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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-19
(54)【発明の名称】抗微生物剤
(51)【国際特許分類】
C07D 471/22 20060101AFI20220812BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220812BHJP
A61K 31/555 20060101ALI20220812BHJP
C07D 471/04 20060101ALI20220812BHJP
C07F 15/00 20060101ALN20220812BHJP
【ＦＩ】
C07D471/22
A61P31/04
A61K31/555
C07D471/04 112T
C07F15/00 A CSP
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021560223
(86)(22)【出願日】2020-04-02
(85)【翻訳文提出日】2021-12-06
(86)【国際出願番号】 GB2020050875
(87)【国際公開番号】W WO2020201754
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】1904796.8
(32)【優先日】2019-04-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507330176
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・シェフィールド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】トーマス，ジェームス アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】シュミッテン，カースティ ローラ
【テーマコード（参考）】
4C065
4C086
4H050
【Ｆターム（参考）】
4C065AA04
4C065AA19
4C065BB09
4C065CC05
4C065CC09
4C065DD02
4C065DD05
4C065EE02
4C065EE05
4C065HH01
4C065HH02
4C065JJ01
4C065KK01
4C065KK02
4C065LL01
4C065PP01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086DA31
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB35
4H050AA01
4H050AA03
4H050AB29
(57)【要約】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）で示される化合物、および、抗微生物剤としての使用のための当該化合物を含む組成物であって、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；Ｙ１およびＹ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択され；Ｍ１およびＭ２は、それぞれ金属中心であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲａは：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択され；Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ二座配位子であり；環Ｄ１およびＤ２は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）から選択される１つ以上のヘテロ原子を含み；前記化合物は、抗微生物剤としての使用のためのものである、化合物および組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）で示される化合物であって、【化1】
式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｙ１およびＹ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択され；
Ｍ１およびＭ２は、それぞれ金属中心であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲａは：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択され；Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ二座配位子であり；
環Ｄ１およびＤ２は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）から選択される１つ以上のヘテロ原子を含み；
前記化合物は、抗微生物剤としての使用のためのものである；
化合物。
【請求項2】
抗生物質としての使用のためのものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
グラム陰性細菌に対する使用のためのものである、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれＮである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
Ｙ１およびＹ２は、それぞれＮである、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
Ｍ１およびＭ２は、それぞれルテニウムである、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲａは：水素、アルキルおよびアリールからそれぞれ独立して選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
前記二座配位子が、式（ＩＩＩ）：【化2】
式中、
Ｚ１およびＺ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される；
で示される化合物である、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は：水素、アルキルおよびアリールからそれぞれ独立して選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項10】
Ｚ１およびＺ２は、それぞれＮである、請求項８または９に記載の化合物。
【請求項11】
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ、（１）～（７）から独立して選択される二座配位子：【化3】
またはこれらの組み合わせである、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項12】
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）：【化4】
式中
Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’は：水素、アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリールからそれぞれ独立して選択され；
ただし、Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１
’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’のうちの少なくとも１つが：アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリールから選択されることとし；
Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される；
で示される化合物。
【請求項13】
Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’およびＲ８’’’が、同じであり；Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’およびＲ９’’’が、同じであり；Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’およびＲ１０’’’が、同じであり；Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’およびＲ１１’’’が、同じであり；Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’およびＲ１２’’’が、同じであり；Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’が、同じである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項14】
式（Ｖ）または式（Ｖａ）：【化5】
で示される構造を有する、請求項１２または１３の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項15】
前記請求項のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項16】
抗微生物剤としての使用のための、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物感染、特に細菌感染の処置における使用のための化合物に関する。新規化合物、上記化合物を作製する方法、ならびに抗微生物感染によって引き起こされる疾患および障害を処置する方法も記載する。
【背景技術】
【0002】
ポリピリジルＲｕ（ＩＩ）錯体は、イメージングプローブおよび抗がん治療リードとして大いに研究されているが、初期の生物学的研究は、抗微生物剤としてのこれらの可能性に焦点を当てていた。その前の多くの方法での研究において、Ｄｗｙｅｒグループは、メチル化フェニルリガンドを含有する［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋（ｐｈｅｎ＝１，１０フェナントロリン）の親油性誘導体が、これらの構造体に対して耐性を生じることができない範囲の細菌、特に、グラム陽性種に対して活性を有することを実証した。これらの錯体の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、同時代の商業用の抗菌剤と比較して相対的に高いことが分かっているが、この研究は、さらには発展されなかった。しかし、抗微生物剤耐性（ＡＭＲ）の増加に起因して急速に出現した地球規模の健康危機という現代の背景において、かかる構造体の活性が再考されている。
【0003】
異なる長さの可撓性メチレン系リンカーを一緒に使用して［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋単位を結合させると、大幅により高い活性（より低いＭＩＣ）を有する錯体を生じることが最近見出された。これらの化合物に関する活性のメカニズムは、依然として調査されている。これらがリボソームで蓄積してポリソームの濃縮を引き起こすと仮定されているが、このクラスの化合物の細胞取り込みおよび抗菌活性がそれらの膜貫通能に起因することも示唆されている。しかし、単核錯体を含む１つの顕著な例を除いて、これらの系は、グラム陰性種、例えば、大腸菌に対して、より低い活性を示す。実際、病原性グラム陰性種は、特に有害なＡＭＲの問題がある。例えば、その最近の報告において、世界保健機関は、抗菌薬後の時代が、「２１世紀では非常に現実に起こり得ること」であると宣言しており、確認されているグラム陰性緑膿菌、アシネトバクター・バウマニ、および腸内細菌のメンバーが、その「Ｐｒｉｏｒｉｔｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｌｉｓｔ Ｆｏｒ Ｒ＆Ｄ」における３つの優先度の１（重大）病原体として重大な院内感染のＥＳＫＡＰＥ群の大部分を構成している。この状況の緊急性は、新しい治療リードの欠失によって深刻になっている：グラム陰性病原体の新しいクラスの抗生物質が５０年超の間承認されておらず、２０１０年以降、唯１つの新しい化合物が、第Ｉ相試験を通って抗生物質パイプラインに入っている。この状況は、化学リードに関する検索において化学的多様性を増加させる機運を高めている。完全に新しい分子の「出発点リード」の欠失が、抗生物質の発見の最も大きな障害であることも示唆されている。
【0004】
特に、共焦点顕微鏡法における使用のための、細菌種のための造影剤としてのルテニウム錯体がいくつか調査されている（例えば、ＷＯ２００９／０５０５０９を参照されたい）。しかし、これまで、新しいクラスの抗生物質および／または抗微生物剤の基礎を形成し得る実質的に有効なルテニウム錯体は発見されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００９／０５０５０９号
【発明の概要】
【0006】
本発明は、この問題を解決する、または、少なくとも改善することが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1A】図１Ａは、４４＋の取り込みおよび細胞死効果を示す。錯体４４＋は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの大腸菌ＭＧ１６５５（上）及びＥＣ９５８（下）プランクトン培養物の用量依存性死滅を誘発する。錯体を、ＧＤＭＭ中の４４＋がＭＩＣ、１．２μＭ（Ａ）または１．６μＭ（Ｂ）を超えないおよびこれを超える種々の濃度で添加した。処理後６時間までの時間間隔でコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数／ｍＬをモニタリングすることによって死滅を測定した。エラーバーは、３つの独立した生物学的繰り返し±標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図1B】図１Ｂは、４４＋の細胞死取り込み効果を示す。４４＋にさらされた後のグルコースの非存在（左）下および存在（右）下での大腸菌ＥＣ９５８によるルテニウムの取り込みに関するＩＣＰ－ＡＥＳデータ。細胞当たりのＲｕ（上の線）およびＦｅ（下の線）のレベルは、細胞当たりの金属（ｇ）で表記される。Ｆｅレベルを対照として算出した。条件：４４＋の濃度＝０．８μＭ。細胞を０．５％（ｖ／ｖ）硝酸で洗浄し、結合していない錯体を除去した。エラーバーは、３つの独立した生物学的繰り返し±ＳＤを表す。
【図2】図２は、５、２０、６０、および１２０分においてレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）ナノ顕微鏡法を通して可視化した大腸菌ＥＣ９５８細胞中の４４＋の局在化を示す。上の列：白色レーザーおよび４７０ｎｍノッチフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起における４４＋の発光を使用して画像化した細胞。中央の列：同じ励起および発光設定によって画像化した細胞；ＳＴＥＤ効果が、７７５ｎｍの枯渇レーザー（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｌａｓｅｒ）および７８０ｎｍのボルテックス位相板（ｖｏｒｔｅｘ ｐｈａｓｅ ｐｌａｔｅ）を用いて得られた。デコンボリューションによる回折限界画像（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｉｍａｇｅｓ）（ｄ－ＬＳＣＭ）および超解像度（ｄ－ＳＴＥＤ）画像の両方を、市販のＨｕｙｇｅｎｓソフトウェア（ＳＶＩ）を使用して処理した。矢印は、４４＋が優先的に蓄積している領域をハイライトしている。下の列：中央の列において示されている細胞の選択領域の頂部において引かれている白色実線に沿って正規化された発光強度プロファイル；黒色の実線はｄ－ＬＳＣＭを表し、赤色の実線はｄ－ＳＴＥＤを表す。条件：０．８μＭ ４４＋による処理後、細胞を硝酸で洗浄し、その後、パラホルムアルデヒド（１６％）によって固定した。
