特表 2022-536089 直接選別によるＴ細胞の製造方法およびその組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-12

(54)【発明の名称】直接選別によるＴ細胞の製造方法およびその組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20220804BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220804BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220804BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20220804BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220804BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 14/545 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20220804BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 14/535 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 14/56 20060101ALN20220804BHJP

   C07K 14/565 20060101ALN20220804BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20220804BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K38/21

A61K38/20

A61K38/19

A61K31/675

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/519

A61K35/76

C12Q1/04

C07K16/00

C07K14/545

C07K14/55

C12M1/34 B

C07K14/535

C07K14/56

C07K14/565

C12N15/117 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021571966

(86)(22)【出願日】2020-06-05

(85)【翻訳文提出日】2021-12-15

(86)【国際出願番号】 US2020036398

(87)【国際公開番号】W WO2020247802

(87)【国際公開日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】62/858,167

(32)【優先日】2019-06-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】102019129341.3

(32)【優先日】2019-10-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520184664

【氏名又は名称】イマティクス ユーエス，アイエヌシー．

(71)【出願人】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(74)【代理人】

【識別番号】100224786

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 卓之

(74)【代理人】

【識別番号】100225015

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 彩夏

(72)【発明者】

【氏名】アルパート，アミール

(72)【発明者】

【氏名】マウラー，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】スミス，アナスタシア

(72)【発明者】

【氏名】ワグナー，クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】モハメド，アリ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB11

4B029FA04

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ36

4B063QR48

4B063QS32

4B063QS33

4B065AA90X

4B065AA94X

4B065BA22

4B065BD39

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084DA12

4C084DA13

4C084DA14

4C084DA16

4C084DA19

4C084DA21

4C084DA22

4C084DA23

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB06

4C086DA35

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA20

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA03

4H045DA04

4H045DA12

4H045DA16

4H045DA17

4H045DA75

4H045EA20

(57)【要約】

本明細書に記載されるのは、患者またはドナーから得られた血液サンプルからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含有する多量体と、Ｔ細胞表面分子に結合する少なくとも１つの結合剤とを接触させるテップと、接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、第１および第２の検出可能薬剤について陽性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップとを含み、その中では、多量体が第１の検出可能な薬剤で標識され、結合剤が第２の検出可能な薬剤で標識される、Ｔ細胞を調製するための方法である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる第１の多量体と、ＭＨＣ分子との複合体中の無関係のペプチドを含んでなる第２の多量体とを接触させるステップと、
前記接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、前記第１の検出可能薬剤について陽性と検出され、前記第２の検出可能薬剤について陰性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、
前記収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、Ｔ細胞を調製する方法であって、
前記第１の多量体が第１の検出可能薬剤で標識され、前記第２の多量体が第２の検出可能薬剤で標識され、
前記第１の検出可能な薬剤が、前記第２の検出可能な薬剤と異なり、
前記無関係のペプチドが、前記標的ペプチドと５０％未満の配列同一性を有する、方法。

【請求項2】

前記接触させるステップが、前記第１の検出可能薬剤に結合する第１の結合剤および／または前記第２の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の結合剤および前記第２の結合剤が抗体である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記接触させるステップが、約４℃～約３７℃で実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記接触させるステップが、タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）の存在下で実施される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＰＫＩが、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セツキシマブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、カボザンチニブ、ダサチニブ、エヌトレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、バンデタニブ、およびベムラフェニブからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記選別、前記収集、および前記増殖が、閉鎖系で実行される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記標的ペプチドが、配列番号１４１のアミノ酸配列からなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記無関係のペプチドが、配列番号１～１４０および１４２～１６１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記無関係のペプチドが、配列番号１６、１８、１０５、１１８、および１６１から選択される少なくとも１つである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、
培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる第１の多量体と、ＭＨＣ分子との複合体中の無関係のペプチドを含んでなる第２の多量体とを接触させるステップと、
前記接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、前記第１の検出可能薬剤について陽性と検出され、前記第２の検出可能薬剤について陰性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、前記収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、Ｔ細胞を調製する方法であって、
前記第１の多量体が第１の検出可能薬剤で標識され、前記第２の多量体が第２の検出可能薬剤で標識され、
前記第１の検出可能な薬剤が、前記第２の検出可能な薬剤と検出可能に異なる、方法。

【請求項12】

前記血液サンプルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または白血球アフェレーシス産物である、請求項１１に記載の方法

【請求項13】

前記血液サンプルが患者から得られる、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項14】

前記血液サンプルがドナーから得られる、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３から選択される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記多量体多量体が四量体である、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＭＨＣ分子がクラスＩＭＨＣ分子である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１および前記第２の検出可能薬剤が、それぞれ蛍光化合物を含んでなる、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記選別および前記収集が、マイクロチップベースの細胞選別装置を使用して実行される、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記マイクロチップベースの細胞選別装置が、単回使用、使い捨て、および完全に閉じたマイクロ流体チップ細胞選別装置である、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記増殖させるステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実施される、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記選別、前記収集、および前記増殖が、閉鎖系で実行される、請求項１１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記接触させるステップが、前記第１の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤および／または前記第２の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤の存在下で実施される、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１の結合剤および前記第２の結合剤が抗体である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記接触させるステップが、約４℃～約３７℃で実施される、請求項１１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記無関係のペプチドが、配列番号１～１６１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ＭＨＣ分子との複合体中の前記無関係のペプチドが、ＭＨＣ分子との複合体中の前記標的ペプチドと同じＴ細胞に結合しない、請求項１１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記接触させるステップが、タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）の存在下で実施される、請求項１１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＰＫＩが、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セツキシマブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、カボザンチニブ、ダサチニブ、エヌトレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、バンデタニブ、およびベムラフェニブからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記接触させるステップが、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる、第３の多量体の存在下で実施される、請求項１１～３０のいずれか一項に記載の方法であって、前記第３の多量体が第３の検出可能薬剤で標識され、前記第３の検出可能薬剤が、前記第１および前記第２の検出可能薬剤と、検出可能に異なり、前記選別するステップが、前記第１および前記第３の検出可能薬剤について陽性と検出され、前記第２の検出可能薬剤について陰性と検出された、前記選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップを含んでなる、方法。

【請求項32】

前記多量体が、前記接触させるステップで使用される前に、濾過される、請求項１１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記血液サンプルが、約０．１×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１０００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約１×１０^６個の細胞／ｍｌ～約９００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約８００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約７００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約２０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約６００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約２５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約５００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約３０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約４００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約３５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約３００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約４０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約２００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約４５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１５０×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約９０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、または約９５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度の細胞を含んでなる、請求項１１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｔ細胞を調製するための前記方法が、前記単離されたＴ細胞を培養するステップに先だってまたはその最中に、前記Ｔ細胞を活性化するための抗原提示細胞の使用、またはＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ２７８、またはＣＤ１３７に対する作動薬の使用を含まない、請求項１１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記増殖したＴ細胞を単離するステップと取得するステップの間の期間が、約７日～約１４日、約７日～約２１日、約７日～約２８日、約１４日～約２１日、約１４日～約２８日、または約２１日～約２８日である、前記増殖したＴ細胞を取得するステップをさらに含んでなる、請求項１１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記方法が、ＣＤ８＋Ｔ細胞でなくＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップ、またはＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を単離するステップを含んでなる、請求項１１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を培養するステップが、前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されないように、Ｔ細胞活性化剤の非存在下で実行される、請求項１１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

血液サンプルと、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる、第１の検出可能薬剤で標識された第１の多量体と、
ＭＨＣ分子との複合体中の前記標的ペプチドと異なる無関係のペプチドを含んでなる、第２の検出可能薬剤で標識された第２の多量体と
を接触させるステップと、
前記接触された細胞を選別し、前記第１の検出可能薬剤について陽性と検出され、第２の検出可能薬剤前記について陰性と検出された前記選別された細胞を収集するステップと、
前記収集されたＴ細胞を増殖させるステップとを含んでなる、Ｔ細胞を調製する方法であって、
前記第１および前記第２の検出可能薬剤が、検出可能に異なる検出可能薬剤である、方法。

【請求項39】

前記血液サンプルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または白血球アフェレーシス産物である、請求項３８に記載の方法

【請求項40】

前記血液サンプルが患者から得られる、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

前記血液サンプルがドナーから得られる、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記接触させるステップが、前記第１の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤および／または前記第２の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤の存在下で実施される、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の１に記載の方法。

【請求項43】

前記第１の結合剤および前記第２の結合剤が抗体である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記接触させるステップが、約４℃～約３７℃で実施される、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記無関係のペプチドが、配列番号１～１６１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ＭＨＣ分子との複合体中の前記無関係のペプチドが、ＭＨＣ分子との複合体中の前記標的ペプチドと同じＴ細胞に結合しない、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記接触させるステップが、タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）の存在下で実施される、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記ＰＫＩが、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セツキシマブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、カボザンチニブ、ダサチニブ、エヌトレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、バンデタニブ、およびベムラフェニブからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記接触させるステップが、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる、第３の多量体の存在下で実施される、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法であって、前記第３の多量体が第３の検出可能薬剤で標識され、前記第３の検出可能薬剤が、前記第１および前記第２の検出可能薬剤と、検出可能に異なり、前記選別するステップが、前記第１および前記第３の検出可能薬剤について陽性と検出され、前記第２の検出可能薬剤について陰性と検出された、前記選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップを含んでなる、方法。

【請求項50】

前記多量体が、前記接触させるステップで使用される前に、フィルターを通して濾過される、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記Ｔ細胞を調製するための前記方法が、前記単離されたＴ細胞を培養するステップに先だってまたはその最中に、前記Ｔ細胞を活性化するための抗原提示細胞の使用、またはＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ２７８、またはＣＤ１３７に対する作動薬の使用を含まない、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記増殖したＴ細胞を単離するステップと取得するステップの間の期間が、約７日～約１４日、約７日～約２１日、約７日～約２８日、約１４日～約２１日、約１４日～約２８日、または約２１日～約２８日である、前記増殖したＴ細胞を取得するステップをさらに含んでなる、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記血液サンプルが、約０．１×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１０００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約１×１０^６個の細胞／ｍｌ～約９００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約８００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約７００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約２０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約６００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約２５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約５００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約３０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約４００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約３５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約３００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約４０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約２００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約４５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１５０×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約９０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、または約９５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度の細胞を含んでなる、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法によって調製された前記ペプチド特異的Ｔ細胞を含んでなる、組成物。

【請求項55】

アジュバントをさらに含んでなる、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

前記アジュバントが、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリ－（Ｉ：Ｃ）、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）を含む粒子状製剤、ビロソーム、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３から選択される、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

請求項５４～５６のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与することを含んでなる、がんを有する特許を治療する方法であって、前記がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん（ＢＲＣＡ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、および子宮がん（ＵＥＣ）から選択される、方法。

【請求項58】

患者におけるがんの治療で使用するための、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、前記患者に投与され、前記がんが、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん（ＢＲＣＡ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、および子宮がん（ＵＥＣ）から選択される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、養子免疫療法のためのＴ細胞を製造する方法に関する。本開示は、Ｔ細胞およびＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、宿主に生産的免疫応答を生じさせる。Ｔ細胞は、患者の血液または腫瘍から採取され、次に生体外培養システム内で成長および増殖するように刺激されてもよい。十分な生体外増殖後、これらの細胞は宿主に再注入されてもよく、そこで理想的には腫瘍破壊を媒介する。したがって、このプロセスは、介入前には生産的な抗がん応答を保有しないように見える、がん患者の大多数に適用可能である。

【0003】

様々な形態の抗原と刺激細胞とを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いるインビトロ法は、以前の抗原への生体内曝露によって宿主中でプライミングされた、例えば、ウイルス特異的な、生体外メモリーＴ細胞を増殖させるのに有効であることが示されている。

【0004】

非特許文献１は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンが、単球由来樹状細胞（ＤＣ）による患者由来（自系）またはドナー由来（同種異系）のＴ細胞の抗原特異的刺激を繰り返すことで、生体外で生成されてもよいこと、およびウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１）ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の成功裏の増殖が、細胞培養条件に、より大きく依存するようであることを教示する。しかし、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，は、増殖前に活性化または刺激されなかったＴ細胞を増殖させることによる、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの生成は教示していない。

【0005】

非特許文献２は、同種異系造血幹細胞移植後に再発した白血病患者におけるＷＴ１に対する活性を有する、同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞の使用を開示している。クローンは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナー細胞の白血球アフェレーシスと、例えば、樹状細胞などのペプチドパルス自己ＡＰＣによる数ヶ月にわたる反復刺激とによって、生成されてもよい。養子移入されたリンパ球は、患者の血液中で長期間検出可能なままであり、これらの高再発リスク患者の２／１１で一過性の応答が観察され、別の３人では安定した疾患が観察された。しかし、Ｃｈａｐｕｉｓ ｅｔ ａｌ，は、増殖前に活性化または刺激されなかったＴ細胞を増殖させることによる、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの生成は教示していない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｈｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００６；３１０４０－５２

【非特許文献2】Ｃｈａｐｕｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１３；５：１７４ｒａ２７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＡＣＴのためのＴ細胞を製造するための、簡単で効率的で費用効果の高い方法に対する必要性がある。この技術的問題の解決策が、本明細書で提供される。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様では、本開示は、患者またはドナーから得られた血液サンプルからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含有する多量体と、Ｔ細胞表面分子に結合する少なくとも１つの結合剤とを接触させるテップと、接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、第１および第２の検出可能な薬剤について陽性と検出された選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集し、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップとを含む、Ｔ細胞を調製するための方法に関し、その中では、多量体は第１の検出可能な薬剤で標識され、結合剤は第２の検出可能な薬剤で標識され、その中では、第１の検出可能な薬剤は、第２の検出可能な薬剤と検出可能に異なる。

【0009】

別の態様では、多量体は、一価または多価の様式で関心のある標的ペプチドを含有する、ＨＬＡ複合体、分子、またはペプチド配列であってもよい。

【0010】

別の態様では、接触させるステップは、ＭＨＣ分子との複合体中に無関係のペプチドを含有する、多量体の存在下で実施されてもよい。

【0011】

別の態様では、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を培養させるステップは、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されないように、Ｔ細胞活性化剤の非存在下であってもよい。

【0012】

別の態様では、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞を接触させるステップは、多量体の存在下で、結合剤の非存在下であってもよい。

【0013】

別の態様では、少なくとも１つの結合剤は、抗体であってもよい。

【0014】

別の態様では、結合剤は、例えば、デキストラマーなどの多量体であってもよい。

【0015】

別の態様では、この方法は、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、増殖前に第１および第２の検出可能な薬剤について陽性と検出された収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を得るステップをさらに含んでもよい。

【0016】

別の態様では、血液サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または白血球アフェレーシス産物であってもよい。

【0017】

別の態様では、血液サンプルは、患者から得られてもよい。

【0018】

別の態様では、血液サンプルは、ドナーから得られてもよい。

【0019】

別の態様では、少なくとも１つのサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３から選択されてもよい。

【0020】

別の態様では、多量体は、四量体であってもよい。

【0021】

別の態様では、ＭＨＣ分子は、クラスＩＭＨＣ分子であってもよい。

【0022】

別の態様では、第１および第２の検出可能薬剤はそれぞれ、蛍光化合物を含んでもよい。

【0023】

別の態様では、Ｔ細胞表面分子は、Ｔ_{ＮＡＩＶＥ}細胞表面マーカーを含んでもよい。

【0024】

別の態様では、Ｔ_{ＮＡＩＶＥ}細胞表面マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ１９７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒα）、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌから選択されてもよい。

【0025】

別の態様では、選別は、例えば、ＢＤ（Becton, Dickinson） ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting）（登録商標）選別装置などの任意の細胞選別装置を用いて実施されてもよい。

【0026】

別の態様では、増殖は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実施されてもよい。

【0027】

別の態様では、選別、収集、および増殖は、閉鎖系で実施されてもよい。

【0028】

別の態様では、閉鎖としては、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）、ＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、ＢｉｏＳａｆｅ Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター、Ｇ－Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系、またはＢｉｏＳａｆｅ Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ－Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系が挙げられてもよい。

【0029】

一態様では、本開示は、患者またはドナーから得られた血液サンプルからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中のペプチドを含有する第１の多量体と、ＭＨＣ分子との複合体中のＴ細胞表面分子に結合する第１の結合剤、第１の多量体に含有されるペプチドとは異なる無関係のペプチドを含有する第２の多量体と、第１の多量体に結合する第２の結合剤とを接触させるステップと、接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、第１のおよび第２の検出可能薬剤について陽性と検出され、第３の検出可能薬剤について陰性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップとを含む、Ｔ細胞を調製するための方法に関し、その中では、第１の多量体は第１の検出可能な薬剤で標識されてもよく、第１の結合剤は第２の検出可能な薬剤で標識され、その中では、第２の多量体は、第３の検出可能薬剤で標識されもよく、その中では、第１、第２、および第３の検出可能薬剤は、検出可能薬剤と検出可能に異なってもよい。

【0030】

別の態様では、第２の結合剤は、第１の検出可能薬剤に結合する。

【0031】

別の態様では、第１の検出可能薬剤は、少なくとも２つの蛍光色素を含んでなる。

【0032】

別の態様では、接触させるステップは、タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）の存在下で実施されてもよい。

【0033】

別の態様では、ＰＫＩは、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セツキシマブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、カボザンチニブ、ダサチニブ、エヌトレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、バンデタニブ、またはベムラフェニブから選択されてもよい。

【0034】

別の態様では、Ｔ細胞活性化剤の除外は、抗原提示細胞の除外を含んでもよい。

【0035】

別の態様では、Ｔ細胞活性化剤の除外は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の除外を含んでもよい。

【0036】

一態様では、本開示は、本開示の方法によって調製された、ペプチド特異的Ｔ細胞を含有する組成物に関する。

【0037】

別の態様では、組成物は、アジュバントをさらに含有してもよい。

【0038】

別の態様では、アジュバントは、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリ－（Ｉ：Ｃ）、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）を含む粒子状製剤、ビロソーム、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３から選択されてもよい。

