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特表2022-537047ヒト免疫不全ウイルス複製の阻害剤としてのピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-23
(54)【発明の名称】ヒト免疫不全ウイルス複製の阻害剤としてのピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン誘導体
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20220816BHJP
A61K 31/52 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/5365 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/635 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/439 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20220816BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220816BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220816BHJP
A61K 31/451 20060101ALI20220816BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 118A
C07D471/04 CSP
A61K31/52
A61K31/537
A61K31/4985
A61K31/5365
A61K31/635
A61K31/4545
A61K31/675
A61K31/513
A61K31/439
A61K31/519
A61P31/18
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K31/451
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575482
(86)(22)【出願日】2020-06-17
(85)【翻訳文提出日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 IB2020055653
(87)【国際公開番号】W WO2020254985
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】62/863,406
(32)【優先日】2019-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520218040
【氏名又は名称】ビーブ、ヘルスケア、ユーケー、（ナンバー５）、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＩＶ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＵＫ （ＮＯ．５） ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】エリック、ピー．ギリス
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアナ、イワグウ
【テーマコード（参考）】
4C065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C065AA04
4C065BB11
4C065CC01
4C065DD03
4C065EE02
4C065HH01
4C065JJ03
4C065KK06
4C065KK09
4C065LL04
4C065PP03
4C065PP18
4C065QQ02
4C065QQ04
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA06
4C084NA14
4C084ZC551
4C084ZC552
4C084ZC751
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC07
4C086BC17
4C086BC42
4C086BC60
4C086CB07
4C086CB09
4C086CB22
4C086DA20
4C086DA34
4C086GA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZC55
4C086ZC75
(57)【要約】
化合物
およびその薬学上許容可能な塩、および組成物およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を治療する方法が開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化合物：【化1】
【請求項2】
以下に示す立体化学を有する請求項１に記載の化合物【化2】
【請求項3】
以下に示す立体化学を有する請求項２に記載の化合物【化3】
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物または塩を含んでなる、医薬組成物。
【請求項5】
薬学上許容可能な賦形剤をさらに含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
経口投与、筋肉内注射、または皮下注射に好適である、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物または塩の投与を含んでなる、ヒトにおけるＨＩＶ感染症を治療する方法。
【請求項8】
前記投与が経口である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記投与が、筋肉内注射または皮下注射である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が、ヒトにおけるＨＩＶ感染症の治療に使用される少なくとも１つの他の剤の投与をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
少なくとも１つの他の剤が、アバカビル、アタザナビル、ビクテグラビル、カボテグラビル、ドルテグラビル、ダルナビル、ドラビリン、フォステムサビル、ラミブジン、マラビロク、リルピビリン(rilpiverine)、テノホビルジソプロキシル、テノホビル、テノホビルアラフェナミド(afenamide)、Ｓ－６４８４１４、ＧＳＫ３６４０２５４、抗体Ｎ６ＬＳ、およびＧＳＫ３７３９９３７／ＶＨ３７３９９３７からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも１つの他の剤が、ドルテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、カボテグラビル、抗体Ｎ６ＬＳ、およびＧＳＫ３７３９９３７／ＶＨ３７３９９３７からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
療法において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項14】
ＨＩＶ感染症の治療において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【請求項15】
ＨＩＶ感染症の治療のための薬剤の製造において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学上許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、化合物、組成物およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の治療のための方法に関する。より詳しくは、本発明は、新規なＨＩＶの阻害剤、このような化合物を含有する医薬組成物、およびＨＩＶ感染症の治療におけるこれらの化合物を使用する方法を提供する。本発明はまた、以下に記載の化合物を製造する方法に関する。
本発明は、化合物、組成物およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症の治療のための方法に関する。より詳しくは、本発明は、新規なＨＩＶの阻害剤、このような化合物を含有する医薬組成物、およびＨＩＶ感染症の治療におけるこれらの化合物を使用する方法を提供する。本発明はまた、以下に記載の化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ＨＩＶによる感染症の結果である。ＨＩＶは、主要な世界的な公衆衛生の問題であり続けている。２０１５年において、推定３６７０万人がＨＩＶと共存しており（１８０万人の小児を含む）、世界的なＨＩＶ有病率は０．８％であった。この数の大部分が、低所得国および中所得国で生活している。同年、１１０万人がＡＩＤＳ関連疾患で死亡した。
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ＨＩＶによる感染症の結果である。ＨＩＶは、主要な世界的な公衆衛生の問題であり続けている。２０１５年において、推定３６７０万人がＨＩＶと共存しており（１８０万人の小児を含む）、世界的なＨＩＶ有病率は０．８％であった。この数の大部分が、低所得国および中所得国で生活している。同年、１１０万人がＡＩＤＳ関連疾患で死亡した。
【0003】
ＨＩＶ感染者に対する現在の療法は、承認済みの抗レトロウイルス剤の組合せからなる。４８種近くの薬剤が、単剤、固定用量配合剤または単一錠剤レジメンのいずれかとして、ＨＩＶ感染症に対して現在承認されており、後者２つは、２～４種の承認済みの剤を含有する。これらの剤は、ウイルス酵素またはウイルス複製サイクル中のウイルスタンパク質の機能のいずれかを標的とした多数の異なるクラスに属する。よって、剤は、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、インテグラーゼ阻害剤(integrase strand transfer inhibitor)（ＩＮＳＴＩ）、または侵入阻害剤（一方はマラビロクであり、宿主ＣＣＲ５タンパク質を標的とし、他方はエンフビルチドであり、これはウイルスｇｐ１６０タンパク質のｇｐ４１領域を標的とするペプチドである）のいずれかに分類される。さらに、薬物動態エンハンサー（コビシスタットまたはリトナビル）を、ブースティングを必要とする抗レトロウイルス剤（ＡＲＶ）と組み合わせて使用することができる。
【0004】
剤および薬剤の組合せの治療法があるにもかかわらず、新規な抗レトロウイルス剤の医学的ニーズが依然として存在する。高いウイルス異質性、薬物関連毒性、忍容性の問題、および不良なアドヒアランスは総て、治療失敗に至る場合があり、クラス全体からの１以上の抗レトロウイルス剤に対してまたは複数の薬剤に対してさえも耐性を付与する変異を有するウイルスの選択に至り得る(Beyrer, C., Pozniak A. HIV drug resistance - an emerging threat to epidemic control. N. Engl. J. Med. 2017, 377, 1605-1607; Gupta, R. K., Gregson J., et al. HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis. Lancet Infect. Dis. 2017, 18, 346-355; Zazzi, M., Hu, H., Prosperi, M. The global burden of HIV-1 drug resistance in the past 20 years. PeerJ. 2018, DOI 10.7717/peerj.4848)。結果として、服用しやすく、耐性の発現に対する高い遺伝的障壁を有し、かつ現在の剤よりも改善された安全性を有する新規な薬剤が必要である。この一式の選択において、好ましい抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）の一部として使用することができる新規な作用機序（ＭＯＡ）は、現在の剤に対するウイルス耐性に対して有効なはずであるため、果たすべき主要な役割を依然として有し得る。薬剤を長期間または生涯にわたってさえ服用を容易にするであろう改善は、以下の総てまたはいくつかを含み得る：副作用の減少、薬物間相互作用の減少、投与間の期間の増加、または個々の患者の好みに一致する代替投与経路。安全性の改善の目的は、投与の中止を引き起こすであろうあらゆる毒性に対する高い治療指数を確実に含むと思われ、副作用の減少または薬物間相互作用の減少も含み得る。併用レジメンにおいてより少ない全体的な薬剤を使用する可能性も、コンプライアンスおよび安全性の改善をもたらす可能性が高いと思われる。抗ウイルス標的に対する効力の増大も、特にヒト血漿および血清アルブミンの存在下で維持される場合、用量の減量に至ると思われ、投与の期間ならびに副作用および毒性をしのぐ治療指数に直接的かつ正の影響を及ぼし得る。要約すると、長期のコンプライアンスおよび安全性を促進する上記の他の利益も有する新規な作用機序を有する抗ＨＩＶ薬が発見されれば、ＨＩＶ感染患者に対する最大限の利益が達成されるであろう。
【0005】
特定の潜在的に治療的な化合物が、現在当技術分野で記載されており、Blair, Wade S. et. al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2009), 53(12), 5080-5087, Blair, Wade S. et al. PLoS Pathogens (2010), 6(12), e1001220, Thenin-Houssier, Suzie; Valente, Susana T. Current HIV Research, 2016, 14, 270-282、ならびに以下の番号のＰＣＴ特許出願：ＷＯ２０１２０６５０６２、ＷＯ２０１３００６７３８、ＷＯ２０１３００６７９２、ＷＯ２０１４１１０２９６、ＷＯ２０１４１１０２９７、ＷＯ２０１４１１０２９８、ＷＯ２０１４１３４５６６、ＷＯ２０１５１３０９６４、ＷＯ２０１５１３０９６６、ＷＯ２０１６０３３２４３、ＷＯ２０１８０３５３５９、およびＷＯ２０１８２０３２３５において示されている。
【0006】
現在当技術分野において必要であるものは、ＨＩＶの治療において新規かつ有用なさらなる化合物である。さらに、これらの化合物は、例えば、それらの作用機序、結合、阻害有効性、標的選択性、溶解性、安全性プロファイル、バイオアベイラビリティおよび／または投与頻度の減少のうち１つ以上に関して、薬学的使用の利点を提供するはずである。新規な処方物およびこれらの化合物を利用する治療の方法も必要である。
【発明の概要】
【0007】
簡単に述べれば、一側面において、本発明は、以下に示す化合物：
およびその薬学上許容可能な塩（以下、「本発明の化合物および塩」）を開示する。
【化1】
【0008】
別の側面において、本発明は、本発明の化合物または塩を含んでなる医薬組成物を開示する。
【0009】
別の側面において、本発明は、本発明の化合物または塩を投与することを含んでなる、ヒトにおけるＨＩＶ感染症を治療する方法を開示する。
【0010】
別の側面において、本発明は、療法において使用するための本発明の化合物または塩を開示する。
【0011】
別の側面において、本発明は、ヒトにおけるＨＩＶ感染症の治療において使用するための、本発明の化合物または塩を開示する。
【0012】
別の側面において、本発明は、ヒトにおけるＨＩＶ感染症の治療のための薬剤の製造における本発明の化合物または塩の使用を開示する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の詳細な説明
好ましくは、本発明の化合物および塩は、以下に示す立体化学を有する。
好ましくは、本発明の化合物および塩は、以下に示す立体化学を有する。
【化2】
【0015】
別の側面において、本発明の化合物および塩は、以下に示す立体化学を有する。
【化3】
【0016】
本発明の塩は、薬学上許容可能なものである。このような塩は、酸付加塩であってもよいし、塩基付加塩であってもよい。好適な薬学上許容可能な塩のレビューについては、例えば、Berge et al, J. Pharm, Sci., 66, 1-19, 1977参照。
【0017】
代表的な薬学上許容可能な酸付加塩としては、限定されるものではないが、４－アセトアミド安息香酸塩、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、安息香酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩（カンシル酸塩）、カプリン酸塩（デカン酸塩）、カプロン酸塩（ヘキサン酸塩）、カプリル酸塩（オクタン酸塩）、桂皮酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、ジグルコン酸塩、２，５－ジヒドロキシ安息香酸塩、ジコハク酸塩、ドデシル硫酸塩（エストール酸塩）、エデト酸塩（エチレンジアミン四酢酸塩）、エストール酸塩（硫酸ラウリル）、エタン－１，２－ジスルホン酸塩（エジシル酸塩）、エタンスルホン酸塩（エシル酸塩）、ギ酸塩、フマル酸塩、ガラクタル酸塩（ムチン酸塩）、ゲンチジン酸塩（２，５－ジヒドロキシ安息香酸塩）、グルコヘプトン酸塩（グルセプト酸塩）、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩(glycerophosphorate)、グリコール酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、馬尿酸塩、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ’－ジ（デヒドロアビエチル）－エチレンジアミン）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、イソ酪酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸塩（ナパジシル酸塩）、ナフタレン－２－スルホン酸塩（ナプシル酸塩）、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ｐ－アミノベンゼンスルホン酸塩、ｐ－アミノサリチル酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルエチルバルビツール酸塩、リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）、ピログルタミン酸塩、ピルビン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、ステアリン酸塩、スバセチン酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（８－クロロテオフィリナート）、チオシアン酸塩、トリエチオダイド、ウンデカン酸塩、ウンデシレン酸塩、および吉草酸塩が挙げられる。
【0018】
代表的な薬学上許容可能な塩基付加塩としては、限定されるものではないが、アルミニウム、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール（トリス、トロメタミン）、アルギニン、ベネタミン（Ｎ－ベンジルフェネチルアミン）、ベンザチン（Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン）、ビス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、ビスマス、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、クレミゾール（１－ｐクロロベンジル－２－ピロリジン(pyrrolildine)－１’－イルメチルベンズイミダゾール）、シクロヘキシルアミン、ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、ジエチルトリアミン、ジメチルアミン、ジメチルエタノールアミン、ドーパミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｌ－ヒスチジン、鉄、イソキノリン、レピジン、リチウム、リシン、マグネシウム、メグルミン（Ｎ－メチルグルカミン）、ピペラジン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、キノリン、ナトリウム、ストロンチウム、ｔ－ブチルアミン、および亜鉛が挙げられる。
【0019】
ある実施形態において、酸付加塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、サッカリン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、カンシル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩から選択される。ある実施形態において、塩基付加塩としては、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、マグネシウムおよび亜鉛）ならびにアンモニウム塩（例えば、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミンの塩）が挙げられる。他の塩（例えば、トリフルオロ酢酸塩およびシュウ酸塩）は、本発明の化合物および塩の製造において使用してもよく、本発明の範囲内に含まれる。
