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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-12
(54)【発明の名称】網膜症を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/28 20060101AFI20220804BHJP
A61K 31/232 20060101ALI20220804BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20220804BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220804BHJP
A61K 38/30 20060101ALI20220804BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220804BHJP
A61K 47/40 20060101ALI20220804BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20220804BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20220804BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220804BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20220804BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220804BHJP
【ＦＩ】
A61K38/28
A61K31/232
A61K31/122
A61P43/00 121
A61K38/30
A61K9/107
A61K47/40
A61K9/19
A61K47/55
A61P27/02
A61P9/14
A61P29/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570441
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2022-01-25
(86)【国際出願番号】 IL2020050589
(87)【国際公開番号】W WO2020240558
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/853,179
(32)【優先日】2019-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521516639
【氏名又は名称】エルガン ファーマ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＬＧＡＮ ＰＨＡＲＭＡ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＮＧＴ３， １３ Ｗａｄｉ Ｅｌ－Ｈａｊ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｚａｒｅｔｈ， Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オルシャンスキー ミカル
(72)【発明者】
【氏名】オストロフスキー エレナ
(72)【発明者】
【氏名】ゼルディス スタヴ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA17
4C076AA30
4C076AA95
4C076CC10
4C076CC41
4C076DD25
4C076DD26
4C076DD37
4C076DD40
4C076DD46
4C076EE06
4C076EE39Q
4C076GG06
4C084AA02
4C084BA01
4C084DB34
4C084DB58
4C084MA22
4C084MA58
4C084NA13
4C084ZA33
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB28
4C206DA05
4C206MA03
4C206MA04
4C206NA13
4C206ZA33
(57)【要約】
インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物、並びに、該組成物の製造及び使用方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む、医薬組成物。
【請求項2】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
局所送達用に処方された担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
眼球への送達用に処方された担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記担体が、界面活性剤を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ナノ粒子に結合した前記インスリンを有する水中油型ナノ油滴エマルジョンとして処方される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記インスリンが、前記ナノ液滴とアミド結合している、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ナノ液滴が、前記ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び前記コエンザイムＱ１０を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記インスリンが、前記ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とアミド結合している、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記インスリンの濃度が、１ｍｌ当たり０．００１Ｕ～２０Ｕである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ＤＨＡの濃度が、１～３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記コエンザイムＱ１０の濃度が、１～３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記ＩＧＦの濃度が、１ｍｌ当たり０．００１Ｕ～２０Ｕである、請求項２の医薬組成物。
【請求項14】
早産児の網膜症を治療する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症を治療する工程を含む、
方法。
【請求項15】
早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる工程を含む、
方法。
【請求項16】
早産児の網膜出血を低減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜出血を低減する工程を含む、
方法。
【請求項17】
網膜症を経験している対象の網膜出血を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の網膜出血を低減する工程を含む、
方法。
【請求項18】
網膜症を経験している対象の網膜血管新生を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の眼の網膜血管新生を低減する工程を含む、
方法。
【請求項19】
早産児の網膜血管被覆を増加させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜血管被覆を増加させる工程（無血管網膜領域を減少させる工程）を含む、
方法。
【請求項20】
早産児の網膜炎症を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜炎症を軽減する工程を含む、
