特表 2022-536083 スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の防除

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-12

(54)【発明の名称】スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の防除

(51)【国際特許分類】

   A01N 63/50 20200101AFI20220804BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 5/04 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220804BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20220804BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20220804BHJP

   A01P 7/04 20060101ALI20220804BHJP

【ＦＩ】

A01N63/50

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12N1/20 E

C12N5/04

C12N5/10

A01H6/46

C12N15/31

A01P7/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021571908

(86)(22)【出願日】2020-06-03

(85)【翻訳文提出日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 US2020035876

(87)【国際公開番号】W WO2020247465

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/857,504

(32)【優先日】2019-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520222106

【氏名又は名称】シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100136249

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 貴光

(72)【発明者】

【氏名】レイノルズ クラレンス マイケル

【テーマコード（参考）】

2B030

4B065

4H011

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD04

2B030CA17

2B030CB03

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AA89X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA48

4B065CA53

4H011AC01

4H011BB21

4H011DA13

(57)【要約】

植物有害生物を防除するための方法が開示される。特に、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に対する毒性を有する殺虫性タンパク質が提供される。殺虫性タンパク質をコードする、植物での発現のために最適化されたコドンを含むポリヌクレオチドも提供される。殺虫性タンパク質を作製する方法、並びに例えばトランスジェニック植物において、虫害からの保護を付与するために、本発明の殺虫性タンパク質及び殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用する方法も開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫を防除する方法であって、前記スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫を、Ｔｘｐ４０タンパク質又は配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体と接触させるステップを含む方法。

【請求項2】

前記スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）害虫である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）害虫は、Ｃｒｙタンパク質及び／又はＶｉｐ３タンパク質に耐性がある、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｖｉｐ３タンパク質は、Ｖｉｐ３Ａタンパク質である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｊ又はＣｒｙ２Ａタンパク質である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記接触ステップは、前記Ｔｘｐ４０タンパク質又はその変異体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された微生物を用いて実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記接触ステップは、前記Ｔｘｐ４０タンパク質又はその変異体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む植物又はその部位を用いて実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記植物は、コーン植物又はその部位である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）は、前記Ｔｘｐ４０タンパク質又はその変異体に加えて、Ｃｒｙタンパク質及び／又はＶｉｐ３タンパク質と接触される、請求項２に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｃｒｙタンパク質及び／又は前記Ｖｉｐ３タンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａ及びＶｉｐ３タンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に対する殺虫活性を有するＴｘｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子に作動可能に連結されたプロモータを含むキメラ遺伝子であって、前記ヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３～５又は１１～７３のいずれかであるか；
（ｂ）配列番号３～５又は１１～７３のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有するか；
（ｃ）配列番号１、２又は７４～１３６のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか；
（ｄ）配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか；又は
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的である、キメラ遺伝子。

【請求項13】

配列番号４、配列番号５又は配列番号１１～７３のいずれかのヌクレオチド配列を含む殺虫性タンパク質をコードする核酸分子。

【請求項14】

配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかのアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質。

【請求項15】

請求項１２に記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。

【請求項16】

請求項１２に記載のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞。

【請求項17】

細菌細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

植物細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項19】

ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））害虫によって外寄生され得るトランスジェニック植物であって、Ｔｘｐ４０タンパク質又は配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体をコードする少なくとも１つの核酸分子で安定に形質転換されることにより、前記害虫から保護される、トランスジェニック植物。

【請求項20】

前記Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質又はその変異体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかを含む、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。

【請求項21】

前記核酸分子は、配列番号３、配列番号４又は配列番号１１～７３のいずれかの配列を含む、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。

【請求項22】

コーン植物である、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。

【請求項23】

前記ツマジロクサヨトウ害虫は、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質又はＶｉｐ３タンパク質に耐性がある、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。

【請求項24】

Ｔｘｐ４０タンパク質又は配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列であって、前記コドンは、コーン植物での発現のために最適化される、コドン最適化ヌクレオチド配列。

【請求項25】

前記ヌクレオチド配列は、配列番号４を含む、請求項２２に記載のコドン最適化ポリヌクレオチド。

【請求項26】

ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））の集団においてＶｉｐ３タンパク質又はＣｒｙ１Ｆタンパク質に対する耐性の発生を軽減する方法であって、Ｔｘｐ４０タンパク質又は配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体をコードするポリヌクレオチドと、Ｖｉｐ３Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列又はＣｒｙ１Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとを含むトランスジェニック植物を前記ツマジロクサヨトウ集団又はその環境に送達するステップを含み、前記Ｔｘｐ４０タンパク質又はその変異体と、前記Ｖｉｐ３タンパク質又は前記Ｃｒｙ１Ｆタンパク質とは、前記トランスジェニック植物において産生される、方法。

【請求項27】

ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に対して保護されたコーンを生産するための方法であって、（ａ）Ｔｘｐ４０タンパク質又は配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその変異体をコードするポリヌクレオチドをコーン植物に導入するステップ、（ｂ）前記コーン植物又は前記コーン植物の子孫を、ツマジロクサヨトウ害虫によって外寄生され得る領域に植えるステップを含み、前記コーン植物又は前記子孫は、前記Ｔｘｐ４０タンパク質を発現する、方法。

【請求項28】

前記導入ステップは、ａ）前記ポリヌクレオチドでコーン細胞を形質転換し、且つ前記Ｔｘｐ４０タンパク質若しくはその変異体を発現するコーン植物を再生するか、又はｂ）前記ポリヌクレオチドを含む第１のコーン植物を第２のコーン植物と交雑させ、前記Ｔｘｐ４０タンパク質若しくはその変異体を発現する子孫コーン植物をもたらすことによって達成される、請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
２０２０年３月３１日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、３０８キロバイトのサイズで“８１８８９－ＷＯ－ＲＥＧ－ＯＲＧ－Ｐ－１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名称である、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表が紙のコピーの代わりに提供される。この配列表は、その開示のために参照により本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、害虫防除、タンパク質工学及び植物分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ｔｘｐ４０遺伝子若しくはＴｘｐ４０タンパク質を使用して又はＴｘｐ４０タンパク質を第２の有害生物防除剤と組み合わせて使用して、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）目の害虫、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ；ＦＡＷ）を防除する方法に関する。本発明は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、特にＦＡＷに対して、より具体的にはＣｒｙ及び／又はＶｉｐ３耐性ＦＡＷに対して作物、特にコーンを保護する方法にも関する。本発明はまた、ＦＡＷに対する殺虫活性を有するＴｘｐ４０タンパク質毒素及びその変異体と、その発現が殺虫性タンパク質をもたらす核酸と、ＦＡＷ有害生物を防除するための殺虫性タンパク質及び対応する核酸の作製方法及び使用方法とを提供する。本発明は、ＦＡＷによって外寄生され得、且つ発現可能なｔｘｐ４０遺伝子で形質転換されているか、又は発現可能なｔｘｐ４０遺伝子及び第２の殺有害生物剤をコードする遺伝子の両方で形質転換されている植物、特に単子葉植物、具体的にはコーン植物にも関する。

【背景技術】

【0003】

スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ、ＦＡＷ）を含むスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）種は、コーン、綿及びダイズを含むいくつかの条植え作物の深刻な有害生物である。ブラジル及び他の南米諸国において、ＦＡＷは、コーン植物（ゼア・マイス（Ｚｅａ Ｍａｙｓ）；トウモロコシ）の最も破壊的な一貫した有害生物種であり、最大で５７％の収穫の減少を生じる。一定の年数が経過すれば、米国を含む他の国でも、ＦＡＷは、コーンに対して著しい経済的な損害をもたらし得る。この昆虫の幼虫は、最初に葉組織を餌にし、その後、輪生内に深く入り、発育中の雄穂への著しい損傷が生じる。ＦＡＷにより生じる落葉は、光合成領域を減少させ、これにより、植物は、成長を阻止され、収穫が減少し得る。ＦＡＷ幼虫は、雌穂の側面を通り抜けて進み、発育する穀粒を餌にすることにより、雌穂にも損傷を与え、穀物品質及び収穫が低下する。

【0004】

歴史的に、コーンにおけるＦＡＷの防除は、合成殺虫剤を使用して達成されてきた。しかしながら、このような殺虫剤は、若い幼虫に対して且つ輪生又は雌穂に深く潜り込む前にのみ有効である。加えて、集約的なコーン栽培領域において、ＦＡＷ集団は、ラムダ－シハロトリン、クロルピリホス、スピノサド及びルフェヌロンなどのいくつかの殺虫剤に対する耐性を進化させている。

【0005】

他のＦＡＷ防除の選択肢には、最近では、細菌バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）に由来する１つ又は複数の殺虫性結晶タンパク質（Ｃｒｙタンパク質）及び／又は植物性殺虫性タンパク質（ＶＩＰ）を発現するトランスジェニックコーン植物の使用が含まれている。これまでのＢｔ由来の最も強力なＦＡＷ活性タンパク質は、植物性殺虫性タンパク質Ｖｉｐ３である。ＦＡＷに対して活性であるＢｔ由来のＣｒｙタンパク質は、ごく少数のみである。それらの中程度～高度の活性を有する少数のものには、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｉｆ、Ｃｒｙ１Ｊ及びＣｒｙ２Ａが含まれる。およそ２００７年以来、これらのＣｒｙタンパク質及びＶｉｐ３タンパク質の１つ又は複数を発現するトランスジェニックコーンイベントの商業的なリリースにより、ＦＡＷ管理のための新しい方策が提供されている。現在、これらのいわゆるＢｔイベントを含有する産物は、ＦＡＷが有害生物である主要なコーン栽培領域の多くにおいて栽培されている。例えば、このような産物は、ブラジルのコーン栽培領域の８０を超える領域において栽培されている（約１２．５百万ｈａ／年）。ＦＡＷに対する活性を有するＢｔ殺虫性タンパク質を含有する産物の急速な採用は、ＦＡＷに対する殺虫剤スプレーの減少に寄与した。しかしながら、場合により、コーン植物におけるＢｔ由来タンパク質の連続的な発現は、標的ＦＡＷ有害生物集団に対して強い選択圧をかけ、耐性の進化が選択される。ブラジルでは、例えば、ＦＡＷの野外集団は、トランスジェニックコーン産物において発現されるＣｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ１Ａｂタンパク質に対する耐性を進化させている。ＦＡＷは、プエルトリコ及び米国地域でもＣｒｙ１Ｆコーンに対する耐性を発生させている。ブラジルでは、ＦＡＷ集団において、Ｃｒｙ１タンパク質を含有するスタックされた産物と共に、高頻度の産物耐性も報告されている。対照的に、Ｖｉｐ３Ａタンパク質に対する耐性は、検出されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

農業家に経済的利益を提供すると共に、環境的に容認できる殺虫剤を使用して、条植え作物の害虫を防除するための新しく且つ有効な方法を特定することが依然として継続的に必要とされている。特に必要とされているのは、耐性の発生を軽減する手段として、Ｃｒｙタンパク質及び／又はＶｉｐ３タンパク質などの現存のＢｔ由来の殺虫性タンパク質と異なる作用機序を有するタンパク質を使用して、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）種、特にＦＡＷを防除するための方法である。さらに、トランスジェニック植物のように環境への負担を最小限にする産物を通して昆虫防除剤を送達することが最も望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0007】

これらの必要性を考慮して、本発明は、Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質及びＴｘｐ４０殺虫性タンパク質の変異体を使用して、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ；ＦＡＷ）及び他の害虫を防除する方法を提供する。本発明は、実質的にＴｘｐ４０と同一であるスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）活性Ｔｘｐ４０タンパク質及び変異体Ｔｘｐ４０タンパク質も提供する。本発明のタンパク質は、驚くべきことに、多数のタイプの殺虫性タンパク質、特にＢｔ由来のＣｒｙタンパク質に抵抗する害虫種であるＦＡＷに対する経口毒性を有する。本発明は、Ｔｘｐ４０タンパク質又は変異体Ｔｘｐ４０タンパク質をコードする組換えコドン最適化ポリヌクレオチドにさらに関連する。

【0008】

本発明には、本発明の組換えポリヌクレオチドを含有する発現カセット及びベクター；このようなポリヌクレオチドを含み、且つその発現を可能にする植物又は微生物；このようなポリヌクレオチドで形質転換された植物、例えばトランスジェニックコーン植物；安定に組み込まれて、メンデルの法則に従って遺伝し得るポリヌクレオチドを含有する、このような植物の子孫並びに／又はこのような植物及びこのような子孫の種子も含まれる。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を子孫植物及び種々のコーン生殖質に導入するための育種方法も含む。

【0009】

本発明は、Ｔｘｐ４０又はその変異体を含有する組成物及び配合物も含み、これは、例えば、ＦＡＷが外寄生した領域若しくは植物に対して組成物若しくは配合物の一部としてのＴｘｐ４０若しくはその変異体を適用するか、又はＦＡＷ有害生物に対する保護を付与するためにＦＡＷ感受性領域若しくは植物を予防的に処理することにより、生存、成長及び／又は繁殖するＦＡＷの能力を阻害するか、又は作物植物へのＦＡＷ関連の損傷又は損失を制限することができる。

【0010】

本発明は、Ｔｘｐ４０又はその変異体を作製する方法と、例えば微生物においてＦＡＷを防除するか又はトランスジェニック植物においてＦＡＷ損傷からの保護を付与するために、本発明のポリヌクレオチドを使用する方法とにさらに関連する。

【0011】

本発明の他の態様及び利点は、本発明の以下の説明及び非限定的な実施例の研究から当業者に明らかになるであろう。

【発明を実施するための形態】

【0012】

配列表の配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字略語を用いて示される。列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、記載されるように配列されたヌクレオチド及びアミノ酸モノマーを有する分子（すなわちそれぞれポリヌクレオチド及びポリペプチド）を定義する。列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、記載されるように配列されたヌクレオチド及びアミノ酸モノマーを含むポリヌクレオチド又はポリペプチドの属もそれぞれ定義する。遺伝子コードの冗長性を考慮して、コード配列を含むヌクレオチド配列は、参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの属も説明することが理解されるであろう。さらに、アミノ酸配列は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドＯＲＦの属を説明することも理解されるであろう。

【0013】

各核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、表示される鎖を参照することによって相補鎖も含まれると理解される。一次ヌクレオチド配列の補体及び逆補体は、必ずしも一次配列によって開示されないため、相補的配列及び逆相補的配列は、そうでないことが明確に記載されない（又は配列が現れる文脈からそうでないことが明らかでない）限り、そのヌクレオチド配列を参照する。さらに、当技術分野において、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されたＤＮＡの配列によって決定される（ヌクレオチド塩基ウラシル（Ｕ）によるチミン（Ｔ）の置換を別にして）ことが理解されるため、ＲＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列を参照することによって含まれる。添付の配列表において：
配列番号１は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のＴｘｐ４０－１アミノ酸配列である。

【0014】

配列番号２は、変異体Ｔｘｐ４０－１アミノ酸配列である。

【0015】

配列番号３は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来の天然ｔｘｐ４０－１ヌクレオチド配列である。

【0016】

配列番号４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ヌクレオチド配列である。

【0017】

配列番号５は、トウモロコシコドン最適化ｔｘｐ４０－１ヌクレオチド配列である。

【0018】

配列番号６は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種由来のＨ１Ｔｘｐ４０アミノ酸配列である。

【0019】

配列番号７は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種由来のＨ２Ｔｘｐ４０アミノ酸配列である。

【0020】

配列番号８は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種由来のＨ３Ｔｘｐ４０アミノ酸配列である。

【0021】

配列番号９は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種由来のＨ５Ｔｘｐ４０アミノ酸配列である。

【0022】

配列番号１０は、ゼノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）由来のＴｘｐ４０アミノ酸配列である。

【0023】

配列番号１１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0024】

配列番号１２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ４８Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0025】

配列番号１３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0026】

配列番号１４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ７３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0027】

配列番号１５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ７５Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0028】

配列番号１６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１０３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0029】

配列番号１７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0030】

配列番号１８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0031】

配列番号１９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0032】

配列番号２０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１４３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0033】

配列番号２１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１７０Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0034】

配列番号２２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１９１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0035】

配列番号２３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２００Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0036】

配列番号２４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２０９Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0037】

配列番号２５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１０Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0038】

配列番号２６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0039】

配列番号２７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２２１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0040】

配列番号２８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２３８Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0041】

配列番号２９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２４７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0042】

配列番号３０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２５０Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0043】

配列番号３１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２６３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0044】

配列番号３２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２６５Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0045】

配列番号３３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２７１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0046】

配列番号３４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２７５Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0047】

配列番号３５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２８４Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0048】

配列番号３６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２９６Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0049】

配列番号３７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３０９Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0050】

配列番号３８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0051】

配列番号３９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ１０Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0052】

配列番号４０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２６Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0053】

配列番号４１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ４６Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0054】

配列番号４２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ１６７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0055】

配列番号４３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ１８６Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0056】

配列番号４４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ１８７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0057】

配列番号４５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２０８Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0058】

配列番号４６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２１７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0059】

配列番号４７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２２６Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0060】

配列番号４８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２４０Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0061】

配列番号４９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２５２Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0062】

配列番号５０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ３０５Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0063】

配列番号５１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ３１１Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0064】

配列番号５２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0065】

配列番号５３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0066】

配列番号５４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｒ２０８Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0067】

配列番号５５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｒ２０８Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0068】

配列番号５６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ／Ｒ２０８Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0069】

配列番号５７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0070】

配列番号５８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0071】

配列番号５９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｒ２０８Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0072】

配列番号６０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ７３Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0073】

配列番号６１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１０３Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0074】

配列番号６２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ／Ｋ２８４Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0075】

配列番号６３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0076】

配列番号６４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0077】

配列番号６５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ／Ｒ１６７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0078】

配列番号６６は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｒ１６７Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0079】

配列番号６７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｓ１１Ｙ／Ｍ８６Ｉ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ｔ変異体ヌクレオチド配列である。

【0080】

配列番号６８は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｓ１１Ｙ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0081】

配列番号６９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｆ１６９Ｖ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0082】

配列番号７０は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｐ１３４Ｌ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0083】

配列番号７１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｉ１０１Ｌ／Ｋ１０３Ｔ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｎ２５７Ｔ変異体ヌクレオチド配列である。

【0084】

配列番号７２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｈ６２Ｑ／Ｄ９９Ｖ／Ｋ１１９Ａ／Ｔ１６５Ｉ／Ｒ１６７Ｃ／Ｋ２１３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0085】

配列番号７３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｌ３１６Ｖ変異体ヌクレオチド配列である。

【0086】

配列番号７４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0087】

配列番号７５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ４８Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0088】

配列番号７６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0089】

配列番号７７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ７３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0090】

配列番号７８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ７５Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0091】

配列番号７９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１０３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0092】

配列番号８０は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0093】

配列番号８１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0094】

配列番号８２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0095】

配列番号８３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１４３Ａ変異体ヌクレオチド配列である。

【0096】

配列番号８４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１７０Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0097】

配列番号８５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１９１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0098】

配列番号８６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２００Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0099】

配列番号８７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２０９Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0100】

配列番号８８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１０Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0101】

配列番号８９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0102】

配列番号９０は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２２１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0103】

配列番号９１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２３８Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0104】

配列番号９２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２４７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0105】

配列番号９３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２５０Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0106】

配列番号９４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２６３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0107】

配列番号９５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２６５Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0108】

配列番号９６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２７１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0109】

配列番号９７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２７５Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0110】

配列番号９８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２８４Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0111】

配列番号９９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２９６Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0112】

配列番号１００は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３０９Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0113】

配列番号１０１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0114】

配列番号１０２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ１０Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0115】

配列番号１０３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２６Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0116】

配列番号１０４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ４６Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0117】

配列番号１０５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ１６７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0118】

配列番号１０６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ１８６Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0119】

配列番号１０７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ１８７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0120】

配列番号１０８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２０８Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0121】

配列番号１０９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２１７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0122】

配列番号１１０は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２２６Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0123】

配列番号１１１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２４０Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0124】

配列番号１１２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２５２Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0125】

配列番号１１３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ３０５Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0126】

配列番号１１４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ３１１Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0127】

配列番号１１５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0128】

配列番号１１６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0129】

配列番号１１７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｒ２０８Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0130】

配列番号１１８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｒ２０８Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0131】

配列番号１１９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ／Ｒ２０８Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0132】

配列番号１２０は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ４９Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0133】

配列番号１２１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0134】

配列番号１２２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｒ２０８Ａ／Ｋ３３３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0135】

配列番号１２３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ７３Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0136】

配列番号１２４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１０３Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0137】

配列番号１２５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ／Ｋ２８４Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0138】

配列番号１２６は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ３１Ａ／Ｋ４９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0139】

配列番号１２７は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0140】

配列番号１２８は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ２１３Ａ／Ｒ１６７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0141】

配列番号１２９は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｒ１６７Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0142】

配列番号１３０は、Ｔｘｐ４０－１ Ｓ１１Ｙ／Ｍ８６Ｉ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ｔ変異体アミノ酸配列である。

【0143】

配列番号１３１は、Ｔｘｐ４０－１ Ｓ１１Ｙ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0144】

配列番号１３２は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９Ａ／Ｆ１６９Ｖ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0145】

配列番号１３３は、Ｔｘｐ４０－１ Ｋ１１９／Ｐ１３４Ｌ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0146】

配列番号１３４は、Ｔｘｐ４０－１ Ｉ１０１Ｌ／Ｋ１０３Ｔ／Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｎ２５７Ｔ変異体アミノ酸配列である。

【0147】

配列番号１３５は、Ｔｘｐ４０－１ Ｈ６２Ｑ／Ｄ９９Ｖ／Ｋ１１９Ａ／Ｔ１６５Ｉ／Ｒ１６７Ｃ／Ｋ２１３Ａ変異体アミノ酸配列である。

【0148】

配列番号１３６は、Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｌ３１６Ｖ変異体アミノ酸配列である。

【0149】

この説明は、本発明が実行され得る様々な方法の全て又は本発明に付加され得る特徴の全ての詳細な目録であることを意図されない。例えば、１つの実施形態に関連して説明される特徴は、他の実施形態に組み込まれ得、及び特定の実施形態に関連して説明される特徴は、その実施形態から削除され得る。したがって、本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組み合わせが除外又は省略可能であることを企図する。さらに、本発明から逸脱しない、本明細書で示唆される種々の実施形態に対する多数の変化形態及び付加形態は、本開示を考慮して当業者に明らかであろう。したがって、以下の記載は、本発明のいくつかの特定の実施形態を説明することが意図され、その全ての並べ替え、組み合わせ及び変化形態を網羅的に明記することを意図されない。