【0020】
本発明の化合物の塩の総ての可能性のある化学量論形態および非化学量論形態が、本発明の範囲内に含まれる。酸および塩基付加塩は、本発明の化合物を好適な溶媒中の適当な酸または塩基と処理し、次いで、結晶化および濾過を行うことにより、熟練の化学者により調製され得る。
【0021】
本発明の医薬組成物は、薬学上許容可能な担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含んでなる。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬学上許容可能な賦形剤をさらに含んでなる。
【0022】
本発明の方法において、好ましい投与経路は、経口および皮下または筋肉内に送達するための注射である。したがって、好ましい医薬組成物としては、経口投与に好適な組成物（例えば、錠剤）および注射、例えば、皮下注射または筋肉内注射に好適な組成物が挙げられる。
【0023】
別の側面において、本発明は、本発明の化合物または塩を投与することを含んでなる、ヒトにおけるＨＩＶ感染症を予防する、または感染症のリスクを低減する方法を開示する。曝露前予防（またはＰｒＥＰ）は、ＨＩＶ感染症のリスクにあるヒトが、ＨＩＶ感染症に罹る可能性を低くするために、毎日薬剤を服用する場合のものである。ＰｒＥＰは、感染症のリスクの低減に有効であることが示されている。本明細書で使用する場合、「ＨＩＶ」または「ヒト免疫不全ウイルス」は、ＨＩＶ－１および／またはＨＩＶ－２を指す。
【0024】
本発明の化合物および塩は、それらの生物学的標的としてＨＩＶカプシドを有すると考えられており、よって、それらの作用機序は、１以上の様式でＨＩＶカプシドの機能を修飾することである。例えば、本発明の化合物および塩は、カプシド阻害剤として作用し得る。
【0025】
本発明の化合物および塩は、単独で用いてもよいし、他の治療剤と組み合わせて用いてもよい。よって、本発明に係る併用療法は、本発明の少なくとも１つの化合物または塩の投与、およびＨＩＶ感染症の治療において有用であり得る少なくとも１つの他の剤の投与を含んでなる。本発明の化合物および塩ならびに任意の他の１つまたは複数の薬学上有効な剤は、一緒に投与してもよいし、別々に投与してもよく、別々に投与する場合、投与は、同時に行ってもよいし、任意の順序で逐次的に行ってもよい。例えば、本発明の化合物または塩、および他の剤は、単一の医薬組成物中で一緒に処方および投与してもよいし、別々に処方および投与してもよい。
【0026】
本発明の化合物および塩ならびに他の１つまたは複数の薬学上有効な剤の量、ならびに投与の相対的タイミングを、所望の併用治療効果を達成するために選択する。本発明の化合物およびその塩、溶媒和物、または他の薬学上許容可能な誘導体と他の治療剤との組合せでの投与は、（１）複数の化合物を含む単位医薬組成物；または（２）それぞれ化合物の１つを含む別々の医薬組成物中での同時投与による組合せであってもよい。あるいは、組合せは、一方の治療剤が１番目に投与され、他方が２番目に投与される、またはその逆という逐次的な様式で別々に投与してもよく、適当な場合、異なる剤を異なるスケジュールで投与することもできる。このような逐次投与は、時間が近くてもよいし、時間が離れていてもよい。本発明の化合物、またはその塩および他の１つまたは複数の薬学上有効な剤の量、ならびに投与の相対的タイミングを、所望の併用治療効果を達成するために選択する。
【0027】
このようなものとして、本発明の化合物および塩は、ＨＩＶの予防または治療において有用な１以上の剤と組み合わせて使用してもよい。このような剤としては、例えば、ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ接着阻害剤、ＣＣＲ５阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、ＨＩＶ出芽または成熟阻害剤、およびＨＩＶインテグラーゼ阻害剤が挙げられる。好適な他の剤としては、例えば、アバカビル、アタザナビル、ビクテグラビル、カボテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ジデオキシイノシン、ドルテグラビル、ドラビリン、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エトラビリン(etavirine)、ホスアンプレナビル、フォステムサビル、ＧＳＫ３６４０２５４、インジナビル、イスラトラビル(slatravir)、ラミブジン、ロピナビル、マラビロク、ネルフィナビル、ネビラピン、ラルテグラビル、リルピビリン(rilpiverine)、リトナビル、サキナビル、イスラトラビル(slatravir)、スタブジン、チプラナビル、テノホビル、テノホビルアラフェナミド、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ザルシタビン、ジドブジン、抗体Ｎ６ＬＳ、ＧＳＫ３７３９９３７／ＶＨ３７３９９３７、およびＳ－６４８４１４が挙げられる。さらなる好適な他の剤としては、ドルテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、カボテグラビル、マラビロク、リルピビリン(rilpiverine)、レイアタッツ、テノホビル、アラフェナミド(afenamide)、ＥｆＤＡ、ドラビリン、およびプレジスタ(Preziata)が挙げられる。さらに好適な他の剤としては、ドルテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、およびカボテグラビルが挙げられる。好ましい剤としては、例えば、ビクテグラビル、カボテグラビル、ドルテグラビル、フォステムサビル、イスラトラビル、およびラミブジンが挙げられる。特に好ましい剤としては、例えば、ビクテグラビル、カボテグラビル、ドルテグラビル、フォステムサビル、およびラミブジンが挙げられる。
【実施例】
【0028】
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オールの製造
０～５℃、Ｎ２雰囲気下で、ＤＣＭ（１２００ｍＬ）中、シクロペンタ－３－エノール（１３０ｇ、１５４５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ヘキサン中ジエチル亜鉛の溶液（１．０Ｍ、３０９１ｍＬ、３０９１ｍｍｏｌ）を３時間かけて滴下した。０℃の溶液に、ＤＣＭ（３００ｍＬ）中、ジヨードメタン（２４９ｍＬ、３０９１ｍｍｏｌ）の溶液を１時間かけて滴下した。反応混合物を２７℃に温め、白色沈殿の形成が認められた。混合物を１６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、２０％ＥｔＯＡｃ／ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性、ＰＭＡ活性）によりモニタリングした。反応混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１．５Ｌ）の慎重な添加によりクエンチした。混合物をセライトのパッドで濾過した。水層をＤＣＭ（２×１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し、粗ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オールを赤色液体、１８０ｇとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.41 - 4.35 (m, 1H), 2.18 - 2.05 (m, 2H), 1.73 (d, J = 13.9 Hz, 2H), 1.35 - 1.25 (m, 2H), 1.21 - 1.14 (m, 1H), 0.57 - 0.43 (m, 2H)。GCMS: m/z = 98.1)。
【化4】
【0029】
ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンの製造
０℃、Ｎ２雰囲気下で、ＤＣＭ（５０００ｍＬ）中、ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オール（２１０ｇ、２０５４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、デス・マーチンペルヨージナン（９５４ｇ、２２５ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。混合物を２７℃に温め、次いで、１６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性、ＰＭＡ活性）によりモニタリングした。反応混合物をセライトのパッドで濾過し、濾液をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ、８×１Ｌ）で洗浄した。合わせた水相をＤＣＭ（５×１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し（浴温度：２０℃）、粗ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンを褐色液体として得た。液体を７０℃での下方蒸留によりさらに精製し、ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンを淡黄色の粘稠な液体、１２５ｇ（６２％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.61 - 2.54 (m, 2H), 2.17 - 2.12 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 0.92 - 0.86 (m, 1H), -0.01 - -0.08 (m, 1H); GCMS: M/Z = 96.1。
【化5】
【0030】
２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンの製造
－７８℃、Ｎ２雰囲気下で、ＴＨＦ（１５００ｍＬ）中、ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オン（１２５ｇ、１２７４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＬＤＡ（ＴＨＦ中、２．０Ｍ、０．７０１Ｌ、１４０２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を－７８℃で１時間撹拌した。この溶液に、－７８℃の温度を維持したＴＨＦ（３００ｍＬ）中、ジフルオロ酢酸エチル（１７４ｇ、１４０２ｍｍｏｌ）の溶液を３０分かけて徐々に加えた。反応混合物を２７℃に温め、次いで、１時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ活性）によりモニタリングした。反応混合物を、ＨＣｌ水溶液（１Ｎ、２０００ｍＬ）の添加によりクエンチした。混合物を３０分間撹拌し、次いで、ＥｔＯＡｃ（３×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１０００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンを淡黄色の粘稠な液体、１８０ｇ（７１％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.18 (t, J = 54.8 Hz, 1H), 2.70 - 2.62 (m, 1H), 2.35 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 2.14 (br s, 1H), 1.26 - 1.21 (m, 1H), 1.04-1.03 (m, 1H), 0.22-0.21 (m, 1H), LCMS: M/Z = 173.17)。
【化6】
【0031】
２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの製造
２７℃、Ｎ２雰囲気下で、エタノール（２Ｌ）中、２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オン（１８０ｇ、９１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２－ヒドラジニル酢酸エチル塩酸塩（４２２ｇ、２７２９ｍｍｏｌ）に次いで、硫酸（２０ｍＬ、３７５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間撹拌し、次いで、１００℃に加熱し、１６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ活性）によりモニタリングした。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２０００ｍＬ）に溶解し、水（２×１Ｌ）、ブライン（１．０Ｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｐｅｔ．：アセトン１００：０→９８：２）に付して、２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルを灰白色固体、１１０ｇ（４６％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 6.86 (t, J = 54.8 Hz, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.88 - 2.79 (m, 1H), 2.76 - 2.68 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.10 - 1.03 (m, 1H), 0.14 (q, J = 4.3 Hz, 1H)。
【化7】
【0032】
２－（３－（ジフルオロメチル）－５－オキソ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの製造
０℃のシクロヘキサン（３．５Ｌ）中、２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（１１０ｇ、４２２ｍｍｏｌ）およびセライト（３９５ｇ）の撹拌溶液に、二クロム酸ピリジニウム（７９４ｇ、２１１０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。窒素雰囲気下で、混合物にｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（３５５ｍＬ、２１３０ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下した。反応混合物を２７℃に温め、次いで、その温度で４８時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、３０％アセトン／ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．４、ＵＶ活性）によりモニタリングした。反応混合物を濾過し、濾過ケーキをＥｔＯＡｃ（１０００ｍＬ）で抽出した。濾液を、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（２×５００ｍＬ）；飽和ＦｅＳＯ４水溶液（３００ｍＬ）；および次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、粗標題化合物（１５０ｇ）を得た。
【化8】
【0033】
２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－［１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチルの製造
２７℃、窒素雰囲気下で、ＤＣＭ（１５００ｍＬ）中、２－（３－（ジフルオロメチル）－５－オキソ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（７５ｇ、２６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、エタン－１，２－ジチオール（４３．０ｍＬ、５１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、三フッ化ホウ素酢酸（７２．６ｍＬ、５１１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を１６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、２０％アセトン／Ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３５、ＵＶ活性）によりモニタリングした。完了後、反応混合物を０℃に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）の添加によりクエンチした。混合物をＤＣＭ（２×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１０００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、褐色液体を得た。この材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ ９５：５→９０：１０）に付して、２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－［１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチルを灰白色固体、８０ｇ（７４％）として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.61 (t, J = 55.2 Hz, 1H), 5.00 - 4.85 (m, 2H), 4.29 - 4.19 (m, 2H), 3.55 - 3.46 (m, 4H), 2.63 - 2.53 (m, 1H), 2.49 - 2.38 (m, 1H), 1.30 - 1.24 (m, 4H), 0.65 - 0.60 (m, 1H)。LCMS M+H = 346.9。
【化9】
【0034】
２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの製造
－７０℃、Ｎ２雰囲気下で、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルイミダゾリジン－２，４－ジオン（２６．３ｇ、９２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＦ－ピリジン（２．４６０ｇ、２４．８３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液は３０分間であった。この溶液に、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチル（１０ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を－４０℃に温め、次いで、その温度で１時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、３０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性）によりモニタリングした。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）の添加によりクエンチした。混合物を室温に温め、次いで、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、褐色固体を得た。この材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ １００：０→７５－２５）に付して、２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルを淡黄色固体、８．５ｇ（９１％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.62 (t, J = 55.2 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.30 - 4.18 (m, 2H), 2.51 - 2.37 (m, 2H), 1.42 - 1.35 (m, 1H), 1.31 - 1.23 (m, 3H), 1.14 - 1.08 (m, 1H)。LCMS M+H = 293.07。
【化10】
【0035】
２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸の製造
