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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-15
(54)【発明の名称】フルクトフィリック乳酸産生細菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/02 20060101AFI20220805BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20220805BHJP
C12P 7/54 20060101ALI20220805BHJP
C12P 7/52 20060101ALI20220805BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220805BHJP
A61K 35/742 20150101ALI20220805BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220805BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220805BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220805BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220805BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220805BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220805BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220805BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20220805BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220805BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220805BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20220805BHJP
【ＦＩ】
C12N1/02 ZNA
C12N1/20 A
C12P7/54
C12P7/52
C12Q1/02
A61K35/742
A61P3/04
A61P1/16
A61P29/00
A61P3/10
A61P9/00
A61P3/06
A61P9/12
A61P19/06
A61P31/00
A61P31/04
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021568485
(86)(22)【出願日】2019-05-13
(85)【翻訳文提出日】2021-12-28
(86)【国際出願番号】 US2019031965
(87)【国際公開番号】W WO2020231397
(87)【国際公開日】2020-11-19
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501394435
【氏名又は名称】サミ－サビンサ グループ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(72)【発明者】
【氏名】マジード ムハンメド
(72)【発明者】
【氏名】ナガブシャナム カリヤナム
(72)【発明者】
【氏名】アリ フルカン
(72)【発明者】
【氏名】アルムガム シヴァクマール
(72)【発明者】
【氏名】マジード シャヒーン
(72)【発明者】
【氏名】ビーディ キランクマール
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ06
4B063QR75
4B063QS40
4B063QX10
4B064AD04
4B064AD05
4B064AD06
4B064CA02
4B064CB18
4B064CD09
4B064CD22
4B064CE08
4B064CE10
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AC05
4B065BD36
4B065CA41
4B065CA44
4C087AA01
4C087BC64
4C087CA09
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZA42
4C087ZA70
4C087ZA75
4C087ZB11
4C087ZB32
4C087ZB35
4C087ZC31
4C087ZC33
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、新規フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランス菌株ＦＦ－７（ＭＴＣＣ ２５２３５）および前記細菌の単離および特性評価の方法を開示する。本発明はまた、食品からのフルクトースの利用の増加、および高フルクトース摂取に関連する障害の管理における、フルクトフィリック乳酸産生細菌の生物学的用途／治療的使用も開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
蜂蜜から新規フルクトース利用プロバイオティクス細菌を単離および同定するための方法であって、ｆ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｇ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｈ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｉ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｊ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
蜂蜜が、生蜂蜜、ろ過蜂蜜、アカシア蜂蜜、アルファルファ蜂蜜、アスター蜂蜜、アボカド蜂蜜、バスウッド蜂蜜、ブナノキ蜂蜜、ブルーベリー蜂蜜、ブルーガム蜂蜜、ソバ蜂蜜、クローバー蜂蜜、タンポポ蜂蜜、ユーカリ蜂蜜、ファイアウィード蜂蜜、ヘザー蜂蜜、アイアンバーク蜂蜜、ジャラ蜂蜜、レザーウッド蜂蜜、リンデン蜂蜜、マカデミア蜂蜜、マヌカ蜂蜜、オレンジブロッサム蜂蜜、パインツリー蜂蜜、サワーウッド蜂蜜、セージ蜂蜜、およびチュペロ蜂蜜を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
培養培地が、ＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）、ＧＹＡ（グルコース酵母エキス寒天）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）、胞子形成培地およびミューラーヒントン寒天を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
単離されたプロバイオティック菌株が、生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に対して陽性になり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに対して陰性になる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
フルクトースに富む食品からのフルクトースの利用を増加させるために蜂蜜から単離された、バチルス属のフルクトフィリックプロバイオティクス細菌。
【請求項6】
グラム陽性である、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項7】
フルクトフィリック細菌の増殖についての最適ｐＨおよび温度が、それぞれ７．５および４０℃である、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項8】
胆汁耐性、胃酸抵抗性であり、乳酸を産生する、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項9】
バチルス・コアグランスである、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項10】
バチルス・コアグランス菌株がバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５である、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項11】
フルクトースに富む食品が、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項12】
高フルクトース摂取に関連する障害の治療管理に使用される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項13】
肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、心血管合併症、糖尿病、高脂血症、高血圧、炎症および高尿酸血症を含む群から選択される、請求項１２に記載の高フルクトース摂取に関連する障害。
【請求項14】
前記フルクトフィリックプロバイオティクス細菌が、接種物、凍結乾燥粉末、微粉末、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、エマルジョン、グミ、チュアブルまたは食用食品の形態で存在し、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択されるフルクトースに富む食品と組み合わせて投与される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項15】
病原性微生物を阻害する方法であって、前記微生物をフルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５と接触させるステップを含む、方法。
【請求項16】
病原性微生物が、サルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｎｙ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
短鎖脂肪酸を産生する方法であって、フルクトース、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー種子繊維、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）からなる群から選択される植物繊維と共に、フルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を培養することによる、方法。
【請求項18】
短鎖脂肪酸が、酢酸、酪酸およびプロピオン酸を含む群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、フルクトフィリック（ｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｉｃ）乳酸産生細菌に関する。より具体的には、本発明は、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の単離、特性評価、および生物学的応用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロバイオティクスならびに健康および多くの障害の予防におけるその重要性はすでに報告されている。フルクトフィリック乳酸菌（ＦＬＡＢ）は、増殖基質としてフルクトースを利用する乳酸菌の特別なグループである。グルコースでの生育が悪く、酸素を好むというそのユニークな特性から、それらは「型破りな」乳酸菌（ＬＡＢ）と見なされる。それらの異常な増殖特性は、二機能性アルコール／アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）をコードする不完全な遺伝子によるものである。その結果、ＮＡＤ／ＮＡＤＨのバランスが崩れ、グルコースを代謝するための追加の電子受容体が必要となる。酸素、フルクトース、ピルビン酸が電子受容体として使用される。ＦＬＡＢは、特に、完全なホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）トランスポータが欠如しているため、他のＬＡＢよりも炭水化物代謝の遺伝子が顕著に少ない。ＦＬＡＢは元来、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）として分類され、その後、ＦＬＡＢの系統発生的位置ならびに生化学的および形態学的特徴に基づいてフルクトバシルス属（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）として再分類された（Endo A, Okada S. 2008. Reclassification of the genus Leuconostoc and proposals of Fructobacillus fructosus gen. nov., comb. nov., Fructobacillus durionis comb. nov., Fructobacillus ficulneus comb. nov. and Fructobacillus pseudoficulneus comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 58:2195-2205）。
【0003】
フルクトースの代謝は、肝臓の酵素フルクターゼから始まる。フルクトースの負荷は、腸細胞および肝臓で乳酸塩に変換される。さらに、肝臓の過剰フルクトースは、末梢組織に向けられ、脂肪組織に存在するインスリン依存性グルコーストランスポーター、ＧＬＵＴ４によって取り込まれ、脂肪酸に変換される。ＧＬＵＴ４は、フルクトース誘発性肝脂肪症および脂質異常症の発症に重要な役割を果たすと報告されている。さらに、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、脂質異常症、肝臓および骨格筋における異所性脂質沈着、尿酸代謝、高血圧、ミネラル代謝のような、いくつかのフルクトース誘発性代謝障害が報告されている。（Prasanthi Jegatheesan and Jean-Pascal De Bandt, Fructose and NAFLD: The Multifaceted Aspects of Fructose Metabolism, Nutrients. 2017 Mar; 9(3): 230; Bidwell AJ, Chronic Fructose Ingestion as a Major Health Concern: Is a Sedentary Lifestyle Making It Worse? A Review, Nutrients. 2017 Jun; 9(6): 549）。フルクトースの過剰摂取は、心血管リスクの増加にも関連している。フルクトース摂取の増加は、血中のｐＨを過度に低下させることにより、乳酸アシドーシスを引き起こす可能性もある。
【0004】
プロバイオティクスは、腸のフルクトースの代謝に重要な役割を果たす。経口摂取される低用量のフルクトースは、腸に到達し、さまざまな酵素や固有の微生物叢の存在下で代謝される。しかしながら、高用量のフルクトースの存在下では、フルクトースの負荷が腸から肝臓に溢流する。腸から肝臓へのフルクトースの溢流を減らすために、プロバイオティクスはフルクトースをＳＣＦＡ（短鎖脂肪酸）に変換する重要な役割を果たす。