【0150】

他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定することを意図されない。

【0151】

本明細書中に引用される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その参考文献が提示される文章及び／又は段落に関連する教示について参照によってその全体が援用される。

【0152】

本明細書に提供されるヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’への方向で提示され、３７ＣＦＲ§§１．８２１－１．８２５及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５に記載されるような、ヌクレオチド塩基を表すための標準コード、例えばアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）を用いて提示される。

【0153】

アミノ酸は、ＷＩＰＯ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５、例えばアラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；１）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）を用いて同様に示される。

【0154】

文脈上特に示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴が任意の組合せで使用され得ることが特に意図される。さらに、本発明は、本発明のある実施形態において、本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組合せが除外又は省略され得ることも想定している。例示するために、組成物が成分Ａ、Ｂ及びＣを含むことを本明細書が記載している場合、Ａ、Ｂ又はＣのいずれか又はそれらの組合せが単独で又は任意の組合せで除外され、特許請求されないことがあることが特に意図される。

【0155】

定義
明確にするために、本明細書において使用される特定の用語は、以下のように定義及び提示される。

【0156】

本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明記されない限り、複数形も含むことが意図される。

【0157】

本明細書において使用される際、「及び／又は」は、関連する列挙される項目の１つ又は複数のあらゆる可能な組合せ並びに代替（「又は」）として解釈されるときには組合せの欠如を指し、それらを包含する。

【0158】

本明細書において使用される際の「約」という用語は、投与量又は期間などの測定可能な値に言及するとき、規定の量の±２０、±１０、±５、±１、±０．５又はさらに±０．１の変動を包含することが意図される。本明細書において使用される際、「約Ｘ～Ｙ」などの語句は、「約Ｘ～約Ｙ」を意味し、及び「約ＸからＹまで」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。

【0159】

文脈上特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「ＸからＹまで」などの語句は、Ｘ及びＹを含むと解釈されるべきである。

【0160】

本発明の殺虫性タンパク質の「活性」は、経口活性な昆虫防除剤として機能する殺虫性タンパク質が毒性効果を有し、且つ／又は昆虫の摂食を妨害又は阻止できることを意味し、これは、昆虫の死を引き起こしてもしなくてもよい。本発明の殺虫性タンパク質が昆虫に送達されると、結果は、通常、昆虫の死であるか、又は昆虫は、殺虫性タンパク質を昆虫に利用可能とする源を餌にしない。「殺有害生物性」は、好ましくは、昆虫、線虫、真菌、細菌又はウィルスなどの有害生物を死滅又は破壊させることにより、それらを防除することができる毒性生物活性と定義される。「殺虫性」は、好ましくは、昆虫を死滅させることによってそれらを防除することができる毒性生物活性と定義される。「殺有害生物剤」は、殺有害生物活性を有する薬剤である。「殺虫剤」は、殺虫活性を有する薬剤である。

【0161】

「と関連する／作動可能に連結される」は、物理的又は機能的に関係される２つの核酸を指す。例えば、２つの配列が作動可能に連結されるか、又はコード若しくは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与え得るように調節ＤＮＡ配列が位置していれば、プロモータ又は調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列「と関連する」と言われる。

【0162】

本明細書で使用される「キメラ構築物」、又は「キメラ遺伝子」、又は「キメラポリヌクレオチド」、又は「キメラ核酸」という用語（又は同様の用語）は、単一の核酸分子内に構築された異なる起源の２つ以上のポリヌクレオチドを含む構築物又は分子を指す。「キメラ構築物」、「キメラ遺伝子」、「キメラポリヌクレオチド」又は「キメラ核酸」という用語は、限定はされないが、（１）天然には一緒に見出されない調節及びコードポリヌクレオチドを含む（すなわち構築物中のポリヌクレオチドの少なくとも１つが構築物の他のポリヌクレオチドの少なくとも１つに関して異種である）ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、又は（２）天然には隣接しないタンパク質の一部をコードするポリヌクレオチド、又は（３）天然には隣接しないプロモータの一部を含有する任意の構築物又は分子を指す。さらに、キメラ構築物、キメラ遺伝子、キメラポリヌクレオチド又はキメラ核酸は、異なる起源から得られる調節ポリヌクレオチド及びコードポリヌクレオチドを含み得るか、又は同じ起源から得られるが、天然に見出されるものと異なるように配列された調節ポリヌクレオチド及びコードポリヌクレオチドを含み得る。本発明のある実施形態において、キメラ構築物、キメラ遺伝子、キメラポリヌクレオチド又はキメラ核酸は、調節ポリヌクレオチドの制御下、特に植物又は細菌において機能性の調節ポリヌクレオチドの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

【0163】

「コード配列」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡに転写される核酸配列である。好ましくは、ＲＮＡは、その後、生物において翻訳されてタンパク質を産生する。

【0164】

本明細書で使用される場合、「コドン最適化」配列は、宿主細胞又は生物が有し得る特定のコドンバイアスを反映するようにコドンが選択されたヌクレオチド配列を意味する。これは、通常、最適化されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を保存するような方法で行われる。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列は、構築物が発現されることになる細胞（例えば、動物、植物又は真菌細胞）に対してコドン最適化されている配列を含む。例えば、植物細胞において発現される構築物は、植物での発現のためにコドン最適化されたその配列（例えば、第１の遺伝子抑制エレメント又は遺伝子発現エレメント）の全て又は一部を有することができる。例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許第６，１２１，０１４号明細書を参照されたい。

【0165】

昆虫を「防除する」ことは、毒性効果により、生存、成長、摂食及び／若しくは繁殖する害虫の能力を阻害するか、又は作物植物における昆虫関連の損傷若しくは損失を制限することを意味する。昆虫を「防除する」ことは、昆虫を死滅させることを意味してもしなくてもよいが、好ましくは昆虫を死滅させることを意味する。

【0166】

本明細書において使用される際の「含む」又は「含んでいる」という用語は、記載される特徴、整数、ステップ、動作、要素又は成分の存在を規定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、成分又はそれらの群の存在又は追加を除外しない。

【0167】

本明細書において使用される際、「から本質的になる」という移行句（及び文法的な変化形）は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に記載される規定の材料又はステップ及び特許請求される本発明の基本的及び新規な特徴を実質的に変更しないものを包含するものと解釈されることを意味する。したがって、本発明の特許請求の範囲において使用されるときの「から本質的になる」という用語は、「含む」と均等であると解釈されることが意図されない。

【0168】

本発明との関連において、「に対応している」又は「に対応する」は、変異体又は相同体Ｃｒｙタンパク質のアミノ酸配列が互いにアラインメントされるとき、変異体又は相同体タンパク質中の特定の列挙された位置「に対応する」アミノ酸が、参照タンパク質中のこれらの位置とアラインメントされるものであるが、必ずしも本発明の特定の参照アミノ酸配列に対してこれらの正確な数字の位置に存在しなくてもよいことを意味する。例えば、配列番号１が参照配列であり、配列番号１０とアラインメントされる場合、配列番号１０のＧｌｙ５１は、配列番号１のＧｌｙ４２「に対応する」か、又は例えば、配列番号１０のＶａｌ５９は、配列番号１のＩｌｅ５０「に対応する」。

【0169】

本明細書で使用される場合、「Ｃｒｙタンパク質」という用語は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶デルタエンドトキシンタイプの殺虫性タンパク質を意味する。「Ｃｒｙタンパク質」という用語は、プロトキシン形態若しくは任意の生物活性断片又はそれらの毒素を指し得、例えばＮ末端ペプチジル断片及び／又はＣ末端プロトキシン尾部を含まない部分的に処理された形態及び成熟毒素形態が含まれる。

【0170】

殺虫性タンパク質を「送達する」ことは、殺虫性タンパク質が昆虫と接触して、毒性効果及び昆虫の防除をもたらすことを意味する。殺虫性タンパク質は、多数の認知された方法において、例えば殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物、配合されたタンパク質組成物、スプレー可能なタンパク質組成物、餌基質又は当技術分野において認められている任意の他の毒素送達系によって送達され得る。

【0171】

「ドメイン」という用語は、進化的に関係するタンパク質の配列アラインメントに沿って特定の位置で保存された一連のアミノ酸を指す。他の位置のアミノ酸は、相同体間で異なり得るが、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は機能に不可欠であり得るアミノ酸を示す。タンパク質相同体ファミリーのアラインメントされた配列におけるその高度の保存により同定されるため、これらは、対象の任意のポリペプチドが、既に同定されたポリペプチド群に属するかどうかを決定するための識別子として使用することができる。

【0172】

「有効昆虫防除量」は、毒性効果により、生存、成長、摂食及び／若しくは繁殖する昆虫の能力を阻害するか、又は作物植物における昆虫関連の損傷若しくは損失を制限する殺虫性タンパク質の濃度を意味する。「有効昆虫防除量」は、昆虫を死滅させることを意味してもしなくてもよいが、好ましくは昆虫を死滅させることを意味する。

【0173】

本明細書で使用される「発現カセット」は、終結シグナルに作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸配列を意味する。発現カセットは、通常、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列も含む。対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに関して異種である。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え型で得られたものでもあり得る。しかしながら、通常、発現カセットは、宿主に関して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然に存在せず、形質転換イベントによって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモータの制御下にあり得るか、又は特定の外部刺激に宿主細胞がさらされたときにのみ転写を開始させる誘導性プロモータの制御下にあり得る。植物などの多細胞生物の場合、プロモータは、特定の組織若しくは器官又は発達段階に対して特異的でもあり得る。

【0174】

対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットは、その天然遺伝子を駆動する天然プロモータを含むものでもあり得る。しかしながら、発現カセットは、異種発現に有用な組換え型で得られている。発現カセットのこのような使用は、発現カセットが導入された細胞中にそれが天然に存在しないことを意味する。

【0175】

発現カセットは、植物中で機能的である転写及び／又は翻訳終結領域（すなわち終結領域）も任意に含み得る。様々な転写ターミネータが発現カセットにおける使用に利用可能であり、対象の異種ヌクレオチド配列を越えた転写の終結及び正確なｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。終結領域は、転写開始領域にネイティブであるか、作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列にネイティブであるか、植物宿主にネイティブであるか、又は別の起源に由来し得る（すなわちプロモータ、対象のヌクレオチド配列、植物宿主又はこれらの任意の組合せに対して外来性又は異種である）。適切な転写ターミネータには、限定はされないが、ＣＡＭＶ ３５Ｓターミネータ、ｔｍｌターミネータ、ノパリンシンターゼターミネータ及び／又はエンドウマメｒｂｃｓ Ｅ９ターミネータが含まれる。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用することができる。さらに、コード配列の天然転写ターミネータを使用することができる。植物中で機能的であることが知られている任意の利用可能なターミネータを本発明との関連において使用することができる。

【0176】

遺伝子、ＯＲＦ若しくはその一部又は植物中の導入遺伝子などのポリヌクレオチドに関連して使用される場合の「発現」という用語は、遺伝子にコードされる遺伝情報をその遺伝子の「転写」によって（すなわちＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｓｎＲＮＡ）に転換し、且つ適用可能な場合（例えば、遺伝子がタンパク質をコードする場合）、ｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に転換するプロセスを指す。遺伝子発現は、このプロセスの多くの段階で制御され得る。例えば、アンチセンス又はｄｓＲＮＡ構築物の場合、発現は、それぞれアンチセンスＲＮＡのみ又はｄｓＲＮＡのみの転写を指し得る。実施形態において、「発現」は、センス（ｍＲＮＡ）又は機能性ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指す。「発現」は、タンパク質の産生を指すこともある。

【0177】

「遺伝子」は、ゲノム内に位置する画定された領域であり、コード核酸配列を含むと共に、通常、コード部分の発現、すなわち転写及び翻訳の制御に関与している他の主に調節性の核酸も含む。遺伝子は、他の５’及び３’非翻訳配列並びに終結配列も含み得る。存在し得るさらなるエレメントは、例えば、イントロンである。遺伝子の調節核酸配列は、通常、天然に見られる関連核酸配列に作動可能に連結できず、したがってキメラ遺伝子であり得る。

【0178】

「対象の遺伝子」は、植物に導入されたとき、抗生物質耐性、ウィルス耐性、昆虫耐性、疾患耐性又は他の有害生物に対する耐性、除草剤耐容性、非生物的ストレス耐容性、雄性不稔、修飾された脂肪酸代謝、修飾された炭水化物代謝、改善された栄養価、工業プロセスにおける改善された性能又は改変された生殖能力などの所望の形質を植物に付与する任意の核酸分子を指す。「対象の遺伝子」は、植物における商業的に価値のある酵素又は代謝産物の産生のために植物に導入されるものでもあり得る。

【0179】

「腸プロテアーゼ」は、昆虫の消化管において天然に見出されるプロテアーゼである。このプロテアーゼは、通常、摂取されたタンパク質の消化に関与する。腸プロテアーゼの例としては、通常、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）残基のＣ末端側のペプチドを切断するトリプシンと、通常、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）のＣ末端側のペプチドを切断するキモトリプシンとが挙げられる。

【0180】

「異種」核酸配列又は核酸分子は、天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数コピーを含む、それが導入される宿主細胞と天然に関連していない核酸配列又は核酸分子である。異種核酸配列又は核酸分子は、プロモータ及びコード領域が複数の起源生物に由来する、キメラ発現カセットなどのキメラ配列を含み得る。プロモータ配列は、構成的プロモータ配列、組織特異的プロモータ配列、化学誘導性プロモータ配列、創傷誘導性プロモータ配列、ストレス誘導性プロモータ配列又は発達段階特異的プロモータ配列であり得る。

【0181】

「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連している核酸配列である。

【0182】

「相同組換え」は、相同核酸分子間の核酸断片の相互交換である。

【0183】

「同一性」又は「同一性パーセント」は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の類似性の度合いを指す。配列比較のために、通常、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、指定されたプログラムパラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。２つのヌクレオチド又は２つのアミノ酸配列との関連における「実質的に同一」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて又は目視検査によって測定される際、最大一致性について比較及びアラインメントしたときに少なくとも約５０のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。特定の実施形態において、実質的に同一な配列は、少なくとも約６０、又は少なくとも約７０、又は少なくとも約８０、又は少なくとも約８５、又はさらに少なくとも約９０若しくは９５のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する。特定の実施形態において、実質的同一性は、長さが少なくとも約５０の残基である配列の領域にわたって若しくは少なくとも約１００の残基の領域にわたって存在するか、又は配列は、少なくとも約１５０の残基にわたって実質的に同一である。さらなる実施形態において、配列は、それらがコード領域の全長にわたって同一である場合に実質的に同一である。

【0184】

比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施により又は目視検査（一般的に下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）により行うことができる。

【0185】

配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされるときに一致するか又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たす、問い合わせ配列の長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次に、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対のための報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下降したとき、累積スコアが１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のためにゼロ以下になったとき又はいずれかの配列の末端に達したとき、各方向におけるワードヒットの拡張は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感受性及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ値、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0186】

配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列と参照核酸配列との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、試験核酸配列は、参照配列と類似していると考えられる。

【0187】

配列アラインメントを実施するために広く使用及び受容されている別のコンピュータプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ ｖ１．６である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：４６７３－４６８０，１９９４）。一致する塩基又はアミノ酸の数を塩基又はアミノ酸の総数で割り、１００をかけて、同一性パーセントが得られる。例えば、２つの５８０塩基対配列が１４５個の一致した塩基を有すれば、これらは、２５パーセント同一である。比較される２つの配列が異なる長さを有する場合、一致の数を２つの長さの短い方で割る。例えば、２００アミノ酸及び４００アミノ酸タンパク質間に１００個の一致したアミノ酸が存在する場合、これらは、短い方の配列に関して５０パーセント同一である。短い方の配列が１５０塩基又は５０アミノ酸未満の長さである場合、一致の数を１５０（核酸塩基の場合）又は５０（アミノ酸の場合）で割り、１００をかけて、同一性パーセントが得られる。

【0188】

２つの核酸が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブリダイズする」という語句は、配列が複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在するとき、ある分子が、ストリンジェントな条件下において、特定のヌクレオチド配列のみに結合、二重化又はハイブリダイズすることを指す。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることよって適応され得る小さい不一致を包含する。

【0189】

サザン及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔ_m）より約５℃低くなるように選択される。通常、「ストリンジェントな条件」下において、プローブは、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にハイブリダイズしないであろう。

【0190】

Ｔ_mは、標的配列の５０が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨ下で）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴ_mに等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルタ上に１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０のホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、約１５分間にわたって７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、１５分間にわたって６５℃で０．２×ＳＳＣの洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については以下のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。多くの場合、バックグラウンドプローブ信号を除去するために、高度のストリンジェンシー洗浄前に低度のストリンジェンシー洗浄を行う。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための中程度のストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間にわたって４５℃で１×ＳＳＣである。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための低度のストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間にわたって４０℃で４～６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件は、典型的に、ｐＨ７．０～８．３で約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的に約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）の塩濃度を含み、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける非関連プローブについて観察されるものの２倍（又はより高い）信号対雑音比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて作成されるときに起こる。

【0191】

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用され得る一連のハイブリダイゼーション／洗浄条件の例である。参照ヌクレオチド配列は、好ましくは、５０℃における２ＸＳＳＣ、０．１のＳＤＳ中での洗浄を伴って、５０℃における７のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ中において、より望ましくは５０℃における１ＸＳＳＣ、０．１のＳＤＳ中での洗浄を伴って、５０℃における７のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ中において、より望ましくはさらに５０℃における０．５ＸＳＳＣ、０．１のＳＤＳ中での洗浄を伴って、５０℃における７のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ中において、好ましくは５０℃における０．１ＸＳＳＣ、０．１のＳＤＳ中での洗浄を伴って、５０℃における７のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ中において、より好ましくは６５℃における０．１ＸＳＳＣ、０．１のＳＤＳ中での洗浄を伴って、５０℃における７のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ中において参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

【0192】

２つの核酸又はタンパク質が実質的に同一であるというさらなる指標は、第１の核酸によりコードされるタンパク質が、第２の核酸によりコードされるタンパク質と免疫学的に交差反応性であるか又はそれと特異的に結合することである。したがって、例えば２つのタンパク質が保存的置換によってのみ異なる場合、タンパク質は、通常、第２のタンパク質と実質的に同一である。

【0193】

ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、そのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列「とアイソコーディングする」。

【0194】

「単離された」核酸分子、又は単離されたポリヌクレオチド、又は単離されたＴｘｐ４０タンパク質は、人の手によってその天然環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない核酸分子、又はポリヌクレオチド、又はタンパク質である。単離された核酸分子、又はポリヌクレオチド、又はタンパク質は、精製された形態で存在し得るか、又は限定はされないが、例えば組換え微生物細胞、植物細胞、植物組織若しくは植物などの非天然環境に存在し得る。

【0195】

「モチーフ」、又は「コンセンサス配列」、又は「シグネチャー」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列内の短い保存領域を指す。モチーフは、多くの場合、ドメインの高度に保存された部分であるが、ドメインの一部のみを含み得るか、又は保存されたドメインの外側に位置し得る（モチーフのアミノ酸の全てが、画定されたドメインの外側に入る場合）。

【0196】

「天然」又は「野生型」核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、ポリペプチド又はアミノ酸配列は、天然に存在するか又は内因性の核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、ポリペプチド又はアミノ酸配列を指す。

【0197】

「核酸分子」又は「ヌクレオチド配列」は、任意の起源から単離され得る一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントである。本発明との関連において、核酸分子は、通常、ＤＮＡのセグメントである。ある実施形態において、本発明の核酸分子は、単離された核酸分子である。

【0198】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。

【0199】

「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能に影響を与えるような、単一の核酸断片上のポリヌクレオチドの関連を指す。例えば、プロモータは、コードポリヌクレオチド又は機能性ＲＮＡの発現に影響を与えることができるとき、そのコードポリヌクレオチド又は機能性ＲＮＡと作動可能に連結されている（すなわちコードポリヌクレオチド又は機能性ＲＮＡがプロモータの転写制御下にある）。センス配向又はアンチセンス配向のコードポリヌクレオチドは、調節ポリヌクレオチドに対して作動可能に連結され得る。

【0200】

「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。

【0201】

「植物」は、任意の発達段階の任意の植物、特に種子植物である。

【0202】

「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理的な単位である。植物細胞は、単離された単一細胞若しくは培養細胞の形態であり得るか、又は例えば植物組織、植物器官若しくは植物全体などのより高度に組織化された単位の一部としてのものであり得る。

【0203】

「植物細胞培養物」は、種々の発達段階における、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び胚などの植物単位の培養物を意味する。

【0204】

「植物材料」は、葉、茎、根、花若しくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞若しくは組織培養物又は植物の任意の他の部位若しくは産物を指す。

【0205】

「植物器官」は、根、茎、葉、つぼみ又は胚など、明確で可視的に構造化及び分化した植物の部位である。

【0206】

本明細書で使用される「植物組織」は、構造的及び機能的な単位に組織化された植物細胞の群を意味する。植物体又は培養物中の植物の任意の組織が含まれる。この用語には、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物並びに構造的及び／又は機能的な単位に組織化された植物細胞の任意の群が含まれるが、これらに限定されない。上記に列挙されるか又は他にこの定義に包含される任意の特定のタイプの植物組織を伴う又は伴わないこの用語の使用は、任意の他のタイプの植物組織を除外することを意図されない。