０℃、Ｎ２雰囲気下で、ＴＨＦ（１７ｍＬ）およびＭｅＯＨ（６６ｍＬ）中、２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（１５ｇ、５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（６６ｍＬ）中、ＬｉＯＨ（１．７８８ｇ、７４．７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を２７℃に温め、次いで、その温度で３時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＳｉＯ２、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、Ｒｆ＝０．２、ＵＶ活性）によりモニタリングした。完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で洗浄して不純物を除去した。水層を、ＨＣｌ水溶液（１Ｍ）を用いてｐＨ２～３に調整し、次いで、ＥｔＯＡｃ（３×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸を灰白色固体、１４ｇ（９８％）として得た。LCMS M+H = 265.15。
【化11】
【0036】
２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸および２－（（３ｂＲ，４ａＳ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸を得るための分離
２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（５．５ｇ）をイソプロパノール（２０ｍＬ）に溶解した。溶液を、以下のようにＳＦＣキラル分離に少量ずつ供した：機器＝Ｔｈａｒ ８０；カラム＝Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ ３０×２５０ｍｍ、５ミクロン；溶媒Ａ＝超臨界ＣＯ２；溶媒Ｂ＝０．５％イソプロピルアミン（ｖ／ｖ）含有イソプロパノール；溶出剤の組成＝７０％Ａ：３０％Ｂ；流速＝６５ｇ／分；背圧＝１００バール；温度＝３０℃；注入量＝２．５ｍＬ；検出＝２２０ｎｍ。２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸は、７．５分～１４分で溶出するピークとして回収し、２－（（３ｂＲ，４ａＳ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸は、２．７分～５．８分で溶出するピークとして回収した。各鏡像異性体に関して、得られた溶液を減圧下で濃縮し、得られた固体をＥｔＯＡｃに溶解した後、クエン酸水溶液（１Ｍ）、次いで水、次いでブラインで２回洗浄した。有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで真空で濃縮し、分離した鏡像異性体を回収率８０～９０％で得た。
【化12】
【0037】
３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンゾニトリルの製造
室温の水（２．１Ｌ）中、３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンズアルデヒド（２１０．０ｇ、０．８９ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ヒドロキシルアミン－Ｏ－スルホン酸（１７５．１５ｇ、１．５５ｍｏｌ、１．７５当量）を加えた。反応混合物を５０℃に加熱し、１８時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、１～１．５時間撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで、水で洗浄した。湿固体を５０℃で１２～１５時間真空下で乾燥させ、３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンズアルデヒド、１９０．０ｇ（９１％）を得た。
【化13】
【0038】
７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの製造
エタノール（１．０８Ｌ）中、３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンゾニトリル（３６０．０ｇ、１．５５ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、メチルヒドラジン硫酸塩（１．１１ｋｇ、７．７３ｍｏｌ、５．０当量）を加え、次いで、２５～３５℃でトリエチルアミン（１．３Ｌ、９．３ｍｏｌ、６．０当量）を加えた。反応混合物を１１０℃に加熱し、１５時間維持した（反応をＴＬＣによりモニタリングした）。反応の完了後、混合物を室温に冷却した。水（３．０Ｌ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。固体を濾過により単離し、水で洗浄した。湿固体を５０℃で１２～１５時間真空下で乾燥させた。粗固体をカラムクロマトグラフィー（１０％ＥＡ／ヘキサン～４０％ＥＡ／ヘキサン）により精製し、生成物を淡黄色固体として得た。収率：１８５．０ｇ（４６．０％）。
【化14】
【0039】
Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドの製造
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中、７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（１．４０ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（３．７５ｍＬ、２１．５ｍｍｏｌ）を加え、次いで、反応物を氷浴中で冷却し、塩化メタンスルホニル（１．２６ｍＬ、１６．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をこの温度で１時間撹拌した（沈殿が形成された）。次いで、混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、水、１Ｍ ＨＣｌおよびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空で濃縮した。残渣をＥｔＯＨ（３０ｍｌ）および１０ｍｌの２０％ＮａＯＨ水溶液に取った。得られた混合物を、それが均一な溶液となるまでヒートガンで加熱し、室温で３０分間撹拌した。混合物を水（８０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（６０ｍＬ）で酸性化した。沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空で乾燥させ、標題生成物（１．５ｇ）を灰白色固体として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.24 (br s, 1H), 6.95 (d, J=7.9 Hz, 1H), 4.38 (s, 3H), 3.42 (s, 3H)。LC/MS (M+H)+ = 337.80。
【化15】
【0040】
Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの製造
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中、Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（１．３ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）および１－（クロロメチル）－４－メトキシベンゼン（０．６２５ｍＬ、４．６１ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸セシウム（１．６２６ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８０℃で２時間加熱した。混合物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ、２×）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。残渣をＢｉｏａｔｅｇ（０～３５％ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）により精製し、標題生成物（１．５ｇ）を白色泡沫として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.44 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.31 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.84 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.99 (br s, 1H), 4.76 (br s, 1H), 4.40 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.01 (s, 3H)。
【化16】
【0041】
Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの製造
参考文献：Andersen, Jacob et al, Synlett 2005 (14), 2209-2213に従う。ＮＭＰ（１０ｍＬ）中、Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（６００．０ｍｇ、１．３０８ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（４９．８ｍｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（５１８ｍｇ、２．６２ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，２Ｒ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（４６．５ｍｇ、０．３２７ｍｍｏｌ）の混合物に、水（２．０ｍＬ）中、アジ化ナトリウム（２５５ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次いで、混合物を密閉し、マイクロ波システムにおいて１２０℃で２．５時間加熱した。次いで、混合物をセライトのパッドで濾過し、パッドをＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ、２×）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で蒸発させた。残渣をＢｉｏａｔｇｅ（５～１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、標題生成物（４００ｍｇ）を灰白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 - 7.29 (m, 2H), 6.89 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.85 - 6.79 (m, 2H), 6.48 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.11 (br.s, 1H), 4.81 (br.s, 1H), 4.30 (s, 3H), 3.80 (br s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.99 (s, 3H)。LC/MS (M+H)+ = 395.00。
【化17】
【0042】
２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸の製造
ベンジルアルコール（９７ｍＬ）中、２－アミノ－６－クロロニコチン酸（５ｇ、２９ｍｍｏｌ）およびカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（９．７５ｇ、８７ｍｍｏｌ）の溶液を、１２０ｏＣに３時間加熱した。周囲温度に冷却した後、濃暗色の反応混合物を水に加え、エーテル（×３）で洗浄した。次いで、水層を０．５Ｍクエン酸で酸性化した。黄褐色の沈殿を濾過し、生成物（４．４ｇ、６２％）を得、これをさらに精製することなく次の反応に使用した。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.40 (br s, 1H), 7.94 (d, J=8.55 Hz, 1H), 7.06-7.52 (m, 5H), 6.04 (d, J=8.24 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H)。LC/MS: m/z = 245.15 [M+1]+。
【化18】
【0043】
Ｎ－［（６Ｐ）－７－｛２－［（１Ｓ）－１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル｝－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル］－Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミドの製造
スキーム：
スキーム：
【化19】
【0044】
工程１：
－２５℃のアセトニトリル（９２ｍＬ）（黄色溶液）中、（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（３，５－ジフルオロフェニル）プロパン酸（５．４９ｇ、１８．２３ｍｍｏｌ）および２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸（４．４５ｇ、１８．２３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ピリジン（９．８３ｍＬ、１２２ｍｍｏｌ）、次いで、２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスフィナン２，４，６－トリオキシド（「Ｔ３Ｐ」、４５．２ｍｌ、７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物（Ｔ３Ｐ添加後に澄明な液となった）を－２５℃～１０℃で４．５時間かけて撹拌し、次いで、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（６ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温に温めながら１８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ ＮａＯＨ、次いで水、次いで０．５Ｍクエン酸、次いで水で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。得られた残渣を、１５ＣＶのヘキサン中０～６０％酢酸エチルを用い、次いで、１０ＣＶの６０％ＥｔＯＡｃで保持して、シリカ（３３０ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）で精製した。所望の画分をプールし、濃縮し、淡黄色固体（８．１ｇ、９．１４ｍｍｏｌ、収率６０．１％）、Ｎ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｐ，３Ｐ）－７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－｛Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド｝－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（メジャー）およびＮ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｍ，３Ｍ）－７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－｛Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド｝－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（マイナー）の混合物を得た。LC/MS: m/z = 886.25 [M+1]+。
－２５℃のアセトニトリル（９２ｍＬ）（黄色溶液）中、（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（３，５－ジフルオロフェニル）プロパン酸（５．４９ｇ、１８．２３ｍｍｏｌ）および２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸（４．４５ｇ、１８．２３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ピリジン（９．８３ｍＬ、１２２ｍｍｏｌ）、次いで、２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスフィナン２，４，６－トリオキシド（「Ｔ３Ｐ」、４５．２ｍｌ、７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物（Ｔ３Ｐ添加後に澄明な液となった）を－２５℃～１０℃で４．５時間かけて撹拌し、次いで、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（６ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温に温めながら１８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ ＮａＯＨ、次いで水、次いで０．５Ｍクエン酸、次いで水で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。得られた残渣を、１５ＣＶのヘキサン中０～６０％酢酸エチルを用い、次いで、１０ＣＶの６０％ＥｔＯＡｃで保持して、シリカ（３３０ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）で精製した。所望の画分をプールし、濃縮し、淡黄色固体（８．１ｇ、９．１４ｍｍｏｌ、収率６０．１％）、Ｎ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｐ，３Ｐ）－７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－｛Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド｝－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（メジャー）およびＮ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｍ，３Ｍ）－７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－｛Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド｝－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（マイナー）の混合物を得た。LC/MS: m/z = 886.25 [M+1]+。
【0045】
工程２：
ＴＦＡ（２１．１ｍＬ、２７４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（４５．７ｍＬ）中、（Ｓ）－（１－（７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（工程１からの生成物、８．１ｇ、９．１４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。得られた淡黄色溶液を濃縮した。残渣を酢酸エチルに取り、次いで、１Ｎ ＮａＯＨで３回洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで、真空で濃縮し、油状残渣を得た。この残渣を、溶媒Ａ：溶媒Ｂ ６５：３５→０：１００（２ＣＶ）、次いで０：１００（９ＣＶ）；溶媒Ａ＝ヘキサン；溶媒Ｂ＝９：９：２ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨのグラジエント法によりシリカゲル（３３０ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）で精製した。最初に溶出する異性体（メジャー）を回収し、真空で濃縮し、Ｎ－［（６Ｐ）－７－｛２－［（１Ｓ）－１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル｝－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル］－Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド（４．１ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、収率６４．５％）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.86 - 7.98 (m, 1 H) 7.15 - 7.37 (m, 4 H) 6.97 - 7.06 (m, 1 H) 6.70 - 6.89 (m, 4 H) 6.40 - 6.48 (m, 1 H) 4.70 - 4.88 (m, 2 H) 3.41 - 3.81 (m, 7 H) 3.20 - 3.28 (m, 1 H) 3.08 - 3.12 (m, 3 H) 2.71 - 2.79 (m, 1 H) 1.69 - 2.00 (m, 2 H)。LC/MS: m/z = 696.20 [M+1]+。
