特表 2022-536157 改変された酸化プロトコルを使用してオリゴヌクレオチドを調製するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-12

(54)【発明の名称】改変された酸化プロトコルを使用してオリゴヌクレオチドを調製するための方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/04 20060101AFI20220804BHJP

   C07H 21/02 20060101ALI20220804BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220804BHJP

【ＦＩ】

C07H21/04 A

C07H21/02

C12N15/11 Z ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021573324

(86)(22)【出願日】2020-06-09

(85)【翻訳文提出日】2021-12-10

(86)【国際出願番号】 EP2020065992

(87)【国際公開番号】W WO2020249571

(87)【国際公開日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】19179310.8

(32)【優先日】2019-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】フェティス アレク

(72)【発明者】

【氏名】ガイザー アーヒム

(72)【発明者】

【氏名】ジャイツ レオナード

(72)【発明者】

【氏名】チョウイ ホンリム

(72)【発明者】

【氏名】ジュン キョン ユン

(72)【発明者】

【氏名】キム スン ウォン

【テーマコード（参考）】

4C057

【Ｆターム（参考）】

4C057AA30

4C057MM02

4C057MM04

(57)【要約】

本発明は、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、ヨウ素、有機溶媒および水を混合することによって得られる酸化溶液を用いたスキーム：

に従って、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への選択的酸化を含み、酸化溶液が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間エイジングされていることを特徴とする、方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、
ヨウ素、有機溶媒および水を混合することによって得られる酸化溶液を用いたスキーム：

に従って、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への酸化を含み、
前記酸化溶液が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間エイジングされていることを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記有機溶媒がピリジンまたはＣ_１－６アルキル置換ピリジンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ピリジンまたはＣ_１－６アルキル置換ピリジンの水に対する体積比が１：１～２０：１、好ましくは５：１～１５：１、より好ましくは９：１である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記酸化溶液中の前記ヨウ素の濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭである、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記酸化溶液の前記エイジングが、２０℃～１００℃の温度、好ましくは３０℃～６０℃の温度で行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記酸化溶液が、少なくとも１日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間または少なくとも２０日間エイジングされている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間を決定するためにｐＨおよび導電率をモニターすることを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記酸化反応に使用される酸化剤の量が、１．１当量～１５当量、より好ましくは１．５当量～４．５当量、最も好ましくは２当量～４当量の間で選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記酸化反応のための反応温度が、１５℃～２７℃、より好ましくは１８℃～２４℃の間で選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記オリゴヌクレオチドが、任意選択的に改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオシドモノマーまたはその組合せからなり、１０～４０、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドを製造するための新規な方法であって、スキーム：

にしたがって式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に酸化することを含み、
前記酸化が特定の酸化プロトコルに従う、方法に関する。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチド合成は、原則として、所望の配列が組み立てられるまで、伸長中の鎖の５’末端にヌクレオチド残基を段階的に付加することである。

【0003】

一般的に、各添加は合成サイクルと呼ばれ、原則として以下の化学反応、
ａ_１）固体支持体上の保護されたヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ_２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして前記固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ_３）それぞれのＰ結合ヌクレオシド（ホスファイトトリエステル）を酸化または硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ_４）任意に、固体支持体上の任意の未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ_５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ_６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのＰ結合二量体を形成すること、
ａ_７）前記それぞれのＰ結合ジヌクレオチド（ホスファイトトリエステル）を酸化または硫化して、それぞれのホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ_８）任意に、任意の未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ_９）所望の配列が組み立てられるまで、前述のステップａ_５～ａ_８を繰り返すことからなる。

【0004】

オリゴヌクレオチド合成の原理は、当技術分野で周知である（例えば、無料の百科事典であるＷｉｋｉｐｅｄｉａのＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１６年３月１５日（非特許文献１）を参照のこと）。

【0005】

酸化ステップは、典型的には、ヨウ素、一般的にピリジンおよび水である有機溶媒を含む酸化溶液を用いて行われる。

【0006】

しかし、新たに調製した酸化溶液を適用すると、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への所望の酸化が起こるだけでなく、副反応として、分子中に存在するホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、ヌクレオチド間結合でのＰ＝ＳからＰ＝Ｏへの変換によって影響を受け、式ＩＩの化合物内のホスホジエステル結合の含有量が予想よりも高くなり得ることが観察された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１６年３月１５日

【発明の概要】

【0008】

したがって、本発明の目的は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合に影響を及ぼすことなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への選択的酸化を可能にする酸化プロトコルを見出すことであった。

【0009】

本発明の目的が、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造方法であって、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への酸化を、
ヨウ素、有機溶媒および水を混合することによって得られる酸化溶液を用いるスキーム：

に従って行うことを含む、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間にわたって酸化溶液がエイジングされていることを特徴とする方法によって達成し得ることが見出された。

【0010】

以下の定義は、本発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を説明および定義するために示されている。

【0011】

「Ｃ_１－６－アルキル」という用語は、１～６個の炭素原子、より特定の実施形態では１～４個の炭素原子を有する一価の直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基を示す。典型的な例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔ－ブチル、好ましくはメチルまたはエチルが挙げられる。