【0039】

一態様では、本開示は、本開示の組成物を患者に投与するステップを含む、がんを有する患者を治療する方法に関し、その中では、前記がんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん（ＢＲＣＡ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、および子宮がん（ＵＥＣ）から選択されてもよい。

【0040】

別の態様では、接触させるステップは、約１ｎＭ～約１０００ｎＭ、約１ｎＭ～約９００ｎＭ、約１ｎＭ～約８００ｎＭ、約１ｎＭ～約７００ｎＭ、約１ｎＭ～約６００ｎＭ、約１ｎＭ～約５００ｎＭ、約１ｎＭ～約４００ｎＭ、約１ｎＭ～約３００ｎＭ、約１ｎＭ～約２００ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約５ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約１００ｎＭ、約４０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約６０ｎＭ～約１００ｎＭ、約７０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約２００ｎＭ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約５０ｎＭ～約１２０ｎＭの濃度のＰＫＩの存在下で実施されてもよい。

【0041】

別の態様では、本開示は、患者またはドナーから得られた血液サンプルからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる第１の多量体と、ＭＨＣ分子との複合体中の無関係のペプチドを含んでなる第２の多量体とを接触させるステップと、接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、第１の検出可能薬剤について陽性と検出され、第２の検出可能作用物質について陰性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップとを含む、Ｔ細胞を調製するための方法に関し、その中では、第１の多量体は第１の検出可能薬剤で標識され、第２の多量体は第２の検出可能薬剤で標識され、その中では、第１の検出可能な薬剤は、第２の検出可能な薬剤と検出可能に異なる。

【0042】

一態様では、本開示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を少なくとも１つのサイトカインの存在下で培養するステップと、培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含有する多量体と、Ｔ細胞表面分子に結合する少なくとも１つの結合剤とを接触させるテップと、接触されたＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、第１および第２の検出可能薬剤について陽性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップと、収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるステップとを含む、Ｔ細胞を調製するための方法に関し、その中では、多量体が第１の検出可能な薬剤で標識され、結合剤が第２の検出可能な薬剤で標識され、その中では、第１の検出可能な薬剤は、第２の検出可能な薬剤と検出可能に異なる。

【0043】

別の態様では、本開示は、血液サンプルと、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる、第１の検出可能薬剤で標識された第１の多量体と、ＭＨＣ分子との複合体中の標的ペプチドと異なる無関係のペプチドを含んでなる第２の多量体とを接触させるステップと、接触された細胞を選別し、第１の検出可能薬剤について陽性と検出され、第２の検出可能薬剤について陰性と検出された選別された細胞を収集するステップと、収集されたＴ細胞を増殖させるステップとを含む、Ｔ細胞を調製するための方法に関し、ここで第２の多量体は、第２の検出可能薬剤で標識され、その中では、第１および第２の検出可能薬剤は、検出可能に異なる検出可能薬剤である。

【0044】

別の態様では、接触させるステップは、第１の検出可能薬剤に結合する第１の結合剤および／または第２の検出可能薬剤に結合する第２の結合剤の存在下で実施されてもよい。

【0045】

別の態様では、第１の結合剤および第２の結合剤は、抗体であってもよい。

【0046】

別の態様では、接触させるステップは、約４℃、室温、約３７℃、約２℃～約８℃、約１８℃～約２６℃、または約３２℃～約３８℃で実施されてもよい。

【0047】

別の態様では、無関係のペプチドは、配列番号１～１６１からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

【0048】

別の態様では、接触させるステップは、ＭＨＣ分子との複合体中に標的ペプチドを含有する、第３の多量体の存在下で実施されてもよく、その中では、第３の多量体は、第３の検出可能薬剤で標識され、その中では、第３の検出可能薬剤は、第１および第２の検出可能薬剤と検出可能に異なってもよく、その中では、選別するステップは、第１および第３の検出可能薬剤について陽性と検出され、第２の検出可能薬剤について陰性と検出された、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を収集するステップを含んでなる。

【0049】

別の態様では、多量体は、接触させるステップで使用される前に、フィルターを通して濾過されてもよい。

【0050】

別の態様では、血液サンプルは、約０．１×１０^３個の細胞／ｍｌ～約１０００×１０^４個の細胞／ｍｌ、約５×１０^５個の細胞／ｍｌ～約９００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約２×１０^５個の細胞／ｍｌ～約８００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約１０×１０^５個の細胞／ｍｌ～約７００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約２０×１０^５個の細胞／ｍｌ～約６００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約２５×１０^５個の細胞／ｍｌ～約５００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約３０×１０^５個の細胞／ｍｌ～約４００×１０^５個の細胞／ｍｌ、約３５×１０^５個の細胞／ｍｌ～約３００×１０^７個の細胞／ｍｌ、約４０×１０^５個の細胞／ｍｌ～約２００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約４５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１５０×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約５５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約６５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約７５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約８５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、約９０×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌ、または約９５×１０^６個の細胞／ｍｌ～約１００×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度の細胞を含有してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】従来のＴ細胞製造プロセスと、本開示の一実施形態による直接選別Ｔ細胞製造との比較を示す。

【図2】Ａ－Ｄ ＭＬＡペプチド選別のためのＣＤ８＋細胞単離を示す。

【図3】第１のＭＬＡ選別を示す。

【図4】第２のＭＬＡ選別を示す。

【図5】本開示の一実施形態による、ＭＬＡ選別の結果を示す。

【図6】Ａ 本開示の一実施形態による、出発物質中のＴ細胞の記憶表現型を示す。 Ｂ 本開示の別の実施形態による、ＭＬＡ直接選別後のＴ細胞の記憶表現型を示す。

【図7】四量体陽性前駆体の大部分がＴ_{ＮＡＩＶＥ}細胞である、直接選別後の記憶表現型を示す。

【図8】四量体陽性前駆体の大部分がＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを発現するＴ_{ＮＡＩＶＥ}細胞である、直接選別後の記憶表現型を示す。

【図9】Ａ－Ｄ ＭＡＧＥＡ１選別のためのＣＤ８＋細胞単離を示す。

【図10】本開示の一実施形態によるＭＡＧＥＡ１選別を示す。

【図11】本開示の別の実施形態によるＭＡＧＥＡ１選別を示す。

【図12】本開示の別の実施形態によるＭＡＧＥＡ１選別を示す。

【図13】本開示の別の実施形態によるＭＡＧＥＡ１選別を示す。

【図14】本開示の別の実施形態によるＭＡＧＥＡ１選別を示す。

【図15】Ａ ＭＬＡおよびＭＡＧＥＡ１直接選別されたＴ細胞のＲＥＰ１後の細胞数、生存率、および倍数増殖を示す。 Ｂ ＭＬＡおよびＭＡＧＥＡ１直接選別されたＴ細胞のＲＥＰ２後の細胞数、生存率、および倍数増殖を示す。

【図16】Ａ－Ｂ ＭＬＡおよびＭＡＧＥＡ１で直接選別されたＴ細胞のＲＥＰ１後およびＲＥＰ２後のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞をそれぞれ示す。

【図17】Ａ－Ｂ ＭＬＡおよびＭＡＧＥＡ１で直接選別されたＴ細胞のＲＥＰ１後およびＲＥＰ２後のＴｅｔ＋ＣＤ８＋細胞をそれぞれ示す。

【図18】Ａ 図１６Ａおよび図１７ＡにおけるＭＬＡのＲＥＰ１後のフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 図１６Ｂおよび図１７ＢにおけるＭＬＡのＲＥＰ２後のフローサイトメトリーデータを示す。

【図19】Ａ ＲＥＰ１後のＡｇ００１－００２のフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ ＲＥＰ２後のＡｇ００１－００２のフローサイトメトリーデータを示す。

【図20】Ａ ＭＬＡ直接選別されたＴ細胞のＴ２殺滅アッセイを示す。 Ｂ ＭＡＧＥＡ１直接選別されたＴ細胞のＴ２殺滅アッセイを示す。

【図21】Ａ ３７℃でのダサチニブの存在下での細胞選別を示す。 Ｂ 室温でのダサチニブの非存在下での細胞選別を示す。

【図22】Ａ 本開示の一実施形態による、αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞染色のフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の一実施形態による、αＭＬＡ Ｔ細胞染色のフローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞および染色αＭＬＡ Ｔ細胞の混合物のフローサイトメトリーデータを示す。

【図23】Ａ 本開示の一実施形態による、二重染色四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の一実施形態による、単一染色四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、二重染色四量体および単一染色四量体のＲ二乗値を示す。

【図24】Ａ 本開示の別の実施形態による、二重染色四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の別の実施形態による、単一染色四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の別の実施形態による、二重染色四量体および単一染色四量体のＲ二乗値を示す。 Ｄ 本開示の別の実施形態による、二重染色四量体および単一染色四量体のＲ二乗値を示す。

【図25】Ａ 本開示の一実施形態による、単一染色四量体および抗蛍光色素抗体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の別の実施形態による、単一染色四量体および抗蛍光色素抗体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、二重染色四量体および抗蛍光色素抗体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｄ 本開示の別の実施形態による、二重染色四量体および抗蛍光色素抗体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｅ 二重染色四量体および抗蛍光色素抗体で染色された対照細胞のフローサイトメトリーデータを示す。

【図26】本開示の一実施形態による、スパイクされたサンプルのフローサイトメトリーデータを示す。

【図27】本開示の一実施形態による、二重染色四量体およびブロッキング剤を用いたフローサイトメトリーデータを示す。

【図28】Ａ 本開示の一実施形態による、室温（ＲＴ）での二重染色四量体および無関係のペプチド四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の一実施形態による、３７℃での二重染色四量体および無関係のペプチド四量体を用いたフローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、染色に対する無関係のペプチド四量体の効果を示す。

【図29】本開示の一実施形態による、染色に対するダサチニブ（ＤＡＳ）の効果を示す。

【図30】本開示の一実施形態による、染色に対する温度の効果を示す。

【図31】Ａ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図32】本開示のいくつかの実施形態による染色条件の染色指数を示す。

【図33】Ａ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図34】Ａ 本開示の一実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図35】Ａ 本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図36】Ａ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 図３６Ａおよび図３６Ｂに示されるデータの棒グラフを示す。

【図37】Ａ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示の一実施形態による、細胞染色におけるＤＡＳ処理ありとなしとの比較を示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、平均蛍光強度（ＭＦＩ）におけるＤＡＳ処理ありとなしとの比較を示す。

【図38】本開示の一実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図39】本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図40】Ａ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｂ 本開示のいくつかの実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。 Ｃ 本開示の一実施形態による、特定のＴ細胞の頻度におけるＤＡＳ処理ありとなしとの比較を示す。 Ｄ 本開示の別の実施形態による、平均蛍光強度（ＭＦＩ）におけるＤＡＳ処理ありとなしとの比較を示す。 Ｅ 本開示の一実施形態による、染色に対する濾過された四量体の効果を示す。

【図41】本開示の一実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図42】本開示の別の実施形態による染色条件から得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図43】本開示の一実施形態による選別ストラテジーから得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【図44】図４３の選別性能を示す略図である。

【図45】本開示の別の実施形態による選別ストラテジーから得られた、フローサイトメトリーデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0052】

養子細胞療法（ＡＣＴ）は、患者への細胞の移動であり、個別化された複数標的化ＡＣＴアプローチであり、その中では、Ｔ細胞製品は、特定の腫瘍タイプおよび／または個々の患者の腫瘍プロファイルに関連する腫瘍抗原のパネルから選択される、少なくとも１つの標的に対して腫瘍が陽性である患者のための、関連する腫瘍標的ペプチド抗原に対して製造されてもよい。例えば、本明細書の表１を参照されたい。

【0053】

疾患の治療または予防のためのＡＣＴは、体外で選択、操作、または改変された細胞を投与することによって実施されてもよい。より多くの細胞ベースの治療製品が、臨床試験および商業化に向けて進むにつれて、現在の製造管理および品質管理に関する基準（ＣＧＭＰ）に準拠したバイオプロセスの開発は困難になってきている。これは、最終製品がモノクローナル抗体のような伝統的な生物学的（分泌）分子ではなく、細胞それ自体であるためであってもよい。そのため、細胞純度の重要性とＣＧＭＰ規制へのプロトコル遵守に関連する特殊な考慮事項のために、１つの焦点は細胞単離に当てられている。

【0054】

例えば、Ｔ細胞などの細胞ベースの製品の従来の製造のための一般的なステップは、収穫、減量、および単離、例えば、活性化、増殖、および／または遺伝子改変などの生体外操作、および凍結保存を含んでもよい。生体外でＴ細胞を生成するために、いくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自系腫瘍浸潤性リンパ球が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生成するために使用され得る。その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ ２５（１９９５）：１７８３－１７８７）は、Ｔ細胞の調製において自系末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自系Ｔ細胞の生成も可能である。Ｂ細胞もまた、自系Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己細胞の調製において使用されてもよい。その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １７１（２００３）４９７４－４９７８）は、これもまた選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用した、Ｔ細胞の生体外プライミングを記載する。例えば、ポリスチレン粒子（マイクロビーズ）の表面に、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体をビオチン：ストレプトアビジンの生化学的手法で結合させることにより、ａＡＰＣが生成されてもよい。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にしてもよく、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答の選択的誘発を可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有してもよい。さらに、このようなａＡＰＣベースのシステムは、例えば、インターロイキン１２のようなサイトカインなどの適切な可溶性因子を含んでいてもよい。

【0055】

図１（左側フローチャート）は、ＰＢＭＣ単離およびＣＤ２５枯渇を含んでもよい、Ｔ細胞製造のための従来のプロセスと、それに続く（１）樹状細胞（ＤＣ）の１週間の生成、（２）ＤＣによるＴ細胞の１週間の第１の刺激（Ｓｔｉｍ １）、（３）ＤＣによるＳｔｉｍ １ Ｔ細胞の１週間の再刺激（Ｓｔｉｍ ２）、（４）刺激された細胞の選別（５）選別された細胞の第１の「急速増殖プロトコル」（ＲＥＰ１）による２週間の増殖、および（６）ＲＥＰ１で増殖されたＴ細胞の２週間の増殖（ＲＥＰ２）を示す。

【0056】

本開示は、Ｔ細胞産物を生成する改善された方法を提供する。図１（右側フローチャート）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を含んでもよい、Ｔ細胞製造のための直接プロセスと、それに続く（１）刺激された細胞の選別（２）選別された細胞の第１の「急速増殖プロトコル」（ＲＥＰ１）による２週間の増殖、および（３）ＲＥＰ１で増殖されたＴ細胞の２週間の増殖（ＲＥＰ２）の一実施形態を示す。代案としては、選別されたＴ細胞は、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などのアンタゴニスト抗体、または人工抗原提示細胞でのＴ細胞の刺激によって増殖されてもよい。

【0057】

一態様では、本明細書に記載の直接選別プロセスは、従来のプロセスよりも大幅に短い時間で、生存可能なＴ細胞の生成を提供する。例えば、図１は、従来のプロセスが、例えば、完了するまでに約５２日など、約５０日～約５５日かかってもよいことを示す一方で、直接選別は、例えば、完了するまでに約７日～約１４日、約７日～約２１日、約７日～約２８日、約１４日～約２１日、約１４日～約２８日、または約２１日～約２８日、約３０日以下など、完了するまでに３０日以下、または例えば、ＲＥＰの１回だけの実行など、完了するまでに約１６日以下かかってもよい。

【0058】

別の態様では、直接選別プロセスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離を含んでもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、正常組織、例えば腫瘍などの罹患組織、全血、ＰＢＭＣ、白血球アフェレーシス産物、および／または治療を受ける患者または健常ドナーから得られた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から単離されてもよい。

【0059】

別の態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度は、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。

【0060】

別の態様では、直接選別プロセスは、例えば、ＣＤ８＋細胞単離なしで、出発物質としてＰＢＭＣを使用して実行されてもよい。

【0061】

別の態様では、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞胞は、サイトカインの存在下または非存在下で組織培養中に休止させてもよい。本明細書の用法では、休止Ｔ細胞は、分裂中でないか、またはサイトカインを産生していないＴ細胞を意味する。休止Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞（およそ１２～１５ミクロン）と比較して、サイズが小さい（およそ６～８ミクロン）。

【0062】

一態様では、以前に生体外で活性化されていない単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、サイトカインの存在下または非存在下で休止させてもよい。休止は、約０．５時間～約１２０時間、約０．５時間～約１０８時間、約０．５時間～約９６時間、約０．５時間～約８４時間、約０．５時間～約７２時間、約０．５時間～約６０時間、約０．５時間～約４８時間、約０．５時間～約３６時間、約１２時間～約９６時間、約２４～７２時間、約１２～約６０時間、約０．５時間～約２４時間、約０．５時間～約１８時間、約０．５時間～約１２時間、約０．５時間～約６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約２～約８時間、約３時間～約６時間、または約１時間～約５時間内に実行されてもよい。

【0063】

別の態様では、休止は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組み合わせであり得る。ＩＬ－７やＩＬ－７ＩＬ－１５などの、サイトカイン非存在下またはサイトカイン存在下で、約０．５時間～約４８時間、約０．５時間～約３６時間、約０．５時間～約２４時間、約０．５時間～約１８時間、約０．５時間～約１２時間、約０．５時間～約６時間、約１時間～約６時間、約２時間～約５時間、約３時間～約５時間、約４時間～６時間、約１時間～約２４時間、約２～約２４時間、約１２～約４８時間、約０．５時間～約１２０時間、約０．５時間～約１０８時間、約０．５時間～約９６時間、約０．５時間～約８４時間、約０．５時間～約７２時間、または約０．５時間～約６０時間、約４～約６時間、約１２時間～約９６時間、約２４～７２時間、約１２～約６０時間、約０．５時間～約２４時間、約０．５時間～約１８時間、約０．５時間～約１２時間、約０．５時間～約６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、または約２～約８時間であってもよい。

【0064】

一態様では、直接選別プロセスは、選別前に、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するステップを含まない。例えば、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドパルスＤＣまたはペプチド特異的ａＡＰＣによるシグナル１を介して；および／またはＣＤ３（例えば、抗ＣＤ３抗体）、ＣＤ２８（例えば、または抗ＣＤ２８抗体）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および／または４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７）に対する作動薬によるシグナル２を介して、活性化されなくてもよい。

