ｋＶでＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（商標）装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により送られるシングルパルスを用いて実施した。パルス送出直後、０．５Ｍのソルビトール及び０．３８Ｍのマンニトールを含有する１ｍｌの２×ＹＴブロスをキュベットに添加した。形質転換懸濁液は２ｍｌのチューブに移し、回転式振盪器上、３７℃で３時間インキュベートした。細胞は選択２×ＹＴ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。

【0168】

代替のエレクトロポレーションプロトコル（Ｘｕｅ，Ｇ．Ｐ．、Ｊ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、及びＢ．Ｐ．Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ：１９９９年；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１８３～１９１頁）を使用して、０．５Ｍのグルシトールを含有する５ｍｌのＬＢにバチルス・サブチリスを接種し、３７℃で一晩インキュベートした。引き続いて、一晩培養物を０．５Ｍのグルシトールを含有する７５ｍｌのＬＢにより希釈し（１対１６）、０．８５～０．９５のＯＤ_６００が得られるまでインキュベートした。次に、細胞は５０００×ｇで４℃、１０分間の遠心分離によりペレット化し、氷冷エレクトロポレーションバッファー（１０％のグリセロール、０．５Ｍのグルシトール、０．５Ｍのマンニトール）で４回洗浄した。最後に、細胞は、１～２ｍｌのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁した。エレクトロポレーションは、冷却エレクトロポレーションキュベット（１ｍｍの電極間隔）中６０μｌのコンピテント細胞をＤＮＡと一緒に使用して実施した。細胞－ＤＮＡ混合物は、２５μＦ、２００Ω及び２１ｋＶ／ｃｍで単回電気パルスを受けさせた。最後に、１ｍｌの回収ブロス（０．５Ｍのグルシトール及び０．３８のマンニトールを含有するＬＢ）をエレクトロ透過処理した細胞に添加し、細菌培養物は３７℃で３時間インキュベートし、続いて抗生物質を補充したＬＢ寒天上に蒔いた。

【0169】

２つの異なる富栄養培地、すなわち、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）及び２×ＹＴを使用した。Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）培地は、１％のトリプトン、０．５％の酵母エキス及び０．５％のＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなっていた。

【0170】

２×ＹＴ培地は、１．６％のトリプトン、１％の酵母エキス及び０．５％のＮａＣｌ（ｐＨ７．５）からなっていた。

【0171】

富栄養培地寒天プレートを調製するため、１５ｇ・Ｌ^－１の寒天を添加した。

【0172】

振盪フラスコ実験では、Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，Ｊ．１９５８年 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４４（１０）：１０７２～１０７８頁）を使用した。

【0173】

Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地は以下の塩：２ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１４ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、６ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ＬのＮａ_３クエン酸×２Ｈ_２Ｏ及び０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏを含有する。

【0174】

前培養培地は、２％のＤ－グルコース、０．０５％のカザミノ酸及びＭｇＳＯ_４を最終濃度２ｍＭまで補充されたＳｐｉｚｉｚｅｎ最少培地からなっていた（任意選択的に、ビオチン及び／又はＬ－トリプトファンをさらに補充された）。

【0175】

本培養培地は、２％のＤ－グルコース、０．０５％のカザミノ酸、ＭｇＳＯ_４を最終濃度２ｍＭまで及び０．５ｍＬ／Ｌの１０００×微量元素溶液を補充されたＳｐｉｚｉｚｅｎ最少培地からなっていた（任意選択的に、ビオチン及び／又はＬ－トリプトファンをさらに補充された）。

【0176】

微量元素溶液（１０００×）は、１００．６ｇＬ^－１のＣ_６Ｈ_９ＮＯ_６、５６．４ｇ・Ｌ^－１のクエン酸アンモノウム鉄、９．８ｇ・Ｌ^－１のＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ・Ｌ^－１のＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、１ｇ／Ｌ^－１のＣｕＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ・Ｌ^－１のＨ_３ＢＯ_３、９ｇ・Ｌ^－１のＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ・Ｌ^－１のＮａ_２ＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ・Ｌ^－１のＮａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ・Ｌ^－１のＮｉＳＯ_４×６Ｈ_２Ｏからなっていた。