【図3-1】図３は、フルボリュームデコンボリューションによる回折限界の細胞（ｆｕｌｌ－ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）の断面を示す代表的な画像および超解像度画像（ｄ－ＬＳＣＭおよびｄ－３Ｄ ＳＴＥＤ）を示す。細胞の選択領域の頂部において引かれている白色実線の正規化された発光強度プロファイルがプロットされる。黒色の実線はｄ－ＬＳＣＭを表し、赤色の実線はｄ－３Ｄ ＳＴＥＤを示す。各時点について引かれている破線の白色の方形の拡大エリアを、画像に隣接させて、ならびに軸毎（ＸＹ、ＸＺ、およびＹＺ）の直交表現を示し、増加した解像度および４４＋のより良好な局在化を緑色で示す。１０および２０分時点は細胞膜内の特定の位置での蓄積を示しており；６０分時点では、化合物は、領域（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）での拡大において分かるように、細胞極の断面で局在している。使用した条件は、図２において用いたものと同一である。
【図3-2】図３は、フルボリュームデコンボリューションによる回折限界の細胞（ｆｕｌｌ－ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）の断面を示す代表的な画像および超解像度画像（ｄ－ＬＳＣＭおよびｄ－３Ｄ ＳＴＥＤ）を示す。細胞の選択領域の頂部において引かれている白色実線の正規化された発光強度プロファイルがプロットされる。黒色の実線はｄ－ＬＳＣＭを表し、赤色の実線はｄ－３Ｄ ＳＴＥＤを示す。各時点について引かれている破線の白色の方形の拡大エリアを、画像に隣接させて、ならびに軸毎（ＸＹ、ＸＺ、およびＹＺ）の直交表現を示し、増加した解像度および４４＋のより良好な局在化を緑色で示す。１０および２０分時点は細胞膜内の特定の位置での蓄積を示しており；６０分時点では、化合物は、領域（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）での拡大において分かるように、細胞極の断面で局在している。使用した条件は、図２において用いたものと同一である。
【図3-3】図３は、フルボリュームデコンボリューションによる回折限界の細胞（ｆｕｌｌ－ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）の断面を示す代表的な画像および超解像度画像（ｄ－ＬＳＣＭおよびｄ－３Ｄ ＳＴＥＤ）を示す。細胞の選択領域の頂部において引かれている白色実線の正規化された発光強度プロファイルがプロットされる。黒色の実線はｄ－ＬＳＣＭを表し、赤色の実線はｄ－３Ｄ ＳＴＥＤを示す。各時点について引かれている破線の白色の方形の拡大エリアを、画像に隣接させて、ならびに軸毎（ＸＹ、ＸＺ、およびＹＺ）の直交表現を示し、増加した解像度および４４＋のより良好な局在化を緑色で示す。１０および２０分時点は細胞膜内の特定の位置での蓄積を示しており；６０分時点では、化合物は、領域（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）での拡大において分かるように、細胞極の断面で局在している。使用した条件は、図２において用いたものと同一である。
【図4A】図４Ａは、大腸菌ＥＣ９５８における膜損傷の証拠を示す。５分（左）および６０分（右）においてＳＩＭを通して可視化された、４４＋およびＮＨＳエステル４０５の共局在化を示す。（ｉ）０．８μＭ ４４＋で処理してパラホルムアルデヒド（１６％）で固定した細胞。固定後、細胞を２．５μｇ／ｍＬのＮＨＳエステル４０５で処理した。上のパネル：４４＋の発光（Ａ５６８フィルタ）、中央のパネル：４０５ｎｍでのＮＨＳエステル４０５発光（ＤＡＰＩフィルタ）、下のパネル：統合画像。（ｉｉ）４４＋の非存在下でのＮＨＳエステルによる染色。
【図4B】図４Ｂは、ＥＣ９５８細胞からの４４＋誘発ＡＴＰ放出を示し、細胞外［ＡＴＰ］（ｎＭ）は、２時間にわたって、０（対照）、０．８および１．６μＭ（ＭＩＣ）の４４＋さらしたサンプルについて照度計において測定した放出されたＡＴＰを用いて組み換え型ルシフェラーゼおよびＤ－ルシフェリンを用いて定量した。０および１ＭＩＣ間で三つ星の有意差が観察されている、Ｐ値＝０．０００６。エラーバーは、３つの生物学的繰り返し±ＳＤを表す。ＡＴＰ陽性対照－ポリミキシン４μｇ／ｍＬ（挿入）。ＨＥＫ２９３細胞および３つの細菌株でのＩＣ５０／ＭＩＣ比較。
【図4D】図４Ｄは、ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）毒性スクリーニングのカプランマイヤー生存曲線を示し、細胞を０～８０ｍｇ／ｋｇの化合物４４＋で処理し、３７．５℃で１２０時間インキュベートしている－水対照（黒）、化合物４４＋（赤）。
【図5A】図５Ａは、ＭｅＣＮ中の［｛Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］の濃度を増加させたときのモル吸光係数の変化を示す、ＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す（Ｃａｒｙ３００ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において２７．５℃で行った）。
【図5B】図５Ｂは、水中の［｛Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］の濃度を増加させたときのモル吸光係数の変化を示す、ＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す（Ｃａｒｙ３００ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において２７．５℃で行った）。
【図6A】図６Ａは、ＭｅＣＮ中の［｛Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］の濃度を増加させたときの５５０～８００ｎｍの発光スペクトルを示す。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ３蛍光光度計において２７．５℃で行った。
【図6B】図６Ｂは、水中の［｛Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］の濃度を増加させたときの５５０～８００ｎｍの発光スペクトルを示す。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ３蛍光光度計において２７．５℃で行った。
【図7】図７は、病原性大腸菌株ＥＣ９５８に対しての各錯体の、求めたＬｏｇＰ値と活性（ＭＩＣ）との比較を示し、親油性の相対的増加と共に活性の増加を示している。ＬｏｇＰデータを、振とうフラスコ手順を使用して収集した。「Ｐｈｅｎ」は、フェナントロリンであり、「ＤＭＰ」は、ジメチルフェナントロリンであり、「ＴＭＰ」は、テトラメチルフェナントロリンであり、「ＤＩＰ」は、ジフェニルフェナントロリンである。
【図9】図９は、４４＋についての、グルコースを用いた（＋）およびグルコースを用いない（－）、各時点での細胞当たりのＲｕ含有量（ｇ）の差を示す。１０および２０分における、グルコース（＋）サンプルにおけるルテニウムの蓄積の有意差を示している。細胞当たりのルテニウム含有量はＩＣＰ－ＡＥＳを介して求めた。
【図11A】図１１Ａおよび１１Ｂは、大腸菌ＥＣ９５８細胞における膜電位の検出を示す。赤色／赤色＋緑色／緑色蛍光を含む細胞（％）の集団の百分率が示される。細胞を、１．６μＭの４４＋の存在下または非存在下で３０分間、３０μＭのＤｉ－ＯＣ２（３）によってインキュベートした。
【図11B】図１１Ａおよび１１Ｂは、大腸菌ＥＣ９５８細胞における膜電位の検出を示す。赤色／赤色＋緑色／緑色蛍光を含む細胞（％）の集団の百分率が示される。細胞を、１．６μＭの４４＋の存在下または非存在下で３０分間、３０μＭのＤｉ－ＯＣ２（３）によってインキュベートした。
【図13】図１３は、１０分（左）および６０分（右）におけるＭＩＣ濃度で４４＋によって染色したアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（ＡＢ１８４）を示し、外膜（１０分）および内膜（６０分）の画像化に相当する。細胞をＰＦＡ（４％）で固定しＰＢＳで洗浄した。細胞を、４８８ｎｍレーザーおよびＡ５６８フィルタを使用する構造化照明顕微鏡において画像化した。
【図14】図１４は、２０ｍｇ／ｋｇ（青色）および８０ｍｇ／ｋｇ（赤色）を注入したハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のルテニウム血リンパ（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ）含有量（μｇ／ｍＬ）を示す。Ｇａｌｌｅｒｉａに、これらの左腹脚に１０μＬの４４＋／水を注入し、３７．５℃で１２０時間インキュベートした。各時間間隔で、Ｇａｌｌｅｒｉａを採点した：生／死、活性およびメラニン化。Ｒｕ含有量を、ＩＣＰ－ＡＥＳを介して求めた。
【図15】図１５は、ハチノスツヅリガ（ＣＦＵ１０５－左および１０６－右）毒性スクリーニングカプランマイヤー生存曲線を示し、細胞を０～８０ｍｇ／ｋｇの化合物４４＋で処理し、３７．５℃で１２０時間インキュベートした－水対照（橙色）、細菌（緑色）および４４＋（紫色）。同時注入した幼虫に、これらの右腹脚に細菌を注入し、次いでこれらの左腹脚に４４＋を３０分後に注入した。
【図16A】図１６Ａは、２４および１２０時間で採取した抽出物を用いて、４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇの４４＋の存在下で１２０時間観察した、抽出した幼虫血リンパ（ハチノスツヅリガ）からの細菌ＣＦＵカウントを示す。初期細菌数１０５（左）および１０６（右）。幼虫を３７．５℃でインキュベートした。
【図16B】図１６Ｂは、図１６Ａのプロットを決定し、２４時間後の４４＋の０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇの投薬を示すために使用される寒天プレートの写真を示す。完全なクリアランスは、単回投与による、４０および８０ｍｇ／ｋｇの用量において、９６時間で観察された。黒色のマークは、細菌コロニーではなく、メラニン化した血リンパである。
【図17】図１７は、共焦点顕微鏡法を使用した、幼虫の血リンパ内のＡ．バウマニＡＢ１８４細胞中の４４＋の局在化を示している。上の列：Ａ５６８フィルタを使用する４５０ｎｍでの励起において、４４＋の発光を使用して画像化した細胞。中央の列：位相コントラスト。下の列：合わせた画像。抽出した血リンパ細胞を硝酸で洗浄し、その後、パラホルムアルデヒド（１６％）によって固定した。
【図18A】図１８Ａ～Ｃは、クリアランスしたハチノスツヅリガ幼虫の画像である。染色したＡ．バウマニＡＢ１８４における錯体４４＋の発光を決定した（頭部Ａ、尾部Ｂ）。細菌性細胞の血球含有領域ＩおよびＩＩをハイライトしている。Ａ．バウマニを１．２μＭ ４４＋によって３０分間染色し、次いで、ＰＦＡ（４％）で固定した。幼虫に細胞を注入し、３０分間インキュベートし、ジエチルエーテルで麻酔した幼虫をＰＦＡ（４％）において３０分間インキュベートした後、ＣＵＢＩＣプロトコルによってクリアランスした。画像は４８８ｎｍレーザーおよび赤色発光フィルタを使用したＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡において撮影した。画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
【図18B】図１８Ａ～Ｃは、クリアランスしたハチノスツヅリガ幼虫の画像である。染色したＡ．バウマニＡＢ１８４における錯体４４＋の発光を決定した（頭部Ａ、尾部Ｂ）。細菌性細胞の血球含有領域ＩおよびＩＩをハイライトしている。Ａ．バウマニを１．２μＭ ４４＋によって３０分間染色し、次いで、ＰＦＡ（４％）で固定した。幼虫に細胞を注入し、３０分間インキュベートし、ジエチルエーテルで麻酔した幼虫をＰＦＡ（４％）において３０分間インキュベートした後、ＣＵＢＩＣプロトコルによってクリアランスした。画像は４８８ｎｍレーザーおよび赤色発光フィルタを使用したＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡において撮影した。画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
【図18C】図１８Ａ～Ｃは、クリアランスしたハチノスツヅリガ幼虫の画像である。染色したＡ．バウマニＡＢ１８４における錯体４４＋の発光を決定した（頭部Ａ、尾部Ｂ）。細菌性細胞の血球含有領域ＩおよびＩＩをハイライトしている。Ａ．バウマニを１．２μＭ ４４＋によって３０分間染色し、次いで、ＰＦＡ（４％）で固定した。幼虫に細胞を注入し、３０分間インキュベートし、ジエチルエーテルで麻酔した幼虫をＰＦＡ（４％）において３０分間インキュベートした後、ＣＵＢＩＣプロトコルによってクリアランスした。画像は４８８ｎｍレーザーおよび赤色発光フィルタを使用したＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡において撮影した。画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
【図19】図１９は、Ａ．バウマニ、ＡＢ１８４を感染させ、ＮＨＳエステル４８８－０．５ｍｇ／ｍＬ（Ａ）または錯体４４＋－１．２μＭ（Ｂ）で染色した、クリアランスしたハチノスツヅリガ幼虫の一連の画像を提供する。細胞の断面を同定し（ｉ）、拡大し（ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＢＩＩ）、血球細胞内のＡ．バウマニを示す。３Ｄ表面プロット（ＡＩＶ、ＢＩＩＩ）を示し、ピーク発光強度を示している。条件は、図１８の画像を蛍光実体顕微鏡：４９０ｎｍ ｅｘ／５２０ｎｍ ｅｍ（ＮＨＳエステル４８８）、５６５ｎｍ ｅｘ／６４０ｎｍにおいて撮影したときと同じである。画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
【図20】図２０は、異なる濃度の４４＋に供したときの、大腸菌ＳＴ１３１、ＥＣ９５８のバイオフィルム形成を示す。Ｎ≧３±ＳＥＭ。バイオフィルムは、２４ウェルプレートにおける３７℃での１９時間にわたるインキュベーションで形成した。ＳＴ１３１は、ルテニウムなしおよび０．１５６μＭ（ＭＩＣの１０％）においてバイオフィルム形成を示す。
【図21】図２１は、既存のバイオフィルムを１５．６μＭ、７８μＭおよび１５６μＭの４４＋に供したときに大腸菌ＳＴ１３１によって生じるバイオフィルムＣＦＵ／ｍＬを示す。Ｎ≧３±ＳＥＭ。ＭＨＡを毎日変化させて３７℃でフィルタ膜において４日バイオフィルムを成長させた。４日目に化合物をバイオフィルム上に直接ピペッティングし、２４時間インキュベートした。ＣＦＵ／ｍｌは、ミスラ法を使用して算出した。一元配置ＡＮＯＶＡは、テューキーの多重比較試験によって実施した。
【図23】図２３は、４２＋の細胞死取り込み効果を示す。４２＋へさらされた後のグルコースの非存在（ａ）下および存在（ｂ）下での大腸菌ＥＣ９５８によるルテニウムの取り込みに関するＩＣＰ－ＡＥＳデータ。細胞当たりのＲｕ（上の線）およびＦｅ（下の線）のレベルは、細胞当たりの金属（ｇ）で表記される。Ｆｅレベルを対照として算出した。条件：４２＋の濃度＝０．８μＭ。細胞を０．５％（ｖ／ｖ）硝酸で洗浄し、結合していない錯体を除去した。エラーバーは、３つの独立した生物学的繰り返し±ＳＤを表す。
