特表 2022-536500 ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-17

(54)【発明の名称】ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20220809BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220809BHJP

   C12P 7/02 20060101ALI20220809BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53

C12N9/04 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P7/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021573488

(86)(22)【出願日】2019-06-13

(85)【翻訳文提出日】2021-12-10

(86)【国際出願番号】 CN2019091068

(87)【国際公開番号】W WO2020248186

(87)【国際公開日】2020-12-17

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519153006

【氏名又は名称】アシムケム ラボラトリーズ （ティエンジン） カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002066

【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ジェームス，ゲージ

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，イー

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ナー

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ，シュエチェン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，クージエン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，イーミン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050EE10

4B050FF01

4B050LL05

4B064AC17

4B064CA19

4B064CA21

4B064CB18

4B064CC24

4B064CD05

4B064CD30

4B064DA16

4B064DA20

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA28

4B065CA46

4B065CA60

(57)【要約】

ケトレダクターゼ突然変異体及びそれを用いたキラルアルコールの生産方法を提供する。該ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、突然変異の部位は、少なくとも、第６位、第２１位、第４２位、第５８位、第６１位、第７６位、第８７位、第９４位、第９６位、第１０８位、第１１３位、第１１７位、第１４４位、第１４６位、第１４７位、第１４９位、第１５１位、第１５２位、第１５６位、第１６５位、第１７７位、第１９８位の部位のうちの１つを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケトレダクターゼ突然変異体であって、
SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記突然変異の部位は、少なくとも、第６位、第２１位、第４２位、第５８位、第６１位、第７６位、第８７位、第９４位、第９６位、第１０８位、第１１３位、第１１７位、第１４４位、第１４６位、第１４７位、第１４９位、第１５１位、第１５２位、第１５６位、第１６５位、第１７７位、第１９８位、第１９９位、第２００位、第２０１位、第２０２位、第２２３位、第９６位、第２３７位及び第２３０位の部位のうちの１つを含む、ことを特徴とするケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項2】

前記ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記突然変異の部位は、少なくとも、E144T、E144V、E144A、L152F、L152R、L152A、L152V、E201A、及びD202Aの突然変異のうちの１つを含み、若しくは、前記ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列とは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項１に記載のケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項3】

SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記アミノ酸突然変異はE144Aを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項4】

前記アミノ酸突然変異はL152F又はL152Yをさらに含む、ことを特徴とする請求項３に記載のケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項5】

前記アミノ酸突然変異は、E144A+L152R、E144A+L152A、E144A+L152V、E144A+E201A、E144A+D202A、E144A+L152W、E144A+L152M、E144A+L152L、E144A+L152K、E144A+L152T、E144A+L152P、E144A+L152C、E144A+L152H、E144A+L152Q、E144A+L152E、E144A+L152S、E144A+L152G、E144A+F152C+G6S、E144A+L152C+L198Q+E201G及びE144A+L152C+L198Q+E201G+G6Sの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項３に記載のケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項6】

前記発生したアミノ酸突然変異は、E144A+L152F+A94E+S96M、E144A+L152F+A94S+S96Q、E144A+L152F+A94V、E144A+L152F+A94Y+S96E、E144A+L152F+A94S+S96N、E144A+L152F+A94S+S96R、E144A+L152F+A94A+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96K、E144A+L152F+A94R+S96K、E144A+L152F+A94S+S96A、E144A+L152F+A94V+S96Q、E144A+L152F+A94A+S96G、E144A+L152F+A94S+S96T、E144A+L152F+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96L、E144A+L152F+S96D、E144A+L152F+A94E+S96A、E144A+L152F+A94T+S96Y、E144A+L152F+A94S、E144A+L152F+A94E+S96C、E144A+L152F+L198V、E144A+L152F+L198V+E201C、E144A+L152F+L198I+E201I、E144A+L152F+L198V+E201A、E144A+L152F+L198V+E201N、E144A+L152F+L198V+E201L、E144A+L152F+L198Q+E201G、E144A+L152F+L198V+E201S、E144A+L152F+L198H+E201G、E144A+L152F+L198I+E201V、E144A+L152F+L198V+E201G、E144A+L152F+L198Y+E201L、E144A+L152F+L198V+E201F、E144A+L152F+L198S+E201Y、E144A+L152F+G6S、E144A+L152F+R₁08H、E144A+L152F+G117S、E144A+L152F+I223V、E144A+L152F+G6S+R₁08H、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V、E144A+L152F+I223V+G6S、E144A+L152F+I223V+R₁08H、E144A+L152F+R₁08H+G117S、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+R₁08H、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S、E144A+F152Y+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146C+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146G+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146H+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146N+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146T+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146D+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147C、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146S+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146A+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S+G148G+D149V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D149I、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+M151R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+Q76L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+I113F、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+N156S+K237E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+F165Y+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K61E+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A21V+A58T+S96N、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A87V、及びE144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+M146K+Y230Fの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項４に記載のケトレダクターゼ突然変異体。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ突然変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。

