ホーム > 特許ランキング > オクタント，インク．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-15
(54)【発明の名称】転写リレー系
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20220805BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220805BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220805BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220805BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220805BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220805BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20220805BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20220805BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20220805BHJP
C12N 9/38 20060101ALN20220805BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/02
C12N9/16 B
C12N9/10
C12N9/02
C12N9/38
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570521
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2022-01-26
(86)【国際出願番号】 US2020034685
(87)【国際公開番号】W WO2020243164
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/853,637
(32)【優先日】2019-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】521229005
【氏名又は名称】オクタント，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】チャン，レオン イェン－リー
(72)【発明者】
【氏名】クーパー，アーロン ロス
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ヘンリー
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK03
4B050LL05
4B063QA20
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QR06
4B063QR13
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
【解決手段】タンパク質発現およびレポーターアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低減させるのに有用な転写リレー系が本明細書に記載されている。これらの系は核酸系を利用し、プロモーター配列は、レポーター分子の転写を活性化させる合成転写因子の発現を制御する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
転写リレー系であって、ａ）応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸と、
ｂ）合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸であって、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列の５’であり、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる、レポーター核酸と、
を含む、転写リレー系。
【請求項2】
前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列または血清応答エレメントヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の転写リレー系。
【請求項3】
前記合成転写因子は、第１の転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の転写因子由来の転写活性化ドメインを含む、請求項１または２に記載の転写リレー系。
【請求項4】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡ由来である、請求項３に記載の転写リレー系。
【請求項5】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示す配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の転写リレー系。
【請求項6】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示す配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の転写リレー系。
【請求項7】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示す配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の転写リレー系。
【請求項8】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列変異を含む、請求項５に記載の転写リレー系。
【請求項9】
前記転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５およびＲｔａを含む、請求項３に記載の転写リレー系。
【請求項10】
前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示す配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の転写リレー系。
【請求項11】
前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示す配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の転写リレー系。
【請求項12】
前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示す配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の転写リレー系。
【請求項13】
前記転写活性化ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列変異を含み、前記配列変異は、転写活性を上昇または低減させる、請求項１０に記載の転写リレー系。
【請求項14】
前記合成転写因子は、配列番号１０に示す配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項15】
前記合成転写因子は、配列番号１０に示す配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項16】
前記合成転写因子は、配列番号１０に示す配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項17】
前記合成転写因子は、前記合成転写因子を不安定化するポリペプチド配列を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項18】
前記合成転写因子を不安定化する前記ポリペプチド配列は、ＰＥＳＴまたはＣＬ１ポリペプチド配列を含む、請求項１７に記載の転写リレー系。
【請求項19】
前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡによって結合できるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項20】
前記レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼまたは固有の分子識別子を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項21】
前記レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型胎盤アルカリホスファターゼおよび固有の分子識別子を含む、請求項２０に記載の転写リレー系。
【請求項22】
前記固有の分子識別子は、試験ポリペプチドに特有であり、前記試験ポリペプチドは、前記レポーター核酸によってコードされる、請求項２０または２１に記載の転写リレー系。
【請求項23】
前記転写因子核酸は、前記転写抑制因子によって結合できる、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項24】
前記転写因子核酸は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域を伸長させる、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の転写リレー系。
【請求項25】
前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの前記５’非翻訳領域は、前記合成転写因子の翻訳を低減する１つ以上の配列を含む、請求項２４に記載の転写リレー系。
【請求項26】
前記転写因子核酸および前記レポーター核酸は、単一の核酸の成分である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の転写リレー系。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか１項に記載のリレー系を含む細胞。
【請求項28】
前記細胞は、真核細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項29】
前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項30】
前記転写因子核酸、前記レポーター核酸、あるいは、前記転写因子核酸と前記レポーター核酸の両方は、単一のコピーとして前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項31】
請求項１～２６のいずれか１項に記載のリレー系を含む細胞集団。
【請求項32】
前記細胞集団は、真核細胞集団を含む、請求項３０に記載の細胞集団。
【請求項33】
前記細胞集団は、哺乳動物細胞集団を含む、請求項３０に記載の細胞集団。
【請求項34】
前記転写因子核酸、前記レポーター核酸、あるいは、前記転写因子核酸および前記レポーター核酸の両方は、単一のコピーとして前記細胞集団のゲノムに組み込まれる、請求項３２または３３に記載の細胞集団。
【請求項35】
前記細胞または細胞集団は、高い基礎レポーター活性を含む、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項36】
前記高い基礎レポーター活性は、バックグラウンドより少なくとも約３０倍大きく、バックグラウンドは、前記レポーターを含まない親細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項37】
前記細胞または細胞集団は、レポーター活性において低い生体変動係数を含む、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項38】
レポーター活性において前記低い生体変動係数は、約０．５より低い、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項39】
応答エレメント調節プロモーターの活性に対する試験剤の効果を試験する方法であって、請求項２７～３８のいずれか１項に記載の細胞または細胞集団と、試験物質を接触させる工程を含む、方法。
【請求項40】
前記試験剤は、低分子化学物質である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８５３，６３７号の利益を主張するものであり、当該出願の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８５３，６３７号の利益を主張するものであり、当該出願の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【0002】
細胞シグナル伝達経路応答を照合するか、細胞シグナル経路のアンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするか、あるいは新規細胞シグナル伝達経路を発見するのに有用な核酸、系および方法が本明細書に記載されている。当技術分野において以前から知られている方法は、レポーター分子をコードする核酸の近位にある内因性の応答エレメント調節プロモーターを利用する。これらの方法は、細胞の内因性の応答エレメント結合プロモーターの「漏れがある」という性質により、レポーター分子のバックグラウンドシグナルの度合いが高いという欠点がある。また、これらの方法は、変動係数が高いという欠点がある。最後に、このような方法は、レポーター活性化の絶対値が低く、結果として、シグナル対ノイズが低いという欠点がある。本開示の核酸および系は、合成転写因子結合部位に対して非常に選択的である非内因性の合成転写因子を使用することによって、生体変動レベルを低減させ、レポーターシグナルのシグナル対ノイズ比を上昇させ、バックグラウンドシグナルを低減させる。よって、レポーター分子の転写は、内因性の転写因子によって開始されないので、バックグラウンドシグナルを低減させ、レポーターのシグナル対ノイズを上昇させるのに役立つ。これらの核酸および系は、Ｇタンパク質共役型受容体、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャネルおよび核内受容体などのシグナル伝達経路の低分子または生物学的アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするのに有用である。広義の態様では、系は、核酸であって、前記核酸は、ａ）合成転写因子リーディングフレームの５’末端の近位にある応答エレメント調節プロモーターと、ｂ）合成転写因子によって結合可能なプロモーターエレメントであって、前記プロモーターエレメントは、レポーター遺伝子リーディングフレームの５’末端の近位にある、プロモーターエレメントと、をコードする、核酸を含む。この系では、レポーター遺伝子は、レポーターアッセイの多重化が可能なように固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでもよい。
【0003】
