特表2022-537042インクレチンミメティックが装填された脂質ナノカプセル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-23
(54)【発明の名称】インクレチンミメティックが装填された脂質ナノカプセル
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20220816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220816BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220816BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220816BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220816BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220816BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220816BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20220816BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220816BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220816BHJP
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A61P 9/12 20060101ALI20220816BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220816BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220816BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220816BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220816BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220816BHJP
A61K 9/113 20060101ALI20220816BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20220816BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20220816BHJP
A61K 47/14 20060101ALI20220816BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220816BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22
A61P43/00 121
A61P3/10 ZNA
A61P3/04
A61P1/04
A61P29/00
A61P43/00 111
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A61P1/18
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A61P3/00
A61P9/10
A61P9/04
A61P9/12
A61P9/00
A61P9/10 101
A61P13/12
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A61P25/00
A61K45/00
A61K9/113
A61K47/44
A61K47/12
A61K47/14
A61K47/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575315
(86)(22)【出願日】2020-05-27
(85)【翻訳文提出日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 EP2020064766
(87)【国際公開番号】W WO2020254083
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】62/864,661
(32)【優先日】2019-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】19187820.6
(32)【優先日】2019-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511294534
【氏名又は名称】ウニベルシテ カソリーク デ ルーベン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ベロクイ，アナ
(72)【発明者】
【氏名】シュウ，イーニン
(72)【発明者】
【氏名】プレト，ヴェロニク
(72)【発明者】
【氏名】カニ，パトリス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA18
4C076BB01
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4C084ZC031
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4C084ZC331
4C084ZC332
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC751
(57)【要約】
本発明は、固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む、経口投与用の脂質ナノカプセルに関する。また本発明は、ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するための脂質ナノカプセルの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
経口投与用の脂質ナノカプセルであって、固体の脂質外殻と、
１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、脂質ナノカプセル。
【請求項2】
前記固体の脂質外殻が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、脂溶性界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の界面活性剤を含む、請求項１に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項3】
前記脂溶性液体内核が、１種以上の油を含む、請求項１または２に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項4】
前記１種以上の油が、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはそれらの混合物である、請求項３に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項5】
前記逆ミセルが、界面活性剤、油、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の成分を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項6】
前記脂質ナノカプセルが、約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項7】
前記脂質ナノカプセルが、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導する、請求項１～６のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項8】
前記１種以上のインクレチンミメティックが、アルビグルチド、デュラグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、およびセマグルチドを含む群で選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項9】
前記１種以上のインクレチンミメティックが、エキセナチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項10】
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、および任意選択でペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項11】
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３を含む固体の脂質外殻と、油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項12】
エキセナチドが、肥満／糖尿病を高脂肪食により誘導したマウスにおいて少なくとも４％の相対的なバイオアベイラビリティを特徴とする薬物動態プロファイルを有する、請求項９～１１のいずれか１項に記載の脂質ナノカプセル。
【請求項13】
固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と、を含む経口投与用の脂質ナノカプセルの治療有効量、および薬学的に許容されるビヒクル
を含む、医薬組成物。
【請求項14】
固体の脂質外殻と１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む経口投与用の脂質ナノカプセルの治療有効量を含む、医薬。
【請求項15】
それを必要とする対象のＧＬＰ－１機能不全に関連する障害の処置および／または予防に使用するための、固体の脂質外殻と１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む脂質ナノカプセル。
【請求項16】
前記障害が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖、脂肪肝、過体重、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、前糖尿病、空腹時血中ブドウ糖不良、過食症、食物摂取挙動の変化、肝臓インスリン抵抗性、全身インスリン抵抗性、移行の加速、脂肪組織炎症、心機能不全、急性心筋梗塞、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、ニューロパチー、および胃不全麻痺を含む群で選択される、請求項１５に記載の使用のための脂質ナノカプセル。
【請求項17】
前記障害が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む群で選択される、請求項１６に記載の使用のための脂質ナノカプセル。
【請求項18】
ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するためのキットであって、固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と、を含む１つ以上の脂質ナノカプセル、および
１種以上の経口血糖降下薬
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脂質ナノカプセルベースの薬物送達システムおよびＧＬＰ－１関連障害を処置するためのその使用の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
治療用ペプチドの全身循環への吸収を可能にする経口剤形の開発は、製薬業界にとって最大の課題の１つである。選択された糖尿病ペプチドは、それらの低い経口バイオアベイラビリティ（０．５～１．０％であると推定）にも関わらず、開発の後期に移行している。それでもなお、静脈内投与または皮下投与を上回る経口ペプチド送達の利点は、特に、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）などの抗糖尿病薬の場合に顕著である。インクレチンミメティックペプチドの経口投与は、ネイティブなペプチドの通常の生理経路を模倣するというさらなる治療上の利点を有する。ＧＬＰ－１アゴニストは、肝門領域を標的とし、皮下送達を介するよりも肝門脈を介してより高い濃度でアクセスすることにより、全身への曝露およびその関連する副作用を低減することができる。インクレチンミメティックペプチドの投与の経口経路を利用するために多くの進行中の試みがなされているにも関わらず、市場において現在経口投与されているものは、ＧＬＰ－１類縁体のみであり（セマグルチド、Ｒｙｂｅｌｓｕｓ（登録商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋにより開発）、これは、機能的な賦形剤、すなわちナトリウムＮ－［８－（２－ヒドロキシベンゾイル）アミノ］カプリラート（ＳＮＡＣ）の同時投与を必要とする。
【0003】
胃腸の生理機能は、刺激的な環境を提供し、薬物送達の分野においてその完全な潜在能力までは完全に利用されてはいない。幅広い様々な細胞が、胃腸上皮を介して点在している。これらのうち、腸内分泌Ｌ細胞は、それらが分泌するペプチド（たとえばＧＬＰ－１およびＧＬＰ－２）の多面的な作用のため、特に関心を集めている。これら細胞は、５～７日間の比較的迅速なターンオーバーを有し、その密度は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの病態において増大し、これら疾患の処置にとって魅力的な標的となっている。Ｔ２ＤＭの状況では、消化器系Ｌ細胞から分泌されるＧＬＰ－１は、食後のインスリン分泌を刺激し、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）により迅速に加水分解される。よって、血漿中半減期が改善されているいくつかのＧＬＰ－１類縁体（たとえばエキセナチド、リラグルチド、セマグルチド）が開発されており、Ｔ２ＤＭの処置を成功させることが証明されている。近年では、研究者は、肥満、Ｔ２ＤＭ、およびＩＢＤの処置の標的として、分泌されたペプチドからＬ細胞自身に興味を向けている。実際に、内因性ＧＬＰ－１の分泌を高めることは、インクレチンベースの糖尿病療法においてより生理的かつ新規な代替案を提示するであろう（Ｂｕｒａｎｔ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ． ２０１３； ３６ Ｓｕｐｐｌ ２， Ｓ１７５－１７９）。酪酸およびプロピオン酸を含む短鎖脂肪酸などの腸管内腔で見出される特定の内因性リガンドはＬ細胞を活性化し得るが、ナノ担体の使用は、腸ペプチドの産生を刺激するための別の治療戦略を提示し得る。実際に、ナノ担体は、特定のリガンドを模倣するように操作でき、腸での滞留を増大させるように設計することにより、長期間のＬ細胞の活性化を誘発することができる。
【0004】
経口ペプチド送達の現在の戦略は、送達システムを単にビヒクルとして使用する。これらのうちいずれもが、製剤の最大治療可能性を達成するために担体自身の生理的な特性を利用しない。
【0005】
本発明者らは、機能障害性糖血症に関連する代謝障害を処置および／または予防するための経口経路を介したインクレチンミメティックを使用する前例のない手法を開発した。実際に、本発明者らは、ＧＬＰ－１類縁体とナノ担体を組み合わせることが、急性的または常習的な処置の後に肥満／糖尿病のマウスの糖血症を正常にするために十分であるとのエビデンスを提供する。本発明の脂質ナノカプセルベースの薬物送達システムは、自身の生体作用（ＧＬＰ－１放出の刺激）およびカプセル化された生物活性分子（インクレチンミメティック）の生体作用を相乗的に協同させる。興味深いことに、経口経路を使用する強力な利点に加えて、この手法は、少なくとも現在販売されている薬物と同程度効率的であり、さらには、経口グルコース負荷、インスリン抵抗性、脂質分布、および脂肪肝の改善により効果的であり得る。よって、この戦略は、経口インクレチンミメティックペプチド送達において現在の手法を超えるさらなる利点を提供し、内因性ＧＬＰ－１レベルの増大を提供する。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、経口投与用の脂質ナノカプセルであって、
固体の脂質外殻と、
１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、脂質ナノカプセルに関する。
固体の脂質外殻と、
１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、脂質ナノカプセルに関する。
【0007】
一実施形態では、固体の脂質外殻は、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、脂溶性界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の界面活性剤を含む。
【0008】
一実施形態では、脂溶性液体内核は、１種以上の油を含む。一実施形態では、１種以上の油は、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはそれらの混合物である。
【0009】
一実施形態では、逆ミセルは、界面活性剤、油、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の成分を含む。
【0010】
一実施形態では、脂質ナノカプセルは、約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【0011】
一実施形態では、脂質ナノカプセルは、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導する。
【0012】
一実施形態では、１種以上のインクレチンミメティックは、アルビグルチド、デュラグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、およびセマグルチドを含む群で選択される。一実施形態では、１種以上のインクレチンミメティックは、エキセナチドである。
【0013】
一実施形態では、ナノカプセルは、
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、および任意選択でペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、および任意選択でペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0014】
一実施形態では、脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0015】
一実施形態では、エキセナチドは、肥満／糖尿病を高脂肪食により誘導したマウスにおいて少なくとも４％の相対的なバイオアベイラビリティを特徴とする薬物動態プロファイルを有する。
【0016】
本発明の別の対象は、固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む経口投与用の脂質ナノカプセルの治療有効量と、
薬学的に許容されるビヒクルと
を含む、医薬組成物である。
薬学的に許容されるビヒクルと
を含む、医薬組成物である。
【0017】
また本発明は、固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む経口投与用の脂質ナノカプセルの治療有効量を含む医薬に関する。
【0018】
さらに本発明は、それを必要とする対象のＧＬＰ－１機能不全に関連する障害の処置および／または予防に使用するための、固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む脂質ナノカプセルに関する。
【0019】
一実施形態では、障害は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖、脂肪肝、過体重、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、前糖尿病、空腹時血中ブドウ糖不良、過食症、食物摂取挙動の変化、肝臓インスリン抵抗性、全身インスリン抵抗性、移行の加速、脂肪組織炎症、心機能不全、急性心筋梗塞、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、ニューロパチー、および胃不全麻痺を含む群で選択される。一実施形態では、上記障害は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む群で選択される。
【0020】
本発明の別の対象は、
ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するためのキットであって、
固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と
を含む、キットである。
ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するためのキットであって、
固体の脂質外殻と、１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核とを含む１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と
を含む、キットである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【0022】
ある値に先行する「約」は、上記値の±１０％を意味する。用語「約」が表す値は、それ自体もまた具体的であり、好ましくは開示されていることを理解されたい。
【0023】
「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「～を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「～を包有する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」、および「～を備える（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味するように意図されている。一部の実施形態では、用語「～を含む」はまた、用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」を包有する。
【0024】
「薬学的に許容される賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与される場合に有害な反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない賦形剤を表す。これは、あらゆる溶媒、分散培地、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体または賦形剤は、あらゆる種類の非毒性の固体、半固体、または液体のフィラー、希釈剤、カプセル化物質、または製剤化助剤を表す。ヒト投与では、製剤は、ＦＤＡ局の生物学的製剤基準が要求する無菌性、全般的な安全性、および純度の基準に一致しなければならない。
【0025】
「対象」は、哺乳類、好ましくはヒトを表す。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち医療の受診を待機しているか、または医療を受診しているか、または過去／現在／将来に医療の対象であった／ある／となり得るか、またはＧＬＰ－１関連障害の発症に関してモニタリングされている、温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成年（たとえば１８歳超の対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（たとえば１８歳未満の対象）である。
【0026】
「治療有効量」は、標的に有意な負のまたは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）ＧＬＰ－１関連障害の発症を遅延もしくは予防すること；（２）ＧＬＰ－１関連障害の１つ以上の症状の進行、憎悪、もしくは悪化を遅延もしくは停止させること；（３）ＧＬＰ－１関連障害の症状の寛解をもたらすこと；（４）ＧＬＰ－１関連障害の重症度もしくは発症頻度を低減させること；または（５）ＧＬＰ－１関連障害を予防することを目的とする作用物質のレベルまたは量を意味する。一実施形態では、治療有効量は、防止的または予防的作用のため、ＧＬＰ－１関連障害の発症より前に投与される。別の実施形態では、治療有効量は、治療作用のため、ＧＬＰ－１関連障害の発症の後に投与される。
【0027】
「処置」は、治療上の処置および防止的または予防的な手段（この目的は、ＧＬＰ－１関連障害を予防または遅延（減少）することである）の両方を表す。処置を必要とするものは、すでに障害を有するもの、および障害を有する傾向のあるもの、または障害を予防すべきものを含む。対象または哺乳類は、本発明に係る脂質ナノカプセルの治療量を投与された後に、以下の観察可能かつ／または測定可能な変化：ＧＬＰ－１関連障害に関連する症状のうちの１つ以上に関連する寛解；罹患率および死亡率の低下、ならびにクオリティオブライフの問題の改善のうちの１つ以上を示す場合、「処置」が成功している。処置の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師によく知られている規定の手法により容易に測定可能である。
【0028】
詳細な説明
本発明者らは、たとえば２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満などのＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するための、インクレチンミメティックが搭載された経口投与用の脂質ナノカプセルを製剤化した。本発明に係るナノカプセルは、たとえば米国特許公開公報第２０１７０８７０９６号および国際特許公開公報第２０１８１５７２０２号により開示される脂質ベースの製剤、ならびにＳｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ． ２０１８； １０：６０３－６１３）およびＢｅｌｏｑｕｉら（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１６； １３：４２２２－４２３０）により開示されるナノ粒子とは、構造上顕著に異なる。さらに、本明細書中開示される比較試験により証明されるように（比較の実施例３を参照）、最先端の技術に由来するこれらナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる試験においてＧＬＰ－１の分泌を誘導できず、高血糖および高インスリン血症も減少できないが、対して本発明に係るナノカプセルは、これが可能である。さらに、本発明に係るペグ化ナノカプセルは、半減期またはミメティックインクレチン、およびその全身吸収を改善させる。
本発明者らは、たとえば２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満などのＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するための、インクレチンミメティックが搭載された経口投与用の脂質ナノカプセルを製剤化した。本発明に係るナノカプセルは、たとえば米国特許公開公報第２０１７０８７０９６号および国際特許公開公報第２０１８１５７２０２号により開示される脂質ベースの製剤、ならびにＳｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ． ２０１８； １０：６０３－６１３）およびＢｅｌｏｑｕｉら（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１６； １３：４２２２－４２３０）により開示されるナノ粒子とは、構造上顕著に異なる。さらに、本明細書中開示される比較試験により証明されるように（比較の実施例３を参照）、最先端の技術に由来するこれらナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる試験においてＧＬＰ－１の分泌を誘導できず、高血糖および高インスリン血症も減少できないが、対して本発明に係るナノカプセルは、これが可能である。さらに、本発明に係るペグ化ナノカプセルは、半減期またはミメティックインクレチン、およびその全身吸収を改善させる。
【0029】
本発明は、経口投与用の脂質ナノカプセルであって、
固体の脂質外殻と、
１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、脂質ナノカプセルに関する。
固体の脂質外殻と、
１種以上のインクレチンミメティックが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む、脂質ナノカプセルに関する。
【0030】
一部の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルを調製するために使用される成分は、「ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）」のリストに属している。
【0031】
本明細書中使用される場合、用語「ナノカプセル」および「ナノ粒子」は、互いに置き換えられ得る。
【0032】
第１の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの固体の脂質外殻は、１種以上（または少なくとも１種）の界面活性剤を含む。
【0033】
一実施形態では、１種以上の界面活性剤は、ペグ化されている。
【0034】
一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤のＨＬＢ（親水親油バランス：Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）は、約４～約４０、好ましくは約６～約１６、より好ましくは約１０～約１４の範囲にある。
【0035】
ＨＬＢ値は、Ｃ． Ｌａｒｐｅｎｔ ｉｎ Ｔｒａｉｔｅ Ｋ．３４２ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｄｅ ｌ’Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒにより定義されている。
【0036】
一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、イオン性、非イオン性、または両性の界面活性剤である。一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、エトキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化脂肪酸の部分グリセリド、およびポリエトキシ化脂肪酸トリグリセリド、ならびにそれらの混合物を含む群で選択される。特定の実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤は、脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、好ましくはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ １５とも称される）である。
【0037】
エトキシ化脂肪アルコールの例として、限定するものではないが、ラウリルアルコールでのエチレンオキシドの付加物、特に９～５０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではラウレス－９～ラウレス－５０）；ベヘニルアルコールでのエチレンオキシドの付加物、特に９～５０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではベヘネス－９～ベヘネス－５０）；セトステアリルアルコール（セチルアルコールおよびステアリルアルコールの混合物）でのエチレンオキシドの付加物、特に９～３０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではセテアレス－９～セテアレス－３０）；セチルアルコールでのエチレンオキシドの付加物、特に、９～３０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではセテス－９～セテス－３０）；ステアリルアルコールでのエチレンオキシドの付加物、特に９～３０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではステアレス－９～セテアレス－３０）；イソステアリルアルコールでのエチレンオキシドの付加物、特に９～５０のオキシエチレン基を含むもの（ＣＴＦＡ名ではイソステアレス－９～イソステアレス－５０）；ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【0038】
エトキシ化脂肪酸の例として、限定するものではないが、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、またはベヘン酸でのエチレンオキシドの付加物、およびそれらの混合物、特に９～５０のオキシエチレン基を含むもの、たとえばＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ラウラート（ＣＴＦＡ名：ＰＥＧ－９ラウラート～ＰＥＧ－５０ラウラート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０パルミタート（ＣＴＦＡ名：ＰＥＧ－９パルミタート～ＰＥＧ－５０パルミタート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ステアラート（ＣＴＦＡ名：ＰＥＧ－９ステアラート～ＰＥＧ－５０ステアラート）；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０パルミトステアラート；ＰＥＧ－９～ＰＥＧ－５０ベヘナート（ＣＴＦＡ名：ＰＥＧ－９ベヘナート～ＰＥＧ－５０ベヘナート）；およびそれらの混合物などが挙げられる。
【0039】
一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、感熱性、親水性の非イオン性界面活性剤である。
【0040】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの固体の脂質外殻は、少なくとも１種の脂溶性界面活性剤をさらに含む。
【0041】
