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特表2022-536948クオラムクエンチングラクトナーゼの安定化変異体及び病原体の治療におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-22
(54)【発明の名称】クオラムクエンチングラクトナーゼの安定化変異体及び病原体の治療におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20220815BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20220815BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220815BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220815BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220815BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20220815BHJP
A01N 63/50 20200101ALI20220815BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C12N9/14 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A01P3/00
A01N63/50 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575258
(86)(22)【出願日】2020-06-17
(85)【翻訳文提出日】2022-02-16
(86)【国際出願番号】 IL2020050673
(87)【国際公開番号】W WO2020255131
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】62/862,348
(32)【優先日】2019-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521550714
【氏名又は名称】ミガル ガリラヤ リサーチ インスティテュート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アフリアット－ジュノウ，リブナット
(72)【発明者】
【氏名】エロフ，マーヤン
(72)【発明者】
【氏名】グレーヴィチ，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】イェリン，メリー ダフニー
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD02
4B050FF01
4B050LL05
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA31
4B065CA47
4H011AA01
4H011BB19
4H011DH11
(57)【要約】
変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片、並びにそれらをコード化する核酸分子及びベクターが提供される。さらに、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを発現する細胞及びそれらを生成するための方法に加えて、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料などの宿主における細菌の感染を治療又は予防するための方法であって、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその野生型酵素をそれらに適用することを含む、方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列中の配列番号１の５９位又は１７２位に対応するアミノ酸残基が置換されている、変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片であって、Ｇ５９に対応するグリシン残基が、バリン、アラニン、ロイシン、及びイソロイシンから選択されるアミノ酸残基で置換されているか、又はＨ１７２に対応するヒスチジン残基が、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基で置換されており、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片。
【請求項2】
配列番号１のＧ５９に対応するグリシン残基がバリンで置換されている、請求項１に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項3】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、請求項２に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項4】
配列番号１のＨ１７２に対応するヒスチジン残基がチロシンで置換されている、請求項１に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項5】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、請求項４に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項6】
タグをさらに含む、請求項１に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項7】
前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼが、非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの熱安定性と比較して増加した熱安定性、又は前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して、基質としてＮ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトンを用いて提供される実質的に同様又はより高いラクトナーゼ触媒活性を有する、請求項１に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項8】
Ｔ５０として表される前記増加した熱安定性が約５０℃～約８０℃、例えば約６５℃である、請求項７に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項9】
前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して延長された貯蔵寿命を有する、請求項７又は８に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項10】
配列番号１のＧ５９に対応するグリシン残基がバリンで置換されているか、又は配列番号１のＨ１７２に対応するヒスチジン残基がチロシンで置換されており、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼが、非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの熱安定性と比較して増加した熱安定性、又は前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して、基質としてＮ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトンを用いて提供される実質的に同様又はより高いラクトナーゼ触媒活性を有する、請求項１に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項11】
配列番号２又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなり、Ｔ５０として表される前記増加した熱安定性が約５５℃～約８０℃、例えば約６５℃であるか、又は前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して延長された貯蔵寿命を有する、請求項１０に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む組成物。
【請求項13】
ＣｕＳＯ４などの銅塩をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料における細菌の感染を治療又は予防するための方法であって、前記植物は、Ｎ－（３－ヒドロキシブタノイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ４－ＨＳＬ）、Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン（Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ）、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］オクタナミド（Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ）、及びＮ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－フラニル］デカンアミド（Ｃ１０－ＨＳＬ）から選択されるラクトンを分泌する細菌に感染している又は感染しやすく、前記植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料に対して、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｌｏｒｏｓｉｓ）由来の野生型推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ、配列番号１）と少なくとも３０％の同一性を有し、前記野生型推定パラチオン加水分解酵素と実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、その機能的断片、又は請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用することを含む、前記方法。
【請求項15】
前記細菌が、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、軟腐病菌（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・コルゲート（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、並びに任意の病原型からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記細菌がエルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細菌が軟腐病菌（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記細菌がシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記シュードモナス・シリンガエが、シュードモナス・トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｍａｔｏ）（従来はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏとして公知）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
結核菌由来の前記推定パラチオン加水分解酵素又はその組成物、及びＣｕＳＯ４などの銅塩を含む別個の組成物は、前記植物又はその部分、器官、若しくは植物繁殖材料に別々に適用される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
配列番号１のＧ５９がバリンで置換された前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、例えば配列番号２又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、又は配列番号１のＨ１７２がチロシンで置換された前記ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、例えば配列番号３又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、を適用することを含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼをコード化する核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項23】
配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４、又は配列番号１５に記載の核酸配列を含む、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項24】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項２２又は２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項25】
請求項２２又は２３に記載の単離核酸分子又は請求項２４に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項26】
細菌、真菌、哺乳動物又は植物細胞、好ましくは大腸菌から選択される、請求項２５に記載の細胞。
【請求項27】
変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片を生成する方法であって、（ｉ）請求項２５又は２６に記載の細胞を培養することと、
（ｉｉ）前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを前記細胞から分離することにより、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを得ることと、を含む、前記方法。
【請求項28】
前記細胞が、細菌、真菌、哺乳動物又は植物細胞、好ましくは大腸菌から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼが、タグをさらに含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又は請求項１２又は１３の組成物で少なくとも部分的に覆われた又はコーティングされた、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、クオラムセンシング依存性細菌感染症の管理、特に火傷病及び他の植物病害の管理に関する。
【背景技術】
【0002】
クオラムセンシング調節系を介して病原体によって引き起こされる疾病は、臨床及び農業環境において大きな課題を提示している。例えば、バラ科のリンゴ、ナシ、及び他の一員に影響を与えるエルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）によって引き起こされる伝染病である火傷病の効果的な管理は、多面的で大部分が予防的であり、衛生管理、培養方法、銅殺虫剤、有効成分としてストレプトマイセス・リディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ）を含む製品、及び抗生物質（例えば、ストレプトマイシンやオキシテトラサイクリン）の組み合わせの利用による（１）。
【0003】
様々な作物のクオラムセンシング調節系を介して病害を引き起こす可能性のある一般的な植物病原菌の他の例は、軟腐病菌（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ（２））、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（３））、及びシュードモナス・コルゲート（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔｅ（４））であり、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）、インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、及びトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に影響を及ぼす。クオラムセンシング調節系に依存する日和見病原体である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、植物病原体であり、嚢胞性線維症患者及び免疫不全患者の罹患率及び死亡率の主要な原因でもある。
【0004】
ただし、規制による制約、公衆衛生上の懸念、及び耐性の発達により、抗生物質やその他の薬剤の使用の長期的な見通しが大幅に制限されている（５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、火傷病及び他の衰弱性植物病害の効果的な薬剤及び管理に対する満たされていないニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列中の配列番号１の５９位又は１７２位に対応するアミノ酸残基が置換されている、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片であって、Ｇ５９に対応するグリシン残基が、バリン、アラニン、ロイシン、及びイソロイシンから選択されるアミノ酸残基で置換されているか、又はＨ１７２に対応するヒスチジン残基が、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基で置換されており、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片を提供する。
【0007】
別の態様では、本発明は、上記で定義される変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む組成物を提供する。
【0008】
