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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-22
(54)【発明の名称】新規ＩＬ－１５プロドラッグおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220815BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220815BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220815BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220815BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220815BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20220815BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20220815BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20220815BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20220815BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220815BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220815BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220815BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220815BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220815BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220815BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220815BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/11 Z
C12N15/12
C07K19/00
C07K16/24
C07K14/54
C07K14/715
C07K7/00
C07K14/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P31/12
A61P37/04
A61K38/20
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021573353
(86)(22)【出願日】2020-06-12
(85)【翻訳文提出日】2022-02-04
(86)【国際出願番号】 US2020037439
(87)【国際公開番号】W WO2020252264
(87)【国際公開日】2020-12-17
(31)【優先権主張番号】62/860,635
(32)【優先日】2019-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/888,444
(32)【優先日】2019-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/891,190
(32)【優先日】2019-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/959,973
(32)【優先日】2020-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/029,473
(32)【優先日】2020-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520347328
【氏名又は名称】アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡｓｋＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ルゥ．ユエフォン
(72)【発明者】
【氏名】ユィ，チュンシャオ
(72)【発明者】
【氏名】ルゥ，ジエン－フォン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC29
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF32
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA41
4C084BA42
4C084BA44
4C084DA12
4C084NA05
4C084NA14
4C084NA15
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB33
4C084ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
ここに提供されるのは、ＩＬ－１５サイトカインプロドラッグおよびその製造および使用方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、
マスキング部分が担体部分に融合し、
Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合し、そして
ＩＬ－１５サイトカインがＳｕｓｈｉドメインに融合している、
プロドラッグ。
【請求項2】
マスキング部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、そして
ＩＬ－１５サイトカインがＳｕｓｈｉドメインに第三ペプチドリンカーを介して融合しており、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つが開裂可能である、
請求項１のプロドラッグ。
【請求項3】
第三ペプチドリンカーが少なくとも１５、２０、２５または３０アミノ酸長であり、所望により、ここで、第三ペプチドリンカーが配列番号１３９または１４０を含む、請求項２のプロドラッグ。
【請求項4】
ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、
ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に融合し、
Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合し、そして
マスキング部分がＳｕｓｈｉドメインに融合している、
プロドラッグ。
【請求項5】
ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、そして
マスキング部分がＳｕｓｈｉドメインに第三ペプチドリンカーを介して融合しており、所望により、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つが開裂可能である、
請求項４のプロドラッグ。
【請求項6】
マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分の受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む、請求項１～５の何れかのプロドラッグ。
【請求項7】
マスキング部分がヒトＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログおよび／またはヒトＩＬ－２ＲγのＥＣＤまたはその機能的アナログを含む、請求項６のプロドラッグ。
【請求項8】
ヒトＩＬ－２ＲγのＥＣＤまたはその機能的アナログが配列番号６またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７のプロドラッグ。
【請求項9】
ヒトＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログが配列番号３、４または５またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７のプロドラッグ。
【請求項10】
マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合する抗体フラグメントを含む、請求項１～５の何れかのプロドラッグ。
【請求項11】
ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)および所望によりＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害する抗体フラグメントを含み、そして
マスキング部分がペプチドリンカーを介して担体部分、ＩＬ－１５サイトカイン部分またはＳｕｓｈｉドメインに融合する、
プロドラッグ。
【請求項12】
抗体フラグメントが１４６Ｂ７、１４６Ｈ５、４０４Ｅ４および４０４Ａ８から選択される抗ＩＬ－１５抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ＳｃＦｖまたはＦａｂである、請求項１０または１１のプロドラッグ。
【請求項13】
抗体フラグメントが配列番号１００を含む重鎖ＣＤＲ(ＨＣＤＲ)１、配列番号１０１を含むＨＣＤＲ２、配列番号１０２または１０６を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０３を含む軽鎖ＣＤＲ(ＬＣＤＲ)１、配列番号１０４を含むＬＣＤＲ２および配列番号１０５を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１０または１１のプロドラッグ。
【請求項14】
抗体フラグメントが(ｉ)配列番号１０７またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１０８または１２３またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；(ii)配列番号１０９；(iii)配列番号１１０；または(iv)配列番号１２４を含む、請求項１０または１１のプロドラッグ。
【請求項15】
重鎖ＣＤＲ３のＣｙｓ残基がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＧｌｎに変異される、請求項１３または１４のプロドラッグ。
【請求項16】
マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分のＩＬ－１５Ｒαへの結合を妨害しないかまたは最小限の影響を有する、請求項１～１５の何れかのプロドラッグ。
【請求項17】
ＩＬ－１５サイトカイン部分が配列番号２を含むヒトＩＬ－１５ポリペプチドまたはその変異タンパク質である、請求項１～１６の何れかのプロドラッグ。
【請求項18】
ヒトＩＬ－１５ポリペプチドが配列番号２に対して、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ａ、Ｎ４Ｄ、Ｉ６Ｔ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｔ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｄ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１、Ｌ５２、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｔ６２Ｌ、Ｔ６２Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６４Ｌ、Ｅ６４Ｋ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｌ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６８Ｓ、Ｉ６８Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８ＥおよびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択される１以上の変異を含む、請求項１７のプロドラッグ。
【請求項19】
担体部分がＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミンフラグメント、抗体Ｆｃドメインまたは抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～１８の何れかのプロドラッグ。
【請求項20】
担体部分が変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」) (ＥＵナンバリング)を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体である、請求項１９のプロドラッグ。
【請求項21】
担体部分がノブ・イントゥ・ホール変異を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、ここで、ＩＬ－１５サイトカイン部分およびマスキング部が抗体Ｆｃドメインの異なるポリペプチド鎖または抗体の異なる重鎖に融合する、請求項１９または２０のプロドラッグ。
【請求項22】
ノブ・イントゥ・ホール変異がＦｃドメインの一方のポリペプチド鎖または抗体の一方の重鎖にＴ３６６Ｙ「ノブ」変異およびＦｃドメインの他方のポリペプチドまたは抗体の他方の重鎖にＹ４０７Ｔ「ホール」変異を含むまたはノブ・イントゥ・ホール変異が「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異(ＥＵナンバリング)を含む、
請求項２１のプロドラッグ。
【請求項23】
担体部分がＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、ここで、該第一ポリペプチドが配列番号８０、８１または８７に示すものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、該第二ポリペプチド鎖が配列番号８２～８６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９のプロドラッグ。
【請求項24】
担体部分が配列番号５５または５６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号５４、６０または６１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号５２、５３、５８、５９、６２、６３または６９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－１抗体である、請求項１９または２０のプロドラッグ。
【請求項25】
担体部分が配列番号５５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号６６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号６４、６５、６７または６８と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－１抗体である、請求項１９または２０のプロドラッグ。
【請求項26】
担体部分が配列番号５０または５１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号４７、４８または４９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号４５または４６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１９または２０のプロドラッグ。
【請求項27】
担体部分がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴから選択される１以上の抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１９または２０のプロドラッグ。
【請求項28】
担体部分が抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、プロドラッグが次のポリペプチド対(Ｎ末端からＣ末端)：ａ) Ｃ１－ＡおよびＣ２－Ｓ－Ｍ、
ｂ) Ａ－Ｃ１およびＭ－Ｓ－Ｃ２、
ｃ) Ｃ１－Ｓ－ＡおよびＣ２－Ｍ、
ｄ) Ｃ１－Ａ－ＳおよびＣ２－Ｍ、
ｅ) Ｓ－Ａ－Ｃ１およびＭ－Ｃ２または
ｆ) Ａ－Ｓ－Ｃ１およびＭ－Ｃ２
を含み、
ここで、Ｃ１およびＣ２がそれぞれ、Ｆｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であるかそれぞれ抗体の第一および第二重鎖であり；そして「－」が直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーである、請求項１９～２７の何れかのプロドラッグ。
【請求項29】
Ｓｕｓｈｉドメインが配列番号７または９またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８の何れかのプロドラッグ。
【請求項30】
第一、第二および第三ペプチドリンカーの少なくとも１つが所望により配列番号１１～１６から選択される、開裂不可能なペプチドリンカーである、請求項１～２９の何れかのプロドラッグ。
【請求項31】
第一、第二および第三ペプチドリンカーの少なくとも１つがウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター(ｕＰＡ)、マトリプターゼ、マトリクスメタロペプチダーゼ(ＭＭＰ)２またはＭＭＰ９の基質配列を含む開裂可能なペプチドリンカーである、請求項１～３０の何れかのプロドラッグ。
【請求項32】
開裂可能なペプチドリンカーが(ｉ)ｕＰＡおよびＭＭＰ２両者、(ii)ｕＰＡおよびＭＭＰ９両者、(iii)ｕＰＡ、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９または(iv)ＭＭＰ２およびマトリプターゼの基質配列を含む、請求項３１のプロドラッグ。
【請求項33】
開裂可能なペプチドリンカーが配列番号１７～３６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１のプロドラッグ。
【請求項34】
開裂可能なペプチドリンカーが腫瘍部位またはその周囲環境に位置する１以上のプロテアーゼにより開裂可能であり、開裂が、腫瘍部位または周囲環境でのプロドラッグの活性化をもたらす、請求項１～３４の何れかのプロドラッグ。
【請求項35】
請求項１～３４の何れかのプロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
【請求項36】
請求項１～３４の何れかのプロドラッグをコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項37】
請求項３６の１以上のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターまたはベクター。
【請求項38】
請求項３７のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項39】
ｕＰＡ、マトリプターゼ、ＭＭＰ－２および／またはＭＭＰ－９をコードする遺伝子が宿主細胞でノックアウトされる、請求項３８の宿主細胞。
【請求項40】
請求項１～３４の何れかのプロドラッグを製造する方法であって、請求項３８または３９の宿主細胞であって、哺乳動物細胞である宿主細胞を、該プロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、そして
該プロドラッグを単離することを含む、
方法。
【請求項41】
処置を必要とする患者における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、患者に治療有効量の請求項３５の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項42】
請求項４１における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法において使用するための、ＩＬ－１５プロドラッグ。
【請求項43】
請求項４１における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法において使用するための医薬の製造のための、ＩＬ－１５プロドラッグの使用。
【請求項44】
患者がウイルス感染または乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有する、請求項４１の方法、請求項４２の使用のためのプロドラッグまたは請求項４３の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１２日出願の米国仮出願６２／８６０,６３５；２０１９年８月１７日出願の米国仮出願６２／８８８,４４４；２０１９年８月２３日出願の米国仮出願６２／８９１,１９０；２０２０年１月１１日出願の米国仮出願６２／９５９,９７３；および２０２０年５月２３日出願の米国仮出願６３／０２９,４７３に基づく優先権を主張する。上記優先権出願の開示を、引用によりそれらの全体を本明細書に包含させる。
本出願は、２０１９年６月１２日出願の米国仮出願６２／８６０,６３５；２０１９年８月１７日出願の米国仮出願６２／８８８,４４４；２０１９年８月２３日出願の米国仮出願６２／８９１,１９０；２０２０年１月１１日出願の米国仮出願６２／９５９,９７３；および２０２０年５月２３日出願の米国仮出願６３／０２９,４７３に基づく優先権を主張する。上記優先権出願の開示を、引用によりそれらの全体を本明細書に包含させる。
【0002】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提供され、ここに、引用によりその全体を本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０２０年６月８日に作成し、025471_WO004_SL.txtなる名称であり、３５９,５８０バイトサイズである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提供され、ここに、引用によりその全体を本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０２０年６月８日に作成し、025471_WO004_SL.txtなる名称であり、３５９,５８０バイトサイズである。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