【図24】図２４は、４２＋についての、グルコースを用いた（＋）およびグルコースを用いない（－）、各時点での細胞当たりのＲｕ含有量（ｇ）の差を示す。１０分における、グルコース（＋）サンプルにおけるルテニウムの蓄積の有意差を示している。細胞当たりのルテニウム含有量はＩＣＰ－ＡＥＳを介して求めた。
【図26A】図２６Ａ～Ｃは、６０分、１２０分および２４時間においてレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）ナノ顕微鏡法を通して可視化した大腸菌ＥＣ９５８細胞中の４２＋の局在化を示す。細胞を、白色レーザーおよび４７０ｎｍノッチフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起における４２＋の発光を使用して画像化し、デコンボリューションによる回折限界画像（ｄ－ＬＳＣＭ）および超解像度（ｄ－ＳＴＥＤ）画像を、市販のＨｕｙｇｅｎｓソフトウェア（ＳＶＩ）を使用して処理した。条件：０．８μＭ ４２＋による処理後、細胞を硝酸で洗浄し、その後、パラホルムアルデヒド（１６％）によって固定した。
【図26B】図２６Ａ～Ｃは、６０分、１２０分および２４時間においてレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）ナノ顕微鏡法を通して可視化した大腸菌ＥＣ９５８細胞中の４２＋の局在化を示す。細胞を、白色レーザーおよび４７０ｎｍノッチフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起における４２＋の発光を使用して画像化し、デコンボリューションによる回折限界画像（ｄ－ＬＳＣＭ）および超解像度（ｄ－ＳＴＥＤ）画像を、市販のＨｕｙｇｅｎｓソフトウェア（ＳＶＩ）を使用して処理した。条件：０．８μＭ ４２＋による処理後、細胞を硝酸で洗浄し、その後、パラホルムアルデヒド（１６％）によって固定した。
【図26C】図２６Ａ～Ｃは、６０分、１２０分および２４時間においてレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）ナノ顕微鏡法を通して可視化した大腸菌ＥＣ９５８細胞中の４２＋の局在化を示す。細胞を、白色レーザーおよび４７０ｎｍノッチフィルタを用いた４７０ｎｍでの励起における４２＋の発光を使用して画像化し、デコンボリューションによる回折限界画像（ｄ－ＬＳＣＭ）および超解像度（ｄ－ＳＴＥＤ）画像を、市販のＨｕｙｇｅｎｓソフトウェア（ＳＶＩ）を使用して処理した。条件：０．８μＭ ４２＋による処理後、細胞を硝酸で洗浄し、その後、パラホルムアルデヒド（１６％）によって固定した。
【図27】図２７は、ＤＮＡ共染色実験の結果を示す。４２＋によって染色した黄色ブドウ球菌（上およびＣＩ）、ＤＮＡ染色ＤＡＰＩによって染色した黄色ブドウ球菌（ＣＩＩ）、画像のオーバーレイ（ＣＩＩＩ）、３Ｄ表面プロットのオーバーレイ（ＣＩＶ）。画像は、ＤＡＰＩおよびモノ－ＴＭＰの直接のオーバーレイを示し、＞０．９のピアソンの共局在化定数を算出している。
【図28】図２８は、４２＋の存在下での大腸菌のＡｍｅｓ変異原性アッセイの結果を示す。突然変異率を、０（自然の突然変異誘発対照）、０．５、１．０および２．０×で４２＋によって大腸菌（２５％一晩中培養、７５％培地）細胞を処理することによって測定した。ブロモクレゾールパープル指示薬を添加し、４８時間のインキュベーション後の紫色から黄色への色の変化の百分率を測定した。ＵＶ光を照射した細胞による陽性対照を比較のために加えた。
【図30】図３０は、大腸菌ＥＣ９５８細胞からの４２＋誘発ＡＴＰ放出を示し、細胞外［ＡＴＰ］（ｎＭ）は、４時間にわたって、０（対照）、０．５ ＭＩＣおよび１．０ ＭＩＣの４２＋にさらしたサンプルについて照度計において測定したポリミキシンを用いて定量している。エラーバーは、３つの生物学的繰り返し±ＳＤを表す。ポリミキシン４μｇ／ｍＬ。
【図31】図３１は、ハチノスツヅリガ毒性スクリーニングカプランマイヤー生存曲線を示し、細胞を０～８０ｍｇ／ｋｇの４２＋で処理し、３７．５℃で１２０時間インキュベートした－水対照（黒色）、化合物（赤色）。
【図32】図３２は、Ａ．バウマニＡＢ１８４毒性スクリーニングカプランマイヤー生存曲線（初期細菌数１０４－左および１０５－右）を示し、細胞を４０または８０ｍｇ／ｋｇの４２＋で処理し、３７．５℃で１２０時間インキュベートした－水対照（赤色）、化合物（緑色）。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の一態様において、式（Ｉ）または式（Ｉａ）で示される化合物であって、
式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｙ１およびＹ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択され；
Ｍ１およびＭ２は、それぞれ金属中心であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲａは：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択され；
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ二座配位子であり；
環Ｄ１およびＤ２は、それぞれ独立して、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてよく；
上記化合物は、抗微生物剤としての使用のためのものである；
化合物が提供される。
【化1】
式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｙ１およびＹ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択され；
Ｍ１およびＭ２は、それぞれ金属中心であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲａは：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択され；
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ二座配位子であり；
環Ｄ１およびＤ２は、それぞれ独立して、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてよく；
上記化合物は、抗微生物剤としての使用のためのものである；
化合物が提供される。
【0009】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）で示される二座官能性錯体は、有効な造影剤として機能し得るだけでなく、顕著な抗微生物性を提供し得ることが本発明者らによって見出された。理論によって拘束されることなく、これらの化合物は、最初に細胞膜を損傷して、外膜および内膜の両方を攻撃する（それぞれ引き離し「ブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）」）とい
う仮説が立てられる。また、式（Ｉ）の化合物は、内膜のｓ－フラップにおける二重の負に帯電した脂質であるカルジオリピンと相互作用するとされている。
う仮説が立てられる。また、式（Ｉ）の化合物は、内膜のｓ－フラップにおける二重の負に帯電した脂質であるカルジオリピンと相互作用するとされている。
【0010】
式（Ｉａ）の化合物に関して、また理論によって拘束されることなく、これらの化合物は、ＤＮＡを標的とするとされている。
【0011】
本発明の第１態様の上記化合物は、抗生物質としての使用のためのものであるである場合が典型的には多い。これらの化合物は、広範な微生物を処理するのに使用され得るが、本発明の第１態様による化合物は、驚くべきことに、細菌に対して有効であることが見出された。このことは、本発明の第１態様の化合物が特に有効であるグラム陰性細菌に関して特に当てはまる。しかし、特許請求の範囲の化合物は、グラム陽性細菌に対して有用であり得ることも予測される。
【0012】
本発明の化合物が展開され得る細菌について特に制限はない。しかし、本発明の第１態様の化合物は：大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ａ．バウマニ（Ａ． ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂ． ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、緑膿菌（Ｐ． ａｕｒｅｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）および連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｃｕｓ）；から選択される１つ以上の細菌種を処理するのに使用される場合が典型的には多い。
【0013】
誤解を避けるために、用語「アルキル」は、その通常の意味を持つことが意図されており、Ｃ１～Ｃ３０の範囲の炭素長を有する線状、分岐状および環状の飽和炭化水素をカバーする。多くの場合、アルキル基は、線状または分岐状、典型的には線状である。アルキル基の正確な長さは変動し得るが、アルキル基は、Ｃ１～Ｃ２０、より典型的にはＣ１～Ｃ１２、より典型的にはＣ１～Ｃ８、最も典型的にはＣ１～Ｃ６の範囲の炭素長を有することが典型的には多い。典型的なアルキル基は、限定されないが：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチルから選択される。同様に、用語「アルコキシ」は、その通常の意味を持つことが意図されており、すなわち、この用語は、上記アルキル基が（当業者によく知られているように）酸素原子を介して共有結合していることを除いて上記に記載されている「アルキル」と同じである。
【0014】
誤解を避けるために、用語「アルケニル」は、その通常の意味を持つことが意図されており、Ｃ２～Ｃ３０の範囲の炭素長を有する線状、分岐状および環状の部分飽和炭化水素をカバーする。用語「部分飽和」は、構造内の少なくとも１つのＣ＝Ｃ結合の存在を指す。多くの場合、アルケニル基は、線状または分岐状、典型的には線状である。アルケニル基の正確な長さは変動し得るが、アルケニル基は、Ｃ２～Ｃ２０、より典型的にはＣ２～Ｃ１２、より典型的にはＣ２～Ｃ８、最も典型的にはＣ２～Ｃ６の範囲の炭素長を有することが典型的には多い。典型的なアルケニル基は、限定されないが：ビニル、プロペニル、イソプロペニルまたはブテニルから選択される。
【0015】
誤解を避けるために、上記に列挙されている「アルキル」および「アルケニル」基は、それぞれ、任意選択的に置換されていてよい。１つ以上の任意選択的な置換基が存在していてよく、典型的な任意選択的な置換基は：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボン酸、アミン、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせ；から選択される。最も典型的には、任意選択的な置換基は、ハロゲンまたはヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、１つ以上の水素原子が、ハロゲンによって置き換えられていてよい。
【0016】
誤解を避けるために、用語「アリール」は、その通常の意味を持つことが意図されており、１つ以上の芳香族環種の基をカバーする。上記芳香族環として、８員環、７員環、６員環、および５員環を挙げることができる。より典型的には、環は、６員環または５員環
であり、最も典型的には、環は、６員環である。また、１つ以上のヘテロ原子は、上記環内に含まれて、ヘテロアリール種を形成していてよい。典型的なヘテロ原子として、Ｎ、ＯおよびＳ、より典型的にはＮおよびＯ、最も典型的にはＮが挙げられる。ヘテロアリール基が使用される場合、唯１つのヘテロ原子が存在することが通例である。アリール基は：フェニル、シクロペンタジエニル、ピリジルおよびフリル；から選択される場合が多い。
であり、最も典型的には、環は、６員環である。また、１つ以上のヘテロ原子は、上記環内に含まれて、ヘテロアリール種を形成していてよい。典型的なヘテロ原子として、Ｎ、ＯおよびＳ、より典型的にはＮおよびＯ、最も典型的にはＮが挙げられる。ヘテロアリール基が使用される場合、唯１つのヘテロ原子が存在することが通例である。アリール基は：フェニル、シクロペンタジエニル、ピリジルおよびフリル；から選択される場合が多い。
【0017】
誤解を避けるために、上記に列挙されている「アリール」基は、任意選択的に置換されていてよい。１つ以上の任意選択的な置換基が存在していてよく、典型的な任意選択的な置換基は：アルキル、アルコキシ、アルケニル、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボン酸、アミン、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせから選択される。より典型的には、任意選択的な置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲンまたはヒドロキシ基であり、なおより典型的には、任意選択的な置換基は、アルキルまたはアルコキシ（通常アルキル）である。いくつかの実施形態において、１つ以上の任意の水素原子が、ハロゲンによって置き換えられていてよい。
【0018】
誤解を避けるために、用語「ハロゲン」は、その通常の意味を持つことが意図されており、多くの場合、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含する。より典型的には、ハロゲンは、フッ素、塩素または臭素；なおより典型的にはフッ素または塩素；最も典型的にはフッ素である。
【0019】
また、用語「金属中心」は、その周りで好適なリガンドと組み合わせて錯体が形成され得る金属原子（典型的には、金属イオン）を指すことが意図される。金属の選択については特に制限されないが、金属中心は、典型的には、六角形状を有する錯体を形成することが可能であり、すなわち、６個の結合を形成することが可能である。典型的には、金属中心（複数可）は遷移金属である。
【0020】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４（すなわち、Ｎ、ＯまたはＳが用いられる）の同一性は、大部分において、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物において使用される金属中心の選択、すなわち、それぞれ「Ｍ１およびＭ２」ならびに「Ｍ１」によって決定される。認識されるように、異なる金属は、異なるドナー原子について異なる親和性を有する。しかし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ独立してＮまたはＯである場合が多い。通常、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの少なくとも１つがＮであり、より典型的には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの少なくとも２つがＮであり、なおより典型的には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの少なくとも３つがＮである。しかし、最も典型的に、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、それぞれＮである。
【0021】
加えて、Ｙ１およびＹ２の同一性については実際の限定はなく、すなわち、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＣ（Ｒａ）が使用されるが、Ｙ１およびＹ２は、Ｎ、Ｏ、Ｃ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択され、より典型的には、ＮまたはＣ（Ｒａ）からそれぞれ独立して選択される場合が多い。通常、Ｙ１およびＹ２のうちの少なくとも１つがＮである。しかし、Ｙ１およびＹ２の両方がＮである場合が最も多い。
