特表 2022-536546 遺伝子操作ＲＮＡを用いた内因性ＡＤＡＲによる標的化ＲＮＡ編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-17

(54)【発明の名称】遺伝子操作ＲＮＡを用いた内因性ＡＤＡＲによる標的化ＲＮＡ編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220809BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220809BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220809BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220809BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20220809BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20220809BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALN20220809BHJP

   A61P 3/00 20060101ALN20220809BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20220809BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/55

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A61K48/00

A61P43/00 105

A61K31/7105

A61P3/00

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502174

(86)(22)【出願日】2020-07-10

(85)【翻訳文提出日】2022-03-14

(86)【国際出願番号】 CN2020101246

(87)【国際公開番号】W WO2021008447

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/095802

(32)【優先日】2019-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507232478

【氏名又は名称】北京大学

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】魏 文▲勝▼

(72)【発明者】

【氏名】伊 宗裔

(72)【発明者】

【氏名】▲チゥ▼ 良

(72)【発明者】

【氏名】田 峰

(72)【発明者】

【氏名】王 春慧

(72)【発明者】

【氏名】朱 ▲詩▼▲優▼

(72)【発明者】

【氏名】周 卓

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB21

4C084ZB26

4C084ZC21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC21

(57)【要約】

本出願は、標的ＲＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化するために宿主細胞にデアミナーゼ動員ＲＮＡを導入することによってＲＮＡを編集する方法を提供する。本出願はまた、ＲＮＡ編集方法に使用されるデアミナーゼ動員ＲＮＡ、ならびにそれを含む組成物、およびキットを提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法。

【請求項2】

前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列および５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である、および／または
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環化され、任意選択的に、前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは前記宿主細胞において内因的に発現される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列と、をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ１である、または
（ｉｉ）前記５’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスト酵素配列がツイスト酵素Ｐ１である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
前記ｄＲＮＡは、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる方法。

【請求項9】

（ｉ）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは少なくとも約７０ヌクレオチドであり、
（ｉｖ）前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含み、
（ｖ）前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含み、および／または
（ｖｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列、またはオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である、請求項６～７または１０に記載の方法。

【請求項12】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法。

【請求項13】

前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドであり、任意選択的に、前記構築体はＡＡＶベクターである、請求項６～７および１０～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＡＤＡＲは前記宿主細胞によって内因的に発現され、任意選択的に、前記宿主細胞はＴ細胞である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

（ｉ）前記標的ＲＮＡ配列の長さが５０ヌクレオチドより長く、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ配列の長さが約１００～約１５０ヌクレオチドであり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含み、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含み、例えば、前記シチジンミスマッチは前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、かつ前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置し、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含み、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含み、
（ｖ）前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物がＵ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの３’に最も近い隣接物がＧ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕであり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフであり、任意選択的に、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ中のウリジンの真向かいにあるＡと、前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンと、前記３塩基モチーフ中のグアノシンの真向かいにあるシチジン、グアノシンまたはウリジンとを含み、および／または、
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡであり、任意選択的に、前記標的ＲＮＡはプレメッセンジャーＲＮＡである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

ＡＤＡＲ３阻害剤および／またはインターフェロン刺激物質を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築体を導入することを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記構築体または前記ｄＲＮＡは免疫応答を誘導しない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記宿主細胞にＡＤＡＲを導入することをさらに含み、任意選択的に、前記ＡＤＡＲはＥ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシング、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転を引き起こし、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点変異、トランケート、伸長および／または誤折り畳みを引き起こし、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転によって機能的、全長的、正確に折り畳まれたおよび／または野生型のタンパク質を引き起こす、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記宿主細胞は真核細胞であり、任意選択的に、前記宿主細胞は哺乳動物細胞であり、例えば、前記宿主細胞はヒト細胞またはマウス細胞である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

編集されたＲＮＡ、または請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法により製造された編集されたＲＮＡを有する宿主細胞。

【請求項25】

個体の疾患または病状を治療または予防する方法であって、
請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法により、前記個体の細胞において前記疾患または病状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、方法。

【請求項26】

（ｉ）前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患または１つ以上の獲得性遺伝子変異に関連する疾患または病状であり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡはＧからＡへの変異を有し、および／または
（ｉｉｉ）前記疾患または病状は、単遺伝子または多遺伝子の疾患または病状である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

（ｉ）前記標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、前記疾患または病状はがんであり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡであり、前記疾患または病状はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）であり、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患または病状はエーラス・ダンロス症候群であり、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、前記疾患または病状はジュベール症候群であり、
（ｖ）前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、前記疾患または病状はファンコニ貧血であり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患または病状は原発性家族性肥大型心筋症であり、あるいは
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、前記疾患または病状はＸ連鎖の重篤な複合免疫不全である、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して、前記ｄＲＮＡは、環状であるかまたは環状ＲＮＡを形成することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。

【請求項29】

前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的であり、および／または
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項２８に記載のｄＲＮＡ。

【請求項30】

前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、請求項２８または２９に記載のｄＲＮＡ。

【請求項31】

前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである、請求項２８または２９に記載のｄＲＮＡ。

【請求項32】

請求項２８～３１のいずれか１項に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体。

【請求項33】

前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列とをさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ１であり、または
（ｉｉ）前記５’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスト酵素配列はツイスト酵素Ｐ１である、請求項３２に記載の構築体。

【請求項34】

標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端における核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。

【請求項35】

（ｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さが少なくとも約７０ヌクレオチドであり、
（ｉｖ）前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含み、
（ｖ）前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含み、および／または
（ｖｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列、またはオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、請求項３４に記載のｄＲＮＡ。

【請求項36】

請求項３４または３５に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体。

【請求項37】

前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である、請求項３２～３３および３６のいずれか１項に記載の構築体。

【請求項38】

宿主細胞に取り込まれるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、構築体。

【請求項39】

前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、請求項３７または３８に記載の構築体。

【請求項40】

前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドであり、任意選択的に、前記構築体はＡＡＶベクターである、請求項３２～３３および３６～３９のいずれか１項に記載の構築体。

【請求項41】

前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡ。

【請求項42】

請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞。

【請求項43】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年７月１２日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０９５８０２の優先権を主張しており、その内容は、その全体が引用により本出願に組み込まれている。

【0002】

（ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出）
以下の提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：ＦＤ００２５４ＰＣＴ－ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日付：２０２０年７月１０日、サイズ：１６ＫＢ）。

【0003】

本開示は、一般に、標的ＲＮＡ中の１つ以上のアデノシンを脱アミノ化するためにアデノシンデアミナーゼを動員することができる遺伝子操作ＲＮＡを用いてＲＮＡを編集する方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

ゲノム編集は、疾患の生物医学研究や治療開発に使われる強力なツールである。遺伝子操作ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓタンパク質）を用いた編集技術は、多くの生物においてゲノムを操作するために応用されている。最近、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などのデアミナーゼタンパク質を用いたＲＮＡ編集のための新しいツールが開発された。哺乳動物の細胞には、３種類のＡＤＡＲタンパク質が存在し、すなわち、Ａｄａｒ１（ｐ１１０とｐ１５０の２つのアイソタイプ）、Ａｄａｒ２、およびＡｄａｒ３（触媒活性を持たない）である。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、ＡＤＡＲはアデノシン（Ａ）核酸塩基から－ＮＨ_２基を除去することで、Ａをイノシン（Ｉ）に変えることができる。（Ｉ）はグアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞転写および翻訳過程でシチジン（Ｃ）と対合する。標的ＲＮＡ編集を実現するために、ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインをλＮペプチド、ＳＮＡＰタグまたはＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ１３ｂ）と融合し、そしてキメラＡＤＡＲタンパク質を標的部位に動員するためにガイドＲＮＡを設計する。あるいは、過剰発現したＡＤＡＲ１やＡＤＡＲ２蛋白がＲ／Ｇモチーフを持つガイドＲＮＡとともに標的化ＲＮＡ編集を行うことが可能であることも報告されている。

【0005】

しかし、現在利用可能なＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集技術は一定の制限がある。例えば、遺伝子治療の場合、最も効果的なインビボ送達はウイルスベクターを介して行われるが、高度に理想的なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、負荷（～４．５ｋｂ）の大きさに制限されていることから、タンパク質とガイドＲＮＡの両方を保持することが困難である。また、最近、ＡＤＡＲ１の過剰発現はＲＮＡに対する異常な過剰編集により多発性骨髄腫の発がん性を引き起こし、大量の全面的なオフターゲット編集を生じさせることが報告されている。また、タンパク質またはその非ヒト由来ドメインの異所性発現は、免疫原性を誘発する潜在的なリスクを有する。さらに、既存の適応性免疫およびｐ５３媒介性ＤＮＡ損傷応答は、治療的タンパク質（例えばＣａｓ９）の効果を損なうことがある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｐｏｒｔｅｕｓ， Ｍ． Ｈ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３， ９６７－９７３ （２００５）．

【非特許文献2】Ｂｏｃｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡＬ－ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６， １５０９－１５１２ （２００９）．

【非特許文献3】Ｍｏｓｃｏｕ， Ｍ． Ｊ． ＆ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， Ａ． Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６， １５０１ （２００９）．

【非特許文献4】Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９， １４３－１４８ （２０１１）．

【非特許文献5】Ｊｉｎｅｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ８１６－８２１ （２０１２）．

【非特許文献6】Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８１９－８２３ （２０１３）．

【非特許文献7】Ｍａｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３－８２６ （２０１３）．

【非特許文献8】Ｋｏｍｏｒ， Ａ． Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｙ． Ｂ．， Ｐａｃｋｅｒ， Ｍ． Ｓ．， Ｚｕｒｉｓ， Ｊ． Ａ． ＆ Ｌｉｕ， Ｄ． Ｒ． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５３３， ４２０－４２４ （２０１６）．

【非特許文献9】Ｍａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＩＤ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ （ＴＡＭ） ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３， １０２９－１０３５ （２０１６）．

【非特許文献10】Ｇａｕｄｅｌｌｉ， Ｎ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ＊Ｔ ｔｏ Ｇ＊Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５５１， ４６４－４７１ （２０１７）．

【非特許文献11】Ｔａｎ， Ｍ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｙｎａｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５０， ２４９－２５４ （２０１７）．

【非特許文献12】Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ， Ｋ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９， ３２１－３４９ （２０１０）．

【非特許文献13】Ｂａｓｓ， Ｂ． Ｌ． ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． Ａｎ ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｃｅｌｌ ５５， １０８９－１０９８ （１９８８）．

【非特許文献14】Ｗｏｎｇ， Ｓ． Ｋ．， Ｓａｔｏ， Ｓ． ＆ Ｌａｚｉｎｓｋｉ， Ｄ． Ｗ． Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２． ＲＮＡ ７， ８４６－８５８ （２００１）．

【非特許文献15】Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ．， Ｙｕｄｏｗｓｋｉ， Ｇ． Ａ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０， １８２８５－１８２９０ （２０１３）．

【非特許文献16】Ｓｉｎｎａｍｏｎ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｃｐ２ ＲＮＡ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４， Ｅ９３９５－Ｅ９４０２ （２０１７）．

【非特許文献17】Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ． Ｃ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｍＲＮＡｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ｅ１５７ （２０１６）．

【非特許文献18】Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ， Ａ．， Ｋｕｚｄｅｒｅ， Ｔ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｊｅｋｅｌｙ， Ｇ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃａｎ Ｂｅ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｌｉｇｈｔ－Ｄｒｉｖｅｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｒｉｂｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３７， １５８７５－１５８８１ （２０１５）．

【非特許文献19】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ｆ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｐ． Ｃ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｇｕｉｄｅＲＮＡｓ ｆｏｒ ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈＡＤＡＲ１ ａｎｄ ｈＡＤＡＲ２ ｉｎ ｔｒａｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２， ｅ８７ （２０１４）．

【非特許文献20】Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ， Ａ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｎｄｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ． ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ６， １６４２－１６４９ （２０１７）．

【非特許文献21】Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ｆ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｉｄｅＲＮＡ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３， ６２６７－６２７１ （２０１４）．

【非特許文献22】Ｖｏｇｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ＳＮＡＰ－ｔａｇｇｅｄ ＡＤＡＲｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５， ５３５－５３８ （２０１８）．

【非特許文献23】Ｃｏｘ， Ｄ． Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８， １０１９－１０２７ （２０１７）．

【非特許文献24】Ｆｕｋｕｄａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７， ４１４７８ （２０１７）．

【非特許文献25】Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ， Ｐ．， Ｇｅｉｓｌｅｒ， Ｓ．， Ｋａｈｌｅ， Ｐ． Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ － Ｒｅｃｏｄｉｎｇ ａ ＰＩＮＫ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５， ２７９７－２８０８ （２０１７）．

【非特許文献26】Ｈｅｅｐ， Ｍ．， Ｍａｃｈ， Ｐ．， Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ， Ｐ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ａｐｐｌｙｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ１ｐ１１０ ａｎｄ ＡＤＡＲ１ｐ１５０ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ－Ｇ／Ｃ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ＧｕｉｄｅＲＮＡｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｇｅｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ） ８ （２０１７）．

【非特許文献27】Ｋａｔｒｅｋａｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６， ２３９－２４２ （２０１９）．

【非特許文献28】Ｙｉｎ， Ｈ．， Ｋａｕｆｆｍａｎ， Ｋ． Ｊ． ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ｇ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １６， ３８７－３９９ （２０１７）．

【非特許文献29】Ｐｌａｔｔ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ． Ｃｅｌｌ １５９， ４４０－４５５ （２０１４）．

【非特許文献30】Ｃｈｅｗ， Ｗ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３， ８６８－８７４ （２０１６）．

【非特許文献31】Ｔｅｏｈ， Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｂｅｒｒａｎｔ ｈｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｃｏｎｆｅｒｓ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｂｌｏｏｄ １３２， １３０４－１３１７ （２０１８）．

【非特許文献32】Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ． Ｃ．， Ｌｉｓｃｏｖｉｔｃｈ－Ｂｒａｕｅｒ， Ｎ．， Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｅ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ｃ． Ａｂｕｎｄａｎｔ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ． ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ １５， １０４－１１４ （２０１８）．

【非特許文献33】Ｍａｙｓ， Ｌ． Ｅ． ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９， １６－２７ （２０１１）．

【非特許文献34】Ｗａｇｎｅｒ， Ｄ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５， ２４２－２４８ （２０１９）．

【非特許文献35】Ｓｉｍｈａｄｒｉ， Ｖ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０， １０５－１１２ （２０１８）．

【非特許文献36】Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ， Ｃ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５， ２４９－２５４ （２０１９）．

【非特許文献37】Ｈａａｐａｎｉｅｍｉ， Ｅ．， Ｂｏｔｌａ， Ｓ．， Ｐｅｒｓｓｏｎ， Ｊ．， Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ， Ｂ． ＆ Ｔａｉｐａｌｅ， Ｊ． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｐ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ９２７－９３０ （２０１８）．

【非特許文献38】Ｉｈｒｙ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ｐ５３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ９３９－９４６ （２０１８）．

【発明の概要】

【0007】

本出願は、内在性ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（「ＡＤＡＲ」）タンパク質を利用してＲＮＡ編集を行うことができる、ＡＤＡＲで動員されたＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」または「ａｒＲＮＡ」）を用いてＲＮＡ編集を行う方法を提供する。本明細書は、また、遺伝子操作ｄＲＮＡ、またはこれらの方法において使用される遺伝子操作ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体、ならびに、それらを含む組成物およびキットを提供する。本明細書は、また、個体の細胞中の疾患または病症に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体の疾患または病状を治療または予防する方法を提供する。