追加の態様では、本発明は、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料における細菌の感染を治療又は予防するための方法であって、前記植物は、Ｎ－（３－ヒドロキシブタノイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ４－ＨＳＬ）、Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン（Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ）、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］オクタナミド（Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ）、及びＮ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－フラニル］デカンアミド（Ｃ１０－ＨＳＬ）から選択されるラクトンを分泌する細菌に感染している又は感染しやすく、前記方法が、前記植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料に対して、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｌｏｒｏｓｉｓ）由来の野生型推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ、配列番号１）と少なくとも３０％の同一性を有し、前記野生型推定パラチオン加水分解酵素と実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有するホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、その機能的断片、又は上記で定義される変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又は上記で定義された組成物のいずれか１つを適用することを含む、前記方法を提供する。
【0009】
さらに追加の態様では、本発明は、上記で定義される変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼをコード化する核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0010】
さらに追加の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0011】
さらに別の態様では、本発明は、上記で定義される単離核酸分子又は発現ベクターを含む細胞を提供する。
【0012】
さらに別の態様では、本発明は、上記で定義される変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片を生成する方法であって、（ｉ）上記の開示された実施形態のいずれか１つの細胞を培養することと、（ｉｉ）前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを前記細胞から分離することにより、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを得ることとを含む、前記方法を対象とする。
【0013】
さらなる態様において、本発明は、上記で定義される組成物で少なくとも部分的に覆われた又はコーティングされた、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】図１Ａ及び図１Ｂは、結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ）の生化学的特徴付けを示す図である。ＰＰＨを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－ＢＬ２１（ＤＥ３）で組換え発現させた後、アミロースカラムを使用して精製工程を行い、ＰＰＨ活性をＣ６－オキソ－ＨＳＬ（Ｅ０＝０．０１μＭ、２５℃）で分析した。Ｃ６－オキソ－ＨＳＬの加水分解は、ｐＨ指示薬であるクレゾールパープルを使用したカルボン酸生成物の放出によってモニタリングした。（ａ）ＰＰＨは、様々な温度範囲内で活性であることが判明した。活性は、チオブチリルブチロラクトン（ＴＢＢＬ）（６）で試験した。その活性は４０℃で最適であり、５０℃までその活性の８０％を維持した。（ｂ）０．０５６±０．００９ｍＭのＫＭ値、１０．１６±０．０１ｓ－１、１．８１×１０５ｓ－１／Ｍ－１のｋｃａｔ／ＫＭ。
【図1B】同上。
【図2A】図２Ａ～図２Ｄは、ＰＰＨ進化型バリアントが、Ｃ６－オキソ－ＨＳＬでの活性の増加、熱安定性の増加、及び貯蔵寿命の改善を示すことを示す図である。（ａ）４５℃での細菌溶解物のインキュベーション後、ＰＰＨのライブラリーを基質としてＴＢＢＬでスクリーニングした。熱インキュベーション後に最も高い活性を示すバリアントを、大規模な生成及び精製のために採用した。以下の変異を含むバリアント：バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５のＧ５８Ｖ及びバリアントＰＰＨ＿Ｒ２のＨ１７１Ｙ：野生型酵素より２倍高いＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の場合、３．７０×１０５ ｓ－１Ｍ－１の高い触媒活性ｋｃａｔ／ＫＭ、及びＰＰＨ＿Ｒ２の場合、９．６７×１０４ ｓ－１／Ｍ－１のｋｃａｔ／ＫＭを示すＰ８－Ｄ１２。（ｂ）どちらのバリアントも熱安定性が向上しており、５０％の残留活性が１５度増加し、６０℃まで１００％維持される。（ｃ）精製から４日後、バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５はその活性の１００％を維持し、野生型（ｗｔ）ＰＰＨはその活性の５０％を維持し、さらに３７日後にｗｔＰＰＨはその活性の９５％を失活した。ＰＰＨ＿Ｒ２ ：Ｐ４－Ｄ５はその活性の８０％を失活した。（ｄ）結核菌由来のＰＰＨの解明された構造、ｐｄｂ番号ｐｄｂ ４ｉｆ２は、活性部位から遠く離れた進化型バリアントの変異Ｇ５８Ｖ（＊）及びＨ１７１Ｙ（＊＊）の位置を示している。
【図2B】同上。
【図2C】同上。
【図2D】同上。
【図3】図３は、野生型ＱＱラクトナーゼ（ＰＰＨ）がエルウィニア・アミロボラにおけるレバン生成を減少させる能力を示す棒グラフを示す図である。レバン生成は、スクロースの添加後３時間後に１μＭのＱＱラクトナーゼの添加の有無にかかわらず、スクロース（バッファー）を添加したＬＢ培地で増殖させたエルウィニア・アミロボラ（単離株Ｅａ２ｔｐ０）培養物で分光的に観察された。
【図4A】図４Ａ～図４Ｃは、植物におけるエルウィニア・アミロボラ感染の病原性アッセイを示す図である。ナシの果実に、活性バッファーでインキュベートしたエルウィニア・アミロボラ細胞懸濁液（１０８ＣＦＵ／ｍＬ）（ａ）又は結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から精製した２μＭ ＰＰＨでインキュベートしたエルウィニア・アミロボラ細胞懸濁液（ｂ）を接種した（７）。２８℃で７日間培養した後、未接種対照は実験全体を通して無症候性のままであり、精製ＰＰＨとのインキュベーション後の接種したナシは、対照（エルウィニア・アミロボラ培養物及びバッファーのみ）よりも症状が少ないように見えた。１列目の１０個のナシは細菌及び酵素の活性バッファーで処理し、２列目は野生型ＰＰＨと細菌で処理し、３列目はＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５（Ｇ５９Ｖ－ＰＰＨに対応）と細菌で処理した（Ｃ）。
【図4B】同上。
【図4C】同上。
【図5A】図５Ａ～図５Ｃは、エルウィニア・アミロボラ（１０７ＣＦＵ／ｍｌ）に感染した後の、グロースチャンバー内の健康な（Ａ；写真上）および感染した（Ａ；写真下）ナシの花におけるエルウィニア・アミロボラ感染の病原性アッセイを示す図である。簡潔には、セイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の開花した開花枝を、２２℃のグロースチャンバー（明期１２時間、暗期１２時間）に置いた。４μＭのｗｔＰＰＨとその進化型変異体であるＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５（Ｇ５９Ｖに対応）を含む酵素溶液を花に噴霧し、２時間後に、エルウィニア・アミロボラの細胞懸濁液（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を噴霧するか、酵素及び培養物の両方を１：１の比率で３０分間混合してから噴霧した。エルウィニア・アミロボラ培養物のみを対照として使用した（陽性対照）。標準として、一般的に使用される抗生物質である４ｐｐｍのオキソリン酸を使用した。実験は３回繰り返して実施した（各繰り返しで１０個の花）。湿度を保つために、チャンバー内の空調及び照明を感染後一晩停止した。図５Ｂでは、火傷病の症状は、感染から３、７、及び１２日後に評価され、１２日後に結果が示された（ＬＳＤ、Ｐ＜０．０５、ｎ＝３０）。図５Ｃでは、進化型変異体ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５は、圃場での火傷病の症状を軽減し、７０％の抑制を示す。この阻害度は、今日使用されている抗生物質であるオキソリン酸（７０％）と同様である。簡潔には、セイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の木の開花に、進化型変異体ＰＰＨ－Ｇ５８Ｖ（４μＭ）を様々な時期に噴霧した。感染の３０～４５分前又は感染と同時（噴霧前に酵素溶液を培養物と３０分間混合することによる）。全ての場合において、１０９ＣＦＵ／ｍＬのエルウィニア・アミロボラ細菌培養物を使用した。感染後、高湿度を確保するために一晩ビニール袋で花を覆った。実験は５回の繰り返しで実施し、木の両側に５個ずつの花、計１０個の花が各繰り返しに含まれた。木に生った状態での処理は、４回未満とした。接種後１３日目に各開花の罹患花を計数して病害の症状を評価した。圃場試験は、北部のフラバレー果樹園実験農場（Ｈｕｌａ Ｖａｌｌｅｙ Ｏｒｃｈａｒｄｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆａｒｍ）（北緯３３度８分５８．１０秒、東経３５度３７分１６．９３秒）で実施した。
【図5B】同上。
【図5C】同上。
【図6】図６は、配列番号１、２、３、１０、及び５０の部分配列のアラインメントを示す図である。保存された活性部位の触媒残基（白文字）及びＰＰＨで置換されている２つの残基（Ｇ５９Ｖ及びＨ１７２Ｙ）が示されている。
【図7A】図７Ａ及び図７Ｂは、ナシ果実におけるエルウィニア・アミロボラ感染の病原性アッセイの結果を示す図である。（Ａ）感染した果実は、未処理（左）か、０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ４（硫酸銅（ＩＩ））のみ（中央）又は０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ４及び４μＭ ＰＰＨ－Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の組み合わせ（右）のいずれかで処理した。（Ｂ）対照及び処理した果実の感染直径の測定値の要約を示す棒グラフ。
【図7B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0015】
クオラムセンシング（ＱＳ）は、様々な細菌で発生するシグナル伝達系であり、自身の個体群密度を感知し、Ｎ－アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）などの小さな拡散性シグナル分子の分泌を介して病原性遺伝子の発現を同期させる（８）。これらの分子は、腐敗酵素（例えば、ポリガラクチュロナーゼ）やアミロボランなどのバイオフィルム成分の生成など、ＱＳ依存性病原体の病原性遺伝子発現を誘発する上で重要な役割を果たす（９）。クオラムクエンチング（ＱＱ）酵素による微生物ＱＳシステムへの干渉は、疾病管理の潜在的な戦略として提案されている。これは、ＱＱは細胞増殖を制限するのではなく、病原菌の病原性発現を停止することを目的としており、抗生物質耐性を克服する可能性を示しているためである（１０）。
【0016】
結核菌由来のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ（本明細書では結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素、ＰＰＨとも称される）はクオラムクエンチング酵素であり（７）、以下に定義されるように、ＴＩＭバレルフォールド及び保存された触媒部位を有するホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ）様のラクトナーゼ（７）に属する。
【0017】
本発明によれば、ＰＰＨの配列における特定の変異は、対応する野生型酵素と比較して、変異型酵素に熱安定性の増加を付与することが見出された。例として使用された特定のバリアントは、酵素を精製するためのタグとして使用される、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合した最初のＮ末端メチオニンを欠失する野生型又は変異体タンパク質であった（配列番号１０～１２）。Ｇ５８をバリンに置換すると６２℃で５０％の残留活性を有する酵素が得られ、Ｈ１７１をチロシンに置換すると６５℃で５０％の残留活性を有する酵素が得られると同時に、野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して触媒活性が維持又は改善されることが判明した（図２Ａ及び図２Ｂ）。さらに、Ｇ５８をバリンに置換すると、野生型酵素の２倍のｋｃａｔ／ＫＭを有する酵素が得られる。なお、変異型酵素の固有の触媒活性が非常に高いため（表３を参照）、６２℃～６５℃の比較的非常に高い温度で５０％の残留活性であったとしても、高い活性を維持する（ｋｃａｔ／ＫＭが約１～２×１０５ｓ－１Ｍ－１）。
【0018】
本明細書に開示されるタンパク質又はその断片における特定のアミノ酸残基の位置は、
配列番号１に示されるような野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの番号付けによるものであり、アミノ酸残基の１文字のコードと、野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼにおけるその位置を参照して指定される。よって、例えば、野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの５９位に対応する位置のグリシン（本明細書ではＧ５９とも称される）は、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ断片又はＭＵＳＣＬＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ Ｌｏｇ－Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）若しくはＭＡＦＦＴ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）などのタンパク質化学の分野で周知のアラインメントアルゴリズムに従った、異なるサイズの相同ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼにおいてもＧ５９と称されることとなる（例えば、図６参照）。
配列番号１に示されるような野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの番号付けによるものであり、アミノ酸残基の１文字のコードと、野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼにおけるその位置を参照して指定される。よって、例えば、野生型結核菌ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの５９位に対応する位置のグリシン（本明細書ではＧ５９とも称される）は、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ断片又はＭＵＳＣＬＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ Ｌｏｇ－Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）若しくはＭＡＦＦＴ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）などのタンパク質化学の分野で周知のアラインメントアルゴリズムに従った、異なるサイズの相同ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼにおいてもＧ５９と称されることとなる（例えば、図６参照）。
【0019】
明確にするために、本明細書の実施例２～４で使用される融合タンパク質の配列中のアミノ酸残基、Ｇ５８及びＨ１７１の位置は、単離野生型全長タンパク質のＧ５９及びＨ１７２にそれぞれ対応する。同様に、結核菌由来のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの三次元構造を解明するために使用される機能的に活性な欠失変異体の配列は、４つの最初のＮ末端アミノ酸残基を欠失している（１１）。よって、本明細書で特徴付けられる酵素の５５位のグリシンは、本発明の酵素のアミノ酸残基の位置を同定するために使用される系によると、Ｇ５９に対応する。
【0020】
ある位置のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することは、アミノ酸残基の１文字コード、上記で定義されたその位置、及び元のアミノ酸残基を置き換えるアミノ酸残基の１文字のコードを参照することによって示される。したがって、例えば、Ｇ５９のバリンによる置換はＧ５９Ｖと示される。
【0021】
上記を考慮して、一態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列中の配列番号１の５９位又は１７２位に対応するアミノ酸残基が置換されている、変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片であって、Ｇ５９に対応するグリシン残基が、バリン、アラニン、ロイシン、及びイソロイシンから選択されるアミノ酸残基で置換されているか、又はＨ１７２に対応するヒスチジン残基が、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基で置換されており、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、すなわち、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの活性部位は、前記野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの触媒残基と同一である、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片を、提供する。