ＦＬＡＢは、果物や野菜、ヒトの便培養物、天然抗菌剤、チーズ、ケフィア粒、乳製品および非乳製品、発酵乳および生乳、授乳を受けている乳児の便、授乳中の乳、羊、水牛乳および牛乳、ヨーグルト、飲料、家禽供給源、動物ルーメン内容物、ペンギング・ダック（Ｐｅｎｇｇｉｎｇ Ｄｕｃｋ）の盲腸、鶏の腸と糞の試料、鶏の飼料、酵素、発酵米、凝乳、肉エキスおよび酵母エキス、グルコースおよびスクロース、ヒトの消化管、ヒトのコロニー上皮細胞、ヒトおよび動物の膣および口腔抽出物、ヒト乳児のおむつ、パイナップルの廃棄物、工業用ソーセージ、アイスクリーム、子豚の小腸、コーンスラリー、作物および腸のアヒル（ｉｎｔｅｎｓｉｎａｌ ｄｕｃｋｓ）のような、さまざまな供給源から単離されている。異なるＦＬＡＢの単離については、以下の先行技術文献に記載されている。
ＦＬＡＢは、果物や野菜、ヒトの便培養物、天然抗菌剤、チーズ、ケフィア粒、乳製品および非乳製品、発酵乳および生乳、授乳を受けている乳児の便、授乳中の乳、羊、水牛乳および牛乳、ヨーグルト、飲料、家禽供給源、動物ルーメン内容物、ペンギング・ダック（Ｐｅｎｇｇｉｎｇ Ｄｕｃｋ）の盲腸、鶏の腸と糞の試料、鶏の飼料、酵素、発酵米、凝乳、肉エキスおよび酵母エキス、グルコースおよびスクロース、ヒトの消化管、ヒトのコロニー上皮細胞、ヒトおよび動物の膣および口腔抽出物、ヒト乳児のおむつ、パイナップルの廃棄物、工業用ソーセージ、アイスクリーム、子豚の小腸、コーンスラリー、作物および腸のアヒル（ｉｎｔｅｎｓｉｎａｌ ｄｕｃｋｓ）のような、さまざまな供給源から単離されている。異なるＦＬＡＢの単離については、以下の先行技術文献に記載されている。
【0005】
1. Akihito Endo, Fructophilic lactic acid bacteria inhabit fructose-rich niches in nature, Microb Ecol Health Dis. 2012; 23
2. Akihito Endo, Shintaro Maeno, Yasuhiro Tanizawa, Wolfgang Kneifel, Masanori Arita, Leon Dicks, Seppo Salminen, Fructophilic Lactic Acid Bacteria, a Unique Group of Fructose Fermenting Microbes, Minireview, Applied and Environmental Microbiology, October 2018 Volume 84 Issue 19 e01290-18
3. Arshad F, Mehmood R, Hussain S, Khan MA, Khan MS (2018) Lactobacilli as Probiotics and their Isolation from Different Sources. Br J Res 5 (3): 43
2. Akihito Endo, Shintaro Maeno, Yasuhiro Tanizawa, Wolfgang Kneifel, Masanori Arita, Leon Dicks, Seppo Salminen, Fructophilic Lactic Acid Bacteria, a Unique Group of Fructose Fermenting Microbes, Minireview, Applied and Environmental Microbiology, October 2018 Volume 84 Issue 19 e01290-18
3. Arshad F, Mehmood R, Hussain S, Khan MA, Khan MS (2018) Lactobacilli as Probiotics and their Isolation from Different Sources. Br J Res 5 (3): 43
【発明の概要】
【0006】
プロバイオティクスの生物学的効果は菌株特異的であり、全ての菌株および種に一般化できるわけではないことを考えると（Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food、ロンドン、オンタリオ、カナダ、２００２年４月３０日および５月１日、「現況の証拠は、プロバイオティクス効果が菌株特異的であることを示唆している。菌株を特定の健康効果に関連付けるには、ならびに正確なサーベイランスおよび疫学研究を可能とするためにも、菌株の同定が重要である。」を示すセクション３．１を参照されたい）、生物学的機能を改善された優れたフルクトフィリックプロバイオティクス細菌を見つける必要が依然としてある。本発明は、新規フルクトフィリック乳酸菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を開示することにより、上記課題を解決するものである。
【0007】
本発明の主な目的は、新規フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびその単離方法を開示することである。
本発明の別の目的は、フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による短鎖脂肪酸の産生を開示することである。
本発明のさらなる別の目的は、フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の抗菌効果を開示することである。
本発明は、上記の目的を解決し、さらに関連する利点を提供する。
生物学的材料の寄託
本出願において述べられる、受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有する生物学的材料バチルス・コアグランス菌株ＦＦ７の寄託は、２０１９年２月２８日に、ＣＳＩＲ－微生物技術研究所、セクター３９－Ａ、チャンディーガル－１６００３６、インドのＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ）で為された。
本発明の別の目的は、フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による短鎖脂肪酸の産生を開示することである。
本発明のさらなる別の目的は、フルクトフィリック乳酸産生細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の抗菌効果を開示することである。
本発明は、上記の目的を解決し、さらに関連する利点を提供する。
生物学的材料の寄託
本出願において述べられる、受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有する生物学的材料バチルス・コアグランス菌株ＦＦ７の寄託は、２０１９年２月２８日に、ＣＳＩＲ－微生物技術研究所、セクター３９－Ａ、チャンディーガル－１６００３６、インドのＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ）で為された。
【0008】
本発明は、フルクトフィリック乳酸産生細菌を開示する。本発明は、フルクトフィリック乳酸産生細菌の単離、特性評価、および生物学的応用／治療的使用の方法をさらに開示する。
【0009】
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理を説明する以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【0010】
本特許または出願書類には、カラーで行われた少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を有する本特許または特許出願公開公報のコピーは、リクエストおよび必要な料金の支払いに応じて、庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A-1D】バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の位相差顕微鏡画像（倍率１０００倍）（図１Ａ）、胞子を有する細胞のウェットマウント（図１Ｂ）、栄養細胞のグラム染色（図１Ｃ）、胞子形成細胞の胞子染色、および（図１Ｄ）、ＧＹＥ寒天プレート上で増殖したコロニーを示す図である。
【図2】炭素源としてフルクトースとデキストロースの存在下でのバチルス・コアグランスＦＦ７、ＭＴＣＣ ２５２３５、およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖パターンの比較のグラフ図である。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図3】培地およびフルクトースに富む食品（蜂蜜、フルーツジュース）の存在下で２４時間インキュベートした後のバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ＦＦ７、２５２３５によるフルクトースの利用のグラフ図である。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図4】バチルス・コアグランスＦＦ７の相対位置を示す１６Ｓ ｒＲＮＡの配列に基づく系統樹を示す図である。
【図5】Ｂ．コアグランスＦＦ７、ＭＴＣＣ ２５２３５、およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖に対する異なるｐＨの影響を示すグラフ図である。増殖に最適なｐＨは、それぞれｐＨ７．５およびｐＨ６．５であることがわかった。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図6】Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ＦＦ７、２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖に対する異なる温度の影響のグラフ図である。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図7】インビボ条件を模倣したインビトロ実験での胃処理後のＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の生存率に対するＧＩＴ過酷条件の影響を示すグラフ図である。滅菌生理食塩水を未処理の対照として採用した。
【図8】バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のＢＳＨ活性を示す図である。（図８Ａ）牛胆汁（０．３％、ｗ／ｖ）およびＣａＣＯ３（０．３％、ｗ／ｖ）を補充したＭＲＳ軟寒天を用いた測定を行い、胆汁塩を含まないＭＲＳ寒天を陰性対照とした（図８Ｂ）。空洞区域は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のＢＳＨ活性を示唆している。
【図9】胃液緩衝液中のさまざまなｐＨ値（１．５～８．０）でのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ＦＦ７、２５２３５の生存のグラフ図である。値はＬｏｇ１０胞子／ｇで表される。データは実行した２つの異なる実験の平均と標準偏差（±ＳＤ）を表す。
【図10】Ｂ．コアグランスＦＦ７、ＭＴＣＣ ２５２３５、およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖に対する牛胆汁塩のインビトロ効果のグラフ図である。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４のオーバーナイト増殖新鮮培養物を牛胆汁塩（０．１、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、０．９および１％、ｗ／ｖ）有りおよび無し（％、ｗ／ｖ）のＭＲＳブロスに接種した。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図11】研究された６×１０9（調製物１）および１５×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物の存在下での、Ｂ．コアグランスＦＦ７、ＭＴＣＣ ２５２３５によるＬ－乳酸の産生のグラフ図である。値は３つの独立した測定からの平均（±ＳＤ）である。
【図12A-12C】フルクトース、ＦＯＳ、クランベリー種子繊維、フェヌグリーク種子繊維の発酵中の、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５からの酢酸（図１２Ａ）、酪酸（図１２Ｂ）およびプロピオン酸（図１２Ｃ）産生のグラフ図である。試料は、発酵の４、８、１２、１８および２４時間後に収集された。値は、２つの異なる機会に実行された３反復の平均であり、ｍｇ／ｇで表される。
【図13】温度４０±２℃、ＲＨ６０％±５％で保存中のＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の生存のグラフ図である。１５×１０9（調製物１）および６×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物を研究した。胞子生存数の平均はｌｏｇ１０ ｃｆｕ／ｇで表される。各時点は、２反復で実行された３つの異なる実験の平均Ｌｏｇ10標準偏差（±ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
最も好ましい実施形態において、本発明は、蜂蜜から新規フルクトース利用プロバイオティクス細菌を単離および同定するための方法であって、以下のステップ：
ａ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｂ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｄ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｅ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法を開示する。
ａ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｂ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｄ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｅ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法を開示する。
【0013】
関連する態様では、蜂蜜は、生蜂蜜、ろ過蜂蜜、アカシア蜂蜜、アルファルファ蜂蜜、アスター蜂蜜、アボカド蜂蜜、バスウッド蜂蜜、ブナノキ蜂蜜、ブルーベリー蜂蜜、ブルーガム蜂蜜、ソバ蜂蜜、クローバー蜂蜜、タンポポ蜂蜜、ユーカリ蜂蜜、ファイアウィード蜂蜜、ヘザー蜂蜜、アイアンバーク蜂蜜、ジャラ蜂蜜、レザーウッド蜂蜜、リンデン蜂蜜、マカデミア蜂蜜、マヌカ蜂蜜、オレンジブロッサム蜂蜜、パインツリー蜂蜜、サワーウッド蜂蜜、セージ蜂蜜、およびチュペロ蜂蜜を含むがこれらに限定されない群から選択される。別の関連する態様では、培養培地は、ＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）、ＧＹＡ（グルコース酵母エキス寒天）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）、胞子形成培地およびミューラーヒントン寒天を含む群から選択される。
【0014】
別の関連する態様において、単離されたプロバイオティック菌株は、生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に対して陽性になり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに対して陰性になる。