【請求項8】

請求項７に記載のＤＮＡ分子が連結されている、ことを特徴とする組換えプラスミド。

【請求項9】

pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である、ことを特徴とする請求項８に記載の組換えプラスミド。

【請求項10】

請求項８又は９に記載の組換えプラスミドを含有する、ことを特徴とする宿主細胞。

【請求項11】

原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、前記原核細胞は大腸菌である、ことを特徴とする請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産するステップを含むキラルアルコールの生産方法であって、
前記ケトレダクターゼは、請求項１～６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ突然変異体である、ことを特徴とするキラルアルコールの生産方法。

【請求項13】

前記キラルケトン系化合物は、構造式

を有し、式中、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂はカルボニル基上の炭素とともに複素環式基、炭素環式基又はヘテロアリール基を形成し、前記複素環式基及びヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記アリール基のうちのアリール基、ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、炭素環式基のうちの炭素環式基又は複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、Ｃ₁～Ｃ₈アルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀シクロアルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂は、カルボニル基上の炭素とともにＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ₅～Ｃ₁₀複素環式基及びＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基のうちのアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、前記ケトン系化合物の構造は、

であり、式中、Ｒ₃はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₄はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₅はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ₃、ＯＣＨ₃又はＣＨ₂ＣＨ₃であり、
より好ましくは、前記ケトン系化合物は

である、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ケトレダクターゼを用いてケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記反応系において、前記ケトン系化合物の濃度が１g/L～２００g/Lである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記反応系のｐＨ値が５～９であり、前記反応系の反応温度が４℃～６０℃である、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記補酵素はＮＡＤＨである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記補酵素再生系は、イソプロパノール、補酵素ＮＡＤ⁺、及びケトレダクターゼを含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、化合物合成の技術分野に関し、具体的には、ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

キラルアルコールは、自然界に広く存在し、多くの重要な生物活性分子の構造単位であり、天然産物とキラル医薬品を合成する重要な中間体である。多くのキラル医薬品は、１つ又は複数のキラル中心を含み、異なるキラル医薬品の薬理学的活性、代謝過程、代謝速度及び毒性には顕著な差異があり、通常、１つのエナンチオマーは、有効であり、別のエナンチオマーは、効果が低く又は無効であり、さらに有毒である。そのため、キラル中心を含む化合物をいかに効率的且つ立体選択的に構築するかは、医薬の研究や開発において重要な意義がある。

【0003】

ケトレダクターゼ(Ketoreductase、KRED)は、カルボニルレダクターゼ(Carbony-reductase)とも呼ばれ、酵素分類番号がEC 1.1.1.184であり、プロキラルアルデヒドやケトンを還元してキラルアルコールを製造することによく用いられている。ＫＲＥＤは、アルデヒド類やケトン類基質を対応するアルコール製品に転化するだけではなく、その逆反応を触媒し、すなわちアルコール基質を触媒し酸化して対応するアルデヒドやケトンを得ることもできる。ケトレダクターゼで触媒される反応には、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む補因子の関与が必要とされる。

【0004】

アルデヒドやケトンの還元反応には、一般的に還元型の補因子ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの関与が必要であるが、実際の反応では、酸化型の補因子ＮＡＤやＮＡＤＰを添加し、次に、適切な補因子再生系により還元型のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨに再生する。よく使われる補因子再生系には、グルコースとグルコース脱水素酵素、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素、亜リン酸塩と亜リン酸脱水素酵素、及びその他の類似系が含まれる。一般に、補酵素再生系の入れ換えは、ケトレダクターゼの機能に実質的な影響を与えない。

【0005】

多くのケトンレダクターゼが商業化されているが、基質によっては触媒できるケトンレダクターゼがないか、触媒効率が非常に低い。そのため、ある基質に対して触媒効率の高い酵素をさらに探索する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ケトレダクターゼの触媒活性を向上させるために、ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、ケトレダクターゼ突然変異体を提供する。該ケトレダクターゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、突然変異の部位は、少なくとも第６位、第２１位、第４２位、第５８位、第６１位、第７６位、第８７位、第９４位、第９６位、第１０８位、第１１３位、第１１７位、第１４４位、第１４６位、第１４７位、第１４９位、第１５１位、第１５２位、第１５６位、第１６５位、第１７７位、第１９８位、第１９９位、第２００位、第２０１位、第２０２位、第２２３位、第９６位、第２３７位及び第２３０位の部位のうちの１つを含む。

【0008】

さらに、ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、突然変異の部位は、少なくとも、E144T、E144V、E144A、L152F、L152R、L152A、L152V、E201A、及びD202Aの突然変異のうちの１つを含み、若しくは、ケトレダクターゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列とは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。

【0009】

さらに、ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、アミノ酸突然変異はE144Aを含む。

【0010】

さらに、アミノ酸突然変異はL152F又はL152Yをさらに含む。

【0011】

さらに、アミノ酸突然変異は、E144A+L152R、E144A+L152A、E144A+L152V、E144A+E201A、E144A+D202A、E144A+L152W、E144A+L152M、E144A+L152L、E144A+L152K、E144A+L152T、E144A+L152P、E144A+L152C、E144A+L152H、E144A+L152Q、E144A+L152E、E144A+L152S、E144A+L152G、E144A+F152C+G6S、E144A+L152C+L198Q+E201G及びE144A+L152C+L198Q+E201G+G6Sの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む。