【0022】
本発明の核酸分子によってコード化されるタンパク質は、特定のアミノ酸配列によって本明細書で定義されるものに限定されず、これらのタンパク質のバリアントであってもよく、又は上記に開示されたものと実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。本明細書で使用される「実質的に同一」のアミノ酸配列は、１又は複数の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入によって参照配列とは異なる配列を指し、これは特に、そのような置換が分子の活性部位ではない部位で起こり、ポリペプチドが本質的にその機能的特性を保持している場合である。保存的アミノ酸置換は、例えば、あるアミノ酸を同じクラスの別のものに置換し、例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に、極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に、及び酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換する。１又は複数のアミノ酸をペプチドから欠失可能であり、したがって、その生物学的活性を著しく変化させることなくその断片が得られ、本明細書では「機能的断片」と称される。
【0023】
本明細書で使用される「バリアント」という用語は、それぞれ１又は複数の塩基対、コドン、又はアミノ酸残基で修飾されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを指し、それでもなお天然に存在する配列のポリペプチドの生物学的及び酵素的活性を保持する。
【0024】
特定の実施形態において、全てのバリアント及びホモログを含む全ての変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの生物学的活性又は酵素機能は、基質特異性及びｋｃａｔ、ＫＭ、及びｋｃａｔ／ＫＭなどの速度論的パラメーターによって定義される。ラクトナーゼ活性を測定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、以下の実施例で教示されるように、Ｃ６－オキソ－ホモセリンラクトンなどのラクトンの加水分解は、既に記載されているように（３５）、ｐＨ指示薬を使用してカルボン酸生成物の出現を追跡することによってモニタリング可能である。
【0025】
触媒残基は、ＰＴＥ様ラクトナーゼ（ＰＬＬ）全体で保存されている：Ｈｉｓ２６、Ｈｉｓ２８、Ｈｉｓ１８２及びＨｉｓ２１１、並びにＡｓｐ２７０。６番目の結合残基はカルバミル化Ｌｙｓ１４９である（番号付けはＰＰＨ用）（図２Ｄ及び図６）。これらのアミノ酸残基のいずれかに変異があると、機能欠失となる。
【0026】
結果として、上記で定義されたように、本発明の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つは、未変化の活性部位を有する。すなわち、配列番号１の野生型全長ＰＰＨのＨｉｓ２６、Ｈｉｓ２８、Ｌｙｓ１４９、Ｈｉｓ１８２、Ｈｉｓ２１１、及びＡｓｐ２７０に対応するこれらの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのアミノ酸残基のそれぞれが保存されている。
【0027】
特定の実施形態において、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有し、野生型酵素のものと実質的に同一であるＴＩＭバレルフォールドを含む、本明細書に記載の各変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、相同体、及びバリアント／変異体ＰＰＨは、Ｃ４－ＨＳＬ （ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：１０３３００８６、別名３－ヒドロキシ－Ｃ４－ＨＳＬ， Ｎ－（３－ヒドロキシブタノイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン）、Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ （ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：６８８５０５、別名Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリン、Ｎ－カプロイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］ヘキサナミド、ＨＨＬ）、Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ （ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：６９１４５７９、別名Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］オクタンアミド）、及びＣ１０－ＨＳＬ （ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：１０１３１２８１、別名Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］デカンアミド）などが挙げられ、特にＣ６－オキソ－ＨＳＬである、ラクトンを加水分解可能な活性酵素である。
【0028】
「ＴＩＭバレルフォールド」という用語は、本明細書ではその従来の意味で使用され、ペプチド骨格に沿って交互になる８つのα－ヘリックス及び８つの平行なβ－ストランドからなる保存されたタンパク質フォールドを指す（１２）。
【0029】
タンパク質の三次構造を決定するための、又はそのモデルを生成するための方法は、当技術分野で周知であり、多数のタンパク質に対して容易に行い得る。例えば、ＴＩＭバレルフォールドのモデルは、公知の構造テンプレートとシーケンス構造アラインメントに基づいてモデルを計算する自動ソフトウェア・パイプラインであるＭＯＤＰＩＰＥを使用して生成してもよい（１３）。
【0030】
本発明の変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのバリアント及びホモログは、変異体タンパク質を特徴付ける変異を含まない、配列番号１の野生型ホスホトリエス
テラーゼ様ラクトナーゼとのそれらの配列同一性によって定義される。したがって、例えば、変異体Ｇ５９Ｖと９０％の同一性を有するホモログは、１位～５８位及び６０位～３３０位のアミノ酸残基を含む配列（又は１位～３３０位のアミノ酸残基を含み、５９位に関連する配列は野生型Ｇ５９と同一）と９０％の同一性を有する。
テラーゼ様ラクトナーゼとのそれらの配列同一性によって定義される。したがって、例えば、変異体Ｇ５９Ｖと９０％の同一性を有するホモログは、１位～５８位及び６０位～３３０位のアミノ酸残基を含む配列（又は１位～３３０位のアミノ酸残基を含み、５９位に関連する配列は野生型Ｇ５９と同一）と９０％の同一性を有する。
【0031】
特定の実施形態において、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１と３０％～９９％、３０％～９８％、３０％～９７％、３０％～９６％、３０％～９５％、３０％～９０％、３０％～８５％、３０％～８０％、３０％～７５％、３０％～７０％、３０％～６５％、３０％～６０％、３０％～５５％、３０％～５０％、３０％～４５％、３０％～４０％、４０％～９９％、４０％～９８％、４０％～９７％、４０％～９６％、４０％～９５％、４０％～９０％、４０％～８５％、４０％～８０％、４０％～７５％、４０％～７０％、４０％～６５％、４０％～６０％、４０％～５５％、４０％～５０％、４０％～４５％、５０％～９９％、５０％～９８％、５０％～９７％、５０％～９６％、５０％～９５％、５０％～９０％、５０％～８５％、５０％～８０％、５０％～７５％、５０％～７０％、５０％～６５％、５０％～６０％、５０％～５５％、６０％～９９％、６０％～９８％、６０％～９７％、６０％～９６％、６０％～９５％、６０％～９０％、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、７０％～９９％、７０％～９８％、７０％～９７％、７０％～９６％、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９０％、８０％～８５％、９０％～９９％、９０％～９８％、９０％～９７％、９０％～９６％、又は９０％～９５％の同一性を有する。
【0032】
特定の実施形態において、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％の同一性を有する。
【0033】
特定の実施形態において、配列番号１と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１と３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。特定の実施形態において、前記アミノ酸配列は、少なく
とも７９％の同一性を有し、配列番号１６～１１０（表２）に示される配列の群から選択される。
とも７９％の同一性を有し、配列番号１６～１１０（表２）に示される配列の群から選択される。
【0034】
特定の実施形態において、配列番号１のＧ５９に対応するグリシン残基が、バリン、アラニン、ロイシン、又はイソロイシンによって置換されているか、又は配列番号１のＨ１７２に対応するヒスチジン残基が、チロシンフェニルアラニン又はトリプトファンで置換されている。特定の実施形態において、これらの置換のいずれか１つは、配列番号１６～１１０のいずれか１つと比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換であるが、他のアミノ酸残基の所望の保存的置換又はＮ末端若しくはＣ末端の１又は複数のアミノ酸残基の所望の欠失を除く。特定の実施形態において、これらの置換のいずれかは、配列番号１と比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換である。すなわち、例えば、酵素機能に影響を及ぼさないＮ末端又はＣ末端でのアミノ酸残基の所望の欠失を除いて、アミノ酸配列に他の修飾はなされない。
【0035】
特定の実施形態において、配列番号１のＧ５９に対応するグリシン残基が、バリンによって置換されている。特定の実施形態において、これは、配列番号１６～１１０のいずれか１つと比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換であるが、他のアミノ酸残基の所望の保存的置換又はＮ末端若しくはＣ末端の１又は複数のアミノ酸残基の所望の欠失を除く。特定の実施形態において、これは、他のアミノ酸残基の保存的置換を除いて、配列番号１と比較した、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換である。特定の実施形態において、これは、配列番号１と比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換である。すなわち、Ｎ末端又はＣ末端の１又は複数のアミノ酸残基の所望の欠失を除いて、アミノ酸配列に他の修飾はなされない。特定の実施形態において、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的にそれからなる。
【0036】
特定の実施形態において、配列番号１のＨ１７２に対応するヒスチジン残基が、チロシンによって置換されている。特定の実施形態において、これは、配列番号１６～１１０のいずれか１つと比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換であるが、他のアミノ酸残基の所望の保存的置換又はＮ末端若しくはＣ末端の１又は複数のアミノ酸残基の所望の欠失を除く。特定の実施形態において、これは、他のアミノ酸残基の保存的置換を除いて、配列番号１と比較した、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換である。特定の実施形態において、これは、配列番号１と比較して、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの配列における唯一の置換である。すなわち、Ｎ末端又はＣ末端の１又は複数のアミノ酸残基の所望の欠失を除いて、アミノ酸配列に他の修飾はなされない。特定の実施形態において、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的にそれからなる。
【0037】
実用的な目的のために、本発明の野生型又は変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つを、溶解性の向上のために、リガンド含有基質への特異的結合によって細胞抽出物から分離するのに有用なタグを含む融合タンパク質として提供してもよい。例えば、本発明の改良型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つは、アミノ末端にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として提供されてもよい。タグの他の例には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、ストレプトアビジンに対して固有の結合親和性を示す選択された９アミノ酸ペプチド（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ））、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの溶解性を改善するために
使用されるチオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）を含むタグも使用され得る。タグは、化学薬品によって、又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシング（ｉｎｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）などの酵素的手段によって、所望により除去可能である。
使用されるチオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）を含むタグも使用され得る。タグは、化学薬品によって、又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシング（ｉｎｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）などの酵素的手段によって、所望により除去可能である。
【0038】
あるいは、前記ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、増殖培地へのその分泌を促進するシグナル配列を含む融合タンパク質として提供又はコード化されてもよい。これは、細胞を破壊する必要性を排除し、増殖培地を収集するだけで本発明のタンパク質を回収することを可能にするため有用である。シグナル配列は、タンパク質の発現に使用される宿主細胞の種類に合うものとなっている。Ｆｒｅｕｄｌ（１４）は、細菌では、２つの主要な輸出経路、通常の分泌又はＳｅｃ経路及びツインアルギニン転座又はＴａｔ経路が、原形質膜を通過するタンパク質の輸送のために存在することを教示している。これらの代替タンパク質輸出システムの１つへの経路は、Ｓｅｃ又はＴａｔ特異的シグナルペプチドを目的の標的タンパク質のアミノ末端に融合させる必要がある。
【0039】
要するに、本発明のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、Ｓｅｃ又はＴａｔシグナルペプチドを含む融合タンパク質として提供されてもよい。これらのペプチドは、正に帯電したｎ領域、中央の疎水性ｈ領域、及びシグナルペプチダーゼの認識部位（コンセンサス：Ａ－Ｘ－Ａ）を含む極性ｃ領域からなる同様の三者構成の全体構造を有する。Ｔａｔシグナルペプチドでは、２つの高度に保存されたアルギニン残基を含む特徴的なアミノ酸コンセンサスモチーフが、しばしば著しく長いｎ領域とｈ領域との間の境界に存在する。さらに、Ｔａｔシグナルペプチドのｈ領域は、Ｓｅｃシグナルペプチドに見られるものよりも疎水性がほとんどなく、Ｔａｔシグナルペプチドのｃ領域には、しばしば正に帯電したアミノ酸（いわゆるＳｅｃ回避モチーフ）が存在し、Ｓｅｃ経路へのＴａｔ基質の誤ったターゲティングを防ぐ。
【0040】
シグナルペプチドは、それぞれのタンパク質トランスロカーゼへのターゲティング及び膜移行に必要であることに加えて、それぞれの標的タンパク質の生合成、折り畳み速度論、及び安定性にもさらなる影響を及ぼすことから、これまでのところ、特定の標的タンパク質及び特定の細菌発現宿主の観点から、どのシグナルペプチドが最もよく機能するかを事前に予測することはできない。しかしながら、所望のタンパク質に最適なシグナルペプチドを見つけるための方法は周知であり、例えば、Ｆｒｅｕｄｌ（本明細書に完全に開示されているかのように参照により援用される）。シグナル配列は、分泌の過程で除去され得るか、化学薬品によって、又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって所望により除去可能である。
【0041】
特定の実施形態において、タグに融合された本発明の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つは、そのＮ末端又はＣ末端において（野生型ＰＰＨと比較して）Ｎ末端の１～４アミノ酸残基などの１～１０アミノ酸残基を欠失してもよく、前記タグはＮ末端に融合している。さらに、リンカーは、タグの配列と、例えば、約１０残基のポリアスパラギンなどの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼとの間に挿入され得る。
【0042】
特定の実施形態において、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ融合タンパク質は、配列番号１０、１１、又は１２のものである。
【0043】