一態様では、転写リレー系であって、前記転写リレー系は、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸と、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸であって、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列の５’であり、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる、レポーター核酸と、を含む、転写リレー系が本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列または血清応答エレメントヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、第１の転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の転写因子由来の転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡ由来である。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示す配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示す配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列変異を含む。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５およびＲｔａを含む。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示す配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示す配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列変異を含み、前記配列変異は、転写活性を上昇または低減させる。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１０に示すアミノ酸配列変異を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、前記合成転写因子を不安定化するポリペプチド配列を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子を不安定化する前記ポリペプチド配列は、ＰＥＳＴまたはＣＬ１ポリペプチド配列を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡによって結合できるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼまたは固有の分子識別子を含む。ある実施形態では、前記レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型胎盤アルカリホスファターゼおよびＵＭＩを含む。ある実施形態では、前記固有の分子識別子は、試験ポリペプチドに特有であり、前記試験ポリペプチドは、前記レポーター核酸によってコードされる。ある実施形態では、前記転写因子核酸は、転写抑制因子によって結合できる、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記転写因子核酸は、合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域を伸長させる、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの前記５’非翻訳領域は、前記合成転写因子の翻訳を低減させる１つ以上の配列を含む。ある実施形態では、前記転写因子核酸および前記レポーター核酸は、単一の核酸の成分である。ある実施形態では、前記リレー系を含む細胞が本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記細胞は、真核細胞を含む。ある実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞を含む。ある実施形態では、転写因子核酸、レポーター核酸、あるいは転写因子核酸とレポーター核酸の両方は、単一のコピーとして細胞のゲノムに組み込まれる。ある実施形態では、前記リレー系を含む細胞集団が本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記細胞集団は、真核細胞集団を含む。ある実施形態では、前記細胞集団は、哺乳動物細胞集団を含む。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、高い基礎レポーター活性を含む。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、高い基礎レポーター活性を含み、高い基礎レポーター活性は、バックグラウンドより少なくとも約３０倍大きく、バックグラウンドは、レポーターを含まない親細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、レポーター活性において低い生体変動係数を含む。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、低い生体変動係数を含み、レポーター活性における低い生体変動係数は、約０．５より低い。
【0004】
ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターの活性に対する試験剤の効果を試験する方法であって、前記方法は、細胞または細胞集団と、前記試験物質を接触させる工程を含む、方法が本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記試験剤は、化学物質である。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1A】転写リレー系の概略図を図示し、転写因子核酸（左）およびレポーター核酸（右）を示す。
【図1B】固有のＲＮＡ配列を含むレポーターをコードする核酸配列を図示する。
【図2】半無作為に組み込まれたＣＲＥ－Ｇａｌ４－ＶＰＲの複数のコピーと共に、単一で組み込まれたＣＲＥ－ルシフェラーゼを保有する細胞（灰色）、および、単一の組み込まれたＵＡＳ－ルシフェラーゼを保有する細胞（黒色）のレポーター産出を示す。
【図4】転写リレー系の誘導倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）に対する、Ｇａｌ４－ＶＰＲプロモーターヌクレオチド配列の配列タグ（デグロンタグ）の不安定化の効果を示す。
【図5】ＮＦＡＴリレー系のアイソタイプの細胞株から生成された細胞ライブラリを示す。細胞株は、陽性コントロール化合物を用いて、Ｇｑ共役型ＧＰＣＲにおけるＮＦＡＴリレーレポーター活性を検出する能力をスクリーニングした。偽発見率（ＦＤＲ）が．００１より低い、あるいはｍａｘ＿Ｑが３より大きいシグナルを生成した、受容体と化合物の組み合わせは、有意なヒットとみなした。このスクリーニングでは、ライブラリｃｂ２９およびｃｂ３７が最も有意なヒットを引き起こした。
【図6】細胞ライブラリを生成するために使用したアイソタイプの細胞株の変動対基礎活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0006】
一態様では、転写リレー系であって、前記転写リレー系は、（ａ）応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸と、（ｂ）合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸であって、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列の５’であり、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる、レポーター核酸と、を含む、転写リレー系が本明細書に記載されている。
【0007】
別の態様では、応答エレメント調節プロモーターの活性に対する試験物質の効果をアッセイする方法であって、前記方法は、（ａ）細胞と試験物質を接触させる工程であって、前記細胞は、（ｉ）応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸と、（ｉｉ）合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸であって、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列の５’であり、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる、レポーター核酸と、を含む、接触させる工程と、（ｂ）前記レポーターの転写を測定する少なくとも１つのアッセイを実施する工程と、を含む、方法が本明細書に記載されている。
【0008】
以下の記載では、様々な実施形態を完全に理解することができるように、ある特定の詳細が示されている。しかし、当業者であれば、これらの詳細がなくとも、提示されている実施形態を実践できることが理解されよう。文脈が特別に必要としない限り、以下の明細書と請求項の全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変更形態（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、開かれた包括的な意味で、すなわち、「含むがこれに限定されない」という意味で解釈されるものとする。本明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容がそれ以外のものを明確に指示していない限り、複数の指示物を含む。用語「または」は、その内容がそれ以外のものを明確に指示していない限り、「および／または」を含む意味で一般に用いられていることにも留意されたい。さらに、本明細書で提示されている見出しは、便宜上のものであり、請求されている実施形態の範囲や意味を解釈するものではない。
【0009】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、述べられた量の１０％付近の量を指す。
【0010】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用され、最小の長さに限定されない。提示されるポリペプチド鎖および他のペプチド、例えば、リンカーおよび結合ペプチドを含むポリペプチドは、天然および／または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含んでもよい。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、生来または天然の配列に関する修飾を含んでもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異導入によるもののように意図的であってよく、あるいはタンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅によるエラーによるもののように偶発的であってもよい。
【0011】
参照ポリペプチド配列に関するパーセント（％）配列同一性は、配列をアライメントし、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、様々な既知の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成できる。比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定できる。しかし、本明細書での目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは、米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公に入手可能であり、あるいはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。
【0012】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：分率Ｘ／Ｙの１００倍であって、式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２のＡおよびＢのプログラムアライメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基数の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるであろう。特に断らない限りは、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【0013】
用語「同一性」、「同一」または「パーセント同一性」は、参照配列と比較して核酸配列を記載するために本明細書で使用される場合、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ２２６４－２２６８， １９９０， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７， １９９３）に記載される式を使用して決定できる。このような式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０， １９９０）のｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列のパーセント同一性は、本出願の出願日現在に最新版のＢＬＡＳＴを使用して決定できる。
【0014】
本明細書に記載の系のポリペプチドは、核酸によってコードできる。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含むポリヌクレオチドの一種である。ある実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に転写するために使用できるベクターの成分である。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、それが連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。ベクターの一種は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるゲノム組み込み型ベクターまたは「組み込み型ベクター」である。ベクターの別の一種は、「エピソーマル」ベクター、例えば、染色体外で複製可能な核酸である。作動可能に連結している遺伝子の発現を指向することが可能なベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。好適なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルスベクターなどを含む。発現ベクターにおいて、転写を制御するために使用される調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物、細菌、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来であってもよい。通常、複製起点によって付与される宿主中での複製能や、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子をさらに取り込むことができる。ウイルス、例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来するベクターを用いることができる。プラスミドベクターは、染色体位置への組み込みのために線形化できる。ベクターは、ゲノム中の規定された位置または制限された部位のセットに部位特異的な組み込みを指向する配列を含んでもよい（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組み換え）。さらに、ベクターは、組み込みのために転移可能エレメント由来の配列を含んでもよい。
【0015】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされる」は、実験で一般的に使用されるプロセスを通して、意図的に細胞に外因性の核酸を導入する方法を指す。トランスフェクションは、例えば、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ウイルス形質導入またはエレクトロポレーションによって達成できる。トランスフェクションは、一過性のものであるか、あるいは安定的なもののいずれかであってもよい。
【0016】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション効率」は、細胞集団が外因性の核酸を取り込んだ程度あるいは割合を指す。トランスフェクション効率は、系の全細胞集団と比較して、外因性の核酸を取り込んだ所与の細胞集団のパーセント（％）として測定できる。トランスフェクション効率は、一過的または安定的にトランスフェクトされた細胞の両方で測定できる。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「生理活性ポリペプチド」は、遺伝子の発現を調整する細胞によって発現するポリペプチドを指す。生理活性ポリペプチドは、刺激に応じて、または任意の他の機構によって、１つ以上の仲介分子またはポリペプチドを介するシグナル伝達によって、遺伝子の発現を直接調整できる。生理活性ポリペプチドは、膜貫通型ポリペプチド（受容体またはチャンネルタンパク質など）、細胞内ポリペプチド（シグナル形質導入仲介体）、細胞外ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドであってもよい。
【0018】
本明細書で使用される場合、「レポーター活性」は、レポーターの経験的な読み出しを指す。例えば、ルシフェラーゼレポーターは、適切な基質で培養されると、発光読み出しを有する。蛍光タンパク質のような他のレポーターは、基質を必要としない場合があるが、例えば顕微鏡または蛍光プレートリーダーを介して測定できる。
【0019】
系の概要
本明細書に記載の系、核酸および方法は、応答エレメント結合プロモーターの有無および／または活性化レベルについてスクリーニングするのに有用である。本明細書に記載の核酸、系および方法は、従来のレポーター系より低いバックグラウンドシグナルレベルで転写の活性化を可能にする。ある実施形態では、応答エレメント結合プロモーターは、細胞シグナル伝達カスケードの終わりに活性化される。ある実施形態では、応答エレメント結合プロモーターの存在は、物理的または化学的な刺激などの外部刺激の前後に測定されるか、平行して実施されるコントロール条件と比較されてもよい。化学的な刺激とは、アゴニストまたはアンタゴニストの低分子または生物学的分子であってもよい。ある実施形態では、系は、医薬品発見の目的のためにスクリーニングするのに有用である。系は、応答エレメント調節プロモーター、合成転写因子プロモーター、合成転写因子およびレポーターを含む核酸を最低限含む。応答エレメント調節プロモーターは、合成転写因子の５’に位置し、応答エレメント結合プロモーターが存在する場合、合成転写因子の転写を活性化する。翻訳に際して、合成転写因子はその後、レポーターをコードする核酸配列の５’に位置する合成転写因子プロモーターに結合できる。合成転写因子プロモーターは、結合したまま、レポーターをコードする核酸配列の転写を活性化する。ある実施形態では、レポーターは、ポリペプチドである。ある実施形態では、レポーターは、ＵＭＩである。系のさらなる任意の特徴には、転写抑制因子によって結合できる応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列が含まれる。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列は、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域を伸長させる。ある実施形態では、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域は、合成転写因子の翻訳を低減させる１つ以上の配列を有する。