【0012】

さらに、発生したアミノ酸突然変異は、E144A+L152F+A94E+S96M、E144A+L152F+A94S+S96Q、E144A+L152F+A94V、E144A+L152F+A94Y+S96E、E144A+L152F+A94S+S96N、E144A+L152F+A94S+S96R、E144A+L152F+A94A+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96K、E144A+L152F+A94R+S96K、E144A+L152F+A94S+S96A、E144A+L152F+A94V+S96Q、E144A+L152F+A94A+S96G、E144A+L152F+A94S+S96T、E144A+L152F+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96L、E144A+L152F+S96D、E144A+L152F+A94E+S96A、E144A+L152F+A94T+S96Y、E144A+L152F+A94S、E144A+L152F+A94E+S96C、E144A+L152F+L198V、E144A+L152F+L198V+E201C、E144A+L152F+L198I+E201I、E144A+L152F+L198V+E201A、E144A+L152F+L198V+E201N、E144A+L152F+L198V+E201L、E144A+L152F+L198Q+E201G、E144A+L152F+L198V+E201S、E144A+L152F+L198H+E201G、E144A+L152F+L198I+E201V、E144A+L152F+L198V+E201G、E144A+L152F+L198Y+E201L、E144A+L152F+L198V+E201F、E144A+L152F+L198S+E201Y、E144A+L152F+G6S、E144A+L152F+R₁08H、E144A+L152F+G117S、E144A+L152F+I223V、E144A+L152F+G6S+R₁08H、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V、E144A+L152F+I223V+G6S、E144A+L152F+I223V+R₁08H、E144A+L152F+R₁08H+G117S、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+R₁08H、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S、E144A+F152Y+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146C+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146G+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146H+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146N+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146T+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146D+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147C、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146S+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146A+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S+G148G+D149V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D149I、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+M151R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+Q76L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+I113F、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+N156S+K237E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+F165Y+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K61E+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A21V+A58T+S96N、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A87V、及びE144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+M146K+Y230Fの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む。

【0013】

本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記いずれか１種のケトレダクターゼ突然変異体をコードする。

【0014】

本発明のさらなる態様によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドには、上記いずれか１種のＤＮＡ分子が連結されている。

【0015】

さらに、組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である。

【0016】

本発明のさらに別の態様によれば、宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する。

【0017】

さらに、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は、大腸菌である。

【0018】

本発明のさらなる態様によれば、キラルアルコールの生産方法を提供する。該方法は、ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産するステップを含み、ケトレダクターゼは、上記いずれか１種のケトレダクターゼ突然変異体である。

【0019】

さらに、キラルケトン系化合物は、構造式

を有し、式中、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂は、カルボニル基上の炭素とともに複素環式基、炭素環式基又はヘテロアリール基を形成し、複素環式基及びヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、アリール基のうちのアリール基、ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、炭素環式基のうちの炭素環式基又は複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、Ｃ₁～Ｃ₈アルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀シクロアルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂は、カルボニル基上の炭素とともにＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基を形成し、Ｃ₅～Ｃ₁₀複素環式基及びＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基のうちのアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、ケトン系化合物の構造は、

であり、式中、Ｒ₃はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₄はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₅はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ₃、ＯＣＨ₃又はＣＨ₂ＣＨ₃であり、
より好ましくは、ケトン系化合物は

である。

【0020】

さらに、ケトレダクターゼを用いてケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている。

【0021】

さらに、反応系において、ケトン系化合物の濃度が１g/L～２００g/Lである。

【0022】

さらに、反応系のｐＨ値が５～９であり、反応系の反応温度が４～６０℃である。

【0023】

さらに、補酵素はＮＡＤＨである。

【0024】

さらに、補酵素再生系は、イソプロパノール、補酵素ＮＡＤ⁺、及びケトレダクターゼを含む。

【0025】

さらに、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。

【発明の効果】

【0026】

本発明の技術案を用いると、ケトレダクターゼは、ケトン系化合物を原料として、立体選択的な還元作用を通じて、キラルアルコールを効率的に生産することができ、そして、選択的に光学分割することができ、生産コストや後続処理の難度を低減させ、キラルアルコールの工業的生産に広く使用されるのに適している。

【発明を実施するための形態】

【0027】

なお、矛盾しない限り、本出願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。

【0028】

名詞の解釈
「ケトレダクターゼ」及び「ＫＲＥＤ」は、本出願において相互に交換して使用することができ、ケトン基を対応するアルコールに還元することができるポリペプチドを意味する。具体的には、本出願のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトン化合物を対応するアルコール産物に立体選択的に還元することができる。このポリペプチドは、通常、還元剤として補因子である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を利用する。本出願において、ケトレダクターゼには、天然に存在する（野生型）ケトレダクターゼと、人工的な処理により生産された非天然に存在するケトレダクターゼ突然変異体とが含まれる。