インターロイキン－１５(ＩＬ－１５)は、ＩＬ－２と構造的類似性を有するサイトカインである。ＩＬ－１５は、ウイルス感染後、単核食細胞および他の免疫細胞により分泌される。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー(ＮＫ)および免疫系の他の細胞の増殖を誘導し、ウイルスに感染した細胞および癌細胞の殺滅に関与する。ＩＬ－２と同様、ＩＬ－１５は、中程度親和性受容体であるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)β／γ複合体に、約１nMのＫＤで結合する(Giri et al., EMBO J. (1994) 13:2822-30)。ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体(ＩＬ－１５Ｒ)αにはるかに高い親和性(ＫＤ＝約０.０５nM)で結合する。ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－２Ｒβ／γ複合体と結合し、ＩＬ－１５特異的、機能的高親和性受容体(αβγ)を形成し得る(Minami et al., Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-67; Giri et al., J Leukoc Biol. (1995) 5745:763-6; and Lehours et al., Eur Cytokine Netw. (2000) 11:207-15)。
インターロイキン－１５(ＩＬ－１５)は、ＩＬ－２と構造的類似性を有するサイトカインである。ＩＬ－１５は、ウイルス感染後、単核食細胞および他の免疫細胞により分泌される。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー(ＮＫ)および免疫系の他の細胞の増殖を誘導し、ウイルスに感染した細胞および癌細胞の殺滅に関与する。ＩＬ－２と同様、ＩＬ－１５は、中程度親和性受容体であるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)β／γ複合体に、約１nMのＫＤで結合する(Giri et al., EMBO J. (1994) 13:2822-30)。ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体(ＩＬ－１５Ｒ)αにはるかに高い親和性(ＫＤ＝約０.０５nM)で結合する。ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－２Ｒβ／γ複合体と結合し、ＩＬ－１５特異的、機能的高親和性受容体(αβγ)を形成し得る(Minami et al., Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-67; Giri et al., J Leukoc Biol. (1995) 5745:763-6; and Lehours et al., Eur Cytokine Netw. (2000) 11:207-15)。
【0004】
ＩＬ－１５Ｒαの細胞外領域は、タンパク質－タンパク質相互作用の共通モチーフであるＳｕｓｈｉドメインを含む。最初の６５アミノ酸を有するＩＬ－１５Ｒα Ｎ末端フラグメントは部分的活性であるが、最初の８５アミノ酸を含むフラグメントは完全に機能的であることが示されている(Wei et al., J Immunol. (2001) 167(1):277-82)。
【0005】
ＩＬ－１５の変異が、ＩＬ－１５のその受容体との相互作用の試験のために行われている。Ｄ８およびＱ１０８は、例えば、それぞれＩＬ－１５のＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットへの結合に関与することが示されている(Pettit et al., J Biol Chem. (1997) 272: 2312-18)。ＩＬ－１５のＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－２Ｒβへの結合に関与するＩＬ－１５の残基Ｌ４５、Ｑ４８、Ｓ５１、Ｌ５２、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｉ６８およびＬ６９の変異を含む、ＩＬ－１５のさらなる変異が開示されている(米国特許７,８５８,０８１)。変異Ｅ６４Ｋ、Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７ＥまたはＩ６８Ｄを有するＩＬ－１５変異タンパク質は、細胞ベースのアッセイで生物活性が低減されることが示されている(Zhu et al., J Immnol. (2009) 183(6):3598；およびＷＯ２００５／０８５２８２Ａ１)。ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαの相互作用を標的とする変異も報告されている。例えば、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１およびＬ５２は、ＩＬ－１５Ｒα結合に関与することが示されている(Bernard et al., J Biol Chem. (2004) 279:24313-22)。Ｅ４６は、酸性側鎖の塩基性側鎖(Ｅ４６Ｋ)への置換が、ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒαの結合および生理活性の完全な喪失をもたらすため、特に重要と考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
残念ながら、現在のＩＬ－１５薬物候補の有害作用は顕著であり、このような薬物の投与量を限定する。さらに、これら薬物候補によるＴ細胞、ＮＫ細胞および他の免疫細胞の活性化は部位特異的ではない。さらに、ＩＬ－１５／２受容体に対する親和性が顕著に低減されていても、ＩＬ－１５変異タンパク質に対する「ＰＫシンカー」があると考えられる。ＩＬ－１５ベースのタンパク質治療剤の産生には多数の困難もある。上記全てが、改善されたＩＬ－１５ベースの治療剤の必要性を強調する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明の概要
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、マスキング部分が担体部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分がＳｕｓｈｉドメインに融合している、プロドラッグを提供する。ある実施態様において、マスキング部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、ＩＬ－１５サイトカインがＳｕｓｈｉドメインに第三ペプチドリンカーを介して融合しており、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、ペプチドリンカー全部が開裂可能ではない。具体的実施態様において、第三ペプチドリンカーは少なくとも１５、２０、２５または３０アミノ酸長(例えば、１５～５０または１５～１００アミノ酸長)であり、所望により、ここで、第三ペプチドリンカーは、配列番号１３９または１４０を含む。
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、マスキング部分が担体部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分がＳｕｓｈｉドメインに融合している、プロドラッグを提供する。ある実施態様において、マスキング部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、ＩＬ－１５サイトカインがＳｕｓｈｉドメインに第三ペプチドリンカーを介して融合しており、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、ペプチドリンカー全部が開裂可能ではない。具体的実施態様において、第三ペプチドリンカーは少なくとも１５、２０、２５または３０アミノ酸長(例えば、１５～５０または１５～１００アミノ酸長)であり、所望により、ここで、第三ペプチドリンカーは、配列番号１３９または１４０を含む。
【0008】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合し、マスキング部分がＳｕｓｈｉドメインに融合している、プロドラッグもまた提供する。ある実施態様において、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、マスキングがＳｕｓｈｉドメインに第三ペプチドリンカーを介して融合しており、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、３つのペプチドリンカー全てが開裂可能ではない。
【0009】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、マスキング部分が担体部分に融合し、ＩＬ－１５部分が担体部分に融合し、ＳｕｓｈｉドメインがＩＬ－１５部分に融合している、プロドラッグをさらに提供する。ある実施態様において、マスキング部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、ＩＬ－１５部分が担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインは、第三ペプチドリンカーを介してＩＬ－１５部分に融合し、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、ペプチドリンカー全部が開裂可能ではない。具体的実施態様において、第三ペプチドリンカーは少なくとも１５、２０、２５または３０アミノ酸長(例えば、１５～５０または１５～１００アミノ酸長)であり、所望により、ここで、第三ペプチドリンカーは、配列番号１３９または１４０を含む。
【0010】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に融合し、マスキング部分が担体部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインがマスキング部分に融合している、プロドラッグもまた提供する。ある実施態様において、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、マスキング部分が担体部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインは第三ペプチドリンカーを介してマスキング部分に融合し、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、３つのペプチドリンカー全てが開裂可能ではない。
【0011】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に融合し、マスキング部分がＩＬ－１５部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合している、プロドラッグもまた提供する。ある実施態様において、ＩＬ－１５サイトカイン部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、マスキング部分は第二ペプチドリンカーを介してＩＬ－１５部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインは第三ペプチドリンカーを介して担体に融合し、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、３つのペプチドリンカー全てが開裂可能ではない。
【0012】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)およびＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害し、マスキング部分が担体部分に融合し、ＩＬ－１５部分がマスキング部分に融合し、Ｓｕｓｈｉドメインが担体部分に融合している、プロドラッグもまた提供する。ある実施態様において、マスキング部分が担体部分に第一ペプチドリンカーを介して融合し、ＩＬ－１５部分がマスキング部分に第二ペプチドリンカーを介して融合し、Ｓｕｓｈｉドメインは第三ペプチドリンカーを介して担体に融合し、ここで、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能である。ある実施態様において、３個のペプチドリンカーの少なくとも１つ(例えば、１、２または３)は開裂可能ではない。ある実施態様において、３つのペプチドリンカー全てが開裂可能ではない。
【0013】
ある実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１５サイトカイン部分の受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む。例えば、マスキング部分は、ヒトＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログおよび／またはヒトＩＬ－２ＲγのＥＣＤまたはその機能的アナログを含む。具体的実施態様において、ヒトＩＬ－２ＲγのＥＣＤまたはその機能的アナログは、配列番号６またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の特定の実施態様において、ヒトＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログは、配列番号３、４または５またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１５サイトカイン部分に結合する抗体フラグメントを含む。
【0014】
本発明は、ＩＬ－１５サイトカイン部分(Ａ)、マスキング部分(Ｍ)、担体部分(Ｃ)および所望によりＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物活性を阻害する抗体フラグメントを含み、マスキング部分が所望によりペプチドリンカーを介して、担体部分ＩＬ－１５サイトカイン部分またはＳｕｓｈｉドメインに融合している、プロドラッグをさらに提供する。
【0015】
ある実施態様において、プロドラッグにおける抗体フラグメントは、１４６Ｂ７、１４６Ｈ５、４０４Ｅ４および４０４Ａ８から選択される抗ＩＬ－１５抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ＳｃＦｖまたはＦａｂである。例えば、抗体フラグメントは、配列番号１００を含む重鎖ＣＤＲ(ＨＣＤＲ)１、配列番号１０１を含むＨＣＤＲ２、配列番号１０２を含むＨＣＤＲ３または１０６、配列番号１０３を含む軽鎖ＣＤＲ(ＬＣＤＲ)１、配列番号１０４を含むＬＣＤＲ２および配列番号１０５を含むＬＣＤＲ３を含む。具体的実施態様において、抗体フラグメントは、(ｉ)配列番号１０７またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１０８または１２３またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；(ii)配列番号１０９；(iii)配列番号１１０；または(iv)配列番号１２４を含む。ある実施態様において、重鎖ＣＤＲ３(配列番号１０２)のＣｙｓ残基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＧｌｎに変異される。
【0016】
ある実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１５サイトカイン部分のＩＬ－１５Ｒαへの結合を妨害しないかまたは最小限の影響を有する。
【0017】
ある実施態様において、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、配列番号２を含むヒトＩＬ－１５ポリペプチドまたはその変異タンパク質である。具体的実施態様において、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドは、配列番号２に対して、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ａ、Ｎ４Ｄ、Ｉ６Ｔ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｔ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｄ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１、Ｌ５２、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｔ６２Ｌ、Ｔ６２Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６４Ｌ、Ｅ６４Ｋ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｌ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６８Ｓ、Ｉ６８Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８ＥおよびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択される１以上の変異を含む。
【0018】
ある実施態様において、担体部分は、ＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミンフラグメント、抗体Ｆｃドメインまたは抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらなる実施態様において、担体部分は、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体である(ＥＵナンバリング)。ある実施態様において、担体部分はノブ・イントゥ・ホール変異を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、ここで、ＩＬ－１５サイトカイン部分およびマスキング部は、抗体Ｆｃドメインの異なるポリペプチド鎖または抗体の異なる重鎖に融合する。ある実施態様において、ノブ・イントゥ・ホール変異は、Ｆｃドメインの一方のポリペプチド鎖または抗体の一方の重鎖にＴ３６６Ｙ「ノブ」変異およびＦｃドメインの他方のポリペプチドまたは抗体の他方の重鎖にＹ４０７Ｔ「ホール」変異を含むか、またはノブ・イントゥ・ホール変異は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含む(ＥＵナンバリング)。ある実施態様において、担体部分はＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、ここで、該第一ポリペプチドは、配列番号８０、８１または８７に示すものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、該第二ポリペプチド鎖は、配列番号８２～８６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0019】
ある実施態様において、担体部分は、配列番号５５または５６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号５４、６０または６１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号５２、５３、５８、５９、６２、６３または６９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－１抗体である。さらなる実施態様において、担体部分は、配列番号５５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号６６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号６４、６５、６７または６８と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－１抗体である。
【0020】
ある実施態様において、担体部分は、配列番号５０または５１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号４７、４８または４９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第一重鎖；および配列番号４５または４６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第二重鎖を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
【0021】
ある実施態様において、担体部分は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３およびＴＩＧＩＴから選択される１以上の抗原に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0022】
ある実施態様において、担体部分は抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、プロドラッグは、次のＣ１－ＡおよびＣ２－Ｓ－Ｍ、Ａ－Ｃ１およびＭ－Ｓ－Ｃ２、Ｃ１－Ｓ－ＡおよびＣ２－Ｍ、Ｃ１－Ａ－ＳおよびＣ２－Ｍ、Ｓ－Ａ－Ｃ１およびＭ－Ｃ２またはＡ－Ｓ－Ｃ１およびＭ－Ｃ２のポリペプチド対(Ｎ末端からＣ末端)を含み；そしてＣ１およびＣ２は、それぞれ、Ｆｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であるかそれぞれ抗体の第一および第二重鎖であり；そして「－」は直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーである。
【0023】
ある実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号７または９またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0024】