特定の実施形態において、上記実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの熱安定性と比較して増加した熱安定性、又は前記非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して、基質としてＮ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン（Ｃ
６－オキソ－ＨＳＬ）を用いて提供される実質的に同様又はより高いラクトナーゼ触媒活性を有する。
６－オキソ－ＨＳＬ）を用いて提供される実質的に同様又はより高いラクトナーゼ触媒活性を有する。
【0044】
本明細書で使用される「熱安定性」という用語は、高温に曝露されたとき、又は曝露後、すなわち、ほとんどの関連タンパク質において部分的又は完全な変性及び失活を引き起こす温度で、その活性を維持するタンパク質の固有の特性を指す。熱安定性は、酵素をある範囲内の温度でインキュベートし、次に最適温度で触媒活性を測定した後、酵素の最大活性の５０％（最適条件で）が得られる温度として、相対項Ｔ５０で測定される場合が多く、本明細書では「５０％残留活性」と称される。
【0045】
特定の実施形態において、増加した熱安定性は、野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのそれよりも実質的又は有意に高い、すなわち約４０℃より実質的又は有意に高い温度での５０％の残留活性（特定の温度でのインキュベーション後）によって特徴付けられる。
【0046】
特定の実施形態において、５０％の残留活性（Ｔ５０）として表される増加した熱安定性は約５０℃～８０℃、５０℃～７５℃、５０℃～７０℃、５０℃～６５℃、６０℃～８０℃、６０℃～７５℃、６０℃～７０℃、６０℃～６５℃、７０℃～８０℃、７０℃～７５℃、又は７５℃～８０℃であるか、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、又は８０℃である。
【0047】
特定の実施形態において、増加した熱安定性は、約６５℃で５０％の残留活性を含み、特にＧ５９をバリンに置換すると、約６２℃で５０％の残留活性を有する酵素になり、Ｈ１７２をチロシンに置換すると、約６５℃で５０％の残留活性を持つ酵素になる。
【0048】
特定の実施形態において、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼＧ５９Ｖは、野生型酵素のそれより２倍高いｋｃａｔ／ＫＭを有する酵素をもたらす。
【0049】
本明細書で使用される「実質的に類似のラクトナーゼ触媒活性」という用語は、参照と同桁数のラクトナーゼ活性、例えば、野生型酵素のラクトナーゼ活性として同桁数を指す。
【0050】
さらに、本発明によれば、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して、延長された貯蔵寿命を有することが見出された。明示されているように、例えば変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの触媒活性は、室温（約２５℃）で３７日間保存すると実質的に高くなる（２倍）一方、非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのラクトナーゼ触媒活性は、室温で３７日間保存した後の元の活性の約５％である。精製から１３日後、バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５（Ｇ５９Ｖに対応）の残留活性は約５０％であったが、野生型酵素の活性は２０％であった（図２Ｃ）。
【0051】
したがって、特定の実施形態において、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して延長された貯蔵寿命を有する。
【0052】
特定の実施形態において、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、最大４０日間、例えば４～４０、６～４０、８～４０、１０～４０、１２～４０、１４～４０、１６～４０、１８～４０、２０～４０、２２～４０、２４
～４０、２６～４０、２８～４０、３０～４０、３２～４０、３４～４０、３６～４０、３８～４０、４～３８、６～３８、８～３８、１０～３８、１２～３８、１４～３８、１６～３８、１８～３８、２０～３８、２２～３８、２４～３８、２６～３８、２８～３８、３０～３８、３２～３８、３４～３８、３６～３８、４～３６、６～３６、８～３６、１０～３６、１２～３６、１４～３６、１６～３６、１８～３６、２０～３６、２２～３６、２４～３６、２６～３６、２８～３６、３０～３６、３２～３６、３４～３６、４～３４、６～３４、８～３４、１０～３４、１２～３４、１４～３４、１６～３４、１８～３４、２０～３４、２２～３４、２４～３４、２６～３４、２８～３４、３０～３４、３２～３４、４～３２、６～３２、８～３２、１０～３２、１２～３２、１４～３２、１６～３２、１８～３２、２０～３２、２２～３２、２４～３２、２６～３２、２８～３２、３０～３２、４～３０、６～３０、８～３０、１０～３０、１２～３０、１４～３０、１６～３０、１８～３０、２０～３０、２２～３０、２４～３０、２６～３０、２８～３０、４～２８、６～２８、８～２８、１０～２８、１２～２８、１４～２８、１６～２８、１８～２８、２０～２８、２２～２８、２４～２８、２６～２８、４～２６、６～２６、８～２６、１０～２６、１２～２６、１４～２６、１６～２６、１８～２６、２０～２６、２２～２６、２４～２６、４～２４、６～２４、８～２４、１０～２４、１２～２４、１４～２４、１６～２４、１８～２４、２０～２４、２２～２４、４～２２、６～２２、８～２２、１０～２２、１２～２２、１４～２２、１６～２２、１８～２２、２０～２２、４～２０、６～２０、８～２０、１０～２０、１２～２０、１４～２０、１６～２０、１８～２０、４～１８、６～１８、８～１８、１０～１８、１２～１８、１４～１８、１６～１８、４～１６、６～１６、８～１６、１０～１６、１２～１６、１４～１６、４～１４、６～１４、８～１４、１０～１４、１２～１４、４～１２、６～１２、８～１２、１０～１２、４～１０、６～１０、８～１０、４～８、６～８、又は４～６日間の貯蔵寿命を有する。特定の実施形態において、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日間の貯蔵寿命を有する。
～４０、２６～４０、２８～４０、３０～４０、３２～４０、３４～４０、３６～４０、３８～４０、４～３８、６～３８、８～３８、１０～３８、１２～３８、１４～３８、１６～３８、１８～３８、２０～３８、２２～３８、２４～３８、２６～３８、２８～３８、３０～３８、３２～３８、３４～３８、３６～３８、４～３６、６～３６、８～３６、１０～３６、１２～３６、１４～３６、１６～３６、１８～３６、２０～３６、２２～３６、２４～３６、２６～３６、２８～３６、３０～３６、３２～３６、３４～３６、４～３４、６～３４、８～３４、１０～３４、１２～３４、１４～３４、１６～３４、１８～３４、２０～３４、２２～３４、２４～３４、２６～３４、２８～３４、３０～３４、３２～３４、４～３２、６～３２、８～３２、１０～３２、１２～３２、１４～３２、１６～３２、１８～３２、２０～３２、２２～３２、２４～３２、２６～３２、２８～３２、３０～３２、４～３０、６～３０、８～３０、１０～３０、１２～３０、１４～３０、１６～３０、１８～３０、２０～３０、２２～３０、２４～３０、２６～３０、２８～３０、４～２８、６～２８、８～２８、１０～２８、１２～２８、１４～２８、１６～２８、１８～２８、２０～２８、２２～２８、２４～２８、２６～２８、４～２６、６～２６、８～２６、１０～２６、１２～２６、１４～２６、１６～２６、１８～２６、２０～２６、２２～２６、２４～２６、４～２４、６～２４、８～２４、１０～２４、１２～２４、１４～２４、１６～２４、１８～２４、２０～２４、２２～２４、４～２２、６～２２、８～２２、１０～２２、１２～２２、１４～２２、１６～２２、１８～２２、２０～２２、４～２０、６～２０、８～２０、１０～２０、１２～２０、１４～２０、１６～２０、１８～２０、４～１８、６～１８、８～１８、１０～１８、１２～１８、１４～１８、１６～１８、４～１６、６～１６、８～１６、１０～１６、１２～１６、１４～１６、４～１４、６～１４、８～１４、１０～１４、１２～１４、４～１２、６～１２、８～１２、１０～１２、４～１０、６～１０、８～１０、４～８、６～８、又は４～６日間の貯蔵寿命を有する。特定の実施形態において、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日間の貯蔵寿命を有する。
【0053】
特定の実施形態において、本発明の変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼでは、配列番号１のＧ５９に対応するグリシン残基がバリンで置換されているか、又は配列番号１のＨ１７２に対応するヒスチジン残基がチロシンで置換されており、上記で定義されるように、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼが、非変異野生型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの熱安定性と比較して増加した熱安定性、又は上記で定義されるように、前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して、基質としてＮ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトンを用いて提供される実質的に同様又はより高いラクトナーゼ触媒活性を有する。
【0054】
特定の実施形態において、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号１１、又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、又は本質的にそれからなり、Ｔ５０として表される前記増加した熱安定性が約５５℃～約８０℃、例えば約６５℃（又は上記で定義される）であるか、又は上記で定義されるように、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、前記非変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼと比較して延長された貯蔵寿命を有する。
【0055】
別の態様では、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを含む組成物を対象とする。
【0056】
特定の実施形態において、上記の組成物のいずれか１つは、石鹸、高級アルコール硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、第四級アンモニウム塩、ポ
リアルキレンオキシドなどの農業的に許容される界面活性剤、キサンタンガムやタルク、リグノ硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリンなどのコーティング剤、アルギン酸ナトリウムなどのゲル形成剤、脂肪アルコールポリグリコールエーテルであるＧｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ０６０及びポリジメチルシロキサン消泡剤エマルジョンであるＡＦ（登録商標）３６５ Ａｎｔｉｆｏａｍなどの湿潤剤、ポリジメチルシロキサン消泡剤エマルジョンであるＡＦ（登録商標）３６５ Ａｎｔｉｆｏａｍなどの非イオン性界面活性剤消泡剤、及び／又はグリセロールなどの安定剤をさらに含む。前記組成物は、固体担体、液体担体、乳化剤、及び分散剤などをさらに含み得、これらはすべて当技術分野で周知である。これらの担体の例には、アカシア、酸性白土、ベントナイト、炭酸カルシウム、二酸化炭素、粘土、珪藻土、フレオン、カオリン、ニトロセルロース、及びデンプンが挙げられる。
リアルキレンオキシドなどの農業的に許容される界面活性剤、キサンタンガムやタルク、リグノ硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリンなどのコーティング剤、アルギン酸ナトリウムなどのゲル形成剤、脂肪アルコールポリグリコールエーテルであるＧｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ０６０及びポリジメチルシロキサン消泡剤エマルジョンであるＡＦ（登録商標）３６５ Ａｎｔｉｆｏａｍなどの湿潤剤、ポリジメチルシロキサン消泡剤エマルジョンであるＡＦ（登録商標）３６５ Ａｎｔｉｆｏａｍなどの非イオン性界面活性剤消泡剤、及び／又はグリセロールなどの安定剤をさらに含む。前記組成物は、固体担体、液体担体、乳化剤、及び分散剤などをさらに含み得、これらはすべて当技術分野で周知である。これらの担体の例には、アカシア、酸性白土、ベントナイト、炭酸カルシウム、二酸化炭素、粘土、珪藻土、フレオン、カオリン、ニトロセルロース、及びデンプンが挙げられる。
【0057】
特定の実施形態において、上記の組成物のいずれか１つは、固体材料（例えば、粉末）又は溶液の形態で処方される。
【0058】
特定の実施形態において、上記の組成物のいずれか１つは、金属、例えば銀若しくは銅又はそれらの合金（真ちゅう、青銅、白銅、銅－ニッケル－亜鉛）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）などの金属イオン塩などの追加の抗菌剤、ストレプトマイシン硫酸塩、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、及びゲンタマイシンなどの植物農業で使用される抗生物質、又はマンコゼブ（Ｍａｎｃｏｚｅｂ）、トリシクラゾール（Ｔｒｉｃｙｃｌａｚｏｌｅ）、カルベンダジム（Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ）、ヘキサコナゾール（Ｈｅｘａｃｏｎａｚｏｌｅ）、メタラキシル（Ｍｅｔａｌａｘｙｌ）、ベノミル（Ｂｅｎｏｍｙｌ）、ジフェノコナゾール（Ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、プロピコナゾール（Ｐｒｏｐｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、キタジン（Ｋｉｔａｚｉｎ）、テブコナゾール（Ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、オキシ塩化銅（Ｃｏｐｐｅｒ ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トリデモルフ（Ｔｒｉｄｅｍｏｒｐｈ）、及びプロピネブ（Ｐｒｏｐｉｎｅｂ）などの殺菌剤をさらに含む。
【0059】
特定の実施形態において、上記の組成物のいずれか１つは、１又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む医薬組成物である。前記担体は、前記組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害であってはならないという意味で「許容可能」でなければならない。
【0060】
「担体」という用語は、活性剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。前記医薬組成物中の担体は、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドン又はポビドン）、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、乳糖、又は乳糖一水和物などの結合剤、アルギン酸及びトウモロコシ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム又はラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤又は界面活性剤、及びコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤を含んでいてもよい。
【0061】
追加の態様では、本発明は、クオラムセンシング調節系を介して、細菌に感染している又は感染しやすい宿主の細菌感染を治療又は予防する方法であって、前記細菌は、Ｎ－（３－ヒドロキシブタノイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ４－ＨＳＬ）、Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン（Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ）、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］オクタナミド（Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ）、及びＮ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－フラニル］デカンアミド（Ｃ１０－ＨＳＬ）から選択されるラクトンを分泌し、前記方法は、前記宿主に、結核菌由来の野生型推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ、配列番号１）と少なくとも３０％の同一性を有し、前記野生型推定パラチオン加水分解酵素と実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、その機能的断片、又は上記の開示された実施形態のいずれか１つ又は上記で定義された組成物のい
ずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用又は投与することを含む、前記方法を提供する。結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素の基質特異性は、Ａｆｒｉａｔ ｅｔ ａｌ．， ２００６（７）より公知である。
ずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用又は投与することを含む、前記方法を提供する。結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素の基質特異性は、Ａｆｒｉａｔ ｅｔ ａｌ．， ２００６（７）より公知である。
【0062】
上記のラクトンの１又は複数を分泌する細菌の例には、
クオラムセンシング調節系に依存するグラム陰性日和見病原体である緑膿菌は、植物病原体であり、嚢胞性線維症患者及び免疫不全患者の罹患率及び死亡率の主要な原因でもあり、Ｃ４－ＨＳＬ及びＣ１２－オキソ－ＨＳＬを分泌する（２２）。
クオラムセンシング調節系に依存するグラム陰性日和見病原体である緑膿菌は、植物病原体であり、嚢胞性線維症患者及び免疫不全患者の罹患率及び死亡率の主要な原因でもあり、Ｃ４－ＨＳＬ及びＣ１２－オキソ－ＨＳＬを分泌する（２２）。
