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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-19
(54)【発明の名称】胃癌を診断するための高メチル化遺伝子の検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20220812BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220812BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220812BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220812BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220812BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 C
G01N33/50 P
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021574947
(86)(22)【出願日】2020-06-22
(85)【翻訳文提出日】2022-02-15
(86)【国際出願番号】 EP2020067370
(87)【国際公開番号】W WO2020254693
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】19305811.2
(32)【優先日】2019-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】594016872
【氏名又は名称】サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス）
(71)【出願人】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(71)【出願人】
【識別番号】505386960
【氏名又は名称】アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム）
(74)【代理人】
【識別番号】100107342
【弁理士】
【氏名又は名称】横田 修孝
(74)【代理人】
【識別番号】100155631
【弁理士】
【氏名又は名称】榎 保孝
(74)【代理人】
【識別番号】100137497
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 未知子
(74)【代理人】
【識別番号】100207907
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 桃子
(74)【代理人】
【識別番号】100217294
【弁理士】
【氏名又は名称】内山 尚和
(72)【発明者】
【氏名】シューファン、ワン－ルノー
(72)【発明者】
【氏名】ヴァレリー、タリー
(72)【発明者】
【氏名】ピエール、ローラン－ピュイグ
(72)【発明者】
【氏名】アズィーズ、ザーナン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CA25
2G045DA13
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS25
4B063QS36
(57)【要約】
本発明は、対象における胃癌の診断または同定方法に関する。本発明者らは実際に、単独でまたは好ましくは組み合わせて、胃癌患者の診断または経過観察、非常に具体的には、他のタイプの癌との鑑別に役立ち得る３つのＤＮＡメチル化バイオマーカーを同定した。さらに、それは胃癌と診断された対象に好適な治療計画を決定するかつ／または適合させるために使用することができる。本発明はまた、高メチル化された遺伝子を検出するため、診断するため、または同定するためのプライマーまたはプローブを含むキットに関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における胃癌のイン・ビトロ診断または同定方法であって、前記対象の生物学的サンプル中のＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子と、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子とのメチル化のレベルまたは量を決定することを含む、方法。
【請求項2】
前記遺伝子が参照値に比べて高メチル化されている場合、前記対象は胃癌に罹患していると診断または同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記生物学的サンプルは前記対象の血液サンプルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記メチル化は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはｑＰＣＲ、好ましくは、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって決定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記メチル化のレベルまたは量は、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号４のヌクレオチド領域において、並びに、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号５のヌクレオチド領域においてまたはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号６のヌクレオチド領域において決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子と、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子またはＫＣＮＡ３遺伝子との前記メチル化のレベルまたは量は、それぞれ配列番号７～１０と、配列番号１１～１４または配列番号１５～１６とのプライマーを使用し、かつ、それぞれ配列番号１７～１８と、配列番号１９～２０または配列番号２１とのプローブを使用することによるｄＰＣＲにより決定される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記対象の生物学的サンプル中のＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子のメチル化のレベルまたは量を同時にまたは逐次に決定することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
胃癌と診断されている対象における胃癌の進行のイン・ビトロ監視方法であって、ａ）第１の時点で、前記対象の生物学的サンプル中のＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子と、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子とのメチル化のレベルまたは量を決定すること、
ｂ）第２の時点で、前記対象の生物学的サンプル中の、工程ａ）において先に選択された前記遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、並びに
ｃ）工程ａ）において決定されたメチル化のレベルまたは量を工程ｂ）において決定されたレベルもしくは量または参照値と比較すること
を含む、方法。
【請求項9】
工程ａ）におけるサンプルが胃癌の処置の前に得られ、かつ、工程ｂ）におけるサンプルが前記対象が胃癌の処置を受けた後に得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記メチル化のレベルまたは量が、前記対象の生物学的サンプル中のＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子において同時にまたは逐次に決定される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記参照値が健康な対象において得られる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
胃癌に罹患している対象に好適な治療計画を決定するまたは適合させるための、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
胃癌に罹患している対象の臨床転帰を予測するための、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号４のヌクレオチド領域と、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号５のヌクレオチド領域またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号６のヌクレオチド領域のいずれかとを特異的に標的とするプライマーを含むキットであって、所望により、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号４のヌクレオチド領域と、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号５のヌクレオチド領域またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号６のヌクレオチド領域のいずれかとを特異的に標的とするプローブも含み、好ましくは、配列番号７～１０と、配列番号１１～１４または配列番号１５～１６のいずれかとのプライマーと、配列番号１７～２１のそれらの対応するプローブとを含む、キット。
【請求項15】
以下のための、請求項１４に記載のキットの使用：ａ）対象における胃癌の診断または同定、
ｂ）胃癌に罹患している対象における臨床転帰の予測、
ｃ）胃癌を有する対象の治療計画の決定、および／または
ｄ）胃癌と診断されている対象における胃癌の進行の監視。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の要旨
本発明は、対象における胃癌を、前記対象の生物学的サンプル中の特定の遺伝子の異常な高メチル化レベルの検出によって、診断または同定するための方法に関する。本発明者らは実際に、単独でまたは組み合わせて、胃癌患者の診断または経過観察に役立ち得る３つのＤＮＡメチル化バイオマーカーを同定した。本発明者らは、対象の血液サンプルでｄＰＣＲにより前記遺伝子のＤＮＡ高メチル化を測定することを提案する。メチル化された遺伝子は、好ましくは、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１およびＫＣＮＡ３からなる群から選択される。本発明はまた、胃癌を診断するためのキットおよび他のツールに関する。
本発明は、対象における胃癌を、前記対象の生物学的サンプル中の特定の遺伝子の異常な高メチル化レベルの検出によって、診断または同定するための方法に関する。本発明者らは実際に、単独でまたは組み合わせて、胃癌患者の診断または経過観察に役立ち得る３つのＤＮＡメチル化バイオマーカーを同定した。本発明者らは、対象の血液サンプルでｄＰＣＲにより前記遺伝子のＤＮＡ高メチル化を測定することを提案する。メチル化された遺伝子は、好ましくは、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１およびＫＣＮＡ３からなる群から選択される。本発明はまた、胃癌を診断するためのキットおよび他のツールに関する。
【背景技術】
【0002】
胃癌(stomach cancer)は、胃癌（gastric cancer）とも呼ばれ、胃の内壁から発生する癌である。初期の症状には、胸やけ、上腹部痛、悪心および食欲減退、嚥下障害が含まれ得る。後期の徴候および症状には、特に、体重減少、食欲不振、嘔吐、吐血、持続性潰瘍、嚥下困難および便潜血が含まれ得る。この癌は、胃から身体の他の部分、特に、肝臓、肺、骨、腹部の内層およびリンパ節に広がる可能性がある。胃癌のほとんどの症例は胃癌腫である。リンパ腫および間葉系腫瘍もまた胃で発生する可能性がある。ほとんどの場合、胃癌は、何年にもわたって段階的に発症する。この疾患の予後は、診断時の腫瘍の病期に関連する。疾患が進行しているほど予後は悪くなる。転移性疾患の場合、５年生存率は５％未満であり、この疾患についての早期診断の重要性を強調している。
【0003】
最も一般的な原因は、細菌ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter
pylori)による感染であり、これは症例の６０％以上を占める。特定の種類のヘリコバクター・ピロリ菌は、他の種類よりもリスクが高くなる。その他のリスク因子として、喫煙、漬物などの食事要因および肥満がある。症例の約１０％は家族内発症であり、症例の１％～３％は遺伝性びまん性胃癌などのその人の両親から受け継いだ遺伝性症候群によるものである。世界的に見て、胃癌は、癌の５番目に多い原因であり、癌による死亡の３番目に多い原因であり、症例の７％、死亡の９％を占めている。２０１２年には、新たに９５０,０００人に発生し、７２３,０００人が死亡した。
【0004】
胃癌の診断は、通常、内視鏡検査中の生検によって行われる。これに続いて、この疾病が身体の他の部分に広がっているかどうかを判定するための医用撮像が行われる。特に胃癌に関連する承認された血液由来のバイオマーカーは存在しない。この疾患の罹患率の高い二国、日本および韓国は、すでに胃内視鏡、超音波検査などにより胃癌のスクリーニングを行っている。しかしながら、これらの方法は、かなりの費用を発生させる高価な医療機器を必要とする。さらに、胃内視鏡を受けたがらない患者もいる。
【0005】
これに関連して、簡単な手段で血液サンプルに使用することができる、高感度で特異的な胃癌のバイオマーカーを同定する必要がなおある。
【0006】
候補癌バイオマーカーの同定は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用した病変組織ＤＮＡのゲノムワイドシーケンシングの導入以来、爆発的に増えた。しかしながら、そのような同定は、末梢で非侵襲的に行われる場合にのみ、癌の早期検出に有用である。ＤＮＡ配列の特定の変化であり、それゆえ、明確に認識され得る突然変異とは異なり、ＤＮＡメチル化は複数のＣｐＧ部位に存在することが多く、腫瘍組織と正常組織の間に様々な定量的差異がある。