【0065】

細胞選別
本発明は、細胞選別技術を利用してＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する、より効率的な方法を包含する。表面マーカーに基づく細胞選別は、典型的には、関心のある細胞表面の特徴を特異的に認識して結合する抗体またはその他の試薬を用いる、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、パンニング、リセットなどをはじめとするが、これらに限定されるものではない、１つまたは複数の技術によって実行されてもよい。細胞内マーカーに基づく細胞選別は、細胞を固定化および透過処理し、それに続く例えば、細胞内マーカーに特異的な標識抗体での染色による、ＦＡＣＳを使用して実行されてもよい。リンパ球は、ＦＡＣＳを使用して、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｌｕｘ（カリフォルニア州サンホセのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの市販の機器、および製造業者のプロトコルおよびキットを使用して、関心のあるサブセットに選別されてもよい。Τ細胞受容体またはΒ細胞受容体のどちらかの抗原特異性に基づくリンパ球の選別または分離は、ＦＡＣＳを用いて、またはＦＡＣＳとＭＡＣＳなどのその他の技術との組み合わせを用いて、実行されてもよい。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）などの細胞選別装置は、全ての実験毎に使い捨てることは意図されない、複雑な流体ラインを備えた圧力ポンプを使用する。これらの細胞選別装置の使用者は、相互汚染を避けるために、各実験の間に厳密な洗浄ステップを実施してもよい。

【0066】

細胞選別はまた、マイクロチップを使用して実施されてもよい。マイクロチップ上の細胞選別は、必要な機器のサイズを縮小し、潜在的バイオハザードのエアロゾルを排除し、細胞選別に一般的に関連する複雑なプロトコルを簡略化することにより、従来法に比べて多数の利点を提供する。さらに、マイクロチップデバイスは並列化に良好に適合していてもよく、細胞の単離、分析、および実験処理のための完全なラボオンチップデバイスを可能にする。

【0067】

一態様では、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、圧力ポンプまたはシリンジポンプを使用して選別のための一定の流量を有する、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｔｙｔｏ（登録商標）細胞選別装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＯｎ－Ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔｔ（Ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのマイクロチップベースの細胞選別装置を使用する多重パラメータ選別を用いた引き続く選別のために、例えば、フルオロフォアなどの検出可能薬剤によってタグ付けされた四量体などのペプチド／ＭＨＣ多量体で標識されてもよい。マイクロチップベースの細胞選別装置は、一般に、完全に閉じた滅菌カートリッジシステムを利用した使いやすい卓上選別装置である。そのため、チップの選別は細胞に対して非常に穏やかであり、生存率を損なうことなく複数の連続した選別が可能である。

【0068】

一態様では、直接選別プロセスは、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の前駆体Ｔ_{ＮＡＩＶＥ}を含有する、増殖前および選別後のペプチド四量体陽性Ｔ細胞を生成してもよい。

【0069】

一態様では、直接選別プロセスは、従来のプロセスで生成された最終製品に増殖される前および純度選別後と同様の百分率の前駆体Ｔ_{ＮＡＩＶＥ}細胞を生成してもよい。

【0070】

一態様では、直接選別によって得られる選別されたＴ細胞は、少なくとも１周期の「迅速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）を用いて増殖されてもよい。本明細書で使用される「迅速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）という用語は、その内容全体が参照により援用される、Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２８，１８９）で以前記載されたように、ＲＥＰプロトコルを用いて生体外で増殖された、例えば、ＴＩＬおよびＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞のクローン集団を指す。例えば、およそ５×１０^４個のＣＤ８＋Ｔ細胞（または９６ウェルクローニングプレートからの単一細胞コロニー）が、５×１０^６個の照射ＴＭ－ＬＣＬ、２５×１０^６個の照射同種異系ＰＢＭＣ、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、および５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む、ＣＴＬ培地からなる、２５ｍｌのクローニング混合物を含有する、Ｔ２５組織培養フラスコに添加されてもよい。４日間の培養後に培養物が採取され、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加した等容積の新鮮なＣＴＬ培地に再懸濁されてもよい。培養液は、３～４日毎に培地の半量を新鮮なＣＴＬ培地と最終濃度５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で置き換えることによって供給されてもよい。細胞は多量体染色による分析またはクロム放出アッセイのために、培養の１２日目以降に採取されてもよい。

【0071】

一態様では、選別されたＴ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２１などのサイトカインの存在下で増殖されてもよい。

【0072】

一態様では、ＩＬ－２の濃度は、約１０ＩＵ／ｍｌ～１０００ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ～９００ＩＵ／ｍｌ、約３０ＩＵ／ｍｌ～８００ＩＵ／ｍｌ、約４０ＩＵ／ｍｌ～７００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～６００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～５５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～４５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～４００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～３５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～３００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～２５０ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ～１５０ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌであってもよい。

【0073】

別の態様では、ＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0074】

別の態様では、ＩＬ－１２の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0075】

一態様では、ＩＬ－１５の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0076】

一態様では、ＩＬ－２１の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0077】

一態様では、直接選別プロセスは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞生存率を含有するＴ細胞を増殖後に生成してもよい。

【0078】

一態様では、直接選別プロセスは、少なくとも５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、または１００００倍の増殖を達成するＴ細胞を増殖後に生成してもよい。

【0079】

本開示の利点としては、（１）生存率を損なうことなく複数の連続した選別を可能にする、細胞に非常に穏やかな影響を与えるマイクロチップベースの選別、（２）約８ｍｌ／時間（標準カートリッジの約２倍の速度）で選別できる高速カートリッジ、（３）複数の標的に対する高純度の抗原特異的Ｔ細胞をもたらす、２×１０^７個の細胞／ｍｌ～４×１０^７個の細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度での一連の選別と、それに続く純度を高めるための迅速な選別、（４）従来のＡＰＣ刺激によるものと同様の表現型の抗原特異的Ｔ細胞を産生する、サイトカインやフィーダー細胞の存在下で高い細胞数まで迅速に増殖する、選別された細胞、（５）迅速増殖段階全体を通じて、汚染ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を最小限に抑え、製品の純度を維持する、最初のＣＤ８＋Ｔ細胞と四量体の選別、（６）Ｔ細胞製品の製造に必要な時間が５０％近く短縮され、ＡＰＣの利用可能性、またはそれに対して製品が生成され得る腫瘍標的の数に制限されない、本開示の短縮されたプロセス、（７）臨床グレードの自動ＣＤ８選択、完全に閉じた選別カートリッジと、それに続く閉鎖系増殖技術の任意の選択を使用して、ＣＧＭＰの下で製造するための閉鎖系に簡単に変換できるプロセス、および（８）所望の標的ペプチドに類似した（しかし同一ではない）配列を有するペプチドに対する交差反応性が低下した、それらの所望の標的ペプチドに高度に特異的なＴ細胞を提供する、標的ペプチド選択的Ｔ細胞をするための方法が挙げられてもよい。

【0080】

腫瘍特異的Ｔ細胞を単離および選択するための従来のプロセスでは、単離された細胞はＴ細胞活性化を受ける。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の使用は、Τ細胞集団に活性化シグナルを提供する。Τ細胞は、活性化のために少なくとも２つのシグナルを必要としてもよい。シグナル１（シグナル－１）は抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介して受信されるペプチド／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）複合体によって惹起される。シグナル２（シグナル－２）（抗原非特異的）もまた、抗原提示細胞によって送達され、その受容体の候補分子の１つはΤ細胞抗原ＣＤ２８である。ＴＣＲ／ＣＤ３とＣＤ２８の双方のΤ細胞受容体が適切なリガンドによって占有されると、Τ細胞は刺激を受けて増殖し、ＩＬ－２（Τ細胞増殖に不可欠なサイトカイン）を産生する一方で、Τ細胞受容体が単独で占有されると、Τ細胞のアネルギーまたはアポトーシスが促進されると考えられている。生体外では、固相に固定化された抗ＣＤ３抗体（例えば、ビーズまたは組織培養プレート）でΤ細胞を培養し、可溶性ＣＤ２８抗体を添加することによって、Τ細胞増殖およびサイトカイン産生が刺激され得ることが示されている。さらに、ＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体の双方を同じ固相に、または異なる固相に共固定化することで、Τ細胞の増殖が誘導され得ることが示されている。

【0081】

ＴＣＲはＴリンパ球（またはＴ細胞）の表面に見られる分子であり、それは一般に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。Ｔ細胞の９５％は、αおよびβ鎖からなるヘテロ二量体であるが、Ｔ細胞の５％は、γおよびδ鎖からなるＴＣＲを有する。ＴＣＲと抗原およびＭＨＣとの係合は、関連する酵素、共受容体、および特殊なアクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的事象を介して、そのＴリンパ球の活性化をもたらす。免疫学では、ＣＤ３抗原（ＣＤは分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の略である）は、哺乳類では４つの異なる鎖（ＣＤ３－γ、ＣＤ３δ、２つのＣＤ３ε）から構成されるタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖と結びついて、Ｔリンパ球で活性化シグナルを発生させる。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は、一緒にＴＣＲ複合体を含有する。ＣＤ３－γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、これは、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）に結合できるようにする特性である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＴＡＭ）として知られる単一の保存モチーフを含有し、これはＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠である。

【0082】

ＣＤ２８はＴ細胞上で発現される分子の１つであり、それはＴ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）の受容体である。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化されると、Ｂ７．１発現が抗原提示細胞（ＡＰＣ）において上方制御される。抗原提示細胞上のＢ７．２発現は、構成的である。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞上で構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ＴＣＲに加えてＣＤ２８を介した刺激は、様々なインターロイキン（特にＩＬ－２およびＩＬ－６）の産生のために、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを提供し得る。

【0083】

生体外でＴ細胞を生成するための従来のプロセスでは、その他のいくつかの方法が使用されている。例えば、自系腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。例えば、自系末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、Ｔ細胞の調製で使用されてもよい。さらに、樹状細胞（ＤＣ）をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自系Ｔ細胞の生成も可能である。Ｂ細胞もまた、自系Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己Ｔ細胞の調製において使用されてもよい。さらに、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用した、Ｔ細胞の生体外プライミングもまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法であってもよい。例えば、ポリスチレン粒子（マイクロビーズ）の表面に、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体をビオチン：ストレプトアビジンの生化学的手法で結合させることにより、ａＡＰＣが生成されてもよい。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答の選択的誘発を可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。

【0084】

しかし、内因性Ｔ細胞を使用した固形がんのＡＣＴは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用を要する長期にわたる複雑なプロセスであってもよい。ＡＰＣを使用した抗原特異的Ｔ細胞の刺激は、製造プロセスに、処理ステップ、時間、および費用を追加することにより、変動して煩雑になってもよい。したがって、本開示の実施形態は、より直接的なアプローチを使用することを含む。例えば、新鮮な白血球アフェレーシス産物からの、または新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの選別された低頻度の抗原特異的前駆体から始めて、ＡＰＣおよび／または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などのＴ細胞活性化剤に対する必要性を排除することによって、製造時間およびプロセスが大幅に短縮されてもよい。

【0085】

ペプチド／ＭＨＣ複合体
本発明の一態様では、直接選別プロセスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞と、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との複合体中の標的ペプチドを含んでなる多量体と、Ｔ細胞表面分子に結合する少なくとも１つの抗体とを接触させるステップを含んでなる。Ｔ細胞に基づく免疫療法は、ＭＨＣの分子によって提示される、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的タンパク質に由来するペプチドエピトープを標的化する。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわち、それらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それぞれの腫瘍細胞において発現され、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。

【0086】

ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は、ペプチドとの非共有結合相互作用のために用いられる結合溝をもたらす。ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見られる。それらは、主に、内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、交差提示と称される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に主に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣによって取り込まれ引き続いてプロセシングされる、外因性タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。

【0087】

ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。

【0088】

ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答を誘導し維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境をサポートし、例えば、ＣＴＬ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける。

【0089】

炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、および樹状細胞などの、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している。本明細書の伸長された（より長い）ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。

【0090】

ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を取りまとめるのに重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。

【0091】

例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された。ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある。

【0092】

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．は、腫瘍からいくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接同定することに成功した（その内容全体が参照により援用される、国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。

【0093】

ＣＤ８依存性とＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、共同して相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。

【0094】

ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラス１結合ペプチドは、通常、長さが８～１２アミノ酸残基であり、通常、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する「結合モチーフ」を有する。

【0095】

ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。

【0096】

タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で使用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞あたりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が上方制御されてもよく、したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。

【0097】

したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイルまたは示差的ペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。それは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本明細書の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能的および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが重要である。このような機能的Ｔ細胞は、特異的抗原での刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」またはＴ_ＥＭ）と定義される。

【0098】

一態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２９１０８２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２９１０８３号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２５５１１０号明細書、米国特許第９，７１７，７７４号明細書、米国特許第９，８９５，４１５号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２４７４３３号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２９２５２０号明細書、米国特許出願公開第２０２０００８５９３０、米国特許第１０，３３６，８０９号明細書、米国特許第１０，１３１，７０３号明細書、米国特許第１０，０８１，６６４号明細書、米国特許第１０，０８１，６６４号明細書、米国特第１０，０９３，７１５号明細書、米国特許第１０，５８３，５７３号明細書、および米国特許出願公開第２０２０００８５９３０号明細書に記載されるＴＡＡペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

【0099】

一態様では、本明細書に記載されるＴ細胞は、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されるＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。

【0100】

別の態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できるＴＡＡは、配列番号１～配列番号１６１から選択される少なくとも１つを含む。一態様では、Ｔ細胞は、配列番号１～１６１に記載される、または本明細書に記載の特許または出願のいずれかに記載される、ＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。

【0101】

表1.アミノ酸の一覧

【0102】

【表1】

【0103】

Ｔ細胞の起源
Ｔ細胞は、腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、ＴＩＬ）、末梢血（末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙ）、ＰＢＭＣ）、または白血球アフェレーシス産物のいずれかから採取されてもよい。ＴＩＬは、培養前に優先的に腫瘍特異的であるため、非特異的に増殖され得る。対照的に、腫瘍特異性は、抗原特異的増殖または遺伝子操作のどちらかを介して、ＰＢＭＣおよび白血球アフェレーシス産物中で誘導されてもよい。

【0104】

Ｔ細胞の増殖および遺伝子修飾前に、Ｔ細胞源が健常または罹患対象から得られてもよい。一態様では、対象はヒトを含んでもよい。別の態様では、対象としては、例えば、ヒト化マウスなどのマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、およびサルが挙げられてもよい。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍をはじめとするいくつかの起源から得られ得る。特定の実施形態では、当該技術分野で利用できる任意の数のＴ細胞株が使用されてもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を用いて、対象から採取された血液の単位から得られ得る。好ましい一実施形態では、個人の循環血液からの細胞は、血液成分分離によって得られてもよい。血液成分分離製品は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞をはじめとするリンパ球、その他の有核白色血液細胞、赤血球、および血小板を含有する。血液成分分離によって採取された細胞は、洗浄されて血漿画分が除去され、後続の処理ステップのために適切な緩衝液または培地に入れられてもよい。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されてもよく、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、または全部でないとしても多くの二価の陽イオンを欠いてもよい、洗浄液で洗浄されてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化ステップは、拡大された活性化をもたらし得る。当業者は容易に理解するであろうように、洗浄ステップは、製造業者の使用説明に従って、半自動化「通過型」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｉｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）などを使用することによって、当業者に知られている方法によって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ^２＋非含有、Ｍｇ^２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなどの様々な生体適合性緩衝液に、または緩衝液ありまたはなしでその他の生理食塩水に再懸濁されてもよい。代案としては、血液成分分離サンプルの望ましくない成分が除去され、細胞が培養液に直接再懸濁されてもよい。

【0105】

別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解して、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通じた心分離によって、または向流遠心分離水簸によって、単球を枯渇させることで、末梢血リンパ球から単離されてもよい。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。正の選択プロトコルでは、所望の細胞は標的細胞である。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択のために、ダイナビーズ（登録商標）Ｍ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）共役ビーズとのインキュベーションによって単離されてもよい。

【0106】

負の選択プロトコルでは、所望されないＴ細胞、すなわち、負に選択された細胞が除去された後、所望のＴ細胞がサンプル中に残る。例えば、負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した、細胞選別および／または選択であってもよい。例えば、負の選択によってＣＤ４＋を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含んでもよい。特定の実施形態では、典型的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌ１、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現してもよい調節Ｔ細胞を濃縮すること、または正に選択することが望ましくあってもよい。代案としては、特定の実施形態では、Ｔ調節細胞は、抗ＣＤ２５共役ビーズまたはその他の類似した選択方法によって枯渇されてもよい。

【0107】

別の態様では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から得られてもよい。１つのＡＣＴストラテジーは、腫瘍転移の腫瘍断片または単一細胞酵素消化物から生体外で増殖された、自系ＴＩＬの移植を伴う。腫瘍のＴ細胞浸潤物は、本質的にポリクローナルであり、複数の腫瘍抗原を集合的に認識する。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８８）３１９：１６７６－１６８０を参照されたい。