【0008】

一態様では、本明細書は、
デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0009】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼによって環化される。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは宿主細胞において内因的に発現される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである。

【0010】

一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスター（ｔｗｉｓｔｅｒ）リボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列とをさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。

【0011】

別の態様では、本明細書は、
デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
前記ｄＲＮＡは、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。

【0012】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である。一部の実施形態において、前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである。一部の実施形態において、前記構築体はＡＡＶベクターである。

【0013】

別の態様では、本明細書は、
デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む。

【0014】

一部の実施形態において、前記ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号３の核酸配列を含む。

【0015】

以下の実施形態は、上述した３つの態様のすべてに適用可能である。一部の実施形態において、前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである。一部の実施形態において、前記構築体はＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞によって内因的に発現される。一部の実施形態において、前記宿主細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列の長さは５０ヌクレオチドより長い。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列の長さは、約１００～約１８０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ配列は、約１００～約１５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、かつ前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチドの箇所に存在する。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む。

【0016】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフである。一部の実施形態において、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ中のウリジンの真向かいにあるＡと、前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンと、前記３塩基モチーフ中のグアノシンの真向かいにあるシチジン、グアノシンまたはウリジンとを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。

【0017】

一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲ３阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、インターフェロン刺激物質を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築体を導入することを含む。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲ（例えば、外来ＡＤＡＲ）を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡの編集効率は少なくとも４０％である。一部の実施形態において、前記構築体または前記ｄＲＮＡは免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、Ｅ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である。

【0018】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシング、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転を引き起こす。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点変異、トランケート、伸長および／または誤折り畳み（ミスフォールディング）を引き起こし、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転によって機能的、完全長的、正確に折り畳まれたおよび／または野生型のタンパク質を引き起こす。一部の実施形態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト細胞またはマウス細胞である。本明細書は、また、上記３つの態様のいずれか１つによって提供される方法によって産生された編集ＲＮＡ、または前記編集ＲＮＡを有する宿主細胞を提供する。

【0019】

別の態様では、本明細書は、上記のいずれか１つの方法に従って、前記疾患または病状に関連する標的ＲＮＡを前記個体の細胞において編集することを含む、個体の疾患または病状を治療または予防する方法を提供する。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患または１つ以上の獲得性遺伝子変異に関連する疾患または病状である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＧ－Ａ変異を有する。一部の実施形態において、前記疾患または病状は単一遺伝子疾患または病状である。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、多遺伝子疾患または病状である。

【0020】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、前記疾患または病状はがんである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡであり、前記疾患または病状はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患または病状はエーラス・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、前記疾患または病状はジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、前記疾患または病状はファンコニ（Ｆａｎｃｏｎｉ）貧血である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患または病状は原発性家族性肥大型心筋症である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、前記疾患または病状はＸ連鎖重症複合免疫不全である。

【0021】

別の態様では、本明細書は、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、前記ｄＲＮＡはＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、前記ｄＲＮＡは環状であるかまたは環状ＲＮＡを形成することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡを提供する。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである。本明細書は、また、本態様に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を提供する。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列とをさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。本明細書は、また、本態様に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞を提供する。本明細書は、また、本態様に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットを提供する。

【0022】

別の態様では、本明細書は、また、標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。

【0023】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。本明細書は、また、本態様に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を提供する。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである。本明細書は、また、本態様に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞を提供する。本明細書は、また、本態様に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットを提供する。

【0024】

別の態様では、本明細書は、宿主細胞に取り込まれるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む構築体を提供する。

【0025】

一部の実施形態において、前記ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号３の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである。一部の実施形態において、前記構築体はＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである。本明細書は、また、本態様に記載の構築体を含む宿主細胞を提供する。本明細書は、また、本態様に記載の構築体を含む宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットを提供する。

【0026】

なお、本明細書に記載の様々な実施形態の１つ、一部、または全ての特徴は、組み合わされて本出願に記載の他の実施形態を形成してもよい。本出願のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドと、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドを４８時間トランスフェクションした後のＦＡＣＳ解析を示す。ＥＧＦＰ陽性百分率はトランスフェクション効率により正規化され、トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性率により決定される。データは、平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。

【図2A】ｓｎｏＲＮＡ末端を側面に持つｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１によるレポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）のｍＲＮＡ上で標的化されたＲＮＡ編集の媒介を示す。図２Ａは、ａｒＲＮＡを発現するプラスミドの模式図を示す。ヒトＵ６プロモーター下で標的蛍光レポーター－１の１５１－ｎｔａｒＲＮＡを発現させる。図２Ｂは、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡトランスフェクションの結果に対するＦＡＣＳの結果を示す。ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１またはＣｔｒｌ ＲＮＡ_１５１はレポーターを発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされた。図２Ｃは、図２ＢにおけるＦＡＣＳ結果の定量化を示す。

【図2B】ｓｎｏＲＮＡ末端を側面に持つｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１によるレポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）のｍＲＮＡ上で標的化されたＲＮＡ編集の媒介を示す。図２Ａは、ａｒＲＮＡを発現するプラスミドの模式図を示す。ヒトＵ６プロモーター下で標的蛍光レポーター－１の１５１－ｎｔａｒＲＮＡを発現させる。図２Ｂは、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡトランスフェクションの結果に対するＦＡＣＳの結果を示す。ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１またはＣｔｒｌ ＲＮＡ_１５１はレポーターを発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされた。図２Ｃは、図２ＢにおけるＦＡＣＳ結果の定量化を示す。

【図2C】ｓｎｏＲＮＡ末端を側面に持つｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１によるレポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）のｍＲＮＡ上で標的化されたＲＮＡ編集の媒介を示す。図２Ａは、ａｒＲＮＡを発現するプラスミドの模式図を示す。ヒトＵ６プロモーター下で標的蛍光レポーター－１の１５１－ｎｔａｒＲＮＡを発現させる。図２Ｂは、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡトランスフェクションの結果に対するＦＡＣＳの結果を示す。ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１またはＣｔｒｌ ＲＮＡ_１５１はレポーターを発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされた。図２Ｃは、図２ＢにおけるＦＡＣＳ結果の定量化を示す。

【図3A】ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡとｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効果をプロットしたものである。図３Ａは、ｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｂは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｃは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。

【図3B】ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡとｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効果をプロットしたものである。図３Ａは、ｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｂは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｃは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。

【図3C】ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡとｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効果をプロットしたものである。図３Ａは、ｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｂは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。図３Ｃは、ＣＭＶまたはｈＵ６から誘導されるｓｎｏ－ａｒＲＮＡの異なる時点での定量ＦＡＣＳ結果を示す。

【図4A】ＬＥＡＰＥＲシステムにおいて環状ａｒＲＮＡを使用する場合の編集効果を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の模式図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物の側面は５’および３’ライゲーション配列であり、それぞれ自己切断後の側面は５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａおよび３’－ツイスターＰ１リボザイムである。得られたＲＮＡ末端をＲｔｃＢで認識して連結する。図４Ｂは、レポーター－１およびレポーター－３の模式図を示す。ｍＣｈｅｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）または１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳコード領域およびインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結されている。分子発現を報告する細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のみを産生するが、レポーター転写物のＵＡＧ終止コドンを標的とした編集はＵＡＧをＵＩＧに転化し、それによって下流のＥＧＦＰ発現を可能にする。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－１を安定に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後と７日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｄは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１（環状）、３１－、５１－、７１－、９１－、１１１－、１３１－、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡを発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｅは、レポーター－１を発現させたプラスミド０．５μｇ、および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド０．５μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５個細胞／孔）に接種したＨｅＬａおよびＡ５４９細胞をコトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。

【図4B】ＬＥＡＰＥＲシステムにおいて環状ａｒＲＮＡを使用する場合の編集効果を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の模式図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物の側面は５’および３’ライゲーション配列であり、それぞれ自己切断後の側面は５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａおよび３’－ツイスターＰ１リボザイムである。得られたＲＮＡ末端をＲｔｃＢで認識して連結する。図４Ｂは、レポーター－１およびレポーター－３の模式図を示す。ｍＣｈｅｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）または１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳコード領域およびインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結されている。分子発現を報告する細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のみを産生するが、レポーター転写物のＵＡＧ終止コドンを標的とした編集はＵＡＧをＵＩＧに転化し、それによって下流のＥＧＦＰ発現を可能にする。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－１を安定に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後と７日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｄは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１（環状）、３１－、５１－、７１－、９１－、１１１－、１３１－、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡを発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｅは、レポーター－１を発現させたプラスミド０．５μｇ、および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド０．５μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５個細胞／孔）に接種したＨｅＬａおよびＡ５４９細胞をコトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。

【図4C】ＬＥＡＰＥＲシステムにおいて環状ａｒＲＮＡを使用する場合の編集効果を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の模式図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物の側面は５’および３’ライゲーション配列であり、それぞれ自己切断後の側面は５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａおよび３’－ツイスターＰ１リボザイムである。得られたＲＮＡ末端をＲｔｃＢで認識して連結する。図４Ｂは、レポーター－１およびレポーター－３の模式図を示す。ｍＣｈｅｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）または１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳコード領域およびインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結されている。分子発現を報告する細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のみを産生するが、レポーター転写物のＵＡＧ終止コドンを標的とした編集はＵＡＧをＵＩＧに転化し、それによって下流のＥＧＦＰ発現を可能にする。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－１を安定に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後と７日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｄは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１（環状）、３１－、５１－、７１－、９１－、１１１－、１３１－、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡを発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｅは、レポーター－１を発現させたプラスミド０．５μｇ、および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド０．５μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５個細胞／孔）に接種したＨｅＬａおよびＡ５４９細胞をコトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。

【図4D】ＬＥＡＰＥＲシステムにおいて環状ａｒＲＮＡを使用する場合の編集効果を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の模式図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物の側面は５’および３’ライゲーション配列であり、それぞれ自己切断後の側面は５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａおよび３’－ツイスターＰ１リボザイムである。得られたＲＮＡ末端をＲｔｃＢで認識して連結する。図４Ｂは、レポーター－１およびレポーター－３の模式図を示す。ｍＣｈｅｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）または１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳコード領域およびインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結されている。分子発現を報告する細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のみを産生するが、レポーター転写物のＵＡＧ終止コドンを標的とした編集はＵＡＧをＵＩＧに転化し、それによって下流のＥＧＦＰ発現を可能にする。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－１を安定に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後と７日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｄは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１（環状）、３１－、５１－、７１－、９１－、１１１－、１３１－、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡを発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｅは、レポーター－１を発現させたプラスミド０．５μｇ、および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド０．５μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５個細胞／孔）に接種したＨｅＬａおよびＡ５４９細胞をコトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。

【図4E】ＬＥＡＰＥＲシステムにおいて環状ａｒＲＮＡを使用する場合の編集効果を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の模式図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物の側面は５’および３’ライゲーション配列であり、それぞれ自己切断後の側面は５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａおよび３’－ツイスターＰ１リボザイムである。得られたＲＮＡ末端をＲｔｃＢで認識して連結する。図４Ｂは、レポーター－１およびレポーター－３の模式図を示す。ｍＣｈｅｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）または１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳコード領域およびインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によって連結されている。分子発現を報告する細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のみを産生するが、レポーター転写物のＵＡＧ終止コドンを標的とした編集はＵＡＧをＵＩＧに転化し、それによって下流のＥＧＦＰ発現を可能にする。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－１を安定に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後と７日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｄは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１（環状）、３１－、５１－、７１－、９１－、１１１－、１３１－、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡを発現させたプラスミド１μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５個細胞／孔）に接種してレポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。図４Ｅは、レポーター－１を発現させたプラスミド０．５μｇ、および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現させたプラスミド０．５μｇをそれぞれ用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５個細胞／孔）に接種したＨｅＬａおよびＡ５４９細胞をコトランスフェクションした実験結果を示す。トランスフェクションしてから２日後にＦＡＣＳ解析を行った。トランスフェクション効率によりＥＧＦＰ＋細胞の割合を正規化する。

【図5】複数の環状ａｒＲＮＡを４８時間および９６時間コトランスフェクションした後のＦＡＣＳ解析を示し、ＥＧＦＰ陽性百分率をｍＣｈｅｒｒｙ陽性で決定されたトランスフェクション効率で正規化したものである。データは、平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。

【図6A】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において複数の環状ａｒＲＮＡを４８時間および９６時間コトランスフェクションした後のＦＡＣＳ解析を示す。ＥＧＦＰ陽性百分率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性により決定されたトランスフェクション効率により正規化される。データは、平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。

【図6B】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において複数の環状ａｒＲＮＡを４８時間および９６時間コトランスフェクションした後のＦＡＣＳ解析を示す。ＥＧＦＰ陽性百分率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性により決定されたトランスフェクション効率により正規化される。データは、平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。

【図7】ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量を示す。様々な長さのＴｏｒｎａｄｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ１１１ ウイルスおよび標的Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡウイルスを含むＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡレンチウイルスを用いて、レポーター－１を安定に発現した細胞に感染させ、感染２日後にＦＡＣＳを行った。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝２）である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本明細書は、ＲＮＡ編集方法（本明細書では、「改良ＬＥＡＰＥＲ」方法と称する）、ならびに宿主細胞中の標的ＲＮＡを編集するために、特に設計されたＲＮＡ、本明細書では、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」）またはＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」）、またはこれらのｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を提供する。

【0029】

本出願発明者らは、内因性ＡＤＡＲを利用してｄＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」とも呼ばれる）を用いて標的ＲＮＡを編集する「ＬＥＡＰＥＲ」（内因性ＡＤＡＲを用いたプログラム可能なＲＮＡ編集）を開発している。ＬＥＡＰＥＲ方法はＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１０１０５およびＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０８４９２２に記載されており、その内容は引用によって全体として本明細書に組み込まれている。具体的には、標的転写物に部分的に相補的である標的ＲＮＡを用いて、天然ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員し、標的ＲＮＡ中の特定の部位でアデノシンをイノシンに変化させる。このようにして、宿主細胞においてＡＤＡＲタンパク質を異所性または過剰発現させることなく、ある系においてＲＮＡ編集を達成することができる。

【0030】

本出願は、例えば、標的細胞中のｄＲＮＡのレベルを増加させることによって、ＲＮＡ編集の効率を向上させることを可能にする、改良ＬＥＡＰＥＲ方法を提供する。一方、改良ＬＥＡＰＥＲ方法は、環状ｄＲＮＡまたは環状ＲＮＡを形成し得るｄＲＮＡの使用に関する。別の態様では、前記改良ＬＥＡＰＥＲ方法は、標的ＲＮＡ配列の３’または５’末端に連結された１つ以上の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含むｄＲＮＡの使用に関する。別の態様では、改良ＬＥＡＰＥＲ方法は、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）の制御下に置かれたｄＲＮＡに関する。改良ＬＥＡＰＥＲ方法は、ＬＥＡＰＥＲ方法と比較してｄＲＮＡの編集効率を著しく向上させることを実証している。理論に縛られることなく、改良ＬＥＡＰＥＲ方法で使用されるｄＲＮＡの安定性や量の増加は、ＲＮＡ編集効率のこのような向上に寄与すると考えられている。