【0007】
遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす腫瘍抑制遺伝子のプロモーターおよび最初のエキソンのメチル化は、腫瘍形成において重要な役割を果たすことが示されている。異常なＤＮＡメチル化は、発癌の初期段階で発生することが多く、従って、癌の早期検出のための魅力的な潜在的マーカーを提供する。癌スクリーニングおよび早期検出のためのバイオマーカーを開発するために、メチル化の増加（高メチル化）は、高感度で特異的なアッセイの開発のための明確な標的領域を有する陽性判定を提供し、従って、臨床試験にとって全体的な低メチル化よりも有利である（Jain, Wojdacz & Su, 2013）。
【0008】
これらの魅力的な有望さにもかかわらず、メチル化されたＤＮＡマーカー候補を有用な臨床診断マーカーに変換するには課題がある。
【0009】
いくつかの総説では、癌療法におけるＤＮＡメチル化バイオマーカーの慣用を制限する障害について議論されている（Mikeska T, 2012; Jain, Wojdacz & Su, 2013; Delpu Y et al, 2013）。
【0010】
これらの総説は、分析感度がメチル化スクリーニング技術の診断適用性の重要なパラメーターであり、単一マーカーのアプローチでは、マーカーが癌の原因と関連している極めて明確に定義された高リスク群を除いて、スクリーニングに十分な感度（＞９０％）が得られる可能性が低いため、いくつかのマーカーを組み合わせるかまたは既存のスクリーニング試験を補完することによって初めて良好な分析感度が達成できることを強調している。
【0011】
スクリーニング試験または診断試験の別の重要な要素は高い特異度である。特異度が低いと、偽陽性の結果が多数発生し、これが患者の精神的ストレスや不必要な医療行為につながる可能性があり、集団での試験の信頼性と受け入れが損なわれる。メチル化イベントの局所的な状態については、真に癌に関連する高メチル化イベントをベースラインのメチル化と区別するのに十分な定量的アッセイが必要である。ＤＮＡメチル化バイオマーカーは、多くの場合、１つの癌に特異的ではなく、大部分は腫瘍種間で保存されていることも報告されている。従って、ある特定の種類の癌のバイオマーカーとして単一のＤＮＡメチル化変化を提案することは難しいと思われるが、可能な限り初期に適当な処置で患者を処置するためにはやはり理想的なことである。この特異度の欠如を補うために、いくつかのバイオマーカーの組合せが提案されることが多いが、それでも試験の感度は低下する。
【0012】
全体として、上述の総説は、臨床使用におけるメチル化バイオマーカーの大きな可能性について原理証明はすでに得ることができるものの、この分野は、高感度と高特異度の両方を示す理想的なバイオマーカーを同定するための多くの課題に直面していることを示している。
【0013】
さらに、これらの総説のいずれにも胃癌を診断するためのメチル化バイオマーカーを強調する研究は開示されていない。これは、高感度で特異的な胃癌のメチル化バイオマーカーを同定することが極めて難しいことを示唆している。
【発明の概要】
【0014】
しかしながら、この科学的背景において、本発明者らは、以下の実験の部に開示されるように、３つの異なる特異的なメチル化バイオマーカーを、優れた感度と特異度で胃癌を診断、監視または経過観察するために単独でまたは組み合わせて使用可能であることを見出した。これらの発見は、上に引用した総説の分野の専門家によって示唆された全ての欠点と対照をなす。
【0015】
発明の詳細な説明
癌バイオマーカーの分野で最も広く研究されているエピジェネティック修飾は、シトシンのメチル化である。ヒトゲノムのＤＮＡメチル化は、大部分はＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基において５位の炭素で起こり、５－メチルシトシンを生じる。ＣｐＧジヌクレオチドはヒトゲノムではまれである（約１％）。ＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧアイランドとしても知られる、Ｇ＋Ｃ含量が５０％を超えＣｐＧ頻度比率が少なくとも０．６である、２００塩基より大きいクラスターに存在することが多く見られる。ヒト遺伝子プロモーターのおよそ６０％は、ＣｐＧアイランドに関連している。プロモーター領域内のＣｐＧアイランドは、組織分化に関与する一部を除いて、通常、正常細胞ではメチル化されていない。一般に、ＣｐＧアイランドのメチル化は、転写サイレンシングに関連している。癌では、全体的な低メチル化（ＤＮＡメチル化の全体的な減少）と局所的な高メチル化（腫瘍抑制遺伝子のプロモーターおよび最初のエキソンのメチル化など）の両方が観察されている。ＤＮＡの低メチル化は、反復エレメント、レトロトランスポゾン、イントロンおよび同様のエレメントなどの多くのゲノム配列で起こり、ゲノムの不安定性をもたらし、ウィルムス腫瘍のＩＧＦ２遺伝子（ＩＧＦ－２をコードする）の場合のように、一部の癌原遺伝子の活性化を説明し、インプリンティングの喪失につながる可能性がある（Jain, Wojdacz & Su, 2013）。
癌バイオマーカーの分野で最も広く研究されているエピジェネティック修飾は、シトシンのメチル化である。ヒトゲノムのＤＮＡメチル化は、大部分はＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基において５位の炭素で起こり、５－メチルシトシンを生じる。ＣｐＧジヌクレオチドはヒトゲノムではまれである（約１％）。ＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧアイランドとしても知られる、Ｇ＋Ｃ含量が５０％を超えＣｐＧ頻度比率が少なくとも０．６である、２００塩基より大きいクラスターに存在することが多く見られる。ヒト遺伝子プロモーターのおよそ６０％は、ＣｐＧアイランドに関連している。プロモーター領域内のＣｐＧアイランドは、組織分化に関与する一部を除いて、通常、正常細胞ではメチル化されていない。一般に、ＣｐＧアイランドのメチル化は、転写サイレンシングに関連している。癌では、全体的な低メチル化（ＤＮＡメチル化の全体的な減少）と局所的な高メチル化（腫瘍抑制遺伝子のプロモーターおよび最初のエキソンのメチル化など）の両方が観察されている。ＤＮＡの低メチル化は、反復エレメント、レトロトランスポゾン、イントロンおよび同様のエレメントなどの多くのゲノム配列で起こり、ゲノムの不安定性をもたらし、ウィルムス腫瘍のＩＧＦ２遺伝子（ＩＧＦ－２をコードする）の場合のように、一部の癌原遺伝子の活性化を説明し、インプリンティングの喪失につながる可能性がある（Jain, Wojdacz & Su, 2013）。
【0016】
本発明者の知る限り、胃癌を特異的に診断するためのＤＮＡメチル化バイオマーカーを明らかにした研究はこれまでになかった。
【0017】
しかし、本発明者らは、３つの特定の遺伝子（すなわち、ＭＳＣ－ＡＳ１、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１およびＫＣＮＡ３）のプロモーターまたはイントロン内の特定の領域が、特に胃癌腫瘍サンプルでは異常に高メチル化されることを見出した。興味深いことに、これらの３つの遺伝子のうちの２つ（すなわち、ＭＳＣ－ＡＳ１およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１）は、癌の診断または進行との関連は見出されていない。第３の遺伝子（ＫＣＮＡ３）は、胃癌に関連していなかった。
【0018】
本発明の「ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子」は、実際には、「ＭＳＣアンチセンスＲＮＡ１」と呼ばれる非コードＲＮＡを示す。そのＤＮＡ配列は、８番染色体（７１ ７１８４３１２３～７２ ０５６３１２）上、より正確には８ｑ１９．３～８ｑ２１．１１に位置する。これには５つのエキソンが含まれる。そのＤＮＡ配列は、ＮＣ＿０００００８．１１と呼ばれる。これは、それぞれＮＲ＿０３３６５１．１およびＮＲ＿０３３６５２．１のインデックスが付けられた２つのＲＮＡ変異体に転写される。本発明者らは、健常なサンプルとの対比によって、７２７５５４８６と７２７５６１８７との間（配列番号４）、より好ましくは７２７５５７８３と７２７５６１８７との間（配列番号１）に含まれるＤＮＡ領域が、胃腫瘍サンプルでは特異的に有意に高メチル化されていることを確認した。従って、本発明者らは、対象における胃癌を診断または同定するための高感度で信頼性の高い非侵襲的方法で、またはそのような目的に有用なキットでこの遺伝子を使用することを提案する。
【0019】
本発明の「ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子」は、「ＺＮＦ７９０アンチセンスＲＮＡ１」と呼ばれる非コードＲＮＡを示す。これはまた、「ＣＴＤ－２１６２Ｋ１８．５」とも呼ばれている。このＤＮＡ配列は、１９番染色体（３６ ７９７５５０～３６ ８２８１１１）上、より正確には１９ｑ１３．１２上に位置する。これには６つのエキソンが含まれる。そのＤＮＡ配列は、ＮＣ＿０００００１９．１０と呼ばれる。これは、それぞれＮＲ＿０４００２７．１およびＮＲ＿０４００２８．１のインデックスが付けられた２つのＲＮＡ変異体に転写される。そのプロモーター領域の高メチル化については報告されたことはない。本発明者らは、健常なサンプルとの対比によって、３７２８８１７０と３７２８８８１１との間（配列番号５）、より好ましくは３７２８８１７０と３７２８８４５０との間（配列番号２）に含まれるＤＮＡ領域が、胃腫瘍サンプルでは特異的に有意に高メチル化されていることを確認した。従って、本発明者らは、対象における胃癌を診断または同定するための高感度で信頼性の高い非侵襲的方法で、またはそのような目的に有用なキットでこの遺伝子を使用することを提案する。
【0020】
本発明の「ＫＣＮＡ３遺伝子」は、「ＨＰＣＮ３」、「ＨＧＫ５」、「ＨＬＫ３」、「ＨＵＫＩＩＩ」、「ＫＶ１．３」、「ＭＫ３」、「ＰＣＮ３」としても知られるカリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードする遺伝子を示す。これは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球で発現され、自己免疫疾患、肥満、およびアルツハイマー病に関与する。そのＤＮＡ配列は、１番染色体（１１０ ６５３５６０～１１０ ６７５０３３）上、より正確には１ｐ１３．３上に位置する。これには４つのエキソンが含まれる。そのＤＮＡ配列は、ＮＣ＿０００００１．１１と呼ばれる。これは、ＮＭ＿００２２３２．４のインデックスが付けられたｍＲＮＡに転写され、ＮＰ＿００２２２３．３のインデックスが付けられたタンパク質に転写される。本発明者らは、健常なサンプルまたは前記患者の参照サンプルとの対比によって、この遺伝子のプロモーターおよび最初のエキソンを部分的に含む、１１１２１７４０６と１１１２１８０１５との間（配列番号６）、より好ましくは１１１２１７４０６と１１１２１７８１５との間（配列番号３）に含まれるＤＮＡ領域が、胃腫瘍サンプルでは特異的に有意に高メチル化されていることを確認した。従って、本発明者らは、対象における胃癌を診断または同定するためまたは胃癌の経過観察を行うための高感度で信頼性の高い非侵襲的方法でこの遺伝子を使用することを提案する。
【0021】
本発明者は、これらの遺伝子のいずれかのプロモーターまたは他の領域の高メチル化が、初期段階でさえ、高感度で特異的な胃癌のバイオマーカーとして、それに罹患している患者において使用できることを示した。ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子を、以下、「本発明のバイオマーカー」と呼ぶ。これらは、個別に、または２つずつ組み合わせて、または３つ全てを一緒に、使用することができる。
【0022】
本発明の方法
従って、第１の側面において、本発明は、対象における胃癌のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）診断または同定方法であって、前記対象の生物学的サンプル中の、上記のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは２つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定することを含む方法に関する。特に好ましい態様では、前記方法は、上記の３つの遺伝子ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１、およびＫＣＮＡ３のメチル化のレベルまたは量を決定することを含む。
従って、第１の側面において、本発明は、対象における胃癌のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）診断または同定方法であって、前記対象の生物学的サンプル中の、上記のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくは２つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定することを含む方法に関する。特に好ましい態様では、前記方法は、上記の３つの遺伝子ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１、およびＫＣＮＡ３のメチル化のレベルまたは量を決定することを含む。
【0023】
好ましい態様では、前記方法は、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号４のヌクレオチド領域において、またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号５のヌクレオチド領域において、またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号６のヌクレオチド領域においてメチル化のレベルまたは量を決定することを含む。
【0024】
より好ましい態様では、前記方法は、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１のヌクレオチド領域において、またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２のヌクレオチド領域において、またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３のヌクレオチド領域においてメチル化のレベルまたは量を決定することを含む。