方法。
【請求項21】
早産児の網膜酸化ストレスを軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜酸化ストレスを軽減する工程を含む、
方法。
【請求項22】
早産児の網膜層の発達を改善する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それにより早産児の網膜層の発達を改善する工程を含む、
方法。
【請求項23】
早産児の視覚障害（発生率又は重症度）を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視覚障害を軽減する工程を含む、
方法。
【請求項24】
早産児の視野を増加させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視野を増加させる工程を含む、
方法。
【請求項25】
前記医薬組成物が、水性ナノエマルジョンである、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記投与が、前記医薬組成物の１つ以上の滴を角膜に適用することによって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記医薬組成物を、前記早産児の出生から６ヶ月齢までの期間内のいずれかの時期に適用する、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記投与が、前記医薬組成物の１回以上の硝子体内注射を介して行われる、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
以下の工程を含む、網膜症の局所治療のための医薬組成物を処方する方法：（ａ）油相中に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む水中油型ナノエマルジョンを生成する工程；
（ｂ）アミンカップリング反応を使用して、インスリン又はＩＧＦ－１を前記ナノエマルジョンのナノ液滴に結合させるか、又は、前記インスリンを遊離形態で提供する工程。
【請求項30】
（ｃ）前記インスリン又はＩＧＦ－１が結合したナノ液滴を精製する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
（ｃ）の工程に続いて、（ｄ）安定剤を添加する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項32】
前記安定剤が、シクロデキストリンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
（ｄ）の工程に続いて、凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、網膜症を治療するための組成物に関する。本発明の実施形態は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を治療するための、インスリン及び／又はＩＧＦを含むナノエマルジョンに関する。
【0002】
［関連出願の参照］
本出願は、２０１９年５月２８日に出願した米国仮特許出願第６２／８５３，１７９号の優先権を主張するものであり、当該仮出願の内容の全てが、本参照をもって本願に組み込まれるものとする。
本出願は、２０１９年５月２８日に出願した米国仮特許出願第６２／８５３，１７９号の優先権を主張するものであり、当該仮出願の内容の全てが、本参照をもって本願に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【0003】
出生は、妊娠３７週よりも前に発生した場合、未熟産、又は早産とみなされる。子宮内の最後の数週間は、健康的な体重増加と様々な重要な臓器の完全な発達にとって極めて重要である。
【0004】
ヒトの場合、網膜は、組織の酸素が少ない子宮内で発達する。血管前駆細胞は、１２～２１週の在胎期間に生じ、将来の血管発達のための足場を作り出す。網膜血管新生は、在胎期間約１６週で始まり、既存の血管から新しい血管が出芽する。発達中の網膜の代謝要求は、脈絡膜循環によって供給される酸素を上回り、血管新生を刺激する「生理学的低酸素症」をもたらす。
【0005】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、不完全な血管新生網膜の網膜血管の異常増殖を特徴とする発達血管障害である。ＲＯＰは、その大部分が１２５０ｇの超短在胎期間児（ＥＬＧＡＮ）、又は妊娠２８週未満の出生時に起こり、小児の視覚障害及び失明の最も一般的な原因である。
【0006】
レーザー光凝固術や血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体の硝子体内注射を含む現在の治療オプションは、重度の後期ＲＯＰにおいて有用であることが証明されている。しかし、レーザー光凝固術は、網膜の主要部分を破壊し、幼若乳児において実施するのは困難で複雑な手技である一方、ＶＥＧＦ抗体の硝子体内注射は、他の臓器に影響を及ぼす血管成長の全身抑制を引き起こす可能性がある。
【0007】
したがって、必要性があり、上記の制限を含まない網膜症治療手法を有することが非常に有利である。
【発明の概要】
【0008】
本発明の一態様によれば、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜症を治療する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症を治療する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜出血を低減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜出血を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、網膜症を経験している対象の網膜出血を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の網膜出血を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、網膜症を経験している対象の網膜血管新生を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の眼の網膜血管新生を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜血管被覆を増加させる方法であって、
早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜血管被覆を増加させる工程（無血管網膜領域を減少させる工程）を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜炎症を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜炎症を軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜酸化ストレスを軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜酸化ストレスを軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜層の発達を改善する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それにより早産児の網膜層の発達を改善する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の視覚障害（発生率又は重症度）を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視覚障害を軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の視野を増加させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視野を増加させる工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、以下の工程を含む、網膜症の局所治療のための医薬組成物を処方する方法が提供される：
