特表 2022-537136 生物学的に封じ込められた細菌及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-24

(54)【発明の名称】生物学的に封じ込められた細菌及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20220817BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20220817BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220817BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20220817BHJP

   A61K 35/742 20150101ALI20220817BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20220817BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220817BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20220817BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20220817BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N15/31

C07K19/00

C12N15/62 Z

A61K35/74 Z

A61K35/742

A61K35/741

A61P43/00 105

C07K14/195

C12R1:01

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021573317

(86)(22)【出願日】2020-06-12

(85)【翻訳文提出日】2022-02-03

(86)【国際出願番号】 US2020037571

(87)【国際公開番号】W WO2020252370

(87)【国際公開日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】62/861,181

(32)【優先日】2019-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521254432

【氏名又は名称】ノヴォム バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＯＭＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】１００ Ｋｉｍｂａｌｌ Ｗａｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ ９４０８０，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000202

【氏名又は名称】新樹グローバル・アイピー特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ウィテカー，ウェストン ロバート

(72)【発明者】

【氏名】デローチ，ウィリアム ケイン

(72)【発明者】

【氏名】ラス フォー，ザカリー ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】シェパード，エリザベス ジョイ スタンリー

(72)【発明者】

【氏名】ポポフ，ローレン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065BB18

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC31

4C087BC53

4C087BC54

4C087BC55

4C087BC68

4C087BC74

4C087CA08

4C087CA12

4C087MA35

4C087MA37

4C087NA14

4C087ZB21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045EA65

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、意図される場合に改変細胞の生存及び複製を可能にする一方、改変細胞がそれらの意図される環境からエスケープすることを防止する生物学的封じ込め方法及び機構を提供する。これは、改変細胞の生存能を、外因的に供給される制御分子の存在に連結して、細胞が増殖することができる位置及び時間を規定することによって達成される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子改変細菌であって、
（ａ）制御分子によって活性化される第１のアクチベーターと；
（ｂ）前記第１のアクチベーターによって活性化される第１のプロモーターと；
（ｃ）前記第１のプロモーターに作動可能に連結されている第１の必須遺伝子と、任意に、
（ｄ）前記制御分子によって活性化される第２のアクチベーターと；
（ｅ）前記第２のアクチベーターによって活性化される第２のプロモーターと；
（ｆ）前記第２のプロモーターに作動可能に連結されている第２の必須遺伝子と
を含む遺伝子改変細菌。

【請求項2】

前記第１のプロモーターは、前記第２のアクチベーターによって活性化されず、及び前記第２のプロモーターは、前記第１のアクチベーターによって活性化されない、請求項１に記載の細菌。

【請求項3】

（ｇ）前記制御分子によって活性化される第３のアクチベーターと；
（ｈ）前記第３のアクチベーターによって活性化される第３のプロモーターと；
（ｉ）前記第３のプロモーターに作動可能に連結されている第３の必須遺伝子と
をさらに含む、請求項１に記載の細菌。

【請求項4】

前記第３のプロモーターは、前記第１又は第２のアクチベーターによって活性化されず、及び前記第３のプロモーターは、前記第１又は第２のアクチベーターによって活性化されない、請求項３に記載の細菌。

【請求項5】

前記第１、第２及び／又は第３の必須遺伝子の発現は、前記制御分子の存在に依存する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項6】

前記細菌の増殖及び／又は生存能は、前記制御分子の存在に依存する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項7】

前記制御分子は、ヒト食餌中において定期的に存在しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項8】

前記制御分子は、単糖又は多糖である、請求項１～７のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項9】

前記制御分子は、海洋多糖及び抗生物質又はその誘導体から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項10】

前記海洋多糖は、ポルフィラン及びアガロースから選択される、請求項９に記載の細菌。

【請求項11】

前記抗生物質又はその誘導体は、アンヒドロテトラサイクリンである、請求項９に記載の細菌。

【請求項12】

前記第１、第２及び／又は第３のアクチベーターは、センサードメイン及び調節ドメインを含む２成分系（ＴＣＳ）タンパク質である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項13】

前記第１、第２及び／又は第３のアクチベーターは、センサードメイン及び調節ドメインを含むハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）タンパク質である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項14】

前記ＨＴＣＳタンパク質は、天然に存在するＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは改変体である、請求項１３に記載の細菌。

【請求項15】

前記ＨＴＣＳタンパク質は、キメラＨＴＣＳタンパク質であり、前記センサードメインは、第１の天然に存在するＨＴＣＳタンパク質由来のセンサードメイン又はその機能的断片若しくは改変体であり、及び前記調節ドメインは、第２の天然に存在するＨＴＣＳタンパク質由来の調節ドメイン又はその機能的断片若しくは改変体である、請求項１３に記載の細菌。

【請求項16】

前記天然に存在するＨＴＣＳタンパク質は、細菌ＨＴＣＳタンパク質である、請求項１４又は１５に記載の細菌。

【請求項17】

前記細菌ＨＴＣＳタンパク質は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＨＴＣＳタンパク質である、請求項１６に記載の細菌。

【請求項18】

前記バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＨＴＣＳタンパク質は、バクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、バクテロイデス・ドレイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ）、バクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）、バクテロイデス・サリエルシアエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）又はバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＨＴＣＳタンパク質である、請求項１７に記載の細菌。

【請求項19】

前記ＨＴＣＳタンパク質は、配列番号１９、２３、２５、３８、３９、４２、４３、５１、５２、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項20】

前記第１、第２及び／又は第３のアクチベーターをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項21】

前記第１、第２及び／又は第３のプロモーターは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１１、１２、１３、４５、４６、６２、６３若しくは７３のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項22】

前記必須遺伝子は、チミジル酸シンターゼ（ＴｈｙＡ）、アルギニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａｒｇＳ）、システイニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ｃｙｓＳ）、ペニシリン耐性タンパク質（ｌｙｔＢ）及びペプチド鎖放出因子（ＲＦ－２）から選択される、請求項２１に記載の細菌。

【請求項23】

前記第１、第２及び／又は第３のアクチベーター及び／又はプロモーターは、前記細菌に対して異種である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項24】

前記第１、第２及び／又は第３の遺伝子は、改変されていない類似の又はさもなければ同一の細菌において、それぞれ前記第１、第２及び／又は第３のプロモーターに作動可能に連結されない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項25】

前記細菌の培養は、前記制御分子の非存在下で１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８又は１０^－９未満の頻度において増殖及び／又は生存可能な細菌をもたらす、請求項１～２４のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項26】

前記細菌と前記制御分子との培養及びその後の培地からの前記制御分子の除去後、培地中の前記細菌の半減期は、１日未満である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項27】

対象への前記細菌及び制御分子の投与後、前記対象における細菌の量は、前記対象からの前記制御分子の除去又は停止から２日以内に１０倍低下する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項28】

前記制御分子は、ポルフィランであり、且つ前記第１及び第２のアクチベーターは、それぞれＨＴＣＳタンパク質であり、及び（ｉ）前記ポルフィランは、存在する場合、前記第１及び第２のＨＴＣＳタンパク質を活性化し、（ｉｉ）前記第１及び第２のＨＴＣＳタンパク質は、活性化される場合、それぞれ前記第１及び第２のプロモーターを活性化し、及び（ｉｉｉ）前記第１及び第２のプロモーターは、活性化される場合、それぞれ前記第１及び第２の必須遺伝子の発現を指示し、それにより、前記ポルフィランの存在に依存する前記細菌の前記増殖及び／又は生存能をもたらす、請求項１～２７のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項29】

共生細菌である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項30】

バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）、ジェミガー（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）、バルネシエラ（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、パラステレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ファスコラークトバクテリウム（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サテレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オドリバクター（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）及びアッケルマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）からなる群から選択される属のものである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項31】

前記属は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）である、請求項３０に記載の細菌。

【請求項32】

ＳｕｓＣ及びＳｕｓＤから選択される、タンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子又はその機能的断片若しくは改変体をさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項33】

炭素源として優先栄養素を利用する前記細菌の能力を増加させる１つ以上の導入遺伝子を含む、請求項３２に記載の細菌。

【請求項34】

前記優先栄養素は、海洋多糖である、請求項３３に記載の細菌。

【請求項35】

前記海洋多糖は、ポルフィランである、請求項３４に記載の細菌。

【請求項36】

１つ以上の治療的導入遺伝子をさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項37】

前記治療的導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３６に記載の細菌。

【請求項38】

前記プロモーターは、非天然プロモーターである、請求項３７に記載の細菌。

【請求項39】

前記プロモーターは、ファージ由来プロモーターである、請求項３７又は３８に記載の細菌。

【請求項40】

前記プロモーターは、コンセンサス配列ＧＴＴＡＡ（ｎ）_４～７ＧＴＴＡＡ（ｎ）_{３４～３８}ＴＡ（ｎ）_２ＴＴＴＧを含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項41】

前記プロモーターは、配列番号４８、配列番号４９又は配列番号５０を含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項42】

前記導入遺伝子のいずれかは、プラスミド上にあり、細菌人工染色体上にあり、且つ／又は遺伝的に統合されている、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の細菌。

【請求項43】

請求項１～４２のいずれか一項に記載の細菌と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項44】

カプセル又は錠剤として処方される、請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

前記カプセルは、腸溶性カプセルである、請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

前記制御分子をさらに含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項47】

制御分子の非存在下で細菌の増殖及び／又は生存能を低下させる方法であって、前記細菌を、
（ａ）前記制御分子によって活性化される第１のアクチベーターと；
（ｂ）前記第１のアクチベーターによって活性化される第１のプロモーターと；
（ｃ）前記第１のプロモーターに作動可能に連結されている第１の必須遺伝子と
を含むように遺伝的に改変することを含む方法。

【請求項48】

前記細菌を、
（ｄ）前記制御分子によって活性化される第２のアクチベーターと；
（ｅ）前記第２のアクチベーターによって活性化される第２のプロモーターと；
（ｆ）前記第２のプロモーターに作動可能に連結されている第２の必須遺伝子と
を含むように遺伝的に改変することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記細菌を、
（ｇ）前記制御分子によって活性化される第３のアクチベーターと；
（ｈ）前記第３のアクチベーターによって活性化される第３のプロモーターと；
（ｉ）前記第３のプロモーターに作動可能に連結されている第３の必須遺伝子と
を含むように遺伝的に改変することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

対象の腸をコロニー形成する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載の細菌又は請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項51】

疾患又は障害の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載の細菌又は請求項４３～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項52】

前記制御分子を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５０又は５１に記載の方法。

【請求項53】

前記制御分子は、前記細菌の前に、前記細菌と同時に又は前記細菌の後に前記対象に投与される、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記細菌又は医薬組成物は、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月又は６ヵ月毎に前記対象に投与される、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記対象への前記細菌又は医薬組成物の連続投与間の時間は、約１日である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記対象は、動物である、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象は、ヒトである、請求項５６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年６月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／８６１，１８１号明細書の利益及びそれに対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

細胞に基づく治療法は、空間的及び時間的特異性、論理及び新しい活動が必要とされる疾患において、従来の低分子及びタンパク質に基づく治療法を補完する新たなアプローチであるが、細胞全体を遺伝子工学的に操作することによってのみ開発可能である。細胞に基づく治療法に特有の課題は、治療機能を妨げないが、規定された時間及び空間に生存を制限し得る方法で治療細胞の複製を制御することである。生物学的封じ込めは、遺伝的に改変された細胞治療法の必要な特徴であり、この操作により、治療細胞は、意図された位置及び／又は持続時間外で複製できないように改変される。意図された治療期間を超えて持続するか、又は環境若しくは他の人にエスケープする治療薬は、対処しなければならないリスクとなる。

【0003】

適合性の不利、例えば実験室でのみ補完できる栄養素要求性を付与する導入された変異は、生物学的封じ込めの有効な手段を提供する。しかしながら、多くの適用のために、例えば病原性微生物を克服するか又は効力に必要な存在量に達するために、細胞治療薬が患者において生存可能であることが必要であろう。インビボでの細胞の制御可能な増殖を可能にするために、容易に制御可能な環境シグナル、典型的には小分子の存在に生存能を依存させる多数の戦略が考案されている。しかしながら、今日までに発表されたほとんどの生物学的封じ込め方法は、制御分子の存在下で細胞を殺傷する手段として誘導される毒素を利用する。このアプローチには、２つの欠点がある。第１に、これらの生物学的に封じ込めされた細胞のデフォルト状態は、生存であり、これは、クリアランスが必要である場合、制御分子に能動的に曝露されない細胞のいずれも持続し続けることを意味する。患者からの完全なクリアランスは、１００％の治療細胞が適切な濃度の制御分子と接触することを必要とし、これは、実際には達成することが困難である。これは、排出率が高く、ヒトからヒトへの伝播が可能である細菌治療に関連して特に問題である。

【0004】

毒素依存性生物学的封じ込め方法の第２の欠点は、毒素遺伝子を無効にする任意の変異（例えば、ナンセンス変異、トランスポゾン挿入など）が生物学的封じ込め戦略を破壊するため、細胞がエスケープできる頻度が高いことである。エスケープ率を低下させるために、毒素の複数のコピーをコードすることができ、それによりエスケープに複数の変異が必要となるが、これは、単一の変異よりも頻度が低いであろう。この冗長性は、エスケープ率を問題なく低下させるが（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，１８０３－１８０８；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＮＡＴ．ＣＨＥＭ．ＢＩＯＬ．１２，８２－８６；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．４３，１９４５－１９５４）、可動遺伝因子は、非モデル生物で一般的であり、複製が誘導されると、高頻度で複数の場所に挿入することが可能である。機能喪失変異が生物学的封じ込めを破壊するあらゆる戦略（毒素に依存する全ての戦略を含む）は、この基本的な限界に直面している。

【0005】

毒素を使用する代わりに、他のものは、制御分子の存在を必須遺伝子の発現に連結するための戦略を記載しており、ここで、制御分子の非存在下では、必須遺伝子は、産生されず、細胞は、もはや生存可能ではない。この戦略は、細胞のデフォルト状態が死であり、それらが生きたままであるために制御分子を能動的に供給されなければならないため、株脱落に関する懸念を回避する。

【0006】

さらに、毒素とは対照的に、必須遺伝子を非機能的にする変異は、生物学的封じ込めからのエスケープの代わりに生存能の喪失をもたらすであろう。しかしながら、今日までに記載されている多くの誘導可能な生存能戦略について、生物学的封じ込めは、制御分子の非存在下で発現をブロックする転写リプレッサーに依存する。毒素に基づく戦略と同様に、リプレッサーに基づく生物学的封じ込めは、リプレッサーが機能することを妨げ、それにより必須遺伝子の恒常的な発現をもたらす機能喪失変異によって容易に破壊することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従って、当技術分野では、エスケープ頻度を低減又は排除する新しい生物学的封じ込め戦略が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、一つには、組換え細菌の生物学的封じ込めのために必須遺伝子の発現を活性化するための活性化剤の使用に関する。 上述したように、リプレッサーは、リプレッサーが機能しないようにする機能喪失変異で容易に破壊され、したがって必須遺伝子の構成的発現を生じさせることができるが、アクチベーターに対する最も一般的な変異は、いかなる条件下でも必須遺伝子発現を生じさせず、したがって逃避しにくいであろうこととは対照的である。

【0009】

しかし、生物学的封じ込めにアクチベーターを使用する場合の１つの課題は、リプレッサーの追加コピーを含むとエスケープ頻度がある程度減少するリプレッサーとは異なり、アクチベーターのエスケープ変異体は優性である（生物学的封じ込めを破壊するために構成的に活性になるには１コピーのみが変異する必要がある）。したがって、活性化因子のコピーを追加しても、脱出の頻度を減らすことはできない。