【0025】
より好ましい態様では、前記方法は、前記対象の生物学的サンプル中のＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子のメチル化のレベルまたは量を同時にまたは逐次に決定することを含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。好ましくは、それは、健常である（胃癌の症状がない）可能性がある、または癌、好ましくは胃癌を発症すると考えられるかもしくはそれに罹患している疑いがあるヒト患者を指す。前記対象は、例えば、以下の症状：胸やけ、上腹部痛、悪心、食欲減退、体重減少、嘔吐、嚥下困難および便潜血の少なくとも１つを示す。前記対象はまた、過去に胃癌に罹患した可能性があり、治療を受けたことがあり、潜在的疾患再発について監視されている。前記対象はまた、健常に見えるかもしれないが、例えば、遺伝的家族歴、例えば、家族の一員が同じ疾患に罹患しているもしくは罹患していたまたはリンチ症候群もしくは生殖細胞ＣＤＨ１突然変異などの遺伝的素因を有するなど胃癌を発症する素因がある。
【0027】
本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」という表現は、固形組織（例えば、消化管生検など）または体液、身体排出物および排泄物（例えば、痰、誘発喀痰、血液、血清、血漿、尿、糞便など）を指す。好ましくは、前記生物学的サンプルは、体液サンプル、最も好ましくは、血液または血漿サンプルである。
【0028】
本発明の方法において、前記遺伝子が参照サンプルに比べて高メチル化されている場合、前記対象は胃癌に罹患していると診断または同定される。言い換えれば、メチル化のレベルまたは量が高いことは、胃癌、浸潤性高悪性度胃癌または胃癌再発の指標と見なされる。別の側面において、前記メチル化は、前記対象の以前のサンプルのメチル化と比較することができ、次に、前記対象は、胃癌に罹患しているまたは罹患していないと診断される。
【0029】
ＤＮＡメチル化を検出するために複数の技術が提案されている。Delpu et al (2013)の総説には、それらのいくつかが開示されている：
【0030】
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ－ＰＣＲ）は、目的のメチル化ＤＮＡ領域および非メチル化ＤＮＡ領域を増幅するように２セットのＰＣＲプライマーが特別に設計された方法である。ＰＣＲ産物の検出は、もともとはゲル電気泳動によって行われる。この技術は、蛍光分子の取り込みによってＰＣＲ増幅をリアルタイムで監視する定量的ＭＳ－ＰＣＲ（ｑＭＳ－ＰＣＲ）に置き換えられた。この改善により、多数の特定の領域のＤＮＡメチル化レベルの正確な定量が可能になり、長い電気泳動工程が回避される。定量的マルチプレックスＭＳ－ＰＣＲ（ＱＭ－ＭＳ－ＰＣＲ）およびワンステップＭＳ－ＰＣＲ（ＯＳ－ＭＳ－ＰＣＲ）も、異なる起源の組織の特定の遺伝子を共増幅するためまたはＤＮＡ抽出処理を行わずに特定の領域のＤＮＡメチル化レベルを決定するために利用可能である。ｑＭＳ－ＰＣＲ技術は、簡単、迅速、安価、高感度で標準化が容易である。これらは、現在、臨床使用における癌診断に最も慣用される技術の１つである。メチル化感受性高分解能融解分析(methylation-sensitive high-resolution melting)（ＭＳ－ＨＲＭ）は、重亜硫酸塩処理を受けたＤＮＡのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は、目的のＤＮＡ領域のメチル化状態によって異なるという事実に基づく。メチル化レベルは、融解解離曲線を、既知のメチル化ＣｐＧ部位を含む同じ領域の標準的なＰＣＲ産物と比較することによって決定される。ＣＯＢＲＡ、すなわち、複合重亜硫酸塩制限分析(combined bisulfite restriction analysis)は、新しい制限酵素部位を創出するまたはＭＳＲＥのコンセンサス部位を維持する重亜硫酸塩変換の能力を使用する。増幅後、ＰＣＲ産物は適当なＭＳＲＥで消化される。消化されたＰＣＲ産物の割合が未消化のＰＣＲ産物と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および画像定量化ソフトウェアによって比較される。この技術は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから得られたＤＮＡに確実に適用される。さらに、このアプローチにより多数の生物学的サンプルのＤＮＡメチル化の評価が可能になる。より最近では、ハイスループットアプローチが開発された。例えば、Ｍｅｔｈｙｌ Ｌｉｇｈｔは、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、ＵＳＡ）を重亜硫酸塩処理と組み合わせて使用するハイスループット定量的メチル化アッセイである。また、重亜硫酸塩処理と組み合わせられるパイロシーケンシングは、ヌクレオチドが成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれるたびに表される酵素反応の結果として光が放出される定量的ＤＮＡシーケンシング法である。これらの定量技術は、異種ＤＮＡ調製物中の少量のメチル化ＤＮＡを検出する。標準化が容易で、迅速かつ安価なこれらの技術は、臨床目的で使用されることが多くなっている。
【0031】
より最近では、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術により、ＤＮＡメチル化プロファイルの分解能レベルが著しく向上した。ＮＧＳはまた、免疫沈降したＤＮＡ断片にも適合させることができる（メチルＤＮＡ免疫沈降シーケンシングはＭｅＤＩＰ ｓｅｑとも呼ばれる）。最終的に、ＮＧＳは、重亜硫酸塩変換後のゲノム全体のシーケンシングを可能にする。これらのＮＧＳアプローチに加えて、ハイスループット一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型決定システムは、重亜硫酸塩変換したゲノムＤＮＡからのＤＮＡメチル化分析に好適である。さらに、当業者に周知の他の方法、例えば、未修飾ＤＮＡを直接分析する方法（例えば、ナノポアシーケンシング）、特定の制限酵素を使用する方法、メチル化配列濃縮法（例えば、ＥｐｉＭａｒｋメチル化濃縮キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ）、免疫沈降法が使用可能である。
【0032】
これら全ての方法（ｑＭＳ－ＰＣＲ、ＭＳ－ＨＲＭ、ＣＯＢＲＡ、ＭＳＲＥ、Ｍｅｔｈｙｌ Ｌｉｇｈｔ、ＮＧＳ、ＳＮＰ遺伝子型決定法、パイロシーケンシング、マイクロアレイ、ＩＣＥ－ｃｏｌｄ ＰＣＲ、ナノポアなど）が、本発明のマーカーのメチル化を決定するために使用できる。
【0033】
本発明の方法は、使用される検出技術に応じて、ＣｐＧ部位において「メチル化のレベル」、「メチル化レベル」または「メチル化の量」を検出することを必要とする。本発明によれば、用語「メチル化のレベル」または「メチル化の量」は、定量的尺度の決定を指す。従って、用語「メチル化のレベル」または「メチル化の量」は互換的に使用できる。
【0034】
本発明によれば、胃癌の診断を実施するためまたは胃癌の進化を追跡するための「高メチル化」を検出するために使用される「参照サンプル」は、胃癌に罹患していない対象に由来する生物学的サンプルまたは胃癌に罹患していると以前に診断された対象に由来する生物学的サンプル（例えば、正常もしくは健常な細胞もしくは組織もしくは体液、または正常もしくは健常な細胞もしくは組織もしくは体液からの情報を使用して作成されたデータセット）である。例えば、前記参照サンプルは、全血から抽出されたゲノムＤＮＡ、または健常な対象から抽出された循環ＤＮＡ（この場合、前記サンプルは、患者について試験されたもの（例えば、血漿）と同じである）であり得る。本発明の特定の態様では、参照サンプルは、使用される生物学的サンプルの種類に応じて異なり得る。例えば、組織サンプルは、腫瘍の周囲組織（正常な隣接組織）において非腫瘍性と同定されたサンプルまたは同じ器官の健常な部分（隣接していない）由来の組織のいずれかであり得る。
【0035】
別の例によれば、診断またはスクリーニングのための参照血液サンプルは、癌（胃癌を含む）に罹患していない対象に由来するサンプル（例えば、正常もしくは健常な細胞もしくは組織もしくは体液）または胃癌に罹患していると以前に診断された対象に由来するサンプル（例えば、正常もしくは健常な細胞もしくは組織、または正常もしくは健常な細胞もしくは組織もしくは体液からの情報を使用して作成されたデータセット）であり得る。さらに、癌患者の経過観察のための血液サンプルは、癌（胃癌を含む）に罹患していない対象に由来する生物学的サンプル、例えば、正常もしくは健常な細胞もしくは組織もしくは体液（その陽性を強調するため）または参照時間（例えば、病気の診断もしくは初期の処置サイクル）に採取された同じ対象および同じ体液に由来する生物学的サンプル（その潜在的進化を強調するため）であり得る。
【0036】
好ましい態様では、本発明による参照値は、健常な対象に由来するサンプルにおいてまたは処置前にまたは処置の初期に実施される胃癌に罹患している対象に由来するサンプルにおいて得られる。
【0037】
「高メチル化」は、例えば、本発明のバイオマーカーの１つのメチル化値（量）または状態（レベル）が、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルで測定した対応するバイオマーカーのメチル化値（量）または状態（レベル）に比べて有意に高い場合に決定される。対象の生物学的サンプルにおける本発明のバイオマーカーの少なくとも１つの、参照サンプルにおける正常なメチル化量またはレベルに比べて有意に高いメチル化量またはレベルは、試験した対象が胃癌を有するか、胃癌を有するリスクが高いかまたは処置に応答しないことを示している。
【0038】
「有意に高いメチル化量またはレベル」とは、前記の量またはレベルを評価するために使用されるアッセイの平均と標準誤差の合計よりも大きいメチル化量またはレベルを指す。
【0039】
好ましい態様では、前記メチル化量は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってまたはｑＰＣＲによって、好ましくはｄＰＣＲによって決定される。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「ｄＰＣＲ」は、「デジタルＰＣＲ」を表す。これは、サンプルが多数の区画に分けられ、各区画で個別にＰＣＲ反応が実施される従来のＰＣＲ法の改良法である。この分割により、核酸量のより信頼性の高い収集と高感度の測定が可能になる。この方法は、遺伝子配列の変化、例えば、コピー数変異体および点突然変異を研究するのに有用であることが実証されており、次世代シーケンシングのためのサンプルのクローン増幅に慣用されている。より正確には、ＰＣＲ溶液は、水油エマルジョン技術によってより小さな反応に分割され、その後、個別にＰＣＲが実行される。例えば、ＰＣＲサンプルは、ピコリットル～ナノリットルサイズのサンプルに分割し、油滴に封入することができる。油滴は、各ウェルに真空を適用する液滴生成器を使用して作製される。使用するシステムに応じて、５００万～１０００万ピコリットルの液滴（２５～５０μＬサンプル）から２０,０００ナノリットルの油滴（２０μＬサンプル）を作出することができる。他の種類のコンパートメント（微細加工されたものなど）並びに単一チューブ限界希釈も使用できる。
【0041】
より好ましい態様では、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号７～１０のプライマーを使用することによる、例えば、配列番号７～８または配列番号９～１０のプライマー対を使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0042】
より好ましい態様では、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号１１～１４のプライマーを使用することによる、例えば、配列番号１１～１２または配列番号１３～１４のプライマー対を使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0043】
より好ましい態様では、ＫＣＮＡ３遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号１５～１６のプライマー対を使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0044】
１つの例示的態様では、本方法は、ＰＣＲ中に蓄積するＰＣＲ産物の検出の特異度および／または感度を向上させるために蛍光性プローブを使用する遺伝子発現を検出するための方法（例えば、ｄＰＣＲ）を使用できる。このようなアッセイは、例えば、マッチしたプローブとミスマッチのプローブのＴｍの差を増大する副溝結合（ＭＧＢ）部分を含むプローブを使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイである。加えて、これらのＭＧＢプローブには、反応に複数の色素を使用する場合のスペクトル分解能を高める非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）が含まれる場合がある。
【0045】
この好ましい態様で使用できるプローブは、下記表２および配列番号１７～２１に表される。
【0046】
より好ましい態様では、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号７～１０のプライマーおよび配列番号１７～１８のプローブを使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0047】
より好ましい態様では、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号１１～１４のプライマーおよび配列番号１９～２０のプローブを使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0048】
より好ましい態様では、ＫＣＮＡ３遺伝子のメチル化のレベルまたは量は、配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用することによるｄｄＰＣＲによって決定される。
【0049】
本発明によるバイオマーカーの好ましい組合せは以下である：
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子、