【0029】

「天然に存在する」又は「野生型」は、「突然変異体」に対して、自然界で発見された形態を指す。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の由来から単離することができ、人為的に意図的に修飾又は改変されていないものである。

【0030】

本出願において、例えば、細胞、核酸又はポリペプチドの「組換え」が記載された場合、既に、自然界には存在しない方式に修飾されたもの、又は自然界に存在する形態と同一であるが、合成材料、及び／又は組換え技術を用いた処理により調製又は誘導されて獲得されたもの、又は天然又は固有の形態に対応する細胞、核酸又はポリペプチドを指す。ここで、非限定的な例としては、細胞内で固有の（非組換え）形態以外の遺伝子を発現している、又は固有の遺伝子を異なるレベルで発現している組換え細胞が含まれる。

【0031】

「配列相同性の百分率」とは、ポリヌクレオチドアラインメントを指し、比較窓を跨いで２つの最適なアラインメントの配列を比較することにより決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、基準配列に比べて、２つの配列の最適なアラインメントに用いるために、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。

【0032】

この百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。

【0033】

選択的に、百分率は、２つの配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現し、若しくは核酸塩基又はアミノ酸残基がギャップとアラインメントする位置の数を決定して整合する位置の数を生成し、整合する位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を得ることにより算出することができる。ここで、「基準配列」とは配列比較の基礎となる指定配列を指す。基準配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子又はポリペプチド配列のセグメントであってもよい。

【0034】

部位特異的突然変異：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法を通じて目的ＤＮＡ断片（ゲノムでもプラスミドでもよい）に必要な変化（通常は有利な方向を特徴付ける変化）を導入することを指し、塩基の追加、削除、点突然変異などを含む。部位特異的突然変異は、ＤＮＡが発現する目的タンパク質の性状及び特徴を迅速且つ効率的に高めることができ、遺伝子研究における非常に有用な手段である。

【0035】

全プラスミドＰＣＲを利用して部位特異的突然変異を導入するのは、簡単で有効であり、しかも現在広く使用されている手段である。その原理は以下のとおりである。突然変異部位を含む一対のプライマー（順方向、逆方向）とテンプレートプラスミドをアニーリングした後に、ポリメラーゼで「循環伸長」し、いわゆる循環伸長とは、ポリメラーゼがテンプレートに従ってプライマーを伸長し、１周後にプライマーの５’末端に戻って終了し、さらに繰り返した加熱アニーリングと伸長の循環をしたことであり、この反応は、ローリング増幅と異なり、複数のタンデム複製を形成しない。

【0036】

この順方向・逆方向プライマーの伸長産物は、アニーリング後にペアリングされ、ニックの入った開環プラスミドとなる。ＤｐｎＩ酵素によって伸長産物を切断し、従来のテンプレートプラスミドが一般的な大腸菌由来であり、ｄａｍメチル化修飾をしたものであるため、ＤｐｎＩに敏感であるので細断され、一方、インビトロで合成された突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないために切断されないため、その後の形質転換に成功し、突然変異プラスミドのクローンが得られる。突然変異プラスミドを宿主細胞に形質転換し、目的タンパク質の発現を誘導した後に、細胞を超音波破砕する方法により粗酵素を得る。

【0037】

Acetobacter pasteurianus 386B由来のケトレダクターゼＫＲＥＤは、目的基質を触媒して産物を得ることができるが、活性が極めて低く、７２ｈ反応後にも転化率が０．１％未満である。本出願では、ケトレダクターゼＫＲＥＤの活性を方向性進化の方法により向上させ、工業的生産に適用できる活性の高いケトレダクターゼ突然変異体をスクリーニングして獲得することを図る。

【0038】

本出願では、まず、ケトレダクターゼに全プラスミドＰＣＲにより突然変異部位を導入し、突然変異体について活性検出を行い、活性が向上した突然変異体を選別する。ここで、ケトレダクターゼＫＲＥＤをテンプレートとし、部位特異的突然変異の手段を用いて、pET-22b(+)を発現ベクターとして、目的遺伝子を有する突然変異プラスミドを得る。

【0039】

上記の突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、大腸菌中で過剰発現させる。その後、細胞を超音波破砕する方法により粗酵素を得る。ケトレダクターゼ誘導発現の最適な条件：２５℃で、０.１mM IPTG一晩誘導である。

【0040】

本発明の代表的な実施形態では、ケトレダクターゼ突然変異体を提供する。

【0041】

前記ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1(MARVAGKVAIVSGAANGIGKATAQLLAKEGAKVVIGDLKEEDGQKAVAEIKAAGGEAAFVKLNVTDEAAWKAAIGQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLDGVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIEGLIGDPMLAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGYKIRVNSVHPGYIWTPMVAGLTKEDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVTGSELVIDGGYTAQ)で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記突然変異の部位は、少なくとも、第６位、第２１位、第４２位、第５８位、第６１位、第７６位、第８７位、第９４位、第９６位、第１０８位、第１１３位、第１１７位、第１４４位、第１４６位、第１４７位、第１４９位、第１５１位、第１５２位、第１５６位、第１６５位、第１７７位、第１９８位、第１９９位、第２００位、第２０１位、第２０２位、第２２３位、第９６位、第２３７位及び第２３０位の部位のうちの１つを含む。好ましくは、該ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、突然変異の部位は、少なくとも、E144T、E144V、E144A、L152F、L152R、L152A、L152V、E201A、及びD202Aの突然変異のうちの１つを含み、若しくは、ケトレダクターゼ突然変異体は、向上したケトレダクターゼ活性を有し、アミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列とは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、ケトレダクターゼ突然変異体は、向上したケトレダクターゼ活性を有し、アミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列とは９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列である。