ＴＦＡ（２１．１ｍＬ、２７４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（４５．７ｍＬ）中、（Ｓ）－（１－（７－（ベンジルオキシ）－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（工程１からの生成物、８．１ｇ、９．１４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。得られた淡黄色溶液を濃縮した。残渣を酢酸エチルに取り、次いで、１Ｎ ＮａＯＨで３回洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで、真空で濃縮し、油状残渣を得た。この残渣を、溶媒Ａ：溶媒Ｂ ６５：３５→０：１００（２ＣＶ）、次いで０：１００（９ＣＶ）；溶媒Ａ＝ヘキサン；溶媒Ｂ＝９：９：２ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨのグラジエント法によりシリカゲル（３３０ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）で精製した。最初に溶出する異性体（メジャー）を回収し、真空で濃縮し、Ｎ－［（６Ｐ）－７－｛２－［（１Ｓ）－１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル｝－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル］－Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド（４．１ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、収率６４．５％）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.86 - 7.98 (m, 1 H) 7.15 - 7.37 (m, 4 H) 6.97 - 7.06 (m, 1 H) 6.70 - 6.89 (m, 4 H) 6.40 - 6.48 (m, 1 H) 4.70 - 4.88 (m, 2 H) 3.41 - 3.81 (m, 7 H) 3.20 - 3.28 (m, 1 H) 3.08 - 3.12 (m, 3 H) 2.71 - 2.79 (m, 1 H) 1.69 - 2.00 (m, 2 H)。LC/MS: m/z = 696.20 [M+1]+。
【0046】
Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの製造
ＤＭＦ（１３ｍｌ）中、Ｎ－［（６Ｐ）－７－｛２－［（１Ｓ）－１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル｝－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル］－Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］メタンスルホンアミド（０．９２６ｇ、１．３３０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（０．３５１ｇ、１．３３０ｍｍｏｌ）、２－（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（「ＨＡＴＵ」、０．５３１ｇ、１．３９７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．５８１ｍｌ、３．３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌し、その後、反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中１０～１００％酢酸エチルを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（１．１ｇ、８８％）を灰白色泡沫状固体として得た。LC/MS: m/z = 942.25 [M+1]+。
【化20】
【0047】
例１：Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの製造
ＴＨＦ（０．２ｍＬ）中、（Ｅ）－ジアゼン－１，２－ジカルボン酸ジイソプロピル（「ＤＩＡＤ」、０．１２５ｍｌ、０．６３７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で、テトラヒドロフラン（２．１ｍＬ）中、Ｎ－（１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（０．２ｇ、０．２１２ｍｍｏｌ））、３，３，３－トリフルオロプロパン－１－オール（０．０７３ｇ、０．６３７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．１７８ｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）の混合物に滴下した。反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空で濃縮した。残渣を、１５ＣＶのヘキサン中０～６０％酢酸エチルのグラジエントを用い、次いで、５ＣＶのヘキサン中６０％酢酸エチルで保持して、シリカゲル（２４ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）で精製した。純生成物を含有する画分をプールし、次いで、濃縮し、黄色固体を得た。この固体をＤＣＭ（１ｍＬ）：ＴＦＡ（０．５ｍＬ）に取り、溶液を０℃に冷却し、この溶液にトリフリン酸（０．０５７ｍＬ、０．６３７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、次いで、真空で濃縮した。残渣を酢酸エチルに取り、１Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、０．５Ｍクエン酸で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、真空で濃縮した。残渣を、２０ＣＶのヘキサン中０～６０％酢酸エチルを用い、次いで、１０ＣＶの６０％酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィー（２４ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）に付した。純生成物を含有する画分をプールし、次いで、真空で濃縮し、Ｎ－（１－（（６Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（０．０７８ｇ、０．０８１ｍｍｏｌ、収率３８．０％）を褐色固体として得た。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ ppm 8.46 - 8.53 (m, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.19 - 7.24 (m, 1 H) 7.03 - 7.09 (m, 1 H) 6.53 - 6.81 (m, 4 H) 4.80 (dd, J=5.96, 2.98 Hz, 3 H) 4.49 - 4.62 (m, 2 H) 3.58 - 3.62 (m, 3 H) 3.40 - 3.49 (m, 1 H) 3.22 - 3.24 (m, 3 H) 3.06 - 3.14 (m, 1 H) 2.80 - 2.89 (m, 2 H) 2.37 - 2.44 (m, 2 H) 1.32 - 1.37 (m, 1 H) 0.96 - 1.01 (m, 1 H)。ＬＣＭＳ分析法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ粒子；注入量＝５．００μＬ；流速＝０．８０ｍＬ／分；溶媒Ａ＝９５：５ 水：ＭｅＣＮ ｗ／０．１％ｖ／ｖギ酸；溶媒Ｂ＝５：９５ 水：ＭｅＣＮ ｗ／０．１％ｖ／ｖギ酸；溶出プロファイル＝開始Ｂ％：０、終了Ｂ％：１００、グラジエント時間：３．５分、次いでＢ１００％で１分間保持；検出波長１＝２２０ｎｍ、波長２＝２５４ｎｍ。ＬＣＭＳ保持時間＝３．０９７分; m/z = 918.05 [M+1]+。
【化21】
【0048】
Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの代替製造
合成スキーム:
【化22】
【化23】
【0049】
工程１：２，６－ジクロロ－３－ニトロベンズアルデヒドの製造
０～５℃の丸底フラスコ中の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）（５．６３Ｌ、４．５Ｖ）の溶液に、２，６－ジクロロベンズアルデヒド（１．２５ｋｇ、７．１０ｍｏｌ、１．０当量）を１５℃未満で少量ずつ加えた。反応生成物を０～５℃で３０分間撹拌した。新たに製造したニトロ化混合物［０℃で濃縮Ｈ２ＳＯ４（０．４２５Ｌ、０．３４Ｖ）および７０％ＨＮＯ３（０．８５ｋｇ、１３．４９ｍｏｌ、１．３０当量）から製造］の溶液を、１０℃未満で上記の反応混合物に加えた［注：反応はわずかに発熱性である（３～６℃）ため、より低い温度での添加が好ましい］。反応混合物を５～１０℃で２～３時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、これを２５℃未満で、氷冷水（１８．７５Ｌ、１５Ｖ）でクエンチした。次いで、反応生成物を室温に温め、２時間撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで、水（２．５Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。粗湿固体を、最初に空気雰囲気で乾燥させ、次いで、５０～５５℃の熱風炉で１０～１２時間乾燥させ（水分含量が５．０％以下となるまで）、乾燥標題生成物、２，６－ジクロロ－３－ニトロベンズアルデヒド（１．４４ｋｇ、収率９２％）を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10. 44 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H)。
【化24】
【0050】
工程２：２，６－ジクロロ－３－ニトロベンゾニトリルの製造
（工程２ａ）丸底フラスコ中のＤＭＳＯ（５．９Ｌ、５．０Ｖ）の溶液に、室温で、２，６－ジクロロ－３－ニトロベンズアルデヒド（１．１７ｋｇ、５．３１ｍｏｌ、１．０当量）を加えた。室温で３０分間撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．６３ｋｇ、９．０４ｍｏｌ、１．７０当量）を加え、反応生成物を室温で３時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、温度を３０℃未満に維持するのに十分な速度で加えた氷冷水（１８．０Ｌ、１５．０Ｖ）の添加により、反応生成物をクエンチした（観察：水の添加時に固体が形成された）。反応生成物を室温で６０～９０分間撹拌した。固体を濾過により単離し、水（２．５Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄し、次いで、アセトンおよびヘキサンの混合物（６．０Ｌ、比１：１）で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。湿固体を、最初に風乾させ、次いで、５０～５５℃の熱風炉で１０～１２時間最後に乾燥させ（水分含量が１．０％以下となるまで）、乾燥目的生成物、２，６－ジクロロ－３－ニトロベンズアルデヒドオキシム（１．２２ｋｇ、収率９２％）を灰白色固体として得た。粗生成物（１０～２０％の２，６－ジクロロ－３－ニトロベンゾニトリルを含有）を、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。
【化25】
【0051】
（工程２ｂ）０～５℃のＤＣＭ（９．０４Ｌ、８．０Ｖ）中、粗オキシム（上記で製造、１．１３ｋｇ、４．８０ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、トリエチルアミン（「ＴＥＡ」、１．０２ｋｇ、１０．０９ｍｏｌ、２．１当量）を加えた。５分間撹拌した後、塩化メタンスルホニル（０．６０ｋｇ、５．２９ｍｏｌ、１．１当量）を１５℃で徐々に加えた（観察：添加中に発熱が認められた）。次いで、反応生成物を室温で３０～４５分間撹拌した。反応の完了後（反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした；移動相：ヘキサン中２０％酢酸エチル）、反応生成物を水（６．７８Ｌ、６．０Ｖ）で希釈し、有機層を分離し、水層をＤＣＭ（３．４Ｌ、３．０Ｖ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５．６５Ｌ、５．０Ｖ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。得られた粗固体を室温で、ヘキサン（４．５０Ｌ、４．０Ｖ）で摩砕した。湿材料を５０～５５℃の熱風炉で５～６時間乾燥させ、乾燥生成物、２，６－ジクロロ－３－ニトロベンゾニトリル（０．９５ｋｇ、収率９１％）を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H)。
【0052】
工程３：４－クロロ－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの製造
１５～２０℃のエタノール（７．５Ｌ、１０．０Ｖ）中、２，６－ジクロロ－３－ニトロベンゾニトリル（７５０．０ｇ、３．４５ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、反応生成物を２５℃未満に維持しながら、ヒドラジン水和物（５１９．０ｇ、１０．３６ｍｏｌ、３．０当量）を徐々に加えた（観察：添加はわずかに発熱性であり、添加時に固体の形成が始まる）。反応混合物の温度を室温まで徐々に上げ、次いで、混合物を３時間撹拌した（観察：この時間中、固体の量が増加する）。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、混合物を水（７．５Ｌ、１０．０Ｖ）で希釈し、室温で１時間さらに撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで、水（２．２５Ｌ、３．０Ｖ）で洗浄した。湿固体を、アセトン（１．８７５Ｌ、２．５Ｖ）およびヘキサン（１．８７５Ｌ、２．５Ｖ）の１：１の比の混合物で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。湿固体を５０℃の熱風炉で７～８時間最後に乾燥させ（水分含量が１．５％未満に達するまで）、乾燥生成物、４－クロロ－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（５４９．０ｇ、収率７５％）を赤れんが色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.36 (bs, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.40 Hz, 1H), 4.73 (bs, 2H)。
【化26】
【0053】
工程４：４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの製造
５～１０℃のＤＭＦ（５．０Ｌ、１０．０Ｖ）中、４－クロロ－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（５００ｇ、０．４２ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、反応生成物を１０℃未満に維持しながら、炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）（１．９１ｋｇ、５．８８ｍｏｌ、２．５当量）を徐々に加えた。５～１０分間撹拌した後、反応生成物を１０℃未満に維持しながら、硫酸ジメチル（３２６．３ｇ、２．５９ｍｏｌ、１．１当量）を加えた（注：より好ましい位置選択性を得るために、緩徐な添加が好ましい）。次いで、反応温度を室温まで徐々に上げ、撹拌を同じ温度でさらに２時間続けた。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、氷冷水（１５．０Ｌ、３０．０Ｖ）の添加により反応生成物をクエンチし、次いで、得られた混合物を室温で６～８時間撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで、水（１．５Ｌ、３．０Ｖ）で洗浄した。湿固体をＩＰＡ（１．５Ｌ、３．０Ｖ）、次いでヘキサン（１．０Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。湿固体を５０℃の熱風炉で７～８時間乾燥させた（水分含量が１．０％未満となるまで）。単離された材料、４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（３１９．０ｇ、収率６０％）を、さらに精製することなく次の工程に使用した。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.97 (d, J = 8.32 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 4.63 (bs, 2H), 3.96 (s, 3H)。
【化27】
【0054】
工程５：Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドの製造
（工程５ａ）０～５℃のＤＣＭ（６．２５Ｌ、１０．０Ｖ）中、４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（６２５．０ｇ、２．７６ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（８３７．０ｇ、８．２７ｍｏｌ、３．０当量）を加え、次いで、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２０．６０ｇ、０．１６５ｍｏｌ、０．０６当量）を加えた。反応生成物を５～１０分間撹拌し、次いで、反応生成物を１０℃未満に維持しながら、塩化メタンスルホニル（ＭｓＣｌ）（７９０．０ｇ、６．８９ｍｏｌ、２．５当量）を徐々に加えた。反応混合物を室温に温め、次いで、１．５～２．０時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、混合物を水（６．２５Ｌ、１０．０Ｖ）で希釈し、次いで、室温で１５分間撹拌した。有機層を分離し、水層をＤＣＭ（６．２５Ｌ、１０．０Ｖ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１．２５Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、粗固体を得た。固体を室温で、ヘキサン（１．２５Ｌ、２．０Ｖ）で摩砕し、中間体、Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（メチルスルホニル）メタンスルホンアミドを得、これを次の工程に直接使用した。
【化28】
【0055】
（ｉｉ）室温のエタノール（１０．５Ｌ、２０．０Ｖ）中、Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（メチルスルホニル）メタンスルホンアミド（上記で製造）の撹拌溶液に、５％ＮａＯＨ水溶液（４．３８Ｌ、７．０Ｖ）を徐々に加えた［注：滴下漏斗による緩徐な添加が好ましい］。反応生成物を同じ温度で３時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）［ＴＬＣ分析のためのサンプル調製：約１．０ｍｌのサンプルを２．０Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性化し、ｐＨ：２～３に到達させ、それを酢酸エチルで抽出し、ＴＬＣにより有機層を分析する］、反応生成物を０～５℃に冷却し、反応温度を１０℃未満に維持しながら、２．０Ｎ ＨＣｌ水溶液（３．１３Ｌ、５．０Ｖ）の添加により、ｐＨを２～３に調整した［注：ＨＣｌの添加時に沈殿が生じ、撹拌により増加した］。反応混合物を室温に温め、次いで、１．５～２．０時間撹拌した。得られた固体を濾過により単離し、次いで、水（１．２５Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄し、次いで、ヘキサン（１．２５Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。湿材料を５０℃の熱風炉で６～７時間乾燥させ（水分含量が１．０％未満となるまで）、乾燥生成物、Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（６４０．０ｇ、７６％）を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.05 (d, J = 8.32 Hz, 1H), 7.32 (bs, 1H), 7.17 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.45 (s, 3H)。