本明細書に記載の系、核酸および方法は、応答エレメント結合プロモーターの有無および／または活性化レベルについてスクリーニングするのに有用である。本明細書に記載の核酸、系および方法は、従来のレポーター系より低いバックグラウンドシグナルレベルで転写の活性化を可能にする。ある実施形態では、応答エレメント結合プロモーターは、細胞シグナル伝達カスケードの終わりに活性化される。ある実施形態では、応答エレメント結合プロモーターの存在は、物理的または化学的な刺激などの外部刺激の前後に測定されるか、平行して実施されるコントロール条件と比較されてもよい。化学的な刺激とは、アゴニストまたはアンタゴニストの低分子または生物学的分子であってもよい。ある実施形態では、系は、医薬品発見の目的のためにスクリーニングするのに有用である。系は、応答エレメント調節プロモーター、合成転写因子プロモーター、合成転写因子およびレポーターを含む核酸を最低限含む。応答エレメント調節プロモーターは、合成転写因子の５’に位置し、応答エレメント結合プロモーターが存在する場合、合成転写因子の転写を活性化する。翻訳に際して、合成転写因子はその後、レポーターをコードする核酸配列の５’に位置する合成転写因子プロモーターに結合できる。合成転写因子プロモーターは、結合したまま、レポーターをコードする核酸配列の転写を活性化する。ある実施形態では、レポーターは、ポリペプチドである。ある実施形態では、レポーターは、ＵＭＩである。系のさらなる任意の特徴には、転写抑制因子によって結合できる応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列が含まれる。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列は、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域を伸長させる。ある実施形態では、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域は、合成転写因子の翻訳を低減させる１つ以上の配列を有する。
【0020】
図１Ａには、本発明の非限定的な一実施形態が示されている。左には、転写因子核酸（１００）が示されている。転写因子核酸（１００）上に、合成転写因子（１０４）をコードするヌクレオチド配列の５’位の応答エレメント調節プロモーター核酸（１０２）が存在する。右には、レポーター核酸（１１０）があり、これは、レポーターをコードするヌクレオチド配列（１１４）の５’である合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列（１１２）を含有する。ある実施形態では、転写因子核酸およびレポーター核酸は、別々の核酸分子、例えば、別々のプラスミドまたはウイルスベクター上に存在する。ある実施形態では、転写因子核酸およびレポーター核酸は、直鎖状である。ある実施形態では、転写因子核酸およびレポーター核酸は、同じ核酸上に存在し、この核酸は、プラスミド、ウイルスベクター、直鎖状構造または任意の他の構造であってもよい。
【0021】
図１Ｂには、レポーターをコードするヌクレオチド配列の非限定的な一実施形態が示されている。レポーターをコードするヌクレオチド配列（１１４）は、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列（１２２）と、ＵＭＩをコードする核酸配列（１２４）とを含む。配列（１２４）は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）としても知られている。ＵＭＩは、特定の生理活性ポリペプチドを同定することができ、結果として、応答エレメント調節プロモーター核酸（１０２）の活性化をもたらす。非限定的な例として、生理活性ポリペプチドは、数百の既知のもののうちの特定のＧタンパク質共役型受容体を含んでもよい。よって、ＵＭＩエレメントは、多重フォーマットでいくつかの異なる生理活性ポリペプチドのシグナル伝達を容易にかつ迅速に照合することができる。さらに、提供されるリレー系は、応答エレメント調節プロモーターを用いてバックグラウンドシグナル伝達を低減させる。これによって、より正確な定量化が可能になり、そして、生理活性ポリペプチドを活性化し得る化合物における任意の多重スクリーニングにおける試験化合物の偽陽性数を低減させる。ある実施形態では、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、存在しない。ある実施形態では、ＵＭＩをコードする核酸配列は、存在しない。ある実施形態では、ＵＭＩをコードする核酸配列は、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列の５’である。ある実施形態では、レポーターポリペプチドをコードする核酸配列は、ＵＭＩをコードする核酸配列の５’である。
【0022】
ある実施形態では、レポーターをコードする核酸は、レポーターポリペプチドをコードする。ある実施形態では、前記レポーターポリペプチドは、直接検出可能である。ある実施形態では、前記レポーターポリペプチドは、タンパク質の基質に対する酵素活性の際に検出可能なシグナルを生成する。ある実施形態では、レポーターポリペプチドの検出は、定量的に達成できる。ある実施形態では、前記レポーターポリペプチドは、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせを含む。前記レポーターポリペプチドがルシフェラーゼタンパク質であるある実施形態では、基質の非限定的な例には、ホタルルシフェリン、ラチアルシフェリン、バクテリアルシフェリン、セレンテラジン、渦鞭毛藻ルシフェリン、ヴァルグリンおよび３－ヒドロキシヒスピジンが含まれる。
【0023】
ある実施形態では、レポーターをコードする核酸は、ＵＭＩをコードする。前記ＵＭＩは、核酸に固有のヌクレオチドの短い配列を含む。前記ＵＭＩは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長以上であってもよい。前記ＵＭＩは、次世代シーケンシング法など、前記ＵＭＩの配列決定可能な任意の好適な方法で検出可能である。前記ＵＭＩの検出方法は、定量的なものであってもよく、これには、次世代シーケンシング法が含まれる。
【0024】
ある実施形態では、創薬での使用のための、転写因子核酸をコードする核酸と、レポーター核酸とを含む系を展開する方法が本明細書で記載されている。ある実施形態では、方法は、核酸が内在化されて細胞によって発現される（例えば、トランスフェクトされる）のに十分な条件下で、核酸と細胞または細胞集団を接触させる工程と、細胞と物理的または化学的な刺激を接触させる工程と、１つ以上のアッセイによって、レポーターエレメントの活性化を決定する工程と、を含む。ある実施形態では、方法は、転写因子核酸をコードする核酸とレポーター核酸とを含む細胞または細胞集団を接触させる工程と、１つ以上のアッセイによってレポーターエレメントの活性化を決定する工程とを含む。
【0025】
応答エレメント調節プロモーター
応答エレメントは、特定の転写因子に結合して遺伝子の転写を調節できる、遺伝子プロモーター領域内にあるＤＮＡの短い配列である。ある応答エレメントは、あるプロモーターに特異的である。いくつかの応答エレメントは、内因性の転写因子によって結合可能である。同じ応答エレメントの複数のコピーは、ヌクレオチド配列の異なる部分に位置し、同じ刺激に応答して異なる遺伝子を活性化できる。本明細書に記載の系に取り込まれる応答エレメントの非限定的な例には、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、Ｂ認識エレメント、ＡｈＲ応答エレメント、ダイオキシン応答エレメントまたは異物応答エレメント、ＨＩＦ応答エレメント、ホルモン応答エレメント、血清応答エレメント、レチノイン酸応答エレメント、ペルオキシソーム増殖因子ホルモン応答エレメント、金属応答エレメント、ＤＮＡ損傷応答エレメント、ＩＦＮ刺激応答エレメント、ＲＯＲ応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、カルシウム応答エレメントＣａＲＥ１、抗酸化剤応答エレメント、ｐ５３応答エレメント、甲状腺ホルモン応答エレメント、成長ホルモン応答エレメント、ステロール応答エレメント、ポリコーム応答エレメントおよびビタミンＤ応答エレメントが含まれる。
応答エレメントは、特定の転写因子に結合して遺伝子の転写を調節できる、遺伝子プロモーター領域内にあるＤＮＡの短い配列である。ある応答エレメントは、あるプロモーターに特異的である。いくつかの応答エレメントは、内因性の転写因子によって結合可能である。同じ応答エレメントの複数のコピーは、ヌクレオチド配列の異なる部分に位置し、同じ刺激に応答して異なる遺伝子を活性化できる。本明細書に記載の系に取り込まれる応答エレメントの非限定的な例には、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、Ｂ認識エレメント、ＡｈＲ応答エレメント、ダイオキシン応答エレメントまたは異物応答エレメント、ＨＩＦ応答エレメント、ホルモン応答エレメント、血清応答エレメント、レチノイン酸応答エレメント、ペルオキシソーム増殖因子ホルモン応答エレメント、金属応答エレメント、ＤＮＡ損傷応答エレメント、ＩＦＮ刺激応答エレメント、ＲＯＲ応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、カルシウム応答エレメントＣａＲＥ１、抗酸化剤応答エレメント、ｐ５３応答エレメント、甲状腺ホルモン応答エレメント、成長ホルモン応答エレメント、ステロール応答エレメント、ポリコーム応答エレメントおよびビタミンＤ応答エレメントが含まれる。
【0026】
応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、遺伝子の転写を調節するためにプロモーターおよび他の分子の補充を補助する１つ以上の応答エレメントを含有する、核酸の領域である。細胞は、遺伝子の転写を調整するために内因性のタンパク質を利用する多数の応答エレメント調節ヌクレオチド配列を含有する。内因性の応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列がレポーターの転写を直接調節する状況では、内因性のプロモーターの存在により、高いレベルのバックグラウンドシグナルが存在する。系を含有する細胞に内在していない転写因子によってレポーターの転写を調節する系は、内因性の転写因子によってレポーターの転写を調節する系に比べて利点がある。このような系の利点の１つは、前記レポーターが、低いバックグラウンドを産生することである。
【0027】
ある実施形態では、本発明の転写リレー系は、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸を含む。前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子ヌクレオチド配列によってコードされる合成転写因子の発現を制御するように作用する。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列、血清応答エレメントヌクレオチド配列、またはこれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、血清応答エレメントヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列および／または血清応答エレメントヌクレオチド配列の任意の組み合わせを含む。
【0028】
ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターは、転写因子によって結合可能である。一般的な転写因子の非限定的な例には、ＬｅｘＡ、Ｇａｌ４、ＶＰ１６（単純ヘルペスウイルス由来）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、またはそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の系は、レポーターアッセイで一般的にまたは潜在的に使用可能な任意の転写因子またはその組み合わせに適合する。
【0029】
ある実施形態では、前記応答エレメント調節プロモーターは、内因性の転写因子によって結合される。内因性の転写因子は、生物、組織または細胞に天然に存在する転写因子である。内因性の転写因子が存在するかは、前記転写リレーが存在する系に依存する。ある実施形態では、前記内因性の転写因子は、バックグラウンド速度で合成転写因子の転写を促進する。
【0030】
ある実施形態では、前記転写因子核酸は、転写抑制因子によって結合できる、前記応答エレメント調節プロモーター核酸配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む。転写抑制因子は、遠位にあるヌクレオチド配列の転写を阻害する。一般的な転写抑制因子の非限定的な例には、ＴｅｔＲ、ｌａｃ抑制因子、ＫＲＡＢ抑制因子、およびそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の系は、レポーターアッセイで一般的にまたは潜在的に使用可能な任意の抑制因子またはその組み合わせに適合する。
【0031】
ある実施形態では、前記転写因子核酸は、合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの５’非翻訳領域を伸長させる、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列の近位にあるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡの前記５’非翻訳領域は、前記合成転写因子の翻訳を低減する１つ以上の配列を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子の翻訳を低減させる前記１つ以上の配列は、前記合成転写因子の翻訳を低減させる二次構造を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子の翻訳を低減させる前記１つ以上の配列は、ＲＮＡ結合タンパク質による結合に影響を及ぼす配列を含む。ある実施形態では、前記合成転写因子の翻訳を低減させる前記１つ以上の配列は、上流オープンリーディングフレームを含む。
【0032】
アッセイ方法
以上に記載の系は、様々な方法を使用して有効に利用できる。系は、定常状態と、物理的または化学的な刺激に応答するときとの両方で、細胞シグナル伝達経路の活性を照合する方法において有用である。レポーターエレメントが特定のレポーターエレメントに結合したＵＭＩ配列を含む場合、系は多重アッセイで展開できる。
以上に記載の系は、様々な方法を使用して有効に利用できる。系は、定常状態と、物理的または化学的な刺激に応答するときとの両方で、細胞シグナル伝達経路の活性を照合する方法において有用である。レポーターエレメントが特定のレポーターエレメントに結合したＵＭＩ配列を含む場合、系は多重アッセイで展開できる。
【0033】
非限定的かつ例示的な一例では、複数の細胞は、マルチウェルプレートの１つのウェルでインキュベートされる。複数の細胞は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸でトランスフェクトされる。細胞は既に、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸を含むか、あるいは前記転写因子核酸でトランスフェクトされてもよい。その後、トランスフェクトされた細胞は、化学的な刺激に接触される。レポーター遺伝子が発現するのに十分な時間の経過後に、細胞溶解物は回収され、前記レポーター遺伝子の活性化が定量化される。この例では、レポーター遺伝子の存在が上昇することにより、前記応答エレメント調節プロモーターに結合する転写因子の活性の上昇を引き起こした化学的な刺激を示す。ある実施形態では、細胞シグナル伝達カスケードに続いて、前記応答エレメント調節プロモーターに結合する前記転写因子の活性が上昇する。
【0034】
前記レポーター遺伝子が基質と相互作用の際に検出可能なシグナルを生成する酵素を含む実施形態では、前記レポーター遺伝子の活性化を定量化するために、当技術分野において既知の標準的なアッセイが利用できる。前記レポーター遺伝子が蛍光分子を含む実施形態では、前記レポーター遺伝子の活性化は、蛍光顕微鏡法または蛍光プレートリーダーによって測定でき、細胞溶解を必要としなくてもよい。前記蛍光分子は、生細胞におけるレポーターの活性化を測定するのに有用である。前記レポーター遺伝子がＵＭＩを含む実施形態では、ｍＲＮＡは、逆転写され、ＵＭＩの配列決定は、次世代シーケンシング技術を用いて行われる。