【0015】
別の好ましい実施形態において、本発明は、フルクトースに富む食品からのフルクトースの利用を増加させるために蜂蜜から単離された、バチルス属の新規プロバイオティクス細菌を開示する。別の関連する態様では、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌はグラム陽性である。さらに別の態様では、フルクトフィリック細菌の増殖について記録された最適ｐＨおよび温度は、それぞれ７．５および４０℃である。別の態様では、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌は、胆汁耐性、胃酸抵抗性であり、乳酸を産生する。関連する態様では、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌は、バチルス・コアグランスである。さらに別の関連する実施形態において、バチルス・コアグランス菌株は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５である。関連する態様において、フルクトースに富む食品は、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択される。関連する態様では、高フルクトース摂取に関連する障害の治療管理に、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌が使用される。関連する態様では、高フルクトース摂取に関連する疾患は、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、心血管合併症、糖尿病、高脂血症、高血圧、炎症および高尿酸血症を含むがそれらに限定されない群から選択される。別の関連する態様では、フルクトフィリックプロバイオティクス細菌は、接種物、凍結乾燥粉末、微粉末、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、エマルジョン、グミ、チュアブルまたは食用食品の形態で存在し、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択されるフルクトースに富む食品と組み合わせて投与される。
【0016】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、病原性微生物を阻害する方法であって、前記微生物をフルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５と接触させるステップを含む、方法を開示する。関連する態様では、病原性微生物は、サルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｎｙ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む群から選択される。
【0017】
別の好ましい実施形態では、本発明は、短鎖脂肪酸を産生する方法であって、フルクトース、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー種子繊維、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）からなる群から選択される植物繊維と共に、フルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を培養することによる、方法を開示する。
【0018】
本明細書の以下に含まれる特定の実施例は、本発明の前述の最も好ましい実施形態を示している。
【実施例】
【0019】
実施例１：フルクトフィリック細菌の単離および同定
方法
本研究においては、胞子を形成するフルクトフィリック乳酸菌を単離するために、ろ過されていない生の蜂蜜を使用した。本研究においては、フルクトフィリック細菌の単離のために、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ）（デキストロースをフルクトースに置き換えたもの）を使用した（表１）。
方法
本研究においては、胞子を形成するフルクトフィリック乳酸菌を単離するために、ろ過されていない生の蜂蜜を使用した。本研究においては、フルクトフィリック細菌の単離のために、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ）（デキストロースをフルクトースに置き換えたもの）を使用した（表１）。
【0020】
【表1】
１ｇｍの未ろ過の生蜂蜜を１０ｍｌの生理食塩水を含む試験管に入れた。これをよく混合して、胞子の選択的単離のため、７０℃で３０分間熱ショックを与えた。細菌の単離は、上記の試料１ｍｌを各希釈液からフルクトースを含むＭＲＳ寒天プレートへ加えることによって行った。プレートをさらに３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細菌単離株のさらなる試験と精製のために、形態学的に異なるコロニーをピックアップした。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を単離し、フルクトースを炭素源として含む他のＭＲＳ寒天培地プレートにストリークした。
【0021】
フルクトフィリック細菌の生化学的特性評価
細菌単離株は、ＭＲＳＡ（ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）に３７℃で２４時間増殖させた。細菌接種物は、１～３個の十分に単離されたコロニーを採取することにより調製し、滅菌生理食塩水中の均一な懸濁液を調製した。懸濁液の濃度は６２０ｎｍで≧０．５ＯＤであった。この接種物（５０μｌ）を使用し、キット製造業者（ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インド）の取扱説明書に従って試験を実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生化学的特性評価は、記載されている方法で実行した（Majeed, M., Nagabhushanam, K., Natarajan, S., Sivakumar, A., Eshuis-de Ruiter, T., Booij-Veurink, J., Janine Booij-Veurink, Ynte P. de Vries, Ali, F. (2016); Evaluation of genetic and phenotypic consistency of Bacillus coagulans MTCC 5856: A commercial probiotic strain. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 32,60）。ＨｉＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ（商標）キット（コード－ＫＢ００９）はＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インドから調達し、試験は、製造業者の取扱説明書に従って実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の細菌懸濁液は、上記のセクションで述べたように調製した。さらに、Ｂ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８０のＩＭＶｉＣ（インドール、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、クエン酸塩利用）試験、オキシダーゼおよびグラム染色は、Ｍａｊｅｅｄら、（２０１６）；（Cappucino G and Natalie Sherman. Microbiology: A Laboratory manual 5th edition. 1998）の方法に従って実行した。
細菌単離株は、ＭＲＳＡ（ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）に３７℃で２４時間増殖させた。細菌接種物は、１～３個の十分に単離されたコロニーを採取することにより調製し、滅菌生理食塩水中の均一な懸濁液を調製した。懸濁液の濃度は６２０ｎｍで≧０．５ＯＤであった。この接種物（５０μｌ）を使用し、キット製造業者（ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インド）の取扱説明書に従って試験を実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生化学的特性評価は、記載されている方法で実行した（Majeed, M., Nagabhushanam, K., Natarajan, S., Sivakumar, A., Eshuis-de Ruiter, T., Booij-Veurink, J., Janine Booij-Veurink, Ynte P. de Vries, Ali, F. (2016); Evaluation of genetic and phenotypic consistency of Bacillus coagulans MTCC 5856: A commercial probiotic strain. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 32,60）。ＨｉＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ（商標）キット（コード－ＫＢ００９）はＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ、インドから調達し、試験は、製造業者の取扱説明書に従って実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の細菌懸濁液は、上記のセクションで述べたように調製した。さらに、Ｂ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８０のＩＭＶｉＣ（インドール、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、クエン酸塩利用）試験、オキシダーゼおよびグラム染色は、Ｍａｊｅｅｄら、（２０１６）；（Cappucino G and Natalie Sherman. Microbiology: A Laboratory manual 5th edition. 1998）の方法に従って実行した。
【0022】
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定
Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ５８５６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定用のゲノムＤＮＡは、（William J. Bruno, Nicholas D. Socci, and Aaron L. Halpern (2000). Weighted Neighbor Joining: A Likelihood-Based Approach to Distance-Based Phylogeny Reconstruction, Mol. Biol. Evol. 17 (1): 189-197）によって以前に記載されたように調製した。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の断片は、以前記載されたようにＡＢＩ ３５００遺伝子アナライザ自動ＤＮＡシーケンサを使用して配列決定した（Ｈｅｙｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｗｉｎｇｓ ２００１）。使用した配列決定プライマーは、５－ＡＧＨＧＴＢＴＧＨＴＣＭＴＧＮＣＴＣＡＳ－３（フォワードプライマー）および５－ＴＲＣＧＧＹＴＭＣＣＴＴＧＴＷＨＣＧＡＣＴＨ－３（リバースプライマー）であった。およそ１．５ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを使用することにより精製した。精製された断片は、ＤＮＡ配列決定に直接使用した。この配列は、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で使用した。
Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ５８５６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定用のゲノムＤＮＡは、（William J. Bruno, Nicholas D. Socci, and Aaron L. Halpern (2000). Weighted Neighbor Joining: A Likelihood-Based Approach to Distance-Based Phylogeny Reconstruction, Mol. Biol. Evol. 17 (1): 189-197）によって以前に記載されたように調製した。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の断片は、以前記載されたようにＡＢＩ ３５００遺伝子アナライザ自動ＤＮＡシーケンサを使用して配列決定した（Ｈｅｙｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｗｉｎｇｓ ２００１）。使用した配列決定プライマーは、５－ＡＧＨＧＴＢＴＧＨＴＣＭＴＧＮＣＴＣＡＳ－３（フォワードプライマー）および５－ＴＲＣＧＧＹＴＭＣＣＴＴＧＴＷＨＣＧＡＣＴＨ－３（リバースプライマー）であった。およそ１．５ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを使用することにより精製した。精製された断片は、ＤＮＡ配列決定に直接使用した。この配列は、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で使用した。
【0023】
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖条件
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖条件の最適化を、異なる温度とｐＨについて分析した。ＭＲＳＢ培地を調製し、２Ｎ ＨＣｌと２Ｎ ＮａＯＨでｐＨを４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０に調整した。オーバーナイト増殖培養液（１％、ｖ／ｖ）をｐＨ調整培地に接種し、振とうインキュベータ内で１２０ｒｐｍ、２４時間インキュベートした。増殖は、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより、６時間間隔でモニタした。ＭＲＳＢ培地は、ｐＨを６．５に調整して調製し、オーバーナイト増殖培養物（１％、ｖ／ｖ）を用いて接種した。さらに、フラスコは、振とうインキュベータ内で１２０ｒｐｍ、２４時間、異なる温度（２０、３０、３７、４０、５０および６０℃）でインキュベートした。増殖は、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより、６時間間隔でモニタした。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖条件の最適化を、異なる温度とｐＨについて分析した。ＭＲＳＢ培地を調製し、２Ｎ ＨＣｌと２Ｎ ＮａＯＨでｐＨを４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０に調整した。オーバーナイト増殖培養液（１％、ｖ／ｖ）をｐＨ調整培地に接種し、振とうインキュベータ内で１２０ｒｐｍ、２４時間インキュベートした。増殖は、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより、６時間間隔でモニタした。ＭＲＳＢ培地は、ｐＨを６．５に調整して調製し、オーバーナイト増殖培養物（１％、ｖ／ｖ）を用いて接種した。さらに、フラスコは、振とうインキュベータ内で１２０ｒｐｍ、２４時間、異なる温度（２０、３０、３７、４０、５０および６０℃）でインキュベートした。増殖は、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより、６時間間隔でモニタした。
