特表 2022-536410 Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ培地製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-16

(54)【発明の名称】Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ培地製剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220808BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220808BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20220808BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220808BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 ZNA

A61P11/00

A61K39/02

A61P31/04 171

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021572872

(86)(22)【出願日】2020-06-05

(85)【翻訳文提出日】2022-02-01

(86)【国際出願番号】 US2020036297

(87)【国際公開番号】W WO2020251847

(87)【国際公開日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】62/859,294

(32)【優先日】2019-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516001834

【氏名又は名称】エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｅｌａｎｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】クマール，アービンド

(72)【発明者】

【氏名】ガンガイア，ダラネシュ・マヒマプラ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B065AA37X

4B065CA43

4C085AA03

4C085BA48

4C085CC07

4C085DD24

4C085EE01

4C085GG03

4C085GG05

(57)【要約】

本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖のためのブタ血清および動物（主にウシ脳および脊髄）由来成分を含まない培地製剤に関する。培地製剤は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ抗原性を保存するように合理的に設計される。これらの培地製剤中で増殖させたＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、ワクチン、特に多価ブタワクチンにおいて有用である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む組成物であって、
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメント（「ＭＧＳ」）である、組成物。

【請求項2】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａが、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、およびＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａが、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法であって、
Ｆｒｅｙ培地およびブタ脳心臓浸出物（ｐ－ＢＨＩ）培地からなる群から選択される基本培地と、
ウマ血清と、
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントと、を含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することを含む、方法。

【請求項5】

前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａが、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、およびＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａが、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記ウマ血清が約２．５％～約１０％ｖ／ｖで存在する、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記ウマ血清が約５％～約１０％ｖ／ｖで存在する、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記ウマ血清が約１０％ｖ／ｖで存在する、請求項４に記載の方法。

【請求項10】

前記ＭＧＳの構成成分が、
約０．５ｍｇ／Ｌの塩化コリン、
約０．０２５ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、
約０．０２５ｍｇ／Ｌのニコチン酸、
約０．１ｍＭのＬ－メチオニン、
約１．５ｍＭのＬ－システイン、
約０．１ｍＭのプトレシン二塩酸塩、
約０．０１ｍｇ／Ｌのチアミンピロリン酸、
約０．２８４ｍＭのＬ－アスコルビン酸ナトリウム、
約０．１ｍＭのスペルミン、
約０．０２５ｍｇ／Ｌのピリドキサール５’－リン酸一水和物、
約０．０５ｍｇ／Ｌのテトラヒドロ葉酸、
約０．０２５ｍｇ／Ｌの３’－デホスホ補酵素Ａ、および
約０．０１ｍｇ／Ｌのリボフラビン、の最終濃度で存在する、請求項４に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａが、３７℃で３～１５日間培養される、請求項４に記載の方法。

【請求項12】

免疫原性組成物の調製方法であって、
Ｆｒｅｙ培地およびブタ脳心臓浸出物（ｐ－ＢＨＩ）培地からなる群から選択される基本培地、ウマ血清、ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中でＭｙｃｏｐｌａｓｍａを培養することと、
前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを３７℃でインキュベートすることと、
前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを不活化することと、を含む、方法。

【請求項13】

前記Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを不活化することは、２－ブロモエチルアミンを用いて行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａによって引き起こされる疾患を予防、軽減、または緩和するための薬物の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭＧＳの使用。

【請求項15】

前記薬物が、ブタの治療のためである、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブタ血清を含まず、動物由来成分を最小限含むかまたは全く含まない培地製剤に関する。培地製剤は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、特にＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖に有用である。培地製剤は、抗原遺伝子発現を維持しながらＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖を最適化するように合理的に設計される。開示される培地製剤中で増殖させたＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、ブタワクチンにおける使用に適している。

【背景技術】

【0002】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、細胞壁を欠く小さなグラム陰性細菌であり、一般に非運動性であり、多くの場合、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、さらには植物に寄生性または病原性を示す。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ科内には多数のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種が分類されている。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは共生細菌であり得、哺乳動物の粘膜と関連して見出されることが多い。２つ以上のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種が、特定の粘膜表面にコロニーを形成し得る。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、特に免疫不全生物において、様々な病態の原因物質として関与してきた。場合によっては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの病原性は、ウイルスまたは他の細菌の存在と関連付けられ得る。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａはまた、二次感染病原体としても作用し得る。

【0003】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ関連疾患を制御、軽減または予防するために、効果的なワクチンが所望される。そのようなワクチンの抗原を生成するためにはＭｙｃｏｐｌａｓｍａの培養物が必要であるが、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの性質そのものが困難を呈する。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、自己複製する最小の非ウイルス生物であり、それに対応して小さなゲノムを含み、総遺伝子数は約１，０００に満たないと推定される。この限られたゲノムは、必須栄養素の産生に必要な多くの酵素を欠いているため、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、増殖のために宿主細胞因子または細胞培養サプリメントに依存する。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、多くの場合、グアニンおよびシトシンヌクレオシド、ならびにコレステロールまたは他の脂質の外部供給源を必要とする。したがって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、その環境の特徴を必然的に帯びるようになり、それによって抗原発現および免疫原性が変化するため、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを含有するワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの増殖に使用されるプロセスおよびサプリメントに応じて有効性が異なる。

【0004】

複数のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種がブタの疾患に関与してきた。Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅは、ブタに関節炎を引き起こすと考えられ、Ｍ．ｓｕｉｓは、貧血をもたらす可能性があり、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓは、特に若いブタにおいて、線維性多発性漿膜炎に寄与し得る。Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）は、流行性肺炎を引き起こし、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスおよびインフルエンザウイルスとともにブタ呼吸器病症候群（ＰＲＤＣ）の因子である。

【0005】

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ抗原が、例えば、ＰＲＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、および／もしくはブタサーコウイルス－２（ＰＣＶ－２）等の１つ以上の他の細菌またはウイルスと組み合わされた、多価ワクチンが望ましいことが多い。しかしながら、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、コレステロール等の供給源としてブタ血清中で増殖させた場合に抗原として最も有効であるが、血清は、他の病原体、特にＰＣＶ－２に対する免疫化を妨げる可能性のある抗体を含有する。抗ＰＣＶ２抗体を低減または排除するために、他者は、プロテインＡ／Ｇカラムによって抗体を除去している（例えば、米国特許第９，１２０，８５９号を参照されたい）が、これは労力を要し、かつコストがかかる。低血清培養系が開発されている（例えば、米国特許第９，２７３，２８１号を参照されたい）が、これらは汚染真核細胞因子を含む場合があり、そのようにして培養されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａは最適な免疫原性を有しない場合がある。