【0207】

本発明のポリペプチドの「部分」又は「断片」は、本発明のポリペプチドの参照アミノ酸配列と比べて長さが短くされたアミノ酸配列を意味することが理解されるであろう。本発明に従うこのような部分又は断片は、適切な場合、それが構成要素となるより大きいポリペプチド（例えば、タグ化又は融合タンパク質）に含まれ得る。実施形態において、「部分」又は「断片」は、実質的に、殺虫活性を保持する（例えば、全長タンパク質の活性の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくはさらに１００であるか、又は全長タンパク質よりもさらに大きい殺虫活性を有する）。

【0208】

「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含有し、且つＤＮＡの転写を開始させるコード領域の上流側の非翻訳ＤＮＡ配列である。プロモータ領域は、遺伝子発現の調節因子の役割を果たす他のエレメントも含み得る。

【0209】

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、天然には通常見出されず、したがって人間の介入によって作り出された核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質又は生物の形態を指す。本明細書で使用される場合、「組換え核酸分子」は、天然には一緒に存在し得ない、人間の介入の結果であるポリヌクレオチドの組合せを含む核酸分子、例えば互いに異種である少なくとも２つのポリヌクレオチドの組合せから構成される核酸分子又は人工的に合成される核酸分子、例えば構築されたヌクレオチド配列を用いて合成されたポリヌクレオチドであり、天然に通常存在し得るポリヌクレオチドから逸脱するポリヌクレオチド又は宿主細胞のゲノムＤＮＡ及び宿主細胞のゲノムの関連隣接ＤＮＡに人工的に組み込まれた導入遺伝子を含む核酸分子を含む。組換え核酸分子の別の例は、植物のゲノムＤＮＡへの導入遺伝子の挿入から得られるＤＮＡ分子であり、これは、最終的に、その生物における組換えＲＮＡ又はタンパク質分子の発現をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「組換え植物」は、天然に通常存在し得ない植物であり、人間の介入の結果であり、そのゲノムに組み込まれた導入遺伝子又は異種核酸分子を含有する。このようなゲノム改変の結果として、組換え植物は、関連の野生型植物と明確に異なる。

【0210】

本明細書で使用される「減少させる」、「減少された」、「減少させること」、「減少」、「減らす」及び「抑制する」という用語（及びこれらの文法的な変化形）及び同様の用語は、例えば、植物を本発明のポリペプチドと接触させる（例えば、トランスジェニック発現又は局所適用法などによる）ことによる、植物有害生物の生存、成長及び／又は繁殖の低下を指す。生存、成長及び／又は繁殖のこの低下は、本発明のポリペプチドの非存在下で観察されるレベル（例えば、ポリペプチドをトランスジェニック発現していないか、又はポリペプチドで局所的に処理されていない植物）に関するものであり得る。したがって、実施形態において、「減少させる」、「減少された」、「減少させること」、「減少」、「減らす」及び「抑制する」という用語（及びこれらの文法的な変化形）及び同様の用語は、本発明のポリペプチドと接触していない植物（例えば、ポリペプチドをトランスジェニック発現していないか、又はポリペプチドで局所的に処理されていない植物）と比較して少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又はそれを上回る低下を意味する。それぞれの実施形態において、減少の結果、植物有害生物の検出可能な生存、成長及び／又は繁殖は、全くないか又は実質的に全くない（すなわちわずかな量、例えば約１０未満、約５未満又はさらに約１未満）。

【0211】

「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列を指す。調節エレメントは、対象のヌクレオチド配列及び終結シグナルに作動可能に連結されたプロモータを含む。調節エレメントは、通常、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列も包含する。

【0212】

「形質転換」は、宿主細胞又は生物に異種核酸を導入するためのプロセスである。特定の実施形態では、「形質転換」は、対象の生物のゲノム（核又はプラスチド）へのＤＮＡ分子の安定した組込みを意味する。

【0213】

「形質転換／トランスジェニック／組換え」は、異種核酸分子が導入された細菌又は植物などの宿主生物を指す。核酸分子は、宿主のゲノムに安定に組み込まれ得るか、又は核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は、自己複製するものであり得る。形質転換細胞、組織又は植物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」又は「非組換え」宿主は、野生型生物、例えば異種核酸分子を含有しない細菌又は植物を指す。

【0214】

本明細書で使用される場合、「Ｔｘｐ４０タンパク質」は、線虫属のステイネルネマ（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ）及びヘテロラブディティス（Ｈｅｔｅｒｒｈａｂｄｉｔｉｓ）とそれぞれ共生的に関連する２つの細菌属、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）及びフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）によって産生される、天然に存在する毒素である。線虫－細菌対は、特定の昆虫に侵入し、死滅させることができる。Ｔｘｐ４０タンパク質は、最初にＰ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）から単離され、いくつかの害虫に対する注入可能な毒性を有することが示された。

【0215】

本発明に従う「変異体Ｔｘｐ４０タンパク質」は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫、特にツマジロクサヨトウ有害生物（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に対して経口的に毒性である、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在しない改変タンパク質を意味する。

【0216】

本発明は、Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質に関し、これは、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）由来のＣｒｙタンパク質を含む多数の種類の殺虫性タンパク質に抵抗する害虫種であるスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ、ＦＡＷ）に対して驚くほど経口毒性を有することが本明細書において示されている。Ｔｘｐ４０タンパク質は、その自然生物学のために当技術分野において知られているが、これらは、主に昆虫の血体腔に直接注入することにより、特定の昆虫に対して殺虫性であることが示されている（例えば、米国特許第６，６３０，６１９号明細書；Ｐａｒｋ ｅｔ．ａｌ．２０１２．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６０：４０５３－４０５９及びＢｒｏｗｎ ｅｔ．ａｌ．２００６．Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：１６５３－１６６２を参照されたい）。このような直接注入は、まず標的昆虫血体腔に侵入して、病原性細菌、例えばＴｘｐ４０タンパク質を産生するフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）及びゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）細菌を放出する病原性線虫、例えばヘテロラブディティダエ（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄａｅ）科及びステイネルネマティダエ（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｉｄａｅ）科の昆虫病原性線虫を介してＴｘｐ４０タンパク質が昆虫に送達される天然経路を模倣する。１つのグループは、オオハチミツガ（ｇｒｅａｔｅｒ ｗａｘ ｍｏｔｈ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）（Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｔｏｘｉｃｏｎ １５４：５９－７３）、作物有害生物でない昆虫及び多数のＣｒｙタンパク質に対して感受性の高いものを含む、多数の種類の殺虫性タンパク質に対して感受性の高い昆虫に対してのみＴｘｐ４０タンパク質の経口毒性を報告している。本発明は、ＦＡＷ害虫に対するＴｘｐ４０タンパク質の経口毒性について初めて知られた開示である。したがって、本発明は、Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質及びＴｘｐ４０タンパク質の変異体を使用して、ＦＡＷ有害生物集団を防除する新規の方法を提供する。本発明の新規の方法は、Ｃｒｙタンパク質及び／又はＶｉｐ３タンパク質などの他の昆虫防除剤に耐性があるか又は耐性になり得るＦＡＷ集団を防除するために特に有用である。

【0217】

したがって、ある実施形態において、本発明は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫を防除する方法であって、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫を、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなるＴｘｐ４０タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１に対してその全長にわたって少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。他の実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１、配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。他の実施形態において、本方法は、有効量の本発明のＴｘｐ４０タンパク質をスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫又はその環境に送達する、例えば経口的に送達するステップを含む。一般に、有効であるために、Ｔｘｐ４０タンパク質は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫によって経口摂取される。本発明のＴｘｐ４０タンパク質をスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に経口的に送達するための方法の例としては、限定はされないが、（１）トランスジェニック植物において（ここで、昆虫は、トランスジェニック植物の１つ又は複数の部分を食べ（摂取し）、それによりトランスジェニック植物において発現されるＴｘｐ４０ポリペプチドを摂取する）；（２）例えば昆虫の成長培地に適用又は取り込まれ得る配合されたタンパク質組成物において；（３）表面に適用され得る、例えば植物部位の表面にスプレーされ得る（これは、次に、昆虫がスプレーされた植物部位の１つ又は複数を食べたときに昆虫により摂取される）タンパク質組成物において；（４）餌基質において；又は（５）当技術分野において認められる任意の他のタンパク質送達系においてタンパク質を提供することが挙げられる。したがって、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫への経口送達のあらゆる方法を使用して、本発明の毒性タンパク質を送達することができる。いくつかの特定の実施形態では、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に経口的に送達され、例えば、ここで、昆虫は、本発明のトランスジェニック植物の１つ又は複数の部分を摂取する。さらなる実施形態において、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ、ＦＡＷ）である。

【0218】

他の実施形態において、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫、例えばツマジロクサヨトウ昆虫（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に経口的に送達され、ここで、昆虫は、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を含む組成物がスプレーされた植物の１つ又は複数の部分を摂取する。本発明の組成物の植物表面への送達は、化合物、組成物、配合物などを植物表面に適用するために、当業者に知られているあらゆる方法を用いて行うことができる。植物若しくはその部位に送達するか、又は植物若しくはその部位と接触させるいくつかの非限定的な例としては、スプレーイング、ダスティング、スプリンクリング、スキャッタリング、ミスティング、アトマイジング、ブロードキャスティング、浸漬、土壌注入、土壌混和、灌注（例えば、根、土壌処理）、ディッピング、注入、コーティング、葉又は茎浸潤、側方施肥又は種子処理など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。植物又はその部位を化合物、組成物又は配合物と接触させるためのこれら及び他の手順は、当業者によく知られている。

【0219】

さらなる実施形態において、本発明は、Ｃｒｙタンパク質及び／又は植物性殺虫性タンパク質、例えばＶｉｐ３に耐性があるＦＡＷ害虫又は有害生物集団を防除する方法であって、ＦＡＷ有害生物若しくは有害生物集団又はその環境に有効量の本発明のＴｘｐ４０タンパク質又は組成物を送達するステップを含む方法を提供する。ある実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。他の実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１に対してその全長にわたって少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。他の実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。他の実施形態において、Ｖｉｐ３は、Ｖｉｐ３Ａタンパク質である。他の実施形態において、Ｖｉｐ３Ａタンパク質は、トランスジェニックイベントＭＩＲ１６２を含むコーン植物において発現されるＶｉｐ３Ａａ２０タンパク質である。さらに他の実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｊ又はＣｒｙ２Ａタンパク質である。さらなる実施形態において、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質は、トランスジェニックイベントＴＣ１５０７を含むコーン植物において発現されるＣｒｙ１Ｆａタンパク質である。

【0220】

他の実施形態において、本発明は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫、例えばツマジロクサヨトウの集団において、トランスジェニック植物で発現されるＣｒｙタンパク質及び／又はＶｉｐ３タンパク質に対する耐性の発生を防止する方法を提供し、本方法は、Ｖｉｐ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はＣｒｙタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと；本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチド発現カセット又はベクターとを含むトランスジェニック植物を標的スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）集団に送達するステップを含む。他の実施形態において、Ｖｉｐ３タンパク質は、Ｖｉｐ３Ａタンパク質である。他の実施形態において、Ｖｉｐ３Ａタンパク質は、Ｖｉｐ３Ａａ２０タンパク質である。さらに他の実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｊ又はＣｒｙ２Ａタンパク質である。さらなる実施形態において、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質である。さらに他の実施形態において、トランスジェニック植物は、イベントＭＩＲ１６２及び／又はイベントＴＣ１５０７を含むコーン植物である。ある実施形態において、Ｔｘｐ４０タンパク質は、その全長にわたって配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。別の実施形態では、Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１、配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかのアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。上記の実施形態によれば、トランスジェニック植物は、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の育種スタック、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の分子スタック又はその両方の組合せを含むことができる。

【0221】

本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる変異体Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質も提供し、ここで、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ、ＦＡＷ）害虫に対する経口活性を有する。ある実施形態において、本発明の変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号２又は配列番号７４～１３６のいずれかのアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。

【0222】

ある実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較してアミノ酸置換を含む変異体Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較して、配列番号１のアミノ酸位置１０、１１、２６、３１、３８、４６、４８、４９、７３、７５、８６、９６、１０１、１０３、１１１、１１６、１１９、１３３、１３４、１４３、１５５、１６７、１６９、１７０、１８２、１８６、１８７、１９１、２００、２０８、２０９、２１０、２１３、２１７、２２１、２２６、２３８、２４０、２４７、２５０、２５２、２５６、２５７、２６３、２６５、２６６、２７１、２７５、２８４、２９３、２９６、３０５、３０８、３０９、３１１、３１３、３１５、３２０、３２６、３２８若しくは３３３又はこれらの任意の組合せに対応する位置でのアミノ酸置換を有する変異体Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質を提供する。

【0223】

ある実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較して、配列番号１のアミノ酸位置１１９及び／又は２１３に対応する位置でのアミノ酸置換を有する変異体Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質を提供する。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、アミノ酸位置１１９に対応する位置にＡを有し、且つ／又は配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応する位置にＡを有する。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１におけるＫ１１９Ａ及び／又はＫ２１３Ａ置換を有する。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１８、配列番号２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。

【0224】

ある実施形態において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較して、配列番号１のアミノ酸位置１１、１１９及び／又は２１３に対応する位置でのアミノ酸置換を有する変異体Ｔｘｐ４０殺虫性タンパク質を提供する。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置１１に対応する位置にＹを有し、配列番号１のアミノ酸位置１１９に対応するアミノ酸位置にＡを有し、且つ／又は配列番号１のアミノ酸位置２１３に対応するアミノ酸位置にＡを有する。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１であり、ここで、位置１１のアミノ酸Ｓは、Ｙで置換されており、位置１１９のアミノ酸Ｋは、Ａで置換されており、且つ／又は位置２１３のアミノ酸Ｋは、Ａで置換されている。他の実施形態において、変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。

【0225】

本発明のＴｘｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、種々の方法によって改変され得ることと、これらの改変は、天然に存在するＴｘｐ４０タンパク質によりコードされるものと異なるアミノ酸配列を有する変異体Ｔｘｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列をもたらし得ることとが認識される。Ｔｘｐ４０タンパク質は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約１７又は約２０までのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、配列番号１の１つ又は複数のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断及び挿入を含む種々の方法で変更され得る。このような操作の方法は、当技術分野において一般的に知られている。例えば、天然Ｔｘｐ４０タンパク質のアミノ酸配列変異体は、Ｔｘｐ４０タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける突然変異によって調製することができる。これは、突然変異誘発のいくつかの形態の１つにより又は定向進化において達成され得る。ある実施形態において、アミノ酸配列においてコードされる変化は、タンパク質の機能に対して実質的に影響を与えないであろう。このような変異体は、所望の殺虫活性を有し得る。他の実施形態において、得られた変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質と比較して、特にスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に対して増大された殺虫活性を有し得る。他の実施形態において、得られた変異体タンパク質は、合成変異体ポリヌクレオチドによってコードされる。さらに他の実施形態において、本発明のＴｘｐ４０タンパク質は、配列番号１１～７３のいずれかのヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる核酸分子によってコードされる。

【0226】

ある実施形態によれば、本発明は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）有害生物、特にツマジロクサヨトウに対して経口毒性のある本発明のＴｘｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる合成ポリヌクレオチドを提供し、ここで、ヌクレオチド配列は、トランスジェニック生物における発現のために最適化されたコドンを有する。他の実施形態において、トランスジェニック生物は、トランスジェニック細菌又はトランスジェニック植物である。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、トランスジェニックコーン植物である。多くの場合、微生物由来の遺伝子は、修飾することなく植物において高レベルで発現され得るが、植物において選択されないコドンを有する微生物ヌクレオチドにより、トランスジェニック植物における低発現が生じ得る。生きている生物は、コドン使用に対する特異的な選択性を有し、且つ本発明に記載されるヌクレオチド配列のコドンは、それによりコードされるアミノ酸を維持しながら、植物の選択性と一致するように変化され得ることが当技術分野において知られている。さらに、植物、例えばコーン植物における高発現は、少なくとも約３５のＧＣ含量又は少なくとも約４５、若しくは少なくとも約５０、若しくは少なくとも約６０のＧＣ含量を有するコード配列から達成可能であることが当技術分野において知られている。低ＧＣ含量を有する微生物ヌクレオチド配列は、植物において不十分に発現し得る。特定のヌクレオチド配列は、単子葉及び双子葉植物の両方の種において適切に発現され得るが、配列は、単子葉植物又は双子葉植物の特異的なコドン選択性及びＧＣ含量選択性を考慮する（これらの選択性は、異なることが示されているため）ように修飾され得る（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８（１９８９））。加えて、実施形態において、ヌクレオチド配列は、メッセージ切断を引き起こし得る非正統的なスプライス部位を除去するように修飾され得る。ヌクレオチド配列に対するこのような修飾は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ並びに例えば米国特許第５，６２５，１３６号明細書、同第５，５００，３６５号明細書及び同第６，０１３，５２３号明細書に記載される方法を使用する合成遺伝子構築の周知の技術を用いて行うことができる。本発明のある実施形態において、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列は、少なくとも５０、５５、６０又は少なくとも６５のＧＣ含量を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。さらに他の実施形態において、コドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号５又は配列番号１１～７３のいずれかのヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。当業者は、このようなＧＣ含量がいくつかの異なる方法で達成され得ることを認識するであろう。例えば、このような合成コード配列又はポリヌクレオチドは、米国特許第５，６２５，１３６号明細書に開示される手順に従って行われる。この手順では、トウモロコシに選択されるコドン、すなわちトウモロコシ内でそのアミノ酸最も頻繁にコードする単一のコドンが使用される。特定のアミノ酸に対してトウモロコシに選択されるコドンは、例えば、トウモロコシ由来の既知の遺伝子配列から得ることができる。例えば、トウモロコシ植物からの２８個の遺伝子に対するトウモロコシのコドン使用は、Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：４７７－４９８（１９８９）において見出される。１つの植物種における発現のために最適化されたコドンは、他の植物種でも機能し得るが、おそらくコドンが最適化された植物種と同レベルではないことが認識される。このようにして、任意の植物での発現のためにヌクレオチド配列を最適化することができる。ヌクレオチド配列の全て又は任意の部分が最適化又は合成され得ることが認識される。すなわち、ポリヌクレオチドは、一部が天然配列であり、一部がコドン最適化配列であるヌクレオチド配列を含み得る。

【0227】

本発明のある実施形態において、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫に対する殺虫活性を有するＴｘｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸分子に作動可能に連結されたプロモータを含むキメラ遺伝子が提供され、ここで、ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号３～５又は１１～７３のいずれかであるか；（ｂ）配列番号３～５又は１１～７３のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有するか；（ｃ）配列番号１、２又は７４～１３６のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか；（ｄ）配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか；又は（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して相補的である。

【0228】

ある実施形態において、核酸分子は、トウモロコシコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、プロモータは、植物発現性プロモータ、特にトウモロコシ植物において発現するプロモータである。例えば、限定はされないが、植物発現性プロモータは、ユビキチン、ケストルムイエローウィルス（ｃｅｓｔｒｕｍ ｙｅｌｌｏｗ ｖｉｒｕｓ）、コーンＴｒｐＡ、ＯｓＭＡＤＳ ６、トウモロコシＨ３ヒストン、バクテリオファージＴ３遺伝子９ ５’ ＵＴＲ、コーンスクロースシンテターゼ１、コーンアルコールデヒドロゲナーゼ１、コーン集光複合体、コーン熱ショックタンパク質、トウモロコシｍｔｌ、エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ、コメアクチン、コメシクロフィリン、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ、ペチュニアカルコンイソメラーゼ、マメグリシンリッチタンパク質１、ジャガイモパタチン、レクチン、ＣａＭＶ ３５Ｓ及びＳ－Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータからなるプロモータの群から選択することができる。

【0229】

双子葉植物に由来する多くのプロモータが単子葉植物において機能することが示されており、逆も同様であるが、実施形態では、双子葉植物プロモータが双子葉植物における発現のために、且つ単子葉植物プロモータが単子葉植物における発現のために選択される。しかしながら、選択されたプロモータの起源に制限はなく、それらが所望の細胞中のヌクレオチド配列の発現の促進において機能すれば十分である。

【0230】

プロモータの選択は、発現のための時間的及び空間的要件に応じて且つ形質転換される宿主細胞にも応じて異なり得る。したがって、例えば、本発明のヌクレオチド配列の発現は、任意の植物及び／又は植物部位内（例えば、葉内、柄又は茎内、雌穂内、花序（例えば、穂状花序、円錐花序、穂軸など）内、根、種子及び／又は苗内など）であり得る。例えば、特定の組織又は器官における発現が所望される場合、組織特異的又は組織選択プロモータを使用することができる（例えば、根特異的／選択プロモータ）。対照的に、刺激に応答する発現が所望される場合、刺激又は化学物質により誘導可能なプロモータを使用することができる。植物の細胞全体にわたって比較的一定のレベルの連続的な発現が所望される場合、構成的プロモータを使用することができる。

【0231】

本発明で有用なプロモータとしては、限定はされないが、構造的にヌクレオチド配列の発現を促すもの、誘導されると発現を促すもの及び組織特異的又は発生学的に特異的な方法で発現を促すものが挙げられる。これらの様々なタイプのプロモータが当技術分野において公知である。

【0232】

適切な構成的プロモータには、例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２，１９８５）；アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ａｔ６６６９プロモータ（ＰＣＴ公開国際公開第０４０８１１７３号を参照されたい）；トウモロコシＵｂｉ１（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９，１９９２）；コメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３－１７１，１９９０）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８，１９９１）；ＣａＭＶ １９Ｓ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ １００：４５６－４６２，１９９７）；ＧＯＳ２（ｄｅ Ｐａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２（６）：８３７－４４、１９９２）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９，１９９２）；コメシクロフィリン（Ｂｕｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５（５）：８３７－４３，１９９４）；トウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６－２８５，１９９２）；アクチン２（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０（１）；１０７－１２１，１９９６）、構成的根端ＣＴ２プロモータ（配列番号１５３５；ＰＣＴ出願イスラエル特許出願公開第２００５／０００６２７号も参照されたい）及びＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｐｅｒ ＭＡＳ（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６６１－７６，１９９５）が含まれる。他の構成的プロモータには、米国特許第５，６５９，０２６号明細書、同第５，６０８，１４９号明細書、同第５，６０８，１４４号明細書、同第５，６０４，１２１号明細書、同第５，５６９，５９７号明細書、同第５，４６６，７８５号明細書、同第５，３９９，６８０号明細書、同第５，２６８，４６３号明細書及び同第５，６０８，１４２号明細書のものが含まれる。