【0177】

必要であれば、適切な抗生物質（複数可）が、培地が選択的になるように培地に添加された。

【0178】

バチルス・サブチリス株は、最初富栄養培地寒天プレート上で成長させて単一のコロニーを得た。これらのプレートは、３０～３７℃で１日間成長させた。振盪フラスコ実験では、２０ｍｌの前培養物に単一コロニーを接種し、回転式振盪器上３０～３７℃で一晩成長させた。それに続く２０ｍｌの本培養物にこの前培養物を約０．１の開始ＯＤ_６００まで接種し、回転式振盪器上３０～３７℃でインキュベートした。誘導が必要な場合には、４０～６０ｍｌの本培養物を誘導の時点で２０ｍｌ部分に分割した。培養物容積は、振盪フラスコ容量の２０％を超えなかった。

【0179】

［実施例２］ ２’－フコシルラクトース用のバチルス・サブチリス生産株の構築
芽胞形成欠損バチルス・サブチリス株（表１）の代謝工学的操作は、異種遺伝子エシェリキア・コリｍａｎＣ、エシェリキア・コリｍａｎＢ及びエシェリキア・コリｍａｎＡの組込み並びに相同組換えによる内因性遺伝子ｌａｃＡの同時欠失により達成された。バチルス・サブチリス遺伝子ｇａｎＡ（ｙｖｆＮ、ｌａｃＡ）は、ガラクタンオペロン内に位置しているが、ベータガラクトシダーゼをコードしている。

【0180】

ＧＤＰ－マンノースの合成では、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ及びｍａｎＡのオープンリーディングフレームは、オペロンとしてのバチルス・サブチリス構成的プロモーターｐ４３（ｉＧｅｍパーツレジストリー：配列ＩＤ：ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）に作動可能に連結されていた。遺伝子ｍａｎＣ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５３．１）は、エシェリキア・コリ由来のＧＤＰ：マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードしている。遺伝子ｍａｎＢ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５２．１）は、エシェリキア・コリ ホスホマンノムターゼをコードしており、遺伝子ｍａｎＡ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿３８９０８４．１）は、バチルス・サブチリスフルクトース－６－リン酸イソメラーゼをコードしている。上記の遺伝子のそれぞれはインシリコでバチルス・サブチリスＲＢＳ配列に融合された。本明細書に記載される発現カセット＜Ｐ４３－ｍａｎＣＢＡ＞はバチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化されており、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃоｒｐにより合成的に調製された。それに続いて、完全組込みカセットを組み立ててｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングして自殺プラスミド＜ｐＢＲ３２２ ｆｌａｎｋ ｇａｎＡ ｕｐ－ｌｏｘ７１－ｅｒｍ－ｌｏｘ６６－Ｐ４３－ｍａｎＣＢＡ－ｆｌａｎｋ ｇａｎＡ ｄｏｗｎ＞（配列番号１）を作製した。その後、バチルス・サブチリスをその天然のコンピテンスによりこのプラスミドで形質転換した。細胞は、適切な抗生物質（５μｇ・ｍＬ^－１のエリスロマイシン）を含有する２×ＹＴ寒天プレート上に広げた。Ａ株を産するバチルス・サブチリスゲノムのｇａｎＡ遺伝子座中への発現カセット＜Ｐ４３－ｍａｎＣＢＡ＞の組込みは、コロニーＰＣＲにより確認した。遺伝子発現は、標的化されたプロテオミクスにより及び／又はリアルタイムＰＣＲにより確認した。

【0181】

こうして得られた＜Ｐ４３－ｍａｎＣＢＡ＞組込み株でのラクトース及びＧＤＰ－マンノースからの２’－フコシルラクトースの生産のため、誘導性プロモーターＰ_{ｇｒａｃ１００}の制御下で必要なすべての遺伝子を含む発現プラスミド（配列番号２）を構築した。したがって、バチルス・サブチリス発現ベクターｐＨＴ２５３（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を骨格として使用した。エシェリキア・コリｌａｃＹ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１４８７７．１）のオープンリーディングフレームは染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅させた。エシェリキア・コリＯ１２６α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｗｂｇＬのオープンリーディングフレームは、バチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製された。その上、エシェリキア・コリ遺伝子ｇｍｄ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５７．１；ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする）及びｗｃａＧ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５６．１；ＧＤＰ－フコースシンターゼをコードする）のオープンリーディングフレームは、バチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製された。誘導性発現カセットに入れたそれぞれの遺伝子は、バチルス・サブチリスＲＢＳ配列に連結された。さらに、ｉＧｅｍパーツレジストリー由来の適切なバチルス・サブチリスターミネーター配列が最終発現プラスミド＜ｐＨＴ２５３ Ｐ_{ｇｒａｃ１００}－ｗｂｇＬ－ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｌａｃＹ－ターミネーター＞（配列番号２）に導入された。＜Ｐ４３－ｍａｎＣＢＡ＞組込み株は、その天然のコンピテンスによりこの発現プラスミド（配列番号２）で形質転換した。遺伝子発現は、標的化されたプロテオミクスにより及び／又はリアルタイムＰＣＲにより確認した。形質転換体は、外因性ラクトースの存在下でバチルス・サブチリスが２’－フコシルラクトースを生産するのに許容的である条件下で培養した。