ある実施態様において、第一、第二および第三ペプチドリンカーの少なくとも１つは、所望により配列番号１１～１６から選択される、開裂不可能なペプチドリンカーである。
【0025】
ある実施態様において、第一、第二および第三ペプチドリンカーの少なくとも１つは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター(ｕＰＡ)、マトリプターゼ、マトリクスメタロペプチダーゼ(ＭＭＰ)２またはＭＭＰ９の基質配列を含む開裂可能なペプチドリンカーである。例えば、開裂可能なペプチドリンカーは、(ｉ)ｕＰＡおよびＭＭＰ２両者、(ii)ｕＰＡおよびＭＭＰ９両者、(iii)ｕＰＡ、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９または(iv)ＭＭＰ２およびマトリプターゼの基質配列を含む。具体的実施態様において、開裂可能なペプチドリンカーは、配列番号１７～３６から選択されるアミノ酸配列を含む。開裂可能なペプチドリンカーは、腫瘍部位またはその周囲環境に位置する１以上のプロテアーゼにより開裂可能であり、開裂が、腫瘍部位または周囲環境でのプロドラッグの活性化をもたらす。
【0026】
他の態様において、本発明は、本プロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物；本プロドラッグをコードする１以上のポリヌクレオチド；該１以上のポリヌクレオチドを含む１以上の発現ベクター；および該ベクターを含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ｕＰＡ、マトリプターゼ、ＭＭＰ－２および／またはＭＭＰ－９をコードする遺伝子は、宿主細胞でノックアウトされる。
【0027】
また提供されるのは、本プロドラッグを製造する方法であって、哺乳動物細胞である宿主細胞を、該プロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、該プロドラッグを単離することを含む、方法である。
【0028】
他の態様において、本発明は、処置を必要とする患者における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、患者に治療有効量の本プロドラッグを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。患者は、例えば、ＨＩＶ感染または乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有し得る。また提供されるのは、このような処置に使用するためのＩＬ－１５プロドラッグおよびこのような処置のための医薬の製造におけるＩＬ－１５プロドラッグの使用である。
【0029】
本発明の他の特性、対象および利点は、以下の詳細な記載から明らかである。しかしながら、詳細な記載は、本発明の実施態様および態様を説明するものであるが、発明の説明のためのみに提供され、これを限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変化および修飾は、詳細な記載から当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１Ａ～Ｃは、担体部分としてＦｃドメインを有するＩＬ－１５プロドラッグの略図である。図１Ａは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドを示す。ＩＬ－１５ポリペプチドは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。図１Ｂは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。図１Ｃは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。全３配置において、Ｆｃドメインは、ノブ・イントゥ・ホール変異を含む。
【0031】
【図2】図２Ａ～Ｃは、担体部分としてＦｃドメインを有するＩＬ－１５プロドラッグの略図を示す。図２Ａは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインを示す。ＩＬ－１５ポリペプチドは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＮ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合する。図２Ｂは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＮ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合する。図２Ｃは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＮ末端に融合する。全３配置において、Ｆｃドメインは、ノブ・イントゥ・ホール変異を含む。
【0032】
【図3】図３Ａ～Ｃは、担体部分として抗体(２つの抗原結合部位を有する)を有するＩＬ－１５プロドラッグの略図を示す。図３Ａは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。図３Ｂは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドを示す。ＩＬ－１５ポリペプチドは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。図３Ｃは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により、開裂不可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。全３図において、抗体は、ノブ・イントゥ・ホール変異を含む。
【0033】
【図4】図４Ａおよび４Ｂは、担体部分として抗体を有するＩＬ－１５プロドラッグの略図である。抗体は、単一抗原結合部位を有する。図４Ａは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。図４Ｂは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドを示す。ＩＬ－１５ポリペプチドは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。両配置において、抗体はノブ・イントゥ・ホール変異を含み、マスキング部分は、抗体の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖にある。
【0034】
【図5】図５Ａおよび５Ｂは、担体部分として抗体を有するＩＬ－１５プロドラッグの略図である。抗体は単一抗原結合部分を有する。図５Ａは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５ポリペプチドを示す。ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。図５Ｂは、所望により開裂不可能なペプチドリンカーを介して、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドを示す。ＩＬ－１５ポリペプチドは、所望により開裂不可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合する。両配置において、抗体はノブ・イントゥ・ホール変異を含み、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＳｕｓｈｉドメインは、抗体の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖にある。
【0035】
【0036】
【図6B】図６Ｂは、図６Ａの分子の構造を示す。分子全て担体部分としてＦｃドメインを有する。ＪＲ３.６８.１、Ｓｕｓｈｉドメインは、開裂不可能なリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。ＩＬ－１５ポリペプチドは、開裂不可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。ＪＲ３.６８.２において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、開裂不可能なリンカーを介して、Ｆｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合する。Ｓｕｓｈｉドメインは、開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。ＪＲ３.６８.３において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、開裂不可能なリンカーを介して、一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。Ｓｕｓｈｉドメインは、開裂不可能なリンカーを介して、他のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合する。マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して、ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合する。ＪＲ３.６８.４およびＪＲ３.６８.５は、それぞれＪＲ３.６８.１およびＪＲ３.６８.２の活性化形態(構築物ではマスキング部分がデザインされなかった)である。
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、抗ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７由来ｓｃＦｖ(ｓｃＦｖ１またはｓｃＦｖ２)でマスクしたＩＬ－１５プロドラッグのＮＫ９２増殖アッセイ結果を示す。図１２Ａは、活性化可能ＩＬ－１５融合タンパク質の配列情報を示す。図１２Ｂは、ＮＫ９２増殖アッセイの結果を示す。対照Ｘ１：ＸｍＡｂ Ｆｃドメイン(ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ)に融合したＩＬ－１５／ＩＬ－１５－受容体アルファ複合体であるＸｍＡｂ(登録商標)２４３０６。Ｆｃ－ＩＬ－１５＊：マスキング部分としてＩＬ－２Ｒβ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を有する活性化可能ＩＬ－１５融合タンパク質。Ｆｃ－ＩＬ－１５：マスキング部分がないＦｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質。ＲＬＵ：相対発光単位。
【0045】
【0046】
【0047】
【図14】図１４Ｂ～Ｄは、活性化前後の活性化可能ＩＬ－１５融合タンパク質のＮＫ９２増殖アッセイ結果を示す。図１４Ｂは、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤによりマスクした野生型ＩＬ－１５の結果を示す。図１４Ｃは、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤでマスクしたＩＬ－１５変異タンパク質Ｑ１０８Ｅの結果を示す。図１４Ｄは、Ｓｕｓｈｉドメインがない活性化可能Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質(ＪＲ２.１４５.１)およびＳｕｓｈｉドメインとＩＬ－１５ポリペプチド部分の間に長いリンカーを有する活性化可能Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質(ＪＲ２.１４５.２)の結果を示す。対照Ｘ１：ＸｍＡｂ Ｆｃドメイン(ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ)に融合したＩＬ－１５／ＩＬ－１５－受容体アルファ複合体であるＸｍＡｂ(登録商標)２４３０６。対照Ｘ２：は、ＳｕｓｈｉドメインがないＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５変異タンパク質融合タンパク質である。
【発明を実施するための形態】
【0048】
発明の詳細な記載
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する単数表現は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数を含む。
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する単数表現は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数を含む。
【0049】
ここでの、値またはパラメータへの「約」の付加は、その値またはパラメータ自体と共にその変動値を含む(記載する)。例えば、「約Ｘ」なる記載は、「Ｘ」を含む。さらに、ある一連の数値の前の「約」の使用は、その記載される一連の数値の各々の「約」を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」なる記載は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」を記載することを意図する。
【0050】
用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは相互作用ポリペプチドのセットを意味し、抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、二重特異的または二特異的抗体、抗イディオタイプ抗体または二機能性ハイブリッド抗体)またはその抗原結合フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)または二重特異性抗体)、一本鎖抗体およびイムノアドヘシンなどのＦｃ含有ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗体は、重鎖アイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ)またはサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)の何れでもよい。ある実施態様において、抗体軽鎖アイソタイプ(例えば、カッパまたはラムダ)の何れでもよい。抗体は、ヒト、非ヒト(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたは他の非ヒト動物)、キメラ(例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を有する)またはヒト化(例えば、非ヒトＣＤＲおよびヒトフレームワークおよび定常領域を有する)であり得る。ある実施態様において、抗体は、誘導体化抗体である。
【0051】
用語「サイトカインアゴニストポリペプチド」は、野生型サイトカインまたはそのアナログをいう。野生型サイトカインのアナログは、野生型サイトカインと同じ生物学的特異性(例えば、同じ受容体に結合し、同じ標的細胞を活性化)を有するが、アナログの活性レベルは、野生型サイトカインと異なり得る。アナログは、例えば、野生型サイトカインの変異タンパク質(すなわち、変異ポリペプチド)であってよく、野生型サイトカインに対して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の変異を含み得る。
【0052】
用語「サイトカインアンタゴニスト」または「サイトカインマスク」は、サイトカインに結合し、それにより、アンタゴニストまたはマスクに結合されたまま、サイトカインが標的細胞表面のその受容体と結合するおよび／またはその生物学的機能を発揮するのを阻害する部分(例えば、ポリペプチド)をいう。サイトカインアンタゴニストまたはマスクの例は、サイトカインと接触するサイトカインの天然受容体の細胞外ドメイン由来のポリペプチドを含むが、これに限定されない。
【0053】
用語「有効量」または「治療有効量」は、その症状の１以上の改善、軽減、低減および／または遅延などの、特定の障害、状態または疾患の処置に十分な化合物または組成物の量をいう。癌などの疾患について、有効量は、癌の進展または進行の遅延(例えば、腫瘍増殖速度低減および／または腫瘍血管形成、転移または癌細胞の末梢臓器への浸潤緩徐化または阻止)、類上皮細胞数減少、癌寛解誘導(例えば、腫瘍縮小または根絶)および／または癌発生または再発阻止または遅延に十分な量であり得る。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。
【0054】
用語「機能的アナログ」は、対照分子と同じ生物学的特異性(例えば、同じリガンドに結合)および／または活性(例えば、標的細胞を活性化または阻害)を有する分子をいう。
【0055】
２個のポリペプチド配列に関する用語「融合した」または「融合」は、主鎖ペプチド結合を介する２個のポリペプチド配列の連結をいう。２個のポリペプチドは、直接または１以上のアミノ酸長のペプチドリンカーを介して融合され得る。融合ポリペプチドは、間のペプチドリンカーのコード配列を伴うまたは伴わず、２個の融合パートナーの各コード配列を含む、コード配列から組み換えテクノロジーにより製造され得る。ある実施態様において、融合は、化学的結合を含む。
【0056】
用語「薬学的に許容される添加物」は、組成物の成分をいうのに使用するとき、対象に有害な副作用なく、かつ原薬(ＡＰＩ)の生物活性に影響することなく、ヒト対象を含む対象の処置のために投与するのに適する添加物を意味する。
【0057】
用語「対象」は、哺乳動物をいい、ヒト、ペット(例えば、イヌまたはネコ)、家畜(例えば、ウシまたはウマ)、齧歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない。
【0058】
ここで使用する「処置」または「処置する」は、有益または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。有益または所望の臨床結果は、次に述べるものを含むが、それらに限定されない：疾患が原因の１以上の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患状態の軽減、疾患安定化(例えば、疾患の悪化または進行の阻止または遅延)、疾患の拡散(例えば、転移)の阻止または遅延、疾患再発の阻止または遅延、疾患の部分的または完全寛解の提供、疾患処置に必要な１以上の他の医薬の用量減少、患者のクオリティ・オブ・ライフの増加および／または生存延長。本発明の方法は、これら処置の態様の何れか１以上を意図する。
【0059】
ここに記載する種々の実施態様の性質の一つ、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成し得ることは理解される。記載する段落の表題は、構成上の目的のためのみであり、その下に記載される主題を限定すると解釈してはならない。
【0060】
Ｉ. ＩＬ－１５プロドラッグ
本発明は、インビボで代謝されて、活性ＩＬ－１５治療剤となるＩＬ－１５プロドラッグに関する。ＩＬ－１５プロドラッグは、副作用が少なく、良好なインビボＰＫプロファイル(例えば、長い半減期)および良好な標的特異性を有し、従前のＩＬ－１５治療剤と比較して、より効果的である。本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、凝集レベルを低減し、製造効率を改善し、それにより、融合分子および二特異的分子の製造の共通の課題を克服する、構成を有する。
本発明は、インビボで代謝されて、活性ＩＬ－１５治療剤となるＩＬ－１５プロドラッグに関する。ＩＬ－１５プロドラッグは、副作用が少なく、良好なインビボＰＫプロファイル(例えば、長い半減期)および良好な標的特異性を有し、従前のＩＬ－１５治療剤と比較して、より効果的である。本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、凝集レベルを低減し、製造効率を改善し、それにより、融合分子および二特異的分子の製造の共通の課題を克服する、構成を有する。
【0061】
本プロドラッグは、ＩＬ－１５ポリペプチド(Ａ)(すなわち、サイトカインアゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５サイトカイン部分)、任意のＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメイン(Ｓ)、マスキング部分(Ｍ)(すなわち、サイトカインアンタゴニスト)および担体部分(Ｃ)を含む。成分は、ペプチドリンカーを介して互いに操作上結合され、その一つは、標的部位でのプロテアーゼによる活性化により、マスキング部分およびＩＬ－１５サイトカイン部分が互いに脱離するように、開裂可能であり得る。ある実施態様において、例えば、ＩＬ－１５の受容体の細胞外ドメインまたはサイトカインに結合する抗体の結合フラグメントであり得るマスキング部分(ＩＬ－１５アンタゴニスト)は、開裂可能なリンカー(例えば、開裂可能なペプチドリンカー)を介して、サイトカイン部分、Ｓｕｓｈｉドメインまたは担体部分に結合する。他の実施態様において、マスキング部分は、開裂不可能なリンカーを介して他の部分に結合する。
【0062】
マスクは、ＩＬ－１５サイトカイン部分の生物学的機能を、マスクがそれに結合している間阻害する。ある実施態様において、本プロドラッグのマスキング部分は、ＩＬ－１５ポリペプチドのＩＬ－２Ｒβおよび／またはγ鎖相互作用ドメインに位置するエピトープに特異的に結合する。マスキング部分の阻害効果は、プロドラッグにおける開裂可能なリンカーのプロテアーゼ消化により除去され、マスキング部分とサイトカイン部分が分離することが可能となる。ある実施態様において、本プロドラッグのマスキング部分は、ＩＬ－１５ポリペプチド(Ａ)のＩＬ－１５Ｒαへの結合を遮断または妨害しない。プロドラッグは、リンカーの開裂により患者の標的部位(例えば、腫瘍部位または周囲環境または感染部位)で活性化され、続いてプロドラッグの残部サイトカインマスクまたはＩＬ－１５サイトカイン部分が放出され、予めマスクされたＩＬ－１５サイトカイン部分が露出され、ＩＬ－１５サイトカイン部分を、標的細胞上のその受容体と結合させ、標的細胞にその生物学的機能を発揮させる。ある実施態様において、プロドラッグのための担体は、標的部位で抗原に結合する、抗体などの抗原結合部分である。
【0063】