一実施形態では、少なくとも１種の脂溶性界面活性剤は、リン脂質である。一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、ホスファチジルコリン（レシチンとも称される）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、およびホスファチジルエタノールアミンを含む群で選択される。脂溶性界面活性剤の例として、限定するものではないが、Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ ４５、Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ ７５－３、Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ １００、Ｌｉｐｏｉｄ ＧＰＣ、Ｌｉｐｏｉｄ Ｅ ８０、ソルビタンオレアート（Ｓｐａｎ ８０）、Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（商標）１３５、およびＰｌｕｒｏｌ（登録商標）が挙げられる。特定の実施形態では、脂溶性界面活性剤は、Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ １００および／またはソルビタンオレアート（Ｓｐａｎ ８０）である。
【0042】
一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤、特に脂溶性界面活性剤、より具体的には脂質、より具体的にはリン脂質は、ペグ化脂質、より具体的にはペグ化リン脂質である。ペグ化リン脂質の例として、限定するものではないが、ＤＰＰＥ－ＰＥＧｘ（ここでＤＰＰＥは、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを意味する）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧｘ（ここでＤＳＰＥは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを意味する）、ＤＯＰＥ－ＰＥＧｘ（ここでＤＯＰＥは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンを意味する）、およびＰＯＰＥ－ＰＥＧｘ（ここでＰＯＰＥは、パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミンを意味する）（式中、ｘは、ｇ／ｍｏｌでのＰＥＧ分子の大きさを表す）が挙げられる。一部の実施形態では、ｘは、約４００～約２０，０００、好ましくは約８００～約５，０００、より好ましくは約１，０００～約３，０００を含む。本明細書中使用される場合、約４００～約２０，０００は、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、および２０，０００を含む。一実施形態では、ｘは、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、または５，０００である。一実施形態では、ｘは、６，０００、７，０００、８，０００、または９，０００である。一実施形態では、ｘは、１０，０００である。
【0043】
本明細書中使用される場合、用語「ＰＥＧ」は、当該最新技術の状態で一般に受け入れられている一般式（Ｉ）のポリエチレングリコールの化合物を表す：
（式中、ｘは、約４００～約２０，０００を含み（ｇ／ｍｏｌでＰＥＧ分子の大きさを表す）、Ｒは、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－Ｃ１２）アルコキシル基、－（Ｃ１－Ｃ１２）カルボキシ基、－ＮＨ２を表す）。
【化1】
【0044】
一実施形態では、Ｒは、－ＯＣＨ３（メトキシル）、－ＯＣ２Ｈ５、－ＯＣ３Ｈ７、－ＯＣ４Ｈ９、－ＯＣ５Ｈ１１、－ＯＣ６Ｈ１３、およびそれらのアイソマーを含む－Ｏ（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシル基を表す。一実施形態では、Ｒは、－ＣＯＯＨ（メタン酸）、－ＣＨ２－ＣＯＯＨ（エタン酸）、－Ｃ２Ｈ４－ＣＯＯＨ（プロピオン酸）、－Ｃ３Ｈ６－ＣＯＯＨ（酪酸）、－Ｃ４Ｈ８－ＣＯＯＨ（ペント酸（ｐｅｎｔｏｉｃ ａｃｉｄ））、－Ｃ５Ｈ１０－ＣＯＯＨ（ヘキサン酸）、およびそれらのアイソマーを含む－（Ｃ１－Ｃ６）カルボキシ基を表す。
【0045】
一実施形態では、ペグ化リン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－メトキシルポリ（エチレングリコール）２０００）であり、これは、式（Ｉ）のＰＥＧを含むＤＳＰＥ－ＰＥＧ（式中ｘは２，０００であり、Ｒは－ＯＣＨ３である）である。
【0046】
一実施形態では、ペグ化リン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ポリ（エチレングリコール）－２０００］－プロピオナート）であり、これは、式（Ｉ）のＰＥＧを含むＤＳＰＥ－ＰＥＧ（式中ｘは２，０００であり、Ｒはプロピオン酸である）である。
【0047】
実際に、ペグ化リン脂質は、粘液の拡散、安定性の増大、および長期間の血液循環を提供する。粘液浸透（ｍｕｃｏｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の増大は、Ｌ細胞の表面とのナノカプセルの接触の増大を支援し得る。実際に、ペグ化リン脂質は、たとえばＮａｎｏｃｓ（登録商標）またはＮａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（登録商標）から商業的に利用可能であり得る。
【0048】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、非イオン性界面活性剤、脂溶性界面活性剤、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の成分を含む。
【0049】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、感熱性、親水性の非イオン性界面活性剤、リン脂質、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の成分を含む。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの固体の脂質外殻は、感熱性、親水性の非イオン性界面活性剤、およびリン脂質を含む。
【0050】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、総量において約１～４０重量％、好ましくは約３～約２５重量％、より好ましくは約５～約１５重量％の範囲の１種以上の界面活性剤、好ましくはＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および／またはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を含む。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、総量において約６．４５重量％の１種以上の界面活性剤、好ましくはＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００および／またはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５を含む。
【0051】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、総量において約０．１～４０重量％、好ましくは約０．５～約２５重量％、より好ましくは約１～約１０重量％の１種以上の界面活性剤、好ましくはＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００および／またはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、および／またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３もしくはＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨを含む。
【0052】
本発明の範囲内において、「約０．１～約４０重量％」との表現は、０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％、２．５重量％、３重量％、３．５重量％、４重量％、４．５重量％、５重量％、５．５重量％、６重量％、６．５重量％、７重量％、７．５重量％、８重量％、８．５重量％、９重量％、９．５重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、１７重量％、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、３５重量％、３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、および４０重量％を包有する。
【0053】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、１種以上の非イオン性界面活性剤、好ましくはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、および１種以上の脂溶性界面活性剤、好ましくはＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００および／またはペグ化リン脂質を含む。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂質外殻は、１種の非イオン性界面活性剤、好ましくはＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５と、２種の脂溶性界面活性剤、好ましくはＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００およびペグ化リン脂質とを含む。
【0054】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂溶性液体内核は、１種以上の油を含む。
【0055】
一実施形態では、油は、少なくとも１種のトリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはそれらの混合物である。
【0056】
一実施形態では、脂肪酸は、飽和または不飽和のＣ８～Ｃ２６脂肪酸、およびそれらの混合物から選択される。一実施形態では、不飽和脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸またはポリ不飽和脂肪酸であり得る。一実施形態では、脂肪酸は、ポリ不飽和型であり、特に、αリノレン酸（１８：３、ＡＬＡ）、エイコサペンタエン酸（２０：５、ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（２２：６、ＤＨＡ）を含むω－３脂肪酸の群から選択される。特に、ω－３脂肪酸の供給源は、魚の油であり得る。
【0057】
一実施形態では、脂肪酸エステルは、Ｃ８～Ｃ１８、好ましくはＣ８～Ｃ１２の脂肪酸エステルから選択される。特定の実施形態では、脂肪酸エステルは、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、およびそれらの混合物を含むかまたはからなる群で選択される。
【0058】
一実施形態では、トリグリセリドは、合成トリグリセリドまたは天然起源のトリグリセリドである。トリグリセリドの天然起源として、限定するものではないが、動物脂肪または植物油、たとえばダイズ油または長鎖トリグリセリド（ＬＣＴ）の供給源が挙げられる。
【0059】
別の実施形態では、トリグリセリドは、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）としても知られている、中鎖脂肪酸から構成される。中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油は、炭化水素鎖が８～１２個の炭素原子を含むトリグリセリドである。
【0060】
ＭＣＴ油の例として、限定するものではないが、ＴＣＲ製品（フランスのＳｏｃｉｅｔｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ ｄｅｓ Ｏｌｅａｇｉｎｅｕｘからの商品名、脂肪酸鎖の約９５％が８～１０個の炭素原子を含むトリグリセリドの混合物）およびＭｙｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２（スウェーデンの企業Ｄｙｎａｍｉｔ Ｎｏｂｅｌにより販売されているトリグリセリド、カプリル酸およびカプリン酸のグリセリドトリエステルの混合物）が挙げられる。
【0061】
一実施形態では、トリグリセリドの脂肪酸の単位は、不飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和である。一実施形態では、脂溶性液体内核は、可変の脂肪酸の単位を含むトリグリセリドの混合物を含む。
【0062】
一実施形態では、油は、グリセロール、グリセリル脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸トリグリセリド、リノール酸および／またはオレイン酸のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、カプリル酸および／またはカプリン酸のプロピレングリコールエステル、植物性脂肪酸のトリグリセリド、ならびにそれらの混合物を含む群で選択される。
【0063】
脂溶性内核に含まれ得る油の例として、限定するものではないが、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９（カプリル酸およびカプリン酸の中鎖トリグリセリド）、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）ＰＧ（カプリル酸およびカプリン酸のプロピレングリコールエステル）、Ｐｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７（ポリグリセリル－６ジオレアート）、Ｐｅｃｅｏｌ（商標）（グリセリルモノオレアート）、Ｍａｉｓｉｎｅ（登録商標）ＣＣ（主にリノール酸およびオレイン酸のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）、ならびにＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１０／８１２（カプリル酸およびカプリン酸のトリグリセリド）が挙げられる。特定の実施形態では、脂溶性内核は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含む。特定の実施形態では、脂溶性内核は、Ｐｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含む。本明細書中使用される場合、用語「Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９」および「Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９」は、区別せずに使用されてよく、同じ成分を表す。
【0064】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂溶性内核は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、総量において約２５～約６５重量％、好ましくは約３０～約５５重量％、より好ましくは約３５～約４５重量％の範囲の１種以上の油、好ましくはＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７）を含む。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの脂溶性内核は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、総量において約４１．４重量％の１種以上の油、好ましくはＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７）を含む。
【0065】
本発明の範囲内において、「約２５～約６５重量％」との表現は、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、３５重量％、３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、４０重量％、４１重量％、４２重量％、４３重量％、４４重量％、４５重量％、４６重量％、４７重量％、４８重量％、４９重量％、５０重量％、５１重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、５６重量％、５７重量％、５８重量％、５９重量％、６０重量％、６１重量％、６２重量％、６３重量％、６４重量％、および６５重量％を包有する。
【0066】
一実施形態では、本発明の脂質ナノカプセルは、少なくとも１種の塩および水をさらに含む。一実施形態では、本発明の脂質ナノカプセルは、塩化ナトリウムおよび水をさらに含む。
【0067】
一実施形態では、本発明の脂質ナノカプセルが調製される水相は、まず、特定の濃度の塩、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。一実施形態では、この塩の濃度は、脂質ナノカプセルの総重量に対して、約２～約８重量％、好ましくは約４～約６重量％、より好ましくは約４．２～約５．２重量％の範囲にある。
【0068】
本発明の範囲内において、「約２～約８％」との表現は、２．０重量％、２．５重量％、３．０重量％、３．５重量％、４．０重量％、４．５重量％、５．０重量％、５．５重量％、６．０重量％、６．５重量％、７．０重量％、７．５重量％、および８．０重量％を包有する。
【0069】
一実施形態では、本発明の脂質ナノカプセルが調製される水相は、浸透剤（ｏｓｍｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、保存剤、またはそれらの混合物をさらに含む。一実施形態では、凍結保護剤または凍結乾燥保護剤は、マンニトールまたはトレハロースである。一実施形態では、凍結保護剤または凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥されるナノカプセルの懸濁液に添加される。
【0070】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの逆ミセルは、界面活性剤、油、およびそれらの混合物を含む群で選択される１種以上の成分を含む。
【0071】
一実施形態では、逆ミセルの界面活性剤は、１０以下、好ましくは８以下、より好ましくは６以下のＨＬＢ値を有する。
【0072】
一実施形態では、逆ミセルの界面活性剤は、脂肪エステルである。一実施形態では、逆ミセルの界面活性剤は、ソルビタンオレアート、ソルビタンモノラウラート、ソルビタントリオレアート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノオレアートのポリオキシエチレン、ソルビタントリオレアートのポリオキシエチレン、またはそれらの混合物である。特定の実施形態では、逆ミセルの界面活性剤は、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８５である。
【0073】
一実施形態では、逆ミセルの油は、リン脂質を含む。一実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、およびホスファチジルエタノールアミン、およびそれらの混合物を含む。
【0074】
一実施形態では、逆ミセルの油は、脂肪酸トリグリセリド、好ましくはカプリル酸トリグリセリド、および／もしくはカプリン酸トリグリセリド、またはそれらの混合物を含む。特定の実施形態では、逆ミセルの油は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含む。
【0075】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの逆ミセルは、本明細書中上述される界面活性剤および油を含む。
【0076】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの逆ミセルは、少なくとも１種のインクレチンミメティック、Ｓｐａｎ（登録商標）８０およびＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含むかまたはからなる。特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルの逆ミセルは、エキセナチド、Ｓｐａｎ（登録商標）８０およびＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含むかまたはからなる。
【0077】
一実施形態では、本発明の逆ミセルは、逆ミセルの総重量に対して、約５～５０重量％、好ましくは約１０～３５重量％、より好ましくは約１５～２０重量％の界面活性剤、好ましくはＳｐａｎ（登録商標）８０を含む。特定の実施形態では、本発明の逆ミセルは、逆ミセルの総重量に対して、約１６．６７重量％の界面活性剤、好ましくはＳｐａｎ（登録商標）８０を含む。
【0078】
本発明の範囲内において、「約５～約５０重量％」との表現は、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、１７重量％、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、３５重量％、３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、４０重量％、４１重量％、４２重量％、４３重量％、４４重量％、４５重量％、４６重量％、４７重量％、４８重量％、４９重量％、および５０重量％を包有する。
【0079】
一実施形態では、本発明の逆ミセルは、逆ミセルの総重量に対して、約５０～約９５重量％、好ましくは約７５～約９０重量％、より好ましくは約８０～約８５重量％の油、好ましくはＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含む。特定の実施形態では、本発明の逆ミセルは、逆ミセルの総重量に対して、約８３．３３重量％の油、好ましくはＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９を含む。
【0080】
本発明の範囲内において、「約５０～約９５重量％」との表現は、５０重量％、５１重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、５６重量％、５７重量％、５８重量％、５９重量％、６０重量％、６１重量％、６２重量％、６３重量％、６４重量％、６５重量％、６６重量％、６７重量％、６８重量％、６９重量％、７０重量％、７１重量％、７２重量％、７３重量％、７４重量％、７５重量％、７６重量％、７７重量％、７８重量％、７９重量％、８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、および９５重量％を包有する。
【0081】
一実施形態では、逆ミセルは、脂質ナノカプセルの総重量に対して、約０．０１～約４０重量％、好ましくは約１～約３５重量％、より好ましくは約１０～約２５重量％を表す。
【0082】
本発明の範囲内において、「約０．０１～約４０重量％」との表現は、０．０１重量％、０．０５重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、１７重量％、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、３５重量％、３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、および４０重量％を包有する。
【0083】
一実施形態では、界面活性剤／油の重量比は、１：１０～１：１の範囲にある。一実施形態では、界面活性剤／油の重量比は、１：８～１：３の範囲にある。一実施形態では、界面活性剤／油の重量比は、１：５である。本発明の範囲内において、「１：１０～１：１」との表現は、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、および１：１を包有する。
【0084】
一実施形態では、インクレチンミメティック／界面活性剤の重量比は、０．００１～０．２、好ましくは０．００５～０．０５、より好ましくは０．０１～０．０３の範囲にある。一実施形態では、インクレチンミメティック／界面活性剤の重量比は、約０．０３である。本発明の範囲内において、「０．００１～０．２」との表現は、０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、および０．２を包有する。
【0085】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、少なくとも約１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、または２００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、最大約２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００ｎｍの平均直径を有する。
【0086】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、好ましくは約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、より好ましくは約１８０ｎｍ～約２３０ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、約２００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、約２００ｎｍの平均直径を有する。実際に、約２００ｎｍ超の平均直径を有する脂質ナノカプセルは、内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導する特性を有し、よってＧＬＰ－１の血中レベルの増大を促進させる特性を有する。一部の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導する。実際に、ｉｎ ｖｉｖｏでの内因性ＧＬＰ－１の分泌は、最新技術に由来するいずれかの適切な方法またはそれから出典した方法により、測定され得る。例として、ＧＬＰ－１のレベルは、血液サンプル、特には血漿サンプルにおいて、ＥＬＩＳＡキット、たとえば市販のＴｏｔａｌ ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（登録商標）製）により測定され得る。内因性ＧＬＰ－１の分泌は、処置前に得られた参照値と比較した倍率変化として表され得る。
【0087】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルのインクレチンミメティックは、エキセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、リラグルチド、リキシセナチド、およびセマグルチドを含む群で選択される。
【0088】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、少なくともエキセナチドを含む。
【0089】
一実施形態では、エキセナチドは、肥満／糖尿病を高脂肪食により誘導したマウスにおいて少なくとも４％の相対的なバイオアベイラビリティを特徴とする薬物動態プロファイルを有する。
【0090】
本発明の範囲内において、「少なくとも４％」との表現は、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１５％、またはそれ以上を含む。
【0091】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
固体の脂質外殻と、
エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
固体の脂質外殻と、
エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0092】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステルおよび脂溶性界面活性剤を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステルおよび脂溶性界面活性剤を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0093】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５およびＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５およびＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0094】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５およびＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５およびＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
【0095】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、および任意選択でペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、および任意選択でペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0096】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３を含む固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）を含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0097】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００および任意選択でＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
【0098】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、およびペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
脂肪酸のポリ－オキシエチレンエステル、非イオン性脂溶性界面活性剤、およびペグ化脂質、特にペグ化リン脂質を含む固体の脂質外殻と、
トリグリセリドおよび脂肪酸エステルを含み、エキセナチドが搭載された逆ミセルを含む脂溶性液体内核と
を含む。
【0099】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３からなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
【0100】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨからなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
界面活性剤のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨからなる固体の脂質外殻と、
油のＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ＷＬ１３４９および／またはＰｌｕｒｏｌ（登録商標）ＣＣ ４９７またはＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、塩化ナトリウム、水、およびエキセナチドが搭載された逆ミセルからなる脂溶性液体内核と
からなる。
【0101】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、２つのステップで製剤化される。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルを調製するための方法は、
１．１種以上のインクレチンミメティックを逆ミセルの中にカプセル化するステップと、
２．逆ミセルを脂質ナノカプセルの中にカプセル化するステップと
を含む。
１．１種以上のインクレチンミメティックを逆ミセルの中にカプセル化するステップと、
２．逆ミセルを脂質ナノカプセルの中にカプセル化するステップと
を含む。
【0102】
インクレチンミメティックが搭載された逆ミセルは、第１のステップの終了時に得られる。インクレチンミメティックが搭載された逆ミセルの脂質ナノカプセルは、第２のステップの終了時に得られる。
【0103】
一実施形態では、第１のステップは、界面活性剤、油、およびそれらの混合物、好ましくは界面活性剤および油を含む群で選択される１種以上の成分の高速撹拌を含む（ステップ１ａ）。
【0104】
一実施形態では、第１のステップは、１種以上のインクレチンミメティック、好ましくはエキセナチドを、上述の１種以上の成分の混合物、好ましくは界面活性剤および油の混合物の中に浸すことをさらに含む（ステップ１ｂ）。
【0105】
一実施形態では、第２のステップは、転相プロセスを含み、ここで脂質ナノカプセルの成分は、磁力による撹拌の下共に混合される（ステップ２ａ）。一実施形態では、脂質ナノカプセルの成分は、本明細書中上述される固体の脂質外殻および脂溶性液体内核の成分を含む。一実施形態では、脂質ナノカプセルの成分は、油、界面活性剤、塩、および水を含む。一実施形態では、このステップは、３０℃～５０℃、好ましくは３５℃～４５℃の範囲の温度、より好ましくは約４０℃の温度で行われる。一実施形態では、このステップは、１００ｒｐｍ～１，０００ｒｐｍの範囲の速度、好ましくは２００ｒｐｍで行われる。一実施形態では、このステップは、少なくとも１分間、２分間、または５分間行われる。
【0106】
一実施形態では、第２のステップは、漸進的に加熱／冷却する温度サイクルをさらに含む（ステップ２ｂ）。一実施形態では、温度サイクルは、４０℃～８５℃、好ましくは４５℃～７５℃、より好ましくは５０℃～６８℃の範囲の温度で行われる。一実施形態では、ステップ１で得られたインクレチンミメティックを含む逆ミセルは、温度サイクルの最後のサイクルの間にステップ２ｂで得られた混合物に添加される（ステップ２ｃ）。一実施形態では、ステップ２ｃは、転相領域（ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｚｏｎｅ：ＰＩＺ）より約３℃高い温度で行われる。一実施形態では、ステップ２ｃは、約５８℃～約７０℃、好ましくは約６０℃～約６８℃、より好ましくは約６２℃～約６４．５℃の範囲の温度で行われる。一実施形態では、温度が冷却され、最後の温度サイクルにおいてＰＩＺに達した後に、冷水（０℃～５℃、好ましくは約４℃）が、ステップ２ｃの終了時に得た混合物に添加される（ステップ２ｄ）。一実施形態では、ステップ２ｄの終了時に、混合物の温度は、約５７℃～約６３℃、好ましくは約５８℃～約６２℃、より好ましくは約５９．５℃～約６１．５℃である。