【0006】

必要とされているのは、増殖が最適化されるが、汚染物質が低減または排除され、かつ免疫原性が維持される、改善されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法である。商業目的のために、方法は費用対効果が高く、容易に実施されるべきであり、かつ望ましくない汚染物質が制限されるべきである。本明細書に開示するのは、合理的に設計されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法、該方法を行うための培地製剤、および該方法を用いて調製されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａを含有するワクチンである。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む組成物を提供する。本組成物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメント（「ＭＧＳ」）として使用され得る。ＭＧＳを使用して増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、またはＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）であり得る。ＭＧＳを使用して増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり得る。ＭＧＳを使用して増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、ブタ動物、組織、もしくは細胞内またはその上で増殖することができる任意のＭｙｃｏｐｌａｓｍａであり得る。ＭＧＳの構成成分は、約０．５ｍｇ／Ｌの塩化コリン、約０．０２５ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、約０．０２５ｍｇ／Ｌのニコチン酸、約０．１ｍＭのＬ－メチオニン、約１．５ｍＭのＬ－システイン、約０．１ｍＭのプトレシン二塩酸塩、約０．０１ｍｇ／Ｌのチアミンピロリン酸、約０．２８４ｍＭのＬ－アスコルビン酸ナトリウム、約０．１ｍＭのスペルミン、約０．０２５ｍｇ／Ｌのピリドキサール５’－リン酸一水和物、約０．０５ｍｇ／Ｌのテトラヒドロ葉酸、約０．０２５ｍｇ／Ｌの３’－デホスホ補酵素Ａ、および約０．０１ｍｇ／Ｌのリボフラビンの最終濃度で完全増殖培地中に存在し得る。

【0008】

本発明は、基本培地、ウマ血清、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することを含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法を提供する。基本培地は、Ｆｒｅｙ培地およびブタ脳心臓浸出物（ｐ－ＢＨＩ）培地から選択される。ＭＧＳは、塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む。ＭＧＳの構成成分は、約０．５ｍｇ／Ｌの塩化コリン、約０．０２５ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、約０．０２５ｍｇ／Ｌのニコチン酸、約０．１ｍＭのＬ－メチオニン、約１．５ｍＭのＬ－システイン、約０．１ｍＭのプトレシン二塩酸塩、約０．０１ｍｇ／Ｌのチアミンピロリン酸、約０．２８４ｍＭのＬ－アスコルビン酸ナトリウム、約０．１ｍＭのスペルミン、約０．０２５ｍｇ／Ｌのピリドキサール５’－リン酸一水和物、約０．０５ｍｇ／Ｌのテトラヒドロ葉酸、約０．０２５ｍｇ／Ｌの３’－デホスホ補酵素Ａ、および約０．０１ｍｇ／Ｌのリボフラビンの最終濃度で完全増殖培地中に存在し得る。

【0009】

本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法を提供し、該方法を用いて増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、ブタ動物、組織、もしくは細胞内またはその上で増殖することができる任意のＭｙｃｏｐｌａｓｍａであり得る。本方法を用いて増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、またはＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）であり得る。本方法を用いて増殖されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり得る

【0010】

本発明は、基本培地、ウマ血清、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することを含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法を提供する。ウマ血清は、約２．５％～約１０％ｖ／ｖで完全培地中に存在し得る。ウマ血清は、約５％～約１０％ｖ／ｖで完全培地中に存在し得る。ウマ血清は、約１０％ｖ／ｖで完全培地中に存在し得る。ウマ血清は、約２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％で完全培地中に存在し得る。

【0011】

本発明は、基本培地、ウマ血清、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することと、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを３７℃で３～１５日間培養することと、を含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法を提供する。本発明は、基本培地、ウマ血清、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することと、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを３７℃で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間培養することと、を含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法を提供する。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養は、軌道振盪も含み得る。

【0012】

本発明は、基本培地、ウマ血清、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメントを含む培地中にＭｙｃｏｐｌａｓｍａを配置することと、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを３７℃でインキュベートすることと、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａを不活化することと、を含む、免疫原性組成物の調製方法を提供する。基本培地は、Ｆｒｅｙ培地およびブタ脳心臓浸出物（ｐ－ＢＨＩ）培地から選択される。ＭＧＳは、塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む。ウマ血清は、約２．５％～約１０％ｖ／ｖで完全培地中に存在し得る。免疫原性組成物に含まれるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、ブタ動物、組織、もしくは細胞内またはその上で増殖することができる任意のＭｙｃｏｐｌａｓｍａであり得る。免疫原性組成物に含まれるＭｙｃｏｐｌａｓｍａは、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、またはＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）であり得る。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、２－ブロモエチルアミンで不活化され得る。

【0013】

本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａによって引き起こされる疾患を予防、軽減、または緩和するための薬物の製造におけるＭＧＳの使用を提供する。ＭＧＳは、塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む。薬物は、免疫原性組成物またはワクチンであり得る。薬物は、ヒトおよびブタを含む非ヒト動物の治療に有用であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】示される培地製剤中でのＭｈｐの３日間培養物の全規模ＣＣＵアッセイの結果。データは、Ａｃｕｔｏｎｅを含有する３つの製剤が１つの実験にのみ含まれたことを除いて、３つの実験複製の平均を表す。

【図2】全規模ＣＣＵアッセイによって判定される、大規模発酵槽システム内の６つの異なる培地製剤中でのＭｈｐの増殖。０日目のＣＣＵレベルは、接種菌に基づいて推定される。

【図3】実験培地製剤中で増殖させたＭｈｐをワクチン接種し、次いで毒性のあるＭｈｐでチャレンジしたブタの肺病変スコア。総肺病変スコアリングは、頭腹側肺硬化（ＣＶＰＣ）法を用いて行われ、肺の別個の７つの葉（右頂端、右心臓、右尾側、左尾側、左心臓、左頂端、および中間）における肺病変パーセンテージの合計に、肺全体に寄与する各肺葉のおよその体積を乗じたものとして定義される総肺病変パーセンテージとして表される。市販のワクチンＦＯＳＴＥＲＡ（Ｚｏｅｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）は、陽性対照として提示されている。