【0042】

説明の便宜上、本出願では、突然変異を「元のアミノ酸－位置－置換後のアミノ酸」の形で表し、例えば、「E144T」は、第１４４位のグルタミン酸がスレオニンに突然変異したものを表す。

【0043】

本発明では、上記突然変異により得られる突然変異体は、ケトン系化合物を原料として、立体選択的な還元作用を通じて、キラルアルコールを効率的に生産することができ、生産コストや後続処理の難度を低減させ、キラルアルコールの工業的生産に広く使用されるのに適している。

【0044】

好ましくは、ケトレダクターゼ突然変異体は、SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、アミノ酸突然変異は、E144Aを含む。E144Aという部位の突然変異だけでは、ケトレダクターゼの活性を１０～５０倍向上できる。さらに好ましくは、アミノ酸突然変異L152F又はL152Yは、いずれもケトレダクターゼの活性をさらに大幅に向上できる。

【0045】

本発明の代表的な実施形態では、アミノ酸突然変異は、E144A+L152R、E144A+L152A、E144A+L152V、E144A+E201A、E144A+D202A、E144A+L152W、E144A+L152M、E144A+L152L、E144A+L152K、E144A+L152T、E144A+L152P、E144A+L152C、E144A+L152H、E144A+L152Q、E144A+L152E、E144A+L152S、E144A+L152G、E144A+F152C+G6S、E144A+L152C+L198Q+E201G及びE144A+L152C+L198Q+E201G+G6Sの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む。

【0046】

より好ましくは、発生したアミノ酸突然変異は、E144A+L152F+A94E+S96M、E144A+L152F+A94S+S96Q、E144A+L152F+A94V、E144A+L152F+A94Y+S96E、E144A+L152F+A94S+S96N、E144A+L152F+A94S+S96R、E144A+L152F+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96K、E144A+L152F+A94R+S96K、E144A+L152F+A94S+S96A、E144A+L152F+A94V+S96Q、E144A+L152F+S96G、E144A+L152F+A94S+S96T、E144A+L152F+S96E、E144A+L152F+A94Y+S96L、E144A+L152F+S96D、E144A+L152F+A94E+S96A、E144A+L152F+A94T+S96Y、E144A+L152F+A94S、E144A+L152F+A94E+S96C、E144A+L152F+L198V、E144A+L152F+L198V+E201C、E144A+L152F+L198I+E201I、E144A+L152F+L198V+E201A、E144A+L152F+L198V+E201N、E144A+L152F+L198V+E201L、E144A+L152F+L198Q+E201G、E144A+L152F+L198V+E201S、E144A+L152F+L198H+E201G、E144A+L152F+L198I+E201V、E144A+L152F+L198V+E201G、E144A+L152F+L198Y+E201L、E144A+L152F+L198V+E201F、E144A+L152F+L198S+E201Y、E144A+L152F+G6S、E144A+L152F+R₁08H、E144A+L152F+G117S、E144A+L152F+I223V、E144A+L152F+G6S+R₁08H、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V、E144A+L152F+I223V+G6S、E144A+L152F+I223V+R₁08H、E144A+L152F+R₁08H+G117S、E144A+L152F+G117S+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+G6S、E144A+L152F+G117S+I223V+R₁08H、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S、E144A+F152Y+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146V+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146C+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146G+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146H+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146N+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146Q+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146T+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146D+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146L+I147T、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146W+I147C、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146S+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147A、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146I+I147D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146A+I147V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V、E144A+L152F+L198Q+E201G+G6S+G148G+D149V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D149I、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+M151R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200R、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+Q76L、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+I113F、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+N156S+K237E、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+F165Y+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+S96N+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K200H、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+K61E+N156S、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A21V+A58T+S96N、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203V、E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+A87V、及びE144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+M146K+Y230Fの部位の組み合わせ突然変異のいずれか１つを含む。

【0047】

本発明の代表的な実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記ケトレダクターゼ突然変異体をコードする。該ＤＮＡ分子がコードする上記ケトレダクターゼは、非常に良い活性を有する。

【0048】

本発明の上記ＤＮＡ分子は、また、「発現カセット」の形で存在してもよい。「発現カセット」とは、線状又は環状の核酸分子であって、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指導することができるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む核酸分子を指す。一般的には、目的ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターが含まれ、選択的に、終了シグナル及び／又は他の制御要素に有効に連結されている。発現カセットは、また、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に必要な配列を含んでもよい。