【0233】

植物、任意にトウモロコシにおける本発明のポリペプチドの発現に有用な組織特異的又は組織選択プロモータには、根、髄、葉又は花粉における発現を指示するものが含まれる。適切な組織特異的プロモータには、限定はされないが、葉特異的プロモータ（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２：２５５－２６５，１９９７；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：３５７－６７，１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：７７３－７７８，１９９４；Ｇｏｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：５０９－１８，１９９３；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：１１２９－１１３８，１９９３；及びＭａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９５８６－９５９０，１９９３によって記載されるものなど）、種子選択プロモータ（例えば、種子特異的遺伝子由来；Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５．１９１，１９８５；Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２２０２，１９８７；Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：６３３，１９９０）、ブラジルナッツアルブミン（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２３５－２４５，１９９２）、レグミン（Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０３－２１４，１９８８）、グルテリン（Ｔａｋａｉｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１５－２２，１９８６；Ｔａｋａｉｗａ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．２２１：４３－４７，１９８７）、ゼイン（Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１４３）．３２３－３２ １９９０）、ｎａｐＡ（Ｓｔａｌｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ １９９：５１５－５１９，１９９６）、コムギＳＰＡ（Ａｌｂａｎｉｅｔａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，９：１７１－１８４，１９９７）、ヒマワリオレオシン（Ｃｕｍｍｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：８７３－８７６，１９９２）］、胚乳特異的プロモータ（例えば、コムギＬＭＷ及びＨＭＷ、グルテニン－１（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１６：８１－９０，１９８９；ＮＡＲ １７：４６１－２）、コムギａ、ｂ及びｇグリアジン（ＥＭＢ０３：１４０９－１５，１９８４）、オオムギｌｔｒｌプロモータ、オオムギＢ１、Ｃ、Ｄホルデイン（Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ ９８：１２５３－６２，１９９９；Ｐｌａｎｔ Ｊ ４：３４３－５５，１９９３；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５０：７５０－６０，１９９６）、オオムギＤＯＦ（Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１１６（１）：５３－６２，１９９８）、Ｂｉｚ２（欧州特許第９９１０６０５６．７号明細書）、合成プロモータ（Ｖｉｃｅｎｔｅ－Ｃａｒｂａｊｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３：６２９－６４０，１９９８）、コメプロラミンＮＲＰ３３、コメ－グロブリンＧｌｂ－１（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３９（８）８８５－８８９，１９９８）、コメアルファ－グロブリンＲＥＢ／ＯＨＰ－１（Ｎａｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：５１３－Ｓ２２，１９９７）、コメＡＤＰ－グルコースＰＰ（Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ ６：１５７－６８，１９９７）、トウモロコシＥＳＲ遺伝子ファミリー（Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２３５－４６，１９９７）、ソルガム（ｓｏｒｇｕｍ）ガンマ－カフィリン（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２：１０２９－３５，１９９６）］、胚特異的プロモータ（例えば、コメＯＳＨ１；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：８１１７－８１２２）、ＫＮＯＸ（Ｐｏｓｔｍａ－Ｈａａｒｓｍａ ｏｆ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：２５７－７１，１９９９）、コメオレオシン（Ｗｕ ｅｔ ａｔ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２３：３８６，１９９８）］、花特異的プロモータ、例えばＡｔＰＲＰ４、カレン（ｃｈａｌｅｎｅ）シンターゼ（ｃｈｓＡ）（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，９５－１０９，１９９０）、ＬＡＴ５２（Ｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２１７：２４０－２４５；１９８９）、ａｐｅｔａｌａ－３並びに植物生殖組織に特異的なプロモータ（例えば、ＯｓＭＡＤＳプロモータ；米国特許出願公開第２００７／０００６３４４号明細書）が含まれる。

【0234】

緑色組織における選択発現に適したプロモータの例としては、光合成に関与する遺伝子を調節する多数のものが挙げられ、これらの多くは、単子葉植物及び双子葉植物の両方からクローニングされている。１つのこのようなプロモータは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子由来のトウモロコシＰＥＰＣプロモータである（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ＆Ｇｒｕｌａ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９－５８９（１９８９））。根特異的発現のための別のプロモータは、ｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ（ＦＥＢＳ ２９０：１０３－１０６（１９９１）又は米国特許第５，４６６，７８５号明細書）により記載されるものである。本発明において有用な別のプロモータは、米国特許第５，６２５，１３６号明細書に記載される、天然でトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を促す茎特異的プロモータである。

【0235】

さらに、プラスチドにおいて機能するプロモータが使用され得る。このようなプロモータの非限定的な例としては、バクテリオファージＴ３遺伝子９ ５’ ＵＴＲ及び米国特許第７，５７９，５１６号明細書に開示されている他のプロモータが挙げられる。本発明で有用な他のプロモータとしては、限定はされないが、Ｓ－Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータ及びＫｕｎｉｔｚトリプシン阻害遺伝子プロモータ（Ｋｔｉ３）が挙げられる。

【0236】

本発明のある実施形態において、誘導性プロモータが使用され得る。したがって、例えば、化学的に調節されたプロモータを用いて、外因性化学調節剤の適用によって植物における遺伝子の発現を調節することができる。化学的に調節されるプロモータによる本発明のヌクレオチド配列の発現の調節は、作物植物が誘導性化学物質で処理されるときのみ、本発明のポリペプチドが合成されることを可能にする。目的に応じて、プロモータは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する場合、化学物質誘導性プロモータであるか、又は化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合、化学物質抑制性プロモータであり得る。遺伝子発現の化学的誘導のためのこのような技術の例は、欧州特許出願公開第０３３２１０４号明細書及び米国特許５，６１４，３９５号明細書において詳述されている。

【0237】

化学物質誘導性プロモータが当技術分野において公知であり、これらとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２－２プロモータ、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモータ及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１ ａプロモータ（例えば、ＰＲ１ａシステム）、ステロイドステロイド応答性プロモータ（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１０４２１－１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４、２４７－２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモータを参照されたい）並びにテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモータ（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，２２９－２３７並びに米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書を参照されたく、Ｌａｃリプレッサシステムプロモータ、銅誘導性システムプロモータ、サリチレート誘導性システムプロモータ（例えば、ＰＲ１ａシステム）、グルココルチコイド誘導性プロモータ（Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：６０５－６１２）及びエクジソン誘導性システムプロモータが挙げられる。

【0238】

誘導性プロモータの他の非限定的な例としては、ＡＢＡ誘導性及び膨圧（ｔｕｒｇｏｒ）誘導性プロモータ、オーキシン結合タンパク質遺伝子プロモータ（Ｓｃｈｗｏｂ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：４２３－４３２）、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル－トランスフェラーゼプロモータ（Ｒａｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１９：１８５－１９７）、ＭＰＩプロティナーゼ阻害剤プロモータ（Ｃｏｒｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：１４１－１５０）及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１２９３－１２９８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：５５１－５６５；及びＱｕｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２９：４１２－４２１）が挙げられる。ベンゼンスルホンアミド誘導性（米国特許第５，３６４，７８０号明細書）及びアルコール誘導性（国際特許出願公開国際公開第９７／０６２６９号及び国際公開第９７／０６２６８号）システム及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼプロモータも含まれる。同様に、Ｇａｔｚ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：１６８－１７２及びＧａｔｚ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：８９－１０８に記載されている誘導性プロモータのいずれかを使用することができる。植物における本発明のヌクレオチド配列の発現を促すのに有用な他の化学的誘導性プロモータは、米国特許第５，６１４，３９５号明細書に開示されている。遺伝子発現による化学的誘導は、欧州特許出願公開第０ ３３２ １０４号明細書（Ｃｉｂａ－Ｇｅｉｇｙに付与された）及び米国特許第５，６１４，３９５号明細書でも詳述されている。

【0239】

本発明において有用なプロモータの別のカテゴリーは、創傷誘導性プロモータである。創傷部位において且つ植物病原体感染部位でも発現される多数のプロモータが記載されている。理想的には、このようなプロモータは、昆虫の侵入部位においてのみ局所的に活性でなければならず、このようにして、殺虫性タンパク質は、侵入害虫を死滅させるために殺虫性タンパク質を合成する必要がある細胞においてのみ蓄積する。この種のプロモータの例としては、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：２００－２０８（１９８９）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３－５８８（１９９３）、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１５１－１５８（１９８９）、Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ＆Ｌｅｈｌｅ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２：７８３－７９２（１９９３）、Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２：１２９－１４２（１９９３）及びＷａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：１９１－２０１（１９９３）によって記載されるものが挙げられる。

【0240】

作動可能であるように本発明のヌクレオチド配列と関連しているプロモータに加えて、本発明の発現カセットは、他の調節エレメントを含むこともできる。調節エレメントは、限定はされないが、エンハンサ、イントロン、翻訳リーダー配列、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル配列を含む。適切な転写ターミネータシグナルの例は、当技術分野において利用可能であり、知られている（例えば、ＣａＭＶ由来のｔｍｌ、ｒｂｃＳ由来のＥ９）。植物において機能することが知られている利用可能なターミネータは、いずれも本発明との関連において使用することができる。

【0241】

多数の他の配列を、本発明において記載されるキメラ遺伝子に組み込むことができる。これらには、イントロン配列（例えば、Ａｄｈｌ及びｂｒｏｎｚｅｌ由来）及びウイルスリーダー配列（例えば、ＴＭＶ、ＭＣＭＶ及びＡＭＶ由来）などの発現を高めることが示されている配列が含まれる。

【0242】

より効率的な翻訳の開始のために、開始メチオニンに隣接する配列が修飾され得る。例えば、これらは、植物において有効であることが知られている配列の包含によって修飾することができる。Ｊｏｓｈｉは、植物のために適切なコンセンサスを示唆しており（ＮＡＲ １５：６６４３－６６５３（１９８７））、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈは、さらなるコンセンサス翻訳イニシエータを示唆している（１９９３／１９９４カタログ、２１０ページ）。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用するのに適している。これらの配列は、ＡＴＧまで及びＡＴＧを含む（第２のアミノ酸は修飾されないままである）ヌクレオチド配列又は代替的にＡＴＧの次のＧＴＣまで及びＧＴＣを含む（導入遺伝子の第２のアミノ酸を修飾する可能性がある）ヌクレオチド配列を含む構築物に組み込まれる。

【0243】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドの発現を植物細胞内の特定の細胞部位に標的化することが望ましいことがある。場合により、サイトゾルにおける局在化が望ましいことがあるが、他の場合、いくつかの細胞内小器官における局在化が望ましいこともある。例えば、植物において遺伝子産物を標的化するための任意のメカニズムを用いて本発明を実施することができ、このようなメカニズムは、植物内に存在することが知られており、これらのメカニズムの機能を制御する配列は、いくらか詳細に特徴付けられている。遺伝子産物の他の細胞コンパートメントへの標的化を生じる配列が特徴付けられている。例えば、アミノ末端配列は、植物細胞の液胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、タンパク粒、小胞体、葉緑体、デンプン粒、アミロプラスト、アポプラスト又は細胞壁などの細胞コンパートメントへの対象のタンパク質の標的化に関与することができる（例えば、Ｕｎｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１３：４１１－４１８（１９８９）；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ．ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６５１２－６５１；米国特許第７，１０２，０５７号明細書；国際公開第２００５／０９６７０４号）。任意に、シグナル配列は、ｗａｘｙ由来のＮ末端シグナル配列、ガンマ－ゼイン由来のＮ末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、Ｃ末端デンプン結合ドメイン、成熟タンパク質を葉緑体に移入する葉緑体標的化配列（Ｃｏｍａｉ ｅｔ．ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１０４－１５１０９；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ，ｅｔ．ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：３５８－３６３；米国特許第５，６３９，９４９号明細書）又はアリューロン細胞由来の分泌シグナル配列（Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｈｏ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：７６９－７８３（１９９０））であり得る。さらに、カルボキシル末端配列と共に、アミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞標的化に関与しており、本発明と共に使用することができる（Ｓｈｉｎｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１４：３５７－３６８）。一実施形態において、選択されるシグナル配列は、既知の切断部位を含み、構築された融合物は、切断のために必要とされる切断部位の後の任意のアミノ酸を考慮に入れる。場合により、この必要性は、切断部位と導入遺伝子ＡＴＧとの間の少数のアミノ酸の付加又は代替的に導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸の置換によって満たされ得る。これらの構築技術は、当技術分野において周知であり、あらゆる細胞コンパートメントに同等に適用できる。

【0244】

細胞標的化のための上記のメカニズムは、標的化シグナルが由来するプロモータと異なる発現パターンを有するプロモータの転写調節下で特定の細胞標的化の目的を達成するように、その同族プロモータと共に利用できるだけでなく、異種プロモータと共に利用することもできることが認識されるであろう。

【0245】

本発明のキメラ遺伝子は、形質転換された植物、植物部位及び／又は植物細胞を選択するために使用され得る、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列も含み得る。好適な選択可能なマーカーの多くの例が当技術分野において公知であり、本明細書に記載される発現カセットに使用され得る。

【0246】

選択可能なマーカーの例としては、限定はされないが、カナマイシン、Ｇ４１８などに対する耐性を与える、ｎｅｏ又はｎｐｔＩＩをコードするヌクレオチド配列（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３－１８８）；ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ｂａｒをコードするヌクレオチド配列；グリホサートに対する耐性を与える、改変５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸（ＥＰＳＰ）シンターゼをコードするヌクレオチド配列（Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：９１５－９２２）；ブロモキシニルに対する耐性を与える、臭鼻菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）に由来するｂｘｎなどのニトリラーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４１９－４２３）；イミダゾリノン、スルホニル尿素又は他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を与える、改変アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードするヌクレオチド配列（欧州特許出願公開第１５４２０４号明細書）；メトトレキサート耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするヌクレオチド配列（Ｔｈｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２５００－１２５０８）；ダラポンに対する耐性を与える、ダラポンデハロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列；マンノースを代謝させる能力を与えるマンノース－６－リン酸イソメラーゼ（ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）とも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（米国特許第５，７６７，３７８号明細書及び同第５，９９４，６２９号明細書）；５－メチルトリプトファンに対する耐性を与える、改変アントラニル酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列；又はハイグロマイシンに対する耐性を与える、ｈｐｈをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。当業者は、本発明の発現カセットに使用するのに好適な選択可能なマーカーを選択することができる。

【0247】

さらなる選択可能なマーカーとしては、限定はされないが、それに対する様々な発色性基質が知られている酵素をコードするβ－グルクロニダーゼ又はｕｉｄＡ（ＧＵＳ）をコードするヌクレオチド配列；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する産物をコードするＲ遺伝子座ヌクレオチド配列（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ Ｒ－ｎｊ ａｌｌｅｌｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ－ｔａｇｇｉｎｇ ｗｉｔｈ Ａｃ”２６３－２８２ Ｉｎ：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，１８ｔｈ Ｓｔａｄｌｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ＆Ａｐｐｅｌｓ ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９８８））；それに対する様々な発色性基質が知られている酵素であるβ－ラクタマーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７３７－３７４１）；カテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥをコードするヌクレオチド配列（Ｚｕｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１１０１－１１０５）；凝集してメラニンを形成するＤＯＰＡ及びドーパキノンにチロシンを酸化することが可能な酵素であるチロシナーゼをコードするヌクレオチド配列（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３－２７１４）；それに対する発色性基質が存在する酵素であるβ－ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｘ）をコードするヌクレオチド配列（Ｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６－８５９）；カルシウム感受性生物発光検出に用いられ得るイクオリンをコードするヌクレオチド配列（Ｐｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２６：１２５９－１２６８）；又は緑色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列（Ｎｉｅｄｚ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：４０３－４０６）が挙げられる。当業者は、本発明の発現カセットに使用するのに好適な選択可能なマーカーを選択することができる。

【0248】

ある実施形態において、本発明のキメラ遺伝子は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質に加えて、他の所望の形質をコードするポリヌクレオチドも含むことができる。このような他のポリヌクレオチドの例としては、対象の他の所望の形質に対するポリペプチド又はｄｓＲＮＡをコードするものが挙げられる。「スタックされた」形質を含むこのような発現カセットは、例えば、スタックされた形質を有する所望の表現型を有する植物、植物部位又は植物細胞を作り出すために使用され得る（すなわち分子スタッキング）。植物におけるこのようなスタックされた組合せは、限定はされないが、任意の従来の方法による植物の交雑育種（すなわち育種スタック）を含む他の方法によって作り出すこともできる。植物を遺伝的に形質転換することによりスタックされる場合、対象のヌクレオチド配列は、いずれの時点でも且ついずれの順番でも組み合わせることができる。例えば、１つ又は複数の所望の形質を含むトランスジェニック植物は、次の形質転換によりさらなる形質を導入するための標的として使用することができる。付加的なヌクレオチド配列は、発現カセットの任意の組合せによって提供される本発明のヌクレオチド配列、核酸分子、核酸構築物又は組成物を用いる同時形質転換プロトコルにおいて同時に導入することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列を導入させる場合、これらは、別々のカセットに組み込まれ得る（トランス）か、又は同じカセットに組み込まれ得る（シス）。ポリヌクレオチドの発現は、同じプロモータ又は異なるプロモータによって促すことができる。さらに、ポリヌクレオチドは、部位特異的組換え系を用いて所望のゲノム位置においてスタックされ得ることが認識される。例えば、国際特許出願公開国際公開第９９／２５８２１号、国際公開第９９／２５８５４号、国際公開第９９／２５８４０号、国際公開第９９／２５８５５号及び国際公開第９９／２５８５３号を参照されたい。

【0249】

それぞれの実施形態において、キメラ遺伝子は、農業形質（例えば、主に種子会社、栽培者又は穀物加工会社にとって有益である農業形質）のために、対象の１つ又は複数のポリペプチド又は二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）に対する付加的なコード配列を含むこともできる。対象のポリペプチドは、対象のヌクレオチド配列によりコードされる任意のポリペプチドであり得る。植物における産生に適している対象のポリペプチドの非限定的な例としては、除草剤耐性（「除草剤耐容性」と呼ばれることもある）、ウィルス耐性、細菌性病原体耐性、昆虫耐性、線虫耐性又は真菌耐性などの農学的に重要な形質をもたらすものが挙げられる。例えば、米国特許第５，５６９，８２３号明細書、同第５，３０４，７３０号明細書、同第５，４９５，０７１号明細書、同第６，３２９，５０４号明細書及び同第６，３３７，４３１号明細書を参照されたい。実施形態において、対象のポリペプチドは、植物の成長力若しくは収穫量（異なる温度、土壌条件並びに日光及び降水のレベルにおいて植物を成長させる形質を含む）を増大させるもの又は対象の形質（例えば、選択可能なマーカー、種皮色など）を示す植物の同定を可能にするものであり得る。種々の対象のポリペプチド及びこれらのポリペプチドを植物に導入するための方法は、例えば、米国特許第４，７６１，３７３号明細書、同第４，７６９，０６１号明細書、同第４，８１０，６４８号明細書、同第４，９４０，８３５号明細書、同第４，９７５，３７４号明細書、同第５，０１３，６５９号明細書、同第５，１６２，６０２号明細書、同第５，２７６，２６８号明細書、同第５，３０４，７３０号明細書、同第５，４９５，０７１号明細書、同第５，５５４，７９８号明細書、同第５，５６１，２３６号明細書、同第５，５６９，８２３号明細書、同第５，７６７，３６６号明細書、同第５，８７９，９０３号明細書、同第５，９２８，９３７号明細書、同第６，０８４，１５５号明細書、同第６，３２９，５０４号明細書及び同第６，３３７，４３１号明細書並びに米国特許出願公開第２００１／００１６９５６号明細書に記載されている。ワールドワイドウェブ上のｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／も参照されたい。

【0250】

イミダザリノン又はスルホニル尿素など、成長点又は分裂組織を阻害する除草剤に対する耐性／耐容性を付与するポリヌクレオチドも本発明のある実施形態において適切であり得る。このカテゴリー内の例示的なポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第５，７６７，３６６号明細書及び同第５，９２８，９３７号明細書に記載されるように、突然変異体ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。米国特許第４，７６１，３７３号明細書及び同第５，０１３，６５９号明細書は、種々のイミダザリノン又はスルホンアミド除草剤に耐性がある植物に関する。米国特許第４，９７５，３７４号明細書は、ＧＳを阻害することが知られている除草剤、例えばホスフィノトリシン及びメチオニンスルホキシミンによる阻害に耐性がある突然変異体グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする核酸を含有する植物細胞及び植物に関する。米国特許第５，１６２，６０２号明細書は、シクロヘキサンジオン及びアリールオキシフェノキシプロパン酸除草剤による阻害に耐性がある植物を開示する。耐性は、改変されたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Ａｃｃａｓｅ）によって付与される。

【0251】

グリホサートに対する耐性を付与するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも本発明に適している。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号明細書及び米国特許第４，７６９，０６１号明細書を参照されたい。米国特許第５，５５４，７９８号明細書には、トランスジェニックグリホサート耐性トウモロコシ植物が開示されており、その耐性は、改変された５－エノールピルビル－３－ホスホシキメート（ＥＰＳＰ）シンターゼ遺伝子により付与される。

【0252】

グルホシネートアンモニウム又はホスフィノトリシンなどのホスホノ化合物及びピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンに対する耐性をコードするポリヌクレオチドも適している。欧州特許出願公開第０２４２２４６号明細書を参照されたい。米国特許第５，８７９，９０３号明細書、同第５，２７６，２６８号明細書及び同第５，５６１，２３６号明細書も参照されたい。