【0035】
ある実施形態では、アッセイは、６、１２、２４、４８、９６または３８４ウェルフォーマットなどのマルチウェルフォーマットで実施される。ある実施形態では、各ウェルに、異なる試験化学物質が供給されるか、あるいは２重ウェル、３重ウェルまたは４重ウェルに、試験化学物質が供給される。アッセイはまた、１つ以上の陽性コントロールウェルまたは１つの陰性コントロールウェルを含んでもよい。
【0036】
合成転写因子
合成転写因子は、遺伝子の発現を標的して調節可能な人工タンパク質である。いくつかの合成転写因子は、複数の異なる遺伝子由来のドメインを含有するキメラタンパク質である。ある実施形態では、合成転写因子は、１つの遺伝子由来のＤＮＡ結合ドメインおよび別の遺伝子由来の転写調節ドメインを含む。
合成転写因子は、遺伝子の発現を標的して調節可能な人工タンパク質である。いくつかの合成転写因子は、複数の異なる遺伝子由来のドメインを含有するキメラタンパク質である。ある実施形態では、合成転写因子は、１つの遺伝子由来のＤＮＡ結合ドメインおよび別の遺伝子由来の転写調節ドメインを含む。
【0037】
本明細書に記載の方法、核酸および系では、転写活性ポリペプチドが転写因子核酸にコードされる。ある実施形態では、前記転写活性ポリペプチドは、合成転写因子である。ある実施形態では、前記合成転写因子は、キメラタンパク質である。ある実施形態では、前記合成転写因子は、第１の転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、第２の転写因子由来の転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記第１の転写因子は、前記第２の転写因子と異なる。
【0038】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、いずれの内因性の転写因子に比べて、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列に高い特異性を有する。ある実施形態では、前記合成転写因子は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列に結合し、内因性のプロモーターによって結合可能でない。ある実施形態では、前記合成転写因子の場合は、結果として、内因性の転写因子を用いた場合に生じるものより、レポーターのバックグラウンド産生が低い。
【0039】
ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、本発明の転写リレー系を含有する細胞に内在していない。ある実施形態では、第１の転写因子由来の前記ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、ＬｅｘＡ、Ｌａｃ９、またはそれらの組み合わせ由来である。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＫＬＬＳＳＩＥＱＡＣＤＩＣＲＬＫＫＬＫＣＳＫＥＫＰＫＣＡＫＣＬＫＮＮＷＥＣＲＹＳＰＫＴＫＲＳＰＬＴＲＡＨＬＴＥＶＥＳＲＬＥＲＬＥＱＬＦＬＬＩＦＰＲＥＤＬＤＭＩＬＫＭＤＳＬＱＤＩＫＡＬＬＴＧＬＦＶＱＤＮＶＮＫＤＡＶＴＤＲＬＡＳＶＥＴＤＭＰＬＴＬＲＱＨＲＩＳＡＴＳＳＳＥＥＳＳＮＫＧＱＲＱＬＴＶＳ（配列番号１）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＫＫＫＮＳＫＫＳＮＲＴＤＳＫＲＧＤＳＮＧＳＫＳＲＴＡＣＫＲＣＲＫＫＫＣＤＳＣＫＲＣＡＫＶＣＶＳＤＡＴＧＫＤＶＲＳＹＶＤＲＡＶＭＭＲＶＫＹＧＶＤＴＫＲＧＮＡＴＳＤＤＤＫＫＹＳＳＶＳＳ（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＫＳＲＴＡＣＫＲＣＲＬＫＫＩＫＣＤＱＥＦＰＳＣＫＲＣＡＫＬＥＶＰＣＹＳＰＫＴＫＲＳＰＬＴＲＡＨＬＴＥＶＥＳＲＬＥＲＬＥＱＬＦＬＬＩＦＰＲＥＤＬＤＭＩＬＫＭＤＳＬＱＤＩＫＡＬＬＴＧＬＦＶＱＤＮＶＮＫＤＡＶＴＤＲＬＡＳＶＥＴＤＭＰＬＴＬＲＱＨＲＩＳＡＴＳＳＳＥＥＳＳＮＫＧＱＲＱＬＴＶＳ（配列番号３）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＫＳＲＴＡＣＫＲＣＲＬＫＫＩＫＣＤＱＥＦＰＳＣＫＲＣＡＫＬＥＶＰＣＶＳＳＰＫＴＫＲＳＰＬＴＲＡＨＬＴＥＶＥＳＲＬＥＲＬＥＱＬＦＬＬＩＦＰＲＥＤＬＤＭＩＬＫＭＤＳＬＱＤＩＫＡＬＬＴＧＬＦＶＱＤＮＶＮＫＤＡＶＴＤＲＬＡＳＶＥＴＤＭＰＬＴＬＲＱＨＲＩＳＡＴＳＳＳＥＥＳＳＮＫＧＱＲＱＬＴＶＳ（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＮＫＫＳＳＥＶＭＨＱＡＣＤＡＣＲＫＫＫＷＫＣＳＫＴＶＰＴＣＴＮＣＬＫＹＮＬＤＣＶＹＳＰＱＶＶＲＴＰＬＴＲＡＨＬＴＥＭＥＮＲＶＡＥＬＥＱＦＬＫＥＬＦＰＶＷＤＩＤＲＬＬＱＱＫＤＴＹＲＩＲＥＬＬＴＭＧＳＴＮＴＶＰＧＬＡＳＮＮＩＤＳＳＬＥＱＰＶＡＦＧＴＡＱＰＡＱＳＬＳＴＤＰＡＶＱＳＱＡＹＰＭＱＰＶ（配列番号５）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＮＫＫＳＳＥＶＭＨＱＡＣＶＥＣＲＱＱＫＳＫＣＤＡＨＥＲＡＰＥＰＣＴＫＣＡＫＫＮＶＰＣＩＶＹＳＰＱＶＶＲＴＰＬＴＲＡＨＬＴＥＭＥＮＲＶＡＥＬＥＱＦＬＫＥＬＦＰＶＷＤＩＤＲＬＬＱＱＫＤＴＹＲＩＲＥＬＬＴＭＧＳＴＮＴＶＰＧＬＡＳＮＮＩＤＳＳＬＥＱＰＶＡＦＧＴＡＱＰＡＱＳＬＳＴＤＰＡＶＱＳＱＡＹＰＭＱＰＶ（配列番号６）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＮＫＫＳＳＥＶＭＨＱＡＣＫＲＣＲＬＫＫＩＫＣＤＱＥＦＰＳＣＫＲＣＬＫＹＮＬＤＣＶＹＳＰＱＶＶＲＴＰＬＴＲＡＨＬＴＥＭＥＮＲＶＡＥＬＥＱＦＬＫＥＬＦＰＶＷＤＩＤＲＬＬＱＱＫＤＴＹＲＩＲＥＬＬＴＭＧＳＴＮＴＶＰＧＬＡＳＮＮＩＤＳＳＬＥＱＰＶＡＦＧＴＡＱＰＡＱＳＬＳＴＤＰＡＶＱＳＱＡＹＰＭＱＰＶ（配列番号７）に示すアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＮＫＫＳＳＥＶＭＨＱＡＣＫＲＣＲＬＫＫＩＫＣＤＱＥＦＰＳＣＫＲＣＡＫＬＥＶＰＣＶＹＳＰＱＶＶＲＴＰＬＴＲＡＨＬＴＥＭＥＮＲＶＡＥＬＥＱＦＬＫＥＬＦＰＶＷＤＩＤＲＬＬＱＱＫＤＴＹＲＩＲＥＬＬＴＭＧＳＴＮＴＶＰＧＬＡＳＮＮＩＤＳＳＬＥＱＰＶＡＦＧＴＡＱＰＡＱＳＬＳＴＤＰＡＶＱＳＱＡＹＰＭＱＰＶ（配列番号８）に示すアミノ酸配列を含む。
【0040】
ある実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列変異を含む。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｒ１５Ｗ、Ｋ２３Ｐ、Ｋ２３Ｔ、Ｋ２３Ｗ、Ｋ２３Ｍ、Ｋ２３Ｎ、Ｆ６８Ｒ、Ｆ６８Ｑ、Ｌ６９Ｐ、Ｌ７０Ｐ、Ｑ９Ｅ、Ｑ９Ａ、Ｑ９Ｎ、Ｒ１５Ｋ、Ｒ１５Ａ、Ｒ１５Ｍ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ１８Ａ、Ｋ１８Ｍ、Ｋ２３Ｒ、Ｋ２３Ａ、Ｋ２３Ｍ、またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｒ１５Ｗである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｐである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｔである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｗである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｍである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｎである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｆ６８Ｒである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｆ６８Ｑである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｌ６９Ｐである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｌ７０Ｐである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｑ９Ｅである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｑ９Ａである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｑ９Ｎである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｒ１５Ｋである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｒ１５Ａである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｒ１５Ｍである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ１８Ｒである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ１８Ａである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ１８Ｍである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｒである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ａである。ある実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列変異は、Ｋ２３Ｍである。
【0041】
ある実施形態では、第２の転写因子由来の転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５およびＲｔａならびにそれらの組み合わせ由来である。ある実施形態では、前記転写活性化ドメインは、ＲＡＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＰＫＫＫＲＫＶＧＳＱＹＬＰＤＴＤＤＲＨＲＩＥＥＫＲＫＲＴＹＥＴＦＫＳＩＭＫＫＳＰＦＳＧＰＴＤＰＲＰＰＰＲＲＩＡＶＰＳＲＳＳＡＳＶＰＫＰＡＰＱＰＹＰＦＴＳＳＬＳＴＩＮＹＤＥＦＰＴＭＶＦＰＳＧＱＩＳＱＡＳＡＬＡＰＡＰＰＱＶＬＰＱＡＰＡＰＡＰＡＰＡＭＶＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰＶＬＡＰＧＰＰＱＡＶＡＰＰＡＰＫＰＴＱＡＧＥＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤＬＧＡＬＬＧＮＳＴＤＰＡＶＦＴＤＬＡＳＶＤＮＳＥＦＱＱＬＬＮＱＧＩＰＶＡＰＨＴＴＥＰＭＬＭＥＹＰＥＡＩＴＲＬＶＴＧＡＱＲＰＰＤＰＡＰＡＰＬＧＡＰＧＬＰＮＧＬＬＳＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱＩＳＳＧＳＧＳＧＳＲＤＳＲＥＧＭＦＬＰＫＰＥＡＧＳＡＩＳＤＶＦＥＧＲＥＶＣＱＰＫＲＩＲＰＦＨＰＰＧＳＰＷＡＮＲＰＬＰＡＳＬＡＰＴＰＴＧＰＶＨＥＰＶＧＳＬＴＰＡＰＶＰＱＰＬＤＰＡＰＡＶＴＰＥＡＳＨＬＬＥＤＰＤＥＥＴＳＱＡＶＫＡＬＲＥＭＡＤＴＶＩＰＱＫＥＥＡＡＩＣＧＱＭＤＬＳＨＰＰＰＲＧＨＬＤＥＬＴＴＴＬＥＳＭＴＥＤＬＮＬＤＳＰＬＴＰＥＬＮＥＩＬＤＴＦＬＮＤＥＣＬＬＨＡＭＨＩＳＴＧＬＳＩＦＤＴＳＬＦ（配列番号１４）に示すアミノ酸配列を含む。
【0042】
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と少なくとも９０％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と少なくとも９５％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と少なくとも９７％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と少なくとも９８％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９９％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１４に示す配列と１００％同一であるＶＰＲアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。
【0043】
ある実施形態では、合成転写因子上にある転写活性化ドメインは、転写活性化を上昇または低減させるアミノ酸配列変異を含む。ある実施形態では、転写活性化を上昇または低減させるアミノ酸配列変異を含む前記転写活性化ドメインは、配列番号１４の配列変異である。
【0044】
ある実施形態では、転写因子核酸の核酸配列によってコードされる合成転写因子は、「デグロン」とも呼ばれる、前記合成転写因子を不安定化するポリペプチド配列を含む。ある実施形態では、前記転写因子を不安定化する前記ポリペプチド配列は、ＰＥＳＴポリペプチド配列を含む。ＰＥＳＴポリペプチド配列は、複数のアミノ酸を含有するポリペプチド配列であり、前記ポリペプチド配列は、アミノ酸プロリン、グルタミン酸、セリンおよび／またはトレオニンに富む。ある実施形態では、前記転写因子を不安定化する前記ポリペプチド配列は、ＣＬ１ポリペプチド配列を含む。ＣＬ１ポリペプチド配列は、分解シグナルとして機能し、結果として得られる合成転写因子は、半減期が短いものになる。ある実施形態では、前記合成転写因子を不安定化する前記ポリペプチド配列は、レポーターのバックグラウンドシグナルを低減させるのを補助する。
【0045】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、ＧＡＬ４－ＶＰ１６のキメラ転写因子を含む。ある実施形態では、前記転写因子は、ＧＡＬ４－ＶＰＲのキメラ転写因子を含む。Ｇａｌ４－ＶＰＲキメラ転写因子の配列は、ＭＫＬＬＳＳＩＥＱＡＣＤＩＣＲＬＫＫＬＫＣＳＫＥＫＰＫＣＡＫＣＬＫＮＮＷＥＣＲＹＳＰＫＴＫＲＳＰＬＴＲＡＨＬＴＥＶＥＳＲＬＥＲＬＥＱＬＦＬＬＩＦＰＲＥＤＬＤＭＩＬＫＭＤＳＬＱＤＩＫＡＬＬＴＧＬＦＶＱＤＮＶＮＫＤＡＶＴＤＲＬＡＳＶＥＴＤＭＰＬＴＬＲＱＨＲＩＳＡＴＳＳＳＥＥＳＳＮＫＧＱＲＱＬＴＶＳＡＳＧＳＧＲＡＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＰＫＫＫＲＫＶＧＳＱＹＬＰＤＴＤＤＲＨＲＩＥＥＫＲＫＲＴＹＥＴＦＫＳＩＭＫＫＳＰＦＳＧＰＴＤＰＲＰＰＰＲＲＩＡＶＰＳＲＳＳＡＳＶＰＫＰＡＰＱＰＹＰＦＴＳＳＬＳＴＩＮＹＤＥＦＰＴＭＶＦＰＳＧＱＩＳＱＡＳＡＬＡＰＡＰＰＱＶＬＰＱＡＰＡＰＡＰＡＰＡＭＶＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰＶＬＡＰＧＰＰＱＡＶＡＰＰＡＰＫＰＴＱＡＧＥＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤＬＧＡＬＬＧＮＳＴＤＰＡＶＦＴＤＬＡＳＶＤＮＳＥＦＱＱＬＬＮＱＧＩＰＶＡＰＨＴＴＥＰＭＬＭＥＹＰＥＡＩＴＲＬＶＴＧＡＱＲＰＰＤＰＡＰＡＰＬＧＡＰＧＬＰＮＧＬＬＳＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱＩＳＳＧＳＧＳＧＳＲＤＳＲＥＧＭＦＬＰＫＰＥＡＧＳＡＩＳＤＶＦＥＧＲＥＶＣＱＰＫＲＩＲＰＦＨＰＰＧＳＰＷＡＮＲＰＬＰＡＳＬＡＰＴＰＴＧＰＶＨＥＰＶＧＳＬＴＰＡＰＶＰＱＰＬＤＰＡＰＡＶＴＰＥＡＳＨＬＬＥＤＰＤＥＥＴＳＱＡＶＫＡＬＲＥＭＡＤＴＶＩＰＱＫＥＥＡＡＩＣＧＱＭＤＬＳＨＰＰＰＲＧＨＬＤＥＬＴＴＴＬＥＳＭＴＥＤＬＮＬＤＳＰＬＴＰＥＬＮＥＩＬＤＴＦＬＮＤＥＣＬＬＨＡＭＨＩＳＴＧＬＳＩＦＤＴＳＬＦ（配列番号１０）に示す配列によって表される。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１０に示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写因子をコードする。
【0046】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示すアミノ酸配列によって表されるＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【0047】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、ＲＡＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）に示すアミノ酸配列によって表されるＶＰ６４由来の転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１１に示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。