【0182】

［実施例３］ ２’－フコシルラクトース用のバチルス・サブチリス生産株の構築
実施例２に記載されているＡ株を親株として使用した。ラクトース及びＧＤＰ－マンノースからの２’－フコシルラクトースの生産のため、さらに、エシェリキア・コリ遺伝子ｌａｃＹ、ｇｍｄ、ｗｃａＧ及びｗｂｇＬをＡ株の内因性ａｍｙＥ（ａｍｙＡ）遺伝子座（アルファアミラーゼをコードしている）に組み込んだ。

【0183】

遺伝子ｗｂｇＬ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードしている）のオープンリーディングフレームは、バチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製された。その上、遺伝子ｇｍｄ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５７．１；ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする）及びｗｃａＧ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１６５５６．１；ＧＤＰ－フコースシンターゼをコードする）のオープンリーディングフレームは、バチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより実行された）、２遺伝子オペロンとして強力な構成的バチルス・サブチリスプロモーターＰ_ｌｅｐＡの制御下に置かれ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製された。ラクトースパーミアーゼをコードするエシェリキア・コリｌａｃＹ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１４８７７．１）のオープンリーディングフレームは、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅させた。

【0184】

ラクトース及びＧＤＰ－マンノースからの２’－フコシルラクトースの生産に必要なすべての遺伝子は、構成的発現カセット＜Ｐ４３－ｗｂｇＬ－ｌａｃＹ－Ｐ_ｌｅｐＡ－ｇｍｄ－ｗｃａＧ＞に組み立てられ、ここで、それぞれの遺伝子はバチルス・サブチリスＲＢＳ配列に連結された。さらに、ｉＧｅｍパーツレジストリー由来の適切なバチルス・サブチリスターミネーター配列（配列ＩＤ：ＢＢａ＿Ｂ００１５）はこの発現カセットの下流に置かれた。上記の構築物はｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングして、＜ｐＢＲ３２２ ｆｌａｎｋ ａｍｙＥ ｕｐ－ｌｏｘ７１－ ａａｄ９－ｌｏｘ６６－Ｐ４３－ｗｂｇＬ－ｌａｃＹ－Ｐ_ｌｅｐＡ－ｇｍｄ ｗｃａＧ－ターミネーター－ｆｌａｎｋ ａｍｙＥ ｄｏｗｎ＞（配列番号３）を生成した。

【0185】

こうして得られたａｍｙＥ組込みベクター（配列番号３）を使用して、その天然のコンピテンスによりバチルス・サブチリスを形質転換した。形質転換体はスペクチノマイシン（１００μｇ・ｍｌ^－１）により選択した。バチルス・サブチリスゲノムのａｍｙＥ遺伝子座中への発現カセット＜Ｐ４３－ｗｂｇＬ－ｌａｃＹ－Ｐ_ｌｅｐＡ－ｇｍｄ ｗｃａＧ－ターミネーター＞の組込みはコロニーＰＣＲにより確認された。遺伝子発現は、標的化されたプロテオミクスにより及び／又はリアルタイムＰＣＲにより確認した。