【0056】
工程６：Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの製造
室温のＤＭＦ（６．３５Ｌ、１０．０Ｖ）中、Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（６３５．０ｇ、２．０８ｍｏｌ、１．０当量）および１－（クロロメチル）－４－メトキシベンゼン（３５９．０ｇ、２．３０ｍｏｌ、１．１当量）の混合物に、炭酸カリウム（３７４．７ｇ、２．７０ｍｏｌ、１．３当量）を加えた。反応混合物を８０～９０℃に加熱し、その温度で３時間維持した。反応の完了後（ＴＬＣによりモニタリング）、混合物を氷冷水（１９．０５Ｌ、３０．０Ｖ）に注いだ［注：生成物が沈殿する際の凝集を避けるために、激しく撹拌しながら徐々にクエンチすることが好ましい］。得られた固体を濾過により単離し、水（１．９０Ｌ、３．０Ｖ）で洗浄し、次いで、固体をヘキサン（１．２７Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄した。真空濾過を６０～９０分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。単離された固体を酢酸エチル（１２．７Ｌ、２０．０Ｖ）に溶解し、木炭を加えた（６３．５ｇ）。混合物を６０～７０℃に加熱し、次いで、その温度で３０～４５分間撹拌した。混合物を、熱いままで（４０～５０℃）、セライトのパッドで濾過し、次いで、セライトパッドを酢酸エチル（３．１７Ｌ、５．０Ｖ）で抽出した。合わせた濾液を５０℃未満で、減圧下で濃縮乾固した。酢酸エチル（０．６３５Ｌ、１．０Ｖ）を室温で固体に加えた。得られた固体懸濁液を３０分間撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで、ヘキサン（１．２７Ｌ、２．０Ｖ）で洗浄した。真空濾過を４５～６０分間維持することにより、残留水を固体から除去し、生成物Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（７０５．０ｇ、収率８０％）を黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.68 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.44 Hz, 2H), 4.95-4.76 (m, 2H), 4.17 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.01 (s, 3H)。
【化29】
【0057】
工程７：Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの製造
室温のＴＨＦ（３．５０Ｌ、１０．０Ｖ）および水（７．０Ｌ、２０．０Ｖ）の混合物中、亜鉛粉末（５４０．０ｇ、８．２３ｍｏｌ、１０．０当量）の撹拌懸濁液に、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）（４４９．０ｇ、８．２３ｍｏｌ、１０．０当量）を加えた。この混合物に、ＴＨＦ（７．０Ｌ、２０．０Ｖ）中、Ｎ－（４－クロロ－１－メチル－７－ニトロ－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（３５０ｇ、０．８２３ｍｏｌ、１．０当量）を加えた。反応混合物を室温で３～４時間撹拌した。反応の完了後（工程内ＴＬＣ／ＨＰＬＣによりモニタリング）、混合物を酢酸エチル（３．５Ｌ、１０．０Ｖ）および水（１．１２Ｌ、２．５Ｖ）で希釈した。混合物を１５分間撹拌した。反応生成物をセライトベッドのパッドで濾過し、酢酸エチル（１．７５Ｌ、５．０Ｖ）で洗浄した。二相性の濾液を回収し、相を分離した。水層を酢酸エチル（３．５０Ｌ、１０．０Ｖ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３．５０Ｌ、１０Ｖ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで、真空で濃縮し、粗固体を得た。粗生成物にＭＴＢＥ（３．２５Ｌ、１０Ｖ）を加え、懸濁液を室温で３０分間撹拌した。固体を濾過により単離した。真空濾過を３０～４５分間維持することにより、バルク残留水を固体から除去した。湿生成物を熱風炉（５０℃）で２時間乾燥させ、標題生成物、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（２７６．０ｇ、収率８５％）を灰白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.29-7.26 (m, 2H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.42 (d, J = 7.80 Hz, 1H), 4.99-4.70 (m, 2H), 4.25 (s, 3H), 3.77 (s, 5H), 2.98 (s, 3H)。
【化30】
【0058】
２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸の製造
合成スキーム：
【化31】
【化32】
【0059】
工程１：２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸の製造
２６℃、Ｎ２雰囲気下で、ベンジルアルコール（１４００ｍＬ、１３４６４ｍｍｏｌ）中、２－アミノ－６－クロロニコチン酸（２００ｇ、１１５９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（３９０ｇ、３４７７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１２０℃に加熱し、その温度で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）。完了時、反応混合物を水（３Ｌ）で希釈し、ジエチルエーテル（２×１０００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、クエン酸水溶液（０．５Ｍ）を用いて、水層をｐＨ４に酸性化した。沈殿した固体を濾過により回収し、次いで、減圧下で乾燥し、２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸を灰白色固体（２２０ｇ、収率＝７２％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.56 - 12.32 (m, 1H), 7.97 - 7.91 (m, 1H), 7.52 - 7.41 (m, 2H), 7.38 - 7.11 (m, 5H), 6.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.39 - 5.31 (m, 2H)。LCMS純度 = 93%; m/z = 245.29 (M+H)。
【化33】
【0060】
工程２：２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸メチルの製造
２６℃、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５Ｌ）中、２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸（２２０ｇ、９０１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、炭酸カリウム（３７３ｇ、２７０２ｍｍｏｌ）およびヨードメタン（０．２８２Ｌ、４５０４ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。反応混合物を２７℃で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、４０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ．、Ｒｆ＝０．６）。完了時、反応混合物を水（５Ｌ）で希釈した。沈殿した固体を濾過により単離し、次いで、真空下で乾燥させ、２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸メチルを灰白色固体（２２０ｇ、収率＝９２％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 6.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 3.84 (s, 3H)。LCMS純度 = 97%、m/z = 259.30 (M+H)。
【化34】
【0061】
工程３：２－アミノ－６－ヒドロキシニコチン酸メチルの製造
２６℃、Ｎ２雰囲気下で、ＤＣＭ（５００ｍＬ）中、２－アミノ－６－（ベンジルオキシ）ニコチン酸メチル（５０ｇ、１９０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＦＡ（８００ｍＬ）およびトリフリン酸（２５ｍＬ、２８２ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。反応混合物を２６℃で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．２）。完了時、揮発物を真空下で除去し、粗生成物を得た。この材料をジエチルエーテル（３×１０００ｍＬ）で摩砕し、次いで、沈殿した固体を濾過により単離した。この固体に水（２Ｌ）を加え、次いで、混合物を５時間とした。固体を濾過により回収し、水で洗浄した。固体を真空下で乾燥させ、２－アミノ－６－ヒドロキシニコチン酸メチルを灰白色固体（２５ｇ、収率＝７８％）として得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 10.92-10.76 (m, 1H), 7.65 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.43-6.87 (m, 2H), 5.51 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H)。LCMS純度 = 99.32%; m/z = 169.32 (M+H)。生成物中のＴＦＡおよびトリフリン酸の非存在を、１９Ｆ－ＮＭＲにより確認した。生成物を、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。
【化35】
【0062】
工程４：２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルの製造
２７℃、窒素雰囲気下で、ＴＨＦ（１０００ｍＬ）中、２－アミノ－６－ヒドロキシニコチン酸メチル（５０ｇ、２９７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリフェニルホスフィン（１５６ｇ、５９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応生成物を０℃に冷却し、反応生成物にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（「ＤＩＡＤ」１１６ｍＬ、５９５ｍｍｏｌ）を滴下した。溶液を３０分間撹拌した。０℃の溶液に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、３，３，３－トリフルオロプロパン－１－オール（５２．４ｍＬ、５９５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次いで、反応生成物を２７℃に徐々に温め、次いで、その温度で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、１０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．５）。完了時、反応混合物を水（５００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を水（５００ｍＬ）、次いでブライン溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し、粗生成物を黄色半固体（１００ｇ）として得た。この材料を、ｐｅｔ中、５～１０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮し、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルを黄色液体（５０ｇ、収率６０％）として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21-6.85 (brs, 1H), 6.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.63-2.55 (m, 2H)。ＬＣＭＳ分析法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝ＣＡＮ中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／３、０．４／３、２．５／９８、３．４／９８、３．５／３、４／３；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝２．０３分；観測イオン＝２６５．１５（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝９３％。
【化36】
【0063】
工程５：２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸の製造
０℃、窒素雰囲気下で、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５００ｍＬ）、メタノール（１５０ｍＬ）および水（８０ｍＬ）中、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチル（５０ｇ、１８９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水酸化リチウム一水和物（２２．６６ｇ、９４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、５０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．３）。完了時、反応混合物を減圧下で濃縮し、水性残渣を得た。次いで、この残渣を１Ｎ ＨＣｌの添加によりｐＨ４に酸性化した。得られた沈殿を濾過により回収し、水（５００ｍＬ）、次いでｎ－ヘキサン（４００ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸を灰白色固体（４５ｇ、収率９０％）として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.35 (brs, 2H), 5.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.44 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.84-2.73 (m, 2H)。生成物を、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。
【化37】
【0064】
２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸の代替製造
合成スキーム：
【化38】
【化39】
【0065】
工程１：２－アミノ－６－フルオロニコチン酸の製造
０℃の水（「Ｈ２Ｏ中２５％ＮＨ３」、１Ｌ、４Ｖ）およびイソプロパノール（６．５Ｌ、２６Ｖ）中、ＮＨ３の混合物にアンモニアガスを１時間スパージした。オートクレーブ（２５Ｌ）中の混合物に、２，６－ジフルオロニコチン酸（２５０ｇ、１５７１ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、反応混合物を１０５℃で２０時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、８０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．３）。完了時、反応混合物を２０℃に放冷し、次いで、２０℃未満で、減圧下で濃縮し、４～６Ｖ（１．５Ｌ）の容量とした。残渣を水（５Ｌ）に溶解し、２Ｎ ＨＣｌ（７００ｍＬ）の添加によりｐＨ２～３に酸性化し、次いで、２時間撹拌した。得られた沈殿を濾過により回収し、水（４０００ｍＬ）、次いでｎ－ヘキサン（５０００ｍＬ）で洗浄した後、５０℃の真空オーブンで乾燥させ、２－アミノ－６－フルオロニコチン酸を灰白色固体（２５０ｇ、収率９２％）として得た。この生成物を、同じ方法により製造した他のバッチの生成物と混合し、２０００ｇの合わせた生成物を得た。トルエン（１０Ｌ）に固体を懸濁させ、次いで、蒸留によりトルエンを除去することにより、残留溶媒を固体から除去した。得られた固体を６０℃の真空オーブンで７日間乾燥させ、２－アミノ－６－フルオロニコチン酸を灰白色固体（１．６ｋｇ、収率７７％）として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.94 (brs, 1H), 8.17 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.56 (brs, 2H), 6.25 (dd, J = 8.2, 2.8 Hz, 1H)。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／３、０．４／３、２．５／９８、３．４／９８、３．５／３、４／３；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝１．２４分；観測イオン＝１５７．０４（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝９６％。
【化40】
【0066】
工程２：２－アミノ－６－フルオロニコチン酸メチルの製造
ＤＭＦ（１５００ｍＬ）中、２－アミノ－６－フルオロニコチン酸（１５０ｇ、９６１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（３９８ｇ、２８８２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ヨードメタン（３００ｍＬ、４８０４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素雰囲気下で、２７℃で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、３０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．７）。完了時、反応混合物を氷冷水（５０００ｍＬ）の添加によりクエンチした。得られた沈殿を濾過により回収し、水（２０００ｍＬ）、次いでｎ－ヘキサン（１０００ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ、２－アミノ－６－フルオロニコチン酸メチルを褐色固体（１２０ｇ、収率７０％）として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.20 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.54 (brs, 2H), 6.29 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 3.82 (m, 3H)。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／３、０．４／３、２．５／９８、３．４／９８、３．５／３、４／３；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝１．５５分；観測イオン＝１７１．０７（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝９６％。生成物を、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。
【化41】
【0067】
工程３：２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルおよび２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピルの製造