【0022】
式（Ｉａ）で示される化合物に関して、環Ｄ１およびＤ２は、それぞれ、上記のＸ３およびＸ４のように典型的に定義されている１つ以上のヘテロ原子をそれぞれ独立して含んでいてよい。特に、Ｘ３および／またはＸ４は、Ｃ、ＮおよびＯ、より典型的にはＣおよびＮ、最も典型的にはＮから選択されてよい。２つ以上のヘテロ原子が環Ｄ１および／またはＤ２内に存在する場合があり得る。典型的には、化合物は、式（Ｉｂ）で示される構造を有し：
式中、
Ａ１、Ａ２、Ｍ１、Ｒ１～Ｒ４、Ｙ１、Ｙ２、およびＸ１～Ｘ４は、上記に定義されている通りである。
【化2】
式中、
Ａ１、Ａ２、Ｍ１、Ｒ１～Ｒ４、Ｙ１、Ｙ２、およびＸ１～Ｘ４は、上記に定義されている通りである。
【0023】
式（Ｉ）および式（Ｉａ）の化合物において使用されている金属中心、Ｍ１およびＭ２は、特に限定されず、ただし、これらは、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のリガンドと共に安定な錯体を形成することが可能であることとする。金属中心の典型的な例として、限定されないが：ルテニウム、イリジウム、オスミウム、鉄、白金、ロジウム、またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。多くの場合、Ｍ１およびＭ２は：ルテニウム、イリジウムおよびオスミウム；から選択される。典型的には、Ｍ１およびＭ２のうちの少なくとも１つがルテニウムまたはイリジウム；より典型的にはルテニウムである。Ｍ１およびＭ２の両方がルテニウムである場合があり得る。いくつかの実施形態において、１つまたは両方の金属中心、Ｍ１およびＭ２がイリジウムであってよい。
【0024】
典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれが：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせから独立して選択される。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれが、当業者によく知られているように、すなわち、式（ＩＩ）または式（ＩＩａ）に示されるように、結合している芳香族環に付着している１～３つの基で表される：
【化3】
【0025】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される場合が典型的である。より典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は：水素、アルキル、アルケニル、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。最も典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は：水素、アルキル、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。通常、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つが水素であり；より多くの場合において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも２つが水素であり；より典型的には、なお、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも３つが水素であり；最も典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、水素である。
【0026】
また、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。より典型的には、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は：水素、アルキル、アルケニル、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。最も典型的には
、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は：水素、アルキル、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。通常、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも１つが水素であり；より多くの場合において、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも２つが水素であり；より典型的には、なお、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも３つが水素であり；なおより典型的には、なお、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも４つが水素であり；最も典型的には、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも５つが水素である。通常、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は、それぞれ水素である。認識されるように、Ｘ３またはＸ４がヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）であるとき、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ省略される場合があり得る。
、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は：水素、アルキル、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される。通常、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも１つが水素であり；より多くの場合において、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも２つが水素であり；より典型的には、なお、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも３つが水素であり；なおより典型的には、なお、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも４つが水素であり；最も典型的には、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１のうちの少なくとも５つが水素である。通常、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は、それぞれ水素である。認識されるように、Ｘ３またはＸ４がヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）であるとき、Ｒ１７およびＲ１８はそれぞれ省略される場合があり得る。
【0027】
当業者によって認識されるように、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４（例えば；Ｒ４に関してはＲ４’、Ｒ４’’およびＲ４’’’）のそれぞれに関連する３つの置換基は、同一である必要はない。
【0028】
典型的には、Ｒａは：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせから選択される。多くの場合、Ｒａは：水素、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシまたはアルコキシ；より典型的には、水素、アルキル、またはアルコキシ；より典型的には、なお、水素またはアルキルから選択され；最も典型的には、Ｒａは、水素である。
【0029】
本発明者らは、二座配位子（Ａ１～Ａ４）を用いた式（Ｉ）および式（Ｉａ）の化合物が、様々な微生物に対して驚くべき効能を実証することを見出した。特に、二座配位子の選択について特に制限はないが、式（ＩＩＩ）で示される化合物が特に有効であることが分かった。かかる二座配位子を以下に示す：
式中、
Ｚ１およびＺ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される。
【化4】
式中、
Ｚ１およびＺ２は：Ｎ、Ｏ、Ｓからそれぞれ独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は：水素、アルキル、アルケニル、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボン酸、アミノ、アミド、ニトロまたはこれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される。
【0030】
理論によって拘束されることなく、４位および５位に２つのドナー原子を含む、一般構
造式（ＩＩＩ）の化合物の使用は、驚くべき抗微生物効能を有する化合物を結果として生じさせるとされている。それぞれのドナー原子、Ｚ１およびＺ２は異なっていてよいが、Ｚ１およびＺ２は、同じである場合が多い。また、Ｚ１およびＺ２は、それぞれが、独立して、ＮまたはＯから選択されてよい。最も典型的には、Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも１つが窒素であり、多くの場合、Ｚ１およびＺ２のそれぞれが窒素である。そのため、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ独立してフェナントロリンまたはこれらの誘導体である場合が典型的には多い。
造式（ＩＩＩ）の化合物の使用は、驚くべき抗微生物効能を有する化合物を結果として生じさせるとされている。それぞれのドナー原子、Ｚ１およびＺ２は異なっていてよいが、Ｚ１およびＺ２は、同じである場合が多い。また、Ｚ１およびＺ２は、それぞれが、独立して、ＮまたはＯから選択されてよい。最も典型的には、Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも１つが窒素であり、多くの場合、Ｚ１およびＺ２のそれぞれが窒素である。そのため、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ独立してフェナントロリンまたはこれらの誘導体である場合が典型的には多い。
【0031】
置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれが、式（ＩＩＩ）の一般構造を構成する環に付着しているこれらの基を表す。Ｒ５およびＲ７は、最大３つの置換基を指し、Ｒ６は、式（ＩＩＩａ）に示されている最大２つの置換基を指す：
【化5】
【0032】
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、同じであっても異なっていてもよく；これらの各置換基が、同じであっても異なっていてもよい。例えば、Ｒ５がアルキル基であるとき；Ｒ５’、Ｒ５’’およびＲ５’’’のうちの１、２または３つがアルキル基であってよい。Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は：水素、アルキル、アルコキシ、アリールまたはこれらの組み合わせ；からそれぞれ独立して選択される場合が多い。Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも１つが水素である場合が多く；Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも２つが水素である場合が多く；いくつかの場合において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のそれぞれが水素である。
【0033】
代替の実施形態において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも１つがアルキルである場合が多く；Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも２つがアルキルである場合が多く；いくつかの場合において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれがアルキルである。いくつかの場合において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの２つが、アルキルである。典型的には、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの２つが、アルキルであるとき、Ｒ５およびＲ７が、アルキルである。典型的なアルキル基は、上記に定義されている通りである。しかし、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７がアルキル基であるときには、上記アルキル基は：メチル、エチルまたはプロピル；から選択される場合が多い。典型的には、上記アルキル基は、メチルまたはエチルであり、より典型的には、上記アルキル基はメチルである。
【0034】
さらなる代替の実施形態において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも１つがアリールである場合が多く；Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの少なくとも２つがアリールである場合が多く；いくつかの場合において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれがアリールである。いくつかの場合において、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの２つがアリールである。典型的には、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの２つがアリールであるとき、Ｒ
５およびＲ７が、アリールである。典型的なアリール基は、上記に定義されている通りである。しかし、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７がアリール基であるときには、上記アリール基は：フェニル、ピリジルまたはフリル；から選択される場合が多い。典型的には、上記アリール基は、フェニルまたはピリジルであり、より典型的には、上記アリール基はフェニルである。
５およびＲ７が、アリールである。典型的なアリール基は、上記に定義されている通りである。しかし、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７がアリール基であるときには、上記アリール基は：フェニル、ピリジルまたはフリル；から選択される場合が多い。典型的には、上記アリール基は、フェニルまたはピリジルであり、より典型的には、上記アリール基はフェニルである。
【0035】
Ｒ５およびＲ７は、同じである場合があり得る。さらに、二座配位子は対称であり、すなわち、式（ＩＩＩａ）の構造についての置換パターンは対称であり、例えば、Ｒ５’およびＲ７’がメチル基であり、全ての他の置換基が水素である場合が多い。
【0036】
典型的な二座配位子は、以下に示す化合物（１）～（７）である：
【化6】
【0037】
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のうちの少なくとも２つが、同じである場合が多い。多くの場合、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のうちの少なくとも３つが同じであり；Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のうちの４つ全てが同じである場合があり得る。いくつかの実施形態に
おいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ異なっている。Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれが、独立して、化合物（１）～（７）から選択されてよい。多くの場合、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）、（２）、（３）、（５）、（６）および（７）からそれぞれ独立して選択され；より典型的にはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）、（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；さらにより典型的には、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；最も典型的にはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）および（２）からそれぞれ独立して選択される。Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、全てが、化合物（３）によって表される場合があり得る。
おいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれ異なっている。Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、それぞれが、独立して、化合物（１）～（７）から選択されてよい。多くの場合、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）、（２）、（３）、（５）、（６）および（７）からそれぞれ独立して選択され；より典型的にはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）、（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；さらにより典型的には、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；最も典型的にはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、化合物（１）および（２）からそれぞれ独立して選択される。Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は、全てが、化合物（３）によって表される場合があり得る。
【0038】
式（ＩＩａ）の化合物の場合において、Ａ１およびＡ２は、それぞれが、独立して、化合物（１）～（７）から選択されてよい。多くの場合、Ａ１およびＡ２は、化合物（１）、（２）、（３）、（５）、（６）および（７）からそれぞれ独立して選択され；より典型的にはＡ１およびＡ２は、化合物（１）、（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；さらにより典型的には、Ａ１およびＡ２は、化合物（２）および（３）からそれぞれ独立して選択され；最も典型的にはＡ１およびＡ２は、化合物（１）および（２）からそれぞれ独立して選択される。Ａ１およびＡ２は、両方が、化合物（３）によって表される場合があり得る。
【0039】
本発明の第１態様の化合物は、正電荷、通常は式（Ｉ）の化合物についての４＋電荷および式（Ｉａ）の化合物についての２＋電荷を保有する場合が典型的には多い。この電荷を平衡化するために様々な対イオンが付与され得る。対イオンの選択について特に制限はないが、典型的には：塩化物、フッ化物、臭化物、水酸化物、硝酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、またはこれらの組み合わせ；から選択されてよい。典型的には、対イオンは、塩化物または硝酸塩、通常は塩化物である。誤解を避けるために、本明細書における化合物への言及は、その薬学的に許容可能な塩への言及も包含することも意図される。
【0040】
本発明の第２態様において、本発明の第１態様による化合物を含む組成物も提供される。組成物の含有量については特に制限されない。組成物は、当業者によく知られている、組成物の物理的または化学的特性を修飾するための１つ以上の賦形剤を含んでいてよい。組成物は、経口送達用の錠剤として、体に適用可能な局所製剤として、または、当業者によく知られている静脈もしくは皮下送達に適合される組成物として製剤化されてよい。
【0041】
組成物は、１つ以上のさらなる抗微生物剤、典型的には１つ以上のさらなる抗生物質を含めた１つ以上のさらなる医薬品有効成分を含んでいてよい。組成物は、本発明の第１態様の化合物の投薬量の範囲で調製されてもよい。
【0042】
本発明の第１態様による化合物および本発明の第２態様による組成物は、微生物によって引き起こされる１つ以上の疾患または障害の処置のためのものであってよい。より典型的には、本発明の第１態様による化合物および本発明の第２態様による組成物は、細菌、特に、グラム陰性細菌によって引き起こされる１つ以上の疾患または障害の処置に使用される。典型的な疾患として、限定されないが：肺炎、結核、コレラ、梅毒、腸チフス、破傷風、院内感染（病院内感染による）、尿路感染、血液感染またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。
【0043】
本発明の第３態様において、微生物疾患または障害を処置する方法であって、本発明の第１態様の化合物または本発明の第２態様の組成物を患者に投与することを含む、方法も提供される。典型的には、微生物疾患または障害は、グラム陰性細菌によって通常引き起こされる細菌性疾患または障害である。典型的な例として、限定されないが：肺炎、結核、コレラ、梅毒、腸チフス、破傷風、院内感染（病院内感染による）、尿路感染、血液感
染、またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。
染、またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。
【0044】
本発明の第４態様において、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）で示される化合物が提供される：
式中、
Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、
Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’は：水素、アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリールからそれぞれ独立して選択され；
ただし、Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’のうちの少なくとも１つが：アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリール（アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリール基は、それぞれ、上記に記載されている通りである）から選択されることとし；Ｒ１４～Ｒ１６およびＲ１８～Ｒ２１は、上記に記載されている通りである。
【化7】
式中、
Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、
Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’は：水素、アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリールからそれぞれ独立して選択され；
ただし、Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’、Ｒ８’’’、Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’、Ｒ９’’’、Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’、Ｒ１０’’’、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’、Ｒ１１’’’、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’、Ｒ１２’’’、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’のうちの少なくとも１つが：アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリール（アルキル、アルコキシ、アルケニルおよびアリール基は、それぞれ、上記に記載されている通りである）から選択されることとし；Ｒ１４～Ｒ１６およびＲ１８～Ｒ２１は、上記に記載されている通りである。
【0045】
Ｒ８、Ｒ８’、Ｒ８’’およびＲ８’’’のうちの２、３または４つ全てが、同じである場合が多い。Ｒ９、Ｒ９’、Ｒ９’’およびＲ９’’’のうちの２、３または４つ全てが、同じである場合も多い。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１０’、Ｒ１０’’およびＲ１０’’’のうちの２、３または４つ全てが、同じであってよく、また、典型的には、Ｒ１１、Ｒ１１’、Ｒ１１’’およびＲ１１’’’のうちの２、３または４つ全てが同じである。また、Ｒ１２、Ｒ１２’、Ｒ１２’’およびＲ１２’’’のうちの２、３または４つ全てが、典型的には同じであり、Ｒ１３、Ｒ１３’、Ｒ１３’’およびＲ１３’’’のうちの２、３または４つ全てが、同じである場合が多い。理解されるように、ルテニウム金属中心についての置換パターンを信頼性のある方法で正確に制御することは難しくあり得るため、異なる二座配位子の組み合わせを使用するよりもむしろ、同じ二座配位子、および、理想的には全て４つ同一の二座配位子を使用して錯体を製造することがより容易である場合が多い。多くの場合、一貫した「混合」リガンド錯体を得るために分離技術が必要とされる。
【0046】
同様に、式（ＩＶａ）に関して、Ｒ８およびＲ８’は、同じである場合が多い。また、Ｒ９およびＲ９’は、同じである場合が多い。いくつかの実施形態において、Ｒ１０およびＲ１０’は、同じであってよく、典型的にはＲ１１およびＲ１１’もまた、同じである。また、Ｒ１２およびＲ１２’は、典型的には同じであり、Ｒ１３およびＲ１３’は、同じである場合が多い。
【0047】
本発明の一実施形態において、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも１つがアルキルであり；より典型的には、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも２つがアルキルであり；なおより典型的には、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも３つがアルキルであり；より典型的には、なお、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも４つがアルキルであり；さらにより典型的には、なお、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも５つがアルキルであり；最も典型的には、Ｒ８～Ｒ１３のそれぞれがアルキルである。上記アルキル基は、メチル、エチルおよびプロピルから典型的には選択され、最も典型的にはメチルまたはエチルであり、通常はメチルである。アルキルではないこれらの置換基Ｒ８～Ｒ１３は、典型的には水素である。二座配位子の周りの置換パターンは対称である場合が多い（例えば、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれＲ１３、Ｒ１２およびＲ１１と同一である）。多くの場合、Ｒ８～Ｒ１３のうちの２つがアルキルであり、より典型的には、Ｒ８～Ｒ１３のうちの４つがアルキルであり、いくつかの場合において、Ｒ８～Ｒ１３のうちの６つ全てが、アルキルである。
【0048】
多くの場合、Ｒ８およびＲ１３はアルキル（通常メチル）である場合があり；典型的には、かかる状況において、Ｒ９～Ｒ１２は水素である。代替的には、Ｒ９～Ｒ１２はアルキル（通常メチル）である場合があり得；典型的には、かかる状況において、Ｒ８およびＲ１３は、水素である。さらに、Ｒ９およびＲ１２はアルキル（通常メチル）である場合があり得；典型的には、かかる状況において、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１３は、水
素である。代替的には、Ｒ１０およびＲ１１はアルキル（通常メチル）である場合があり得；典型的には、かかる状況において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１２およびＲ１３は、水素である。
素である。代替的には、Ｒ１０およびＲ１１はアルキル（通常メチル）である場合があり得；典型的には、かかる状況において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１２およびＲ１３は、水素である。
【0049】
本発明の別の実施形態において、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも１つがアリールであり；より典型的には、Ｒ８～Ｒ１３のうちの少なくとも２つが、アリールである。上記アリール基は、フェニル、ピリジルおよびフリルから典型的には選択され；最も典型的にはフェニルである。アリールではないこれらの置換基Ｒ８～Ｒ１３は、典型的には水素である。二座配位子についての置換パターンは対称である場合が多い（例えば、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれＲ１３、Ｒ１２およびＲ１１と同一である）。多くの場合、Ｒ８～Ｒ１３のうちの２つがアリールであり、いくつかの場合において、Ｒ８～Ｒ１３のうちの４つがアリールである。
【0050】
多くの場合、Ｒ１０およびＲ１１は、アリール（通常フェニル）であり；典型的には、かかる状況において、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１２およびＲ１３は、水素である場合がある。代替的には、Ｒ９～Ｒ１２は、アリール（通常フェニル）である場合があり得；典型的には、かかる状況において、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１３は、水素である。
【0051】
化合物は、式（Ｖ）または式（Ｖａ）によって表され：
またはその薬学的に許容可能な塩である場合があり得る。使用され得る対イオンの選択については特に制限されず、例示的な対イオンは上記に記載されている。
【化8】
またはその薬学的に許容可能な塩である場合があり得る。使用され得る対イオンの選択については特に制限されず、例示的な対イオンは上記に記載されている。
【0052】
本発明の第５態様において、本発明の第４態様による化合物を含む組成物も提供される。組成物の含有量については特に制限されない。組成物は、当業者によく知られている、組成物の物理的または化学的特性を修飾するための１つ以上の賦形剤を含んでいてよい。組成物は、経口送達用の錠剤として、体に適用可能な局所製剤として、または、当業者によく知られている静脈もしくは皮下送達に適合される組成物として製剤化されてよい。
【0053】
組成物は、１つ以上の抗微生物剤、典型的には１つ以上の抗生物質を含めた１つ以上のさらなる医薬品有効成分を含んでいてよい。組成物は、本発明の第１態様の化合物の投薬