【図4】ＥＬＩＳＡによって測定される、ワクチン接種したブタの血清中のＰＣＶ－２中和抗体価。ＥＬＩＳＡは、製造業者（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．）の推奨に従って、ＩＮＧＥＺＩＭ ＣＩＲＣＯ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキットを使用して行われた。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下の考察で使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、別途指定されない限り、１つ以上を包含すると理解されるべきである。

【0016】

本明細書で使用される場合、「Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ」は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ科内に分類される任意の種を指す。この用語は、単一の生物、または複数の生物を含有する培養物を意味し得る。この定義に特に含まれるのは、Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｍ．ｓｕｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｔｉｓ、およびＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｍｈｐ」）である。本明細書で使用される場合、「不活化された」Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは、宿主または培養物内でもはや複製することができない生物を意味する。不活化された生物は、殺傷または死滅させられたとみなされる。不活化は、タンパク質の化学的変化、細胞の構造の化学的もしくは物理的変化、または核酸の化学的もしくは物理的変化を含むが、これらに限定されない様々な方法によって達成され得る。

【0017】

本明細書で使用される場合、「Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメント」（「ＭＧＳ」）は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖に重要であると特定された構成成分の合理的に設計された組成物を意味する。構成成分の特定は、Ｍｈｐのゲノム解析に基づいている。ＭＧＳは、典型的には、完全培地の調製中に基本培地製剤に添加される濃縮溶液として調製される。本明細書に開示されるＭＧＳは、塩化コリン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、プトレシン二塩酸塩、チアミンピロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、スペルミン、ピリドキサール５’－リン酸一水和物、テトラヒドロ葉酸、３’－デホスホ補酵素、およびリボフラビンを含む。当業者は、これらの構成成分のいくつかの塩形態が交換可能であり得ることを認識するであろう。

【0018】

本明細書で使用される場合、「完全培地」は、示される生物または細胞の増殖に必要な有機因子を含む培養培地を指す。Ｍｈｐの場合、完全培地は、少なくとも基本培地、血清、およびＭＧＳを含む。「最終濃度」とは、完全培地中の示される構成成分の濃度を意味する。

【0019】

本明細書で使用される場合、「Ｆｒｅｙ」培地および「ブタ脳心臓浸出物」（「ｐ－ＢＨＩ」）培地は、表１１および表１２に特定される製剤を意味する。

【0020】

本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、動物に投与されたときに免疫応答を誘発する組成物である。免疫原性組成物は、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む。抗原は、生きているかもしくは不活化された全ウイルス、細菌、または他の病原体であり得る。抗原はまた、ウイルス、細菌、または他の病原体から単離、精製、または部分精製された抗原分子でもあってもよい。抗原は、ポリペプチド、多糖、核酸、もしくは脂質、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0021】

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物に投与された場合に、疾患の症状からの保護、症状に対する耐性、症状の予防、または症状の軽減を付与する免疫原生組成物であり、該症状は、病原性生物、例えば、細菌、より具体的にはＭｙｃｏｐｌａｓｍａによって引き起こされる。

【0022】

本明細書で使用される場合、「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、偶蹄類イノシシ科内のＳｕｓ属の動物のいずれかであるブタを指す。

【0023】

「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。本明細書で使用される場合、「約」は、その用語が関連付けられた値の±１０％の変動を包含することを意味する。

【0024】

本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、既存の症状、障害、状態、もしくは疾患の進行または重症度を抑制、減速、停止、軽減、改善、または逆転させることを含む。治療は、予防的または治療的に適用され得る。

【0025】

以下の実施例は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養に有用な材料およびそのように培養されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａの使用を含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの培養方法の例示である。他の実施形態および使用が当業者には明らかであり、本発明がこれらの特定の例示的な実施例または好ましい実施形態に限定されないことが理解されるであろう。

【0026】

本明細書に提示される試験の目的は、ブタ血清を含まず、ウシの脳心臓浸出物（または可能であれば任意の動物成分）を含まない培地中で、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを成功裏に増殖させることができるかどうかを判定することである。最も成功した製剤は、次いで、動物における有効性試験の材料を生成するために使用される。新しい培地製剤の成功を評価するための主要な応答変数は、色調変化単位（ＣＣＵ）アッセイによって推定される生存細胞数であった。最も有望な製剤中で増殖させた細胞のプロテオミクス分析を行い、ブタ血清の不在が、細胞の抗原特性を低下させ、ワクチン製品の免疫原性効果を低下させる可能性がある細胞のタンパク質発現プロファイルを著しく変化させたかどうかを判定する。

【0027】

別途記載されない限り、与えられるすべてのパーセンテージは、体積当たりの体積（ｖ／ｖ）である。

【0028】

実施例１
本試験の目的は、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｈｐ）株の同一性を確認し、さらなる実験のための作業用ストックを確立することである。

【0029】

ＧＬ７１３と称されるＭｈｐの北米株（ＰＮＥＵＭＯＳＴＡＲ ＭＹＣＯの有効成分）を使用して作業用ストックを確立する。実施例１、４、および５では、ＧＬ７１３のＸ＋４継代の０．５ｍＬアリコートを使用して、１０％ブタ血清（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０９０８．０４）を含有する２５ｍＬのＦｒｉｉｓ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）をバッフル付きの非通気性ポリカーボネートフラスコ（１２５ｍＬ）に接種する。３日間３７℃で軌道撹拌（１００ｒｐｍ）した後、１２．５ｍＬの培養物を使用して、１０％ブタ血清を含有する１００ｍＬのＦｒｉｉｓ培地を５００ｍＬフラスコに接種する。３日後、１０％ブタ血清とともに２０％グリセロールを含有する１００ｍＬのＦｒｉｉｓ培地を培養物に添加し、混合した。混合物を等分し（１ｍＬ）、－８０℃で凍結させてＸ＋５作業用シードを確立する。提示される試験の過程において、Ｍｈｐ培養物を３～４日ごとに１０％ブタ血清を含有する新鮮なＦｒｉｉｓ培地に継代し、接種源を継代Ｘ＋６で維持する。

【0030】

ＧＬ７１３シードの同一性を確認するために、フェノール－クロロホルム法を用いてゲノムＤＮＡを単離する。単離されたゲノムの質および量を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびアガロースゲル電気泳動法を用いて評価する。アガロースゲル電気泳動法は、８ｋｂ超で流れるゲノムＤＮＡの存在を示す。ＮＡＮＯＤＲＯＰ分析は、７７．３ｎｇ／ｕＬのゲノムＤＮＡ収率を示す。