（ａ）油相中に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む水中油型ナノエマルジョンを生成する工程；
（ｂ）アミンカップリング反応を使用して、インスリン又はＩＧＦ－１を上記ナノエマルジョンのナノ液滴に結合させる工程。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜症を治療する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症を治療する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜症の予防又は重症度を軽減させる工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜出血を低減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜出血を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、網膜症を経験している対象の網膜出血を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の網膜出血を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、網膜症を経験している対象の網膜血管新生を低減する方法であって、対象の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって対象の眼の網膜血管新生を低減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜血管被覆を増加させる方法であって、
早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜血管被覆を増加させる工程（無血管網膜領域を減少させる工程）を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜炎症を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜炎症を軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜酸化ストレスを軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の網膜酸化ストレスを軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の網膜層の発達を改善する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それにより早産児の網膜層の発達を改善する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の視覚障害（発生率又は重症度）を軽減する方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視覚障害を軽減する工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、早産児の視野を増加させる方法であって、早産児の眼に、インスリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む医薬組成物を投与し、それによって早産児の視野を増加させる工程を含む方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、以下の工程を含む、網膜症の局所治療のための医薬組成物を処方する方法が提供される：
（ａ）油相中に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む水中油型ナノエマルジョンを生成する工程；
（ｂ）アミンカップリング反応を使用して、インスリン又はＩＧＦ－１を上記ナノエマルジョンのナノ液滴に結合させる工程。
【0009】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の好ましい実施形態の詳細な説明を目的とするのみであり、本発明の原理及び概念的態様の最も有用であり、容易に理解される説明であると考えられるものを提供する目的で提示することを強調する。同様に、本発明の基本的な理解のために必要である以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされていない。また、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図7】図７Ａ～Ｄは、インスリン（図７A）、ＩＧＦ－１（図７Ｂ）、未治療（図７Ｃ）及び正常酸素（図７Ｄ）群についての、Ｐ１４のイソレクチン－Ｂ４染色を示す画像である。ＲＯＩ（緑）、血管被覆領域（青）、血管骨格（赤）及び分岐点（白）を示した。
【図8】図８は、全ての反応成分、例えば、反応物（ｒｈ－インスリン及びＤＨＡ）、中間体（ＤＨＡ－ＥＤＣ中間体）、及び得られた生成物（インスリン－ＤＨＡ結合体）との、特定の時点におけるカップリング反応のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、網膜症を治療するために使用することができる組成物そのものである。具体的には、本発明は、インスリン又はＩＧＦを含むナノエマルジョンの局所投与を介してＲＯＰを治療するために使用することができる。
【0013】
本発明の原理及び実施は、図面及び以下の説明を参照してより良く理解されよう。
【0014】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その用途が、以下の記載に示す、詳細に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、さまざまな手段で実施又は実行することが可能である。また、本明細書で使用する表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなすべきではないことも理解されたい。
【0015】
ＲＯＰの治療オプションは存在するが、このようなオプションは、投与の複雑性、副作用、及び眼組織に対する損傷の可能性によって制限される。
【0016】
本発明者は、ＲＯＰの効果的な治療は、出生後の毒性影響（例えば、酸素過剰）を防止し、これらの因子への全身曝露を最小限にしながら、生理学的血管系発達を促進し得る、欠損した子宮内因子（インスリン及びインスリン成長因子１）を提供するべきであると仮定した。
【0017】
本発明を実施に還元する一方で、本発明者は、生理学的眼血管系の発達を促進し、眼内毒性を低減することができ、それによって網膜症などの網膜障害の治療を可能にする組成物を処方した。以下の実施例の項にさらに記載されるように、本発明の組成物は、健康な血管の成長を刺激し、ラットにおける酸素誘導モデルによって引き起こされる網膜出血及び病的血管成長（血管新生）を防止し、低減するのに効果的であった。
【0018】
「生理学的血管発達を促進する」という表現は、視神経から眼の周辺部への酸素の流れ又は通過を増加させることを意味する。
【0019】
「網膜症」という言葉は、視覚障害を引き起こす可能性のある網膜のあらゆる障害を意味する。これは、例えば、生理学的血管系の成長を遅らせるか、又は停止させる病態（例えば、ＲＯＰの第Ｉ相等の血管閉塞又は収縮期）、及び、組織低酸素症及び虚血に応答して形成される異常な（異常である）病的血管を含むことができる。網膜症は、放射線照射又は頭部外傷等の外部因子、或いは、糖尿病又は高血圧等の全身性疾患の症状発現に起因しうる。網膜症は、血管の炎症や薬（エキセナチド、リラグルチド、プラムリンタイド等の糖尿病治療薬）によっても引き起こされうる。
【0020】