【0107】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルを調製するための方法は、いずれの有機溶媒の使用をも含まない。言い換えると、本方法は、本発明に係る脂質ナノカプセルを調製するための有機溶媒フリーの方法である。
【0108】
一実施形態では、本発明の脂質ナノカプセルは、凍結乾燥され、次にコロイド懸濁液の形態で再構成され得る。一実施形態では、浸透剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、保存剤、またはそれらの混合物が、凍結乾燥される脂質ナノカプセルの懸濁液に添加され得る。一実施形態では、これら化合物が完全に溶解した後に、懸濁液は、約－５０℃で迅速に凍結する第１のステップを経てもよい。一実施形態では、次に、これら懸濁液は、減圧下、低温の蒸気の形態の水を直接通過することにより凍結乾燥され得る。一実施形態では、その後、乾燥形態の脂質ナノカプセルが、使用前に長期間無菌の形態で保存され得る。
【0109】
さらに本発明は、本明細書中上述される脂質ナノカプセルの治療有効量と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【0110】
さらに本発明は、医薬として使用するための本明細書中上述される脂質ナノカプセルまたは医薬組成物に関する。
【0111】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、医薬の調製のために使用される。本発明の１つの目的は、医薬の調製のための本発明に係る脂質ナノカプセルの使用である。
【0112】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬は、ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0113】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖、脂肪肝、過体重、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、前糖尿病、空腹時血中ブドウ糖不良、過食症、食物摂取挙動の変化、肝臓インスリン抵抗性、全身インスリン抵抗性、移行の加速、脂肪組織炎症、心機能不全、急性心筋梗塞、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、ニューロパチー、および胃不全麻痺を含む群で選択される障害の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0114】
特定の実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0115】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセルは、肝臓の重量、肝臓の脂質の集積、ならびに脂肪滴の数および大きさを有意に減少させる利点を有する。
【0116】
また本発明は、それを必要とする対象のＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するための方法であって、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬の前記対象への経口投与を含む、方法に関する。
【0117】
一実施形態では、本方法は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、肥満、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖、脂肪肝、過体重、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、前糖尿病、空腹時血中ブドウ糖不良、過食症、食物摂取挙動の変化、肝臓インスリン抵抗性、全身インスリン抵抗性、移行の加速、脂肪組織炎症、心機能不全、急性心筋梗塞、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、ニューロパチー、および胃不全麻痺を含む群で選択される障害を処置および／または予防するためのものである。
【0118】
本発明の別の目的は、それを必要とする個体のＧＬＰ－１の血中レベルを増大させるためのｉｎ ｖｉｖｏでの方法であって、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、また医薬の治療有効量の前記個体への経口投与を含む、方法である。
【0119】
本発明の別の目的は、それを必要とする個体の血糖値を減少させるためのｉｎ ｖｉｖｏでの方法であって、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、また医薬の治療有効量の前記個体への経口投与を含む、方法である。
【0120】
本発明の脂質ナノカプセル、医薬組成物、および医薬の一日総使用量は、健全な医療の判断の範囲内で担当医により決定されることが理解されるであろう。いずれかの特定の患者に特有の治療有効量は、処置される障害および障害の重症度；使用される特定の作用物質の活性；使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事；使用される特定の作用物質の投与の時間、投与の経路、および排泄速度；処置期間；使用される特定の作用物質と併用してまたは同時に使用される薬物；ならびに医療の分野でよく知られている同様の要因を含む様々な要因に依存する。たとえば、作用物質の用量を望ましい治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、望ましい効果が達成されるまでこの用量を徐々に増大させることは、十分に当業者の範囲内にある。
【0121】
しかしながら、本製品の一日の用量は、約０．０１～約１，０００ｍｇ／成年／日、好ましくは０．１～約５００、より好ましくは約１～約２００ｍｇ／成年／日の幅広い範囲で変動し得る。一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬は、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ／成年／日の用量で投与される。
【0122】
脂質ナノカプセルの有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで通常供給される。
【0123】
一実施形態では、脂質ナノカプセルの有効量は、１日あたり１回、２回、または３回投与され得る。
【0124】
一実施形態では、本発明に係る脂質ナノカプセル、医薬組成物、または医薬は、経口投与により投与されるか、または経口投与による投与に適している。
【0125】
また本発明は、ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するためのキットであって、
本発明に係る１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と、
を含む、キットに関する。
本発明に係る１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と、
を含む、キットに関する。
【0126】
一実施形態では、経口血糖降下薬は、α－グルコシダーゼ阻害剤、好ましくはアカルボース、ミグリトール、またはボグリボース；ビグアナイド、好ましくはメトホルミン；ｃｙｃｌｏｓｅｔ、好ましくはブロモクリプチン；ＤＰＰ－４阻害剤、好ましくはシタグリプチン、サキサグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチン、またはアログリプチン；メグリチニド、好ましくはレパグリニド、またはナテグリニド；ＳＧＬＴ２阻害剤、好ましくはダパグリフロジンまたはカナグリフロジン；スルホニル尿素、好ましくはグリピジド、グリブリド、グリクラジド、またはグリメピリド；チアゾリジンジオン、好ましくはロシグリタゾンまたはピオグリタゾンを含む群で選択される。
【0127】
本発明の別の目的は、ＧＬＰ－１機能不全に関連する障害を処置および／または予防するための薬物送達システムであって、
本発明に係る１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と
を含む、薬物送達システムである。
本発明に係る１つ以上の脂質ナノカプセルと、
１種以上の経口血糖降下薬と
を含む、薬物送達システムである。
【図面の簡単な説明】
【0128】
【図1】図１Ａ～Ｆは、バイオミメティック腸液における脂質ナノカプセルの安定性およびエキセナチドの放出を示すヒストグラムおよびプロットの組み合わせである。図１Ａは、所定の時間間隔でペプシンの存在下にてＦａＳＳＧＦでインキュベーションした後のエキセナチドが搭載された逆ミセル（ＲＭ）の脂質ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）のバリエーションの粒径およびＰＤＩを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。図１Ｂは、所定の時間間隔でペプシンの非存在下にてＦａＳＳＧＦでインキュベーションした後のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのバリエーションの粒径およびＰＤＩを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。図１Ｃは、所定の時間間隔にてＦａＳＳＩＦでインキュベーションした後のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのバリエーションの粒径およびＰＤＩを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。図１Ｄは、所定の時間間隔にてＦｅＳＳＩＦでインキュベーションした後のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのバリエーションの粒径およびＰＤＩを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。図１Ｅは、所定の時間間隔にてＦｅＳＳＩＦ－Ｖ２でインキュベーションした後のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのバリエーションの粒径およびＰＤＩを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの粒径は、いずれの場合でも有意に変化せず（Ｐ＞０．０５）、アッセイした培地における単分散度を呈した（ＰＤＩ＜０．２）。図１Ｆは、ＨＰＬＣにより測定した３７℃、６時間にわたるＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）における累積的なエキセナチドの放出プロファイルを示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝９）。
【図2】図２Ａ～Ｂは、正常血糖マウスにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＭ ＬＮＣが介在するＧＬＰ－１の分泌を示すグラフの組み合わせである。図２Ａは、２時間の共インキュベーション期間の後のＧＬＵＴａｇ細胞（左）およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（右）（それぞれマウスおよびヒトのＬ細胞）におけるＲＭ ＬＮＣが介在するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ－１の分泌（２ｍｇ／ｍＬ）を示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝６－１０）。図２Ｂは、ＲＭ ＬＮの経口投与から６０分後および１８０分後の正常血糖マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの総ＧＬＰ－１の分泌を示す（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝７～８）。図２Ａおよび図２ＢのＰ値は、スチューデントｔ検定またはマン・ホイットニー検定により決定した。
【図3】図３は、正常血糖マウスのエキセナチドの血漿中レベルを示すプロットを表す。エキセナチドの血液像は、ＥＬＩＳＡにより測定される水溶液（ＥＸＥ）またはＲＭ ＬＮＣの中へのカプセル化（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）（５００μｇ／ｋｇエキセナチドの用量、約１．６２ｍｇ／ｇの脂質ナノカプセル用量に対応）において正常血糖マウスへ経口投与した後に測定された（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝４）。２元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を行ったところ、異なる上付き文字を伴うデータは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図4】図４Ａ～４Ｄは、Ｌ細胞および腸細胞様細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験を示すヒストグラムの組み合わせである。図４Ａは、薬物濃度に関する細胞の生存率として表される３７℃で２時間のインキュベーションの後のＣａｃｏ－２細胞でのＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの細胞の生存率を示す。図４Ｂは、ナノ粒子の濃度に関する細胞の生存率として表される３７℃で２時間のインキュベーションの後のＣａｃｏ－２細胞でのＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの細胞の生存率を示す。図４Ｃは、２時間の間増大する脂質ナノカプセルの濃度（１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍｌ）との共インキュベーション後のＧＬＵＴａｇ細胞でのＲＭ ＬＮＣの細胞の生存率を示す。図４Ｄは、２時間の間増大する脂質ナノカプセルの濃度（１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍｌ）との共インキュベーション後のヒトＮＣＩ－Ｈ７１６細胞でのＲＭ ＬＮＣの細胞の生存率を示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝９）で示される。破線は、８０％の生存率に対応する。データは、３つの独立した実験に対応する。
【図5】図５は、グルコース試験の３０分前および試験から１２０分後に測定された血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）を示すプロットを表す（ｎ＝８～９）。２元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を行ったところ、異なる上付き文字を伴うデータは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図8】図８は、皮下投与（ＥＸＥ ｓ．ｃ．）（５０μｇ／ｋｇのエキセナチド用量）ならびに溶液における経口投与およびＲＭ ＬＮＣの中での経口投与（それぞれＥＸＥおよびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）（約１．６２ｍｇ／ｇの脂質ナノカプセル用量に対応する５００μｇ／ｋｇのエキセナチド用量）の後のエキセナチドの濃度－時間のプロファイルおよびＡＵＣを示すプロットを表す。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝８～１０）。１元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を行ったところ、異なる上付き文字を伴うデータは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図9】図９Ａ～９Ｂは、８週間および１０週間ＨＦＤにより誘導された糖尿病マウスにおけるＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのＯＧＴＴの評価を示すプロットの組み合わせである。図９Ａは、対照食およびＨＦＤ（８週間）を与えたマウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス）で測定した２ｇ／ｋｇのグルコースの経口試験による血漿グルコースレベルおよびＡＵＣを示す。図９Ｂは、対照食およびＨＦＤ（１０週間）を与えたマウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス）で測定した２ｇ／ｋｇのグルコースの経口試験による血漿グルコースレベルおよびＡＵＣを示し、これらは２元ＡＮＯＶＡにより決定した。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝７～８）。異なる上付き文字を伴う値は、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、ＯＧＴＴでは２元ＡＮＯＶＡにより、グループ間のＡＵＣの比較では１元ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙの事後検定を行うことにより、決定された。
【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、肥満／糖尿病マウスにおけるグルコースのホメオスタシスに及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの作用を示すプロットの組み合わせである。図１０Ａは、ｍｇ／ｄｌで表される５週間の処置（１３週間のＨＦＤの給餌）にわたる血漿グルコースレベルを示す。図１０Ｂは、ｍｇ／ｄｌで表される５週間の処置（１３週間のＨＦＤの給餌）後の血漿中グルコース濃度を示す。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝１０）。異なる上付き文字を伴うデータは、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、２元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を行うことにより決定した。
【図11】図１１は、肥満／糖尿病マウスにおける高インスリン血症に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの作用を示すヒストグラムを表す。インスリン血漿中レベルは、門脈から測定した（ｎ＝８～１０）。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている。異なる上付き文字を伴うデータは、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次にＤｕｎｎの事後検定を行うことにより決定した。
【図12】図１２は、肝臓の重量（ｇ）に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示すヒストグラムを表す。異なる上付き文字を伴うデータは、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、１元ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの事後検定により決定した。
【図13-1】図１３Ａ～Ｃは、脂質のホメオスタシスに及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示すヒストグラムの組み合わせである。図１３Ａは、肝臓の総脂質含有量（ｍｇ－１／１００ｍｇの組織）を示す。図１３Ｂは、肝臓のトリグリセリド（ｎｍｏｌ．ｍｇ－１）を示す。図１３Ｃは、肝臓のコレステロール（ｎｍｏｌ．ｍｇ－１）を示す。異なる上付き文字を伴うデータは、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでＤｕｎｎの事後検定を行うことにより決定した。
【図13-2】同上。
【図14-1】図１４Ａ～１４Ｅは、ヒストグラムの組み合わせである。図１４Ａは、脾臓の重量に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示す。図１４Ｂは、内臓脂肪組織（ＶＡＴ）の重量に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示す。図１４Ｃは、皮下脂肪組織（ＳＡＴ）の重量に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示す。図１４Ｄは、心外膜脂肪組織（ＥＡＴ）の重量に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示す。図１４Ｅは、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ処置の影響を示す。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝９～１０）。異なる上付き文字を伴うデータは、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｐ値は、１元ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙの事後検定を行うことにより決定した。
【図14-2】同上。
【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、ＧＬＵＴａｇ細胞（マウスＬ細胞）および正常血糖マウスにおけるＧＬＰ－１の刺激に及ぼす（リガンドとしてグラフトされたプロピオナートを伴うまたは伴わない）ペグ化ナノカプセルの作用を示す、ヒストグラムの組み合わせである。０．５から２ｍｇ／ｍＬへと増大するナノカプセル濃度との２時間の共インキュベーションの後のマウスのＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ－１の刺激に及ぼす（リガンドとしてグラフトされたプロピオナートを伴うまたは伴わない）ペグ化ＲＭ ＬＮＣの作用（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝４；Ｎ＝３）。各パネルおよびアッセイされた各濃度において、左から右へ：培地、ＲＭ ＬＮＣ、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯが表されている。図１５Ａ（ａ）は、総ＧＬＰ－１レベルを表し；図１５Ｂ（ｂ）は、細胞外総ＧＬＰ－１レベルを表す（ｐｇ／ｍＬで表されている）。
【図16】図１６は、同じナノカプセル用量（１．６２ｍｇ／ｇ）を使用して、対照としての培地（黒色のバー）ＲＭ ＬＮＣ（濃灰色のバー）、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（淡灰色のバー）、およびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ（白色のバー）を経口強制投与してから６０分後および１８０分後の健常な対照マウスにおける総ＧＬＰ－１レベルを示すヒストグラムである（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝８）。異なる上付き文字は、１元ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙの事後検定に基づき、グループ間の有意差を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図17-1】図１７Ａ～１７Ｆは、単回で経口投与した後の肥満／糖尿病マウスにおける薬理学的試験および薬物動態学的試験を示すグラフおよびヒストグラムの組み合わせである。図１７Ａ：血中グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）および平均ＡＵＣ（ｍｇ／ｄＬ・ｍｉｎ）を、グルコース投与の３０分前および１２０分後に試験した（ｎ＝７～８）。ＨＦＤ（黒色のダイヤ）；ＥＸＥ（四角）；ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ（逆三角形）；ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（三角形）；ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（灰色のダイヤ）。図１７Ｂ：血漿中総ＧＬＰ－１濃度を、グルコース投与の３０分前および１５分後に測定した（ｎ＝６～８）。条件の順序に関しては、図１７Ａの挿入を参照されたい。図１７Ｃ：ＯＧＴＴ後の肥満／糖尿病マウスの門脈で測定した活性ＧＬＰ－１レベル（製剤の投与から３時間後）（ｎ＝６～８）。図１７Ｄ：インスリン濃度を、経口グルコース投与の３０分前および１５分後に、尾静脈由来の血液から回収した血漿で測定した（ｎ＝６～８）。条件の順序に関しては、図１７Ａまたは図１７Ｃの挿入を参照されたい。図１７Ｅ：インスリン抵抗性指数（ｎ＝７～８）。図１７Ｆ：薬物溶液または薬物を搭載したペグ化ナノカプセル（それぞれＥＸＥおよびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）の経口投与（用量：５００μｇ／ｋｇ）後の糖尿病マウス（１０週間のＨＦＤの給餌）における血漿中エキセナチド濃度－時間のプロファイルおよびエキセナチドＡＵＣ（ｎ＝９～１０）。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。異なる上付き文字は、２元分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＴｕｋｅｙの事後検定（図１７Ａ、Ｆ）、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでＤｕｎｎの事後検定（図１７Ｂ）、または１元ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙの事後検定（図１７Ｃ～Ｅ）を行い得られたグループ間の有意差を表す（＊ｐ＜０．０５）。
【図17-2】同上。
【図17-3】同上。
【図18】図１８Ａ～Ｃは、長期間の治療を介してＨＦＤ食により誘導される糖尿病マウスにおける高血糖および高インスリン血症の抑制に及ぼす異なる経口投与頻度でのペグ化ＥＸＥおよび非ペグ化ＥＸＥが搭載された脂質ナノカプセルの作用を示すグラフの組み合わせである。図１８Ａ：４週間の投与（合計１４週間のＨＦＤ給餌）後の血漿中グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝７～１０）。図１８Ｂ：インスリン濃度を、尾静脈から回収した血液由来の血漿で試験した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝６～９）。図１８Ｃ：ＨＯＭＡ－ＩＲを、Ａｍｒｕｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２０１５； ６４：２７９１－２８０４）で以前に定義されるように式［ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖×ｎｇ／ｍＬの空腹時インスリン］／４０５を使用して計算した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝８－９）。異なる上付き文字は、２元分散分析、次いでＴｕｋｅｙの事後検定（図１８Ａ）、またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでＤｕｎｎの事後検定（図１８Ｂ～Ｃ）に基づくグループ間の統計上有意差を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図19-1】図１９Ａ～１９Ｇは、ナノ構造の脂質の担体（ＮＬＣ）を介したグルコース試験の３０分前および１２０分後に測定した血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）（ｎ＝９～１０）（図１９Ａ）ならびにグルコース試験の３０分前および１２０分後に測定した平均曲線下面積（ＡＵＣ、ｍｇ／ｄＬ／分）（ｎ＝９～１０）（図１９Ｂ）、グルコース試験の３０分前および１５分後に測定した血漿中総ＧＬＰ－１レベル（図１９Ｃ～Ｄ）、血漿中インスリンレベル（図１９Ｅ～Ｆ）、ならびにインスリン抵抗性指数（ｎ＝８～９）（図１９Ｇ）を示すグラフの組み合わせである。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝８～１０）。
【図19-2】同上。
【実施例】
【0129】
本発明を、以下の実施例によりさらに示す。
実施例１：作業例１
１．材料および方法
１．１－試験設計
この試験の目的は、インクレチンミメティックペプチドの経口送達のためのナノ担体ベースの薬物送達システムを開発することであった。内因性ＧＬＰ－１の分泌の亢進は、内分泌ベースの糖尿病療法においてより生理的かつ新規の代替案を表す。内因性ＧＬＰ－１の分泌のみを増大させることが、病理学的な状況での治療効果を誘導するには十分ではないとの仮説が立てられていた。よって、Ｔ２ＤＭのための別の経口処置として、その自身の生体作用（内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導）およびカプセル化されたインクレチンミメティックペプチドの作用（ペプチドのバイオアベイラビリティを増大）の相乗作用を提供する二重作用の薬物送達ナノシステムを設計することに焦点が置かれた。この新規ナノシステムの物理化学的な特性は特徴づけられており（大きさ、ゼータ電位）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのバイオミメティック培地におけるカプセル化ペプチド（エキセナチド）のカプセル化の効率、安定性、および放出が確認された。ＧＬＰ－１の分泌を誘導するナノシステムそれ自体の特性を、マウス細胞株およびヒト細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、ならびに正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。さらに、薬物動態学的試験を、正常血糖マウスで行い、ペプチド単独と比較して、ナノシステムの中にカプセル化された場合に高いバイオアベイラビリティを確認した。ＧＬＰ－１を誘導する際のナノ担体の効力に関する概念実証を得た後に、高血糖の低減に関する二重作用のナノシステムの有用性を、３、８、または１０週間のＨＦＤの給餌の後急性的な処置（１つの単回投与）により糖尿病および肥満のマウスにおいて評価し、ナノシステムの中にカプセル化されたペプチドのバイオアベイラビリティの増大を、肥満／糖尿病マウスで確認した。最後に、グルコースのホメオスタシスおよび脂質の代謝に及ぼすナノシステムの影響を、常習的な長期間の処置（５週間の間１日１回）により肥満／糖尿病マウスモデルで試験し、このナノシステムが、Ｔ２ＤＭの処置におけるインクレチンペプチドの経口送達において現在の戦略に代わる有効な代替案を表すことを確認した。肥満／糖尿病マウスにおける処置および薬物動態学的試験では、以前の試験に基づきグループあたり１０匹のマウスを使用した。全ての動物実験は、実験動物の保護に関する２０１３年５月２９日のベルギーの法律により明記されるように、地元の動物委員会（２０１４／ＵＣＬ／ＭＤ／０３３および２０１７／ＵＣＬ／ＭＤ／００５）により承認されており、これに従い行われた。
実施例１：作業例１
１．材料および方法
１．１－試験設計
この試験の目的は、インクレチンミメティックペプチドの経口送達のためのナノ担体ベースの薬物送達システムを開発することであった。内因性ＧＬＰ－１の分泌の亢進は、内分泌ベースの糖尿病療法においてより生理的かつ新規の代替案を表す。内因性ＧＬＰ－１の分泌のみを増大させることが、病理学的な状況での治療効果を誘導するには十分ではないとの仮説が立てられていた。よって、Ｔ２ＤＭのための別の経口処置として、その自身の生体作用（内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘導）およびカプセル化されたインクレチンミメティックペプチドの作用（ペプチドのバイオアベイラビリティを増大）の相乗作用を提供する二重作用の薬物送達ナノシステムを設計することに焦点が置かれた。この新規ナノシステムの物理化学的な特性は特徴づけられており（大きさ、ゼータ電位）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのバイオミメティック培地におけるカプセル化ペプチド（エキセナチド）のカプセル化の効率、安定性、および放出が確認された。ＧＬＰ－１の分泌を誘導するナノシステムそれ自体の特性を、マウス細胞株およびヒト細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、ならびに正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。さらに、薬物動態学的試験を、正常血糖マウスで行い、ペプチド単独と比較して、ナノシステムの中にカプセル化された場合に高いバイオアベイラビリティを確認した。ＧＬＰ－１を誘導する際のナノ担体の効力に関する概念実証を得た後に、高血糖の低減に関する二重作用のナノシステムの有用性を、３、８、または１０週間のＨＦＤの給餌の後急性的な処置（１つの単回投与）により糖尿病および肥満のマウスにおいて評価し、ナノシステムの中にカプセル化されたペプチドのバイオアベイラビリティの増大を、肥満／糖尿病マウスで確認した。最後に、グルコースのホメオスタシスおよび脂質の代謝に及ぼすナノシステムの影響を、常習的な長期間の処置（５週間の間１日１回）により肥満／糖尿病マウスモデルで試験し、このナノシステムが、Ｔ２ＤＭの処置におけるインクレチンペプチドの経口送達において現在の戦略に代わる有効な代替案を表すことを確認した。肥満／糖尿病マウスにおける処置および薬物動態学的試験では、以前の試験に基づきグループあたり１０匹のマウスを使用した。全ての動物実験は、実験動物の保護に関する２０１３年５月２９日のベルギーの法律により明記されるように、地元の動物委員会（２０１４／ＵＣＬ／ＭＤ／０３３および２０１７／ＵＣＬ／ＭＤ／００５）により承認されており、これに従い行われた。
【0130】
１．２－材料