【0031】

ゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって分析し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の同一性を確認する。簡潔に述べると、２５ｕＬのＧＲＥＥＮＴＡＱ ＨＯＴ ＳＴＡＲＴ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｕＬのフォワードプライマー（５’ＧＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＣ３’、配列番号１）、１ｕＬのリバースプライマー（５’ＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＡＡＴ３’、配列番号２）、２０．０ｕＬのＨ_２Ｏ、および３ｕＬの単離されたゲノムＤＮＡを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ反応混合物を調製する。ＰＣＲ増幅のために、９５℃の初期変性温度を３分間行い、次いで、９５℃の変性温度で３０秒間、６０℃のアニーリング温度で３０秒間、および７２℃の伸長温度で１分間を３５サイクル行う。最終的な伸長ステップは、７２℃で１０分間行われる。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＰＣＲ産物の質および量を、ＮＡＮＯＤＲＯＰおよびアガロースゲル電気泳動法を用いて評価した。ＰＣＲ増幅の結果は、約１６００ｂｐのＰＣＲ産物を示すが、予想されたサイズと相関するのは１５０３ｂｐである。

【0032】

精製したＰＣＲ産物を希釈し、プライマーと混合して、配列決定用の予め混合した試料（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を作製する。ＰＣＲ産物は、両端から配列決定される（すなわち、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を使用する）。配列決定後、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して結果を分析し、ＧＬ７１３ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列がＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ２３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１７３３２）と９９％同一であることが確認される。

【0033】

実施例２
これらの試験で使用するためのＧＬ７１３のストックを調製するために、ＧＬ７１３のＸ＋１継代の１ｍＬアリコートを使用して、１０％ブタ血清を含有する５０ｍＬのＦｒｉｉｓ培地を、２５０ｍＬのバッフル付き、非通気性ポリカーボネートフラスコに接種する。４日間３７℃で軌道撹拌（１００ｒｐｍ）した後、２０％グリセロールを含有するがブタ血清は含有しない１５ｍＬの新鮮なＦｒｉｉｓ基本培地を培養物に添加し、混合した。各１ｍＬのアリコートを－８０℃で凍結させて、Ｘ＋２プレプレマスターシードを確立する。１つのアリコートを使用して、１０％ブタ血清を含有する１００ｍＬのＦｒｉｉｓを各々含有する３×５００ｍＬのバッフル付きフラスコに接種する。培養物を３７℃で５日間、１００ｒｐｍで軌道振盪しながらインキュベートする。５日目に、３つのフラスコを合わせて３００ｍＬの培養物を得る。３００ｍＬの培養物を、２０％グリセロール（ブタ血清なし）を含有する３００ｍＬの新鮮なＦｒｉｉｓ基本培地と合わせ、－８０℃にて１．２５ｍＬアリコートで保存することによってＸ＋３のプレマスターシードを調製する。プレマスターシードは、全規模ＣＣＵアッセイを用いて生存率について試験し、好気性および嫌気性の両方の条件下、室温および３７℃の両方でインキュベートした血液寒天プレートを用いて無菌性について試験する。提示される試験の過程において、３～４日ごとに、１０％ブタ血清を含有する新鮮なＦｒｉｉｓ培地にＭｈｐ培養物を継代し、接種源を継代Ｘ＋４で維持する。

【0034】

Ｘ＋２プレプレマスターシードの全ゲノム配列決定を行って、ＧＬ７１３の同一性をさらに確認し、Ｍｈｐの潜在的な代謝／栄養能力または欠損を特定するための経路解析を容易にする。

【0035】

高分子量ゲノムＤＮＡは、フェノール－クロロホルム法を用いて単離する。単離されたゲノムの質および量を、ＮＡＮＯＤＲＯＰおよびアガロースゲル電気泳動法を用いて評価する。アガロースゲル電気泳動法は、８ｋｂ超で流れるゲノムＤＮＡの存在を示し、ＮＡＮＯＤＲＯＰ分析は、３７７．６ｎｇ／ｕＬのゲノムＤＮＡ収率を示す。単離されたＤＮＡは、ＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．（Ｗｈｅｅｌｉｎｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって配列決定される。配列決定の後、コンティグに注釈を付け、ＢＬＡＳＴによって同一性について分析する。

【0036】

ＧＬ７１３の配列決定は、ペアエンドシーケンシングによる３８，４１０，８９７の生リード、およびメイトペアシーケンシングによる３，１０２，６８９のリードをもたらす。最終的なアセンブリにより５つのコンティグが明らかになる。ＧＬ７１３の推定ゲノムサイズは８６２，８３８ｂｐである。ＢＬＡＳＴ分析は、ＧＬ７１３のゲノム配列がＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ２３２と９９％同一であることを示す。

【0037】

実施例３
本試験の目的は、代謝経路解析を通じてＭｈｐの主要な代謝要件を特定することである。実施例２のＧＬ７１３およびＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ２３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１７３３２）のゲノム配列を、以下の４つのアプローチを用いて分析する：
バイオインフォマティクス的に、ＭｈｐゲノムをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムおよびＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉゲノムと比較することにより経路を特定する、
Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＧＬ７１３ゲノムおよび２３２ゲノムを既存の代謝経路について手動でスキャンする、
経路情報を公開された文献（インシリコおよび実験研究の両方）から収集する、ならびに
他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種、特にヒトＭｙｃｏｐｌａｓｍａから予測される経路情報を、Ｍｈｐゲノム配列と比較する。

【0038】

この分析に基づくと、Ｍｈｐはアミノ酸の合成のための経路を含まないと考えられるが、膜内にいくつかのアミノ酸およびペプチドトランスポーターが存在する。したがって、Ｍｈｐは、アミノ酸および／またはペプチドの外部供給源を絶対的に必要とする。

【0039】

Ｍｈｐは、脂質を合成する能力が限られており、識別可能な脂肪酸生合成経路を有しない。したがって、Ｍｈｐは、脂肪酸、グリセロール、グリセロホスホジエステル、およびコリンの外部供給源を絶対的に必要とする。コレステロールは、恐らく膜の安定性に必要とされ、細胞表面に吸着され得るが、コレステロールを利用する経路またはトランスポーターは特定されていない。