【0049】

コード領域は、通常、目的タンパク質をコードするが、センス方向又はアンチセンス方向において、アンチセンスＲＮＡや非翻訳ＲＮＡなどの目的機能ＲＮＡもコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その少なくとも１つの成分が他の少なくとも１つの成分と異種であることを意味するキメラであってもよい。発現カセットは、また、天然に存在するが、異種発現のための効果的な組換えにより形成し獲得されるものであることができる。

【0050】

本発明の代表的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のいずれかのＤＮＡ分子を含む。上記組換えプラスミド中のＤＮＡ分子を組換えプラスミドの適切な位置に配置することにより、上記ＤＮＡ分子を正確且つ円滑に複製、転写又は発現することが可能になる。

【0051】

本発明では、上記ＤＮＡ分子を限定する際に用いる限定語は「含む」であるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関連しない他の配列を任意に付加してもよいわけではない。組換え操作の要件を満たすためには、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの酵素切断部位を追加するか、又は始動コドン、終止コドンなどを追加する必要があるので、閉鎖的な表現で限定すれば、これらの状況を確実にカバーすることができないことは当業者に知られている。

【0052】

本発明で使用される用語「プラスミド」は、二本鎖、一本鎖線状又は環状の形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは、組換え発現プラスミドであり、原核発現プラスミドであってもよいし、真核発現プラスミドであってもよいが、好ましくは原核発現プラスミドであり、いくつかの実施態様では、組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19から選ばれる。より好ましくは、上記組換えプラスミドはpET-22b(+)である。

【0053】

本発明の代表的な実施形態によれば、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、上記いずれかの組換えプラスミドを含有する。本発明に適用できる宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含むが、これらに制限されない。好ましくは、原核細胞は、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。

【0054】

本発明の代表的な実施形態によれば、キラルアルコールの生産方法を提供する。該方法は、ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産するステップを含み、ケトレダクターゼは、上記いずれかのケトレダクターゼ突然変異体である。本発明の上記ケトレダクターゼ突然変異体が非常に良い活性を有するため、本発明のケトレダクターゼ突然変異体を用いて製造されるキラルアルコールは、反応速度を向上させ、基質の濃度を高め、酵素用量を減少させ、後処理の難度を低減させることができる。

【0055】

本出願では、キラルケトン系化合物は、構造式

を有するものを含むが、これに制限されるものではなく、式中、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂は、カルボニル基上の炭素とともに複素環式基、炭素環式基又はヘテロアリール基を形成し、前記複素環式基及びヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、前記アリール基のうちのアリール基、ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、炭素環式基のうちの炭素環式基又は複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、好ましくは、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して、Ｃ₁～Ｃ₈アルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀シクロアルキル基、Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基であり、若しくは、Ｒ₁及びＲ₂は、カルボニル基上の炭素とともにＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基を形成し、Ｃ₅～Ｃ₁₀複素環式基及びＣ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる少なくとも１種であり、Ｃ₅～Ｃ₁₀アリール基のうちのアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ₅～Ｃ₁₀炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ₅～Ｃ₁₀複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して、未置換又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換され、
好ましくは、ケトン系化合物の構造は、

であり、式中、Ｒ₃はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₄はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＣＨ₃であり、Ｒ₅はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ₃、ＯＣＨ₃又はＣＨ₂ＣＨ₃であり、
より好ましくは、ケトン系化合物は

である。

【0056】

本出願の前述宿主細胞は、ケトレダクターゼの発現及び単離に用いられ、又は、選択的に、ケトン基質をキラルアルコール産物に転化することに直接用いられ得る。好ましくは、原核細胞は大腸菌である。

【0057】

上述した還元反応には一般に補因子が必要であり、この補因子は、通常ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨであり、且つ該還元反応は、該補因子を再生するための系、例えばＤ－グルコース、補酵素ＮＡＤ⁺及びグルコース脱水素酵素ＧＤＨ；ギ酸根化合物、補酵素ＮＡＤ⁺及びギ酸根脱水素酵素ＦＤＨ；又はイソプロパノール、補酵素ＮＡＤ⁺及びアルコール脱水素酵素ＡＤＨを含んでもよい。

【0058】

純化したケトレダクターゼを用いたいくつかの実施形態では、このような補因子、及び選択的にこのような補因子再生系は、通常、基質及びケトレダクターゼとともに反応媒体に添加される。ケトレダクターゼと同様に、補因子再生系を含む任意の酵素は、このような細胞の抽出物又は溶解産物の形態であってもよく、又は、純化した酵素として反応混合物に添加される。

【0059】

細胞抽出物又は細胞溶解産物を用いた実施態様では、抽出物又は溶解産物を産生するための細胞は、補因子再生系だけを含有する、又は補因子再生系とケトレダクターゼを含有する酵素を発現するものであることができる。全細胞を用いた実施態様では、該細胞は、補因子再生系とケトレダクターゼを含有する酵素を発現するものであることができる。

【0060】

全細胞、細胞抽出物又は純化したケトレダクターゼの使用にかかわらず、単一のケトレダクターゼを使用するか、又は選択的に２種以上のケトレダクターゼの混合物を使用することができる。