【0108】

例示的なＴＩＬ ＡＣＴプロトコルでは、腫瘍は患者から切除され、滅菌条件下で、小さな（例えば、３～５ｍｍ^２）断片に刻まれてもよい。断片は、成長培地と共に培養プレートまたはフラスコに入れられ、高用量ＩＬ－２で処理されてもよい。この初期ＴＩＬ増殖相（「プレＲＥＰ」相としても知られる）は、典型的には、約３～約５週間持続し、その間、約５×１０^７個以上のＴＩＬが生産されてもよい。次に、得られたＴＩＬはさらに増殖され（例えば、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）に従って）、対象への注入に適したＴＩＬが生産されてもよい。プレＲＥＰＴＩＬは、より後の増殖のために冷凍保存され得て、またはそれらは即座に増殖されてもよい。またプレＲＥＰ ＴＩＬをスクリーニングして、増殖前の抗腫瘍反応性の高い培養物が識別され得る。典型的なＲＥＰは、例えば、照射ＰＢＭＣフィーダー細胞の存在下で、抗ＣＤ３ ｍＡｂなどのＴ細胞刺激抗体を使用して、ＴＩＬを活性化することを伴ってもよい。フィーダー細胞は、患者対象から、または健常ドナー対象から得られ得る。ＩＬ－２が約６，０００Ｕ／ｍＬの濃度でＲＥＰ培養物に添加され、迅速なＴＩＬ細胞分裂が促進されてもよい。この様式でのＴＩＬの増殖は約２週間以上かかり得て、約１００億～１５００億個のＴＩＬのプールがもたらされる。増殖された細胞は、洗浄およびプールされてもよく、患者への注入に適していてもよい。患者は、典型的には、１０^９～１０^１１個の細胞の１回または２回（１～２週間隔離で）の注入を受けてもよい。患者には、注入後のＴＩＬ細胞の支持を助けるために、高用量のＩＬ－２療法（例えば、約２日から約３日間にわたる８時間毎の７．２×１０^５ＩＵ／ｋｇ）が投与される。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ（２００８）８：２９９－３０８を参照されたい。注入前に、患者は、任意選択的に、シクロホスファミド（Ｃｙ）およびフルダラビン（Ｆｌｕ）を使用してリンパ球除去され得る。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）２９８：８５０－８５４を参照されたい。さらに、内因的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の再出現を防ぐために、全身照射（ＴＢＩ）がリンパ球枯渇と共に使用されており、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００８）２６（３２）：５２３３－５２３９を参照されたい。

【0109】

Ｔ細胞表現型
Ｔ細胞の活性化中、ＴＣＲは抗原提示細胞のＭＨＣ複合体上に提示される抗原と相互作用する。ＴＣＲによる抗原－ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞刺激をもたらし、それは次に、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）と細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の双方のメモリーリンパ球およびエフェクターリンパ球への分化をもたらす。次に、これらの細胞はクローン様式で増殖し、１つの特定の抗原に反応できるＴ細胞集団全体の中に、活性化された亜集団を与え得る。

【0110】

Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；Ｔ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡの発現が増加し、ＣＤ４５ＲＯの発現が減少している）、メモリーＴ細胞（Ｔ_Ｍ）（抗原経験があり長寿命）、およびエフェクター細胞（Ｔ_Ｅ）（抗原経験あり、細胞傷害性）であり得る。Ｔ_Ｍ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現が増加し、ＣＤ５４ＲＡの発現が減少している）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現が減少し、ＣＤ１２７の発現が増加している）のサブセットにさらに分類され得る。特定の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ４４Ｈｉ、およびＣＤ６２ＬＨｉ Ｔ細胞またはＣＤ８＋、ＣＤ４４Ｈｉ、およびＣＤ６２ＬＨｉ Ｔ細胞である。なおもさらなる実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４４Ｌｏ ＣＤ４５ＲＡＨｉ ＣＤ６２ＬＨｉ ＣＤ９５Ｈｉ ＣＤ１２２Ｈｉ ｓｃａ－１＋の表現型を有し、それ自体を維持しながらＴ_ＣＭおよびＴ_ＥＭサブセットを生成できる、メモリーＴ幹細胞（Ｔ_ＭＳＣ）を含む。エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）は、Ｔ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少しており、グランザイムおよびパーフォリンについて陽性である、抗原経験があるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）は、サイトカインを放出することによってその他の免疫細胞の活動に影響を及ぼすＣＤ４＋細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化および抑制し得て、どの作用が誘導されるかはその他の細胞およびシグナルの存在に依存する。Ｔ細胞にはまた、γδＴ細胞、ＭＡＩＴ Ｔ細胞、およびＴｒｅｇも含まれるＴ細胞は、既知の技術に従って収集され得て、様々な亜集団またはそれらの組み合わせは、抗体への親和性結合、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択などの既知の技術によって富化または枯渇され得る。例えば、特定の実施形態では、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ６２ＬＨｉ（ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞）またはＣＤ６２ＬＬｏ Ｔ細胞（エフェクターメモリーおよびエフェクターＴ細胞）に選別され得る。

【0111】

ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍細胞を殺滅するのに不可欠であると考えられている。これらの細胞は、典型的には、抗原提示細胞によってＭＨＣ複合体上に以前提示されていた抗原をがん細胞が表面に提示したときに、がん細胞におけるアポトーシスを誘導できる。通常は、ＣＴＬは標的細胞に対する作用に続いて、細胞の脅威が除去されるとアポトーシを起こしてもよく、リンパ球のサブセットが残って、これはさらにメモリーＴ細胞に分化し、身体が再び抗原にさらされた場合に備えて存続する。メモリーリンパ球のプールは、非常に不均一であってもよい。エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－）と、二次リンパ器官のＴ細胞領域でのホーミングに必要な２つの分子であるＣＣＲ７とＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられる、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞であるセントラルメモリーＴ細胞との２種類のメモリーＴ細胞が同定されている。抗原刺激に際して、セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－４およびＩＦＮ－γなどのエフェクターサイトカインを低レベルで、ＩＬ－２を高レベルで産生し、迅速で一貫した増殖を維持できる。抗原に遭遇すると、セントラルメモリーＴ細胞は以下を受ける：１）それらのプールを増やすことを目的とした自動再生プロセスをもたらす増殖、および２）低い増殖能によって特徴付けられるが、炎症を起こした非リンパ組織に移動して免疫応答のエフェクター段階を仲介できる、エフェクターメモリーＴ細胞の生成をもたらす分化。

【0112】

ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
正または負の選択による所望の細胞集団の単離では、細胞濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）が変化され得る。特定の実施形態では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、その中でビーズと細胞が共に混合されてもよい体積を著しく減少させる（すなわち、細胞濃度を増加させる）ことが望ましくあってもよい。例えば、一実施形態では、２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用されてもよい。一実施形態では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１億個の細胞／ｍｌを超える濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用されてもよい。なおも別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用されてもよい。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高い濃度を使用することで、細胞収量、細胞活性化、および細胞増殖の増加がもたらされ得る。さらには、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの関心のある標的抗原を弱く発現してもよい細胞の、または数多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）からの細胞の、より効率的な捕捉を可能にしてもよい。このような細胞の集団は、治療的価値を有してもよく、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用して、通常であればより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にしてもよい。関連する実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましくあってもよい。（例えば、ビーズなどの粒子を使用することによって）Ｔ細胞と表面との混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞の間の相互作用が最小化されてもよい。これにより、粒子に結合されるべき所望の抗原を多量に発現する細胞が選択てもよい。

【0113】

本開示の実施形態は、新鮮な白血球アフェレーシス産物から、または新鮮なＰＢＭＣから単離された、ＣＤ８＋陽性の選択されたＴ細胞を利用することを含んでもよい。一実施形態では、細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮されてもよい。Ｔ細胞培養物は、例えば、ＣＤ８マイクロビーズ分離を使用して、ＣＤ４＋細胞が枯渇されＣＤ８＋細胞について濃縮されてもよい（例えば、Ｃｌｉｎｉ－ＭＡＣＳＰｐｌｕｓ ＣＤ８マイクロビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（商標）を使用して）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮は、ＣＤ４＋Ｔ調節細胞を除去することによってＡＣＴの予後を改善してもよい。

【0114】

ペプチド／ＭＨＣ多量体
例えば、ペプチド／ＭＨＣ四量体（Ｔｅｔ）などのペプチド／ＭＨＣ多量体は、ストレプトアビジン（ＳＡまたはＳａ）によって形成されてもよい。ストレプトアビジンは、細菌ストレプトミセス・アビディニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）細菌に由来する四量体タンパク質である。ＳＡは、その天然リガンドであるビオチン（Ｋｄ^{－１０－１５}ｍｏｌ／Ｌ）に対して四面体に配置された、並外れた親和性と４つの固有の結合部位を有する。ストレプトアビジンのビオチンに対するモル結合能は、４：１のビオチン：ＳＡである。ＳＡは、（例えば、ビオチン相互作用などを介して）結合分子に特異的に結合する必要はないが、一態様では、ストレプトアビジン、結合分子（例えば、ＭＨＣ分子）がビオチン化され、タンパク質－リガンド対ＳＡとの四量体アセンブリが可能になり得る。いくつかの実施形態では、結合分子はまた、共有結合（アミドカップリングなど）を介してＳＡに結合され得て、したがって、必ずしもビオチン－ＳＡ相互作用を介する必要はない。当業者は、選択された実験計画に基づいて、最も適切な結合を同定できるであろう。本開示のいくつかの実施形態では、ＳＡが使用されて、ペプチド／ＭＨＣモノマーが四量体にアセンブルされてもよい。例えば、ＭＨＣ鎖は、酵素ＢｉｒＡでビオチン化され、例えば、ＴＡＡなどの関心のある抗原ペプチドで再折りたたみされてもよい。ビオチンは、ストレプトアビジンと強力な結合を形成する、小型タンパク質である。フルオロフォアでタグ付けされたストレプトアビジンは、バイオエンジニアリングされたＭＨＣモノマーに添加されてもよく、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用は、４つのＭＨＣモノマーをストレプトアビジンに結合させ、四量体が生成される。ペプチド／ＭＨＣ四量体が、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのサンプと混合されると、それらは、例えば、ＴＡＡ特異的ＴＣＲなどの、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に結合する適切な抗原特異的受容体（ＴＡＡ特異的ＴＣＲなど）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する。結合していないあらゆるＭＨＣ四量体は、フローサイトメトリーで分析される前に、サンプルから洗い流される。

【0115】

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析
生存細胞のＦＡＣＳは、蛍光標識に基づいて、細胞集団を亜集団に分離する。選別は、非選別分析よりも、フローサイトメーター内のより複雑な機序を伴う。フルオロフォアタグ付きペプチド／ＭＨＣ四量体および／またはフルオロフォア共役抗体を使用して染色された細胞は、それらを染色したフルオロフォアに応じて互いに分離され得る。例えば、１つの細胞マーカーを発現する細胞が、そのマーカーを認識するイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役抗体を使用して検出されてもよく、異なるマーカーを発現する別の細胞種が、そのマーカーに特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）共役抗体を使用して検出され得る。

【0116】

ＦＡＣＳによって生成されたデータは、ヒストグラムを作成するために一次元でプロットされても、二次元ドットプロットでプロットされても、三次元でプロットされてもよい。これらのプロット上の領域は、「ゲート」と称される一連のサブセット抽出を作成することによって、蛍光強度に基づいて順次分離され得る。特に血液学に関連して、診断および臨床目的のために特定のゲーティングプロトコルが存在してもよい。例えば、シングルゲーティングは、狭く集束されたレーザー光線を介した「飛行時間」（「パルス幅」としても示される）によって、個々の単一細胞を細胞ダブレットまたはより高い凝集体と区別することを可能にしてもよい。投棄ゲーティングを使用して、分析に関係のない細胞が低減されてもよい。プロットは、対数目盛で作成されてもよい。異なる蛍光色素の発光スペクトルは重複しているため、検出器での信号は電子的にも計算的にも補正する必要がある。フローサイトメーターを使用して蓄積されたデータは、ソフトウェアを使用して解析され得る。ひとたびデータが収集されると、フローサイトメーターに接続したままにする必要はなく、別のコンピューターで解析が実施されてもよい。

【0117】

治療法
一態様では、養子細胞移入または治療法（ＡＣＴ）は、細胞がドナーから取り出され、生体外で培養および／または操作され、疾患の治療のために患者に投与される、治療方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、移入された細胞は自系細胞であってもよく、これは、患者が自らのドナーの役割を果たすことを意味する。いくつかの実施形態では、移入された細胞は、例えば、Ｔ細胞などのリンパ球であってもよい。いくつかの実施形態では、移入された細胞は、患者への投与前に遺伝子改変されてもよい。例えば、移入された細胞は操作されて、関心のある抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。一実施形態では、移入された細胞は操作されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現してもよい。特定の実施形態では、移入された細胞は操作されて（例えば、形質移入またはコンジュゲーションによって）、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１２）、抗アポトーシス分子（ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－Ｘ）、またはケモカイン（ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２Ｂ）などの細胞の抗腫瘍活性を促進する分子を発現してもよい。特定の実施形態では、移入された細胞は操作されて、ＣＡＲと、抗腫瘍活性または細胞の持続性を促進する分子との双方を発現してもよい。

【0118】

一態様では、本明細書に記載の増殖され操作されたＴ細胞は、異常なアポトーシスまたは分化プロセス（例えば、がんなどの細胞の増殖障害または細胞の分化障害）に関連した障害を治療するのに有用である。本発明の方法を用いた治療に適していてもよいがんの非限定的例が、以下に記載される。

【0119】

細胞の増殖および／または分化障害の例としては、がん（例えば、がん腫、肉腫、転移性障害、または例えば白血病などの造血性新生物障害）が挙げられてもよい。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓の腫瘍をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の原発腫瘍型から発生し得る。したがって、本開示の組成物（例えば、最小限に生体外で増殖され操作されたＴ細胞）は、がんを有する患者に投与され得る。

【0120】

自系細胞の投与
自系細胞は、当技術分野で公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、細胞は、約３０～約６０分間持続する、動脈内または静脈内注入として投与されてもよい。その他の例示的な投与経路としては、腹腔内、クモ膜下腔内、およびリンパ管内が挙げられてもよい。

【0121】

同様に、自系細胞の任意の適切な用量が投与され得る。例えば、一実施形態では、約１．０×１０^８個の細胞～約１．０×１０^１２個の細胞が投与されてもよい。一実施形態では、平均で約５．０×１０^１０個のＴ細胞で、約１．０×１０^１０個の細胞～約１３．７×１０^１０個のＴ細胞が投与されてもよい。代案としては、別の実施形態では、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０個のＴ細胞が投与されてもよい。

【0122】

一実施形態では、ＡＣＴのために使用される自系細胞は、例えば、Ｔ細胞などのリンパ球であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，３８３，０９９号明細書に記載されるように、例えば、１９～３５日齢の間の「若い」Ｔ細胞であってもよい。若いＴ細胞は、古いＴ細胞より長いテロメアを有すると考えられており、場合によっては、より長いテロメア長は、ＡＣＴに続く臨床転帰の改善に関連してもよい。

【0123】

ＡＣＴレジメンを受けている対象に、本開示の直接選別によって得られた増殖Ｔｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を注入することは、移入された細胞の持続性を促進し、移入された細胞の持続性、増殖、および生存を刺激し、および／または腫瘍の退縮を改善してもよい。

【0124】

本開示の実施形態は、ＩＬ－２での、または例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３などの共通γ鎖に結合するその他のサイトカインでの刺激によって、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることを含んでもよい。一態様では、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくとも１周期の「迅速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）によって増殖されてもよく、その中では、Ｔ細胞は、例えば、ＩＬ－２またはＩＬ－１５、ＯＫＴ－３によって、およびＦｃ－γＩ受容体（ＦｃγＲＩ）を発現するアクセサリー細胞を含む、照射されたフィーダー細胞としての同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によって、増殖されてもよい。ＯＫＴ－３抗体をはじめとする免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ２ａサブクラスマウス抗体のＦｃ部分は、ヒトフィーダー細胞上のＦｃγＲＩに結合する。Ｆｃに結合した抗ＣＤ３抗体γＲＩは、固体表面上に固定化された抗ＣＤ３／ＣＤ２８よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してより最適な増殖／分化シグナルを誘導する。これは、抗ＣＤ３Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）架橋と、Ｔ細胞およびＦｃγＲＩアクセサリー細胞間の細胞間相互作用によって提供される共刺激との二重の利点を反映していてもよい。別の態様では、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ビーズ上に固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で増殖され、シグナル１および共刺激シグナル２が同時に送達されて、アネルギーまたは早期アポトーシスを誘発することなく、Ｔ細胞増殖が誘導されてもよい。

【0125】

細胞培養閉鎖系
本開示の直接選別は、Ｔ細胞製品を製造するための任意の細胞培養閉鎖系と組み合わせて実行されてもよい。細胞培養閉鎖系としては、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、単独のまたはＢｉｏＳａｆｅ Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＷＡＶＥ（ＸＵＲＩ（商標））バイオリアクター（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および単独のまたはＢｉｏＳａｆｅ Ｓｅｐａｘ（商標）ＩＩと組み合わされたＧ－Ｒｅｘ／ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）閉鎖系（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）などの市販のシステムが挙げられてもよい。Ｇ－Ｒｅｘ（商標）閉鎖系は増殖容器であり、ＧａｔｈｅＲｅｘ（商標）は濃縮および収穫用ポンプである。

【0126】

ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（商標）とＴＣＴプロセスソフトウエアおよびＴＳ５２０管材料セットは、細胞の濃縮、形質導入、洗浄、および増殖のための閉鎖系処理を可能にしてもよい。例えば、ＭＡＣＳ－ＣＤ４およびＣＤ８－マイクロビーズを濃縮のために使用してもよく、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８試薬などのＴｒａｎｓＡＣＴビーズを活性化のために使用してもよく、組換えＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを形質導入のために使用してもよく、ＴｅｘＭＡＣＳ培地－３％－ＨＳ－ＩＬ２を培養のために使用してもよく、リン酸緩衝生理食塩水／エチレンジアミン四酢酸緩衝液を洗浄のために使用してもよい。このシステムは、約４～５×１０^９個の細胞をもたらしてもよく、チャンバーの最大充填量約３００ｍＬでの製造のための自動化されたプロトコルを含み、１０日～１４日間かけて選択と活性化（ＴｒａｎｓＡＣＴビーズ）、導入、増殖を実施する。

【0127】

ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクター（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、灌流ありおよび／またはなしで、例えば、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌｂａｇｓなどの培養バッグ内でＴ細胞を培養できるようにする。栄養供給のための中型バッグは、５リットルのＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｔａｉｎｅｒであってもよい。老廃物バッグは、Ｍｂａｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された）であってもよい。このシステムは、約１５～３０×１０^９個の細胞をもたらし、培養制御とモニタリングを可能にするｕｎｉｃｏｒｎソフトウエアを使用して、約０．３リットル～約２５リットルを保持するロッキングトレーを含み、ガス交換を媒介して新鮮な培地およびサイトカインを細胞培養に導入しながら、灌流機能を果たして培養容積を維持してもよい。