したがって、本発明の一態様によれば、治療有効量のインスリン及び／又はＩＧＦ－１、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含む組成物が提供される。
【0021】
本明細書にさらに記載されるように、インスリン及び／又はＩＧＦ－１は、生理学的血管発達を促進し、一方、ＤＨＡは、炎症反応を減少させ、コエンザイムＱ１０は、酸化ストレスシグナル伝達を減少させる。
【0022】
用語「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、有効成分又は有効成分が示される治療効果を提供する有効成分を含む組成物の用量を意味する。
【0023】
本願の医薬組成物中の各々の有効成分の用量は、治療される対象、網膜症の段階（例えば、ＲＯＰ）及び投与経路（局所又は眼内）を含む多くの因子に依存し得る。
【0024】
ＲＯＰの場合、進行は、体細胞効果（例えば、血管密度及び被覆率）、血管形成の程度及び／又は進行、或いは網膜層発達の質を介して決定され得る。
【0025】
組成物は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含み、（例えば、アミド結合を介して）インスリン及び／又はＩＧＦに結合されるナノ液滴を有する油中水ナノエマルジョンとして処方され得る。図１は、インスリン又はＩＧＦ １２に結合し、ＤＨＡ １２及びコエンザイムＱ１０ １４を含むナノ液滴を示す本組成物の概略図である。
【0026】
以下の実施例セクションは、本組成物を処方するための１つのアプローチを記載する。
【0027】
本組成物は、凍結乾燥状態で保存することができ、例えば、使用のために水又は生理食塩水で再構成されるか、又はすぐに使用できる医薬組成物として保存されうる。
【0028】
本組成物は、局所又は眼球内への送達用に処方される担体を含む医薬組成物の一部であり得る。
【0029】
本医薬組成物の局所製剤は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、ヒマシ油等の長鎖トリグリセリド油、鉱油等の合成油及び半合成油、並びにオレイン酸等の不飽和脂肪酸等の担体を含むことができる。
【0030】
本医薬組成物の眼内製剤は、マイクロエマルジョンとして処方することができ、及び／又はリポソーム、ナノスフェア、ミセル及びナノカプセル等の担体を含むことができる。
【0031】
眼内製剤は、キレート剤、界面活性剤、及びシクロデキストリン等の有効成分と包接複合体を形成する賦形剤を使用して、有効成分の徐放又は遅延放出のために処方することができる。
【0032】
医薬組成物は、以下を含むことができる。
（ｉ）炭水化物（安定剤、潤滑剤、凍結防止剤として）：当該炭水化物としては、単糖類（グルコース、マルトース等）、二糖類（トレハロース等）、オリゴ糖（デキストリン等）、シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）等）、多糖類（デキストラン等）等が含まれるが、これらに限定されない。
（ｉｉ）乳化剤：当該乳化剤としては、天然起源の非イオン性界面活性剤（例えば、レシチン、卵黄リン脂質）、合成起源の非イオン性界面活性剤（例えば、チロキサポール）、及びイオン性界面活性剤（例えば、セタクロニウムクロリド）が含まれるが、これらに限定されない。
（ｉｉｉ）増粘剤：増粘剤としては、親水性ポリマー（例えばポリビニルアルコール）又はセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｖ）ポリアミノ酸（例えば、ゼラチン、ヒトアルブミン）等の生物接着剤、及びセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及びヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒアルロン酸等の多糖。
（ｖ）アルギン酸塩及びポリアクリル酸塩等のゲル化剤を医薬組成物に添加して、角膜上の有効成分の滞留時間を増大させることができる。
（ｉ）炭水化物（安定剤、潤滑剤、凍結防止剤として）：当該炭水化物としては、単糖類（グルコース、マルトース等）、二糖類（トレハロース等）、オリゴ糖（デキストリン等）、シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）等）、多糖類（デキストラン等）等が含まれるが、これらに限定されない。
（ｉｉ）乳化剤：当該乳化剤としては、天然起源の非イオン性界面活性剤（例えば、レシチン、卵黄リン脂質）、合成起源の非イオン性界面活性剤（例えば、チロキサポール）、及びイオン性界面活性剤（例えば、セタクロニウムクロリド）が含まれるが、これらに限定されない。
（ｉｉｉ）増粘剤：増粘剤としては、親水性ポリマー（例えばポリビニルアルコール）又はセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｖ）ポリアミノ酸（例えば、ゼラチン、ヒトアルブミン）等の生物接着剤、及びセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及びヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒアルロン酸等の多糖。
（ｖ）アルギン酸塩及びポリアクリル酸塩等のゲル化剤を医薬組成物に添加して、角膜上の有効成分の滞留時間を増大させることができる。
【0033】
本発明の実施形態によれば、医薬組成物中のインスリンの濃度は、０．００１Ｕ～２０Ｕ／ｍｌであり得る。一方、ＩＧＦの濃度は、０．００１Ｕ～２０Ｕ／ｍｌであり得る。
【0034】
本発明の実施形態によれば、医薬組成物中のＤＨＡの濃度は、１～４ｍｇ／ｍｌであり得る。
【0035】
本発明の実施形態によれば、医薬組成物中のコエンザイムＱ１０の濃度は、１～３ｍｇ／ｍｌであり得る。
【0036】
以下の表１は、本組成物の局所製剤を記載する。
【表1】
【0037】
本製剤は、ＭＣＴを含まないように改変することができ、遊離酸として、及びエチルエステルとして、の２つの形態のＤＨＡを含む。これらの２つの形態のＤＨＡは、液滴コア中のＭＣＴに取って代わる。２つの別々のエマルジョンが製造され、最後の製造工程で組み合わされる。第１のエマルジョンは、インスリンが結合されるＤＨＡ遊離酸を含む液滴を含有する。第２のエマルジョンは、Ｑ１０がＤＨＡエチルエステルコアに組み込まれている液滴を含有する。以下の表２は、注射可能な形態の本製剤の本実施形態の成分を列挙する。
【表2】
【0038】
本組成物の眼内製剤を、以下の表３に記載する。
【表3】
【0039】
本組成物の有効性を高めるために、（ＤＨＡ）とコエンザイムＱ１０を封入し、インスリン又はＩＧＦに結合したナノ液滴を有するナノエマルジョンを製造するための手法を開発した。
【0040】
したがって、本発明の別の態様によれば、網膜症の局所治療のための医薬組成物を処方する方法が提供される。医薬組成物は、油相中に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びコエンザイムＱ１０を含む水中油型ナノエマルジョンを生成し、アミンカップリング反応を用いて、インスリン又はＩＧＦ－１をナノエマルジョンのナノ液滴に結合させることによって製造される。
【0041】
ナノエマルジョン生成に続いて、ナノ液滴は、カラムクロマトグラフィー、タンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）、透析を使用して精製又は濃縮することができるが、これらに限定されない。シクロデキストリン、デキストリン、モノ又は二糖等の安定剤を添加することができるが、これらに限定されない。
【0042】
次いで、製剤は、保存のために凍結乾燥され、使用前に生理食塩水又は水により再構成することができる。
【0043】
以下の実施例のセクションは、本製剤化アプローチのより詳細な説明を提供する。
【0044】
上記で述べたように、本組成物は、網膜症、特に未熟児の網膜症を治療するために使用することができる。
【0045】
したがって、本発明の別の態様によれば、早産児等の必要とする対象における網膜症を治療する方法が提供される。本方法は、本発明の医薬組成物を必要とする対象の眼に投与することによって行われる。このような投与は、局所的又は眼内であり得る。