【0061】

ケトレダクターゼを用いてキラルケトン系化合物を還元反応させてキラルアルコールを生産する反応系には、補酵素、補酵素再生系及び緩衝液がさらに含まれている。

【0062】

本発明のケトレダクターゼ突然変異体は、触媒活性が高いため、基質の濃度を高め、生産効率を向上させることができ、反応系において、キラルケトン系化合物の濃度が１g/L～２００g/Lである。

【0063】

反応系のｐＨ値が５～９であり、反応系の反応温度が４～６０℃であり、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、バルビタールナトリウム－塩酸緩衝液又はクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液である。

【0064】

以下、実施例を参照して本発明の有益な効果をさらに説明する。

【0065】

（実施例１）
１０mLの反応フラスコに２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン１０mg、０.１ＭのＰＢ（リン酸緩衝液）ｐＨ７.０、イソプロパノール１００mg、ＮＡＤ⁺０.１mg、ケトレダクターゼ（表１参照）１０mgを加え、均一に混合して全体積を１mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて４０時間反応させた。反応サンプルの系に酢酸エチル２ｍＬを加え、均一に混合した後に、５mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清１５μLをサンプリング瓶に取り、酢酸エチル１mLを加え、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0066】

【表1】

【0067】

活性は、原種よりも向上した倍数で表され、＋は１～５倍向上し、＋＋は５～１０倍向上し、＋＋＋は１０～５０倍向上したことを表す。

【0068】

表１の結果から分かるように、単一部位突然変異体は、形質転換効果が原種よりも向上したが、満足のいく効果ほどに至らなかった。複合飽和突然変異は、いくつかの突然変異部位の間で相乗作用を有する突然変異体が得られ、且つそのアミノ酸の組成を組合せ最適化できる。

【0069】

本実施例では、ハイスループットスクリーニングにおける酵素液の製造方法は、以下のとおりである。９６ウェルプレートを遠心分離して上清培地を除去し、１ウェルあたり酵素分解溶液（リゾチーム２mg/mL、ポリミキシン０.５mg/mL、ｐＨ＝７.０）２００μLを加え、３７℃で保温して３ｈ破砕した。

【0070】

本実施例では、ハイスループットスクリーニング方法は以下のとおりである。２００μL反応系：２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２mg、ＮＡＤ⁺０.２mg、破砕酵素液１００μL、ｐＨ＝７.０、温度３０℃である。

【0071】

スクリーニングした突然変異体を振とうフラスコで培養し、次に増幅反応を行った。

【0072】

ケトレダクターゼ誘導発現の最適な条件：２５℃で、０.１mM IPTG一晩誘導である。

【0073】

（実施例２）
１０mLの反応フラスコに２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン１０mg、０.１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７.０、イソプロパノール１００mg、ＮＡＤ⁺０.１mg、ケトレダクターゼ（具体的には表２参照）１０mgを加え、均一に混合して全体積を１mLとし、３０℃で、２００ｒｐｍのシェーカーにて４０時間反応させた。反応サンプルの系に酢酸エチル２mLを加え、均一に混合した後に、５mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清１５μLをサンプリング瓶に取り、酢酸エチル１mLを加え、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0074】

【表2】

【0075】

活性は、原種よりも向上した倍数で表され、＋は１～５倍向上し、＋＋は５～１０倍向上し、＋＋＋は１０～５０倍向上し、＋＋＋＋は５０～１００倍向上し、＋＋＋＋＋は１００～１０００倍向上し、＋＋＋＋＋＋は１０００倍よりも大きく向上したことを表す。

【0076】

工業的生産において、基質濃度は、コストや排気、排水や固体廃棄物の制御にとって非常に重要なことであり、反応基質の濃度が高いほど、コストが低く、発生する廃物が少ない。初期結果に基づいて、基質濃度を１０倍向上させ、突然変異及びスクリーニングをさらに行い、結果を表２に示す。

【0077】

本実施例では、ハイスループットスクリーニングにおける酵素液の製造方法は以下のとおりである。９６ウェルプレートを遠心分離して上清培地を除去し、１ウェルあたり酵素分解溶液（リゾチーム２mg/mL、ポリミキシン０.５mg/mL、ｐＨ＝７.０）２００μLを加え、３７℃で保温して３ｈ破砕した。

【0078】

本実施例では、ハイスループットスクリーニング方法は以下のとおりである。反応系２００μL：２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２０mg、ＮＡＤ⁺２mg、破砕酵素液１００μL、ｐＨ＝７.０、温度３０℃である。

【0079】

スクリーニングした突然変異体を振とうフラスコで培養し、次に増幅反応を行った。

【0080】

ケトレダクターゼ誘導発現の最適な条件：２５℃で、０.１mM IPTG一晩誘導である。

【0081】

（実施例３）
１０mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン１１００mg、０.１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７.０、イソプロパノール１００mg、ＮＡＤ⁺１mg、ケトレダクターゼ（表３参照）１０mgを加え、均一に混合して全体積を１mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて４０時間反応させた。反応サンプルの系に酢酸エチル２mLを加え、均一に混合した後に、５mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清１５μLをサンプリング瓶に取り、酢酸エチル１mLを加え、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0082】