【0031】

したがって、本出願の一態様は、１つ以上の改良ＬＥＡＰＥＲ方法による標的ＲＮＡの編集方法を提供する。

【0032】

別の態様では、改良ＬＥＡＰＥＲ方法のためのｄＲＮＡおよび構築体を提供する。

【0033】

本明細書はまた、前記ＲＮＡ編集方法を用いて個体の疾患または病状を治療または予防する方法および組成物を提供する。

【0034】

Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用されているすべての特許、出願、開示された出願やその他の刊行物は、全体として本明細書に組み込まれている。この節に記載された定義が、引用によって本明細書に組み込まれた特許、出願またはその他の出版物に記載された定義と相反するかまたは一致しない場合、この節に記載された定義は、引用によって本明細書に組み込まれた定義よりも優先される。

【0035】

なお、別個の実施形態の文脈で説明された本開示のいくつかの特徴は、明確にするために、個別の実施形態において組み合わせて提供されてもよい。逆に、簡潔さから、個別の実施形態の文脈で説明された本開示の様々な特徴は、別個に、または任意の適切なサブセットとして提供されてもよい。特定の方法ステップ、試薬、または条件に関連する実施形態のすべての組合せは、本開示によって明示的に包含され、それぞれおよび各組合せが別々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書において開示される。

【0036】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「１／１種（ａ／ａｎ）」および「該／前記（ｔｈｅ）」は、文脈で特に明示的に説明されていない限り、複数の対象を含む。なお、特許請求の範囲は任意の構成要素を除外するように記載されてもよい。このように、このような陳述は、請求項の構成要素の明細書と共に「唯一」、「のみ」などの排他的な用語を使用する先行基礎として、または「負の」制限を使用することを意図している。

【0037】

用語「デアミナーゼ動員ＲＮＡ」、「ｄＲＮＡ」、「ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ」、および「ａｒＲＮＡ」は、本明細書では相互に交換して使用可能であり、ＡＤＡＲを動員してＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化することができる遺伝子操作ＲＮＡを意味する。

【0038】

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は、相互に交換して使用可能である。これらは、任意の長さのヌクレオチドの重合形態、すなわちデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその類似体を意味する。

【0039】

本明細書で使用されるように、「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」、および「ヒポキサンチン」という用語は、それ自体が核酸塩基を意味する。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに部分的に結合した核酸塩基を意味する。「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を意味する。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－リボシル－リン酸または核酸塩基－デオキシリボシル－リン酸を意味する。アデノシンおよびアデニン（「Ａ」と略称される）、グアノシンおよびグアニン（「Ｇ」と略称される）、シトシンおよびシチジン（「Ｃ」と略称される）、ウラシルおよびウリジン（「Ｕ」と略称される）、チミンおよびチミジン（「Ｔ」と略称される）、イノシンおよびヒポキサンチン（「Ｉ」と略称される）という用語は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを意味するために、相互に交換して使用されることがある。場合によって、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドという用語は、文脈において異なるものとすることが明確に要求されない限り、相互に交換して使用することができる。

【0040】

本明細書で使用されるように、用語「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ／ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」は、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ｄＲＮＡ、または本明細書で記載されたベクターを含む１つまたは複数の構築体）、その１つまたは複数の転写物を宿主細胞に送達することを意味する。本発明は、標的化可能なＲＮＡ編集のための基本プラットフォームとして使用され、前記ＲＮＡは、例えば、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、および小さなＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）である。本出願の方法は、本明細書に記載のｄＲＮＡまたは構築体を宿主細胞に導入するために、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびコンジュゲーションを含むが、これらに限定されない多くの送達システムを採用することができる。従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法は哺乳動物細胞または標的組織への核酸導入に有用である。このような方法は、培養生物または宿主生物中の細胞に、本出願のｄＲＮＡをコードする核酸を投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築体の転写物）、ベア核酸、およびリポソームのような送達ベクターと複合化された核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、宿主細胞に送達するための遊離または組み込まれたゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。

【0041】

本出願の文脈において、「標的ＲＮＡ」とは、完全に相補性または実質的に相補性を有するようにデアミナーゼ動員ＲＮＡ配列が設計されたＲＮＡ配列を意味し、標的配列とｄＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、前記標的アデノシンを脱アミノ化させるＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員する標的アデノシン含有二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、真核細胞（例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞）のような宿主細胞に天然に存在する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に導入される。

【0042】

本明細書で使用されるように、「相補性」とは、核酸が従来のワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対を介して他の核酸と水素結合を形成する能力を意味する。相補性のパーセンテージは、第２の核酸と水素結合（すなわちワトソン・クリック塩基対）を形成し得る核酸分子中の残基のパーセンテージ（例えば、約１０分の５、６、７、８、９、１０、すなわち、相補性は約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％）を表す。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続する全ての残基が、第２の核酸配列の連続する残基と同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用されるように、「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域において、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の相補性の程度を意味するか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を意味する。

【0043】

本明細書で使用されるように、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が、主に前記標的配列にハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしないような条件をいう。ストリンジェントな条件は、通常、配列依存的であり、多くの要因によって変化する。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非制限的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ，」 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ，Ｙに詳細に記載されている。

【0044】

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成する反応をいう。水素結合による結合は、ワトソン－クリック塩基対、ホグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で起こり得る。与えられた配列にハイブリダイズし得る配列は、与えられた配列の「補体」と呼ばれる。

【0045】

本明細書で使用されるように、用語「具備する」、「含有」、および「含む」は、オープンで非限定的な意味で使用される。なお、本明細書に記載の本出願の態様および実施形態は、「からなる」および／または「実質的に、からなる」態様および実施形態を含みうる。

【0046】

なお、用語「約」が明示的に使用されているか否かにかかわらず、本明細書で与えられた各数量は、実際に与えられた値を指し、また、与えられた値に基づく実験および／または測定条件の同値および近似値を含む、当業者によって合理的に推測される与えられた値の近似値も指す。

【0047】

本明細書で使用されるように、「担体」は、使用された用量および濃度でそれに曝露された細胞または哺乳動物に対して毒性のない、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、通常、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の非限定的な例としては、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩生成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0048】

本明細書で使用されるように、物質の用語「有効量」または「治療有効量」は、少なくとも、特定の疾患の測定可能な改善または予防をもたらすのに必要な最小限の濃度である。本明細書における有効量は、疾患の状態、患者の年齢、性別、体重、および個体内で所望の応答を引き起こす当該物質の能力などの要因によって変化することがある。有効量は、治療上の有益な作用が、治療上の有毒または有害な作用を全て上回る量でもある。がんに関しては、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、および／または腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍の成長を阻害する）、またはがんにおける他の望ましくない細胞の増殖を予防または遅延するのに十分な量を含む。一部の実施形態において、有効量は、がんの進行を遅延させるのに十分な量である。一部の実施形態において、有効量は、再発を予防または遅延するのに十分な量である。一部の実施形態において、有効量は、個体の再発率を低下させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回で投与することができる。薬剤または組成物の有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させること、（ｉｉ）腫瘍の大きさを縮小すること、（ｉｉｉ）がん細胞の周囲の器官への浸潤をある程度抑制、遅延、低減し、好ましくは停止させること、（ｉｖ）腫瘍の転移を抑制する（すなわち、ある程度低減、好ましくは停止する）こと、（ｖ）腫瘍の増殖を抑制すること、（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延すること、（ｖｉｉ）腫瘍の再発率を低下させること、および／または（ｖｉｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状をある程度緩和すること。有効量は、１回または複数回の投与で投与されることができる。本開示の目的のために、薬剤、化合物または医薬組成物の有効量は、直接的または間接的に予防または治療を達成するのに十分な量である。臨床の文脈で理解されているように、他の薬剤、化合物、または医薬組成物と組み合わせると、有効量の薬剤、化合物、または医薬組成物を達成することができるか、達成することができない。したがって、「有効量」は、１つまたは複数の治療薬を投与する場合に考慮され、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて所望の結果が得られるまたは得られた場合、有効量の単一薬剤が投与されたものとみなすことができる。

【0049】

ここで述べるように、「宿主細胞」とは、本明細書に記載のように修飾できれば、宿主細胞として使用できるあらゆる種類の細胞を意味する。例えば、前記宿主細胞は、内因的に発現されるＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を有する宿主細胞であってもよいし、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が当分野で公知の方法により導入された宿主細胞であってもよい。前記宿主細胞は、例えば、原核細胞、真核細胞または植物細胞であってもよい。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト細胞系または非ヒト細胞系を含む哺乳動物細胞系のような、予め確立された細胞系から誘導される。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト個体などの個体から誘導される。

【0050】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ（一部の実施形態において２つ）のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に側面を有する１つ以上の異種配列（すなわち、非ＡＡＶ由来の核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを意味する。このようなｒＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルス（または適切なヘルパー機能を発現する）に感染し、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子として複製してパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体中またはクローニングまたはトランスフェクションのためのプラスミドのような別のベクター中）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター（ｐｒｏ－ｖｅｃｔｏｒ）」と称されてもよく、ＡＡＶパッケージング機能および適切な補助機能の存在下で複製およびキャプシド化によって「救い出す」ことができる。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体、脂質との複合化して、リポソームにカプセル化し、ウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子にカプシド化しているものを含むが、これらに限定されない様々な形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングされてもよい。

【0051】

用語「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に約１４５ヌクレオチドの配列が存在するものであり、この分野で広く知られている。ＩＴＲの最も外側の１２５個のヌクレオチドは２種類の任意の方向の１つに存在することができ、それによって異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの両端間の異質性をもたらす。最も外側の１２５個のヌクレオチドは、いくつかの短い自己相補的領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と呼ばれる）も含み、それによって、ＩＴＲのこの部分内での鎖内塩基対の発生が可能になる。

【0052】

「プロトコル」とは、通常、商業用医薬品の包装に含まれる取扱書であって、通常商業用医薬品の包装に含まれる適応症に関する情報を含み、これらの情報には、適応症、用法、用量、投与方法、禁忌症、この包装製品と組み合わせて使用される他の薬物、および／またはこの薬物の使用に関する警告に関する情報が含まれている。

【0053】

「被験者」、「患者」、または「個体」は、人間または他の動物のような哺乳動物を含み、通常は人間である。一部の実施形態において、治療剤および組成物が投与される患者などの被験者は、哺乳動物、通常ヒトなどの霊長類である。一部の実施形態において、前記霊長類はサルまたは類人猿である。前記被験者は、男性または女性であってもよく、幼児、少年、青少年、成人および高齢者を含む任意の適切な年齢であってもよい。一部の実施形態において、前記被験者は、非霊長類哺乳動物、例えば齧歯類、イヌ、ネコ、ウシまたはウマなどの農場動物である。

【0054】

本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、臨床病理学的過程において、治療される個体または細胞の自然な過程に有益かつ望ましい効果をもたらすように設計された臨床的介入を意味する。本開示の目的のために、治療による望ましい効果は、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または低減、および予後の緩和または改善を含むが、これらに限定されない。例えば、がんに関連する１つ以上の症状が軽減または解消され、がん細胞の増殖を減少させる（またはがん細胞を破壊する）こと、癌細胞への殺傷を増加させること、その疾患による症状を軽減させること、その疾患の伝播を予防すること、その疾患の再発を予防すること、その疾患に罹患した人々の生活の質を向上させること、その疾患の治療に必要な他の薬物の投与量を減少させること、その疾患の進行を遅延させること、および／またはその個体の生存を延長させることを含むが、これらに限定されるものではなく、この場合、その個体は成功的に「治療」するものとする。

【0055】

ＩＩ．ＲＮＡ編集方法
本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞（例えば真核細胞）に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、方法を提供する。

【0056】

環状ｄＲＮＡ
一つの態様では、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞（例えば真核細胞）に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、（３）前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0057】

一部の実施形態において、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、任意のタンパク質、またはこのタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0058】

一部の実施形態において、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、任意のタンパク質、またはこのタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0059】

一部の実施形態において、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、任意のタンパク質、またはこのタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0060】

一部の実施形態において、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することと、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することとを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（「Ａ」）残基を脱アミノ化することができ、（３）前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、または環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされるＡＤＡＲであり、前記ＡＤＡＲの導入は、前記宿主細胞におけるＡＤＡＲの過剰発現を含む。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に対して外因的である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体は、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）のようなベクターである。

【0061】

一態様では、本出願は、複数のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする１つ以上の構築体を宿主細胞に導入することによって、前記宿主細胞中の複数の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００またはそれ以上）を編集する方法を提供する。

【0062】

一態様では、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである。一部の実施形態において、Ｌｉｔｋｅ， Ｊ．Ｌ．およびＪａｆｆｒｅｙ， Ｓ．Ｒ． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，６６７－６７５ （２０１９）に記載されたＴｏｒｎａｄｏ発現系（「持続的過剰発現のためのツイスター最適化ＲＮＡ」）を使用して循環を行い、これは、全体として本明細書に引用によって組み込まれている。要するに、Ｔｏｒｎａｄｏ発現の転写物は、ツイスターリボザイムを側面に有する標的ＲＮＡを含む。ツイスターリボザイムは自己切断が可能なあらゆる触媒ＲＮＡ配列である。このリボザイムは急速に自己接触分解を受け、残りの末端はＲＮＡリガーゼで連結されている。

【0063】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体によって導入される。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列とをさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは自己触媒的に開裂する。一部の実施形態において、前記触媒されたｄＲＮＡ産物は、３’末端に５’－ヒドロキシル基および２’，３’－環状リン酸エステルを含む。一部の実施形態において、前記触媒されたｄＲＮＡ産物は、一般的に存在する内在性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢ）によって連結される。一部の実施形態において、前記構築体はプラスミドまたはウイルスベクターである。

【0064】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ転写物は、さらに５’および／または３’ライゲーション配列を側方に有し、それに、それぞれ５’－ツイスターリボザイムおよび／または３’－ツイスターリボザイムを側方に有する。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、５’ライゲーション配列を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、互いに完全に相補的である。

【0065】

一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、独立して、少なくとも約２０ヌクレオチドが、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、独立して、約２０～３０ヌクレオチド、約３０～４０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約５０～６０ヌクレオチド、約６０～７０ヌクレオチド、約７０～８０ヌクレオチド、約８０～９０ヌクレオチド、約９０～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、または約１００～１５０ヌクレオチドである。

【0066】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼによって環化される。ＲＮＡリガーゼの非制限的な例としては、ＲｔｃＢ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２、Ｒｎｌ３およびＴｒｌ１が含まれる。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼは前記宿主細胞において内因的に発現される。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。一部の実施形態において、前記方法は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲｔｃＢ）を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。

【0067】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは宿主細胞に導入される前に環化される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは化学的に合成される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素的連結（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼを使用する）または化学的連結（例えば、臭化シアンまたは類似の縮合剤を使用する）によって環化される。

【0068】

１つまたは２つのｓｎｏＲＮＡ末端を有するｄＲＮＡ
別の態様では、本出願は、デアミナーゼ－動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞（例えば真核細胞）において標的ＲＮＡを編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列、および（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる方法を提供する。

【0069】

一部の実施形態において、本明細書は、デアミナーゼ－動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞（例えば真核細胞）において標的ＲＮＡを編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、宿主細胞の内因的に発現されるＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、任意のタンパク質、またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0070】

一部の実施形態において、本明細書は、（ａ）デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体、および（ｂ）ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞（例えば、真核細胞）において標的ＲＮＡを編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、前記宿主細胞の内因的にコードされるＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、前記宿主細胞におけるＡＤＡＲの過剰発現を含む。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に対して外因的である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体は、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）のようなベクターである。