【0063】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）は土壌や水中に見られ、Ｃ８－ＨＳＬを分泌する主要な食品腐敗菌である（２３）。これはヒトにおける疾病の特異な原因であり、通常、免疫系が低下している患者に影響を及ぼす。
【0064】
エルウィニア・アミロボラはバラ科作物に火傷病を引き起こし、Ｎ－アシルホモセリンラクトン、Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン、及びＮ－（３－ヒドロキシ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトンを生成及び分泌する（１５）。
【0065】
軟腐病菌は、トマトでは細菌の茎の腐敗及び果実の腐敗を引き起こし、ジャガイモでは軟腐病を引き起こし、ＱＳシグナル伝達を使用して細胞外酵素やＨｒｐ（ＩＩＩ型分泌）システムなどの病原性因子の発現、および主に３－オキソ－Ｃ６及び３－オキソ－Ｃ８ＡＨＬによって制御されるカルバペネム系抗生物質の産生を制御する（１６）（１７）（１８）（１９）（Ｂａｒｎａｒｄ ａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。
【0066】
シュードモナス・コルゲートは、Ｃ６－ＨＳＬクオラムセンシングシグナル（３－オキソ－Ｃ６及び３－オキソ－Ｃ８ ＡＨＬ）を分泌して、病原性、抗菌活性、及び適応度に寄与する特性を調節する（４）。
【0067】
シュードモナス・シリンガエは細菌の斑点病を引き起こし、３－オキソ－Ｃ６、３－オキソ－Ｃ８、Ｃ８－ＡＨＬに固有の複数のＱＳ回路を使用することが報告されている（２１）。
【0068】
バークホルデリア・ベトナミエンシスは複数のＡＨＬ分子を生成し、主なＡＨＬであるＮ－デカノイルホモセリンラクトン（Ｃ１０－ＨＳＬ）、Ｃ８－ＨＳＬ、及びＮ－ヘキサノイルホモセリンラクトン（Ｃ６－ＨＳＬ）を有し（２４）、バークホルデリア・セパシアはＮ－オクタノイルホモセリンラクトンを分泌し（２５）、並びにバークホルデリア・タイランデンシスはＮ－オキソ－デカノイルホモセリンラクトン（Ｃ１０－オキソ－ＨＳＬ）及びＮ－オキソ－オクタノイルホモセリンラクトン（Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ）を分泌する（２６）。
【0069】
特定の実施形態では、前記宿主は植物であり、したがって本発明は、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料における細菌の感染を治療又は予防するための方法であって、前記植物は、Ｎ－（３－ヒドロキシブタノイル）－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ４－ＨＳＬ）、Ｎ－（３－オキソ－ヘキサノイル）－ホモセリンラクトン（Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ）、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］オクタナミド（Ｃ８－オキソ－ＨＳＬ）、及びＮ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－フラニル］デカンアミド（Ｃ１０－ＨＳＬ）から選択されるラクトンを分泌する細菌に感染している又は感染しやすく、前記方法が、前記植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料に対して、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｌｏｒｏｓｉｓ）由来の野生型推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ、配列番号１）と少なくとも３０％の同一性を有し、前記野生型推定パラチオン加水分
解酵素と実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、その機能的断片、又は上記の開示された実施形態のいずれか１つ又は上記で定義された組成物のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用又は投与することを含む、前記方法を提供する。
解酵素と実質的に同一のＴＩＭバレルフォールドを有し、その活性部位に保存された触媒残基を有する、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、その機能的断片、又は上記の開示された実施形態のいずれか１つ又は上記で定義された組成物のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用又は投与することを含む、前記方法を提供する。
【0070】
よって、特定の実施形態において、前記細菌が、エルウィニア・アミロボラ、軟腐病菌、シュードモナス・シリンガエ、シュードモナス・コルゲート、バークホルデリア・ベトナミエンシス、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・タイランデンシス、及び緑膿菌、並びに任意の病原型からなる群から選択される。特定の実施形態において、前記細菌は、エルウィニア・アミロボラ、軟腐病菌、及びシュードモナス・シリンガエから選択されるＣ６－オキソ－ＨＳＬを分泌する細菌である。
【0071】
特定の実施形態において、前記はエルウィニア・アミロボラであり、それによって引き起こされる植物病害は、例えば、リンゴやナシなどのナシ状果樹などのバラ科作物の火傷病である。
【0072】
特定の実施形態において、前記細菌は、軟腐病菌であり、それによって引き起こされる植物病害は、ニンジン、ジャガイモ、トマト、葉物野菜、カボチャなどのウリ科植物、タマネギ、ピーマン、セントポーリアなどの植物に対する細菌性軟腐病であり、特に、ジャガイモのビートヴァスキュラーネクロシス（ｂｅｅｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及び黒脚病（ｂｌａｃｋｌｅｇ）、並びに多くの異なる樹種でのスライムフラックス（ｓｌｉｍｅ ｆｌｕｘ）病である。
【0073】
特定の実施形態において、前記細菌はシュードモナス・シリンガエであり、それによって引き起こされる植物病害は、細菌性斑点病である。特に、シュードモナス・シリンガエ細菌は、シュードモナス・トマト（従来はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏとして公知）であり得、前記病害はトマト細菌性斑点病であり得る。
【0074】
特定の実施形態において、前記宿主は、嚢胞性線維症患者及び免疫不全の個体などの哺乳動物であり、前記細菌は、緑膿菌又はシュードモナス・フルオレッセンスである。
【0075】
特定の実施形態において、結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素又は上記の実施形態のいずれか１つで定義されるその組成物、及びＣｕＳＯ４などの銅塩を含む別個の組成物を、前記植物又はその部分、器官、若しくは植物繁殖材料に別々に適用する。２つの組成物は、同時に又は連続して適用され得る。
【0076】
特定の実施形態において、上記の実施形態のいずれか１つの細菌の感染を治療又は予防する方法は、上記の実施形態のいずれか１つの変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを適用することを含む。
【0077】
特定の実施形態において、上記の開示された実施形態のいずれかの細菌の感染を治療又は予防する方法は、配列番号１のＧ５９がバリンで置換された前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、例えば配列番号２又は配列番号１１に記載の又は上記の実施形態のいずれか１つで定義されるアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、又は配列番号１のＨ１７２がチロシンで置換された前記ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、例えば配列番号３又は配列番号１２に記載の又は上記の実施形態のいずれか１つで定義されるアミノ酸配列を含む又は本質的にそれからなる、前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、を適用することを
含む。
含む。
【0078】
さらに追加の態様では、上記の実施形態のいずれか１つで定義される変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼをコード化する核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。
【0079】
特定の実施形態において、前記単離核酸分子は、リガンド含有基質への特異的結合によって細胞抽出物から分離するのに有用なタグを含む融合タンパク質をコード化する。例えば、本発明の野生型又は改良変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つをコード化する核酸配列は、マルトース結合タンパク質をコード化する配列に融合され得る（例えば、配列番号１３～１５のいずれか１つに記載されているように、又はそのようなタグに同様に融合された表２の配列番号１６～１１０の配列のいずれかをコード化し得る）。あるいは、前記核酸配列は、上記のように増殖培地への分泌を促進するシグナル配列を含む本発明のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼのいずれか１つをコード化する。
【0080】
特定の実施形態において、前記核酸配列は、配列番号４（野生型）、配列番号５（Ｇ５９Ｖ）、配列番号６（Ｈ１７２Ｙ）、又は配列番号１０（ＭＢＰとの野生型融合）に記載されている野生型又は変異体酵素をコード化する元の未修飾ＤＮＡ配列である。
【0081】
特定の実施形態において、前記核酸配列は、その発現レベルを増加させるために、大腸菌における発現のために最適化される。例えば、前記核酸配列は、大腸菌でよく見られるｔＲＮＡと一致するようにそのコドンを変更することによって最適化され得る（例えば、Ｐｕｉｇｂｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００７， Ｖｏｌ． ３５を参照）。特定の実施形態において、野生型酵素の最適化された配列は、配列番号７に示される通りである。
【0082】
特定の実施形態において、前記（コドン最適化）核酸配列は、配列番号８［Ｇ５９Ｖ］又は配列番号９［Ｈ１７２Ｙ］に記載される通り、又はそのＭＢＰ融合タンパク質は、配列番号１４及び１５に示される通りである。
【0083】
さらに追加の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された上記の開示された実施形態のいずれか１つの核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0084】
調節配列が、それに連結されたコード化配列に対して調節効果を発揮可能な場合、コード化核酸配列は、調節配列（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結」される。
【0085】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合してＲＮＡの転写を開始する遺伝子の転写開始部位の上流にあるＤＮＡの領域を指す。プロモーターは遺伝子発現の開始を制御する。
【0086】
本発明のいくつかの実施形態によれば、プロモーターは、単離されたポリヌクレオチド及び／又は宿主細胞に対して異種である。
【0087】
任意の適切なプロモーター配列を、本発明の核酸構築物によって使用してもよい。プロモーターは構成的又は誘導性であり得る。
【0088】
さらに別の態様では、本発明は、上記に開示された実施形態のいずれか１つの単離核酸分子又は上記で定義された発現ベクターを含む及び／又は発現する細胞を提供する。
【0089】
特定の実施形態において、前記細胞は、細菌、真菌、哺乳動物又は植物細胞、好ましく
は細菌細胞、特に大腸菌から選択される。
は細菌細胞、特に大腸菌から選択される。
【0090】
さらに別の態様では、本発明は、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又はその機能的断片を生成する方法であって、（ｉ）上記の開示された実施形態のいずれか１つの細胞を培養することと、（ｉｉ）前記変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを前記細胞から分離することにより、変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼを得ることとを含む、前記方法を対象とする。
【0091】
特定の実施形態において、前記細胞は、細菌、真菌、哺乳動物又は植物細胞、好ましくは細菌細胞、特に大腸菌から選択される。
【0092】
細菌細胞を増殖させるための方法、及び細胞から分泌されたタンパク質を回収するための方法は、当技術分野で周知である（Ｃｈｏｉ， Ｊ．Ｈ．， ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｓ．Ｙ．， ２００４）。非限定的な例として、大腸菌細胞は、グルコースを含む溶原培地（ＬＢ）培地などの適切な増殖培地で増殖させてもよい。次に、細菌を回収し、適切な溶解バッファーで溶解し、例えば超音波処理によって破壊する。あるいは、タンパク質は、増殖培地へのタンパク質の分泌を促進するシグナル配列でタグ付けされており、これにより、細胞を溶解する工程が節約される。次に、分泌又は放出されたタンパク質は、清澄化された増殖培地又は溶解物から単離及び精製される。目的のタンパク質が単離を容易にする目的でタグ付けされている場合、タグに特異的に結合するカラムで精製され、洗浄され、溶出される。例えば、目的のタンパク質とマルトース結合タンパク質とを含む組換えタンパク質を含む清澄化した溶解物をアミロースカラムにロードする。次に、組換えタンパク質をマルトース添加カラムバッファーで溶出する。タンパク質を含む溶出画分を収集し、濃縮し、所望によりサイズ排除カラムを使用して分画する。変異酵素を生成するための方法の非限定的な特定の例は、以下の実施例に見出される。
【0093】
特定の実施形態において、前記ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのタグをさらに含む（例えば、配列番号１０～１２のいずれか１つに示される又は同様にそのようなタグに融合されている表２の配列番号１６～１１０の配列のいずれかに記載されている）。あるいは、本発明のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼは、上記のように増殖培地への分泌を促進するシグナル配列を含む融合タンパク質として提供又はコード化され得る。
【0094】
さらに、ラクトナーゼ及びホスホトリエステラーゼの触媒活性は、例えば、本発明の実験部分に開示された方法によって、それぞれの基質で試験され得る。
【0095】
さらなる態様において、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つの組成物で少なくとも部分的に覆われるか又はコーティングされた、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料を提供する。
【0096】
特定の実施形態では、前記植物は、リンゴ及びナシの木などのバラ科作物、ニンジン、ジャガイモ、トマト、葉物野菜、カボチャ及び他のウリ科植物、タマネギ、ピーマン、セントポーリアなどのイワタバコ科、ビーツ、及びジャガイモから選択される。
【0097】
本明細書で使用される「治療（する）」という用語は、所望の生理学的効果を得る手段を指す。その効果は、病害及び／又は病害に起因する症状を部分的又は完全に治癒するという点で治療的であり得る。この用語は、病害を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、病害を改善すること、すなわち病害の退行を引き起こすこと、又は感染を防止又は制限することにより、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料を病害から保護することを指す。本明細書で使用される用語はさらに、例えば、ＥＰＳの形成に寄与す
る細胞外多糖（ＥＰＳ）マトリックス又はレバンの減少に見られる細菌の病原性の減少を指す（図３を参照）。
る細胞外多糖（ＥＰＳ）マトリックス又はレバンの減少に見られる細菌の病原性の減少を指す（図３を参照）。
【0098】
「予防（する）」という用語は、本明細書では「保護（する）」又は「予防的治療」という用語と互換的に使用されてもよく、識別可能な微生物感染前に、感染しやすい哺乳動物、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料への本発明の組成物を適用することを指す。
【0099】
前記組成物を適用することにより、例えば、種子、果実、開花、又は花への感染を防ぐ方法は、本予防方法の対象ではなかった種子、果実、開花、又は花と比較して、その後の感染の減少をもたらし得る。前記処理は細菌の死滅させたり細胞増殖の阻害したりしないため、前記用語は必ずしも微生物感染又は微生物の存在の完全な欠如をもたらすと理解されるべきではない。例えば、識別可能な感染の前に微生物感染を防止する方法に供された種子は、植え付け後、本方法に供されなかった種子に由来する植物と比較して、より長い茎長及び葉量を有する植物をもたらし、この場合、本発明の防止方法の効果が観察され得る。植物バイオマス収量の違いは、未処理の種子と比較して、種子の無感染、又は予防的処理にもかかわらず、その後に発症した前処理された種子の感染レベル低下の結果となる。花、全開花、及び果実は、本発明の組成物を適用することによって同様に前処理してもよく、その結果、花、開花、及び果実の完全性が維持され（図４Ａ～図４Ｃを参照）、したがって収量が増加する。別の例は、（同じ圃場又は他の圃場からの）感染した植物の近くで成長する植物又は実生における微生物の感染を防ぐために本発明の方法を使用することが考えられる。感染性病原体が感染した植物又は圃場から元々感染していない植物又は圃場に広がる場合、予防的処理は植物を保護し、よって本方法の対象とされなかった植物又は苗と比較してより高い収量をもたらす。
【0100】
本発明の方法は、本明細書で定義される組成物を、植物又は部分、器官、若しくは植物繁殖材料に直接適用することを含み得る。あるいは、前記組成物は、顆粒、粉剤、乳化性濃縮物、水和剤、ペースト、水性流動性物質、乾燥流動性物質、油剤、エアロゾル、噴霧剤、又は燻蒸剤などの製剤に、上記のように適切な固体担体、液体担体、乳化および分散剤とともに適用することができる。