【0040】

Ｍｈｐは、ＤＮＡおよびＲＮＡ構築のためのプリンおよびピリミジンを新規に合成する能力を有しない。しかしながら、Ｍｈｐは、ペントースリン酸経路に供給されるＬ－アスコルビン酸塩を利用する経路を有するため、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成のためのホスホリボース前駆体を形成することができる。したがって、Ｍｈｐは、グアニン、アデニン、シチジン、ウラシル、およびチミジンの外部供給源、ならびにＬ－アスコルビン酸塩またはリボースのいずれかの外部供給源も必要とする。

【0041】

Ｍｈｐは、グルコースを利用するための完全な経路を有し、グルコースは好ましい炭素源であると考えられる。グルコースは解糖経路に入ってピルビン酸塩を生成し、ピルビン酸塩は、酢酸経路に入って最終生成物として酢酸を生成するか、または乳酸経路に入って最終生成物として乳酸を生成するかのいずれかである。解糖経路と酢酸経路の両方がＡＴＰを生成し、乳酸経路はＡＴＰ合成に必要なＮＡＤを再生する。ＣＣＵアッセイは、グルコースの乳酸への変換に基づいており、これはｐＨ変化をもたらし、その結果として培地中のフェノールレッドの色変化をもたらす。したがって、Ｍｈｐは、培地中のグルコースを必要とするが、代替の炭素源であるマンニトール、フルクトース、グリセロール、マンノース、Ｌ－アスコルビン酸塩も、Ｍｈｐが膜内のこれらすべての炭素源のトランスポーターを有するため、可能である。１つのグルコース源は、１～２ｍＭのグルコースを含有する血清であり得る。しかしながら、Ｍｈｐは、機能的ＴＣＡサイクルを有しないため、ＴＣＡサイクルおよび他のグルコース集約経路の欠如により、Ｅ．ｃｏｌｉのような高レベルのグルコースを必要としない。

【0042】

このようにして特徴付けられるすべてのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種のうち、Ｍｈｐのみがミオイノシトール異化経路を含むと考えられる。したがって、Ｍｈｐ中のミオイノシトールは、炭素源およびＣｏＡの前駆体として機能し得る。ミオイノシトールのトランスポーターは、Ｍｈｐ膜にも存在する。

【0043】

適切な代謝活性に必要な補因子の中でも、Ｍｈｐは、テトラヒドロ葉酸塩、４－ホスホパントテン、リボフラビン、ピリドキサール－５－リン酸、およびチアミンピロリン酸を合成する手段を有しないと考えられ、したがって、それらの外部供給源を必要とする。同様に、Ｍｈｐは、ポリアミン、スペルミン、およびプトレシンを合成する手段を有しないと考えられ、したがって、それらの外部供給源を必要とするが、これらの分子の膜組み込みトランスポーターがＭｈｐに存在する。他の潜在的な栄養必要量としては、Ｌ－システインおよびメチオニンが挙げられる。

【0044】

経路解析から得られた照合情報に基づいて、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメント（ＭＧＳ）と称されるサプリメントを設計する。このサプリメント中の成分およびその濃度を表１に記載する。照合された経路情報は、塩基培地および他の成分を選択するために用いることもでき、これらは以下の実施例において実験的に試験される。

【表1】

【0045】

実施例４
本試験の目的は、省略型のＣＣＵアッセイを用いて、以下の変数に応じてＭｈｐ ＧＬ７１３の増殖を評価することである。
１．基本培地：Ｖｅｇｅｔｏｎｅ浸出物ブロス（動物成分なし、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４１９６０）、ＡＦ Ｆｒｉｉｓ（動物成分なし、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ実験製剤、バッチ番号ＣＲＤ１７０８２）、ＡＦ ＰＰＬＯ（動物成分なし、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ実験製剤、バッチ番号ＣＲＤ１７０７９）、Ａｃｕｔｏｎｅ（動物成分なし、Ｎｅｏｇｅｎ／Ａｃｕｍｅｄｉａ、カタログ番号７７４２Ａ）、Ｆｒｉｉｓ（ウシ脳心臓浸出物含有；Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｆ０４８５）、ブタ脳心臓浸出物（ブタＢＨＩ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号ＢＤ２５６１２０）、およびＦｒｅｙ（膵臓ダイジェスト含有；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号２１２３４６）。これらの培地は、経路解析からの情報に基づいて、Ｍｈｐの基本的な栄養必要量を提供するように選択される。ワクチン製品の国際的登録を容易にするために、動物由来成分を含まない基本培地が含まれる。
２．血清源：ブタおよびウマ。以前は、ニワトリ、七面鳥、ウサギ等の他の血清源がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖のために用いられていたが、コスト分析により、これらの血清源が増殖培地のコストを増加させることが示されたため、試験されなかった。ウマ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ１１３８－５００ｍＬ）は、ブタ血清と同等のコストである。
３．ブタ血清レベル：１％、５％、および１０％。現在一般的な培地製剤であるＦｒｉｉｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｅｋｎｏｖａ）は、増殖のために１０％ブタ血清を使用する。Ｍｈｐがブタ血清の非存在下で増殖しない場合、培地中のブタ血清の減少が、Ｍｈｐ抗原調製物中の汚染抗体の下流除去を容易にし得る。
４．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ増殖サプリメント（ＭＧＳ）：１倍および２．５倍（表１）。
５．ミオイノシトール：１倍、２倍、および１０倍（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）。代謝経路解析により、Ｍｈｐがミオイノシチオール異化の完全な経路を含んでいることが明らかになり、ミオイノシトールがＭｈｐ増殖のエネルギー源として機能する可能性が示唆される。
６．Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ：経路解析に基づくと、Ｍｈｐはアミノ酸を合成することができず、アミノ酸およびペプチドのための膜トランスポーターをコードする遺伝子を含有する。ＤＩＦＣＯ ＳＥＬＥＣＴ ＰＨＹＴＯＮＥ ＵＦ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号２１０９３１）は動物由来成分を含まず、アミノ酸およびペプチドの豊富な供給源であるため、この栄養素の添加によってＭｈｐ増殖が促進される可能性がある。
７．酵母抽出物：酵母抽出物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、Ｍｈｐが増殖のために絶対的に必要とするペプチドおよびアミノ酸の豊富な供給源である。
８．ｐＨ：７．６および８．０。Ｗｏｄｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：６５３，２０１３）において、著者らは、Ｍｈｐが、ｐＨ７．５と比較して、ｐＨ８．０でより多くのグルコースを利用し、より多くのタンパク質を蓄積したことを示した。
９．卵黄抽出物：卵黄は、コレステロール、脂肪酸、およびアミノ酸の豊富な供給源である。以前は、卵黄抽出物（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を用いてＭｙｃｏｐｌａｓｍａを増殖させることに成功していた（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（６）：４９９－５０７，１９８５）。
１０．グルコース：１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、および４ｇ／Ｌ。一般に、血清は、約４ｇ／Ｌのグルコースを含有し、経路解析からの情報に基づいて、グルコースは、Ｍｈｐの主要な炭素源であると考えられる。したがって、特に血清が培地製剤に含まれない場合の、Ｍｈｐ増殖に対するグルコースの効果が試験される。
１１．グリセロール：Ｍｈｐは、炭素源および脂質生合成の前駆体の両方として機能することができるグリセロールの代謝経路を含む。Ｍｈｐ増殖に対するグリセロールの効果が試験される。