【0024】
結果
フルクトフィリック細菌の同定
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の胞子は楕円形の端在性胞子であり（図１Ａ）、栄養細胞はグラム染色で示されるようにグラム陽性の棒状であった（図１Ｂ）。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のコロニーを培地上で増殖させ、栄養棒状細胞を含む均一で直径１～３ｍｍ、白色からクリーム色の滑らかなコロニーを得た（図１ＣおよびＤ）。単離された細菌の増殖は、デキストロースに富む培地よりもフルクトースに富む培地で良好であったが（図２）、これは、他のバチルス・コアグランス菌株と比較した場合、そのフルクトフィリックな性質およびフルクトース利用の可能性を示している。この細菌の増殖は、フルクトースに富む食品でも試験され、フルクトース含有量の減少を示した（図３）が、これは、この細菌が、増殖と成長のためにフルクトースを炭素源として利用していることを暗示している。このように、この細菌は、食品中の過剰なフルクトースをその代謝のために利用することにより、高フルクトース摂取に関連する障害の管理および予防に使用することができる。この細菌は、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含むフルクトースに富む食品と組み合わせて投与することができる（Ｂｒａｖｅｒｍａｎ Ｊ、Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｆｏｏｄｓ ｈｉｇｈ ｉｎ ｆｒｕｃｔｏｓｅ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｖｅｓｔｒｏｎｇ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／３０４５４－ｌｉｓｔ－ｆｏｏｄｓ－ｈｉｇｈ －ｆｒｕｃｔｏｓｅ／、２０１９年５月３日閲覧）
フルクトフィリック細菌の同定
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の胞子は楕円形の端在性胞子であり（図１Ａ）、栄養細胞はグラム染色で示されるようにグラム陽性の棒状であった（図１Ｂ）。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のコロニーを培地上で増殖させ、栄養棒状細胞を含む均一で直径１～３ｍｍ、白色からクリーム色の滑らかなコロニーを得た（図１ＣおよびＤ）。単離された細菌の増殖は、デキストロースに富む培地よりもフルクトースに富む培地で良好であったが（図２）、これは、他のバチルス・コアグランス菌株と比較した場合、そのフルクトフィリックな性質およびフルクトース利用の可能性を示している。この細菌の増殖は、フルクトースに富む食品でも試験され、フルクトース含有量の減少を示した（図３）が、これは、この細菌が、増殖と成長のためにフルクトースを炭素源として利用していることを暗示している。このように、この細菌は、食品中の過剰なフルクトースをその代謝のために利用することにより、高フルクトース摂取に関連する障害の管理および予防に使用することができる。この細菌は、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含むフルクトースに富む食品と組み合わせて投与することができる（Ｂｒａｖｅｒｍａｎ Ｊ、Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｆｏｏｄｓ ｈｉｇｈ ｉｎ ｆｒｕｃｔｏｓｅ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｖｅｓｔｒｏｎｇ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／３０４５４－ｌｉｓｔ－ｆｏｏｄｓ－ｈｉｇｈ －ｆｒｕｃｔｏｓｅ／、２０１９年５月３日閲覧）
【0025】
生化学的特性評価
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生化学的特性評価は、記載される方法によって実行した（Majeed, M., Nagabhushanam, K., Natarajan, S., Sivakumar, A., Eshuis-de Ruiter, T., Booij-Veurink, J., Janine Booij-Veurink, Ynte P. de Vries, Ali, F. (2016); Evaluation of genetic and phenotypic consistency of Bacillus coagulans MTCC 5856: A commercial probiotic strain. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 32,60）。結果を市販のＢ．コアグランスＡＴＴＣＣ ３１２８菌株と比較し、表２に示した。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生化学的特性評価は、記載される方法によって実行した（Majeed, M., Nagabhushanam, K., Natarajan, S., Sivakumar, A., Eshuis-de Ruiter, T., Booij-Veurink, J., Janine Booij-Veurink, Ynte P. de Vries, Ali, F. (2016); Evaluation of genetic and phenotypic consistency of Bacillus coagulans MTCC 5856: A commercial probiotic strain. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 32,60）。結果を市販のＢ．コアグランスＡＴＴＣＣ ３１２８菌株と比較し、表２に示した。
【0026】
【表2】
【0027】
結果は、単離されたプロバイオティック菌株が生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、メロビオース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に陽性であり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに陰性であることを示した。
【0028】
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定
細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを配列決定して配列情報（配列番号）を以下のように得た：
細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを配列決定して配列情報（配列番号）を以下のように得た：
【0029】
遺伝子座 ｓｅｑ＿ＦＦ７ １４３７ ｂｐ
開始点
1 ACTTGCAAGT CGTGCGGCCC TTTTTTAAAA GCTTGCTTTT TAAAAGGTTA GCGGCGGACG
61 GGTGAGTAAC ACGTGGGCAC CCTGCCTGTA AGATCGGGAT AACGCCGGGA AACCGGGGCT
121 AATACCGGAT AGTTTTTTCC TCCGCATGGA GGAAAAAGGA AAGACGGCTT CTGCTGTCAC
181 TTACAGATGG GCCCGCGGCG CATTAGCTAG TTGGTGGGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG
241 ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACATTGGGA CTGAGACACG GCCCAAACTC
301 CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC
361 GCGTGAGTGA AGAAGGCCTT CGGGTCGTAA AACTCTGTTG CCGGGGAAGA ACAAGTGCCG
421 TTCGAACAGG GCGGCGCCTT GACGGTACCC GGCCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA
481 GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGCGCGC
541 GCAGGCGGCT TCTTAAGTCT GATGTGAAAT CTTTGCGGGC TCACCCGCAA GCGGTCATTG
601 GAAACTGGGA GGGCTTTGAG TGCAAGAAAG AGGAGAGTGG AATTTCCACG TGTAGCGGTG
661 AAATGCGTAA AGATGTGGAG GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTCTCTGGT CTGTAACTGA
721 CGCTGAGGCG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT
781 AAACGATGAG TGCTAAGTGT TAGAGGGTTT CCGCCCTTTA GTGCTGCAGC TAACGCATTA
841 AGCACTCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC
901 GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT ACCAGGTCTT
961 GACATCCTCT GACCTCCCTG GAGACAGGGC CTTCCCCTTC GGGGGACAGA GTGACAGGTG
1021 GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA
1081 ACCCTTGACC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTA AGGTGACTGC CGGTGACAAA
1141 CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG
1201 TGCTACAATG GATGGTACAA AGGGCTGCGA GACCGCGAGG TTAAGCCAAT CCCAGAAAAC
1261 CATTCCCAGT TCGGATTGCA GGCTGCAACC CGCCTGCATG AAGCCGGAAT CGCTAGTAAT
1321 CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC
1381 CACGAGAGTT TGTAACACCC GAAGTCGGTG AGGTAACCTT ACGGAGCCAG CCGCCGA
//
上記の配列を用いてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；基本的局所アラインメント検索ツール）検索を実行し、最初の１０個のアラインメント配列の結果を表３に示す。
開始点
1 ACTTGCAAGT CGTGCGGCCC TTTTTTAAAA GCTTGCTTTT TAAAAGGTTA GCGGCGGACG
61 GGTGAGTAAC ACGTGGGCAC CCTGCCTGTA AGATCGGGAT AACGCCGGGA AACCGGGGCT
121 AATACCGGAT AGTTTTTTCC TCCGCATGGA GGAAAAAGGA AAGACGGCTT CTGCTGTCAC
181 TTACAGATGG GCCCGCGGCG CATTAGCTAG TTGGTGGGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG
241 ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACATTGGGA CTGAGACACG GCCCAAACTC
301 CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC
361 GCGTGAGTGA AGAAGGCCTT CGGGTCGTAA AACTCTGTTG CCGGGGAAGA ACAAGTGCCG
421 TTCGAACAGG GCGGCGCCTT GACGGTACCC GGCCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA
481 GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGCGCGC
541 GCAGGCGGCT TCTTAAGTCT GATGTGAAAT CTTTGCGGGC TCACCCGCAA GCGGTCATTG
601 GAAACTGGGA GGGCTTTGAG TGCAAGAAAG AGGAGAGTGG AATTTCCACG TGTAGCGGTG
661 AAATGCGTAA AGATGTGGAG GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTCTCTGGT CTGTAACTGA
721 CGCTGAGGCG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT
781 AAACGATGAG TGCTAAGTGT TAGAGGGTTT CCGCCCTTTA GTGCTGCAGC TAACGCATTA
841 AGCACTCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC
901 GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT ACCAGGTCTT
961 GACATCCTCT GACCTCCCTG GAGACAGGGC CTTCCCCTTC GGGGGACAGA GTGACAGGTG
1021 GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA
1081 ACCCTTGACC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTA AGGTGACTGC CGGTGACAAA
1141 CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG
1201 TGCTACAATG GATGGTACAA AGGGCTGCGA GACCGCGAGG TTAAGCCAAT CCCAGAAAAC
1261 CATTCCCAGT TCGGATTGCA GGCTGCAACC CGCCTGCATG AAGCCGGAAT CGCTAGTAAT
1321 CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC
1381 CACGAGAGTT TGTAACACCC GAAGTCGGTG AGGTAACCTT ACGGAGCCAG CCGCCGA
