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特表2022-535987自己組織化単分子膜を用いて予備機能付与されたナノ粒子およびその調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-10
(54)【発明の名称】自己組織化単分子膜を用いて予備機能付与されたナノ粒子およびその調製方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/52 20170101AFI20220803BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220803BHJP
A61K 51/02 20060101ALI20220803BHJP
B22F 1/06 20220101ALI20220803BHJP
B22F 1/054 20220101ALI20220803BHJP
B22F 1/05 20220101ALI20220803BHJP
B22F 1/00 20220101ALN20220803BHJP
B22F 1/18 20220101ALN20220803BHJP
【ＦＩ】
A61K47/52
A61K48/00
A61K51/02 200
A61K51/02 100
B22F1/06
B22F1/054
B22F1/05
B22F1/00 K
B22F1/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021573785
(86)(22)【出願日】2020-06-12
(85)【翻訳文提出日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 FR2020051005
(87)【国際公開番号】W WO2020249912
(87)【国際公開日】2020-12-17
(31)【優先権主張番号】1906224
(32)【優先日】2019-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505351201
【氏名又は名称】セントレ ナシオナル デ ラ ルシェルシェ シエンティフィーク
(71)【出願人】
【識別番号】521543060
【氏名又は名称】エコール ノーマル シューペリウール パリ－サクレー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ノグ，クロードゥ
(72)【発明者】
【氏名】ブックル，マルコルム
(72)【発明者】
【氏名】ヴィアル，ステファニ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4K018
【Ｆターム（参考）】
4C076CC38
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA11
4C084AA13
4C084NA13
4C085HH01
4C085JJ20
4C085KA26
4C085KB01
4K018BA01
4K018BB01
4K018BB03
4K018BB05
4K018BB10
4K018BC26
4K018BC28
(57)【要約】
本発明は、予備機能付与されたナノ粒子（ＮＰ）の分野に関する。本発明はより詳細には自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて予備機能付与されたＮＰに関し、また、上記ＮＰが溶液中で安定であるように生体分子を用いて機能付与されたＮＰに関する。これらのＮＰは多くの用途において、特に、診断ツール、溶液中の対象分子を枯渇させるためのツール、および治療ツールとして使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）：ＨＳ（ＣＨ２）ｎ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨの分子Ｍのマトリクスによって形成される自己組織化保護単分子膜を用いて予備機能付与された金属表面を含むナノ粒子であって、ここで、
ｎは、ＣＨ２の数を表し、３≦ｎ≦１１であり、
ｍは、エチレングリコールの数を表し、１≦ｍ≦１２であり、
上記分子は、一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端が不活性であり、
上記単分子膜の被覆率Ｗは、１．５％～９９％であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項2】
上記ナノ粒子が、式（７）：ＳＨ－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＯ－Ｆの少なくとも１つのＬ－ＰＥＧ分子を用いてさらに機能付与されており、ここで、
ｑは、エチレングリコールの数を表し、２０≦ｑ≦５００であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表し、
上記Ｌ－ＰＥＧ分子の被覆率Ｘは、少なくとも１％であることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
少なくとも１つのチオール化分子を用いてさらに機能付与されており、上記チオール化分子は、式（８）：ＨＳ（ＣＨ２）ｒ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ－ＦのＰＥＧ－Ｆリンカー分子であって、
ここで、
ｒは、ＣＨ２の数を表し、３以上の整数であり、
ｐは、エチレングリコールの数を表し、２≦ｐ≦１２であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表し、
上記リンカー分子は、一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端に生体分子と相互作用することができる活性基または反応性基を有する、ＰＥＧ－Ｆリンカー分子；または、
チオール官能基を含む生体分子、のいずれかである、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項4】
上記チオール化リンカー分子がＰＥＧ－Ｆ基であり、上記ＦがＣＯＯＨ官能基であり、その被覆率Ｙが少なくとも１％であることを特徴とする請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項5】
上記リンカー分子に結合した少なくとも１つの生体分子を用いてさらに機能付与されていることを特徴とする、請求項３または４に記載のナノ粒子。
【請求項6】
上記チオール化生体分子がチオール化ＤＮＡであり、その被覆率Ｚが少なくとも１０％であることを特徴とする請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項7】
上記ナノ粒子は、球状ナノ粒子、ナノロッド、立方体ナノ粒子、ナノトライアングル、コアシェル、またはナノアーチンである、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項8】
一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端が不活性である分子の溶液によって形成された自己組織化保護単分子膜を用いて予備機能付与された金属表面を含むナノ粒子を調製する方法であって、上記方法は以下の工程：請求項１に規定されている式（１）の分子Ｍを付加し、１．５％～９９％の被覆率Ｗを達成すること、
少なくとも５分間撹拌すること、を含む、方法。
【請求項9】
請求項２に規定されている式（７）のＬ－ＰＥＧ分子の溶液を添加し、１％～１０％の被覆率Ｘを達成する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
請求項３に規定されている式（８）のＰＥＧ－Ｆリンカー分子から選択されるチオール化分子であって、生体分子またはチオール化生体分子と相互作用することができるチオール化分子を付加する工程をさらに含む、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項11】
溶液、特に複合培地中の対象分子を検出するための方法であって、以下の工程：請求項２～７のいずれかに記載の少なくとも１つの機能付与されたナノ粒子に溶液を接触させること、
ＳＰＲ、ストリップ試験、または任意の他の適切な方法によって、生体分子が上記溶液の成分の１つと相互作用するときの特定のシグナルを検出すること、を含む、方法。
【請求項12】
溶液中、特に複合培地中に存在する対象分子を検出するための方法であって、上記方法は、以下の工程：ａ）請求項２～７のいずれかに記載の少なくとも１つの機能付与されたナノ粒子に、上記対象分子を含む溶液を接触させること、
ｂ）上記ナノ粒子の存在下で上記溶液をインキュベートすること
ｃ）上記ナノ粒子を回収すること、
ｄ）上記対象分子の溶液が無くなるまで、任意に工程ａ）～ｃ）を繰り返すこと、を含む、方法。
【請求項13】
癌の治療、特に放射線療法、光線療法、および医薬品の調剤、ならびに医用画像診断におけるその使用のための、請求項２～７のいずれかに記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本発明は、予備機能付与されたナノ粒子（ＮＰ）の分野に関する。本発明は、より詳細には自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて予備機能付与されたＮＰ、ならびに生体分子を用いて機能付与されたＮＰであって、上記ＮＰが溶液中で安定であるＮＰに関する。上記ＮＰは、複数の用途において、特に診断ツール、溶液中の対象分子の枯渇または濃縮ツール、および治療ツールとして使用することができる。
【0002】
〔従来技術および欠点〕
ＳＡＭの分子膜によって覆われたナノ粒子が、文献に開示されている。例えば、Hurst K.M.らによる論文（Journal of Microelectromechanical Systems; Volume: 20, Issue: 2, April 2011）は、ｐ－アミノフェニルトリメトキシシアン（ＡＰｈＴＳ）および３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）からなるＳＡＭをＮＰ上に固定化して、マイクロエレクトロメカニカルシステムのシリコーン処理された表面上の上記ＮＰの接着を安定化させることを開示している。しかしながら、このようなＮＰは、生体分子を用いた機能付与には適していない。
ＳＡＭの分子膜によって覆われたナノ粒子が、文献に開示されている。例えば、Hurst K.M.らによる論文（Journal of Microelectromechanical Systems; Volume: 20, Issue: 2, April 2011）は、ｐ－アミノフェニルトリメトキシシアン（ＡＰｈＴＳ）および３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）からなるＳＡＭをＮＰ上に固定化して、マイクロエレクトロメカニカルシステムのシリコーン処理された表面上の上記ＮＰの接着を安定化させることを開示している。しかしながら、このようなＮＰは、生体分子を用いた機能付与には適していない。
【0003】
他の先行技術文献には、チオール化単分子膜で被覆されたナノ粒子が開示されている。
【0004】
Hurstら（２００６）は、ＤＮＡ分子が帯電している金ナノ粒子を開示しており、この研究の目的は、ナノ粒子の表面で最大のＤＮＡ分子を帯電させることである。著者らは塩分条件が制御下（０．７Ｍ ＮａＣｌ）に置かれ、ＤＮＡ分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型のスペーサーを含む場合に、最大電荷が達成されることを実証している。