【0046】

これらの実験（実施例４および５）のための接種菌を調製するために、１０％ブタ血清を含有する１００ｍＬのＦｒｉｉｓを、２×１ｍＬの凍結Ｘ＋２ストックを含む５００ｍＬバッフル付きフラスコに接種する。完全なＣＣＵアッセイは非常に多くの労力および空間を要するため、Ｍｈｐを３日間増殖させ、次いで省略型のＣＣＵアッセイを用いて増殖を評価する。簡潔に述べると、被験試料を１０倍に連続希釈し、ボルテックスで混合し、３７℃で３日間インキュベートする。陰性対照として、少なくとも２本の未接種チューブが含まれる。増殖は、培地中のフェノールレッドの赤色から黄色への色変化をもたらすｐＨシフトによって示される。Ｍｈｐ増殖は、ｐＨシフトを引き起こす乳酸の蓄積と相関する。エンドポイント力価は、Ｍｈｐ増殖を示す最高希釈度（最終）によって示される。

【0047】

異なる変数を用いて、培地製剤の９ラウンドの試験を行う。ＣＣＵアッセイの結果は調製の３日後に得られる。したがって、ある場合には、前の実験の結果が分かる前に次の実験が設定される。培養物は、培養３日目の終わりに、血液寒天上で無菌性（すなわち、汚染）試験にも供される。

【表2】

【0048】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、培地のｐＨを８．０に調整することによって、ｐＨ７．６と比較してＭｈｐ増殖は増強されないこと、Ｖｅｇｅｔｏｎｅ浸出物ブロスおよびＳｅｌｅｃｔ ＰｈｙｔｏｎｅがＭｈｐ増殖を支持しないこと、ウマ血清がブタ血清の代わりになると考えられること、ならびにＭＧＳがＭｈｐ増殖を増強することである。

【表3】

【0049】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ミオイノシトールがＭｈｐ増殖を増強するとは考えられず、ブタ血清を含むＡｃｕｔｏｎｅ（動物成分なし）が対照よりも高い増殖を支持するということである。このラウンドの結果はまた、ウマ血清がブタ血清の代わりになり得ること、およびＭＧＳがＭｈｐ増殖を促進することを裏付ける。

【表4】

【0050】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、グルコースの添加がＭｈｐ増殖を増強するとは考えられず、ＭＧＳは、Ｆｒｉｓ基本培地を用いた増殖を増強するが、Ａｃｕｔｏｎｅ基本培地を用いた増殖は増強しないということである。

【表5】

【0051】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ミオイノシトール濃度を増加させることがＭｈｐ増殖を増強するとは考えられないということである。Ｍｈｐは、対照培地中よりもブタ血清を含むＡｃｕｔｏｎｅ中で良好に増殖するが、血清の非存在下、またはウマ血清の存在下では、ＡｃｕｔｏｎｅはＭｈｐ増殖を支持しない。

【表6】

【0052】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ＭＧＳは、Ｆｒｉｓ基本培地を用いた増殖を促進するが、Ａｃｕｔｏｎｅ基本培地を用いた増殖は促進しないということ、およびＡｃｕｔｏｎｅは、ブタ血清の非存在下ではＭｈｐ増殖を支持しないということである。

【表7】

【0053】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ブタ血清またはウマ血清を含むブタＢＨＩが、Ｍｈｐ増殖を支持する上でＦｒｉｉｓ培地と非常に類似した挙動を示すということである。

【表8】

【0054】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、特にＡｃｕｔｏｎｅおよびＰｏｒｃｉｎｅ ＢＨＩでは、ブタ血清のパーセンテージを１％に減少させることによりＭｈｐ増殖が妨げられる可能性があるということである。このラウンドの変数試験から導き出すことができる別の結論は、ブタ血清パーセンテージを５％に減少させることにより、Ｍｈｐ増殖を支持するためにＦｒｉｉｓ基本培地を用いた対照と非常に類似した挙動を示すが、５％ブタ血清は、ＡｃｕｔｏｎｅおよびＰｏｒｃｉｎｅ ＢＨＩを用いたＭｈｐ増殖を支持しないということである。このラウンドは、数回凍結および解凍したＭＧＳを用いて行われ、Ｍｈｐ増殖に対するＭＧＳの非効率的な影響を説明していることに留意されたい。

【表9】

【0055】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ＡＦ Ｆｒｉｉｓ培地は、ブタ血清の存在下で対照培地と同様にＭｈｐ増殖を支持するが、通常のＦｒｉｉｓ培地とは異なり、ＡＦ ＦｒｉｉｓおよびＡＦ ＰＰＬＯ培地は、ウマ血清および／またはＭＧＳを用いたＭｈｐ増殖を支持しないということである。

【表10】

【0056】

このラウンドの変数試験から導き出すことができる結論は、ＡＦ Ｆｒｉｉｓ培地は、ブタ血清の存在下では対照培地と同様にＭｈｐ増殖を支持するが、通常のＦｒｉｉｓ培地とは異なり、ＡＦ Ｆｒｉｉｓ培地は、ウマ血清、ＭＧＳ、および／または酵母抽出物を用いたＭｈｐ増殖を支持しないということである。