【0071】

一態様では、本出願は、複数のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする１つ以上の構築体を宿主細胞に導入することによって、宿主細胞中の複数の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００またはそれ以上）を編集する方法を提供する。

【0072】

核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、他のＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、および核内低分子ＲＮＡ）の化学修飾を導くことが知られている小さな非コードＲＮＡ分子である。ｓｎｏＲＮＡはその特定の二次構造特徴により、ボックス（ｂｏｘ）Ｃ／ＤとボックスＨ／ＡＣＡの２種類に分けられる。ｓｎｏＲＮＡは、２つの構造的特徴により、補助タンパク質と共に対応するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）に結合し、機能的な核小体低分子リボ核タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）複合体を形成することが可能である。ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡはメチル化に関連していると考えられ、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡは偽ウリジン化に関連していると考えられている。ｓｎｏＲＮＡの他のファミリーには、例えば、複合Ｈ／ＡＣＡおよびＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ、および孤立したｓｎｏＲＮＡが含まれる。本明細書に記載のｓｎｏＲＮＡ配列は、天然に存在するｓｎｏＲＮＡ、その一部またはそれらの変体を含み得る。

【0073】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）と、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）とを含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチドが、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、約５０～７５ヌクレオチド、約７５～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約１５０～１７５ヌクレオチド、約１７５～２００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、約１２５～１７５ヌクレオチド、または約１００～２００ヌクレオチドである。

【0074】

一部の実施形態において、前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列（５’－ＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧ－３’）を含む。一部の実施形態において、前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列（５’－ ＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＴＡＡ－３’）を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。

【0075】

Ｐｏｌ ＩＩプロモーターを有する構築体
別の態様では、本明細書は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0076】

一部の実施形態において、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞の内因的に発現されるＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、任意のタンパク質、またはタンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、またはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含まない。

【0077】

一部の実施形態において、本明細書は、（ａ）デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体、（ｂ）ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞の内在的にコードされるＡＤＡＲであり、前記ＡＤＡＲの導入は、前記宿主細胞におけるＡＤＡＲの過剰発現を含む。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に対して外因的である。一部の実施形態において、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む前記構築体は、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）などのベクターである。

【0078】

一態様では、本出願は、複数のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする１つ以上の構築体を宿主細胞に導入することによって、前記宿主細胞中の複数の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００またはそれ以上）を編集する方法を提供する。一部の実施形態において、１つのＰｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ）は２つ以上のｄＲＮＡの発現を駆動している。

【0079】

Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非制限的な例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１α、ＣＡＧ、およびＲＳＶが含まれる。一部の実施形態において、前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号３の核酸配列を含む：（５’－ ＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ－３’）。

【0080】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞はネズミ細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は植物細胞または真菌細胞である。

【0081】

本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＲＤ、ＳＦ２６８、ＳＷ１３およびＨｅＬａ細胞のような細胞株である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、線維芽細胞、上皮細胞または免疫細胞のような初代細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は有糸分裂後の細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、例えば、小脳細胞のような脳細胞のような中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である。

【0082】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に内因的である。一部の実施形態において、前記ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、宿主細胞中、例えば真核細胞中に天然または内因的に存在する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞によって内因的に発現される。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に外因的に導入される。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の群より選ばれる１つ以上のＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１であり、例えば、ＡＤＡＲ１のｐ１１０とアイソタイプである（「ＡＤＡＲ１^ｐ１１０」）および／またはＡＤＡＲ１のｐ１５０アイソタイプ（「ＡＤＡＲ１^ｐ１５０」である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ２である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞によって発現されたＡＤＡＲ２、例えば、小脳細胞によって発現されたＡＤＡＲ２である。

【0083】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に対して外因的であるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、天然に存在するＡＤＡＲの過剰に活性化された変異体である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、Ｅ１００８Ｑ変異を含むＡＤＡＲ１である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、遺伝子操作された二本鎖核酸結合ドメインを含まない。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、前記ｄＲＮＡ中の相補的なＲＮＡ配列に融合されたＭＳ２ヘアピンに結合されたＭＣＰドメインを含まない。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲはＤＳＢを含まない。

【0084】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記宿主細胞は高いＡＤＡＲ１発現レベル（例えば、ＡＤＡＲ１^ｐ１１０および／またはＡＤＡＲ１^ｐ１５０）を有し、例えば、β－チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２ｘ、３ｘ、５ｘまたはそれ以上のいずれか１つである。一部の実施形態において、前記宿主細胞は高いＡＤＡＲ２発現レベルを有し、例えば、β－チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２ｘ、３ｘ、５ｘ、またはそれ以上である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は低いＡＤＡＲ３発現レベルを有し、例えば、β－チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、約５ｘ、３ｘ、２ｘ、１００％、５０％、２０％、またはそれ以下である。

【0085】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ヌクレオチドのいずれか１つの数のヌクレオチドを含む。本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ヌクレオチド以下のいずれか１つの数のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０または１０５～１４０ヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドの数である。

【0086】

本明細書に記載の方法または用途のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＡＤＡＲ－動員ドメインを含まない。「ＡＤＡＲ動員ドメイン」は、ＡＤＡＲに高親和性で結合するヌクレオチド配列または構造であってもよく、または、遺伝子操作されたＡＤＡＲ構築体に融合されたＡＤＡＲの結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であってもよい。例示的なＡＤＡＲ動員ドメインとしては、ＧｌｕＲ－２、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｒ／Ｇ）、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｑ／Ｒ）、ＧｌｕＲ－６（Ｒ／Ｇ）、５ＨＴ２ＣおよびＦｌｎＡ（Ｑ／Ｒ）ドメインを含むが、これらに限定されるものではなく、例えば、Ｗａｈｌｓｔｅｄｔ， Ｈｅｌｅｎｅ,およびＭａｒｉｅ， “Ｓｉｔｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ．“ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ： ＲＮＡ ２．６ （２０１１）： ２０ ７６１－７７１を参照し、これは引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは二本鎖部分を含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、ＭＳ２ステムループのようなヘアピンを含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは一本鎖である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＤＳＢ結合ドメインを含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは相補的なＲＮＡ配列からなる（または本質的にそれからなる）。

【0087】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは化学修飾を含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドのような化学修飾されたヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、最初の３残基および後の３残基のみで２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ではない。

【0088】

本明細書に記載のｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含む。本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ヌクレオチドのいずれか１つの数のヌクレオチドを含む。本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ヌクレオチド以下のいずれか１つの数のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列のヌクレオチド長は、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、１０７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１６０、１１０～１７５、１１０～１５０、１４０～１６０、１０５～１４０または１０５～１５５ヌクレオチドのいずれか１つの数のヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列の長さは、約７１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは約１１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは約１５１ヌクレオチドである。

【0089】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基の真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基の真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドの箇所に存在する。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記相補的なＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５、３０、３５またはそれ以上のヌクレオチドの箇所に存在する。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から２０（例えば、１５、１０、５以下）ヌクレオチド内には存在しない。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、少なくとも２５、３０、３５以上のヌクレオチド）および前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０以上のヌクレオチド）に存在する。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の中心に位置する。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、前記ｄＲＮＡ中の標的配列の中心の２０ヌクレオチド（例えば、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド）内に位置する。

【0090】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、１、２、３、４、５、６、または複数のＧのような１つ以上のグアノシン（Ｇ）をさらに含み、すなわち、各Ｇは、前記標的ＲＮＡにおいて非標的アデノシンと正対している。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシン（Ａ）に対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチド（例えば、２、３、４、５またはそれ以上のミスマッチヌクレオチド）を含む。

【0091】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、約２０個以下の非標的Ａ、例えば、約１５個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個の非標的Ａのいずれか１つを超えない数の非標的Ａを含む。非標的Ａに対向するＧと連続するミスマッチヌクレオチドはＡＤＡＲのオフターゲット編集作用を低下させることができる。

【0092】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基は、前記標的ＲＮＡにおいて、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフにある。一部の実施形態において、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、３塩基モチーフにおいてＵの真向かいにあるＡ、標的Ａの真向かいにあるＣ、および３塩基モチーフにおいてＧの真向かいにあるＣ、ＧまたはＵを含む。一部の実施形態において、前記３塩基モチーフは、前記標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む。一部の実施形態において、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣを含む。

【0093】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、および小さなＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）からなる群より選ばれるいずれか１つのＲＮＡである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。

【0094】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲ３の阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤は、ＡＤＡＲ３に対するｓｈＲＮＡまたはＡＤＡＲ３に対するｓｉＲＮＡのような、ＡＤＡＲ３に対するＲＮＡｉである。一部の実施形態において、前記方法は、インターフェロン刺激物質を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲはインターフェロンにより誘導されてもよく、例えば、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ^ｐ１５０である。一部の実施形態において、インターフェロンの刺激物質はＩＦＮである。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤および／またはインターフェロンの刺激物質は、前記ｄＲＮＡをコードする同じ構築体（例えば、ベクター）によってコードされる。

【0095】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上のいずれか１つである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡの編集効率は少なくとも約４０％である。一部の実施形態において、前記編集効率は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングによって決定される。一部の実施形態において、前記編集効率は次世代シーケンシングによって決定される。一部の実施形態において、前記編集効率は、レポーター遺伝子（例えば、ＥＧＦＰのような蛍光レポーター）の発現を評価することによって決定される。

【0096】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記方法は、低いオフターゲット編集率を有する。一部の実施形態において、前記方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａに対して、約１％未満（例えば、約０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％以下のいずれか１つ）の編集効率を有する。一部の実施形態において、前記方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａを編集しない。一部の実施形態において、前記方法は、非標的ＲＮＡ中のＡに対して、約０．１％未満（例えば、約０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％以下のいずれか１つ）の編集効率を有する。

【0097】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記方法は、先天性免疫応答のような免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、前記方法は、宿主細胞におけるインターフェロンおよび／またはインターロイキンの発現を誘導しない。一部の実施形態において、前記方法は、宿主細胞においてＩＦＮ－βおよび／またはＩＬ－６の発現を誘導しない。

【0098】

本明細書に記載の方法のいずれか１つによって製造された編集されたＲＮＡまたは編集されたＲＮＡを有する宿主細胞も提供される。一部の実施形態において、前記編集されたＲＮＡはイノシンを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ミスセンス変異、早期終止コドン、可変的スプライシング部位または異常なスプライシング部位を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、変異したタンパク質、トランケートされたタンパク質、または誤って折り畳まれたタンパク質を含む。

【0099】

核酸の非ウイルス送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック法、ウイルスソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エキソマー、マイクロバブルまたは遺伝子銃、裸のＤＮＡ、および人工ウイルス粒子が含まれる。

【0100】

核酸送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムは、ウイルスを特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送するのに効率的である。

【0101】

本明細書に記載の方法のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡをコードするウイルスベクター（例えばＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）を宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、前記構築体は、１つまたは複数のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列を側面に有する。一部の実施形態において、前記構築体は２つのＡＡＶ ＩＴＲを側面に有する。一部の実施形態において、前記ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、前記ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲである。一部の実施形態において、前記ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、前記スタッファー核酸は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の上流または下流に位置する。一部の実施形態において、前記ベクターは自己相補型ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、前記ベクターは、前記ｄＲＮＡをコードする第１の核酸配列と、前記ｄＲＮＡの相補配列をコードする第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列は、その長さの大部分または全長に沿って、第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成し得る。一部の実施形態において、前記第１の核酸配列および第２の核酸配列は変異したＡＡＶ ＩＴＲによって連結され、前記変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の変異を含む。一部の実施形態において、前記ベクターはキャプシドによってｒＡＡＶ粒子中に包まれている。一部の実施形態において、前記ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、１５ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶ２Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。

【0102】

一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡをコードするプラスミドを宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡ（例えば、合成ｄＲＮＡ）を宿主細胞内にエレクトロポレーションすることを含む。一部の実施形態において、前記方法は、前記ｄＲＮＡを宿主細胞にトランスフェクションすることを含む。

【0103】

脱アミノ化後、標的ＲＮＡおよび／または前記標的ＲＮＡがコードするタンパク質の修飾は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を用いて決定することができる。例えば、標的ＲＮＡ中の「Ａ」が「Ｉ」に編集されているか否かを決定するために、前記分野で知られているＲＮＡシーケンシング方法を用いて、前記ＲＮＡ配列の修飾を検出することができる。前記ＲＮＡ編集は、標的アデノシンがｍＲＮＡのコード領域に位置する場合、前記ｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列の変化をもたらし得る。例えば、「Ａ」から「Ｉ」への形質転換により、点変異を先天的なｍＲＮＡに導入することができ、またはｍＲＮＡ中の獲得点変異を逆転させて野生型遺伝子産物を生成することができる。当該分野で知られている方法によるアミノ酸のシーケンシングは、コードされたタンパク質中のアミノ酸残基の変化を発見するのに有用である。終止コドンの修飾は、機能性、伸長性、トランケート、全長および／または野生型のタンパク質の存在を評価することによって決定され得る。例えば、標的アデノシン残基（ＵＧＡまたはＵＡＧ）またはＡ（ＵＡＡ）に対する修飾は、前記標的アデノシンがＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ終止コドンに位置する場合、リードスルー変異および／または伸長タンパク質を生成することができ、または前記標的ＲＮＡによってコードされるトランケートされたタンパク質を逆転させて、機能性、全長および／または野生型タンパク質を生成することができる。標的ＲＮＡの編集はまた、前記標的ＲＮＡ中に異常なスプライシング部位および／または可変的スプライシング部位を生じさせ、それにより、伸長した、トランケートされた、または誤って折り畳まれたタンパク質を生じさせるか、または前記標的ＲＮＡ中にコードされた異常なスプライシング部位または可変的スプライシング部位を逆転させて、機能的、正しく折り畳まれた、全長および／または野生型タンパク質を生じさせることができる。一部の実施形態において、本出願は、ミスセンス変異、早期終止コドン、標的ＲＮＡによってコードされる異常なスプライシングまたは可変的スプライシング部位などの、先天的および後天的な遺伝的変化の編集を考慮する。既知の方法を用いて、前記標的ＲＮＡがコードするタンパク質の機能を評価することにより、前記ＲＮＡ編集が所望の効果を達成するか否かを見出すことができる。アデノシン（Ａ）を脱アミノ化してイノシン（Ｉ）にすることにより、タンパク質をコードする変異ＲＮＡ中の標的部位の変異Ａを修正することができるので、前記脱アミノ化イノシンを同定することにより、機能性タンパク質の存在の有無や、変異アデノシンの存在に起因する疾患や薬剤耐性に関連するＲＮＡが逆転しているか、部分的に逆転しているかを評価することができる。同様に、アデノシン（Ａ）を脱アミノ化してイノシン（Ｉ）にすることにより、得られたタンパク質に点変異を導入することができるので、前記脱アミノ化してイノシンにすることを同定することは、疾患の原因または疾患の関連因子を同定するための機能的指標を提供することができる。

【0104】

このリードアウト（ｒｅａｄ－ｏｕｔ）は、標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、異常なスプライシングの発生および頻度の評価とすることができる。一方、標的アデノシンを脱アミノ化してスプライシング部位を導入したい場合、同様の方法を用いて、所望のタイプのスプライシングが発生しているか否かを調べることができる。当業者に公知の方法を用いて、標的アデノシンの脱アミノ化後のイノシンの存在を同定するのに好適な例示的方法は、ＲＴ－ＰＣＲおよびシーケンシングである。