本発明のＩＬ－１５プロドラッグのある実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは、ペプチドリンカー(開裂不可能または開裂可能)を介して、担体、マスキング部分および／またはＩＬ－１５サイトカイン部分と融合される。ある実施態様において、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、ペプチドリンカー(開裂不可能または開裂可能)を介して、担体部分、マスキング部分および／またはＳｕｓｈｉドメインと融合する。ある実施態様において、マスキング部分は、ペプチドリンカー(開裂不可能または開裂可能)を介して、担体部分、サイトカイン部分および／またはＳｕｓｈｉドメインと融合する。
【0064】
ある実施態様において、本プロドラッグは、体内の担体により標的とされる標的部位で、代謝されて炎症促進性である活性ＩＬ－１５サイトカインとなる。さらなる実施態様において、プロドラッグにおける担体は、プロドラッグが患者の腫瘍部位に送達され、サイトカインマスクを担体またはサイトカイン部分に連結するリンカーの開裂により局所的に(例えば、腫瘍微小環境内またはその近位)代謝され、炎症促進性サイトカイン部分を、標的細胞上のその受容体と相互作用できるようにし、局所的に標的免疫細胞を刺激するように、腫瘍抗原をターゲティングする抗体である。
【0065】
Ａ. プロドラッグのＩＬ－１５部分
本ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、野生型ヒトＩＬ－１５ポリペプチド(配列番号２)などの野生型ＩＬ－１５ポリペプチドまたは野生型ＩＬ－１５と比較してＩＬ－２Ｒβ(ＣＤ１２２)への親和性が低減されたヒト野生型ＩＬ－１５由来のＩＬ－１５変異タンパク質などのＩＬ－１５変異タンパク質であり得る。ＩＬ－１５変異タンパク質は、野生型ＩＬ－１５と比較して、ＣＤ１２２または二量体ＩＬ－２Ｒへの親和性が有意に減少されている。
本ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、ＩＬ－１５サイトカイン部分は、野生型ヒトＩＬ－１５ポリペプチド(配列番号２)などの野生型ＩＬ－１５ポリペプチドまたは野生型ＩＬ－１５と比較してＩＬ－２Ｒβ(ＣＤ１２２)への親和性が低減されたヒト野生型ＩＬ－１５由来のＩＬ－１５変異タンパク質などのＩＬ－１５変異タンパク質であり得る。ＩＬ－１５変異タンパク質は、野生型ＩＬ－１５と比較して、ＣＤ１２２または二量体ＩＬ－２Ｒへの親和性が有意に減少されている。
【0066】
ある実施態様において、ＩＬ－１５部分は、マスクされたとき、生物活性は少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍減少され；またはＥＣ５０値は少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍増加している。
【0067】
ある実施態様において、ＩＬ－１５部分は、ヒトＩＬ－１５のＮ１、Ｎ４、Ｉ６、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｅ４６、Ｄ６１、Ｔ６２、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｉ６８、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｖ６３、Ｌ６６、Ｉ６７、Ａ７０、Ｎ７１、Ｑ１０８、Ｎ１１２の位置に少なくとも１、２、３、４または５の変異を含む、ＩＬ－１５変異タンパク質である。ＩＬ－１５変異タンパク質の例は、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ａ、Ｎ４Ｄ、Ｉ６Ｔ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、ＤＡＴ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｄ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｔ６２Ｌ、Ｔ６２Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６４Ｌ、Ｅ６４Ｋ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｌ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６８Ｓ、Ｉ６８Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｑ１０８ＥおよびＮ１１２Ａから選択される１以上の変異を有するものである。ある実施態様において、ＩＬ－１５部分は、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１およびＬ５２から選択される変異または位置を含む。特に断らない限り、ここに記載するＩＬ－１５およびＩＬ－１５変異タンパク質の全残基番号は、配列番号２のナンバリングに従う。他の実施態様において、ＩＬ－１５部分は、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0068】
具体的実施態様において、ＩＬ－１５変異タンパク質は、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８ＥおよびＮ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅから選択される変異を含む。
【0069】
Ｂ. ＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメイン
ある実施態様において、本ＩＬ－１５プロドラッグは、ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインを含む。Ｓｕｓｈｉドメインは、担体に直接または ＩＬ－１５サイトカイン部分に、所望によりリンカー(例えば、開裂不可能または開裂可能なペプチドリンカー)を介して融合し得る。マスキング部分は、開裂可能または開裂不可能なペプチドリンカーを介して、Ｓｕｓｈｉドメインまたは担体に融合し得る。特定の実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは担体に融合し、サイトカインはＳｕｓｈｉドメインにペプチドリンカーを介して融合している。本ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、Ｓｕｓｈｉドメインは、野生型Ｓｕｓｈｉドメインまたは配列番号７もしくは９のアミノ酸配列を含むＳｕｓｈｉドメインであり得る。他の実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号７または配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本ＩＬ－１５プロドラッグは、ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインを含む。Ｓｕｓｈｉドメインは、担体に直接または ＩＬ－１５サイトカイン部分に、所望によりリンカー(例えば、開裂不可能または開裂可能なペプチドリンカー)を介して融合し得る。マスキング部分は、開裂可能または開裂不可能なペプチドリンカーを介して、Ｓｕｓｈｉドメインまたは担体に融合し得る。特定の実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは担体に融合し、サイトカインはＳｕｓｈｉドメインにペプチドリンカーを介して融合している。本ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、Ｓｕｓｈｉドメインは、野生型Ｓｕｓｈｉドメインまたは配列番号７もしくは９のアミノ酸配列を含むＳｕｓｈｉドメインであり得る。他の実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号７または配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0070】
ある実施態様において、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ(ＩＬ－１５Ｒα)タンパク質は、配列番号８に示すアミノ酸配列を有する。ある例において、ヒトＩＬ－１５Ｒαのコード配列は、配列番号１３７に示す。ここに概説するプロドラッグのＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号８のＳｕｓｈｉドメイン(例えば、配列番号８のアミノ酸３１～９５または３１～１０５)または換言すると、配列番号９または配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるものである。ある実施態様において、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は配列番号７のアミノ酸配列およびＤ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８およびＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択されるアミノ酸挿入を有し、ここで、アミノ酸位置は、完全長ヒトＩＬ－１５Ｒαタンパク質または配列番号８に対するものである。例えば、Ｄ、Ｐ、Ａ、ＤＰ、ＤＣ、ＤＰＡ、ＤＰＣまたはＤＣＡなどのアミノ酸を、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質(例えば、配列番号９)のＣ末端に加え得る。ある実施態様において、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列およびＫ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０ＣおよびＬ４２Ｃからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、配列番号９に対するものである。ある実施態様において、ＩＬ－１５アナログおよびＳｕｓｈｉドメインは、それぞれＥ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８；Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８；Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ；Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ；Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ；Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ；Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ；Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ；およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換または付加のセットを有する(ＩＬ－１５における変異はコロンの前に示す；そしてＳｕｓｈｉドメインにおける変異はコロンの後に示す)。
【0071】
Ｃ. プロドラッグのマスキング部分
本プロドラッグのサイトカインアンタゴニスト、すなわち、マスキング部分は、プロドラッグにおけるサイトカイン部分と結合し、サイトカイン部分をマスキングし、その生物学的機能を阻害するペプチドまたは抗体または抗体フラグメントを含み得る。ある実施態様において、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドに結合し、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの生物活性を阻害する抗体の抗原結合部分または結合フラグメントを含む。
本プロドラッグのサイトカインアンタゴニスト、すなわち、マスキング部分は、プロドラッグにおけるサイトカイン部分と結合し、サイトカイン部分をマスキングし、その生物学的機能を阻害するペプチドまたは抗体または抗体フラグメントを含み得る。ある実施態様において、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドに結合し、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドの生物活性を阻害する抗体の抗原結合部分または結合フラグメントを含む。
【0072】
一例として、ＩＬ－１５アンタゴニストは、ＩＬ－１５に結合し、その受容体へのＩＬ－１５部分の結合を妨害し、マスクされているときＩＬ－１５部分の生物活性を減少させる、ペプチドおよび抗体を含み得る。ある実施態様において、ＩＬ－１５アンタゴニストは、ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγ細胞外ドメインまたはヒトＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγ由来のものなどのその機能的アナログ(例えば、配列番号３～６の一つ)を含む。ある実施態様において、ＩＬ－１５アンタゴニストは、ペプチドライブラリーのスクリーニングにより同定されたペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－１５アンタゴニストは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５変異タンパク質のＩＬ－１５受容体への結合を遮断する抗体またはそのフラグメントを含む。他の実施態様において、アンタゴニストは、ＩＬ－１５ポリペプチドの生物活性を阻害する。ある実施態様において、アンタゴニストは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは当分野で知られる他のタイプの抗体フラグメントを含む。好ましい実施態様において、抗体フラグメントは、ＩＬ－１５に特異的なｓｃＦｖである。他の好ましい実施態様において、アンタゴニストは、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドのβおよび／またはγ鎖相互作用ドメインに位置するエピトープに特異的に結合する。具体的実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１５ポリペプチドのＩＬ－１５Ｒαへの結合を遮断または妨害しない。一例として、ＩＬ－１５結合抗体は、１４６Ｂ７、１４６Ｈ５、４０４Ｅ４および４０４Ａ８から選択され得る。ある実施態様において、ｓｃＦｖまたはＦａｂ ＩＬ－１５アンタゴニストは、１４６Ｂ７、１４６Ｈ５、４０４Ｅ４および４０４Ａ８から選択される抗ＩＬ－１５抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン；および１４６Ｂ７、１４６Ｈ５、４０４Ｅ４および４０４Ａ８から選択される抗ＩＬ－１５抗体の軽鎖からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含み、その全てが、ＷＯ２００３／０１７９３５Ａ２に記載される。
【0073】
ある実施態様において、ＩＬ－１５アンタゴニストは、それぞれ配列番号１００、１０１および１０２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン；およびそれぞれ配列番号１０３、１０４および１０５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。ある実施態様において、配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ３ドメインは、そのＣｙｓ残基に置換変異を含む。配列番号１０２のＣＤＲ３ドメイン内のＣｙｓ残基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＧｌｎに変異され得る。他の実施態様において、ＣＤＲ３ドメインは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、アンタゴニストまたはマスキング部分は、配列番号１０７または配列番号１０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０８もしくは１２３または配列番号１０８もしくは１２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、ｓｃＦｖまたはＦａｂである。ある特定の部分において、マスキング部分は、配列番号１１０または１２４のアミノ酸配列を含む。
【0074】
Ｄ. プロドラッグの担体部分
本プロドラッグの担体部分は、抗原結合部分または抗原結合部分ではない部分であり得る。担体部分はサイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善し得て、またサイトカインアゴニストポリペプチドを、腫瘍部位など体内の標的部位に指向させ得る。
本プロドラッグの担体部分は、抗原結合部分または抗原結合部分ではない部分であり得る。担体部分はサイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善し得て、またサイトカインアゴニストポリペプチドを、腫瘍部位など体内の標的部位に指向させ得る。
【0075】
ある実施態様において、担体部分(Ｃ)は、第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２つの異なる重鎖)からなるＦｃドメインであり、ここで、該ポリペプチド鎖は、次の対の一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端)を含み：
ａ) Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ａ)；
ｂ) Ｆ１－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ｂ)；および
ｃ) Ｆ１－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ｃ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２は、ヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
ａ) Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ａ)；
ｂ) Ｆ１－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ｂ)；および
ｃ) Ｆ１－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図１Ｃ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２は、ヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
【0076】
ある実施態様において、担体部分(Ｃ)は、第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２つの異なる重鎖)からなるＦｃドメインであり、ここで、該ポリペプチド鎖は、次の対の一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端)を含み：
ａ) Ａ－ＰＬ１－Ｓ－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｆ２(図２Ａ)；
ｂ) Ｓ－ＰＬ１－Ａ－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｆ２(図２Ｂ)；および
ｃ) Ａ－ＰＬ１－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｓ－Ｆ２(図２Ｃ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２は、ヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
ａ) Ａ－ＰＬ１－Ｓ－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｆ２(図２Ａ)；
ｂ) Ｓ－ＰＬ１－Ａ－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｆ２(図２Ｂ)；および
ｃ) Ａ－ＰＬ１－Ｆ１、Ｍ－ＣＬ－Ｓ－Ｆ２(図２Ｃ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２は、ヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
【0077】
ある実施態様において、担体部分(Ｃ)は、抗体の２つの軽差、第一抗体重鎖および第二抗体重鎖を含む抗体であり、ここで
ａ) 第一重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ１－ＣＬ－Ｍを含み；そして
ｂ) 第二重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ２－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａを含み、
ここで、Ｃ１およびＣ２は抗体重鎖であり；該ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。他の実施態様において、上記第一および第二重鎖の順番が逆である(図３Ａおよび３Ｂ)。
ａ) 第一重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ１－ＣＬ－Ｍを含み；そして
ｂ) 第二重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ２－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａを含み、
ここで、Ｃ１およびＣ２は抗体重鎖であり；該ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。他の実施態様において、上記第一および第二重鎖の順番が逆である(図３Ａおよび３Ｂ)。
【0078】
ある実施態様において、担体部分(Ｃ)は、抗体の２つの軽差、第一抗体重鎖および第二抗体重鎖を含む抗体であり、ここで
ａ) 第一重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ１－Ａを含み；そして
ｂ) 第二重鎖ポリペプチド鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ２－ＰＬ１－Ｓ－ＣＬ－Ｍを含み、