【0005】
Wangら（RSC Adv. 2017, 7. 3676-3679）は、ＰＥＧおよびチオール化ＤＮＡを含む混合単分子膜を用いて機能付与された球状金ＮＰを開示している。上記ナノ粒子は、２つの工程：チオール化ＤＮＡ分子を用いて機能付与すること、次いでチオール化ＰＥＧを用いてＮＰの全表面を覆うことによって調製される。
【0006】
Liら（Langmuir 2015, DOI: 10.1021/acs.iangmuir.5b01680）は、ＤＮＡ分子を用いて機能付与されたナノロッド（ＮＲ）を開示している。金ＮＲは正に荷電しているので、負に荷電したＤＮＡの存在下では共に集まる傾向がある。著者らはチオール化ＤＮＡを添加する前に、ＰＥＧおよび界面活性剤のＮＲ長分子上で格子形成することを提案している。
【0007】
文献US 2011/165077は、画像形成のための金ナノ粒子の使用を開示している。レポーター分子をＮＰの表面にグラフトし、次いでこれらを飽和点までＰＥＧ－ＳＨ保護分子膜で覆う。この分子膜は粒子の凝集を防止し、特異的プローブを用いて機能付与することができる。
【0008】
文献US 2019/142966は、癌の治療を目的とする金属ＮＰの使用を開示している。これらのＮＰは単一工程でＰＥＧ－ＣＯＯＨ分子で覆われ、次いで、カルボキシ基はＳＤＳの存在下で、治療分子および標的分子で機能付与される。
【0009】
文献US 2016/243254は、癌の治療におけるセラノスティックツールとしてのナノプローブの調製を開示している。チオール化ＰＥＧ－ＣＯＯＨの第１の分子膜がＮＰの表面にグラフトされ、この第１の分子膜はＰＥＧ－ＣＯＯＨが高分子量であるために、ＮＰの表面の約３０％を覆い、これは最大の被覆率である。チオール化ＤＮＡ－ハーピン分子の第２の分子膜が付加され、ＰＥＧ分子の間に挟まれる。この構成では、非特異的相互作用の出現のためには、部分的な被覆率とカルボキシ官能基とを組み合わせることが好ましい。
【0010】
生物学的プローブを固定するための支持体として使用されることが意図されるＮＰの分野においては、種々の制約が考慮されなければならない。第１に、予備機能付与された、または機能付与されたＮＰは溶液中で安定でなければならず、すなわち、凝集しなくてもよい。それらはまた、目的の特異的プローブ／分子相互作用を可能にしなければならない。
【0011】
〔発明の開示および利点〕
本発明は、低分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子から形成され、その被覆が部分的である自己組織化単分子膜を用いているＮＰの予備機能付与によって、これらの課題に対する解決策を提供する。ＮＰの表面上のこの予備膜の存在は、単独で、または他の分子と組み合わせて（機能付与）、溶液中で安定なＮＰを調製することを可能にする。この単分子膜は特に、低分子量（１００～７３２ダルトンの間）を有する分子から構成され、その分子鎖は短く、表面の領域におけるバルクは最適であり、これにより、以下に記載されるそれらの革新的な特性を有するナノ粒子が提供される。
本発明は、低分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子から形成され、その被覆が部分的である自己組織化単分子膜を用いているＮＰの予備機能付与によって、これらの課題に対する解決策を提供する。ＮＰの表面上のこの予備膜の存在は、単独で、または他の分子と組み合わせて（機能付与）、溶液中で安定なＮＰを調製することを可能にする。この単分子膜は特に、低分子量（１００～７３２ダルトンの間）を有する分子から構成され、その分子鎖は短く、表面の領域におけるバルクは最適であり、これにより、以下に記載されるそれらの革新的な特性を有するナノ粒子が提供される。
【0012】
ＮＰの表面にグラフトされた要素の構成の説明を図１に示す。
【0013】
本発明による機能付与のストラテジーは表面化学であり、すなわち、非特異的相互作用の阻害および特異的相互作用の最適化によって、ナノ粒子の表面に固定化されたリガンド（生体分子）の数を制御し、これによって、金などの金属ナノ粒子、またはコアシェルの混成タイプのナノ粒子の、緩衝液および複合培地中における安定性を改善することができるものである。この技術は、プローブとして作用する１つ以上の生体分子の固定化に先立つ予備機能付与からなる。生体分子がＮＰの表面上へのそれらの直接固定化を可能にするチオール化基を含むか、または、生体分子の固定化が２つの工程：１）一方にチオールを有し、他方に反応性官能基を有するリンカー分子の固定化（前者は金属表面上へのそれらの固定化のためであり、後者は生体分子の固定化のためである）、そして２）リンカー分子上に存在する官能基と反応または相互作用することができる基を含む生体分子（プローブまたは活性分子）の付加で行われるか、のどちらかである。ここで説明した方法は、特に球状ＮＰ、ナノロッド、ナノキューブ、ナノトライアングル、およびナノアーチンに適している。
【0014】
さらに、この予備機能付与は、プローブの密度の最適化、プローブの均一な分布、および非特異的相互作用の不在を可能にする。特に、本発明は、高度の検出感度を達成するために、密度が低く最適化されたプローブを用いて機能付与されたＮＰを得ることを可能にする。また、プローブの各々について制御された密度および分布を維持しながら、複数の異なるプローブを組み合わせることも可能である。
【0015】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の第１の対象は、一方の末端にチオール官能基を有し他方の末端が不活性である分子のマトリクスによって形成された自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて予備機能付与された金属表面を含むナノ粒子に関し、上記ナノ粒子は、上記単分子膜の被覆率Ｗが１．５％～９９％であることを特徴とする。
本発明の第１の対象は、一方の末端にチオール官能基を有し他方の末端が不活性である分子のマトリクスによって形成された自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて予備機能付与された金属表面を含むナノ粒子に関し、上記ナノ粒子は、上記単分子膜の被覆率Ｗが１．５％～９９％であることを特徴とする。
【0016】
自己組織化単分子膜の特性は、それが機能付与の前にＮＰの表面に適用されること、およびそれが不飽和であることである。それは表面を保護する役割を果たす。この単分子膜は、式（Ｉ）の分子Ｍから形成される：
ＨＳ（ＣＨ２）ｎ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨ
ここで、
ｎは、ＣＨ２の数を表し、３≦ｎ≦１１であり、
ｍは、エチレングリコールの数を表し、１≦ｍ≦１２である。
ＨＳ（ＣＨ２）ｎ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨ
ここで、
ｎは、ＣＨ２の数を表し、３≦ｎ≦１１であり、
ｍは、エチレングリコールの数を表し、１≦ｍ≦１２である。
【0017】
分子Ｍの分子量は１００～７３２ダルトンである。
【0018】
総じて、ＳＡＭ分子膜の効果を認めるために、最低１．５％の被覆率Ｗが必須である。低い被覆率は、ＮＰ表面における生体分子が高密度になることを許容し、これは例えば、２つの異なった生体分子が存在するときの目的になり得る。一方、被覆率Ｗは飽和点付近（例えば９９％）に高くなり得、単一分子の付着を可能にするが、この手法の唯一の限界は、高感度の適切なツールがないことに起因する検出限界である。いずれにせよ、ＮＰの表面を予備機能付与することは、制御された手法で生体分子を固定化すること、すなわち、固定化された生体分子間の平均距離を確実に均一にすることを可能にする。
【0019】
特定の実施形態では、被覆率Ｗは用途に応じて、３％～８０％であり得、例えば１０％～５０％、または５％～３０％であり、特に２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％であってもよい。
【0020】
本発明の意義の範囲内において、「被覆率」とは、理論的に初期段階の被覆率を意味するものであり、分子表面に対応し、次式（２）により算出される：
（ｎｍ２で表される略号）×１００／ナノ粒子の表面積
本発明の意義の範囲内において、「ナノ粒子」（ＮＰ）とは、球状ナノ粒子（ＮＳ）、ナノロッド（ＮＲ）、立方体ナノ粒子（ＮＣ）、またはナノトライアングル（ＮＴ）、またはナノアーチンであり得る。これらは、特に、直径が１０～８０ｎｍである球状金ナノ粒子、アスペクト比が２．５～５であるナノロッド、および一辺が４０ｎｍであるナノキューブ、または一辺が３０～１００ｎｍで厚みが１０～４０ｎｍであるナノトライアングルであってもよい。ＮＰはまた、例えば酸化型（例えば酸化鉄、酸化ケイ素）または金属の核、および金属シェル（例えば金）を含む、同じ形状の混成ＮＰ（球体、ナノロッドなど）であってもよい。コア－シェル混成ナノ粒子の金属表面は金属ナノ粒子の表面と同様であり、その表面を計算する方法は同一である。
（ｎｍ２で表される略号）×１００／ナノ粒子の表面積
本発明の意義の範囲内において、「ナノ粒子」（ＮＰ）とは、球状ナノ粒子（ＮＳ）、ナノロッド（ＮＲ）、立方体ナノ粒子（ＮＣ）、またはナノトライアングル（ＮＴ）、またはナノアーチンであり得る。これらは、特に、直径が１０～８０ｎｍである球状金ナノ粒子、アスペクト比が２．５～５であるナノロッド、および一辺が４０ｎｍであるナノキューブ、または一辺が３０～１００ｎｍで厚みが１０～４０ｎｍであるナノトライアングルであってもよい。ＮＰはまた、例えば酸化型（例えば酸化鉄、酸化ケイ素）または金属の核、および金属シェル（例えば金）を含む、同じ形状の混成ＮＰ（球体、ナノロッドなど）であってもよい。コア－シェル混成ナノ粒子の金属表面は金属ナノ粒子の表面と同様であり、その表面を計算する方法は同一である。
【0021】
分子の表面積はその形状に依存し、被覆率を決定するために既知でなければならない。
【0022】
球状ナノ粒子では、表面積は次式（３）：
４πｒ２
であり、ここで、ｒはナノ粒子の半径である。
４πｒ２
であり、ここで、ｒはナノ粒子の半径である。
【0023】
ナノロッドの場合、表面積は、以下の式（４）：
２πｒｌ＋２πｒ２
であり、ここで、ｒはナノロッドの半径であり、ｌはその長さである。
２πｒｌ＋２πｒ２
であり、ここで、ｒはナノロッドの半径であり、ｌはその長さである。
【0024】
ナノキューブの場合、表面積は下記式（５）：
６ａ２
であり、ここで、ａはナノキューブの一辺である。
６ａ２
であり、ここで、ａはナノキューブの一辺である。
【0025】
ナノトライアングルの場合、表面積は次式（６）：
（ｐｈ／２）＋ｂ
であり、ここで、ｐは底面の周辺の長さであり、ｈは傾きの高さであり、ｂは底面の面積に対応する。
（ｐｈ／２）＋ｂ
であり、ここで、ｐは底面の周辺の長さであり、ｈは傾きの高さであり、ｂは底面の面積に対応する。
【0026】
ＮＰの表面上にそれらの予備機能付与またはそれらの機能付与のために存在する分子は、上記で定義されるＭ分子、以下で定義されるＬ－ＰＥＧおよびＰＥＧ－Ｆ分子、ならびに二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、抗体またはペプチドなどのタンパク質、アプタマーなど、から選択され得る。
【0027】
そして、被覆率を決定するためには、ＮＰの表面に存在する分子の理論的略号を認識することも必要である：
略号ＭおよびＰＥＧ－Ｆ＝０．２３ｎｍ２［１］
Ｌ－ＰＥＧの略号＝０．４５ｎｍ２［２］
ｄｓＤＮＡの略号＝３．１４ｎｍ２。
略号ＭおよびＰＥＧ－Ｆ＝０．２３ｎｍ２［１］
Ｌ－ＰＥＧの略号＝０．４５ｎｍ２［２］
ｄｓＤＮＡの略号＝３．１４ｎｍ２。
【0028】
より好ましい実施形態では、本発明によって予備機能付与されたナノ粒子は、少なくとも１つのＬ－ＰＥＧ分子を用いて機能付与されており、その被覆率Ｘは少なくとも１％、好ましくは１％～１０％である。