【0105】

標的アデノシンの脱アミノ化作用としては、例えば、点変異、早期終止コドン、異常なスプライシング部位、可変的スプライシング部位、および得られたタンパク質の誤折り畳みが含まれる。これらの作用は、遺伝的に受け継がれるか後天性遺伝子変異に起因するかにかかわらず、疾患に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造および機能の変化を誘導したり、薬剤耐性の発生に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造および機能の変化を誘導したりすることができる。従って、本出願のｄＲＮＡ、前記ｄＲＮＡをコードする構築体、およびＲＮＡ編集方法は、遺伝的遺伝子疾患または病状、または獲得遺伝子変異に関連する疾患または病状を、疾患に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造および／または機能を変化させることにより予防または治療するのに有用である。

【0106】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは制御性ＲＮＡである。一部の実施形態において、前記編集すべき標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、または小さなＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡまたはｓｃａＲＮＡ）である。標的アデノシンの脱アミノ化作用としては、例えば、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡまたは小さなＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）の構造および機能の変化、例えば、三次元構造の変化および／または前記標的ＲＮＡの機能の喪失または機能の獲得が含まれる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的Ａの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡの１つ以上の下流分子（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、および／または代謝物）の発現レベルを変化させる。下流分子の発現レベルの変化は、発現レベルの増減であってもよい。

【0107】

本出願の一部の実施形態は、宿主細胞における標的ＲＮＡの多重編集に関するものであり、これは、標的遺伝子の異なる変体または宿主細胞における異なる遺伝子のスクリーニングに有用である。一部の実施形態において、前記方法は複数のｄＲＮＡを宿主細胞に導入することを含み、前記複数のｄＲＮＡのうち少なくとも２つは、異なる配列を有するおよび／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態において、各ｄＲＮＡは、異なる配列および／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態において、前記方法は、宿主細胞中の単一の標的ＲＮＡ内に複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の修飾を生成する。一部の実施形態において、前記方法は、宿主細胞中の複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の標的ＲＮＡにおいて修飾を生成する。一部の実施形態において、前記方法は、複数の宿主細胞集団における複数の標的ＲＮＡを編集することを含む。一部の実施形態において、宿主細胞の各集団は、他の宿主細胞集団と異なるｄＲＮＡまたは異なる標的ＲＮＡを有するｄＲＮＡを受け取る。

【0108】

ＩＩＩ．デアミナーゼ動員ＲＮＡ、構築体およびライブラリー
また、本明細書はまた、本明細書に記載の方法のいずれにも使用され得るデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは構築体を提供する。本節に記載されたｄＲＮＡまたは構築体のいずれも、本明細書に記載のＲＮＡの編集および処理に使用することができる。本明細書に記載のｄＲＮＡまたは構築体に対する任意の特徴およびパラメータは、あたかもそれぞれの組み合わせが別個に記載されているかのように、互いに組み合わされ得ることが意図される。本明細書に記載のｄＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に用いられるｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含まない。一部の実施形態において、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含むｄＲＮＡを提供する。

【0109】

一態様では、本発明は、本明細書に記載のデアミナーゼ－動員ＲＮＡのいずれか１つを含む構築体を提供する。一部の実施形態において、前記構築体は、ウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）またはプラスミドである。一部の実施形態において、前記構築体は単一のｄＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、前記構築体は、複数（例えば、約１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上）のｄＲＮＡをコードする。

【0110】

一態様では、本出願は、複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは本明細書に記載の複数の構築体を含むライブラリーを提供する。

【0111】

一態様では、本出願は、デアミナーゼ動員ＲＮＡまたは本明細書に記載の構築体を含む組成物または宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞はヒト細胞である。

【0112】

環状ｄＲＮＡおよび構築体
一態様では、本明細書は、標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、前記標的ＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡはＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、前記ｄＲＮＡは環状であるかまたは環状ＲＮＡを形成することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。

【0113】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、Ｔｏｒｎａｄｏ法によって循環される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ転写物の側面も５’および／または３’ライゲーション配列であり、その側面はそれぞれ５’－ツイスターリボザイムおよび／または３’－ツイスターリボザイムである。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が互いに相補的である。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、互いに完全に相補的である。

【0114】

一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、独立して、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、独立して、約２０～３０ヌクレオチド、約３０～４０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約５０～６０ヌクレオチド、約６０～７０ヌクレオチド、約７０～８０ヌクレオチド、約８０～９０ヌクレオチド、約９０～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、または約５０～１００ヌクレオチド、または約１００～１５０ヌクレオチドである。

【0115】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼによって環化される。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼは宿主細胞において内因的に発現される。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。一部の実施形態において、前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは宿主細胞において内因的に発現される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏの酵素的連結（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼを使用する）または化学的連結（例えば、臭化シアンまたは類似の縮合剤を使用する）によって環化される。

【0116】

本明細書はまた、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を提供する。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体によって導入される。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列とをさらに含む。一部の実施形態において、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列は、ツイスターＰ１である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは自己触媒的に切断される。一部の実施形態において、前記触媒されたｄＲＮＡ産物は、３’末端に５’－ヒドロキシルおよび２’，３’－環状リン酸エステルを含む。一部の実施形態において、前記触媒されたｄＲＮＡ産物は、一般的に存在する内在性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢ）によって連結される。一部の実施形態において、前記構築体はプラスミドまたはウイルスベクターである。

【0117】

１つまたは２つのｓｎｏＲＮＡ末端を有するｄＲＮＡおよび構築体
別の態様では、本明細書は、（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に位置する核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含む、標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。

【0118】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、約５０～７５ヌクレオチド、約７５～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約１５０～１７５ヌクレオチド、約１７５～２００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、約１２５～１７５ヌクレオチド、または約１００～２００ヌクレオチドである。

【0119】

一部の実施形態において、前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。

【0120】

Ｐｏｌ ＩＩプロモーターを有する構築体
別の態様では、本明細書は、宿主細胞に取り込まれるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体であって、（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、構築体を提供する。

【0121】

一部の実施形態において、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターがコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されることにより、前記プロモーターは前記コードヌクレオチド配列の転写または発現を制御する。前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、その制御下にあるコードヌクレオチド配列５’（上流）に存在してもよい。前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターとコード配列との間の距離は、前記プロモーターが由来する遺伝子のうち前記プロモーターが制御する遺伝子と前記プロモーターとの間の距離とほぼ同じであってもよい。当技術分野で知られているように、この距離の変化は、プロモーター機能を失うことなく適応することができる。一部の実施形態において、前記構築体は、前記コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態において、前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、前記ＣＭＶプロモーターは、配列番号３の核酸配列を含む。一部の実施形態において、１つのＰｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ）は２つ以上のｄＲＮＡの発現を駆動する。

【0122】

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリー、または組成物のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の編集すべき標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに正対する１つ以上のグアノシンをさらに含む。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度が、Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の５’に最も近い隣接物がＵである。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の５’に最も近い隣接物がＣまたはＡである。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物がＧである。一部の実施形態において、前記標的アデノシン残基の３’に最も近い隣接物がＣである。

【0123】

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリーまたは組成物のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシン残基は、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフ中にある。一部の実施形態において、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、前記３塩基モチーフ中のＵの真向かいにあるＡ、標的Ａの真向かいにあるＣ、および前記３塩基モチーフ中のＧの真向かいにあるＣ、ＧまたはＵを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中のＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＵを含む。

【0124】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基の真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の中心から２０、１５、１０、５、４、３、２、または１ヌクレオチド内のように、相補的ＲＮＡ配列の中心付近にある。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチドである。

【0125】

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリー、または組成物のいずれか１つに係る一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ヌクレオチドを超えるいずれか１つの数のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～１５０または１０５～１４０ヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドの数である。

【0126】

本出願のｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含む。前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと完全に相補的または実質的に相補的であり、前記標的ＲＮＡ配列が標的ＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にする。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと１００％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の少なくとも約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００またはそれ以上のヌクレオチドの連続的な伸長の少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のいずれか１つに相補的である。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列と前記標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の非ワトソン－クリック塩基対の対（すなわちミスマッチ）を有する。

【0127】

ＡＤＡＲ、例えばヒトＡＤＡＲ酵素は、多くの因子に応じて異なる特異性で二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を編集する。重要な要素の１つは、ｄｓＲＮＡ配列を構成する２本の鎖の相補性の程度である。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの完全な相補性は、通常、ＡＤＡＲの触媒ドメインによってアデノシンを非差別的に脱アミノ化させる。ＡＤＡＲの特異性および効率は、ｄｓＲＮＡ領域にミスマッチを導入することによって修飾され得る。例えば、Ａ－Ｃミスマッチは、編集すべきアデノシンの脱アミノ化の特異性および効率を高めることから、好ましく推奨される。逆に、Ｇ－Ａミスマッチは、標的アデノシン残基以外の他のＡ（アデノシン）位置（すなわち「非標的Ａ」）において、オフターゲット編集を減少させることができる。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡのハイブリダイゼーションと形成には基本的な相補性を有する限り、ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡの形成は必ずしも完全な相補性を必要としない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ配列またはその一本鎖ＲＮＡ領域は、最適にアライメントされた場合、標的ＲＮＡと７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つの配列相補性を有する。最適なアライメントは、配列アライメントに使用される任意の適切なアルゴリズムを使用して決定してもよく、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）が含まれる。

【0128】

標的アデノシンに隣接するヌクレオチドも、脱アミノ化の特異性および効率に影響を与える。例えば、アデノシンの脱アミノ化の特異性および効率に関しては、標的ＲＮＡ配列中の編集すべき標的アデノシンの５’に最も近い隣接物の優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡ配列中の編集すべき標的アデノシンの３’に最も近い隣接物の優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフにあり得る場合、アデノシンの脱アミノ化の特異性および効率は、他の３塩基モチーフ中のアデノシンよりも高い。一部の実施形態において、編集すべき標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣまたはＡＡＡからなる群より選ばれる３塩基モチーフにある場合、アデノシンの脱アミノ化効率は他のモチーフ中のアデノシンよりもかなり高い。同一の３塩基モチーフに対して、ｄＲＮＡの設計が異なると、脱アミノ化効率が異なる可能性もある。３塩基モチーフＵＡＧを例にとると、一部の実施形態において、ｄＲＮＡが、編集すべき標的アデノシンの真向かいにあるシチジン（Ｃ）、ウリジンの真向かいにあるアデノシン（Ａ）、およびグアノシンの真向かいにあるシチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）を含む場合、前記標的アデノシンは、他のｄＲＮＡ配列を用いた場合よりも脱アミノ化効率が高い。一部の実施形態において、ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＵを含む場合、前記標的ＲＮＡのＵＡＧ中のＡの編集効率は、約２５～９０％（例えば、約２５～８０％、２５％～７０％、２５％～６０％、２５％～５０％、２５％～４０％、または２５％～３０％）に達することができる。

【0129】

標的ＲＮＡ中には、標的アデノシンに加えて、編集されたくない１種以上のアデノシンが存在していてもよい。これらのアデノシンは、編集効率をできるだけ低くすることが好ましい。本開示によれば、標的ＲＮＡにおいてグアノシンとアデノシンが正対している場合、脱アミノ化の効率が著しく低下することを見出した。従って、オフターゲット脱アミノ化を低減するために、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の編集すべき標的アデノシン以外の１つ以上のアデノシンの真向かいにある１つ以上のグアノシンを含むように設計されてもよい。

【0130】

標的ＲＮＡ配列を編集するために必要なレベルの特異性および効率は、用途に依存する。本特許出願の指示に従うと、当業者は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的または実質的に相補的な配列を有するｄＲＮＡを必要に応じて設計することができ、いくつかの試行錯誤を経て、所望の結果を得ることができる。本明細書で使用されるように、「ミスマッチ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）において対向するヌクレオチドであって、ワトソン－クリック塩基対の規則に従って完全な塩基対を形成しないものを意味する。ミスマッチ塩基対としては、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ塩基対が含まれる。標的ＲＮＡにおいて標的アデノシン残基が編集されるＡ－Ｃマッチングを例にとると、ｄＲＮＡは、編集されるＡに対向するＣを含むように設計され、これにより、標的ＲＮＡとｄＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡにおいてＡ－Ｃミスマッチが生じる。

【0131】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡはミスマッチを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つ以上、例えば１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のミスマッチのいずれか１つ（例えば、異なるタイプのミスマッチの同じタイプ）のミスマッチを含む。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－ＣおよびＵ－Ｕから選ばれる１、２、３、４、５、６および７種類のミスマッチのような１つ以上のミスマッチを含む。

【0132】

ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡ中のミスマッチヌクレオチドが突起を形成することができ、このように、標的ＲＮＡの編集効率を向上させることができる。前記ミスマッチにより形成された１つ（標的アデノシン上にのみ形成された）または複数の突起があってもよい。他の突起により誘導されるミスマッチは、標的アデノシンの上流および／または下流にあり得る。前記突起は、単一のミスマッチ突起（１つのミスマッチ塩基対に起因）または複数のミスマッチ突起（複数の連続するミスマッチ塩基対、例えば２つまたは３つの連続するミスマッチ塩基対に起因）とすることができる。

【0133】

前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列は一本鎖である。前記ｄＲＮＡは、完全に一本鎖であってもよいし、１つ以上（例えば、１、２、３またはそれ以上）の二本鎖領域および／または１つ以上のステムループ領域を有していてもよい。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれ以上のヌクレオチドのいずれか１つである。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡ配列の長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、５７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１６０、１１０～１７５、１１０～１５０、１４０～１６０、１０５～１４０または１０５～１５５ヌクレオチドのいずれか１つである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡ中の標的ＲＮＡ配列の長さは、約７１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは約１１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは約１５１ヌクレオチドである。

【0134】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列に加えて、前記ｄＲＮＡを安定化するための領域、例えば、１つ以上の二本鎖領域および／またはステムループ領域を含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡの二本鎖領域またはステムループ領域は、約２００個以下、１５０個以下、１００個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下の塩基対のいずれか１つを含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはステムループまたは二重鎖領域を含まない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＡＤＡＲ動員ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡはＡＤＡＲ動員ドメインを含まない。

【0135】

前記ｄＲＮＡは、１つ以上の修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、核酸塩基修飾および／または骨格修飾を含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを有する。例示的なＲＮＡ修飾は、ホスホロチオエート骨格修飾、リボース中の２’－置換（例えば、２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ置換）、ＬＮＡおよびＬ－ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは核酸塩基または骨格に対する修飾を有さない。

【0136】

本出願はまた、上記の各節に記載されたいずれか１つの構築体を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載のｄＲＮＡを含む構築体も考慮する。本明細書で使用されるように、「構築体」という用語は、ＲＮＡとして転写され得る、またはタンパク質として発現され得るコードヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。一部の実施形態において、前記構築体は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つ以上の調節要素を含む。前記構築体が宿主細胞に導入されると、適切な条件下で、前記構築体中のコードヌクレオチド配列を転写または発現させることができる。

【0137】

一部の実施形態において、前記構築体は、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、これにより、前記プロモーターは、前記コードヌクレオチド配列の転写または発現を制御する。プロモーターは、その制御下にあるコードヌクレオチド配列５’（上流）に位置していてもよい。前記プロモーターとコード配列との間の距離は、該プロモーターが由来する遺伝子のうち、前記プロモーターが制御する遺伝子と前記プロモーターとの距離とほぼ同じであってもよい。当技術分野で知られているように、この距離の変化は、プロモーター機能を失うことなく適応することができる。一部の実施形態において、前記構築体は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態において、前記プロモーターはＵ６プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは、上記の部分に記載されたＰｏｌｙ ＩＩプロモーターである。