ここで、Ｃ１およびＣ２は抗体重鎖であり；該ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである(図３Ｃ)。
ａ) 第一重鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ１－Ａを含み；そして
ｂ) 第二重鎖ポリペプチド鎖は分子式(Ｎ末端からＣ末端)Ｃ２－ＰＬ１－Ｓ－ＣＬ－Ｍを含み、
ここで、Ｃ１およびＣ２は抗体重鎖であり；該ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである(図３Ｃ)。
【0079】
ある実施態様において、本発明のプロドラッグは３つのポリペプチド鎖 － 一つの抗体軽鎖と２つの重鎖 － を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は抗体軽鎖可変領域であり、第一重鎖は抗体の重鎖可変および定常領域を含み、第二重鎖はＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、第一および第二重鎖は、次の対の一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端)を含み：
ａ) Ｆ－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、ＨＣ－ＣＬ－Ｍ(図４Ａ)；
ｂ) Ｆ－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、ＨＣ－ＣＬ－Ｍ(図４Ｂ)；
ｃ) ＨＣ－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、Ｆ－ＣＬ－Ｍ(図５Ａ)；および
ｄ) ＨＣ－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ－ＣＬ－Ｍ(図５Ｂ)。
ここで、ＦはＦｃドメインのサブユニットであり(ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む)；ＨＣは、該軽鎖と抗原結合部分を形成する抗体の重鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
ａ) Ｆ－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、ＨＣ－ＣＬ－Ｍ(図４Ａ)；
ｂ) Ｆ－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、ＨＣ－ＣＬ－Ｍ(図４Ｂ)；
ｃ) ＨＣ－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｓ、Ｆ－ＣＬ－Ｍ(図５Ａ)；および
ｄ) ＨＣ－ＰＬ１－Ｓ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ－ＣＬ－Ｍ(図５Ｂ)。
ここで、ＦはＦｃドメインのサブユニットであり(ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む)；ＨＣは、該軽鎖と抗原結合部分を形成する抗体の重鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能なペプチドリンカーであり；ＳはＳｕｓｈｉドメインであり；そしてＡはＩＬ－１５ポリペプチドである。
【0080】
１. 抗原結合担体部分
担体部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合部分は、２つの重鎖と２つの軽鎖の完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は、二特異的抗原結合部分であり、２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドにさらなるかつおそらく相乗的である治療有効性を提供し得る。
担体部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合部分は、２つの重鎖と２つの軽鎖の完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は、二特異的抗原結合部分であり、２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドにさらなるかつおそらく相乗的である治療有効性を提供し得る。
【0081】
サイトカイン(ＩＬ－１５)ポリペプチドおよびそのマスクは、抗原結合部分の軽鎖および／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。一例として、サイトカイン(例えば、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびそのマスクは、抗体重鎖またはその抗原結合フラグメントまたは抗体軽鎖またはその抗原結合フラグメントに融合し得る。ある実施態様において、サイトカイン(ＩＬ－１５)ポリペプチドは、抗体の一方または両方の重鎖のＣ末端に融合し、サイトカインのマスク は、開裂可能または開裂不可能なペプチドリンカーを介して、重鎖の他の末端またはサイトカインアゴニストポリペプチドのＣ末端に融合する。ある実施態様において、サイトカイン(ＩＬ－１５)ポリペプチドは、抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合し、サイトカインのマスクは、開裂可能なペプチドリンカーを介して抗体の他方の重鎖のＣ末端と融合し、ここで、２つの重鎖は、所望により２つの異なる重鎖の特異的対形成を可能にする変異を含む。
【0082】
Ｆｃ融合ポリペプチドまたは二特異的抗体のヘテロ二量体を形成する戦略は、周知である(例えば、Spies et al., Mol Imm. (2015) 67(2)(A):95-106参照)。例えば、プロドラッグの２つの重鎖ポリペプチドは、「ノブ・イントゥ・ホール」変異を介して安定なヘテロ二量体を形成し得る。「ノブ・イントゥ・ホール」変異は、抗体重鎖のヘテロ二量体の形成を促進するために行われ、二特異的抗体の製造に一般に使用される(例えば、米国特許８,６４２,７４５参照)。例えば、抗体のＦｃドメインは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を導入することによる、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用できる(例えば、Merchant et al., Nature Biotech (1998)16:677-81参照)。他の実施態様において、抗体部分は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。ある実施態様において、抗体部分は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ(またはＥ３５６Ｃ)、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み、一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ変異および他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を有し、鎖間ジスルフィド架橋を形成する(ナンバリングは、常にＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う；Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されるような他のノブ・イントゥ・ホールテクノロジーをこれらとは別にまたはこれらに加えて使用し得る。故に、抗体部分のノブ・イントゥ・ホール変異の他の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインのＲ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｅ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインのＤ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ変異を有する(ＥＵナンバリング)。
【0083】
ある実施態様において、プロドラッグにおける抗体部分は、ＦｃドメインにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)変異を含む。ＬＡＬＡ変異は、補体結合および固定ならびにＦｃγ依存的ＡＤＣＣを排除する(例えば、Hezareh et al. J. Virol. (2001) 75(24):12161-8参照)。さらなる実施態様において、ＬＡＬＡ変異は、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えて、抗体部分に存在する。
【0084】
ある実施態様において、抗体部分は、ＦｃドメインにＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ(「ＹＴＥ」)変異を含む。ＹＴＥ変異は、血清半減期、組織分布およびＩｇＧ１活性の同時調節を可能にする(Dall'Acqua et al., J Biol Chem. (2006) 281: 23514-24;およびRobbie et al., Antimicrob Agents Chemother. (2013) 57(12):6147-53)。さらなる実施態様において、ＹＴＥ変異は、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えて、抗体部分に存在する。具体的実施態様において、抗体部分は、ＹＴＥ、ＬＡＬＡおよびノブ・イントゥ・ホール変異またはこれらの何らかの組み合わせを有する。
【0085】
抗原結合部分は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの細胞の表面の抗原に結合するかまたはサイトカインに結合する。例えば、抗原結合部分はＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４またはＴＧＦ－ベータに結合し得て、抗体であり得る。抗体は、免疫細胞を活性化する能力を有し、その抗癌活性を増強し得る。
【0086】
抗原結合部分は、腫瘍細胞の表面の抗原に結合し得る。例えば、抗原結合部分はＦＡＰアルファ、５Ｔ４、Ｔｒｏｐ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ－２、ＥＧＦＲ、クローディン１８.２、ＤＬＬ－３、ＧＣＰ３または癌胎児性抗原(ＣＥＡ)に結合し得て、抗体であり得る。抗体は、ＡＤＣＣ活性を有しても有していなくてもよい。抗体はまた、さらに細胞毒性薬物にコンジュゲートされ得る。
【0087】
ある実施態様において、抗原結合部分は、グアニル酸シクラーゼＣ(ＧＣＣ)、炭水化物抗原１９－９(ＣＡ１９－９)、糖タンパク質Ａ３３(ｇｐＡ３３)、ムチン１(ＭＵＣ１)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ１－Ｒ)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２(ＨＥＲ２)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＨＥＲ３)、デルタ様タンパク質３(ＤＬＬ３)、デルタ様タンパク質４(ＤＬＬ４)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、グリピカン－３(ＧＰＣ３)、ｃ－ＭＥＴ、血管内皮細胞増殖因子受容体１(ＶＥＧＦＲ１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ネクチン－４、Ｌｉｖ－１、糖タンパク質ＮＭＢ(ＧＰＮＭＢ)、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔｒｏｐ－２、炭酸脱水酵素IX(ＣＡ９)、エンドセリンＢ受容体(ＥＴＢＲ)、前立腺の６回膜貫通型上皮性抗原１(ＳＴＥＡＰ１)、葉酸受容体アルファ(ＦＲ－α)、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６(ＳＬＩＴＲＫ６)、炭酸脱水酵素VI(ＣＡ６)、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３(ＥＮＰＰ３)、メソテリン、栄養芽細胞糖タンパク質(ＴＰＢＧ)、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル制御タンパク質アルファ(ＳＩＲＰα)、クローディン１８.２、クローディン６、ＢＣＭＡまたはＥＰＣＡＭに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＤＬＬ３の上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＤＬＬ３のデルタ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ２(ＤＳＬ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３の３７４番目のアミノ酸の後に位置するエピトープに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３のヘパリン硫酸グリカンに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分クローディン１８.２に結合し、クローディン１８.１に結合しない。ある実施態様において、抗原結合部分は、クローディン１８.２への結合親和性より少なくとも１０倍弱く、クローディン１８.１に結合する。
【0088】
ある実施態様において、抗原結合部分(担体部分)は、当分野でＰＤ－１に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激するように、ＰＤ－１とそのリガンド(ＰＤ－Ｌ１)の相互作用を妨害する、抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ－１を標的とし、本発明で有用であり得る抗体は、ニボルマブ(ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb)、ペムブロリズマブ(ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Merck)、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１(ShangHai JunShi)、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２(Tesaro, Inc.)、ピディリズマブ(抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation)、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７(BeiGene)および／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０(ShangHai HengRui)、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０(Regeneron)、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６(Bristol-Myers Squibb)および／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１(Novartis)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＰＤ－１抗体はクローン：ＲＭＰ１－１４(ラットＩｇＧ)由来である － BioXcell cat# BP0146。他の適当な抗ＰＤ－１抗体は、米国特許８,００８,４４９に開示のものを含む。ある実施態様において、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１との相互作用を妨害し、それにより、免疫活性を高める。ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当分野で知られるあらゆる抗体が、ここに記載する組み合わせ処置方法における使用に適する。例として、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９(Bristol-Myers Squibb)およびＭＰＤＬ３２８０Ａ(Genetech；現在人で治験中)を含む。他の適当なＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、米国特許７,９４３,７４３に開示される。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0089】
ある実施態様において、ここで、担体は、ＡＳＫＢ１２９６、アベルマブ、アテゾリズマブおよびデュルバルマブから選択される抗体である。
【0090】
ある実施態様において、担体は、癌細胞に発現される抗原に結合する抗体である。ある実施態様において、担体抗体はＡＤＣＣ活性を有する。ある実施態様において、担体抗体は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、Ｔｒｏｐ－２、ＧＰＣ３、クローディン１８.２、クローディン６、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４７およびＶＥＧＦＲ２から選択される抗原に結合する。
【0091】
ある実施態様において、担体は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－４、ＴＩＭ－３、ＣＤ４７およびＴＩＧＩＴから選択される２つの抗原に結合する二特異的抗体である。
【0092】
ある実施態様において、担体抗体はヒトＰＤ－１に結合し、ここで、ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、トリパリマブ、シンチリマブまたはティスレリズマブの重鎖および軽鎖に由来するものと同じ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインおよび軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【0093】
ある実施態様において、担体抗体はヒトＰＤ－１に結合し、ここで、軽鎖は、配列番号５５および５６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、第一重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号５４、６０または６１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そしてここで、第二重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号５２、５３、５８、５９、６２、６３および６９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0094】
ある実施態様において、抗体はヒトＰＤ－１に結合し、ここで、軽鎖は、配列番号５５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、第一重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そしてここで、第二重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６４、６５、６７および６８から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0095】
ある実施態様において、担体抗体はＰＤ－１に結合し、ここで、軽鎖は、配列番号５５および５６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、第一重鎖は、配列番号８０、８１または８７から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そしてここで、第二重鎖は、配列番号５２、５３、５８、５９、６２、６３および６９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0096】
ある実施態様において、担体抗体はＰＤ－１に結合し、ここで、軽鎖は、配列番号５５および５６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、第一重鎖は、配列番号５４、６０または６１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そしてここで、第二重鎖は、配列番号８２、８３、８４、８５および８６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0097】
ある実施態様において、担体抗体はＰＤ－Ｌ１に結合し、ここで、軽鎖は、配列番号５０または５１と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、第一重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号４７、４８または４９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そしてここで、第二重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号４５または４６と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0098】
ある実施態様において、担体抗体は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、Ｔｒｏｐ－２、ＧＰＣ３、クローディン１８.２、クローディン６、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ３０およびＶＥＧＦＲ２から選択される２つの抗原に結合する二特異的抗体である。ある実施態様において、担体はｃＭｅｔおよびＥＧＦＲに結合する二特異的抗体であり；ここで、ＥＧＦＲ結合ドメインは、配列番号８８または９０由来の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号８９または９１由来の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0099】