【0029】
「Ｌ－ＰＥＧ分子」とは、長い高さと高分子量とを有するチオール化ポリエチレングリコールの分子を意味する。
【0030】
Ｌ－ＰＥＧ分子は、式（７）：
ＳＨ－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＯ－Ｆ
であり得、ここで、
ｑはエチレングリコールの数を表し、２０≦ｑ≦５００であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表す。
ＳＨ－ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＯ－Ｆ
であり得、ここで、
ｑはエチレングリコールの数を表し、２０≦ｑ≦５００であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表す。
【0031】
Ｌ－ＰＥＧ分子の分子量は、８００ダルトン以上である。
【0032】
Ｌ‐ＰＥＧ分子を用いた機能付与は、特に、ＰＢＳ溶液中のＮＰを安定化することを目的とする。それは、１つ以上の生体分子が吸着され得て「すぐに使用できる」ＮＰを調製するために、分子Ｍを用いた予備機能付与と組み合わされ得る。
【0033】
さらに、Ｆ基がＣＨ３またはＯＨではない場合、ＮＰの表面上にプローブを付加するために、Ｆ基は生体分子と相互作用および／または反応し得る。
【0034】
本発明の特定の実施形態では、本発明による予備機能付与されたナノ粒子は、少なくとも１つのチオール化分子を用いて機能付与され、上記チオール化分子は、
・一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端に生体分子と相互作用することができる活性基または反応性基を有するチオール化リンカー分子、または、
・チオール官能基を含む生体分子、
のいずれかである。
・一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端に生体分子と相互作用することができる活性基または反応性基を有するチオール化リンカー分子、または、
・チオール官能基を含む生体分子、
のいずれかである。
【0035】
上記ナノ粒子はさらに、上記のＬ－ＰＥＧ分子を用いて機能付与することができる。
【0036】
好ましい実施形態では、チオール化リンカー分子は、ＰＥＧ－Ｆ分子であり、ここで、ＦはＣＯＯＨなどの活性化可能な官能基であり、その被覆率Ｙは少なくとも１％である。ＮＰの表面の総被覆率は、用途に応じて、部分的または全体（飽和）であってよい。好ましい実施形態では、全体の被覆は部分的である。
【0037】
「ＰＥＧ－Ｆ」は、チオール化ポリエチレングリコールの分子を意味する。
【0038】
ＰＥＧ－Ｆ分子は例えば、式（８）：
ＨＳ（ＣＨ２）ｒ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ－Ｆ
であってよく、ここで、
ｒは、ＣＨ２の数を表し、３以上の整数であり、
ｐは、エチレングリコールの数を表し、２≦ｐ≦１２であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表す。
ＨＳ（ＣＨ２）ｒ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ－Ｆ
であってよく、ここで、
ｒは、ＣＨ２の数を表し、３以上の整数であり、
ｐは、エチレングリコールの数を表し、２≦ｐ≦１２であり、
Ｆは、ＣＨ３、ＣＯＯＨまたはＮＨ２などの官能基を表す。
【0039】
ＰＥＧ－Ｆ分子の分子量は低くても高くてもよく、８００ｋＤａ超までに及ぶ。
【0040】
別の実施形態では、リンカー分子が活性化可能な官能基を含むＬ－ＰＥＧ分子であってもよい。
【0041】
別の好ましい実施形態では、本発明によって予備機能付与されたナノ粒子は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）、タンパク質（抗体、抗原、ホルモンなど）、ペプチド、ホルモン、糖、脂肪酸、あるいは実際に細胞全体などの、プローブ（「チオール化プローブ」と呼ばれる）として働くチオール化された生体分子を用いて機能付与される。
【0042】
別の目的の実施形態では、チオール化された生体分子は、薬物、サンドイッチまたは錯体形成などの小分子であり、ここでは「活性分子」と呼ばれる。これらの活性分子は、ＰＥＧ－ＦまたはＬ－ＰＥＧ分子上に存在する活性化可能な官能基によって結合されてもよい。
【0043】
チオール化分子が二本鎖または一本鎖ＤＮＡである場合、被覆率Ｚは少なくとも１０％である。ＮＰの表面の総被覆率は、用途に応じて、部分的または全体（飽和）であってよい。好ましい実施形態では、全体の被覆率は部分的である。
【0044】
好ましい実施形態において、ＰＥＧ－Ｆが短い場合、Ｌ－ＰＥＧ分子は、ＮＰを安定化させるために１％の割合で付加される。
【0045】
本発明の意義の範囲内で、「チオール化プローブ」は、水性培地（例えば緩衝液）または複合培地（培地、生物学的培地、体液、そして血液、血漿、血清、尿、涙、細胞抽出物などの液体マトリクスなど）中に位置する対象分子と特異的に相互作用（捕捉）することができるプローブの役割を果たす生体分子を意味する。プローブとして機能する上記生体分子はＮＰの支持体に固定され、これは、（ｉ）生体分子上に存在するチオール化基と、ＮＰの表面との直接相互作用によるものか、あるいは（ｉｉ）一方の末端におけるチオール化分子および、他方の末端に「強い」結合（例えばアミド結合などの共有結合、キレート化、ストレプトアビジン－ビオチン結合などの「タグ」タイプの強い親和力）を生成することによって結合分子と反応（結合）することができる活性または反応性基を有することによるものか、のいずれかである。上記チオール化分子は、本明細書では「リンカー分子」と呼ばれる。
【0046】
一旦、基体が上記の保護分子膜ＳＡＭによって保護されると、チオール化プローブ付着のさらなる工程が、使用の直前または直前、数時間、数日、または数ヶ月後に続く。
【0047】
これらのチオール化プローブは、
・一般に低い濃度（マイクロモルオーダーの、またはより低い濃度）に依存する時間のインキュベーションを必要とする直接チオール化プローブ、
・反応性アミンまたはカルボキシル基、二重または三重炭素－炭素、エポキシ樹脂、クリック化学（click chemistry）などの結合を有するチオール化分子、
・例えばビオチン－ストレプトアビジン－ビオチンなどのサンドウィッチを形成するために、相補的分子と相互作用する活性基を有するチオール化分子、
であり得る。
・一般に低い濃度（マイクロモルオーダーの、またはより低い濃度）に依存する時間のインキュベーションを必要とする直接チオール化プローブ、
・反応性アミンまたはカルボキシル基、二重または三重炭素－炭素、エポキシ樹脂、クリック化学（click chemistry）などの結合を有するチオール化分子、
・例えばビオチン－ストレプトアビジン－ビオチンなどのサンドウィッチを形成するために、相補的分子と相互作用する活性基を有するチオール化分子、
であり得る。
【0048】
本発明の第２の対象は、一方の末端にチオール官能基を有し、他方の末端は不活性である分子の溶液によって形成された自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いて予備機能付与された金属表面を含むナノ粒子を調製する方法に関し、以下の工程：
・自己組織化単分子膜を形成することができる分子Ｍを付加し、１．５％～９９％の被覆率Ｗを達成すること、
・少なくとも５分間撹拌すること、
を含む。
・自己組織化単分子膜を形成することができる分子Ｍを付加し、１．５％～９９％の被覆率Ｗを達成すること、
・少なくとも５分間撹拌すること、
を含む。
【0049】
この種の方法は、水中およびＰＢＳ中で安定な、予備機能付与されたＮＰを調製することを可能にする。このように調製されたＮＰは、使用するまで数ヶ月間、４℃で保存することができる。
【0050】
この方法を行う間に界面活性剤を添加することが可能である。使用される界面活性剤は、当業者に既知の全ての界面活性剤、特にＳＤＳ、ＣＨＡＲＳ、ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＲＳ：３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）などから選択することができる。当業者は、溶液中のＮＰの調製のための界面活性剤の使用に精通している。
【0051】
本発明の特定の実施形態では、さらに、１～１０％の被覆率Ｙを達成するために、ＳＡＭ分子膜を用いて予備機能付与されたＮＰの溶液にＬ－ＰＥＧ分子の溶液を添加し、次いで、撹拌しながら最低５分間、一般的には５分間～１時間、インキュベーションを行う。
【0052】
分子Ｍを用いて予備機能付与され、任意選択でＬ－ＰＥＧ分子を用いて機能付与されたＮＰは、チオール化分子および／または生体分子を用いてさらに機能付与することができる。代替の実施形態では、Ｌ－ＰＥＧ分子がＰＥＧ－Ｆ分子の後に付加されてもよい。
【0053】
この種の調製方法は、以下の工程：
・生体分子またはチオール化生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子から選択されるチオール化分子を付加すること、
・例えば５分～２４時間、撹拌すること、
・チオール化分子が生体分子である場合、そのチオール化分子に適した緩衝液条件にそのチオール化分子を置くこと、
・例えば遠心分離などの手段によって、過剰のチオール化分子を除去すること、
・適切な溶液（蒸留水、界面活性剤を含む緩衝液等）中に再分散させること、
・チオール化分子が活性化可能な分子である場合は、活性化剤（例えばＥＣＤ／ＮＨＳまたはＰＤＥＡ）を添加し、少なくとも５分間インキュベートし、遠心分離し、そして固定化されるべき生体分子の既知の溶液と共にインキュベートする前に、緩衝溶液中に再分散させること、
・チオール化分子がチオール化リンカー分子である場合、続いて、任意に、リンカー分子の基と相互作用することができる生体分子の溶液を添加すること、
を含む。
・生体分子またはチオール化生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子から選択されるチオール化分子を付加すること、
・例えば５分～２４時間、撹拌すること、
・チオール化分子が生体分子である場合、そのチオール化分子に適した緩衝液条件にそのチオール化分子を置くこと、
・例えば遠心分離などの手段によって、過剰のチオール化分子を除去すること、
・適切な溶液（蒸留水、界面活性剤を含む緩衝液等）中に再分散させること、
・チオール化分子が活性化可能な分子である場合は、活性化剤（例えばＥＣＤ／ＮＨＳまたはＰＤＥＡ）を添加し、少なくとも５分間インキュベートし、遠心分離し、そして固定化されるべき生体分子の既知の溶液と共にインキュベートする前に、緩衝溶液中に再分散させること、
・チオール化分子がチオール化リンカー分子である場合、続いて、任意に、リンカー分子の基と相互作用することができる生体分子の溶液を添加すること、
を含む。
【0054】
この方法は、実施される工程に応じて、異なる種類の機能付与されたＮＰ：
ＮＰ 予備機能付与Ｍ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ＋ＰＥＧ－Ｆ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋チオール化生体分子（例えばＤＮＡ）
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ＋プローブとしての使用に適しているあらゆるタイプの生体分子を伴うチオール化生体分子など
を調製することを可能にする。