【0048】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、ＱＹＬＰＤＴＤＤＲＨＲＩＥＥＫＲＫＲＴＹＥＴＦＫＳＩＭＫＫＳＰＦＳＧＰＴＤＰＲＰＰＰＲＲＩＡＶＰＳＲＳＳＡＳＶＰＫＰＡＰＱＰＹＰＦＴＳＳＬＳＴＩＮＹＤＥＦＰＴＭＶＦＰＳＧＱＩＳＱＡＳＡＬＡＰＡＰＰＱＶＬＰＱＡＰＡＰＡＰＡＰＡＭＶＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰＶＬＡＰＧＰＰＱＡＶＡＰＰＡＰＫＰＴＱＡＧＥＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤＬＧＡＬＬＧＮＳＴＤＰＡＶＦＴＤＬＡＳＶＤＮＳＥＦＱＱＬＬＮＱＧＩＰＶＡＰＨＴＴＥＰＭＬＭＥＹＰＥＡＩＴＲＬＶＴＧＡＱＲＰＰＤＰＡＰＡＰＬＧＡＰＧＬＰＮＧＬＬＳＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱＩＳＳ（配列番号１２）に示すアミノ酸配列によって表されるｐ６５由来の転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１２に示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。
【0049】
ある実施形態では、前記合成転写因子は、ＲＤＳＲＥＧＭＦＬＰＫＰＥＡＧＳＡＩＳＤＶＦＥＧＲＥＶＣＱＰＫＲＩＲＰＦＨＰＰＧＳＰＷＡＮＲＰＬＰＡＳＬＡＰＴＰＴＧＰＶＨＥＰＶＧＳＬＴＰＡＰＶＰＱＰＬＤＰＡＰＡＶＴＰＥＡＳＨＬＬＥＤＰＤＥＥＴＳＱＡＶＫＡＬＲＥＭＡＤＴＶＩＰＱＫＥＥＡＡＩＣＧＱＭＤＬＳＨＰＰＰＲＧＨＬＤＥＬＴＴＴＬＥＳＭＴＥＤＬＮＬＤＳＰＬＴＰＥＬＮＥＩＬＤＴＦＬＮＤＥＣＬＬＨＡＭＨＩＳＴＧＬＳＩＦＤＴＳＬＦ（配列番号１３）に示すアミノ酸配列によって表されるＲｔａ由来の転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１３に示す配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する転写活性化ドメインを含む。
【0050】
合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列
合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、合成転写因子によって結合可能な核酸の配列である。ある実施形態では、前記合成転写因子ヌクレオチド配列は、内因性の転写因子によって結合されない。前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、レポーター分子の転写を活性化するために前記合成転写因子の補充を補助する。前記レポーター分子は、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列の３’に位置する核酸にコードされる。
合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、合成転写因子によって結合可能な核酸の配列である。ある実施形態では、前記合成転写因子ヌクレオチド配列は、内因性の転写因子によって結合されない。前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、レポーター分子の転写を活性化するために前記合成転写因子の補充を補助する。前記レポーター分子は、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列の３’に位置する核酸にコードされる。
【0051】
本明細書に記載の方法、核酸および系では、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、レポーター核酸にコードされる。前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、転写因子核酸にコードされる合成転写因子によって結合できる。前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、レポーターをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する。ある実施形態では、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、内因性の転写因子によって結合されない。ある実施形態では、前記合成転写因子は、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列に非常に特異的である。
【0052】
ある実施形態では、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡによって結合できる。ある実施形態では、前記合成転写因子は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドによって結合できる。
【0053】
ある実施形態では、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、Ｇａｌ４、ＰＰＲ１、Ｌａｃ９またはＬｅｘＡのアミノ酸配列変異によって結合できる。ある実施形態では、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列変異で結合できる。
【0054】
レポーターエレメント
レポーター核酸は、合成転写因子によって結合できる調節エレメントと、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを最低限含む。レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる前記調節エレメントの下流である。前記合成転写因子は、前記レポーターの発現を調節する。
レポーター核酸は、合成転写因子によって結合できる調節エレメントと、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを最低限含む。レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる前記調節エレメントの下流である。前記合成転写因子は、前記レポーターの発現を調節する。
【0055】
ある実施形態では、レポーターをコードするヌクレオチド配列は、レポーター遺伝子を含む。ある実施形態では、前記レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよび分泌型胎盤アルカリホスファターゼから選択されるレポーターをコードする。これらのレポータータンパク質は、特定の酵素活性についてアッセイできるか、あるいは蛍光レポーターの場合は、蛍光発光についてアッセイできる。ある実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはシアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を含む。
【0056】
ある実施形態では、レポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、固有の配列識別子（ＵＭＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、試験ポリペプチドに特有であり、前記試験ポリペプチドは、前記レポーター核酸によってコードされる。概して、前記ＵＭＩは、８ヌクレオチド長と２０ヌクレオチド長の間であるが、それを超える長さであってもよい。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長以上である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、８ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、９ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１０ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１１ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１２ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１３ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１４ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１６ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１７ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１８ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、１９ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、２０ヌクレオチド長である。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、２０ヌクレオチド長を超える。
【0057】
本明細書に記載の系は、合成転写因子結合を介してレポーター遺伝子の活性化を制御する多数の異なる調節配列を利用することができる。調節配列は、合成転写因子ポリペプチドによって結合できるものである。概して、調節配列は、ＵＭＩ、レポーター遺伝子、あるいはその両方の５’であるように構成される。ある実施形態では、調節配列は、合成転写因子によって結合できるＧａｌ４－、ＰＰＲ１－またはＬｅｘＡ－ＵＡＳを含む。
【0058】
ある実施形態では、前記レポーターは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型胎盤アルカリホスファターゼおよびＵＭＩを含む。ある実施形態では、前記ＵＭＩは、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型胎盤アルカリホスファターゼのレポーター核酸の５’にコードされる。ある実施形態では、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型胎盤アルカリホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、前記ＵＭＩの５’である。
【0059】
ＵＭＩの転写は、特定のリレー系とレポーターの関連性を示すので、ＵＭＩによって、同じアッセイ内で異なる転写リレー系の多重化が可能になる。ＵＭＩは、同じアッセイ内で異なる転写リレー系の多重決定が可能になるように十分な多様性が可能な任意の長さであってもよい。前記長さは、少なくとも１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００の転写リレー標的を分化させるのに十分でなければならない。ある実施形態では、前記異なる転写リレー系は、異なる細胞に存在する。ある実施形態では、前記異なる転写リレー系は、同じ細胞に存在する。
【0060】
レポーターエレメントは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、あるいはその両方をさらに含んでもよい。ＵＴＲは、レポーターエレメントとは異種であってもよい。
【0061】
レポーター活性化
レポーター分子の活性化は、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼタンパク質、β－グルクロニダーゼタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質、分泌型胎盤アルカリホスファターゼタンパク質を検出するために標準的なアッセイを使用して決定できる。概して、基質に対するタンパク質酵素活性に基づいて検出可能なシグナルが産生される酵素アッセイがある。例えば、ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼ基質が存在するときはルミノメーターによって測定できる。蛍光レポーターは、基質を必要とせず、シグナルは、蛍光顕微鏡法または蛍光プレートリーダによって測定できる。蛍光レポーターは、生細胞におけるレポーターの活性化を測定するのに特に有用である。
レポーター分子の活性化は、ルシフェラーゼタンパク質、β－ガラクトシダーゼタンパク質、β－グルクロニダーゼタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質、分泌型胎盤アルカリホスファターゼタンパク質を検出するために標準的なアッセイを使用して決定できる。概して、基質に対するタンパク質酵素活性に基づいて検出可能なシグナルが産生される酵素アッセイがある。例えば、ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼ基質が存在するときはルミノメーターによって測定できる。蛍光レポーターは、基質を必要とせず、シグナルは、蛍光顕微鏡法または蛍光プレートリーダによって測定できる。蛍光レポーターは、生細胞におけるレポーターの活性化を測定するのに特に有用である。
【0062】
レポーター分子が固有のＲＮＡ配列を含む実施形態では、レポーター活性化は、固有のＲＮＡ配列の配列決定を可能にする任意の好適な方法で、好ましくは、マルチプレックス法で配列決定を可能にする方法で測定できる。このような方法には、２４時間の間に少なくとも約１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００または１００，０００，０００のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基に関する情報を生成することができるスループットの高い配列決定方法が含まれる。ある実施形態では、次世代シーケンシング技術は、固有のＲＮＡ配列の配列を決定するために使用される。次世代シーケンシングは、パイロシーケンシング、合成による配列決定、１分子シーケンシング法、第２世代シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングなどの多数の種類のシーケンシングを包含する。次世代シーケンシングプラットフォームには、ｌｌｌｕｍｉｎａ社（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）およびＨｅｌｉｃｏｓ社（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、すなわち「ＤＧＥ」）市販のものが含まれる。次世代シーケンシング法には、１）Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２００５） ４３７：３７６－３８０ （２００５）、ならびに米国特許第７，２４４，５５９号、第７，３３５，７６２号、第７，２１１，３９０号、第７，２４４，５６７号、第７，２６４，９２９号、第７，３２３，３０５号に記載の方法および機器が含まれるがこれらに限らない４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、２）米国特許仮出願第１１／１６７０４６号、ならびに米国特許第７５０１２４５号、第７４９１４９８号、第７，２７６，７２０号、ならびに米国特許出願公開第２００９００６１４３９号、第２００８００８７８２６号、第２００６０２８６５６６号、第２００６００２４７１１号、第２００６００２４６７８号、第２００８０２１３７７０号および第２００８０１０３０５８号に記載されるようなＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）、３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（例えばＳＯＬｉＤシーケンシング）、４）Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（例えばＰｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇ．００７シーケンシング）、５）米国特許第５，７５０，３４１号、第６，３０６，５９７号および第５，９６９，１１９号に記載されるようなｌｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．、ならびに６）米国特許第７，４６２，４５２号、第７，４７６，５０４号、第７，４０５，２８１号、第７，１７０，０５０号、第７，４６２，４６８号、第７，４７６，５０３号、第７，３１５，０１９号、第７，３０２，１４６号、第７，３１３，３０８号、ならびに、米国特許出願公開第２００９００２９３８５号、第２００９００６８６５５号、第２００９００２４３３１号および第２００８０２０６７６４号に記載されるようなＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販のものが含まれるが、これらに限らない。このような方法および機器は、例としてここに提示されているが、限定するように意図されていない。
【0063】
マーカー