エキセナチドは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）およびＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（オレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ １００（９４％のホスファチジルコリンでのダイズレシチン）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（遊離ＰＥＧ ６６０およびＰＥＧ ６６０ １２－ヒドロキシステアラートの混合物、Ｍｗ ８７０Ｄａ）およびＳｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンオレアート）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、レシチン、タウロコール酸ナトリウム、ペプシン、３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１（ｖｅｒ．２）アッセイキットおよび活性型ＧＬＰ－１アッセイキットは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）から購入した。エキセンディン－４酵素イムノアッセイキットは、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５Ｍｍのグルコース）、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）－１６４０培地、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．０２％）を含むトリプシン（０．２５％）も使用し、これらは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。この試験で利用される全ての化学試薬は、分析グレードであった。
エキセナチドは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）およびＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（オレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ １００（９４％のホスファチジルコリンでのダイズレシチン）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（遊離ＰＥＧ ６６０およびＰＥＧ ６６０ １２－ヒドロキシステアラートの混合物、Ｍｗ ８７０Ｄａ）およびＳｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンオレアート）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、レシチン、タウロコール酸ナトリウム、ペプシン、３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１（ｖｅｒ．２）アッセイキットおよび活性型ＧＬＰ－１アッセイキットは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）から購入した。エキセンディン－４酵素イムノアッセイキットは、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５Ｍｍのグルコース）、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）－１６４０培地、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．０２％）を含むトリプシン（０．２５％）も使用し、これらは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。この試験で利用される全ての化学試薬は、分析グレードであった。
【0131】
１．３－逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセルの調製および特性決定
逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）を、最初に薬物を逆ミセルの中にカプセル化し、次にＬＮＣの中にさらにカプセル化する、２つのステップで製剤化した。最初に、エキセナチドが搭載された逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）を、界面活性剤（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）および油（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）の混合物（１：５の重量比）を高速で撹拌することにより調製した。次に、５０μＬのＥＸＥ（ＭｉｌｌｉＱ水において３０ｍｇ／ｍｌ）を、混合物に滴下し、撹拌しながら維持した。エキセナチドが搭載された逆ミセルの脂質ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）を、Ｈｅｕｒｔａｕｌｔら（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００２； １９：８７５－８８０）に記載される転相プロセスの改変版により調製した。簡潔に述べると、脂溶性Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９、Ｐｅｃｅｏｌ（登録商標）、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）およびＭｉｌｌｉＱ水を含む全ての成分（表１に示されている）を、４０℃、２００ｒｐｍで５分間、磁力による撹拌によりまとめて混合した。
逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）を、最初に薬物を逆ミセルの中にカプセル化し、次にＬＮＣの中にさらにカプセル化する、２つのステップで製剤化した。最初に、エキセナチドが搭載された逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）を、界面活性剤（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）および油（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）の混合物（１：５の重量比）を高速で撹拌することにより調製した。次に、５０μＬのＥＸＥ（ＭｉｌｌｉＱ水において３０ｍｇ／ｍｌ）を、混合物に滴下し、撹拌しながら維持した。エキセナチドが搭載された逆ミセルの脂質ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）を、Ｈｅｕｒｔａｕｌｔら（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００２； １９：８７５－８８０）に記載される転相プロセスの改変版により調製した。簡潔に述べると、脂溶性Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９、Ｐｅｃｅｏｌ（登録商標）、Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）およびＭｉｌｌｉＱ水を含む全ての成分（表１に示されている）を、４０℃、２００ｒｐｍで５分間、磁力による撹拌によりまとめて混合した。
【0132】
【表1】
【0133】
漸進的に加熱／冷却する温度サイクルを、５０℃～６７℃で行った。最後のサイクルの間に、５００μＬのあらかじめ温めた薬物を搭載したＲＭを、転相領域（ＰＩＺ；５９℃～６１．５℃）より約３℃高い混合物に添加した。この溶液を、転相領域（ＰＩＺ）の温度に達するまで冷却し、２．５ｍｌの冷却ＭｉｌｌｉＱ水（４℃）を添加し、高速で２分間撹拌した。ブランクのＲＭ ＬＮＣを、エキセナチドの非存在下にて同じプロトコルにより調製した。
【0134】
１．４－エキセナチドの定量化
ＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化したエキセナチドを、Ｓｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ． ２０１８； １０：６０３－６１３）により以前に記載される勾配方法を使用し高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ， Ｊａｐａｎ）により定量化した。簡潔に述べると、ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｇｕａｒｄカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， ＵＳＡ）を伴うＫｉｎｅｔｅｘ（登録商標）ＥＶＯ Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， ＵＳＡ）を、室温で使用した。水性移動相は、０．０５（ｖ／ｖ）％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を含み、有機移動相は、０．０５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルからなるものであった。勾配システムは、１ｍＬ／分の流速にて、比を最初は１０：９０（ｖ／ｖ、水相：有機相）とし、１０分間で９０：１０（ｖ／ｖ）へと線形に変化させ、次の１分間で一定に保つように開発された。次に、この比を、次の１．５分間で最初の組成へと線形に変化させ、最後の１分間で安定化させた。使用される注入容量は２０μＬであり、使用される検出波長は、２２０ｎｍであった。保持時間は５．９分であり、検出限界および定量限界は、それぞれ１．１±０．４μｇ／ｍＬおよび３．３±１．１μｇ／ｍＬであった。
ＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化したエキセナチドを、Ｓｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ． ２０１８； １０：６０３－６１３）により以前に記載される勾配方法を使用し高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ， Ｊａｐａｎ）により定量化した。簡潔に述べると、ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｇｕａｒｄカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， ＵＳＡ）を伴うＫｉｎｅｔｅｘ（登録商標）ＥＶＯ Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， ＵＳＡ）を、室温で使用した。水性移動相は、０．０５（ｖ／ｖ）％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を含み、有機移動相は、０．０５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルからなるものであった。勾配システムは、１ｍＬ／分の流速にて、比を最初は１０：９０（ｖ／ｖ、水相：有機相）とし、１０分間で９０：１０（ｖ／ｖ）へと線形に変化させ、次の１分間で一定に保つように開発された。次に、この比を、次の１．５分間で最初の組成へと線形に変化させ、最後の１分間で安定化させた。使用される注入容量は２０μＬであり、使用される検出波長は、２２０ｎｍであった。保持時間は５．９分であり、検出限界および定量限界は、それぞれ１．１±０．４μｇ／ｍＬおよび３．３±１．１μｇ／ｍＬであった。
【0135】
１．５－ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの特性決定
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によりそれらの粒径および多分散指数（ＰＤＩ）を測定することにより特性決定した。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用してレーザードップラー流速計（ＬＤＶ）により決定した。測定では、５μＬの脂質ナノカプセル懸濁液を、９９５μＬの超純水に分散させた。全ての測定は、三連で行った。
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によりそれらの粒径および多分散指数（ＰＤＩ）を測定することにより特性決定した。ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用してレーザードップラー流速計（ＬＤＶ）により決定した。測定では、５μＬの脂質ナノカプセル懸濁液を、９９５μＬの超純水に分散させた。全ての測定は、三連で行った。
【0136】
また、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、それらの薬物カプセル化の効率（ＥＥ、％）に基づき特性決定した。薬物の総含有量を計算するために、５０μＬのＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを９５０μＬのメタノールに溶解し、次に強力なボルテックスにかけた。遊離エキセナチドおよびカプセル化エキセナチドを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルター（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、４０００ｇ、４℃、２０分）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過により分離した。ろ液を、さらに、１：２の希釈倍率を使用して希釈した。ろ液中のエキセナチドおよびメタノールに溶解したエキセナチドを、上述のＨＰＬＣ法を使用して定量化した。ＥＥは、以下の式：ＥＥ（％）＝（エキセナチドの総量－遊離エキセナチド）／（エキセナチドの総量）×１００を使用して計算した。
【0137】
１．６－刺激した消化管液における脂質ナノカプセルの安定性および薬物の放出
ＥＸＥ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を、５つの異なるバイオミメティック培地：ペプシンを伴うＦａＳＳＧＦ（Ｆａｓｔｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｆｌｕｉｄ）および伴わないＦａＳＳＧＦ、ＦａＳＳＩＦ（Ｆａｓｔｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ）、ＦｅＳＳＩＦ（Ｆｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ）、ならびにＦｅＳＳＩＦ－Ｖ２（ＦｅＳＳＩＦ ｖｅｒｓｉｏｎ ２）（ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ．ｃｏｍ， ＵＫ）で試験した。使用される疑似体液の組成の詳細な記載は、表２に提示する。
ＥＸＥ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を、５つの異なるバイオミメティック培地：ペプシンを伴うＦａＳＳＧＦ（Ｆａｓｔｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｆｌｕｉｄ）および伴わないＦａＳＳＧＦ、ＦａＳＳＩＦ（Ｆａｓｔｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ）、ＦｅＳＳＩＦ（Ｆｅｄ Ｓｔａｔｅ－Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ）、ならびにＦｅＳＳＩＦ－Ｖ２（ＦｅＳＳＩＦ ｖｅｒｓｉｏｎ ２）（ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ．ｃｏｍ， ＵＫ）で試験した。使用される疑似体液の組成の詳細な記載は、表２に提示する。
【0138】
【表2】
【0139】
脂質ナノカプセルの安定性に及ぼす胃および腸の状態の影響を、脂質ナノカプセルの大きさおよびＰＤＩに基づき評価した。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、ペプシンを伴うＦａＳＳＧＦおよび伴わないＦａＳＳＧＦ、ＦａＳＳＩＦ、ＦｅＳＳＩＦ、およびＦｅＳＳＩＦ－Ｖ２において３７℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした（１０ｍＬの培地において１００μＬの脂質ナノカプセル）。所定の時間間隔（刺激した胃の培地では０、０．５、１、および２時間、ならびに刺激した腸の培地およびＦｅＳＳＩＦでは０、０．５、１、３、および６時間）で、サンプルを取り出し、次にＤＬＳにより分析した。
【0140】
１．７－ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出試験
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣからの薬物の放出を、ペプシンの非存在下のＦａＳＳＧＦ培地およびＦａＳＳＩＦ培地において、それぞれ２時間および６時間評価した。試験は、透析方法を使用して行った。簡潔に述べると、１ｍＬのＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、使い捨ての透析膜（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２， Ｍｉｃｒｏｆｌｏａｔ， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ， ＵＳＡ）に載置し、磁力により撹拌しながら３７℃の３５ｍｌの培地を含む５０ｍｌのファルコンチューブに導入した。所定の時間で、５０μＬのサンプルを取り出し、９５０μＬのメタノールに溶解させた。エキセナチドの濃度を、上述のようにＨＰＬＣにより決定した。
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣからの薬物の放出を、ペプシンの非存在下のＦａＳＳＧＦ培地およびＦａＳＳＩＦ培地において、それぞれ２時間および６時間評価した。試験は、透析方法を使用して行った。簡潔に述べると、１ｍＬのＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、使い捨ての透析膜（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２， Ｍｉｃｒｏｆｌｏａｔ， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ， ＵＳＡ）に載置し、磁力により撹拌しながら３７℃の３５ｍｌの培地を含む５０ｍｌのファルコンチューブに導入した。所定の時間で、５０μＬのサンプルを取り出し、９５０μＬのメタノールに溶解させた。エキセナチドの濃度を、上述のようにＨＰＬＣにより決定した。
【0141】
１．８－ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞試験
１．８．１－細胞培養
ヒトＮＣＩ－Ｈ７１６ Ｌ細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手し、１５～２０継代で使用した。完全培地は、１（ｖ／ｖ）％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地から構成されていた。細胞を、３７℃、５（ｖ／ｖ）％のＣＯ２／９５（ｖ／ｖ）％の空気の雰囲気にて７５ｃｍ２のフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｌｏｗｅｌｌ， ＭＡ， ＵＳＡ）で懸濁および増殖させた。１日おきに、いくらかの新鮮な培地を添加した。培地を交換した後、培養物を遠心分離し、その後適切な密度で再懸濁させた。
１．８．１－細胞培養
ヒトＮＣＩ－Ｈ７１６ Ｌ細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手し、１５～２０継代で使用した。完全培地は、１（ｖ／ｖ）％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地から構成されていた。細胞を、３７℃、５（ｖ／ｖ）％のＣＯ２／９５（ｖ／ｖ）％の空気の雰囲気にて７５ｃｍ２のフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｌｏｗｅｌｌ， ＭＡ， ＵＳＡ）で懸濁および増殖させた。１日おきに、いくらかの新鮮な培地を添加した。培地を交換した後、培養物を遠心分離し、その後適切な密度で再懸濁させた。
【0142】
消化器系のマウスＬ細胞株のＧＬＵＴａｇ細胞を、１６～２９継代で使用した。細胞を、１０（ｖ／ｖ）％の不活性化ＦＢＳおよび１（ｖ／ｖ）％のＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５ｍＭのグルコース）（完全ＤＭＥＭ培地）において、５％のＣＯ２を供給させながら３７℃で増殖させた。細胞を、ＥＤＴＡ（０．０２％）を含むトリプシン（０．２５％）を使用して、４～５日ごとに継代培養した。
【0143】
Ｃａｃｏ－２細胞（クローン１）を、２５～３０継代で使用した。Ｃａｃｏ－２細胞株を、１０（ｖ／ｖ）％のＨｙＣｌｏｎｅＴＭ ＦＢＳ、１（ｖ／ｖ）％のＬ－グルタミン、１（ｖ／ｖ）％の非必須アミノ酸、および１（ｖ／ｖ）％のＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭからなる培地において、１０（ｖ／ｖ）％のＣＯ２／９５（ｖ／ｖ）％の空気の雰囲気にて３７℃で維持した。培地は、１日おきに交換した。
【0144】
１．８．２－細胞傷害性試験
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－（２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）比色分析アッセイ（Ｂｅｌｏｑｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１３； １６６， １１５－１２３）を使用して上述のように計算した薬物および脂質ナノカプセルの濃度に基づき、Ｃａｃｏ－２細胞において行った。また、細胞の生存率に及ぼす搭載されていないＲＭ ＬＮＣの影響を、ＧＬＵＴａｇ細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞で試験した。Ｃａｃｏ－２細胞（５×１０４個の細胞／ウェル）を、９６ウェルの組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅ， ＵＳＡ）に播種し、一晩接着させた。ＧＬＵＴａｇおよびＮＣＩ－Ｈ７１６における細胞傷害性試験では、５×１０４個の細胞／ウェルを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした（１０μＬ／ｍＬの培地）９６ウェルプレートに播種した。あらかじめ温めたＰＢＳバッファーでプレートを洗浄（×３）した後、増大する脂質ナノカプセルの濃度（２～１８ｍｇ／ｍＬ）に対応する増大する薬物濃度（０．５～１０ｍｇ／ｍＬ）のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ１００μＬを、ＤＭＥＭ（ＦＢＳを含まない）に分散し、３７℃で２時間Ｃａｃｏ－２細胞と共インキュベートさせた。増大する搭載されていないＲＭ ＬＮＣの濃度（１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたはＲＰＭＩ－１６４０培地（ＦＢＳを含まない）に分散し、ＧＬＵＴａｇ細胞またはＮＣＩ－Ｈ７１６細胞と、それぞれ３７℃で２時間共インキュベートした。インキュベーション後、上清を、３時間の間、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ１００μＬと交換した。紫色のホルマザンの結晶を、ＭｕｌｔｉＳｋｓａｎ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を使用する５６０ｎｍでの吸光度の判定のため２００μＬのＤＭＳＯで溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を伴う細胞（１００％死亡）および培養培地を伴う細胞（１００％生存）を、それぞれ陽性対照および陰性対照とみなした。試験は、三連で行った。
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－（２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）比色分析アッセイ（Ｂｅｌｏｑｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１３； １６６， １１５－１２３）を使用して上述のように計算した薬物および脂質ナノカプセルの濃度に基づき、Ｃａｃｏ－２細胞において行った。また、細胞の生存率に及ぼす搭載されていないＲＭ ＬＮＣの影響を、ＧＬＵＴａｇ細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞で試験した。Ｃａｃｏ－２細胞（５×１０４個の細胞／ウェル）を、９６ウェルの組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅ， ＵＳＡ）に播種し、一晩接着させた。ＧＬＵＴａｇおよびＮＣＩ－Ｈ７１６における細胞傷害性試験では、５×１０４個の細胞／ウェルを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした（１０μＬ／ｍＬの培地）９６ウェルプレートに播種した。あらかじめ温めたＰＢＳバッファーでプレートを洗浄（×３）した後、増大する脂質ナノカプセルの濃度（２～１８ｍｇ／ｍＬ）に対応する増大する薬物濃度（０．５～１０ｍｇ／ｍＬ）のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ１００μＬを、ＤＭＥＭ（ＦＢＳを含まない）に分散し、３７℃で２時間Ｃａｃｏ－２細胞と共インキュベートさせた。増大する搭載されていないＲＭ ＬＮＣの濃度（１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたはＲＰＭＩ－１６４０培地（ＦＢＳを含まない）に分散し、ＧＬＵＴａｇ細胞またはＮＣＩ－Ｈ７１６細胞と、それぞれ３７℃で２時間共インキュベートした。インキュベーション後、上清を、３時間の間、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ１００μＬと交換した。紫色のホルマザンの結晶を、ＭｕｌｔｉＳｋｓａｎ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を使用する５６０ｎｍでの吸光度の判定のため２００μＬのＤＭＳＯで溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を伴う細胞（１００％死亡）および培養培地を伴う細胞（１００％生存）を、それぞれ陽性対照および陰性対照とみなした。試験は、三連で行った。
【0145】
１．９－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ－１の分泌
ＧＬＵＴａｇ細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（１．８×１０５個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした２４ウェル細胞培養プレートに播種し、２４時間接着させた。翌日に、プレートを、予め温めたＰＢＳを使用してやさしく洗浄した。次に、ＧＬＵＴａｇ細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたは搭載されていないＲＭ ＬＮＣと共インキュベートした。他方で、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞を、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地および搭載していないＲＭ ＬＮＣとインキュベートした。両方の培地は、５０μＭの最終濃度でＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含んでいた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。以前に試験した脂質ナノカプセル（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と比較した脂質ナノカプセルの効率を確認するために、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌの脂質ナノカプセルの濃度を使用した。３７℃で２時間インキュベーションした後、上清を回収し、２５０ｇ、４℃で５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、さらなる分析まで－８０℃で保存した。細胞を、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の存在下でＰＢＳに回収した。ＧＬＰ－１を含む細胞抽出物を、３回の凍結融解サイクルの後に入手し、次に、２５０ｇにて４℃で５分間遠心分離した。総ＧＬＰ－１の濃度を、Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）を使用して決定した。ＧＬＰ－１の分泌は、上清＋細胞で検出されるＧＬＰ－１の量として表されている。ＧＬＰ－１の分泌は、以下の式により計算した：ＧＬＰ－１の分泌＝Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ／（Ｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＋Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）（式中、Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒは、上清で試験したＧＬＰ－１の濃度であり、Ｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒは、細胞で試験したＧＬＰ－１の濃度である）。
ＧＬＵＴａｇ細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（１．８×１０５個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした２４ウェル細胞培養プレートに播種し、２４時間接着させた。翌日に、プレートを、予め温めたＰＢＳを使用してやさしく洗浄した。次に、ＧＬＵＴａｇ細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたは搭載されていないＲＭ ＬＮＣと共インキュベートした。他方で、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞を、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地および搭載していないＲＭ ＬＮＣとインキュベートした。両方の培地は、５０μＭの最終濃度でＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含んでいた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。以前に試験した脂質ナノカプセル（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と比較した脂質ナノカプセルの効率を確認するために、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌの脂質ナノカプセルの濃度を使用した。３７℃で２時間インキュベーションした後、上清を回収し、２５０ｇ、４℃で５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４ Ｒ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、さらなる分析まで－８０℃で保存した。細胞を、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の存在下でＰＢＳに回収した。ＧＬＰ－１を含む細胞抽出物を、３回の凍結融解サイクルの後に入手し、次に、２５０ｇにて４℃で５分間遠心分離した。総ＧＬＰ－１の濃度を、Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）を使用して決定した。ＧＬＰ－１の分泌は、上清＋細胞で検出されるＧＬＰ－１の量として表されている。ＧＬＰ－１の分泌は、以下の式により計算した：ＧＬＰ－１の分泌＝Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ／（Ｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＋Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）（式中、Ｃｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒは、上清で試験したＧＬＰ－１の濃度であり、Ｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒは、細胞で試験したＧＬＰ－１の濃度である）。
【0146】
１．１０－正常血糖マウスにおける総ＧＬＰ－１の分泌
正常血糖マウス（雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、２０～２５ｇ、１０週齢；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を、それぞれ８匹のマウスを含む２つのグループに無作為に分割した。動物を一晩絶食させた後、自由に水にアクセスさせながら実験を行った。マウスを、約１．６２ｍｇ／ｇのナノ粒子用量に対応するブランクのＲＭ ＬＮＣで処置した。対照マウスを、等量のＭｉｌｌｉＱ水の経口強制投与により処置した。経口投与から６０分後および１８０分後に、尾静脈の先端から血液サンプルを取り出した。サンプルを、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤（血液１ｍｌあたり２０μＬ）の存在下で回収し、氷上で維持した。試験の直後に、血液サンプルを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分）し、血漿を、分析まで－８０℃で凍結した。総ＧＬＰ－１レベルを、Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡ）を使用して定量化した。総ＧＬＰ－１血漿値は、未処置の対照グループと比較した倍率変化として表されている。