【0046】
本明細書で使用される「それを必要とする対象」という語句は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物を指す。ヒト又はヒト以外の哺乳動物（ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ）は、任意の年齢（例えば、満期産児や早産児等の乳児、成人、又は高齢者等）、又は性別であってもよい。対象としてのヒトは、在胎週数２４～３３週で生まれた早産児であり得る。また、対象としてのヒトは、出生時の体重が５００～１６５０ｇｍの低出生体重児であり得る。
【0047】
本組成物の局所製剤（点眼剤）は、出生から６ヶ月齢までの間のいつでも、１０マイクロリットルから１００マイクロリットルの用量で、１８０日の期間にわたって１日１回又は数回、早産児に投与することができる。本組成物の眼内製剤は、臨床的に必要とされる１回の注射当たり５～３０マイクロリットルの用量で、１８０日の期間にわたって数週間に１回、出生から６ヶ月齢の間のいつでも早産児に投与することができる。
【0048】
本明細書で使用する「約」は、±１０％を指す。
【0049】
本発明の更なる目的、利点、及び新規の特徴は、限定することを意図していない以下の実施例を検討すれば、当業者には明らかになるであろう。
【実施例】
【0050】
次に、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で説明する。
【0051】
実施例１
ナノエマルジョン製剤
以下の実施例は、水中油型ナノエマルジョンとして再構成するのに適した凍結乾燥粉末として処方された本組成物の製造を実証する。
ナノエマルジョン製剤
以下の実施例は、水中油型ナノエマルジョンとして再構成するのに適した凍結乾燥粉末として処方された本組成物の製造を実証する。
【0052】
以下の表４は、組成物製剤の製造プロセスで使用される成分を列挙する。
【表4】
【0053】
ナノ液滴の配合は、溶剤置換法を用いて達成した。１００ｍｇのＤＨＡ、５０ｍｇのＣｏＱ１０、２５ｍｇのチロキサポール及び５０ｍｇのＭＣＴを９ｍｌのアセトンに溶解し、２５ｍｇのＬｉｐｏｉｄ Ｅ８０を１ｍｌのエタノールに溶解した。得られた溶液を合わせ、９００ｒｐｍで３０分間室温で混合し、０．１％ｗ／ｖのＰＶＡ水溶液２０ｍｌに滴下添加し、９００ｒｐｍでさらに１５分間連続的に撹拌した。その後、実験室ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下（５０ｍＢａｒ）、室温で有機溶媒を完全に除去し、得られたエマルジョンを、０．５ＭのＮａＯＨでｐＨ７．４に予備調整した後、アミンカップリング反応に供した。
【0054】
０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中で調製した１．３μｍｏｌのＥＤＣを、得られたエマルジョンに加え、混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで、炭酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨを８．３±０．２に調整した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．２）中の０．１μｍｏｌ／ｍＬのｒｈ－インスリン溶液０．５ｍｌを、エマルジョン１９．５ｍｌに加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌するように設定した。次いで、より小さいサイズの粒子（例えば、ＥＤＣ、遊離活性物質分子）からナノ液滴を分離するために、水を溶離剤として使用して、重力流ＰＤ－１０ゲル濾過カラム（Sephadex Ｇ－２５）に反応混合物をロード（loaded onto）した。過剰の溶離液（水）を、実験室ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下（５０ｍＢａｒ）及び３７℃でナノ液滴画分から除去した。次に、エマルジョンを２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンと混合して、最終濃度２％ｗ／ｖとし、０．４５μｍのＰＥＳ（ポリセタールスルホン）膜で濾過し、バイアルに分注した後、凍結乾燥した。再構成された溶液１ｍｌ中の有効成分は、０．６７Ｕのｒｈ－インスリン、２ｍｇのＤＨＡ及び１ｍｇのＣｏＱ１０であった。
【0055】
実施例２
試験１
実施例１に記載の組成物の眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０で構成されたＥＬＧＮ０１）を、ラットの酸素誘発性網膜症モデルで試験した。
試験１
実施例１に記載の組成物の眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０で構成されたＥＬＧＮ０１）を、ラットの酸素誘発性網膜症モデルで試験した。
【0056】
＜手順＞
単一の母ラットの孕んだ１８匹の子を２つの群：Ａ群－ＥＬＧＮ０１（９匹）、Ｂ群－未治療（９匹、治療なしの酸素チャンバー）に分けた。正常酸素状態におかれた単一の母ラットの孕んでいる３匹の子を追加対照として用いた。
単一の母ラットの孕んだ１８匹の子を２つの群：Ａ群－ＥＬＧＮ０１（９匹）、Ｂ群－未治療（９匹、治療なしの酸素チャンバー）に分けた。正常酸素状態におかれた単一の母ラットの孕んでいる３匹の子を追加対照として用いた。
【0057】
治療は、５～１４日目又は１８日目（屠殺日に従う）に開始され、最初に注射器（局所、眼表面を損傷しない）を用いて瞼の下に投与され、次いで、開眼後に点眼された。
【0058】
酸素投与レジメンは、以下の通りであった：生後０～１４日、高酸素（５０％）で２４時間のサイクルと、その後２４時間の低酸素（１２％）。
【0059】
１群の試験は生後１４日目（Ｐ１４）に、２群は生後１８日目（Ｐ１８）に終了し、１７日目に眼科医による眼底検査による評価を実施し、その後サンプルを組織学的及び免疫組織学的に評価した。
【0060】
＜結果＞
Ｉｎ－ｖｉｖｏ眼底検査の結果
治療群では、計１２の網膜出血箇所が観察されたのに対し、未治療群では２２箇所であった（治療ＥＬＧＮ０１の有意性ｐ＝０．０４）。
Ｉｎ－ｖｉｖｏ眼底検査の結果
治療群では、計１２の網膜出血箇所が観察されたのに対し、未治療群では２２箇所であった（治療ＥＬＧＮ０１の有意性ｐ＝０．０４）。
【表5】
【0061】
治療群及び未治療群における網膜損傷箇所の総数と重度出血箇所の総数を、図２Ａ～Ｂのグラフに示す。
【0062】
図３Ａ～Ｃは、正常酸素状態、低酸素状態（治療及び未治療）の網膜の画像である。正常酸素状態の動物は、網膜に無傷の血管が示され、出血や焼灼（ablation）はない。未治療の低酸素状態の動物は、網膜出血を呈する（矢印）。治療された動物は、損傷が減少している。
【0063】
新生血管領域
血管新生への影響を図４Ａ～Ｂに示す。血管新生（ＮＶ）はＰ１８で高く、ヒトの疾患のフェーズＩＩの終わりに相当していた。Ｐ１４は、疾患のフェーズＩの終了（進行期）に相当していた。いずれの時点においても、治療群のＮＶは、未治療群よりも有意に少なかった。Ｐ１４では、ＥＬＧＮ０１投与群は０％の血管新生を示したのに対し、非投与群では０．０９％であった（Ｔ検定比較ｐ＝０．０７）。Ｐ１８では、ＥＬＧＮ０１投与群は、非投与群と比較して平均で４０％少ない血管新生を示した（治療ＥＬＧＮ０１ １．３５％、未治療１．８９％、Ｔ検定比較ｐ＝０．０７、治療効果２８％）。
血管新生への影響を図４Ａ～Ｂに示す。血管新生（ＮＶ）はＰ１８で高く、ヒトの疾患のフェーズＩＩの終わりに相当していた。Ｐ１４は、疾患のフェーズＩの終了（進行期）に相当していた。いずれの時点においても、治療群のＮＶは、未治療群よりも有意に少なかった。Ｐ１４では、ＥＬＧＮ０１投与群は０％の血管新生を示したのに対し、非投与群では０．０９％であった（Ｔ検定比較ｐ＝０．０７）。Ｐ１８では、ＥＬＧＮ０１投与群は、非投与群と比較して平均で４０％少ない血管新生を示した（治療ＥＬＧＮ０１ １．３５％、未治療１．８９％、Ｔ検定比較ｐ＝０．０７、治療効果２８％）。