ある実施態様において、担体部分はＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、ここで、第一ポリペプチドは配列番号３７、７０～７２および７３から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖は、配列番号３８、３９、７５～７８および７９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0100】
ある実施態様において、担体部分はＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、ここで、第一ポリペプチドは、配列番号８０、８１または８７に示すものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第二ポリペプチド鎖は、配列番号８２～８５および８６から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0101】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＣＴＬＡ－４を標的とする抗体の例は、ＦＤＡ承認されているイピリムマブ(ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Bristol-Myers Squibb)および現在ヒト治験中であるトレメリムマブ(チシリムマブ、ＣＰ－６７５、２０６、Pfizer)を含む。ＣＴＬＡ－４を標的とする他の適当な抗体は、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許６,９８４,７２０、６,６８２,７３６８および米国特許出願２００２／００３９５８１、２００２／００８６０１４および２００５／０２０１９９４に開示される。ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0102】
ある実施態様において、組み合わせ治療は、ＬＡＧ－３と結合し、ＭＨＣクラスII分子とのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体を含む。ＬＡＧ－３を標的とする抗体の例は、現在ヒト治験中である、ＩＭＰ３２１(Immutep)である。ＬＡＧ－３を標的とする他の適当な抗体は、米国特許出願２０１１／０１５０８９２に開示される。ＬＡＧ－３に結合し、ＭＨＣクラスII分子とのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0103】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＴＩＭ－３に結合し、ガレクチン９とのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＴＩＭ－３を標的とする適当な抗体は、米国特許出願２０１３／００２２６２３に開示される。ＴＩＭ－３に結合し、ガレクチン９とのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0104】
ある実施態様において、抗原結合部分は、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合し、ＣＤ１３７Ｌとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。４－１ＢＢ／ＣＤ１３７と結合し、ＣＤ１３７Ｌまたは他のリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0105】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＩＴＲに結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＧＩＴＲと結合し、ＧＩＴＲＬまたは他のリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0106】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＯＸ４０に結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＯＸ４０と結合し、ＯＸ４０Ｌまたは他のリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0107】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＣＤ４０に結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＣＤ４０と結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0108】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＩＣＯＳに結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＩＣＯＳと結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0109】
ある実施態様において、抗原結合部分は、ＣＤ２８に結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害する、当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ＣＤ２８と結合し、そのリガンドとのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答もしくは全体的抗腫瘍活性をもたらす免疫刺激応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適することを、当業者は理解する。
【0110】
抗原結合部分(担体部分)のさらなる例は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)および抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)または抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)またはそのフラグメントの抗体重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体重鎖を有する。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)またはそのフラグメントの抗体軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体軽鎖を有する。抗原結合部分はＩＬ－１５ポリペプチドに融合される。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３または抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６の６つの相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。
【0111】
いくつかのＣＤＲ線引きが当分野で知られ、ここに包含される。当業者は、重鎖または軽鎖可変領域の配列に基づき、ＣＤＲのある線引きを容易に決定できる。「Ｋａｂａｔ」ＣＤＲは、配列可変性に基づき、最も一般に使用される(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「Ｃｈｏｔｈｉａ」ＣＤＲは、構造ループの位置をいう(Chothia & Lesk, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., vol. 196, pp. 901-917 (1987))。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの妥協点を表す「ＡｂＭ」ＣＤＲは、Oxford Molecular’s AbM抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「接触」ＣＤＲは、入手可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＣＤＲの各々からの残基を、一般的抗体ナンバリングスキームを参照して、下表１に示す。ここで特に断らない限り、抗体のアミノ酸番号は、ＣＤＲ線引きがＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭまたは接触スキームを参照してなされたときを含み、Kabat et al., supraに記載のとおりＫａｂａｔナンバリングスキームを参照する。このナンバリングシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク領域(ＦＲ)またはＣＤＲの短縮または挿入に対応して少ないまたは多いアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に一アミノ酸挿入(Ｋａｂａｔによる残基５２ａ)および重鎖ＦＲ残基８２後に挿入残基(例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)に含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、ある抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列の抗体の配列の相同性の領域と整列することにより決定し得る。
【表1】
【0112】
ある実施態様において、ＣＤＲは「拡張ＣＤＲ」であり、異なるスキームに従い始まりまたは終わる領域を包含する。例えば、拡張ＣＤＲは次のとおりであり得る：Ｌ２４－Ｌ３６、Ｌ２６－Ｌ３４またはＬ２６－Ｌ３６(ＶＬ－ＣＤＲ１)；Ｌ４６－Ｌ５２、Ｌ４６－Ｌ５６またはＬ５０－Ｌ５５(ＶＬ－ＣＤＲ２)；Ｌ９１－Ｌ９７(ＶＬ－ＣＤＲ３)；Ｈ４７－Ｈ５５、Ｈ４７－Ｈ６５、Ｈ５０－Ｈ５５、Ｈ５３－Ｈ５８またはＨ５３－Ｈ６５(ＶＨ－ＣＤＲ２)；および／またはＨ９３－Ｈ１０２(ＶＨ－ＣＤＲ３)。
【0113】
ある実施態様において、抗原結合部分はＥＧＦＲに結合し、配列番号８８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号８９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、配列番号８８からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号８９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0114】
ある実施態様において、抗原結合部分はＥＧＦＲに結合し、配列番号９０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号９１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、配列番号９０からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号９１からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0115】
ある実施態様において、抗原結合部分はｃ－ＭＥＴに結合し、配列番号９２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号９３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、配列番号９２からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号９３からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0116】
ある実施態様において、抗原結合部分はＧＰＣ３に結合し、配列番号９４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号９５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、配列番号９４からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号９５からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0117】
ある実施態様において、抗原結合部分は５Ｔ４に結合し、配列番号９８または９９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号９６または９７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインまたはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、配列番号９８または９９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号９６または９７からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0118】
ある実施態様において、抗原結合部分はＴｒｏｐ－２に結合し、ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ(配列番号１２５)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ(配列番号１２６)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２およびＱＱＨＹＩＴＰＬＴ(配列番号１２７)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；およびＮＹＧＭＮ(配列番号１２８)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ(配列番号１２９)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２およびＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ(配列番号１３０)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【0119】
ある実施態様において、抗原結合部分はメソテリンに結合し、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ(配列番号１３１)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＤＴＳＫＬＡＳ(配列番号１３２)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２およびＱＱＷＳＧＹＰＬＴ(配列番号１３３)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；およびＧＹＴＭＮ(配列番号１３４)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ(配列番号１３５)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ(配列番号１３６)のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【0120】
ある実施態様において、抗原結合部分は、１つ、２つまたは３つの抗原結合ドメインを含む。例えば、抗原結合部分は二特異的であってよく、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、５Ｔ４、ＦＡＰアルファ、Ｔｒｏｐ－２、ＧＰＣ３、ＶＥＧＦＲ２、クローディン１８.２およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される２つの異なる抗原に結合する。ある実施態様において、二特異的抗原結合部分は同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。例えば、二特異的抗体は、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープに結合し得る。
【0121】
２. 他の担体部分
他の非抗原結合担体部分を、本プロドラッグに使用し得る。例えば、抗体Ｆｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子が使用され得る。
他の非抗原結合担体部分を、本プロドラッグに使用し得る。例えば、抗体Ｆｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子が使用され得る。
【0122】
一例として、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＳｕｓｈｉドメインおよびＩＬ－１５アンタゴニストを抗体Ｆｃドメインに融合して、Ｆｃ融合タンパク質を形成させ得る。ある実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインを、所望によりＦｃドメインの重鎖の一方のＣ末端またはＮ末端に融合し、ＩＬ－１５ポリペプチドを開裂不可能なリンカーを介してＳｕｓｈｉドメインのＣ末端またはＮ末端に融合し、マスキング部分を、開裂可能なペプチドまたは開裂不可能なリンカーを介して、Ｆｃドメインの他方の重鎖のＣ末端またはＮ末端に融合する。ある実施態様において、Ｆｃドメインの重鎖の各々は、それらの対形成を可能とする変異を含む。ある実施態様において、変異はノブ・イントゥ・ホール、ＹＴＥおよび／またはＬＡＬＡ変異であり得る。
【0123】
プロドラッグの担体部分は、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)またはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、アルブミンまたはアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントと約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９.５％以上または約９９.８％以上同一である。
【0124】
ある実施態様において、担体部分は、約１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１４０以上、１６０以上、１８０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上または５５０以上のアミノ酸長であるアルブミンフラグメント(例えば、ヒト血清アルブミンフラグメント)を含む。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは、約１０アミノ酸～約５８４アミノ酸長(例えば約１０～約２０、約２０～約４０、約４０～約８０、約８０～約１６０、約１６０～約２５０、約２５０～約３５０、約３５０～約４５０または約４５０～約５５０アミノ酸長)である。ある実施態様において、アルブミンフラグメンは、Ｓｕｄｌｏｗ ＩドメインまたはそのフラグメントまたはＳｕｄｌｏｗ IIドメインまたはそのフラグメントを含む。
【0125】
Ｄ. プロドラッグのリンカー成分
ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＳｕｓｈｉドメインは、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに担体部分と融合され得る。ペプチドリンカー開裂不可能であり得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、配列番号１１～１６から選択される。具体的実施態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号１３)を含む。
ある実施態様において、ＩＬ－１５ポリペプチド(Ａ)は、ペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)に融合される。ペプチドリンカーは、少なくとも２５、３０または３５アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、２５～４５アミノ酸であり得る。他の実施態様において、ペプチドリンカーは、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５アミノ酸を有する。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ(配列番号１３８)を含む。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ１ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ(ＧＧＧＧＳ)ｎ２(配列番号１３９)(ここで、ｎ１＝１、２または３およびｎ２＝１、２または３である)を含む。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ１ＡＡ(ＧＧＧＧＳ)ｎ２(配列番号１４０)(ここで、ｎ１＝２または３およびｎ２＝２または３である)を含む。
ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＳｕｓｈｉドメインは、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに担体部分と融合され得る。ペプチドリンカー開裂不可能であり得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、配列番号１１～１６から選択される。具体的実施態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号１３)を含む。