正常血糖マウス（雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、２０～２５ｇ、１０週齢；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を、それぞれ８匹のマウスを含む２つのグループに無作為に分割した。動物を一晩絶食させた後、自由に水にアクセスさせながら実験を行った。マウスを、約１．６２ｍｇ／ｇのナノ粒子用量に対応するブランクのＲＭ ＬＮＣで処置した。対照マウスを、等量のＭｉｌｌｉＱ水の経口強制投与により処置した。経口投与から６０分後および１８０分後に、尾静脈の先端から血液サンプルを取り出した。サンプルを、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤（血液１ｍｌあたり２０μＬ）の存在下で回収し、氷上で維持した。試験の直後に、血液サンプルを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分）し、血漿を、分析まで－８０℃で凍結した。総ＧＬＰ－１レベルを、Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡ）を使用して定量化した。総ＧＬＰ－１血漿値は、未処置の対照グループと比較した倍率変化として表されている。
【0147】
１．１１－高脂肪食により誘導した肥満／糖尿病マウスにおける経口グルコース負荷試験
８週齢の雄性のマウスを、ケージあたり５匹で収容し、５つのグループ（グループあたり１０匹のマウス）に分割した。２週間順化させた後、実験前に３、８、または１０週間、マウスに高脂肪食（６０％の脂肪、２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）（ＨＦＤで処置したグループおよびエキセナチドで処置したグループ）または通常の固形飼料食（対照、ＡＩＮ９３Ｍｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）を与え、一晩絶食させた後に、経口エキセナチド溶液（ＥＸＥ、５００μｇのエキセナチド／ｋｇ体重）、エキセナチドの逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ、５００μｇのエキセナチド／ｋｇ体重）、または搭載されていないミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣと同等の濃度）で１時間処置し、その後経口グルコース強制投与を用いて試験した。対照グループ（対照食グループおよびＨＦＤグループ）は、等量の無菌のＭｉｌｌｉＱ水を経口強制投与することにより処置した。１時間後、マウスを、経口グルコース強制投与（２ｇ／ｋｇのグルコース用量）で試験した。血中グルコースを、経口グルコース負荷の３０分前（－３０分）、ならびに経口グルコース負荷から０、１５、３０、９０、および１２０分後に測定した。血中グルコースは、尾静脈の先端から回収した血液サンプルから、グルコースメーター（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ， Ｒｏｃｈｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。血液サンプルは、－３０分および１５分で回収し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（それぞれＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡおよびＭｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）により総ＧＬＰ－１およびインスリンの血漿中濃度を試験した。インスリン抵抗性指数は、入手した血漿における血中グルコースおよびインスリンの曲線下面積を、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）で乗算することにより決定した。
８週齢の雄性のマウスを、ケージあたり５匹で収容し、５つのグループ（グループあたり１０匹のマウス）に分割した。２週間順化させた後、実験前に３、８、または１０週間、マウスに高脂肪食（６０％の脂肪、２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）（ＨＦＤで処置したグループおよびエキセナチドで処置したグループ）または通常の固形飼料食（対照、ＡＩＮ９３Ｍｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）を与え、一晩絶食させた後に、経口エキセナチド溶液（ＥＸＥ、５００μｇのエキセナチド／ｋｇ体重）、エキセナチドの逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ、５００μｇのエキセナチド／ｋｇ体重）、または搭載されていないミセルが搭載された脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣと同等の濃度）で１時間処置し、その後経口グルコース強制投与を用いて試験した。対照グループ（対照食グループおよびＨＦＤグループ）は、等量の無菌のＭｉｌｌｉＱ水を経口強制投与することにより処置した。１時間後、マウスを、経口グルコース強制投与（２ｇ／ｋｇのグルコース用量）で試験した。血中グルコースを、経口グルコース負荷の３０分前（－３０分）、ならびに経口グルコース負荷から０、１５、３０、９０、および１２０分後に測定した。血中グルコースは、尾静脈の先端から回収した血液サンプルから、グルコースメーター（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ， Ｒｏｃｈｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。血液サンプルは、－３０分および１５分で回収し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（それぞれＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡおよびＭｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）により総ＧＬＰ－１およびインスリンの血漿中濃度を試験した。インスリン抵抗性指数は、入手した血漿における血中グルコースおよびインスリンの曲線下面積を、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）で乗算することにより決定した。
【0148】
１．１２－正常血糖マウスおよび肥満／糖尿病マウスにおける薬物動態学的試験
８週齢の雄性のマウスを、無作為に３つのグループ（時点あたり１０匹のマウス）に分割し、食餌および無菌水に自由にアクセスできる制御された環境（２３±２℃の室温、１２時間の明暗周期）に収容した。２週間順化させた後、マウスに３週間ＨＦＤ（６０％の脂肪）を与えた。実験の前に、マウスを、無菌性のＭｉｌｌｉ－Ｑ水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。エキセナチド溶液およびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、５００μｇ／ｋｇの用量で経口投与した。またエキセナチドを、５０μｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。異なる時点（０、０．５、１、１．５、２、４、６、および８時間）で、血液サンプルを、尾静脈の先端から回収した。次に、血液サンプルを遠心分離（１５００ｇ、４℃で１０分間）し、エキセナチドの血漿中濃度を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＥＫ－０７０－９４， Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化した。エキセナチドの相対的なバイオアベイラビリティ（ＦＲ％）を、以下の式：
を使用して計算した。
８週齢の雄性のマウスを、無作為に３つのグループ（時点あたり１０匹のマウス）に分割し、食餌および無菌水に自由にアクセスできる制御された環境（２３±２℃の室温、１２時間の明暗周期）に収容した。２週間順化させた後、マウスに３週間ＨＦＤ（６０％の脂肪）を与えた。実験の前に、マウスを、無菌性のＭｉｌｌｉ－Ｑ水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。エキセナチド溶液およびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを、５００μｇ／ｋｇの用量で経口投与した。またエキセナチドを、５０μｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。異なる時点（０、０．５、１、１．５、２、４、６、および８時間）で、血液サンプルを、尾静脈の先端から回収した。次に、血液サンプルを遠心分離（１５００ｇ、４℃で１０分間）し、エキセナチドの血漿中濃度を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＥＫ－０７０－９４， Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化した。エキセナチドの相対的なバイオアベイラビリティ（ＦＲ％）を、以下の式：
【数1】
【0149】
薬物動態学的なパラメータは、ＰＫＳｏｌｖｅｒ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ． ２０１０； ９９， ３０６－３１４）を使用して分析した。正常血糖マウスの場合では、時点あたり４匹のマウスを代わりに使用した。エキセナチドは、同じ条件下で測定した。
【0150】
１．１３－肥満／糖尿病マウスにおける常習的なエキセナチドの長期間の処置試験
８週齢の雄性のマウスを、無作為に７つのグループ（グループあたり１０匹のマウス）に分割し、無菌性の食餌（ＡＩＮ９３Ｍｉ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔ）および無菌水に自由にアクセスできる制御された環境（２３℃±２℃の室温、１２時間の明暗周期）でケージあたり５匹を収容した。２週間の順化期間の後に、マウスに、８週間ＨＦＤ（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）（エキセナチドで処置したグループ）または通常の固形飼料食（対照）を与えた。この期間の後に、続く５週間の処置期間の中で、マウスの体重を毎日記録し、糖血症を１週間に１回モニタリングした。マウスを、（ｉ）エキセナチド溶液もしくはＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化されたエキセナチド（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）、もしくは対応する濃度の搭載されていないＲＭ ＬＮＣを用いて経口的に、または（ｉｉ）エキセナチド溶液（１０μｇ／ｋｇ）を用いるかもしくはＢｙｅｔｔａ（登録商標）（１０μｇ／ｋｇ）（販売されているエキセナチド皮下投与注射剤）としての皮下投与により、午後４時に毎日処置した。対照グループ（健常およびＨＦＤ）は、等量の無菌性ＭｉｌｌｉＱ水を用いて毎日経口的に処置した。グルコース試験前に、マウスを、週に１回６時間絶食させた。処置期間の終了時に、動物に、イソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ， Ａｂｂｏｔｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で麻酔をかけ、血液を、門脈および大静脈からサンプリングした。全採血の後、マウスを、頚椎脱臼により安楽死させた。皮下脂肪組織、肝臓、および脾臓を正確に解剖し、重量測定し、液体窒素に即座に浸漬した後、さらなる解析のため－８０℃で保存するか、または組織解析（肝臓）のため４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に保存した。体組成および脂肪組織に及ぼす影響を、皮下脂肪組織（ＳＡＴ）、精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）、内臓脂肪組織（ＶＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量（ｍｇ）により評価した。総ＧＬＰ－１（ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ， Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）およびインスリン（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ， Ｍｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を含む食物摂取および体重に関与するグルコースおよび消化管ホルモンのレベルを、末梢血および門脈血で測定した。脂肪肝を、オイルレッドＯ染色により可視化した。肝臓組織は、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に埋め込み、冷却したイソペンタンにて急速冷凍した。５μメートル厚の組織切片を、脂肪含有量の分析のためオイルレッドＯ染色で染色した。マウスあたり５つの高倍率の視野（２０×）を分析した。平均液滴領域の定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．０－ｒｃ－６９／１．５２ｉ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）を使用して行った。肝臓の全般的な形態を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片により評価した。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析では、総ＲＮＡは、ＴｒｉＰｕｒｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して組織から単離した。相補ＤＮＡは、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ）を使用する１μｇの総ＲＮＡの逆転写により調製した。リアルタイムＰＣＲは、製造社の説明にしたがい検出のためＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）を使用して、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムおよびＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）で行った。リボソームタンパク質Ｌ１９（Ｒｐｌ１９）を、ハウスキーピング遺伝子として選択した。全てのサンプルは、２つの９６ウェル反応プレートにおいて二連で行い、データは、２－ΔΔＣＴ法により分析した。増幅させた産物の同一性および純度は、増幅の終了時に融解曲線分析により評価した。目的のマウス遺伝子のプライマー配列を、表３に提示する。
８週齢の雄性のマウスを、無作為に７つのグループ（グループあたり１０匹のマウス）に分割し、無菌性の食餌（ＡＩＮ９３Ｍｉ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔ）および無菌水に自由にアクセスできる制御された環境（２３℃±２℃の室温、１２時間の明暗周期）でケージあたり５匹を収容した。２週間の順化期間の後に、マウスに、８週間ＨＦＤ（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）（エキセナチドで処置したグループ）または通常の固形飼料食（対照）を与えた。この期間の後に、続く５週間の処置期間の中で、マウスの体重を毎日記録し、糖血症を１週間に１回モニタリングした。マウスを、（ｉ）エキセナチド溶液もしくはＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化されたエキセナチド（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）、もしくは対応する濃度の搭載されていないＲＭ ＬＮＣを用いて経口的に、または（ｉｉ）エキセナチド溶液（１０μｇ／ｋｇ）を用いるかもしくはＢｙｅｔｔａ（登録商標）（１０μｇ／ｋｇ）（販売されているエキセナチド皮下投与注射剤）としての皮下投与により、午後４時に毎日処置した。対照グループ（健常およびＨＦＤ）は、等量の無菌性ＭｉｌｌｉＱ水を用いて毎日経口的に処置した。グルコース試験前に、マウスを、週に１回６時間絶食させた。処置期間の終了時に、動物に、イソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ， Ａｂｂｏｔｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で麻酔をかけ、血液を、門脈および大静脈からサンプリングした。全採血の後、マウスを、頚椎脱臼により安楽死させた。皮下脂肪組織、肝臓、および脾臓を正確に解剖し、重量測定し、液体窒素に即座に浸漬した後、さらなる解析のため－８０℃で保存するか、または組織解析（肝臓）のため４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に保存した。体組成および脂肪組織に及ぼす影響を、皮下脂肪組織（ＳＡＴ）、精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）、内臓脂肪組織（ＶＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量（ｍｇ）により評価した。総ＧＬＰ－１（ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ， Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）およびインスリン（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ， Ｍｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を含む食物摂取および体重に関与するグルコースおよび消化管ホルモンのレベルを、末梢血および門脈血で測定した。脂肪肝を、オイルレッドＯ染色により可視化した。肝臓組織は、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に埋め込み、冷却したイソペンタンにて急速冷凍した。５μメートル厚の組織切片を、脂肪含有量の分析のためオイルレッドＯ染色で染色した。マウスあたり５つの高倍率の視野（２０×）を分析した。平均液滴領域の定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．０－ｒｃ－６９／１．５２ｉ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）を使用して行った。肝臓の全般的な形態を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片により評価した。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析では、総ＲＮＡは、ＴｒｉＰｕｒｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して組織から単離した。相補ＤＮＡは、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ）を使用する１μｇの総ＲＮＡの逆転写により調製した。リアルタイムＰＣＲは、製造社の説明にしたがい検出のためＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）を使用して、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムおよびＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）で行った。リボソームタンパク質Ｌ１９（Ｒｐｌ１９）を、ハウスキーピング遺伝子として選択した。全てのサンプルは、２つの９６ウェル反応プレートにおいて二連で行い、データは、２－ΔΔＣＴ法により分析した。増幅させた産物の同一性および純度は、増幅の終了時に融解曲線分析により評価した。目的のマウス遺伝子のプライマー配列を、表３に提示する。
【0151】
【表3】
【0152】
総脂質を、（Ｅｖｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１９； １０， ４５７）により上述されるように改変したＦｏｌｃｈ法（Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９５７； ２２６， ４９７－５０９）により、クロロホルム－メタノールで抽出した後に測定した。トリグリセリドおよびコレステロールの濃度を、最終産物の酵素反応と分光光度法による検出とをカップリングしたキット（Ｄｉａｓｙｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｈｏｌｚｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。全てのサンプルは、二連で行った。
【0153】
１．１４－統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７プログラム（ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して統計分析を行った。全ての分析および各グループで、全ての排除は、異常値の検出のためのＧｒｕｂｂｓ検定の使用により裏付けられていた。値は、分析を行う前にグループ間で分散が有意に異なるものだった場合に、対数変換により正規化した。２元または１元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を、複数のグループ間の比較に適用した。正規化の後であっても分散がグループ間で有意に異なっていた場合、ノンパラメトリック検定を行った。この結果は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。Ｐ＜０．０５の差異は、統計上有意であるとみなした。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７プログラム（ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して統計分析を行った。全ての分析および各グループで、全ての排除は、異常値の検出のためのＧｒｕｂｂｓ検定の使用により裏付けられていた。値は、分析を行う前にグループ間で分散が有意に異なるものだった場合に、対数変換により正規化した。２元または１元ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙの事後検定を、複数のグループ間の比較に適用した。正規化の後であっても分散がグループ間で有意に異なっていた場合、ノンパラメトリック検定を行った。この結果は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。Ｐ＜０．０５の差異は、統計上有意であるとみなした。
【0154】
２．結果および論考
２．１－エキセナチドは、脂質ベースの脂質ナノカプセルの中にうまくカプセル化され、保存されている。
近年、脂質ベースの脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）が、約２００ｎｍの大きさを提示する場合、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌をもたらしたことが発見された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）。カプセル化されたＧＬＰ－１類縁体の薬理学的作用と共にＬＮＣの生体作用の相乗作用を提供することが実現可能であり得るかどうかは知られていなかった。よって、概念実証として、ＧＬＰ－１類縁体エキセナチド（ＥＸＥ）を、親水性分子である、ＬＮＣの中にカプセル化されているインクレチンミメティックとして選択した。この可能性を評価するためには、脂質ナノカプセル自体で観察されるｉｎ ｖｉｖｏでの（たとえば内因性ＧＬＰ－１の分泌をもたらす）生体作用に寄与する、ナノ担体の物理化学的な特徴を保ちつつ、脂質ナノカプセルの液体の脂質内核の中にエキセナチドをカプセル化することが重要であった（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）。ＬＮＣは、転相プロセスにより調製した（Ｈｅｕｒｔａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００２； １９， ８７５－８８０）。ＬＮＣを調製するために使用された以前に記載の手法（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と比較して、この内部の油状のコアは、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリドの混合物（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）ならびにオレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド（Ｐｅｃｅｏｌ（登録商標））と置き換えられた。このバリエーションは、６０℃～９０℃から５０℃～６７℃へと漸進的に加熱／冷却する温度サイクルの低減を可能にし、ＥＸＥのＬＮＣへの組み込みを可能にした。ＬＮＣへのカプセル化の前に、ＥＸＥは、ソルビタンオレアート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）ならびにカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）の混合物から構成される界面活性剤－油の組み合わせを使用して逆ミセル（ＲＭ）の中に導いた（Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ． ２０１０； ３９８， ２０４－２０９）。次に、これらＥＸＥ ＲＭを、ＬＮＣ調製プロセスの最後のサイクルの間に製剤に組み込んだ。製剤の最終的な組成は、上記の表１に記載されており、物理化学的な特性評価が表４に詳述されている。
２．１－エキセナチドは、脂質ベースの脂質ナノカプセルの中にうまくカプセル化され、保存されている。
近年、脂質ベースの脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）が、約２００ｎｍの大きさを提示する場合、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌をもたらしたことが発見された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）。カプセル化されたＧＬＰ－１類縁体の薬理学的作用と共にＬＮＣの生体作用の相乗作用を提供することが実現可能であり得るかどうかは知られていなかった。よって、概念実証として、ＧＬＰ－１類縁体エキセナチド（ＥＸＥ）を、親水性分子である、ＬＮＣの中にカプセル化されているインクレチンミメティックとして選択した。この可能性を評価するためには、脂質ナノカプセル自体で観察されるｉｎ ｖｉｖｏでの（たとえば内因性ＧＬＰ－１の分泌をもたらす）生体作用に寄与する、ナノ担体の物理化学的な特徴を保ちつつ、脂質ナノカプセルの液体の脂質内核の中にエキセナチドをカプセル化することが重要であった（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）。ＬＮＣは、転相プロセスにより調製した（Ｈｅｕｒｔａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００２； １９， ８７５－８８０）。ＬＮＣを調製するために使用された以前に記載の手法（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と比較して、この内部の油状のコアは、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリドの混合物（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）ならびにオレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド（Ｐｅｃｅｏｌ（登録商標））と置き換えられた。このバリエーションは、６０℃～９０℃から５０℃～６７℃へと漸進的に加熱／冷却する温度サイクルの低減を可能にし、ＥＸＥのＬＮＣへの組み込みを可能にした。ＬＮＣへのカプセル化の前に、ＥＸＥは、ソルビタンオレアート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）ならびにカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９）の混合物から構成される界面活性剤－油の組み合わせを使用して逆ミセル（ＲＭ）の中に導いた（Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ． ２０１０； ３９８， ２０４－２０９）。次に、これらＥＸＥ ＲＭを、ＬＮＣ調製プロセスの最後のサイクルの間に製剤に組み込んだ。製剤の最終的な組成は、上記の表１に記載されており、物理化学的な特性評価が表４に詳述されている。
【0155】
【表4】
【0156】
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ、およびペプチドを含まないＲＭをカプセル化した脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）の両方の平均粒径は、約２２０ｎｍであった。小さなＰＤＩ指数（ＰＤＩ＜０．２）は、粒度分布の観点からの得られた脂質ナノカプセルの均一性を表した。大きさおよびＰＤＩに加え、エキセナチドのカプセル化の後の脂質ナノカプセルの表面電荷にも有意な影響はなかった（Ｐ＞０．０５）。特に、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣは、約８５％の封入効率を呈した。
【0157】
脂質ナノカプセルは、バイオミメティック消化管液においてｉｎ ｖｉｔｒｏで安定したままであり、エキセナチドの分解を阻止していた（図１）。脂質ナノカプセルの安定性は、絶食状態および食事が供給される状態の模擬胃液または模擬腸液を含む５つのバイオミメティック培地（それぞれ、ペプシンを伴うかまたは伴わないＦａＳＳＧＦ、ＦａＳＳＩＦ、ＦｅＳＳＩＦ、およびＦｅＳＳＩＦ－ｖ２）において確認された（図１Ａ～Ｅ）。これら結果により、新規に開発した脂質ナノカプセルが以前に記載された従来の脂質ナノカプセル（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５； Ｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ． ２００９； ３７９， ２６０－２６５）と同じ胃に耐性のある特性を保持していたことが確認された。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのエキセナチドの放出プロファイルを、胃の培地（ペプシンを伴わないＦａＳＳＧＦ、ｐＨ１．６）および腸の培地（ＦａＳＳＩＦ、ｐＨ６．５）でさらに評価した（図１Ａ～Ｆ）。エキセナチドは、６時間の期間にわたりＲＭ ＬＮＣから漸進的に放出し、ＦａＳＳＩＦではこの時間の後に６０％の累積的なエキセナチドの放出を達成したが、ＦａＳＳＧＦでは検出できなかった（図１Ｆ）。
【0158】
２．２－ＲＭ ＬＮＣは、正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＧＬＰ－１の分泌を誘導し、ＥＸＥの血中レベルを増大させる。
まず、ＧＬＰ－１の分泌を誘導する特性に及ぼすＲＭ ＬＮＣの特性を、マウスＬ細胞（ＧＬＵＴａｇ細胞）およびヒトＬ細胞（ＮＣｌ－Ｈ７１６）の両方においてｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した（図２Ａ）。約２２０ｎｍの粒径のＲＭ ＬＮＣは、両方のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘発することができた（図２Ａ）。重要なことに、さらなる液体の脂質がＲＭ ＬＮＣの内核に組み込まれたが、ＧＬＰ－１の分泌の刺激は、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリドのコアを含む脂質ナノカプセルに関して以前に記載されたもの（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と同等であった。よって、これらデータにより、ナノシステムの外部の物理化学的な特性（たとえば表面電荷）を保存することにより、ＧＬＰ－１の分泌を誘導するナノ担体の特性を維持することが可能であったことが確認された。
まず、ＧＬＰ－１の分泌を誘導する特性に及ぼすＲＭ ＬＮＣの特性を、マウスＬ細胞（ＧＬＵＴａｇ細胞）およびヒトＬ細胞（ＮＣｌ－Ｈ７１６）の両方においてｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した（図２Ａ）。約２２０ｎｍの粒径のＲＭ ＬＮＣは、両方のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘発することができた（図２Ａ）。重要なことに、さらなる液体の脂質がＲＭ ＬＮＣの内核に組み込まれたが、ＧＬＰ－１の分泌の刺激は、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリドのコアを含む脂質ナノカプセルに関して以前に記載されたもの（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５， １０８－１１５）と同等であった。よって、これらデータにより、ナノシステムの外部の物理化学的な特性（たとえば表面電荷）を保存することにより、ＧＬＰ－１の分泌を誘導するナノ担体の特性を維持することが可能であったことが確認された。
【0159】