０℃、窒素雰囲気下で、ＴＨＦ（５００ｍＬ）中、２－アミノ－６－フルオロニコチン酸メチル（２５ｇ、１４７ｍｍｏｌ）および３，３，３－トリフルオロプロパン－１－オール（１５．５４ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水素化ナトリウム（油中６０％分散体、８．８２ｇ、２２０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで、２７℃に徐々に温め、その温度で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、１０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．５）。完了時、反応混合物を０℃に冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルを黄色液体（４０ｇ）として得た。エステル交換反応の副生成物２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピルの形成も、反応において認められた。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／９７、０．４／９７、２．５／２、３．４／２、３．５／９７、４．０／９７；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝２．０４および２．２２分；観測イオン＝２６５．１８および３４７．２９（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝５７％の２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルおよび１５％の２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピル。この粗生成物混合物を、同じ方法により製造した粗生成物の２つの他のバッチ（４０ｇおよび５０ｇ）と混合した。合わせた材料（１３０ｇ）を、ｐｅｔ中、１０～２０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮し、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルおよび２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピルの６：１の混合物を淡黄色液体（１００ｇ、収率９０％）として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.02-7.97 (m, 1H), 7.04-6.48 (m, 1H), 6.08-6.03 (m, 1H), 4.52-4.47 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.64-2.54 (m, 2H)。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／９７、０．４／９７、２．５／２、３．４／２、３．５／９７、４．０／９７；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝２．０２および２．２１分；観測イオン＝２６４．９７および３４６．９７（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝６６％の２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルおよび１１％の２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピル。
【化42】
【0068】
工程４：２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸の製造
２７℃、窒素雰囲気下で、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（８００ｍＬ）、メタノール（３００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）中、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸メチルおよび２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸３，３，３－トリフルオロプロピル（６：１、１００ｇ、３１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水酸化リチウム一水和物（３７．２ｇ、１５５２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で８時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、５０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．３）。完了時、反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、得られた水性残渣を１Ｎ ＨＣｌの添加によりｐＨ４に酸性化した。得られた沈殿を濾過により回収し、水（２０００ｍＬ）、次いでｎ－ヘキサン（１０００ｍＬ）で洗浄した後、乾燥させ、２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸を灰白色固体（８０ｇ、収率９７％）として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (brs, 2H), 5.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.83-2.74 (m, 2H)。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／３、０．４／３、２．５／９８、３．４／９８、３．５／３、４／３；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝１．７３分；観測イオン＝２５１．１７（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝９４％。生成物を、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。
【化43】
【0069】
例１：Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの代替製造
合成スキーム：
工程１：（Ｓ）－（１－（３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルの製造
－２５℃、窒素雰囲気下で、アセトニトリル（６００ｍＬ）中、（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（３，５－ジフルオロフェニル）プロパン酸（６２．３ｇ、２０７ｍｍｏｌ）および２－アミノ－６－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ニコチン酸（５５ｇ、２０７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（４１．８ｍＬ、５１７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物に、２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスフィナン２，４，６－トリオキシド（「Ｔ３Ｐ」、ＥｔＯＡｃ中５０％ｗｔ、６０９ｍＬ、１０３３ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下した。この溶液を－２５℃で１時間撹拌し、次いで、１３℃に徐々に温め、５時間撹拌した。１３℃の溶液に、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（８２ｇ、２０７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、反応生成物を２７℃に徐々に温め、次いで、その温度で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、４０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．４）。完了時、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解した後、クエン酸水溶液（０．５Ｍ、２×５００ｍＬ）、次いでＮａＯＨ水溶液（１Ｎ、３×５００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し、粗生成物（１８０ｇ）を得、これをｐｅｔ中、４０～５０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮し、（Ｓ）－（１－（３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルを灰白色固体（８５ｇ、収率３９％）として得た。生成物は、ホモキラルアトロプ異性体（ジアステレオマー）の混合物である。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）；移動相Ａ＝水中０．０５％ギ酸；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．０５％ギ酸；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／３、０．４／３、２．５／９８、３．４／９８、３．５／３、４／３；カラム温度＝３５℃；流速＝０．６ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝２．４６分；観測イオン＝８９２．５３（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝８５％。
【化44】
【化45】
【化46】
【0070】
工程２：（Ｓ）－Ｎ－（（６Ｐ）－７－（（３Ｐ）－２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドの製造
０℃のＤＣＭ（３００ｍＬ）中、（Ｓ）－（１－（３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（８５ｇ、９５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２９４ｍＬ、３８１０ｍｍｏｌ）、次いでトリフリン酸（２５．４ｍＬ、２８６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を２７℃に温め、窒素雰囲気下で１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした（ＳｉＯ２、８０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ． Ｒｆ＝０．３）。完了時、揮発物を窒素ガスの緩流下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（１０００ｍＬ）に溶解し、２Ｎ ＮａＯＨ（２×５００ｍＬ）、次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで、減圧下で濃縮し、粗生成物を得、これをＰｅｔ中、５０～９９％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮し、（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドを淡黄色固体（６３ｇ）として得た。材料は、ＬＣＭＳにより決定された６４：２６の比のホモキラルアトロプ異性体（ジアステレオマー）の混合物である。この生成物を、以下の同じ手順により製造した生成物の３つの追加のバッチと混合した。合わせた生成物（１９５ｇ）をメタノール：アセトニトリル（８０：２０、１３００ｍＬ）に溶解し、この溶液を以下の方法を用いたｐｒｅｐ－ＳＦＣにより精製した：カラム＝（Ｒ，Ｒ）Ｗｈｅｌｋ－０１（２５０×３０×５μ）；溶出剤＝ＣＯ２：ＭｅＯＨ（６５：３５）；流速＝９０ｇ／分；背圧＝１２０バール；検出＝２１４ｎｍ（ＵＶ）；スタック時間＝１４分；注入あたりのロード＝４３０ｍｇ。純粋な主要ピークを回収し、減圧下で濃縮し、単一立体異性体（Ｓ）－Ｎ－（（６Ｐ）－７－（（３Ｐ）－２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドを灰白色固体（１１３ｇ、収率６３％）として得た。1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.42 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 7.03-6.97 (m, 1H), 6.75-6.70 (m, 2H), 4.73-4.69 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.28-3.24 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.97-2.83 (m, 3H)。ＬＣＭＳ法：カラム＝ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８（７５ｍｍ×４．６ｍｍ、３．５μｍ）；移動相Ａ＝水中５ｍＭ重炭酸アンモニウム；移動相Ｂ＝アセトニトリル；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／５、０．５／５、１．０／１５、４．０／９８、７．０／９８、７．５／５、８．０／５；カラム温度＝３５℃；流速＝１．３ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝４．０３分；観測イオン＝６７２．０７（Ｍ＋Ｈ）；ＬＣＭＳ純度＝９８％；ＨＰＬＣ純度＝９８％；キラルＨＰＬＣ純度＝９８％。
【化47】
【0071】
工程３：Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの製造
酢酸エチル（８１８ｍｌ）中、（Ｓ）－Ｎ－（（６Ｐ）－７－（（３Ｐ）－２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（５５ｇ、８２ｍｍｏｌ）および２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（２２．７０ｇ、８６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２，６－ルチジン（２３．８３ｍｌ、２０５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物に、内部温度を１７℃から２４℃に上昇させた２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスフィナン２，４，６－トリオキシド（「Ｔ３Ｐ」、酢酸エチル(ethyl actate)中５０％ｗｔ．）（９７ｍＬ、１６４ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応を、水（５００ｍＬ）の添加によりクエンチした。相を分配し、有機相を水（５００ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過し、濾液を最初の容量の１／４に濃縮し、粗生成物を酢酸エチル中の溶液として得た。
【化48】
【0072】
生成物の第２のバッチを、以下のように改変した同じ手順に従って製造した：反応を、（Ｓ）－Ｎ－（（６Ｐ）－７－（（３Ｐ）－２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（５３．４ｇ、７９ｍｍｏｌ）を用いて実施し、総ての他の試薬の量をそれに合うように調整した。ＭｇＳＯ４で乾燥させる前に、ブライン（３００ｍＬ）での洗浄によりワークアップを完了した。
【0073】
粗生成物を合わせ、次いで、セライトに吸着させた。得られた粉末を、ヘキサン中３０～８５％酢酸エチルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー（３ｋｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム）に付した。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮し、黄色泡沫を得た。材料を高真空下に１８時間置いた。材料を、乳鉢および乳棒を用いて微粉末に変換し、固体を５０℃の真空オーブンに４８時間入れ、Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドを黄色粉末（１３４．１ｇ、収率９０％）として得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.84 - 9.91 (1 H, m) 9.49 (1 H, d, J=8.34 Hz) 8.47 (1 H, d, J=8.35 Hz) 7.79 (1 H, d, J=7.75 Hz) 7.49 (1 H, d, J=8.05 Hz) 7.11 (1 H, d, J=8.64 Hz) 6.80 - 7.09 (2 H, m) 6.66 (2 H, dd, J=8.20, 2.24 Hz) 4.69 - 4.75 (3 H, m) 4.57 (1 H, d, J=16.39 Hz) 4.48 (1 H, ddd, J=11.03, 8.35, 2.68 Hz) 3.51 (3 H, s) 3.42 (1 H, dd, J=14.01, 2.38 Hz) 3.20 (3 H, s) 3.05 (1 H, dd, J=14.01, 11.03 Hz) 2.89 - 2.99 (2 H, m) 2.42 - 2.48 (2 H, m) 1.32 - 1.40 (1 H, m) 0.81 - 0.86 (1 H, m)。ＬＣＭＳ法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．７ｕｍ粒子）；溶媒Ａ＝０．１％ｖ／ｖギ酸含有の、水：ＭｅＣＮ（９５：５）；溶媒Ｂ＝０．１％ｖ／ｖギ酸含有の、ＭｅＣＮ：水（９５：５）；グラジエント＝時間（分）／％Ｂ：０／０、３．５／１００、４．５／１００；流速＝０．８ｍＬ／分。ＬＣＭＳの結果：保持時間＝３．１７３分；観測質量＝９１７．９５（Ｍ＋Ｈ）。ＵＰＬＣ純度＝９９．８％。
【0074】
例１の命名：
上記で製造した例１の化合物は、軸不斉を有するホモキラル材料である。軸不斉は、ＩＵＰＡＣ Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ(doi:10.1351/goldbook.A00547)に詳述されているＰ／Ｍ命名法を用いて説明することができる。しかしながら、現時点では、Ｐ／Ｍ命名法を有する化学名を生成することができる利用可能なソフトウェアツールの数はごく限られており、この命名法を用いた化学名を分子の構造的表現に変換するために利用可能な選択肢も少ない。したがって、明瞭性および利便性のために、例１に関するいくつかの名称を以下に提供する：
上記で製造した例１の化合物は、軸不斉を有するホモキラル材料である。軸不斉は、ＩＵＰＡＣ Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ(doi:10.1351/goldbook.A00547)に詳述されているＰ／Ｍ命名法を用いて説明することができる。しかしながら、現時点では、Ｐ／Ｍ命名法を有する化学名を生成することができる利用可能なソフトウェアツールの数はごく限られており、この命名法を用いた化学名を分子の構造的表現に変換するために利用可能な選択肢も少ない。したがって、明瞭性および利便性のために、例１に関するいくつかの名称を以下に提供する：
【0075】
ＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １２（Ｐ／Ｍ命名法なし）により生成された例１の名称：
Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド
Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド
【0076】
ＪＣｈｅｍ ｆｏｒ Ｅｘｃｅｌ（Ｐ／Ｍ命名法を含む）により生成された例１の化学名：
Ｎ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｐ，３Ｐ）－３－（４－クロロ－３－メタンスルホンアミド－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－２－［（２Ｓ，４Ｒ）－９－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－７，８－ジアザトリシクロ［４．３．０．０２，４］ノナ－１（６），８－ジエン－７－イル］アセトアミド
Ｎ－［（１Ｓ）－１－［（３Ｐ，３Ｐ）－３－（４－クロロ－３－メタンスルホンアミド－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３Ｈ，４Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル］－２－［（２Ｓ，４Ｒ）－９－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－７，８－ジアザトリシクロ［４．３．０．０２，４］ノナ－１（６），８－ジエン－７－イル］アセトアミド
【0077】