【0101】
特定の実施形態において、上記の組成物又は製剤のいずれか１つは、噴霧、浸漬、ドレッシング、コーティング、ペレット化、又は浸漬によって、植物又はその一部、器官、若しくは植物繁殖材料に適用される。
【0102】
特定の実施形態において、本発明の方法は、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、又は植物の一部などの繁殖材料に対する上記で定義された細菌の感染の治療又は予防を目的とし、前記組成物は、感染の検出の前又は後に、噴霧、浸漬、ドレッシング、コーティング、ペレット化、又は浸漬によって前記繁殖材料に適用される。
【0103】
特定の実施形態において、前記植物繁殖材料は、種子又は果実である。
【0104】
特定の実施形態では、前記植物の部分は、葉、枝、花、開花、花序、又は茎である。
【0105】
「結核菌由来のホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ」という用語は、本明細書では、「結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ）」及びクオラムクエンチング（ＱＱ）ＰＰＨという用語と互換的に使用される。
【0106】
「本質的に～からなる」又は「～から本質的になる」という移行句は、アミノ酸又は核酸配列を指す場合、列挙された配列を含み、列挙されていないタンパク質自体又は核酸配
列によってコード化されるタンパク質の基本的及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさない配列の存在又は不在を受け入れる配列を指す。
列によってコード化されるタンパク質の基本的及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさない配列の存在又は不在を受け入れる配列を指す。
【0107】
５０％の残留活性が測定される温度を指す場合の「実質的に高い」という用語は、基準より少なくとも５℃高い差を指す。
【0108】
「より有意に高い」という用語は、例えば、α＝０．０５のスチューデントのｔ検定で試験した統計的に有意な差を指す。
【0109】
本明細書で使用される「約」という用語は、提供された値より１０％上又は下の値も含まれることを意味する。しかしながら、「約」という用語が前に付いていない数値は、全ての場合にこの用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて±１０％まで変動し得る近似値である。
【0110】
【表1】
【0111】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【0112】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【0113】
材料及び方法：
クローニング、発現、及び精製
結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ）（７）（Ｓｙｎｔｅｚｚａ）の合成遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合体として発現させるために、発現ベクターｐＭａｌ－ｃ４Ｘ（ＮＥＢ）のＥｃｏＲＩ部位及びＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＭＡＬ－ｃ４ｘ－ＰＰＨを生成し、これを使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５Ｒ細胞を形質転換した。
クローニング、発現、及び精製
結核菌由来の推定パラチオン加水分解酵素（ＰＰＨ）（７）（Ｓｙｎｔｅｚｚａ）の合成遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合体として発現させるために、発現ベクターｐＭａｌ－ｃ４Ｘ（ＮＥＢ）のＥｃｏＲＩ部位及びＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＭＡＬ－ｃ４ｘ－ＰＰＨを生成し、これを使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５Ｒ細胞を形質転換した。
【0114】
ＰＰＨ野生型及びバリアントの発現及び精製
大規模生産のために、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２を含むＬＢ培地（５ ｍＬ）に、ｐＭＡＬ－ｃ４ｘＰＰＨで新たに形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、一晩増殖させた。得られた培養物を５００ｍＬの同じ培地に加え、３０℃で一晩増殖させた。後続の工程を４℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１：５００に希釈したヒスチジンタグ付きプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）、及び１００ μＭＺｎＣｌ２］に再懸濁した。遠心分離後、上清をカラムバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１００μＭ ＺｎＣｌ２］で平衡化したアミロースカラム（ＮＥＢ）に通した。融合タンパク質は、１０ｍＭマルトースを添加したカラムバッファーで溶出した。収集した画分の酵素活性をチオブチリルブチロラクトン（ＴＢＢＬ）で分析し、最も高い活性を含む画分を一
緒にプールし、アセンブリバッファーに対して透析した。融合酵素の純度は、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確立され、４℃で保存した。
大規模生産のために、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２を含むＬＢ培地（５ ｍＬ）に、ｐＭＡＬ－ｃ４ｘＰＰＨで新たに形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、一晩増殖させた。得られた培養物を５００ｍＬの同じ培地に加え、３０℃で一晩増殖させた。後続の工程を４℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１：５００に希釈したヒスチジンタグ付きプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）、及び１００ μＭＺｎＣｌ２］に再懸濁した。遠心分離後、上清をカラムバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１００μＭ ＺｎＣｌ２］で平衡化したアミロースカラム（ＮＥＢ）に通した。融合タンパク質は、１０ｍＭマルトースを添加したカラムバッファーで溶出した。収集した画分の酵素活性をチオブチリルブチロラクトン（ＴＢＢＬ）で分析し、最も高い活性を含む画分を一
緒にプールし、アセンブリバッファーに対して透析した。融合酵素の純度は、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確立され、４℃で保存した。
【0115】
酵素反応速度論
ＰＰＨバリアントのラクトナーゼ活性は、９６ウェルプレート及びマイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅＫ社、光学長：約０．５ｃｍ）を使用して２５℃で２００μＬの反応容量の吸光度変化をモニタリングすることにより分析した。各基質について、基質濃度に関係なく、同じ濃度の有機溶媒で、記載されているように反応を行った（７）。使用した基質を、モニタリング波長、経路長０．５ｃｍの吸光係数、及び最終有機溶媒含有量と共に以下に示す：ＴＢＢＬ及び指示薬としての０．５ｍＭ ５，５‘－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（３３）（４１２ｎｍ、７０００ＯＤ／Ｍ、１％アセトニトリル、０．５％ＤＭＳＯ）。Ｃ６－オキソ－ホモセリンラクトンの加水分解は、既に記載されているように（３５）、ｐＨ指示薬を使用してカルボン酸生成物の出現を追跡することによってモニタリングした。反応混合物は、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ ビシンバッファー（ｐＨ８．３）に０．０１～１ｍＭのラクトン基質を含み、ｐＨ指示薬として０．２～０．３ｍＭのクレゾールパープル（５７７ｎｍ、１５５０～２５００ＯＤ／Ｍ、１％ＤＭＳＯ）を添加した。初期速度（Ｖ０）は、酵素の非存在下での自発的加水分解のバックグラウンド速度に対して補正した。速度論的パラメーターは、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ）方程式［Ｖ０＝ｋｃａｔ［Ｅ］０［Ｓ］０／（［Ｓ］０＋ＫＭ）］に直接初期速度を当てはめることによって得た。誤差範囲は、少なくとも３回の独立した測定から得られたデータの標準偏差に関連している。
ＰＰＨバリアントのラクトナーゼ活性は、９６ウェルプレート及びマイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＴｅＫ社、光学長：約０．５ｃｍ）を使用して２５℃で２００μＬの反応容量の吸光度変化をモニタリングすることにより分析した。各基質について、基質濃度に関係なく、同じ濃度の有機溶媒で、記載されているように反応を行った（７）。使用した基質を、モニタリング波長、経路長０．５ｃｍの吸光係数、及び最終有機溶媒含有量と共に以下に示す：ＴＢＢＬ及び指示薬としての０．５ｍＭ ５，５‘－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（３３）（４１２ｎｍ、７０００ＯＤ／Ｍ、１％アセトニトリル、０．５％ＤＭＳＯ）。Ｃ６－オキソ－ホモセリンラクトンの加水分解は、既に記載されているように（３５）、ｐＨ指示薬を使用してカルボン酸生成物の出現を追跡することによってモニタリングした。反応混合物は、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ ビシンバッファー（ｐＨ８．３）に０．０１～１ｍＭのラクトン基質を含み、ｐＨ指示薬として０．２～０．３ｍＭのクレゾールパープル（５７７ｎｍ、１５５０～２５００ＯＤ／Ｍ、１％ＤＭＳＯ）を添加した。初期速度（Ｖ０）は、酵素の非存在下での自発的加水分解のバックグラウンド速度に対して補正した。速度論的パラメーターは、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ）方程式［Ｖ０＝ｋｃａｔ［Ｅ］０［Ｓ］０／（［Ｓ］０＋ＫＭ）］に直接初期速度を当てはめることによって得た。誤差範囲は、少なくとも３回の独立した測定から得られたデータの標準偏差に関連している。
【0116】
ライブラリーの構築及びスクリーニング
ＰＰＨ遺伝子に由来する遺伝子ライブラリーは、遺伝子ごとに平均２つの非同義変異を生成するように調整されたＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して構築した。変異原性ＰＣＲに続いて、ｐＭａｌ－ｃ４Ｘについて説明したように、ライブラリーを改変ｐＭＡＬベクターにクローン化して戻した。クローン化したライブラリーをＢＬ２１細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％（ｗ／ｖ）グルコースを添加したＬＢプレートにプレーティングした。スクリーニングの各ラウンドで、約６００のランダムに選択した単一コロニーを採取し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％（ｗ／ｖ）グルコースを添加した５００μＬのＬＢを含む９６ディープウェルプレートで、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。一晩培養物を使用して、９６個のディープウェルプレートに２００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した新鮮な５００μＬのＬＢを（１：２０希釈で）接種した。細胞を３０℃で約４時間振とうしながらＯＤ６００＝０．６～１．０まで増殖させた後、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し（最終濃度０．４ｍＭ）、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの発現を誘導した。２０℃で一晩インキュベートした後、細胞をペレット化し、－８０℃で凍結した。細胞を溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１００μＭ ＭｎＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬリゾチーム、０．５単位／ｍＬベンゾナーゼ、０．１％トリトンＸ－１００、１：５００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８８４９）を、２５℃で９６０ｒｐｍで１時間振とう）に再懸濁した。溶解物を遠心分離により清澄化し、４５℃でインキュベートし、室温に冷却し、活性バッファーで希釈し、指示薬として０．５ｍＭ ５，５‘－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と共にＴＢＢＬの加水分解をアッセイした。各ラウンドでは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩキットを使用して遺伝子をシャッフル及び変異させた次のラウンドの親として機能するように、活性が最も多いバリアントを選択した。
ＰＰＨ遺伝子に由来する遺伝子ライブラリーは、遺伝子ごとに平均２つの非同義変異を生成するように調整されたＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して構築した。変異原性ＰＣＲに続いて、ｐＭａｌ－ｃ４Ｘについて説明したように、ライブラリーを改変ｐＭＡＬベクターにクローン化して戻した。クローン化したライブラリーをＢＬ２１細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％（ｗ／ｖ）グルコースを添加したＬＢプレートにプレーティングした。スクリーニングの各ラウンドで、約６００のランダムに選択した単一コロニーを採取し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１％（ｗ／ｖ）グルコースを添加した５００μＬのＬＢを含む９６ディープウェルプレートで、３７℃で振とうしながら一晩増殖させた。一晩培養物を使用して、９６個のディープウェルプレートに２００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した新鮮な５００μＬのＬＢを（１：２０希釈で）接種した。細胞を３０℃で約４時間振とうしながらＯＤ６００＝０．６～１．０まで増殖させた後、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し（最終濃度０．４ｍＭ）、ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼの発現を誘導した。２０℃で一晩インキュベートした後、細胞をペレット化し、－８０℃で凍結した。細胞を溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１００μＭ ＭｎＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬリゾチーム、０．５単位／ｍＬベンゾナーゼ、０．１％トリトンＸ－１００、１：５００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８８４９）を、２５℃で９６０ｒｐｍで１時間振とう）に再懸濁した。溶解物を遠心分離により清澄化し、４５℃でインキュベートし、室温に冷却し、活性バッファーで希釈し、指示薬として０．５ｍＭ ５，５‘－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と共にＴＢＢＬの加水分解をアッセイした。各ラウンドでは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩキットを使用して遺伝子をシャッフル及び変異させた次のラウンドの親として機能するように、活性が最も多いバリアントを選択した。
【0117】
ｗｔＰＰＨ及びその進化型の熱安定性及び貯蔵寿命
熱安定性は、酵素バリアントを４～７０℃の範囲内の温度で１時間プレインキュベートすることによって試験し、０．５μＭに設定し、ＴＢＢＬは０．２ｍＭに設定した（６）。残留活性は、室温でラクトナーゼ活性を追跡することによって測定した。貯蔵寿命の測定では、ｗｔＰＰＨ及び進化型バリアント（０．５μＭ酵素濃度）の両方のラクトナーゼ活性を、精製後、酵素溶液を室温に保った後、０．１ｍＭ ＴＢＢＬで１８日間測定した。
熱安定性は、酵素バリアントを４～７０℃の範囲内の温度で１時間プレインキュベートすることによって試験し、０．５μＭに設定し、ＴＢＢＬは０．２ｍＭに設定した（６）。残留活性は、室温でラクトナーゼ活性を追跡することによって測定した。貯蔵寿命の測定では、ｗｔＰＰＨ及び進化型バリアント（０．５μＭ酵素濃度）の両方のラクトナーゼ活性を、精製後、酵素溶液を室温に保った後、０．１ｍＭ ＴＢＢＬで１８日間測定した。
【0118】
実施例１．ｃ６－オキソ－ＨＳＬによる酵素の組換え発現、精製、及び生化学的性質決定
結核菌由来のＰＰＨのコード化遺伝子及びその進化型バリアントを、発現ベクターｐＭａｌ－ｃ４Ｘにクローン化し、大腸菌－ＢＬ２１（ＤＥ３）（配列番号１０）で、高結合性変異体（Ａ３１３Ｖ）マルトース結合タンパク質との融合タンパク質として過剰発現させた。次に、細胞を溶解し、アミロースカラム（ＮＥＢ）を使用してタンパク質を精製した。精製後、酵素の最適温度、熱安定性、及び発色基質（ＴＢＢＬ、チオブチリルブチロラクトン）での貯蔵寿命を試験した。Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ（別名Ｎ－カプロイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］ヘキサンアミド、ＨＨＬ）、植物病原体のエルウィニア・アミロボラ（Ｅ．ａｍｙｌｏｖｏｒａ）によって分泌されるラクトンとの活性について、前述のように、ｐＨ指示薬アッセイを使用した（７）。図１Ｂ及び図２Ａを参照。ＰＰＨはＣ６－オキソ－ＨＳＬで高い活性を示し、Ｋｃａｔ／ＫＭ 値は、１．２４×１０５ｓ－１／Ｍ－１であった（表３を参照）。その最適温度は４０℃であり（図１Ａ）、熱安定性の観点から、５５℃で５０％の残留活性を示した。図２Ｂを参照。