ＮＰ 予備機能付与Ｍ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ＋ＰＥＧ－Ｆ
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋チオール化生体分子（例えばＤＮＡ）
ＮＰ 予備機能付与Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ＋プローブとしての使用に適しているあらゆるタイプの生体分子を伴うチオール化生体分子など
を調製することを可能にする。
【0055】
実施形態を図１に示す。
【0056】
分子Ｍが異なる被覆率で予備機能付与されたＮＰの調製を起点とする方法の利点は、これに続く水中また緩衝溶液中で実施され得る機能付与工程においてＮＰが安定である点である。上記分子Ｍは、低分子量で不活性な小分子である。分子Ｍを用いた予備機能付与は、ＮＰのサイズおよび形状にかかわらず、ＮＰの表面全体にわたって機能付与が均一になることを確実にする。さらにそれは、固定化された生体分子が変性せず、溶液に向かって配向され、ＮＰの表面に向かっては配向されないことを確実にする。さらに、分子Ｍは、非特異的な相互作用を防ぐ。
【0057】
本発明の第３の対象は、本発明によるナノ粒子の使用に関する。
【0058】
機能付与されたＮＰは、医療、農業食品、および環境分野の当業者に周知の多数の用途に使用され得る。
【0059】
それらは、特に、典型的には診断試験において、溶液中の対象分子を検出するために使用され得る。
【0060】
本発明は、したがって、溶液中、特に複合培地中の対象分子を検出するための方法に関し、以下の工程：
・上述の少なくとも１つの機能付与されたナノ粒子に溶液を接触させること、
・ＳＰＲ、ストリップ試験、または任意の他の適切な方法によって、生体分子が上記溶液の成分の１つと相互作用するときの特定のシグナルを検出すること、
を含む。
・上述の少なくとも１つの機能付与されたナノ粒子に溶液を接触させること、
・ＳＰＲ、ストリップ試験、または任意の他の適切な方法によって、生体分子が上記溶液の成分の１つと相互作用するときの特定のシグナルを検出すること、
を含む。
【0061】
本発明による機能付与されたＮＰはまた、特定の分子を枯渇させるために、これらが回収されることが意図される対象分子であるか、または実際に排除されることが意図される望ましくない分子であるかにかかわらず、使用され得る。
【0062】
本発明はしたがって、溶液中、特に複合培地中に存在する対象分子を検出するための方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）上述の機能付与されたナノ粒子に、対象分子を含む溶液を接触させること、
ｂ）上記ナノ粒子の存在下で上記溶液をインキュベートすること、
ｃ）上記ナノ粒子を回収すること、
ｄ）上記対象分子の溶液が無くなるまで、任意に工程ａ）～ｃ）を繰り返すこと、
を含む。
ａ）上述の機能付与されたナノ粒子に、対象分子を含む溶液を接触させること、
ｂ）上記ナノ粒子の存在下で上記溶液をインキュベートすること、
ｃ）上記ナノ粒子を回収すること、
ｄ）上記対象分子の溶液が無くなるまで、任意に工程ａ）～ｃ）を繰り返すこと、
を含む。
【0063】
癌の治療において、標的細胞におけるそれらの標的化および／または治療化合物のグラフト化を可能にするために機能付与されたＮＰを使用することが、長い間想定されてきた。放射線治療において、Ｘ線によって活性化され得るこのＮＰは、制御されている腫瘍を破壊することを目的とした放射線治療の実践において、大きな進歩をもたらす可能性がある。ＮＰはまた、癌と戦うための金ナノ粒子の最も有望な適用の１つである光熱療法のアプローチにおいて使用され得る。そのコンセプトは、患者の血液循環に金ナノ粒子を注入するというものである。それらの構造のために、上記ナノ粒子は癌性組織中に固定される傾向があるが、それらを特定の分子で覆う（機能付与）ことによって、それらを腫瘍にさらに特異的に指向させることが可能である。次に、レーザー光を用いてそれらを「加熱」する。ＮＰから放出された熱によって、がん細胞に不可逆的な損傷が生じる。この技術は、現在、頭部または頸部の癌、または実際に肺および前立腺の癌を対象とした複数の臨床試験において試験されている。
【0064】
したがって本発明は、癌の治療、特に放射線療法または光熱療法による、本発明による機能付与されたＮＰの使用に関する。制御された光熱療法は、細胞または標的器官に影響を及ぼすことなく、ナノ粒子上に予めグラフトされた治療用分子の塩析を可能にし得る。
【0065】
本発明は、本発明によって機能付与されたＮＰの、医用画像診断のための使用に関する。
【0066】
ＮＰが添加される溶液は、性質が変化し得る。それは、単純な培地（水、ＰＢＳ、モデル培地）、または複合培地（体液、排水、流出液など）であってもよい。それはまた、より一般的には、ＮＰがその中に、またはそれと接触して分散され得るマトリクスであり得る。このマトリクスは、ゲル、砂、またはその表面上に対象分子を含む可能性がある任意の平坦な表面であり得る。
【0067】
特定の実施形態では、溶液が細胞抽出物、細菌培養抽出物、生物学的ヒト試料（血清、血液、尿、羊水、涙などから選択される）、水性培地（廃水、汚染水または水（海水、水槽からの水などであり得る）から選択される）などの複雑な生物学的培地である。
【0068】
〔図面の簡単な説明〕
図１： ＮＰの機能付与のための技術的方法の概観。Ａ）分子Ｍ（短い黒い曲線で示す）のＳＡＭを用いた予備機能付与；Ｂ）Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ（長い薄灰色の曲線で示す）；Ｃ）Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆまたは生体分子（中間の長さの灰色の曲線で示す）；Ｄ）Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆまたは生体分子＋Ｌ－ＰＥＧ。Ｆは官能基を示す。
図２： 界面活性剤の存在下または非存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍの球状ナノ粒子；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ－４）。
図３： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＲの吸光度スペクトル。ナノロッドλ＝８００ｎｍ；撹拌時間＝３０分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝８％。
図４： 遠心分離後の、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子；被覆率１．６～８０％；撹拌時間＝５分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図５： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子；被覆率１．６～８０％；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図６： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。４０ｎｍの市販のナノ粒子（ref:741981 Sigma Aldrich）；被覆率０、１．６および１６％；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝１２）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図７： 分子Ｍで予備機能付与されたＮＳ、および分子Ｍで予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０、１、１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＬ－ＰＥＧ（Ｗ＝５％）で機能付与されたＮＰの吸光度スペクトル。４０ｎｍのナノ粒子（ref:741981 Sigma Aldrich）、インキュベーション時間 Ｌ－ＰＥＧ＝５分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００、Ｆ＝ＣＨ３。
図８： 異なる被覆率の分子Ｍ（Ｗ＝０、１．６および１６％）を有するＰＢＳ中に分散されたＣＯＯＨ官能基を有するチオール化分子（Ｙ＝１．６％）で機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）およびＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）。
図９： 異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００およびＦ＝ＣＨ３、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）
図１０： 異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝市販品８０ｎｍ（ref:742023 Sigma Aldrich）、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００、Ｆ＝ＣＨ３、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）
図１１： 分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与されたＤＮＡを有する（Ｗ＝０または１．６％；Ｚ＝１２．５％）、ＮＳの吸光度スペクトル；Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＮＳサイズ＝２０ｎｍ。
図１２： 分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。Ｆ＝ＣＨ３；ＮＳサイズ＝２０ｎｍ。市販品（ref:741965 Sigma Aldrich）。
図１３： 分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｙ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（Ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル、Ｆ＝ＣＨ３；ＮＳサイズ＝８０ｎｍ市販品（ref:742023 Sigma Aldrich）。
図１４： インキュベーション時間に応じた、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤中の分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル；２０ｎｍのＮＳ；撹拌時間＝５、３０、１２０、２４０および１４４０分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝４０％。
図１５： ３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡ（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）のＮＳの吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１，ｍ＝４）、ＮＰ ２０ｎｍ。
図１６： ３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡを有する（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）、ＮＳの最初の洗浄の上清の吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＮＳ ２０ｎｍ。