【0064】
網膜層
パラフィン包埋した全眼を切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。異なる場所からの４つの切片を１枚のスライド上に収集した。Ｈ＆Ｅ染色は、１０倍対物レンズ（いくつかの位置で４倍）を用いて光学顕微鏡で画像化した。
パラフィン包埋した全眼を切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。異なる場所からの４つの切片を１枚のスライド上に収集した。Ｈ＆Ｅ染色は、１０倍対物レンズ（いくつかの位置で４倍）を用いて光学顕微鏡で画像化した。
【0065】
未治療ＯＩＲ群からの代表的な染色は、ＯＩＲ損傷の結果としての網膜層の崩壊、神経節細胞層の厚膜化を示す。群ごとに合計８サンプル、即ち、各眼ごとに４つの切片、各投与群ごとに（異なる動物から）２眼、が入手可能であった。
【0066】
網膜層の完全性を評価するために、脱同定されたＨ＆Ｅ染色画像をWimasis Software Imageにアップロードした。各網膜をマスクした状態で分析し、各網膜層（ＲＧＣＬ－網膜神経節細胞層、ＩＰＬ－内網状層、ＩＮＬ－内核層、ＯＰＬ－外網状層、ＯＮＬ－外核層、ＲＰＥ－網膜色素上皮、ＣＨＯ－脈絡膜）を同定し、そのサイズを測定した。図１１Ａは、網膜層の平均厚さを示す。
【表6】
【0067】
実施例３
試験２
実施例１に記載された組成物に基づく眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０で構成されたＥＬＧＮ０１、並びにＩＧＦ－０１及び同じもので構成されたＥＬＧＮ０２）を、ラットの酸素誘導網膜症モデルで試験した。
試験２
実施例１に記載された組成物に基づく眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０で構成されたＥＬＧＮ０１、並びにＩＧＦ－０１及び同じもので構成されたＥＬＧＮ０２）を、ラットの酸素誘導網膜症モデルで試験した。
【0068】
＜手順＞
２匹の母ラットそれぞれが孕んだ１８匹の子を、３つの治療群：Ａ群 ＥＬＧＮ０１（１２匹）Ｂ群 ＥＬＧＮ０２（１２匹）、Ｃ群 未治療（１２匹）に分けた。正常酸素状態のＤ群を対照として分析した。
２匹の母ラットそれぞれが孕んだ１８匹の子を、３つの治療群：Ａ群 ＥＬＧＮ０１（１２匹）Ｂ群 ＥＬＧＮ０２（１２匹）、Ｃ群 未治療（１２匹）に分けた。正常酸素状態のＤ群を対照として分析した。
【0069】
治療は、５日目に開始され、１４日目又は１８日目（屠殺日に準じて）まで治療され、最初に注射器（眼表面を損傷しない局所）で瞼の下に投与され、その後、開眼後に点眼剤を投与された。
【0070】
酸素レジメンは、最初の４日間に次の８回の間欠的低酸素イベントを実施した：３０分にわたり１２％まで減少させるイベントを３回と、残りの時間は５０％の高酸素とした。生後５～１４日は、高酸素（５０％）で２４時間のサイクルと、その後、２４時間の低酸素（１２％）。
【0071】
１群の試験は１４日目に終了し、１７日目に眼科医による眼底検査による評価を実施し、その後、試料を組織学的及び免疫組織学的に評価した。
【0072】
＜結果＞
イソレクチン染色
サンプルを平らにマウントし、網膜をイソレクチンＧＳ－ＩＢ４で染色した。無血管領域（ＡＶＡ）は、イソレクチン染色網膜の画像を使用して独立した専門家によって手動で定量化された。
イソレクチン染色
サンプルを平らにマウントし、網膜をイソレクチンＧＳ－ＩＢ４で染色した。無血管領域（ＡＶＡ）は、イソレクチン染色網膜の画像を使用して独立した専門家によって手動で定量化された。
【0073】
図５Ａ～Ｄは、インスリン及びＩＧＦ治療群、未治療群及び正常酸素群の染色を示す。インスリン投与群及びＩＧＦ－１投与群（図５Ａ～Ｂ）では、完全な中心血管を伴う最小限の無血管領域が観察される。未治療群（図５Ｃ）では、大きな無血管領域が観察される（矢印）。正常酸素群（図５Ｄ）では、血管の完全な被覆が観察される。
【0074】
図６Ａ～Ｂは、ＡＶＡを表すグラフである。Ｐ１４では、両治療群とも、対照群と比較して、ＡＶＡが５０％低下した（治療ＥＬＧＮ０１：２．７７％、治療ＥＬＧＮ０２：３．１５％、無血管領域：６．１３％）。正常酸素群の無血管領域は、１．４％を示した。Ｔ検定（Ｔ－Ｔｅｓｔ）を用いて、治療群と未治療動物を比較する場合は、ＥＬＧＮ０１治療群対未治療群は、ＥＬＧＮ０２治療群対未治療群（ｐ＝０．０３）と同様に、統計的に有意差（ｐ＝０．０１）を有していた。
【0075】
各網膜の、血管密度（％、血管の画素の数を、対象領域の総画素数で割ることによって計算される）、総血管面積、分岐点の数（２つ以上のセグメントが収束する）、セグメントの数（個々の血管セグメントの数）及び平均セグメント長を、マスクして分析した。
【0076】
Ｐ１４では、両治療群は、多数の特性において未治療動物よりも優れていた。治療ＥＬＧＮ０１は、未治療群と比較して有意に高い血管密度（％）を有し（ｐ＝０．０５１）、同様に治療ＥＬＧＮ０２群（ｐ＝０．０３２）は、網膜の血管のより良い成長と発達、並びにより少ない無血管領域を示した。また、治療群；ＥＬＧＮ０１（ｐ＝０．０７３）及び治療ＥＬＧＮ０２群（ｐ＝０．０１４）は、未治療群と比較して、より大きな血管領域を示した。さらに、治療Ａ－ＥＬＧＮ０１は、未治療の動物と比較して、有意に高い平均セグメント長（ｐ＝０．０３７）を有し、血管のより良好な連続性を示した。
【表7】
【0077】
図７Ａ～Ｄは、治療群当たりのＰ１４のイソレクチン－Ｂ４染色の画像である。ＲＯＩ（緑）、被覆領域の血管（青）、血管骨格（赤）及び分岐点（白）が示されている。
【0078】
以下の表８に概説されるように、Ｐ１８では、治療ＥＬＧＮ０１群は、未治療群と比較して有意に高い血管密度（％）を有した（ｐ＝０．００７）。治療ＥＬＧＮ０２群は、有意ではない傾向を示した。血管密度（％）は、血管新生していない領域と比較して、血管新生している網膜の量を反映する。血管新生を伴わない血管密度が高い場合は、網膜の血管の増殖と発達が良好であるほか、無血管領域が少ないことを示している。また、治療群は、未治療群と比較して血管面積が大きい傾向を示した。治療ＥＬＧＮ０１群は、未治療群と比較して、より高い分岐点数を示した（ｐ＝０．０２）。さらに、治療ＥＬＧＮ０１群は、未治療群と比較して血管量が多かった（ｐ＝０．０４）。
【表8】
【0079】
バイオマーカー活性
Ｐ１４及びＰ１８では、眼を採取し、ホモジナイズし、遠心分離して、異なる研究群の組織中の異なるバイオマーカーのレベルを比較した。試料は、各群４匹の異なるラットを含み、各３試料について試験した。含有量は、各試料の総蛋白質濃度に対して正規化した。分析したバイオマーカーは、一般的に研究され、酸化ストレス及び脂質過酸化の間にin vivoで豊富に生成される、酸化ストレスの信頼性の高い、実証済みのバイオマーカーである、８－イソプロスタン又は８－ｉｓｏＰＧＦ２αである（Ｂｅｈａｒｒｙ ２０１７）。さらに、炎症プロセスのバイオマーカーであるＰＧＥ２も測定された（図１１Ｂ）。このＰＧＥ２は、内皮細胞に対して二重の反対の効果を有する。それは、血管収縮と血管拡張の両方を（異なる受容体を介して）媒介する。ＰＧＥ２は、サイトカインと成長因子によって活性化されるＣＯＸ－２アイソフォームの主要代謝物であり、血管新生に深く関与する（Ｂｅｈａｒｒｙ ２０１７）。
Ｐ１４及びＰ１８では、眼を採取し、ホモジナイズし、遠心分離して、異なる研究群の組織中の異なるバイオマーカーのレベルを比較した。試料は、各群４匹の異なるラットを含み、各３試料について試験した。含有量は、各試料の総蛋白質濃度に対して正規化した。分析したバイオマーカーは、一般的に研究され、酸化ストレス及び脂質過酸化の間にin vivoで豊富に生成される、酸化ストレスの信頼性の高い、実証済みのバイオマーカーである、８－イソプロスタン又は８－ｉｓｏＰＧＦ２αである（Ｂｅｈａｒｒｙ ２０１７）。さらに、炎症プロセスのバイオマーカーであるＰＧＥ２も測定された（図１１Ｂ）。このＰＧＥ２は、内皮細胞に対して二重の反対の効果を有する。それは、血管収縮と血管拡張の両方を（異なる受容体を介して）媒介する。ＰＧＥ２は、サイトカインと成長因子によって活性化されるＣＯＸ－２アイソフォームの主要代謝物であり、血管新生に深く関与する（Ｂｅｈａｒｒｙ ２０１７）。