【0253】

他の適切なポリヌクレオチドには、トリアジン及びベンゾニトリル（ニトリラーゼ）などの光合成を阻害する除草剤に対する耐性をコードするものが含まれる。米国特許第４，８１０，６４８号明細書を参照されたい。除草剤耐性をコードする付加的な適切なポリヌクレオチドには、２，２－ジクロロロピオン酸、セトキシジム、ハロキシホップ、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ｓ－トリアジン除草剤及びブロモキシニルに対する耐性をコードするものが含まれる。プロトックス酵素に対する耐性を付与するか、或いは植物病害に対する耐性の増強；限定はされないが、干ばつ、過度の寒気、過度の熱若しくは過度の土壌塩分又は極端な酸性度若しくはアルカリ度を含む、不利な環境条件（非生物的ストレス）の耐容性の増強；及び発育のタイミングの変化を含む、植物の構造又は発育の変化を提供するポリヌクレオチドも適切である。例えば、米国特許出願公開第２００１／００１６９５６号明細書及び米国特許第６，０８４，１５５号明細書を参照されたい。

【0254】

付加的な適切なポリヌクレオチドには、殺有害生物性（例えば、殺虫性）ポリペプチドをコードするものが含まれる。これらのポリペプチドは、例えば、害虫を防除するために十分な量（すなわち昆虫防除量）で産生され得る。実施形態において、ポリペプチドは、鱗翅目活性、鞘翅目活性、半翅目活性及び／又は双翅目活性ポリペプチド又はこれらの任意の組合せである。昆虫又は他の有害生物を防除するために必要な殺有害生物性ポリペプチドの植物中の産生量は、栽培品種、有害生物の種類、環境因子などに応じて異なり得ることが認識される。付加的な昆虫又は有害生物耐性のために有用なポリヌクレオチドには、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）生物において同定された毒素をコードするものが含まれる。いくつかの亜種からのバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）Ｃｒｙタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがクローニングされており、組換えクローンは、鱗翅目、双翅目及び鞘翅目の昆虫の幼虫に対して毒性のあることが見出されている。このようなＢｔ殺虫性タンパク質の例としては、Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９ＣなどのＣｒｙタンパク質及びＶｉｐ１、Ｖｉｐ２、Ｖｉｐ３などの植物性殺虫性タンパク質並びに上記のＢｔ殺虫性タンパク質の任意の組合せが挙げられる。Ｂｔ由来のタンパク質の完全なリストは、サセックス大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｓｓｅｘ）により維持されるバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｔｏｘｉｎ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅにおいてワールドワイドウェブ上で見出すことができる（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７－８１３も参照されたい）。

【0255】

実施形態において、付加的なポリペプチドは、限定はされないが、アルファ－アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、パタチン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ウレアーゼ、アルファ－アミラーゼ阻害剤、細孔形成タンパク質、キチナーゼ、レクチン、改変抗体又は抗体断片、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）殺虫性タンパク質、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）種（例えば、Ｘ．ネマトフィラ（Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）又はＸ．ボビエニイ（Ｘ．ｂｏｖｉｅｎｉｉ））殺虫性タンパク質、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種（例えば、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）又はＰ．アシムビオティカ（Ｐ．ａｓｙｍｏｂｉｏｔｉｃａ））殺虫性タンパク質、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｂ．ラテロスポルス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓ））殺虫性タンパク質、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｌ．スファエリクス（Ｌ．ｓｐｈｅａｒｉｃｕｓ））殺虫性タンパク質、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、Ｃ．スブツガエ（Ｃ．ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）又はＣ．ピスキナエ（Ｃ．ｐｉｓｃｉｎａｅ））殺虫性タンパク質、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種（例えば、Ｙ．エントモファガ（Ｙ．ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ））殺虫性タンパク質、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｐ．プロピラエア（Ｐ．ｐｒｏｐｙｌａｅａ））殺虫性タンパク質、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（例えば、Ｃ．ビフェルメンタンス（Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））殺虫性タンパク質、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））及びリグニンを含む、非Ｂｔ起源から得られる殺虫性ポリペプチドである。

【0256】

植物における産生に適したポリペプチドには、例えば、炭水化物含量若しくは分布の増大若しくは変更、発酵特性の改善、油含量の増大、タンパク質含量の増大、消化性の改善及び栄養含量の増大、例えばフィトステロール含量の増大、トコフェロール含量の増大、スタノール含量の増大又はビタミン含量の増大を含む、商業的に有用な産物への収穫植物又は植物部位の転換を改善するか又は他に促進するものがさらに含まれる。対象のポリペプチドには、例えば、収穫作物中の不要な成分、例えばフィチン酸又は糖分解酵素の含量の低下をもたらすか又はそれに寄与するものも含まれる。「もたらす」又は「寄与する」とは、対象のポリペプチドが対象の形質の存在に直接又は間接的に寄与すること（例えば、異種セルラーゼ酵素の使用によるセルロース分解の増大）が意図される。

【0257】

ある実施形態において、ポリペプチドは、食物又は飼料の消化性の改善に寄与する。キシラナーゼは、植物細胞壁の分解を改善するヘミセルロース分解酵素であり、これにより動物が植物栄養素をよりよく利用できるようになる。これは、成長速度及び飼料転換率の改善をもたらす。キシランを含有する飼料の粘度も低減され得る。植物細胞におけるキシラナーゼの異種産生も工業加工におけるリグノセルロースの発酵性糖への転換を促進することができる。

【0258】

真菌及び細菌性微生物由来の多数のキシラナーゼが同定され、特徴付けされている（例えば、米国特許第５，４３７，９９２号明細書；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ ＴＲＩＣＥＬ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ”Ｅｓｐｏｏ；Ｓｏｕｍｉｎｅｎ ａｎｄ Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ，ｅｄｓ．（１９９３）Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１２５－１３５；米国特許出願公開第２００５／０２０８１７８号明細書；及びＰＣＴ公開国際公開第０３／１６６５４号を参照されたい）。特に、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）において３つの特異的キシラナーゼ（ＸＹＬ－Ｉ、ＸＹＬ－ＩＩ及びＸＹＬ－ＩＩＩ）が同定されている（Ｔｅｎｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：５６６；Ｔｏｒｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４６１；及びＸｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：７１８）。

【0259】

他の実施形態において、本発明のために有用なポリペプチドは、多糖分解酵素であり得る。このような酵素を産生する本発明の植物は、例えば、生物学的加工のための発酵原料を生成するために有用であり得る。ある実施形態において、発酵プロセスに有用な酵素には、アルファアミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、粒状デンプン加水分解酵素及び他のグルコアミラーゼが含まれる。

【0260】

多糖分解酵素には、デンプン分解酵素、例えばアルファ－アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、グルクロニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３１）；エキソ－１，４－アルファ－Ｄグルカナーゼ、例えばアミログルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、ベータ－アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、アルファ－グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）及び他のエキソ－アミラーゼ；デンプン脱分枝酵素、例えばａ）イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）など；ｂ）セルラーゼ、例えばエキソ－１，４－３－セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、エキソ－１，３－ベータ－Ｄ－グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．３９）、ベータ－グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）；ｃ）Ｌ－アラビナーゼ、例えばエンド－１，５－アルファ－Ｌ－アラビナーゼ（ＥＣ３．２．１．９９）、アルファ－アラビノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）など；ｄ）ガラクタナーゼ、例えばエンド－１，４－ベータ－Ｄ－ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）、エンド－１，３－ベータ－Ｄ－ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．９０）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）など；ｅ）マンナナーゼ、例えばエンド－１，４－ベータ－Ｄ－マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）、ベータ－マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）、アルファ－マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）など；ｆ）キシラナーゼ、例えばエンド－１，４－ベータ－キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、ベータ－Ｄ－キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）、１，３－ベータ－Ｄ－キシラナーゼなど；並びにｇ）他の酵素、例えばアルファ－Ｌ－フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５１）、アルファ－Ｌ－ラムノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．４０）、レバナーゼ（ＥＣ３．２．１．６５）、イヌラナーゼ（ｉｎｕｌａｎａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．７）などが含まれる。一実施形態において、アルファ－アミラーゼは、米国特許８，０９３，４５３号明細書に記載される合成アルファ－アミラーゼＡｍｙ７９７Ｅである。

【0261】

本発明と共に使用され得るさらなる酵素には、プロテアーゼ、例えば真菌及び細菌プロテアーゼが含まれる。真菌プロテアーゼには、限定はされないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）及びＭ．ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）から得られるものが含まれる。ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）酵素（ＥＣ３．２．１．９１）であり得る。一実施形態において、セロビオヒドロラーゼ酵素は、ＣＢＨ１又はＣＢＨ２であり得る。

【0262】

本発明と共に有用な他の酵素には、限定はされないが、ヘミセルラーゼ、例えばマンナーゼ及びアラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；リグニナーゼ；リパーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、グルコースオキシダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、アルファ１，６グルコシダーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）；エステラーゼ、例えばフェルラ酸エステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）及びアセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７２）；並びにクチナーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７４）が含まれる。

【0263】

本発明と共に有用な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子には、限定はされないが、標的有害生物（例えば、昆虫）遺伝子を抑制するものが含まれる。実施形態において、ｄｓＲＮＡは、鱗翅目、鞘翅目、半翅目若しくは双翅目の害虫又は上記のものの任意の組合せの遺伝子を標的とする。本明細書で使用される場合、「遺伝子抑制」という語は、まとめると、ｍＲＮＡへの遺伝子転写及びその後のｍＲＮＡの翻訳の結果として産生されるタンパク質のレベルを低下させるための周知の方法のいずれかを指すことが意図される。遺伝子抑制は、転写後遺伝子抑制及び転写抑制を含む、遺伝子又はコード配列からのタンパク質発現の低下を意味することも意図される。転写後遺伝子抑制は、抑制の標的とされる遺伝子又はコード配列から転写されるｍＲＮＡの全て又は一部と、抑制に使用される対応する二本鎖ＲＮＡとの間の相同性によって媒介されるものであり、リボソームによる結合のために細胞内で利用可能なｍＲＮＡの量の実質的及び測定可能な低下を指す。転写されたＲＮＡは、いわゆる同時抑制をもたらすためのセンス配向、いわゆるアンチセンス抑制をもたらすためのアンチセンス配向又はいわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をもたらためのｄｓＲＮＡを生じる両方の配向であり得る。転写の抑制は、いわゆるプロモータトランス抑制をもたらすためのプロモータＤＮＡ配列又はその補体に対して実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ、遺伝子抑制剤の細胞内の存在によって媒介される。遺伝子抑制は、例えば、天然遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの低下を有するか、又は影響される代謝産物のレベルの向上若しくは低下を有する植物を提供するために、形質に関連する天然の植物遺伝子に対して有効であり得る。遺伝子抑制は、特に、有害生物の細胞において１つ又は複数の相同又は相補的配列の発現を阻害又は抑制するように設計された遺伝子抑制剤を含有する植物材料を摂取し得るか、又はそれと接触し得る植物有害生物内の標的遺伝子に対しても有用であり得る。抑制の標的とされるこのような遺伝子は、筋肉形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節及び輸送、消化酵素合成、細胞膜電位の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感知、触角形成、翅形成、脚形成、発達及び分化、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸並びにアポトーシスからなる群からその予測機能が選択される必須タンパク質をコードすることができる。

【0264】

ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ベクターをさらに含むか、それから本質的になるか又はそれからなることができる。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド及び発現カセットは、ベクター内に含まれる。植物及び他の生物の形質転換において使用するためのベクターは、当技術分野でよく知られている。ベクターの一般的な種類の非限定的な例としては、プラスミド、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミド、バクテリオファージ、人工染色体又はウイルスベクターが挙げられる。実施形態において、ベクターは、例えば、植物の形質転換において使用するための植物ベクターである。実施形態において、ベクターは、例えば、細菌の形質転換において使用するための細菌ベクターである。植物、細菌及び他の生物に適したベクターは、当技術分野において知られている。

【0265】

本発明は、本発明のポリヌクレオチド、核酸分子、発現カセット、ベクター又はポリペプチドを含むトランスジェニック非ヒト宿主細胞も包含する。トランスジェニック非ヒト宿主細胞は、限定はされないが、植物細胞（単子葉植物細胞及び／又は双子葉植物細胞を含む）、酵母細胞、細菌細胞又は昆虫細胞を含むことができる。したがって、ある実施形態において、本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィルス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）又はアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）から選択される細菌細胞を提供する。したがって、例えば生物学的昆虫防除剤として、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質は、それをコードするポリヌクレオチドの細菌細胞における発現によって産生され得る。例えば、ある実施形態において、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞が提供される。

【0266】

ある実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞又は単子葉植物細胞である。付加的な実施形態において、双子葉植物細胞は、ダイズ細胞、ヒマワリ細胞、トマト細胞、アブラナ科作物（ｃｏｌｅ ｃｒｏｐ）細胞、綿細胞、サトウダイコン細胞又はタバコ細胞である。さらなる実施形態において、単子葉植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、オートムギ細胞、コメ細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞又はコムギ細胞である。実施形態において、本発明は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を発現するポリヌクレオチドを含む複数の双子葉植物細胞又は単子葉植物細胞を提供する。他の実施形態において、複数の細胞は、並置されてアポプラストを形成し、太陽光の下で成長される。他の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、植物全体を再生することができない。

【0267】

本発明のある実施形態において、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質は、より高等生物、例えば植物において発現される。ある実施形態において、植物は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）有害生物によって外寄生され得、特にツマジロクサヨトウによって外寄生され得る。他の実施形態において、ツマジロクサヨトウによって外寄生され得る植物は、コーン植物である。この場合、有効量のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物は、少なくともスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）有害生物、特にツマジロクサヨトウからそれ自体を保護する。昆虫がこのようなトランスジェニック植物を餌にし始めると、昆虫は、発現されたＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を摂取する。これは、昆虫が植物組織をさらにかじることを阻むか、又はさらに昆虫を害するか若しくは死滅させ得る。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、発現カセットに挿入され、これは、次に、植物のゲノムに安定に組み込まれる。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、非病原性の自己再生ウィルス内に含まれる。

【0268】

本発明のある実施形態において、本発明の核酸分子又はポリペプチドを含むトランスジェニック植物細胞は、限定はされないが、根、葉、種子、花、果実、花粉の細胞、器官若しくは植物培養物など、又はカルス細胞若しくは培養物を含む、植物部位、植物器官又は植物培養物（それぞれ本明細書に記載される）の細胞である。

【0269】

本発明に従うトランスジェニック植物又は植物細胞は、単子葉又は双子葉植物又は植物細胞であり得、限定はされないが、コーン（トウモロコシ）、ダイズ、コメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、サトウダイコン、綿、サトウキビ、アブラナ、アルファルファ、タバコ、ピーナツ、野菜（サツマイモ、マメ、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ニンジン、ナス、キュウリ、ダイコン、ホウレンソウ、ジャガイモ、トマト、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、メロン、コショウ、セロリ、カボチャ、パンプキン、ズッキーニなどを含む）、果実（リゴン、セイヨウナシ、マルメロ、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナなどを含む）、特殊植物若しくは植物細胞（例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））又は木材植物若しくは植物細胞（例えば、針葉樹及び／又は落葉樹）を含む。実施形態において、本発明の植物又は植物細胞は、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナ植物又は植物細胞などの作物植物又は植物細胞である。

【0270】

本発明は、本発明のトランスジェニック植物の部位を提供する。任意に、植物部位は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質及び／又はそれをコードする核酸をさらに含む。

【0271】

本発明は、本発明のトランスジェニック植物の種子又は本発明のトランスジェニック植物を生じる種子をさらに提供する。任意に、種子は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質及び／又はそれをコードする核酸を含む。

【0272】

本発明の付加的な実施形態には、本発明のトランスジェニック植物、植物部位又は種子から生産される収穫産物及び収穫産物から生産される加工産物が含まれる。収穫産物は、本明細書に記載されるように、植物全体又は任意の植物部位であり得る。したがって、ある実施形態において、収穫産物の非限定的な例としては、種子、果実、花又はその一部（例えば、葯、柱頭など）、葉、茎などが挙げられる。他の実施形態において、加工産物には、限定はされないが、本発明の収穫種子又は他の植物部位から生産される花、粗びき粉、油、デンプン、穀物などが含まれる。任意に、収穫産物又は加工産物は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質及び／又はそれをコードする核酸を含む。

【0273】

他の実施形態において、本発明は、本発明のトランスジェニック植物、植物部位からの抽出物を提供し、任意に、抽出物は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質及び／又はそれをコードする核酸を含む。植物又は植物部位からの抽出物は、当技術分野において周知の手順に従って作製することができる（ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ，Ａｇｒｉｃ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２（１）：８４－８９（２００４）；Ｇｕｉｄｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（９）：１７７２－１７７３（１９９４）；Ｌｉｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．Ｉｍｍｕｎ．１２：１５３－１６４（２０００）を参照されたい）。

【0274】

キメラ殺虫性タンパク質は、植物部位、植物細胞、植物器官、種子、収穫産物、加工産物又は抽出物などにおいて昆虫防除剤として機能することができる。換言すると、キメラ殺虫性タンパク質は、それがトランスジェニック植物内で有していた殺虫機能を実施し続けることができる。核酸は、キメラ殺虫性タンパク質を発現する機能を果たすことができる。本発明の殺虫性タンパク質をコードすることの代替として、核酸は、本発明のトランスジェニック植物部位、植物細胞、植物器官、種子、収穫産物、加工産物又は抽出物を同定する機能を果たすことができる。

【0275】

実施形態において、本発明のトランスジェニック植物、植物部位、植物細胞、植物器官又は種子は、本発明のポリヌクレオチド又は発現カセットに対してヘミ接合である。実施形態において、本発明のトランスジェニック植物、植物部位、植物細胞、植物器官又は種子は、本発明のポリヌクレオチド又は発現カセットに対してホモ接合である。

【0276】

実施形態において、トランスジェニック植物、植物部位、植物細胞、植物器官、種子、収穫産物、加工産物又は抽出物は、本発明の殺虫性タンパク質をコードする核酸を含まない適切な対照と比較して、１つ又は複数の害虫（例えば、ツマジロクサヨトウなどの鱗翅目有害生物）に対する耐性が増大されている。

【0277】

植物を形質転換するための手順は、当技術分野においてよく知られており、ルーチン的であり、文献全体にわたって記載されている。植物の形質転換のための方法の非限定的な例には、細菌媒介性核酸送達（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による）、ウィルス媒介性核酸送達、炭化ケイ素又は核酸ウィスカ媒介性核酸送達、リポソーム媒介性核酸送達、マイクロインジェクション、微粒子衝撃、リン酸カルシウム媒介性形質転換、シクロデキストリン媒介性形質転換、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介性形質転換、音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介性核酸取込み及び植物細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）又は生物学的メカニズム（その任意の組合せを含む）による形質転換が含まれる。当技術分野において既知の種々の植物形質転換法の全般的な案内には、Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３）、ｐａｇｅｓ ６７－８８）及びＲａｋｏｗｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：８４９－８５８（２００２））が含まれる。

【0278】

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の場合、少なくとも１つのＴ－ＤＮＡ境界配列を担持するバイナリーベクター又はベクターが一般的に適しているが、遺伝子直接導入（例えば、粒子衝撃など）の場合、任意のベクターが適しており、対象の構築物のみを含む線状ＤＮＡを使用することができる。遺伝子直接導入の場合、単一のＤＮＡ種による形質転換又は同時形質転換を使用することができる（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１０９３－１０９６（１９８６））。遺伝子直接導入及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性導入の両方について、形質転換は、通常（必ずしもそうとは限らないが）、正の選択であり得る選択可能なマーカー（例えば、ホスホマンノースイソメラーゼ）と共に行われ、これは、抗生物質（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサート）又は除草剤（例えば、グリホサート又はグルホシネート）に対する耐性を提供する。しかしながら、選択可能なマーカーの選択は、本発明にとって重要ではない。

【0279】

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換は、その高い形質転換効率のために且つ多数の異なる種に対するその汎用性のために、植物を形質転換するために一般的に使用される方法である。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換は、通常、共存するＴｉプラスミド上又は染色体上のいずれかで宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株によって担持されるｖｉｒ遺伝子の補体に依存し得る、適切なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株への、対象の外来性ＤＮＡを担持するバイナリーベクターの導入を伴う（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：１５９－１６９）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）への導入は、組換えバイナリーベクターを担持するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に動員することができるプラスミドを担持するヘルパーＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いる三系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）手順によって達成することができる。代替的に、組換えバイナリーベクターは、核酸形質転換によってアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に導入され得る（Ｈｏｅｆｇｅｎ＆Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９８７７）。

【0280】

双子葉植物及び単子葉植物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて形質転換され得る。コメのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換のための方法には、コメの形質転換のための周知の方法、例えば以下のいずれかにおいて記載されるものが含まれる：欧州特許出願公開第１１９８９８５号明細書、Ａｌｄｅｍｉｔａ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ（Ｐｌａｎｔａ １９９：６１２－６１７，１９９６）；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２（３）：４９１－５０６，１９９３）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ ６（２）：２７１－２８２，１９９４）（これらの開示は、完全に明記されたかのように参照によって本明細書中に援用される）。コーンの形質転換の場合、好ましい方法は、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（６）：７４５－５０，１９９６）又はＦｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９（１）：１３－２２，２００２）のいずれかに記載される通りである（これらの開示は、完全に明記されたかのように参照によって本明細書中に援用される）。前記方法は、例として、Ｂ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）１２８－１４３及びＰｏｔｒｙｋｕｓ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）２０５－２２５）においてさらに記載される。発現される核酸又は構築物は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を形質転換するのに適したベクター、例えばｐＢｉｎ１９にクローニングされる（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１９８４）８７１１）。このようなベクターによって形質転換されたアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、次に、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のようなモデルとして使用される植物又は例として、タバコ植物などの作物植物などの植物の形質転換のために、例えば傷ついた葉又は刻んだ葉をアグロバクテリア溶液に浸漬し、次にこれらを適切な培地中で培養することにより、既知の方法で使用することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた植物の形質転換は、例えば、Ｈａｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８８）１６，９８７７によって記載されているか、又は特にＦ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ；ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｐｐ．１５－３８から知られている。