【0012】

本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。治療的に価値のあるオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは、典型的には、１０～４０ヌクレオチド、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長として合成される。

【0013】

オリゴヌクレオチドは、任意に改変されていてもよいＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオシドモノマーまたはそれらの組合せからなり得る。

【0014】

本明細書で使用される場合、任意に改変されていてもよいとは、糖部分または核酸塩基部分の１つ以上の改変の導入によって、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して改変されたヌクレオシドを指す。

【0015】

典型的な改変は、糖部分の２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－置換（２’－ＭＯＥ）置換またはロック核酸（ＬＮＡ）であってもよく、これはリボース部分が２’酸素と４’炭素とを結合する過剰な架橋で改変されている改変ＲＮＡヌクレオチドである。

【0016】

改変されたヌクレオシドという用語は、「ヌクレオシド類似体」または改変「ユニット」または改変「モノマー」という用語と交換的に使用されてもよい。

【0017】

ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、一般的に、２つのヌクレオチドを互いに共有結合するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオチド間結合によって連結される。

【0018】

本発明によれば、少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）からなっていなければならない。したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドでは、他の全てのヌクレオチド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）からなっていてもよく、または他のオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド間結合の配列が異なっており、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）とホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）の両方のヌクレオチド間結合を含む。

【0019】

したがって、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドという用語は、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）からならなければならないオリゴヌクレオチドを指す。

【0020】

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、ＬＮＡヌクレオシドについては大文字のＡ、Ｔ、Ｇおよび^ＭｅＣ（５－メチルシトシン）で、ＤＮＡヌクレオシドについては小文字のａ、ｔ、ｇ、ｃおよび^ＭｅＣで記載される。改変された核酸塩基としては、保護基を有する核酸塩基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリルまたはジメチルホルムアミジノ（ＷｉｋｉｐｅｄｉａのＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ、２０１６年３月２４日を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0021】

好ましくは、オリゴヌクレオチドは、任意に改変されていてもよいＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドモノマーまたはそれらの組合せからなり、１０～４０、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長である。

【0022】

オリゴヌクレオチド合成の原理は、当技術分野で周知である（例えば、無料百科事典であるＷｉｋｉｐｅｄｉａのＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１６年３月１５日を参照のこと）。

【0023】

今日、大規模なオリゴヌクレオチド合成は、コンピュータ制御合成装置を使用して自動化された方法で行われている。

【0024】

一般的に、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、ここで、組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヒドロキシ基を介して固体支持体材料に共有結合し、鎖組み立ての全過程にわたってそこに結合したままである。適切な支持体は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｒｉｍｅｒ支持体５ＧまたはＫｉｎｏｖａｔｅのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ支持体のような市販のマクロ多孔質ポリスチレン支持体である。

【0025】

その後の樹脂からの切断は、濃アンモニア水を用いて行うことができる。リン酸塩基およびヌクレオチド塩基上の保護基もこの切断手順内で除去される。

【0026】

上に概説したように、混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドの製造方法は、式Ｉの中間ホスファイトトリエステル化合物、の式ＩＩのホスホジエステル化合物への酸化を、
ヨウ素、有機溶媒、および水を混合することによって得られる酸化溶液を使用するスキーム：

に従って行うことを含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間にわたって酸化溶液がエイジングされていることを特徴とする。

【0027】

混合Ｐ＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ骨格オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0028】

酸化溶液は、典型的には、ヨウ素と有機溶媒と水とを混合して得られる溶液である。

【0029】

有機溶媒は、ピリジン、またはＣ_１－６アルキル置換ピリジン、例えばルチジンから選択することができるが、好ましくはピリジンから選択することができる。テトラヒドロフラン等のさらなる有機溶媒が存在し得る。

【0030】

酸化溶液は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）から酸化剤溶液として市販されている。あるいは、市販のヨウ素およびピリジンを使用して新鮮な溶液を調製することができる。

【0031】

ピリジンまたはＣ_１－６アルキル置換ピリジンの水に対する体積比は、１：１～２０：１、好ましくは５：１～１５：の範囲で変化し得るが、より好ましくは９：１である。

【0032】

酸化溶液中のヨウ素濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭの範囲、より好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭの範囲とすることができる。

【0033】

エイジングの最適期間は、酸化溶液がエイジングされる温度によって大きく決定される。低いエイジング温度はより長いエイジング期間をもたらすが、より高いエイジング温度はエイジング時間を著しく短縮する。

【0034】

酸化溶液のエイジングは、２０℃～１００℃の温度で行うことができるが、好ましくは３０℃～６０℃の温度で行うことができることが見出された。

【0035】

酸化溶液のエイジングに必要な時間は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物の、式ＩＩのホスホジエステル化合物への選択的酸化をもたらすのに十分でなければならない。

【0036】

一般的に、酸化溶液は、少なくとも１日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間または少なくとも２０日間エイジングすることができる。

【0037】

期間は、上述のように、エイジング温度に応じて大きく変化し得、３０℃～３５℃のエイジング温度では、１０日～１５０日、より典型的には２０日～６０日の間で変化し得るが、６０℃～６５℃のエイジング温度では、１日～３０日の間、より典型的には２日～１５日の間で変化し得る。