結核菌由来のＰＰＨのコード化遺伝子及びその進化型バリアントを、発現ベクターｐＭａｌ－ｃ４Ｘにクローン化し、大腸菌－ＢＬ２１（ＤＥ３）（配列番号１０）で、高結合性変異体（Ａ３１３Ｖ）マルトース結合タンパク質との融合タンパク質として過剰発現させた。次に、細胞を溶解し、アミロースカラム（ＮＥＢ）を使用してタンパク質を精製した。精製後、酵素の最適温度、熱安定性、及び発色基質（ＴＢＢＬ、チオブチリルブチロラクトン）での貯蔵寿命を試験した。Ｃ６－オキソ－ＨＳＬ（別名Ｎ－カプロイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－［（３Ｓ）－テトラヒドロ－２－オキソ－３－フラニル］ヘキサンアミド、ＨＨＬ）、植物病原体のエルウィニア・アミロボラ（Ｅ．ａｍｙｌｏｖｏｒａ）によって分泌されるラクトンとの活性について、前述のように、ｐＨ指示薬アッセイを使用した（７）。図１Ｂ及び図２Ａを参照。ＰＰＨはＣ６－オキソ－ＨＳＬで高い活性を示し、Ｋｃａｔ／ＫＭ 値は、１．２４×１０５ｓ－１／Ｍ－１であった（表３を参照）。その最適温度は４０℃であり（図１Ａ）、熱安定性の観点から、５５℃で５０％の残留活性を示した。図２Ｂを参照。
【0119】
実施例２．ランダムな遺伝子ライブラリーの構築並びにより高い活性、熱安定性、及び貯蔵寿命を備えた改良型バリアントの単離
ＰＰＨコード化遺伝子を使用して、Ｇｅｎｅ Ｍｏｒｐｈランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して遺伝子ライブラリーを構築した。ＰＣＲ増幅後、得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘにライゲーションした後、外部プライマーを使用したネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。ライブラリープラスミドを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、ライブラリーサイズを５０００と推定し、プラスミドＤＮＡを単離した。非選択ライブラリーの個々のクローンの配列を決定し、遺伝子あたり平均２～３個の点突然変異を特定した。ランダム突然変異誘発（３～４×１０５バリアントのライブラリーサイズ）の作成及び熱安定性の向上のためのスクリーニング（ラウンドあたり６００バリアント）の数ラウンドを使用して、固有配列を有する２つのバリアントを単離した。図２を参照。以下の変異を内包するバリアント：バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５のＧ５８Ｖ［Ｇ５９Ｖ；配列番号１１］及びバリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ８－Ｄ１２のＨ１７１Ｙ［Ｈ１７２Ｙ；配列番号１２］は、野生型酵素と同桁数の１０５ ｓ－１Ｍ－１の高い触媒活性ｋｃａｔ／ＫＭを示す（表３）。ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の場合、ｋｃａｔ／ＫＭは２倍に増加した。表３及び図２Ａを参照。さらに、熱安定性が向上し、５０％の残留活性が約１５度増加し、６０℃まで１００％の活性を維持した（図２Ｂ）。ｗｔＰＰＨと比較した進化型バリアントの貯蔵寿命をさらに分析した。図２Ｃに示すように、精製から１３日後、バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の残留活性は約５０％であったが、ｗｔＰＰＨの活性は２０％であった。これにより、抗菌処理として農業での使用により適したものとなる。
ＰＰＨコード化遺伝子を使用して、Ｇｅｎｅ Ｍｏｒｐｈランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して遺伝子ライブラリーを構築した。ＰＣＲ増幅後、得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘにライゲーションした後、外部プライマーを使用したネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。ライブラリープラスミドを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、ライブラリーサイズを５０００と推定し、プラスミドＤＮＡを単離した。非選択ライブラリーの個々のクローンの配列を決定し、遺伝子あたり平均２～３個の点突然変異を特定した。ランダム突然変異誘発（３～４×１０５バリアントのライブラリーサイズ）の作成及び熱安定性の向上のためのスクリーニング（ラウンドあたり６００バリアント）の数ラウンドを使用して、固有配列を有する２つのバリアントを単離した。図２を参照。以下の変異を内包するバリアント：バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５のＧ５８Ｖ［Ｇ５９Ｖ；配列番号１１］及びバリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ８－Ｄ１２のＨ１７１Ｙ［Ｈ１７２Ｙ；配列番号１２］は、野生型酵素と同桁数の１０５ ｓ－１Ｍ－１の高い触媒活性ｋｃａｔ／ＫＭを示す（表３）。ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の場合、ｋｃａｔ／ＫＭは２倍に増加した。表３及び図２Ａを参照。さらに、熱安定性が向上し、５０％の残留活性が約１５度増加し、６０℃まで１００％の活性を維持した（図２Ｂ）。ｗｔＰＰＨと比較した進化型バリアントの貯蔵寿命をさらに分析した。図２Ｃに示すように、精製から１３日後、バリアントＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５の残留活性は約５０％であったが、ｗｔＰＰＨの活性は２０％であった。これにより、抗菌処理として農業での使用により適したものとなる。
【0120】
【表3】
【0121】
実施例３．野生型ＱＱＰＰＨラクトナーゼは、培養中の細胞外多糖形成を阻害する
細胞外多糖（ＥＰＳ）マトリックスの形成に見られる細菌毒性の尺度として、前述のプロトコルに従って、５００ｍＭのショ糖を添加した後、４００ｎｍでレバン生成を分光的に観察した（Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。
細胞外多糖（ＥＰＳ）マトリックスの形成に見られる細菌毒性の尺度として、前述のプロトコルに従って、５００ｍＭのショ糖を添加した後、４００ｎｍでレバン生成を分光的に観察した（Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。
【0122】
精製した野生型ＰＰＨタンパク質をエルウィニア・アミロボラの細胞培養に適用すると、ＥＰＳ産生の３０％の減少が観察された（図３）。Ｇ５９Ｖ変異体及びＨ１７２Ｙ変異体は、ＥＰＳ産生の減少に少なくとも同じくらい効果的であると予想される。
【0123】
実施例４．ＰＰＨ変異体による火傷病の治療
ナシの火傷病を阻害するＱＱラクトナーゼの能力を評価するために、前述のプロトコルに従って、野生型ＰＰＨ酵素を使用して植物の病原性アッセイを確立した（２８）（２９）。傷つけた未成熟ナシの果実にエルウィニア・アミロボラを接種し、症状の発現をモニタリングした。ナシに対して、以下の３つの処理を施した：２０℃において３００ｒｐｍで１時間のインキュベーション後、細菌培養のみ、精製した野生型又は変異体ＰＰＨ酵素を用いた細菌培養、酵素活性バッファーを１：１の比率で用いた細菌培養。そのために、未成熟セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、「Ｓａｆａｄｏｎａ」）を７０％エタノールで表面滅菌して、細菌培養物のみ又は対照としてのラクトナーゼバッファー及びラクトナーゼでインキュベートした細菌を使用した細菌培養物を用いて滅菌針で穿刺し、加湿チャンバー内で２８℃でインキュベートした。症状を、接種後２、４、６、及び７日目に記録した。２８℃で７日間培養した後、病害の症状を測定した。未接種対照は、実験を通して無症候性のままであった。各処理群は１０個のナシからなり、実験は３回の独立した試験で経時的に繰り返した。図４Ａ～図４Ｃに見られるように、細菌－酵素（結核菌由来のＰＰＨ）溶液を用いて穿刺したナシの火傷病病変は、対照と比較して同程度に黒色化及び拡大していなかった。ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５変異体（配列番号１１）（図４Ｃ、上から３列目）は、野生型酵素（配列番号１０）（図４Ｃ、上から２行目）よりも感染制御において効果的であった。
ナシの火傷病を阻害するＱＱラクトナーゼの能力を評価するために、前述のプロトコルに従って、野生型ＰＰＨ酵素を使用して植物の病原性アッセイを確立した（２８）（２９）。傷つけた未成熟ナシの果実にエルウィニア・アミロボラを接種し、症状の発現をモニタリングした。ナシに対して、以下の３つの処理を施した：２０℃において３００ｒｐｍで１時間のインキュベーション後、細菌培養のみ、精製した野生型又は変異体ＰＰＨ酵素を用いた細菌培養、酵素活性バッファーを１：１の比率で用いた細菌培養。そのために、未成熟セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、「Ｓａｆａｄｏｎａ」）を７０％エタノールで表面滅菌して、細菌培養物のみ又は対照としてのラクトナーゼバッファー及びラクトナーゼでインキュベートした細菌を使用した細菌培養物を用いて滅菌針で穿刺し、加湿チャンバー内で２８℃でインキュベートした。症状を、接種後２、４、６、及び７日目に記録した。２８℃で７日間培養した後、病害の症状を測定した。未接種対照は、実験を通して無症候性のままであった。各処理群は１０個のナシからなり、実験は３回の独立した試験で経時的に繰り返した。図４Ａ～図４Ｃに見られるように、細菌－酵素（結核菌由来のＰＰＨ）溶液を用いて穿刺したナシの火傷病病変は、対照と比較して同程度に黒色化及び拡大していなかった。ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５変異体（配列番号１１）（図４Ｃ、上から３列目）は、野生型酵素（配列番号１０）（図４Ｃ、上から２行目）よりも感染制御において効果的であった。
【0124】
火傷病の治療又は予防における、Ｈ１７２Ｙ（配列番号３又は１２に記載のアミノ酸配列からなる）などのＨ１７２に変異を有する変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又は所望によりＭＢＰ融合タンパク質として発現され、配列番号１におけるＧ５９Ｖ若しくはＨ１７２Ｙに対応するアミノ酸残基が置換されている、配列番号１６～１１０のＰＬＬのいずれかの有効性を、野生型ＰＰＨ及びＧ５９ＶＰＰＨについて上記と同様に試験する。野生型変異体よりも火傷病の軽減及び抑制におけるこれらの変異体のより高い効力が期待される。
【0125】
実施例５．グロースチャンバー及び圃場でのＰＰＨ及びその変異体による花の火傷病の治療方法
方法
セイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の開花した開花枝を、２２℃のグロースチャンバー（明期１２時間、暗期１２時間）に置いた。４μＭのｗｔＰＰＨとその進化型変異体を含む酵素溶液を花に噴霧し、２時間後に、エルウィニア・アミロボラの細胞懸濁液（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を花に噴霧するか（感染前）、酵素及び培養物の両方を１：１の比率で３０分間混合してから噴霧（混合）した。エルウィニア・アミロボラ培養物のみを対照として使用した。実験は３回繰り返して実施し、各繰り返しで１０個の花を使用した。チャンバー内の乾燥及び温度上昇を防ぐために、チャンバー内の空調及び照明を感染後２時間停止した。
方法
セイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の開花した開花枝を、２２℃のグロースチャンバー（明期１２時間、暗期１２時間）に置いた。４μＭのｗｔＰＰＨとその進化型変異体を含む酵素溶液を花に噴霧し、２時間後に、エルウィニア・アミロボラの細胞懸濁液（１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を花に噴霧するか（感染前）、酵素及び培養物の両方を１：１の比率で３０分間混合してから噴霧（混合）した。エルウィニア・アミロボラ培養物のみを対照として使用した。実験は３回繰り返して実施し、各繰り返しで１０個の花を使用した。チャンバー内の乾燥及び温度上昇を防ぐために、チャンバー内の空調及び照明を感染後２時間停止した。
【0126】
圃場実験では、セイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の木の花に様々な酵素溶液を噴霧した：ｗｔＰＰＨ及び進化型変異体ＰＰＨ－Ｇ５８Ｖ（４μＭ）。様々な適用期間で試験した：感染の３０～４５分前又は感染と同時（噴霧前に酵素溶液を培養物と３０分間混合することによる）。全ての場合において、１０９ＣＦＵ／ｍＬのエルウィニア・アミロボラ細菌培養物を使用した。感染後、高湿度を確保するために一晩ビニール袋で花を覆った。実験は５回の繰り返しで実施し、木の両側に５個ずつの花、計１０個の花が各繰り返しに含まれた。木に生った状態での処理は、４回未満とした。接種後１３日目に各開花の罹患花を計数し、接種後２４日目に感染した花を計数して病害の症状を評価した。同様の実験を、セイヨウナシ「Ｃｏｓｔｉａ」で実施した。感染後１２日目及び３５日目に同様に病害評価を行った。圃場試験は、２０１９年と２０２０年の２年連続で、北部のフラバレー果樹園実験農場（Ｈｕｌａ Ｖａｌｌｅｙ Ｏｒｃｈａｒｄｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｆａｒｍ）（北緯３３度８分５８．１０秒、東経３５度３７分１６．９３秒）で実施した。感染した花の計数による接種から２４日後のセイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の木のデータを示す。
Ｆａｒｍ）（北緯３３度８分５８．１０秒、東経３５度３７分１６．９３秒）で実施した。感染した花の計数による接種から２４日後のセイヨウナシ「Ｓｐａｄｏｎａ」の木のデータを示す。
【0127】
結果
ＰＰＨ野生型及び進化型変異体が、グロースチャンバー内で花の病原性を阻害する能力を試験した。図５Ａ及び図５Ｂのように、接種後６日目、４μＭのｗｔＰＰＨ及びＰＰＨ－Ｇ５８Ｖの両方が、病原体感染前に適用した場合、未処理の対照と比較して花の感染を３０％抑制した。オキシリン酸は４５％抑制された。酵素及びバクテリアを混合して花に噴霧した場合、処理は効果的であったが（２０％抑制）、感染の兆候が増加した。
ＰＰＨ野生型及び進化型変異体が、グロースチャンバー内で花の病原性を阻害する能力を試験した。図５Ａ及び図５Ｂのように、接種後６日目、４μＭのｗｔＰＰＨ及びＰＰＨ－Ｇ５８Ｖの両方が、病原体感染前に適用した場合、未処理の対照と比較して花の感染を３０％抑制した。オキシリン酸は４５％抑制された。酵素及びバクテリアを混合して花に噴霧した場合、処理は効果的であったが（２０％抑制）、感染の兆候が増加した。
【0128】
圃場では、混合処理よりも変異体のプレインキュベーションに明らかな利点が観察され、現在使用されている抗生物質であるオキソリン酸と同様の阻害範囲で、ＰＰＨ－Ｇ５８Ｖによる７０％近くの阻害が認められた（図５Ｃ）。
【0129】
火傷病の治療又は予防における、Ｈ１７２Ｙ（配列番号３又は１２に記載のアミノ酸配列からなる）などのＨ１７２に変異を有する変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ又は所望によりＭＢＰ融合タンパク質として発現され、配列番号１におけるＧ５９Ｖ若しくはＨ１７２Ｙに対応するアミノ酸残基が置換されている、配列番号１６～１１０のＰＬＬのいずれかの有効性を、野生型ＰＰＨ及びＧ５９ＶＰＰＨについて上記と同様に試験する。野生型変異体よりも火傷病の軽減及び抑制におけるこれらの変異体のより高い効力が期待される。
【0130】
実施例６．ＰＰＨ変異体及び銅塩の組み合わせによる火傷病の治療
銅は、エルウィニア・アミロボラ感染の抑制に使用する保護剤（０．１９ｇ／Ｌの濃度）として周知である。
銅は、エルウィニア・アミロボラ感染の抑制に使用する保護剤（０．１９ｇ／Ｌの濃度）として周知である。
【0131】
この予備実験は、相加効果を達成するために、ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５（ＰＰＨ－Ｇ５８Ｖ）と共に低用量のＣｕ２＋を使用する可能性を確認するために実施した。２つの分離株（５１１及び５７６と命名）からのエルウィニア・アミロボラの単一コロニーの混合
物を、ＬＢ培地（１０ｍＬ）で一晩培養し、４時間リフレッシュし、各分離株をＯＤ６００ ０．５に正規化した。培養懸濁液を室温で３０分間以下と混合した：（ｉ）０．２５μＭ ＣｕＳＯ４、（ｉｉ）４μＭ ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５及び０．２５μＭ ＣｕＳＯ４。未処理の培養懸濁液を対照として使用した。
物を、ＬＢ培地（１０ｍＬ）で一晩培養し、４時間リフレッシュし、各分離株をＯＤ６００ ０．５に正規化した。培養懸濁液を室温で３０分間以下と混合した：（ｉ）０．２５μＭ ＣｕＳＯ４、（ｉｉ）４μＭ ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５及び０．２５μＭ ＣｕＳＯ４。未処理の培養懸濁液を対照として使用した。
【0132】
未成熟ナシを１％ＨＣｌで数秒間滅菌した後、Ｈ２Ｏで洗浄し、別の混合物に浸した滅菌針で穴を開けた。処理した果実を、２５℃の加湿チャンバー内で培養した。病害症状を示す直径を９日後に測定した。各処理は３回の繰り返しで実施し、各繰り返しには３～６個の未成熟ナシが含まれている。
【0133】
予備データは、０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ４を使用すると、未成熟ナシにおけるエルウィニア・アミロボラの感染度が大幅に抑制され、０．２５ ｍＭ ＣｕＳＯ４溶液に４μＭ
ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５を添加すると、ＣｕＳＯ４単独よりも優れた効果が得られた。
ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５を添加すると、ＣｕＳＯ４単独よりも優れた効果が得られた。
【0134】
図７の結果は、ＣｕＳＯ４と変異体酵素ＰＰＨ＿Ｒ２：Ｐ４－Ｄ５との組み合わせにより、感染直径から計算される（ｎ＝１２～１８個の未成熟果実）感染率（％）（ｎ＝３ ）に見られるように、どのナシも感染しなかったため、症状が完全に抑制されたことを示している。
【0135】