ある実施態様において、ＩＬ－１５ポリペプチド(Ａ)は、ペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)に融合される。ペプチドリンカーは、少なくとも２５、３０または３５アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、２５～４５アミノ酸であり得る。他の実施態様において、ペプチドリンカーは、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５アミノ酸を有する。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ(配列番号１３８)を含む。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ１ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ(ＧＧＧＧＳ)ｎ２(配列番号１３９)(ここで、ｎ１＝１、２または３およびｎ２＝１、２または３である)を含む。ある実施態様において、リンカーは、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ１ＡＡ(ＧＧＧＧＳ)ｎ２(配列番号１４０)(ここで、ｎ１＝２または３およびｎ２＝２または３である)を含む。
【0126】
マスキング部分は、開裂可能なリンカーを介して担体に融合し得る。開裂可能なリンカーは、１以上の(例えば、２つまたは３つの)開裂可能部分(ＣＭ)を含み得る。各ＣＭは、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ－３／４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＴ１－ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、ベータ－セクレターゼ、ｕＰＡおよびＰＳＡから選択される酵素またはプロテアーゼの基質であり得る。開裂可能なリンカーの例は、配列番号１７～３５および３６から選択されるアミノ酸配列を含むものを含むが、これらに限定されない。
【0127】
ある実施態様において、本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、ペプチドリンカーを介してＩＬ－１５ポリペプチドに融合したＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメイン(Ｓ)を含む。ある実施態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも２０アミノ酸、２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸または少なくとも４０アミノ酸；または２７アミノ酸、３２アミノ酸、３７アミノ酸、４２アミノ酸または４７アミノ酸を含む。
【0128】
II. ＩＬ－１５プロドラッグの例
ある実施態様において、活性化可能ＩＬ－１５プロドラッグは、図１Ａ～１Ｃおよび図２Ａ～２Ｃの何れかに示す分子構造を有する。特定の実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図１Ｂまたは図２Ｂの何れかに示す分子構造を有する。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図３Ａ～３Ｃの何れかに示す構造を含む。特定の実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図３Ｂに示す構造を含む。ある実施態様において、担体部分は、図４Ａ、４Ｂ、５Ａまたは５Ｂに示すとおり、１つの抗原結合部分を含む抗体である。好ましい実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図４Ｂおよび図５Ｂから選択される構造を含む。
ある実施態様において、活性化可能ＩＬ－１５プロドラッグは、図１Ａ～１Ｃおよび図２Ａ～２Ｃの何れかに示す分子構造を有する。特定の実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図１Ｂまたは図２Ｂの何れかに示す分子構造を有する。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図３Ａ～３Ｃの何れかに示す構造を含む。特定の実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図３Ｂに示す構造を含む。ある実施態様において、担体部分は、図４Ａ、４Ｂ、５Ａまたは５Ｂに示すとおり、１つの抗原結合部分を含む抗体である。好ましい実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、図４Ｂおよび図５Ｂから選択される構造を含む。
【0129】
ＩＬ－１５プロドラッグは、Ｓｕｓｈｉドメインまたはその機能的アナログの何れも含み得ない。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１およびＬ５２から選択される一か所以上に１以上の変異を含む、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む(配列番号２に従いナンバリング)。ある実施態様において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、変異Ｅ４６Ｋを含む(配列番号２に従いナンバリング)。他の実施態様において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、変異Ｅ４６Ｋ／Ｎ６５Ｄを含む(配列番号２に従いナンバリング)。さらに他の実施態様において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、変異Ｅ４６Ｋ／Ｑ１０８Ｅを含む(配列番号２に従いナンバリング)。
【0130】
ある実施態様において、本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、担体部分としてＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。例えば、ＩＬ－１５プロドラッグは、表２から選択され得る。他の実施態様において、本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。例えば、ＩＬ－１５プロドラッグは、表３から選択され得る。ある実施態様において、本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、担体部分としてヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む。例えば、ＩＬ－１５プロドラッグは、表４から選択され得る。ある実施態様において、本発明のＩＬ－１５プロドラッグは、担体部分としてヒトＰＤ－１に結合する抗体を含む。例えば、ＩＬ－１５プロドラッグは、表５から選択され得る。
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【0131】
ＩＬ－１５ポリペプチド、Ｓｕｓｈｉドメイン、サイトカインアンタゴニスト／マスク、担体、ペプチドリンカーおよびプロドラッグの特定の非限定的例を、下記配列セクションに示す。さらに、本発明のプロドラッグは、周知の組み換えテクノロジーにより製造され得る。例として、プロドラッグのポリペプチド鎖のコード配列を含むさらに１つの発現ベクターを哺乳動物宿主細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)にトランスフェクトし、細胞をコード配列の発現および発現ポリペプチドのプロドラッグ複合体への集合を可能とする条件下、培養し得る。プロドラッグが不活性のままであるために、ｕＰＡ、ＭＭＰ－２および／またはＭＭＰ－９を発現しないまたは僅かしか発現しない宿主細胞が使用され得る。ある実施態様において、宿主細胞は、これらプロテアーゼの遺伝子のヌル変異(ノックアウト)を含み得る。
【0132】
III. 医薬組成物
本発明のプロドラッグおよび変異タンパク質(すなわち、原薬またはＡＰＩ)を含む医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形の所望の純度のＡＰＩと１以上の任意の薬学的に許容される添加物(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980)参照)の混合により調製され得る。薬学的に許容される添加物(または担体)は、一般に用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、ヒスチジン、酢酸または他の無機酸または有機酸もしくはその塩を含む緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えばＺｎ－タンパク質錯体)；および／またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
本発明のプロドラッグおよび変異タンパク質(すなわち、原薬またはＡＰＩ)を含む医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形の所望の純度のＡＰＩと１以上の任意の薬学的に許容される添加物(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980)参照)の混合により調製され得る。薬学的に許容される添加物(または担体)は、一般に用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、ヒスチジン、酢酸または他の無機酸または有機酸もしくはその塩を含む緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えばＺｎ－タンパク質錯体)；および／またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【0133】
緩衝液は、特に、安定性がｐＨ依存的であるとき、治療有効性を最適化する範囲内にｐＨを制御するために使用する。緩衝液は、好ましくは約５０mM～約２５０mM範囲の濃度で存在する。本発明で使用するための適当な緩衝剤は、有機酸および無機酸両者およびその塩、例えばクエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および酢酸塩などを含む。さらに、緩衝液は、ヒスチジンおよびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を含み得る。
【0134】
防腐剤は、微生物増殖を遅らせるために加えられ、一般に０.２％～１.０％(ｗ／ｖ)の範囲で存在する。本発明での使用のための適当な防腐剤は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化(例えば、塩化、臭化、ヨウ化)ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールを含む。
【0135】
「安定化剤」としても知られることもある等張化剤は、組成物における液体の張性を調節または維持するために存在する。タンパク質および抗体などの大きな荷電生体物質と使用するとき、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間および分子内相互作用の可能性を低減し得るため、しばしば「安定化剤」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０.１％～２５重量％以上、好ましくは１％～５重量％の何れかの量で存在し得る。好ましい等張化剤は、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールを含む。
【0136】
非イオン性界面活性剤または洗剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療剤の可溶化を助け、撹拌誘発凝集に対する治療タンパク質の保護のために存在し、また、製剤が活性治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、剪断表面応力に曝されることも可能とする。非イオン性界面活性剤は、約０.０５mg／ml～約１.０mg／ml、好ましくは約０.０７mg／ml～約０.２mg／mlの範囲で存在する。
【0137】
適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(２０、４０、６０、６５、８０など)、ポロキサマー(１８４、１８８など)、プルロニック(登録商標)ポリオール、トリトン(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(トゥイーン(登録商標)－２０、トゥイーン(登録商標)－８０など)、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む。使用できるアニオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネートおよびジオクチルナトリウムスルホネートを含む。カチオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
【0138】
選りすぐりの医薬担体、添加物または希釈剤は、意図する投与経路および標準的製剤技術により選択され得る。医薬組成物は、さらに何らかの適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含み得る。
【0139】
送達系が異なれば、組成物／製剤条件も異なり得る。一例として、本発明において有用な医薬組成物は、ミニポンプを使用してまたは、例えば、吸入用経鼻スプレーもしくはエアロゾルまたは摂取可能溶液として粘膜経路でまたは組成物が、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射用形態で製剤される非経腸的に投与するように、製剤化され得る。
【0140】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、凍結乾燥タンパク質製剤である。他の実施態様において、医薬組成物は、水性液体製剤であり得る。
【0141】
IV. 処置方法
ＩＬ－１５プロドラッグは、抗原結合ドメインにより結合される抗原に依存して、疾患の処置に使用され得る。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、癌の処置に使用される。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、例えば、薬物分子が抗細菌剤または抗ウイルス剤であるとき、感染の処置に使用される。
ＩＬ－１５プロドラッグは、抗原結合ドメインにより結合される抗原に依存して、疾患の処置に使用され得る。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、癌の処置に使用される。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグは、例えば、薬物分子が抗細菌剤または抗ウイルス剤であるとき、感染の処置に使用される。
【0142】
ある実施態様において、対象における疾患(例えば癌、ウイルス感染または細菌感染)を処置する方法は、対象に有効量のＩＬ－１５プロドラッグを投与することを含む。他の実施態様において、処置方法は、ＩＬ－１５プロドラッグと組み合わせて(前、後または同時)さらなる治療剤を投与することをさらに含む。さらなる薬剤は、一部ここに開示する抗体またはそのフラグメント、小分子薬物または他のタイプの治療薬物であり得る。
【0143】
ある実施態様において、癌は固形癌である。ある実施態様において、癌は血液癌または固形腫瘍である。処置し得る癌の例は、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、尿路癌、頸部癌、脳腫瘍、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、肝臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮細胞癌腫、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌などの肺癌、胆管細胞癌、乳癌および卵巣癌を含むが、これらに限定されない。
【0144】
ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグを、敗血症などの細菌感染の処置に使用する。ある実施態様において、細菌感染を引き起こす細菌は、薬物耐性細菌である。ある実施態様において、抗原結合部分は、細菌抗原に結合する。
【0145】
ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグを、ウイルス感染の処置に使用する。ある実施態様において、ウイルス感染を引き起こすウイルスは、Ｃ型肝炎(ＨＣＶ)、Ｂ型肝炎(ＨＢＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は、ウイルス抗原に結合する。
【0146】
一般に、本医薬組成物の投与量および投与経路は、標準製薬実務に従い、対象の体格および状態により決定される。ある実施態様において、医薬組成物を、経口、経真皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への特設適用、手術部位への適用、腹腔内、坐薬、皮下、皮内、経皮、噴霧化、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、頭蓋内または髄腔内を含む、何らかの経路を介して、対象に投与する。ある実施態様において、組成物は、対象に静脈内投与される。
【0147】
ある実施態様において、医薬組成物の投与量は、単回投与または反復投与である。ある実施態様において、用量は、対象に１日１回、１日２回、１日３回または１日４回またはそれ以上で投与される。ある実施態様において、約１以上(例えば約２、３、４、５、６または７以上)の用量が１週で投与される。ある実施態様において、医薬組成物は、毎週、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、３週中２週間毎週または４週中３週間毎週で投与される。ある実施態様において、複数用量が、数日、数週、数カ月または数年にわたり投与される。ある実施態様において、処置の過程は、約１以上の投薬(例えば約２、３、４、５、７、１０、１５または２０以上の投薬)である。
【0148】
ここで他に定義しない限り、本開示に関連して使用する科学的および技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。例示的方法および材料が下に記載されるが、ここに記載するのに類似するまたは等価な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用され得る。矛盾があるならば、定義を含む本明細書が優先する。一般に、ここに記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品化学および医薬化学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連しておよびその技術で使用する術語は、当分野で周知であり、一般に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当分野で一般に実施されるまたはここに記載するとおり、製造業者の仕様に従い実施する。さらに、文脈から他の解釈が必要ではない限り、単数表現は複数を含みかつ複数表現が単数を含む。本明細書および実施態様をとおして、用語「有する」および「含む」または「有し」、「含有する」、「含み」または「含んで」などのその変形は、記載された整数または整数の群を含むが、他のあらゆる整数または整数の群を除外しないことを含意すると理解される。ここに記載する本発明の態様およびバリエーションは、「からなる」および／または「から本質的になる」態様およびバリエーションを含むと理解される。ここに記載する全ての刊行物および他の引用文献は、引用により全体として本明細書に包含させる。多数の文献がここで引用されるが、この引用は、これらの文献の何れも、当分野の技術常識の一部を形成することを認めるものではない。
【実施例】
【0149】
ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション
発現プラスミドを、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)を使用して、２.５～３μg／mlで３×１０６細胞／mlフリースタイルＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。ＦｃベースのＩＬ－１５プロドラッグについて、Ｆｃ－ＩＬ－１５変異タンパク質融合ポリペプチドおよびＦｃ－マスキング部分融合ポリペプチドは、１：２比であった。抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグについて、ノブ重鎖(ＩＬ－１５ポリペプチド含有)、ホール重鎖(マスキング部分含有)および軽鎖ＤＮＡは、２：１：２モル比であった。細胞培養物を、トランスフェクション６日後、９,０００rpmで４５分間遠心分離、続いて０.２２μM濾過により採取した。
発現プラスミドを、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)を使用して、２.５～３μg／mlで３×１０６細胞／mlフリースタイルＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。ＦｃベースのＩＬ－１５プロドラッグについて、Ｆｃ－ＩＬ－１５変異タンパク質融合ポリペプチドおよびＦｃ－マスキング部分融合ポリペプチドは、１：２比であった。抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグについて、ノブ重鎖(ＩＬ－１５ポリペプチド含有)、ホール重鎖(マスキング部分含有)および軽鎖ＤＮＡは、２：１：２モル比であった。細胞培養物を、トランスフェクション６日後、９,０００rpmで４５分間遠心分離、続いて０.２２μM濾過により採取した。
【0150】
タンパク質精製