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子、
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子。
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子、
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子、
・ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子。
【0050】
本発明の方法はまた、前記遺伝子のメチル化のレベルまたは量を、上記で定義されたような参照サンプルにおいて決定された同じ遺伝子のメチル化レベルまたは量と比較する工程も含む。
【0051】
ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子が、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されている場合、試験した対象は胃癌を有するか、または胃癌を有するもしくはそれを発症するリスクが高い。
【0052】
ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子が、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されている場合、試験した対象は胃癌を有するか、または胃癌を有するもしくはそれを発症するリスクが高い。
【0053】
ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子が、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されている場合、試験した対象は胃癌を有するか、または胃癌を有するもしくはそれを発症するリスクが高い。
【0054】
ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子およびＫＣＮＡ３遺伝子が、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されている場合、試験した対象は胃癌を有するか、または胃癌を有するもしくはそれを発症するリスクが高い。
【0055】
別の側面において、本発明のバイオマーカーは、胃癌患者の転帰を予測するために使用できる。また、これらは、患者の生存を最大限に延ばすための適当な処置の選択において熟練の腫瘍学者を支援するために使用できる。適当な処置は、例えば、化学療法処置、免疫療法処置、放射線療法処置および／または手術である。好ましくは、本発明の用法指示は、処置開始前に作成される。
【0056】
具体的には、前記患者は、化学療法薬での処置を受けているかまたは受ける予定である。
【0057】
前記「化学療法薬」は、一般には、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、白金系成分、特定のキナーゼ阻害剤、ホルモン、サイトカイン、抗血管新生剤、抗体、免疫療法剤または血管破壊剤から選択される薬剤である。
【0058】
本発明はまた、胃癌に罹患している対象の臨床転帰を予測するための方法であって、
ａ）前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定し、それを参照値と比較すること、
ｂ）工程ａ）の比較に基づいて臨床転帰を予測すること
を含む方法に関する。
ａ）前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定し、それを参照値と比較すること、
ｂ）工程ａ）の比較に基づいて臨床転帰を予測すること
を含む方法に関する。
【0059】
ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＫＣＮＡ３遺伝子および／もしくはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子またはこれらの遺伝子の組合せが、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されている場合、試験した対象は、不良の臨床転帰（短い生存、転移など）を示す可能性がある。
【0060】
逆に、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＫＣＮＡ３遺伝子および／もしくはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子またはこれらの遺伝子の組合せが、試験した対象の生物学的サンプルにおいて、参照サンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に高メチル化されていないか、あるいは同等以下のメチル化である場合、試験した対象は、良好な臨床転帰を示す可能性がある。
【0061】
本発明はまた、胃癌に罹患している対象に治療計画を適合させる方法であって、
ａ）前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、および
ｂ）手術後の前記対象または処置が施された後の前記対象の生物学的サンプル中の、工程ａ）において選択された同じバイオマーカーのメチル化のレベルまたは量と、それを比較すること、
ｃ）工程ａ）単独または工程ａ）と工程ｂ）との比較に基づいて前記対象の治療計画を適合させる／修正すること
を含む方法に関する。
ａ）前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、および
ｂ）手術後の前記対象または処置が施された後の前記対象の生物学的サンプル中の、工程ａ）において選択された同じバイオマーカーのメチル化のレベルまたは量と、それを比較すること、
ｃ）工程ａ）単独または工程ａ）と工程ｂ）との比較に基づいて前記対象の治療計画を適合させる／修正すること
を含む方法に関する。
【0062】
特に、前記手術または治療計画は、前記バイオマーカーのレベルまたは量が、前記処置の前に決定された前記バイオマーカーのレベルまたは量に有意に劣るか、あるいは同等である場合に、有効であると認められる。
【0063】
これに対し、前記バイオマーカーのレベルまたは量が、処置下にあって、前記処置の前に決定された（または処置の初期に決定された）前記バイオマーカーのレベルまたは量に比べて増加した場合には、前記治療計画は変更すべきである。
【0064】
治療戦略のこの側面は、生活の質を維持し、効果のない処置の不要な毒性効果を回避しながら生存を改善するために、個別化医療の状況において重要な目標である。
【0065】
本発明はまた、胃癌と診断されている対象における胃癌の進行の監視方法であって、
ａ）第１の時点で、前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、
ｂ）第２の時点で、前記対象の生物学的サンプル中の工程ａ）において先に選択された前記遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、並びに
ｃ）工程ａ）において決定されたメチル化のレベルまたは量を工程ｂ）において決定されたレベルまたは量と比較すること
を含む方法に関する。
ａ）第１の時点で、前記対象の生物学的サンプル中のＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、およびＫＣＮＡ３遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、
ｂ）第２の時点で、前記対象の生物学的サンプル中の工程ａ）において先に選択された前記遺伝子のメチル化のレベルまたは量を決定すること、並びに
ｃ）工程ａ）において決定されたメチル化のレベルまたは量を工程ｂ）において決定されたレベルまたは量と比較すること
を含む方法に関する。
【0066】
工程ｂ）において決定されたメチル化のレベルまたは量が、工程ａ）において決定されたレベルまたは量よりも有意に高い場合、胃癌の悪性度が増悪していると結論付けることができる。言い換えれば、試験した対象が、すでに治療を受けている可能性があるにもかかわらず、増悪する疾患を有する。
【0067】
対象がすでに治療を受けている場合、第１のサンプルは、胃癌の処置の前に対象から採取し、第２のサンプルは、胃癌の処置を受けた後に対象から採取したものでよい。従って、前記第１の時点は、好ましくは、前記対象の処置の前であり、前記第２の時点は、前記対象が胃癌の処置を受けた後である。
【0068】
この場合、本発明の方法は、前記処置の有効性を評価するために使用できる。
【0069】
処置に対する応答は、より好ましくは、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準（Mandard et al, 1994）に従って定義される。完全奏功（ＣＲ）は、全ての標的病変の消失と定義される。どの病的リンパ節（標的または非標的にかかわらず）も短軸が１０ｍｍ未満に縮小していなければならない。部分奏功（ＰＲ）は、ベースライン径和を基準として、標的病変の径の和の少なくとも３０％の減少と定義される。進行（ＰＤ）は、試験における最小和を基準として、標的病変の径の和の少なくとも２０％の増加と定義される（試験において最小であればベースライン和を含む）。２０％の相対的な増加に加えて、その和はまた、少なくとも５ｍｍの絶対的な増加も示さなければならない（注：１以上の新たな病変の出現も進行と見なされる）。安定（ＳＤ）は、試験中の最小径和を基準として、ＰＲに当てはまめるには十分な縮小でなく、ＰＤに当てはめるには十分な増加でもないことと定義される。評価の時間は、多くの場合、疾患によって異なる（胃癌の場合、通常、６週間から３か月の間に含まれる）。
【0070】
本発明に関して、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＫＣＮＡ３遺伝子および／もしくはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子またはこれらの遺伝子の組合せのメチル化が、処置が施された後に取得された生物学的サンプルにおいて、処置が施される前に取得されたサンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に減少している場合、試験した対象は、試験した処置に対して効率的に応答する可能性がある（従って、上記のＲＥＣＩＳＴ基準「完全奏功」に定義される「奏効者」である）。
【0071】
逆に、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子、ＫＣＮＡ３遺伝子および／もしくはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子またはこれらの遺伝子の組合せのメチル化が、処置が施された後に取得された生物学的サンプルにおいて、処置が施される前に取得されたサンプルにおける同じバイオマーカーと比べて有意に増加している場合、試験した対象は、試験した処置に対して効率的に応答しない可能性がある（従って、「不奏効者」である）。
【0072】
本明細書で使用される場合、「不奏効者」は、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準に従って定義されるような進行性疾患または安定性疾患を有する患者と見なされる。
【0073】
本明細書で使用される場合、「処置」は、手術、化学療法、放射線療法および標的療法のいくつかの組み合わせを含み得る。特に、処置を決定する前に、学際的な会議を計画する必要がある。処置前の評価には、一般状態、栄養評価、心機能（心毒性の化学療法が計画される場合）、肺機能（開胸による手術が想定される場合）および腎機能に関する身体検査を含める必要がある。処置は、腫瘍の病期によって異なる。例えば、限局性腫瘍の場合、処置は、周術期化学療法または術後化学放射線療法と組み合わせた手術に基づく。転移性疾患では、処置は、フルオロピリミジン（カペシタビンまたは５－フルオロウラシル）および白金塩（シスプラチンまたはオキサリプラチン）を組み合わせた緩和的化学療法に基づく。ＨＥＲ２受容体を遮断するモノクローナル抗体であるトラスツズマブは、免疫組織化学またはＦＩＳＨによって決定されたＨＥＲ２陽性腫瘍を有する患者に対しては、緩和的化学療法と組み合わせて使用する必要がある。
【0074】
本発明の全ての方法において、本発明のバイオマーカー、他の遺伝子とのそれらの組合せ、試験した対象、生物学的サンプル、および他の全てのパラメーターおよび定義は、上記で定義されたものである。
【0075】
本発明のキット
本発明さらに、胃癌を診断するために本発明の高メチル化バイオマーカーを決定するための診断キットおよびツールを提供する。
本発明さらに、胃癌を診断するために本発明の高メチル化バイオマーカーを決定するための診断キットおよびツールを提供する。
【0076】
第１に、本発明は、上記で強調した高メチル化領域を検出するのに有用な核酸に関する。より詳しくは、本発明は、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６の配列の少なくとも１０、１２、１５、２０、３０、４０または５０の連続するヌクレオチド（例えば、１０～３０ヌクレオチドまたは１０～２５ヌクレオチド）の配列を有する単離された核酸に関する。
【0077】
本発明の範囲内において、「核酸」とは、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを意味する。
【0078】
これらの核酸は、優先的には、プライマーまたはプローブである。
【0079】
別の側面において、本発明は、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域において、またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域において、またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域においてメチル化のレベルまたは量を決定するための前記核酸、好ましくはプライマーを含むキットに関する。
【0080】
好ましい態様では、本発明は、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域において、またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域において、またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域においてメチル化のレベルまたは量を決定するための前記核酸、好ましくはプライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。