量の範囲で調製されてもよい。
量の範囲で調製されてもよい。
【0054】
本発明の第４態様による化合物および本発明の第５態様による組成物は、微生物によって引き起こされる１つ以上の疾患または障害の処置のためのものであってよい。より典型的には、本発明の第４態様による化合物および本発明の第５態様による組成物は、細菌、特に、グラム陰性細菌によって引き起こされる１つ以上の疾患または障害の処置に使用されてよい。典型的な疾患として、限定されないが：肺炎、結核、コレラ、梅毒、腸チフス、破傷風、院内感染（病院内感染による）、尿路感染、血液感染、またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。
【0055】
本発明の第６態様において、微生物疾患または障害を処置する方法であって、本発明の第４態様の化合物または本発明の第５態様の組成物を患者に投与することを含む、方法も提供される。典型的には、微生物疾患または障害は、グラム陰性細菌によって通常引き起こされる細菌性疾患または障害である。典型的な例として、限定されないが：肺炎、結核、コレラ、梅毒、腸チフス、破傷風、院内感染（病院内感染による）、尿路感染、血液感染、またはこれらの組み合わせ；が挙げられる。
【0056】
純粋に理解を助けるために、本発明は同封の図を参照して説明される。
【0057】
本発明をここで具体的な例に関して説明する。これらの例は、限定的であると解釈されるべきではなく、本発明の理解を深めるために提供される。
【実施例】
【0058】
二核錯体の合成
錯体１４＋および２４＋（スキーム１を参照されたい）を以下に概説する手順を使用して合成した。
錯体１４＋および２４＋（スキーム１を参照されたい）を以下に概説する手順を使用して合成した。
【化9】
【0059】
１，１０－フェナントロリン－５，６－ジオン（化合物１４＋）
１，１０－フェナントロリン（１８．０２ｇ、１００ｍｍｏｌ）を６０％Ｈ２ＳＯ４（１２５ｍＬ）に溶解した。一定の撹拌をしながら、臭素酸カリウム（６６．８１ｇ、４００．１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加して、反応が激しくなりすぎないようにした。反応により、臭素ガスの褐色の煙が放散した。全ての臭素酸カリウムを添加した後、反応混合物を放置して室温まで冷却した。混合物を、砕いた氷（１００ｇ）を添加して氷浴に置くことによってさらに冷却した。溶液をＮａＯＨ（２０Ｍ）の滴加によってｐＨ５～６に中和し、中和の間に混合物が熱くなり、これを、氷浴において冷たく保つようにして行わなければならなかった。黄色沈殿物をシンターで濾過し、水（１Ｌ）およびジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空中で乾燥した。粗生成物を水／メタノール（１：５０）中での再結晶を介して精製し、鮮やかな黄色結晶を、真空濾過を介して収集した。質量＝１６．０４ｇ（７６．３１ｍｍｏｌ、７６．３％）黄色固体。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（分裂統合）；７．６１（ｄｄ，２Ｈ），８．５２（ｄｄ，２Ｈ），９．１３（ｄｄ，２Ｈ）．ＭＳ；ｍ／ｚ：２１０．１（１００）［Ｍ＋］．
１，１０－フェナントロリン（１８．０２ｇ、１００ｍｍｏｌ）を６０％Ｈ２ＳＯ４（１２５ｍＬ）に溶解した。一定の撹拌をしながら、臭素酸カリウム（６６．８１ｇ、４００．１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加して、反応が激しくなりすぎないようにした。反応により、臭素ガスの褐色の煙が放散した。全ての臭素酸カリウムを添加した後、反応混合物を放置して室温まで冷却した。混合物を、砕いた氷（１００ｇ）を添加して氷浴に置くことによってさらに冷却した。溶液をＮａＯＨ（２０Ｍ）の滴加によってｐＨ５～６に中和し、中和の間に混合物が熱くなり、これを、氷浴において冷たく保つようにして行わなければならなかった。黄色沈殿物をシンターで濾過し、水（１Ｌ）およびジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空中で乾燥した。粗生成物を水／メタノール（１：５０）中での再結晶を介して精製し、鮮やかな黄色結晶を、真空濾過を介して収集した。質量＝１６．０４ｇ（７６．３１ｍｍｏｌ、７６．３％）黄色固体。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（分裂統合）；７．６１（ｄｄ，２Ｈ），８．５２（ｄｄ，２Ｈ），９．１３（ｄｄ，２Ｈ）．ＭＳ；ｍ／ｚ：２１０．１（１００）［Ｍ＋］．
【0060】
テトラピリド［３，２－ａ：２’，３’－ｃ：３’－ｃ：３’’，２’’－ｈ：２’’’，３’’’－ｊ］フェナジン（ＴＰＰＨＺ）
酢酸アンモニウム（１５ｇ、１９４．６ｍｍｏｌ）、ｄｉｐ（２．９０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）および亜ジチオン酸ナトリウム（３００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を、窒素下、１８０℃で２時間、還流下で沸騰させた。反応混合物を時折撹拌した。反応が完了した後、混合物を放置して室温まで冷却し、次いで蒸留水（２０ｍＬ）を添加した。形成した黄色沈殿物を収集し、真空下で濾過し、水、メタノールおよびアセトン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。得られた粗生成物を還流エタノール（１００ｍＬ）においてトリチュレートし
、不純物を除き、熱いうちに濾過し、真空中で乾燥した。質量＝（０．９２ｇ、２．３９ｍｍｏｌ、３４．６％）黄色固体。生成物は、大部分の溶媒に難溶性であった。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（分裂統合）７．９４（ｄｄ，４Ｈ），９．４１（ｄｄ，４Ｈ），９．８３（ｄｄ，４Ｈ）．１ＨＮＭＲ（ｄ－ＴＦＡ）δ（分裂統合）８．６２（ｄｄ，４Ｈ），９．５６（ｄｄ，４Ｈ），１０．５２（ｄｄ，４Ｈ）．ＭＳ；ｍ／ｚ（４２．６％）：３８５．１（１００）［Ｍ＋］．
酢酸アンモニウム（１５ｇ、１９４．６ｍｍｏｌ）、ｄｉｐ（２．９０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）および亜ジチオン酸ナトリウム（３００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を、窒素下、１８０℃で２時間、還流下で沸騰させた。反応混合物を時折撹拌した。反応が完了した後、混合物を放置して室温まで冷却し、次いで蒸留水（２０ｍＬ）を添加した。形成した黄色沈殿物を収集し、真空下で濾過し、水、メタノールおよびアセトン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。得られた粗生成物を還流エタノール（１００ｍＬ）においてトリチュレートし
、不純物を除き、熱いうちに濾過し、真空中で乾燥した。質量＝（０．９２ｇ、２．３９ｍｍｏｌ、３４．６％）黄色固体。生成物は、大部分の溶媒に難溶性であった。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（分裂統合）７．９４（ｄｄ，４Ｈ），９．４１（ｄｄ，４Ｈ），９．８３（ｄｄ，４Ｈ）．１ＨＮＭＲ（ｄ－ＴＦＡ）δ（分裂統合）８．６２（ｄｄ，４Ｈ），９．５６（ｄｄ，４Ｈ），１０．５２（ｄｄ，４Ｈ）．ＭＳ；ｍ／ｚ（４２．６％）：３８５．１（１００）［Ｍ＋］．
【0061】
［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］
４つの化合物を以下の方法によって合成した。Ｎ－Ｎは、置換フェナントロリン補助リガンドを表す。ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ、Ｎ－ＮおよびＬｉＣｌを還流下ＤＭＦ中で８時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、アセトンを添加した。これを４℃で１６時間保存した。暗紫色沈殿物を水およびエタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。
４つの化合物を以下の方法によって合成した。Ｎ－Ｎは、置換フェナントロリン補助リガンドを表す。ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ、Ｎ－ＮおよびＬｉＣｌを還流下ＤＭＦ中で８時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、アセトンを添加した。これを４℃で１６時間保存した。暗紫色沈殿物を水およびエタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。
【0062】
［Ｒｕ（１，１０－フェナントロリン）２Ｃｌ２］
ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ（１．５６ｇ、６ｍｍｏｌ）、ＬｉＣｌ（１．５５ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）、ｐｈｅｎ（２．５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２０ｍＬ）およびアセトン（１００ｍＬ）。質量＝２．４１ｇ（４．５９ｍｍｏｌ、収率６６．１％）。ＥＳ－ＭＳｍ／ｚ（％）：４９７（７０）［Ｍ－Ｃｌ］＋、５２５（１００）［Ｍ－Ｃｌ］＋＋ＣＯ。
ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ（１．５６ｇ、６ｍｍｏｌ）、ＬｉＣｌ（１．５５ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）、ｐｈｅｎ（２．５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２０ｍＬ）およびアセトン（１００ｍＬ）。質量＝２．４１ｇ（４．５９ｍｍｏｌ、収率６６．１％）。ＥＳ－ＭＳｍ／ｚ（％）：４９７（７０）［Ｍ－Ｃｌ］＋、５２５（１００）［Ｍ－Ｃｌ］＋＋ＣＯ。
【0063】
［｛Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］［ＰＦ６］４
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］および（ｔｐｐｈｚ）をエタノールおよび水の１：１溶液に添加した。溶液を、窒素下、還流で１２時間加熱した。完了後、反応混合物を室温まで冷却し、４℃で１６時間保存した。赤色溶液を濾過し、エタノールを回転蒸発によって除去した。飽和量のＮＨ４ＰＦ６を添加し；これにより、暗赤色沈殿物が形成された。沈殿物を濾過によって収集し、水で洗浄し、ジエチルエーテルの添加によってアセトニトリル中で再結晶化した。生成物を真空中で乾燥し、以下の溶媒系：９５％ ＭｅＣＮ、３％ ｄＨ２Ｏおよび２％ ＫＮＯ３；を使用してアルミナカラムにおいて精製した。
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］および（ｔｐｐｈｚ）をエタノールおよび水の１：１溶液に添加した。溶液を、窒素下、還流で１２時間加熱した。完了後、反応混合物を室温まで冷却し、４℃で１６時間保存した。赤色溶液を濾過し、エタノールを回転蒸発によって除去した。飽和量のＮＨ４ＰＦ６を添加し；これにより、暗赤色沈殿物が形成された。沈殿物を濾過によって収集し、水で洗浄し、ジエチルエーテルの添加によってアセトニトリル中で再結晶化した。生成物を真空中で乾燥し、以下の溶媒系：９５％ ＭｅＣＮ、３％ ｄＨ２Ｏおよび２％ ＫＮＯ３；を使用してアルミナカラムにおいて精製した。
【0064】
［｛Ｒｕ（１，１０－フェナントロリン）２｝２（ｔｐｐｈｚ）］［ＰＦ６］４
Ｔｐｐｈｚ（０．２６３ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２Ｃｌ２］（１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）およびエタノール／水（５０ｍＬ）。質量＝１．１ｇ（０．５８ｍｍｏｌ、収率８５．６％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ６）δ（分裂統合）：７．７１（ｍ，８Ｈ），７．９４（ｄｄ，４Ｈ），８．０９（ｄ，４Ｈ），８．２９（ｄｄ，８Ｈ），８．３３（ｓ，８Ｈ），８．６９（ｄｄ，８Ｈ），１０．０１（ｄｄ，４Ｈ）．ＥＳ－ＭＳ；ｍ／ｚ（％）：７９９（１０）［Ｍ－２ＰＦ６］２＋，４８４（１５）［Ｍ－３ＰＦ６］３＋，３２１（５０）［Ｍ－４ＰＦ６］４＋，正確な質量分析：Ｃ７２Ｈ２８Ｎ１４［１０２Ｒｕ］２ ４＋、計算値３２１．１１１０．実測値３２１．１１１２。
錯体３４＋および４４＋を、同様の方法を使用して、関連するメチル化二座配位子を用いて合成した。３４＋および４４＋の両方が、それぞれ６７０ｎｍおよび７００ｎｍを中心として、ＭｅＣＮ中、予期された強いＲｕＩＩ→ｔｐｐｈｚベースの３ＭＬＣＴ発光を示す（図５および６）。これら４つの錯体のそれぞれの生物学的特性を、アニオンメタセシスによって得られる塩化物塩を使用して検討した。
Ｔｐｐｈｚ（０．２６３ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２Ｃｌ２］（１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）およびエタノール／水（５０ｍＬ）。質量＝１．１ｇ（０．５８ｍｍｏｌ、収率８５．６％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ６）δ（分裂統合）：７．７１（ｍ，８Ｈ），７．９４（ｄｄ，４Ｈ），８．０９（ｄ，４Ｈ），８．２９（ｄｄ，８Ｈ），８．３３（ｓ，８Ｈ），８．６９（ｄｄ，８Ｈ），１０．０１（ｄｄ，４Ｈ）．ＥＳ－ＭＳ；ｍ／ｚ（％）：７９９（１０）［Ｍ－２ＰＦ６］２＋，４８４（１５）［Ｍ－３ＰＦ６］３＋，３２１（５０）［Ｍ－４ＰＦ６］４＋，正確な質量分析：Ｃ７２Ｈ２８Ｎ１４［１０２Ｒｕ］２ ４＋、計算値３２１．１１１０．実測値３２１．１１１２。
錯体３４＋および４４＋を、同様の方法を使用して、関連するメチル化二座配位子を用いて合成した。３４＋および４４＋の両方が、それぞれ６７０ｎｍおよび７００ｎｍを中心として、ＭｅＣＮ中、予期された強いＲｕＩＩ→ｔｐｐｈｚベースの３ＭＬＣＴ発光を示す（図５および６）。これら４つの錯体のそれぞれの生物学的特性を、アニオンメタセシスによって得られる塩化物塩を使用して検討した。
【0065】
二核錯体の特性
親油性および親水性のバランスは、生物活性基質の生細胞取り込みに重要であるとされている。全４つの錯体のＬｏｇＰを、振とうフラスコ手順を使用してオクタノール－水分配を通して決定した。結果は以下の通りであった：１４＋＝１．７７、２４＋＝１．０３、３４＋＝１．３８および４４＋＝１．１３。これらのデータは、２４＋が最も親油性の
錯体であることを明らかにしている。さらに、相対的な親油性は、これらの錯体の補助リガンドに付着しているメチル基の数によって増加すると思われる。
親油性および親水性のバランスは、生物活性基質の生細胞取り込みに重要であるとされている。全４つの錯体のＬｏｇＰを、振とうフラスコ手順を使用してオクタノール－水分配を通して決定した。結果は以下の通りであった：１４＋＝１．７７、２４＋＝１．０３、３４＋＝１．３８および４４＋＝１．１３。これらのデータは、２４＋が最も親油性の
錯体であることを明らかにしている。さらに、相対的な親油性は、これらの錯体の補助リガンドに付着しているメチル基の数によって増加すると思われる。
【0066】