Ｆｃおよび抗体ベースのＩＬ－１５融合ポリペプチドは、一般に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。ある例において、抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグのタンパク質の精製を、１)プロテインＡ親和性クロマトグラフィー；２)フロースルーモードで操作するCaptoTM Adhere；３)CaptoTM MMC ImpResおよび４)フロースルーモードで操作するＱセファロース(登録商標)ＨＰを含む４工程のクロマトグラフィーを使用して実施した。CaptoTM Adhereを、５０mM 酢酸、３０mM ＮａＣｌ(ｐＨ５.５)を含む緩衝液で平衡化した。CaptoTM MMC ImpResを、緩衝液Ａ(５０mM 酢酸、３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ５.５)を使用して平衡化し、緩衝液Ｂ(５０mM 酢酸、０.５Ｍアルギニン、ｐＨ５.５)の３０ ＣＶ線形勾配を使用して溶出した。Ｑセファロース(登録商標)ＨＰを、４０mM Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６.５で平衡化した。
Ｆｃおよび抗体ベースのＩＬ－１５融合ポリペプチドは、一般に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。ある例において、抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグのタンパク質の精製を、１)プロテインＡ親和性クロマトグラフィー；２)フロースルーモードで操作するCaptoTM Adhere；３)CaptoTM MMC ImpResおよび４)フロースルーモードで操作するＱセファロース(登録商標)ＨＰを含む４工程のクロマトグラフィーを使用して実施した。CaptoTM Adhereを、５０mM 酢酸、３０mM ＮａＣｌ(ｐＨ５.５)を含む緩衝液で平衡化した。CaptoTM MMC ImpResを、緩衝液Ａ(５０mM 酢酸、３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ５.５)を使用して平衡化し、緩衝液Ｂ(５０mM 酢酸、０.５Ｍアルギニン、ｐＨ５.５)の３０ ＣＶ線形勾配を使用して溶出した。Ｑセファロース(登録商標)ＨＰを、４０mM Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６.５で平衡化した。
【0151】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣ－ＨＰＬＣを、Tosoh BioscienceからのTSKgel(登録商標)G3000SWXLカラム(７.８mmＩＤ×３０cm、５μm粒子径)を備えたAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して、実施した。１００μlまでのサンプルを負荷した。カラムを、２００mM Ｋ３ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌを含む緩衝液、ｐＨ６.５で流した。流速は０.５ml／分であった。カラムを室温で流した。タンパク質溶出を２２０nmおよび２８０nm両者でモニターした。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＳＥＣ－ＨＰＬＣを、Tosoh BioscienceからのTSKgel(登録商標)G3000SWXLカラム(７.８mmＩＤ×３０cm、５μm粒子径)を備えたAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して、実施した。１００μlまでのサンプルを負荷した。カラムを、２００mM Ｋ３ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌを含む緩衝液、ｐＨ６.５で流した。流速は０.５ml／分であった。カラムを室温で流した。タンパク質溶出を２２０nmおよび２８０nm両者でモニターした。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
【0152】
１０μlの培養上清または２０μgの精製タンパク質サンプルを、還元剤存在下または非存在下、BoltTM LDSサンプル緩衝液(Novex)と混合した。サンプルを７０℃で３分間加熱し、次いでNuPAGETM ４～１２％BisTris Gel(Invitrogen)に負荷した。ゲルを、NuPAGETM MOPS SDSランニング緩衝液(Invitrogen)で２００ボルトで４０分間流し、次いでクマシーで染色した。
【0153】
タンパク質分解処理
１μgのプロテアーゼ、ヒトＭＭＰ－２(R&D systems)、ヒトＭＭＰ－９(R&D systems)、マウスＭＭＰ－２(R&D systems)またはマウスＭＭＰ－９(R&D systems)を、５０μgの前駆体タンパク質に加え、３７℃で一夜インキュベートした。
１μgのプロテアーゼ、ヒトＭＭＰ－２(R&D systems)、ヒトＭＭＰ－９(R&D systems)、マウスＭＭＰ－２(R&D systems)またはマウスＭＭＰ－９(R&D systems)を、５０μgの前駆体タンパク質に加え、３７℃で一夜インキュベートした。
【0154】
ＣＴＬＬ２アッセイ
ＣＴＬＬ２細胞を、Ｌ－グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１０％非必須アミノ酸、１０％ピルビン酸ナトリウムおよび５５μM ベータ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。ＣＴＬＬ２細胞は非接着性であり、１００ng／mlのＩＬ－１５を含む培地に５×１０４～１×１０６細胞／mlで維持した。一般に、細胞を週に２回分けた。バイオアッセイのために、細胞を継代後４８時間以降に使用するのが最良であった。
ＣＴＬＬ２細胞を、Ｌ－グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１０％非必須アミノ酸、１０％ピルビン酸ナトリウムおよび５５μM ベータ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。ＣＴＬＬ２細胞は非接着性であり、１００ng／mlのＩＬ－１５を含む培地に５×１０４～１×１０６細胞／mlで維持した。一般に、細胞を週に２回分けた。バイオアッセイのために、細胞を継代後４８時間以降に使用するのが最良であった。
【0155】
サンプルを９６ウェルプレートで５０μl／ウェルで２倍濃度に希釈した。ＩＬ－１５標品を１２ウェルで２０ng／ml(２倍濃度)から３倍連続希釈で希釈して、力価測定した。サンプルを、適宜力価測定試験した。ＣＴＬＬ２細胞を５回洗浄してＩＬ－１５を除去し、５０μlで５０００細胞／ウェルに分配し、一夜または少なくとも１８時間、サンプルとインキュベートした。その後、１００μl／ウェルCell Titer Glo試薬(Promega)を加え、発光を測定した。
【0156】
ＮＫ９２増殖アッセイ
ＮＫ９２細胞増殖アッセイは、下記プロトコールに従い実施した。
ＮＫ９２細胞増殖アッセイは、下記プロトコールに従い実施した。
【0157】
ＮＫ９２細胞株は、増殖および生存のためにＩＬ－２を必要とする因子依存的細胞株である。アッセイ前、細胞を洗浄してＩＬ－２を除去し、増殖因子非存在下、一夜培養する。細胞を採取し、再び洗浄して、残存増殖因子を除去する。次いで、細胞(２０,０００／ウェル)を試験品の連続希釈物および対照を含む９６ウェルプレートに加える。プレートを一夜インキュベートし、Cell Titer Glo(Promega)を加え、発光を測定する。これは、細胞生存能の指標として、ＡＴＰレベルの測定値を提供する。
【0158】
アッセイを、数個のＩＬ－２Ｒβ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤおよびＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７由来ｓｃＦｖ分子でマスクしたＩＬ－１５プロドラッグを使用して実施した。
【0159】
ｐＳＴＡＴ５分析
ＮＫ９２／ｐＳＴＡＴ５安定細胞株を、０.１％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地で、一夜飢餓状態とした。９６ウェルプレートの各ウェルに５×１０５の細胞を播種し、その後３７℃および５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。ＩＬ－１５融合ポリペプチドを細胞に加え、該インキュベーターで５～６時間インキュベートした。その後、１００μlのPierceTM Firefly Luc One-Step Glowアッセイ溶液を加え、生物発光をルミノメーターで測定した。
ＮＫ９２／ｐＳＴＡＴ５安定細胞株を、０.１％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地で、一夜飢餓状態とした。９６ウェルプレートの各ウェルに５×１０５の細胞を播種し、その後３７℃および５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。ＩＬ－１５融合ポリペプチドを細胞に加え、該インキュベーターで５～６時間インキュベートした。その後、１００μlのPierceTM Firefly Luc One-Step Glowアッセイ溶液を加え、生物発光をルミノメーターで測定した。
【0160】
酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)
ＰＢＳ中１０μg／mlのＩＬ－１５融合タンパク質を、１００μl／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、４度で一夜被覆した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μl ２％ミルク／ＰＢＳで１時間遮断した。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３倍連続希釈した１００μlタンパク質サンプルを、室温(ＲＴ)での１時間のインキュベートで加えた。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μlのＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧ抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、ウェルを再びＰＢＳで３回洗浄し、続いて検出試薬を加え、光学密度(ＯＤ)を４５０nmで測定した。
ＰＢＳ中１０μg／mlのＩＬ－１５融合タンパク質を、１００μl／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、４度で一夜被覆した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μl ２％ミルク／ＰＢＳで１時間遮断した。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３倍連続希釈した１００μlタンパク質サンプルを、室温(ＲＴ)での１時間のインキュベートで加えた。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μlのＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧ抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、ウェルを再びＰＢＳで３回洗浄し、続いて検出試薬を加え、光学密度(ＯＤ)を４５０nmで測定した。
【0161】
実施例１：ＩＬ－１５プロドラッグの発現および試験
多数のプロドラッグを構築し、ＨＥＫ２９３細胞で組み換えにより発現させた(図６Ａおよび図１０Ａ参照)。ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、ＩＬ－１５ポリペプチドは融合ポリペプチドの一部として発現され、その生物活性を試験した。発現されたＩＬ－１５融合ポリペプチドの配列のいくつかを図６Ａ、図１０Ａおよび図１２Ａに列記する。
多数のプロドラッグを構築し、ＨＥＫ２９３細胞で組み換えにより発現させた(図６Ａおよび図１０Ａ参照)。ＩＬ－１５プロドラッグにおいて、ＩＬ－１５ポリペプチドは融合ポリペプチドの一部として発現され、その生物活性を試験した。発現されたＩＬ－１５融合ポリペプチドの配列のいくつかを図６Ａ、図１０Ａおよび図１２Ａに列記する。
【0162】
発現されたＩＬ－１５融合ポリペプチドを、活性化前後にＳＤＳ－ＰＡＧＥで試験した(図７Ａ；非還元；および図７Ｂ；還元)。データは、ＪＲ３.６８.１、ＪＲ３.６８.２およびＪＲ３.６８.３サンプルのマスキング部分が、プロテアーゼ処置により成功裏に開裂されたことを示した。
【0163】
実施例２：活性化可能ＩＬ－１５プロドラッグ成分の精製
活性化可能ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.６８.１、ＪＲ３.６８.２およびＪＲ３.６８.３をプロテインＡカラムで精製し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して分析した。ＪＲ３.６８.１(図１Ａ)は、Ｆｃドメインの重鎖の一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合したＳｕｓｈｉドメインを有し、ＩＬ－１５ポリペプチドはペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合し、マスキング部分(ＩＬ２Ｒβ ＥＣＤ)はＦｃドメインの他方の重鎖のＣ末端に融合する。ＪＲ３.６８.２は図１Ｂに示し、ＪＲ３.６８.３は図１Ｃに示す。
活性化可能ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.６８.１、ＪＲ３.６８.２およびＪＲ３.６８.３をプロテインＡカラムで精製し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して分析した。ＪＲ３.６８.１(図１Ａ)は、Ｆｃドメインの重鎖の一方のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合したＳｕｓｈｉドメインを有し、ＩＬ－１５ポリペプチドはペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合し、マスキング部分(ＩＬ２Ｒβ ＥＣＤ)はＦｃドメインの他方の重鎖のＣ末端に融合する。ＪＲ３.６８.２は図１Ｂに示し、ＪＲ３.６８.３は図１Ｃに示す。
【0164】
プロドラッグ分子の数個の成分の形式、配置、相対位置または立体配置が、プロテインＡ親和性カラムで精製したとき、薬物凝集のレベルに有意に影響したのは驚きであった。Ｆｃ－Ｓｕｓｈｉ－ＩＬ－１５(２個のポリペプチド鎖配列番号３７および配列番号３８を含む)(ＪＲ３.６８.１)が、Ｆｃ－ＩＬ－１５－Ｓｕｓｈｉ(ＪＲ３.６８.２、配列番号３７および配列番号４０の２個のポリペプチド鎖を有する)の形式と比較したとき(図８Ｂ)、有意に高い純度(高い主ピークにより明らか；図８Ａ)および低レベルの凝集を有したのは明らかであった。同時に、ＳｕｓｈｉドメインおよびサイトカインがＦｃドメインの異なる重鎖にある形式は、ＪＲ３.６８.２(ＪＲ３.６８.３、図８Ｃ)より良好であるが、ＪＲ３.６８.１(図８Ａ)より低い、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ主ピーク純度を有した。担体が抗体であるとき、傾向は本質的に同じであった(例えば、ニボルマブ、ヒトＰＤ－１に対する抗体；図１１Ｂ、ＪＲ３.７３.２対ＪＲ３.７３.４)。
【0165】
マスキング部分の付加により、融合ポリペプチドの純度が有意に向上したことも、予想外に観察された。担体部分として抗体を有するＪＲ３.７３.２ ＩＬ－１５プロドラッグは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで活性化バージョンＪＲ３.７４.１より高い単量体純度であることが観察された(図１１Ａおよび図１１Ｂ)。ＪＲ３.７４.１の単量体ピークは顕著なショルダー(図１１Ａ)であることも観察され、さらなる精製の潜在的課題を示し得る。
【0166】
実施例３：ＩＬ－１５プロドラッグの細胞ベースの活性
ＣＴＬＬ２アッセイ
ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.６８.１、ＪＲ３.６８.２およびＪＲ３.６８.３のＣＴＬＬ２細胞ベースの活性を、図９Ａ～９Ｃに示すとおり、活性化前後に決定した。結果は、ＪＲ３.６８.１がプロテアーゼ処理後、顕著に活性化されたことを示す。担体部分として抗体を有するＩＬ－１５プロドラッグの細胞ベースの活性を図１１Ｃに示す。結果は、ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.７３.２が活性化可能であったことを示す。
ＣＴＬＬ２アッセイ
ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.６８.１、ＪＲ３.６８.２およびＪＲ３.６８.３のＣＴＬＬ２細胞ベースの活性を、図９Ａ～９Ｃに示すとおり、活性化前後に決定した。結果は、ＪＲ３.６８.１がプロテアーゼ処理後、顕著に活性化されたことを示す。担体部分として抗体を有するＩＬ－１５プロドラッグの細胞ベースの活性を図１１Ｃに示す。結果は、ＩＬ－１５プロドラッグＪＲ３.７３.２が活性化可能であったことを示す。
【0167】
ＮＫ９２アッセイ
ＮＫ９２細胞増殖アッセイも、ｓｃＦｖ分子(ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７由来)、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤでマスクした数個のＩＬ－１５プロドラッグで実施した。ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７のｓｃＦｖ１またはｓｃＦｖ２でマスクしたＩＬ－１５プロドラッグのＮＫ９２増殖アッセイ結果は、ｓｃＦｖ２およびｓｃＦｖ１両者が、ＩＬ－１５ ＷＴおよびＮ６５Ｄ変異を有するＩＬ－１５変異タンパク質の活性を有意にマスクしたことを示す(図１２Ｂ)。
ＮＫ９２細胞増殖アッセイも、ｓｃＦｖ分子(ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７由来)、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤでマスクした数個のＩＬ－１５プロドラッグで実施した。ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７のｓｃＦｖ１またはｓｃＦｖ２でマスクしたＩＬ－１５プロドラッグのＮＫ９２増殖アッセイ結果は、ｓｃＦｖ２およびｓｃＦｖ１両者が、ＩＬ－１５ ＷＴおよびＮ６５Ｄ変異を有するＩＬ－１５変異タンパク質の活性を有意にマスクしたことを示す(図１２Ｂ)。
【0168】
活性化前後の活性化可能ＩＬ－１５融合ポリペプチドのＮＫ９２細胞ベースの活性を、ｐＳＴＡＴ５方法を使用して決定した。図１３Ａは、ｓｃＦｖ２およびｓｃＦｖ１両者が野生型ＩＬ－１５を同程度マスクし、融合ポリペプチドは、プロテアーゼ処理により活性化可能であったことを示す。図１３Ｂは、ｓｃＦｖ２がＩＬ－１５変異タンパク質Ｎ６５Ｄの活性を有意にマスクしたことを示す。結果は、ｓｃＦｖ１がＩＬ－１５変異タンパク質を効率的にマスクしたことも示す。両ＩＬ－１５プロドラッグが、インビトロで、プロテアーゼ処理により、開裂したｓｃＦｖ分子を除去するためにさらに精製せずとも、活性化可能であったのは予想外であった。ｓｃＦｖ２が、ＩＬ－１５変異タンパク質Ｎ６５Ｄに対して、ｓｃＦｖ１より有意に強いマスキング効果を有することも驚きであった。
【0169】
ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤでマスクしたさらなる活性化可能ＩＬ－１５融合ポリペプチドのＮＫ９２細胞ベースの活性を決定した。これら融合ポリペプチドにおいて、野生型ＩＬ－１５は、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２ＲγＥＣＤでマスクした。結果は、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤと組み合わせたＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤが、野生型ＩＬ－１５に対して有効なマスクを形成し、ＩＬ－１５プロドラッグがプロテアーゼ処理により活性化可能であったことを示す(図１４Ａ)。ＩＬ－１５変異タンパク質Ｑ１０８Ｅ(プロテアーゼ処理により活性化可能であった)の活性もＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤでマスクされた(図１４Ｃ)。
【0170】
Ｓｕｓｈｉドメインがない活性化可能Ｆｃ－ＩＬ－１５融合ポリペプチド(ＪＲ２.１４５.１)およびＳｕｓｈｉドメインとＩＬ－１５ポリペプチド部分の間に長いリンカーを有する活性化可能Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質(ＪＲ２.１４５.２)のＮＫ９２細胞ベースのアッセイ結果も決定した。データは、両者における、ＩＬ－１５変異タンパク質Ｎ６５Ｄの有意なマスキングを示した。結果は、ｓｃＦｖ２マスクが、Ｓｕｓｈｉドメインの非存在下でＩＬ－１５ポリペプチドのマスキングに有効であることを示した。マスキングドメインは、ＳｕｓｈｉドメインとＩＬ－１５ポリペプチドの間のリンカーが長いとき(３２アミノ酸)、また良好に機能した。
【0171】
上記非限定的例は、本開示の主題のより完全な理解を容易にするために、説明の目的のためのみに提供する。これらの例は、抗体、医薬組成物または方法および癌、神経変性または感染性疾患の処置のための使用に関するものを含む、本明細書に記載の実施態様の何れも限定すると解釈してはならない。
【0172】
配列
下記配列において、四角で囲った残基は変異を示す。開裂可能なリンカーにおける下線はプロテアーゼ基質配列を示す。
下記配列において、四角で囲った残基は変異を示す。開裂可能なリンカーにおける下線はプロテアーゼ基質配列を示す。
【表6】
【表7】
【0173】
【表8】
【表9】
【0174】
【表10】
【表11】
【0175】
【表12】
【表13】
【0176】
【表14】
【表15】
【0177】
【表16】
【表17】
【0178】
【表18】
【表19】
【0179】
【表20】
【表21】
【0180】
【表22】
【表23】
【0181】
【表24】
【表25】
【0182】
【表26】
【表27】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B-1】
【図11B-2】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【配列表】
【国際調査報告】