【0057】

実施例５
本試験の目的は、実施例４で特定された潜在的な培地製剤を、３つの独立した実験において全規模ＣＣＵアッセイを用いて確認することである。

【0058】

これらの実験のための接種菌を調製するために、１０％ブタ血清を含有する１００ｍＬのＦｒｉｉｓを、２×１ｍＬの凍結ストックを含む５００ｍＬバッフル付きフラスコに接種する。各実験培地製剤につき、２５ｍＬの培養物（最終体積）に、２０％（すなわち５ｍＬ）の３日齢培養物を播種する。Ｍｈｐを３日間増殖させ、次いで、３つの独立した実験複製を用いる全規模ＣＣＵアッセイを用いて増殖を評価する。全規模アッセイでは試料希釈液中のＭｈｐを３７℃で１４～１５日間増殖させることを除いて、全規模ＣＣＵアッセイは、省略型のアッセイ（実施例４）と同じ様式で実施される。培養物は、培養３日目の終わりに、血液寒天上で無菌性（すなわち、汚染）試験にも供される。

【0059】

１８種の異なる培地製剤を試験する：
製剤１：Ｆｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清＋ＭＧＳ
製剤２：変更後のブタ－ＢＨＩ＋１０％ブタ血清＋ＭＧＳ
製剤３：Ｆｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清
製剤４：変更後のブタＢＨＩ＋１０％ブタ血清
製剤５：Ｆｒｉｉｓ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ
製剤６：Ｆｒｉｉｓ＋１０％ウマ血清
製剤７：Ｆｒｅｙ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ
製剤８：変更後のブタＢＨＩ＋１０％ウマ血清
製剤９：Ｆｒｉｉｓ＋ＭＧＳ
製剤１０：Ｆｒｅｙ＋ＭＧＳ
製剤１１：変更後のブタＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ
製剤１２：Ｆｒｅｙ＋１０％ブタ血清
製剤１３：変更後のブタＢＨＩ＋ＭＧＳ
製剤１４：Ｆｒｅｙ＋１０％ウマ血清
製剤１５：Ａｃｕｔｏｎｅ＋１０％ブタ血清＋ＭＧＳ
製剤１６：Ｆｒｉｉｓ
製剤１７：Ａｃｕｔｏｎｅ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ
製剤１８：Ａｃｕｔｏｎｅ＋ＭＧＳ

【0060】

これらの実験では、ブタの脳／心臓浸出物（ブタＢＨＩ）が、表１１に示すように製造業者（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号ＢＤ２５６１２０）の指示から変更される。

【表11】

どちらのタイプにも０．０１ｇ／Ｌのフェノールレッドが含まれる。

【0061】

図１に示すように、製剤１７（Ａｃｕｔｏｎｅ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ）および製剤１８（Ａｃｕｔｏｎｅ＋ＭＧＳ）を除いて、製剤は、対照製剤であるＦｒｉｉｓ＋ブタ血清のＭｈｐ増殖に相当するＭｈｐ増殖を支持した。図には示されていないが試験された他の培地製剤としては、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＡＦ ＦｒｉｉｓおよびＡＦ ＰＰＬＯからの２つ以上の動物由来成分を含まない培地が挙げられる。これらの培地はまた、ブタ血清の非存在下ではＭｈｐ増殖を支持しなかった。血清またはＭＧＳを一切含まないＦｒｉｉｓ培地が、Ｍｈｐの増殖をかなり良好に指示したことは興味深いが、Ｆｒｉｉｓにはウシ脳浸出物が含まれており、国際的な製品登録には許容されない。また、図１には示されていないが、Ｍｈｐは、いずれかの血清またはＭＧＳを含まないｍ－ＢＨＩおよびＦｒｅｙ中では増殖不良である。

【0062】

Ｍｈｐ増殖を支持した１６の培地製剤のうち、Ｆｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清（対照、製剤３）、ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（製剤１１）、ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（毎日補充）、ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋ＭＧＳ（製剤１３）、Ｆｒｅｙ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（製剤７）、およびＦｒｅｙ＋ＭＧＳ（製剤１０）の５つの培地製剤を、大規模（フラスコ規模とは対照的に）発酵槽システムにおけるさらなる検証のために使用した。

【0063】

実施例６
本試験の目的は、フラスコ試験（実施例５）から選択された培地製剤を、商業的製造条件により近い大規模発酵槽システム（Ａｍｂｒ ２５０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）において比較することである。これらの実験で試験された変数は以下のとおりである。
１．基本培地：Ｆｒｉｉｓ（対照）、Ｆｒｅｙ、および変更後のブタ脳心臓浸出物（ｍ－Ｐ－ＢＨＩ）、
２．血清：１０％ブタ血清（対照）、１０％ウマ血清、または血清なし、ならびに
３．ＭＧＳ：毎日、または初期培養時にのみ補充される。

【0064】

この実験のための接種菌を調製するために、２５ｍＬの培養物に、３日間増殖させた０．５ｍＬの作業用ストックを接種する。この「前接種菌」２０ｍＬを、ＦｏａｍＡｗａｙ消泡剤（Ｇｉｂｃｏ、０．７５ｍｌ／Ｌ）を含む２００ｍＬのＦｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清に接種するために使用する。この接種菌を、１％（ｖ／ｖ）の比率で発酵槽に接種するために使用される前に、３７℃で３日間、１００ＲＰＭで軌道振盪しながらインキュベートする。

【0065】

６つの様々な培地製剤を試験する：
製剤１：Ｆｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清（対照）、
製剤２：ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ、
製剤３：ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（毎日補充）、
製剤４：ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋ＭＧＳ、
製剤５：Ｆｒｅｙ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ、および
製剤６：Ｆｒｅｙ＋ＭＧＳ。

【0066】

Ｍｈｐを６つの製剤のそれぞれにおいて４日間培養する。全規模ＣＣＵアッセイを毎日行う。３日目の終わりに、アリコートを採取し、血液寒天上で無菌性（すなわち、汚染）試験に供する。４日間培養の終わりに、実施例７に記載されるようなプロテオミクス分析のためにＭｈｐを収集する。

【0067】

図２に示すように、Ｆｒｅｙ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（製剤５）、ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（製剤２）、およびｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋１０％ウマ血清＋ＭＧＳ（毎日補充）（製剤３）におけるＭｈｐ増殖は、対照製剤１であるＦｒｉｉｓ＋１０％ブタ血清のＭｈｐ増殖と非常に類似している。しかしながら、ｍ－Ｐ－ＢＨＩ＋ＭＧＳおよびＦｒｅｙ＋ＭＧＳにおけるＭｈｐ増殖は、対照培地と比較して不良である。実施例５におけるフラスコ規模の試験との違いについて考えられる１つの説明は、選択された培地製剤がＭｈｐ増殖に与える極端な影響を識別するために、発酵槽試験が１％という非常に少ない接種菌で行われることである。