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上記の配列を用いてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；基本的局所アラインメント検索ツール）検索を実行し、最初の１０個のアラインメント配列の結果を表３に示す。
【0030】
【表3】
この結果は、単離された生物がバチルス・コアグランス菌株５５－ＬＲ４と９８．９６％の同一性を有するバチルス・コアグランスの新しい菌株であることを示した。系統発生分析の結果も、生物がバチルス・コアグランスの新しい菌株であることを示した（図４）。
【0031】
【0032】
実施例２：インビトロでのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のプロバイオティクス評価
胃酸への抵抗性
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の生存については、１ｍｌの懸濁液を０．０１％リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．３％ペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１００ｍｌの滅菌電解質溶液（６．２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．２２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、および１．２ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３）に添加して、５分間インキュベートすることによって研究した。さらに、ｐＨを１．５、３、４、５、６、７および８に調整した（１Ｎ ＮａＯＨおよび１Ｎ ＨＣｌを使用して調整した）。インキュベーション温度は、３７℃で４時間モニタした。０、１．０、２．０、３．０および４．０時間の異なる時間間隔で、１ｍｌの試料を採取した。インキュベーション後、滅菌生理食塩水（０．８９％ｗ／ｖ）中に連続希釈し、生菌数は、グルコース酵母エキス寒天（ＨｉＭｅｄｉａ）にプレーティングすることによって計数された。実験は、２つの異なる機会に３反復で実行した。
胃酸への抵抗性
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の生存については、１ｍｌの懸濁液を０．０１％リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．３％ペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１００ｍｌの滅菌電解質溶液（６．２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．２２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、および１．２ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３）に添加して、５分間インキュベートすることによって研究した。さらに、ｐＨを１．５、３、４、５、６、７および８に調整した（１Ｎ ＮａＯＨおよび１Ｎ ＨＣｌを使用して調整した）。インキュベーション温度は、３７℃で４時間モニタした。０、１．０、２．０、３．０および４．０時間の異なる時間間隔で、１ｍｌの試料を採取した。インキュベーション後、滅菌生理食塩水（０．８９％ｗ／ｖ）中に連続希釈し、生菌数は、グルコース酵母エキス寒天（ＨｉＭｅｄｉａ）にプレーティングすることによって計数された。実験は、２つの異なる機会に３反復で実行した。
【0033】
胆汁塩耐性
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５細胞の胆汁耐性は、既報の方法（Gilliland et al. 1984; Hyronimus et al. 2000）によって決定された。ＭＲＳブロス（ＨｉＭｅｄｉａ）におよそ１０6ｃｆｕ ｍＬ-1のバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５オーバーナイト増殖培養液を接種し、その後、（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５および２．０％、ｗ／ｖ）胆汁塩を補充し、胆汁塩を補充しないものを実験の対照とした。試料を１２０ｒｐｍでの振とうと共に２４時間、３７℃でインキュベートした。対照（胆汁無し）および異なる濃度の胆汁での試験培養物の増殖を、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより毎時間モニタした。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５細胞の胆汁耐性は、既報の方法（Gilliland et al. 1984; Hyronimus et al. 2000）によって決定された。ＭＲＳブロス（ＨｉＭｅｄｉａ）におよそ１０6ｃｆｕ ｍＬ-1のバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５オーバーナイト増殖培養液を接種し、その後、（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５および２．０％、ｗ／ｖ）胆汁塩を補充し、胆汁塩を補充しないものを実験の対照とした。試料を１２０ｒｐｍでの振とうと共に２４時間、３７℃でインキュベートした。対照（胆汁無し）および異なる濃度の胆汁での試験培養物の増殖を、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、京都、日本）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定することにより毎時間モニタした。
【0034】
乳酸の産生
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による乳酸産生は、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを使用して推定した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のオーバーナイト増殖培養物の１白金耳量をグルコース酵母エキスブロス（ＨｉＭｅｄｉａ）に加え、３７℃で１８時間、１２０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ブロスを０．２２μ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、インド）に通してろ過し、取扱説明書に従ってＭｅｇａｚｙｍｅキット（Ｋ－ＤＬＡＴＥ １０／０４）を使用して乳酸含有量を分析した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ、ＩＤＡ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド）。アッセイではＧＹＥ培地をブランクとして使用した。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による乳酸産生は、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを使用して推定した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５のオーバーナイト増殖培養物の１白金耳量をグルコース酵母エキスブロス（ＨｉＭｅｄｉａ）に加え、３７℃で１８時間、１２０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ブロスを０．２２μ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、インド）に通してろ過し、取扱説明書に従ってＭｅｇａｚｙｍｅキット（Ｋ－ＤＬＡＴＥ １０／０４）を使用して乳酸含有量を分析した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ、ＩＤＡ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド）。アッセイではＧＹＥ培地をブランクとして使用した。
【0035】
人工胃液耐性
口腔消化条件を示すために、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の生存を研究した。１ｍＬのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５懸濁液を、ｐＨ６．８±０．２に調整された、ＫＣｌ（０．８９４６ｇ／ｌ）、ＣＯ（ＮＨ2）2（０．１９８１ｇ／Ｌ）、Ｎａ2ＳＯ4（０．５６８１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（１．６８０ｇ／Ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（０．８８７８ｇ／Ｌ）からなる人工唾液内容物に供し、３７℃で５分間インキュベートした。さらに、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムおよび３ｇ／Ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を加えることにより人工胃液を調製し、その後、２Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを無菌状態で３．０±０．２に調整した。試料を３７℃で３時間、低ｒ．ｐ．ｍ．でさらにインキュベートした。３時間のインキュベーション後、２Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨを無菌的に７．０に調整した。牛胆汁（５ｇ／Ｌ）を３７℃で２４時間、さらにインキュベートした。人工消化プロセスの最終ステップの後、試料を収集し、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の胞子生存について評価した。グルコース酵母エキス寒天培地（ＨｉＭｅｄｉａ）を使用した連続希釈法により計数を行った（図７）。
口腔消化条件を示すために、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の生存を研究した。１ｍＬのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５懸濁液を、ｐＨ６．８±０．２に調整された、ＫＣｌ（０．８９４６ｇ／ｌ）、ＣＯ（ＮＨ2）2（０．１９８１ｇ／Ｌ）、Ｎａ2ＳＯ4（０．５６８１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（１．６８０ｇ／Ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（０．８８７８ｇ／Ｌ）からなる人工唾液内容物に供し、３７℃で５分間インキュベートした。さらに、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムおよび３ｇ／Ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を加えることにより人工胃液を調製し、その後、２Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを無菌状態で３．０±０．２に調整した。試料を３７℃で３時間、低ｒ．ｐ．ｍ．でさらにインキュベートした。３時間のインキュベーション後、２Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨを無菌的に７．０に調整した。牛胆汁（５ｇ／Ｌ）を３７℃で２４時間、さらにインキュベートした。人工消化プロセスの最終ステップの後、試料を収集し、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の胞子生存について評価した。グルコース酵母エキス寒天培地（ＨｉＭｅｄｉａ）を使用した連続希釈法により計数を行った（図７）。
【0036】
抗生物質抵抗性パターン
ＭＩＣは、臨床研究基準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＣＬＳＩ ２０１２）のガイドラインに従って決定された。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５懸濁液は、１８時間増殖細菌培養物を滅菌標準生理食塩水（０．８９％ＮａＣｌ ｗｔ／ｖｏｌ；Ｈｉｍｅｄｉａ、ムンバイ インド）に懸濁して調製した。細菌懸濁液の濁度を０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液（１．５×１０8コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌに相当）に調整した。抗生物質ストック溶液はＣＬＳＩガイドラインに従って調製し、２倍連続希釈液を、９６ウェルＵ底マイクロタイタプレート（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ、ＮＪ ＵＳＡ）内に１００μｌの容量で、ブロス培地（グルコース酵母エキスアセテートブロス［バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＧＹＥＡ、ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ インド、スタフィロコッカス・アウレウスについてはＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ［ＭＨＢ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ ＵＳＡ］）中に調製した。上に述べた細菌懸濁液をＭＨＢ中にさらに希釈し、この希釈した接種物の１００μｌ容量をプレートの各ウェルに加えて、ウェル内に５×１０5ＣＦＵ／ｍｌの最終接種物とし、抗生物質の最終濃度は０．００７８～４μｇ／ｍｌの範囲であった。本研究では、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８を参照培養物として使用した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、濁りの有無について目視した。濁りを示さない化合物濃度の最小濃度をＭＩＣと記録した。
ＭＩＣは、臨床研究基準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＣＬＳＩ ２０１２）のガイドラインに従って決定された。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５懸濁液は、１８時間増殖細菌培養物を滅菌標準生理食塩水（０．８９％ＮａＣｌ ｗｔ／ｖｏｌ；Ｈｉｍｅｄｉａ、ムンバイ インド）に懸濁して調製した。細菌懸濁液の濁度を０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液（１．５×１０8コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌに相当）に調整した。抗生物質ストック溶液はＣＬＳＩガイドラインに従って調製し、２倍連続希釈液を、９６ウェルＵ底マイクロタイタプレート（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ、ＮＪ ＵＳＡ）内に１００μｌの容量で、ブロス培地（グルコース酵母エキスアセテートブロス［バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＧＹＥＡ、ＨｉＭｅｄｉａ、ムンバイ インド、スタフィロコッカス・アウレウスについてはＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ［ＭＨＢ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ ＵＳＡ］）中に調製した。上に述べた細菌懸濁液をＭＨＢ中にさらに希釈し、この希釈した接種物の１００μｌ容量をプレートの各ウェルに加えて、ウェル内に５×１０5ＣＦＵ／ｍｌの最終接種物とし、抗生物質の最終濃度は０．００７８～４μｇ／ｍｌの範囲であった。本研究では、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８を参照培養物として使用した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、濁りの有無について目視した。濁りを示さない化合物濃度の最小濃度をＭＩＣと記録した。