【0010】

本明細書に開示されるのは、活性剤に基づく生物学的封じ込めを覆す稀な率を利用しつつ、小分子感知二成分系（ＴＣＳ）を必須遺伝子の発現を制御するように方向転換することによって、冗長性の効果を低減する優性活性剤変異の問題を回避する生物学的封じ込めの方法及び組成物である。このように操作された腸内細菌の治療株は、患者がＴＣＳによって感知された制御分子を摂取すると腸内で繁殖することができるが、制御分子が摂取されない場合または制御分子を欠く他の環境では患者において繁殖することができない。本開示は、任意の生物においてこの戦略を実施するための組成物および方法を提供し、バクテロイデス属の腸内細菌の種においてポルフィラン依存性生物学的封じ込めを実施する複数の実施例を含む。

【0011】

１つの局面において、本開示は、制御分子によって活性化される第１の活性化因子、第１の活性化因子によって活性化される第１のプロモーターおよび第１のプロモーターに作動可能に連結される第１の必須遺伝子を含む遺伝子組み換え細菌に関連する。特定の実施形態では、細菌は、制御分子によって活性化される第２の活性化因子、第２の活性化因子によって活性化される第２のプロモーターおよび第２のプロモーターに作動可能に連結されている第２の必須遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、第１のプロモーターは、第２の活性化因子によって活性化されず、第２のプロモーターは、第１の活性化因子によって活性化されない。

【0012】

特定の実施形態では、細菌は、制御分子によって活性化される第３の活性化因子、第３の活性化因子によって活性化される第３のプロモーターおよび第３のプロモーターに作動可能に連結されている第３の必須遺伝子をさらに含む。特定の実施形態において、第３のプロモーターは、第１または第２の活性化因子によって活性化されず、第１または第２のプロモーターは、第３の活性化因子によって活性化されない。

【0013】

特定の実施形態において、第１、第２及び／又は第３の必須遺伝子の発現は、制御分子の存在に依存する。特定の実施形態では、細菌の成長および／または生存率は、制御分子の存在に依存する。特定の実施形態では、対照分子は、ヒトの食事に定期的に存在しない。特定の実施形態では、制御分子は、単糖類または多糖類、例えば、海洋多糖類または抗生物質、または前述のいずれかの誘導体である。特定の実施形態において、海洋多糖類は、ポルフィランもしくはアガロース、または前述のいずれかの誘導体である。特定の実施形態では、抗生物質は、アンヒドロテトラサイクリンまたはその誘導体である。

【0014】

特定の実施形態において、第１、第２及び／又は第３の活性化剤は、センサードメインと調節ドメインとを含む２成分系（ＴＣＳ）タンパク質である。特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３の活性化剤は、センサードメインと調節ドメインとを含むハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）タンパク質である。

【0015】

特定の実施形態では、ＨＴＣＳタンパク質は、天然に存在するＨＴＣＳタンパク質、又はその機能的断片若しくはバリアントである。例えば、天然に存在するＨＴＣＳタンパク質は、細菌ＨＴＣＳタンパク質、例えば、バクテロイデス（例えば、バクテロイデス・オバータス、バクテロイデス・ドレイ、バクテロイデス・ノルディ、バクテロイデス・サリエルシエ、又はバクテロイデス・ユニフォルミス）ＨＴＣＳタンパク質とすることができる。

【0016】

特定の実施形態において、ＨＴＣＳタンパク質は、キメラＨＴＣＳタンパク質であり、センサードメインは、第１の天然に存在するＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは変種からのセンサードメインであり、調節ドメインは、第２の天然に存在するＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは変種からの調節ドメインである。

【0017】

特定の実施形態では、ＨＴＣＳタンパク質は、配列番号１９、２３、２５、３８、３９、４２、４３、５１、５２、５３、５４、５９又は６４～７１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的フラグメントもしくは変異体を含んでいる。

【0018】

特定の実施形態において、細菌は、第１、第２及び／又は第３の活性化剤をコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含む。

【0019】

特定の実施形態では、第１、第２および／または第３のプロモーターは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１１、１２、１３、４５、４６、６２、６３または７３のいずれか１つ、またはその機能的断片もしくは変異体、例えば配列番号４４に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列から構成される。

【0020】

特定の実施形態では、必須遺伝子は、チミジル酸合成酵素（ＴｈｙＡ）、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素（ａｒｇＳ）、システイニルｔＲＮＡ合成酵素（ｃｙｓＳ）、ペニシリン耐性タンパク質（ｌｙｔＢ）およびペプチド鎖放出因子（ＲＦ－２）から選択される。

【0021】

特定の実施形態において、第１、第２、及び／又は第３の活性化因子及び／又はプロモーターは、細菌に異種である。特定の実施形態では、第１、第２および／または第３の遺伝子は、修飾されていない類似のまたはそうでなければ同一の細菌において、第１、第２および／または第３のプロモーターにそれぞれ作動可能に連結されない。

【0022】

特定の実施形態において、細菌の培養は、１０^－５，１０^－６，１０^－７，１０^－８又は１０^－９未満の頻度で制御分子の非存在下で増殖および／または生存が可能な細菌を結果としてもたらす。特定の実施形態では、制御分子による細菌の培養、およびその後の培養物からの制御分子の除去の後、培養物中の細菌の半減期は、１日未満である。特定の実施形態では、対象への細菌および制御分子の投与後、対象中の細菌の量は、対象からの制御分子の除去または中止の２日以内に１０倍減少する。

【0023】

特定の実施形態において、制御分子はポルフィランであり、第１及び第２の活性化剤はそれぞれＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質であり、（ｉ）ポルフィランは、存在すると、第１及び第２のＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質を活性化し、（ｉｉ）第１及び第２のＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質は、活性化した場合、それぞれ第１及び第２のプロモーターを活性化し、（ｉｉｉ）第１及び第２のプロモーターは、活性化されると、それぞれ第１及び第２の必須遺伝子の発現を指令し、それによって、細菌の成長及び／又は生存率がポルフィランの存在に依存することになる。特定の実施形態において、細菌は、常在菌である。

【0024】

特定の実施形態では、細菌は、ＳｕｓＣ又はＳｕｓＤ、例えば配列番号２０又は２１などのデンプン結合タンパク質に相同なタンパク質をコードする１又は複数のトランスジーンをさらに含む。特定の実施形態では、細菌は、特権的な栄養素を炭素源として利用する能力を高める１つ以上の導入遺伝子、例えばポルフィランのような海洋多糖類を含む。

【0025】

特定の実施形態では、細菌は、１つ以上の治療用トランスジーンをさらに含んでいる。特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、非ネイティブプロモーター（例えば、ファージ由来プロモーター）などのプロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、プロモーターは、コンセンサス配列ＧＴＴＡＡ（ｎ）４－７ＧＴＴＡＡ（ｎ）３４－３８ＴＡ（ｎ）２ＴＴＴＧを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０を含む。特定の実施形態において、導入遺伝子のいずれかは、プラスミド上、細菌人工染色体上および／またはゲノム的に統合されている。

【0026】

別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるような細菌と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、組成物は、カプセル、例えば、腸溶性コーティングカプセル又は錠剤として製剤化される。特定の実施形態では、組成物は、制御分子をさらに含む。

【0027】

別の態様において、本開示は、制御分子の非存在下で細菌（例えば、常在菌）の増殖及び／又は生存率を低下させる方法に関する。この方法は、制御分子によって活性化される第１の活性化因子、第１の活性化因子によって活性化される第１のプロモーター、及び第１のプロモーターに作動可能に連結される第１の必須遺伝子を含むように細菌を遺伝的に改変することを含む。特定の実施形態では、この方法は、制御分子によって活性化される第２の活性化因子、第２の活性化因子によって活性化される第２のプロモーターおよび第２のプロモーターに作動可能に連結される第２の必須遺伝子を含むように細菌を遺伝的に改変することをさらに含む。

【0028】

特定の実施形態において、この方法は、制御分子によって活性化される第３の活性化因子、第３の活性化因子によって活性化される第３のプロモーターおよび第３のプロモーターに作動可能に連結される第３の必須遺伝子を含むように細菌を遺伝的に改変することをさらに含む。

【0029】

別の態様において、本開示は、配列番号３９、４３、５３、５４、５９もしくは６４～７１のいずれか１つのアミノ酸、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号３９、４３、５３、５４、５９、もしくは６４から７１のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性のあるアミノ酸配列、その機能的断片もしくは変異体を含むタンパク質（例えば、単離タンパク質）に関する。さらなる態様において、本開示は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、単離核酸）、核酸を含む発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、細菌）およびタンパク質、核酸、発現ベクターまたは宿主細胞を含む医薬組成物に関連する。

【0030】

別の態様において、本開示は、配列番号２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、４０、５５、５６、６０、６１もしくは７２のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、４０、５５、５６、６０、６１もしくは７２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含む核酸（例えば、単離核酸）に関する。さらなる態様において、本開示は、核酸を含む発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、細菌）及びタンパク質、核酸、発現ベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物に関する。

【0031】

別の態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポルフィランによって活性化されたＨＴＣＳ、（ｉｉ）配列番号７３のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号７３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは変異体を含むＨＴＣＳによって活性化されたプロモーター；および（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）を含む遺伝子組換え細菌に関するものである。特定の実施形態において、必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）は、配列番号４７のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に動作可能に結合している。

【0032】

別の態様において、本開示は、（ｉ）配列番号５９のアミノ酸、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号５９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポルフィランによって活性化されたＨＴＣＳ、（ｉｉ）配列番号４５のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号４５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは変異体を含むＨＴＣＳにより活性化するプロモーター、および（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）を含む遺伝子組換え細菌に関するものである。特定の実施形態において、必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）は、配列番号８４のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号８４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、もしくはその機能的断片もしくは変異体を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に動作可能に結合している。

【0033】

別の態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポルフィランによって活性化された第１のＨＴＣＳ、（ｉｉ）配列番号７３のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号７３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含む第１のＨＴＣＳによって活性化された第１のプロモーター、（ｉｉｉ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１の必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）、（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号５９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポルフィランによって活性化された第２のＨＴＣＳ、（ｖ）配列番号４５のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号４５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含む第２のＨＴＣＳにより活性化された第２のプロモーター並びに（ｖｉ）第２のプロモーターに作動可能に連結されている第２の必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）を含む遺伝子組換え細菌に関する。特定の実施形態において、第１の必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）は、配列番号４７のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号４７もしくはその機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１リボソーム結合部位（ＲＢＳ）に対して作動可能に連結され、このＲＢＳは、配列番号４７、または配列番号４７の機能的断片もしくは変異体に対して少なくとも９９％、または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、第２の必須遺伝子（例えばｌｙｔＢ遺伝子）は、配列番号８４のヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体、または配列番号８４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、もしくはその機能的断片もしくは変異体を含む第２リボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に結合している。

【0034】

別の態様において、本開示は、被験者の腸をコロニー化する方法に関し、本方法は、本明細書に記載の細菌又は医薬組成物を投与することを含む。

【0035】

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法に関し、本方法は、本明細書に記載の細菌又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法は、被験体に制御分子を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、対照分子は、細菌の前に、細菌と同時に、または細菌の後に、被験体に投与される。特定の実施形態では、細菌または医薬組成物は、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月ごとに、被験体に投与される。特定の実施形態では、対象への細菌又は医薬組成物の連続投与間の時間は、約１日である。
特定の実施形態では、対象は、動物、例えば、ヒトである。
本開示のこれら及び他の態様及び特徴は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0036】

本開示は、以下の図面を参照してより詳細に理解することができる。

【図1】様々な生物学的封じ込め戦略及び変異が生物学的封じ込めを破壊する最も可能性のある失敗様式の比較を示す。

【図2】様々な生物学的封じ込め戦略において実施された冗長性及び変異が生物学的封じ込めを破壊する最も可能性のある失敗様式の比較を示す。

【図3】適切な制御分子プロモーター要素の同定を実証する一連の棒グラフを示す。図３Ａは、野生型ＮＢ００１バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）における候補ポルフィラン応答性プロモーター（配列番号１～１０）のルシフェラーゼレポーター誘導を示す。ポルフィランの非存在下又は存在下で発光を測定し、ＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化した。図３Ｂは、野生型ＮＢ００３における候補アガロース応答性プロモーター（配列番号１１、１２）のルシフェラーゼレポーター誘導を示す。発光を測定し、アガロースの非存在下又は存在下でＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化した。図３Ｃは、野生型ＮＢ００４における推定テトラサイクリン応答性プロモーター（配列番号１３）のルシフェラーゼレポーター誘導を示す。発光を測定し、アンヒドロテトラサイクリンの非存在下又は存在下でＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化した。

【図4】ポルフィラン誘導性プロモーターＰ＿ｐｏｒ１０の特徴付けを示す。図４Ａは、Ｐ＿ｐｏｒ１０駆動ルシフェラーゼコンストラクトのプラスミドマップ（配列番号２６）を示す。図４Ｂは、様々な濃度のポルフィランで増殖させたＰ＿ｐｏｒ１０駆動ルシフェラーゼプラスミドで形質転換された野生型ＮＢ００１の、ＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化された測定された発光を示す。

【図5】ポルフィラン誘導性ＨＴＣＳ単独ではポルフィラン応答に十分でないことを実証する棒グラフを示す。Ｐ＿ｐｏｒ１０駆動ルシフェラーゼ要素を、完全ポルフィラン多糖利用遺伝子座（ＰＵＬ）を含むＮＢ００４又はポルフィランＰＵＬのハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）のみを含むＮＢ００４において刺激した。ポルフィランの非存在下又は存在下で発光を測定し、ＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化した。

【図6】必須遺伝子ｔｈｙＡのポルフィラン誘導性調節及びポルフィラン依存性生物学的封じ込めを示すインビトロ増殖アッセイを示す。図６Ａは、ポルフィランを添加した培地中の変性ＲＢＳライブラリー（配列番号３０）に結合したＰ＿ｐｏｒ１０駆動ｔｈｙＡ－ルシフェラーゼの、ＯＤ_{６００ｎｍ}により正規化した発光を示す。各ドットは、クロ－ンライブラリ－メンバーである。図６Ｂは、Ｐ＿ｐｏｒ１０駆動ｔｈｙＡ発現コンストラクト（配列番号３１）のプラスミドマップを示す。図６Ｃは、野生型（「ｗｔ」）株ＮＢ００１、ｔｈｙＡノックアウト（「ＫＯ」）株ＮＢ０２３及び生物学的封じ込め（「ＢＣ」）株ＮＢ０２４の増殖曲線を示す。株を、標準的なＢＨＩＳ培地、チミジンを添加した培地又はポルフィランを添加した培地中で増殖させた。図６Ｄは、０．０％ポルフィラン、０．００２％ポルフィラン、０．０２％ポルフィラン又は０．２％ポルフィランを添加したＢＨＩＳ中の生物学的封じ込め株ＮＢ０２４の増殖曲線を示す。