手動でＰ／Ｍ命名法を加えたＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １２により生成された化学名：
Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド
Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３Ｐ）－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－７－（３，３，３－トリフルオロプロポキシ）－３，４－ジヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド
【0078】
比較試験：
例１の化合物を、多数の試験においてＷＯ２０１８２０３２３５（スキーム１）に記載の例６０．２の化合物と比較した。これらの比較の目的で、本発明者らは、このレベルの純度がヒト臨床試験において使用されるもののうち最も代表的なものであるため、各化合物のホモキラル材料を使用することを選択した。具体的には、インダゾールの示されたＣ－Ｎ結合を軸とした束縛回転が、クロマトグラフィーにより分離することができ、かつ室温で相互変換しない例１および例６０．２の両方におけるアトロプ異性体（ジアステレオマー）を生じさせる。よって、クロマトグラフィーを用いて、本発明者らは、スキーム２に示される立体異性体を純粋な形態で単離した。
例１の化合物を、多数の試験においてＷＯ２０１８２０３２３５（スキーム１）に記載の例６０．２の化合物と比較した。これらの比較の目的で、本発明者らは、このレベルの純度がヒト臨床試験において使用されるもののうち最も代表的なものであるため、各化合物のホモキラル材料を使用することを選択した。具体的には、インダゾールの示されたＣ－Ｎ結合を軸とした束縛回転が、クロマトグラフィーにより分離することができ、かつ室温で相互変換しない例１および例６０．２の両方におけるアトロプ異性体（ジアステレオマー）を生じさせる。よって、クロマトグラフィーを用いて、本発明者らは、スキーム２に示される立体異性体を純粋な形態で単離した。
【化49】
【化50】
【0079】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより化合物を定量化する一般的手順：
総てのｉｎ ｖｉｔｒｏサンプルをＥｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。使用した分析カラムは、室温に維持したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（Ｃ１８、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相Ａは、ＭｉｌｌｉＱ水中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸からなるものであった。移動相Ｂは、１００％メタノールからなるものであった。流速は１ｍＬ／分であった。グラジエントは、以下の通りであった：移動相Ｂを、０．７分かけて５％から９０％に直線的に増加させ、９０％に１．４分間維持し、５％に０．７分間維持した。
総てのｉｎ ｖｉｔｒｏサンプルをＥｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。使用した分析カラムは、室温に維持したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（Ｃ１８、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、５μｍ）であった。移動相Ａは、ＭｉｌｌｉＱ水中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸からなるものであった。移動相Ｂは、１００％メタノールからなるものであった。流速は１ｍＬ／分であった。グラジエントは、以下の通りであった：移動相Ｂを、０．７分かけて５％から９０％に直線的に増加させ、９０％に１．４分間維持し、５％に０．７分間維持した。
【0080】
総てのｉｎ ｖｉｖｏサンプルを、カラムを６０℃に維持したＴｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）６５００ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、０．０２５％ギ酸からなるものであった。移動相Ｂは、ＭｅＯＨ、５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃからなるものであった。流速は０．６ｍＬ／分であった。カラムおよび溶出グラジエントは、以下に記載の一般的分析法のうちの１つから選択した。
【0081】
一般的分析法Ａ：
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／１０、０．２／１０、０．８／９０、１．３／９０、１．３１／１０、２．０／１０。
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／１０、０．２／１０、０．８／９０、１．３／９０、１．３１／１０、２．０／１０。
【0082】
一般的分析法Ｂ：
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／１０、０．２／１０、０．８／９０、１．３／９０、１．３１／１０、２．０／１０。
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／１０、０．２／１０、０．８／９０、１．３／９０、１．３１／１０、２．０／１０。
【0083】
一般的分析法Ｃ：
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／２、０．４０／２、０．７／６５、１．３／９０、１．９／９０、１．９１／２、２．５／２。
カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）；グラジエント：時間（分）／％Ｂ＝０．０／２、０．４０／２、０．７／６５、１．３／９０、１．９／９０、１．９１／２、２．５／２。
【0084】
効力および細胞毒性を測定するための手順：
ＭＴ－２細胞、２９３Ｔ細胞およびＮＬ４－３ウイルスのプロウイルスＤＮＡクローンを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。ＭＴ－２細胞を、１０％非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンＧおよび最大１００単位／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において増殖させた。２９３Ｔ細胞を、１０％非働化ＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍＬペニシリンＧおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地において増殖させた。ｎｅｆ遺伝子のセクションをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と置き換えた組換えＮＬ４－３プロウイルスクローンを用いて、これらの試験において使用する参照ウイルスを作製した。Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ（マディソン、ウィスコンシン州）のＴｒａｎｓｉｔ－２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、組換えＮＬ４－３プロウイルスクローンを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、組換えウイルスを作製した。２～３日後に上清を回収し、存在するウイルスの量を、ルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより、ルシフェラーゼ酵素活性をマーカーとして用いて、ＭＴ－２細胞において測定した。ルシフェラーゼを、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マディソン、ウィスコンシン州）のＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて定量化した。化合物の段階希釈の存在下で組換えウイルスに４～５日間感染させたＭＴ－２細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することにより、組換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性を定量化した。
ＭＴ－２細胞、２９３Ｔ細胞およびＮＬ４－３ウイルスのプロウイルスＤＮＡクローンを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。ＭＴ－２細胞を、１０％非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンＧおよび最大１００単位／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において増殖させた。２９３Ｔ細胞を、１０％非働化ＦＢＳ、１００ｍｇ／ｍＬペニシリンＧおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地において増殖させた。ｎｅｆ遺伝子のセクションをウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と置き換えた組換えＮＬ４－３プロウイルスクローンを用いて、これらの試験において使用する参照ウイルスを作製した。Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ（マディソン、ウィスコンシン州）のＴｒａｎｓｉｔ－２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、組換えＮＬ４－３プロウイルスクローンを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、組換えウイルスを作製した。２～３日後に上清を回収し、存在するウイルスの量を、ルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより、ルシフェラーゼ酵素活性をマーカーとして用いて、ＭＴ－２細胞において測定した。ルシフェラーゼを、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マディソン、ウィスコンシン州）のＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて定量化した。化合物の段階希釈の存在下で組換えウイルスに４～５日間感染させたＭＴ－２細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することにより、組換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性を定量化した。
【0085】
（Ｆａ）＝１／［１＋（ＥＤ５０／薬物濃度）ｍ］である半有効式の指数関数形式(Johnson VA, Byington RT. Infectivity Assay. In Techniques in HIV Research. ed. Aldovini A, Walker BD. 71-76. New York: Stockton Press.1990)を用いて、５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。阻害パーセント＝１／［１＋（ＥＣ５０／薬物濃度）ｍ］（式中、ｍは、濃度反応曲線の傾きを反映するパラメータである）である半有効式の指数関数形式を用いて、５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を算出した。
【0086】
非感染細胞を使用したことを除き、抗ウイルスアッセイに記載のものと同じプロトコールを用いて、化合物の細胞毒性および対応するＣＣ５０値を決定した。ＸＴＴ（２，３－ビス［２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル］－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキシアニリド分子内塩）ベースの比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）を使用することにより、細胞毒性を非感染ＭＴ２細胞において４日目に評価した。
【0087】
結果：
例１および例６０．２の効力は、最初の抗ＨＩＶウイルス学的アッセイの誤差の範囲内である（例１のＥＣ５０＝２５±８ｐＭ、例６０．２のＥＣ５０＝１８±１３ｐＭ）。例１のＥＣ５０は、最初に試験した際、０．０３４ｎＭであったが、さらに試験した結果、２５±８ｐＭと平均が修正されたことに留意されたい。測定された細胞毒性ＣＣ５０は、例１および例６０．２でそれぞれ０．５μＭ超および１０μＭ超である。
例１および例６０．２の効力は、最初の抗ＨＩＶウイルス学的アッセイの誤差の範囲内である（例１のＥＣ５０＝２５±８ｐＭ、例６０．２のＥＣ５０＝１８±１３ｐＭ）。例１のＥＣ５０は、最初に試験した際、０．０３４ｎＭであったが、さらに試験した結果、２５±８ｐＭと平均が修正されたことに留意されたい。測定された細胞毒性ＣＣ５０は、例１および例６０．２でそれぞれ０．５μＭ超および１０μＭ超である。
【0088】
肝ミクロソームにおける代謝を測定するための手順：
ヒト、ラット、イヌおよびサル由来の肝ミクロソームを解凍し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。試験化合物および対照を、１：１アセトニトリル：水（ｖ／ｖ）中、１００倍終濃度１μＭで調製し、ミクロソーム混合物に分注した。混合物を、振盪水浴中で３７℃にて１０分間プレインキュベートした。インキュベーションは、二重反復で行った。ワルファリン、フェナセチン、およびベラパミルの３つの対照をインキュベーションに含めた。プレインキュベーション後、反応を終濃度１ｍＭのＮＡＤＰＨで開始した。０、５、１５、３０、４５および６０分において、２５μＬのサンプルを除去し、内部標準（テルミサルタン）を含有するアセトニトリル３００μＬでクエンチした。サンプルを１２００ｒｐｍで５分間ボルテックスし、次いで、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の１００μＬアリコートを水で３倍希釈し、Ｅｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。結果は、残存する親試験化合物のパーセンテージとして報告し、各時点において残存する試験化合物のピーク面積比から算出し、ゼロ時間のインキュベーションと比較した。
ヒト、ラット、イヌおよびサル由来の肝ミクロソームを解凍し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。試験化合物および対照を、１：１アセトニトリル：水（ｖ／ｖ）中、１００倍終濃度１μＭで調製し、ミクロソーム混合物に分注した。混合物を、振盪水浴中で３７℃にて１０分間プレインキュベートした。インキュベーションは、二重反復で行った。ワルファリン、フェナセチン、およびベラパミルの３つの対照をインキュベーションに含めた。プレインキュベーション後、反応を終濃度１ｍＭのＮＡＤＰＨで開始した。０、５、１５、３０、４５および６０分において、２５μＬのサンプルを除去し、内部標準（テルミサルタン）を含有するアセトニトリル３００μＬでクエンチした。サンプルを１２００ｒｐｍで５分間ボルテックスし、次いで、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の１００μＬアリコートを水で３倍希釈し、Ｅｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。結果は、残存する親試験化合物のパーセンテージとして報告し、各時点において残存する試験化合物のピーク面積比から算出し、ゼロ時間のインキュベーションと比較した。
【0089】
結果：
例１は、例６０．２よりもイヌ肝ミクロソームにおいて６倍安定性が高く、例１は、例６０．２よりもサル肝ミクロソームにおいて少なくとも２倍安定性が高い。このデータは、例１は、イヌおよびサルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの代謝に対して、例６０．２よりも有意に安定性が高いはずであることを示唆している。
例１は、例６０．２よりもイヌ肝ミクロソームにおいて６倍安定性が高く、例１は、例６０．２よりもサル肝ミクロソームにおいて少なくとも２倍安定性が高い。このデータは、例１は、イヌおよびサルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの代謝に対して、例６０．２よりも有意に安定性が高いはずであることを示唆している。
【0090】
【表1】
【0091】
ヒト肝細胞における代謝を測定するための手順：
ヒト、サル、イヌ、ラットおよびマウス由来の懸濁液中の凍結保存肝細胞を解凍し、予熱したウィリアム培地Ｅ（ｐＨ７．４）で希釈した。肝細胞懸濁液のアリコートを、予熱したウィリアム培地Ｅ（ｐＨ７．４）中で調製した試験化合物標準溶液に加え、０．５×１０６細胞／ミリリットル中０．５μＭおよび０．２５％以下のＤＭＳＯの終濃度を達成した。これらのサンプルを５％二酸化炭素で３７℃にてインキュベートし、２００ｒｐｍで振り混ぜた。インキュベーションは、１回で行った。０、１０、３０、６０、１２０および２４０分の時点において、インキュベーション混合物の５０μＬアリコートを除去し、内部標準を含有するアセトニトリルの１００μＬ溶液に加え、混合物をボルテックスし、次いで、４℃および３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。実験の完了後、サンプルをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。代謝安定性の結果は、残存する親試験化合物のパーセンテージとして報告した。このパーセンテージは、インキュベーション後（ｔｘ）の試験化合物のピーク面積比を、インキュベーション直前のゼロ時点（ｔ０）における試験化合物のピーク面積比で割ることにより、算出した。
消失速度定数（ｋ、ｍｉｎ－１）は、以下の式に適合する非線形回帰を用いて算出する：
式中、
Ｃ０は、ピーク面積比（試験化合物のピーク面積／内部標準のピーク面積）として表される初濃度であり、
Ｃｔは、面積比（試験化合物のピーク面積／内部標準のピーク面積）として表されるｔにおける濃度であり、
ｅは、自然対数の底であり、
ｔは、時間（分）であり、
ｋは、消失速度定数（ｍｉｎ－１）である。
半減期（ｔ１／２、分）は、以下の式を用いて算出する：
式中、
ｋは、消失速度定数（ｍｉｎ－１）である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ、ｍＬ／分／１００万個の細胞）は、以下の式を用いて算出する：
式中、
ｔ１／２は、半減期であり、
ｎは、ｍＬあたりの細胞の数である。
ヒト、サル、イヌ、ラットおよびマウス由来の懸濁液中の凍結保存肝細胞を解凍し、予熱したウィリアム培地Ｅ（ｐＨ７．４）で希釈した。肝細胞懸濁液のアリコートを、予熱したウィリアム培地Ｅ（ｐＨ７．４）中で調製した試験化合物標準溶液に加え、０．５×１０６細胞／ミリリットル中０．５μＭおよび０．２５％以下のＤＭＳＯの終濃度を達成した。これらのサンプルを５％二酸化炭素で３７℃にてインキュベートし、２００ｒｐｍで振り混ぜた。インキュベーションは、１回で行った。０、１０、３０、６０、１２０および２４０分の時点において、インキュベーション混合物の５０μＬアリコートを除去し、内部標準を含有するアセトニトリルの１００μＬ溶液に加え、混合物をボルテックスし、次いで、４℃および３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。実験の完了後、サンプルをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。代謝安定性の結果は、残存する親試験化合物のパーセンテージとして報告した。このパーセンテージは、インキュベーション後（ｔｘ）の試験化合物のピーク面積比を、インキュベーション直前のゼロ時点（ｔ０）における試験化合物のピーク面積比で割ることにより、算出した。
消失速度定数（ｋ、ｍｉｎ－１）は、以下の式に適合する非線形回帰を用いて算出する：
【数1】
Ｃ０は、ピーク面積比（試験化合物のピーク面積／内部標準のピーク面積）として表される初濃度であり、
Ｃｔは、面積比（試験化合物のピーク面積／内部標準のピーク面積）として表されるｔにおける濃度であり、
ｅは、自然対数の底であり、
ｔは、時間（分）であり、
ｋは、消失速度定数（ｍｉｎ－１）である。
半減期（ｔ１／２、分）は、以下の式を用いて算出する：
【数2】
ｋは、消失速度定数（ｍｉｎ－１）である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ、ｍＬ／分／１００万個の細胞）は、以下の式を用いて算出する：
【数3】
ｔ１／２は、半減期であり、
ｎは、ｍＬあたりの細胞の数である。
【0092】
結果：