【0037】
ＡＭＥＳ試験
実験のデータは、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子が、Ｓ９代謝活性化系の有無にかかわらず、陰性対照と比較して、５つのサルモネラ菌株（ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７）の復帰変異体の数を増加させなかったことを示唆した。さらに、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子（最大５０００μｇ／プレート）によって用量依存的な変異原性効果は生じなかった。Ｂ．コアグランスＭＴＣ ２５２３５胞子は、実験条件下で変異原性活性を示さなかった。
実験のデータは、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子が、Ｓ９代謝活性化系の有無にかかわらず、陰性対照と比較して、５つのサルモネラ菌株（ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７）の復帰変異体の数を増加させなかったことを示唆した。さらに、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子（最大５０００μｇ／プレート）によって用量依存的な変異原性効果は生じなかった。Ｂ．コアグランスＭＴＣ ２５２３５胞子は、実験条件下で変異原性活性を示さなかった。
【0038】
ＢＳＨ活性
牛胆汁および炭酸カルシウムを含む寒天プレート上でバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖を観察したが、これは牛胆汁に対する耐性とＢＳＨ活性の存在を示している。（図８Ａおよび８Ｂ）に示すように、軟寒天プレートには１９±２ｍｍの透明区域があったが、これはＢＳＨ活性の存在を示した。
牛胆汁および炭酸カルシウムを含む寒天プレート上でバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖を観察したが、これは牛胆汁に対する耐性とＢＳＨ活性の存在を示している。（図８Ａおよび８Ｂ）に示すように、軟寒天プレートには１９±２ｍｍの透明区域があったが、これはＢＳＨ活性の存在を示した。
【0039】
ヒト病原体に対する抗菌活性
抗菌活性は、わずかな修正を加えた、以前に記載されたウェル拡散アッセイによって実行した（Cintas LM, Rodriguez JM, Fernandez MF, Sletten K, Nes IF, Hernandez PE, Holo H (1995) Isolation and characterization of pediocin L50, a new bacteriocin from Pediococcus acidilactici with a broad inhibitory spectrum. Appl Environ Microbiol 61:2643-2648）。簡単に説明すると、１０6ｃｆｕ ｍＬ-1の指示菌株（Ｓ．エピダーミディス ＡＴＣＣ １４９９０、Ｓ．ミュータンス ＭＴＣＣ １９４３、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ２９２１３、Ｂ．セレウス ＡＴＣＣ １４５７９、Ｐ．アクネス ＡＴＣＣ １１８２７、大腸菌 ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｐ．エルギノーサ ＡＴＣＣ ９０２７、Ｍ．ルテウス ＮＣＩＭ ２１６およびＳ．アボニー ＮＣＩＭ ２２５７）を含む、５ｍＬ菌叢の軟（０．７％寒天）グルコース酵母エキス（ＨｉＭｅｄｉａ、インド）を、強化した硬（１．５％寒天）トリプシン大豆寒天（ＨｉＭｅｄｉａ、インド）の頂上に注いだ。１白金耳量のオーバーナイト増殖培養液Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５３２５をＭＲＳ培地に加え、１２０ｒｐｍで２４時間、３７℃でインキュベートした。２４時間後、培養液を遠心分離（１０，０００×９ｇ）して細胞を除去し、上清を回収し、凍結乾燥により１０倍に濃縮し、０．２２μフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、インド）に通してろ過滅菌した。濃縮した上清（５０μＬ）を、固化２層寒天に穴を開けた６ｍｍウェルに加えた。冷蔵庫（４±２℃）で５時間プレートを保存し、試料を寒天中に拡散させた後、３７℃で１８～２０時間インキュベートした。インキュベーション後、阻害区域を測定し、ｍｍ単位で記録した。
抗菌活性は、わずかな修正を加えた、以前に記載されたウェル拡散アッセイによって実行した（Cintas LM, Rodriguez JM, Fernandez MF, Sletten K, Nes IF, Hernandez PE, Holo H (1995) Isolation and characterization of pediocin L50, a new bacteriocin from Pediococcus acidilactici with a broad inhibitory spectrum. Appl Environ Microbiol 61:2643-2648）。簡単に説明すると、１０6ｃｆｕ ｍＬ-1の指示菌株（Ｓ．エピダーミディス ＡＴＣＣ １４９９０、Ｓ．ミュータンス ＭＴＣＣ １９４３、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ２９２１３、Ｂ．セレウス ＡＴＣＣ １４５７９、Ｐ．アクネス ＡＴＣＣ １１８２７、大腸菌 ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｐ．エルギノーサ ＡＴＣＣ ９０２７、Ｍ．ルテウス ＮＣＩＭ ２１６およびＳ．アボニー ＮＣＩＭ ２２５７）を含む、５ｍＬ菌叢の軟（０．７％寒天）グルコース酵母エキス（ＨｉＭｅｄｉａ、インド）を、強化した硬（１．５％寒天）トリプシン大豆寒天（ＨｉＭｅｄｉａ、インド）の頂上に注いだ。１白金耳量のオーバーナイト増殖培養液Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５３２５をＭＲＳ培地に加え、１２０ｒｐｍで２４時間、３７℃でインキュベートした。２４時間後、培養液を遠心分離（１０，０００×９ｇ）して細胞を除去し、上清を回収し、凍結乾燥により１０倍に濃縮し、０．２２μフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、インド）に通してろ過滅菌した。濃縮した上清（５０μＬ）を、固化２層寒天に穴を開けた６ｍｍウェルに加えた。冷蔵庫（４±２℃）で５時間プレートを保存し、試料を寒天中に拡散させた後、３７℃で１８～２０時間インキュベートした。インキュベーション後、阻害区域を測定し、ｍｍ単位で記録した。
【0040】
短鎖脂肪酸の産生
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を用いたインビトロ発酵を、ＭｃＢｕｒｎｅｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９８７）に記載された方法にいくつかの修正を施した以下の方法によって行った。簡単に説明すると、２．０ｇのフルクトース、フェヌグリーク種子、クランベリー種子繊維、ＦＯＳを１００ｍｌの脱イオン水に添加した。ｐＨを７．０±０．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブした。滅菌後、酸素還元酵素オキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）ｆｏｒ Ｂｒｏｔｈ、Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ、ＯＨ、ＵＳＡ）を各フラスコに加えて、嫌気性条件を誘導した。５％のオーバーナイト増殖バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５培養物を全てのフラスコに接種し、３７℃で穏やかに振とうさせたｒｐｍで２４時間インキュベートした。ボトルをきつく閉じ、パラフィルムで密封して、酵素補充によって生成された嫌気性条件を維持した。インキュベーション０時間および発酵後（２４時間）のｐＨ値も記録された。１ｍｌの硫酸銅（１０ｇ／Ｌ）を各試料に加えて、さらなる微生物の増殖を阻害した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。さらに、５．０ｍｌの試料を５ｍｌの蒸留水に加え、３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用してｐＨを１．５に調整した。１０ｍｌの冷却ジエチルエーテル（－２０℃）を試料に加え、１分間ボルテックスした。塩化ナトリウムを加え、３０００×ｇで１０分間、遠心分離した。遠心分離後、有機層を分離し、新しいバイアルに移した。これを使用してＳＣＦＡを定量した。ＳＣＦＡ標準はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、同様に処理した。ＳＣＦＡ産生（酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩）は、ＤＢ－ＦＦＡＰ（テレフタル酸修飾ポリエチレングリコール）カラムを含む、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０Ｎガスクロマトグラフ（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｃｒｅｅｋ Ｂｌｖｄ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定した。カラム温度は２００℃であった。インジェクターおよび検出器ポートの温度は２５０℃であった。キャリアガスは、１．０ｍｌ／分の流量のＮ2であった。ＳＣＦＡ標準はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ＳＣＦＡ（酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩）濃度は、フェヌグリーク種子からのガラクトマンナン１ｇ当たりのｍｇ数で表した。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を用いたインビトロ発酵を、ＭｃＢｕｒｎｅｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９８７）に記載された方法にいくつかの修正を施した以下の方法によって行った。簡単に説明すると、２．０ｇのフルクトース、フェヌグリーク種子、クランベリー種子繊維、ＦＯＳを１００ｍｌの脱イオン水に添加した。ｐＨを７．０±０．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブした。滅菌後、酸素還元酵素オキシラーゼ（Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）ｆｏｒ Ｂｒｏｔｈ、Ｏｘｙｒａｓｅ，Ｉｎｃ、ＯＨ、ＵＳＡ）を各フラスコに加えて、嫌気性条件を誘導した。５％のオーバーナイト増殖バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５培養物を全てのフラスコに接種し、３７℃で穏やかに振とうさせたｒｐｍで２４時間インキュベートした。ボトルをきつく閉じ、パラフィルムで密封して、酵素補充によって生成された嫌気性条件を維持した。インキュベーション０時間および発酵後（２４時間）のｐＨ値も記録された。１ｍｌの硫酸銅（１０ｇ／Ｌ）を各試料に加えて、さらなる微生物の増殖を阻害した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。さらに、５．０ｍｌの試料を５ｍｌの蒸留水に加え、３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を使用してｐＨを１．５に調整した。１０ｍｌの冷却ジエチルエーテル（－２０℃）を試料に加え、１分間ボルテックスした。塩化ナトリウムを加え、３０００×ｇで１０分間、遠心分離した。遠心分離後、有機層を分離し、新しいバイアルに移した。これを使用してＳＣＦＡを定量した。ＳＣＦＡ標準はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、同様に処理した。ＳＣＦＡ産生（酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩）は、ＤＢ－ＦＦＡＰ（テレフタル酸修飾ポリエチレングリコール）カラムを含む、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０Ｎガスクロマトグラフ（Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｃｒｅｅｋ Ｂｌｖｄ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定した。カラム温度は２００℃であった。インジェクターおよび検出器ポートの温度は２５０℃であった。キャリアガスは、１．０ｍｌ／分の流量のＮ2であった。ＳＣＦＡ標準はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ＳＣＦＡ（酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩）濃度は、フェヌグリーク種子からのガラクトマンナン１ｇ当たりのｍｇ数で表した。
【0041】
結果
胃酸への抵抗性
４時間までの研究で、初期の胞子数と比較して、ｐＨ３からｐＨ８．０での胞子数に有意な差（２～５％）はなかった（図９）。しかしながら、ｐＨ１．５では、１および４時間でそれぞれ０．４４および２．０３６ ｌｏｇ10の減少が観察された。研究の結果は、酸性ならびにアルカリ性ｐＨ条件でのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の安定性を確認するものであった。
胃酸への抵抗性
４時間までの研究で、初期の胞子数と比較して、ｐＨ３からｐＨ８．０での胞子数に有意な差（２～５％）はなかった（図９）。しかしながら、ｐＨ１．５では、１および４時間でそれぞれ０．４４および２．０３６ ｌｏｇ10の減少が観察された。研究の結果は、酸性ならびにアルカリ性ｐＨ条件でのバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５胞子の安定性を確認するものであった。
【0042】
胆汁耐性試験