【0081】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、標的ゲノム領域の５’領域または３’領域（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）に特異的にハイブリダイズまたはアニーリングすることができる単離された核酸分子を示す。一般に、それらは約１０～３０ヌクレオチド長であり、約５０～２００ヌクレオチド長を含む領域の両端でアニーリングする。適当な条件下で適当な試薬を用いて、そのようなプライマーは、それらのプライマーに隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。それらは対で使用する必要があるため、「プライマー対」または「プライマーセット」と呼ばれることが多い（配列番号７～８；配列番号９～１０、配列番号１１～１２；配列番号１３～１４；および配列番号１５～１６の対を参照）。
【0082】
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」は、（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６の）目的のゲノム領域と特異的にハイブリダイズすることが可能な分子を示す。これらは、生物学的サンプル中の前記ゲノム領域の存在を強調するのに有用である。これらのプローブは、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋核酸またはロックド核酸（ＢＮＡまたはＬＮＡ）、およびモルホリノ核酸を含み得る。非天然ヌクレオチドにはまた、メチルホスホネート型ＤＮＡまたはＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡまたはＲＮＡ、ホスホルアミデート型ＤＮＡまたはＲＮＡ、および２’－Ｏ－メチル型ＤＮＡまたはＲＮＡなどの化学的に修飾された核酸または核酸類似体も含まれる。
【0083】
好ましい態様では、本発明のプローブは、重亜硫酸塩処理された配列番号１～配列番号６またはそれらの断片と相補的である少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。より好ましい態様では、本発明によるプローブとして使用できる分子は、合計最小サイズ１５ヌクレオチドを有する。さらにより好ましい態様では、これらの分子は、１５～３０ヌクレオチド（合計）を含む。
【0084】
ある特定の用途では、本発明のプローブおよびプライマーを検出可能な標識で直接的または間接的に標識してもよい。前記標識は、実施される実験に応じて、任意の種類のものであり得る。前記標識は、放射性同位体（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉなど）、またはリガンド（ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンなど）、ジオキシゲニン、ハプテン、着色剤および発光剤（放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤またはリン光剤など）から選択される非放射性物質であり得る。好ましくは、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ＶＩＣ、ＨＥＸおよびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を使用する。非標識ポリヌクレオチド配列はまた、直接、プローブまたはプライマーとして、例えば、ＰＣＲに基づくプロセス（例えば、定量的ＰＣＲ）で使用することもできる。
【0085】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、定義された分子がその標的ゲノム領域以外のゲノム領域とハイブリダイズしない場合に見られる。好ましくは、それは、高ストリンジェンシー条件で、すなわち、温度条件およびイオン強度条件が、２つの相補的ＤＮＡ断片間のハイブリダイゼーションを可能にするように選択される場合に、その標的領域とハイブリダイズする。例として、高ストリンジェンシー条件は次の通りであり得る。ＤＮＡ－ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションは、２段階で行われる：（１）５＊ＳＳＣ（１＊ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％のホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０＊デンハルト、５％のデキストラン硫酸および１％のサケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、サイズが１００ヌクレオチドより大きなプローブの場合は４２℃）で２０時間の実際のハイブリダイゼーション、続いて、２０℃、２＊ＳＳＣ＋２％ＳＤＳで２０分の洗浄２回および２０℃、０．１＊ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２０分の洗浄１回。最終洗浄は、サイズが１００ヌクレオチドより大きなプローブの場合、６０℃、０．１＊ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで３０分間行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドについて上記した高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より大きなまたはより小さなサイズのオリゴヌクレオチドの場合には当業者により調整される。
【0086】
本明細書で使用される場合、用語「キット」とは、材料を送達するための任意のシステムを指す。本発明に関して、これは、反応試薬（例えば、適当な容器内のオリゴヌクレオチド、酵素など）および／または補助材料（例えば、バッファー、アッセイを実施するための書面での指示など）のある場所から別の場所への貯蔵、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助材料を含む１以上のエンクロージャー（例えば、箱）を含む。本キットはまた、１以上の試薬、バッファー、ハイブリダイゼーション媒体、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固相支持体、データベース、分配順序を計算するためのコンピュータプログラムおよび／または本方法の実施を容易にするための使い捨て実験器具（マルチウェルプレートなど）も含み得る。本キットに含めることができる酵素には、ヌクレオチドポリメラーゼなどが含まれる。固相支持体には、ビーズなどを含めることができ、分子量マーカーには、結合可能なマーカー、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンなどを含めることができる。
【0087】
本発明のキットは、より好ましくは、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域を特異的に標的とするプライマーを含む。
【0088】
好ましい態様では、本発明のキットは、より好ましくは、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域を特異的に標的とするプライマーおよびプローブを含む。
【0089】
前記キットは、好ましくは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３それぞれまたは配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６それぞれにおいてメチル化のレベルまたは量を決定するための配列番号７～１０、配列番号１１～１４または配列番号１５～１６のプライマーおよび、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３それぞれまたは配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６それぞれにおいてメチル化のレベルまたは量を決定するための配列番号１７～１８、配列番号１９～２０または配列番号２１のプローブを含む。より好ましくは、前記キットは、配列番号１もしくは配列番号４においてメチル化のレベルもしくは量を決定するための配列番号７～８もしくは配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１７～１８のプローブ、配列番号２もしくは配列番号５においてメチル化のレベルもしくは量を決定するための配列番号１１～１２もしくは配列番号１３～１４のプライマー対および配列番号１９～２０のプローブ、または配列番号３もしくは配列番号６においてメチル化のレベルもしくは量を決定するための配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを含む。
【0090】
本発明のキットは、より好ましくは、以下の領域でメチル化のレベルまたは量を決定するためのプライマーおよびプローブを含む：
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域；または
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域；または
・ＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域；または
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域。
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域；または
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域；または
・ＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域；または
・ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域およびＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域およびＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域。
【0091】
ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１または配列番号４のヌクレオチド領域の高メチル化を決定するために本発明のキットで使用できる例示的プライマーは、配列番号７～１０で強調している。さらに使用できる２つの例示的プローブを表２および配列番号１７～１８に示している。
【0092】
ＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２または配列番号５のヌクレオチド領域の高メチル化を決定するために本発明のキットで使用できる例示的プライマーは、配列番号１１～１４で強調している。さらに使用できる２つの例示的プローブを表２および配列番号１９～２０に示している。
【0093】
ＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３または配列番号６のヌクレオチド領域の高メチル化を決定するために本発明のキットで使用できる例示的プライマーは、配列番号１５～１６で強調している。さらに使用できる１つの例示的プローブを表２および配列番号２１に示している。
【0094】
これらの例示的プライマーおよびプローブを下記表１および２にまとめる。
【0095】
【表1】
【0096】
【表2】
【0097】
本発明はまた、ＭＳＣ－ＡＳ１遺伝子の配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド領域またはＺＮＦ７９０－ＡＳ１遺伝子の配列番号２もしくは配列番号５のヌクレオチド領域またはＫＣＮＡ３遺伝子の配列番号３もしくは配列番号６のヌクレオチド領域を特異的に標的とするヌクレオチドを保持するマイクロアレイに関する。好ましい態様では、前記マイクロアレイは、配列番号７～２１の任意のプライマーおよび／またはプローブを含む。
【0098】
本発明によれば、「核マイクロアレイ」は、マイクロチップ、スライドガラスまたはミクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に結合された種々の核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカもしくはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成されてよい。プローブは、ｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」）などの核酸であり得、オリゴヌクレオチドは、約１０～約４０塩基対以下の長さであり得る。一般に、上述の例示的プライマーおよびプローブは、前記基材に結合させることができる。
【0099】
好ましい態様では、本発明の核酸マイクロアレイは、配列番号１～６のメチル化領域のうち１つ、２つ、または３つと特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを保持するオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。より好ましい態様では、本発明の核酸マイクロアレイは、配列番号１もしくは配列番号４でメチル化のレベルもしくは量を決定するためのプライマー配列番号７～１０の少なくとも１つの、配列番号２もしくは配列番号５でメチル化のレベルもしくは量を決定するための配列番号１１～１４のプライマー、または配列番号３もしくは配列番号６でメチル化のレベルもしくは量を決定するための配列番号１５～１６のプライマーを含む。
【0100】
より好ましい態様では、本発明の核酸マイクロアレイはまた、追加の遺伝子および所望により、１以上のハウスキーピング遺伝子に特異的な核酸も保持するが、好ましくは、最大５００、４００、３００、２００、好ましくは、１００、９０、８０、７０、より好ましくは、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、またはそれ以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２または１）の異なる核酸からなる。