図１７： 調製および４℃での保存の１日後、３か月後および１１か月後の、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳ ２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝３２％。
図１８： ４℃での１日および２か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝０および１６％、Ｚ＝１２．５％。
図１９： ４℃での１日および３か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３２％およびＺ＝２５％）の吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）。
図２０： １００倍に希釈した細胞抽出物（点線）中で１時間インキュベートした後、細胞抽出物（実線）を添加する前に、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３０％、Ｚ＝１２．５％）のＵＶ－可視スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）。
図２１： １００倍に希釈した細胞抽出物の吸光度スペクトル、および遠心分離後の３つの上清の合計（点線）。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１，ｍ＝４）（Ｗ＝３０％、Ｚ＝１２．５％）。
図２２： 左側の画像：相補的な蛍光ＤＮＡの位置を特定するためのＣｙ５の蛍光の画像；右側の画像：ナノ粒子の位置を特定するためのゲルのコントラスト画像。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）（Ｗ＝０および１６％、Ｚ＝１２．５％）。
図１： ＮＰの機能付与のための技術的方法の概観。Ａ）分子Ｍ（短い黒い曲線で示す）のＳＡＭを用いた予備機能付与；Ｂ）Ｍ＋Ｌ－ＰＥＧ（長い薄灰色の曲線で示す）；Ｃ）Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆまたは生体分子（中間の長さの灰色の曲線で示す）；Ｄ）Ｍ＋ＰＥＧ－Ｆまたは生体分子＋Ｌ－ＰＥＧ。Ｆは官能基を示す。
図２： 界面活性剤の存在下または非存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍの球状ナノ粒子；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ－４）。
図３： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＲの吸光度スペクトル。ナノロッドλ＝８００ｎｍ；撹拌時間＝３０分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝８％。
図４： 遠心分離後の、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子；被覆率１．６～８０％；撹拌時間＝５分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図５： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子；被覆率１．６～８０％；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図６： 界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。４０ｎｍの市販のナノ粒子（ref:741981 Sigma Aldrich）；被覆率０、１．６および１６％；撹拌時間＝４時間、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝１２）、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤。
図７： 分子Ｍで予備機能付与されたＮＳ、および分子Ｍで予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０、１、１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＬ－ＰＥＧ（Ｗ＝５％）で機能付与されたＮＰの吸光度スペクトル。４０ｎｍのナノ粒子（ref:741981 Sigma Aldrich）、インキュベーション時間 Ｌ－ＰＥＧ＝５分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００、Ｆ＝ＣＨ３。
図８： 異なる被覆率の分子Ｍ（Ｗ＝０、１．６および１６％）を有するＰＢＳ中に分散されたＣＯＯＨ官能基を有するチオール化分子（Ｙ＝１．６％）で機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。２０ｎｍのナノ粒子。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）およびＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）。
図９： 異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００およびＦ＝ＣＨ３、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）
図１０： 異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝市販品８０ｎｍ（ref:742023 Sigma Aldrich）、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｌ－ＰＥＧ分子量＝６０００、Ｆ＝ＣＨ３、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ｒ＝１１、ｐ＝６）
図１１： 分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与されたＤＮＡを有する（Ｗ＝０または１．６％；Ｚ＝１２．５％）、ＮＳの吸光度スペクトル；Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＮＳサイズ＝２０ｎｍ。
図１２： 分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。Ｆ＝ＣＨ３；ＮＳサイズ＝２０ｎｍ。市販品（ref:741965 Sigma Aldrich）。
図１３： 分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｙ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（Ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル、Ｆ＝ＣＨ３；ＮＳサイズ＝８０ｎｍ市販品（ref:742023 Sigma Aldrich）。
図１４： インキュベーション時間に応じた、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤中の分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル；２０ｎｍのＮＳ；撹拌時間＝５、３０、１２０、２４０および１４４０分、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝４０％。
図１５： ３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡ（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）のＮＳの吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１，ｍ＝４）、ＮＰ ２０ｎｍ。
図１６： ３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡを有する（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）、ＮＳの最初の洗浄の上清の吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、ＮＳ ２０ｎｍ。
図１７： 調製および４℃での保存の１日後、３か月後および１１か月後の、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。ＮＳ ２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝３２％。
図１８： ４℃での１日および２か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）、Ｗ＝０および１６％、Ｚ＝１２．５％。
図１９： ４℃での１日および３か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３２％およびＺ＝２５％）の吸光度スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）。
図２０： １００倍に希釈した細胞抽出物（点線）中で１時間インキュベートした後、細胞抽出物（実線）を添加する前に、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３０％、Ｚ＝１２．５％）のＵＶ－可視スペクトル。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）。
図２１： １００倍に希釈した細胞抽出物の吸光度スペクトル、および遠心分離後の３つの上清の合計（点線）。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１，ｍ＝４）（Ｗ＝３０％、Ｚ＝１２．５％）。
図２２： 左側の画像：相補的な蛍光ＤＮＡの位置を特定するためのＣｙ５の蛍光の画像；右側の画像：ナノ粒子の位置を特定するためのゲルのコントラスト画像。ＮＳサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１、ｍ＝４）（Ｗ＝０および１６％、Ｚ＝１２．５％）。
【0069】
〔実施例〕
（用語）
チオール化分子：「生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子」または「チオール化生体分子」
Ｗは、分子Ｍから形成された予備膜の被覆率である。
（用語）
チオール化分子：「生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子」または「チオール化生体分子」
Ｗは、分子Ｍから形成された予備膜の被覆率である。
【0070】
Ｘは、Ｌ－ＰＥＧの被覆率である。
【0071】
Ｙは、ＰＥＧ－Ｆの被覆率である。
【0072】
Ｚはチオール化ＤＮＡの被覆率である。
【0073】
〔実施例１〕ナノ粒子の予備機能付与／機能付与のための一般的なプロトコル
いかなる予備機能付与前にも、ナノ粒子（ＮＰ）の溶液（水中で希釈）中の過剰な界面活性剤（例えば、クエン酸塩）を除去することが好ましい。これを達成するために、あらかじめＮＰ溶液を遠心分離し、上清を除去し、同容量の蒸留水にＮＰケーキを再分散させる。遠心分離の速度および時間は、ＮＰのサイズに応じて調整される。