【0138】

一部の実施形態において、前記構築体は、本出願に開示されたいずれか１つのｄＲＮＡをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、既に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターは、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸分子；１つまたは複数の自由端を含んだり、自由端を持っていなかったりする（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；当該分野で知られている他のポリヌクレオチド変異体を含むが、これらに限定されない。ベクターの１種は「プラスミド」であり、標準的な分子クローニング技術により、他のＤＮＡセグメントを挿入し得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。いくつかのベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｃｔｏｒ））。宿主細胞に導入された後、他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、いくつかのベクターは、それらに作動可能に連結されたコードヌクレオチド配列の転写または発現を指導することができる。本明細書では、このようなベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。

【0139】

組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸を転写または発現するのに適した形態の本出願の核酸を含んでもよい。一部の実施形態において、前記組換え発現ベクターは、転写または発現のための宿主細胞に基づいて選択することができ、転写または発現すべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「動作可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入された後に宿主細胞において）、調節エレメントに連結されることを意味する。

【0140】

一部の実施形態において、前記ベクターはｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、前記ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型由来のベクターであり、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型などであってもよいが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＩＴＲを含む。一部の実施形態において、前記ＡＡＶ中の核酸はまた、本明細書に記載のｄＲＮＡをコードする。本開示の範囲内では、任意のＡＡＶ血清型の使用が考慮される。一部の実施形態において、前記ベクターはキャプシドによってｒＡＡＶ粒子に包まれている。一部の実施形態において、前記ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶまたはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。

【0141】

一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む構築体（例えばウイルスベクターのようなベクター）を提供する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む構築体（例えばウイルスベクターのようなベクター）を提供する。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列および前記ＡＤＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列を含む構築体を提供する。一部の実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態において、前記第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導可能である。一部の実施形態において、前記構築体は前記ＡＤＡＲをコードしない。一部の実施形態において、前記ベクターは、ＡＤＡＲ３の阻害剤（例えば、ＡＤＡＲ３ ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）および／またはインターフェロンの刺激物質（例えば、ＩＦＮ－α）をコードする核酸配列をさらに含む。

【0142】

ＩＶ．治療方法
本明細書に記載のＲＮＡ編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病状の治療または予防に有用である。

【0143】

一部の実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して標的ＲＮＡを編集することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の細胞中の標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法を提供する。

【0144】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体の細胞に導入することを含む個体（例えば、ヒト個体）の細胞中の標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0145】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体の細胞に導入することを含む個体（例えば、ヒト個体）の細胞中の標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。

【0146】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体の細胞に導入することを含む前記個体（例えば、ヒト個体）の細胞中の標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは内因的に発現される。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を細胞に導入することをさらに含む。

【0147】

一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、個体の疾患または病状に関連する。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の獲得性遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病状である。一部の実施形態において、前記方法は、個体から細胞を得ることをさらに含む。

【0148】

一部の実施形態において、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して、前記個体の細胞において前記疾患または病状に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む方法を提供する。

【0149】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、前記疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0150】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。

【0151】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を、個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0152】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、さらに、編集されたＲＮＡを有する細胞を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の獲得性遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病状である。

【0153】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0154】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる。

【0155】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0156】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の獲得性遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病状である。

【0157】

本出願の方法を使用して治療するのに適した疾患および状態は、例えばＧ－Ａ変異、例えばＲＮＡ転写物におけるミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングを引き起こすＧ－Ａ変異などの変異に関連する疾患を含む。本出願の方法によって回復され得る疾患関連変異の例としては、がんに関連するＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳＩ）に関連するＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えばエクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）、エーラス・ダンロス症候群に関連しているＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例：３８３３Ｇ＞Ａ変異）、原発性肺高血圧に関連するＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）、ジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群に関連するＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）、ファンコニー貧血に関連するＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）、原発性家族性肥大型心筋症に関連するＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３ＧＡ）、およびＸ連鎖重症連合免疫不全に関連するＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記疾患または病状はがんである。一部の実施形態において、前記疾患または病状は単一遺伝子疾患である。一部の実施形態において、前記疾患または病状は、多遺伝子疾患である。

【0158】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するがんを治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0159】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を、個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する癌を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。

【0160】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を、個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するがんを治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0161】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞にエクスビボで導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号４の核酸配列（５’－ＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＵＣＵＧＧＣＡＵＵＣＵＧＧＧＡＧＣＵＵＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＵＧＧＧＵＣＵＵＣＡＧＵＧＡＡＣＣＡＵＵＧＵＵＣＡＡＵＡＵＣＧＵＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＡＵＣＡＵＣＣＡＵＵＧＣＵＵＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡ－３’）を含む。

【0162】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関するがんを治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0163】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するがんを治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0164】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体においてに変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するがんを治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0165】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号４の核酸配列を含む。

【0166】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群またはシャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0167】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー症候群またはシャイエ症候群）を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる方法を提供する。

【0168】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー症候群またはシャイエ症候群）を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0169】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号５の核酸配列（５’－ ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＵＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＧＡＣＧＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＵＣＧＣＣＧＣＧＵＧＧＧＧＵＣＧＵＵＧ－３’）を含む。

【0170】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー症候群またはシャイエ症候群）を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0171】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー症候群またはシャイエ症候群）を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0172】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、ハーラー症候群またはシャイエ症候群）を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0173】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号５の核酸配列を含む。

【0174】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する疾患または病状であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法を提供する。

【0175】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する疾患または病状であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0176】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する疾患または病状であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0177】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号６の核酸配列（５’－ＣＡＵＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＡＣＣＵＵＧＡＵＡＧＣＡＵＣＣＡＡＵＵＵＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＵＵＡＧＧＧＵＣＡＡＣＣＣＡＧＵＡＵＵＣＵＣＣＡＣＵＣＵＵＧＡＧＵＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＡＧＡＡＵＵＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＣＡＧＵＵＵＣＵ－３’）を含む。

【0178】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するエーラス・ダンロス症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0179】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するエーラス・ダンロス症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0180】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するエーラス・ダンロス症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0181】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ} （例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは配列番号６の核酸配列を含む。

【0182】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0183】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0184】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を、個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0185】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号７の核酸配列（５’－ＧＵＧＡＡＧＡＵＡＡＧＣＣＡＧＵＣＣＵＣＵＡＧＵＡＡＣＡＧＡＡＵＧＡＧＣＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＵＵＡＣＣＣＡＧＵＣＡＣＵＵＧＵＧＵＧＧＡＧＡＣＵＵＡＡＡＵＡＣＵＵＧＣＡＵＡＡＡＧＡＵＣＣＡＵＵＧＧＧＡＵＡＧＵＡＣＵＣ－３’）を含む。

【0186】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性肺高血圧の方法を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0187】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性肺高血圧症を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0188】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡを個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性肺高血圧を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む方法を提供する。

【0189】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号７の核酸配列を含む。

【0190】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0191】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0192】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0193】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号８の核酸配列（５’－ＧＵＧＡＡＣＧＵＣＡＡＡＣＵＧＵＣＧＧＡＣＣＡＡＵＡＵＧＧＣＡＧＡＡＵＣＵＵＣＵＣＵＣＡＵＣＵＣＡＡＣＵＵＵＣＣＡＵＡＵＣＣＧＵＡＵＣＡＵＧＧＡＡＵＣＡＵＡＧＣＡＵＣＣＵＧＵＡＡＣＵＡＣＵＡＧＣＵＣＵＣＵＵＡＣＡＧＣＵＧＧ－３’）を含む。

【0194】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ）症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0195】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するジュベール症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0196】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するジュベール症候群を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0197】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号８の核酸配列を含む。

【0198】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0199】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0200】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0201】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号９の核酸配列（５’－ＧＣＣＡＡＵＧＡＵＣＵＣＧＵＧＡＧＵＵＡＵＣＵＣＡＧＣＡＧＵＧＵＧＡＧＣＣＡＵＣＡＧＧＧＵＧＡＵＧＡＣＡＵＣＣＣＡＧＧＣＧＡＵＣＧＵＧＵＧＧＣＣＵＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＵＵＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＣＵ－３’）を含む。

【0202】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するファンコニ貧血を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0203】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するファンコニ貧血を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0204】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異を有する（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するファンコニ貧血を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0205】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号９の核酸配列を含む。

【0206】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスヒドロで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0207】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスヒドロで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡが、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0208】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスヒドロで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0209】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号１０の核酸配列（５’－ＣＡＡＧＡＣＧＧＵＧＡＡＣＣＡＣＵＣＣＡＵＧＧＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＡＣＵＧＵＧＵＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＵＣＣＧＵＧＵＵＧＣＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＧＧＵＧＧＣＵＵＣＣＡＣＵＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＵＵＡＡＧ－３’）を含む。

【0210】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0211】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異を有する（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0212】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異を有する（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有する原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0213】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号１０の核酸配列を含む。

【0214】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエキスビトロで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0215】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0216】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体から単離された細胞にエクスビボで導入することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0217】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列（５’－ＡＧＧＡＵＵＣＵＣＵＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＵＧＣＵＣＣＣＣＣＡＧＵＧＧＡＵＵＧＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＵＣＡＣＵＣＣＡＡＵＧＣＵＧＡＧＣＡＣＵＵＣＣＡＣＡＧＡＧＵＧＧＧＵＵＡＡＡＧＣＧＧＣＵＣＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＧＵＧＵＡ－３’）を含む。

【0218】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異を有する（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法を提供する。

【0219】

一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

【0220】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む有効量の構築体を個体に投与することを含む、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を含有する標的ＲＮＡを有するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法であって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

【0221】

一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤＡＲまたは前記ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは配列番号１１の核酸配列を含む。

【0222】

通常、前記組成物（例えば、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体）の投与量、スケジュール、および経路は、個体のサイズおよび病状に応じて、標準的な薬理学的慣行に従って決定され得る。例示的な投与経路は、静脈内、動脈内、腹膜内、肺内、小胞内、筋内、気管内、皮下、眼内、鞘内、または経皮を含む。

【0223】

本出願のＲＮＡ編集方法は、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）だけでなく、例えば、ＡＤＡＲが内因的に発現している植物または真菌において、植物または真菌のＲＮＡを修飾するために用いることができる。本明細書に記載の方法は、改良された特性を有する遺伝子操作植物および真菌を生成するために用いることができる。

【0224】

本明細書に記載のいずれか１つの治療方法に用いる、ｄＲＮＡ、構築体、編集されたＲＮＡを有する細胞、および組成物のいずれか１つ、ならびに、疾患または病状を治療する薬物の製造に用いる、本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、編集済み細胞、および組成物のいずれか１つをさらに提供する。

【0225】

Ｖ．組成物、キットおよび製品
本明細書はまた、本明細書に記載の、ｄＲＮＡ、構築体、ライブラリー、または編集されたＲＮＡを有する宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。

【0226】

一部の実施形態において、本明細書に記載のｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする構築体のいずれか１つと、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版， Ｏｓｏｌ， Ａ． 編集（１９８０））とを含む医薬組成物が提供される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル等のｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキル；カテコール；レゾルシン；シクロヘキサノール；３－ペンタノールおよびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩生成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態において、凍結乾燥製剤が提供される。インビボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜による濾過によって達成され得る。

【0227】

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、組成物、ライブラリー、または編集された宿主細胞のいずれか１つを含む、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれか１つに使用できるキットがさらに提供される。

【0228】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、前記ｄＲＮＡは、疾患または病状に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、キットが提供される。

【0229】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたは前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、前記ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列と、（２）標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、キットが提供される。

【0230】

一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、キットが提供される。

【0231】

一部の実施形態において、前記キットは、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築体をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、ＡＤＡＲ３の阻害剤またはその構築体をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、インターフェロンの刺激物質またはその構築体をさらに含む。一部の実施形態において、前記キットは、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれか１つを実行するための説明書をさらに含む。

【0232】

本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたポリエステルフィルム（Ｍｙｌａｒ）またはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、細胞培養培地、緩衝液、および解釈情報などの追加コンポーネントを選択可能に提供する場合がある。

【0233】

したがって、本出願はまた、製品を提供する。該製品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含むことができる。適切な容器には、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、ジャー、柔軟な包装などが含まれる。一部の実施形態では、前記容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。前記医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする複数回使用可能なバイアルであってもよい。プロトコルとは、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのような製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、および/または警告などの情報が含まれている。また、該製品は、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。

【0234】

前記キットまたは製品は、薬局（例えば、病院薬局および調剤薬局）での保管および使用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物のおよび使用説明書を含んでもよい。

【0235】

以下の例示的な実施形態および実施例は、本出願の純粋な例として意図されているので、本発明を何らの方式で限定するものとはみなされない。以下の例示的な実施形態および実施例、ならびに詳細な説明は、限定的なものではなく、説明として提供される。