【0128】

ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、増殖のためのＸｕｒｉバッグ、解凍および休止のためのＳａｉｎｔ Ｇｏｂａｉｎ’ｓ ＶｕｅＬｉｆｅバッグ、および活性化のためのＶｕｅＬｉｆｅ ＳＣバッグを含んでもよい。ＷＡＶＥ（Ｘｕｒｉ（商標））バイオリアクターは、培養洗浄および減容化ステップのために、例えば、Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのその他の技術と組み合わせて使用してもよい。滅菌ウェルダー（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ（商標））は、溶液移送用の滅菌バッグの接続、および管材料を封着するためのヒートシーラーで使用されてもよい。

【0129】

Ｓｅｐａｘ（商標）細胞分離システムは、シリンジチャンバーの回転による分離（遠心分離）と、シリンジピストンの転置による成分移送との双方を提供する、分離チャンバーに依存する。光学的センサーは、分離された成分の吸光度を測定し、正しい排出容器内への各成分の流れ方向を管理し、例えば、血漿、バフィーコート、および赤血球が、このようにして血液サンプルから分離され採取されてもよい。

【0130】

定義
「活性化」という用語は、刺激されて、検出可能な細胞増殖を誘導するＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、増殖中のＴ細胞を指す。Ｔ細胞の完全な活性化のためには、ＴＣＲを介して生成されたシグナルだけでは不十分であり、１つまたは複数の二次的シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した一次刺激シグナルと、１つまたは複数の二次的共刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を介したまたはＣＤ２を介した刺激などの一次活性化シグナルを受信したＴ細胞による、増殖および／またはサイトカイン産生によって証明され得る。例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、またはタンパク質キナーゼＣ活性化剤をカルシウムイオノフォアと併用して、Ｔ細胞集団が活性化されてもよい。

【0131】

活性化は、休止状態と比較して差示的に発現される、遺伝子発現シグネチャの任意の表現型によって検出され得る。このような変化は、Ｔ細胞増殖、エフェクター機能、および／または細胞周期状態の変化を誘発する、既知のマイトジェンまたはバイオシミラーとの培養によって誘発されてもよい。

【0132】

増殖を誘導するために、活性化Ｔ細胞集団と、Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子を刺激する第２の薬剤とが接触されてもよい。例えば、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子を対象とする抗ＣＤ２８抗体を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が刺激され増殖され得る。代案としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ７－１およびＢ７－２などのＣＤ２８に対する天然リガンドで刺激され得る。天然リガンドは、細胞膜上で可溶性であるか、または固相表面に共役され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増殖は、活性化Ｔ細胞上に存在する約２７ｋＤの分子量を有するアクセサリー分子ＣＤ９に結合する、モノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８の使用によって達成されてもよい。代案としては、活性化Ｔ細胞集団の増殖は、ＣＤ２８などのアクセサリー分子のライゲーションに起因する、１つまたは複数の細胞内シグナルの刺激によって誘導され得る。

【0133】

一次活性化シグナルを提供する薬剤および共刺激剤を提供する薬剤は、可溶性形態で添加されるか、または固相表面に共役され得る。好ましい実施形態では、２つの薬剤が同じ固相表面に共役されてもよい。このような環境におけるＴ細胞の培養は、同族の受容体を発現する全てのＴ細胞の無差別な活性化をもたらす。

【0134】

Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の活性化と刺激に続いて、細胞内で作用してアクセサリー分子によって媒介される経路をシミュレートする、リガンドまたはその他の薬剤への継続的な曝露に応答したＴ細胞の増殖の進行が、モニターされてもよい。Ｔ細胞の増殖速度が低下した場合、追加的な抗ＣＤ３抗体および共刺激性リガンドなどを用いて、Ｔ細胞を再活性化して再刺激し、さらなる増殖が誘導されてもよい。一実施形態では、Ｔ細胞の増殖速度は、細胞サイズを調べることによってモニターされてもよい。代案としては、Ｔ細胞増殖は、ＣＤ２８またはＣＤ２７などのリガンドまたはその他の薬剤への曝露に応答した細胞表面分子の発現をアッセイすることによって、モニターされてもよい。持続的な増殖についてＴ細胞のモニタリングと再刺激を繰り返し、元のＴ細胞集団よりも約１００倍～約１００，０００倍に増加したＴ細胞集団が生成されてもよい。

【0135】

一態様では、本明細書に記載の活性化は、約１時間～約１２０時間、約１時間～約１０８時間、約１時間～約９６時間、約１時間～約８４時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約２時間～約２４時間、約４時間～約２４時間、約６時間～約２４時間、約８時間～約２４時間、約１０時間～約２４時間、約１２時間～約２４時間、約１２時間～約７２時間、約２４時間～約７２時間、約６時間～約４８時間、約２４時間～約４８時間、約６時間～約７２時間、または約１時間～約１２時間の期間内に実行されてもよい。

【0136】

本開示の方法を使用して、感染性疾患またはがんの治療で使用するための選択されたＴ細胞集団が増殖され得る。得られたＴ細胞集団は遺伝的に形質導入されて、免疫療法に使用され得るか、または感染性因子の生体外分析のために使用され得る。Ｔ細胞集団の十分な数への増殖に続いて、増殖Ｔ細胞は個人に戻されてもよい。本開示の方法はまた、Ｔ細胞の再生可能な供給源を提供してもよい。したがって、個人からのＴ細胞を生体外で増殖させ得て、増殖した集団の一部が個人に再投与され得て、別の部分は長期保存および引き続く増殖と個人への投与のためにアリコートで冷凍され得る。同様に、がんに罹患した個人から腫瘍浸潤性リンパ球の集団が得られ、Ｔ細胞を刺激して十分な数に増殖されて個人に戻され得る。

【0137】

一態様では、増殖させるステップは、約１日～２日、約１日～３日、約１日～約４日、約１日～約５日、約１日～６日、約１日～７日、約１日～８日、約１日～９日、約１日～１０日、約２日～３日、約２日～４日、約２日～５日、約２日～６日、約２日～７日、約２日～８日、約２日～９日、約２日～１０日、約３日～４日、約３日～５日、約３日～６日、約３日～７日、約３日～８日、約３日～９日、約３日～１０日、約４日～５日、約４日～６日、約４日～７日、約４日～８日、約４日～９日、約４日～１０日、約５日～６日、約５日～７日、約５日～８日、約５日～９日、または５日～１０日にわたり実施されてもよい。

【0138】

「迅速増殖」という用語は、抗原特異的Ｔ細胞の数が、１週間で少なくとも約３倍（または４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、または９倍）、より好ましくは１週間で少なくとも約１０倍（または２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、または９０倍）、最も好ましくは１週間で少なくとも約１００倍に増加することを意味する。例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、３０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２（例えば、６０００ＩＵ／ｍＬ）を添加した完全培地（ＣＭ）中で、照射された（例えば４０Ｇｙ）同種異系末梢血単核「フィーダー」細胞と共に、抗原特異的Ｔ細胞を培養することによって、その内容が参照により援用される、以前記載されたような迅速増殖プロトコル（ＲＥＰ）（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６：３３２－４２（２００３）、およびＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２８：１８９－２０１（１９９０）が用いられてもよい。

【0139】

「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」という用語は、本明細書の用法では、アルファ（α）およびベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指すが、ただしいくつかの細胞では、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。いくつかの実施形態では本開示のＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびγδＴ細胞をはじめとする、ＴＣＲを有する任意の細胞上で修飾されてもよい。

【0140】

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含んでもよい。特定の実施形態で使用するのに適した例示的なＴ細胞集団としては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、または任意のその他のＴ細胞のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で使用するのに適したその他の例示的なＴ細胞集団としては、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数を発現するＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されず、所望ならば、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。

【0141】

一態様では、「無関係のペプチド」は標的ペプチドでないペプチドであり、選別プロセスにおけるその使用は、非標的特異的Ｔ細胞の排除を容易にする。無関係のペプチドは、無関係のペプチド／ＭＨＣ複合体が、所望のＴ細胞応答をもたらさないような、目的でないペプチドとして定義されてもよい。例えば、無関係のペプチドとは、標的ペプチドとの配列同一性が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％未満であり、無関係のペプチド／ＭＨＣ複合体が、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体と同じＴ細胞に結合しないようなペプチドを指してもよい。さらなる例では、無関係のペプチドとは、標的ペプチドとの配列同一性が、例えば、３０％未満など、３０％未満、４０％未満、５０％未満であり、無関係のペプチド／ＭＨＣ複合体が、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体と同じＴ細胞に結合しないようなペプチドを指してもよい。無関係のペプチドのアミノ酸配列は、典型的には、８～１６アミノ酸長を含んでなる。無関係のペプチドは、ハウスキーピング遺伝子によってコード化されてもよい。このように、潜在的な無関係のペプチドを除外しながらのＴＣＲ標的ペプチド複合体の選択は、その中で、無関係のペプチド／ＭＨＣ複合体が、所望のＴ細胞応答をもたらさない。標的類似ペプチドは、典型的には８～１６アミノ酸長、好ましくは８～１１アミノ酸長を含んでなり、標的ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の類似性を有する。典型的には、標的類似ペプチドは、標的ペプチドのアミノ酸配列に関して、５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、または１アミノ酸の置換によって異なる。さらに、好ましい標的ペプチド／ＭＨＣ結合Ｔ細胞は、標的類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合せず、主にまたは唯一、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。これは、標的ペプチド／ＭＨＣ複合体と標的類似ペプチド／ＭＨＣ複合体の双方に結合するＴ細胞が、望まれないＴ細胞応答を示す、すなわち、「オンターゲット／オフ腫瘍」の副作用、健常組織上の標的類似ペプチドとの交差反応性などの副作用をもたらすこともあるという事実に起因する（Ｌｏｗｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；００：１－１７）。

【0142】

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、丸い核を有する任意の血液細胞（すなわち、リンパ球、単球、またはマクロファージ）を指す。これらの血球は、感染症と戦い、侵入者に適応するための免疫系の重要な構成要素である。リンパ球集団は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ１４＋単球、および好塩基球／好中球／好酸球／樹状細胞からなる。これらの細胞は、血液の層を分離して血漿の層の下に単球およびリンパ球がバフィーコーを形成する親水性多糖類であるＦＩＣＯＬＬ（商標）を使用して、全血またはＬｅｕｋｏＰａｋから分離されることが多い。一実施形態では、「ＰＢＭＣ」は、少なくともＴ細胞、および任意選択的にＮＫ細胞、および抗原提示細胞を含有する、細胞集団を指す。

【0143】

本明細書で使用される細胞選別技術は、本開示に限定されることなく、当該技術分野で一般に使用される方法または機器を使用することによって、達成され得る。表面マーカーが、これらの技術、方法、および機器において細胞を選別するために使用される限り、細胞を選別するための任意の技術、方法、および機器が本開示で使用されてもよい。例えば、磁気選別技術またはフローサイトメトリーが使用され得る。磁気分離技術またはフローサイトメトリーなどの細胞選別技術の実験プロセスは、様々な科学文献に見いだされ得て、または機器または装置の製造業者によって提供される、取扱い説明書または推奨プロトコルに従って実施されてもよい。当業者であれば、これらの特定の実験プロセスまたはプロトコルを取得する能力を有するであろう。

【0144】

本明細書で使用される「直接選別」という用語は、選別前のＴ細胞のクローン培養（すなわち、開始細胞を複数の継代培養に分割する培養）に依存しない、任意の選別活動を指す。例えば、Ｔ細胞を直接選別すること、例えば、非クローン培養Ｔ細胞から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞などは、ＣＤ４５、ＣＤ１９７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒα）、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ６２ＬなどのＴ細胞表面分子に結合する、例えば、四量体などのフルオロフォアタグ付きペプチド／ＭＨＣ多量体（例えば４量体）およびその他のフルオロフォアタグ付き抗体を使用することによって、選別されてもよい。このようにして直接選別によって得られるＴ細胞は、主に低頻度の抗原特異的前駆体Ｔ細胞を含有してもよい。

【0145】

本明細書の用法では、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」、および「新生物性」という用語は、自律的増殖能力（すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状態または病状）を有する細胞を指すために使用されてもよい。過剰増殖性および新生物性疾患状態は、病理的（すなわち、病態を特徴付けまたは構成する）として分類されてもよく、またはそれらは、非病的として（すなわち、正常からの逸脱であるが、病態とは関連していないとして）分類されてもよい。用語には、組織病理学的タイプまたは侵襲段階にかかわりなく、全てのタイプのがん性増殖または発がんプロセス、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織、または臓器が含まれることが意図される。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる疾患状態で発生してもよい。非病的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に関連した細胞の増殖が挙げられてもよい。

【0146】

「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、胃腸器官、および尿生殖路に影響を及ぼすものをはじめとする、様々な器官系の悪性腫瘍を指すために、ならびにほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、小腸がん、および食道がんなどの悪性腫瘍を含むと一般に考えられる腺がんを指すために、使用されてもよい。発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん；肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん；頸部、胆嚢、または胸膜のがん；鼻、鼻腔、または中耳のがん；外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、子宮頸がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん；腹膜、網、および腸間膜のがん；咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、軟部組織がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がん；および例えば、食道がん、胃がん、膵臓がん、胃がん、小腸がん、消化管カルチノイド腫瘍などの消化管がん；口腔のがん、結腸がん、および肝胆道がんのいずれかをはじめとする、任意のがんであり得る。

【0147】

「がん腫」という用語は、呼吸器系がん腫、消化器系がん腫、泌尿生殖器系がん腫、精巣がん腫、乳がん腫、前立腺癌、内分泌系がん腫、および黒色腫をはじめとする、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的ながん腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣組織から形成するものが挙げられる。この用語には、がん性肉腫および肉腫性組織からなる悪性腫瘍をはじめとする、がん肉腫もまた含まれてもよい。「腺がん」は、腺組織に由来するがん腫、またはその中で腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。

【0148】

増殖障害の追加的な例としては、造血性新生物障害が挙げられてもよい。本明細書の用法では、「造血性新生物障害」という用語は、例えば、骨髄系、リンパ系または赤血球系、またはそれらの前駆細胞から生じる、造血器起源の過形成細胞／新生物細胞を伴う疾患を含んでもよい。好ましくは、疾患は、不十分に分化した急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じてもよい。追加的な例示的骨髄性障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７－９７で概説される）；Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含めた、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）をはじめとするが、これらに限定されないリンパ系悪性腫瘍が挙げられてもよいが、これらに限定されない。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその変異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード・シュテルンベルク病が挙げられてもよいが、これらに限定されない。

【0149】

腫瘍の増殖およびサイズを減少させるのに十分な増殖され操作されたＴ細胞の量、または治療的有効量は、特定の選択された組成物だけでなく、投与経路、治療される病状の性質、および患者の年齢および病状によっても変動してよく、最終的には、患者の医師または薬剤師の裁量となることが、当業者によって理解されるであろう。本方法において、使用される最小限に増殖され操作されたＴ細胞が与えられる時間の長さは、個々のベースで変化する。治療法に関する本明細書における参照は、記載されたがんおよび症状の予防法ならびに治療法に及ぶことが、当業者によって理解されるであろう。

【実施例】

【0150】

実施例１
直接選別プロセスと従来のプロセスとの比較
図１は、ＰＢＭＣ分離から始めて、１週間の樹状細胞（ＤＣ）生成；周期毎に１週間の２周期の刺激（Ｓｔｉｍ１およびＳｔｉｍ２）；選別；および周期毎に２週間の２周期の迅速増殖プロトコル（ＲＥＰ）、すなわち、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２がそれに続く、従来のプロセスを使用してＴ細胞製品を調製するのに、約５２日かかってもよいことを示す。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離から始めて、選別と、周期毎に２週間の２周期の増殖（ＲＥＰ１およびＲＥＰ２）とがそれに続く、直接選別を使用すると、約３０日以下で完了してもよい。したがって、直接選別は、従来のプロセスと比較して、Ｔ細胞の製造を完了するのに約３週間の時間を節約してもよい。

【0151】

実施例２
改善されたゲーティングストラテジーによる直接選別
ＭＬＡ直接選別
ＣＤ８＋Ｔ細胞選択

【0152】

ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ドナー２から得られた新鮮なＬｅｕｋｏ Ｐａｋｓから単離した（ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標））。図１および図２Ａ～２Ｄは、ドナー２からのＭＬＡ直接選別のために使用される、ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を示す。図２Ａは、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に存在するリンパ球の９７．３％を示す。図２Ｂは、リンパ球の９４．１％（８．５×１０^８個の細胞）がＣＤ８について陽性であったことを示し、すなわち、純度は約９４％である。ＣＤ８陰性画分では、図２Ｃは、リンパ球の８３．９％を示す。図２Ｄは、リンパ球の０．２７％がＣＤ８陽性であることを示す。

【0153】

選別＃１
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養し、直接選別がそれに続いた。「陰性投棄」では、すなわち、無関係のペプチドＴｅｔ、ＣＤ５６、ＣＤ１９、およびＣＤ１４について陰性と検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の投棄では、それらを選別し、ＭＬＡ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図３は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、選別＃１の後に、３９９，５１６個のＭＬＡ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0154】

表2:選別#1の結果

【0155】

【表2】

理論純度は25.6%である
投入濃度= 31.8×10⁶個の細胞/mlおよび0.21%の標的
SAΔ = 自己認識予測-Quantからの実際の結果
自己認識予測は、高バックグラウンド細胞濃度およびトリガーストラテジーがあるので、正確であることが期待される。

【0156】

選別＃２
選別＃１と同様に、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養した後、直接選別がそれに続いた。「陰性投棄」では、すなわち、無関係のペプチドＴｅｔ、ＣＤ５６、ＣＤ１９、およびＣＤ１４について陰性と検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の投棄では、それらを減量し、ＭＬＡ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図４は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、減量選別後に、４６２，１６８個のＭＬＡ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0157】

表3:選別#2の結果

【0158】

【表3】

理論純度は23.7%である
投入濃度= 約30×10⁶個の細胞/mlおよび0.21%の標的

【0159】

選別＃３
引き続く直接選別のために、選別＃１および選別＃２から得られたＭＬＡ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を合わせた。図５は、純度選別後に、陰性対照（右側パネル）と比較して、６６２，６５０個のＭＬＡ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（左側パネル）が回収されたことを示す。