いかなる予備機能付与前にも、ナノ粒子（ＮＰ）の溶液（水中で希釈）中の過剰な界面活性剤（例えば、クエン酸塩）を除去することが好ましい。これを達成するために、あらかじめＮＰ溶液を遠心分離し、上清を除去し、同容量の蒸留水にＮＰケーキを再分散させる。遠心分離の速度および時間は、ＮＰのサイズに応じて調整される。
【0074】
（機能付与された球状ＮＰの調製例）
ＮＰ溶液（直径１０～８０ｎｍのサイズ）から、以下の工程を実施する。
ＮＰ溶液（直径１０～８０ｎｍのサイズ）から、以下の工程を実施する。
【0075】
ａ）分子Ｍを付加し、１．５％～９９％の被覆率Ｗを達成する、
ｂ）５分～４時間撹拌する、
ｃ）Ｌ－ＰＥＧ分子を任意に付加し、１％～１０％の被覆率Ｙを達成する、
ｄ）５～６０分間撹拌する、
ｅ）被覆率Ｙが少なくとも１％またはＺ＝少なくとも１０％を達成するために、チオール化分子（生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子、または、チオール化生体分子のいずれか）を付加する、
ｆ）５分～２４時間撹拌する、
ｇ）チオール化分子が生体分子である場合、そのチオール化分子に適した緩衝液条件にそのチオール化分子を置く、
ｈ）過剰のチオール化分子を除去するための遠心分離、
ｉ）適切な溶液（蒸留水、界面活性剤を含む緩衝溶液等）中に再分散させる。
ｂ）５分～４時間撹拌する、
ｃ）Ｌ－ＰＥＧ分子を任意に付加し、１％～１０％の被覆率Ｙを達成する、
ｄ）５～６０分間撹拌する、
ｅ）被覆率Ｙが少なくとも１％またはＺ＝少なくとも１０％を達成するために、チオール化分子（生体分子と相互作用することができるチオール化リンカー分子、または、チオール化生体分子のいずれか）を付加する、
ｆ）５分～２４時間撹拌する、
ｇ）チオール化分子が生体分子である場合、そのチオール化分子に適した緩衝液条件にそのチオール化分子を置く、
ｈ）過剰のチオール化分子を除去するための遠心分離、
ｉ）適切な溶液（蒸留水、界面活性剤を含む緩衝溶液等）中に再分散させる。
【0076】
〔実施例２〕分子Ｍを用いた金ナノ粒子表面の予備機能付与は、ＰＢＳ溶液中での上記ナノ粒子の安定性を改善する
ａ）球状ナノ粒子の場合
分子Ｍ（Ｗ＝２４％）の溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を数時間（少なくとも４時間）撹拌し、次いで０および０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液、ならびにＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下または非存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
ａ）球状ナノ粒子の場合
分子Ｍ（Ｗ＝２４％）の溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を数時間（少なくとも４時間）撹拌し、次いで０および０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液、ならびにＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下または非存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
【0077】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図２に示す。
【0078】
分子Ｍがなければ、ナノ粒子は安定ではなく、凝集することが観察される。対照的に、分子Ｍの存在は、上記ナノ粒子を懸濁状態に保つことを可能にする。図２の吸光度スペクトルによれば、プラズモンバンドが精緻化（refine）されるので、界面活性剤の存在下でのＰＢＳ中のナノ粒子の安定性の改善が観察される。
【0079】
ｂ）ナノロッドの場合
分子Ｍの溶液、次いで０．００５％界面活性剤をナノロッド（ＮＲ）の溶液に添加する。混合物を３０分間撹拌し、次いでｐＨ７．４のリン酸緩衝液およびＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
分子Ｍの溶液、次いで０．００５％界面活性剤をナノロッド（ＮＲ）の溶液に添加する。混合物を３０分間撹拌し、次いでｐＨ７．４のリン酸緩衝液およびＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
【0080】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図３に示す。分子Ｍがなければ、ナノ粒子は安定ではなく、凝集することが観察される。対照的に、分子Ｍの存在は、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤中で上記ナノ粒子を懸濁状態に保つことを可能にする。
【0081】
残りの実験は球状ＮＰを用いて実施した。
【0082】
〔実施例３〕分子Ｍを用いて予備機能付与されたナノ粒子を洗浄し、界面活性剤の存在下でＰＢＳ溶液中に再分散させることができる
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を５分間または４時間撹拌し、遠心分離し、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ１×の溶液中に再分散させる。
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を５分間または４時間撹拌し、遠心分離し、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ１×の溶液中に再分散させる。
【0083】
「ＰＢＳ１×」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４である溶液を意味する。
【0084】
さまざまなプロトコルを試験した：
ａ）２０ｎｍの球状ナノ粒子を、分子Ｍの溶液中で５分間インキュベートした。
ａ）２０ｎｍの球状ナノ粒子を、分子Ｍの溶液中で５分間インキュベートした。
【0085】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図４に示す。
【0086】
ｂ）２０ｎｍの球状ナノ粒子を、分子Ｍの溶液中で４時間インキュベートした。
【0087】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図５に示す。
【0088】
ｃ）４０ｎｍの球状ナノ粒子を、分子Ｍの溶液中で４時間インキュベートした。
【0089】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図６に示す。
【0090】
これらの結果は、ナノ粒子の安定性が分子Ｍの溶液の被覆率と共に増加することを明らかに示している。
【0091】
〔実施例４〕Ｌ－ＰＥＧ分子を用いた機能付与は、ＰＢＳ溶液中での、分子Ｍを用いて予備機能付与されたナノ粒子の安定性を改善する
ａ）予備機能付与のみ
予備機能付与のみのために、Ｗ＝１．６～８０％の分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。混合物を数分間または数時間（５分～２４時間）撹拌し、遠心分離し、適切な溶液に再分散させた。
ａ）予備機能付与のみ
予備機能付与のみのために、Ｗ＝１．６～８０％の分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。混合物を数分間または数時間（５分～２４時間）撹拌し、遠心分離し、適切な溶液に再分散させた。
【0092】
ｂ）予備機能付与後のＬ－ＰＥＧ分子を用いた機能付与
予備機能付与後のＬ－ＰＥＧ分子を用いた機能付与のため、被覆率Ｗ＝５％を達成するために、分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。少なくとも５分間撹拌した後、Ｌ－ＰＥＧ溶液を０、１および１０％の被覆率で添加する。混合物を再び１５分間撹拌し、次いで遠心分離し、ＰＢＳ（１×）の溶液中に再分散させる。
予備機能付与後のＬ－ＰＥＧ分子を用いた機能付与のため、被覆率Ｗ＝５％を達成するために、分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。少なくとも５分間撹拌した後、Ｌ－ＰＥＧ溶液を０、１および１０％の被覆率で添加する。混合物を再び１５分間撹拌し、次いで遠心分離し、ＰＢＳ（１×）の溶液中に再分散させる。
【0093】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図７に示す。
【0094】
これらの結果は、Ｘ＝１％から、Ｌ－ＰＥＧの添加が、ＰＢＳ中の分子Ｍの単分子膜によって被覆されたＮＰを、低い被覆率で安定化することを可能にすることを示す（本件の場合、Ｗ＝５％）。実際、プラズモンバンドはＬ－ＰＥＧで精緻化され、安定性の改善が確認されている。
【0095】
〔実施例５〕分子Ｍを用いたナノ粒子の予備機能付与は、ＰＢＳ溶液中での、チオール化分子を用いて機能付与された上記ナノ粒子の安定性を改善する
ａ）チオール化カルボキシル分子を用いた機能付与（予備機能付与なし）。
ａ）チオール化カルボキシル分子を用いた機能付与（予備機能付与なし）。
【0096】
被覆率Ｙが１．６％となるように、ＰＥＧ－ＣＯＯＨの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。混合物を３０分間撹拌し、遠心分離し、Ｈ２ＯまたはＰＢＳ１×＋０．００５％界面活性剤のいずれかに再分散させた。
【0097】
ｂ）予備機能付与後のチオール化カルボキシル分子を用いた機能付与
理論的初期被覆率Ｙが１．６％～８０％となるように、分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。５分間撹拌した後、１．６％の被覆率Ｙを達成するために、ＰＥＧ－ＣＯＯＨの溶液を添加した。混合物を３０分間撹拌し、遠心分離し、蒸留水またはＰＢＳ１×＋０．００５％界面活性剤のいずれかに再分散させた。
理論的初期被覆率Ｙが１．６％～８０％となるように、分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。５分間撹拌した後、１．６％の被覆率Ｙを達成するために、ＰＥＧ－ＣＯＯＨの溶液を添加した。混合物を３０分間撹拌し、遠心分離し、蒸留水またはＰＢＳ１×＋０．００５％界面活性剤のいずれかに再分散させた。
【0098】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図８に示す。
【0099】
これらの結果は、ＰＥＧ－ＣＯＯＨのみで機能付与されたＮＰがＰＢＳ中で凝集することを示す。分子Ｍの溶液を用いてＮＰを予備機能付与する事実は、特に被覆率Ｗ＝１．６％から、溶液中のＮＰの安定性を改善することを可能にする。インキュベーション時間およびＷを増加させることによって、すなわち、ＮＰの表面における分子Ｍの密度を増加させることによって、安定性はさらに改善される（本件の場合、Ｗ＝１６％で最高の安定性を反映する曲線である）。
【0100】
〔実施例６〕Ｌ－ＰＥＧ分子を用いた機能付与は、ＰＢＳ溶液中での、分子Ｍを用いて予備機能付与され、チオール化分子を用いて機能付与されたＮＰの安定性を改善する
分子Ｍの溶液をＮＰの溶液に添加して、被覆率Ｗ＝５％を達成した。次に、被覆率Ｘが０または１０％となるように、Ｌ－ＰＥＧの溶液を添加した。次いで、被覆率Ｙ＝５％を達成するために、ＰＥＧ－ＣＯＯＨの溶液を添加した。混合物を撹拌し、遠心分離し、蒸留水またはＰＢＳ１×＋０．００５％界面活性剤のいずれかに再分散させた。
分子Ｍの溶液をＮＰの溶液に添加して、被覆率Ｗ＝５％を達成した。次に、被覆率Ｘが０または１０％となるように、Ｌ－ＰＥＧの溶液を添加した。次いで、被覆率Ｙ＝５％を達成するために、ＰＥＧ－ＣＯＯＨの溶液を添加した。混合物を撹拌し、遠心分離し、蒸留水またはＰＢＳ１×＋０．００５％界面活性剤のいずれかに再分散させた。