これらの化合物の生物活性を、大腸菌の野生型Ｋ１２誘導ＭＧ１６５５および尿路病原性多剤耐性ＥＣ９５８ ＳＴ１３１株に関して調査した。別のグラム陽性細菌、ＥＳＫＡＰＥ細菌－大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の病原性胃腸株、Ｖ５８３（ＡＴＣＣ７００８０２）－主要な日和見感染病原体である（および尿路感染の主因）もまた、化合物に関して試験した。４つの錯体の最小阻止濃度、ＭＩＣを、グルコース限定最小培地（ＧＤＭＭ）および栄養リッチなＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ－ＩＩ（ＭＨ－ＩＩ）において得た（図７）。表１におけるデータによって実証されているように、全４つの錯体が、ＧＤＭＭにおいてより高い活性を示している。
【表1】
【0067】
最も親油性の化合物、２４＋は－水性媒体へのそのより低い溶解性におそらく起因して－最も少ない活性を示すが、親油性シリーズは、親油性の増加およびそれに伴う活性の増加を示し、４４＋は、細菌の全３つの株に対して最も高い活性を有している。とりわけ、１４＋、３４＋および４４＋は、大腸菌のβ－ラクタム耐性株およびエンテロコッカス・
フェカリスのバンコマイシン耐性株に対して相当な活性を示し；錯体４４＋は、さらに、大腸菌の野生型株に対してアンピシリンよりも高い活性を示す。１４＋～４４＋に関しての最小殺菌濃度、ＭＢＣの推定値も得られ、表１にまとめた。これらのデータは、ＭＩＣデータに関しては、ＧＤＭＭおよびＭＨ－ＩＩ間のＭＢＣ値の増加が観察されることを示している。また、４４＋は最も活性を有し、ＧＤＭＭにおいては、そのＭＢＣ値がアンピシリンよりも低く、これは、全ての細菌株に関して、従来の抗生物質よりも活性を有することを示している。さらに、全３つの株に対してのＭＢＣ値が、少なくとも４倍、ＭＩＣよりも高いため、全ての化合物が静菌性の抗微生物剤として機能する。
フェカリスのバンコマイシン耐性株に対して相当な活性を示し；錯体４４＋は、さらに、大腸菌の野生型株に対してアンピシリンよりも高い活性を示す。１４＋～４４＋に関しての最小殺菌濃度、ＭＢＣの推定値も得られ、表１にまとめた。これらのデータは、ＭＩＣデータに関しては、ＧＤＭＭおよびＭＨ－ＩＩ間のＭＢＣ値の増加が観察されることを示している。また、４４＋は最も活性を有し、ＧＤＭＭにおいては、そのＭＢＣ値がアンピシリンよりも低く、これは、全ての細菌株に関して、従来の抗生物質よりも活性を有することを示している。さらに、全３つの株に対してのＭＢＣ値が、少なくとも４倍、ＭＩＣよりも高いため、全ての化合物が静菌性の抗微生物剤として機能する。
【0068】
錯体４４＋が最も有望な殺菌性を有することを確立したため、時間殺菌動力学アッセイ（ｔｉｍｅ－ｋｉｌｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｓｓａｙ）を、３７℃における最少培地中で、増加する濃度の錯体に６時間さらした際の両方の大腸菌株について実施した（図１Ａおよび８を参照されたい）。ＭＩＣよりも低い濃度では、細菌が成長し続けるにつれてコロニー形成単位（ＣＦＵ）が徐々に増加した。両方の株において、ＭＩＣの濃度以上では、化合物が細菌増殖を停止させ、生存している細菌性細胞の数を低減させることが明らかである。ＥＣ９５８については、４４＋への最も高い暴露において、コロニーが形成されず、系内の全ての細菌が死滅されたことを示した。ＭＢＣ値と時間殺菌アッセイとの間の相違は、異なる実験条件から生じると考えられ、ＭＢＣアッセイは、１６～１８時間にわたる静止インキュベーションを含み、時間殺菌アッセイは、９０％通気および６時間にわたる回転によって実施される。
【0069】
大腸菌細胞による４４＋の取り込みを調査するために、ＩＣＰ－ＡＥＳ研究を実施した。４４＋による取り込み研究をグルコースの存在下および非存在下で実施した（図１Ｂおよび９を参照されたい）。１時間にわたる大腸菌ＥＣ９５８中でのルテニウムの蓄積を調査する実験を、高濃度で、時間殺菌アッセイとして行い、細菌の９９．９％が４４＋への最初の暴露時間内に死滅されたことを示した。これらの実験において、鉄の濃度（全細胞中の微量の元素）もまた対照として定量した。４４＋による処理では、鉄分が一定で残存することが分かり；さらに、ＣＦＵ／ｍＬの無視できるほどの変化もあり、このことは、細胞が蓄積実験の際に溶解しなかったことを実証した。
【0070】
グルコース不含条件では、蓄積は２段階を示し：暴露における最初の増加後、低いルテニウムレベルが約２０分間維持され、この後、取り込み量は徐々に倍になり、最終的な数字が細胞当たり１．１×１０－１６ｇとなる。平均細胞容積を１μｍ３とすると、これは、＞１ｍＭの細胞内濃度と等しい。対照的に、グルコースの存在下では－最終的に蓄積するルテニウムの量が実験誤差内で同一であるが－錯体の取り込みは迅速であり、ルテニウムの最大細胞内濃度が２０分以内に達成される。グルコースおよびグルコース不含条件間の有意差は１０および２０分で見られる。
【0071】
４４＋の取り込みおよび４４＋への暴露への細胞応答も金属錯体を使用した超解像度において分析した。改良した解像度（約１００ｎｍ）において４４＋の内在化を画像化するために構造化照明顕微鏡法を使用したが、本発明者らはまた、最も高いサブ回折限界解像度を提供するために、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）ナノ顕微鏡法も用いた。経時的（５～１２０分）に撮影した例のＳＴＥＤ画像を図２に示す。
【0072】
細胞形態の変化が暴露の最初の５～２０分内に起こるか否かを調査するために、蓄積実験において使用した同じ時点および同一の条件で画像を撮影した。これらの画像は、４４＋が大腸菌の病原性株によって容易かつ迅速に取り込まれることを確認した。興味深いことに、最大２０分で、錯体は大部分が細胞膜に蓄積し、概して細胞コンパートメント内に分散される。しかし、この期間の後、細胞極に次第に優先的に位置する。
【0073】
詳細な３Ｄセクショニング実験（３Ｄ ＳＴＥＤ）ではＳＴＥＤ顕微鏡法も用いた。ＸＹ面およびＺ軸に分裂したデュアルＳＴＥＤビームを用いることによって、それぞれ画像化された面において、可能な限り高い３Ｄ解像度を促した；細菌の細胞寸法を与える重要な因子。この手順を使用して、各面における５０ｎｍの、およびＺ軸において１２０ｎｍ付近の、３Ｄ ＳＴＥＤ解像度を得た。図３は、４４＋へさらした後の特定の時点において撮影した画像を示す。最初の１０分の間に、プローブが、独特の分布パターンを形成して細胞膜内に蓄積する。２０分後、染料の再分配が開始し、極における蓄積が次第に現れる。
【0074】
画像化研究により、ＩＣＰ－ＡＥＳデータと一緒に、およそ２０分後の取り込み量の変化および錯体の細胞内分布を示す。さらに、４４＋の分子量は、ポーリン介在取り込みについての上限（約６００Ｄａ）よりもかなり大きいため、このメカニズムは無視されてよい。膜損傷の可能性を調査するために、プローブＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＮＨＳエステル４０５による第２の共染色実験を実施した（図４Ａを参照されたい）。
【0075】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＮＨＳエステル４０５は、非易感染性細菌細胞膜（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に不浸透性であるため、細胞膜を局在化および画像化する。４４＋へさらした５分後、ＮＨＳエステル４０５の局在化は、細菌の細胞膜に限定された。しかし、錯体へさらした６０分後、両方の染料が大腸菌に内在化していることが分かる。対照的に、６０分後であっても、ＮＨＳエステル４０５によって単に染色した細胞は、膜染色を専ら表し続ける。膜染色が４４＋による処理後にのみ内在化されるという事実は、錯体が細菌細胞膜の構造を破壊しているという証拠をさらに提示する。この現象をより定量的に調査するために、濃度依存性ＡＴＰ細胞漏出アッセイを実施した。特定の濃度の４４＋による処理の後、細菌細胞膜に損傷から放出される細胞外ＡＴＰの存在を、組み換え型蛍ルシフェラーゼおよびＤ－ルシフェリン間のＡＴＰ依存性反応から生じるルミネセンスを使用して検出した。
【0076】
図４Ｂにまとめられている、［ＡＴＰ］のルミネセンスベースの定量から得られるデータにより、細菌細胞膜が、４４＋への暴露において濃度依存的に損なわれることが確認される。この効果を考慮すると、膜損傷は内在化した４４＋のレベルが高濃度に上昇し得る前に最初に起こらなければならないため、グルコース不含条件における錯体の取り込みは二相性であると思われる。この膜損傷は錯体に関する治療作用の唯一のメカニズムである可能性がある；しかし－内在化された後－錯体が局在化し、第２の細胞標的を示唆する細胞の特定の領域で結合する。病原性の、治療耐性の大腸菌の株が依然として錯体に敏感であることを考慮すると、４４＋の膜破壊効果は、より複雑な一連の相互作用および細胞応答の単に一面に過ぎないと思われる。
【表2】
【表3】
【0077】
４４＋が高い抗微生物活性を示し、膜を標的とするため、非がん性真核細胞における化合物の効力を測定して、抗微生物セラノスティックリードとしてのその可能性をさらに調査した。ヒト胚腎臓株、ＨＥＫ２９３におけるＭＴＴアッセイでは、１３５μＭの平均ＩＣ５０値を示し、これは、細菌およびＨＥＫ２９３細胞に対する阻害濃度において少なくとも８０倍の大きさの差があることを示している（図４Ｃを参照されたい）。
【0078】
ＩＣ５０およびＭＩＣ値間の有望な比較を考慮して、動物モデルスクリーニングを実施した。ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）幼虫の生理学の多くの態様、特にこれらの免疫系は、哺乳動物と非常に類似しているため、毒性スクリーニングを含めた、ｉｎ ｖｉｖｏモデルとしてよく用いられ、一般的に使用される哺乳動物モデルに匹敵する結果を得ている。毒性スクリーニングを、４４＋を用いて行い、カプランマイヤー生存曲線をプロットした（図４Ｄを参照されたい）。使用した全ての濃度がＥＣ９５８に対する４４＋についてのＭＩＣを超えており、抗微生物剤について臨床において使用される１日用量範囲内であった。ログランク試験から、４４＋によって処置したＧａｌｌｅｒｉａによる生存百分率と、全ての化合物濃度での対照との間に有意差がないと判断した。加えて、活性及びメラニン化スコアは、４４＋にさらしたＧａｌｌｅｒｉａに対する有意な陰性効果はないことを示しており、この化合物がＭＩＣを優に上回る濃度でも毒性はないことを確認した。
【表4】
【表5】
【0079】
図１１および１２に示すように、膜電位および４４＋のフローサイトメトリーの挙動を求めた。さらに、ＭＩＣ濃度の４４＋がアシネトバクター・バウマニ（ＡＢ１８４）を浸透し得ることが示されている（図１３）。１０分で外膜を、６０で内膜を、画像化することができる。幼虫の血リンパ内のＡ．バウマニＡＢ１８４細胞における４４＋の局在化を図１７に示す。
【0080】
ルテニウムの血リンパ含有量（μｇ／ｍＬ）を、４４＋を注入したハチノスツヅリガについて求めた（図１４）。予期されるように、より高い用量では、ルテニウム含有量が血リンパにおいてより高いが、これは、実験の継続期間にわたって大部分が一定のままである。カプランマイヤー感染モデル（図１５）は、対照（水）と比較して４４＋の両方の濃度（４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇ）において良好な生存率を示している。さらに、図１６Ａおよび１６Ｂは、抽出した幼虫血リンパ（Ｇａｌｌｅｒｉａ細菌）からの細菌ＣＦＵカウントを示している。これらのプロットから、４８時間後、両方の処理濃度（４０または８０ｍｇ／ｋｇの４４＋）下で、コロニーがクリアランスされたことが明らかである。このクリアランスは、単回の化合物投与から達成した。これに対し、４４＋の非存在下では、細菌成長の指数関数的増加が観察された。
【0081】
ハチノスツヅリガ幼虫を、ＣＵＢＩＣクリアリングプロトコルを使用して、さらなる研究用に選択した。図１８は、クリアランスしたハチノスツヅリガ幼虫を通して撮影した画像を示す。４４＋の発光は、ハチノスツヅリガの頭部（Ａ）および尾部（Ｂ）におけるＡ．バウマニ細胞を染色した。Ａ．バウマニ細胞の領域をハイライトしている（Ｉ，ＩＩ）。Ｇａｌｌｅｒｉａの血リンパ細胞における免疫応答の開始が観察されている（Ｃ）。画像は、４４＋で染色したＡ．バウマニを幼虫の血球細胞によって取り込み、貪食したことを示している。これは、４４＋が細菌を死滅させるだけでなく、幼虫の免疫反応を上方調節して、感染をクリアランスさせることを示している。図１９はまた、ＮＨＳエステル４８８（Ａ）または４４＋（Ｂ）によって染色した、Ａ．バウマニ、ＡＢ１８４を感染させ
た、クリアランスした幼虫の画像も示す。細胞の断面を同定し（ｉ）、拡大して（ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＢＩＩ）、血球細胞内のＡ．バウマニを示す。ピーク発光強度を示すのに３Ｄ表面プロット（ＡＩＶ、ＢＩＩＩ）を与えた。
た、クリアランスした幼虫の画像も示す。細胞の断面を同定し（ｉ）、拡大して（ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＢＩＩ）、血球細胞内のＡ．バウマニを示す。ピーク発光強度を示すのに３Ｄ表面プロット（ＡＩＶ、ＢＩＩＩ）を与えた。
【0082】
図２０において、錯体４４＋に供されたときの大腸菌ＳＴ１３１、ＥＣ９５８のバイオフィルム形成の研究を提示する。ＳＴ１３１は、１０％のＭＩＣにおいて、４４＋の非存在下でバイオフィルムを形成した。ウェルチのＴ検定は、これらの群の間に有意差を示さなかった（Ｐ＝０．６８７）。０．３９０および０．７８１の濃度は、それぞれ０．００３および０．００５の小さなネガティブな値を有するバイオフィルムが形成しないことを示した。そのため、４４＋は、０．３９０μＭの低い濃度でバイオフィルムを形成することを防止する。図２１は、前形成したバイオフィルムによる研究を示す。バイオフィルムを１５．６μＭ、７８μＭおよび１５６μＭの４４＋に供した。対照（０μＭ）と１５６μＭサンプルとの間に一つ星の有意差が観察され（ｐ値＝０．００１５）、対照（０μＭ）と１５．６μＭサンプルとの間に二つ星の有意差が観察された（ｐ値＝０．００８６）。そのため、４４＋は、バイオフィルム形成を防止し、かつ、既存のバイオフィルムに浸透する能力を有する。
【0083】
単核錯体の合成
錯体１２＋および２２＋（スキーム２を参照されたい）を以下に概説する手順を使用して合成した。
錯体１２＋および２２＋（スキーム２を参照されたい）を以下に概説する手順を使用して合成した。
【化10】
【0084】
［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］
４つの化合物を以下の方法によって合成した。Ｎ－Ｎは、置換フェナントロリン補助リガンドを表す。ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ、Ｎ－ＮおよびＬｉＣｌを還流下で８時間、ＤＭＦ中で加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、アセトンを添加した。これを４℃で１６時間保存した。暗紫色沈殿物を水およびエタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。
４つの化合物を以下の方法によって合成した。Ｎ－Ｎは、置換フェナントロリン補助リガンドを表す。ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ、Ｎ－ＮおよびＬｉＣｌを還流下で８時間、ＤＭＦ中で加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、アセトンを添加した。これを４℃で１６時間保存した。暗紫色沈殿物を水およびエタノールで洗浄し、真空中で乾燥した。
【0085】
［Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）２Ｃｌ２］
ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ（１．１４ｇ、５．５０ｍｍｏｌ）、ＴＭＰ（２．４ｇ、１０．１６ｍｍｏｌ）、ＬｉＣｌ（１．４７ｇ、３４．６８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１９ｍＬ）およびアセトン（１００ｍＬ）。質量＝２．０７ｇ（３．２１ｍｍｏｌ、６３．２％）紫色固体。ＭＳ ｍ／ｚ（％）：６０９．１（６２）［Ｍ－Ｃｌ］＋、６３７．１（１００）［Ｍ］＋６６７．１．（４４）［Ｍ＋Ｎａ］＋。一酸化炭素が塩素のうちの１つに置き換わった。
ＲｕＣｌ３．３Ｈ２Ｏ（１．１４ｇ、５．５０ｍｍｏｌ）、ＴＭＰ（２．４ｇ、１０．１６ｍｍｏｌ）、ＬｉＣｌ（１．４７ｇ、３４．６８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１９ｍＬ）およびアセトン（１００ｍＬ）。質量＝２．０７ｇ（３．２１ｍｍｏｌ、６３．２％）紫色固体。ＭＳ ｍ／ｚ（％）：６０９．１（６２）［Ｍ－Ｃｌ］＋、６３７．１（１００）［Ｍ］＋６６７．１．（４４）［Ｍ＋Ｎａ］＋。一酸化炭素が塩素のうちの１つに置き換わった。
【0086】
［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２（ＤＰＱ）］［ＰＦ６］２
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］およびＤＰＱをＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏの１：１溶液に懸濁した。懸濁液をアルゴン下１２時間還流し、室温に冷却し、濾過した。ＮＨ４ＰＦ６を添加して褐色のヘキサフルオロホスフェ
ート塩を形成した。
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２Ｃｌ２］およびＤＰＱをＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏの１：１溶液に懸濁した。懸濁液をアルゴン下１２時間還流し、室温に冷却し、濾過した。ＮＨ４ＰＦ６を添加して褐色のヘキサフルオロホスフェ
ート塩を形成した。
【0087】
［Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）（ＤＰＱ）］［ＰＦ６］２
［Ｒｕ（ＴＭＰ）２Ｃｌ２］（１．０１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、ＤＰＱ（０．４９５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）およびＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）。質量＝０．８６１ｇ（０．８０１ｍｍｏｌ、５１％）。ＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＬＤ＋）ｍ／ｚ（％）：７８４（５１）［Ｍ－２ＰＦ６］２＋、９２９（１００）［Ｍ－ＰＦ６］＋。１ ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（分裂統合）：２．２３（６Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．７９（６Ｈ，ｓ），２．８５（６Ｈ，ｓ），７．４６（２Ｈ，ｄｄ），７．８５（２Ｈ，ｄ），７．６５（２Ｈ，ｓ），７．９５（２Ｈ，ｓ），８．４１（４Ｈ，ｄ），８．４８（２Ｈ，ｄ）．
［Ｒｕ（ＴＭＰ）２Ｃｌ２］（１．０１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、ＤＰＱ（０．４９５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）およびＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）。質量＝０．８６１ｇ（０．８０１ｍｍｏｌ、５１％）。ＭＳ（ＴＯＦ ＭＳ ＬＤ＋）ｍ／ｚ（％）：７８４（５１）［Ｍ－２ＰＦ６］２＋、９２９（１００）［Ｍ－ＰＦ６］＋。１ ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（分裂統合）：２．２３（６Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．７９（６Ｈ，ｓ），２．８５（６Ｈ，ｓ），７．４６（２Ｈ，ｄｄ），７．８５（２Ｈ，ｄ），７．６５（２Ｈ，ｓ），７．９５（２Ｈ，ｓ），８．４１（４Ｈ，ｄ），８．４８（２Ｈ，ｄ）．
【0088】
［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２（ｔｐｐｈｚ）］［ＰＦ６］２
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。５，６－ジアミノ－１，１０－フェナントロリンを熱メタノールに溶解し、これを、［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２ＤＰＱ］［ＰＦ６］２の、アセトニトリル中の沸騰溶液に添加した。反応混合物を加熱して８０℃で６時間還流した。溶液を室温まで冷却し、濾過した。ＮＨ４ＰＦ６を添加して赤色ヘキサフルオロホスフェート塩を形成した。粗生成物を水、エタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した。これを次いでアセトニトリル／水／ＫＮＯ３によるグレードＩアルミナカラムにおいて精製した。赤色バンドを収集し、溶媒を減圧下で除去し、赤色固体を真空中で乾燥した。
４つの化合物を以下の一般的な手順によって合成した。５，６－ジアミノ－１，１０－フェナントロリンを熱メタノールに溶解し、これを、［Ｒｕ（Ｎ－Ｎ）２ＤＰＱ］［ＰＦ６］２の、アセトニトリル中の沸騰溶液に添加した。反応混合物を加熱して８０℃で６時間還流した。溶液を室温まで冷却し、濾過した。ＮＨ４ＰＦ６を添加して赤色ヘキサフルオロホスフェート塩を形成した。粗生成物を水、エタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した。これを次いでアセトニトリル／水／ＫＮＯ３によるグレードＩアルミナカラムにおいて精製した。赤色バンドを収集し、溶媒を減圧下で除去し、赤色固体を真空中で乾燥した。
【0089】
［Ｒｕ（３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン）（ｔｐｐｈｚ）］［ＰＦ６］２
５，６－ジアミノ－１，１０－フェナントロリン（８８．２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、熱メタノール（１７ｍＬ）、［Ｒｕ（ＴＭＰ）２ＤＰＱ］［ＰＦ６］２（６０６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（３０ｍＬ）。質量＝０．２７２ｇ（０．３８９ｍｍｏｌ、４５％）、１ ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ－ｄ６）δ（分裂統合）：２．２９（６Ｈ，ｓ），２．３２（６Ｈ，ｓ），２．８０（６Ｈ，ｓ），２．８６（６Ｈ，ｓ），７．７１－７．７８（４Ｈ，ｍ），７．８４（４Ｈ，ｓ，），８．１５（４Ｈ，ｄ），９．３０（４Ｈ，ｄ），９．５９（４Ｈ，ｄ）．ＭＳ；ｍ／ｚ（％）：４７９［Ｍ－２（ＰＦ６）］２＋．正確な質量分析：Ｃ５６Ｈ４４Ｎ１０［１０２Ｒｕ］２＋、計算値４７９．１３９１．実測値４７９．１４０５。
５，６－ジアミノ－１，１０－フェナントロリン（８８．２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、熱メタノール（１７ｍＬ）、［Ｒｕ（ＴＭＰ）２ＤＰＱ］［ＰＦ６］２（６０６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（３０ｍＬ）。質量＝０．２７２ｇ（０．３８９ｍｍｏｌ、４５％）、１ ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ－ｄ６）δ（分裂統合）：２．２９（６Ｈ，ｓ），２．３２（６Ｈ，ｓ），２．８０（６Ｈ，ｓ），２．８６（６Ｈ，ｓ），７．７１－７．７８（４Ｈ，ｍ），７．８４（４Ｈ，ｓ，），８．１５（４Ｈ，ｄ），９．３０（４Ｈ，ｄ），９．５９（４Ｈ，ｄ）．ＭＳ；ｍ／ｚ（％）：４７９［Ｍ－２（ＰＦ６）］２＋．正確な質量分析：Ｃ５６Ｈ４４Ｎ１０［１０２Ｒｕ］２＋、計算値４７９．１３９１．実測値４７９．１４０５。
【0090】
単核錯体の特性
上記で使用したものと同じパラメータおよび条件により、化合物１４＋～４４＋に関してのＭＩＣおよびＭＢＣ値を求め、これらを、錯体１２＋～４２＋のＭＩＣおよびＭＢＣ値を試験するために用いた。
上記で使用したものと同じパラメータおよび条件により、化合物１４＋～４４＋に関してのＭＩＣおよびＭＢＣ値を求め、これらを、錯体１２＋～４２＋のＭＩＣおよびＭＢＣ値を試験するために用いた。
【表6】
【表7】
【0091】
表６および７から分かるように、抗微生物活性を化合物１２＋～４２＋のそれぞれから決定した。また、化合物４２＋は、既存の抗生物質、例えば、アンピシリンよりも良好な特性で、抗生物質として驚くべき効能を示すことが分かった。誤解を避けるために；ＳＨ１０００は黄色ブドウ球菌であり；ＡＢ１８４は、アシネトバクター・バウマニであり；ＰＡ２０１７は、緑膿菌である。
【0092】
錯体４２＋が最も有望な殺菌性を有することを確立したため、ＤＮＡ結合（図２２）および時間殺菌動力学アッセイを、３７℃における最少培地中で増加する濃度の錯体へさらした際に、大腸菌について実施した（図２３を参照されたい）。グルコースの存在下で、流出メカニズムを観察したところ、錯体が細胞の内外に活発に輸送され得ることを明らかに示している。図２４は、図２３での時間間隔における細胞当たりのＲｕ含有量（ｇ）の差を示しており、Ｒｕ含有量は、５、１０および２０分においてグルコースの存在下で概
してより高く、有意差が１０分後に観察されている。
してより高く、有意差が１０分後に観察されている。
【0093】
１、２および２４時間においてＭＩＣ濃度で４２＋によって処理した大腸菌細胞は、４２＋が存在するときに多核の細胞フィラメンテーションの開始を示した（図２６Ａ～Ｃおよび図２７）。これは、細胞死が、この錯体の存在下でＤＮＡ損傷によって引き起こされることを示している。図２７において、ＤＡＰＩおよび４２＋の直接のオーバーレイは、＞０．９のピアソンの共局在化定数を与える。この定数は、４２＋を確認する強い共局在化が黄色ブドウ球菌ＤＮＡを標的化することを示している。図２６および２７における観察を裏付けるために、大腸菌における４２＋の変異原性を、自然の突然変異誘発およびＵＶ照射と比較して、Ａｍｅｓ変異原性アッセイ（図２８）を使用して求めた。４２＋のＭＩＣレベル以上では、有意なＤＮＡ突然変異誘発が観察され、ＭＩＣの２倍では、これがＵＶ照射で観察されるレベルに近く、このことは、４２＋が、図２６に示すフィラメンテーションにおいて観察されるように、細菌細胞ＤＮＡへの損傷を引き起こすことを示している。図２９は、４２＋による処理後の大腸菌のＴＥＭ画像を示しており、細胞膜は無傷のままであり、細胞死が膜損傷を通して起こり、膜溶解では起こらないというさらなる証拠を付与している。しかし、死滅細胞における原形質分離を示しており（例えば、ＩＩＩにおいて観察される内細胞漏出）、これは、４２＋がまた、細胞に浸透性損傷も引き起こし得ることを示している。ＤＮＡ損傷モデルは、図３０の膜損傷アッセイによってさらに裏付けられる。このアッセイは、異なる４２＋濃度による処理後の細胞外ＡＴＰを定量し、ポリミキシン対照と比較して、４２＋によって処理した細胞はＡＴＰを保持する。このことは、損傷したＤＮＡを修復するために細胞内に過剰なレベルのＡＴＰを必要とすることに起因するとされている。
【0094】
４２＋（図３１）についての毒性スクリーニングを、４４＋（図４Ｄ）について上記で記載されているように完了した。４２＋は、最大８０ｍｇ／ｋｇ（抗生物質に関する最大臨床１日用量）まで、ハチノスツヅリガに対して毒性がない。４４＋と同様に、マンテルコックスログランク試験は、いずれの濃度においても、対照および化合物処置幼虫についての生存百分率間の統計的差異がなかったことを示した。図３２は、このときはＡ．バウマニＡＢ１８４による、さらなる毒性スクリーニングデータを提供し、これらの試験において、４２＋によって処置していない幼虫は生存していないのに対し、全ての処置した幼虫が実験の１２０時間の継続期間の間生存していることから、４２＋の存在はコロニーをクリアランスすることが明らかである。マンテルコックスログランク研究は、未処置の感染した幼虫と処置した幼虫との間の生存百分率の一つ星の有意差を示した。さらに、図３３Ａおよび３３Ｂは、抽出した幼虫血リンパ（Ａ．バウマニＡＢ１８４細菌）からの細菌ＣＦＵカウントを示している。これらのプロットから、４８時間後、両方の処理濃度（４０または８０ｍｇ／ｋｇの４２＋）下で、コロニーがクリアランスされたことが明らかである。このクリアランスは、単回の化合物投与から達成した。これに対し、４２＋の非存在下では、細菌成長の指数関数的増加が観察された。
【0095】
単および二核錯体の特性の比較
化合物１４＋～４４＋および化合物１２＋～４２＋の抗微生物活性をさらに考慮するために、化合物４４＋および４２＋を広範な微生物による研究のために選択した。結果を以下の表８に示す。ＭＩＣおよびＭＢＣ値を上記のように決定した。
化合物１４＋～４４＋および化合物１２＋～４２＋の抗微生物活性をさらに考慮するために、化合物４４＋および４２＋を広範な微生物による研究のために選択した。結果を以下の表８に示す。ＭＩＣおよびＭＢＣ値を上記のように決定した。
【表8-1】
【表8-2】
【0096】
以上のように、特許請求の範囲の錯体は、広範な細菌株ライブラリに対して活性を示す。特に、両方の錯体が、優先度１：重大としてＷＨＯによって同定されているカルバペネム耐性株を含めた全ての細菌にわたって高い活性を示す。
【0097】
表９～１１は、錯体４４＋および４２＋の活性を臨床標準ゲンタマイシンおよびシスプラチンとさらに比較する。
【表9】
【0098】
以上のように、両方の化合物が、試験したグラム陰性バイオフィルムに対して活性を有し－バイオフィルムに浸透および破壊することを示している。二核錯体、４４＋による活性は、４２＋または臨床標準抗生物質ゲンタマイシンのいずれかよりも高い。
【表10】
【0099】
表１０は、化合物のＭＩＣのものを超える濃度では、錯体が未処理の対照（自然の突然変異誘発）の範囲で変異頻度を示すことが見出されたことを示している。変異頻度は、シスプラチンによって観察されるよりも低かった。ゆえに、化合物が、哺乳動物ＤＮＡに対して非変異原性であることが確認される。
【表11】
【0100】
表１１の哺乳動物細胞毒性データは、両方の化合物がシスプラチンよりも毒性が低く、二核４４＋が、この周知の薬物よりも、健康な真核細胞に対して１０倍を超えて毒性が低いことを示している。加えて、４４＋については＞６０、４２＋については約６の平均治療指数が観察されている。これに対し、シスプラチンは、２の治療指数を有する。
【0101】
錯体４２＋および４４＋の相対取り込み速度。図２５に示されるように、錯体４４＋と比較して初期取り込み速度の増加が観察され、、これは、単核錯体のより低い分子量に起因するとされる。
【0102】
表１２は、錯体４２＋および４４＋の動的溶解度を試験し、これらが、可溶性の陽性対照薬物（ニカルジピン）に匹敵したことを示している。両方の化合物が、最適な溶解度及び動的安定性を有して、ＤＭＰＫ分析に合格した。
【表12】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【手続補正書】
【提出日】2021-12-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図25】
【国際調査報告】