【0160】

表4.選別#1～選別#3後の結果

【0161】

【表4】

【0162】

記憶表現型（増殖前および純度選別後）
図６Ａは、例えば、ＭＬＡ Ｔｅｔ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮が、出発物質の０．３４％から直接選別細胞中の９５．７５％に増加し、Ｔ_{ＮＡＩＶＥ}が、出発物質の４１．７％から直接選別細胞中の８０．２％に増加したことを示す。

【0163】

図６Ｂは、例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮が、出発物質の８１．１％から直接選別細胞中の９９．９％に増加し、ＣＤ１２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、出発物質の１１．４％から直接選別細胞中の９６．４％に増加し、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、出発物質の５３．６％から直接選別細胞中の９２．８％に増加したことを示す。

【0164】

図７は、直接選別されたＭＬＡ Ｔｅｔ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＬＡ Ｔｅｔ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、より多数のＴ_ナイーブ、より多数のＴ_ＣＭ、より少数のＴ_ＥＭ、およびより少数のＴ_ＥＦＦを含有することを示す。矛盾なく、図８は、ＭＬＡ Ｔｅｔ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＬＡ Ｔｅｔ陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７などのＴ_{ＮＡＩＶＥ}細胞マーカをより多く発現することを示す。

【0165】

ＭＡＧＥＡ１直接選別
ＣＤ８＋Ｔ細胞選択
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ドナー３から得られた新鮮なＬｅｕｋｏ Ｐａｋｓから単離した（ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標））。図３および図９Ａ～９Ｄは、ドナー３からのＭＡＧＥＡ１直接選別のために使用される、ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を示す。図９Ａは、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に存在するリンパ球の９８．８％を示す。図９Ｂは、リンパ球の９９．４％（１．１×１０^９個の細胞）がＣＤ８について陽性であったことを示し、すなわち、純度は約９９％である。ＣＤ８陰性画分では、図９Ｃは、９１．０％の細胞がリンパ球および単球であったことを示し、図９Ｄは、これらの細胞の０．７８％がＣＤ８について陽性であったことを示している。

【0166】

選別＃１
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養し、直接選別がそれに続いた。「陰性投棄」では、すなわち、無関係のペプチドＴｅｔ、ＣＤ５６、ＣＤ１９、およびＣＤ１４について陰性と検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の投棄では、それらを減量し、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性のＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図１０は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、減量選別後に、１２，１４４個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0167】

表5.選別#1に続くMAGEA1

【0168】

【表5】

理論純度は23.7%である
投入濃度= 34.0×10⁶個の細胞/mlおよび0.04%の標的
SAΔ = 自己認識予測-Quantからの実際の結果
自己認識予測は、高バックグラウンド細胞濃度およびトリガーストラテジーがあるので、正確であることが期待される。

【0169】

選別＃２
選別＃１と同様に、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養した後、直接選別がそれに続いた。「陰性投棄」では、すなわち、無関係のペプチドＴｅｔ、ＣＤ５６、ＣＤ１９、およびＣＤ１４について陰性と検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の投棄では、それらを減量し、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性のＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図１１は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、減量選別後に、１０，８４６個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0170】

表6.選別#2に続くMAGEA1

【0171】

【表6】

理論純度は23.7%である
投入濃度= 約30×10⁶個の細胞/ml

【0172】

選別＃３
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養し、直接選別がそれに続いた。投棄ゲーティングを使用せずに、ＣＤ８＋Ｔ細胞を減量し、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性のＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図１２は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、減量選別後に、１７，６４６個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0173】

表7.選別#3後のMAGEA1

【0174】

【表7】

理論純度は23.7%である
^*より低い純度は、ダンプゲーティングの不在に起因してもよい。
投入濃度= 約30×10⁶個の細胞/ml

【0175】

選別＃４
選別＃３と同様に、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ－７の存在下で一晩培養した後、直接選別がそれに続いた。投棄ゲーティングを使用せずに、ＣＤ８＋Ｔ細胞を減量し、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陰性またはＣＤ４５陰性のＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した。図１３は、投入（左側パネル）および陰性対照（右側パネル）と比較して、減量選別後に、７，０６４個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞（中パネル）が回収されたことを示す。

【0176】

表8:選別#4後のMAGEA1

【0177】

【表8】

理論純度は23.7%である
^*より低い純度は、ダンプゲーティングの不在に起因してもよい。
投入濃度＝約２０×１０^６個の細胞／ｍｌ

【0178】

選別＃５
選別＃１～選別＃４で得られたＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を引き続く選別＃５で合わせた。図１４は、選別＃５後に、陰性対照（右側パネル）と比較して、３３，６０５個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左側パネル）が回収されたことを示す。

【0179】

表9: 選別#1～選別#4に従った直接選別に続くMAGEA1

【0180】

【表9】

【0181】

純度選別から得られた３３，６０５個のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ陽性およびＣＤ４５陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を２つのＲＥＰ、すなわち、ＰＥＰ１ウェルあたり１６，８０２個の細胞に分割した。

【0182】

ＭＬＡおよびＭＡＧＥＡ１で選別された細胞の細胞生存率と倍数増殖
純度選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞生存率および倍数増殖を測定するために、ＡＯＰＩ、すなわち、細胞膜を越えて容易に拡散し、ひいては生きている細胞のＤＮＡを染色し得るアクリジンオレンジ（ＡＯ）と、膜が損傷した細胞にのみ侵入して、死細胞を染色し得るヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とで細胞を染色する。

【0183】

図１５Ａは、ＲＥＰ１後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別された、およびＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞における、生存可能なＴ細胞の総数（上側パネル）および倍数増殖（下側パネル）を示す。

【0184】

図１５Ｂは、ＲＥＰ２２後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別された、およびＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞における、生存可能なＴ細胞の総数（上側パネル）および倍数増殖（下側パネル）を示す。

【0185】

図１６Ａは、ＲＥＰ１後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別された、およびＭＡＧＥＡ１選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。

【0186】

図１６Ｂは、ＲＥＰ２後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別された、およびＭＡＧＥＡ１選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。

【0187】

図１７Ａは、ＲＥＰ１後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＭＬＡ Ｔｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率と、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。

【0188】

図１７Ｂは、ＲＥＰ２後、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＭＬＡ Ｔｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率と、ＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。

【0189】

図１８Ａは、図１６Ａおよび図１７ＡのＭＬＡのＲＥＰ１後フローサイトメトリーデータを示す。

【0190】

図１８Ｂは、図１６Ｂおよび図１７ＢのＭＬＡのＲＥＰ２後フローサイトメトリーデータを示す。

【0191】

図１９Ａは、Ａｇ００１－０２ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＥＰ１後のフローサイトメトリーデータを示す。

【0192】

図１９Ｂは、Ａｇ００１－０２ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＥＰ２後のフローサイトメトリーデータを示す。

【0193】

ＭＬＡ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性を測定するために、ＭＬＡ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞を例えば、それぞれ、０（対照）、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、および１０μｇ／ｍｌのＭＬＡペプチドまたはＭＡＧＥＡ１ペプチドなど、濃度を上げながらパルス化されたＴ２細胞と共にインキュベートすることによって、Ｔ２殺滅アッセイを実施した。

【0194】

ＭＬＡ Ｔｅｔ選別されたＣＴＬ（図２０Ａ）およびＭＡＧＥＡ１ Ｔｅｔ選別されたＣＴＬ（図２０Ｂ）は、濃度依存様式でＭＬＡペプチドまたはＭＡＧＥＡ１ペプチドでパルスされたＴ２細胞を殺滅した。

【0195】

実施例３
染色条件の比較
ＴＣＲは、同族抗原と係合した後、トリガーして内部移行することが知られている。ｐＭＨＣ四量体は、これらの細胞が同族抗原に曝露された後、Ｔ細胞を染色できない可能性がある。染色強度を高める１つの方法は、ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体染色の前に、例えば、ダサチニブなどのタンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＫＩ）でこれらの細胞を処理することによって、ＴＣＲ内部移行を阻害することであってもよい（その内容全体が参照により援用される、Ｌｉｓｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；３４０：１１－２４）。

【0196】

ｐＭＨＣ多量体染色に対するＰＫＩおよび温度の影響を比較するために、健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を５０ｎＭダサチニブ（図２１Ａ）で前処理し、または未処理のままにし（図２１Ｂ）、次に、３７℃（図２１Ａ）または室温（ＲＴ）（図２１Ｂ）のどちらかで３０分間、２つのＣｏｌ６Ａ３－００２ペプチド（ＦＬＤＧＳＡＮＶ（配列番号１４１））（Ｃｏｌ）の四量体（２Ｄｔｅｔ）にストレプトアビジンＢＶ４２１とＰＥを共役させたもの、および５つの異なるの無関係のＡＰＣの四量体（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５）を共役させたもので染色した。四量体染色に続いて、４℃でＰＥおよびＡＰＣに対する四量体安定化抗体染色でサンプルを対比染色し、４℃での抗ＣＤ４５ ＰＥ－Ｃｙ７抗体での染色がそれに続いた。

【0197】

図２１Ａ（パネルＡ１）および２１Ｂ（パネルＢ１）は、四量体なしで染色されたサンプルにおけるバックグラウンドゲーティングストラテジーを示す。

【0198】

図２１Ａ（パネルＡ２）および２１Ｂ（パネルＢ２）は、Ｑ２で表される関心のある細胞での２Ｄｔｅｔ染色を示す。３７℃でのダサチニブ処理は、０．０２７％のＣｏｌ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞をもたらし、これは、ＲＴでのダサチニブ処理なしで得られたものと類似しており、すなわち０．００９５％である。

【0199】

図２１Ａ（パネルＡ３）および２１Ｂ（パネルＢ３）は、無関係のＡＰＣ四量体（ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、およびペプチド５）に対する図２１Ａ（パネルＡ２）および２１Ｂ（パネルＢ２）からのＱ２象限を示し、Ｑ１象限は関心のある細胞を表す。３７℃でのダサチニブ処理は、０．９３％のＣｏｌ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞をもたらし、これは、ＲＴでのダサチニブ処理なしで得られたものと類似しており、すなわち３．３５％である。

【0200】

図２１Ａ（パネルＡ４）および図２１Ｂ（パネルＢ４）は、図２１Ａ（パネルＡ３）および図２１Ｂ（パネルＢ３）からのＱ１細胞の位置を図２１Ａ（パネルＡ２）および図２１Ｂ（パネルＢ２）に重ね合わせて示す。全ての細胞は、ＣＤ４５＋単一細胞リンパ球からゲートされた。最終的な頻度と染色感度は、３７℃でのダサチニブ処理は、４×１０^５個のＣＤ４５＋細胞中に１つのＣｏｌ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞をもたらすことを示し、これは、ＲＴでのダサチニブ処理なしで得られたもの、すなわち、３×１０^５個のＣＤ４５＋細胞中の１つのＣｏｌ Ｔｅｔ＋Ｔ細胞と類似している。

【0201】

実施例４
パネル最適化
Ｔ細胞染色に対する単一（１Ｄ）および二重（２Ｄ）蛍光色素共役ｐＭＨＣ多量体の影響を比較するために、細胞表面にＣｏｌ６Ａ３－００２ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞に特異的に結合するＴ細胞である、約５×１０^６個の細胞／ｍｌのＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１（αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞）細胞、および陰性対照として、細胞表上にＭＬＡペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞に特異的に結合するＴ細胞である、約５×１０^６個の細胞／ｍｌのαＭＬＡ Ｔ細胞を表１０に示される条件下で染色した。全ての細胞は、ＣＤ４５＋単一細胞リンパ球からゲートされた。

【0202】

【表10】

【0203】

図２２Ａ（パネルＡ１）は、抗ＣＤ４５抗体（αＣＤ４５）染色されたαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞のバックグラウンドＡＰＣ／ＰＥ染色を示す。パネルＡ２（Ｑ１）は、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の３７．７％が、Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥについて陽性に染色されたことを示す。パネルＡ３（Ｑ３）は、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の３３．５％が、Ｃｏｌ６Ａ３－ＡＰＣについて陽性に染色されたことを示す。パネルＡ４（Ｑ２）は、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の３３．５％が、Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥとＣｏｌ６Ａ３－ＡＰＣの双方について陽性に染色されたことを示す。陰性対照として、図２２Ｂは、αＣＤ４５染色αＭＬＡ Ｔ細胞（パネルＢ１）、Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥ染色αＭＬＡ Ｔ細胞（０．４８％）（パネルＢ２、Ｑ１）、Ｃｏｌ６Ａ３－ＡＰＣ染色αＭＬＡ Ｔ細胞（１．４８％）（パネルＢ３、Ｑ３）、Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥおよびｏｌ６Ａ３－ＡＰＣ二重染色αＭＬＡ Ｔ細胞（０．０２４％）（パネルＢ４、Ｑ２）のバックグラウンドＡＰＣ／ＰＥ染色を示す。図２２Ｃは、染色された陰性対照αＭＬＡ Ｔ細胞と、二重染色されたαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞とを１０：１の比率で混合することで、０．３９％（Ｑ２）のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞もまた検出され得ることを示す。

【0204】

低頻度のペプチド特異的Ｔ細胞の検出における１Ｄ四量体と２Ｄ四量体の能力を比較するために、二重染色αＭＬＡ Ｔ細胞と、二重染色（ＡＰＣ／ＰＥ）αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞とを３：１、３０：１、および９０：１の希釈比で混合またはスパイクし、フロー解析がそれに続いた。染色条件は、表１１に示される。

【0205】

【表11】

【0206】

図２３Ａは、二重Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥ／ＡＰＣ染色を用いて、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞が、３：１（９．５１％）（パネルＡ１、Ｑ２）、３０：１（１．３８％）（パネルＡ２、Ｑ２）、および９０：１（０．６６％、パネルＡ３、Ｑ２）の希釈比で検出され得ることを示す。対照的に、図２３Ｂは、単一のＣｏｌ６Ａ３－ＰＥ染色を用いて、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞が、３：１（１３．５％）（パネルＢ１、Ｑ１）、３０：１（２．３２％）（パネルＢ２、Ｑ１）、および９０：１（１．０６％、パネルＢ３、Ｑ１）の希釈比で検出され得ることを示す。図２３Ｃは、試験された希釈範囲内でαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を検出する際に、１Ｄ四量体染色（Ｒ^２＝０．８７５６）と比較して、２Ｄ四量体染色が改善された直線性（Ｒ^２＝０．９３９４）を有してもよいことを示す。

【0207】

低頻度のペプチド特異的Ｔ細胞の検出における１Ｄ四量体と２Ｄ四量体の能力をさらに比較するために、二重染色αＭＬＡ Ｔ細胞と、二重染色（ＡＰＣ／ＰＥ）αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞とを３：１、９：１、２７：１、８１：１、２４３：１、および７２９：１の希釈率で混合またはスパイクし、フロー解析がそれに続いた。染色条件は、表１２に示される。

【0208】

【表12】

【0209】

図２４Ａは、二重Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥ／ＡＰＣ染色を用いて、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞が、３：１（９．８６％）（パネルＡ１、Ｑ２）、９：１（３．４０％）（パネルＡ２、Ｑ２）、２７：１（１．９２％）（パネルＡ３、Ｑ２）、８１：１（０．８８％）（パネルＡ４、Ｑ２）、２４３：１（０．３１％）（パネルＡ５、Ｑ２）、および７２９：１（０．１９％、パネルＡ６、Ｑ２）の希釈比で検出され得ることを示す。対照的に、図２４Ｂは、単一Ｃｏｌ６Ａ３－ＰＥ染色を用いて、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞が、３：１（１６．５％）（パネルＢ１、Ｑ１）、９：１（６．１５％）（パネルＢ２、Ｑ１）、２７：１（２．９２％）（パネルＢ３、Ｑ１）、８１：１（１．３９％）（パネルＢ４、Ｑ１）、２４３：１（０．８３％）（パネルＢ５、Ｑ１）、および７２９：１（０．９６％、パネルＢ６、Ｑ１）の希釈比で検出され得ることを示す。図２４Ｃは、試験された希釈範囲内でαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を検出する際に、１Ｄ四量体染色（Ｒ^２＝０．７０２１）よりも、２Ｄ四量体染色が改善された直線性（Ｒ^２＝０．７２６５）を有してもよいことを示す。図２４Ｄは、αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出において、例えば、６４：１～１０２４：１などの低希釈範囲で、１Ｄ四量体染色（Ｒ２＝０．５３８１）よりも、２Ｄ四量体染色が優れた直線性（Ｒ２＝０．８７５８）を有することを示す。これらの結果は、低頻度のペプチド特異的Ｔ細胞の検出において、２Ｄ四量体染色が１Ｄ四量体染色よりも優れていてもよいことを示す。

【0210】

それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｔｕｎｇａｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，１９４：４６３－４７４）およびＤｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１５，１４６：１１－２２）は、染色中に抗蛍光色素非共役抗体を添加すると、ｐＭＨＣ四量体およびデキストラマーと、ＰＥ、ＡＰＣ、またはＦＩＴＣベースの試薬との双方で、蛍光強度が大幅に向上したことを開示している。

【0211】

ペプチド特異的Ｔ細胞の１Ｄ Ｔｅｔ染色に対する、抗蛍光色素非共役抗体の効果を判定するために、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を（ｉ）１Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ）±抗ＡＰＣ一次抗体、または（ｉｉ）１Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ）Ｔｅｔ±抗ＰＥ一次抗体で染色した。図２５Ａ（パネルＡ１、Ｑ３）は、抗ＡＰＣ一次抗体の添加が、αＣＤ４５＋ＡＰＣ－Ｔｅｔ染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を、抗ＡＰＣ一次抗体なしでの４６．３％から６３．８％（パネルＡ２、Ｑ３）まで増強することを示す。図２５Ｂは、抗ＰＥ一次抗体の添加が、ＰＥ－Ｔｅｔ染色αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を、抗ＡＰＣ一次抗体なしでの３９．１％（パネルＢ１、Ｑ１）から６０．６％（パネルＢ２、Ｑ１）まで増強することを示す。