ＲＭ ＬＮＣが正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ－１の分泌を誘発できるかどうかをさらに調査した（図２Ｂ）。特に、ＲＭ ＬＮＣの経口投与により、ＧＬＰ－１レベルが最大約３倍まで増大したことが観察されたため、薬理学的作用がｉｎ ｖｉｖｏで保存されていた（図２Ｂ）。よって、ナノ担体の薬理学的作用は、細胞の性質（マウスまたはヒト）に関わらず両細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、および正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで再現された。
【0160】
ＲＭ ＬＮＣがＧＬＰ－１の内因性分泌を誘発するだけでなく、インクレチンミメティックペプチドの経口送達のためのナノ担体として二重作用として作用するという仮説を検証するために、これらペプチドの吸収を増大させるナノ担体の特性を評価した。この目的のため、エキセナチドの血漿中濃度を、水溶液またはＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化された溶液（５００μｇ／ｋｇのエキセナチド用量）として経口投与した後に測定した。エキセナチドの血漿中レベルは、溶液における遊離エキセナチドとして送達された場合よりもＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化された場合に高かった（図３）。まとめると、これらデータにより、内因性ＧＬＰ－１レベルを高め、ＥＸＥの血漿中レベルを増大させ、よってペプチドの吸収を可能にするＲＭ ＬＮＣの有効性に関する仮説が確認された。
【0161】
さらに、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの細胞傷害性のエビデンスは、増大する薬物濃度０．５～１０ｍｇ／ｍＬ（図４Ａ）またはナノ粒子の濃度２～１８ｍｇ／ｍＬ（図４Ｂ）の後にヒトの腸上皮Ｃａｃｏ－２細胞で観察できなかった。ＧＬＵＴａｇ細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞におけるＲＭ ＬＮＣの細胞傷害性は、それぞれ図４Ｃおよび図４Ｄに記載されている。
【0162】
２．３－エキセナチドの血漿中レベルの増大と内因性ＧＬＰ－１の放出の組み合わせは、糖尿病マウスの糖血症を改善する。
ナノ担体が介在する内因性ＧＬＰ－１レベルのＥＸＥ血漿中濃度の増大との組み合わせに関する治療上の関連性を、食餌誘導性肥満／糖尿病マウスモデルで評価した。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの投与を、マウスの高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性Ｔ２ＤＭモデル（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）において急性的な処置（１回の単一投与）により行った。最初に、ＨＦＤマウスが、絶食状態で著しく高血糖性かつ高インスリン性であり、強力な度合いのインスリン抵抗性（たとえばインスリン抵抗性の指数）を呈したことが確認された。
ナノ担体が介在する内因性ＧＬＰ－１レベルのＥＸＥ血漿中濃度の増大との組み合わせに関する治療上の関連性を、食餌誘導性肥満／糖尿病マウスモデルで評価した。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの投与を、マウスの高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性Ｔ２ＤＭモデル（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）において急性的な処置（１回の単一投与）により行った。最初に、ＨＦＤマウスが、絶食状態で著しく高血糖性かつ高インスリン性であり、強力な度合いのインスリン抵抗性（たとえばインスリン抵抗性の指数）を呈したことが確認された。
【0163】
経口グルコース投与（２ｇ／ｋｇ）の６０分前に、５００μｇ／ｋｇのエキセナチド用量（遊離およびＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化）ならびに同等の濃度のＲＭ ＬＮＣまたは水を１度経口投与した。驚くべきことに、本発明者らは、これらマウスの糖血症が、痩せた正常血糖対照マウスで観察されたものと同じ全体的な経口グルコース試験を通したプロファイルをたどったため、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣでの処置が、糖血症を完全に正常化したことを見出した（図５）。逆に、ＥＸＥで処置したマウスで測定したグルコースレベルは、３０分でＨＦＤを供給したマウスのレベルと同様のままであり、９０分までＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスのレベルよりも依然として高かった（図５）。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣは、血漿グルコースレベルおよびグルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）を有意に減少できた（図６）。重要なことに、総ＧＬＰ－１レベルは、対照グループ（対照およびＨＦＤ）と比較してＲＭ ＬＮＣで処置したグループおよびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したグループの両方において有意に増大したことが観察され、病態下でＧＬＰ－１の放出を刺激するナノシステム自体の特性が確認された。しかしながら、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのみが、ＨＦＤグループと比較して有意にインスリン抵抗性指数を低減した（図７）。
【0164】
興味深いことに、ＲＭ ＬＮＣ単独は、未処置のＨＦＤマウスと比較して血中グルコースレベルを低下させる効果を有していた。しかしながら、この効果は、高血糖を低減するには十分ではなかった。ＨＦＤマウスにおいてエキセナチドレベルを測定する薬物動態学的試験により、エキセナチドの血中レベルが、エキセナチド溶液と比較してＲＭ ＬＮＣの中で経口投与された場合（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）に有意に増大したことが確認された（ＬＮＣとの相対的なバイオアベイラビリティ４．３２％、Ｐ＜０．００１）。この相対的なバイオアベイラビリティは、開発の最終段階に推移した既知のペプチドが推定０．５～１％のバイオアベイラビリティを伴うことを鑑みると、価値が高く、大幅に改善されていると考えることができる。計算された薬物動態学的なパラメータを、表５にまとめる。
【0165】
【表5】
【0166】
本発明者らは、正常血糖マウス（図３）対ＨＦＤマウス（図８）における異なるエキセナチドの薬物動態プロファイル（たとえば異なるＣｍａｘ、ＡＵＣ、Ｔｍａｘ）を観察した。エキセナチドの血中レベルの増大および内因性ＧＬＰ－１レベルの増大をまとめて考慮すると、これらデータは、Ｔ２ＤＭの症状の寛解のために開発されたナノシステムの有効性に関する強力な概念実証として用いられる。
【0167】
このモデルは、マウスの食餌誘導性糖尿病および代謝障害のより強力なモデルであるため、ＥＸＥ対ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの影響をＨＦＤで８週間および１０週間処置したマウスでさらに調査した。ＯＧＴＴの間の血中グルコースレベルの低下に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの有効性に関して同等の結果が、疾患の慢性度に関わらず得られた（図９Ａ～Ｂ）。
【0168】
２．４－常習的なＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの長期間の処置は、肥満および糖尿病のマウスのグルコースの代謝を改善する。
グルコースの代謝に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣでの常習的かつ長期間の処置の影響を評価するために、肥満／糖尿病の傾向のマウスを、８週間のＨＦＤに供した後、５００μｇ／ｋｇのエキセナチド（経口）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）または等量の搭載されていない脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）または溶液における遊離エキセナチド（ＥＸＥ）または水を毎日投与しながら５週間ＨＦＤに供した。この実験的な処置の影響を既存の処置戦略と比較するために、市販のエキセナチドの皮下投与形態（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））で処置したグループも同様に包含した。エキセナチドの経口投与を、１０μｇ／ｋｇのエキセナチド溶液またはＢｙｅｔｔａ（登録商標）の皮下投与（ｓ．ｃ．）と比較した。
グルコースの代謝に及ぼすＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣでの常習的かつ長期間の処置の影響を評価するために、肥満／糖尿病の傾向のマウスを、８週間のＨＦＤに供した後、５００μｇ／ｋｇのエキセナチド（経口）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）または等量の搭載されていない脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）または溶液における遊離エキセナチド（ＥＸＥ）または水を毎日投与しながら５週間ＨＦＤに供した。この実験的な処置の影響を既存の処置戦略と比較するために、市販のエキセナチドの皮下投与形態（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））で処置したグループも同様に包含した。エキセナチドの経口投与を、１０μｇ／ｋｇのエキセナチド溶液またはＢｙｅｔｔａ（登録商標）の皮下投与（ｓ．ｃ．）と比較した。
【0169】
５週間毎日処置した後、マウスを屠殺し、血液を、門脈および大静脈から取り出した。興味深いことに、５週間の処置の後、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのみが、対照グループのレベルと同等なレベルに達成するまで血漿グルコースレベルを減少できた（図１０Ａ～Ｂ）。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスが、ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスよりも有意に低い血漿グルコースレベルを有したことに言及することは注目に値する。また血漿グルコースレベルは、ＥＸＥで処置したグループよりもＲＭ ＬＮＣグループにおいて有意に低かった。よって、これらデータは、グルコースのホメオスタシスに関してＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣにより提供される相乗効果を表している。この効果は、恐らくはＲＭ ＬＮＣにより誘発される内因性ＧＬＰ－１の分泌およびエキセナチドの血漿中レベルの増大の組み合わせによるものである。さらに、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスおよび皮下投与により処置したマウスは、対照グループと同等なインスリンレベルを呈した（図１１）。ＨＦＤグループと比較したこの低下は、このデータがＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでＤｕｎｎの事後検定を行うことにより分析された場合に統計上有意性に達しなかったが、マン・ホイットニー検定により分析した場合に有意差が見出された（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ対ＨＦＤでＰ＝０．０４）。
【0170】
２．５－ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを用いた常習的な処置は、肥満／糖尿病マウスにおいて食餌誘導性脂肪肝を減少する。
本発明者らは、肝臓の重量が、ＨＦＤを供給したグループと比較して５週間の処置（１３週間のＨＦＤの供給）の後にＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したグループにおいてのみ有意に低いことを見出した（図１２）。オイルレッドＯ染色の後の組織分析は、ＨＦＤマウスよりもＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスにおいて低い肝臓の脂質の蓄積および少なく小さな脂肪滴により証明されるように、顕著な脂肪肝の減少を明らかにした（データ不図示）。
本発明者らは、肝臓の重量が、ＨＦＤを供給したグループと比較して５週間の処置（１３週間のＨＦＤの供給）の後にＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したグループにおいてのみ有意に低いことを見出した（図１２）。オイルレッドＯ染色の後の組織分析は、ＨＦＤマウスよりもＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスにおいて低い肝臓の脂質の蓄積および少なく小さな脂肪滴により証明されるように、顕著な脂肪肝の減少を明らかにした（データ不図示）。
【0171】
トリグリセリドレベルへのわずかな影響にも関わらず、肝臓の総脂質含有量およびコレステロールレベルは、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスと皮下投与で処置したマウスとの間で同等であり、ＨＦＤグループのレベルよりも有意に低かった（図１３Ａ～Ｃ）。
【0172】
ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣを使用した本手法は、全ての他の処置よりも肝臓の重量の減少において効率的であり、通例の投与経路（ｓ．ｃ．）による市販の薬と同程度に効率的あり、よって、現在の皮下投与の手法と比較して良好なグルコースのパラメータに及ぼす効果および肝臓のマーカーにおける非劣性を明らかに示すことに留意することが非常に重要である。
【0173】
生化学的および組織学的な分析に加えて、免疫細胞集団の浸潤／動員（Ｆ４／８０、Ｃｄ１１ｃ、Ｍｃｐ１）、炎症（Ｔｎｆａ）および脂質の代謝（Ｆａｓｎ、Ｐｐａｒｇ、Ｃｐｔ１ａ）に関連する重要なマーカーを、肝臓および内臓脂肪組織（ＶＡＴ）にて定量ＰＣＲにより分析した。肝臓では、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスにおけるＣｄ１１ｃおよびＭｃｐ１のｍＲＮＡ発現は、ＨＦＤグループよりも有意に低く（それぞれ（Ｐ＝０．０５およびＰ＝０．０３５５）、同じ効果が、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）で処置したグループで観察された（それぞれＰ＝０．００１５およびＰ＝０．０００７）。
【0174】
内臓脂肪の質量は、肝疾患およびインスリン抵抗性の発症に関するリスク因子とみなされている（Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ． ２０１１； ３４ Ｓｕｐｐｌ ２， Ｓ３６７－３７０； Ｌｅｂｏｖｉｔｚ ＆ Ｂａｎｅｒｊｉ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ． ２００５； ２８， ２３２２－２３２５）。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したグループおよびＢｙｅｔｔａ（登録商標）で処置したグループの両方が、ＨＦＤを供給したマウスよりも少ない脂肪を呈したこと、ならびに未処置の対照グループとのこれらグループの脂肪量の有意差はなかったことが見出された（図１４Ａ～Ｅ）。これらの重量は、マン・ホイットニー検定により分析した場合は著しく有意に異なるものであった（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ対ＨＦＤではＰ＝０．００５７およびＢｙｅｔｔａ（登録商標）対ＨＦＤではＰ＝０．０００４）。興味深いことに、ＨＦＤグループで観察されたＦ４／８０の高い発現は、ＡＮＯＶＡによるとＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスでのみ有意にダウンレギュレートされていた。ＨＦＤグループと比較した際、有意な効果は、他のマーカー（Ｃｄ１１ｃ、Ｍｃｐ１、Ｆａｓｎ、Ｐｐａｒｇ、Ｔｎｆａ）では観察されなかった。
【0175】
２．６－論考
多くの進行中の試みにも関わらず、Ｔ２ＤＭの注射可能な治療薬の経口薬物送達戦略への変換は、依然として課題である。結果として、販売されているＧＬＰ－１類縁体を用いた現在の処置は、未だ排他的に皮下投与されている。ペプチドの別の薬物送達システムを提供する目的の試験は、経口投与経路の見込みを完全に利用するために最も重要である。しかしながら、経口ペプチド送達の現在の最先端の戦略は、送達システムを単にビヒクルとして使用し、これらは、担体が最終的な製剤にさらなる治療効果を有し得る可能性を研究していない。インクレチンベースの糖尿病疾患治療の状況では、内因性ＧＬＰ－１の分泌の亢進は、ペプチドの生理機能により密接に類似する新規の別の処置を表す。ここで、（ｉ）カプセル化された合成ＧＬＰ－１類縁体の送達および（ｉｉ）内因性ＧＬＰ－１の分泌の刺激に及ぼす二重の治療効果を有する脂質ベースの薬物送達システム、すなわち脂質ナノカプセルが提供される。
多くの進行中の試みにも関わらず、Ｔ２ＤＭの注射可能な治療薬の経口薬物送達戦略への変換は、依然として課題である。結果として、販売されているＧＬＰ－１類縁体を用いた現在の処置は、未だ排他的に皮下投与されている。ペプチドの別の薬物送達システムを提供する目的の試験は、経口投与経路の見込みを完全に利用するために最も重要である。しかしながら、経口ペプチド送達の現在の最先端の戦略は、送達システムを単にビヒクルとして使用し、これらは、担体が最終的な製剤にさらなる治療効果を有し得る可能性を研究していない。インクレチンベースの糖尿病疾患治療の状況では、内因性ＧＬＰ－１の分泌の亢進は、ペプチドの生理機能により密接に類似する新規の別の処置を表す。ここで、（ｉ）カプセル化された合成ＧＬＰ－１類縁体の送達および（ｉｉ）内因性ＧＬＰ－１の分泌の刺激に及ぼす二重の治療効果を有する脂質ベースの薬物送達システム、すなわち脂質ナノカプセルが提供される。
【0176】
この送達システムの開発における主な一課題は、脂質ナノカプセルの物理化学的な特性を保ちつつ、脂質コアの中に親水性ペプチドをカプセル化することであった。この目的のため、まず、エキセナチドを逆ミセルの中に捕捉し、次に、それ自身を脂質ナノカプセルの内部脂質コアに包含した。この戦略は、それらの構造を変えず、Ｌ細胞の活性化に関するそれらの効果を保持しつつ、脂質ベースのナノ担体の中にＧＬＰ－１ミメティックをカプセル化でき、よって、内因性ＧＬＰ－１の分泌を誘発することができた。
【0177】
ＧＬＰ－１の分泌を誘導するエキセナチドを搭載した脂質ナノカプセルの特性を、マウスＬ細胞およびヒトＬ細胞の両方においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、ならびに正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで確認した（図２Ａ～Ｂ）。さらに、本発明者らは、薬物動態学的試験を行い、エキセナチドの全身循環への吸収を確認した（図３）。製剤の安定性のエビデンス、ペプチドの完全性を保存するナノシステムの特性、ペプチドの全身循環への吸収を可能にしつつｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ－１レベルを増大させるその特性、および最終的にはＨＦＤ誘導性肥満／糖尿病マウスモデルの病理学的状況での本製剤の効果が、本明細書中において提供される。
【0178】
急性的な処置によるｉｎ ｖｉｖｏでの肥満／糖尿病マウスの糖血症を改善するための本発明者らの二重作用ナノシステムの有用性を、最初に評価した。単一の急性投与、次にＯＧＴＴ試験を行った後、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスは、血中グルコースレベルを正常化し、これは対照のグループの値と同等であった。空の脂質ナノカプセルおよびＥＸＥを搭載した脂質ナノカプセルは、未処置のグループまたはＥＸＥ溶液で処置したグループと比較して増大したＧＬＰ－１レベルを提示したが、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスのみが、インスリン抵抗性指数の有意な減少を呈したことが観察された。肥満／糖尿病マウスの薬物動態分析により、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣが４％超までエキセナチドのバイオアベイラビリティを増大させたことが確認された。これらデータは、内因性ＧＬＰ－１レベルの増大およびペプチドのバイオアベイラビリティの増大の両方を組み合わせることにより糖血症の寛解における二重作用薬物送達ナノシステムの有効性のエビデンスを提供する。
【0179】
このナノシステムがＴ２ＤＭの処置におけるインクレチンペプチドの送達に関する現在の皮下投与戦略の代替案を表すことを示すために、５週間の毎日の投与プロトコルからなる常習的な／長期間の処置を行った。グルコースのホメオスタシスおよび脂質の代謝に及ぼすナノシステムの効果を評価した。５週間の処置の後、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣで処置したマウスは、インスリンレベルの減少と共に、未処置の対照マウスの値と同等の正常化した血漿グルコースレベルを呈した。よって、観察された有用な効果は、ナノ担体の急性的な効果に限定されるものではなく、経口グルコース負荷に及ぼす治療効果にも変換される。
【0180】
まとめると、エキセナチドが搭載された脂質ナノカプセルは、高血糖および高インスリン血症の低減の両方に有効であった。
【0181】
この手法が、グルコースのホメオスタシスに関して、皮下投与される現在販売されている薬物で観察されたものと同等の結果をもたらしたことは注目に値する。よって、これら結果は、常習的な処置での経口投与により投与される利点を伴いこの手法の非劣性を表す。
【0182】
またこれらデータは、肝臓および内臓脂肪組織の両方における免疫細胞集団（マクロファージ、樹状細胞）および炎症性マーカーの浸潤－動員に関連するあまり重要ではないマーカーに対する強力な傾向を指摘しており、繰り返しになるが、このようなマーカーに及ぼすこの手法の有用な効果を強調している。Ｆ４／８０は、炎症性細胞の浸潤のマーカーであり（成熟なマクロファージ）、Ｃｄ１１ｃ、Ｍｃｐ１、およびＴｎｆａは、肥満に関連する炎症の間のＭ１マクロファージの表現型を反映することが知られている。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣが、内臓脂肪組織におけるＦ４／８０の遺伝子発現を有意に低減した唯一の処置であったことに留意することが重要である。肥満では、脂肪組織におけるマクロファージの浸潤は、慢性炎症をもたらし、インスリン抵抗性および糖尿病のトリガー因子であるとみなされている（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３； １１２， １７９６－１８０８）。しかしながら、マウスのマクロファージのアブレーションは、グルコースのホメオスタシスの正常化に関連していた（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１４； ２０， ４９９－５１１）。機構的な観点から、本発明者らは、以前に、ＲＭ ＬＮＣがＧＬＰ－１、および恐らくは共ペプチドのＧＬＰ－２の分泌を増大させることを示しており、これは、腸のバリア機能を強化することにより、肥満のげっ歯類において細菌化合物の転位、炎症、および脂肪肝を低減することが示されている（Ｃａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ． ２００９； ５８， １０９１－１１０３）。
【0183】
理論により拘束されることを望むものではないが、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣまたはＲＭ ＬＮＣのいずれかを用いた毎日の経口強制投与は、１日中腸ペプチドの産生を刺激し得、よって、ＨＦＤ供給マウスに良好な代謝プロファイルを維持することに寄与し得る。全ての場合において、毎日の常習的な投与は、代謝を改善し、さらには他のマーカーを正常化するために十分である。最後に、脂質ナノカプセルは、ＤＰＰ－ＩＶの活性を調節し得、よって、体内循環する総ＧＬＰ－１レベルの増大を保持し得る。
【0184】
実施例２：作業例２
１．材料および方法
１．１－材料
エキセナチド（酢酸エキセナチド）（ＥＸＥ）は、Ｂａｃｈｅｍ（登録商標）（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）およびＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（オレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により提供された。Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ １００（９４％のホスファチジルコリンでのダイズレシチン）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）からの贈与であった。Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（遊離ＰＥＧ ６６０およびＰＥＧ ６６０ １２－ヒドロキシステアラートの混合物、Ｍｗ ８７０Ｄａ）およびＳｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンオレアート）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－メトキシルポリ（エチレングリコール）２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ３）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ポリ（エチレングリコール）－２０００］－プロピオナート（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）は、Ｎａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ， ＵＳＡ）から得た。レシチン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、サポニン、ペプシン、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、タウロコール酸ナトリウムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１（ｖｅｒ．２）アッセイキットおよび活性型ＧＬＰ－１アッセイキットは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）から購入した。エキセンディン－４酵素イムノアッセイキットは、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５Ｍｍのグルコース）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、トリプシン（０．２５％）－ＥＤＴＡ（０．０２％）、およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）も使用し、これらは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５）ｓｏｌｉｄ（１，１’－イオクタデシル（ｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ）－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン，４－クロロベンゼンスルホナート塩））は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＫ）から得た。この試験で利用される全ての化学試薬は、分析グレードであった。
１．材料および方法
１．１－材料
エキセナチド（酢酸エキセナチド）（ＥＸＥ）は、Ｂａｃｈｅｍ（登録商標）（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）およびＰｅｃｅｏｌ（登録商標）（オレイン酸モノ、ジ、およびトリグリセリド）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ（Ｓａｉｎｔ－Ｐｒｉｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により提供された。Ｌｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ １００（９４％のホスファチジルコリンでのダイズレシチン）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）からの贈与であった。Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（遊離ＰＥＧ ６６０およびＰＥＧ ６６０ １２－ヒドロキシステアラートの混合物、Ｍｗ ８７０Ｄａ）およびＳｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンオレアート）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－メトキシルポリ（エチレングリコール）２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ３）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ポリ（エチレングリコール）－２０００］－プロピオナート（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）は、Ｎａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ， ＵＳＡ）から得た。レシチン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、サポニン、ペプシン、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、タウロコール酸ナトリウムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）から購入した。Ｔｏｔａｌ ＧＬＰ－１（ｖｅｒ．２）アッセイキットおよび活性型ＧＬＰ－１アッセイキットは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）から購入した。エキセンディン－４酵素イムノアッセイキットは、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５Ｍｍのグルコース）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、トリプシン（０．２５％）－ＥＤＴＡ（０．０２％）、およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）も使用し、これらは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５）ｓｏｌｉｄ（１，１’－イオクタデシル（ｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ）－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン，４－クロロベンゼンスルホナート塩））は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＫ）から得た。この試験で利用される全ての化学試薬は、分析グレードであった。
【0185】
１．２－非目的のナノ粒子および目的のナノ粒子の調製および特性決定
１．２．１－非目的および目的の脂質ベースのナノシステムの調製
エキセナチドをカプセル化した逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）および改変された脂質ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｕｌｅ）（ＬＮＣ）を含む非目的の脂質ナノシステム（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）を、実施例１に記載されるように調製した。まず、エキセナチドをカプセル化した逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）を、１：５ｗ／ｗの比率のＳｐａｎ（登録商標）８０（界面活性剤）およびＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（油）からなる混合物を高速下で撹拌することにより調製した。撹拌の間に、５０μＬの薬物溶液（ＭｉｌｌｉＱ水において３０ｍｇ／ｍＬのエキセナチド）を、混合物に滴下した。第２に、ＬＮＣを、わずかに改変した転相プロセスにより生成した。７６９．５ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９、８５．５ｍｇのＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、１３．４ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、１２０ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、５０ｍｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および１．０２５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水の混合物を、２００ｒｐｍで５分間撹拌した。３回の漸進的に加熱／冷却するサイクル（５０℃～６７℃）を行った。最後のサイクルで、５００μＬのあらかじめ温めたＥＸＥ ＲＭを、温度が転相領域（ＰＩＺ；５９～６１．５℃）より約３℃高い際に混合物に添加した。最後に、２．５ｍＬの冷却水を添加して、２分間の高速撹拌下でＰＩＺの温度に到達させた。ブランクの非目的のナノシステム（ＲＭ ＬＮＣ）は、同じプロトコルを使用して薬物溶液を添加することなく生成した。
１．２．１－非目的および目的の脂質ベースのナノシステムの調製