【図7】ポルフィラン誘導性プロモーターとの必須遺伝子プロモーター置換のために使用されるプラスミドマップ（配列番号３２に対応する）を示す。

【図8】複数の必須遺伝子のポルフィラン誘導性調節を示す成長曲線を示す。図８Ａは、ポルフィランを含まないＢＨＩＳ培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィランＰＵＬを保有する野生型株ＮＢ０７５の増殖曲線を示す。図８Ｂは、ポルフィランを含まない培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィラン駆動ｔｈｙＡ遺伝子を保有するｔｈｙＡ欠失株ｓＷＷ０９０の増殖曲線を示す。図８Ｃは、ポルフィランを含まない培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィラン駆動ａｒｇＳ遺伝子を保有する株ｓＷＷ１８０の増殖曲線を示す。図８Ｄは、ポルフィランを含まない培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィラン駆動ｃｙｓＳ遺伝子を保有する株ｓＷＷ２０２の増殖曲線を示す。図８Ｅは、ポルフィランを含まない培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィラン駆動ｌｙｔＢ遺伝子を保有するｌｙｔＢ欠失株ｓＷＷ０９０の増殖を示す。図８Ｆは、ポルフィランを含まない培地及び０．２％ポルフィランを含む培地中における、ポルフィラン駆動ＲＦ－２遺伝子を保有するＲＦ－２欠失株ｓＷ２０６の増殖を示す。

【図9】野生型及びポルフィラン依存性生物学的封じ込め株の増殖を比較するインビトロケモスタット増殖アッセイを示す。０．５％ポルフィランを含むＢＨＩＳ培地を、ポルフィランを含まないＢＨＩＳで培地の半分を８．７時間毎に置き換えることによって希釈した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、野生型株ｓＺＲ０１０３（灰色線）及び生物学的封じ込め株ｓＺＲ０２５０（黒線）並びにポルフィランなしで増殖することができる生物学的封じ込め株のエスケープ（黒破線）についてモニターした。

【図10】ポルフィラン離脱後のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの腸からの野生型及びポルフィラン依存性株の排除を実証する線グラフを示す。ポルフィラン－ＰＵＬのみを含む野生型株ｓＷＷ８０８又はポルフィラン生物学的封じ込め株ｓＷＷ８０５の１０^９ＣＦＵを０日目にラットに強制経口投与し、ポルフィランを添加した飼料を給餌した。３日後、各群の半数のラットは、ポルフィランを欠く食餌に切り替えられたが、残りの半数は、ポルフィラン含有食餌のままであった。糞便のＣＦＵプレーティングを用いて、排除された株の存在量を決定した。図１０Ａは、野生型株ｓＷＷ８０８についてのインビボ実験の結果を示す。図１０Ｂは、生物学的封じ込め株ｓＷＷ８０５についてのインビボ実験の結果を示し、ポルフィラン離脱後の生物学的封じ込め株の迅速なクリアランスを実証する。影付きの領域は、９５％信頼区間を示す。

【図11】アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーターとの必須遺伝子プロモーター置換に利用されるコンストラクトのプラスミドマップ（配列番号３７）を示す。

【図12】野生型、１×生物学的封じ込めポルフィラン依存性株並びに２×生物学的封じ込めポルフィラン及びアンヒドロテトラサイクリン依存性株の生物学的封じ込めを比較するインビトロ増殖アッセイを示す。野生型株ＮＢ０７５、ポルフィラン制御ｃｙｓＳ生物学的封じ込め株ｓＷＷ２０２及びポルフィラン制御ｃｙｓＳ／ａＴｃ制御ａｒｇＳ二重生物学的封じ込め株ｓＣＧ０３７をインビトロでの増殖についてモニターした。株を、リッチ培地、ポルフィランのみを含む培地、ａＴｃのみを含む培地又はポルフィラン及びａＴｃの両方を含む培地中で増殖させた。両方の生物学的封じ込め株は、増殖するために栄養素補給を必要としたが、２×生物学的封じ込め株のみに、ａＴｃ及びポルフィランが存在しない場合にエスケープコロニーが観察されなかった。

【図13】野生型及び２×生物学的封じ込めポルフィラン及びアンヒドロテトラサイクリン依存性株の生物学的封じ込めを比較する、ケモスタットにおいて実施されたインビトロ増殖アッセイを示す。ポルフィラン及びａＴｃを、１日目に、１日当たり２．１６容量のフラスコ培地をＢＨＩＳのみで置き換えることによって培地から除去した。７日目に、ポルフィラン及びａＴｃを培地に再導入して、生存細胞が存在するかどうかを評価したが、増殖は、検出されなかった。

【図14】例えば、単一の制御分子を使用する二重生物学的封じ込めのために使用することができるキメラＨＴＣＳの生成を示す。図１４Ａは、単一の制御分子を用いて複数のプロモーターを調節するためのキメラＨＴＣＳの使用を実証する概略図を示す。図１４Ｂは、ＮＢ００１ポルフィラン応答性ＨＴＣＳ由来のポルフィラン感知ドメイン及びバクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）ＨＴＣＳ由来の調節ドメインを有するキメラＨＴＣＳの発現に利用されるコンストラクトｐＷＷ１２６７のプラスミドマップを示す（配列番号３９）。図１４Ｃは、３つのキメラＨＴＣＳ：ＨＴＣＳ－１７１０６（ｐＷ１２６６）、ＨＴＣＳ－１０８０９（ｐＷ１２６５）又はＨＴＣＳ－１７１５０（ｐＷ１２６７）の１つを発現するコンストラクトで形質転換された、ＮＢ０７５又はＮＢ０７５株におけるルシフェラーゼのプロモーター駆動発現を示す棒グラフである。培地中の０．２％ポルフィランの非存在下又は存在下での活性をそれぞれ明るい灰色及び黒色のバーで示す。ポルフィランの存在に応答した活性のおよその倍率変化を各キメラＨＴＣＳについてのバーの上に示す。

【図15】生物学的封じ込めに使用するための改善された変異体キメラＨＴＣＳの生成を示す。図１５Ａは、ルシフェラーゼがキメラＨＴＣＳ関連プロモーター（配列番号４５）によって駆動される、キメラＨＴＣＳの活性を測定するためのアッセイの概略図を示す。図１５Ｂは、ポルフィランの非存在下（ｘ軸）又は存在下（ｙ軸）で増殖させた場合の、変異キメラＨＴＣＳを発現する株について得られたルシフェラーゼ値を示す。各ドットは、ユニークな変異体を含む株を表し、四角は、最初に設計されたキメラＨＴＣＳの複製を含む株を表し、三角は、改良された変異体キメラＨＴＣＳを含む株ｐＷＷ１３３３を表す。図１５Ｃは、レポータープラスミド（配列番号４１）からの発光によって評価される、ポルフィランの非存在下（灰色）又は存在下（黒色）での、ＨＴＣＳなし（左）、最初に設計されたキメラＨＴＣＳ（ｐＷ１２６７；中央）及び改善された変異体キメラＨＴＣＳ（ｐＷＷ１３３３；右）の存在下でのプロモーター活性をさらに示す。

【図16】野生型ポルフィラン応答性ＨＴＣＳ（「ＷＴ ＨＴＣＳ」）及びキメラＨＴＣＳ（「ＨＴＣＳ－１７１５０ｖ２」、「キメラＨＴＣＳ」）が、他のプロモーターとのクロストークなしに、それらの関連するプロモーターをそれぞれ活性化することを実証する。試験した株をＸ軸上で特定し、各株の下の識別子は、その株において発現されるＨＴＣＳ及びその株においてルシフェラーゼ発現を駆動するために使用されるプロモーターの概略図を示す。灰色及び黒色のバーは、ポルフィランの非存在下又は存在下での発光を表す。

【図17】生物学的に封じ込めされない（ｓＷＷ１８０；左上）、野生型ポルフィランＨＴＣＳのみで生物学的封じ込めした（ＮＢ０７５；右上）、キメラＨＴＣＳのみで生物学的封じ込めした（ｓＷ９３９；左下）又は野生型ポルフィランＨＴＣＳ及び種々の必須遺伝子を制御するキメラＨＴＣＳで二重生物学的封じ込めした（ｓＷ９４２；右下）株の、ポルフィランの存在下（黒破線）又は非存在下（灰色破線）での、経時的なＯＤ_{６００ｎｍ}増殖曲線によって示されるような増殖を実証する。影付きの領域は、各群（ｎ＝３）についての９５％信頼区間を表す。

【図18】ポルフィランを欠く新鮮なＢＨＩＳで希釈された０．２％ポルフィランを最初に含有したＢＨＩＳの１００ｍｌケモスタット中の、単一（ｓＷＷ１８０；黒実線）、二重（ｓＷ９４２；黒破線）又は無（ＮＢ０７５；灰色実線）生物学的封じ込めを有する、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定された株の存在量を示す。検出限界は、灰色破線で示されている。

【図19】４つの異なるヒト微生物叢の１つを保有するマウス（ドナーＡ～Ｄ）における、ポルフィランを消費する非生物学的封じ込め株（ＮＢ１４４；左）及び生物学的封じ込め株（ｓＺＲ０３２３；右）の存在量を実証する。マウスに１日目に株を１回強制経口投与し、最初の４週間にわたり、ポルフィランを含む食餌（実線）を与え、その後、ポルフィランを欠く食餌（破線）に切り替えた。影付きの領域は、各群（ｎ＝２）についての９５％信頼区間を表す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本開示は、意図される場合に改変細胞の生存及び複製を可能にする一方、改変細胞がそれらの意図される環境からエスケープすることを防止する生物学的封じ込め方法及び機構を提供する。これは、改変細胞の生存能を、外因的に供給される制御分子の存在に連結して、細胞が増殖することができる位置及び時間を規定することによって達成される。本明細書に記載される本発明の好ましい実施形態は、腸内での改変細菌細胞の制御可能な増殖を可能にするが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者に明らかであろう。他の実施形態は、本発明から逸脱することなく、異なる細胞型（例えば、哺乳動物細胞又は酵母細胞）を利用するか、又は異なる環境（例えば、口、皮膚、土壌又は工業用発酵槽）に合わせることができる。場合により、生物学的封じ込めは、空間的である。場合により、生物学的封じ込めは、位置的である。いくつかの実施例では、生物学的封じ込めは、一時的である。

【0038】

生物学的封じ込めのための制御分子依存性の生存能を達成するための代替戦略が以前に提案されており、実験室で実証されているが、高い株エスケープ率、生体内での使用に適していない制御分子への依存又は許容条件でさえコロニー形成を妨げる生物学的封じ込めを実施しながらの適応度の重度の低下に関連する制限のため、いずれもインビボで有効であることが示されていない。図１は、種々の生物学的封じ込め戦略及び変異が生物学的封じ込めを破壊する最も可能性のある失敗様式（右）の比較を示す。一般的な機能喪失変異により、毒素及びリプレッサーが機能しなくなることがある。アクチベーターは、制御分子がなくても遺伝子を恒常的に発現するように変異させることもできるが、この機能獲得型変異は、はるかに少ない。

【0039】

必須遺伝子のアクチベーター駆動発現に基づく生物学的封じ込めからのエスケープには、制御分子が存在しない場合に必須遺伝子の恒常的発現を可能にする稀な機能獲得型変異が必要である。これがどのように達成され得るかの一例は、アクチベーターを恒常的に活性にする変異であろう。このような変異の頻度を減らすことは、有利であるが、冗長性を加える手段として同じ制御分子で複数の必須遺伝子を駆動すると、優性変異としての役割を果たし、全ての必須遺伝子を活性化するためにアクチベーターのコピーを１つのみ変異させなければならない。そのため、エスケープ率を減らすために冗長性を利用する能力が低下する。図２は、種々の生物学的封じ込め戦略において実施される冗長性及び変異が生物学的封じ込めを破壊する最も可能性のある失敗様式（右）の比較を示す。リプレッサーと異なり、アクチベーターを破壊する変異は、優性である可能性が高く（中央の行）、従って冗長性を効果的に付加するために直交バージョン（下部）を必要とする。

【0040】

従って、本開示は、部分的には、１つのアクチベーターを恒常的に活性にする変異が他のプロモーターに影響を与えないような、同じ分子に応答するが、異なるプロモーターを標的とする複数のアクチベーターを使用する生物学的封じ込め戦略の発見に関する。このタイプの天然に存在するアクチベーターを同定することは、不可能ではないにしても、極めて困難である。従って、本明細書に記載されるのは、操作された２成分系（ＴＣＳ）又はハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）であり、これらは、通常、（リプレッサーとは対照的に）アクチベーターであり、生物学的封じ込めの手段として必須遺伝子発現を駆動するために使用され得る。ＴＣＳ及びＨＴＣＳは、治療又は産業的用途における生物学的封じ込めに適した多くの小分子に応答する。このような分子としては、炭水化物、金属イオン、アミノ酸、リン酸塩、硝酸塩、ｐＨ、モル浸透圧濃度、膜応力及び抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

ＴＣＳ及びＨＴＣＳのモジュラー性は、同じ分子に応答するが、異なるプロモーターを活性化する複数の直交バージョンの操作を可能にする。標準的ＴＣＳは、刺激に応答し、ヒスチジンからアスパラギン酸へのリン酸基転移を介して応答レギュレーター（ＲＲ）を活性化するセンサーヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）から構成される。リン酸化されると、ＲＲは、特定の標的プロモーターを活性化又は抑制するであろう。ＨＴＣＳは、刺激依存的な様式で標的プロモーターを同様に調節するが、典型的には同じポリペプチド上にセンサー及びＤＮＡ結合制御ドメインを含む。ほとんどの細菌は、低い配列同一性を有するが、高度の構造類似性を保持し、各シグナル伝達事象に関与する別々のモジュールドメインを有する数十のＴＣＳ又はＨＴＣＳを含む。この構造的類似性のため、１つのＴＣＳ又はＨＴＣＳのセンサーからのシグナル伝達を別のもののプロモーターにリダイレクトするキメラＴＣＳ又はＨＴＣＳを生成することが可能である。

【0042】

シグナル伝達の再配線は、いくつかの学術刊行物（Ｌｙｎｃｈ ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｎｂｕｒｇ（２０１２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８５：４７８－４９１；Ｓｋｅｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ １３３：１０４３－１０５４；Ｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１２４６－１２４９；Ｗｈｉｔａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：１８０９０－１８０９５）において実証されているが、同じ分子によって同時に誘導される２つの直交レギュレーターを操作する能力は、示されていない。キメラＴＣＳ又はＨＴＣＳを操作することにより、複数のアクチベーターが同じ制御分子に応答できるが、他のアクチベーターによって制御される必須遺伝子を発現することはできず、変異によって１つのＴＣＳが恒常的に活性化されるようになった場合のエスケープを防ぐ。このアプローチは、生物の適応度を低下させる広範なゲノム改変を必要とする（Ｍａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１８：５５－６０；Ｒｏｖｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１８：８９－９３）か、又は分子選択に制限を課す（Ｌｏｐｅｚ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，（２０１５）ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．４：１２７９－１２８６）、冗長な生物学的封じ込めのための既存の選択肢よりもはるかに容易に実施され得る強固な生物学的封じ込め系を提供する。

【0043】

Ｉ．定義
用語「異種」は、遺伝物質が細胞中に天然に存在しないか、又は天然に存在するが、導入された遺伝物質と比較して配列若しくは遺伝的状況が変化している細胞に導入された遺伝物質を指す。用語「組換え微生物」は、天然の遺伝物質を改変若しくは除去するか、又は異種の遺伝物質を付加するように遺伝的に改変された生物を指す。本発明者らは、主に細菌細胞に言及するが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者に明らかであろう。他の実施形態は、本発明から逸脱することなく、異なる細胞型（例えば、哺乳動物細胞又は酵母細胞）を利用し得る。

【0044】

用語「生存能」は、生物が特定の環境条件下で繁殖する可能性を指す。所与の環境条件下で生存可能な細胞は、その環境条件下で繁殖することができる。所与の環境条件下で生存不能である細胞は、その環境条件下で繁殖することができない。