【0101】
【0102】
１０％のＬ－ＰＥＧの添加は、予備機能付与され、さらに、チオール化分子（本件の場合、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）を用いて機能付与されたＮＰの安定性を、特に分子Ｍおよびチオール化分子の低い被覆率（それぞれ５％の被覆率）で増加させることに留意されたい。
【0103】
〔実施例７〕分子Ｍを用いた予備機能付与は、ＰＢＳ溶液中での、チオール化分子を用いて機能付与したＮＰの安定性を改善する：チオール化ＤＮＡ分子の場合
ａ）チオール化ＤＮＡ分子を用いた機能付与（予備機能付与なし）
少なくとも１２．５％の被覆率Ｚを達成するために、ＤＮＡの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。混合物を１時間撹拌し、次いで０．００５％界面活性剤、およびリン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
ａ）チオール化ＤＮＡ分子を用いた機能付与（予備機能付与なし）
少なくとも１２．５％の被覆率Ｚを達成するために、ＤＮＡの溶液をナノ粒子の溶液に添加した。混合物を１時間撹拌し、次いで０．００５％界面活性剤、およびリン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
【0104】
ｂ）予備機能付与後のチオール化ＤＮＡ分子を用いた機能付与
分子Ｍの溶液をＮＰの溶液に添加して、被覆率１．６および８０％を達成した。次いで、少なくとも１２．５％の被覆率Ｚを達成するために、ＤＮＡの溶液を添加した。１時間撹拌した後、０．００５％界面活性剤、リン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
分子Ｍの溶液をＮＰの溶液に添加して、被覆率１．６および８０％を達成した。次いで、少なくとも１２．５％の被覆率Ｚを達成するために、ＤＮＡの溶液を添加した。１時間撹拌した後、０．００５％界面活性剤、リン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
【0105】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図１１に示す。
【0106】
ＤＮＡで機能付与されたＮＰは、ＰＢＳ中で凝集することに留意されたい。しかしながら、分子Ｍを用いる予備機能付与は、１．５％の被覆率Ｗから始まる安定性を改善する。インキュベーション時間およびＷを増加させることによって、すなわち、ＮＰの表面における分子Ｍの密度を増加させることによって、安定性はさらに改善され得る（データは示さず）。
【0107】
〔実施例８〕Ｌ－ＰＥＧ機能付与は、ＰＢＳ溶液中での、分子Ｍを用いて予備機能付与され、チオール化ＤＮＡを用いて機能付与されたＮＰの安定性を改善する
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加し、１．６および８０％の被覆率Ｗを達成した。次いで、１～１０％の被覆率Ｘを達成するために、３０分間のインキュベーション後にＬ－ＰＥＧの溶液を添加した。混合物を１５分間撹拌した。次いで、少なくとも１２．５％の理論的初期被覆率を達成するために、ＳＨ－ＤＮＡの溶液を添加した。ＤＮＡ溶液の添加後、０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（最終濃度１０ｍＭ）、およびＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）を添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加し、１．６および８０％の被覆率Ｗを達成した。次いで、１～１０％の被覆率Ｘを達成するために、３０分間のインキュベーション後にＬ－ＰＥＧの溶液を添加した。混合物を１５分間撹拌した。次いで、少なくとも１２．５％の理論的初期被覆率を達成するために、ＳＨ－ＤＮＡの溶液を添加した。ＤＮＡ溶液の添加後、０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（最終濃度１０ｍＭ）、およびＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）を添加した。混合物を１８時間撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。
【0108】
【0109】
ＮＰの安定性の改善は、Ｌ－ＰＥＧ分子を付加したときに認められる。特に、Ｌ－ＰＥＧの分子膜の存在は、低レベルの分子Ｍ（Ｗ＝１０％）を有するＰＢＳ溶液中で８０ｎｍのＮＰを安定化させることを可能にする。
【0110】
〔実施例９〕分子Ｍを含む溶液中でのＮＰのインキュベーション時間が安定性に及ぼす効果
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を数分間または数時間（５分～２４時間）撹拌し、次に０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
分子Ｍの溶液をナノ粒子の溶液に添加する。混合物を数分間または数時間（５分～２４時間）撹拌し、次に０．００５％界面活性剤、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液、およびＮａＣｌを添加する。次いで、ＮＰを、０．００５％界面活性剤の存在下でＰＢＳ（リン酸塩１０ｎＭ、ｐＨ＝７．４、および０．１Ｍ ＮａＣｌ）中に分散させる。
【0111】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図１４に示す。
【0112】
被覆率は時間の関数として増加し、インキュベーションの１２０～２４０分の間で最大に達することに留意されたい。この期間を越えてインキュベーションを続けることは、Ｗにさらなる影響を及ぼさない。
【0113】
〔実施例１０〕ナノ粒子を安定化する方法の再現性
プロトコルの再現性を確認するために、プロトコルを異なる日に３回繰り返した。試料の安定性をＵＶ－可視分光法によって特徴付けた。チオール化ＤＮＡのグラフト化に関して、過剰のＤＮＡを除去するための洗浄工程の間、第１の上清を、ＵＶ－可視分光法によって分析した。
プロトコルの再現性を確認するために、プロトコルを異なる日に３回繰り返した。試料の安定性をＵＶ－可視分光法によって特徴付けた。チオール化ＤＮＡのグラフト化に関して、過剰のＤＮＡを除去するための洗浄工程の間、第１の上清を、ＵＶ－可視分光法によって分析した。
【0114】
【0115】
ＵＶ－可視スペクトルは重ね合わせることができる微細なプラズモンバンドを含み、これは、上清の同一の吸光度強度が同数のＤＮＡがＮＰに結合されていることを示唆しているのと同様に、分子Ｍを用いて予備機能付与され、ＤＮＡを用いて機能付与されたナノ粒子ＮＰが安定であることを示唆している。結論として、これらの結果によって、試料の調製における再現性を確認する。
【0116】
〔実施例１１〕分子Ｍを用いて予備機能付与されたＮＰは水中で数か月間安定である
上述のように、分子Ｍを用いて２０ｎｍのＮＰを予備機能付与し、次いで、４℃および暗所で数か月間保存した。安定性は、ＵＶ－可視分光法によって検討した。典型的には、１ｍＬの溶液を取り出し、ＵＶＩＫＯＮ分析計によって分析した。異なる時間で得られたスペクトルを比較した。
上述のように、分子Ｍを用いて２０ｎｍのＮＰを予備機能付与し、次いで、４℃および暗所で数か月間保存した。安定性は、ＵＶ－可視分光法によって検討した。典型的には、１ｍＬの溶液を取り出し、ＵＶＩＫＯＮ分析計によって分析した。異なる時間で得られたスペクトルを比較した。
【0117】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図１７に示す。
【0118】
分子Ｍを用いて予備機能付与されたＮＰの吸光度スペクトルの良好な相関が、１日および１１か月後の保存に観察される。３つのスペクトルはプラズモンバンドのいかなる変位もない微細なプラズモンバンドを示し、４℃での１１か月の保存後に、予備機能付与されたＮＰが依然として水中で安定であることを確認する。
【0119】
〔実施例１２〕分子Ｍを用いて予備機能付与され、ＤＮＡを用いて機能付与されたＮＰは、ＰＢＳ溶液中で数か月間安定である
上述のように、分子Ｍを用いて２０ｎｍのＮＰを予備機能付与し、ＤＮＡを用いて機能付与した後、４℃および暗所で数か月間保存した。安定性を、ＵＶ－可視分光法によって評価する。典型的には、１ｍＬの溶液を取り出し、ＵＶＩＫＯＮ分析計によって分析する。異なる保存時間で得られたスペクトルを比較する。
上述のように、分子Ｍを用いて２０ｎｍのＮＰを予備機能付与し、ＤＮＡを用いて機能付与した後、４℃および暗所で数か月間保存した。安定性を、ＵＶ－可視分光法によって評価する。典型的には、１ｍＬの溶液を取り出し、ＵＶＩＫＯＮ分析計によって分析する。異なる保存時間で得られたスペクトルを比較する。
【0120】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図１８および１９に示す。
【0121】
第１に、分子Ｍの存在は、調製後および保存中のＮＰを安定化させることを可能にすることに留意されたい。これらの結果は、１日および２～３か月の保存後に得られたスペクトルと比較して、予備機能付与され、ＤＮＡを用いて機能付与されたＮＰのスペクトルの良好な相関を示す。２つのスペクトルはプラズモンバンドのいかなる変位もない２つの微細なプラズモンバンドを示し、４℃での２～３か月の保存後、ＮＰは依然としてＰＢＳ中で安定であることを確認する。
【0122】
〔実施例１３〕予備機能付与され、ＤＮＡを用いて機能付与されたＮＰは、複合培地中で安定である
１０μｌの細胞抽出物を、１ｎＭ（複合培地の希釈は×１００である）で、分子Ｍを用いて予備機能付与し、チオール化ＤＮＡを用いて機能付与した１ｍｌのＮＰの溶液に添加した。混合物を１時間撹拌し、次いで遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。ＮＰの安定性および上清中の細胞培地の吸光度強度は、ＵＶ－可視分光法によって特徴付けられる。Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則によれば、吸光度強度は溶液中の濃度に関連する。細胞抽出物の吸光度強度が上清の吸光度強度と同様である場合、これは、細胞抽出物中に存在する生体分子がＮＰにおいて非特異的な態様で吸収されていないことを示す。
１０μｌの細胞抽出物を、１ｎＭ（複合培地の希釈は×１００である）で、分子Ｍを用いて予備機能付与し、チオール化ＤＮＡを用いて機能付与した１ｍｌのＮＰの溶液に添加した。混合物を１時間撹拌し、次いで遠心分離し、ＰＢＳ１×に再分散させた。ＮＰの安定性および上清中の細胞培地の吸光度強度は、ＵＶ－可視分光法によって特徴付けられる。Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則によれば、吸光度強度は溶液中の濃度に関連する。細胞抽出物の吸光度強度が上清の吸光度強度と同様である場合、これは、細胞抽出物中に存在する生体分子がＮＰにおいて非特異的な態様で吸収されていないことを示す。
【0123】
ナノ粒子の安定性に関するデータを図２０および２１に示す。
【0124】
細胞抽出物の添加前および１時間のインキュベーション後の試料の吸光度スペクトルを比較した。複合培地中では凝集が起こらず、粒子が十分に保護されていることが示唆されることに留意されたい。非特異的な吸着があるかどうかを決定するために、細胞抽出物を除去するように粒子を遠心分離によって洗浄した。１時間のインキュベーション後の３つの上清の合計を、最初の細胞抽出物のスペクトルに重ね合わせた。スペクトルが重ね合わされていることを観察することが可能であり、このことは、機能付与されたＮＰの表面における細胞抽出物に由来するタンパク質の特異的な吸着がほとんどまたは全くないことを示唆した。