【0101】
本発明のバイオマーカーがメチル化されているかどうかを決定するために、試験サンプルを標識し、ハイブリダイゼーション条件で本発明の核酸マイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合されたプローブ配列と相補的である標的核酸との間での複合体形成に至らせる。次に、核酸マイクロアレイ上のハイブリダイズされた標識複合体の存在が決定される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
【0102】
配列番号１～６の任意の遺伝子に特異的な好適なマイクロアレイオリゴヌクレオチドは、各遺伝子のゲノム配列に基づいて、当技術分野で公知のマイクロアレイオリゴヌクレオチド設計の任意の方法を使用して設計することができる。特に、マイクロアレイオリゴヌクレオチドの設計のために開発された利用可能なソフトウエア、例えば、OligoArrayソフトウエア（http://berry.engin.umich.edu/oligoarray/で利用可能）、GoArraysソフトウエア（http://www.isima.fr/bioinfo/goarrays/で利用可能）、Array Designerソフトウエア（http://www.premierbiosoft.com/dnamicroarray/index.htmlで利用可能）、Primer3ソフトウエア（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3_code.htmlで利用可能）、またはPromide ソフトウエア（http://oligos.molgen.mpg.de/で利用可能）、MethPrimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）などを使用することができる。
【0103】
本発明はまた、本発明の方法で提案するように、対象の生物学的サンプルにおける、以下のための、上記のキットの、または上記のマイクロアレイの、または上記のプライマーの、または上記のプローブの使用に関する：
・対象における胃癌の診断または同定、
・胃癌に罹患している対象における臨床転帰の予測、
・胃癌を有する対象の治療計画の決定、および／または
・胃癌と診断されている対象における胃癌の進行の監視。
・対象における胃癌の診断または同定、
・胃癌に罹患している対象における臨床転帰の予測、
・胃癌を有する対象の治療計画の決定、および／または
・胃癌と診断されている対象における胃癌の進行の監視。
【0104】
本明細書で使用される場合、用語「イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」および「エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）」は、同等であり、通常の宿主生物（例えば、動物またはヒト）から単離された生物学的成分（例えば、細胞または細胞集団）を使用して行われる研究または実験を指す。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】図１は、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによるＧＣ患者由来の腫瘍および非腫瘍隣接組織における選択されたバイオマーカー、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１、およびＫＣＮＡ３のＤＮＡメチル化レベル（ｎ＝１０）を開示する。対応のあるノンパラメトリックウィルコクソン検定を正常組織ＤＮＡと隣接組織ＤＮＡの間の高メチル化の差異の分析に使用した。
【図2】図２は、ｄｄＰＣＲによる選択されたバイオマーカー、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、ＭＳＣ－ＡＳ１、およびＫＣＮＡ３のＤＮＡメチル化の検証（ｎ＝２０）を開示する。対応のあるノンパラメトリックウィルコクソン検定を腫瘍組織ＤＮＡと隣接する正常組織ＤＮＡの間の高メチル化の差異の分析に使用した。
【実施例】
【0106】
材料および方法：
＜患者および健常な対照個体＞
２０人の胃癌患者からのマッチした腫瘍および隣接する非腫瘍組織の生検検体をこの研究に含めた。３３人の健常な個体由来の血漿サンプルは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（コルマール、ＵＳＡ）およびＢｉｏＰｒｅｄｉｃｔ．Ｉｎｃ（オラデル、ＵＳＡ）から購入した。５５人の進行胃癌患者由来の血漿は、ＥＤＴＡチューブに収集した。この研究は、現地の倫理委員会に承認を受け、全ての患者から書面による同意を得た。
＜患者および健常な対照個体＞
２０人の胃癌患者からのマッチした腫瘍および隣接する非腫瘍組織の生検検体をこの研究に含めた。３３人の健常な個体由来の血漿サンプルは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（コルマール、ＵＳＡ）およびＢｉｏＰｒｅｄｉｃｔ．Ｉｎｃ（オラデル、ＵＳＡ）から購入した。５５人の進行胃癌患者由来の血漿は、ＥＤＴＡチューブに収集した。この研究は、現地の倫理委員会に承認を受け、全ての患者から書面による同意を得た。
【0107】
＜腫瘍サンプルの調製、貯蔵、ＤＮＡ抽出、および定量＞
腫瘍および隣接する非腫瘍組織の生検検体は、切除直後にさらなる分析まで、液体窒素で急速冷凍した。各腫瘍は、病理学者により概説されており、腫瘍細胞含量は、ヘマトキシリン－エオジン－サフラン染色により評価した。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で製造者の説明書に従い抽出した。ＤＮＡ濃度は、ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
腫瘍および隣接する非腫瘍組織の生検検体は、切除直後にさらなる分析まで、液体窒素で急速冷凍した。各腫瘍は、病理学者により概説されており、腫瘍細胞含量は、ヘマトキシリン－エオジン－サフラン染色により評価した。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で製造者の説明書に従い抽出した。ＤＮＡ濃度は、ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
【0108】
＜血漿サンプルの調製、貯蔵、ＤＮＡ抽出、および定量＞
健常な個体の血漿サンプルをドライアイス中に受け取り、等分量にし、すぐに－８０℃で冷凍した。抽出前に、血漿サンプルを３０００ｇで１０分間遠心分離し、次いで、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＲＳＣ Ｍａｘｗｅｌｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによるｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従い使用して抽出した。胃癌患者由来の血漿は、ＲＳＣ Ｍａｘｗｅｌｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによるｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａキットｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＤＮＡの量は、ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
健常な個体の血漿サンプルをドライアイス中に受け取り、等分量にし、すぐに－８０℃で冷凍した。抽出前に、血漿サンプルを３０００ｇで１０分間遠心分離し、次いで、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＲＳＣ Ｍａｘｗｅｌｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによるｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従い使用して抽出した。胃癌患者由来の血漿は、ＲＳＣ Ｍａｘｗｅｌｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによるｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａキットｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ＤＮＡの量は、ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
【0109】
＜バフィーコートの調製、ＤＮＡ抽出、および定量＞
バフィーコートは、胃癌に罹患していない患者の全血からまたは健常な個体から調製し、次いで、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。ＤＮＡの量は、ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
バフィーコートは、胃癌に罹患していない患者の全血からまたは健常な個体から調製し、次いで、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。ＤＮＡの量は、ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。抽出されたＤＮＡサンプルは、試験まで－２０℃で保存した。
【0110】
＜Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによる胃癌患者のゲノムワイドＤＮＡメチロームプロファイリング＞
ＤＮＡメチロームライブラリーを、ＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って使用して調製した。簡単に述べれば、５００ｎｇ～１μｇの腫瘍または非腫瘍組織ＤＮＡを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｓ．ａ、ベルギー）を使用して断片化した。断片化されたＤＮＡにＮＧＳアダプターを連結させ、続いて、重亜硫酸塩変換処理を、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行った。いくつかの精製および増幅段階の後、重亜硫酸塩変換されたサンプルをＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉプローブプールでハイブリダイズし、次いで、ＳｅｑＣａｐ Ｐｕｒｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓにより捕捉した。サンプルがＮｅｘｔｓｅｑ（商標）５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）へ移る前に捕捉後の増幅を適用した。
ＤＮＡメチロームライブラリーを、ＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って使用して調製した。簡単に述べれば、５００ｎｇ～１μｇの腫瘍または非腫瘍組織ＤＮＡを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｓ．ａ、ベルギー）を使用して断片化した。断片化されたＤＮＡにＮＧＳアダプターを連結させ、続いて、重亜硫酸塩変換処理を、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行った。いくつかの精製および増幅段階の後、重亜硫酸塩変換されたサンプルをＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉプローブプールでハイブリダイズし、次いで、ＳｅｑＣａｐ Ｐｕｒｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓにより捕捉した。サンプルがＮｅｘｔｓｅｑ（商標）５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）へ移る前に捕捉後の増幅を適用した。
【0111】
＜Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑデータに基づいたＤＮＡメチル化バイオマーカーの分析および同定＞
品質管理に続いて、配列データを重亜硫酸塩変換した参照ゲノムにアラインし、メチレン：Ｒ ｓｃｒｉｐｔを使用して、腫瘍および非腫瘍のＤＮＡ間の差次的にメチル化されたＣｐＧ部位（ＤＭＣ）および差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）について分析した。ＤＭＲは、８０％を超えるサンプルで少なくとも５つのＤＭＣを含有する領域である。種々の情報：非腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベル、腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベル、腫瘍および非腫瘍組織のＤＮＡ間のメチル化レベルの差異、ｑ値、同定されたＤＭＲに対応する遺伝子記号などを含むＤＭＲのリストが作成された。次いで、作成されたこのＤＭＲリストに基づいて、胃癌患者のＤＮＡメチル化バイオマーカーを同定するために種々のパラメーターが使用された。第１に、ｑ値が０．０５未満の全てのＤＭＲを選択した。第２に、腫瘍および非腫瘍のＤＮＡ間でメチル化レベルの差異が４０％を超えるＤＭＲを選択した。次に、第３に、前の２つの基準を満たすＤＭＲを、非腫瘍ＤＮＡでのメチル化レベルが５％未満であったという条件によって選択した。この後、遺伝子間領域のＤＭＲを候補バイオマーカーリストから除外し、遺伝子で注釈付けされたＤＭＲを公開データベースで検証して、以前に記載されたものを除外した。