【0212】

ペプチド特異的Ｔ細胞の２Ｄ Ｔｅｔ染色に対する、抗蛍光色素非共役抗体の効果を判定するために、αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を（ｉ）２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）±抗ＡＰＣ一次抗体および抗ＰＥ一次抗体、または（ｉｉ）２Ｄ Ｔｅｔ（ＢＶ４２１＋ＰＥ）±抗ＰＥ一次抗体で染色した。図２５Ｃ（パネルＣ１、Ｑ２）は、抗ＡＰＣ一次抗体および抗ＰＥ一次抗体の添加が、αＣＤ４５＋２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を、抗ＡＰＣ一次抗体および抗ＰＥ一次抗体なしでの１２．０％から３９．２％まで増強することを示す（パネルＣ２、Ｑ２）。図２５Ｄは、抗ＰＥ一次抗体の添加が、２Ｄ Ｔｅｔ（ＢＶ４２１＋ＰＥ）染色αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を、抗ＡＰＣ一次抗体なしでの２０．８％から（パネルＤ１、Ｑ６）３９．５％（パネルＤ２、Ｑ６）まで増強することを示す。陰性対照として、図２５Ｅは、抗ＡＰＣ一次抗体および抗ＰＥ一次抗体の添加が、２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色αＭＬＡ Ｔ細胞を検出せず（パネルＥ１、Ｑ２）、抗ＰＥ一次抗体検出２Ｄ Ｔｅｔ（ＢＶ４２１＋ＰＥ）染色αＭＬＡ Ｔ細胞の添加もまた、検出しなかったことを示す（パネルＥ２、Ｑ６）。陰性対照は、図２５Ｃに示される。これらの結果は、抗蛍光色素非共役抗体の添加が、ペプチド特異的Ｔ細胞の１Ｄ Ｔｅｔおよび２Ｄ Ｔｅｔ染色における、ペプチド特異的Ｔ細胞の検出を増強し得ることを示す。

【0213】

２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）および２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）の間で検出感度を比較するために、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色αＭＬＡ Ｔ細胞中に、抗ＰＥ一次抗体の存在下で、１：１０、１：１００、１：１０００、および１：１００００の希釈比でスパイクした（図２６、上部パネル）。２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色の陰性対照は、図２５Ｅ（Ｅ２）に示される。同様に、２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色αＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞を２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色αＭＬＡ Ｔ細胞中に、抗ＡＰＣ一次抗体および抗ＰＥ一次抗体の存在下で、１：１０、１：１００、１：１０００、および１：１００００の希釈比でスパイクした（図２６、下部パネル）。２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色の陰性対照は、図２５Ｅ（Ｅ１）に示される。これらの結果は、それぞれの希釈比における、２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞（上部パネルのＱ６）の検出と、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞（下部パネルのＱ２）の検出とが同等であることを示し、２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）および２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）の同等の感度が示唆される。しかし、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）を使用することで、例えば、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）を染色するために、例えば、抗ＰＥ一次抗体などの１つの抗蛍光色素非標識抗体を使用することと、２Ｄ Ｔｅｔ（ＡＰＣ＋ＰＥ）の染色のために例えば、抗ＡＰＣ一次抗体と抗ＰＥ一次抗体の２つの抗蛍光色素非標識抗体を使用することの比較で、試薬の要求量を低減させてもよい。

【0214】

未染色のＴ細胞を検出する際のバックグラウンドブロック剤、例えば牛乳の能力を検証するために、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する洗浄液に５％の牛乳緩衝液を添加した。例えば、未染色のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞、αＭＬＡ Ｔ細胞、およびＰＢＭＣ Ｔ細胞は、５％の牛乳と０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する溶液で洗浄するか、牛乳なしで０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有する溶液で洗浄した。図２７は、洗浄液への牛乳の添加が、牛乳なしの洗浄液に比べて、αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞（左下パネルのＱ６）およびαＭＬＡ Ｔ細胞（中央下パネルのＱ６）の自己蛍光を増強することを示す（それぞれ左上パネル（Ｑ６）および中央上パネル（Ｑ６）。洗浄液への牛乳の添加が、ＰＢＭＣ Ｔ細胞の自己蛍光を増強しないこともある（右上および右下パネル）。

【0215】

染色に対する、ＰＫＩ、無関係のペプチド四量体、温度の影響
最も低いバックグラウンドと最も低い偽陽性率を提供してもよい染色条件を判定するために、例えば、ダサチニブ（ＤＡＳ）などのＰＫＩ処理ありまたはなしで、異なる四量体染色温度で、無関係のペプチド四量体の混合物ありまたはなしでＰＢＭＣを染色した（その内容全体が本明細書に参照により援用される、Ｈａｄｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，６：５２０－５２６）。例えば、ＰＢＭＣ細胞を、例えば、５種類の無関係のペプチド（ＹＬＭＤＤＦＳＳＬ（配列番号１６））、ＭＡＧ－００３（ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１１８））、ＭＡＧＥＣ２－００１（ＴＬＤＥＫＶＡＥＬ（配列番号１６１））、ＭＸＲＡ５－００３（ＬＬＷＧＨＰＲＶＡＬＡ（配列番号１８））、およびＭＡＧＥＡ１－００３（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号１０５））ＡＰＣ四量体などの無関係のペプチド四量体混合物の存在下または非存在下、±ＤＡＳ処理によって、３７℃または室温（ＲＴ）で、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色した。ＤＡＳ処置は３７℃で実施した。

【0216】

この解析では、最低でも０．５×１０^６回のイベントを取得した。ＤＡＳ処理ありでは、図２８Ａの左上パネルは、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下でのＲＴでの染色、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）によるＰＢＭＣ染色中の８．０４Ｅ－３％（Ｑ２）ＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９５．２％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約４．７６％のＡＰＣ陰性およびＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）。無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の非存在下では、右下パネル（Ｑ２）は、左下パネルのＱ２（７．１７Ｅ－３％）で検知されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞中の０％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞を示す。したがって、左下パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞中の１００％の細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞であるように見る（右下パネルのＱ１）。これらの結果は、ＲＴでの四量体染色への無関係のペプチド四量体混合物の添加が、ＰＢＭＣ中の偽陽性ペプチド特異的Ｔ細胞の検出率を、例えば、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の非存在下での１００％から、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下での４．７６％まで、低下させ得ることを示す。

【0217】

図２８Ａに示される実験を３７℃で実施して、同様の結果を観察した。図２８Ｂの左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、０．０５５％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９８．２％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約１．７８％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）。対照的に、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の非存在下では、右下パネル（Ｑ２）は、左下パネルのＱ２（０．１９％）で検知されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞中の０％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞を示す。したがって、左下パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞中の１００％の細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞であるように見る（右下パネルのＱ１）。これらの結果は、３７℃での四量体染色への無関係のペプチド四量体混合物の添加が、ＰＢＭＣ中の偽陽性ペプチド特異的Ｔ細胞の検出率を、例えば、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の非存在下での１００％から、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下での１．７８％まで、低下させ得ることを示す。

【0218】

図２８Ｃは、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の添加が、ＰＢＭＣ中の無関係のペプチド陰性細胞および２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞の検出を、例えば、無無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の非存在下での平均（ｎ＝４）９９．３±１．１４％から、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下での３．７７±２．７％まで、有意に減少させることを示す。これらの結果は、無関係のペプチド四量体混合物が偽陽性２Ｄ Ｔｅｔ染色ペプチド特異的Ｔ細胞を減少させ得ることを示す。

【0219】

図２９は、ＤＡＳ処理が、ＤＡＳ処理なしと比較して、ＰＢＭＣ中のＣＤ４５＋２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞の検出を有意に増加させなくてもよい（ｎ＝４、Ｔ検定、ｐ＝０．５２７３７３）ことを示す。

【0220】

図３０は、ＲＴでの染色と比較して、３７℃での２Ｄ Ｔｅｔ染色が、ＰＢＭＣ中のバックグラウンドＣＤ４５＋２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞の検出を増加させる傾向がある（ｎ＝４、Ｔ検定、ｐ＝０．０６３９５４）ことを示す。

【0221】

無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下、ＤＡＳ処理ありでＲＴで染色を実施した場合、図３１Ａの左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、８．０４Ｅ－３％（Ｑ２）ＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９５．２％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約４．７６％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）。ＤＡＳ処理なしでは、右下パネルは、左下パネルのＱ２（５．５１Ｅ－３％）で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の９２．９％（Ｑ２）を示す。したがって、左下パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、ＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞の７．１４％は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞に相当してもよい（右下パネルのＱ１）。

【0222】

無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で３７℃で染色を実施した場合にも、同様の結果が観察された。ＤＡＳ処理ありでは、図３１Ｂの左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、０．０５５％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９８．２％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約１．７８％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３特異的Ｔ細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）。ＤＡＳ処理なしでは、右下パネルは、左下パネルのＱ２（０．０２７％）で検出された、ＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９８．６％（Ｑ２）の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわちＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を示す。

【0223】

陽性に染色された細胞と陰性に染色された細胞の分離が良好で、偽陰性率が低いことを示す、より高い染色指数（ＳＩ）を提供してもよい染色条件を判定するために、迅速増殖プロトコル（ＲＥＰ）によって調製されたＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞を±ＤＡＳ処理（３７℃）、±無関係のペプチド四量体混合物、ＲＴまたは３７℃で染色した。

【0224】

染色指数（ＳＩ）は、式（Ｉ）を用いて計算してもよい：ＳＩ＝（平均ＰＥ＋平均ＢＶ４２１ ２Ｄｔｅｔ＋）－（平均ＰＥ＋平均ＢＶ４２１ ２Ｄｔｅｔ－）／２×（ＳＤ ＰＥ＋ＳＤ ＢＶ４２１ ２Ｄｔｅｔ－）。図３２は、ＤＡＳ処理が、ＤＡＳ処理なしと比較して、ＳＩを例えば、Ｐ＝０．００６１０１など、有意に上昇させることを示す。対照的に、染色温度および無関係のペプチド混合物は、例えば、ＲＴ対３７℃（Ｐ＝０．３１６６９５）、および±無関係のペプチド四量体混合物（Ｐ＝０．５９７２２３））など、ＳＩに有意な影響を与えなくてもよい。

【0225】

ＤＡＳ処理ありでは、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下でＲＴで染色を実施した場合、図３３Ａの左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された５５．８％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、２１．６％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約７８．４％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）（ＳＩ＝２４．０）。３７℃で染色を実施した場合、右下パネル（Ｑ２）は、左下パネルのＱ２（５４．４％）で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、６．３８％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞を示す。したがって、約９３．６％の細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞に相当してもよい（右下パネルのＱ１）（ＳＩ＝１９．０）。これらの結果は、ＤＡＳ処理ありで、無関係のペプチド四量体混合物の存在下での３７℃の四量体染色温度が、偽陰性Ｔ細胞を、例えば、ＲＴでの２１．６％から３７℃での６．３８％に低下させてもよいことを示す。

【0226】

ＤＡＳ処理なしで、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で染色を実施した場合、図３３Ｂの左上パネルは、ＲＴで２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された５９．２％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。右上パネルは、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、１２．４％（Ｑ２）の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約８７．６％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞に相当してもよい（右上パネルのＱ１）（ＳＩ＝１５．９）。３７℃で染色を実施した場合、図３３の右下パネル（Ｑ２）は、左上のパネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、４．１２％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞を示す。したがって、約９５．９％の細胞は、真のＣｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞に相当してもよい（右下パネルのＱ１）（ＳＩ＝９．４９）。これらの結果は、ＤＡＳ処理なしで、無関係のペプチド四量体混合物の存在下での３７℃での四量体染色が、偽陰性Ｔ細胞を、例えば、ＲＴでの１２．４％から３７℃での４．１２％に低下させ得ることを示す。

【0227】

２つの染色条件の比較
条件＃１：ＤＡＳ処理あり＋無関係のペプチド四量体混合物あり、３７℃での染色。

【0228】

以下のサンプル＃１～＃３は、条件＃１で染色した。

【0229】

サンプル＃１：αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞
図３４Ａの左側パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された２５．１％（Ｑ２）のＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した（ＳＩ＝１５．６）。右側パネル（Ｑ２）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、３．１８％の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約９６．９％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相当してもよい（右側パネルのＱ１）。

【0230】

サンプル＃２：ＰＢＭＣ中にスパイクされたαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞（１：１×１０^５）、約２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞の取得
図３４ＢのＢ２パネルは、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔで染色されたＰＢＭＣ（１：１×１０^５）中にスパイクされた０．０３５％（Ｑ２）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。図３４ＢのＢ３パネルは、Ｂ２パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９７．４％（Ｑ２）のＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性の無関係のペプチドＴ細胞の検出を示す。したがって、約２．５８％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、ＰＢＭＣ中にスパイクされた真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相 当してもよい（Ｂ３パネルのＱ１）。未染色のＰＢＭＣ（Ｂ１パネル）が、陰性対照として機能する。Ｂ４パネルは、Ｂ３パネルのＱ１をＢ２パネルに重ねたものである。これらの結果は、取得された２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞における、１８個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出、すなわち、１×１０^５個のＣＤ４５＋細胞における、約１個のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。

【0231】

サンプル＃３：ＰＢＭＣ（５×１０^６個の細胞）のみ、約２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞の取得
図３４ＣのＣ２パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ／ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、０．０２７％（Ｑ２）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。Ｃ３パネルは、Ｃ２パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９９．１％（Ｑ２）のＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性で無関係のペプチドＴ細胞の検出を示す。したがって、約０．９３％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、ＰＢＭＣ中の真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相当してもよい（Ｃ３パネルのＱ１）。未染色のＰＢＭＣ（Ｃ１パネル）が、陰性対照として機能する。Ｃ４パネルは、Ｃ３パネルのＱ１をＣ２パネルに重ねたものである。結果は、取得された２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞における、５個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性の細胞の検出、すなわち、４×１０^５個のＣＤ４５＋細胞における、約１個のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。

【0232】

条件２：ＤＡＳ処理なし＋無関係のペプチド四量体混合物、ＲＴでの染色
以下のサンプル＃４～＃６は、条件＃２で染色した。

【0233】

サンプル＃４：αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞
図３５Ａの左側パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された３５．５％（Ｑ２）のＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した（ＳＩ＝１０．２）。右側パネルは、左側パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、２．６０％（Ｑ２）の無関係のペプチド陽性Ｔ細胞の検出を示す。したがって、約９７．４％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相当してもよい（右側パネルのＱ１）。

【0234】

サンプル＃５：ＰＢＭＣ中にスパイクされたαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞（１：１×１０^５）、約２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞の取得
図３５ＢのＢ２パネルは、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔで染色されたＰＢＭＣにスパイクされた０．０１２％（Ｑ２）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。図３５ＢのＢ３パネルは、Ｂ２パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９３．７％（Ｑ２）のＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性の無関係のペプチドＴ細胞の検出を示す。したがって、約６．３２％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、ＰＢＭＣ中にスパイクされた真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相当してもよい（Ｂ３パネルのＱ１）。未染色のＰＢＭＣ（Ｂ１パネル）が、陰性対照として機能する。Ｂ４パネルは、Ｂ３パネルのＱ１をＢ２パネルに重ねたものである。結果は、取得された２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞における、１２個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性の細胞の検出、すなわち、１．７×１０^５個のＣＤ４５＋細胞における、約１個のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。

【0235】

サンプル＃６：ＰＢＭＣ（５×１０^６個の細胞）のみ、約２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞の取得
図３５ＣのＣ２パネルは、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔで染色されたＰＢＭＣにおける、９．５４Ｅ－３％（Ｑ２）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。Ｃ３パネルは、Ｃ２パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９６．６％（Ｑ２）のＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性で無関係のペプチドＴ細胞の検出を示す。したがって、約３．３５％のＡＰＣ陰性／ＢＶ４２１陽性細胞は、ＰＢＭＣ中の真のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞に相当してもよい（Ｃ３パネルのＱ１）。未染色のＰＢＭＣ（Ｃ１パネル）が、陰性対照として機能する。Ｃ４パネルは、Ｃ３パネルのＱ１をＣ２パネルに重ねたものである。結果は、取得された２×１０^６個のＣＤ４５＋細胞における、６個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性の細胞の検出、すなわち３．３×１０^５個のＣＤ４５＋細胞における、約１個のαＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。

【0236】

上述したように、図３４Ａの左側パネルは、ＤＡＳ処理ありで、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下３７℃での染色で、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された、２５．１％（Ｑ２）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。図３５Ａの左側パネルは、ＤＡＳ処理なしで、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下、ＲＴでの染色で、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された、３５．５％（Ｑ４５）ＣＤ４５＋αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の検出を示す。表１３に示されるように、条件Ａ～Ｇで２Ｄ Ｔｅｔ染色を実行することによって、ＤＡＳ処理なし（３５．５％）よりもＤＡＳ処理あり（２５．１％）での予想よりも低い２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色の観察を調査した。

【0237】

【表13】

【0238】

図３６Ａは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色±ＤＡＳ処理を無関係のペプチド四量体混合物の存在下で、卓上インキュベーション（例えば、氷上）と４℃での遠心分離を行った場合（パネルＣ～ＧのＱ２）には、いかなるステップも４℃で実施されない場合（パネルＡおよびＢのＱ２）と比較して、ＰＥ／ＢＶ４２１二重染色されたＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３ ＲＥＰ１細胞の検出が一般的に増加することを示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。ＤＡＳ処理ありで、図３６ＢのパネルＤ（１３．７％、Ｑ２）は、４℃で２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色、卓上インキュベーション、および遠心分離を実施した場合には、３７℃で実施された（パネルＣ、２．０１％、Ｑ２）またはＲＴで実施された（パネルＦ、３．０７％、Ｑ２）２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色と比較して、ＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性の無関係のペプチドＴ細胞のバックグラウンド染色が増加することを示す。ＤＡＳ処置なしで、パネルＧ（５．４８％、Ｑ２）は、４℃で２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色、卓上インキュベーション、および遠心分離を実施した場合には、ＲＴで実施された２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）染色（パネルＥ、２．８０％、Ｑ２）と比較して、ＢＶ４２１／ＡＰＣ二重陽性の無関係のペプチドＴ細胞のバックグラウンド染色が増加することを示す。