胆汁塩（１％ｗ／ｖ）を含む寒天プレートでバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖が観察され、胆汁塩に対する耐性を示した。さらに、異なるフラスコ内に（０．１～２．０％）牛胆汁をＭＲＳブロスに補充することによって胆汁耐性アッセイを実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖が、最大２％、ｗ／ｖの牛胆汁の存在下および非存在下で観察された。一方で、Ｂ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖が０．８％ｗ／ｖで見られた（図１０）。同様に、胆汁塩の存在下および非存在下で、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生存率に有意な差はなかった。
乳酸の産生
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による乳酸産生は、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを使用して推定した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５によって産生された乳酸の総量は４．４８７ｇ／Ｌであった。Ｌ型乳酸は４．１２ｇ／Ｌであった。一方、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５によるＤ型乳酸は０．３６７ｇ／Ｌである（図１１）。
胆汁塩（１％ｗ／ｖ）を含む寒天プレートでバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖が観察され、胆汁塩に対する耐性を示した。さらに、異なるフラスコ内に（０．１～２．０％）牛胆汁をＭＲＳブロスに補充することによって胆汁耐性アッセイを実行した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の増殖が、最大２％、ｗ／ｖの牛胆汁の存在下および非存在下で観察された。一方で、Ｂ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の増殖が０．８％ｗ／ｖで見られた（図１０）。同様に、胆汁塩の存在下および非存在下で、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＢ．コアグランスＡＴＣＣ ３１２８４の生存率に有意な差はなかった。
乳酸の産生
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５による乳酸産生は、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを使用して推定した。バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５によって産生された乳酸の総量は４．４８７ｇ／Ｌであった。Ｌ型乳酸は４．１２ｇ／Ｌであった。一方、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５によるＤ型乳酸は０．３６７ｇ／Ｌである（図１１）。
【0043】
抗生物質抵抗性
クリンダマイシン、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールの、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＳ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８に対するＭＩＣの結果を表４に示す。試験した全ての抗生物質は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５に対して０．００７８～１．０μｇ／ｍｌのＭＩＣ範囲を示した。全ての試験した抗生物質は、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８に対して０．０３１～２μｇ／ｍｌのＭＩＣ範囲を示した。
クリンダマイシン、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールの、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５およびＳ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８に対するＭＩＣの結果を表４に示す。試験した全ての抗生物質は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５に対して０．００７８～１．０μｇ／ｍｌのＭＩＣ範囲を示した。全ての試験した抗生物質は、Ｓ．アウレウス ＡＴＣＣ ６５３８に対して０．０３１～２μｇ／ｍｌのＭＩＣ範囲を示した。
【0044】
【表4】
抗菌活性
Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５の抗菌活性を評価した。抗菌活性は、Ｃｉｎｔａｓら（１９９５）に記載されるように、ウェル拡散アッセイによって決定した。結果は、プロバイオティクス細菌がサルモネラ・アボニー、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌、シュードモナス・エルギノーサ、バチルス・セレウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、ストレプトコッカス・ミュータンス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピダーミディスに対して効果的な抗菌剤であることを示した。
【0045】
【表5】
データは、3反復で実行された3回の独立した実験の平均±SDを表す
【0046】
短鎖脂肪酸の産生
分析の結果を図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに示す。酢酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＦＯＳで高く、続いて、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー繊維およびフルクトースであった（図１２Ａ）。同様に、酪酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはフルクトースで高く、続いて、ＦＯＳ、フェヌグリーク種子繊維およびクランベリー繊維であった（図１２Ｂ）。プロピオン酸の産生は、フルクトース、ＦＯＳおよびクランベリー種子繊維と共に培養したＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５について同様であったが、フェヌグリーク種子繊維についてはより低かった（図１２Ｃ）。
保存および生存率
１５×１０9（調製物１）および６×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物を研究した。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５は、温度４０±２℃、ＲＨ６０％±５％で保存する間、生存率の向上を示した（図１３）。
本発明に対する他の修正および変形は、前述の開示および教示から当業者には明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これに多数の変更を加えることができることが明らかであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
分析の結果を図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに示す。酢酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＦＯＳで高く、続いて、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー繊維およびフルクトースであった（図１２Ａ）。同様に、酪酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはフルクトースで高く、続いて、ＦＯＳ、フェヌグリーク種子繊維およびクランベリー繊維であった（図１２Ｂ）。プロピオン酸の産生は、フルクトース、ＦＯＳおよびクランベリー種子繊維と共に培養したＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５について同様であったが、フェヌグリーク種子繊維についてはより低かった（図１２Ｃ）。
保存および生存率
１５×１０9（調製物１）および６×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物を研究した。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５は、温度４０±２℃、ＲＨ６０％±５％で保存する間、生存率の向上を示した（図１３）。
本発明に対する他の修正および変形は、前述の開示および教示から当業者には明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これに多数の変更を加えることができることが明らかであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
蜂蜜から新規フルクトース利用プロバイオティク細菌を単離および同定するための方法であって、ａ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｂ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｄ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｅ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
蜂蜜が、生蜂蜜、ろ過蜂蜜、アカシア蜂蜜、アルファルファ蜂蜜、アスター蜂蜜、アボカド蜂蜜、バスウッド蜂蜜、ブナノキ蜂蜜、ブルーベリー蜂蜜、ブルーガム蜂蜜、ソバ蜂蜜、クローバー蜂蜜、タンポポ蜂蜜、ユーカリ蜂蜜、ファイアウィード蜂蜜、ヘザー蜂蜜、アイアンバーク蜂蜜、ジャラ蜂蜜、レザーウッド蜂蜜、リンデン蜂蜜、マカデミア蜂蜜、マヌカ蜂蜜、オレンジブロッサム蜂蜜、パインツリー蜂蜜、サワーウッド蜂蜜、セージ蜂蜜、およびチュペロ蜂蜜からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
培養培地が、ＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）、ＧＹＡ（グルコース酵母エキス寒天）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）、胞子形成培地およびミューラーヒントン寒天からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
単離されたプロバイオティック菌株が、生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に対して陽性になり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに対して陰性になる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
フルクトースに富む食品からのフルクトースの利用を増加させるために蜂蜜から単離された、バチルス属のフルクトフィリックプロバイオティク細菌。
【請求項6】
グラム陽性である、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項7】
フルクトフィリック細菌の増殖についての最適ｐＨおよび温度が、それぞれ７．５および４０℃である、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項8】
胆汁耐性、胃酸抵抗性であり、乳酸を産生する、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項9】
バチルス・コアグランスである、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項10】
バチルス・コアグランスがバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５である、請求項９に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項11】
フルクトースに富む食品が、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャム、ゼリー、エナジードリンク、調味料、及びアイスクリームからなる群から選択される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項12】
高フルクトース摂取に関連する障害の治療管理に使用される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項13】
前記障害が、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、心血管合併症、糖尿病、高脂血症、高血圧、炎症および高尿酸血症からなる群から選択される、請求項１２に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項14】
前記フルクトフィリックプロバイオティク細菌が、接種物、凍結乾燥粉末、微粉末、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、エマルジョン、グミ、チュアブルまたは食用食品の形態で存在し、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャム、ゼリー、エナジードリンク、調味料、及びアイスクリームからなる群から選択されるフルクトースに富む食品と組み合わせて投与される、請求項５に記載のプロバイオティック細菌。
【請求項15】
病原性微生物を阻害する方法であって、前記微生物をフルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５と接触させるステップを含む、方法。
【請求項16】
病原性微生物が、サルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｎｙ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及びスタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
短鎖脂肪酸を産生する方法であって、フルクトース、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー種子繊維、及びフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）からなる群から選択される植物繊維と共に、フルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を培養することによる、方法。
【請求項18】
短鎖脂肪酸が、酢酸、酪酸およびプロピオン酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0046】
短鎖脂肪酸の産生