品質管理に続いて、配列データを重亜硫酸塩変換した参照ゲノムにアラインし、メチレン：Ｒ ｓｃｒｉｐｔを使用して、腫瘍および非腫瘍のＤＮＡ間の差次的にメチル化されたＣｐＧ部位（ＤＭＣ）および差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）について分析した。ＤＭＲは、８０％を超えるサンプルで少なくとも５つのＤＭＣを含有する領域である。種々の情報：非腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベル、腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベル、腫瘍および非腫瘍組織のＤＮＡ間のメチル化レベルの差異、ｑ値、同定されたＤＭＲに対応する遺伝子記号などを含むＤＭＲのリストが作成された。次いで、作成されたこのＤＭＲリストに基づいて、胃癌患者のＤＮＡメチル化バイオマーカーを同定するために種々のパラメーターが使用された。第１に、ｑ値が０．０５未満の全てのＤＭＲを選択した。第２に、腫瘍および非腫瘍のＤＮＡ間でメチル化レベルの差異が４０％を超えるＤＭＲを選択した。次に、第３に、前の２つの基準を満たすＤＭＲを、非腫瘍ＤＮＡでのメチル化レベルが５％未満であったという条件によって選択した。この後、遺伝子間領域のＤＭＲを候補バイオマーカーリストから除外し、遺伝子で注釈付けされたＤＭＲを公開データベースで検証して、以前に記載されたものを除外した。
【0112】
＜組織ＤＮＡ、バフィーコートＤＮＡおよび血漿ｃｃｆＤＮＡの重亜硫酸塩変換＞
組織ＤＮＡ、バフィーコートＤＮＡおよび血漿ｃｃｆＤＮＡは、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して重亜硫酸塩により修飾した。簡単に説明すると、重亜硫酸塩反応をサーマルサイクラーで、９８℃で１２分間および６４℃で２時間３５分間実施した。重亜硫酸塩変換されたＤＮＡのクリーンアップは、製造者の推奨に従い、変換されたＤＮＡをＭ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで溶出し、－２０℃で保存した。
組織ＤＮＡ、バフィーコートＤＮＡおよび血漿ｃｃｆＤＮＡは、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して重亜硫酸塩により修飾した。簡単に説明すると、重亜硫酸塩反応をサーマルサイクラーで、９８℃で１２分間および６４℃で２時間３５分間実施した。重亜硫酸塩変換されたＤＮＡのクリーンアップは、製造者の推奨に従い、変換されたＤＮＡをＭ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで溶出し、－２０℃で保存した。
【0113】
＜液滴に基づくデジタルＰＣＲによる選択バイオマーカーのメチル化変化の検出＞
腫瘍ＤＮＡにおける選択バイオマーカーの高メチル化は、ｄｄＰＣＲによって検証した。デュプレックス形式を使用し、ＤＮＡ量を正規化するためのアルブミンを使用して高メチル化を分析した。プライマーおよびプローブは上記表１および２に記載した。特に、ＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用した。
腫瘍ＤＮＡにおける選択バイオマーカーの高メチル化は、ｄｄＰＣＲによって検証した。デュプレックス形式を使用し、ＤＮＡ量を正規化するためのアルブミンを使用して高メチル化を分析した。プライマーおよびプローブは上記表１および２に記載した。特に、ＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用した。
【0114】
標的配列のＤＮＡメチル化は、Ｒａｉｎｄｒｏｐ ｄｄＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒａｉｎｄａｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、現在Ｂｉｏ－Ｒａｄ）またはＱＸ－２００ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用したｄｄＰＣＲにより分析した。簡単に説明すると、第１のシステムを使用する場合、１２．５μＬのＫａｐａ ｐｒｏｂｅ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．７５μＬの４０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．５μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＬ ２５ｘ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＲａｉｎＤａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．２５μＬの２０ｘアッセイ混合物（８μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、４μＭの６－ＦＡＭおよび１２μＭのＶＩＣ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブを含有）、および標的修飾ＤＮＡ鋳型を含有するアッセイ溶液と混合し、最終反応量を２５μＬにした。可能な場合、各反応で最少１０ｎｇの修飾ＤＮＡを使用した。
【0115】
第２のシステムを使用する場合、ＰＣＲ試薬の混合物（ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、製造者の推奨に従い調製した。トリプレックスパネルは、ＫＣＮＡ３およびＭＳＣ－ＡＳ１のメチル化された標的配列並びに参照遺伝子としてのメチル化されていないアルブミン配列を検出するために開発された。ＺＮＦ７９０－ＡＳ１のメチル化された標的配列並びに参照遺伝子としてのメチル化されていないアルブミン配列を検出するデュプレックスアッセイも開発された。トリプレックスパネルでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの反応混合物の終濃度は、アルブミンおよびＫＣＮＡ３については４００ｎＭ、ＭＳＣ－ＡＳ１については６００ｎＭであった。６００ｎＭのＶＩＣ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブを使用して、アルブミンの非メチル化配列を検出し、４００ｎＭのＦＡＭ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブを使用して、ＭＳＣ－ＡＳ１のメチル化配列を検出し、２００のＦＡＭおよびＶＩＣ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブの両方を使用して、ＫＣＮＡ３のメチル化配列を検出した（プライマーおよびプローブ配列については方法１を参照）。ＺＮＦ７９０－ＡＳ１の標的配列を検出するデュプレックスもＱＸ－２００ ｐｌａｔｆｏｒｍ用に最適化した。このアッセイでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの反応混合物の終濃度は、アルブミンについては４００ｎＭ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については６００ｎＭであった。さらに、６００ｎＭのＶＩＣ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブを使用して、アルブミンの非メチル化配列を検出し、４００ｎＭのＦＡＭ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）標識プローブを使用して、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１のメチル化配列を検出した。ｄｄＰＣＲのＰＣＲ工程は、以下のプログラムを使用してＢＩＯ－ＲＡＤ Ｃ１０００またはＳ１０００で実行した：９５℃で１０分（２．５℃／秒のランプレートを使用）、続いて、９４℃、３０秒および５７．３℃（トリプレックスアッセイ）または５８．４℃（デュプレックスアッセイ）、１分（２．５℃／秒のランプレートを使用）を４５サイクル、最終工程９８℃で１０分。完了後、エマルジョンは、４℃で保存するかまたはすぐに処理して各液滴からのエンドポイント蛍光シグナルを測定した。データは、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ ＢＩＯ－ＲＡＤソフトウエアを製造者の説明に従い使用して分析した。集団は、蛍光レベルに従ってクラスター化され、腫瘍および正常な増幅可能なＤＮＡ分子の両方の正確な計数が可能である。
【0116】
種々のアッセイについて、ブランク上限（limit of blank、ＬＯＢ）は、従前に記載されているように（Taly, V., et al. 2013）、デュプレックスおよびトリプレックスで開発されたアッセイの両方で全血から抽出された市販のＤＮＡ(Promega)を使用して計算した。これは、高メチル化ＤＮＡが存在しない正常な対照ＤＮＡサンプルで測定された陽性液滴の頻度により定義される（サンプルの利用可能性に応じて各アッセイにつきｎ＝１０～２３）。計算されたＬＯＢは、メチル化レベルを計算するために各サンプルから減じた。
【0117】
サンプル分析は、前述の手順（Taly, V., et al. 2013）に従い実行した。観察した液滴の数値がＬＯＢ値より高い場合、サンプルは陽性と見みなした。各サンプルのメチル化レベルは、アルブミン配列を含む液滴の数値に対するメチル化配列を含む液滴の数値の割合として計算した。
【0118】
修飾処理の適切な実現を確実にするために、２つのＤＮＡ対照を使用した（陽性対照：ユニバーサル高メチル化ＤＮＡおよび陰性対照：正常なヒトゲノムＤＮＡ。
【0119】
＜健常な個体および胃癌患者由来の血漿の循環無細胞ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）における選択バイオマーカーのメチル化レベルの測定＞
健常な個体または胃癌患者由来の血漿における選択バイオマーカーのＤＮＡメチル化は、前に説明した同じ反応条件を使用してｄｄＰＣＲによって測定した。デュプレックス形式を使用し、ＤＮＡ量を正規化するためのアルブミンを使用して高メチル化を分析した。上記表１および２に記載した同じプライマーおよびプローブを使用した。特に、ＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用した。
健常な個体または胃癌患者由来の血漿における選択バイオマーカーのＤＮＡメチル化は、前に説明した同じ反応条件を使用してｄｄＰＣＲによって測定した。デュプレックス形式を使用し、ＤＮＡ量を正規化するためのアルブミンを使用して高メチル化を分析した。上記表１および２に記載した同じプライマーおよびプローブを使用した。特に、ＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用した。
【0120】
＜検出感度および特異度の計算＞
非腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベルの平均および標準偏差の合計を、各選択バイオマーカーの感度および特異度を計算するための閾値として使用した。感度は、腫瘍組織で閾値より高いメチル化レベルを示している患者のパーセンテージである。特異度は、非腫瘍組織で閾値より低いメチル化レベルを示している患者のパーセンテージである。
非腫瘍組織ＤＮＡのメチル化レベルの平均および標準偏差の合計を、各選択バイオマーカーの感度および特異度を計算するための閾値として使用した。感度は、腫瘍組織で閾値より高いメチル化レベルを示している患者のパーセンテージである。特異度は、非腫瘍組織で閾値より低いメチル化レベルを示している患者のパーセンテージである。
【0121】
＜統計分析＞
統計分析は、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）およびＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．６．３ Ｓｔｕｄｉｏを使用して実行した。Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。正常組織と隣接組織の間の高メチル化の差異の分析では、対応のあるノンパラメトリックウィルコクソン検定を使用した。健常な血漿および胃癌血漿のｃｃｆＤＮＡ間の高メチル化の差異の分析では、マン・ホイットニー検定を使用した。患者の人口統計学的特性は、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定により比較した。連続データは、独立サンプルのｔ検定で分析した。生存率は、カプラン・マイヤー法を使用して計算した。無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、研究でｃｔＤＮＡ決定のために使用された採血日から最初に記録された放射線画像検査による進行（ＲＥＣＩＳＴ Ｖ１．１）、または死亡のいずれか早い方まで測定した。経過観察に失敗した患者は、最後の経過観察訪問で打ち切りとした。結果とベースライン特性との関連は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルで評価し、９５％ＣＩのハザード比（ＨＲ）を得た。
統計分析は、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）およびＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．６．３ Ｓｔｕｄｉｏを使用して実行した。Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。正常組織と隣接組織の間の高メチル化の差異の分析では、対応のあるノンパラメトリックウィルコクソン検定を使用した。健常な血漿および胃癌血漿のｃｃｆＤＮＡ間の高メチル化の差異の分析では、マン・ホイットニー検定を使用した。患者の人口統計学的特性は、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定により比較した。連続データは、独立サンプルのｔ検定で分析した。生存率は、カプラン・マイヤー法を使用して計算した。無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、研究でｃｔＤＮＡ決定のために使用された採血日から最初に記録された放射線画像検査による進行（ＲＥＣＩＳＴ Ｖ１．１）、または死亡のいずれか早い方まで測定した。経過観察に失敗した患者は、最後の経過観察訪問で打ち切りとした。結果とベースライン特性との関連は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルで評価し、９５％ＣＩのハザード比（ＨＲ）を得た。
【0122】
結果
＜Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑデータに基づいたＤＮＡメチル化バイオマーカーの同定＞