【0239】

図３６Ｃは、特異的染色（図３６ＡのＱ２）および非特異的染色（図３６ＢのＱ２）の棒グラフを示す。１×１０^６個のＣＤ４５＋細胞あたりのペプチド特異的Ｔ細胞の数を示すフロー％に基づく１×１０^６個あたりの推定値は、以下の式で算出されてもよい：（２Ｄｔｅｔ＋％×１×１０^６／１００）－（（２Ｄｔｅｔ＋％×１×１０^６／１００）×無関係のペプチド四量体混合物＋％／１００））。表１４は、染色条件Ａ～Ｇ下での推定値を要約する。ＤＡＳ処理は、３７℃で３０分間実施した。

【0240】

【表14】

^*(2Dtet+%×1×10⁶/100)- ((2Dtet+%×1×10⁶/100)×無関係のペプチド 四量体混合物 +%/100))。

【0241】

これらの結果は、例えば、染色条件ＤおよびＧなど、４℃で全ての染色、スピン（遠心分離）、および／または洗浄を実施することが、その他の条件、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＦよりも高い、１×１０^６個のＣＤ４５＋細胞あたりのペプチド特異的Ｔ細胞の推定数、すなわち、それぞれ６．７５×１０^５個および７．０６×１０^５個の検出に基づいて、好ましくあってもよいことを示す。

【0242】

条件ＤおよびＧでのＰＢＭＣ染色を調べるために、４人のドナーから得たＰＢＭＣ（１２．５×１０^６個の細胞／ｍｌ）を染色した±ＤＡＳ処理（５０ｎＭ、３７℃）、Ｃｏｌ６Ａ３－００２ ＢＶ４２１四量体（３μｇ／ｍｌ）およびＣｏｌ６Ａ３－００２ ＰＥ四量体（２．５μｇ／ｍｌ）、例えばＰＥ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの蛍光色素標識抗ＣＤ４５抗体、Ｃｏｌ６Ａ３－００２ ＢＶ４２１四量体（３μｇ／ｍｌ）、およびＡＰＣ無関係のペプチド（ｎ＝５、例えば、Ｃｏｌ６Ａ３－０１５（ＹＬＭＤＤＦＳＳＬ（配列番号１６））、ＭＡＧ－００３（ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１１８））、ＭＡＧＥＣ２－００１（ＴＬＤＥＫＶＡＥＬ（配列番号１６１））、ＭＸＲＡ５－００３（ＬＬＷＧＨＰＲＶＡＬＡ（配列番号１８））、およびＭＡＧＥＡ１－００３（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号１０５））の四量体混合物（３μｇ／ｍｌ）、全ての染色、スピン、および洗浄は４℃で実施した。

【0243】

ＤＡＳ処理ありでは、図３７Ａの左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、４．２３Ｅ－３％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３陽性Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＰＥ二重染色細胞を検出した。中央上パネル（枠内）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、４６．５％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右上パネルは、中央上パネルの枠内領域を左上パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された４．７８×１０^６個のリンパ球における、９４個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0244】

ＤＡＳ処理ありでは、図３７Ａの左下パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、４．３８Ｅ－３％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３陽性Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＰＥ二重染色細胞を検出した。中央下パネル（枠内）は、左下パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、３４．４％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右下パネルは、中央下パネルの枠内領域を左下パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された４．１１×１０^６個のリンパ球における、６２個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0245】

要約すると、図３７Ｂは、ＤＡＳ処理が、全てての染色、スピン（遠心分離）、および洗浄を４℃で実施した場合、ＤＡＳ処理なしと比較して、ＰＤＭＣ中の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を増加させることを示す。図３７Ｃは、ＤＡＳ処理が、全ての染色、スピン（遠心分離）、および洗浄を４℃で実施した場合、ＤＡＳ処理なしと比較して、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）＋ＰＥおよび２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）＋ＢＶ４２１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を減少させることを示す。

【0246】

図３７Ａ～３７Ｄに示される実験を、例えば、ＰＥ－Ｃｙ（商標）７マウス抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの異なる蛍光色素標識抗ＣＤ４５抗体を使用して繰り返した。４人のドナーから得たＰＢＭＣ（１０×１０^６個の細胞／ｍｌ）を染色した、ＤＡＳ処理（５０ｎＭ、３７℃）ありまたはなし、ＢＶ４２１（３μｇ／ｍｌ）、Ｃｏｌ６Ａ３－００２ ２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）（２．５μｇ／ｍｌ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ（商標）５．５マウス抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｏｌ６Ａ３－００２ ＢＶ４２１四量体（３μｇ／ｍｌ）、およびＡＰＣ（ｎ＝５）無関係の四量体混合物（３μｇ／ｍｌ）、全ての染色、スピン、および洗浄は４℃で実施した。

【0247】

ＤＡＳ処理なしで、図３８の左側パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色されたＰＢＭＣにおける、０．０１２％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３陽性Ｔ細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＰＥ二重染色細胞を検出した。中央パネル（枠内）は、左側パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、７．６２％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右側パネルは、中央パネルの枠内領域を左側パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された１．０９×１０^７個のリンパ球における、１００個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0248】

対照としてＣｏｌ６Ａ３ ＰＥＰ１細胞を使用して、図３８に示す実験を繰り返した。ＤＡＳ処理ありでは、図３９の左上パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された６８．９％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３ ＰＥＰ１細胞が検出されたことを示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＰＥ二重染色細胞を検出した。中央上パネル（枠内）は、左上パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９５．８％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右上パネルは、中央上パネルの枠内領域を左上パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された２０６０５５個のリンパ球における、１３５９４１個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0249】

ＤＡＳ処理なしで、図３９の左下パネルは、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された６２．５％（Ｑ２）のＣＤ４５＋Ｃｏｌ６Ａ３ ＰＥＰ１細胞が検出されたことを示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＰＥ二重染色細胞を検出した。中央下パネル（枠内）は、左下パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９７．６％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右下パネルは、中央下パネルの枠内領域を左下パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された２９４７５２個のリンパ球における、１７９８１９個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0250】

取得されたＰＢＭＣの数が多い場合と少ない場合の２Ｄ Ｔｅｔ検出への影響を調べるために、例えば、数が多い場合（Ｓ１とＳ２）と少ない場合（Ｓ３とＳ４）の４つのサンプルを染色した。ＰＢＭＣの数が多い場合、図４０Ａ（左上パネル）は、Ｓ１（ＤＡＳ処理あり）で取得された１．２９×１０^７個のリンパ球における、１２８個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。右上パネルは、Ｓ１（ＤＡＳ処理なし）で取得された１．０９×１０^７個のリンパ球における、１００個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。左下パネルは、Ｓ２（ＤＡＳ処理あり）で取得された６．０９×１０^６個のリンパ球における、６８個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。右下パネルは、Ｓ２（ＤＡＳ処理なし）で取得された６．３７×１０^６個のリンパ球における、６５個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。

【0251】

ＰＢＭＣの数が少ない場合、図４０Ｂ（左上パネル）は、Ｓ３（ＤＡＳ処理あり）で取得された９．７１×１０^５個のリンパ球における、２３個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。右上パネルは、Ｓ３（ＤＡＳ処理なし）で取得された９．４８×１０^５個のリンパ球における、１１個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。左下パネルは、Ｓ４（ＤＡＳ処理あり）で取得された５．３５×１０^６個のリンパ球における、８０個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。右下パネルは、Ｓ４（ＤＡＳ処理なし）で取得された６．４２×１０^６個のリンパ球における、６６個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。

【0252】

図４０Ｃは、２Ｄ Ｔｅｔ染色におけるＤＡＳ処理が、ＤＡＳ処理なしと比較して、２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞の検出頻度を増大させる傾向があることを示している。

【0253】

図４０Ｄは、２Ｄ Ｔｅｔ染色におけるＤＡＳ処理が、ＤＡＳ処理なしと比較して、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性細胞の検出において、２Ｄ Ｔｅｔ＋ＢＶ４２１のＭＦＩを減少させる傾向があり、２Ｄ Ｔｅｔ＋ＰＥのＭＦＩに影響を与えなくてもよいことを示す。

【0254】

濾過されたおよび濾過されていない２Ｄ Ｔｅｔが染色に及ぼす影響を調べるために、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ溶液を作業希釈し、０．２ｕＭフィルターで濾過した。αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞は、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で、濾過されたおよび濾過されていない２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１Ｔｅｔで染色した。αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞の染色において濾過されていない２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔを使用すると、図４０Ｅ（パネルＡ～Ｅ）は、パネルＤおよびＥの矢印で示されるように、染色凝集体を示している。対照的に、αＣｏｌ６Ａ３ Ｔ細胞染色において濾過された２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔを使用すると、図４０Ｅ（パネルＦ～Ｊ）は、パネルＩおよびＪの矢印で示されるように、染色凝集体の減少を示す。濾過された２Ｄ四量体は、ＡＰＣ、ＢＶ４２１、ＰＥなどの試験された全ての蛍光色素で、「凝集体」染色の減少を示す。

【0255】

要約すると、染色プロセス全体を通じて温度を４℃に下げると、染色％と染色強度が高められてもよい。ＤＡＳ処理サンプルの１／４がＭＦＩの約２倍の増加を示すことから、ＤＡＳ処理もまた染色感度を高めてもよい。したがって、染色条件の好ましい一実施形態としては、（１）４℃での染色、（２）３７℃でのＤＡＳ処理、（３）ＢＶ４２１に共役したペプチド特異的四量体、（４）ＰＥに共役したペプチド特異的四量体、（５）ＡＰＣに共役した無関係のペプチド四量体、および（６）例えば、ＰＥ－Ｃｙ（商標）７マウス抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの蛍光色素標識抗ＣＤ４５抗体を含んでもよい。例えば、最適化されたパネルとしては、（１）２Ｄ ＰＥ（２．５ｕｇ／ｍＬ）＋ＢＶ４２１（３ｕｇ／ｍＬ）特異的四量体、（２）無関係の混合物（ｎ＝５、例えば、Ｃｏｌ６Ａ３－０１５（ＹＬＭＤＤＦＳＳＬ（配列番号１６））、ＭＡＧ－００３（ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１１８））、ＭＡＧＥＣ２－００１（ＴＬＤＥＫＶＡＥＬ（配列番号１６１））、ＭＸＲＡ５－００３（ＬＬＷＧＨＰＲＶＡＬＡ（配列番号１８））、およびＭＡＧＥＡ１－００３（ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号１０５））ＡＰＣ四量体（３ｕｇ／ｍＬ）（配列類似ペプチドが使用されてもよい）、（３）抗ＡＰＣ＋抗ＰＥ四量体安定化抗体（１：５０希釈液＝それぞれ１０ｕｇ／ｍＬ）、（４）３７℃で３０分間のＤＡＳ（５０ｎＭ）処理、（５）試験管を氷上に保ち、４℃で遠心沈殿させ、全ての染色中に４℃で染色し（例えば、冷蔵庫内）、これにより最大の感度が達成されてもよく、（６）全ての蛍光色素の「凝集体」染色を低減するために濾過された四量体を含んでもよい。

【0256】

実施例５
選別最適化
選別ストラテジーにおける様々なパネルを比較するために、ＰＢＭＣ（４～５×１０^６個の細胞／ｍｌ）を、２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔおよび無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で、例えばＣＤ４５ＰＥ－Ｃｙ７などの±抗ＣＤ４５抗体で染色した。表１５に結果を要約する。

【0257】

【表15】

【0258】

１５に示すように、抗ＣＤ４５抗体ありでは、ＢＶ４２１トリガーとＰＥトリガーの純度はそれぞれ７５．２％と７７．２％であり、例えば、それぞれ７３．８％と７１．９％の純度など、抗ＣＤ４５抗体なしよりもわずかに高い。既知の標的陽性百分率のモデルシステムを使用して、ポアソン分布に基づいて計算された理論純度よりも低い純度が観察されたのは、寛大な２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞ゲーティングに起因してもよい。この低純度は、連続選別ステップを含む選別ストラテジーにとって許容可能であってもよい。

【0259】

純度に対する細胞濃度の影響を調べるために、例えば、０．１３％の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性細胞がスパイクされた２３×１０^６個の細胞／ｍｌ、０．１４％の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性細胞がスパイクされた４４×１０^６個の細胞／ｍｌ、０．０９％の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性細胞がスパイクされた７６×１０^６個の細胞／ｍｌ、および０．１２％の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性細胞がスパイクされた８７×１０^６個の細胞／ｍｌなどの約０．１％の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性細胞がスパイクされた４つの異なる濃度のＰＢＭＣを分析した。表１６に結果を要約する。

【0260】

【表16】

【0261】

表１６は、細胞濃度が低いほど純度が高くなることを示す。しかし、純度は全例で理論純度より１３～２５％低かった。上述したように、理論上の純度よりも低い純度が観察されたのは、寛大な２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞ゲーティングに起因してもよい。

【0262】

純度を向上させるために、２つの選別ストラテジーを用いた。ストラテジー＃１：１つのカートリッジのみを使用し、すなわち、全細胞を１つのカートリッジに装填し、同じカートリッジを使用して選別プロセスを３回繰り返した。９００×１０^６個の細胞を処理することによって、約０．０００４％の２Ｄ Ｔｅｔ陽性細胞を検出し得ると仮定すると、８７×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度で６５％の選別効率を基準に、同じカートリッジを使って３回繰り返し選別することによって、９５．７％の総選別効率が得られてもよい。

【0263】

ストラテジー＃２では、４つのカートリッジを使用して、例えば、９００×１０^６個の細胞を３つのカートリッジに分割し、各カートリッジは１回だけ使用した。選別効率は、９２．８％（２５×１０^６個の細胞／ｍｌの場合と同様）から７９．２％（５０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの場合と同様）までと仮定する。例えば、それぞれのカートリッジが１０ｍｌを保持する場合、１×１０^９個の細胞、２×１０^９個の細胞、または３×１０^９個の細胞をストラテジー＃２によって処理し、それぞれ３３×１０^６個の細胞／ｍｌ、６６×１０^６個の細胞／ｍｌ、または１００×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度を選別に使用する。選別プロセスが完了するまでに、約５時間かかってもよい。

【0264】

選別における選別効率を最大化するために、サンプル全体を１つのカートリッジを使用して９０～１００×１０^６個の細胞／ｍＬで処理した（ストラテジー＃１）。対照として、図４１の左側パネルは、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色された、７６．０％（Ｑ２）のＣｏｌ６Ａ３ ＰＥＰ１細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。中央パネル（枠内）は、左側パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、９８．９％の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右側パネルは、中央パネルの枠内領域を左側パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された１２６６９０個のリンパ球における、９５３１５個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性で無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性のイベントの検出を示す。

【0265】

図４２は、ゲーティングストラテジーの一例を示す。図４２の左側パネルは、無関係のペプチドＡＰＣ四量体混合物の存在下で２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）で染色したＰＢＭＣ（７．０９×１０^６単一細胞）における２．６２Ｅ－３％（Ｑ２）のＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞の検出を示す。これらのＱ２細胞をさらに分析し、無関係のペプチド陽性Ｔ細胞、すなわち、ＡＰＣ／ＢＶ４２１二重染色細胞を検出した。央パネル（枠内）は、左側パネルのＱ２で検出されたＢＶ４２１／ＰＥ二重陽性細胞における、４０．２％（単一細胞の頻度＝６．９１Ｅ－４）の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性細胞および無関係のペプチド陰性細胞の検出を示す。右側パネルは、中央パネルの枠内領域を左側パネルに重ねたものを示す。これらの結果は、取得された４．６６×１０^６個のリンパ球（リンパ球の頻度＝１．０５Ｅ－３）における、４９．０個の２Ｄ ＰＥ／ＢＶ４２１ Ｔｅｔ陽性および無関係のペプチドＡＰＣ四量体陰性イベントの検出を示す。

【0266】

図４３は、供試サンプル（左側パネル、０．００１％（４９／４．６６×１０^６））から、最終選別（右側パネル、９７．３％（７３／７５））に至る、２ＤＴｅｔ＋ＡＰＣ－の連続枯渇の一例を示す。１，８７７個の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性イベントが選別され、５３６個の２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥＢＶ４２１）陽性および無関係のペプチド陰性細胞が廃棄物中にあった。

【0267】

図４４は、供試サンプルからの２ＤＴｅｔ＋ＡＰＣ－の連続枯渇後における、２Ｄ Ｔｅｔ（ＰＥ＋ＢＶ４２１）陽性細胞および無関係のペプチド陰性細胞を約９２，０００倍に濃縮（０．００１％から９７．３％への）する選別性能を示す。

【0268】

ＰＢＭＣパネルの染色からのＣＤ８細胞の完全選別をモデル化するために、ＰＢＭＣ（１×１０^９個の細胞）を染色し、分析した。図４５は、ＰＢＭＣ中の５４．７％のリンパ球の（パネルＡ）が収集され、９８．３％の生きている細胞がパネルＢに示されていることを示す。パネルＣは、収集されたリンパ球中の３５．３％のＣＤ３＋細胞を示す。パネルＤは、ＣＤ３＋細胞中の４９．１％のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を示す。

【0269】

【表17】

【0270】

表１７は、１×１０^９個のＰＢＭＣから分離された９．３％のＣＤ８を示す。単離されたＣＤ８＋細胞をさらに選別して、約１，４４０個のＣｏｌ６Ａ３－００２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらし得る。これらの観察に基づいて、１×１０^９個のＣＤ８＋細胞から始めると、その約８５％がＣＤ８＋細胞であると予測される。そうであれば、１×１０^９個のＣＤ８＋細胞中に、約１３，１６１個のＣｏｌ６Ａ３－００２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出されると予測される。したがって、同じ数の細胞から始めて、ＣＤ８＋細胞から始める選別は、ＰＢＭＣで始めるよりもペプチド特異的Ｔ細胞のより高い収量を達成してもよい。

【0271】

要約すると、細胞選別では、ＰＥトリガーはＢＶ４２１トリガーより優れていてもよい。例えば、１×１０^８個の細胞／ｍｌを超えるなどの高濃度の細胞を使用した選別を改善するために、高流量フィルターカートリッジおよび／または純粋なＣＤ８開始集団を使用してもよい。

【0272】

本明細書で言及される全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。あらゆる参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明の性質上、そのような参照を先取りする権利を有していないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【配列表】

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【国際調査報告】