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、選択ポリペプチドまたはマーキングポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、トランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。例えば、核酸は、抗生物質耐性から、ネオマイシン耐性／Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性、ゼオシン耐性またはブラストサイジン耐性に至るまでを付与する抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、細胞表面上に発現されるエピトープタグを含むポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。これによって、アフィニティー精製または細胞分取し、記載の核酸でトランスフェクトされた細胞を集めることを可能にする。ある実施形態では、エピトープタグは、ｃ－Ｍｙｃタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグ、Ｖ５タグまたはＦＬＡＧタグを含む。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、蛍光ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるプロモーターレス遺伝子をさらに含む。このような遺伝子は、特定の位置またはランディングパッドにトランスフェクションが組み込まれるように意図され、標的化される場合に有用である。これらの場合、細胞ゲノムの「ランディングパッド」は、プロモーターレス遺伝子のプロモーターの不足を補うことができ、かつ、意図したゲノム位置に組み込まれた場合のみにプロモーターレス遺伝子の発現をもたらすことができるプロモーターを含む。正しい組み込みの細胞は、フローサイトメトリーと細胞分取によって選択できる。この種類のマーカーはまた、確実に、意図した核酸の単一のコピーのみがゲノムに組み込まれるようにし、異所性過剰発現を回避するのに役立つことができる。ある実施形態では、ベイトポリペプチドをコードする核酸は、トランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子、細胞表面上に発現されるエピトープタグを含むポリペプチドをコードする遺伝子、または蛍光ポリペプチドをコードするプロモーターレス遺伝子を含む。
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、選択ポリペプチドまたはマーキングポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、トランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。例えば、核酸は、抗生物質耐性から、ネオマイシン耐性／Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性、ゼオシン耐性またはブラストサイジン耐性に至るまでを付与する抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、細胞表面上に発現されるエピトープタグを含むポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる遺伝子をさらに含む。これによって、アフィニティー精製または細胞分取し、記載の核酸でトランスフェクトされた細胞を集めることを可能にする。ある実施形態では、エピトープタグは、ｃ－Ｍｙｃタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグ、Ｖ５タグまたはＦＬＡＧタグを含む。ある実施形態では、本明細書に記載の核酸は、蛍光ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるプロモーターレス遺伝子をさらに含む。このような遺伝子は、特定の位置またはランディングパッドにトランスフェクションが組み込まれるように意図され、標的化される場合に有用である。これらの場合、細胞ゲノムの「ランディングパッド」は、プロモーターレス遺伝子のプロモーターの不足を補うことができ、かつ、意図したゲノム位置に組み込まれた場合のみにプロモーターレス遺伝子の発現をもたらすことができるプロモーターを含む。正しい組み込みの細胞は、フローサイトメトリーと細胞分取によって選択できる。この種類のマーカーはまた、確実に、意図した核酸の単一のコピーのみがゲノムに組み込まれるようにし、異所性過剰発現を回避するのに役立つことができる。ある実施形態では、ベイトポリペプチドをコードする核酸は、トランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子、細胞表面上に発現されるエピトープタグを含むポリペプチドをコードする遺伝子、または蛍光ポリペプチドをコードするプロモーターレス遺伝子を含む。
【0064】
細胞
本明細書に記載の方法において有用な細胞は、概して、合成転写因子およびレポーターエレメントをコードする１つ以上の外因性の核酸をトランスジェニックに容易に付与できるものである。合成転写因子およびレポーターエレメントをコードする系の核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂肪系トランスフェクション（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００（商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤ）、エレクトロポレーションまたはウイルス形質導入などの当技術分野において既知の方法を使用して好適な細胞株にトランスフェクトまたは形質導入できる。細胞はまた、適切な組織培養容器でコンフルエントまたはほぼコンフルエントになるまで増殖させられた同じ種類の細胞集団であってもよい。
本明細書に記載の方法において有用な細胞は、概して、合成転写因子およびレポーターエレメントをコードする１つ以上の外因性の核酸をトランスジェニックに容易に付与できるものである。合成転写因子およびレポーターエレメントをコードする系の核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂肪系トランスフェクション（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－３０００（商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤ）、エレクトロポレーションまたはウイルス形質導入などの当技術分野において既知の方法を使用して好適な細胞株にトランスフェクトまたは形質導入できる。細胞はまた、適切な組織培養容器でコンフルエントまたはほぼコンフルエントになるまで増殖させられた同じ種類の細胞集団であってもよい。
【0065】
ある実施形態では、使用される細胞は、合成転写因子をコードする核酸、レポーターエレメントを含む核酸、あるいはその両方のいずれかの核酸の安定した組み込みを含む。安定した細胞株は、直鎖状プラスミドの無作為組み込み、ウイルス組み込みあるいはトランスポゾン指向型組み込み、または指向型組み込みを使用して、例えば、ＡｔｔＰとＡｔｔＢとの部位間での部位特異的組み換えを使用して生成できる。ある実施形態では、核酸のいずれかは、ＡＡＶＳ１部位などの安全な着地部位にコードされる。
【0066】
ある実施形態では、系で使用される細胞または細胞集団は、真核細胞である。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、哺乳動物細胞である。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒト細胞である。ある実施形態では、細胞または細胞集団は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞癌）、Ｈｅｐ Ｇ２（ヒト白色人肝細胞癌）、２９３（ＨＥＫ ２９３としても知られる）（ヒト胎児腎）、ＲＡＷ ２６４．７（マウス単球マクロファージ）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部類上皮癌）、ＭＲＣ－５（ＰＤ １９）（ヒト胎児肺）、 Ａ２７８０（ヒト卵巣癌）、ＣＡＣＯ－２（ヒト白色人結腸腺癌）、ＴＨＰ １（ヒト単球性白血病）、Ａ５４９（ヒト白色人肺癌）、ＭＲＣ－５（ＰＤ ３０）（ヒト胎児肺）、ＭＣＦ７（ヒト白色人乳腺癌）、ＳＮＬ ７６／７（マウス細胞株ＳＩＭ胚線維芽細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウスＣ３Ｈ筋芽細胞）、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１（ヒト白血病性Ｔ細胞リンパ芽球）、Ｕ９３７（ヒト白色人組織球性リンパ腫）、Ｌ９２９（マウスＣ３Ｈ／Ａｎ結合組織）、３Ｔ３ Ｌ１（マウス胚）、ＨＬ６０（ヒト白色人骨髄性白血病）、ＰＣ－１２（ラット副腎褐色細胞腫）、ＨＴ２９（ヒト白色人結腸腺癌）、ＯＥ３３（ヒト白色人食道癌）、ＯＥ１９（ヒト白色人食道癌）、ＮＩＨ ３Ｔ３（マウススイスＮＩＨ胚）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト白色人乳腺癌）、Ｋ５６２（ヒト白色人慢性骨髄性白血病）、Ｕ－８７ ＭＧ（ヒト膠芽腫星細胞腫）、ＭＲＣ－５（ＰＤ ２５）（ヒト胎児肺）、Ａ２７８０ｃｉｓ（ヒト卵巣癌）、Ｂ９（マウスＢ細胞ハイブリドーマ）、ＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）、ＭＤＣＫ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、１３２１Ｎ１（ヒト脳星状細胞腫）、Ａ４３１（ヒト扁平上皮癌）、ＡＴＤＣ５（マウス１２９奇形癌ＡＴ８０５由来）、ＲＣＣ４ ＰＬＵＳ ＶＥＣＴＯＲ ＡＬＯＮＥ（ネオマイシン耐性を付与する空の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３で安定的にトランスフェクトさせた腎細胞癌細胞株ＲＣＣ４）、ＨＵＶＥＣ（Ｓ２００－０５ｎ）（プレスクリーニングされたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、新生児、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）、ＲＣＣ４ ＰＬＵＳ ＶＨＬ（ｐｃＤＮＡ３－ＶＨＬで安定的にトランスフェクトさせた腎細胞癌細胞株ＲＣＣ４）、Ｆａｏ（ラット肝細胞癌）、Ｊ７７４Ａ．１（マウスＢＡＬＢ／ｃ単球マクロファージ）、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（マウスＣ５７ＢＬ／６頭蓋冠）、Ｊ７７４．２（マウスＢＡＬＢ／ｃ単球マクロファージ）、ＰＮＴ１Ａ（ＳＶ４０で不死化させた思春期後のヒト正常前立腺）、Ｕ－２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）、ＨＣＴ １１６（ヒト大腸癌）、ＭＡ１０４（アフリカミドリザル腎臓）、ＢＥＡＳ－２Ｂ（ヒト正常気管支上皮）、ＮＢ２－１１（ラットリンパ腫）、ＢＨＫ ２１（クローン１３）（シリアンハムスター腎臓）、ＮＳ０（マウス骨髄腫）、Ｎｅｕｒｏ ２ａ（アルビノマウス神経芽細胞腫）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、マウス×マウス非産生性骨髄腫、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳腫瘍）、１３０１（ヒトＴ細胞白血病）、ＭＤＣＫ－ＩＩ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、ＰＮＴ２（ＳＶ４０で不死化させたヒト正常前立腺）、ＰＣ－３（ヒト白色人前立腺癌）、ＴＦ１（ヒト赤白血病）、ＣＯＳ－７（ＳＶ４０で形質転換させたアフリカミドリザル腎臓）、ＭＤＣＫ（コッカースパニエルイヌ腎臓）、ＨＵＶＥＣ（２００－０５ｎ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、新生児、ＮＣＩ－Ｈ３２２（ヒト白色人細気管支肺胞癌）、ＳＫ．Ｎ．ＳＨ（ヒト白色人神経芽細胞腫）、ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ（ヒト白色人前立腺癌）、ＯＥ２１（ヒト白色人食道扁平上皮癌）、ＰＳＮ１（ヒト膵臓腺癌）、ＩＳＨＩＫＡＷＡ（ヒトアジア人子宮内膜線癌）、ＭＦＥ－２８０（ヒト白色人子宮内膜腺癌）、ＭＧ－６３（ヒト骨肉腫）、ＲＫ １３（ＢＶＤＶ陰性ウサギ腎臓）、ＥｏＬ－１細胞（ヒト好酸球性白血病）、ＶＣａＰ（ヒト前立腺癌転移）、ｔｓＡ２０１（ＳＶ４０で形質転換させたヒト胚腎臓）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＴ １０８０（ヒト線維肉腫）、ＰＡＮＣ－１（ヒト白色人膵臓）、Ｓａｏｓ－２（ヒト原発性骨原性肉腫）、線維芽細胞増殖培地（１１６Ｋ－５００）、線維芽細胞増殖培地キット、ＮＤ７／２３（マウス神経芽細胞腫×ラットニューロンハイブリッド）、ＳＫ－ＯＶ－３（ヒト白色人卵巣腺癌）、ＣＯＶ４３４（ヒト卵巣顆粒膜腫瘍）、Ｈｅｐ ３Ｂ（ヒト肝細胞癌）、Ｖｅｒｏ（ＷＨＯ）（アフリカミドリザル腎臓）、Ｎｔｈｙ－ｏｒｉ ３－１（ヒト甲状腺濾胞上皮、Ｕ３７３ ＭＧ（ウプサラ）（ヒト膠芽腫星細胞腫）、Ａ３７５（ヒト悪性黒色腫）、ＡＧＳ（ヒト白色人胃腺癌）、ＣＡＫＩ ２（ヒト白色人腎細胞癌）、ＣＯＬＯ ２０５（ヒト白色人結腸腺癌）、ＣＯＲ－Ｌ２３（ヒト白色人肺大細胞癌）、ＩＭＲ ３２（ヒト白色人神経芽細胞腫）、ＱＴ ３５（日本ウズラ線維肉腫）、ＷＩ ３８（ヒト白色人胎児肺）、ＨＭＶＩＩ（ヒト膣悪性黒色腫）、ＨＴ５５（ヒト大腸癌）、ＴＫ６（ヒトリンパ芽球、チミジンキナーゼヘテロ接合体）、ＳＰ２／０－ＡＧ１４（ＡＣＦＲＥＥ）（非分泌性、無血清、動物成分（ＡＣ）不含マウス×マウスハイブリドーマ）、ＡＲ４２Ｊ、またはラット膵外分泌腫瘍、あるいはそれらの任意の組み合わせである。
【0067】
本明細書に記載の細胞および細胞株は、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸を含む。ある実施形態では、細胞株は、哺乳動物細胞株である。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターは、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列または血清応答エレメントヌクレオチド配列である。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターは、ＮＦＡＴ応答エレメント調節プロモーターである。ある実施形態では、細胞株は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸であって、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列の５’であり、前記合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子によって結合できる、レポーター核酸を含む。
【0068】
ある実施形態では、細胞株は、高い基礎レポーター活性を含む。ある実施形態では、高い基礎レポーター活性は、バックグラウンドより少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％大きく、バックグラウンドは、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである。このような比較のために、概して、コンパレータとして使用される細胞または細胞株は、レポーターを含む細胞株の親になる（例えば、レポーターを有するＨＥＫ２９３対レポーターを有さないＨＥＫ２９３）。
【0069】
ある実施形態では、細胞株は、高い基礎レポーター活性を含む。ある実施形態では、高い基礎レポーター活性は、バックグラウンドより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３２倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、５００倍、７５０倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍または２０，０００倍大きく、バックグラウンドは、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである。ある実施形態では、細胞株は、高い基礎レポーター活性を含む。ある実施形態では、高い基礎レポーター活性は、バックグラウンドより少なくとも約３０倍大きく、バックグラウンドは、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである。ある実施形態では、高い基礎レポーターは、バックグラウンドより少なくとも約３２倍大きく、バックグラウンドは、レポーターを含まない細胞または細胞株において観察されるレポーター活性レベルである。このような比較のために、概して、コンパレータとして使用される細胞または細胞株は、レポーターを含む細胞株の親になる（例えば、レポーターを有するＨＥＫ２９３対レポーターを有さないＨＥＫ２９３）。
【0070】
ある実施形態では、細胞株は、基礎レポーター活性において低い変動を含む。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．６未満の生体変動係数である。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．５未満の生体変動係数である。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．４未満の生体変動係数である。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．３未満の生体変動係数である。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．２未満の生体変動係数である。ある実施形態では、基礎レポーター活性における低い変動は、約０．１未満の生体変動係数である。