ヒト肝細胞における例１の半減期は、４８０分超と算出され、一方、ヒト肝細胞における例６０．２の半減期は、３５０分と算出された。ヒト肝細胞における例６０．２の固有クリアランスは、例１で認められた０．３１２ｍＬ／分／ｇ肝臓のクリアランスより１．５倍速い０．４６５ｍＬ／分／ｇ肝臓である。
ヒト肝細胞における例１の半減期は、４８０分超と算出され、一方、ヒト肝細胞における例６０．２の半減期は、３５０分と算出された。ヒト肝細胞における例６０．２の固有クリアランスは、例１で認められた０．３１２ｍＬ／分／ｇ肝臓のクリアランスより１．５倍速い０．４６５ｍＬ／分／ｇ肝臓である。
【0093】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態パラメータ（ＰＫ）を測定する手順：
雄ＣＤ１マウス、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ系ラット、カニクイザル、およびビーグル犬においてＰＫを検討した。２群の動物（群あたりＮ＝３）が、静脈内（ＩＶ）投与（１ｍｇ／ｋｇ）または強制経口投与（５ｍｇ／ｋｇの溶液および懸濁液）のいずれかで試験化合物の投与を受けた。薬剤は、ＩＶ投与では９０％ＰＥＧ４００、１０％エタノール、ＰＯ投与では９０％ＰＥＧ４００、５％エタノール中で処方された。血液サンプルを、ＩＶでは投与後０．１６７、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２および９６時間に、経口では投与後０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２および９６時間に採取した。血液サンプルをＫ３ＥＤＴＡチューブに採取し、１５００～２０００×ｇで遠心分離して、血漿を得た。血漿サンプルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析まで－２０℃で保存した。総てのｉｎ ｖｉｖｏサンプルを、カラムが６０℃に維持され、流速が０．６ｍＬ／分であったＥｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。総てのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析パラメータは、生データファイルに電子的に取り込まれている。ラットＩＶ、イヌＩＶ、サルＩＶ、サルＰＯのＰＫサンプルは、一般的分析法Ａにより分析した。マウスＩＶ、マウスＰＯ、およびイヌＰＯのＰＫサンプルは、一般的分析法Ｂにより分析した。ラットＰＯサンプルは、一般的分析法Ｃにより分析した。
雄ＣＤ１マウス、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ系ラット、カニクイザル、およびビーグル犬においてＰＫを検討した。２群の動物（群あたりＮ＝３）が、静脈内（ＩＶ）投与（１ｍｇ／ｋｇ）または強制経口投与（５ｍｇ／ｋｇの溶液および懸濁液）のいずれかで試験化合物の投与を受けた。薬剤は、ＩＶ投与では９０％ＰＥＧ４００、１０％エタノール、ＰＯ投与では９０％ＰＥＧ４００、５％エタノール中で処方された。血液サンプルを、ＩＶでは投与後０．１６７、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２および９６時間に、経口では投与後０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２および９６時間に採取した。血液サンプルをＫ３ＥＤＴＡチューブに採取し、１５００～２０００×ｇで遠心分離して、血漿を得た。血漿サンプルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析まで－２０℃で保存した。総てのｉｎ ｖｉｖｏサンプルを、カラムが６０℃に維持され、流速が０．６ｍＬ／分であったＥｘｉｏｎ ＬＣ ４５００ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ（商標）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。総てのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析パラメータは、生データファイルに電子的に取り込まれている。ラットＩＶ、イヌＩＶ、サルＩＶ、サルＰＯのＰＫサンプルは、一般的分析法Ａにより分析した。マウスＩＶ、マウスＰＯ、およびイヌＰＯのＰＫサンプルは、一般的分析法Ｂにより分析した。ラットＰＯサンプルは、一般的分析法Ｃにより分析した。
【0094】
ＰＫパラメータは、血漿中濃度対時間データ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖ８．１）のノンコンパートメント解析により得た。ピーク濃度（Ｃｍａｘ）およびＣｍａｘ到達時間（Ｔｍａｘ）を、実験的観察から直接記録した。ゼロ時間から最終サンプリング時間までの曲線下面積［ＡＵＣ０－Ｔ］およびゼロ時間から無限時間までの曲線下面積［ＡＵＣＩＮＦ］を、線形対数台形法を用いて算出した。全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）、定常状態分布容積（Ｖｓｓ）、見かけの消失半減期（Ｔ－ＨＡＬＦ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ）を、ＩＶ投与後に推定した。ＡＵＣおよびＴ－ＨＡＬＦの推定は、定量可能濃度を有する最低３つの時点時点を用いて行った。絶対経口バイオアベイラビリティ（Ｆ）は、経口投与およびＩＶ投与後の用量補正ＡＵＣ値の比として推定した。
【0095】
結果：
例１および例６０．２のＩＶ薬物動態（ＰＫ）パラメータを、４つの前臨床種：マウス、ラット、イヌおよびサルにおいて測定した。例１は、例６０．２と比較して、全４種において改善したクリアランスを示した。上記の肝ミクロソームアッセイの結果と一致して、クリアランスの差は、イヌおよびサルで最も有意であり、クリアランスがそれぞれ４．９倍および２．６倍改善した。同様に、イヌおよびサルにおける循環中の例１の半減期は、それぞれ例６０．２よりも３．４倍および２倍高かった。
例１および例６０．２のＩＶ薬物動態（ＰＫ）パラメータを、４つの前臨床種：マウス、ラット、イヌおよびサルにおいて測定した。例１は、例６０．２と比較して、全４種において改善したクリアランスを示した。上記の肝ミクロソームアッセイの結果と一致して、クリアランスの差は、イヌおよびサルで最も有意であり、クリアランスがそれぞれ４．９倍および２．６倍改善した。同様に、イヌおよびサルにおける循環中の例１の半減期は、それぞれ例６０．２よりも３．４倍および２倍高かった。
【0096】
【表2】
【0097】
【表3】
【0098】
予定された薬剤がヒト臨床試験に入ることができる前に、化合物の安全性を一般に、２つの前臨床種：１種は齧歯類、１種は非齧歯類において評価すべきである。これらの種は通常、ラット、およびイヌまたはサルのいずれかである。ｉｎ ｖｉｖｏ安全性試験の１つの目的は、ヒトが有効量の薬物を投与された場合に予想される濃度よりも数倍高い循環中の薬物の濃度を達成することである。安全性試験において達成された薬物濃度と有効量の薬物を服用するヒトにおいて予想される薬物濃度との間の倍数差は、「マージン」という。マージンが増加するにつれて、薬物関連有害事象が生じ得るならば、それが前臨床安全性評価中に観察されるであろうという信頼度が高くなることから、安全性試験において高いマージンを達成することが重要である。
【0099】
ラット、イヌまたはサルにおける改善されたＰＫパラメータは、これらの前臨床種に関して、循環中の薬物の高濃度を達成するためには、より低用量の化合物が必要であることを意味する。したがって、例１の用量を投与されたサルまたはイヌは、同じサイズの用量の例６０．２を投与された場合よりも高いマージンを達成すると思われる。用量サイズの実施上の制約のために、非齧歯類安全性評価試験において例１で達成され得るマージン（およびしたがって信頼度）は、例６０．２で達成され得るマージンより高い。
【0100】
ヒトにおける用量の予測を提供するための前臨床ＰＫパラメータのアロメトリックスケーリングの手順：
Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ｖ８．０）ソフトウェア、および母集団モデリングのためのＭｏｄｅｌＲｉｓｋアドインを使用したＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて、ヒト用量予測を行った。各化合物のＣＬＴｐに対するヒト推定値を、マウス、ラット、サルおよびイヌＩＶデータの平均アロメトリックスケーリング（体重スケーリング因子０．７５）およびＶｓｓに関する全種の平均（体重スケーリング因子１．０）に基づいて得た。ヒトＶｓｓおよびＣＬＴｐ推定値を使用した前臨床種（マウス、ラット、イヌおよびカニクイザル）からの平均滞留時間（ＭＲＴ）スケーリングを用いて、ヒトＩＶパラメータ（Ｖｃ、Ｋａ、Ｋ１２、Ｋ２１、Ｋｅｌ）を決定した。吸収（Ｋａ）を、デコンボリューション（ＰＯ）により、または前臨床種における半減期（ＳＣ）から決定した（Ｋａ＝ＬＮ（２）／ｔ１／２）。ＰＯおよびＳＣに関する予測ヒト用量は、ヒトのばらつきを考慮して算出し、ヒト集団の９５％を網羅するように算出する。
Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ｖ８．０）ソフトウェア、および母集団モデリングのためのＭｏｄｅｌＲｉｓｋアドインを使用したＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて、ヒト用量予測を行った。各化合物のＣＬＴｐに対するヒト推定値を、マウス、ラット、サルおよびイヌＩＶデータの平均アロメトリックスケーリング（体重スケーリング因子０．７５）およびＶｓｓに関する全種の平均（体重スケーリング因子１．０）に基づいて得た。ヒトＶｓｓおよびＣＬＴｐ推定値を使用した前臨床種（マウス、ラット、イヌおよびカニクイザル）からの平均滞留時間（ＭＲＴ）スケーリングを用いて、ヒトＩＶパラメータ（Ｖｃ、Ｋａ、Ｋ１２、Ｋ２１、Ｋｅｌ）を決定した。吸収（Ｋａ）を、デコンボリューション（ＰＯ）により、または前臨床種における半減期（ＳＣ）から決定した（Ｋａ＝ＬＮ（２）／ｔ１／２）。ＰＯおよびＳＣに関する予測ヒト用量は、ヒトのばらつきを考慮して算出し、ヒト集団の９５％を網羅するように算出する。
【0101】
結果：
前臨床種ＰＫパラメータは、ヒト臨床試験の前にヒトＰＫパラメータを予測するために一般に使用される。この予測(predication)に使用される方法は、「アロメトリックスケーリング」と呼ばれ、文献において一般に考察および実施されている。アロメトリックスケーリングを用いると、ヒトにおける薬物の有効な血漿中濃度を維持するのに必要な予測１日１回経口用量は、例１で例６０．２よりも７倍低い。具体的には、例１の予測ヒトＱＤ ＰＯ用量は１０ｍｇ未満であり、一方、例６０．２の予測ヒトＱＤ ＰＯ用量は３０ｍｇ超である。
前臨床種ＰＫパラメータは、ヒト臨床試験の前にヒトＰＫパラメータを予測するために一般に使用される。この予測(predication)に使用される方法は、「アロメトリックスケーリング」と呼ばれ、文献において一般に考察および実施されている。アロメトリックスケーリングを用いると、ヒトにおける薬物の有効な血漿中濃度を維持するのに必要な予測１日１回経口用量は、例１で例６０．２よりも７倍低い。具体的には、例１の予測ヒトＱＤ ＰＯ用量は１０ｍｇ未満であり、一方、例６０．２の予測ヒトＱＤ ＰＯ用量は３０ｍｇ超である。
【0102】
薬物特異体質反応（すなわち、過敏性反応）は、予測不可能であり、性質上深刻なものであるため、重大な臨床的問題を呈するが、１日量１０ｍｇ以下で投与される薬剤は、薬物特異体質反応の高い発現率と関連するとしてもまれであることが述べられている(Uetrecht, J. P. New Concepts in Immunology Relevant to Idiosyncratic Drug Reactions: The “Danger Hypothesis” and Innate Immune System. Chem. Res. Toxicol. 1999, 12(5), 387-395, DOI:10.1021/tx980249i)。
【0103】
皮下ｉｎ ｖｉｖｏ実験における薬物動態パラメータを測定する手順：
薬剤を、１％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８／１％ＰＥＧ３３５０／３．５％マンニトール／９４．５％水中で処方し、次いで、２０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射としてＷｉｓｔａｒ Ｈａｎ系ラットに投与した。血液サンプルを、０．１６７、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２、９６時間に、次いで３日毎に最大１２２日間採取した。血液サンプルをＫ３ＥＤＴＡチューブに採取し、１５００～２０００×ｇで遠心分離して、血漿を得た。血漿サンプルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析まで－２０℃で保存した。
薬剤を、１％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８／１％ＰＥＧ３３５０／３．５％マンニトール／９４．５％水中で処方し、次いで、２０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射としてＷｉｓｔａｒ Ｈａｎ系ラットに投与した。血液サンプルを、０．１６７、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、５、７、２４、４８、７２、９６時間に、次いで３日毎に最大１２２日間採取した。血液サンプルをＫ３ＥＤＴＡチューブに採取し、１５００～２０００×ｇで遠心分離して、血漿を得た。血漿サンプルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析まで－２０℃で保存した。
【0104】
結果：
皮下（ＳＣ）投与に対する各化合物の適合性を、ラットＳＣ ＰＫ実験において評価した。この実験で決定されたように、血漿中の化合物の見かけの半減期は、例１で１３日、例６０．２で１１．５日であった。例１のＡＵＣ０－ｉｎｆｉｎｉｔｙは、４，９４１日＊ｎｇ／ｍＬ（外挿されたＡＵＣの２．８９％）であった。例６０．２のＡＵＣ０－ｉｎｆｉｎｉｔｙは、６０９日＊ｎｇ／ｍＬ（外挿されたＡＵＣの１２．８％）であった。バイオアベイラビリティは、例１で９３％、例６０．２で２５％であった。薬物濃度は、例１で７３日間、例６０．２で２４日間、全動物に関して７ｎｇ／ｍＬ超に維持された（図１）。アロメトリックスケーリングから導出した予測ヒトクリアランス値とともに、ＳＣラットＰＫから導出した見かけの半減期およびバイオアベイラビリティを用いて、ヒトの予測月１回皮下（Ｑ１Ｍ ＳＣ）用量を算出した。ヒトにおける薬物の有効な血漿中濃度を維持するのに必要な予測Ｑ１Ｍ ＳＣ用量は、例１で例６０．２よりも１５倍低い。
皮下（ＳＣ）投与に対する各化合物の適合性を、ラットＳＣ ＰＫ実験において評価した。この実験で決定されたように、血漿中の化合物の見かけの半減期は、例１で１３日、例６０．２で１１．５日であった。例１のＡＵＣ０－ｉｎｆｉｎｉｔｙは、４，９４１日＊ｎｇ／ｍＬ（外挿されたＡＵＣの２．８９％）であった。例６０．２のＡＵＣ０－ｉｎｆｉｎｉｔｙは、６０９日＊ｎｇ／ｍＬ（外挿されたＡＵＣの１２．８％）であった。バイオアベイラビリティは、例１で９３％、例６０．２で２５％であった。薬物濃度は、例１で７３日間、例６０．２で２４日間、全動物に関して７ｎｇ／ｍＬ超に維持された（図１）。アロメトリックスケーリングから導出した予測ヒトクリアランス値とともに、ＳＣラットＰＫから導出した見かけの半減期およびバイオアベイラビリティを用いて、ヒトの予測月１回皮下（Ｑ１Ｍ ＳＣ）用量を算出した。ヒトにおける薬物の有効な血漿中濃度を維持するのに必要な予測Ｑ１Ｍ ＳＣ用量は、例１で例６０．２よりも１５倍低い。
【0105】
凍結保存ヒト肝細胞におけるシトクロムＰ４５０誘導を測定する手順：
ＦＤＡのガイダンス（「ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝およびトランスポーターを介した薬物間相互作用試験の業界向けガイダンス(In Vitro Metabolism- and Transporter- Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry)」）に従い、例１および例６０．２が、ＣＹＰ２Ｂ６発現を誘導する能力を、同じ３例の個々のドナー（プールドナーではなく）由来の肝細胞を用いて試験し、酵素ｍＲＮＡレベルの変化を、「倍率変化法」を用いて評価した。この試験において、２倍未満のｍＲＮＡレベルの倍率変化を陰性所見とみなし、一方、２倍以上の変化を陽性所見とみなす。
ＦＤＡのガイダンス（「ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝およびトランスポーターを介した薬物間相互作用試験の業界向けガイダンス(In Vitro Metabolism- and Transporter- Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry)」）に従い、例１および例６０．２が、ＣＹＰ２Ｂ６発現を誘導する能力を、同じ３例の個々のドナー（プールドナーではなく）由来の肝細胞を用いて試験し、酵素ｍＲＮＡレベルの変化を、「倍率変化法」を用いて評価した。この試験において、２倍未満のｍＲＮＡレベルの倍率変化を陰性所見とみなし、一方、２倍以上の変化を陽性所見とみなす。
【0106】
ＣＹＰ２Ｂ６の誘導（ｍＲＮＡ転写の増加により測定）を引き起こす能力を判定するために、３例のドナー由来の誘導性凍結保存ヒト初代肝細胞を用いたＣＹＰ誘導アッセイにおいて、化合物を試験した。種々のＣＹＰ酵素の発現レベルの調節に関与する総ての核内受容体を天然に発現する初代ヒト肝細胞とともに、試験化合物（終濃度０．１２～３０μＭ）を４８時間インキュベートした。試験化合物および対照の新鮮溶液をアッセイ培地で希釈し、２４時間毎に２日連続で加え、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％とした。インキュベーションの終了時に、細胞毒性作用を評価するために、細胞単層の完全性、細胞密度および生存率を評価した。次いで、細胞を細胞溶解バッファーで可溶化し、全ＲＮＡを各アッセイサンプルから精製した。次いで、サンプルを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）において使用し、ヒトＣＹＰ２Ｂ６遺伝子をコードする特異的ｍＲＮＡ種の量を定量化した。
【0107】
試験化合物および対照の誘導能を、既知のＣＹＰ２Ｂ６誘導物質フェノバルビタール（１０００μＭ）と比較した。このアッセイの結果は、誘導倍率として表す。誘導倍率は、ＤＭＳＯ（溶媒対照）単独で処理した細胞におけるｍＲＮＡレベル、すなわち基礎ｍＲＮＡレベルに対する、試験化合物で処理した細胞におけるｍＲＮＡレベルの比として算出し、よって、試験化合物の誘導能を表す。誘導倍率値を用いて、対照活性値のパーセントを算出し、次いでこれを４パラメータロジスティック回帰モデルに当てはめ、ＥＣ５０およびＥｍａｘの値（誘導が観察された場合）を決定した。細胞毒性に起因する偽陽性のＣＹＰ誘導の結果を回避するために、細胞毒性も並行して評価した。細胞毒性濃度でのＣＹＰ誘導能の評価および解釈は避けるべきである。
【0108】
結果：
試験したいずれの濃度（最大３０μＭ）のいずれの化合物においても、細胞毒性は認められなかった。例１では、全３例のドナーにおいて陰性所見（誘導なし）が認められた。例６０．２では、３例のドナー中２例において、陽性所見（誘導）が認められた（１．５μＭおよび１．８μＭのＥＣ５０値）。
試験したいずれの濃度（最大３０μＭ）のいずれの化合物においても、細胞毒性は認められなかった。例１では、全３例のドナーにおいて陰性所見（誘導なし）が認められた。例６０．２では、３例のドナー中２例において、陽性所見（誘導）が認められた（１．５μＭおよび１．８μＭのＥＣ５０値）。
【0109】
ＣＹＰ酵素発現の誘導は、誘導されたＣＹＰアイソフォームにより代謝が支配される犠牲薬のクリアランス増加に至る、薬物間相互作用の根本原因として認識されている。ＣＹＰアイソフォームのうち、ＣＹＰ２Ｂ６がＨＩＶ治療の文脈において特に重要であるが、その理由は、ＨＩＶの治療に広く使用される薬剤であるエファビレンツ（ＥＦＶ）（２０１９年世界保健機関必須医薬品リストに含まれる）は、ＣＹＰ２Ｂ６により主に代謝されるからである(Ward, B. A., Gorski, J. C., Jones, D. R., Hall, S. D., Flockhard, D. A., Desta, Z. The Cytochrome P450 2B6 (CYP2B6) Is the Main Catalyst of Efavirenz Primary and Secondary Metabolism: Implication for HIV/AIDS Therapy and Utility of Efavirenz as a Substrate Marker of CYP2B6 Catalytic Activity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 287-300, DOI: 10.1124/jpet.103.049601)。
【図1】
【国際調査報告】