【0125】
〔実施例１４〕分子ＭによるＮＰの予備機能付与は、複合培地中でのハイブリダイゼーションを改善する
１００ｎＭの相補的な蛍光ＤＮＡ（Ｃｙ５）１μｌを、１．５ｎＭのＮＰ２００μｌの溶液に添加し、分子Ｍを用いた予備機能付与を行った、または行っていないＤＮＡを用いて機能付与した。したがって、相補的ＤＮＡの総濃度は５００ｐＭであった。ハイブリダイゼーションは、３つの異なる培地（ＰＢＳ１×、細胞抽出物およびヒト血清）中、３７℃で２時間インキュベートした。複合培地を１００倍希釈する。蛍光ＤＮＡ、ＤＮＡで機能付与されたＮＰ、およびＤＮＡで機能付与される前に予備機能付与されたＮＰを区別するために、試料を電気泳動用アガロースゲルに置いた。電気泳動は、ハイブリダイズしたナノ粒子および溶液中で遊離の相補的ＤＮＡを分離および区別することを可能にする。
１００ｎＭの相補的な蛍光ＤＮＡ（Ｃｙ５）１μｌを、１．５ｎＭのＮＰ２００μｌの溶液に添加し、分子Ｍを用いた予備機能付与を行った、または行っていないＤＮＡを用いて機能付与した。したがって、相補的ＤＮＡの総濃度は５００ｐＭであった。ハイブリダイゼーションは、３つの異なる培地（ＰＢＳ１×、細胞抽出物およびヒト血清）中、３７℃で２時間インキュベートした。複合培地を１００倍希釈する。蛍光ＤＮＡ、ＤＮＡで機能付与されたＮＰ、およびＤＮＡで機能付与される前に予備機能付与されたＮＰを区別するために、試料を電気泳動用アガロースゲルに置いた。電気泳動は、ハイブリダイズしたナノ粒子および溶液中で遊離の相補的ＤＮＡを分離および区別することを可能にする。
【0126】
ＤＮＡ分子のみを用いて機能付与されたＮＰ、または、分子Ｍの単分子膜を用いて予備機能付与され、次いでＤＮＡ分子を用いて機能付与されたＮＰのいずれかである、２つのタイプのナノ粒子との相補的な蛍光鎖のハイブリダイゼーションを、３つの異なる培地（ＰＢＳ、１００倍に希釈された細胞抽出物、および１００倍に希釈されたヒト血清中で検討した。用いたナノ粒子は使用２か月前に合成し、４℃で保存した。
【0127】
この実験の結果を図２２に示す。
【0128】
フルオロフォアのみが励起されないので、ナノ粒子のみが可視であることが観察される。ＤＮＡを用いて機能付与されたナノ粒子ＮＰの移動距離、およびＤＮＡを用いた機能付与の前に予備機能付与されたＮＰの移動距離は、ＰＢＳおよび細胞抽出物中において影響を受けないようである。対照的に、ヒト血清において、機能付与の前に予備機能付与されたＮＰについて移動距離はわずかに変化するが、ＤＮＡを用いて機能付与されたＮＰ（分子Ｍなし）についてはより有意に変化する。これはこれらのナノ粒子上での非特異的吸着の可能性を示唆する（ＮＰのサイズの増加による移動の減速によって明らかである）。図の左側部分では、蛍光の放射のみが観察され（ゲル中の黒色バンド）、ゲル中の相補的ＤＮＡの位置を示す。図２２におけるバンドの強度およびバンドの位置を比較すると、ＤＮＡの位置をゲル中のＮＰの位置と相関させることが可能であり、その結果、ハイブリダイゼーションの有効性を相関させることが可能である。ＰＢＳ中では予備機能付与されたナノ粒子と予備機能付与されていないナノ粒子との間のハイブリダイゼーションの有効性は影響を受けないようであるが、複合培地では明らかな差が観察される。実際、分子Ｍを含まない試料（すなわち、ＤＮＡのみ）については、遊離ＤＮＡに対応する蛍光が有意により強い（より少ない相補的ＤＮＡがＮＰに結合したＤＮＡにハイブリダイズしている）ので、ハイブリダイゼーションが影響を受けるようである。これらの結果は、予備機能付与された試料に対するハイブリダイゼーションの有効性が複合培地中の方が大きいことを示唆する。複合培地中において、ＤＮＡを用いて機能付与された（しかし、予備機能付与されていない）ＮＰ上のタンパク質の非特異的吸着が、相補的ＤＮＡとＮＰに結合したＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを妨げると仮定することが可能である。
【0129】
〔実施例１５〕様々な培地における標的の相補的なＤＮＡの検出の評価
上記標的の相補的な蛍光ＤＮＡ（Ｃｙ５）と、分子Ｍを用いて予備機能付与されたナノ粒子上に固定化されたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの有効性に従って、標的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の一本鎖の検出が可能になる。ＤＮＡがハイブリダイズしたら、ＮＰの遠心分離前および遠心分離後に２つのゲル電気泳動を行った。遠心分離はＮＰの表面における相補的な蛍光ＤＮＡの可視化の改善を達成するために、ＮＰを濃縮することを可能にする。
上記標的の相補的な蛍光ＤＮＡ（Ｃｙ５）と、分子Ｍを用いて予備機能付与されたナノ粒子上に固定化されたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの有効性に従って、標的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の一本鎖の検出が可能になる。ＤＮＡがハイブリダイズしたら、ＮＰの遠心分離前および遠心分離後に２つのゲル電気泳動を行った。遠心分離はＮＰの表面における相補的な蛍光ＤＮＡの可視化の改善を達成するために、ＮＰを濃縮することを可能にする。
【0130】
ハイブリダイゼーションプロトコルを次に示す。１ｎＭの相補的な蛍光ＤＮＡ５０ｐＭを２ｎＭのＮＰの懸濁液に添加した（ＮＰのサイズ＝２０ｎｍ、Ｍ（ｎ＝１１およびｍ＝４）、Ｗ＝１６％およびＺ＝１２．５％）。混合物を、ＰＢＳ中、または市販のヒト血清（希釈１００）（Thermofisher, Normal Human Serum, ref.31876）中のいずれかで、３７℃で２時間インキュベートする。
【0131】
ＮＰのゲル移動を行った（データは示さず）。「ナノ粒子の画像」部分はバイオコンジュゲートされたＮＰの位置を示し、「蛍光の画像」部分は、相補的な蛍光ＤＮＡの位置を示す。コントロールは遊離の相補的な蛍光ＤＮＡに相当する。異なる濃度を５０ｐＭ～１ｎＭにチャージ（charge）させた。
【0132】
蛍光がナノ粒子の位置に相関するため、これらの結果によってハイブリダイゼーションが起こったことを確認する。蛍光は、ＰＢＳまたはヒト血清中で、５０ｐＭまでの標的ＤＮＡの濃度範囲について観察される。複合培地の存在は、低濃度の標的ＤＮＡでさえ、ハイブリダイゼーションを妨げない。
【0133】
（結論）
ＤＮＡプローブのＮＰ上でのハイブリダイゼーションは、ＰＢＳまたはヒト血清中、１ｎＭで、５０ｐＭの相補的ＤＮＡを検出することを可能にする。
ＤＮＡプローブのＮＰ上でのハイブリダイゼーションは、ＰＢＳまたはヒト血清中、１ｎＭで、５０ｐＭの相補的ＤＮＡを検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0134】
【図1】ＮＰの機能付与のための技術的方法の概観。
【図2】界面活性剤の存在下または非存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図3】界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＲの吸光度スペクトル。
【図4】遠心分離後の、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図5】界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図6】界面活性剤の存在下での、ＰＢＳ中の、被覆率に応じた、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図7】分子Ｍで予備機能付与されたＮＳ、および分子Ｍで予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０、１、１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＬ－ＰＥＧ（Ｗ＝５％）で機能付与されたＮＰの吸光度スペクトル。
【図8】異なる被覆率の分子Ｍ（Ｗ＝０、１．６および１６％）を有するＰＢＳ中に分散されたＣＯＯＨ官能基を有するチオール化分子（Ｙ＝１．６％）で機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図9】異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。
【図10】異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散された、分子Ｍによって予備機能付与され、Ｌ－ＰＥＧ機能付与の存在に応じて機能付与されたＰＥＧ－ＣＯＯＨを有する（Ｗ＝５％、Ｙ＝５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。
【図11】分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与されたＤＮＡを有する（Ｗ＝０または１．６％；Ｚ＝１２．５％）、ＮＳの吸光度スペクトル。
【図12】分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｘ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図13】分子Ｍ（Ｗ＝１０％）によって予備機能付与され、異なるＬ－ＰＥＧ被覆率（Ｙ＝０または１０％）を有するＰＢＳ中に分散されたＤＮＡ（Ｚ＝２５％）によって機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図14】インキュベーション時間に応じた、ＰＢＳ＋０．００５％界面活性剤中の分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図15】３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡ（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）のＮＳの吸光度スペクトル。
【図16】３つの異なる実験に対応する、分子Ｍによって予備機能付与され、機能付与ＤＮＡを有する（Ｗ＝４％およびＺ＝５０％）、ＮＳの最初の洗浄の上清の吸光度スペクトル。
【図17】調製および４℃での保存の１日後、３か月後および１１か月後の、分子Ｍで予備機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図18】４℃での１日および２か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＳの吸光度スペクトル。
【図19】４℃での１日および３か月の保存後の、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３２％およびＺ＝２５％）の吸光度スペクトル。
【図20】１００倍に希釈した細胞抽出物（点線）中で１時間インキュベートした後、細胞抽出物（実線）を添加する前に、分子Ｍで予備機能付与され、チオール化ＤＮＡで機能付与されたＮＰ（Ｗ＝３０％、Ｚ＝１２．５％）のＵＶ－可視スペクトル。
【図21】１００倍に希釈した細胞抽出物の吸光度スペクトル、および遠心分離後の３つの上清の合計（点線）。
【図22】左側の画像：相補的な蛍光ＤＮＡの位置を特定するためのＣｙ５の蛍光の画像；右側の画像：ナノ粒子の位置を特定するためのゲルのコントラスト画像。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】