【0071】
理論に拘束されるわけではないが、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸であって、前記応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列は、前記合成転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列の５’である、転写因子核酸を含む少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つ以上のコピーを含むクローン細胞株を選択することによって、変動の低減と、高い基礎活性レベルとが得られる。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターは、ｃＡＭＰ応答エレメントヌクレオチド配列、ＮＦＡＴ転写因子応答エレメントヌクレオチド配列、ＦＯＳプロモーターヌクレオチド配列または血清応答エレメントヌクレオチド配列である。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターは、ＮＦＡＴ応答エレメント調節プロモーターである。ある実施形態では、細胞株は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸の１つのコピーのみを含む。ある実施形態では、細胞株は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸の２つのコピーのみを含む。ある実施形態では、細胞株は、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含み、組み込まれずに、あるいはエピソームの状態で維持されたレポーター核酸を含む。ある実施形態では、細胞株は、細胞シグナル伝達タンパク質のｃＤＮＡあるいはイントロンレスバージョンをコードする核酸をさらに含む。ある実施形態では、細胞シグナル伝達タンパク質は、ＧＰＣＲあるいはＧＰＣＲサブユニットである。
【0072】
ある実施形態では、細胞は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーメンバーをコードする核酸を含む。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、７回（パス）膜貫通型ドメイン受容体としても知られているが、リガンド結合細胞表面シグナル伝達タンパク質である。リガンドがＧＰＣＲに結合すると、ＧＰＣＲのコンホメーション変化を引き起こし、それによって、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として機能することが可能になる。ＧＰＣＲは、その後、ＧＴＰのためのＧタンパク質に結合したＧＤＰを変換することによって、附随Ｇタンパク質を活性化することができる。その後、Ｇタンパク質のαサブユニットは、結合したＧＴＰと共に、βサブユニットとγサブユニットから分離することができ、αサブユニットタイプ（Ｇαｓ、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、Ｇα１２／１３）に直接依存する細胞内シグナル伝達タンパク質または標的機能タンパク質にさらに影響を及ぼす。少なくとも約８００のＧＰＣＲがヒトゲノムにコードされており、これらは、大きくクラスＡ、ＢおよびＣに分けられ、本明細書の系に利用できる。ある実施形態では、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーメンバーをコードする核酸は、ゲノムに組み込まれることができる。ある実施形態では、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーメンバーをコードする核酸は、エピソームとして維持されることができる。
【0073】
ある実施形態では、細胞は、受容体チロシンキナーゼファミリーメンバーをコードする核酸を含む。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多数のポリペプチド増殖因子、サイトカインおよびホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。受容体チロシンキナーゼは、正常な細胞プロセスの主要な調節因子であるだけでなく、多数の種類の癌の発症と進行において重大な役割を持つことが示されてきた。ＲＴＫには、多数のクラスが存在し、そのいずれのメンバーも本明細書に記載の系で利用できる。ある実施形態では、ＲＴＫは、ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）（ＥｒｂＢファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＰＤＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＶ（ＶＥＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩ（ＣＣＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩＩ（ＮＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＶＩＩＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＩＸ（Ｅｐｈ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＶ（ＲＥＴ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶ（ＲＯＳ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶＩ（ＬＴＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＶＩＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）、ＲＴＫクラスＸＩＸ（ＬＭＲ受容体）またはＲＴＫクラスＸＸ（未決定）メンバーを含む。ある実施形態では、ＲＴＫファミリーメンバーをコードする核酸は、ゲノムに組み込まれることができる。ある実施形態では、ＲＴＫファミリーメンバーをコードする核酸は、エピソームとして維持されることができる。
【0074】
また、ＮＦＡＴ応答エレメントを含む哺乳動物細胞株が本明細書に記載されている。ある実施形態では、ＮＦＡＴ応答エレメントを含む哺乳動物細胞株は、ｃｂ２９を含む。
【0075】
また、ＮＦＡＴ応答エレメントを含む哺乳動物細胞株が本明細書に記載されている。ある実施形態では、ＮＦＡＴ応答エレメントを含む哺乳動物細胞株は、ｃｂ３７を含む。
【0076】
系の使用方法
本発明のポリヌクレオチド配列は、細胞にトランスフェクトされると利用できる。トランスフェクションは、リポフェクチンを含むがこれらに限らない様々なトランスフェクション剤、リン酸カルシウム沈澱、ウイルス形質導入またはエレクトロポレーションによって達成できる。トランスフェクションは、一過性のものであるか、あるいは安定的なものであってもよい。トランスフェクションが安定的なものである実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞は、後に使用するために凍結またはバンクできる。
本発明のポリヌクレオチド配列は、細胞にトランスフェクトされると利用できる。トランスフェクションは、リポフェクチンを含むがこれらに限らない様々なトランスフェクション剤、リン酸カルシウム沈澱、ウイルス形質導入またはエレクトロポレーションによって達成できる。トランスフェクションは、一過性のものであるか、あるいは安定的なものであってもよい。トランスフェクションが安定的なものである実施形態では、安定的にトランスフェクトされた細胞は、後に使用するために凍結またはバンクできる。
【0077】
ある実施形態では、単一の核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。ある実施形態では、１、２、３、４、５、１０または１００以上の核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。ある実施形態では、２つの核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。ある実施形態では、３つの核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。ある実施形態では、４つの核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。ある実施形態では、５つの核酸リレー系は、細胞集団にトランスフェクトされる。複数の核酸リレー系で細胞集団がトランスフェクトされるある実施形態では、前記複数の核酸リレー系は、異なる応答エレメント調節プロモーターを含む。前記複数の核酸リレー系が異なる応答エレメント調節プロモーターを含むある実施形態では、前記複数の核酸リレー系は、異なるレポーターを含む。ある実施形態では、前記異なるレポーターは、ＵＭＩを含む。
【0078】
本発明の核酸でトランスフェクトされた細胞集団は、任意の大きさであってもよい。ある実施形態では、細胞集団は、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００以上の細胞を含む。ある実施形態では、１つ以上の転写リレー系で少なくとも約１，０００以上の細胞がトランスフェクトされる。ある実施形態では、１つ以上の転写リレー系で少なくとも約１０，０００以上の細胞がトランスフェクトされる。ある実施形態では、１つ以上の転写リレー系で少なくとも約１００，０００以上の細胞がトランスフェクトされる。ある実施形態では、１つ以上の転写リレー系で少なくとも約１，０００，０００以上の細胞がトランスフェクトされる。ある実施形態では、１つ以上の転写リレー系で少なくとも約１０，０００，０００以上の細胞がトランスフェクトされる。
【0079】
ある実施形態では、本発明の核酸系は、マルチウェルプレート実験で利用できる。本発明の核酸リレー系に適合したマルチウェルプレートの非限定的な例には、６、１２、２４、４８、９６、３８４または１，５３６ウェルプレートが含まれる。ある実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、単一の転写リレー系でトランスフェクトされた細胞集団を含む。ある実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、複数の転写リレー系でトランスフェクトされた細胞集団を含む。ある実施形態では、各ウェルは、各細胞集団が単一の核酸リレー系でトランスフェクトされた複数の細胞集団を含む。ある実施形態では、各ウェルは、各細胞集団が複数の核酸リレー系でトランスフェクトされた複数の細胞集団を含む。
【0080】
ある実施形態では、本発明の転写リレー系でトランスフェクトされた細胞に試験剤が適用される。ある実施形態では、前記細胞に前記試験剤を接触させた後に、レポーター分子の転写の活性化レベルが測定される。ある実施形態では、前記検査剤は、化学物質、低分子、生体分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、またはそれらの任意の組み合わせである。ある実施形態では、細胞集団に単一の試験剤が適用される。ある実施形態では、細胞集団に複数の試験剤が適用される。
【0081】
ある実施形態では、本発明の転写リレー系は、試験剤に対するＧＰＣＲの反応を測定するように適合される。本発明の核酸系は、任意のＧＰＣＲ受容体と使用するように適合できる。ある実施形態では、前記転写リレー系は、ｃＡＭＰ応答エレメント調節プロモーターを利用することによって、ＧＰＣＲ受容体と使用するように適合される。ＧＰＣＲの非限定的な例には、５－ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ１１９、Ｇタンパク質共役型エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、ＬＰＡ受容体、Ｓ１Ｐ受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、神経ペプチドＦＦ／神経ペプチドＡＦ受容体、神経ペプチドＳ受容体、神経ペプチドＷ／神経ペプチドＢ受容体、神経ペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オプシン受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、 プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、サイロトロピン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体ファミリー、副甲状腺ホルモン受容体、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体、カルシウム感知受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、代謝型グルタミン酸受容体、味覚１受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体、接着クラスＧＰＣＲ、オーファン受容体、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【0082】
本発明の核酸は、当技術分野において一般的な多数のベクターに適合する。ベクターの非限定的な例には、ゲノム組み込み型ベクター、エピソーマルベクター、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、バクテリア人工染色体および酵母人工染色体が含まれる。本発明の核酸に適合するウイルスベクターの非限定的な例には、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス由来のベクターが含まれる。ある実施形態では、本発明の核酸は、ゲノム内の規定された位置または制限された部位のセットに部位特異的な組み込み（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組み換え）を指向する配列を含むベクターに存在する。
【0083】
ある実施形態では、本明細書に記載の転写リレー系は、単一のベクターに取り込まれる。ある実施形態では、前記単一のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある実施形態では、前記単一のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。
【0084】
ある実施形態では、前記転写リレー系は、２つのベクターにわたって分けられる。ある実施形態では、応答エレメント調節プロモーターヌクレオチド配列と、合成転写因子をコードするヌクレオチド配列とを含む転写因子核酸が、第１のベクターに取り込まれ、合成転写因子プロモーターヌクレオチド配列と、レポーターをコードするヌクレオチド配列とを含むレポーター核酸は、第２のベクターに取り込まれる。ある実施形態では、前記第１のベクターおよび前記第２のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある実施形態では、前記第１のベクターおよび前記第２のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。ある実施形態では、前記第１のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされ、前記第２のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされる。ある実施形態では、前記第１のベクターは、一過的に細胞にトランスフェクトされ、前記第２のベクターは、安定的に細胞にトランスフェクトされる。
【0085】
本明細書またはその一部に記載の転写リレー系を含むベクターは、多数の周知の分子生物学技術を使用して構成できる。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などを含むこのような多数のプロトコルの詳細のプロトコルは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１２） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １０ （“Ａｕｓｕｂｅｌ”）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ - Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （４ｔｈ Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０１２ （“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；およびＡｂｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （“Ａｂｅｌｓｏｎ”）に記載されている。