【0068】

実施例７
本試験の目的は、選択された培地製剤中のブタ血清および／または動物由来成分の不在が、細胞の抗原特性を低下させ、ワクチン製品の免疫原性効果を低下させる可能性があるＭｈｐの全体的なタンパク質プロファイルを著しく変化させるかどうかを判定することである。

【0069】

実施例６に記載の発酵槽培養物から約８０ｍＬを収集し、１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離する。細胞ペレットを１ｍＬの氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、次いで８Ｍの尿素、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０で１時間溶解させる。細胞溶解物は、プロテオミクス分析のためにＭＳＢｉｏＷｏｒｋｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）に提出される。

【0070】

選択された培地製剤中で増殖させたＭｈｐのタンパク質発現プロファイルは、Ｆｒｉｉｓ＋ブタ血清（対照）中で増殖させたＭｈｐのタンパク質発現プロファイルと非常に類似している。これらのデータは、選択された培地製剤中のブタ血清の不在が、Ｍｈｐのタンパク質発現プロファイルを変化させるとは考えられないことを示唆している。選択された培地製剤中で増殖させたＭｈｐは、Ｆｒｉｉｓ＋ブタ血清中で増殖させたＭｈｐと同様の免疫原性を保持し得るが、これは実験によって確認されるべきである。インビボでの免疫原性有効性のためにＭｈｐを増殖させるために使用される最終培地製剤の組成を表１２に記載する。

【表12】

どちらの基本培地にも０．０１ｇ／Ｌのフェノールレッドが含まれる。完全培地は、最大１０％の熱不活化ウマ血清（ＨＳ）および１倍ＭＧＳを含む（表１）。ＭＧＳは、１００倍溶液として調製し、さらなる使用のために－２０℃にてアリコートで保存するべきである。一旦解凍した後は、再使用のためにＭＧＳを凍結させるべきではない。

【0071】

実施例８
本試験の目的は、Ｍｈｐ（Ｘ＋３ストック）を最終培地製剤中で増殖させたときの、Ｍｈｐとブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ－２）ワクチンの組み合わせのＭｈｐ画分の有効性を評価することである。ワクチン接種－チャレンジ実験は、対照、無作為化、および単一盲検試験である。

【表13】

【表14】

【0072】

実験ワクチンを調製するために、Ｓｆ９ ＭＣＳ細胞（昆虫細胞株）においてバキュロウイルス発現系を使用してＰＣＶ２ウイルス様粒子を調製する。ＰＣＶ２抗原（５０μｇ／ｍｌの最終濃度）を含有する上清を、希釈剤対照または不活化Ｍｈｐと混合し、続いて、５０％～５０％の最終濃度でＷ／Ｏ／Ｗ製剤を添加する。

【0073】

実験Ｍｈｐワクチンは、以下の場合に有効であるとみなされる：（１）陰性対照（第１群）と比較して、治療群の平均肺硬化の減少が＞４０％であり、（２）ワクチン接種における緩和率が＞０．３５であり、（３）緩和率のより低い９５％信頼区間が＞０．２である。３～４週齢のブタでは、陰性対照動物におけるチャレンジ後の肺硬化は、肺の８～１５％（群平均応答）であると予想される。陽性ワクチンの影響は、対照と比較したワクチン接種の群平均応答の低下に等しい。ワクチン接種における肺病変の減少は、少なくとも４０％であるべきである。ワクチン接種群の動物から記録された肺硬化率を、毒性のあるＭｈｐでチャレンジした後の非ワクチン接種（陰性対照）群の動物から記録された肺硬化率と比較することによって、データセットを統計的有意性（両側ｐ＜０．０５）について試験する。チャレンジ材料は、対照培地中で増殖させたＧＬ７１３である。対照群（第７群）に対する治験ワクチン群（第１～５群）の緩和率および関連する９５％のより低い信頼区間（ＬＣＢ）が、肺硬化率について推定される。第６群は、陽性対照群として含まれる。

【0074】

実験の主要転帰は、剖検時に検査され、動物の肺全体の大きさのパーセンテージとして記録された、チャレンジ動物における肺硬化の量である。図３に示すように、予想されたとおり、ＰＣＶ－２抗原のみをワクチン接種した動物は、毒性のあるＭｈｐによるチャレンジから保護されない。Ｍｈｐをブタ－ＢＨＩ＋ＨＳ＋ＭＧＳ中で増殖させ、４ｍＭの最終濃度になるように２－ブロモエチルアミンを添加することによって不活化して、ワクチンに製剤化すると、Ｍｈｐ抗原は、ワクチンが皮内投与されるか筋肉内投与されるかにかかわらず、毒性のあるＭｈｐによるチャレンジからの保護を提供する。しかしながら、Ｆｒｅｙ基本培地＋ＨＳ＋ＭＧＳ中で増殖させたＭｈｐ由来の抗原は、筋肉内投与された場合にのみ有効である。３つの有効なＭｈｐワクチンは、陽性対照ワクチンと同様かまたはそれよりも優れた効力を示す。

【0075】

毎日の臨床観察結果を評価し、実験の副次的転帰として報告する。表１５．さらに、異なる実験ワクチンの免疫化部位の注射部位病変および肉質を剖検時に評価して、ベースラインの屠殺による中止データを確立する。

【表15】

【0076】

最終的な試験変数は、Ｍｈｐ抗原画分が、実験培地製剤中で増殖させた場合に、Ｍｈｐ抗原とＰＣＶ－２抗原を組み合わせたときのＰＣＶ－２抗原の免疫原性を妨げるかどうかを判定することである。図４に示すように、すべての実験ワクチンは、ブタに投与されたときに抗ＰＣＶ２抗体を誘発することができるが、皮内投与されたＭｈｐ（Ｆｒｅｙ）＋ＰＣＶ２は、この場合も最適以下の結果であった。第２～４群からのワクチン接種は、ＰＣＶ２対照、第１群と同等の様式で応答する。
配列表
配列番号１
Ｍｈｙｏ－ＰＣＲ－１６Ｓ－ｒＲＮＡフォワードプライマー
５’ＧＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＣＣ３’
配列番号２
Ｍｈｙｏ－ＰＣＲ－１６Ｓ－ｒＲＮＡリバースプライマー
５’ＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＡＡＴ３’

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】