【0281】

組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物の形質転換は、通常、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、植物からの外植片との共培養を伴い、当技術分野において周知の方法に従う。形質転換組織は、バイナリープラスミドのＴ－ＤＮＡ境界間に抗生物質又は除草剤耐性マーカーを担持する選択培地において再生される。

【0282】

前述のように、植物、植物部位及び植物細胞を形質転換するための別の方法は、不活性又は生物活性粒子を植物組織及び細胞に推進させることを伴う。例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，０３６，００６号明細書及び同第５，１００，７９２号明細書を参照されたい。一般に、この方法は、細胞の外表面を貫通させ、その内部への取込みを提供するのに有効な条件下で不活性又は生物活性粒子を植物細胞に推進させることを伴う。不活性粒子が利用される場合、対象の核酸を含有するベクターで粒子をコーティングすることにより、ベクターは、細胞内に導入され得る。代替的に、粒子の通った跡によりベクターが細胞内に運び込まれるように、１つ又は複数の細胞は、ベクターにより包囲され得る。生物活性粒子（例えば、導入が求められる１つ又は複数の核酸をそれぞれ含有する乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）も植物組織内に推進され得る。

【0283】

他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、プラスチドゲノムに直接形質転換され得る。プラスチド形質転換の大きい利点は、プラスチドが一般に実質的に修飾することなく細菌遺伝子を発現する能力があり、且つプラスチドが単一のプロモータの制御下で多数のオープンリーディングフレームを発現する能力があることである。プラスチド形質転換技術は、米国特許第５，４５１，５１３号明細書、同第５，５４５，８１７号明細書及び同第５，５４５，８１８号明細書、ＰＣＴ出願国際公開第９５／１６７８３号並びにＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，７３０１－７３０５において広く記載されている。葉緑体の形質転換のための基本的な技術は、例えば、バイオリステック又はプロトプラスト形質転換（例えば、塩化カルシウム又はＰＥＧ媒介性形質転換）を用いて、対象の遺伝子と一緒に選択可能なマーカーに隣接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を適切な標的組織に導入することを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる１～１．５ｋｂの隣接領域は、プラスチドゲノムによる相同組換えを促進し、したがってプラストームの特定領域の置換又は修飾を可能にする。最初に、スペクチノマイシン又はストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡ及びｒｐｓ１２遺伝子における点突然変異を形質転換のための選択可能なマーカーとして利用することができる（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，８５２６－８５３０；Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４，３９－４５）。これらのマーカー間のクローニング部位の存在により、外来遺伝子の導入のためのプラスチド標的化ベクターの作製が可能になる（Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２，６０１－６０６）。形質転換頻度の実質的な増大は、劣性ｒＲＮＡ又はｒ－タンパク質抗生物質耐性遺伝子を、優性の選択可能なマーカー、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド－３’－アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌ａａｄＡ遺伝子で置換することにより得ることができる（Ｓｖａｂ，Ｚ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，９１３－９１７）。これまで、このマーカーは、緑藻クラミドモナス・ラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のプラスチドゲノムの高頻度形質転換のために問題なく使用されてきた（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ－Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｍ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０８３－４０８９）。プラスチド形質転換に有用な他の選択可能なマーカーは、当技術分野において知られており、本発明の範囲内に包含される。通常、ホモプラスチド（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｉｄｉｃ）状態に達するために、形質転換後、約１５～２０の細胞分裂周期が必要とされる。各植物細胞中に存在する環状プラスチドゲノムの数千のコピーの全てに相同組換えによって遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、核発現遺伝子を上回る膨大なコピー数の利点を利用して、可溶性植物タンパク質全体の１０を容易に超えることができる発現レベルを可能にする。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、プラスチド標的化ベクターに挿入され、所望の植物宿主のプラスチドゲノムに形質転換され得る。したがって、本発明のヌクレオチド配列を含有するプラスチドゲノムにホモプラスチックな植物を得ることができ、これは、ポリヌクレオチドの高発現が可能である。

【0284】

形質転換されたトランスジェニック植物、植物細胞又は植物組織培養物を選択する方法は、当技術分野においてルーチン的であり、本明細書に提供される本発明の方法において使用することができる。例えば、本発明の組換えベクターは、形質転換された植物、植物部位又は植物細胞を選択するために使用され得る、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むこともできる。

【0285】

さらに、当技術分野においてよく知られているように、無傷のトランスジェニック植物は、様々な既知の技術のいずれかを用いて、形質転換された植物細胞、植物組織培養物又は培養プロトプラストから再生させることができる。植物細胞、植物組織培養物又は培養プロトプラストからの植物の再生は、例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｖｏｌ．１，ＭａｃＭｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３））及びＶａｓｉｌ Ｉ．Ｒ．（ｅｄ．）（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｖｏｌ．Ｉ（１９８４）、ａｎｄ Ｖｏｌ．ＩＩ（１９８６））に記載されている。

【0286】

さらに、上記の本発明のトランスジェニック種子及び植物、植物部位又は植物細胞内に設計された遺伝的特性は、有性生殖又は栄養成長によって伝えることができ、したがって子孫植物において維持及び増殖され得る。一般に、維持及び繁殖は、収穫、播種又は耕耘などの特定の目的に適合させるために開発された既知の農学的方法を使用する。

【0287】

したがって、ポリヌクレオチドは、上記のように、当技術分野において周知の任意の数の方法で植物、植物部位又は植物細胞に導入され得る。したがって、１つ又は複数のポリヌクレオチドを植物に導入するための特定の方法に依存するのではなく、１つ又は複数のポリヌクレオチドが植物のゲノムに安定に組み込まれることを可能にする任意の方法を使用することができる。２つ以上のポリヌクレオチドが導入される場合、それぞれのポリヌクレオチドは、単一の核酸分子の一部として又は別々の核酸分子として構築することができ、同じ又は異なる核酸分子に位置することができる。したがって、ポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントで、別々の形質転換イベントで又は例えば植物における育種プロトコルの一部として対象の細胞に導入することができる。

【0288】

所望のポリヌクレオチドは、特定の植物種に形質転換されると、従来の育種技術を使用して、その種において繁殖され得るか、又は同じ種の他の変種（特に商業品種を含む）に移動され得る、

【0289】

ある実施形態において、本発明は、農学的に許容される担体中に本発明のキメラ殺虫性タンパク質を含む殺虫性組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「農学的に許容される担体」は、天然又は合成の有機又は無機材料を含むことができ、これは、植物又はその部位に対する又はそれらの中への適用を容易にするために活性タンパク質と組み合わされる。農学的に許容される担体の例としては、限定はされないが、粉末、ダスト、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド及び溶液が挙げられる。農学的に許容される担体は、限定はされないが、農学的配合物において使用することができる不活性成分、分散剤、界面活性剤、補助剤、粘着付与剤、ステッカー、結合剤又はこれらの組合せをさらに含む。このような組成物は、殺有害生物性タンパク質又は他の有害生物防除剤を有害生物と接触させる任意の方法で適用させることができる。したがって、組成物は、種子、葉、花、茎、塊茎、根などを含む植物又は植物部位の表面に適用させることができる。他の実施形態において、植物体内で本発明の殺虫性タンパク質を産生する植物は、発現される殺虫性タンパク質の農学的に許容される担体である。実施形態において、本発明の組成物及び農学的に許容される担体は、トランスジェニック植物を除く。

【0290】

さらなる実施形態において、殺虫性組成物は、本発明の細菌細胞又はトランスジェニック細菌細胞を含み、ここで、細菌細胞又はトランスジェニック細菌細胞は、本発明の殺虫性タンパク質を産生する。このような殺虫性組成物は、トランスジェニックＢｔ培養物を含むバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降又は濃縮によって調製することができる。実施形態において、本発明の組成物は、重量により少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９７又は少なくとも９９の本発明のポリペプチドを含み得る。付加的な実施形態において、組成物は、重量により約１～約９９の本発明の殺虫性タンパク質を含む。

【0291】

本発明の殺虫性タンパク質は、有害生物の標的範囲を拡大するため且つ／又は昆虫耐性の予防若しくは管理のために、他の有害生物防除剤と組み合わせて使用することができる。さらに、異なる作用機序を有するか、又は昆虫の腸内の異なる受容体を標的とする殺虫剤と組み合わせた本発明の殺虫性タンパク質の使用は、昆虫耐性の予防及び／又は管理のために特定の有用性がある。

【0292】

したがって、ある実施形態において、本発明は、１つ又は複数の植物有害生物（例えば、鱗翅目害虫、鞘翅目害虫、半翅目害虫及び／又は双翅目害虫などの害虫）を防除する組成物を提供し、ここで、組成物は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質である第１の有害生物防除剤と、少なくとも第１の有害生物防除剤と異なる第２の有害生物防除剤とを含む。他の実施形態において、組成物は、植物への局所適用のための配合物である。さらに他の実施形態において、組成物は、トランスジェニック植物である。さらなる実施形態において、組成物は、トランスジェニック植物に局所的に適用される配合物の組み合わせである。ある実施形態において、トランスジェニック植物が第２の有害生物防除剤を含む場合、配合物は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質である第１の有害生物防除剤を含む。他の実施形態において、トランスジェニック植物が、本発明のキメラ殺虫性タンパク質である第１の有害生物防除剤を含む場合、配合物は、第２の有害生物防除剤を含む。

【0293】

ある実施形態において、第２の有害生物防除剤は、化学殺有害生物剤、例えば殺虫剤、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）殺虫性タンパク質及び／又は限定はされないが、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）殺虫性タンパク質、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）殺虫性タンパク質、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）殺虫性タンパク質、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）殺虫性タンパク質、プロテアーゼ阻害剤（セリン及びシステインの両方のタイプ）、レクチン、アルファ－アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ若しくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含む非Ｂｔ殺有害生物剤の１つ又は複数であり得る。

【0294】

他の実施形態において、第２の有害生物防除剤は、１つ又は複数の化学殺有害生物剤であり、任意に種子コーティングである。化学殺有害生物剤の非限定的な例としては、ピレスロイド、カルバメート、ネオニコチノイド、ニューロンナトリウムチャネル遮断薬、殺虫性大環状ラクトン、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アンタゴニスト、殺虫性尿素及び幼若ホルモン模倣物が挙げられる。他の実施形態において、化学殺有害生物剤は、アバメクチン、アセフェート、アセタミプリド、アミドフルメト（Ｓ－１９５５）、アベルメクチン、アザジラクチン、アジンホス－メチル、ビフェントリン、ビンフェナゼート、ブプロフェジン、カルボフラン、クロルフェナピル、クロルフルアズロン、クロルピリホス、クロルピリホス－メチル、クロマフェノジド、クロチアニジン、シフルトリン、ベータ－シフルトリン、シハロトリン、ラムダ－シハロトリン、シペルメトリン、シロマジン、デルタメトリン、ジアフェンチウロン、ジアジノン、ジフルベンズロン、ジメトエート、ジオフェノラン、エマメクチン、エンドスルファン、エスフェンバレレート、エチプロール、フェノチカルブ、フェノキシカルブ、フェンプロパトリン、フェンプロキシメート、フェンバレレート、フィプロニル、フロニカミド、フルシトリネート、タウ－フルバリネート、フルフェネリム（ＵＲ－５０７０１）、フルフェノクスロン、ホノホス、ハロフェノジド、ヘキサフルムロン、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イソフェンホス、ルフェヌロン、マラチオン、メタアルデヒド、メタミドホス、メチダチオン、メトミル、メトプレン、メトキシクロル、モノクロトホス、メトキシフェノジド、ニチアジン、ノバルロン、ノビフルムロン（ＸＤＥ－００７）、オキサミル、パラチオン、パラチオン－メチル、ペルメトリン、ホレート、ホサロン、ホスメト、ホスファミドン、ピリミカルブ、プロフェノホス、ピメトロジン、ピリダリル、ピリプロキシフェン、ロテノン、スピノサド、スピロメシフィン（ＢＳＮ ２０６０）、スルプロオス、テブフェノジド、テフルベンズロン、テフルトリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チアクロプリド、チアメトキサム、チオジカルブ、チオスルタプ－ナトリウム、トラロメトリン、トリクロルホン及びトリフルムロン、アルジカルブ、オキサミル、フェナミホス、アミトラズ、キノメチオナート、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホル、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、酸化フェンブタスズ、フェンプロパトリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾックス、プロパルギット、ピリダベン並びにテブフェンピラドの１つ又は複数である。さらに他の実施形態において、化学殺有害生物剤は、シペルメトリン、シハロトリン、シフルトリン及びベータ－シフルトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、トラロメトリン、フェノチカルブ、メトミル、オキサミル、チオジカルブ、クロチアニジン、イミダクロプリド、チアクロプリド、インドキサカルブ、スピノサド、アバメクチン、アベルメクチン、エマメクチン、エンドスルファン、エチプロール、フィプロニル、フルフェノクスロン、トリフルムロン、ジオフェノラン、ピリプロキシフェン、ピメトロジン及びアミトラズの１つ又は複数から選択される。

【0295】

付加的な実施形態において、第２の有害生物防除剤は、限定はされないが、Ｃｒｙタンパク質を含む任意の数のバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）殺虫性タンパク質、植物性殺虫性タンパク質（ＶＩＰ）及び前述の殺虫性タンパク質のいずれかの殺虫性キメラの１つ又は複数であり得る。他の実施形態において、第２の有害生物防除剤は、Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｄ、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ａｆ、Ｃｒｙ１Ａｇ、Ｃｒｙ１Ａｈ、Ｃｒｙ１Ａｉ、Ｃｒｙ１Ａｊ、Ｃｒｙ１Ｂａ、Ｃｒｙ１Ｂｂ、Ｃｒｙ１Ｂｃ、Ｃｒｙ１Ｂｄ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｂｆ、Ｃｒｙ１Ｂｇ、Ｃｒｙ１Ｂｈ、Ｃｒｙ１Ｂｉ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｃｂ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ｄｂ、Ｃｒｙ１Ｄｃ、Ｃｒｙ１Ｄｄ、Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｅｂ、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｆｂ、Ｃｒｙ１Ｇａ、Ｃｒｙ１Ｇｂ、Ｃｒｙ１Ｇｃ、Ｃｒｙ１Ｈａ、Ｃｒｙ１Ｈｂ、Ｃｒｙ１Ｈｃ、Ｃｒｙ１Ｉａ、Ｃｒｙ１Ｉｂ、Ｃｒｙ１Ｉｃ、Ｃｒｙ１Ｉｄ、Ｃｒｙ１Ｉｅ、Ｃｒｙ１Ｉｆ、Ｃｒｙ１Ｉｇ、Ｃｒｙ１Ｊａ、Ｃｒｙ１Ｊｂ、Ｃｒｙ１Ｊｃ、Ｃｒｙ１Ｊｄ、Ｃｒｙ１Ｋａ、Ｃｒｙ１Ｌａ、Ｃｒｙ１Ｍａ、Ｃｒｙ１Ｎａ、Ｃｒｙ１Ｎｂ、Ｃｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｄ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ、Ｃｒｙ２Ａｇ、Ｃｒｙ２Ａｈ、Ｃｒｙ２Ａｉ、Ｃｒｙ２Ａｊ、Ｃｒｙ２Ａｋ、Ｃｒｙ２Ａｌ、Ｃｒｙ２Ｂａ、Ｃｒｙ３Ａａ、Ｃｒｙ３Ｂａ、Ｃｒｙ３Ｂｂ、Ｃｒｙ３Ｃａ、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、Ｃｒｙ４Ｃａ、Ｃｒｙ４Ｃｂ、Ｃｒｙ４Ｃｃ、Ｃｒｙ５Ａａ、Ｃｒｙ５Ａｂ、Ｃｒｙ５Ａｃ、Ｃｒｙ５Ａｄ、Ｃｒｙ５Ｂａ、Ｃｒｙ５Ｃａ、Ｃｒｙ５Ｄａ、Ｃｒｙ５Ｅａ、Ｃｒｙ６Ａａ、Ｃｒｙ６Ｂａ、Ｃｒｙ７Ａａ、Ｃｒｙ７Ａｂ、Ｃｒｙ７Ａｃ、Ｃｒｙ７Ｂａ、Ｃｒｙ７Ｂｂ、Ｃｒｙ７Ｃａ、Ｃｒｙ７Ｃｂ、Ｃｒｙ７Ｄａ、Ｃｒｙ７Ｅａ、Ｃｒｙ７Ｆａ、Ｃｒｙ７Ｆｂ、Ｃｒｙ７Ｇａ、Ｃｒｙ７Ｇｂ、Ｃｒｙ７Ｇｃ、Ｃｒｙ７Ｇｄ、Ｃｒｙ７Ｈａ、Ｃｒｙ７Ｉａ、Ｃｒｙ７Ｊａ、Ｃｒｙ７Ｋａ、Ｃｒｙ７Ｋｂ、Ｃｒｙ７Ｌａ、Ｃｒｙ８Ａａ、Ｃｒｙ８Ａｂ、Ｃｒｙ８Ａｃ、Ｃｒｙ８Ａｄ、Ｃｒｙ８Ｂａ、Ｃｒｙ８Ｂｂ、Ｃｒｙ８Ｂｃ、Ｃｒｙ８Ｃａ、Ｃｒｙ８Ｄａ、Ｃｒｙ８Ｄｂ、Ｃｒｙ８Ｅａ、Ｃｒｙ８Ｆａ、Ｃｒｙ８Ｇａ、Ｃｒｙ８Ｈａ、Ｃｒｙ８Ｉａ、Ｃｒｙ８Ｉｂ、Ｃｒｙ８Ｊａ、Ｃｒｙ８Ｋａ、Ｃｒｙ８Ｋｂ、Ｃｒｙ８Ｌａ、Ｃｒｙ８Ｍａ、Ｃｒｙ８Ｎａ、Ｃｒｙ８Ｐａ、Ｃｒｙ８Ｑａ、Ｃｒｙ８Ｒａ、Ｃｒｙ８Ｓａ、Ｃｒｙ８Ｔａ、Ｃｒｙ９Ａａ、Ｃｒｙ９Ｂａ、Ｃｒｙ９Ｂｂ、Ｃｒｙ９Ｃａ、Ｃｒｙ９Ｄａ、Ｃｒｙ９Ｄｂ、Ｃｒｙ９Ｄｃ、Ｃｒｙ９Ｅａ、Ｃｒｙ９Ｅｂ、Ｃｒｙ９Ｅｃ、Ｃｒｙ９Ｅｄ、Ｃｒｙ９Ｅｅ、Ｃｒｙ９Ｆａ、Ｃｒｙ９Ｇａ、Ｃｒｙ１０Ａａ、Ｃｒｙ１１Ａａ、Ｃｒｙ１１Ｂａ、Ｃｒｙ１１Ｂｂ、Ｃｒｙ１２Ａａ、Ｃｒｙ１３Ａａ、Ｃｒｙ１４Ａａ、Ｃｒｙ１４Ａｂ、Ｃｒｙ１５Ａａ、Ｃｒｙ１６Ａａ、Ｃｒｙ１７Ａａ、Ｃｒｙ１８Ａａ、Ｃｒｙ１８Ｂａ、Ｃｒｙ１８Ｃａ、Ｃｒｙ１９Ａａ、Ｃｒｙ１９Ｂａ、Ｃｒｙ１９Ｃａ、Ｃｒｙ２０Ａａ、Ｃｒｙ２０Ｂａ、Ｃｒｙ２１Ａａ、Ｃｒｙ２１Ｂａ、Ｃｒｙ２１Ｃａ、Ｃｒｙ２１Ｄａ、Ｃｒｙ２１Ｅａ、Ｃｒｙ２１Ｆａ、Ｃｒｙ２１Ｇａ、Ｃｒｙ２１Ｈａ、Ｃｒｙ２２Ａａ、Ｃｒｙ２２Ａｂ、Ｃｒｙ２２Ｂａ、Ｃｒｙ２２Ｂｂ、Ｃｒｙ２３Ａａ、Ｃｒｙ２４Ａａ、Ｃｒｙ２４Ｂａ、Ｃｒｙ２４Ｃａ、Ｃｒｙ２５Ａａ、Ｃｒｙ２６Ａａ、Ｃｒｙ２７Ａａ、Ｃｒｙ２８Ａａ、Ｃｒｙ２９Ａａ、Ｃｒｙ２９Ｂａ、Ｃｒｙ３０Ａａ、Ｃｒｙ３０Ｂａ、Ｃｒｙ３０Ｃａ、Ｃｒｙ３０Ｄａ、Ｃｒｙ３０Ｄｂ、Ｃｒｙ３０Ｅａ、Ｃｒｙ３０Ｆａ、Ｃｒｙ３０Ｇａ、Ｃｒｙ３１Ａａ、Ｃｒｙ３１Ａｂ、Ｃｒｙ３１Ａｃ、Ｃｒｙ３１Ａｄ、Ｃｒｙ３２Ａａ、Ｃｒｙ３２Ａｂ、Ｃｒｙ３２Ｂａ、Ｃｒｙ３２Ｃａ、Ｃｒｙ３２Ｃｂ、Ｃｒｙ３２Ｄａ、Ｃｒｙ３２Ｅａ、Ｃｒｙ３２Ｅｂ、Ｃｒｙ３２Ｆａ、Ｃｒｙ３２Ｇａ、Ｃｒｙ３２Ｈａ、Ｃｒｙ３２Ｈｂ、Ｃｒｙ３２Ｉａ、Ｃｒｙ３２Ｊａ、Ｃｒｙ３２Ｋａ、Ｃｒｙ３２Ｌａ、Ｃｒｙ３２Ｍａ、Ｃｒｙ３２Ｍｂ、Ｃｒｙ３２Ｎａ、Ｃｒｙ３２Ｏａ、Ｃｒｙ３２Ｐａ、Ｃｒｙ３２Ｑａ、Ｃｒｙ３２Ｒａ、Ｃｒｙ３２Ｓａ、Ｃｒｙ３２Ｔａ、Ｃｒｙ３２Ｕａ、Ｃｒｙ３３Ａａ、Ｃｒｙ３４Ａａ、Ｃｒｙ３４Ａｂ、Ｃｒｙ３４Ａｃ、Ｃｒｙ３４Ｂａ、Ｃｒｙ３５Ａａ、Ｃｒｙ３５Ａｂ、Ｃｒｙ３５Ａｃ、Ｃｒｙ３５Ｂａ、Ｃｒｙ３６Ａａ、Ｃｒｙ３７Ａａ、Ｃｒｙ３８Ａａ、Ｃｒｙ３９Ａａ、Ｃｒｙ４０Ａａ、Ｃｒｙ４０Ｂａ、Ｃｒｙ４０Ｃａ、Ｃｒｙ４０Ｄａ、Ｃｒｙ４１Ａａ、Ｃｒｙ４１Ａｂ、Ｃｒｙ４１Ｂａ、Ｃｒｙ４２Ａａ、Ｃｒｙ４３Ａａ、Ｃｒｙ４３Ｂａ、Ｃｒｙ４３Ｃａ、Ｃｒｙ４３Ｃｂ、Ｃｒｙ４３Ｃｃ、Ｃｒｙ４４Ａａ、Ｃｒｙ４５Ａａ、Ｃｒｙ４６Ａａ、Ｃｒｙ４６Ａｂ、Ｃｒｙ４７Ａａ、Ｃｒｙ４８Ａａ、Ｃｒｙ４８Ａｂ、Ｃｒｙ４９Ａａ、Ｃｒｙ４９Ａｂ、Ｃｒｙ５０Ａａ、Ｃｒｙ５０Ｂａ、Ｃｒｙ５１Ａａ、Ｃｒｙ５２Ａａ、Ｃｒｙ５２Ｂａ、Ｃｒｙ５３Ａａ、Ｃｒｙ５３Ａｂ、Ｃｒｙ５４Ａａ、Ｃｒｙ５４Ａｂ、Ｃｒｙ５４Ｂａ、Ｃｒｙ５５Ａａ、Ｃｒｙ５６Ａａ、Ｃｒｙ５７Ａａ、Ｃｒｙ５７Ａｂ、Ｃｒｙ５８Ａａ、Ｃｒｙ５９Ａａ、Ｃｒｙ５９Ｂａ、Ｃｒｙ６０Ａａ、Ｃｒｙ６０Ｂａ、Ｃｒｙ６１Ａａ、Ｃｒｙ６２Ａａ、Ｃｒｙ６３Ａａ、Ｃｒｙ６４Ａａ、Ｃｒｙ６５Ａａ、Ｃｒｙ６６Ａａ、Ｃｒｙ６７Ａａ、Ｃｒｙ６８Ａａ、Ｃｒｙ６９Ａａ、Ｃｒｙ６９Ａｂ、Ｃｒｙ７０Ａａ、Ｃｒｙ７０Ｂａ、Ｃｒｙ７０Ｂｂ、Ｃｒｙ７１Ａａ、Ｃｒｙ７２Ａａ、Ｃｒｙ７３Ａａ又は上記のものの任意の組合せから選択されるＣｒｙタンパク質である。実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、例えば、トウモロコシイベントＴＣ１５０７で表されるようなＣｒｙ１Ｆａである。