【0038】

エイジングは、一般的に、導電率（μＳ／ｃｍ）の増加およびｐＨの低下を伴う。本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を酸化することなく、式Ｉのホスファイトトリエステル化合物を式ＩＩのホスホジエステル化合物に選択的に酸化するのに十分な時間を決定するためのパラメータｐＨおよび導電率のモニターすることを含む。

【0039】

酸化反応に使用される酸化剤の量は、１．１当量～１５当量、より好ましくは１．５当量～４．５当量、最も好ましくは２当量～４当量の間で選択することができる。

【0040】

一般的に、酸化反応温度は、１５℃～２７℃、より好ましくは１８℃～２４℃の間で行われる。

【0041】

例示として、オリゴヌクレオチドは、以下から選択することができる。
５’－^Ｍｅ Ｃ _Ｓ ^Ｍｅ Ｕ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ Ａ _Ｏ Ｇ _ＳＴ_ＳＡ_ＳＡ_Ｓ ^ＭｅＣ_ＳＡ_ＳＴ_ＳＴ_ＳＧ_ＳＡ_Ｓ ^ＭｅＣ_Ｓ Ａ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ Ａ _Ｓ ^Ｍｅ Ｃ－３’
下線が引かれた残基は、２’－ＭＯＥヌクレオシドである。ホスホロチオエートおよびホスフェートジエステル結合の位置は、それぞれＳおよびＯによって示される。２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－５－メチルウリジン（２’－ＭＯＥ ＭｅＵ）ヌクレオシドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）リボチミジン（２’－ＭＯＥ Ｔ）と呼ばれることがあることに留意されたい。

【0042】

本明細書に開示される化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。
配列番号１：ｃｕｃａｇｔａａｃａｔｔｇａｃａｃｃａｃ

【実施例】

【0043】

実施例１
５’－^Ｍｅ Ｃ _Ｓ ^Ｍｅ Ｕ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ Ａ _Ｏ Ｇ _ＳＴ_ＳＡ_ＳＡ_Ｓ ^ＭｅＣ_ＳＡ_ＳＴ_ＳＴ_ＳＧ_ＳＡ_Ｓ ^ＭｅＣ_Ｓ Ａ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ ^Ｍｅ Ｃ _Ｏ Ａ _Ｓ ^Ｍｅ Ｃ－３’の合成
オリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００およびＰｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＬＨ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３３０）を使用して、固相上で標準的なホスホラミダイト化学によって２．２０ｍｍｏｌのスケールで製造した。一般的に、１．４当量のＤＮＡ／２’－ＭＯＥ－ホスホラミダイトを使用した。市販の供給源から受け取った他の試薬（ジクロロ酢酸、１－メチルイミダゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、無水酢酸、フェニルアセチルジスルフィド、ピリジン、トリエチルアミン）を使用し、適切な濃度の試薬溶液を調製し（以下の表１を参照）、水酸化アンモニウムを使用して切断および脱保護を達成して、粗製オリゴヌクレオチドを得た。

【0044】

（表１）標準試薬溶液

【0045】

実施例２
酸化剤エイジング実験
実施例２．１
購入した酸化剤溶液を用いる

【0046】

（表２）

^１は、市販の溶液からのアリコートを使用試験のために採取し、溶液の残りの部分の熱処理を開始した時点を指す。これは、溶液の調製時間と同じではない。
^２溶液は、３０～３５℃でエイジングさせず、ｔ＝０から開始して１～１５℃で保存した。
^３は、質量分析で決定された所望の化合物の分子質量に対する１６Ｄａの質量差を有する分子のパーセント比率、すなわち１つのＰ＝Ｓ結合がＰ＝Ｏ結合に変換されている分子のパーセント比率を指す。

【0047】

実施例２．２
新たに調製した酸化剤溶液を使用する、
ａ）ヨウ素溶液の調製
１．００ｋｇの水を８．００ｋｇのピリジンに室温で添加した。１２７ｇのヨウ素を添加した。０．８２７ｋｇのピリジンをすすぎのために添加し、混合物を乾燥窒素の正圧下で１時間撹拌した。
ｂ）ヨウ素溶液のエイジング
・ ３０～３５°Ｃでのエイジング、
・ ８００ｍＬのアリコートを、使用するまで琥珀色のガラス瓶に３０～３５°Ｃで保存した。
・ ６０～６５℃でのエイジング：
この材料を、使用するまで乾燥窒素の正圧下で、ジャケット付きガラス反応器内に６０～６５°Ｃで保持した。

【0048】

（表３）３０℃～３５℃でのエイジング

【0049】

（表４）６０℃～６５℃でのエイジング

^１は、溶液が溶液の調製が完了した時点を指す。
^２は、質量分析で決定された所望の化合物の分子質量に対する１６Ｄａの質量差を有する分子のパーセント比率、すなわち１つのＰ＝Ｓ結合がＰ＝Ｏ結合に変換されている分子のパーセント比率を指す。

【配列表】

2022536157000001.app

【国際調査報告】