【0236】

例示的な実施形態
本出願は、以下の実施形態を提供する。
１．デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる方法。
２．前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である、実施形態２に記載の方法。
４．前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、実施形態２または３に記載の方法。
５．前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環化される、実施形態１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは前記宿主細胞において内因的に発現される、実施形態４に記載の方法。
７．前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
９．前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列をさらに含む、請求項９に記載の方法。
１１．前記３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態１０に記載の方法。
１３．デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、前記ｄＲＮＡは、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、方法。
１４．前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態１３または１４に記載の方法。
１６．前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは少なくとも約７０ヌクレオチドである、実施形態１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含む、実施形態１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含む、実施形態１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
２１．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態９～１２および２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である、実施形態２４に記載の方法。
２６．デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、方法。
２７．前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである、実施形態２５または２６に記載の方法。
２８．前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである、実施形態９～１２および２３～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記構築体はＡＡＶベクターである、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記ＡＤＡＲは前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態１～３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記宿主細胞はＴ細胞である、実施形態３１に記載の方法。
３３．標的ＲＮＡ配列の長さは５０ヌクレオチドより長い、実施形態１～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記標的ＲＮＡ配列の長さは約１００～約１５０ヌクレオチドである、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む、実施形態１～３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記シチジンミスマッチは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置する、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態１～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９．前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態１～３８のいずれか１項に記載の方法。
４０．前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである、実施形態１～３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、実施形態１～４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ中のウリジンの真向かいにあるＡと、前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンと、前記３塩基モチーフ中のグアノシンの真向かいにあるシチジン、グアノシンまたはウリジンとを含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、実施形態１～４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記標的ＲＮＡはプレメッセンジャーＲＮＡである、実施形態４３に記載の方法。
４５．ＡＤＡＲ３阻害剤および／または前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．インターフェロン刺激物質を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～４５のいずれか１項に記載の方法。
４７．それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築体を導入することを含む、実施形態１～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．前記標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である、実施形態１～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．前記構築体または前記ｄＲＮＡは免疫応答を誘導しない、実施形態１～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．ＡＤＡＲ（例えば外来ＡＤＡＲ）を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記ＡＤＡＲは、Ｅ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である、実施形態５０に記載の方法。
５２．前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシング、または前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転をもたらす、実施形態１～５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点変異、トランケート、伸長および／または誤折り畳みを引き起こすか、又は前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転により、機能的、全長的、正確に折り畳まれたおよび／または野生型のタンパク質を生成する、実施形態５２に記載の方法。
５４．前記宿主細胞は真核細胞である、実施形態１～５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態５４に記載の方法。
５６．前記宿主細胞はヒト細胞またはマウス細胞である、実施形態５５に記載の方法。
５７．編集されたＲＮＡまたは実施形態１～５６のいずれか１項に記載の方法によって製造された編集されたＲＮＡを有する宿主細胞。
５８．個体の疾患または病状を治療または予防する方法であって、前記疾患または病状に関連する標的ＲＮＡを、前記個体の細胞において、実施形態１～５７のいずれか１項に記載の方法に従って編集することを含む方法。
５９．前記疾患または病状は、遺伝性遺伝子疾患または１つ以上の獲得性遺伝子変異に関連する疾患または病状である、実施形態５８に記載の方法。
６０．前記標的ＲＮＡはＧ－Ａ変異を有する、実施形態５８または５９に記載の方法。
６１．疾患または病状は単一遺伝子疾患または病状である、実施形態５８～６０のいずれか１項に記載の方法。
６２．前記疾患または病状は多遺伝子疾患または病状である、実施形態５８～６１のいずれか１項に記載の方法。
６３．（ｉ）前記標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、前記疾患または病状はがんであり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡであり、前記疾患または病状はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）であり、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患または病状がエーラス・ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群であり、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、前記疾患または病状はジュベール症候群であり、
（ｖ）前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、前記疾患または病状はファンコニ（Ｆａｎｃｏｎｉ）貧血であり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患または病状は原発性家族性肥大型心筋症であり、または
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、前記疾患または病状はＸ連鎖重症複合免疫不全である、実施形態５８～６２のいずれか１項に記載の方法。
６４．標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、前記ｄＲＮＡは、環状であるかまたは環状ＲＮＡを形成することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。
６５．前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含む、実施形態６４に記載のｄＲＮＡ。
６６．前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である、実施形態６５に記載のｄＲＮＡ。
６７．前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、実施形態６５または６６に記載のｄＲＮＡ。
６８．前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、実施形態６４～６７のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
６９．前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである、実施形態６４～６７のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
７０．実施形態６４～６９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体。
７１．前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列とをさらに含む、実施形態７０に記載の構築体。
７２．前記３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態７１に記載の構築体。
７３．前記５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態７２に記載の構築体。
７４．標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端における核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。
７５．前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態７４に記載のｄＲＮＡ。
７６．前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（３’ｓｎｏＲＮＡ配列）を含む、実施形態７５に記載のｄＲＮＡ。
７７．ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは少なくとも約７０ヌクレオチドである、実施形態７４～７６のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
７８．前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含む、実施形態７６～７７のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
７９．前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含む、実施形態７５～７８のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８０．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態７４～７９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８１．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態７４～７９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８２．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態７４～７９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８３．前記ｓｎｏＲＮＡ配列はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態７４～７９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８４．実施形態７４～８３のいずれか１項に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体。
８５．前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態７０～７３および８４のいずれか１項に記載の構築体。
８６．前記プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）である、実施形態８５に記載の構築体。
８７．宿主細胞に取り込まれるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体であって、
（１）前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含む、構築体。
８８．前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである、実施形態８６または８７に記載の構築体。
８９．前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、実施形態８８に記載の構築体。
９０．前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドである、実施形態７０～７３および８４～８９のいずれか１項に記載の構築体。
９１．前記構築体はＡＡＶベクターである、実施形態９０に記載の構築体。
９２．前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、実施形態６４～９１のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡ。
９３．実施形態６４～９１のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞。
９４．宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、実施形態６４～９１のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む、キット。

【0237】

実施例
材料および方法
プラスミドの構築
二重蛍光レポーターは、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの第１のコドンＡＴＧが欠失された）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅することによってクローン化され、３×ＧＳリンカーおよびターゲティングＤＮＡ配列がＰＣＲ中にプライマーを介して付加された。次に、ＰＣＲ産物をタイプＩＩの制限酵素ＢｓｍＢ１（Ｔｈｅｒｍｏ）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）で切断して連結し、ｐＬｅｎｔｉバックボーン（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＳＶ－Ｂｓｄ、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｃｏｈｅｎ Ｌａｂ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に挿入した。

【0238】

ｄＬｂｕＣａｓ１３ ＤＮＡは、Ｌｂｕプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲにより増幅された。ＡＤＡＲ１ＤＤとＡＤＡＲ２ＤＤは、厦門大学のハン（Ｈａｎ）の研究室からのＡｄａｒ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡとＡｄａｒ２ ｃＤＮＡから増幅された。ＡＤＡＲ１ＤＤまたはＡＤＡＲ２ＤＤをオーバーラップＰＣＲによってｄＬｂｕＣａｓ１３ＤＮＡに融合し、融合したＰＣＲ産物をｐＬｅｎｔｉバックボーンに挿入した。

【0239】

哺乳動物細胞でのｄＲＮＡの発現のために、ｄＲＮＡ配列（短いｄＲＮＡの場合）を直接に合成し、オーバーラップｓｓＤＮＡを合成したことによってアニーリングしたか、またはＰＣＲ増幅し、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅ）クローニングによりＵ６発現下で対応するベクターにクローニングした。

【0240】

全長ＡＤＡＲ１（ｐ１１０）およびＡＤＡＲ１（ｐ１５０）はＡＤＡＲ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅され、全長ＡＤＡＲ２はＡＤＡＲ２ ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅され、それぞれｐＬｅｎｔｉバックボーンにクローニングされた。

【0241】

二重蛍光レポーターの２つのバージョン（レポーター－１、および－３）について、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの開始コドンＡＴＧが欠失された）をＰＣＲ増幅し、ＢｓｍＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＲ０４５２）を使用して消化し、続いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を介したＧＧＧＧＳリンカーとのライゲーションが行われた。そして、ライゲーション産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯバックボーンに挿入した。

【0242】

ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲ_ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）を発現する構築体の場合、ＡＤＡＲ１_ＤＤ遺伝子はＡＤＡＲ１^ｐ１５０構築体（厦門大学のＪｉａｈｕａｉ Ｈａｎ研究室からの贈り物）から増幅された。ｄＬｂｕＣａｓ１３遺伝子は、Ｌｂｕ＿Ｃ２ｃ２＿Ｒ４７２Ａ＿Ｈ４７７Ａ＿Ｒ１０４８Ａ＿Ｈ１０５３Ａプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲによって増幅された。ＡＤＡＲ１_ＤＤ（高活性Ｅ１００８Ｑ変異体）はオーバーラップＰＣＲによって生成され、ｄＬｂｕＣａｓ１３に融合された。ライゲーション産物はｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤバックボーンに挿入された。

【0243】

ａｒＲＮＡを発現する構築体の場合、ａｒＲＮＡの配列を合成し、ｐＬｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－ｌｉｂ ２．０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８９６３８）バックボーンにゴールデンゲート（ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅ）によりクローニングし、ａｒＲＮＡの転写をｈＵ６プロモーターによって駆動した。ＡＤＡＲを発現する構築体の場合、全長ＡＤＡＲ１^ｐ１１０およびＡＤＡＲ１^ｐ１５０はＡＤＡＲ１^ｐ１５０構築体からＰＣＲ増幅され、全長ＡＤＡＲ２はＡＤＡＲ２構築体（厦門大学のＪｉａｈｕａｉ Ｈａｎ研究室からの贈り物）からＰＣＲ増幅された。次に、増幅された産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤバックボーンにクローニングした。

【0244】

病原性変異を有する遺伝子を発現する構築体については、ＴＰ５３の全長コード配列（Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏから購入）および他の６つの疾患関連遺伝子（ＣＯＬ３Ａ１、ＢＭＰＲ２、ＡＨＩ１、ＦＡＮＣＣ、ＭＹＢＰＣ３およびＩＬ２ＲＧ、中国医学科学院病原体生物学研究所のＪｉａｎｗｅｉ Ｗａｎｇの研究室からの贈り物）は、Ｇ＞Ａ突然変異が導入された対応する遺伝子をコードする構築体から、誘発ＰＣＲにより増幅された。増幅産物は、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）クローニング法によりｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ｍＣｈｅｒｒｙバックボーンにクローニングされた。

【0245】

哺乳動物の細胞株と細胞培養
哺乳動物細胞株は、ダルベッコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，１０－０１３－ＣＶ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ））を用いて３７℃、５％ＣＯ_２で培養され、１０％ウシ胎児血清（蘭州百霊生物技術有限公司、蘭州、中国）を添加し、１％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充した。ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株はＥｄｉＧｅｎｅ Ｃｈｉｎａから購入し、ジェノタイピングの結果もＥｄｉＧｅｎｅ Ｃｈｉｎａから提供された。

【0246】

ＨｅＬａおよびＢ１６細胞株は、Ｚ．Ｊｉａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、Ｃ．Ｚｈａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。ＲＤ細胞株は、Ｊ Ｗａｎｇの研究室（北京協和医学院および中国医学科学院の病原体生物学研究所）からのものであった。ＳＦ２６８細胞株は、中国医学科学院、基礎医学研究所、セルセンターから入手した。Ａ５４９およびＳＷ１３細胞株は、ＥｄｉＧｅｎｅ Ｉｎｃ．から入手した。ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＭＥＦ細胞株は、北京大学の我らの研究室で維持されていた。これらの哺乳動物細胞株は３７℃、５％ＣＯ_２下で、１０％ウシ胎児血清（ＣｅｌｌＭａｘ、ＳＡ２０１．０２）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）で培養され、さらに１％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充した。特に明記されていない限り、細胞はＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６６５４６００１）で製造元の説明に従ってトランスフェクトされた。

【0247】

ヒト初代肺線維芽細胞（＃３３００）およびヒト初代気管支上皮細胞（＃３２１０）は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．から購入し、線維芽細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃２３０１）および気管支上皮細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃３２１１）でそれぞれ培養された。両方の培地にそれぞれ１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）と１％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。ＧＭ０６２１４およびＧＭ０１３２３初代細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに注文し、１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）および１％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）で培養された。すべての細胞は３７℃で５％ＣＯ_２下で培養された。

【0248】

レポーターシステムのトランスフェクション、ＦＡＣＳ解析およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング
二重蛍光レポーター編集実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞を６ウェルプレートに播種し（６×１０^５細胞／ウェル）、２４時間後、１．５μｇのレポータープラスミドと１．５μｇのｄＲＮＡプラスミドを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を、サプライヤーのプロトコルに従って使用して同時トランスフェクトした。４８～７２時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ解析を実行した。レポーターｍＲＮＡ編集をさらに確認するために、ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、レポーターおよびｄＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ－ＷＴ細胞からのＥＧＦＰ陽性細胞を選別し、続いて全ＲＮＡを単離した（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４３０）。次に、ＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介してＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、標的遺伝子座を対応するプライマーペア（２３ＰＣＲサイクル）でＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシング用に精製した。

【0249】

ＡＤＡＲ１（ｐ１１０）、ＡＤＡＲ１（ｐ１５０）、またはＡＤＡＲ２のレスキュー（ＲＥＳＣＵＥ）および過剰発現実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞を１２ウェルプレート（２．５×１０^５細胞／ウェル）に播種し、２４時間後、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して、０．５μｇのレポータープラスミド、０．５μｇのｄＲＮＡプラスミドおよび０．５μｇのＡＤＡＲ１／２プラスミド（ｐＬｅｎｔｉバックボーンを対照として）を同時トランスフェクトした。４８～７２時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ解析を実行した。

【0250】

内因性ｍＲＮＡ実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０^５細胞／ウェル）。約７０％コンフルエントになったときに、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して３μｇのｄＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした。７２時間後、次のＲＮＡ分離のために、細胞を収集し、ＦＡＣＳを介してＧＦＰ陽性またはＢＦＰ陽性細胞（対応する蛍光マーカーによる）を選別した。

【0251】

ヒト初代Ｔ細胞の分離と培養
初代ヒトＴ細胞は、健康なヒトドナーからの白血球アフェレーシス産物から単離された。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ遠心分離（Ｄａｋｅｗｅｉ、ＡＳ１１１４５４６）で分離し、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、１７９５１）を使用してＴ細胞をＰＢＭＣから磁気ネガティブセレクションで分離した。分離後、Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地、１０％ＦＢＳおよびＩＬ２（１０００ Ｕ／ｍｌ）で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１１３１Ｄ）で２日間刺激した。健康なドナーからの白血球アフェレーシス製品は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣ Ｃｈｉｎａから購入した。すべての健康なドナーはインフォームドコンセントを提供した。

【0252】

レンチウイルスパッケージとレポーター細胞株の構築
発現プラスミドは、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬を介して、２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞に同時トランスフェクトされた。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞をレンチウイルスに感染させ、７２時間後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別して培養し、限界希釈法により、ＥＧＦＰバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。

【0253】

安定したレポーター細胞株の場合、レポーター構築体（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯバックボーン）を、２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。７２時間後、上澄みウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスに感染させた後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別して培養し、検出可能なＥＧＦＰバックグラウンドのない二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１^－／－およびＴＰ５３^－／－細胞株は、以前に報告された方法^６０に従って生成された。ＡＤＡＲ１を標的とするｓｇＲＮＡとＣＭＶ駆動のピューロマイシン耐性遺伝子を含むＰＣＲ増幅されたドナーＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。次に、トランスフェクションの７日後に細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離した後、シーケンシングとウエスタンブロットによる検証を行った。

【0254】

内因性または外因性で発現した転写産物のＲＮＡ編集
二重蛍光レポーターでのＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１^－／－細胞を６ウェルプレート（６×１０^５細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、細胞に１．５μｇのレポータープラスミドと１．５μｇのａｒＲＮＡプラスミドを同時トランスフェクトした。ＡＤＡＲ１^ｐ１１０、ＡＤＡＲ１^ｐ１５０、またはＡＤＡＲ２タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をＥＧＦＰ陽性率とディープシーケンシングによってアッセイした。

【0255】

ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１^－／－細胞を１２ウェルプレートに播種した（２．５×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞に０．５μｇのレポータープラスミド、０．５μｇのａｒＲＮＡプラスミドおよび０．５μｇのＡＤＡＲ１／２プラスミド（対照としてのｐＬｅｎｔｉバックボーン）を同時トランスフェクトした。編集効率は、ＥＧＦＰ陽性率とディープシーケンシングによって解析された。

【0256】

内因性ｍＲＮＡ転写産物のＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞に３μｇのａｒＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした。編集効率は、ディープシーケンシングによって解析された。

【0257】

複数の細胞株でのＲＮＡ編集効率を評価するために、８～９×１０^４（ＲＤ、ＳＦ２６８、ＨｅＬａ）または１．５×１０^５（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を１２ウェルプレートに播種した。ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＥＦ、Ｂ１６などのトランスフェクションが困難な細胞の場合、２～２．５×１０^５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。２４時間後、レポーターとａｒＲＮＡプラスミドをこれらの細胞に同時トランスフェクトした。編集効率は、ＥＧＦＰ陽性率によって解析された。

【0258】

ＥＧＦＰ陽性率を評価するために、トランスフェクションの４８～７２時間後に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析によって細胞を選別して収集した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、レポーター／ａｒＲＮＡ発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、ＥＧＦＰ^＋／ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞のパーセンテージは編集効率の読み取り値として計算された。

【0259】

ＡからＩへの編集率のＮＧＳ定量化のために、トランスフェクションの４８～７２時間後に、細胞をＦＡＣＳアッセイによって選別および収集してＲＮＡ単離（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４２０）をした。次に、ＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介して全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次の表に記載されている対応するプライマーを使用して、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅した。

【0260】

【表1】

【0261】

ＰＣＲ産物は、サンガーシーケンシングまたはＮＧＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ）のために精製された。