【0045】

用語「生物学的封じ込め」又は「生物学的な封じ込め」は、生物の生存能が、規定された位置及び時間に制限されることを確実にする方法を指す。

【0046】

用語「制御分子」は、典型的には、生物学的に封じ込めされた組換え微生物の生存能を制御するために使用することができる、１５００ダルトン未満の重量の有機化合物を指すが、これに限定されない。

【0047】

用語「アクチベーター」は、活性化の条件下で調節する遺伝子の発現を増加させる遺伝子、遺伝子産物、タンパク質又はその一部を指す。アクチベーターが機能的に発現していない場合（例えば、機能喪失変異の場合）、活性化条件下でも、調節されている遺伝子の発現は、低い。

【0048】

用語「リプレッサー」は、抑制条件下で調節する遺伝子の発現を減少させる遺伝子、遺伝子産物、タンパク質又はその一部を指す。リプレッサーが機能的に発現していない場合（例えば、機能喪失変異の場合）、抑制の条件下でも、調節されている遺伝子の発現は、高い。

【0049】

用語「毒素」は、その生成物が、直接的又は間接的のいずれかで、目的の条件下で生存能の喪失をもたらし得る遺伝子を指す。

【0050】

用語「必須遺伝子」とは、その機能発現が目的の条件下で生存能を維持するために必要である遺伝子を指す。

【0051】

用語「２成分系」（ＴＣＳ）及び「ハイブリッド２成分系」（ＨＴＣＳ）は、センサードメインが環境シグナル（例えば、分子）に応答し、遺伝子調節、典型的には転写調節をもたらす保存されたリン酸基転移ドメインを介してシグナルを伝達する、微生物に共通の一種のシグナル伝達経路を指す。標準的なＴＣＳには、ヒスチジンキナーゼ及び応答レギュレーターの２つの成分がある。ＨＴＣＳでは、リン酸基転移ドメインは、標準的に配置されず、ヒスチジンキナーゼ及び応答レギュレーターに関連するドメインは、単一のタンパク質に含まれ得る。本明細書では、ほとんどの原理がＴＣＳ及びＨＴＣＳの両方に適用され、ＴＣＳ及びＨＴＣＳという用語は、別段の指示がない限り、本明細書では互換的に使用される。

【0052】

用語「エスケープ頻度」は、特定の細胞群において生物学的封じ込めが失敗する頻度を指す。例えば、「１０^－５のエスケープ頻度を有する」生物学的封じ込めの実施は、１０^５個のうちの１つの細胞が、それらが制限されている状態（例えば、制御分子が存在しない場合）の外で生存可能であることが見出される細胞集団を産生するであろう。生物学的封じ込めからのエスケープは、典型的には、生物学的封じ込め機構を破壊した変異の結果である。

【0053】

本明細書で使用される用語「相同性」又は「配列同一性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指し得る。配列同一性は、任意の適切なアラインメントアルゴリズムにより、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して測定され得る（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照されたい）。他のアラインメントアルゴリズムも複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の配列同一性パーセントを測定するために使用され得る。

【0054】

用語「治療的導入遺伝子」は、治療的利益を付与することができる異種遺伝子又はＤＮＡ配列を指す。

【0055】

用語「診断的導入遺伝子」は、状態又は病態を診断するために用いることができる異種性遺伝子又はＤＮＡ配列を指す。

【0056】

本明細書で使用される場合、生物学的実体（例えば、遺伝子、タンパク質（例えば、ＨＴＣＳ）、プロモーター又はリボソーム結合部位）の「機能的断片」という用語は、例えば、対応する全長の生物学的実体の生物学的活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を保持する全長の生物学的実体の断片を指す。

【0057】

ＩＩ．２成分系
本開示は、部分的には、アクチベーターと、プロモーターと、特定の実施形態において、生物学的封じ込めを達成するために役立ち得るプロモーターに作動可能に連結された必須遺伝子とを含む遺伝子改変細菌に関する。遺伝子改変細菌のアクチベーター、プロモーター及び必須遺伝子は、２成分系又はハイブリッド２成分系（ＴＣＳ又はＨＴＣＳ）を含み得る。細菌が制御分子に曝露されると、制御分子は、アクチベーターに結合し、且つアクチベーターを活性化し、これは、プロモーターを活性化して必須遺伝子を発現させる。従って、特定の実施形態では、細菌の増殖及び／又は生存能は、必須遺伝子の発現を調節する制御分子の存在に依存する。

【0058】

特定の実施形態では、アクチベーターは、単一のポリペプチドである。特定の実施形態では、アクチベーターは、２つ以上のポリペプチドを含む。例えば、アクチベーターは、制御分子を感知（例えば、制御分子に結合）し、プロモーターを活性化することができる単一のポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、アクチベーターは、２つのポリペプチドを含み、１つのポリペプチドは、制御分子を感知（例えば、制御分子に結合）することができ、１つのポリペプチドは、プロモーターを活性化することができる。

【0059】

ＴＣＳ又はＨＴＣＳが（例えば、点変異によって）構成的に活性になるように変異する場合又は代替機構（例えば、プロモーターへのトランスポゾン挿入、必須遺伝子の上流のゲノム再構成などによって）によって起こり得る生物学的閉じ込めエスケープを回避するために、複数のＴＣＳ又はＨＴＣＳを使用することができる。特に、交差活性化しない異なるアクチベーター／プロモーター対を組み込むことは、冗長性を提供し、エスケープ率を低下させる。

【0060】

従って、特定の実施形態では、細菌はまた、同じ制御分子又は異なる制御分子によって活性化される第２のアクチベーターと、第２のアクチベーターによって活性化される第２のプロモーターと、第２のプロモーターに作動可能に連結される第２の必須遺伝子とを含み得る。特定の実施形態では、第１のプロモーターは、第２のアクチベーターによって活性化されず、及び第２のプロモーターは、第１のアクチベーターによって活性化されない。

【0061】

特定の実施形態では、細菌は、同じ制御分子又は異なる分子によって活性化される第３のアクチベーターと、第３のアクチベーターによって活性化される第３のプロモーターと、第３のプロモーターに作動可能に連結される第３の必須遺伝子とをさらに含む。特定の実施形態では、第３のプロモーターは、第１又は第２のアクチベーターによって活性化されず、及び第３のプロモーターは、第１又は第２のアクチベーターによって活性化されない。特定の実施形態では、３つのアクチベーターは、３つの異なる制御分子によって活性化され、特定の実施形態では、３つのアクチベーターは、２つの異なる制御分子によって活性化され（すなわち、１つの制御分子は、アクチベーターの２つを活性化するが、第３のものを活性化しない）、特定の実施形態では、３つのアクチベーターは、同じ制御分子によって活性化される。

【0062】

特定の実施形態では、細菌は、第１、第２及び／又は第３のアクチベーターをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。

【0063】

特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３のアクチベーターは、センサードメイン及び調節ドメインを含む２成分系又はハイブリッド２成分系（ＴＣＳ又はＨＴＣＳ）タンパク質である。特定の実施形態では、センサードメインは、制御分子に結合し、調節ドメインは、必須遺伝子のプロモーターを活性化する。特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３のアクチベーターは、センサードメイン及び調節ドメインを含むハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）タンパク質である。

【0064】

特定の実施形態では、調節ドメインは、ＡｒａＣファミリーヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフを含む（例えば、Ｒｅｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ １０２（２２）：９２７２－７を参照されたい）。

【0065】

ＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質は、天然に存在するＴＣＳ若しくはＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは改変体であり得る。例えば、天然に存在するＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（例えば、バクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、バクテロイデス・ドレイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ）、バクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）、バクテロイデス・サリエルシアエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）又はバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＨＴＣＳタンパク質などの細菌ＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質であり得る。

【0066】

特定の実施形態では、ＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質は、キメラＴＣＳ又はＨＴＣＳタンパク質であり、センサードメインは、第１の天然に存在するＴＣＳ若しくはＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは改変体由来のセンサードメインであり、及び調節ドメインは、第２の天然に存在するＴＣＳ若しくはＨＴＣＳタンパク質又はその機能的断片若しくは改変体由来の調節ドメインである。

【0067】

キメラＨＴＣＳタンパク質の一実施形態では、１つのＨＴＣＳのセンサーは、第２のＨＴＣＳのＤＮＡ結合領域に連結される（例えば、図１４Ａを参照されたい）。これは、実施例６により詳細に記載されるように、キメラＨＴＣＳが制御分子を感知するが、第１のものと異なるプロモーターを標的とするように、第２のＨＴＣＳのセンサードメインを第１のＨＴＣＳのセンサードメインで置き換えることによって行うことができる。

【0068】

キメラＴＣＳを作製するために、１つのＴＣＳ（例えば、天然に存在するＴＣＳ）のセンサードメインを第２のＴＣＳ（例えば、天然に存在するＴＣＳ）の調節ドメインと組み合わせて使用することができる。ＨＴＣＳタンパク質と異なり、キメラＴＣＳでは、センサードメイン及び調節ドメインは、別々のポリペプチド上にあり、従って２つのポリペプチドの１つ（ヒスチジンキナーゼ又は応答レギュレーターのいずれか）のみが従来の意味において「キメラ」タンパク質である。しかしながら、例えば、第１のＴＣＳの調節ドメイン及び第２のＴＣＳの調節ドメインを有し、それにより第１のＴＣＳのセンサードメインが第１及び第２のＴＣＳの両方の調節ドメインを活性化する、第１のＴＣＳのセンサードメインを含む細菌を操作することにより、同様の系を設計することができる。

【0069】

新しく設計されたプロモーターは、キメラ活性化分子のみに応答し、宿主によって産生されるか若しくは宿主によって一般に遭遇される分子又は宿主に天然の他のＨＴＣＳ若しくは他のレギュレーターに応答しないことを考慮することが重要であるため、ＴＣＳ又はＨＴＣＳは、生物学的に封じ込めされた株に存在しないか又は稀にのみ見出される調節ドメインを含むべきである。

【0070】

特定の実施形態では、ＨＴＣＳタンパク質は、配列番号１９、２３、２５、３８、３９、４２、４３、５１、５２、５３、５４、５９若しくは６４から７１のアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９、２３、２５、３８、３９、４２、４３、５１、５２、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む。

【0071】

センサードメインは、典型的には、総タンパク質配列の約半分であり、調節ドメインは、タンパク質の残りの半分である。調節ドメインは、例えば、プロモーター配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン、例えばヘリックス－ループ－ヘリックスドメインを含み得る。特定の実施形態では、配列番号１９のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２３の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３３～約アミノ酸１３１３のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号２３のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７８７のセンサードメイン、約アミノ酸７８８～約アミノ酸１３６８の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２７９～約アミノ酸１３５９のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号２５のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸２４８のセンサードメイン、約アミノ酸２４９～約アミノ酸７７２の調節ドメインを含み、約アミノ酸６９９～約アミノ酸７７２のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号３８のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７７４のセンサードメイン、約アミノ酸７７５～約アミノ酸１３４９の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２６１～約アミノ酸１３４１のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号３９のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号４２のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７６８のセンサードメイン、約アミノ酸７６９～約アミノ酸１３３６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２４９～約アミノ酸１３２９のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号４３のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３１９の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３２～約アミノ酸１３１２のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号５１のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７７５のセンサードメイン及び約アミノ酸７７６～約アミノ酸１３４９の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２５９～約アミノ酸１３３９のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号５２のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７６０のセンサードメイン、約アミノ酸７６１～約アミノ酸１３１１の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２２６～約アミノ酸１３０６のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号５３のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２５の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３５～約アミノ酸１３１５のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号５４のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３０２の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２１７～約アミノ酸１２９７のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号５９のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６４のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６５のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６６のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６７のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６８のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号６９のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号７０のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。特定の実施形態では、配列番号７１のＨＴＣＳタンパク質は、約アミノ酸１～約アミノ酸７５１のセンサードメイン、約アミノ酸７５２～約アミノ酸１３２６の調節ドメインを含み、約アミノ酸１２３８～約アミノ酸１３１８のＤＮＡ結合ドメインを有する。

【0072】

従って、特定の実施形態では、意図されるＨＴＣＳタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸１～７５１、配列番号２３の１～７８７、配列番号２５の１～２４８、配列番号３８の１～７７４、配列番号３９の１～７５１、配列番号４２の１～７６８、配列番号４３の１～７５１、配列番号５１の１～７７５、配列番号５２の１～７６０、配列番号５３の１～７５１、配列番号５４の１～７５１、配列番号５９の１～７５１、配列番号６４の１～７５１、配列番号６５の１～７５１、配列番号６６の１～７５１、配列番号６７の１～７５１、配列番号６８の１～７５１、配列番号６９の１～７５１、配列番号７０の１～７５１若しくは配列番号７１の１～７５１を含むアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９のアミノ酸１～７５１、配列番号２３の１～７８７、配列番号２５の１～２４８、配列番号３８の１～７７４、配列番号３９の１～７５１、配列番号４２の１～７６８、配列番号４３の１～７５１、配列番号５１の１～７７５、配列番号５２の１～７６０、配列番号５３の１～７５１、配列番号５４の１～７５１、配列番号５９の１～７５１、配列番号６４の１～７５１、配列番号６５の１～７５１、配列番号６６の１～７５１、配列番号６７の１～７５１、配列番号６８の１～７５１、配列番号６９の１～７５１、配列番号７０の１～７５１又は配列番号７１の１～７５１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むセンサードメインを含む。