エキセナチドをカプセル化した逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）および改変された脂質ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｕｌｅ）（ＬＮＣ）を含む非目的の脂質ナノシステム（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ）を、実施例１に記載されるように調製した。まず、エキセナチドをカプセル化した逆ミセル（ＥＸＥ ＲＭ）を、１：５ｗ／ｗの比率のＳｐａｎ（登録商標）８０（界面活性剤）およびＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９（油）からなる混合物を高速下で撹拌することにより調製した。撹拌の間に、５０μＬの薬物溶液（ＭｉｌｌｉＱ水において３０ｍｇ／ｍＬのエキセナチド）を、混合物に滴下した。第２に、ＬＮＣを、わずかに改変した転相プロセスにより生成した。７６９．５ｍｇのＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９、８５．５ｍｇのＰｅｃｅｏｌ（登録商標）、１３．４ｍｇのＬｉｐｏｉｄ（登録商標）Ｓ１００、１２０ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、５０ｍｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および１．０２５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水の混合物を、２００ｒｐｍで５分間撹拌した。３回の漸進的に加熱／冷却するサイクル（５０℃～６７℃）を行った。最後のサイクルで、５００μＬのあらかじめ温めたＥＸＥ ＲＭを、温度が転相領域（ＰＩＺ；５９～６１．５℃）より約３℃高い際に混合物に添加した。最後に、２．５ｍＬの冷却水を添加して、２分間の高速撹拌下でＰＩＺの温度に到達させた。ブランクの非目的のナノシステム（ＲＭ ＬＮＣ）は、同じプロトコルを使用して薬物溶液を添加することなく生成した。
【0186】
１．２．２－ＤｉＤ標識した非目的の脂質ベースのナノシステムおよび目的の脂質ベースのナノシステムの調製
ＤｉＤ標識したＲＭ ＬＮＣを、２２５μｇのＤｉＤを混合物に添加することにより調製した。すなわち、４５μＬのＤｉＤ（エタノールにおいて５ｍｇ／ｍＬ）をバイアルに添加し、次に、有機溶媒が完全に蒸発するまで水槽で加熱した。その後、Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９を同じバイアルに添加し、ＤｉＤが完全に油相に溶解するまで水槽でＤｉＤと混合した。次に、混合物を室温（約２０℃）に冷却し、他の成分を添加し、上述のように調製プロセスを続行した。
ＤｉＤ標識したＲＭ ＬＮＣを、２２５μｇのＤｉＤを混合物に添加することにより調製した。すなわち、４５μＬのＤｉＤ（エタノールにおいて５ｍｇ／ｍＬ）をバイアルに添加し、次に、有機溶媒が完全に蒸発するまで水槽で加熱した。その後、Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９を同じバイアルに添加し、ＤｉＤが完全に油相に溶解するまで水槽でＤｉＤと混合した。次に、混合物を室温（約２０℃）に冷却し、他の成分を添加し、上述のように調製プロセスを続行した。
【0187】
１．２．３－プロピオナートを伴うまたは伴わないペグ化された逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセルの調製
プロピオナートを伴うまたは伴わないペグ化された逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（それぞれＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧまたはＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）を、それぞれＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ３またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨを５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＭ ＬＮＣと、穏やかに撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートすることにより生成した。インキュベーションの間に、懸濁液を、１５分ごとにボルテックスし、次に氷槽で１分間クエンチした。
プロピオナートを伴うまたは伴わないペグ化された逆ミセルが搭載された脂質ナノカプセル（それぞれＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧまたはＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）を、それぞれＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ３またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨを５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＭ ＬＮＣと、穏やかに撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートすることにより生成した。インキュベーションの間に、懸濁液を、１５分ごとにボルテックスし、次に氷槽で１分間クエンチした。
【0188】
１．３－エキセナチドの定量化
ペグ化ＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化されたエキセナチドを、実施例１に記載の勾配方法（１．４参照）を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ， Ｊａｐａｎ）により定量化した。
ペグ化ＲＭ ＬＮＣの中にカプセル化されたエキセナチドを、実施例１に記載の勾配方法（１．４参照）を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ， Ｊａｐａｎ）により定量化した。
【0189】
１．４－ＮＰの特性決定
ペグ化ＲＭ ＬＮＣ ＮＰの平均直径、多分散指数（ＰＤＩ）、ゼータ電位、および薬物カプセル化の効率（ＥＥ、％）を、実施例１に開示されるように決定した（１．５参照）。
ペグ化ＲＭ ＬＮＣ ＮＰの平均直径、多分散指数（ＰＤＩ）、ゼータ電位、および薬物カプセル化の効率（ＥＥ、％）を、実施例１に開示されるように決定した（１．５参照）。
【0190】
１．５－刺激した消化管液におけるナノカプセルの安定性および薬物の放出
１．５．１－刺激した消化管液におけるペグ化ナノカプセルの安定性
リガンドとしてのプロピオナートを伴うまたは伴わないペグ化ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を、実施例１に開示されるように評価した（１．６参照）。
１．５．１－刺激した消化管液におけるペグ化ナノカプセルの安定性
リガンドとしてのプロピオナートを伴うまたは伴わないペグ化ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を、実施例１に開示されるように評価した（１．６参照）。
【0191】
１．５．２－ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出試験
ペグ化ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣからの薬物の放出を、実施例１に開示されるように、ペプシンの非存在下でのＦａＳＳＧＦ培地およびＦａＳＳＩＦ培地において、それぞれ２時間および６時間評価した（１．７参照）。
ペグ化ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣからの薬物の放出を、実施例１に開示されるように、ペプシンの非存在下でのＦａＳＳＧＦ培地およびＦａＳＳＩＦ培地において、それぞれ２時間および６時間評価した（１．７参照）。
【0192】
１．６－ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞試験
１．６．１－細胞培養
消化器系のマウスＬ細胞株のＧＬＵＴａｇは、Ｄａｎｉｅｌ Ｄｒｕｃｋｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ）の厚意により提供された。ＧＬＵＴａｇ細胞は、１７～２５継代で使用した。細胞は、１０（ｖ／ｖ）％の不活性化ＦＢＳおよび１（ｖ／ｖ）％のＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５ｍＭのグルコース）（完全ＤＭＥＭ培地）において、５％のＣＯ２を供給しながら３７℃で増殖させた。細胞は、４～５日ごとに継代培養した。
１．６．１－細胞培養
消化器系のマウスＬ細胞株のＧＬＵＴａｇは、Ｄａｎｉｅｌ Ｄｒｕｃｋｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ）の厚意により提供された。ＧＬＵＴａｇ細胞は、１７～２５継代で使用した。細胞は、１０（ｖ／ｖ）％の不活性化ＦＢＳおよび１（ｖ／ｖ）％のＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（５．５ｍＭのグルコース）（完全ＤＭＥＭ培地）において、５％のＣＯ２を供給しながら３７℃で増殖させた。細胞は、４～５日ごとに継代培養した。
【0193】
１．６．２－細胞傷害性試験
搭載されていないペグ化ＲＭ ＬＮＣナノカプセルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－（２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）比色分析アッセイ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５：１０８－１１５）を使用し、以前に計算されたナノ粒子の濃度を使用して、ＧＬＵＴａｇ細胞において行った。ＧＬＵＴａｇ細胞（５×１０４個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）がコーティングされた（１０μＬ／ｍＬの培地）９６ウェルプレートに播種した。プレートをあらかじめ温めたＰＢＳバッファーで洗浄（×３）した後、増大するナノカプセルの濃度（０．５～１０ｍｇ／ｍＬ）のナノ粒子懸濁液１００μＬを、ＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（ＦＢＳを含まない）に分散し、ＧＬＵＴａｇ細胞と３７℃で２時間共インキュベートした。インキュベーションの後、上清を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ１００μＬと３時間にわたり置き換えた。紫色のホルマザン結晶を、ＭｕｌｔｉＳｋｓａｎ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を使用する５６０ｎｍでの吸光度の判定のため、２００μＬのＤＭＳＯに溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を伴う細胞（１００％死亡）および培養培地を伴う細胞（１００％生存）を、それぞれ陽性対照および陰性対照とみなした。試験は、三連で行った。
搭載されていないペグ化ＲＭ ＬＮＣナノカプセルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－（２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）比色分析アッセイ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１８； １５：１０８－１１５）を使用し、以前に計算されたナノ粒子の濃度を使用して、ＧＬＵＴａｇ細胞において行った。ＧＬＵＴａｇ細胞（５×１０４個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）がコーティングされた（１０μＬ／ｍＬの培地）９６ウェルプレートに播種した。プレートをあらかじめ温めたＰＢＳバッファーで洗浄（×３）した後、増大するナノカプセルの濃度（０．５～１０ｍｇ／ｍＬ）のナノ粒子懸濁液１００μＬを、ＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（ＦＢＳを含まない）に分散し、ＧＬＵＴａｇ細胞と３７℃で２時間共インキュベートした。インキュベーションの後、上清を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ１００μＬと３時間にわたり置き換えた。紫色のホルマザン結晶を、ＭｕｌｔｉＳｋｓａｎ ＥＸプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を使用する５６０ｎｍでの吸光度の判定のため、２００μＬのＤＭＳＯに溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を伴う細胞（１００％死亡）および培養培地を伴う細胞（１００％生存）を、それぞれ陽性対照および陰性対照とみなした。試験は、三連で行った。
【0194】
１．６．３－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ－１の分泌
ＧＬＵＴａｇ（１．８×１０５個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングした２４ウェルの細胞培養プレート上に播種し、２４時間接着させた。翌日、プレートを、予め温めたＰＢＳを使用してやさしく洗浄した。次に、ＧＬＵＴａｇ細胞を、ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたは搭載されていないペグ化ＮＰ（リガンドを伴うかまたは伴わないＲＭ ＬＮＣナノカプセル）と共インキュベートした。この培地は、５０μＭの最終濃度でＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含んでいた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）， Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。ＧＬＰ－１の分泌に及ぼす異なるナノ粒子の濃度の作用を試験するために、本発明者らは、０．５～２ｍｇ／ｍＬのナノカプセルおよび０．１～３ｍｇ／ｍＬのナノ粒子の濃度をそれぞれ使用した。プロトコルは、実施例１に記載されている（１．９参照）。
ＧＬＵＴａｇ（１．８×１０５個の細胞／ウェル）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングした２４ウェルの細胞培養プレート上に播種し、２４時間接着させた。翌日、プレートを、予め温めたＰＢＳを使用してやさしく洗浄した。次に、ＧＬＵＴａｇ細胞を、ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸまたは搭載されていないペグ化ＮＰ（リガンドを伴うかまたは伴わないＲＭ ＬＮＣナノカプセル）と共インキュベートした。この培地は、５０μＭの最終濃度でＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含んでいた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）， Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。ＧＬＰ－１の分泌に及ぼす異なるナノ粒子の濃度の作用を試験するために、本発明者らは、０．５～２ｍｇ／ｍＬのナノカプセルおよび０．１～３ｍｇ／ｍＬのナノ粒子の濃度をそれぞれ使用した。プロトコルは、実施例１に記載されている（１．９参照）。
【0195】
１．７－ｉｎ ｖｉｖｏでの試験
１．７．１－動物
動物試験を含む全てのプロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ （２０１８／ＵＣＬ／ＭＤ／４５；ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ＬＡ１２３０４１８）により承認されており、実験動物の保護に関するベルギーの法律（２０１３年５月２９日の国王令）にしたがい行われた。
１．７．１－動物
動物試験を含む全てのプロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ （２０１８／ＵＣＬ／ＭＤ／４５；ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ＬＡ１２３０４１８）により承認されており、実験動物の保護に関するベルギーの法律（２０１３年５月２９日の国王令）にしたがい行われた。
【0196】
１．７．２－正常血糖マウスにおけるリガンドがコンジュゲートしたペグ化ＮＰおよびリガンドがコンジュゲートしていないペグ化ＮＰの総ＧＬＰ－１の分泌
（プロピオナートを伴うまたは伴わない）ペグ化ＲＭ ＬＮＣを試験するために、雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０～２５ｇ、１０週齢、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を、無作為に４つのグループ（それぞれ８匹）に分け、実施例１に開示されるように（１．１０参照）約１．６２ｍｇ／ｇのナノカプセル用量で処置した。
（プロピオナートを伴うまたは伴わない）ペグ化ＲＭ ＬＮＣを試験するために、雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０～２５ｇ、１０週齢、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を、無作為に４つのグループ（それぞれ８匹）に分け、実施例１に開示されるように（１．１０参照）約１．６２ｍｇ／ｇのナノカプセル用量で処置した。
【0197】
１．７．３－肥満／糖尿病マウスの小腸および結腸におけるナノカプセルの分布
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を無作為に４つのグループ（ｎ＝４／グループ）に分けた。順化（２週間）の後、マウスに、１０週間ＨＦＤの給餌（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ％）を含むげっ歯類の食餌（Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）を行った。実験の前に、マウスを、水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。小腸および結腸におけるナノカプセルの分布の評価のため、ＲＭ ＬＮＣ、ペグ化ＲＭ ＬＮＣおよびペグ化ＲＭ ＬＮＣ－ＰＲＯを含むＤｉＤ標識したナノカプセル（約１．６２ｍｇ／ｇのナノ粒子用量）を、経口強制投与を介して投与した。対照マウスには、等量のＭｉｌｌｉＱ水を経口投与した。投与から１時間後に十二指腸、空腸、回腸、および結腸の切片を切除し、その後ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で急速に凍結した。全ての組織で、６μｍ厚の切片を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ－３０５０－Ｓクリオスタットを使用して切断した。組織切片は、簡潔に４％のパラホルムアルデヒドで５分間固定した。０．０２％のポリソルベート２０を含むＰＢＳで洗浄した後、スライドを、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｈａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍで標本にした。サンプルは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ １５０）を使用してＣＬＳＭにより試験し、連続して画像を捕捉した。データは、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．８）を使用して分析した。
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を無作為に４つのグループ（ｎ＝４／グループ）に分けた。順化（２週間）の後、マウスに、１０週間ＨＦＤの給餌（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ％）を含むげっ歯類の食餌（Ｄ１２４９２ｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， ＵＳＡ）を行った。実験の前に、マウスを、水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。小腸および結腸におけるナノカプセルの分布の評価のため、ＲＭ ＬＮＣ、ペグ化ＲＭ ＬＮＣおよびペグ化ＲＭ ＬＮＣ－ＰＲＯを含むＤｉＤ標識したナノカプセル（約１．６２ｍｇ／ｇのナノ粒子用量）を、経口強制投与を介して投与した。対照マウスには、等量のＭｉｌｌｉＱ水を経口投与した。投与から１時間後に十二指腸、空腸、回腸、および結腸の切片を切除し、その後ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で急速に凍結した。全ての組織で、６μｍ厚の切片を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ－３０５０－Ｓクリオスタットを使用して切断した。組織切片は、簡潔に４％のパラホルムアルデヒドで５分間固定した。０．０２％のポリソルベート２０を含むＰＢＳで洗浄した後、スライドを、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｈａｒｄ Ｓｅｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍで標本にした。サンプルは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ １５０）を使用してＣＬＳＭにより試験し、連続して画像を捕捉した。データは、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．８）を使用して分析した。
【0198】
１．７．４－肥満／糖尿病マウスの腸からの粘液の抽出
未処置の１０週間ＨＦＤにより誘導された糖尿病マウスを、水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。粘液の抽出の前に、マウスを頚椎脱臼により屠殺した。以下のプロトコルは、Ｗａｎｇら（Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ． ２０１７； ７：ｅ２３９４）からの出典であった。簡潔に述べると、十二指腸および先端空腸（ａｐｉｃａｌ ｊｅｊｕｎｕｍ）を解剖し、腸の糞便物質（ｄｅｃａｌ ｍａｔｔｅｒ）を除去するためにＰＢＳで非常に優しく流した後、ペトリ皿に載置した。１９．５ゲージの針を伴う注射器を使用して、腸のセグメントの１つの開口端を介してＰＢＳをやさしく送達した。腸のセグメントを、外科用ハサミを使用して長軸方向に切断した。次に、粘液を、セルスクレーパー（１．８ｃｍの刃、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））を使用して腸のセグメントからこすり取り、清潔なチューブに移した。単離した粘液を、さらなる粘液の拡散および粘液の安定性の試験のため－２０℃に保存した。
未処置の１０週間ＨＦＤにより誘導された糖尿病マウスを、水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた。粘液の抽出の前に、マウスを頚椎脱臼により屠殺した。以下のプロトコルは、Ｗａｎｇら（Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ． ２０１７； ７：ｅ２３９４）からの出典であった。簡潔に述べると、十二指腸および先端空腸（ａｐｉｃａｌ ｊｅｊｕｎｕｍ）を解剖し、腸の糞便物質（ｄｅｃａｌ ｍａｔｔｅｒ）を除去するためにＰＢＳで非常に優しく流した後、ペトリ皿に載置した。１９．５ゲージの針を伴う注射器を使用して、腸のセグメントの１つの開口端を介してＰＢＳをやさしく送達した。腸のセグメントを、外科用ハサミを使用して長軸方向に切断した。次に、粘液を、セルスクレーパー（１．８ｃｍの刃、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））を使用して腸のセグメントからこすり取り、清潔なチューブに移した。単離した粘液を、さらなる粘液の拡散および粘液の安定性の試験のため－２０℃に保存した。
【0199】
１．７．５－単一の粒子の追跡および共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ）
ＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ、ＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ、およびＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯを、水またはマウスの小腸粘液に希釈し、やさしく撹拌することにより混合した。５μＬの容量を、接着スペーサー（Ｓ２４７３７， Ｓｅｃｕｒｅ－Ｓｅａｌ（商標）Ｓｐａｃｅｒ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびカバーガラス（＃１．５）で密閉した顕微鏡のスライドガラス上に載置した。
ＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ、ＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ、およびＤＩＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯを、水またはマウスの小腸粘液に希釈し、やさしく撹拌することにより混合した。５μＬの容量を、接着スペーサー（Ｓ２４７３７， Ｓｅｃｕｒｅ－Ｓｅａｌ（商標）Ｓｐａｃｅｒ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびカバーガラス（＃１．５）で密閉した顕微鏡のスライドガラス上に載置した。
【0200】
単一の粒子の追跡のため、蛍光シグナルを、ＭＬＣ ４００ Ｂ ｌａｓｅｒ ｂｏｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｘ１共焦点スピニングディスクデバイス（Ａｎｄｏｒ， Ｂｅｌｆａｓｔ， ＵＫ）、ｉＸｏｎ ｕｌｔｒａ ＥＭＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）， Ｂｅｌｆａｓｔ， ＵＫ）、およびＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ， Ｊａｐａｎ）を搭載したスピニングディスク型共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を使用して記録した。１００倍の油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ １００ｘ ｏｉｌ， １．４ ＮＡ， Ｎｉｋｏｎ， Ｊａｐａｎ）を使用した。対物レンズヒーター（Ｂｉｏｔｅｃｈｓ）と組み合わせた実体顕微鏡用培養装置（ｓｔａｇｅ－ｔｏｐ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（３７℃、Ｔｏｋａｉ Ｈｉｔ）を、イメージングの間使用した。４３．９ｍｓの時間分解能での１００フレームの動画を、カバースリップから５～１０μｍ上で記録した。粘液の別のパートにおけるナノカプセルの集積または蛍光標識の漏出によりさらなる分析は行うことができず、よって、個別のナノカプセルは観察または分析できなかった。
【0201】
また、単一の粒子の追跡で調製したサンプルを、レーザー走査型共焦点顕微鏡により試験した。画像は、ガルバノスキャナを使用して６０ｘ／１．２７ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＩＲ水浸対物レンズ（ＳＲ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＩＲ ＡＣ， Ｎｉｋｏｎ）を伴うＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ ＨＤ共焦点レーザー走査型顕微鏡で記録した。６３７ｎｍの波長（ＬＵ－Ｎ４ Ｌａｓｅｒ Ｕｎｉｔ）を、ＤｉＤの励起に使用した。蛍光シグナルは、Ｍｕｌｔｉ－Ａｌｋａｌｉ ＰＭＴ（Ａ１－ＤＵＧ－２ ＧａＡｓＰ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｕｎｉｔ）で検出した。Ｎｙｑｕｉｓｔ解像度、０．５μｍの刻み幅でのガラス表面上の１９．５μｍのスタックを記録し、可視化のため最大値投影（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｎｓｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ：ＭＩＰ）を作製した。全てのイメージングは、ＲＴで行った。
【0202】
１．７．６－ＨＦＤ誘導性肥満／糖尿病マウスにおける薬理学的試験
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を無作為に収容した（ケージあたり５匹のマウス）。通常の固形飼料食（ＡＩＮ９３Ｍｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）， ＵＳＡ）を与えながらの順化期間（２週間）の後、マウスに１０週間ＨＦＤを与えた。実験前に、ケージを無作為に５つのグループ（１０匹のマウス／グループ）に分けた。マウスを一晩絶食させた後、遊離薬物溶液（ＥＸＥ）（用量：５００μｇ／ｋｇ）、非ペグ化またはペグ化薬物搭載ナノシステム（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）（用量：５００μｇ／ｋｇ）、または空のペグ化ナノシステム（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）（用量：他のグループと同等のナノカプセル濃度）を経口強制投与した。対照のＨＦＤグループには、等量の無菌水を経口投与した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を、実施例１のように上述の製剤の経口投与から１時間後に行った。簡潔に述べると、グルコースを経口投与し（２ｇ／ｋｇ）、次に、血中グルコースを、グルコース負荷の３０分前（－３０分）、およびグルコース投与から０、１５、３０、９０、および１２０分後に尾静脈の先端からの血液を測定して、グルコースメーター（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ， Ｒｏｃｈｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で決定した。また血漿中インスリンおよび総ＧＬＰ－１レベルを、ＥＬＩＳＡキット（それぞれＭｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， ＳｗｅｄｅｎおよびＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡ）を使用して－３０分および１５分で、尾静脈から回収した血液サンプル由来の血漿で試験した。インスリン抵抗性指数を、ＯＧＴＴの間の血中グルコースおよびインスリンのＡＵＣを乗算することにより計算した。ＯＧＴＴ試験の終了時に、マウスをイソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ， Ａｂｂｏｔｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて安楽死させ、血液サンプルを門脈から回収した。活性ＧＬＰ－１レベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）により試験した。
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を無作為に収容した（ケージあたり５匹のマウス）。通常の固形飼料食（ＡＩＮ９３Ｍｉ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）， ＵＳＡ）を与えながらの順化期間（２週間）の後、マウスに１０週間ＨＦＤを与えた。実験前に、ケージを無作為に５つのグループ（１０匹のマウス／グループ）に分けた。マウスを一晩絶食させた後、遊離薬物溶液（ＥＸＥ）（用量：５００μｇ／ｋｇ）、非ペグ化またはペグ化薬物搭載ナノシステム（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）（用量：５００μｇ／ｋｇ）、または空のペグ化ナノシステム（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）（用量：他のグループと同等のナノカプセル濃度）を経口強制投与した。対照のＨＦＤグループには、等量の無菌水を経口投与した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を、実施例１のように上述の製剤の経口投与から１時間後に行った。簡潔に述べると、グルコースを経口投与し（２ｇ／ｋｇ）、次に、血中グルコースを、グルコース負荷の３０分前（－３０分）、およびグルコース投与から０、１５、３０、９０、および１２０分後に尾静脈の先端からの血液を測定して、グルコースメーター（Ａｃｃｕ Ｃｈｅｃｋ， Ｒｏｃｈｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で決定した。また血漿中インスリンおよび総ＧＬＰ－１レベルを、ＥＬＩＳＡキット（それぞれＭｅｒｃｏｄｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， ＳｗｅｄｅｎおよびＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＵＳＡ）を使用して－３０分および１５分で、尾静脈から回収した血液サンプル由来の血漿で試験した。インスリン抵抗性指数を、ＯＧＴＴの間の血中グルコースおよびインスリンのＡＵＣを乗算することにより計算した。ＯＧＴＴ試験の終了時に、マウスをイソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ， Ａｂｂｏｔｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて安楽死させ、血液サンプルを門脈から回収した。活性ＧＬＰ－１レベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）により試験した。