１０人の胃癌（ＧＣ）患者由来の合計２０個のサンプル（腫瘍および非腫瘍組織のＤＮＡ組）をＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリーの調製後、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによってメチロームプロファイルについて分析した。非腫瘍組織ＤＮＡと比較して胃腫瘍組織ＤＮＡにおいて１８７，１６６のＤＭＲを同定した。それらの中で、１５，５４３のＤＭＲはｑ値が０．０５未満であった。この後、より厳密な閾値：腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡの間でメチル化レベルの差異が４０％を超え、かつメチル化レベルが非腫瘍ＤＮＡにおけるメチル化の５％未満である、を胃癌の潜在的ＤＮＡメチル化バイオマーカーの同定に適用した。最後に、３つの潜在的バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、およびＭＳＣ－ＡＳ１を確認した。
＜Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑデータに基づいたＤＮＡメチル化バイオマーカーの同定＞
１０人の胃癌（ＧＣ）患者由来の合計２０個のサンプル（腫瘍および非腫瘍組織のＤＮＡ組）をＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリーの調製後、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによってメチロームプロファイルについて分析した。非腫瘍組織ＤＮＡと比較して胃腫瘍組織ＤＮＡにおいて１８７，１６６のＤＭＲを同定した。それらの中で、１５，５４３のＤＭＲはｑ値が０．０５未満であった。この後、より厳密な閾値：腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡの間でメチル化レベルの差異が４０％を超え、かつメチル化レベルが非腫瘍ＤＮＡにおけるメチル化の５％未満である、を胃癌の潜在的ＤＮＡメチル化バイオマーカーの同定に適用した。最後に、３つの潜在的バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、およびＭＳＣ－ＡＳ１を確認した。
【0123】
＜Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによるＧＣ患者由来の腫瘍ＤＮＡにおける選択バイオマーカーの高メチル化＞
図１に示されるように、選択バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、およびＭＳＣ－ＡＳ１のメチル化レベルは、胃腫瘍組織ＤＮＡにおいて非腫瘍組織ＤＮＡでのメチル化レベルと比べて有意に増加していた。これらの全てのバイオマーカーのＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによる検出感度および特異度は８０％を超えていた：
図１に示されるように、選択バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１、およびＭＳＣ－ＡＳ１のメチル化レベルは、胃腫瘍組織ＤＮＡにおいて非腫瘍組織ＤＮＡでのメチル化レベルと比べて有意に増加していた。これらの全てのバイオマーカーのＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによる検出感度および特異度は８０％を超えていた：
【0124】
【表3】
【0125】
＜ｄｄＰＣＲによる選択バイオマーカーのＤＮＡメチル化変化の検証＞
ＧＣ患者由来の腫瘍および非腫瘍組織におけるいくつかの潜在的バイオマーカーのＤＮＡメチル化の差異を、ｄｄＰＣＲによってＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用して検証した（ｎ＝２０）。腫瘍組織におけるＤＮＡメチル化は、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによりすでに実証されたように、非腫瘍組織におけるＤＮＡメチル化と比べて有意に増加していた（図２）。
ＧＣ患者由来の腫瘍および非腫瘍組織におけるいくつかの潜在的バイオマーカーのＤＮＡメチル化の差異を、ｄｄＰＣＲによってＭＳＣ－ＡＳ１については配列番号９～１０のプライマー対および配列番号１８のプローブ、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１については配列番号１１～１２のプライマー対および配列番号１９のプローブ並びにＫＣＮＡ３については配列番号１５～１６のプライマー対および配列番号２１のプローブを使用して検証した（ｎ＝２０）。腫瘍組織におけるＤＮＡメチル化は、Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑによりすでに実証されたように、非腫瘍組織におけるＤＮＡメチル化と比べて有意に増加していた（図２）。
【0126】
胃癌におけるバイオマーカーＭＳＣ－Ａ１、ＫＣＮＡ３およびＺＮＦ－９０－ＡＳ１のｄｄＰＣＲによる検出感度および特異度は８０％を超えていた：
【0127】
【表4】
【0128】
＜より高い感度および特異度を達成するための異なるバイオマーカーの組合せ＞
個々のバイオマーカーのＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑおよびｄｄＰＣＲによる感度および特異度をそれぞれ表３および表４に示している。１つのバイオマーカーのみを使用した最も高い感度は８５％である。より高い検出感度および特異度を達成するために、異なるバイオマーカーを組み合わせることができる（表５および６、それぞれＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑまたはｄｄＰＣＲにより得られた結果）。本発明で対象とするように、ｄｄＰＣＲによる検出感度は、さらに、ＭＳＣ－ＡＳ１とＺＮＦ７９０－ＡＳ１またはＭＳＣ－ＡＳ１とＫＣＮＡ３を組み合わせることにより１００％に高めることができる。
個々のバイオマーカーのＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑおよびｄｄＰＣＲによる感度および特異度をそれぞれ表３および表４に示している。１つのバイオマーカーのみを使用した最も高い感度は８５％である。より高い検出感度および特異度を達成するために、異なるバイオマーカーを組み合わせることができる（表５および６、それぞれＭｅｔｈｙｌ－ｓｅｑまたはｄｄＰＣＲにより得られた結果）。本発明で対象とするように、ｄｄＰＣＲによる検出感度は、さらに、ＭＳＣ－ＡＳ１とＺＮＦ７９０－ＡＳ１またはＭＳＣ－ＡＳ１とＫＣＮＡ３を組み合わせることにより１００％に高めることができる。
【0129】
【表5】
【0130】
【表6】
【0131】
＜健康な個体および患者由来の血漿ｃｃｆＤＮＡおよびバフィーコート画分における選択バイオマーカーのｄｄＰＣＲによるメチル化プロファイル＞
これらの潜在的バイオマーカーの目的は、胃癌患者におけるＤＮＡ高メチル化を検出することであるが健康な個体では検出されない。これを検証するために、健康な個体由来の血漿ｃｃｆＤＮＡにおけるメチル化レベルをｄｄＰＣＲにより調査した。これら全ての潜在的バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１およびＭＳＣ－ＡＳ１について健康な血漿ｃｃｆＤＮＡにおいて有意なレベルのメチル化は観察されなかった（ＭＳＣ－ＡＳ１については図３、他のマーカーについての結果（デュプレックスおよびトリプレックスアッセイについては、それぞれ表７および表９））。さらに、バフィーコート（胃癌に罹患していない患者由来のもの、胃癌を有する患者または健康な個体由来のもの）から抽出されたＤＮＡもマーカーに関して試験し、これらのサンプルにおいて試験したマーカーのメチル化は観察されなかった（デュプレックスおよびトリプレックスアッセイについては、それぞれ表８および１０）。各バイオマーカーについて実行したサンプルの数は、ＤＮＡの利用可能性によって異なった。バフィーコートＤＮＡ１～６は結腸直腸癌患者由来のものであり、バフィーコートＤＮＡ７～１６は健康な個体由来のものであり、他のバフィーコートは胃癌患者由来のものであった。ＬＯＢの計算について前述したように、全血から抽出された市販のＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまたアッセイの検証に使用した。バフィーコートＤＮＡに加えて、これらの対照は、血液中に含まれる細胞ではマーカーが陽性でないことを確認するために実行し、血球溶血（例えば、分析前のサンプル処理による）の場合に偽陽性がないことを保証した。
これらの潜在的バイオマーカーの目的は、胃癌患者におけるＤＮＡ高メチル化を検出することであるが健康な個体では検出されない。これを検証するために、健康な個体由来の血漿ｃｃｆＤＮＡにおけるメチル化レベルをｄｄＰＣＲにより調査した。これら全ての潜在的バイオマーカー：ＫＣＮＡ３、ＺＮＦ７９０－ＡＳ１およびＭＳＣ－ＡＳ１について健康な血漿ｃｃｆＤＮＡにおいて有意なレベルのメチル化は観察されなかった（ＭＳＣ－ＡＳ１については図３、他のマーカーについての結果（デュプレックスおよびトリプレックスアッセイについては、それぞれ表７および表９））。さらに、バフィーコート（胃癌に罹患していない患者由来のもの、胃癌を有する患者または健康な個体由来のもの）から抽出されたＤＮＡもマーカーに関して試験し、これらのサンプルにおいて試験したマーカーのメチル化は観察されなかった（デュプレックスおよびトリプレックスアッセイについては、それぞれ表８および１０）。各バイオマーカーについて実行したサンプルの数は、ＤＮＡの利用可能性によって異なった。バフィーコートＤＮＡ１～６は結腸直腸癌患者由来のものであり、バフィーコートＤＮＡ７～１６は健康な個体由来のものであり、他のバフィーコートは胃癌患者由来のものであった。ＬＯＢの計算について前述したように、全血から抽出された市販のＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまたアッセイの検証に使用した。バフィーコートＤＮＡに加えて、これらの対照は、血液中に含まれる細胞ではマーカーが陽性でないことを確認するために実行し、血球溶血（例えば、分析前のサンプル処理による）の場合に偽陽性がないことを保証した。
【0132】
しかしながら、健康な対象および胃癌患者の血漿から抽出されたＤＮＡで試験した場合、開発したデュプレックスおよびトリプレックスアッセイの両方を使用して、メチル化は胃の患者でのみ観察され（下記参照）、血液サンプルでのＧＣの検出について１００％の潜在的特異度をもたらした。
【0133】
【表7】
【0134】
【表8】
【0135】
【表9】
【0136】
【表10】
【0137】
＜胃癌の進行の監視＞
マーカーＭＳＣ－Ａ１およびＫＣＮＡ３を使用して決定された循環無細胞ＤＮＡのメチル化状況は、無増悪生存期間と相関していることを示した（図４）。一次、二次または三次治療中の５５人の患者を上記手順によりメチル化腫瘍ＤＮＡの存在について試験した。少なくとも１つのマーカーについて陽性であった（ｎ＝４３）のは７６パーセントを超えていた（７８％）。ＧＣ患者のメチル化状況は無増悪生存期間が長いことと関連していた（図４参照）。検出されたメチル化マーカーの量に従って患者を分けると（メチル化ｃｔＤＮＡ濃度（血漿１ｍＬあたりのコピー数）が低い三分位数、中間の三分位数および高い三分位数）、無病生存期間の有意差が観察された。実際に、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が最も高い群では、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が中間の群に対して、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が低い群に対して進行の確率が増加していることが観察された（ログランク傾向検定、ｐ＝０．００９２）。これらのマーカーの適切性は単変量分析を使用してさらに検証した。メチル化状況の分析（サンプルをメチル化について陽性と陰性と見なした場合またはメチル化ｃｔＤＮＡの量を３つの三分位数に分けて考えた場合の両方）により癌進行の予測に有意な結果が得られた場合、潜在的ＧＣマーカー（性別、Ｈｅｒ２増幅または腫瘍分化度など）の分析により有意な結果は得られなかった。表１１は、一次および二次化学療法で処置した患者について得られたデータ（ｎ＝４８）をまとめている。重要なことに、ｃｔＤＮＡの量もまた、連続変数として取得した場合、ＧＣの進行と関連していた（ｐ値＝０．０２４）。
マーカーＭＳＣ－Ａ１およびＫＣＮＡ３を使用して決定された循環無細胞ＤＮＡのメチル化状況は、無増悪生存期間と相関していることを示した（図４）。一次、二次または三次治療中の５５人の患者を上記手順によりメチル化腫瘍ＤＮＡの存在について試験した。少なくとも１つのマーカーについて陽性であった（ｎ＝４３）のは７６パーセントを超えていた（７８％）。ＧＣ患者のメチル化状況は無増悪生存期間が長いことと関連していた（図４参照）。検出されたメチル化マーカーの量に従って患者を分けると（メチル化ｃｔＤＮＡ濃度（血漿１ｍＬあたりのコピー数）が低い三分位数、中間の三分位数および高い三分位数）、無病生存期間の有意差が観察された。実際に、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が最も高い群では、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が中間の群に対して、メチル化ｃｔＤＮＡ濃度が低い群に対して進行の確率が増加していることが観察された（ログランク傾向検定、ｐ＝０．００９２）。これらのマーカーの適切性は単変量分析を使用してさらに検証した。メチル化状況の分析（サンプルをメチル化について陽性と陰性と見なした場合またはメチル化ｃｔＤＮＡの量を３つの三分位数に分けて考えた場合の両方）により癌進行の予測に有意な結果が得られた場合、潜在的ＧＣマーカー（性別、Ｈｅｒ２増幅または腫瘍分化度など）の分析により有意な結果は得られなかった。表１１は、一次および二次化学療法で処置した患者について得られたデータ（ｎ＝４８）をまとめている。重要なことに、ｃｔＤＮＡの量もまた、連続変数として取得した場合、ＧＣの進行と関連していた（ｐ値＝０．０２４）。
【0138】
【表11】
【0139】
参考文献
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】