【0073】

特定の実施形態では、意図されるＨＴＣＳタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸７５２～１３２３若しくは１２３３～１３１３、配列番号２３の７８８～１３６８若しくは１２７９～１３５９、配列番号２５の２４９～７７２若しくは６９９～７７２、配列番号３８の７７５～１３４９若しくは１２６１～１３４１、配列番号３９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号４２の７６９～１３３６若しくは１２４９～１３２９、配列番号４３の７５２～１３１９若しくは１２３２～１３１２、配列番号５１の７７６～１３４９若しくは１２５９～１３３９、配列番号５２の７６１～１３１１若しくは１２２６～１３０６、配列番号５３の７５２～１３２５若しくは１２３５～１３１５、配列番号５４の７５２～１３０２若しくは１２１７～１２９７、配列番号５９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６４の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６５の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６６の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６７の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６８の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号７０の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８又は配列番号７１の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８を含むアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９のアミノ酸７５２～１３２３若しくは１２３３～１３１３、配列番号２３の７８８～１３６８若しくは１２７９～１３５９、配列番号２５の２４９～７７２若しくは６９９～７７２、配列番号３８の７７５～１３４９若しくは１２６１～１３４１、配列番号３９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号４２の７６９～１３３６若しくは１２４９～１３２９、配列番号４３の７５２～１３１９若しくは１２３２～１３１２、配列番号５１の７７６～１３４９若しくは１２５９～１３３９、配列番号５２の７６１～１３１１若しくは１２２６～１３０６、配列番号５３の７５２～１３２５若しくは１２３５～１３１５、配列番号５４の７５２～１３０２若しくは１２１７～１２９７、配列番号５９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６４の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６５の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６６の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６７の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６８の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号７０の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８又は配列番号７１の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む調節ドメインを含む。特定の実施形態では、意図されるＨＴＣＳタンパク質は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸１～７５１、配列番号２３の１～７８７、配列番号２５の１～２４８、配列番号３８の１～７７４、配列番号３９の１～７５１、配列番号４２の１～７６８、配列番号４３の１～７５１、配列番号５１の１～７７５、配列番号５２の１～７６０、配列番号５３の１～７５１、配列番号５４の１～７５１、配列番号５９の１～７５１、配列番号６４の１～７５１、配列番号６５の１～７５１、配列番号６６の１～７５１、配列番号６７の１～７５１、配列番号６８の１～７５１、配列番号６９の１～７５１、配列番号７０の１～７５１若しくは配列番号７１の１～７５１を含むアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９のアミノ酸１～７５１、配列番号２３の１～７８７、配列番号２５の１～２４８、配列番号３８の１～７７４、配列番号３９の１～７５１、配列番号４２の１～７６８、配列番号４３の１～７５１、配列番号５１の１～７７５、配列番号５２の１～７６０、配列番号５３の１～７５１、配列番号５４の１～７５１、配列番号５９の１～７５１、配列番号６４の１～７５１、配列番号６５の１～７５１、配列番号６６の１～７５１、配列番号６７の１～７５１、配列番号６８の１～７５１、配列番号６９の１～７５１、配列番号７０の１～７５１又は配列番号７１の１～７５１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むセンサードメインと；（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸７５２～１３２３若しくは１２３３～１３１３、配列番号２３の７８８～１３６８若しくは１２７９～１３５９、配列番号２５の２４９～７７２若しくは６９９～７７２、配列番号３８の７７５～１３４９若しくは１２６１～１３４１、配列番号３９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号４２の７６９～１３３６若しくは１２４９～１３２９、配列番号４３の７５２～１３１９若しくは１２３２～１３１２、配列番号５１の７７６～１３４９若しくは１２５９～１３３９、配列番号５２の７６１～１３１１若しくは１２２６～１３０６、配列番号５３の７５２～１３２５若しくは１２３５～１３１５、配列番号５４の７５２～１３０２若しくは１２１７～１２９７、配列番号５９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６４の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６５の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６６の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６７の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６８の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号７０の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８又は配列番号７１の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８を含むアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９のアミノ酸７５２～１３２３若しくは１２３３～１３１３、配列番号２３の７８８～１３６８若しくは１２７９～１３５９、配列番号２５の２４９～７７２若しくは６９９～７７２、配列番号３８の７７５～１３４９若しくは１２６１～１３４１、配列番号３９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号４２の７６９～１３３６若しくは１２４９～１３２９、配列番号４３の７５２～１３１９若しくは１２３２～１３１２、配列番号５１の７７６～１３４９若しくは１２５９～１３３９、配列番号５２の７６１～１３１１若しくは１２２６～１３０６、配列番号５３の７５２～１３２５若しくは１２３５～１３１５、配列番号５４の７５２～１３０２若しくは１２１７～１２９７、配列番号５９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６４の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６５の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６６の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６７の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６８の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号６９の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８、配列番号７０の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８又は配列番号７１の７５２～１３２６若しくは１２３８～１３１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む調節ドメインとを含む。

【0074】

意図されるタンパク質（例えば、ＨＴＣＳタンパク質）における第１のドメイン（例えば、センサードメイン）と第２のドメイン（例えば、調節ドメイン）とは、リンカーによって連結され得る。リンカーは、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーであり得る。任意に又は加えて、リンカーは、可撓性リンカー又は非可撓性リンカーであり得る。リンカーは、第１のドメインと第２のドメインとを互いに立体障害なしで連結することを可能にするために十分な長さを有する必要があり、また、タンパク質の意図する活性を保持するために十分に短くなければならない。リンカーは、タンパク質の不安定性を回避するか又は最小限にするために十分に親水性であることが好ましい。リンカーは、タンパク質の不溶性を回避するか又は最小限にするために十分に親水性であることが好ましい。リンカーは、融合タンパク質がインビボで作用できるようにインビボで十分に安定である必要がある（例えば、酵素によって切断されないなど）。

【0075】

リンカーは、約１オングストローム（Å）～約１５０Å長、又は約１Å～約１２０Å長、又は約５Å～約１１０Å長、又は約１０Å～約１００Å長とすることができる。リンカーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２７、３０を超える若しくはそれを超えるオングストローム長及び／又は約１１０、１００、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１若しくはそれ未満のÅ長とすることができる。さらに、リンカーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０及び１２０Å長とすることができる。

【0076】

特定の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーを含む。リンカーが使用される場合、リンカーは、親水性アミノ酸残基、例えばＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＡｒｇを含み得る。特定の実施形態では、リンカーは、１～２５アミノ酸残基、１～２０アミノ酸残基、２～１５アミノ酸残基、３～１０アミノ酸残基、３～７アミノ酸残基、４～２５アミノ酸残基、４～２０アミノ酸残基、４～１５アミノ酸残基、４～１０アミノ酸残基、５～２５アミノ酸残基、５～２０アミノ酸残基、５～１５アミノ酸残基、５～１０アミノ酸残基又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０アミノ酸残基を含むペプチドである。例示的なリンカーは、グリシン及びセリンリッチリンカー、例えば（ＧｌｙＧｌｙＰｒｏ）_ｎ又は（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_ｎを含み、ここで、ｎは、１～５である。特定の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２である。さらなる例示的なリンカー配列は、例えば、Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１－８７９並びに米国特許第５，４８２，８５８号明細書及び第５，５２５，４９１号明細書に開示されている。特定の実施形態では、リンカーは、天然に存在するタンパク質、例えば天然に存在するＨＴＣＳタンパク質に由来する。特定の実施形態では、リンカーは、ＮＰＰＦ（配列番号７８）、ＫＡＰＷ（配列番号７９）、ＡＰＰＦ（配列番号８０）、ＬＰＰＷ（配列番号８１）又はＫＰＰＦ（配列番号８２）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、４つ以上のアミノ酸残基を含み、そのうちの２つ以上は、プロリンである。例えば、特定の実施形態では、リンカーは、Ｘ_１ＰＰＸ_４（配列番号８３）を含み、ここで、Ｘ_１及びＸ_４は、任意のアミノ酸である。

【0077】

ＴＣＳ又はＨＴＣＳの使用により、細株のエスケープ率が低下する。特定の実施形態では、細菌の培養は、制御分子の非存在下で１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８又は１０^－９未満の頻度において増殖及び／又は生存可能な細菌をもたらす。特定の実施形態では、細菌と制御分子との培養及びその後の培地からの制御分子の除去後、細菌は、培地中において、３日未満、２日未満、１日未満又は１２時間未満生存可能である。特定の実施形態では、細菌と制御分子との培養及びその後の培地からの制御分子の除去後、細菌は、１０回、９回、８回、７回、６回、５回、４回、３回、２回又は１回未満分割することが可能である。

【0078】

特定の実施形態では、対象、例えばヒト対象への細菌及び制御分子の投与後、対象内の細菌の量は、対象からの制御分子の除去又は停止から２日以内に少なくとも約１０倍、５倍又は２倍低下する。対象内の細菌の量は、当技術分野で既知の任意の手段、例えば定量的ＰＣＲ（例えば、治療遺伝子の）により、又は唯一の炭素源としての制御分子を含むプレート上にサンプルをプレーティングし、ＣＦＵを計数することにより測定することができる。

【0079】

特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３のプロモーターは、配列番号１～１３、４４～４６、６２、６３若しくは７３のいずれか１つのヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１～１３、４４～４６、６２、６３若しくは７３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む。特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３のプロモーターは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１１、１２、１３、４５、４６、６２、６３若しくは７３のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体（例えば、配列番号４４）或いは配列番号１、２、７、８、９、１０、１１、１２、１３、４５、４６、６２、６３若しくは７３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体（例えば、配列番号４４）を含む。Ｐｐｏｒ１０ｓ６ｖ７と呼ばれる配列番号４４は、最少のポルフィラン応答性プロモーターであり、これは、特定の実施形態では、活性を改善し得る変異を含む配列番号８の切断形態である。

【0080】

特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３のアクチベーター及び／又はプロモーターは、細菌に対して異種である。特定の実施形態では、第１、第２及び／又は第３の遺伝子は、改変されていない類似の又はさもなければ同一の細菌において、それぞれ第１、第２及び／又は第３のプロモーターに作動可能に連結されない。

【0081】

必須遺伝子が、上記のように、ＴＣＳ又はＨＴＣＳによって転写的に直接制御されるシステムを実施することに加えて、このシステムは、必須遺伝子機能を間接的に調節するＴＣＳ又はＨＴＣＳを用いて実施され得ることが当業者によって認識されるであろう。例えば、ＴＣＳ又はＨＴＣＳは、１つ以上の異なるアクチベーターの発現を制御し得、これは、次いで、必須遺伝子の発現を駆動する。当業者は、ＴＣＳ又はＨＴＣＳ活性を必須遺伝子機能に機能的に連結する手段として、転写調節の代替法も認識するであろう。例えば、本明細書に記載される生物学的封じ込め戦略は、必須遺伝子翻訳、成熟、翻訳後修飾又は局在化を制御することによって実施することもできる。例えば、ＴＣＳ又はＨＴＣＳは、翻訳開始を変化させるＲＮＡ分子、適切なタンパク質フォールディングを確実にするシャペロン、翻訳後プロセシングを媒介するプロテアーゼ又は必須遺伝子機能を間接的に制御するために単独で若しくは組み合わせて使用され得る種々の他の因子の発現を駆動し得る。当業者は、必須遺伝子のＴＣＳ又はＨＴＣＳ調節の原理が、それら自体必須ではないが、両方が一緒に欠失されると生存能の喪失を生じる冗長遺伝子対に適用され得ることも認識するであろう。この場合、ＴＣＳ又はＨＴＣＳは、生存能を制御する手段として、両方の遺伝子の機能に連結させることができるか、又は一方の冗長遺伝子を単純に削除して、他方がそれ自体必須であることを確実にすることができる。

【0082】

特定の実施形態では、生物学的封じ込めは、炭水化物制御生物学的封じ込め戦略を用いて実施され、それにより、腸内で見出される炭水化物上で増殖する組換え微生物の能力が制限され、制御分子が供給される。組換え微生物の腸内で見出される炭水化物上での増殖能を制限することは、天然の多糖利用遺伝子座（ＰＵＬ）をノックアウトすることによって達成することができる。ＰＵＬは、ＳｕｓＣ及びＳｕｓＤ相同体を含む推定オペロンを検索することによって同定され得る（例えば、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）における少なくとも１２の推定ＰＵＬ：ＢＴＯ１３９－ＢＴ０１４６、ＢＴ０１８８－ＢＴ０１９６、ＢＴ０７５２－ＢＴ０７５８、ＢＴ１２７８－ＢＴ１２８７、ＢＴ１６１７－ＢＴ１６２２、ＢＴ１８７１－ＢＴ１８７７、ＢＴ２１８９－ＢＴ２１９８、ＢＴ２４５７－ＢＴ２４６３、ＢＴ３５１７－ＢＴ３５３２、ＢＴ３７４８－ＢＴ３７５４、ＢＴ４６２９－ＢＴ４６３６及びＢＴ４７２２－ＢＴ４７３０を同定したＸｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ２９９，２０７４－２０７７を参照されたい）。ＰＵＬは、確立された方法を用いて完全に又は部分的に欠失され得る（Ｋｏｒｏｐａｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １６，１１０５－１１１５）。単一のＰＵＬ又は複数のＰＵＬの欠失は、腸内の生存能を部分的に又は完全に排除するために使用され得る。複数のＰＵＬの欠失は、確立された方法を用いて連続して行うことができる（Ｋｏｒｏｐａｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、前出）。次いで、異種ＰＵＬを導入して、腸内で一般に見出されない炭水化物上で増殖する能力を付与することができる。多数の炭水化物－ＰＵＬ対は、少なくとも部分的に生存能を回復させることができ得るが、理想的な炭水化物は、上記のポルフィランＰＵＬなどの他の腸内微生物によって分解されないものであろう。ポルフィランＰＵＬの移動は、以下の実施例に記載のように行うことができる。

【0083】

ＩＶ．必須遺伝子
必須遺伝子とは、目的の条件下で生存能を維持するために機能発現が必要な遺伝子である。特定の実施形態では、必須遺伝子は、チミジル酸シンターゼ（ＴｈｙＡ）、アルギニルｔＲＮＡシンテターゼ（ａｒｇＳ）、システイニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｃｙｓＳ）、ペニシリン耐性タンパク質（ｌｙｔＢ）及びペプチド鎖放出因子（ＲＦ－２）から選択される。他の例示的な必須遺伝子には、表１に列挙されるものが含まれる。表１は、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）についての予測される必須遺伝子を提供する（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ６（３）：２７９－２８９）。他の細菌についての必須遺伝子は、当技術分野で公知であるか、又は表１に列挙されるものと８０％以上の配列同一性を有する遺伝子（例えば、表１に列挙されるものに対してオルソロガスな遺伝子）として同定され得る。

【0084】

【表1】

【0085】

Ｖ．制御分子
特定の実施形態では、制御分子は、ヒト食餌中において定期的に存在しない。特定の実施形態では、制御分子は、単糖又は多糖、例えば海洋多糖若しくは抗生物質又はいずれかの誘導体である。特定の実施形態では、海洋多糖は、ポルフィラン若しくはアガロース又はその誘導体である。特定の実施形態では、抗生物質又はその誘導体は、アンヒドロテトラサイクリンである。

【0086】

特定の実施形態では、制御分子は、所与の集団の一般的な食餌の一部ではない分子又は所与の集団の腸の約１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満若しくは約０．００１％未満に見出される分子である。所与の集団は、地理的に記述され得、例えば、制御分子は、従来の北米（ヨーロッパ、南米、アフリカ、アジアなど）食餌の一部ではないものであり得る。集団は、他の方法、例えば亜集団でも定義され得る。ある場合には、制御分子は、第１の集団の食餌において一般に見出されないが、第２の集団の食餌において一般的である場合がある。いくつかの実施形態では、希少炭水化物は、集団の腸の１％、０．１％、０．０１％又は０．００１％未満に見出されるものである。いくつかの場合、制御分子は、海洋炭水化物、例えばポルフィラン又はアガロースである。いくつかの場合、制御分子は、薬物、例えば抗生物質又は抗生物質誘導体、例えばテトラサイクリン又はアンヒドロテトラサイクリンである。いくつかの場合、制御分子は、１－クロロ－１－デオキシ－Ｄ－フルクトース又は１，６－ジクロロ－１，６－ジデオキシ－Ｄ－フルクトースなどのハロゲン化炭水化物である。いくつかの場合、制御分子は、北米（ヨーロッパ、南米、アフリカ、アジアなど）食餌から欠けているものである。いくつかの場合、制御分子は、北米（ヨーロッパ、南米、アフリカ、アジアなど）食餌において、平均で頻繁に消費されないもの（例えば、年に２０回、年に１０回、年に９回未満、年に８回、年に７回、年に６回、年に５回、年に４回、年に３回未満）である。いくつかの場合、制御分子は、天然に存在しない。いくつかの場合、制御分子は、環境の温度が所与の範囲内にある場合に存在する。

【0087】

特定の実施形態では、制御分子は、ポルフィランであり、且つ第１及び第２のアクチベーターは、それぞれＨＴＣＳタンパク質であり、及び（ｉ）ポルフィランは、存在する場合、第１及び第２のＨＴＣＳタンパク質を活性化し、（ｉｉ）第１及び第２のＨＴＣＳタンパク質は、活性化される場合、第１及び第２のプロモーターをそれぞれ活性化し、及び（ｉｉｉ）第１及び第２のプロモーターは、活性化される場合、それぞれ第１及び第２の必須遺伝子の発現を指示し、それにより、ポルフィランの存在に依存する細菌の増殖及び／又は生存能をもたらす。特定の実施形態では、細菌は、共生細菌である。