【実施例】
【0086】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の組成物および方法の代表的な実施形態であり、何ら限定することを意味するものではない。
【0087】
実施例１－ＣＲＥ活性化についてＧＰＣＲ受容体をスクリーニングする実施例
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、図１Ａおよび図１Ｂに構成されている核酸を含む転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞は、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与のＧＰＣＲとを含む。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、図１Ａおよび図１Ｂに構成されている核酸を含む転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞は、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与のＧＰＣＲとを含む。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
【0088】
１日目、９６ウェルアッセイプレートのＤＭＥＭに３５，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングする。２日目、培地を０．５％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭに交換する。３日目、培地を取り除き、２５ｕＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍに、所望の濃度の試験化合物を加える。約４時間後、培地を取り除き、ＲＮＡの抽出のためにｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに置き換える。ＲＮＡは、標準的な方法またはキットを使用して抽出し、その後、標準的なアッセイによって定量化する。その後、シーケンシングライブラリの調製後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑでＲＮＡシーケンスを実施する。
【0089】
実施例２－ＮＦＡＴ活性化についてＧＰＣＲ受容体をスクリーニングする実施例
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、図１Ａおよび図１Ｂに構成されている核酸を含む転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの核酸は、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞は、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与のＧＰＣＲとを含む。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、図１Ａおよび図１Ｂに構成されている核酸を含む転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの核酸は、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞は、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与のＧＰＣＲとを含む。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
【0090】
１日目、９６ウェルアッセイプレートのＤＭＥＭに３５，０００細胞／ウェルで細胞をプレーティングする。２日目、培地を０．５％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭに交換する。３日目、培地を取り除き、２５ｕＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍに、所望の濃度の試験化合物を加える。約４時間後、培地を取り除き、ＲＮＡの抽出のためにｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに置き換える。ＲＮＡは、標準的な方法またはキットを使用して抽出し、その後、標準的なアッセイによって定量化する。その後、シーケンシングライブラリの調製後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑでＲＮＡシーケンスを実施する。
【0091】
実施例３－複数のＧＰＣＲのＣＲＥ活性化についてＧＰＣＲ受容体をスクリーニングする実施例
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、各々が図１Ａおよび図１Ｂに構成されている複数の核酸を含む１００以上の転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの各核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの各核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞集団はそれぞれ、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与の単一のＧＰＣＲとを含む。各細胞集団が単一の固有のＧＰＣＲをコードする１００以上の複数の細胞集団を一緒に混合して、混合細胞集団を形成する。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
この実施例では、ＧＰＣＲシグナル伝達を誘導する潜在的な化合物についてスクリーニングするために、各々が図１Ａおよび図１Ｂに構成されている複数の核酸を含む１００以上の転写リレー系を使用する。この実施例では、図１Ａの各核酸は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の活性化を含み、これは、結果として（Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインと、キメラ活性化ドメインＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａとを含む）合成転写因子Ｇａｌ４－ＶＰＲの発現をもたらす。図１Ｂの各核酸は、Ｇａｌ４－ＶＰＲ合成転写因子によって結合されて活性化できるプロモーターを含み、これは、結果としてルシフェラーゼ遺伝子と、ＵＭＩをコードする遺伝子とを含むレポーターエレメントの発現をもたらす。使用される細胞集団はそれぞれ、図１Ａおよび図１Ｂの系をコードする、安定的に組み込まれた核酸と、所与の単一のＧＰＣＲとを含む。各細胞集団が単一の固有のＧＰＣＲをコードする１００以上の複数の細胞集団を一緒に混合して、混合細胞集団を形成する。各ＵＭＩは、所与のＧＰＣＲに対応付けられ、ＣＲＥの発現が、特定のＧＰＣＲにマップされることを可能にする。これによって、アッセイの多重化が可能になる。
【0092】
１日目、９６ウェルアッセイプレートのＤＭＥＭに３５，０００細胞／ウェルで前記混合細胞集団をプレーティングする。２日目、培地を０．５％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭに交換する。３日目、培地を取り除き、２５ｕＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍに、所望の濃度の試験化合物を加える。約４時間後、培地を取り除き、ＲＮＡの抽出のためにｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに置き換える。ＲＮＡは、標準的な方法またはキットを使用して抽出し、その後、標準的なアッセイによって定量化する。その後、シーケンシングライブラリの調製後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑでＲＮＡシーケンスを実施する。
【0093】
実施例４－転写リレーを使用してレポーター産物を増幅する
この実施例の実験では、転写リレー系を使用すると、転写リレーを有さない系と比較して、ルシフェラーゼシグナルが増加し、ルシフェラーゼシグナルの変動係数が低下することを示す。半無作為に組み込まれたＣＲＥ－Ｇａｌ４－ＶＰＲの複数のコピーと共に、単一で組み込まれたＣＲＥ－ルシフェラーゼを保有するＨＥＫ２９３由来の細胞、または、単一で組み込まれたＵＡＳ－ルシフェラーゼを保有する細胞を、白色壁のポリ－Ｌ－リシンをコートした９６ウェルプレートの１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに３０，０００細胞／ウェルでプレーティングする。４５ｎｇのドキシサイクリンを有する５０μＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍを細胞の上に加えた。２４時間後に、ＤＭＳＯを加えた。表示された期間にわたって、細胞をＤＭＳＯで処理した。表示されたインキュベーション時間の後に、培地を吸引して、３５μＬのＤＭＥＭと置き換え、そして、製造業者の説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット［Ｐｒｏｍｅｇａ］を使用して、細胞をアッセイした。半無作為に組み込まれたＣＲＥ－Ｇａｌ４－ＶＰＲの複数のコピーと共に、結果として生じる、単一で組み込まれたＣＲＥ－ルシフェラーゼを保有する細胞（灰色）と、単一で組み込まれたＵＡＳ－ルシフェラーゼを保有する細胞（黒色）のルシフェラーゼ活性化の発現を図２に示す。実験は技術的に３回繰り返して実施し、図３に各試料の変動係数を算出した。
この実施例の実験では、転写リレー系を使用すると、転写リレーを有さない系と比較して、ルシフェラーゼシグナルが増加し、ルシフェラーゼシグナルの変動係数が低下することを示す。半無作為に組み込まれたＣＲＥ－Ｇａｌ４－ＶＰＲの複数のコピーと共に、単一で組み込まれたＣＲＥ－ルシフェラーゼを保有するＨＥＫ２９３由来の細胞、または、単一で組み込まれたＵＡＳ－ルシフェラーゼを保有する細胞を、白色壁のポリ－Ｌ－リシンをコートした９６ウェルプレートの１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに３０，０００細胞／ウェルでプレーティングする。４５ｎｇのドキシサイクリンを有する５０μＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍを細胞の上に加えた。２４時間後に、ＤＭＳＯを加えた。表示された期間にわたって、細胞をＤＭＳＯで処理した。表示されたインキュベーション時間の後に、培地を吸引して、３５μＬのＤＭＥＭと置き換え、そして、製造業者の説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット［Ｐｒｏｍｅｇａ］を使用して、細胞をアッセイした。半無作為に組み込まれたＣＲＥ－Ｇａｌ４－ＶＰＲの複数のコピーと共に、結果として生じる、単一で組み込まれたＣＲＥ－ルシフェラーゼを保有する細胞（灰色）と、単一で組み込まれたＵＡＳ－ルシフェラーゼを保有する細胞（黒色）のルシフェラーゼ活性化の発現を図２に示す。実験は技術的に３回繰り返して実施し、図３に各試料の変動係数を算出した。
【0094】
実施例５－Ｇａｌ４－ＶＰＲのデグロンタグを使用して、転写リレーの誘導倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を増強する
この実施例の実験では、転写リレー系のＧａｌ４－ＶＰＲにデグロンタグを含むと、ルシフェラーゼシグナルの誘導倍率が増加することを示す。単一で組み込まれたＴＲＥ－ＣＨＲＭ３：：ＵＡＳ－ルシフェラーゼ二重遺伝子カセットと、多重に半無作為に組み込まれたＦＯＳ－Ｇａｌ４－ＶＰＲ－ＣＰ（デグロン）またはＦＯＳ－Ｇａｌ４－ＶＰＲ（デグロンなし）とを保有するＨＥＫ２９３由来の細胞を、白色壁のポリ－Ｌ－リシンをコートした９６ウェルプレートの１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに３０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。４５ｎｇのドキシサイクリンを有する５０μＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍを細胞の上に加えた。２４時間後に、８時間にわたって、細胞をＤＭＳＯまたは１μＭのカルバコールで処理した。表示されたインキュベーション時間の後に、培地を吸引して、３５μＬのＤＭＥＭと置き換え、そして、製造業者の説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット［Ｐｒｏｍｅｇａ］を使用して、細胞をアッセイした。結果としてもたらされる、カルバコールにおけるルシフェラーゼ活性対ＤＭＳＯにおけるルシフェラーゼ活性の比率を、図４にプロットする。
この実施例の実験では、転写リレー系のＧａｌ４－ＶＰＲにデグロンタグを含むと、ルシフェラーゼシグナルの誘導倍率が増加することを示す。単一で組み込まれたＴＲＥ－ＣＨＲＭ３：：ＵＡＳ－ルシフェラーゼ二重遺伝子カセットと、多重に半無作為に組み込まれたＦＯＳ－Ｇａｌ４－ＶＰＲ－ＣＰ（デグロン）またはＦＯＳ－Ｇａｌ４－ＶＰＲ（デグロンなし）とを保有するＨＥＫ２９３由来の細胞を、白色壁のポリ－Ｌ－リシンをコートした９６ウェルプレートの１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに３０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。４５ｎｇのドキシサイクリンを有する５０μＬのＯｐｔｉ－ｍｅｍを細胞の上に加えた。２４時間後に、８時間にわたって、細胞をＤＭＳＯまたは１μＭのカルバコールで処理した。表示されたインキュベーション時間の後に、培地を吸引して、３５μＬのＤＭＥＭと置き換え、そして、製造業者の説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット［Ｐｒｏｍｅｇａ］を使用して、細胞をアッセイした。結果としてもたらされる、カルバコールにおけるルシフェラーゼ活性対ＤＭＳＯにおけるルシフェラーゼ活性の比率を、図４にプロットする。
【0095】
実施例６－ＮＦＡＴ応答エレメントを含む細胞株
この実施例に記載の細胞株は、組み込まれたＮＦＡＴ－応答エレメント転写リレー（合成転写因子のＮＦＡＴプロモーター駆動転写）のコピーを有する。これらの細胞株は、コピー数および組み込み部位の面で異種の遺伝子プールとして生成した。このプールから、単一の細胞クローンを単離して拡張させた。これらの株をさらに使用して、ＧＰＣＲおよびＵＡＳ－ルシフェラーゼバーコードレポーターを組み込み、ＮＦＡＴシグナル伝達の多重化を検出する能力を試験した。これらの１０の細胞ライブラリから、コントロールアゴニストに対して、最も大きい数の明確なＧＰＣＲヒットを検出することができたものを２つ同定したが、これらは、図５に示しているように ｃｂ２９（クローンｃ７１３から構成されている）およびｃｂ３７（クローンｃ７０８から構成されている）である。
この実施例に記載の細胞株は、組み込まれたＮＦＡＴ－応答エレメント転写リレー（合成転写因子のＮＦＡＴプロモーター駆動転写）のコピーを有する。これらの細胞株は、コピー数および組み込み部位の面で異種の遺伝子プールとして生成した。このプールから、単一の細胞クローンを単離して拡張させた。これらの株をさらに使用して、ＧＰＣＲおよびＵＡＳ－ルシフェラーゼバーコードレポーターを組み込み、ＮＦＡＴシグナル伝達の多重化を検出する能力を試験した。これらの１０の細胞ライブラリから、コントロールアゴニストに対して、最も大きい数の明確なＧＰＣＲヒットを検出することができたものを２つ同定したが、これらは、図５に示しているように ｃｂ２９（クローンｃ７１３から構成されている）およびｃｂ３７（クローンｃ７０８から構成されている）である。
【0096】
重要なことに、これらの２つの細胞ライブラリを生じさせたアイソタイプの細胞株が、共通した２つの特性を共有していたことを見出した。第１に、これらの細胞株は、刺激されていない状態で最も多量のレポーター発現を示していた（図６「基礎活性－リバーストランスフェクション」を参照）。第２に、おそらく依存的に、対応する２つの細胞ライブラリは、最も低いレベルの変動を示していた（図６「ＢＣＶ」を参照）。
【0097】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更および置換を思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。
【0098】
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、発行済み特許、およびその他の文書は、個々の刊行物、特許出願、発行済み特許、またはその他の文書が具体的かつ個別に、その全体が参照により組み込まれると示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる文章に含まれている定義は、それらが本開示の定義に矛盾する程度で除外される。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】