【0186】

［実施例４］ ２’－フコシルラクトース用のバチルス・サブチリス生産株の構築
ＧＤＰ－フコース及び外因性ラクトースからの２’－フコシルラクトースの生産では、最初、エシェリキア・コリ遺伝子ｌａｃＹを内因性ａｍｙＥ（ａｍｙＡ）遺伝子座（アルファアミラーゼをコードしている）中に組み込んだ。ラクトースパーミアーゼをコードするエシェリキア・コリｌａｃＹ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１４８７７．１）のオープンリーディングフレームは、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅させた。組込みカセット＜ｆｌａｎｋ ａｍｙＥ ｕｐ－ｌｏｘ７１－ ａａｄ９－ｌｏｘ６６－Ｐ４３－ｌａｃＹ－ｆｌａｎｋ ａｍｙＥ ｄｏｗｎ＞（配列番号４）を構築し、ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングした。バチルス・サブチリスをこうして得られたプラスミドでその天然のコンピテンスにより形質転換した。Ｂ株を産するバチルス・サブチリスゲノムのａｍｙＥ遺伝子座中への発現カセット＜Ｐ４３－ｌａｃＹ＞の組込みは、コロニーＰＣＲにより確認した。遺伝子発現は、標的化されたプロテオミクスにより及び／又はリアルタイムＰＣＲにより確認した。

【0187】

外因性Ｌ－フコースからのＧＤＰ－フコースの合成では、必要な遺伝子をすべて含むバチルス・サブチリス発現プラスミドを構築した。プラスミドｐＤＷ１は骨格として使用した。このプラスミドはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製され、エシェリキア・コリ及びバチルス・サブチリスにおける選択のためにそれぞれ遺伝子ｂｌａ及びｅｒｍを含有する。さらに、このプラスミドは、エシェリキア・コリでの増殖用にｐＭＢ１のレプリコン、及びバチルス・サブチリスでの増殖用にｐＵＢ１１０レプリコンを含有する。

【0188】

バクテロイデス・フラジリス遺伝子ｆｋｐ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号ＡＹ８４９８０６）は、二機能性フコースキナーゼ／Ｌ－フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードしており、エシェリキア・コリ遺伝子ｗｂｇＬはα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードしており、エシェリキア・コリ遺伝子ｆｕｃＰ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１７２８１．１）はＬ－フコースパーミアーゼをコードしている。これらの遺伝子のオープンリーディングフレームはそれぞれ、バチルス・サブチリスでの発現のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐにより合成的に調製された。強力な構成的バチルス・サブチリスプロモーターＰ４３の制御下で遺伝子ｆｋｐ、ｗｂｇＬ及びｆｕｃＰを含む発現カセットを構築した。

【0189】

発現カセットに入れたそれぞれの遺伝子は、バチルス・サブチリスＲＢＳ配列に連結された。さらに、ｉＧｅｍパーツレジストリー由来の適切なバチルス・サブチリスターミネーター配列（配列ＩＤ：ＢＢａ＿Ｂ００１５）が最終発現プラスミド＜ｐＤＷ１－Ｐ４３－ｆｋｐ－ｗｂｇＬ－ｆｕｃＰ－ターミネーター＞（配列番号５）に導入された。Ｂ株は、その天然のコンピテンスによりこの発現プラスミド（配列番号５）で形質転換した。遺伝子発現は、標的化されたプロテオミクスにより及び／又はリアルタイムＰＣＲにより確認した。形質転換体は、外因性ラクトース及びＬ－フコースの存在下でバチルス・サブチリスが２’－フコシルラクトースを生産するのに許容的である条件下で培養した。

【0190】

［実施例５］ 代謝的に操作されたバチルス・サブチリス株を使用する２’－フコシルラクトースの生産
前培養物を、２’－フコシルラクトースの生合成に適した代謝的に操作されたバチルス・サブチリス株で接種した（それぞれ実施例２、３及び４に記載されている）。

【0191】

前培養物は３０～３７℃で一晩インキュベートし、次に新鮮な本培養培地において約０．１の開始ＯＤ_６００まで希釈した。本培養物がおおよそ０．５のＯＤ_６００に到達すると、２ｍＭのラクトースを成長培地に添加した。遺伝子発現用に誘導性プロモーターＰｇｒａｃ１００を使用した場合、誘導は、ラクトース（２ｍＭ）で又はラクトース（２ｍＭ）とＩＰＴＧ（１ｍＭ）の両方で実行した。ＧＤＰ－フコースのサルベージ生合成では、さらに、２ｍＭのＬ－フコースを添加した。培養は２４時間／４８時間後に中止し、細胞内及び細胞外２’－フコシルラクトースは、薄層クロマトグラフィー並びに／又はＨＰＬＣ及び／若しくは質量分析（ＷＯ ２０１７／０４２３８２ Ａ又はＷＯ ２０１９／００８１３３ Ａに記載されている）により分析した。２’－フコシルラクトースの相当量の生合成が検出された。

【配列表】

2022535960000001.app

【国際調査報告】