果実及び開花は、ナシの果実及び開花の火傷病に対して、様々な濃度のＣｕＳＯ４（例えば、０．０１２５、０．０２５、０．２５、及び２．５ｍＭ）を単独で、又は野生型若しくは変異体酵素と（例えば、４μＭで）組み合わせて処理される。対照は未処理であり、バッファーのみ又は酵素のみで処理されている。試験される変異酵素は、Ｇ５９Ｖ（配列番号２又は１１に記載のアミノ酸配列からなる）などのＧ５９に変異を有する変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、Ｈ１７２Ｙ（配列番号３又は１２に記載のアミノ酸配列からなる）などのＨ１７２に変異を有する変異型ホスホトリエステラーゼ様ラクトナーゼ、又は所望によりＭＢＰ融合タンパク質として発現され、配列番号１におけるＧ５９Ｖ若しくはＨ１７２Ｙに対応するアミノ酸残基が置換されている、配列番号１６～１１０のＰＬＬのいずれかであり、火傷病の治療又は予防において、野生型ＰＰＨ及びＧ５９ＶＰＰＨについて上記と同様に試験する。
野生型変異体よりも火傷病の軽減及び抑制におけるこれらの変異体のより高い効力が期待される。
野生型変異体よりも火傷病の軽減及び抑制におけるこれらの変異体のより高い効力が期待される。
【0136】
先行技術文献
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１８． Ｂｈａｔ ＫＡ， Ｍａｓｏｏｄ ＳＤ， Ｂｈａｔ ＮＡ， Ｂｈａｔ ＭＡ， Ｒａｚｖｉ ＳＭ， ｅｔ ａｌ． ２０１０． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．
１９． Ｌｏｈ Ｊ， Ｐｉｅｒｓｏｎ ＥＡ， Ｐｉｅｒｓｏｎ ＬＳ， Ｓｔａｃｅｙ Ｇ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ａ． ２００２． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
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２１． Ｌａｄｅ Ｈ， Ｐａｕｌ Ｄ， Ｋｗｅｏｎ ＪＨ． ２０１４． Ｎ －Ａｃｙｌ Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｌａｃｔｏｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｕｓｅ ｏｆ Ｑｕｏｒｕｍ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ． Ｉｎｔ．
２２． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＥＰ． ２００６． Ａ ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋｓ： Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
２３． Ｌｉ Ｔ， Ｗａｎｇ Ｄ， Ｌｉｕ Ｎ， Ｍａ Ｙ， Ｄｉｎｇ Ｔ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｂｙ ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２４． Ｃｏｎｗａｙ ＢＡ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＥＰ． ２００２． Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
２５． Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｖ， Ｆｒｉｓｃｉｎａ Ａ， Ｂｅｒｔａｎｉ Ｉ， Ｄｅｖｅｓｃｏｖｉ Ｇ， Ａｇｕｉｌａｒ Ｃ． ２００４． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ
２６． Ｄｕｅｒｋｏｐ ＢＡ， Ｖａｒｇａ Ｊ， Ｃｈａｎｄｌｅｒ ＪＲ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＳＢ， Ｈｅｒｍａｎ ＪＰ， ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
２７． Ｃｈｏｉ ＪＨ， Ｌｅｅ ＳＹ． ２００４． Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ
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ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
２８． Ｍｏｌｉｎａ Ｌ， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ Ｆ， Ｄｅｆａｇｏ Ｇ， Ｄｕｆｆｙ Ｂ． ２００５． Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ａｃｙｌ－ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｅ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７（９）：３２０６－１３
２９． Ｚｈａｏ Ｙ， Ｂｌｕｍｅｒ ＳＥ， Ｓｕｎｄｉｎ ＧＷ． ２００５． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｇｅｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｐｅａｒ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１． ＭｃＭａｎｕｓ ＰＳ， Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ ＶＯ， Ｓｕｎｄｉｎ ＧＷ， Ｊｏｎｅｓ ＡＬ． ２００２． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ４０（１）：４４３－６５
２． Ｐｏｌｌｕｍａａ Ｌ， Ａｌａｍａｅ Ｔ， Ｍａｅ Ａ． ２０１２． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ
ｉｎ ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉａ
３． Ａｒｎｏｌｄ ＤＬ， Ｌｏｖｅｌｌ ＨＣ， Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＷ， Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ＪＷ． ２０１１． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ： Ｆｒｏｍ “ｈａｓ ｂｅａｎ” ｔｏ ｓｕｐｅｒｍｏｄｅｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．
４． Ｌｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｏ Ｇ， Ｂｅｒｔａｎｉ Ｉ， Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒ Ｌ， Ｂｅｌｌａ Ｐ， Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｖ， Ｃａｔａｒａ Ｖ． ２００７． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｎ－ａｃｙｌ ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉ
ｎｇ ｓｙｓｔｅｍ； ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｅｃｏｌ．
５． Ｄｕｆｆｙ Ｂ， Ｓｃｈａｒｅｒ ＨＪ， Ｂｕｎｔｅｒ Ｍ， Ｋｌａｙ Ａ， Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｅ． ２００５． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｉｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ６． Ｋｈｅｒｓｏｎｓｋｙ Ｏ， Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ． ２００６． Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｃｔｏｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅｓ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ
７． Ａｆｒｉａｔ Ｌ， Ｒｏｏｄｖｅｌｄｔ Ｃ， Ｍａｎｃｏ Ｇ， Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ． ２００６． Ｔｈｅ ｌａｔｅｎｔ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌａｃｔｏｎａｓｅｓ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｄｉｖｅｒｇｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ４５（４６）：１３６７７－８６
８． Ｊａｙａｒａｍａｎ Ａ， Ｗｏｏｄ ＴＫ． ２００８． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ： ｓｉｇｎａｌｓ， ｃｉｒｃｕｉｔｓ， ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １０：１４５－６７
９． Ｖｒａｎｃｋｅｎ Ｋ， Ｈｏｌｔａｐｐｅｌｓ Ｍ， Ｓｃｈｏｏｆｓ Ｈ， Ｄｅｃｋｅｒｓ Ｔ， Ｖａｌｃｋｅ Ｒ． ２０１３． Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｅ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｉｎ Ｒｏｓａｃｅａｅ： Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ
１０． Ｃｈｅｎ Ｆ， Ｇａｏ Ｙ， Ｃｈｅｎ Ｘ， Ｙｕ Ｚ， Ｌｉ Ｘ． ２０１３． Ｑｕｏｒｕｍ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
１１． Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｚｈｏｕ Ｗ， Ｒａｏ Ｚ． ２０１９． Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， ａｎｏｔｈｅｒ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒａｓｅ－ｌｉｋｅ
ｌａｃｔｏｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．
１２． Ｗｉｅｒｅｎｇａ ＲＫ． ２００１． Ｔｈｅ ＴＩＭ－ｂａｒｒｅｌ ｆｏｌｄ： Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ
１３． Ｐｉｅｐｅｒ Ｕ， Ｗｅｂｂ ＢＭ， Ｂａｒｋａｎ ＤＴ， Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ－Ｄｕｈｏｖｎｙ Ｄ， Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． ２０１１． ＭｏｄＢａｓｅ，ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１４． Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ． ２０１８． Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ
１５． Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｖ， Ｖｅｎｕｔｉ Ｃ， Ｄｅｖｅｓｃｏｖｉ Ｇ， Ｌｕｃｃｈｅｓｅ Ｃ， Ｆｒｉｓｃｉｎａ Ａ， ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｐｒｏｄｕｃｅｓ
ａｃｙｌ－ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｐｌａｎｔａ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２４１（２）：１７９－８３
１６． Ｃｒｅｐｉｎ Ａ， Ｂａｒｂｅｙ Ｃ， Ｂｅｕｒｙ－Ｃｉｒｏｕ Ａ， Ｈｅｌｉａｓ Ｖ， Ｔａｕｐｉｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｏｆｔ－ｒｏｔ ｂａｃｔｅｒｉａ （Ｄｉｃｋｅｙａ ａｎｄ Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ
１７． Ｃｒｅｐｉｎ Ａ， Ｂｅｕｒｙ－Ｃｉｒｏｕ Ａ， Ｂａｒｂｅｙ Ｃ， Ｆａｒｍｅｒ Ｃ， Ｈｅｌｉａｓ Ｖ， ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｎ－Ａｃｙｌ Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｌａｃｔｏｎｅｓ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ Ｄｉｃｋｅｙａ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ： Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａｂｕｎｄａｎｃｅ， ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ． Ｓｅｎｓｏｒｓ
１８． Ｂｈａｔ ＫＡ， Ｍａｓｏｏｄ ＳＤ， Ｂｈａｔ ＮＡ， Ｂｈａｔ ＭＡ， Ｒａｚｖｉ ＳＭ， ｅｔ ａｌ． ２０１０． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．
１９． Ｌｏｈ Ｊ， Ｐｉｅｒｓｏｎ ＥＡ， Ｐｉｅｒｓｏｎ ＬＳ， Ｓｔａｃｅｙ Ｇ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ａ． ２００２． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
２０． Ｂａｒｎａｒｄ ＡＭＬ， Ｓａｌｍｏｎｄ ＧＰＣ． ２００７． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３８７（２）：４１５－２３
２１． Ｌａｄｅ Ｈ， Ｐａｕｌ Ｄ， Ｋｗｅｏｎ ＪＨ． ２０１４． Ｎ －Ａｃｙｌ Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｌａｃｔｏｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｕｓｅ ｏｆ Ｑｕｏｒｕｍ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ． Ｉｎｔ．
２２． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＥＰ． ２００６． Ａ ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋｓ： Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
２３． Ｌｉ Ｔ， Ｗａｎｇ Ｄ， Ｌｉｕ Ｎ， Ｍａ Ｙ， Ｄｉｎｇ Ｔ， ｅｔ ａｌ． ２０１８． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｂｙ ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２４． Ｃｏｎｗａｙ ＢＡ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＥＰ． ２００２． Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
２５． Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｖ， Ｆｒｉｓｃｉｎａ Ａ， Ｂｅｒｔａｎｉ Ｉ， Ｄｅｖｅｓｃｏｖｉ Ｇ， Ａｇｕｉｌａｒ Ｃ． ２００４． Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ
２６． Ｄｕｅｒｋｏｐ ＢＡ， Ｖａｒｇａ Ｊ， Ｃｈａｎｄｌｅｒ ＪＲ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＳＢ， Ｈｅｒｍａｎ ＪＰ， ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｑｕｏｒｕｍ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
２７． Ｃｈｏｉ ＪＨ， Ｌｅｅ ＳＹ． ２００４． Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
２８． Ｍｏｌｉｎａ Ｌ， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ Ｆ， Ｄｅｆａｇｏ Ｇ， Ｄｕｆｆｙ Ｂ． ２００５． Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ａｃｙｌ－ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｅ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７（９）：３２０６－１３
２９． Ｚｈａｏ Ｙ， Ｂｌｕｍｅｒ ＳＥ， Ｓｕｎｄｉｎ ＧＷ． ２００５． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｇｅｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｐｅａｒ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【国際調査報告】