【0080】
結果は、Ｐ１４及びＰ１８では、未治療群と比較して８－ｉｓｏＰＧＦ２αレベルの減少を示し、動物モデルによって作り出された酸化ストレス損傷に対する予防効果を示した（図１１Ｃ）。その効果は、病気の第１ステージと第２ステージ（Ｐ１４とＰ１８）の両方で見られる。Ｐ１４では、ＰＧＥ２のレベルは、正常酸素状態と比較して全ての群でより高く、Ｐ１８では、ＰＧＥ２のレベルは、治療群は減少を示し、未治療群は病理学の炎症段階と関係した有意な増加を示す（図１１Ｂ）。
【0081】
実施例４
試験３
眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０を含むＥＬＧＮ０１（実施例１に記載））を新生児ラットに投与し、投与後の眼中のインスリン濃度を測定した。
試験３
眼科用製剤（インスリン、ＤＨＡ及びＣｏｑ１０を含むＥＬＧＮ０１（実施例１に記載））を新生児ラットに投与し、投与後の眼中のインスリン濃度を測定した。
【0082】
＜手順＞
２匹の母ラットそれぞれが孕んだ１８匹の子２つの群に分けた：Ａ群－ＥＬＧＮ０１ 正常酸素群（１８匹）、Ｂ群－ＥＬＧＮ０１ 低酸素群（１８匹）。正常酸素状態におかれた単一の母ラットの孕んでいる２匹の子を対照として用いた。
２匹の母ラットそれぞれが孕んだ１８匹の子２つの群に分けた：Ａ群－ＥＬＧＮ０１ 正常酸素群（１８匹）、Ｂ群－ＥＬＧＮ０１ 低酸素群（１８匹）。正常酸素状態におかれた単一の母ラットの孕んでいる２匹の子を対照として用いた。
【0083】
治療は、５日目に開始され、４日間、注射器（局所）を用いて、瞼の下に組成物（０．００６７インスリン単位を含有する１０μＬの用量）を投与することによって行われた。投与後３０分、６０分、１２０分にラットを屠殺し（ＴあたりＮ＝３）、全眼をホモジナイズし、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ）で評価した。
【0084】
＜結果＞
投与したインスリンの８～１６％が、最初の２時間以内に眼組織に吸収されたことが、以下の表９に示されている。
投与したインスリンの８～１６％が、最初の２時間以内に眼組織に吸収されたことが、以下の表９に示されている。
【表9】
【0085】
実施例５
ナノエマルジョン製剤
以下の実施例は、本発明の組成物を製造するための代替アプローチを実証する。
ナノエマルジョン製剤
以下の実施例は、本発明の組成物を製造するための代替アプローチを実証する。
【0086】
本発明は、処方プロセスの過程で直接的に油性ナノ液滴へのインスリンのワンポット結合を開示する。架橋試薬Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて、水媒体中でインスリンとＤＨＡカルボキシル基の一段階カップリングにより、その結合を行った。
【0087】
インスリン－ＤＨＡ結合体を作製するための方法は、以下の一般的プロセスを利用する：
・溶剤置換法によるナノ液滴の生成；
・活性なＯ－アシリソ尿素ＤＨＡ－ＥＤＣエステルの形成による、ＥＤＣによるＤＨＡカルボキシル基の活性化；
・可溶性Ｎ－非置換尿素としてのＥＤＣ副生成物の放出を伴う、インスリンの第一級アミン基とのアミド結合の生成による、インスリンのＤＨＡカルボキシル基への結合；
・３０，０００～１００，０００ ＭＷＣＯ膜による限外濾過を用いた、ＥＤＣ副生成物からの反応混合物の精製
・溶剤置換法によるナノ液滴の生成；
・活性なＯ－アシリソ尿素ＤＨＡ－ＥＤＣエステルの形成による、ＥＤＣによるＤＨＡカルボキシル基の活性化；
・可溶性Ｎ－非置換尿素としてのＥＤＣ副生成物の放出を伴う、インスリンの第一級アミン基とのアミド結合の生成による、インスリンのＤＨＡカルボキシル基への結合；
・３０，０００～１００，０００ ＭＷＣＯ膜による限外濾過を用いた、ＥＤＣ副生成物からの反応混合物の精製
【0088】
＜材料及び方法＞
有機相の調製：
３４７ｍｇのＤＨＡ遊離酸、７５ｍｇのチロキサポール及び７５ｍｇのリポイドＥ８０を２５ｍｌのエタノールに溶解した。これを、二重脱イオン水１００ｍｌに２１Ｇ針で滴下し、常温、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４０±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
有機相の調製：
３４７ｍｇのＤＨＡ遊離酸、７５ｍｇのチロキサポール及び７５ｍｇのリポイドＥ８０を２５ｍｌのエタノールに溶解した。これを、二重脱イオン水１００ｍｌに２１Ｇ針で滴下し、常温、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４０±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
【0089】
得られたエマルジョンを０．１ＮのＨＣｌでｐＨ４．５に予め調整した後、アミンカップリング反応に供した。
１ｍｌの水に溶解した０．２７ｍｍｏｌのＥＤＣを得られたエマルジョンに添加し、この混合物を、ＤＨＡ－ＥＤＣ中間体エステルの形成が完了するまで、室温で４０分間インキュベートした。
１ｍｌの水に溶解した０．２７ｍｍｏｌのＥＤＣを得られたエマルジョンに添加し、この混合物を、ＤＨＡ－ＥＤＣ中間体エステルの形成が完了するまで、室温で４０分間インキュベートした。
【0090】
反応混合物のｐＨを６．２に調整し、５０ｍｌの水（ｐＨ ７．２）に溶解した０．０４５ｍｍｏｌのインスリンを添加した。反応は、１時間の間に完了し、カップリングの間、ｐＨは６．３～６．４に維持された。反応をＨＰＬＣ（Dionex Ultimate ３０００）によってモニターし、方法条件及び３０分の時点での反応混合物のクロマトグラムを、図８に示した。
【0091】
反応完了時に、混合物を二重脱イオン水で１：２に希釈し、蠕動ポンプを使用して１００，０００ ＭＷＣＯ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して移した。
【0092】
得られた保持液１５０ｍｌ中のインスリン結合体の含有量は０．０３７ミリモルであり、インスリン含有量に対して計算して収率は８２％であった。エマルジョンのモル浸透圧濃度は、３０１ｍｏｓｍ／ｋｇであった。
【0093】
【0094】
水中油型ナノエマルジョンに再構成するのに適した凍結乾燥粉末として処方された別の組成物を製造した。以下の表１１に、製造工程で使用した成分を列挙する。
【表11】
【0095】
処方プロセスは、２つの別々のエマルジョンの調製を含む：第１のエマルジョンは、コエンザイムＱ１０をＤＨＡナノ液滴に取り込んでおり、第２のエマルジョンは、ＤＨＡナノ液滴に結合したインスリンを含む。エマルジョンは、置換法により別々に調製し、精製工程の前に組み合わせた。
【0096】
＜エマルジョン１＞
３００ｍｇのコエンザイムＱ１０、５２５ｍｇのＤＨＡエチルエステル、１２５ｍｇのチロキサポール及び１２５ｍｇのリポイドＥ８０を、１５ｍｌのアセトンと５０ｍｌのエタノールの混合物に溶解した。この混合物を、２５０ｍｌの０．１％ＰＶＡ水溶液に、２１Ｇニードルで滴下し、常温、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４５±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて、減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
３００ｍｇのコエンザイムＱ１０、５２５ｍｇのＤＨＡエチルエステル、１２５ｍｇのチロキサポール及び１２５ｍｇのリポイドＥ８０を、１５ｍｌのアセトンと５０ｍｌのエタノールの混合物に溶解した。この混合物を、２５０ｍｌの０．１％ＰＶＡ水溶液に、２１Ｇニードルで滴下し、常温、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４５±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて、減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
【0097】
＜エマルジョン２＞