【0088】

ＶＩ．改変細菌
例えば、開示される医薬組成物又は方法に使用するための意図される改変細菌としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）、アクチノ細菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオ細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）又はウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）の門のメンバー及びバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）、ジェミガー（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）、バルネシエラ（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、パラステレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ファスコラークトバクテリウム（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サテレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オドリバクター（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）又はアッケルマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）属の細菌が挙げられる。例えば、開示される医薬組成物又は方法に使用するための意図される細菌は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属のものとすることができ、すなわちバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種細菌とすることができる。

【0089】

例示的なバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種としては、Ｂ．アシジファシエンス（Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アミロフィルス（Ｂ．ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アサッカロリチクス（Ｂ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．バルネシアエス（Ｂ．ｂａｒｎｅｓｉａｅｓ）、Ｂ．ビビウス（Ｂ．ｂｉｖｉｕｓ）、Ｂ．ブッカエ（Ｂ．ｂｕｃｃａｅ）、Ｂ．ブッカリス（Ｂ．ｂｕｃｃａｌｉｓ）、Ｂ．カッカエ（Ｂ．ｃａｃｃａｅ）、Ｂ．カエシコラ（Ｂ．ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、Ｂ．カエシガリナルム（Ｂ．ｃａｅｃｉｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．カピロサス（Ｂ．ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、Ｂ．カピルス（Ｂ．ｃａｐｉｌｌｕｓ）、Ｂ．セルロシリチクス（Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．セルロソルベンス（Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．チンチラ（Ｂ．ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ）、Ｂ．クラルス（Ｂ．ｃｌａｒｕｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．コプロコラ（Ｂ．ｃｏｐｒｏｃｏｌａ）、Ｂ．コプロフィルス（Ｂ．ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コプロスイス（Ｂ．ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ）、Ｂ．コルポリス（Ｂ．ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、Ｂ．デンチコラ（Ｂ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、Ｂ．ジシエンス（Ｂ．ｄｉｓｉｅｎｓ）、Ｂ．ジスタソニス（Ｂ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ｂ．ドレイ（Ｂ．ｄｏｒｅｉ）、Ｂ．エゲルチイ（Ｂ．ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、Ｂ．エンドドンタリス（Ｂ．ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）、Ｂ．ファエシチンチラエ（Ｂ．ｆａｅｃｉｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ）、Ｂ．ファエシス（Ｂ．ｆａｅｃｉｓ）、Ｂ．フィネゴルジイ（Ｂ．ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、Ｂ．フルクスス（Ｂ．ｆｌｕｘｕｓ）、Ｂ．フォルシスス（Ｂ．ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、Ｂ．フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂ．フルコスス（Ｂ．ｆｕｒｃｏｓｕｓ）、Ｂ．ガラクツロニクス（Ｂ．ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ガリナセウム（Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）、Ｂ．ガリナルム（Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．ギンギバリス（Ｂ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、Ｂ．ゴルドステイニイ（Ｂ．ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ）、Ｂ．グラシリス（Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｂ．グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．ヘルコゲネス（Ｂ．ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．ヘパリノリチクス（Ｂ．ｈｅｐａｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ヒペルメガス（Ｂ．ｈｙｐｅｒｍｅｇａｓ）、Ｂ．インテルメジウス（Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｂ．インテスチナリス（Ｂ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｂ．ジョンソニイ（Ｂ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｂ．レビイ（Ｂ．ｌｅｖｖｉ）、Ｂ．ロエシェイイ（Ｂ．ｌｏｅｓｃｈｅｉｉ）、Ｂ．ルチ（Ｂ．ｌｕｔｉ）、Ｂ．マカカエ（Ｂ．ｍａｃａｃａｅ）、Ｂ．マシリエンシス（Ｂ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メラニノゲニクス（Ｂ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．メルダエ（Ｂ．ｍｅｒｄａｅ）、Ｂ．ミクロフスス（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｕｓｕｓ）、Ｂ．ムルアチアシヅス（Ｂ．ｍｕｌｔｉａｃｉｄｕｓ）、Ｂ．ノドスス（Ｂ．ｎｏｄｏｓｕｓ）、Ｂ．ノルジイ（Ｂ．ｎｏｒｄｉｉ）、Ｂ．オクラセウス（Ｂ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、Ｂ．オレイシプレヌス（Ｂ．ｏｌｅｉｃｉｐｌｅｎｕｓ）、Ｂ．オラリス（Ｂ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｂ．オリス（Ｂ．ｏｒｉｓ）、Ｂ．オウロルム（Ｂ．ｏｕｌｏｒｕｍ）、Ｂ．オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）、Ｂ．パウロサッカロリチクス（Ｂ．ｐａｕｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ペクチノフィルス（Ｂ．ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ペントサセウス（Ｂ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、Ｂ．プレベイウス（Ｂ．ｐｌｅｂｅｉｕｓ）、Ｂ．ニューモシンテス（Ｂ．ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）、Ｂ．ポリプラグマツス（Ｂ．ｐｏｌｙｐｒａｇｍａｔｕｓ）、Ｂ．プラエアクツス（Ｂ．ｐｒａｅａｃｕｔｕｓ）、Ｂ．プロピオニシファシエンス（Ｂ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．プトレジニス（Ｂ．ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、Ｂ．ピオゲネス（Ｂ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．レチキュロテルミチス（Ｂ．ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ）、Ｂ．ロデンチウム（Ｂ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｂ．ルミニコラ（Ｂ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｂ．サラニトロニス（Ｂ．ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ）、Ｂ．サリボスス（Ｂ．ｓａｌｉｖｏｓｕｓ）、Ｂ．サリエルシアエ（Ｂ．ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）、Ｂ．サルトリイ（Ｂ．ｓａｒｔｏｒｉｉ）、Ｂ．セジメント（Ｂ．ｓｅｄｉｍｅｎｔ）、Ｂ．スプランクニクス（Ｂ．ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ステルコリロソリス（Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｒｏｓｏｒｉｓ）、Ｂ．ステルコリス（Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、Ｂ．スシノゲネス（Ｂ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、Ｂ．テクツス（Ｂ．ｔｅｃｔｕｓ）、Ｂ．テルミチジス（Ｂ．ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、Ｂ．ウレフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ウレオリチクス（Ｂ．ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ベロラリス（Ｂ．ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）、Ｂ．ブルガツス（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）、Ｂ．キシラニソルベンス（Ｂ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．キシラノリチクス（Ｂ．ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）又はＢ．ズーグレオフォンナンス（Ｂ．ｚｏｏｇｌｅｏｆｏｎｎａｎｓ）が挙げられる。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語「種」は、ゲノム配列及び表現型特性によって慣用的に定義される分類学的実体を指す。「株」は、従来の微生物学的技術に従って単離及び精製された種の特定の例である。本開示は、開示される細株の誘導体を包含する。用語「誘導体」は、娘株（子孫）又は株の生物学的活性を負に変化させることなく、元のものから培養（サブクローン化）されたが、何らかの方法で改変された（遺伝子レベルを含む）染色体を含む。

【0091】

特定の実施形態では、意図される改変細菌は、処置される対象の糞便中又は平均的なヒトの糞便中の全培養可能微生物の０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％又は４０％超を構成する属のものである。特定の実施形態では、意図される改変細菌は、処置される対象の糞便の１グラム当たり又は平均的なヒトの糞便の１グラム当たり１０^１２、１０^１１、１０^１０、１０^９、１０^８、１０^７コロニー形成単位を超えるレベルで検出される属のものである。特定の実施形態では、意図される改変細菌は、処置される対象の腸内ミクロビオーム又は平均的なヒトの腸内ミクロビオームの０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％又は４０％超を構成する属のものである。ヒトの腸又は糞便ミクロビオーム組成物は、１６Ｓリボソーム配列決定を含む、当技術分野で公知の任意の技術によってアッセイされ得る。バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）は、ヒト腸内で最も天然に豊富な属である（Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８６．７４０２：２０７）。

【0092】

ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ、１８Ｓ、１８Ｓ ｒＲＮＡ及び１８Ｓ ｒＤＮＡは、リボソームの成分の成分であるか、又はその成分をコードする核酸を指す。リボソームには、小サブユニット（ＳＳＵ）及び大サブユニット（ＬＳＵ）と呼ばれる２つのサブユニットがある。ｒＤＮＡ遺伝子とその相補的ＲＮＡ配列とは、それらが可変であるが、生物間の分子比較を可能にするために十分に保存されているため、生物の進化的関係量の決定に広く用いられている。

【0093】

３０Ｓ ＳＳＵの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（長さ約１５４２ヌクレオチド）は、実施形態において、原核生物の分子ベースの分類学的割り当てのために使用され得、４０Ｓ ＳＳＵの１８Ｓ ｒＤＮＡ配列（長さ約１８６９ヌクレオチド）は、真核生物に使用され得る。例えば、１６Ｓ配列は、それらが一般に高度に保存されているが、大部分の細菌の属及び種を分化させるために十分なヌクレオチド多様性を有する特異的超可変領域を含むため、系統発生学的再構築のために使用され得る。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列データは、分類学的分類を提供するために使用されてきたが、同じ属及び種内で分類される密接に関連した細株は、異なる生物学的表現型を示す場合がある。

【0094】

意図される細菌種又は株のアイデンティティは、１６Ｓ ｒＲＮＡ又は全ゲノム配列解析によって特徴付けることができる。例えば、特定の実施形態では、意図される細株は、参照配列に対して特定の％同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ又はゲノム配列を含むことができる。

【0095】

配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範疇内である種々の方法で決定することができる。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）解析（Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（参照により組み込まれる）は、配列類似性検索のために調整される。配列データベースを検索する際の基本的な問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９－１２９（これは、参照により完全に組み込まれる）を参照されたい。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。ヒストグラム、説明、アラインメント、期待値（すなわちデータベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マトリクス及びフィルタの検索パラメーターは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９（参照により完全に組み込まれる）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ったｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈ位置ごとにワードヒットを生成する）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。均等なＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であり得る。検索は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｏｎパラメーター（例えば、－Ｇ、ギャップを開放するためのコスト［Ｉｎｔｅｇｅｒ］：デフォルト＝ヌクレオチドで５／タンパク質で１１；－Ｅ、ギャップを伸長するためのコスト［Ｉｎｔｅｇｅｒ］：デフォルト＝ヌクレオチドで２／タンパク質で１；－ｑ、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］：デフォルト＝－３；－ｒ、ヌクレオチド一致に関する報酬［Ｉｎｔｅｇｅｒ］：デフォルト＝１；－ｅ、期待値［Ｒｅａｌ］：デフォルト＝１０；－Ｗ、ワードサイズ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］：デフォルト＝ヌクレオチドで１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔで２８／タンパク質で３；－ｙ、ビットでのｂｌａｓｔ伸長についてのＤｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎで２０／その他で７；－Ｘ、ギャップアラインメントについてのＸドロップオフ値（ビットでの）：デフォルト＝ｂｌａｓｎに適用不可能な全てのプログラムについて１５；及び－Ｚ、ギャップアラインメントについての最終Ｘドロップオフ値（ビットでの）：ｂｌａｓｔｎで５０、その他で２５）を使用して行うこともできる。ペアワイズタンパク質アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷも使用され得る（デフォルトパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクス及びギャップオープニングペナルティ＝１０及びギャップ伸長ペナルティ＝０．１を含み得る）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、タンパク質比較における均等な設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。

【0096】

特定の実施形態では、意図される改変細菌は、ヒト腸で安定にコロニー形成することができる。開示される細菌は、例えば、ヒト対象への投与後、糞便内容物の１グラム当たり１０^１２、１０^１１、１０^１０、１０^９、１０^８又は１０^７ｃｆｕを超える存在量をもたらす可能性がある。例えば、開示される細菌の約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１又は約１０^１２細胞をヒト対象に投与することにより、投与の１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間又は７２時間で糞便内容物の１グラム当たり１０^１２、１０^１１、１０^１０、１０^９、１０^８又は１０^７ｃｆｕを超える存在量がもたらされる可能性がある。

【0097】

開示される細菌は、例えば、改変されていない類似の又はさもなければ同一の細菌と比較して増加した存在量、安定性、予測可能性又は初期コロニー形成の容易さでヒト腸にコロニー形成するように改変され得る。例えば、意図される細菌は、優先栄養素を炭素源として利用する能力を増加させるように改変され得る。「優先栄養素」は、腸内の他の細菌の１％以下の増殖補助を提供しながら、特定の細株の増殖を補助するために消費され得る分子又は分子のセットとして定義される。従って、特定の実施形態では、改変細菌は、そのコロニー形成を維持し、他の炭素又はエネルギー源の非存在下でさえ、対象の腸内で予測可能に高い存在量まで拡大するために優先栄養素を消費する能力を有する一方、対象の腸内のほとんどの他の細菌は、そうではない。例示的な優先栄養素には、例えば、海洋多糖、例えばポルフィランが含まれる。当業者が認識するように、意図される優先栄養素は、所与の細菌及び対象について意図される制御分子と重複し得る。

【0098】

例えば、特定の実施形態では、細菌は、多糖利用遺伝子座（ＰＵＬ）、炭水化物、例えば優先栄養素を消費する能力を細菌に付与する可動遺伝因子の全部又は一部を含み得る。例示的なポルフィラン消費ＰＵＬは、配列番号１４に示されるポルフィラン消費バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）株ＮＢ００１由来のＰＵＬである。従って、特定の実施形態では、改変細菌は、配列番号１４又はその機能的断片若しくは改変体を含む。特定の実施形態では、改変細菌は、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む。

【0099】

他の例示的なＰＵＬは、配列番号１５に提供されるアガロース消費バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）株ＮＢ００２及び配列番号１６に提供されるＮＢ００３に由来するものである。従って、特定の実施形態では、改変細菌は、配列番号１５若しくは１６又はその機能的断片若しくは改変体を含む。特定の実施形態では、改変細菌は、配列番号１５若しくは１６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む。

【0100】

対象の腸における存在量を増加させるためのさらなる例示的な細菌改変、優先栄養素、優先栄養素を利用する細菌の能力を増加させる導入遺伝子、ＰＵＬ並びに改変細菌の増殖を調節するための他の方法及び組成物は、国際（ＰＣＴ）特許公開国際公開第２０１８１１２１９４号パンフレットに記載されている。

【0101】

特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を含む、開示される導入遺伝子又は核酸は、少なくとも１つのプロモーター、例えばファージ由来プロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、遺伝子に機能的に連結される。作動可能に連結されるヌクレオチド配列は、典型的には、連続している。しかしながら、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース分離された場合に機能し、イントロン配列は、可変長であり得るため、いくつかのポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結され得るが、直接隣接せず、異なる対立遺伝子又は染色体からトランスでも機能し得る。特定の実施形態では、プロモーターは、コンセンサス配列ＧＴＴＡＡ（ｎ）_４～７ＧＴＴＡＡ（ｎ）_{３４～３８}ＴＡ（ｎ）_２ＴＴＴＧを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４８、配列番号４９若しくは配列番号５０又はその機能的断片或いは配列番号４８、配列番号４９若しくは配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片を含む。さらなる例示的なファージ由来プロモーターは、国際（ＰＣＴ）特許公開国際公開第２０１７１８４５６５号パンフレットに記載されている。

【0102】

特定の実施形態では、細菌は、デンプン結合タンパク質に相同なタンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子、例えばＳｕｓＣ又はＳｕｓＤ、例えば配列番号２０若しくは２１又はその機能的断片若しくは改変体をさらに含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２０及び２１若しくはその機能的断片又は配列番号２０若しくは２１に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するタンパク質又はその機能的断片の１つ以上をコードする。