【0262】

複数の細胞株でのテスト
ＨＥＫ２９３Ｔ（陽性対照）およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１^－／－（陰性対照）細胞に加えて、１つのマウス細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）およびさまざまな組織や器官に由来する７つのヒト細胞株（ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３）を選択して実験を行った。トランスフェクション効率の高い細胞株では、約８～９×１０^４細胞（ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８）または１．５×１０^５（ＨＥＫ２９３Ｔ）を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、トランスフェクションが困難なもの（Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３）について、２～２．５ｘ１０^５細胞を６ウェルプレートに播種した。そして、これらの細胞はすべて、３７℃、５％ＣＯ_２でダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で維持され、この培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＣｅｌｌＭａｘ）が補充された。２４時間後、ＣＧ２レポーターと７１ｎｔ ｄＲＮＡ（３５－Ｃ－３５）プラスミドをＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）で異なるタイプの細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をトリプシンで処理し、ＦＡＣＳ（ＢＤ）で解析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ陽性細胞が非常に少なかったため、６ウェルプレートに播種した細胞について、ＦＡＣＳ解析のための総細胞数を１×１０^５に増やした。

【0263】

実施例１：ＣＭＶプロモーターを用いたａｒＲＮＡ発現の駆動によるＬＥＡＰＥＲの最適化
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）により編集効率が向上するか否かを調べるために、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）で駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドを構築した。ＣＭＶで駆動されるａｒＲＮＡとＵ６プロモーターとのＲＮＡ編集効率（ａｒＲＮＡ_５１）を、ＥＧＦＰ発現に基づくレポーター系（レポーター１、図４Ｂ）を用いて比較した。未処理の細胞をモックコントロール（Ｍｏｃｋ）として使用した。非標的ＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、コントロール（Ｃｔｒｌ ＲＮＡ）としても使用された。その結果、ＲＮＡ編集においてＣＭＶ－ａｒＲＮＡがＵ６－ａｒＲＮＡよりも優れていることがわかった（図１）。

【0264】

【表2】

【0265】

実施例２：ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ媒介ＲＮＡ編集
ａｒＲＮＡを安定化し、その核局在化を増強するために、ａｒＲＮＡはｓｎｏＲＮＡ末端を有するように操作された。標的蛍光レポーター－１の１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡの側面にｓｎｏＲＮＡ末端があった（図２Ａ）：
５’末端：
ＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＴＡＡ （配列番号１９）；
３’端末：
ＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧ （配列番号２０）
名称はｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１であった。
二重蛍光レポーター－１は、ｍＣｈｅｒｙの配列（配列番号２１）、３×ＧＳリンカーおよびＡを標的とする配列（配列番号２２）、およびｅＧＦＰの配列（配列番号２３）を含む。
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧ （ｍＣｈｅｒｒｙの配列） （配列番号２１）

【0266】

【化1】

【0267】

（配列は、３×ＧＳリンカー（斜体および太字で示されている）および標的Ａ（大きい太字Ａで示されている）を含む）（配列番号２２）

【0268】

ＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡ （ｅＧＦＰの配列） （配列番号２３）。

【0269】

次に、ヒトＵ６で駆動されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１、ａｒＲＮＡ１５１、ｓｎｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ１５１またはＣｔｒｌ ＲＮＡ１５１を、レポーターを発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、ＦＡＣＳ解析によりＥＧＦＰ陽性率を定量化した。ＦＡＣＳの結果、ｓｎｏＲＮＡ末端を側面とするｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１は、線型ａｒＲＮＡよりも低い、ＥＧＦＰ陽性率約３８％でレポーターｍＲＮＡ上の標的ＲＮＡ編集を媒介できることが示された（図２Ｂ～２Ｃ）。
ｓｎｏＲＮＡ末端がａｒＲＮＡを安定化しているかどうかを調べるために、異なる時点でＥＧＰＦ陽性率を測定した。ヒトＵ６プロモーター下のｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－Ｃｔｒｌ ＲＮＡ_１５１またはＣｔｒｌ ＲＮＡ_１５１をＨＥＫ２９３Ｔ－レポーター細胞にトランスフェクションした。ＥＧＦＰ陽性率はトランスフェクション後３日、６日、１２日の３時点で測定した。その結果、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡは、延長した期間において、ａｒＲＮＡよりも高い編集効率を示し、ｓｎｏＲＮＡ末端がａｒＲＮＡを分解から保護し、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡの存在量を増強することが示された（図３Ａ）。
ａｒＲＮＡの発現レベルをさらに高めるために、ウイルスベースの強力なプロモーターであるＣＭＶを用いてａｒＲＮＡまたはｓｎｏ－ａｒＲＮＡを発現させた。その結果、ＣＭＶプロモーターが発現するａｒＲＮＡ（ＣＭＶ＿ａｒＲＮＡ）は、Ｕ６プロモーターが発現するａｒＲＮＡ（Ｕ６＿ａｒＲＮＡ）よりも高い編集効率を示すことがわかった。また、Ｕ６＿ａｒＲＮＡ群のＥＧＦＰ陽性率は時間の経過とともに低下したが、ＣＭＶ＿ａｒＲＮＡのＥＧＦＰ陽性率はトランスフェクション６日後も増加した。同様に、ＣＭＶプロモーターが発現するｓｎｏ－ａｒＲＮＡ（ＣＭＶ＿ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ）は、Ｕ６プロモーターが発現するｓｎｏ－ａｒＲＮＡ（Ｕ６＿ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ）よりも高い編集効率を実現した（図３Ｂ、および図３Ｃ）。
以上の結果から、ｓｎｏＲＮＡ末端がａｒＲＮＡを安定化し、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるａｒＲＮＡまたはｓｎｏ－ａｒＲＮＡの発現量を増加させることが可能であることが判明した。この２種類の策はいずれもａｒＲＮＡの編集効率を顕著に高めることができた。

【0270】

実施例３：環状ａｒＲＮＡ媒介ＲＮＡ編集
レポーター－１を標的とした環状ａｒＲＮＡ_７１および環状ａｒＲＮＡ_１１１の両方を発現したプラスミドを用いて、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの間にインフレーム終止コドンを含むレポーター－１を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした（図４Ｂ）。ＥＧＦＰ蛍光はＲＮＡ上の標的編集の効率を示す。最も効果的なａｒＲＮＡの構造を調べるために、環状ａｒＲＮＡの側面には、両端のライゲーション配列に連結された２５－ｎｔまたは５０－ｎｔのリンカーが設けられている（図４Ａ）。比較のために、線状（非環状）ａｒＲＮＡ_７１およびａｒＲＮＡ_１１１も同時にトランスフェクションした。その結果、環状ａｒＲＮＡは、線状ａｒＲＮＡに比べて、ＥＧＦＰ^＋細胞の比率とＥＧＦＰ強度を強く改善することが明らかになった（図４Ｃ）一方、２５－ｎｔまたは５０－ｎｔリンカーを持つ環状ａｒＲＮＡは効率の向上を低減してしまった（図４Ｃ）。
レポーター－３を安定的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ（図４Ｂ）において、長さが編集効率に与える影響をさらにテストした。レポーターＥＧＦＰ比率に基づいて、環状ａｒＲＮＡの長さは編集効率と正の相関があり、１１１－ｎｔから１５１－ｎｔまでの間にピークに達しており（図４Ｄ）、また、７１－ｎｔは環状ａｒＲＮＡ活性の最小長であった（図４Ｄ）。
二重蛍光レポーター－３は、ｍＣｈｅｒｙ配列（配列番号２１）、１×ＧＳリンカー（斜体および太字で示される）および標的Ａを含む配列（配列番号２４）、およびｅＧＦＰ（配列番号２３）を含む。

【0271】

【化2】

【0272】

（配列は、３×ＧＳリンカー（斜体および太字で示されている）および標的Ａ（大きい太字Ａで示されている）を含む）（配列番号２４）

【0273】

ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞に環状ａｒＲＮＡを使用すると、ＡＤＡＲ１の低発現またはＡＤＡＲ３の高発現のため、我々がテストした複数の細胞株の中でＬＥＡＰＥＲの効率が相対的に低下していた。その結果、ＥＧＦＰレポーターアッセイに基づいて、両細胞株において環状ａｒＲＮＡが編集効率を大幅に向上させることが明らかになった（図４Ｅ）。

【0274】

【表3】

【0275】

【表4】

【0276】

実施例４：環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲシステムを用いた早期終止コドンの修正
多くの疾患は早期終止コドン（ＰＴＣ）によって引き起こされる。ＰＴＣ関連疾患の治療におけるＬＥＡＰＥＲ－環状ａｒＲＮＡの潜在力を検査するため、１つのインフレームＵＡＡ終止コドンレポーターを構築した。３種類の環状ａｒＲＮＡ（すなわち、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－Ａ１}、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－Ａ２}およびＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－２Ａ}）を設計してこのレポーターのＵＡＡ部位を標的とし、３種類の異なるａｒＲＮＡのＥＧＦＰ陽性率を比較した。その結果、ＴＡＡコドンの２番目のアデノシンを標的とするＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－Ａ２}はより効果的であった（図５）。

【0277】

実施例５：環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲシステムを用いたｍＲＮＡスプライシングの調節
新しいスプライシング生成物を生成するようにｍＲＮＡスプライシングを操作することは、デュシェーン（Ｄｕｃｈｅｎｅ）筋ジストロフィーのような疾患の治療戦略である。ＲＧ６スプライシングレポーターを用いてＬＥＡＰＥＲ環状ａｒＲＮＡがスプライシング受容体サイトを変化させることができるかどうかを測定した。スプライスアクセプターサイトを標的とするように、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_７１（７１－ｎｔ）、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_７１（１１１－ｎｔ）およびＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_{７１＋ＢＰ}（受容体サイトと分岐点の両方を標的とする１１１－ｎｔ）を含む３種類の環状ａｒＲＮＡを設計した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＬＥＡＰＥ－Ｔｏｒｎａｄｏによってスプライシングパターンが変化すると、ＲＧ６レポーターはＥＧＦＰタンパク質よりも多くのｄｓＲＮＡタンパク質を発現していることを報告している（図６Ａ）。ＬＥＡＰＥＲ－環状ａｒＲＮＡが細胞のスプライシング機構を効果的に標的化できることを見出した（図６Ｂ）。

【0278】

実施例６：環状ａｒＲＮＡを用いたＬＥＡＰＥＲシステムによるレンチウイル送達
治療用ＲＮＡの連続投与は、その有効性に重要である。環状ａｒＲＮＡを持つＬＥＡＰＥＲをレンチウイルで送達することでＲＮＡ編集が可能かどうかをテストした。その結果、環状ａｒＲＮＡを持つＬＥＡＰＥＲは、レンチウイル送達によって機能し、それにより、多様なＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡをゲノムに組み込み、安定的に発現させることができることがわかった。Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡの長さは編集効率と正の相関を示した（図７）。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2022-03-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、環状ＲＮＡを形成することができる、方法。

【請求項2】

前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列および５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的である、および／または
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであり、または、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡであり、前記ｄＲＮＡはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環化され、任意選択的に、前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは前記宿主細胞において内因的に発現される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含み、
好ましくは、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列と、をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ１である、または
（ｉｉ）前記５’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイストリボザイム配列がツイスト酵素Ｐ１である、
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
前記ｄＲＮＡは、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる方法。

【請求項6】

（ｉ）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは少なくとも約７０ヌクレオチドであり、
（ｉｖ）前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含み、
（ｖ）前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含み、および／または
（ｖｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列、またはオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築体を前記宿主細胞に導入することを含み、
好ましくは、前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）であり、
更に好ましくは、前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、
請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体を宿主細胞に導入することを含む、前記宿主細胞において標的ＲＮＡを編集する方法であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含み、
好ましくは、前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、方法。

【請求項9】

前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドであり、任意選択的に、前記構築体はＡＡＶベクターである、請求項４および７または８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＡＤＡＲは前記宿主細胞によって内因的に発現され、任意選択的に、前記宿主細胞はＴ細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）前記標的ＲＮＡ配列の長さが５０ヌクレオチドより長く、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ配列の長さが約１００～約１５０ヌクレオチドであり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含み、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含み、例えば、前記シチジンミスマッチは前記標的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、かつ前記標的ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置し、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含み、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含み、
（ｖ）前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’に最も近い隣接物がＵ、Ｃ、ＡおよびＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの３’に最も近い隣接物がＧ、Ｃ、ＡおよびＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕであり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフであり、任意選択的に、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ中のウリジンの真向かいにあるＡと、前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンと、前記３塩基モチーフ中のグアノシンの真向かいにあるシチジン、グアノシンまたはウリジンとを含み、および／または、
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡであり、任意選択的に、前記標的ＲＮＡはプレメッセンジャーＲＮＡである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ＡＤＡＲ３阻害剤および／またはインターフェロン刺激物質を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡまたは構築体を導入することを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記構築体または前記ｄＲＮＡは免疫応答を誘導しない、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記宿主細胞にＡＤＡＲを導入することをさらに含み、任意選択的に、前記ＡＤＡＲはＥ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシング、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転を引き起こし、任意選択的に、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点変異、トランケート、伸長および／または誤折り畳みを引き起こし、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは選択的スプライシングの逆転によって機能的、全長的、正確に折り畳まれたおよび／または野生型のタンパク質を引き起こす、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記宿主細胞は真核細胞であり、任意選択的に、前記宿主細胞は哺乳動物細胞であり、例えば、前記宿主細胞はヒト細胞またはマウス細胞である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

編集されたＲＮＡ、または請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法により製造された編集されたＲＮＡを有する宿主細胞。

【請求項20】

標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して、前記ｄＲＮＡは、環状であるかまたは環状ＲＮＡを形成することができる、
好ましくは、前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列は、少なくとも部分的に互いに相補的であり、および／または
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列および前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、
デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。

【請求項21】

前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであり、または、前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成し得る線状ＲＮＡである、請求項２０に記載のｄＲＮＡ。

【請求項22】

請求項２０または２１に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含み、
好ましくは、構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイストリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイストリボザイム配列とをさらに含み、任意選択的に、
（ｉ）前記３’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ１であり、または
（ｉｉ）前記５’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイストリボザイム配列はツイスト酵素Ｐ１である、
構築体。

【請求項23】

標的ＲＮＡを編集するデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的ＲＮＡ配列の３’および／または５’末端における核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列とを含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。

【請求項24】

（ｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さが少なくとも約７０ヌクレオチドであり、
（ｉｖ）前記３’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号１の核酸配列を含み、
（ｖ）前記５’ｓｎｏＲＮＡ配列は配列番号２の核酸配列を含み、および／または
（ｖｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ配列、Ｃ／ＤボックスとＨ／ＡＣＡボックスとの複合ｓｎｏＲＮＡ配列、またはオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、請求項２３に記載のｄＲＮＡ。

【請求項25】

請求項２３または２４に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含み、
好ましくは、構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）であり、
前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、
構築体。

【請求項26】

宿主細胞に取り込まれるデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築体であって、
（１）前記ｄＲＮＡは前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である標的ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、かつ
（３）前記構築体は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩプロモーター」）を含み、
好ましくは、前記Ｐｏｌ ＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択的に、前記ＣＭＶプロモーターは配列番号３の核酸配列を含む、
構築体。

【請求項27】

前記構築体はウイルスベクターまたはプラスミドであり、任意選択的に、前記構築体はＡＡＶベクターである、請求項２２および２５または２６に記載の構築体。

【請求項28】

前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡおよび小さなＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡ。

【請求項29】

請求項２０～２７のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含む宿主細胞。

【請求項30】

宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するキットであって、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の構築体またはｄＲＮＡを含むキット。

【国際調査報告】