【0296】

さらなる実施形態において、第２の有害生物防除剤は、Ｖｉｐ３Ａａ１、Ｖｉｐ３Ａａ２、Ｖｉｐ３Ａａ３、Ｖｉｐ３Ａａ４、Ｖｉｐ３Ａａ５、Ｖｉｐ３Ａａ６、Ｖｉｐ３Ａａ７、Ｖｉｐ３Ａａ８、Ｖｉｐ３Ａａ９、Ｖｉｐ３Ａａ１０、Ｖｉｐ３Ａａ１１、Ｖｉｐ３Ａａ１２、Ｖｉｐ３Ａａ１３、Ｖｉｐ３Ａａ１４、Ｖｉｐ３Ａａ１５、Ｖｉｐ３Ａａ１６、Ｖｉｐ３Ａａ１７、Ｖｉｐ３Ａａ１８、Ｖｉｐ３Ａａ１９、Ｖｉｐ３Ａａ２０、Ｖｉｐ３Ａａ２１、Ｖｉｐ３Ａａ２２、Ｖｉｐ３Ａａ２、Ｖｉｐ３Ａａ２４、Ｖｉｐ３Ａａ２５、Ｖｉｐ３Ａａ２６、Ｖｉｐ３Ａａ２７、Ｖｉｐ３Ａａ２８、Ｖｉｐ３Ａａ２９、Ｖｉｐ３Ａａ３０、Ｖｉｐ３Ａａ３１、Ｖｉｐ３Ａａ３２、Ｖｉｐ３Ａａ３３、Ｖｉｐ３Ａａ３４、Ｖｉｐ３Ａａ３５、Ｖｉｐ３Ａａ３６、Ｖｉｐ３Ａａ３７、Ｖｉｐ３Ａａ３８、Ｖｉｐ３Ａａ３９、Ｖｉｐ３Ａａ４０、Ｖｉｐ３Ａａ４１、Ｖｉｐ３Ａａ４２、Ｖｉｐ３Ａａ４３、Ｖｉｐ３Ａａ４４、Ｖｉｐ３Ａｂ１、Ｖｉｐ３Ａｂ２、Ｖｉｐ３Ａｃ１、Ｖｉｐ３Ａｄ１、Ｖｉｐ３Ａｄ２、Ｖｉｐ３Ａｅ１、Ｖｉｐ３Ａｆ１、Ｖｉｐ３Ａｆ２、Ｖｉｐ３Ａｆ３、Ｖｉｐ３Ａｇ１、Ｖｉｐ３Ａｇ２、Ｖｉｐ３Ａｇ３ ＨＭ１１７６３３、Ｖｉｐ３Ａｇ４、Ｖｉｐ３Ａｇ５、Ｖｉｐ３Ａｈ１、Ｖｉｐ３Ｂａ１、Ｖｉｐ３Ｂａ２、Ｖｉｐ３Ｂｂ１、Ｖｉｐ３Ｂｂ２、Ｖｉｐ３Ｂｂ３又は上記のものの任意の組合せから選択される１つ又は複数のＶｉｐ３植物性殺虫性タンパク質である。実施形態において、Ｖｉｐ３タンパク質は、例えば、コーンイベントＭＩＲ１６２（米国特許第８，２３２，４５６号明細書；米国特許第８，４５５，７２０号明細書；及び米国特許第８，６１８，２７２号明細書）で表されるようなＶｉｐ３Ａａ（米国特許第６，１３７，０３３号明細書）である。

【0297】

実施形態において、第２の有害生物防除剤は、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）以外の起源から得ることができる。例えば、第２の有害生物防除剤は、アルファ－アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、パタチン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ウレアーゼ、アルファ－アミラーゼ阻害剤、細孔形成タンパク質、キチナーゼ、レクチン、改変抗体又は抗体断片、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）殺虫性タンパク質、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）種（例えば、Ｘ．ネマトフィラ（Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）又はＸ．ボビエニイ（Ｘ．ｂｏｖｉｅｎｉｉ））殺虫性タンパク質、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種（例えば、Ｐ．ルミネッセンス（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）又はＰ．アシムビオティカ（Ｐ．ａｓｙｍｏｂｉｏｔｉｃａ））殺虫性タンパク質、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｂ．ラテロスポルス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓ））殺虫性タンパク質、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｌ．スファエリクス（Ｌ．ｓｐｈｅａｒｉｃｕｓ））殺虫性タンパク質、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、Ｃ．スブツガエ（Ｃ．ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）又はＣ．ピスキナエ（Ｃ．ｐｉｓｃｉｎａｅ））殺虫性タンパク質、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種（例えば、Ｙ．エントモファガ（Ｙ．ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ））殺虫性タンパク質、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｐ．プロピラエア（Ｐ．ｐｒｏｐｙｌａｅａ））殺虫性タンパク質、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（例えば、Ｃ．ビフェルメンタンス（Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））殺虫性タンパク質、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））及びリグニンであり得る。他の実施形態において、第２の防除剤は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ゼノラブス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）又はエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に由来する殺虫性毒素複合体（Ｔｃ）から得られる少なくとも１つの殺虫性タンパク質であり得る。他の実施形態において、殺虫性タンパク質は、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種などの殺虫性細菌に由来するＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼであり得る。他の実施形態において、殺虫性タンパク質は、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）に由来するＶＩＰ１及び／又はＶＩＰ２などのＶＩＰタンパク質であり得る。さらに他の実施形態において、殺虫性タンパク質は、殺虫性細菌に由来するバイナリー毒素、例えばＢ．ラテロスポルス（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓ）に由来するＩＳＰ１Ａ及びＩＳＰ２Ａ又はＬ．スファエリクス（Ｌ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するＢｉｎＡ及びＢｉｎＢであり得る。さらに他の実施形態において、殺虫性タンパク質は、操作され得るか、又は前述の殺虫性タンパク質のいずれかのハイブリッド若しくはキメラであり得る。

【0298】

ある実施形態において、第２の殺有害生物剤は、非タンパク質性の、例えばｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子であり得、これは、遺伝子導入で発現され得るか、又は組成物の一部として適用され得る（例えば、局所法を用いる）。干渉ＲＮＡは、通常、少なくとも、標的遺伝子に対するＲＮＡ断片と、スペーサー配列と、二本鎖ＲＮＡ構造が形成され得るように第１のＲＮＡ断片に相補的な第２のＲＮＡ断片とを含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、生物が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を認識し、それらを加水分解するときに生じる。得られた加水分解産物は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる約１９～２４ヌクレオチドの長さの小さいＲＮＡ断片である。次に、ｓｉＲＮＡは、生物全体に拡散又は輸送（細胞膜の通過を含む）され、そこで、ｍＲＮＡ（又は他のＲＮＡ）にハイブリダイズして、ＲＮＡの加水分解を引き起こす。干渉ＲＮＡは、ＲＮＡのエフェクター鎖（又は「ガイド鎖」）がロードされるＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって認識される。このガイド鎖は、二本鎖配列の認識及び破壊のための鋳型の役割を果たす。このプロセスは、ｓｉＲＮＡがその相補ＲＮＡ標的にハイブリダイズするたびに繰り返され、それらのｍＲＮＡが翻訳されることを効果的に防止し、したがってｍＲＮＡが転写された特定の遺伝子の発現を「サイレンシング」する。干渉ＲＮＡは、昆虫防除に有用であることが当技術分野において知られている（例えば、参照によって本明細書中に援用される国際公開第２０１３／１９２２５６号を参照されたい）。昆虫防除において使用するために設計された干渉ＲＮＡは、天然に存在しない二本鎖ＲＮＡを生じさせ、これは、昆虫の天然ＲＮＡｉ経路を利用して、摂食及び／又は成長の休止をもたらし得る標的遺伝子の下方制御を引き起こし、その結果、害虫の死が起こり得る。干渉ＲＮＡ分子は、本発明のタンパク質と同じ標的有害生物に対する昆虫耐性を付与し得るか、又は異なる有害生物を標的とし得る。標的とされる昆虫植物有害生物は、咀嚼、吸引又は穿孔によって摂食し得る。干渉ＲＮＡは、昆虫防除に有用であることが当技術分野において知られている。実施形態において、昆虫防除に有用なｄｓＲＮＡは、２０１６年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７１，２５９号明細書、同第６２／３７１，２６１号明細書又は同第６２／３７１，２６２号明細書に記載されている。実施形態において、昆虫防除に有用なｄｓＲＮＡは、米国特許第９，２３８，８２２３号明細書、同第９，３４０，７９７号明細書又は同第８，９４６，５１０号明細書に記載されている。実施形態において、昆虫防除に有用なｄｓＲＮＡは、米国特許出願公開第１２／８６８，９９４号明細書、同第１３／８３１，２３０号明細書、同第１４／２０７，３１３号明細書又は同第１４／２０７３１８号明細書に記載されている。他の実施形態において、干渉ＲＮＡは、昆虫でない植物有害生物、例えば線虫有害生物又はウィルス有害生物に対する耐性を付与し得る。

【0299】

またさらなる実施形態において、本発明のキメラ殺虫性タンパク質である第１の昆虫防除剤及び第２の有害生物防除剤は、トランスジェニック植物において同時発現される。同じトランスジェニック植物における２つ以上の殺有害生物性成分のこの同時発現は、昆虫防除剤をコードする核酸配列を含有及び発現するように植物を遺伝的に操作することによって達成することができる。例えば、同じトランスジェニック植物における２つ以上の殺有害生物剤の同時発現は、「分子スタック」において２つ以上の殺有害生物剤のコード配列を含む単一の組換えベクターを作製し、トランスジェニック植物において全ての殺有害生物剤を含有及び発現するように植物を遺伝的に操作することによって達成することができる。このような分子スタックは、例えば、米国特許第７，２３５，７１６号明細書に記載されるようにミニ染色体を用いて作製され得る。代替的に、植物、親１は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質の発現のために遺伝子操作され得る。第２の植物、親２は、第２の有害生物防除剤の発現のために遺伝子操作され得る。親１と親２を交雑させることにより、親１及び２からの両方の昆虫防除剤を発現する子孫植物が得られる。

【0300】

他の実施形態において、本発明は、標的有害生物における必須遺伝子の抑制のためのｄｓＲＮＡをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列と、標的有害生物に対する殺虫活性を示す本発明のキメラ殺虫性タンパク質をコードする核酸、例えば（ＤＮＡ）配列とを含む、植物有害生物の外寄生に耐性があるスタックされたトランスジェニック植物を提供する。おそらくｄｓＲＮＡを不安定化する中腸の高ｐＨに起因して、ｄｓＲＮＡは、特定の鱗翅目有害生物に対して効果がないことが報告されている（Ｒａｊａｇｏｐｏｌ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４６８－４９４）。したがって、標的有害生物が鱗翅目有害生物であるいくつかの実施形態において、本発明のキメラ殺虫性タンパク質は、中腸ｐＨを一時的に低下させるように作用し、これは、同時摂取されたｄｓＲＮＡを安定化することに役立ち、標的遺伝子のサイレンシングにおいてｄｓＲＮＡを有効にする。

【0301】

本発明の殺虫性タンパク質を含み且つ／又は発現するトランスジェニック植物又は種子は、米国特許第５，８４９，３２０号明細書及び同第５，８７６，７３９号明細書に記載されるような殺虫剤又は殺虫性種子コーティングによって処理することもできる。殺虫剤又は殺虫性種子コーティング及び本発明のトランスジェニック植物又は種子の両方が同じ標的昆虫、例えば鱗翅目有害生物（例えば、ツマジロクサヨトウ）に対して活性である実施形態において、この組み合わせは、（ｉ）標的昆虫に対する本発明の組成物の活性をさらに増強するための方法において、及び／又は（ｉｉ）標的昆虫に対してさらに別の作用メカニズムを提供することによって本発明の組成物に対する耐性の発生を防止するための方法において有用である。したがって、実施形態において、本発明は、本発明のトランスジェニック植物又は種子を提供し、その植物又は種子に、殺虫剤又は殺虫性種子コーティングを本発明のトランスジェニック植物又は種子に適用するステップを含む、鱗翅目昆虫集団の防除を増強する方法を提供する。

【0302】

殺虫剤又は殺虫性種子コーティングが異なる昆虫に対して活性である場合でも、例えば鞘翅目昆虫に対する活性を有する殺虫剤又は殺虫性種子コーティングを本発明のトランスジェニック種子に付加することにより、殺虫剤又は殺虫性種子コーティングは、昆虫防除の範囲を拡大するために有用であり、ある実施形態では、本発明のトランスジェニック種子は、鱗翅目昆虫に対する活性を有し、生産された被覆トランスジェニック種子は、鱗翅目及び鞘翅目害虫の両方を防除する。

【0303】

本発明は、昆虫耐性（例えば、鱗翅目昆虫耐性）トランスジェニック植物を生産する方法も包含する。それぞれの実施形態において、この方法は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクター（本明細書に具体的に開示されるポリペプチドと実質的に同一である毒素の断片及び修飾形態を含む）を植物に導入するステップ（ここで、ヌクレオチド配列は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を産生し、それにより害虫に対する耐性を植物に付与するために植物において発現される）と、昆虫耐性トランスジェニック植物（例えば、適切な防除植物、例えば本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含まず、且つ／又は本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して）を生産するステップとを含む。

【0304】

実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを植物に導入する方法は、まずポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターにより植物細胞を形質転換し、そこからトランスジェニック植物を再生させるステップを含み、ここで、トランスジェニック植物は、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を発現する。

【0305】

代替的に又は付加的に、導入ステップは、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む第１の植物と、第２の植物（例えば、第１の植物と異なる植物、例えばポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含まない植物）とを交雑させるステップと、任意に、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を発現し、それにより少なくとも１つの害虫に対する耐性の増大をもたらす子孫植物を生産するステップとを含むことができる。したがって、本発明のトランスジェニック植物は、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、任意にキメラ殺虫性タンパク質を発現し、少なくとも１つの害虫に対する耐性の増大をもたらす、形質転換イベントの直接的な結果である植物及びその子孫（任意の世代）を包含する。

【0306】

本発明は、本発明のトランスジェニック植物を同定する方法をさらに提供し、本方法は、植物（又はそれから得られる植物細胞、植物部位など）における本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター又はキメラ殺虫性タンパク質の存在を検出し、それにより本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター又はキメラ殺虫性タンパク質の存在に基づいて植物を本発明のトランスジェニック植物と同定するステップを含む。

【0307】

本発明は、少なくとも１つの害虫（例えば、少なくとも１つの鱗翅目有害生物）に対する耐性が増大されたトランスジェニック植物を生産する方法をさらに提供し、本方法は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む種子を蒔き、その種子からトランスジェニック植物を成長させるステップを含み、ここで、トランスジェニック植物は、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、キメラ殺虫性タンパク質を産生する。

【0308】

実施形態において、本発明の方法によって生産されるトランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む。実施形態において、本発明の方法によって生産されるトランスジェニック植物は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を含み、任意に、少なくとも１つの害虫に対する耐性が増大されている。

【0309】

本明細書に記載されるトランスジェニック植物を生産する方法は、トランスジェニック植物から種子を収穫するさらなるステップを任意に含み、ここで、種子は、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、キメラ殺虫性タンパク質を産生する。任意に、種子は、さらなるトランスジェニック植物を生産し、これは、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、キメラ殺虫性タンパク質を産生し、それにより少なくとも１つの害虫に対する耐性が増大されている。

【0310】

本発明は、本発明の方法によって生産されるトランスジェニック植物の植物部位、植物細胞、植物器官、植物培養物、種子、植物抽出物、収穫産物及び加工産物をさらに提供する。

【0311】

さらなる態様として、本発明は、種子を生産する方法も提供し、本方法は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含むトランスジェニック植物を提供し、そのトランスジェニック植物から種子を収穫するステップを含み、ここで、種子は、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクターを含み、キメラ殺虫性タンパク質を産生する。任意に、種子は、さらなるトランスジェニック植物を生産し、これは、ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、キメラ殺虫性タンパク質を産生し、それにより少なくとも１つの害虫に対する耐性が増大されている。それぞれの実施形態において、トランスジェニック植物を提供するステップは、トランスジェニック植物を生産する種子を播くことを含む。

【0312】

本発明は、ハイブリッド植物種子を生産する方法をさらに提供し、本方法は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、任意に本発明のキメラ殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物である第１の近交系植物と、異なる近交系植物（例えば、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含まない近交系植物）とを交雑させ、ハイブリッド種子を形成させるステップを含む。任意に、本方法は、ハイブリッド種子を収穫することをさらに含む。実施形態において、ハイブリッド種子は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、実施形態においてさらに本発明のキメラ殺虫性タンパク質を含み、害虫に対する耐性の増大を有し得る。実施形態において、ハイブリッド種子は、トランスジェニック植物を生産し、これは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を発現し、少なくとも１つの害虫に対する耐性が増大されている。

【0313】

ある実施形態において、本発明のトランスジェニック植物は、少なくとも１つの鱗翅目害虫（本明細書に記載される通り）に耐性がある。実施形態において、トランスジェニック植物は、Ｖｉｐ３Ａ（例えば、Ｖｉｐ３Ａａタンパク質、例えばトウモロコシイベントＭＩＲ１６２において発現されるもの）及び／又はＣｒｙ１Ｆタンパク質（例えば、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質、例えばトウモロコシイベントＴＣ１５０７において発現されるもの）に耐性のあるツマジロクサヨトウ害虫又はコロニーを防除する。

【0314】

さらなる実施形態において、少なくとも１つの害虫（例えば、ツマジロクサヨトウなどの少なくとも１つの鱗翅目害虫）を防除する方法は、本発明のキメラ殺虫性タンパク質を提供するステップを含む。実施形態において、本方法は、害虫又はその環境に有効量の本発明のキメラ殺虫性タンパク質を送達する（例えば、経口的に送達する）ステップを含む。一般に、有効であるために、ポリペプチドは、昆虫によって経口摂取される。しかしながら、キメラ殺虫性タンパク質は、多くの認識される方法で昆虫に送達することができる。タンパク質を昆虫に経口的に送達するための方法には、限定はされないが、（１）トランスジェニック植物において（ここで、昆虫は、トランスジェニック植物の１つ又は複数の部分を食べ（摂取し）、それによりトランスジェニック植物において発現されるポリペプチドを摂取する；（２）例えば、昆虫の成長培地に適用又は取り込まれ得る配合されたタンパク質組成物において；（３）表面に適用され得る、例えば植物部位の表面にスプレーされ得る（これは、次に、昆虫がスプレーされた植物部位の１つ又は複数を食べたときに昆虫により摂取される）タンパク質組成物において；（４）餌基質において；又は（５）当技術分野において認められる任意の他のタンパク質送達系においてタンパク質を提供することが含まれる。したがって、昆虫への経口送達のあらゆる方法を使用して、本発明の毒性タンパク質を送達することができる。いくつかの特定の実施形態では、本発明のキメラ殺虫性タンパク質は、昆虫に経口的に送達され、例えば、ここで、昆虫は、本発明のトランスジェニック植物の１つ又は複数の部分を摂取する。