【0103】

特定の実施形態では、細菌は、治療的導入遺伝子をさらに含む。いくつかの場合、治療的導入遺伝子は、ｇａｄ６５、ｉｌ１０、ｉｌ２２、ＴＮＦ－α、ｎａｇｓ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ｍｔｒ、プロピオン酸トランスポーター、キヌレニントランスポーター、胆汁酸塩トランスポーター、アンモニアトランスポーター、ＧＡＢＡトランスポーター、ＰｈｅＰ又はＡｒｏＰであり得る。いくつかの場合、細菌は、診断的導入遺伝子を含む。いくつかの場合、診断的導入遺伝子は、ＴｔｒＲ／ＴｔｒＳである。いくつかの場合、細菌は、外膜輸入タンパク質をさらに含む。

【0104】

特定の実施形態では、開示される導入遺伝子又は核酸は、プラスミド上にあり、細菌人工染色体上にあり、且つ／又はゲノムに統合されている。細菌が複数のタンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子又は核酸を含む場合、タンパク質の２つ以上をコードするオープンリーディングフレームは、例えば、単一のオペロンに存在し得ることが意図される。

【0105】

特定の実施形態では、開示される遺伝子（例えば、必須遺伝子又は導入遺伝子）又は核酸は、少なくとも１つのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結される。例示的なＲＢＳには、配列番号４７、７４、７５、７６、７７、８４若しくは８５のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号４７、７４、７５、７６、７７、８４若しくは８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又は前述したヌクレオチド配列のいずれかの機能的断片若しくは変異体を含むものが含まれる。

【0106】

細菌は、配列番号４７、７４、７５、７６、７７、８４若しくは８５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号４７、７４、７５、７６、７７、８４若しくは８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む核酸を含み得ることが意図される。

【0107】

細菌は、配列番号３９、４３、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずれか１つのアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号３９、４３、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むタンパク質を含み得ることが意図される。

【0108】

細菌は、配列番号３９、４３、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずれか１つのアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号３９、４３、５３、５４、５９若しくは６４～７１のいずに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を含み得ることが意図される。

【0109】

細菌は、配列番号２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、４０、５５、５６、６０、６１若しくは７２のいずれか１つのヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、４０、５５、５６、６０、６１若しくは７２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む１つ以上の核酸を含み得ることが意図される。

【0110】

細菌は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むポルフィランによって活性化されるＨＴＣＳと；（ｉｉ）配列番号７３のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号７３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むＨＴＣＳによって活性化されるプロモーターと；（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結される必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）とを含み得ることが意図される。特定の実施形態では、必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）は、配列番号４７のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結される。

【0111】

細菌は、（ｉ）配列番号５９のアミノ酸又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号５９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むポルフィランによって活性化されるＨＴＣＳと；（ｉｉ）配列番号４５のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号４５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むＨＴＣＳによって活性化されるプロモーターと；（ｉｉｉ）プロモーターに作動可能に連結される必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）とを含み得ることが意図される。特定の実施形態では、必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）は、配列番号８４のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号８４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結される。

【0112】

細菌は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的断片若しくは改変体を含むポルフィランによって活性化される第１のＨＴＣＳと；（ｉｉ）配列番号７３のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号７３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を有する第１のＨＴＣＳによって活性化される第１のプロモーターと；（ｉｉｉ）第１のプロモーターに作動可能に連結される第１の必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）と；（ｉｖ）配列番号５９のアミノ酸又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号５９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸又はその機能的断片若しくは改変体を含むポルフィランによって活性化される第２のＨＴＣＳと；（ｖ）配列番号４５のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号４５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む第２のＨＴＣＳによって活性化される第２のプロモーターと；（ｖｉ）第２のプロモーターに作動可能に連結される第２の必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）とを含み得ることが意図される。特定の実施形態では、第１の必須遺伝子（例えば、ａｒｇＳ遺伝子）は、配列番号４７のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む第１のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結される。特定の実施形態では、第２の必須遺伝子（例えば、ｌｙｔＢ遺伝子）は、配列番号８４のヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体或いは配列番号８４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的断片若しくは改変体を含む第２のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作動可能に連結される。

【0113】

ＶＩＩ．方法
別の態様では、本開示は、制御分子の非存在下で細菌（例えば、共生細菌）の増殖及び／又は生存能を低下させる方法に関する。本方法は、細菌を、制御分子によって活性化される第１のアクチベーターと、第１のアクチベーターによって活性化される第１のプロモーターと、第１のプロモーターに作動可能に連結される第１の必須遺伝子とを含むように遺伝子改変することを含む。特定の実施形態では、本発明は、細菌を、制御分子よって活性化される第２のアクチベーターと、第２のアクチベーターよって活性化される第２のプロモーターと、第２のプロモーターに作動可能に連結される第２の必須遺伝子とを含むように遺伝子改変することをさらに含む。特定の実施形態では、第１のプロモーターは、第２のアクチベーターによって活性化されず、及び第２のプロモーターは、第１のアクチベーターによって活性化されない。交差活性化しない異なるアクチベーター／プロモーター対を組み込むことにより、冗長性が提供され、エスケープ率が低下する。

【0114】

従って、制御分子の非存在下で細菌の増殖及び／又は生存能をさらに低下させるために、制御分子によって活性化される第３のアクチベーターを導入し得る。従って、本方法は、細菌を、制御分子によって活性化される第３のアクチベーターと、第３のアクチベーターによって活性化される第３のプロモーターと、第３のプロモーターに作動可能に連結される第３の必須遺伝子とを含むように遺伝子改変することをさらに含み得る。特定の実施形態では、第３のプロモーターは、第１又は第２のアクチベーターによって活性化されず、及び第３のプロモーターは、第１又は第２のアクチベーターによって活性化されない。さらなるアクチベーター／プロモーター対の組み込みにより、さらなる冗長性が提供され、エスケープ率をさらに低下させる。

【0115】

特定の実施形態では、本発明は、細菌を、第１、第２及び／又は第３のアクチベーターをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むように遺伝的に改変することをさらに含む。

【0116】

本開示は、対象の腸をコロニー形成する方法にも関し、この方法は、本明細書に記載される細菌又は医薬組成物を投与することを含む。腸のコロニー形成を増加させるための戦略は、以下により詳細に論じられる。

【0117】

ＶＩＩＩ．医薬組成物／単位
本明細書に開示される細菌は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができ、これは、当技術分野において公知の任意の手段によって患者に投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される賦形剤」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、妥当な利益／リスク比に見合って、対象、例えばヒト対象への投与に適した緩衝液、キャリア、または賦形剤の１以上を意味すると理解される。 賦形剤（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、かつ受領者に有害でないという意味で「許容可能」であるべきである。

【0118】

薬学的に許容される賦形剤には、医薬投与に適合する緩衝剤、溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、およびそれらの任意の組み合わせも含まれる。賦形剤、担体、安定剤、およびアジュバントのさらなる例については、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 8th Ed., Edited by P.J. Sheskey, W.G. Cook, and C.G. Cable, Pharmaceutical Press, London, UK［2017］を参照。薬学的活性物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において既知である。

【0119】

企図される細菌は、凍結乾燥状態（任意に１つ以上の適切な凍結保護剤を伴う）、冷凍（例えば、標準又は過冷却フリーザー内）、噴霧乾燥、及び／又は凍結乾燥を含む、当業者に知られているように、任意の形態、例えば安定形態で開示される組成物に使用することができる。安定な製剤または組成物は、その中の生物学的活性物質が、保存時にその物理的安定性、化学的安定性、および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。安定性は、選択された温度および湿度条件下で、選択された期間にわたって測定することができる。傾向分析を用いて、材料が実際にその期間保管される前に予想される保存期間を推定することができる。生きた細菌の場合、例えば、安定性は、温度、湿度及び期間の予め定められた条件下で１ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇの乾燥製剤を失うのに要する時間として定義することができる。

【0120】

本明細書に開示される細菌は、１つ又は複数の凍結保護剤と組み合わせてもよい。例示的な凍結保護剤には、フルクトリゴ糖（例えば、ラフィロース（登録商標））、トレハロース、マルトデキストリン、アルギン酸ナトリウム、プロリン、グルタミン酸、グリシン（例えば。グリシンベタイン）、モノ、ジ、またはポリサッカライド（グルコース、スクロース、マルトース、ラクトースなど）、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、グリセロールなど）、デキストラン、ＤＭＳＯ、メチルセルロース、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、Ｔｗｅｅｎ８０などのノニオン性界面活性剤、および／またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0121】

医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化されるべきである。本明細書に開示される企図された細菌組成物は、任意の適切な方法によって調製することができ、様々な形態に製剤化し、多数の異なる手段によって投与することができる。想定される組成物は、所望により従来から許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む製剤で、経口、直腸、または腸に投与することができる。本明細書で使用される場合、「直腸投与」は、浣腸、座薬、または結腸鏡検査による投与を含むと理解される。開示された医薬組成物は、例えば、ボーラス投与またはボーラス放出に適するかもしれない。例示的な実施形態では、開示された細菌組成物は、経口投与される。

【0122】

経口投与のための固形剤形には、カプセル、錠剤、カプレット、丸薬、トローチ、トローチ剤、粉末、顆粒が含まれる。カプセルは、典型的には、細菌組成物からなるコアと、コアをカプセル化するシェルとからなる。いくつかの実施形態では、コアは、固体、液体及びエマルジョンのうちの少なくとも１つからなる。いくつかの実施形態では、シェル材料は、軟質ゼラチン、硬質ゼラチン及びポリマーのうちの少なくとも１つからなる。適切なポリマーには、以下が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、サクシネートヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース性高分子、アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート、アンモニオメチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルメタクリレートおよび／またはエチルメタクリレートから形成されるポリマー（例えば、オイドラギッド（登録商標）という商品名で販売されているそれらのコポリマー）、ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸フタル酸、酢酸ビニル－クロトン酸コポリマー、エチレン酢酸ビニルコポリマーなどのビニルポリマーおよびコポリマーおよびシェラック（精製ラック）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーが味覚マスキング剤として機能する。

【0123】

錠剤、丸薬などは、圧縮、多重圧縮、多重層化および／またはコーティングすることができる。企図されるコーティングは、単一または複数であることができる。一実施形態では、企図されるコーティング材料は、植物、菌類及び微生物の少なくとも１つから抽出されたサッカライド、多糖類及び糖タンパク質の少なくとも１つを含んでいる。非限定的な例としては、コーンスターチ、小麦スターチ、ジャガイモスターチ、タピオカスターチ、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン。アラビアガム、ローカストビーンガム、メスキートガム、グアーガム、カラヤガム、ガッティガム、トラガカントガム、フノリ、カラギーナン、ポルフィラン、寒天、アルギン酸塩、キトサンまたはジェランガムが挙げられる。いくつかの実施形態では、企図されるコーティング材料は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、企図されるコーティング材料は、脂肪及び油のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも一方は、高温溶融性である。いくつかの実施形態では、脂肪および油の少なくとも一方は、水素化または部分的に水素化されている。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも一方は、植物に由来する。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも一方は、グリセリド、遊離脂肪酸及び脂肪酸エステルの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、企図されるコーティング材料は、少なくとも１つの食用ワックスを含んでいる。企図される食用ワックスは、動物、昆虫または植物に由来し得る。非限定的な例としては、蜜蝋、ラノリン、ベイベリーワックス、カルナウバワックス及び米ぬかワックスが挙げられる。錠剤および丸薬は、さらに、腸溶性コーティングまたは逆腸溶性コーティングを用いて調製することができる。

【0124】

あるいは、本明細書に開示された細菌組成物を具現化した粉末または顆粒は、食品に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、企図される食品は、経口投与用の飲料である。 好適な飲料の非限定的な例としては、水、果汁、果実飲料、人工的に味付けした飲料、人工的に甘くした飲料、炭酸飲料、スポーツ飲料、液体日記製品、シェイク、アルコール飲料、カフェイン入り飲料、乳児用調製粉乳等が挙げられる。経口投与のための他の適切な手段としては、適切な溶媒、保存料、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、着色剤および香味剤の少なくとも１つを含む水性および非水性溶液、乳濁液および非発泡性顆粒から再構成した溶液および／または懸濁液が挙げられる。

【0125】

本明細書に開示される細菌を含む医薬組成物は、単位投与形態、すなわち医薬単位で提示することができる。組成物、例えば本明細書で提供される医薬単位は、細菌の総質量又はコロニー形成単位のいずれかによって測定される、任意の適切な量の細菌を含むことができる。

【0126】

例えば、開示される医薬組成物又はユニットは、約１０^３ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^９ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^１０ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^１１ｃｆｕから約１０^１２ｃｆｕ、約１０^３ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^９ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^１０ｃｆｕから約１０^１１ｃｆｕ、約１０^３ｃｆｕから約１０^１０ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^１０ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕから約１０^１０ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕから約１０^１０ｃｆｕ、約１０^９ｃｆｕから約１０^１０ｃｆｕ、約１０^３ｃｆｕから約１０^９ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^９ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕから約１０^９ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕから約１０^９ｃｆｕ、約１０^３ｃｆｕから約１０^８ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^８ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕから約１０^８ｃｆｕ、約１０^３ｃｆｕから約１０^７ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕから約１０^７ｃｆｕ、または約１０^３ｃｆｕから約１０^６ｃｆｕの各菌株を含んでいてもよいし、約１０^３ｃｆｕ、約１０^６ｃｆｕ、約１０^７ｃｆｕ、約１０^８ｃｆｕ、約１０^９ｃｆｕ、約１０^１０ｃｆｕ、約１０^１１ｃｆｕまたは約１０^１２ｃｆｕの各菌株を含んでいてもよい。

【0127】

特定の実施形態では、医薬組成物又はユニットは、制御分子をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、被験者に投与されたときに細菌の生存能力を維持するのに十分な量の制御分子を含んでいる。例えば、制御分子は、１回の投与当たり約１０ｍｇから約１００ｇの量で存在してもよい。特定の実施形態では、制御分子は、用量当たり約１０ｍｇから約１０ｇ、用量当たり約１０ｍｇから約１ｇ、用量当たり約１０ｍｇから約１００ｍｇ、用量当たり約１００ｍｇから約１ｇ、用量当たり約１００ｍｇから約１０ｇ、用量当たり約１００ｍｇから約１００ｇ、用量当たり１ｇから約１０ｇ、用量当たり約１ｇから１００ｇ又は用量当たり約１０ｇから約１００ｇまでの量にて存在してもよい。

【0128】

ＩＸ．治療用途
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患又は障害を有する対象を治療する方法を提供し、生存率のために制御分子を必要とするように操作された細菌を対象に投与することを含む。該細菌は、治療用トランスジーンを発現してもよい。細菌は、疾患または障害を治療するのに十分な時間、対象への制御分子の投与によって対象内で維持され得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、疾患または障害を有する対象を診断またはモニタリングする方法は、対象に対し、生存能力のために制御分子を必要とするように操作された細菌を投与することを含む。この細菌は、診断用トランスジーンを発現し、疾患または障害を診断または監視するのに十分な時間、対象への制御分子の投与によって対象内で維持され得る。場合によっては、細菌は人から人への感染、または生物から生物への感染が不可能であることもある。制御分子及び細菌は、被験者に経口投与することができる。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの例では、最後の投与から少なくとも１日、２日、３日、４日、１週間または２週間後に、対照分子細菌が対象で検出されることはない。

【0130】

本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象、例えば、ヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、 （ａ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること及び（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患状態の退行を引き起こすことを含む。本明細書で使用される場合、用語「対象」及び「患者」は、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される細菌を指す。そのような生物は、好ましくは、哺乳類、例えば、ヒト、伴侶動物（例えば、犬、猫またはウサギ）、または家畜動物（例えば、牛、羊、豚、ヤギ、馬、ロバ、およびラバ、水牛、牛またはラクダ）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0131】