【表3】

【0083】

活性は、原種よりも向上した倍数で表され、＋は１～５倍向上し、＋＋は５～１０倍向上し、＋＋＋は１０～５０倍向上し、＋＋＋＋は５０～１００倍向上し、＋＋＋＋＋は１００～１０００倍向上し、＋＋＋＋＋＋は１０００倍よりも大きく向上したことを表す。

【0084】

（実施例４）
突然変異体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203Vを用いて様々なｐＨで反応検証を行い、結果を表４に示す。

【0085】

１）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ５.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0086】

２）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ６.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0087】

３）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0088】

４）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ８.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0089】

５）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＴｒｉｃ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0090】

サンプリング方法は全て同じであった。反応サンプルの系から０.２mLをサンプリングしてアセトニトリル１mLを加え、均一に混合した後に、２mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清をサンプリング瓶に取り、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0091】

ｅｅ値の検出方法：１mLをサンプリングして酢酸エチル２mLを加え、均一に振とう混合した後に、１２０００rpmで３min遠心分離し、上清１００μLに酢酸エチル１mLを加え、硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、均一に振とう混合した後に、１２０００rpmで３min遠心分離し、上清を取ってＧＣ検出を行い、クロマトグラフィーカラムＣＹＣＬＯＳＩＬ－Ｂを用い、温度プログラムとして１２０℃から１５℃/minで２２０℃に昇温し、２min保留した。

【0092】

【表4】

【0093】

（実施例５）
突然変異体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203Vを用いて様々な温度での反応検証を行い、結果を表５に示す。

【0094】

１）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、４℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0095】

２）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、１０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0096】

３）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、２０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0097】

４）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0098】

５）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、４０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0099】

６）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、５０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0100】

７）２５mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、６０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0101】

サンプリング方法：反応サンプルの系から０.２mLをサンプリングしてアセトニトリル１mLを加え、均一に混合した後に、２mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清をサンプリング瓶に取り、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0102】

ｅｅ値の検出方法：１mLをサンプリングして酢酸エチル２mLを加え、均一に振とう混合した後に、１２０００ｒpmで３min遠心分離し、上清１００μLに酢酸エチル１mLを加え、硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、均一に振とう混合した後に、１２０００rpmで３min遠心分離し、上清を取ってＧＣ検出を行い、クロマトグラフィーカラムＣＹＣＬＯＳＩＬ－Ｂを用い、温度プログラムとして１２０℃から１５℃/minで２２０℃に昇温し、２min保留した。

【0103】

【表5】

【0104】

（実施例６）
得られた突然変異体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203Vの収率については、具体的なステップは以下のとおりである。

【0105】

２５０mLの反応フラスコに基質である２,６－ジクロロ－３－フルオロアセトフェノン２０ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２０ｇ、ＮＡＤ⁺２００mg、ケトレダクターゼ突然変異体２ｇを加え、均一に混合して全体積を１００mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0106】

反応サンプルの系から０.２mLをサンプリングしてアセトニトリル１mLを加え、均一に混合した後に、２mLのＥＰチューブに入れて、１２０００rpmで３分間遠心分離した。上清をサンプリング瓶に取り、ＨＰＬＣ検出を検出波長２１０nmで行った。

【0107】

反応終了後に、酢酸エチル１００mLを加えて３回抽出し、抽出有機相を合わせた後に、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾固まで回転蒸発させ、重量を秤量したところ、産物は重量が１７.４ｇで、純度が９７％で、ｅｅ値が＞９９％であった。

【0108】

（実施例７）
突然変異体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+I147V+D42E+T199V+G177D+A203Vを用いて様々な基質の反応検証を行い、結果を表６に示す。

【0109】

１）２５mLの反応フラスコに基質である２－クロロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0110】

２）２５mLの反応フラスコに基質である３－フルオロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0111】

３）２５mLの反応フラスコに基質である４－メトキシアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0112】

４）２５mLの反応フラスコに基質であるアセト酢酸エチル２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0113】

【表6】

【0114】

（実施例８）
異なる突然変異体を用いて、２,４－ジクロロアセトフェノンに対する活性を検証し、結果を表７に示す。

【0115】

２５mLの反応フラスコに基質である２,４－ジクロロアセトフェノン２ｇ、０.１ＭのＰＢ ｐＨ７.０、イソプロパノール２ｇ、ＮＡＤ⁺２０mg、ケトレダクターゼ突然変異体０.２ｇを加え、均一に混合して全体積を１０mLとし、３０℃で、２００rpmのシェーカーにて１６時間反応させた。

【0116】

【表7】

【0117】

以上は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとっては、本発明は様々な変更や変化が可能である。本発明の精神及び原則を逸脱することなく行われる修正、等同置換、改良などであれば、全て本発明の特許範囲に含まれるものとする。

【配列表】

2022536500000001.app

【国際調査報告】