１２５ｍｇのＤＨＡ遊離酸、２５ｍｇのチロキサポールおよび２５ｍｇのリポイドＥ８０を１２ｍｌのエタノールに溶解した。この混合物を、二重脱イオン水５０ｍｌに２１Ｇ針を通して滴下し、常温で３５０ｒｐｍで連続的に混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４０±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
１２５ｍｇのＤＨＡ遊離酸、２５ｍｇのチロキサポールおよび２５ｍｇのリポイドＥ８０を１２ｍｌのエタノールに溶解した。この混合物を、二重脱イオン水５０ｍｌに２１Ｇ針を通して滴下し、常温で３５０ｒｐｍで連続的に混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４０±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
【0098】
得られたエマルジョンを０．１ＮのＨＣｌでｐＨ４．５に予め調整した後、アミンカップリング反応を行った。
【0099】
１ｍｌの水に溶解した０．１１ｍｍｏｌのＥＤＣを得られたエマルジョンに添加し、混合物を、ＤＨＡ－ＥＤＣ中間体エステルの形成が完了するまで室温で１．２５時間インキュベートした。反応混合物のｐＨを６．２に調整し、１８ｍｌの水に溶解した０．０１５ｍｍｏｌのインスリン溶液（ｐＨ４．２）を添加した。反応は１時間の間に完了し、ｐＨ６．２～６．４はカップリングの間維持された。反応をＨＰＬＣ（Dionex Ultimate ３０００）によってモニターし、方法条件及び反応混合物の典型的なクロマトグラムを、図８に提供した。
【0100】
反応完了後、混合物は、エマルジョン＃１と結合し、その後、０．１％のＰＶＡ水溶液（モル浸透圧濃度＜５ｍｏｓｍ／ｋｇ）で１：２を希釈し、周縁ポンプを用いて３０，０００ ＭＷＣＯハイドロサートフィルターカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して移送し、残留物の最終量は２５０ｍｌ（結合インスリン（conjugated insulin）の理論的含有量は０．０６μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
【0101】
８ｍｌの水に溶解した４ｇのＨＰＢＣＤを８０ｍｌのエマルジョンに添加し、容量を１００ｍｌに調整した。
エマルジョンを、０．２２μｍのＰＥＳ膜を通して濾過し、４ｍｌをガラスバイアルに充填し（１バイアルあたり０．５ｍｌ）、低温にした。最終バルク製品のモル浸透圧濃度は、３７６ｍｏｓｍ／ｋｇであった。
エマルジョンを、０．２２μｍのＰＥＳ膜を通して濾過し、４ｍｌをガラスバイアルに充填し（１バイアルあたり０．５ｍｌ）、低温にした。最終バルク製品のモル浸透圧濃度は、３７６ｍｏｓｍ／ｋｇであった。
【0102】
１バイアル当たりのインスリン結合体の理論的含有量は０．０２４μｍｏｌ／バイアル、観測された含有量は０．０１７μｍｏｌ／バイアルであり、結合インスリンの収量は７２％であった。
【0103】
液状バルクと乾式最終製品のＺ－Ａｖｅｒａｇｅサイズは、それぞれ１１９．９ｎｍ（ポリ分散指数０．１３７）と２４３ｎｍ（ポリ分散指数０．３４２）であった。
【0104】
凍結乾燥粉末中の結合インスリン、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０の含有量を、ＲＰ－ＨＰＬＣによってモニターする。凍結乾燥された最終製品のクロマトグラムを、図１０に示す。以下の表１２は、凍結乾燥された製剤の試験に使用されるクロマトグラフィー条件を提供する。
【表12】
【0105】
実施例５に記載したように、製造した製剤の典型的な凍結透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を図１４Ａ～Ｅ及び１５Ａ～Ｅに示す。
【0106】
実施例６
ＧＩ処方
早産児の腸吸収不良の局所治療のための経口エマルションを製造した。製剤は、３つの有効成分：ｒｈ－インスリン、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０を含有する。再構成製剤では、インスリンは遊離蛋白質として存在し、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０は、油滴に取り込まれている。
ＧＩ処方
早産児の腸吸収不良の局所治療のための経口エマルションを製造した。製剤は、３つの有効成分：ｒｈ－インスリン、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０を含有する。再構成製剤では、インスリンは遊離蛋白質として存在し、ＤＨＡ及びコエンザイムＱ１０は、油滴に取り込まれている。
【0107】
配合プロセスには、以下の一般的工程が含まれていた：
－溶剤置換法を用いた、ＤＨＡとコエンザイムＱ１０エマルジョンの生成、
－ｒｈ－インスリン及び凍結保護剤の追加、
－ろ過・凍結乾燥。
－溶剤置換法を用いた、ＤＨＡとコエンザイムＱ１０エマルジョンの生成、
－ｒｈ－インスリン及び凍結保護剤の追加、
－ろ過・凍結乾燥。
【0108】
＜材料及び方法＞
５１３ｍｇのコエンザイムＱ１０、８９８ｍｇのＤＨＡエチルエステル、１７５ｍｇのチロキサポール及び１７５ｍｇのリポイドＥ８０を、８０ｍｌのエタノールに溶解した。混合物を、３５０ｍｌの０．１％ＰＶＡ水溶液に２１Ｇニードルで滴下し、常温下、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４５±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて、減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
５１３ｍｇのコエンザイムＱ１０、８９８ｍｇのＤＨＡエチルエステル、１７５ｍｇのチロキサポール及び１７５ｍｇのリポイドＥ８０を、８０ｍｌのエタノールに溶解した。混合物を、３５０ｍｌの０．１％ＰＶＡ水溶液に２１Ｇニードルで滴下し、常温下、３５０ｒｐｍで連続混合した。得られたエマルジョンをさらに１０分間混合し、その後、実験室ロータリーエバポレーター（４５±２℃、５０ｍＢａｒ）を用いて、減圧下で有機溶媒を完全に除去した。
【0109】
１ｍｌのインスリン溶液（２．７ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ ８．５）を、２８．６ｍｇ／ｍｌのＨＰＢＣＤ及び３４３ｍｇ／ｍｌのマルトデキストリンを含む１４ｍｌの凍結保護剤溶液と混合した。得られた溶液を、連続的に混合されたエマルジョンに加え、２０分間混合した。
【0110】
エマルジョンを０．２２μｍのＰＥＳ膜を通して濾過し、４ｍｌをガラスバイアルに充填し（充填容量０．５ｍｌ／バイアル）、凍結乾燥した。最終バルク製品のモル浸透圧濃度は、３５８ｍｏｓｍ／ｋｇであった。１バイアル中にｒｈ－インスリンを０．６５ＩＵ、ＤＨＡを０．９ｍｇ及びコエンザイムＱ１０を０．５ｍｇ含有する。
【0111】
【0112】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせに対しても提供され得る。
【0113】
本発明をその特定の実施形態との関連で説明したが、多数の代替、修正及び変種が当業者には明らかであろう。したがって、そのような代替、修正及び変種の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれることを意図するものである。本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれについて具体的且つ個別の参照により本明細書に組み込む場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。
【0114】
さらに、本願の基礎出願に係る書類も、本参照をもって本明細書に完全に組み込まれたものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A-B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】