分析の結果を図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに示す。酢酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＦＯＳで高く、続いて、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー繊維およびフルクトースであった（図１２Ａ）。同様に、酪酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはフルクトースで高く、続いて、ＦＯＳ、フェヌグリーク種子繊維およびクランベリー繊維であった（図１２Ｂ）。プロピオン酸の産生は、フルクトース、ＦＯＳおよびクランベリー種子繊維と共に培養したＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５について同様であったが、フェヌグリーク種子繊維についてはより低かった（図１２Ｃ）。
保存および生存率
１５×１０9（調製物１）および６×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物を研究した。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５は、温度４０±２℃、ＲＨ６０％±５％で保存する間、生存率の向上を示した（図１３）。
本発明に対する他の修正および変形は、前述の開示および教示から当業者には明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これに多数の変更を加えることができることが明らかであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕蜂蜜から新規フルクトース利用プロバイオティクス細菌を単離および同定するための方法であって、
ｆ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｇ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｈ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｉ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｊ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法。
〔２〕蜂蜜が、生蜂蜜、ろ過蜂蜜、アカシア蜂蜜、アルファルファ蜂蜜、アスター蜂蜜、アボカド蜂蜜、バスウッド蜂蜜、ブナノキ蜂蜜、ブルーベリー蜂蜜、ブルーガム蜂蜜、ソバ蜂蜜、クローバー蜂蜜、タンポポ蜂蜜、ユーカリ蜂蜜、ファイアウィード蜂蜜、ヘザー蜂蜜、アイアンバーク蜂蜜、ジャラ蜂蜜、レザーウッド蜂蜜、リンデン蜂蜜、マカデミア蜂蜜、マヌカ蜂蜜、オレンジブロッサム蜂蜜、パインツリー蜂蜜、サワーウッド蜂蜜、セージ蜂蜜、およびチュペロ蜂蜜を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕培養培地が、ＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）、ＧＹＡ（グルコース酵母エキス寒天）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）、胞子形成培地およびミューラーヒントン寒天を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕単離されたプロバイオティック菌株が、生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に対して陽性になり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに対して陰性になる、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕フルクトースに富む食品からのフルクトースの利用を増加させるために蜂蜜から単離された、バチルス属のフルクトフィリックプロバイオティクス細菌。
〔６〕グラム陽性である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔７〕フルクトフィリック細菌の増殖についての最適ｐＨおよび温度が、それぞれ７．５および４０℃である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔８〕胆汁耐性、胃酸抵抗性であり、乳酸を産生する、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔９〕バチルス・コアグランスである、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１０〕バチルス・コアグランス菌株がバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１１〕フルクトースに富む食品が、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１２〕高フルクトース摂取に関連する障害の治療管理に使用される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１３〕肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、心血管合併症、糖尿病、高脂血症、高血圧、炎症および高尿酸血症を含む群から選択される、前記〔１２〕に記載の高フルクトース摂取に関連する障害。
〔１４〕前記フルクトフィリックプロバイオティクス細菌が、接種物、凍結乾燥粉末、微粉末、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、エマルジョン、グミ、チュアブルまたは食用食品の形態で存在し、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択されるフルクトースに富む食品と組み合わせて投与される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１５〕病原性微生物を阻害する方法であって、前記微生物をフルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５と接触させるステップを含む、方法。
〔１６〕病原性微生物が、サルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｎｙ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む群から選択される、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕短鎖脂肪酸を産生する方法であって、フルクトース、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー種子繊維、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）からなる群から選択される植物繊維と共に、フルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を培養することによる、方法。
〔１８〕短鎖脂肪酸が、酢酸、酪酸およびプロピオン酸を含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
分析の結果を図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに示す。酢酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはＦＯＳで高く、続いて、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー繊維およびフルクトースであった（図１２Ａ）。同様に、酪酸の産生は、Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５についてはフルクトースで高く、続いて、ＦＯＳ、フェヌグリーク種子繊維およびクランベリー繊維であった（図１２Ｂ）。プロピオン酸の産生は、フルクトース、ＦＯＳおよびクランベリー種子繊維と共に培養したＢ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５について同様であったが、フェヌグリーク種子繊維についてはより低かった（図１２Ｃ）。
保存および生存率
１５×１０9（調製物１）および６×１０9ｃｆｕ／ｇ（調製物２）に相当する２つの標準化調製物を研究した。Ｂ．コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５は、温度４０±２℃、ＲＨ６０％±５％で保存する間、生存率の向上を示した（図１３）。
本発明に対する他の修正および変形は、前述の開示および教示から当業者には明らかであろう。したがって、本発明の特定の実施形態のみが本明細書に具体的に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これに多数の変更を加えることができることが明らかであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕蜂蜜から新規フルクトース利用プロバイオティクス細菌を単離および同定するための方法であって、
ｆ）蜂蜜を生理食塩水と１：１０ｗ／ｖの比率で混合して、懸濁液を得るステップと、
ｇ）ステップａ）の懸濁液を十分に混合し、胞子を選択的に分離するために５０～７０℃で３０分間熱ショックを与えるステップと、
ｈ）ステップｂ）からの懸濁液１～２ｍｌを、フルクトースを含む適切な培養培地中３５～３７℃で４８時間インキュベートすることにより、細菌コロニーを単離するステップと、
ｉ）炭素源としてフルクトースを含む適切な培地中で、形態学的に異なるコロニーを選択およびインキュベートすることにより、細菌単離株を精製するステップと、
ｊ）生化学的分析および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定により、細菌株を受託番号ＭＴＣＣ ２５２３５を有するバチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）菌株ＦＦ７として同定するステップと
を含む、方法。
〔２〕蜂蜜が、生蜂蜜、ろ過蜂蜜、アカシア蜂蜜、アルファルファ蜂蜜、アスター蜂蜜、アボカド蜂蜜、バスウッド蜂蜜、ブナノキ蜂蜜、ブルーベリー蜂蜜、ブルーガム蜂蜜、ソバ蜂蜜、クローバー蜂蜜、タンポポ蜂蜜、ユーカリ蜂蜜、ファイアウィード蜂蜜、ヘザー蜂蜜、アイアンバーク蜂蜜、ジャラ蜂蜜、レザーウッド蜂蜜、リンデン蜂蜜、マカデミア蜂蜜、マヌカ蜂蜜、オレンジブロッサム蜂蜜、パインツリー蜂蜜、サワーウッド蜂蜜、セージ蜂蜜、およびチュペロ蜂蜜を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕培養培地が、ＭＲＳ（Ｄｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅによる寒天）、ＧＹＡ（グルコース酵母エキス寒天）、ＴＳＢ（トリプトン大豆ブロス）、胞子形成培地およびミューラーヒントン寒天を含む群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕単離されたプロバイオティック菌株が、生化学的試験カタラーゼ、オキシダーゼ、メチルレッド、フォーゲス・プロスカウエル、ラクトース、キシロース、マルトース、フルクトース、デキストロース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、メロビオース、スクロース、アラビノース、マンノース、イヌリン、グルコン酸ナトリウム、サリシン、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、メチルグルコシド、ラムノース、セロビオース、ＯＮＰＧ、エスクリン加水分解に対して陽性になり、生化学的試験ソルボースマロネート利用、クエン酸塩利用、キシリトール、メチルマンノシド、メレジトース、エリスリトール、アドニトール、イノシトール、ダルシトール、グリセロール、血液溶血、クエン酸塩およびインドールに対して陰性になる、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕フルクトースに富む食品からのフルクトースの利用を増加させるために蜂蜜から単離された、バチルス属のフルクトフィリックプロバイオティクス細菌。
〔６〕グラム陽性である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔７〕フルクトフィリック細菌の増殖についての最適ｐＨおよび温度が、それぞれ７．５および４０℃である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔８〕胆汁耐性、胃酸抵抗性であり、乳酸を産生する、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔９〕バチルス・コアグランスである、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１０〕バチルス・コアグランス菌株がバチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５である、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１１〕フルクトースに富む食品が、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１２〕高フルクトース摂取に関連する障害の治療管理に使用される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１３〕肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、心血管合併症、糖尿病、高脂血症、高血圧、炎症および高尿酸血症を含む群から選択される、前記〔１２〕に記載の高フルクトース摂取に関連する障害。
〔１４〕前記フルクトフィリックプロバイオティクス細菌が、接種物、凍結乾燥粉末、微粉末、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、エマルジョン、グミ、チュアブルまたは食用食品の形態で存在し、単独で、または高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、アガベ、メープルシロップ、ココナッツシュガー、パームシュガー、糖蜜、ソーダ、キャンディー、甘味ヨーグルト、冷凍食品、缶詰食品、シリアル、フルーツジュース、コーヒークリーマ、ジャムおよびゼリー、エナジードリンク、調味料、アイスクリームを含む群から選択されるフルクトースに富む食品と組み合わせて投与される、前記〔５〕に記載のプロバイオティック細菌。
〔１５〕病原性微生物を阻害する方法であって、前記微生物をフルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５と接触させるステップを含む、方法。
〔１６〕病原性微生物が、サルモネラ・アボニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｎｙ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む群から選択される、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕短鎖脂肪酸を産生する方法であって、フルクトース、フェヌグリーク種子繊維、クランベリー種子繊維、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）からなる群から選択される植物繊維と共に、フルクトフィリックプロバイオティック細菌バチルス・コアグランスＭＴＣＣ ２５２３５を培養することによる、方法。
〔１８〕短鎖脂肪酸が、酢酸、酪酸およびプロピオン酸を含む群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
【国際調査報告】