【0203】
１．７．７－肥満／糖尿病マウスにおける薬物動態学的試験
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を、２週間の順化の間収容し、無作為に２つのグループ（時点あたり１０匹のマウス）に分けた。次に、上述のセクションに記載されるように、１０週間マウスにＨＦＤの給餌を行った。全てのマウスに、無菌性ＭｉｌｌｉＱ水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた後、経口強制投与を行った。エキセナチド溶液およびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧを、５００μｇ／ｋｇの用量で経口投与した。所定の時点（０、０．５、１、１．５、２、４、６、および８時間）で、血液サンプルを、尾静脈の先端から回収し、遠心分離し（１，５００ｇ、１０分、４℃）、血漿抽出に供した後、さらなる分析まで－８０℃で保存した。エキセナチド血漿中濃度を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（ＥＫ－０７０－９４， Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定した。
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を、２週間の順化の間収容し、無作為に２つのグループ（時点あたり１０匹のマウス）に分けた。次に、上述のセクションに記載されるように、１０週間マウスにＨＦＤの給餌を行った。全てのマウスに、無菌性ＭｉｌｌｉＱ水に自由にアクセスさせながら一晩絶食させた後、経口強制投与を行った。エキセナチド溶液およびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧを、５００μｇ／ｋｇの用量で経口投与した。所定の時点（０、０．５、１、１．５、２、４、６、および８時間）で、血液サンプルを、尾静脈の先端から回収し、遠心分離し（１，５００ｇ、１０分、４℃）、血漿抽出に供した後、さらなる分析まで－８０℃で保存した。エキセナチド血漿中濃度を、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（ＥＫ－０７０－９４， Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定した。
【0204】
１．７．８－肥満／糖尿病マウスの異なる経口投与頻度での長期間の処置
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を、無作為に７つのグループ（１０匹のマウス／グループ）に分け、無菌の食餌（ＡＩＮ９３Ｍｉ； Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）（対照食）および無菌水に自由にアクセスさせながらケージあたり５匹で収容した。２週間の順化の後、マウスに１０週間、ＨＦＤまたは通常の対照食を与えた。この期間の後、マウスを、さらに１カ月、ＨＦＤを与え続けながら（合計１４週間のＨＦＤ）、本発明者らの製剤で処置した。この月の間、マウスに、毎日（Ｄ）または２日に１回（Ｔ）、午後４時に、（ｉ）毎日の処置での同等のナノカプセル濃度の空の、または薬物を搭載した、ペグ化製剤（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＤまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｄ）および（ｉｉ）１日おきの処置での非ペグ化またはペグ化薬物搭載製剤（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ－ＴまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｔ）を経口投与した。対照グループ（健常およびＨＦＤ）には、等量の無菌性Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を毎日経口投与した。この４週間の処置期間の間、マウスの体重を毎日記録し、糖血症を、１週間に１回モニタリングした。グルコース試験前に６時間、マウスを１週間に１回絶食させた。
雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）を、無作為に７つのグループ（１０匹のマウス／グループ）に分け、無菌の食餌（ＡＩＮ９３Ｍｉ； Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）（対照食）および無菌水に自由にアクセスさせながらケージあたり５匹で収容した。２週間の順化の後、マウスに１０週間、ＨＦＤまたは通常の対照食を与えた。この期間の後、マウスを、さらに１カ月、ＨＦＤを与え続けながら（合計１４週間のＨＦＤ）、本発明者らの製剤で処置した。この月の間、マウスに、毎日（Ｄ）または２日に１回（Ｔ）、午後４時に、（ｉ）毎日の処置での同等のナノカプセル濃度の空の、または薬物を搭載した、ペグ化製剤（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＤまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｄ）および（ｉｉ）１日おきの処置での非ペグ化またはペグ化薬物搭載製剤（５００μｇ／ｋｇ用量）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ－ＴまたはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｔ）を経口投与した。対照グループ（健常およびＨＦＤ）には、等量の無菌性Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を毎日経口投与した。この４週間の処置期間の間、マウスの体重を毎日記録し、糖血症を、１週間に１回モニタリングした。グルコース試験前に６時間、マウスを１週間に１回絶食させた。
【0205】
１．８－統計分析
データ分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。全ての分析前に、各グループの外れ値検知のためＧｒｕｂｂｓ検定を行った。分析を行う前に、グループ間で分散に有意差がある場合、対数変換を使用して値を正規化した。統計分析は、２超のグループを含む試験では２元または１元ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの事後検定を使用して、２つのグループではｔ検定またはマン・ホイットニー検定を使用して行った。正規化の後であってもグループ間の分散に有意差が存在する場合、ノンパラメトリック検定を行った。統計上の有意性は、ｐ＜０．０５とみなした。全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
データ分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。全ての分析前に、各グループの外れ値検知のためＧｒｕｂｂｓ検定を行った。分析を行う前に、グループ間で分散に有意差がある場合、対数変換を使用して値を正規化した。統計分析は、２超のグループを含む試験では２元または１元ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの事後検定を使用して、２つのグループではｔ検定またはマン・ホイットニー検定を使用して行った。正規化の後であってもグループ間の分散に有意差が存在する場合、ノンパラメトリック検定を行った。統計上の有意性は、ｐ＜０．０５とみなした。全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
【0206】
２．結果および論考
２．１－標的化部分としてのプロピオナートを伴うペグ化ナノ粒子の調製および特性決定
Ｌ細胞を標的とする脂質ベースのナノカプセルを開発するために、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を、粘液拡散能が高いナノカプセルを提供するためのペグ化リンカーとして選択した。ＰＥＧ鎖が粒子のコアの中に保持されるよりも表面にのみ局在化したことを保証するために、ポストインサーション法（ｐｏｓｔ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を選択した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨの両方を使用して、Ｌ細胞の表面に存在するＬ細胞ＧＰＣＲに対する特異的な標的化を提供した。空の脂質ナノカプセルの物理化学的な特性を、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨのポストインサーションの前（ＲＭ ＬＮＣ）および後（それぞれＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）に評価した（表６）。
２．１－標的化部分としてのプロピオナートを伴うペグ化ナノ粒子の調製および特性決定
Ｌ細胞を標的とする脂質ベースのナノカプセルを開発するために、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を、粘液拡散能が高いナノカプセルを提供するためのペグ化リンカーとして選択した。ＰＥＧ鎖が粒子のコアの中に保持されるよりも表面にのみ局在化したことを保証するために、ポストインサーション法（ｐｏｓｔ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を選択した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨの両方を使用して、Ｌ細胞の表面に存在するＬ細胞ＧＰＣＲに対する特異的な標的化を提供した。空の脂質ナノカプセルの物理化学的な特性を、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＣＨ３およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨのポストインサーションの前（ＲＭ ＬＮＣ）および後（それぞれＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）に評価した（表６）。
【0207】
【表6】
【0208】
ブランクのＬＮＣは、約２００ｎｍの粒径および狭い粒度分布（ＰＤＩ＝０．１８）を提示した。生体機能ポリマーとＬＮＣをインキュベートした後、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯでそれぞれ約１８ｎｍおよび約２７ｎｍの大きさの増大が観察された。ゼータ電位の値は、－０．９４ｍＶ（ＲＭ ＬＮＣ）から－９．９３ｍＶ（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）に有意に減少した。ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯの表面電荷はさらに減少し、脂肪酸の存在下で－１８．２０ｍＶに達した。それぞれの空のナノカプセルと比較した場合、同様の粒径およびゼータ電位が、ＤｉＤでナノ担体を標識した後に得られた（表６）。さらにまた、ペグ化ナノカプセルの中にエキセナチドをカプセル化した場合（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）、ナノカプセルの大きさおよび表面電荷には有意に影響しなかった（表６）。
【0209】
２．２－ペグ化ＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＧＬＰ－１の分泌を誘導する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の刺激を誘導する、搭載されておらず、ペグ化されており、プロピオナートをグラフトしたＲＭ ＬＮＣの特性を、最初にＧＬＵＴａｇ細胞（マウスＬ細胞）で調査した。ナノ粒子の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で細胞傷害性のエビデンスが観察されなかったことを考慮して、０．５ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬの範囲とした。図１５Ａ～Ｂに示されるように、全ての脂質ベースの製剤は、ナノ粒子の濃度に関わらず、Ｌ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌を有意に増大できた（＊＊ｐ＜０．０５）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の刺激を誘導する、搭載されておらず、ペグ化されており、プロピオナートをグラフトしたＲＭ ＬＮＣの特性を、最初にＧＬＵＴａｇ細胞（マウスＬ細胞）で調査した。ナノ粒子の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で細胞傷害性のエビデンスが観察されなかったことを考慮して、０．５ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬの範囲とした。図１５Ａ～Ｂに示されるように、全ての脂質ベースの製剤は、ナノ粒子の濃度に関わらず、Ｌ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで内因性ＧＬＰ－１の分泌を有意に増大できた（＊＊ｐ＜０．０５）。
【0210】
さらに、これらナノカプセルが正常血糖マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ－１の刺激をさらに強化および／または誘導できるかどうかを試験した。正常血糖マウスに経口投与する際に、ペグ化脂質ナノカプセル（それぞれＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）ならびに非ペグ化脂質ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ）は両方とも、投与から６０分後にＧＬＰ－１レベルを有意に増大させた（＊ｐ＜０．０５）（図１６）。特に、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧは、６０分で最大約８倍までＧＬＰ－１レベルを増大させ、対してＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯは、元の修飾されていないＲＭ ＬＮＣと同じ作用を有し、未処置の対照グループと比較して最大約４倍までＧＬＰ－１の分泌を増大させた。さらに、対照グループと比較した場合に、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧのみが、１８０分でこの効果を引き延ばした（＊ｐ＜０．０５）。ペグ化ＮＰは、非ペグ化ＮＰと比較した場合にｉｎ ｖｉｔｒｏで有意な作用を発揮しなかったが（図１５Ａ～Ｂ）、ペグ化は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ－１の分泌を誘導するナノ担体の特性を有意に改善および長期化できた。
【0211】
２．３－肥満／糖尿病マウスの小腸および結腸におけるナノ粒子の分布
ナノカプセルの分布を、１０週間ＨＦＤを供給したマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでの経口強制投与後の腸の異なるセグメントにおいて追跡した。ＨＦＤマウスに経口投与した後の小腸および結腸の中のＤｉＤ標識したナノカプセルの集積を、蛍光ナノ粒子により経過観察した。全ての蛍光粒子（ＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ、ＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ、およびＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）は、十二指腸で見出すことができ、ここでＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧグループは、他のグループと比較して最も強力な赤色蛍光（ＤｉＤ）を示した。
ナノカプセルの分布を、１０週間ＨＦＤを供給したマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでの経口強制投与後の腸の異なるセグメントにおいて追跡した。ＨＦＤマウスに経口投与した後の小腸および結腸の中のＤｉＤ標識したナノカプセルの集積を、蛍光ナノ粒子により経過観察した。全ての蛍光粒子（ＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ、ＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ、およびＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－ＰＲＯ）は、十二指腸で見出すことができ、ここでＤｉＤ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧグループは、他のグループと比較して最も強力な赤色蛍光（ＤｉＤ）を示した。
【0212】
粘液の拡散の潜在的な差を調査するために、単一の粒子の追跡を行った。この目的のため、粒子を小腸粘液と混合し、特注のガラスのチャンバーに入れ、スピニングディスク型顕微鏡で可視化した。しかしながら、粒子の水溶液と比較して観察される粒子の量が非常に少なかったため、マウスの小腸の粘液におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの粒子の拡散を判定することはできなかった。共焦点顕微鏡を用いた場合、粘液単独と比較して高い蛍光強度を有する大きな構造が、全ての製剤で観察され、これは粘液の構成要素に対する凝集および／または結合を表す。個別のナノカプセルの移動度が調査できなかったため、異なる製剤間の正味の移動度に何らかの差異があるかどうかを結論付けることはできなかった。
【0213】
ＤｉＤ標識したＲＭ ＬＮＣは、投与から１時間後に、主に十二指腸で観察され、空腸ではほとんど観察されなかった。興味深いことに、処置から１時間後に、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧのみが、空腸の腸上皮を通過でき、ここで他のグループと比較して上皮の基底層で高いレベルの赤色蛍光が観察された。さらに、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧのみが、小腸全体（十二指腸、空腸、および回腸）を通過し、結腸に達することができた。
【0214】
２．４－肥満／糖尿病マウスにおける薬理学的試験および薬物動態学的試験
ｉｎ ｖｉｖｏでの製剤の効力の評価の前に、模擬胃液および模擬腸液での製剤の安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで証明し、エキセナチドの放出プロファイルを評価した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの製剤の効力の評価の前に、模擬胃液および模擬腸液での製剤の安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで証明し、エキセナチドの放出プロファイルを評価した。
【0215】
２型糖尿病マウスの食後の高血糖の制御に及ぼすエキセナチドを搭載したＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）の治療上の効力を決定するために、薬力学的なプロファイルを、１０週間ＨＦＤを供給したマウスで行った。単回用量のナノカプセルを投与した後、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。遊離薬物溶液および薬物を搭載した製剤（それぞれＥＸＥ溶液、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣおよびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧを含む）で５００μｇ／ｋｇのエキセナチドの用量、空のＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（薬物を搭載したナノカプセルと同等の量）、または同等の水量を、経口グルコース試験（グルコース濃度：２ｇ／ｋｇ）の６０分前に経口投与した。グルコース投与の時点は、０時間に対応する（図１７Ａ）。薬物溶液で処置したマウスの血漿中グルコースプロファイルは、水を与えたＨＦＤを供給したマウスと同様の傾向を示した。逆に、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ、および空のＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧを含むナノカプセルで処置した全てのグループは、血中グルコースレベルおよびグルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）を著しく低下することができた（図１７Ａ）。空のＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧは、エキセナチドを搭載したＲＭ ＬＮＣと比較して同様の血漿グルコースレベルの低下に関する効力および同様のＡＵＣを有しており、ペグ化の後ナノ担体単独により達成された血糖降下作用が、薬物をカプセル化した非ペグ化ナノ担体と同等であったことを表していることは注目に値する。よって、ペグ化ナノカプセルにより分泌されるＧＬＰ－１レベル（図１６）は、グルコースを低下させる作用に関して治療上関連することが見出された。試験した全ての製剤の中で、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧを経口的に処置されたマウスのみが、未処置のＨＦＤマウスと比較して全ＯＧＴＴ試験にわたり血漿グルコースレベルの有意な減少を示したことは注目に値する。
【0216】
さらにまた、総ＧＬＰ－１レベル（図１７Ｂ）は、対照グループと比較して全てのナノカプセルで処置したグループにおいて有意に改善した（＊ｐ＜０．０５）。ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣグループにおける総ＧＬＰ－１レベルの増大はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの事後検定により分析される場合、ＨＦＤグループと比較して有意差に達しなかったが、マン・ホイットニー検定を適用した場合に、有意差が観察された（ｐ＝０．００８）（図１７Ｂ）。未処置のＨＦＤマウスと比較した（製剤の投与から３時間後の）門脈で測定した活性ＧＬＰ－１の濃度もまた、ＯＧＴＴ試験の後のＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧで処置したマウスにおいて有意に増大していた（＊ｐ＜０．０５）（図１７Ｃ）。１元ＡＮＯＶＡによりデータを分析する際に、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧおよびＨＦＤの間に有意差はなかったが、スチューデントｔ検定により、これらグループ間に有意差が現れた（ｐ＝０．０２８）。これらデータにより、ペグ化が、病態下でＧＬＰ－１の放出を刺激し、この作用を長期化するナノシステムの特性を改善できることが確認された。インスリンレベルに関してグループ間に差は観察されなかった（図１７Ｄ）。しかしながら、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧは、未処置の糖尿病マウスと比較してインスリン抵抗性指数を顕著に低減できた（図１７Ｅ）。１元ＡＮＯＶＡでは、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣおよびＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧの間に有意差はなかったが、スチューデントｔ検定により、これらグループ間に有意差が現れた（それぞれｐ＝０．０３５およびｐ＝０．０２３）。驚くべきことに、搭載されていないペグ化ＲＭ ＬＮＣに対してＥＸＥが搭載されたナノカプセルと比較して同等の結果が得られ、ペグ化を介して得られたＧＬＰ－１レベルの増大の治療上の関連性がさらに確認された。
【0217】
ペグ化ＲＭ ＬＮＣを介したエキセナチドの経口送達を調査するために、薬物動態学的試験を行い、薬物溶液を介するかまたはＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）の中の５００μｇ／ｋｇのエキセナチドの単回用量の経口投与の後の、慢性的な糖尿病マウス（１０週間のＨＦＤ；ｎ＝ポイントあたり１０）におけるエキセナチドの経口吸収を評価した（図１７Ｆ）。エキセナチドの吸収の異なるパターンを、薬物溶液単独またはＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧの経口強制投与の後に肥満／糖尿病マウスにおいて観察した。溶液として経口投与した場合、エキセナチドの血漿中濃度は、試験期間を通して変化しないままであった。比較すると、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧは、８時間の経口投与の後ペプチドの全身での吸収をより多く誘発し、ここで、ＴｍａｘおよびＣｍａｘは、それぞれ、１時間および２７．９１±１．２２ｎｇ／ｍＬであった。異なるエキセナチドの薬物動態プロファイル（たとえば異なるＣｍａｘ、ＡＵＣ、Ｔｍａｘ）が、ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ対ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣの経口投与後に観察され、これは、ペグ化が製剤の循環時間を延長し（薬物を搭載した製剤のｔ１／２は、１．６８±０．３５時間から５．６９±１．０２時間へと長期化した）、次いでカプセル化ペプチドの全身吸収を増大した（ＡＵＣは、１１．７９±２．７３ｎｇ・ｈ／ｍＬから２７．９１±１．２２ｎｇ・ｈ／ｍＬへ増大した）ことを表していることに留意されたい。
【0218】
２．５－肥満／糖尿病マウスにおけるペグ化脂質ナノカプセルでの長期間の処置
グルコースの代謝に及ぼすペグ化後に観察されるＧＬＰ－１の分泌の増大の影響を調査するために、長期間の処置（１カ月）を、糖尿病マウス（１０週間、ＨＦＤ）で行い、エキセナチドを搭載するかまたは搭載していないＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（５００μｇ／ｋｇ）を異なる投与頻度（毎日または１日おきに１回）（合計１４週間のＨＦＤ、１０週目から４週間毎日または１日おきに投与）で投与した。経口投与（１日おきに１回）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ；５００μｇ／ｋｇ）によるかまたは同一量の搭載していないペグ化ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）を用いて低頻度で処置したマウスもまた、投与レジメンにより、非ペグ化ＥＸＥ搭載ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ；５００μｇ／ｋｇ）を投与したマウスと比較した。
グルコースの代謝に及ぼすペグ化後に観察されるＧＬＰ－１の分泌の増大の影響を調査するために、長期間の処置（１カ月）を、糖尿病マウス（１０週間、ＨＦＤ）で行い、エキセナチドを搭載するかまたは搭載していないＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ（５００μｇ／ｋｇ）を異なる投与頻度（毎日または１日おきに１回）（合計１４週間のＨＦＤ、１０週目から４週間毎日または１日おきに投与）で投与した。経口投与（１日おきに１回）（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ；５００μｇ／ｋｇ）によるかまたは同一量の搭載していないペグ化ナノカプセル（ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ）を用いて低頻度で処置したマウスもまた、投与レジメンにより、非ペグ化ＥＸＥ搭載ナノカプセル（ＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ；５００μｇ／ｋｇ）を投与したマウスと比較した。
【0219】
４週間の処置の後の血漿中グルコースおよびインスリンのレベルならびに計算されたＨＯＭＡ－ＩＲを、図１８Ａ～Ｃに表す。毎日投与されたペグ化グループ（搭載または非搭載）および１日おきに投与されたＥＸＥを搭載したペグ化グループは、同等のグルコースの血漿中レベルを呈した。よって、これらレベルは、非肥満／糖尿病の未処置の対照マウスと同等であった（ｐ＞０．０５、図１８Ａ）。ペグ化ナノカプセルがＥＸＥをカプセル化していた場合のみが、長期間の処置によるグルコースの血漿中レベルの低下に有効であったことは注目に値する。より重要なことに、これらは、投与頻度が少ない場合であっても効率的であり、これは本試験の主な目標である（図１８Ａ）。さらに、これらグループは、インスリン抵抗性のホメオスタシスのモデル評価（ＨＯＭＡ－ＩＲ）により分析されるように同等のインスリン抵抗性を呈し、これは、健常な対照グループで得られた対照値と同等（ｐ＞０．０５）であった（図１８Ｃ）。ＨＦＤグループと比較すると、これらグループの間の低下は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでＤｕｎｎの事後検定を使用する場合、統計上有意ではなかった（図１８Ｃ）。しかしながら、マン・ホイットニー検定を使用した場合、有意差が観察された（それぞれＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｄ対ＨＦＤではｐ＝０．００１２、ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｄ処置対ＨＦＤではｐ＝０．０００３、およびＥＸＥ ＲＭ ＬＮＣ ＰＥＧ－Ｔ処置対ＨＦＤではｐ＝０．０５）。
【0220】
２．６－結論
結論として、ＧＬＰ－１の分泌を増大させることおよび製剤の抗糖尿病効果を長期化することは、ナノカプセルのペグ化を介して達成され得る。
結論として、ＧＬＰ－１の分泌を増大させることおよび製剤の抗糖尿病効果を長期化することは、ナノカプセルのペグ化を介して達成され得る。
【0221】
実施例３：比較例
Ｓｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ２０１８、上記参照）は、本明細書中開示される本発明に係るナノ粒子と比較して異なる脂質ベースのナノ粒子：ナノ構造の脂質の担体（ＮＬＣ）に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータを提示した。脂質ナノカプセルとの差異のうち、ＮＬＣは、固体のコアを呈し、本発明に係る脂質ナノカプセルのように液体のコアを呈さなかった。Ｓｈｒｅｓｔｈａらでは、エキセナチドおよびリラグルチドがカプセル化され、これらＮＬＣは、１５０ｎｍのナノ粒径を提示する際にｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の分泌を誘導していたことを示した。また、Ｂｅｌｏｑｕｉら（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、上記参照）の試験では、ＮＬＣ（１５０ｎｍ）のＧＬＰ－１を分泌する作用が利用された。試験される異なるナノ粒子のうち、１５０ｎｍのナノ粒径を提示するＮＬＣのみが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の分泌を誘導できた。しかしながら、これらナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる試験においてＧＬＰ－１の分泌を誘導できず、また高血糖および高インスリン血症も減少できなかった。
Ｓｈｒｅｓｔｈａら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ２０１８、上記参照）は、本明細書中開示される本発明に係るナノ粒子と比較して異なる脂質ベースのナノ粒子：ナノ構造の脂質の担体（ＮＬＣ）に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータを提示した。脂質ナノカプセルとの差異のうち、ＮＬＣは、固体のコアを呈し、本発明に係る脂質ナノカプセルのように液体のコアを呈さなかった。Ｓｈｒｅｓｔｈａらでは、エキセナチドおよびリラグルチドがカプセル化され、これらＮＬＣは、１５０ｎｍのナノ粒径を提示する際にｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の分泌を誘導していたことを示した。また、Ｂｅｌｏｑｕｉら（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、上記参照）の試験では、ＮＬＣ（１５０ｎｍ）のＧＬＰ－１を分泌する作用が利用された。試験される異なるナノ粒子のうち、１５０ｎｍのナノ粒径を提示するＮＬＣのみが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＰ－１の分泌を誘導できた。しかしながら、これらナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる試験においてＧＬＰ－１の分泌を誘導できず、また高血糖および高インスリン血症も減少できなかった。
【0222】
ｉｎ ｖｉｖｏの試験を、４週間ＨＦＤを供給したマウスにおいて（実施例１のように）行った。エキセナチド（５００μｇ／ｋｇのエキセナチド用量）をカプセル化したＮＬＣを１度経口投与した後、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。図１９に示されるように、グルコースの曲線下面積に及ぼす作用（図１９Ａ～Ｂ）、ＧＬＰ－１レベルの増加（図１９Ｃ～Ｄ）、高インスリン血症の変化（図１９Ｅ～Ｆ）、およびインスリン抵抗性指数に及ぼす作用（図１９Ｇ）は観察できない。
【0223】
これら結果は、同様の組成を先験的に提示する２つの脂質ベースのナノ粒子が必ずしも同じ効果を誘導しないことを表している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【手続補正書】
【提出日】2022-03-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】