【0315】

他の実施形態において、本発明の殺虫性タンパク質は、昆虫に経口的に送達され、ここで、昆虫は、本発明の殺虫性タンパク質を含む組成物がスプレーされた植物の１つ又は複数の部分を摂取する。本発明の組成物の植物表面への送達は、化合物、組成物、配合物などを植物表面に適用するために、当業者に知られているあらゆる方法を用いて行うことができる。植物若しくはその部位に送達するか、又は植物若しくはその部位と接触させるいくつかの非限定的な例としては、スプレーイング、ダスティング、スプリンクリング、スキャッタリング、ミスティング、アトマイジング、ブロードキャスティング、浸漬、土壌注入、土壌混和、灌注（例えば、根、土壌処理）、ディッピング、注入、コーティング、葉又は茎浸潤、側方施肥又は種子処理など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。植物又はその部位を化合物、組成物又は配合物と接触させるためのこれら及び他の手順は、当業者によく知られている。

【0316】

ある実施形態において、本発明は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫を防除する手段を農業家に提供する方法を包含し、本方法は、種子などの植物材料を農業家に供給又は販売するステップを含み、植物材料は、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を発現することができるＴｘｐ４０ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む。他の実施形態において、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）害虫は、ツマジロクサヨトウ有害生物であり、植物材料は、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を含み、任意に、少なくともツマジロクサヨトウに対する耐性が増大されている。他の実施形態において、植物材料は、コーン種子であり、種子から成長されるコーン植物は、本発明のＴｘｐ４０殺虫性タンパク質を発現する本発明のＴｘｐ４０ポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含み、少なくともツマジロクサヨトウに対する耐性が増大されている。

【実施例】

【0317】

本発明は、以下の詳細な実施例を参照してさらに説明される。これらの実施例は、説明のためにのみ提供され、他に規定されない限り、限定であることを意図されない。ここで使用される標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）により、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により、且つＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，（１９８８）、Ｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）及びＳｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８）により記載されている。

【0318】

実施例１．Ｃｒｙ耐性ツマジロクサヨトウに対するＴｘｐ４０タンパク質の殺虫活性
Ｔｘｐ４０タンパク質を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物で人工昆虫飼料の表面が覆われた人工飼料バイオアッセイを用いて、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｍｅｓｃｅｎｓ）から得られるＴｘｐ４０タンパク質（配列番号１）の殺虫活性を決定した。これらのバイオアッセイにおいて使用したＦＡＷの系統は、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質に耐性があるＦＡＷの野外集団から得られる。Ｖｉｐ３タンパク質を陽性対照として使用した。エンプティベクター、すなわちｔｘｐ４０コード配列を含まないベクターを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンを陰性対照として使用した。バイオアッセイの結果は、７日目に死亡率及び有効死亡率パーセントで記録される。ここで、有効死亡率は、試験中にＦＡＷ幼虫により達成される成長段階を考慮し、すなわち成長阻害を有し、瀕死の状態である処理幼虫は、事実上死んでいると見なされる。

【0319】

結果は、表１に示される。Ｔｘｐ４０を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物を昆虫バイオアッセイで試験すると、Ｔｘｐ４０は、驚くべきことに、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ＦＡＷに対して著しい殺虫活性を示した。これらの結果は、ＦＡＷに対するＴｘｐ４０タンパク質の驚くべき経口活性を実証するだけでなく、Ｔｘｐ４０が、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のＣｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質と異なる作用機序を有することも示す。

【0320】

【表1】

【0321】

Ｔｘｐ４０タンパク質の効力を試験するために、Ｔｘｐ４０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物の希釈物を作り、上記のように人工昆虫飼料の表面に付加した。Ｔｘｐ４０処理及びＶｉｐ３陽性対照処理の両方について、無希釈抽出物も試験した。

【0322】

表２に示される結果は、Ｔｘｐ４０タンパク質が１：３２希釈物でも著しい活性を有することを実証し、これにより、トランスジェニックコーン植物におけるＴｘｐ４０の発現は、特にＣｒｙ耐性ＦＡＷに対して実行可能なＦＡＷ防除の選択肢であり得ることが示される。

【0323】

【表2】

【0324】

実施例２．Ｔｘｐ４０変異体のＦＡＷ活性
Ｔｘｐ４０－１（配列番号１）に突然変異を導入し、各Ｔｘｐ４０変異体からの細菌ライセートのタンパク質安定性及び殺虫活性をアッセイした。突然変異は、種々の残基におけるアミノ酸変化と、アミノ酸残基の挿入及び／又は欠失とも含んでいた。本質的に実施例１に記載されるように実施される飼料オーバーレイアッセイを用いて、１つ又は複数の突然変異を有する変異体Ｔｘｐ４０タンパク質を、ブラジル由来の系統（ＢＲ－ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））及び北米由来の系統（ＮＡ－ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））の２系統のツマジロクサヨトウに対する殺虫活性について試験した。植物性殺虫性タンパク質Ｖｉｐ３Ｄ、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質及び／又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株Ｃ０７５６を陽性対照として使用した。ｐＥＴ２９エンプティベクターを陰性対照として使用した。表３～４は、標的突然変異を有する変異体Ｔｘｐ４０タンパク質の発現、溶解性及び／又は殺虫活性アッセイの結果を示す。

【0325】

【表3-1】

【表3-2】

【0326】

【表4】

【0327】

表３の結果は、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質と比較して、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）に対して同等の又はより優れた殺虫活性を有する変異体Ｔｘｐ４０タンパク質が産生され得ることを実証する。例えば、Ｋ７３Ａ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ２０９Ａ、Ｋ２３８Ａ、Ｋ３０９Ａ、Ｒ１０Ａ、Ｒ２６Ａ、Ｒ４６Ａ、Ｒ１８６Ａ及びＲ２２６Ａにおける単一の突然変異を有する変異体タンパク質は、ＮＡ－ＦＡＷに対して野生型Ｔｘｐ４０とほぼ同じ殺虫活性を有し、且つＫ４９Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２２１Ａ、Ｒ２６Ａ、Ｒ１６７Ａ、Ｒ２０８Ａ及びＲ２１７Ａにおける単一の突然変異を有する変異体タンパク質は、ＢＲ－ＦＡＷに対して野生型Ｔｘｐ４０とほぼ同じ殺虫活性を有した。

【0328】

Ｔｘｐ４０における突然変異のいくつかは、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質と比較して、ＮＡ－ＦＡＷに対する殺虫活性が増大された又は著しく増大された（２０％以上）変異体タンパク質を作り出した。例えば、Ｋ３１Ａ、Ｋ４９Ａ、Ｋ７３Ａ、Ｋ７５Ａ、Ｋ１０３Ａ、Ｋ１１１Ａ、Ｋ１１９Ａ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２１０Ａ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２２１Ａ、Ｋ２８４Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｒ１６７Ａ、Ｒ２０８Ａ及びＲ２５２Ａにおける単一の突然変異を有する変異体タンパク質の全ては、野生型Ｔｘｐ４０と比較して、ＮＡ－ＦＡＷに対してより優れた活性を有し、これらの突然変異体のうち、Ｋ３１Ａ、Ｋ４９Ａ、Ｋ７５Ａ、Ｋ１１１Ａ、Ｋ１１９Ａ、Ｋ２００Ａ及びＫ３３３Ａは、野生型Ｔｘｐ４０と比較してＮＡ－ＦＡＷに対する殺虫活性の２０％以上の増大を有した。Ｔｘｐ４０における突然変異のいくつかは、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質と比較して、ＢＲ－ＦＡＷに対する殺虫活性が増大された又は著しく増大された（１４％以上）変異体タンパク質を作り出した。例えば、Ｋ３１Ａ、Ｋ４９Ａ、Ｋ７３Ａ、Ｋ７５Ａ、Ｋ１０３Ａ、Ｋ１１１Ａ、Ｋ１１９Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２１３Ａ及びＫ３３３Ａにおける単一の突然変異を有する変異体タンパク質の全ては、野生型Ｔｘｐ４０と比較して、ＢＲ－ＦＡＷに対してより優れた活性を有し、これらのうち、Ｋ７３Ａ、Ｋ１０３Ａ及びＫ２１３Ａは、野生型Ｔｘｐ４０タンパク質と比較して、ＢＲ－ＦＡＷに対する殺虫活性の著しい増大を有した。

【0329】

結果は、Ｔｘｐ４０（配列番号１）における特定の突然変異が、ＢＲ－ＦＡＷと比較してＮＡ－ＦＡＷに対する毒性が驚くほど異なる変異体タンパク質を作り出したことをさらに実証する。いくつかの突然変異体、例えばＫ３１Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｋ７５Ａ、Ｋ１１１Ａ、Ｋ１１９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ２０９Ａ、Ｋ２１０Ａ、Ｋ２３８Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｒ１０Ａ、Ｒ２０８Ａ及びＲ２２６Ａは、ＢＲ－ＦＡＷよりもＮＡ－ＦＡＷに対してより毒性であった。いくつかの変異体、例えばＫ７３Ａ、Ｋ１０３Ａ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２７１Ａ、Ｋ２８４Ａ、Ｒ２６Ａ、Ｒ４６Ａ、Ｒ１８７Ａ、Ｒ２１７Ａ及びＲ２４０Ａは、ＮＡ－ＦＡＷよりもＢＲ－ＦＡＷに対してより毒性であり、これらの位置は、異なるＦＡＷ活性のために重要であることが示された。

【0330】

複数の突然変異を含む変異体Ｔｘｐ４０タンパク質の大部分は、野生型Ｔｘｐ４０と比較してＮＡ－ＦＡＷに対する殺虫活性が低減されており、いくつかの突然変異は、活性を完全にノックアウトしており、再度、Ｔｘｐ４０の生物活性に対するこれらのアミノ酸位置の重要性が示された。複数の突然変異を有する変異体のいくつかは、野生型Ｔｘｐ４０と等しい活性を有し、位置Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａにおける突然変異を有する１つの変異体（配列番号１２７）は、野生型Ｔｘｐ４０と比較して殺虫活性を著しく増大させた。

【0331】

ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により実行される、全長Ｔｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ ＤＮＡにおける縮重オリゴヌクレオチドランダム突然変異誘発技術を用いて、さらなる突然変異を生じさせるために、変異体Ｔｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａタンパク質（配列番号１２７）をコードするＤＮＡを鋳型として使用した。ランダム突然変異を含む変異体のライブラリーをｐＥＴ２９ａベクターにサブクローニングした。変異体Ｔｘｐ４０タンパク質を含む何百もの細菌ライセートを、上記のようにＮＡ－ＦＡＷ、ＢＲ－ＦＡＷ及びソイビーンルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ）（ＳＢＬ；クリソデイキシス・インクルデンス（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ））に対する殺虫活性について試験した。特定の変異体についての結果は、表５に示される。

【0332】

【表5】

【0333】

上記のように、野生型Ｔｘｐ４０（配列番号１）及び変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、ＮＡ－ＦＡＷ及びＢＲ－ＦＡＷに対して異なる毒性を有する。ランダム化実験の目的は、ＮＡ－及びＢＲ－ＦＡＷの両方の系統並びに他の鱗翅目種に対する高殺虫活性を付与する突然変異を含む１つ又は複数のＴｘｐ４０変異体を同定することであった。ランダム突然変異誘発のための鋳型として使用したＫ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ突然変異を含むＴｘｐ４０変異体（配列番号１２７）は、ＮＡ－ＦＡＷに対して非常に活性であるが、ＢＲ－ＦＡＷ及びＳＢＬに対する活性がはるかに低い（表５を参照されたい）。

【0334】

何百ものランダム変異誘発されたＴｘｐ４０突然変異体のバイオアッセイの結果は、大多数がＮＡ－ＦＡＷ及びＢＲ－ＦＡＷに対して異なる毒性を維持することを示した。しかしながら、野生型Ｔｘｐ４０（配列番号１）及び鋳型として使用したＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ変異体（配列番号１２７）の活性と比較して、ＮＡ－ＦＡＷに対する高活性を維持し、驚くべきことにＢＲ－ＦＡＷに対しても非常に高い活性を有する３つの変異体、Ｔｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｓ１１Ｙ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１３０）；Ｔｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｓ１１Ｙ（配列番号１３１）及びＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｆ１６９Ｖ（配列番号１３２）を同定した。それらの変異体の１つであるＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｓ１１Ｙ（配列番号１３１）は、驚くべきことに、変異体鋳型のＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａと比較して、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ）に対しても著しく増大した活性を有した。これらの結果は、配列番号１のアミノ酸位置１１、１１９及び２１３がＴｘｐ４０タンパク質の殺虫効力の決定において非常に重要であることを強く示唆する。

【0335】

上記のように作製及びＮＡ－ＦＡＷに対して試験した、さらに他の変異体Ｔｘｐ４０タンパク質は、表６に示される。表６における全ての突然変異は、配列番号１におけるアミノ酸置換を指す。

【0336】

【表6】

【0337】

表６に示される結果は、配列番号１の少なくともアミノ酸位置１１９及び２１３がＦＡＷ活性を決定するために重要であるという知見を支持する。

【0338】

実施例３．Ｖｉｐ３耐性ＦＡＷに対するＴｘｐ４０活性の試験
Ｔｘｐ４０及び／又は変異体タンパク質の毒性が、Ｖｉｐ３Ａタンパク質からの異なるＭＯＡによるものであるかどうかを決定するために、Ｔｘｐ４０野生型及び上記のＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ変異体タンパク質を実施例２に記載されるように作製した。Ｔｘｐ４０タンパク質をＴｘｐ４０ Ｂｕｆｆｅｒ中に別々に混合し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、溶解したタンパク質調製物の純度をモニターした。

【0339】

Ｖｉｐ３Ａ殺虫性タンパク質に耐性があるＦＡＷの系統に対する効力について精製タンパク質を試験した。本質的に実施例１に記載されるように飼料オーバーレイアッセイを実施した。Ｖｉｐ３Ａタンパク質をＰＢＳ中に溶解させた。２つの陰性対照処理は、ＰＢＳ及びＴｘｐ４０ Ｂｕｆｆｅｒであった。Ｖｉｐ３Ａ耐性ＦＡＷ系統のための陽性対照としてＣｒｙ１Ｆａタンパク質を使用した。各タンパク質の複数の濃縮物を試験した。７日目に殺虫活性を有効死亡率として評価した（成長阻害を有し、瀕死の状態である幼虫は、事実上死んでいると記録した）。

【0340】

結果は、Ｖｉｐ３Ａ耐性ＦＡＷ系統がＶｉｐ３Ａによって防除されないことを示し、その系統がこのタンパク質に耐性があることが実証される。対照的に、Ｔｘｐ４０野生型タンパク質及びＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ変異体は、Ｖｉｐ３耐性昆虫に６０％の死亡率を与え、これにより、Ｔｘｐ４０の作用機序がＶｉｐ３Ａタンパク質の作用機序と異なり、したがってＦＡＷ集団における耐性の発生を軽減するためにＶｉｐ３とのスタッキングの組合せにおいて有用であることが示唆される。

【0341】

実施例４．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセート調製物における疑似胃液試験
この実施例は、Ｔｘｐ４０及び／又はＴｘｐ４０変異体のＳＧＦ消化性を決定するためのアッセイを記載する。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１^*（ＤＥ３）において各Ｔｘｐ４０タンパク質及び／又は変異体を産生させた。細菌株における変異体の発現レベル及び変異体の溶解性を決定した。緩衝液中の細菌ライセートを消化性分析のために３ｍｇ／ｍＬ（全タンパク質濃度）に希釈した。３７℃において１５μＬのライセートを２８５μＬの疑似胃液［Ｇ－Ｃｏｎ溶液（２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、ｐＨ１．２）中、１０単位のペプシン／μｇタンパク質又は約１５７９単位のペプシン／ｍＬ］に添加することにより、消化反応を開始させた。５分したら、１００μＬのライセート－ＳＧＦ反応物を取り出し、６５のトリシン負荷緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ ２ｘトリシン負荷緩衝液ｗ／１０β－メルカプトエタノール）及び３５の５００ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．０から構成される１００μＬの予熱（９５℃）した停止溶液に添加することにより反応を停止させた。予熱（９５℃）した１００μＬの停止溶液及び９５μＬの疑似胃液に５μＬの試験ライセートを添加することにより、ゼロ（Ｔ０）時点を作製した。全てのサンプルを９５℃に５分間加熱してから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析まで氷上で保管した。標準的なタンパク質ゲル電気泳動前に、３０マイクロリットルの各反応を１０～２０のトリス－トリシンペプチドゲル上にロードした。電気泳動の直後に４０メタノール：１０酢酸混合物によりトリス－トリシンゲルを２０分間固定した。次に、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅタンパク質染料によりゲルを室温で１時間染色した。１時間後、ポリアクリルアミドゲルを蒸留水により少なくとも１２時間脱染した。結果は、「合格」、「不合格」評価からなる。Ｔ５試験の「不合格」は、ゲル電気泳動後のＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅタンパク質染色により、無傷又は部分消化されたＴｘｐ４０タンパク質及び／又は変異体が検出可能であったことを意味し、ＳＧＦアッセイにおいてタンパク質を完全には消化できなかったことが示される。Ｔ５試験の「合格」は、無傷のＴｘｐ４０タンパク質及び／又は変異体が検出不能であったことを意味し、ＳＧＦアッセイにおいてＴｘｐ４０タンパク質及び／又は変異体を消化できたことが示される。これらの実験の結果は、Ｔｘｐ４０及び変異体Ｔｘｐ４０タンパク質がＳＧＦアッセイにおいて完全に消化されることを実証した。

【0342】

実施例５．ｔｘｐ４０－１コドン最適化遺伝子によるトウモロコシの形質転換
トウモロコシのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換に適したバイナリーベクター構築物を作製する。バイナリーベクターは、植物での発現を促すのに適したプロモータに５末端で作動可能に連結され、且つターミネータ配列に３末端で作動可能に連結された、ｔｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ（配列番号１２７）をコードするトウモロコシ最適化核酸及びＴｘｐ４０－Ｋ１１９Ａ／Ｋ２１３Ａ／Ｓ１１Ｙ（配列番号１３１）をコードするものを含む。例えば、米国特許第６，３２０，１００号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載される方法を用いて、トウモロコシのコドン最適化が実施される。構築物は、当業者に知られている標準的な分子生物学技術を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に形質転換される。形質転換のためのアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を調製するために、２８℃及び２２０ｒｐｍにおいて、液体ＹＰＣ培地中で細胞を一晩培養する。未成熟トウモロコシ胚のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換は、本質的にＮｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：７９８－８０３）に記載されるように実施される。この実施例では、全ての培地成分は、本質的に上記のＮｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．に記載される通りである。しかしながら、当技術分野において知られている種々の培地成分が代用され得る。

【0343】

形質転換、選択及び再生後、植物は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を用いて、選択可能なマーカーをコードする遺伝子及びｔｘｐ４０トウモロコシコドン最適化コード配列の存在についてアッセイされる。植物は、ベクター骨格の存在についても試験される。ベクター骨格に対して陰性であり、導入遺伝子の１つのコピーを含む植物を温室に移し、ＦＡＷ損傷に対する耐性についてアッセイする。結果は、両方のタンパク質が植物において発現し、ツマジロクサヨトウに対して活性であることを示すであろう。

【0344】

実施例６．第２の殺虫剤と組み合わせたＴｘｐ４０－１
Ｔｘｐ４０及び／又はＴｘｐ４０変異体は、実施例１と同様に細菌ライセートとして精製されるか、又はタンパク質として精製される。第２の殺虫剤、例えばＣｒｙタンパク質、及び／又はＶＩＰ、及び／又はｄｓＲＮＡが調製される。非限定的な例において、Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｊ及び／又はＣｒｙ２Ａタンパク質であり得る。他の非限定的な例において、Ｖｉｐ３タンパク質は、Ｖｉｐ３Ａ及び／又はＶｉｐ３Ｂタンパク質であり得る。ｄｓＲＮＡは、液胞型ＡＴＰシンターゼ、ベータ－チューブリン、２６Ｓプロテオソームサブユニットｐ２８タンパク質、ＥＦ１α４８Ｄ、トロポニンＩ、テトラスパニン、ガンマ－コートマー、ベータ－コートマー及び／又は幼若ホルモンエポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子を標的とし得る（国際公開番号国際公開第２０１８／０２６７７０号、国際公開第２０１８／０２６７７３号及び国際公開第２０１８／０２６７７４号；米国特許第７，８１２，２１９号明細書；それぞれ参照によって本明細書中に援用される）。本質的に実施例１に記載される通りであるが、第２の殺虫剤を添加して実施される飼料オーバーレイアッセイにおいて、精製Ｔｘｐ４０タンパク質及び第２の殺虫剤をＦＡＷに対する殺虫効力について試験する。

【0345】

本明細書に記載される実施例及び実施形態は、説明のためのみのものであり、及びその説明に照らして、種々の修正形態又は変化形態が当業者に示唆されることになり、本出願及び特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれるべきであることが理解されるはずである。

【0346】

本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の技能のレベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照によって援用されると具体的及び個別に示されているのと同程度まで参照によって本明細書に援用される。

【配列表】

2022536083000001.app

【国際調査報告】