医薬組成物または細菌の正確な投与量は、治療される患者の観点から個々の医師によって選択されることが理解され、一般に、投与量および投与は、治療される患者に細菌剤の有効量を提供するように調節される。本明細書で使用する「有効量」は、有益なまたは所望の生物学的反応を引き出すために必要な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与、用途または用量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定することを意図していない。当業者には理解されるように、医薬単位、医薬組成物または細菌株の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、標的組織、投与経路などの要因によって変化し得る。 考慮され得る追加の要因には、疾患状態の重症度、治療される患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性並びに治療に対する耐性／反応が含まれる。

【0132】

企図される方法は、細菌のコロニー形成を支援するために、制御分子及び／又は特権的な栄養素を対象に投与することをさらに含むことができる。例示的な特権的栄養素は、海洋多糖類、例えば、ポルフィランを含む。例えば、開示される特権的栄養素は、開示される細菌の前に、それと同時に、またはその後に、対象に投与され得る。

【0133】

企図される方法は、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、週、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月ごとに開示される細菌又は医薬組成物を対象に投与することを含んでよい。特定の実施形態では、開示された細菌又は医薬組成物の対象への連続投与間の時間は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間又は４週間より長い。

【0134】

特定の実施形態では、開示された細菌と、開示された制御分子及び／又は特権的栄養素、例えば、海洋多糖類、例えば、ポルフィランが、同じ頻度で被験者に投与される。例えば、細菌及び特権栄養剤は共に、８時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、週、２週間、３週間、４週間、月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月毎に対象に投与されてもよい。特定の実施形態では、開示された細菌と、開示された制御分子及び／又は特典のある栄養素、例えば、海洋多糖類、例えば、ポルフィランとが、異なる頻度で対象に投与される。例えば、細菌は、８時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月ごとに対象に投与されてもよく、制御分子および／または特典栄養剤は、８時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、週、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月ごとに対象に投与され得る。例えば、特定の実施形態では、細菌は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月ごとに対象に投与されてもよく、特典のある栄養素は、８時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日ごとに対象に投与されてもよい。

【0135】

本明細書に記載の方法及び組成物は、単独で又は他の治療剤及び／若しくは様式と組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるという用語は、ある時点で患者に対する治療の効果が重なるように、被験者が障害を患っている間に、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が被験者に送達されることを意味すると理解される。特定の実施形態では、第２の治療の送達が始まるとき、１つの治療の送達はまだ起こっており、投与の点で重複があるようにする。これは、本明細書において、「同時」または「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の処置の送達は、他方の治療の送達が開始される前に終了する。いずれの場合も特定の実施形態では、複合投与のため、治療がより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、第２の治療が第１の治療の非存在下で投与された場合に見られるであろうよりも、第２の治療の少ない量で同等の効果が見られる、または第２の治療が症状をより大きく軽減する、または類似の状況が第１の治療で見られる。特定の実施形態において、送達は、症状または障害に関連する他のパラメータの低減が、他方の治療がない場合に送達された一方の治療で観察されるであろうものよりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的、または相加的よりも大きくなり得る。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されたときにまだ検出可能であるようなものとすることができる。特定の実施形態では、第１及び／又は第２の治療の副作用は、複合投与のために低減される。

【0136】

特定の実施形態において、本開示は、対象から治療用細菌を除去する方法に関し、細菌は、機能が低下した治療用トランスジーンをコードする（例えば、治療用トランスジーンが変異し、それによってその治療機能を低下又は消失させる）。ある実施形態では、機能の低下は、治療用トランスジーンが非機能的であるような完全な低下である。

【0137】

機能が低下した治療用トランスジーンを有する細菌は、繁殖上の利点を有し、機能的な治療用トランスジーンを有する細菌と競合する可能性がある。したがって、特定の実施形態において、対象は、第１の期間（例えば、６ヶ月、５ヶ月、４ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、２週間、１週間）、対照分子（及び任意に本明細書に開示する細菌）を投与され、その後、対象が対照分子を受け取らない第２の期間（例えば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月）であってよいと企図するものである。第２の期間の間、機能低下した治療用トランスジーンを含む細菌は、対象から除去される。特定の実施形態では、本方法は、機能低下した治療用トランスジーンを含む細菌が対象から除去された後、本明細書に記載の治療レジメンのいずれかに従って、対象が機能治療用トランスジーンを含む細菌を投与される第３の期間をさらに含む。

【0138】

キット
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような細菌を含むキットが提供される。一態様では、そのようなキットは、本明細書に記載の細菌及び細菌における１つ以上の必須遺伝子の発現に必要とされる制御分子を含む。

【0139】

本明細書を通じて、組成物が特定の成分を有する（having）、含む（including）または構成される（comprising）と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含むまたは構成されると記載される場合、さらに、本開示による組成物で、言及した成分から本質的になる、またはそれからなるものが存在し、本開示によるプロセスおよび方法で、言及した処理ステップから本質的になる、またはそれからなるものがあることが企図される。

【0140】

本願において、要素又は成分が、引用された要素又は成分のリストに含まれる及び／又はそこから選択されると言われる場合、要素又は成分は、引用された要素又は成分のうちの任意の１つであり得ること、又は要素又は成分は、引用された要素又は成分のうちの２以上からなる群から選択され得ることを理解されたい。

【0141】

さらに、本明細書に記載される組成物又は方法の要素及び／又は特徴は、本明細書に明示されているか暗黙のうちにかかわらず、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく様々な方法で組み合わせることができることを理解されたい。例えば、特定の化合物に言及する場合、その化合物は、文脈から特に理解されない限り、本開示の組成物の様々な実施形態及び／又は本開示の方法において使用することが可能である。言い換えれば、本願内で、実施形態は、明確かつ簡潔な願書を書き、描くことを可能にする方法で説明され、描かれてきたが、本教示及び開示から離れることなく、実施形態を様々に組み合わせ又は分離することが意図され、理解されよう。例えば、本明細書で説明され描かれた全ての特徴は、本明細書で説明され描かれた開示の全ての態様に適用可能であることが理解されよう。

【0142】

「少なくとも１つの」という表現は、文脈や用途から他に理解されない限り、表現以降の各記載対象及び２つ以上の記載対象の様々な組み合わせを個別に含むと理解されるべきである。３つ以上の言及されたオブジェクトに関連する表現「および／または」は、文脈から他に理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。

【0143】

用語「含む（include）、（includes）、（including）」、「持つ（have）、（has）、（having）」または「含む（contain）、（contains）、（containing）」（その文法的等価物を含む）の使用は、特に明記するか文脈から理解しない限り、例えば、追加の非引用要素またはステップを除外しない、オープンエンドおよび非限定として概して理解されるべきである。

【0144】

用語「約」の使用が定量値の前である場合、本開示は、特に断らない限り、特定の定量値自体も含む。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記又は推論されない限り、公称値からの±１０％の変動又は対数スケールでの±１０倍の変動を意味する。

【0145】

本開示が動作可能である限り、特定の動作を実行するためのステップの順序又は順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたはアクションが同時に実施されてもよい。

【0146】

本明細書における任意の及び全ての例又は例示的な言語、例えば「例えば」又は「含む」の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、請求されない限り本開示の範囲に制限を与えることはない。本明細書におけるいかなる文言も、請求されていない要素を本開示の実施に必須であると示すものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0147】

以下の実施例は、単なる例示であり、決して本開示の範囲及び内容を限定するものではない。

【0148】

実施例１ － 優先栄養素制御配列の同定
ハイブリッド２成分系（ＨＴＣＳ）活性化に対する必須遺伝子活性の機能的連結は、適切な制御分子の同定を必要とする。適切な制御分子の特徴は、消費に安全であり、宿主によって吸収され得ず、平均的な宿主食餌において最小限の存在であり、宿主微生物叢によって消費され得ないことである。例えば、紅藻ポルフィラ・ウンビリカリス（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｕｍｂｉｌｉｃａｌｉｓ）に見出される海洋多糖であるポルフィランは、よく適した分子として同定された。試験したさらなる例示的な分子には、アガロース及びアンヒドロテトラサイクリンが含まれた。

【0149】

多糖利用のための可動遺伝因子（多糖利用遺伝子座又はＰＵＬと呼ばれる）を同定するために、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）を、唯一の炭素源として０．８％ノリ抽出物の形態で２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン及びポルフィランを含有する最小培地中に２００倍希釈した。一次排水を回収し、約２時間沈澱させ、培地中に１０倍希釈し、これを次いで３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートすることによって選択を行った。次いで、培養物を新鮮な培地中にさらに２００倍希釈し、３７℃でさらに２４時間嫌気的にインキュベートした。次いで、飽和培養物を連続希釈としてＢｌｏｏｄ－Ｈｅａｒｔ－Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地＋１０％ウマ血液寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で嫌気的に２４時間インキュベートした。次いで、コロニーを新鮮な培地に取り、３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートして、分析及び低温保存のために調製した。

【0150】

例示的な株ＮＢ００１、ＮＢ００２及びＮＢ００３を、増殖可能であるとして選択し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ又はｉＳｅｑによって単離及び配列決定した。相同性検索を行って、それらの活性に関連する多糖利用遺伝子座（ＰＵＬ）を同定した。ＮＢ００１、バクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）の株は、Ｈｅｈｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（２０１０），ＮＡＴＵＲＥ ４６４：９０８－９１２からのポルフィランについて以前に公表されたＰＵＬと９８．１％の同一性を有し、推定ポルフィラン誘導性ＨＴＣＳ（配列番号１８及び１９）を含有するＰＵＬ（配列番号１４）を含有した。バクテロイデス・ドレイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ）（配列番号１５）の株であるＮＢ００２及びバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）（配列番号１６）の株であるＮＢ００３において、新規なアガラーゼ含有ＰＵＬが同定された。このＰＵＬは、推定アガロース応答性ＨＴＣＳ（配列番号：２２及び２３）を含んでいた。ＮＢ００４は、テトラサイクリン耐性を示し、既知のテトラサイクリン耐性遺伝子（配列番号：２４及び２５）と高度に相同なＴＣＳ駆動オペロンを含んでいた。同定された例示的なＨＴＣＳ及びＴＣＳを利用して、必須遺伝子活性をポルフィラン、アガロース又はアンヒドロテトラサイクリンに連結することができる。

【0151】

＞７８キロベースのポルフィランＰＵＬ（配列番号１～１０）の分析に続いて、１０個の候補プロモーター配列を合成した。各候補をルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合させ、ポルフィランの非存在下又は０．２％ポルフィランの存在下で発光を定量した。結果を表２に記載する。プロモーター配列の６つは、ポルフィランに応答し、Ｐ＿ｐｏｒ１０（配列番号８）は、図３Ａに示すように、ポルフィラン添加時に最大の発現を示した。アガロース（配列番号２２及び２３）及びアンヒドロテトラサイクリン（配列番号２４及び２５）に応答するさらなるプロモーターを同定し、図３Ｂ、３Ｃに示す。

【0152】

【表2】

【0153】

最大の誘導倍率を示したＰ＿ｐｏｒ１０を、生物学的封じ込めにおける使用のために選択した。図４Ａ（配列番号２６）に示すように、Ｐ＿ｐｏｒ１０駆動ルシフェラーゼを保有する株ＮＢ００１を用いて、ポルフィラン誘導曲線を特徴付けた。ルシフェラーゼタンパク質発現をポルフィラン依存性転写レベルのレポーターとして使用し、発光／ＯＤ_{６００ｎｍ}によって定量した。ルシフェラーゼのほぼ１，０００倍の誘導が、図４Ｂに示すように、約１０^－７～２×１０^－４ポルフィラン抽出物の濃度（重量／体積）間で観察された。

【0154】

Ｐ＿ｐｏｒ１０ ＨＴＣＳ単独がルシフェラーゼ発現に十分であるかどうかを調べるために、Ｐ＿ｐｏｒ１０ルシフェラーゼコンストラクト（配列番号２６）を、その天然プロモーター下でのポルフィランＨＴＣＳ（配列番号１８及び１９）の発現を含むように改変した。得られたコンストラクト（配列番号２７）を、完全ポルフィランＰＵＬ、ＮＢ００１又はポルフィランＰＵＬ、ＮＢ００４を欠く株のいずれかを含む株に移した。発光出力を測定し、ポルフィランＰＵＬを有する株は、ポルフィラン依存性ルシフェラーゼ誘導を示したが、ＨＴＣＳのみを含む株は、ポルフィラン依存性誘導を示さなかった（図５）。これらの結果は、ＨＴＣＳ及び追加遺伝子がポルフィラン応答プロモーターの誘導に必要であることを示唆する。例えば、ＳｕｓＣ及びＳｕｓＤ遺伝子（配列番号２０及び２１）は、ＨＴＣＳ（配列番号１８及び１９）に加えて、複合多糖上のポルフィラン応答性プロモーター（配列番号１、２及び７～１０）の誘導に必要であり得る。

【0155】

実施例２－インビトロ優先栄養素依存性生物封じ込め
実施例１で同定したポルフィラン増殖用ＰＵＬ（Ｐ＿ｐｏｒ１０）を用いて、必須遺伝子ｔｈｙＡ、チミジル酸シンテターゼのポルフィラン依存性誘導を発現するバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）株を作製した。内因性ｔｈｙＡ（配列番号２８）を、Ｋｏｒｏｐａｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ，（２００８）ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ １６：１１０５－１１１５に記載されているのと同様の方法を用いて、トリメトプリム及びチミジン対抗選択の修飾によりノックアウトし、株ＮＢ０２３を得た。変性したリボソーム結合部位（ＲＢＳ）（配列番号３０）を有するＰ＿ｐｏｒ１０（配列番号８）駆動型ｔｈｙＡ－ルシフェラーゼプラスミドを作製し、図６Ｂに示す。このプラスミドをＮＢ０２３に組み込んだ。この株を、クロロフェニルアラニン対抗選択を伴う最小培地中で増殖させ、ＢＨＩＳ寒天プレート上に画線し、ＧＦＰ陽性及び／又はクロラムフェニコール耐性を示すコロニーを選択し、ＰＣＲ及びサンガー法によって遺伝子プロモーター置換について検証した。

【0156】

個々のＲＢＳライブラリーメンバーをｔｈｙＡ発現についてアッセイした。それぞれを、チミジンを含有する培地中で増殖させ、次いでチミジンを含有しないが、ポルフィランを含有する培地中に希釈した。固有のＲＢＳを有する株を、図６Ａに描写される発光及び最終ＯＤ_{６００ｎｍ}についてアッセイした。高ＯＤ_{６００ｎｍ}まで増殖することができる株の全ては、同様のレベルの発光を示し、狭範囲のｔｈｙＡ発現が増殖に許容可能であることを示唆した。ｔｈｙＡ欠失を最もよく相補したＮＢ０２４株を配列決定し（配列番号３１）、さらなる実験のために選択した。

【0157】

図６Ｃは、栄養素可変培地におけるＮＢ０２４、野生型株ＮＢ００１及びｔｈｙＡ欠失株ＮＢ０２３についての増殖アッセイの結果を示す。３つの株の全ては、チミジンを含有する培地中で増殖することができる（破線）。野生型ＮＢ００１のみが標準的なＢＨＩＳ培地（点線）中での増殖を示す。ポルフィランを添加したＢＨＩＳ（実線）では、ＮＢ０２４は、野生型に匹敵するレベルで増殖するが、おそらくｔｈｙＡ誘導に必要な時間により、わずかな初期の遅れを伴う。ｔｈｙＡ欠失株ＮＢ０２３は、ポルフィランを添加したＢＨＩＳ培地で増殖しない。

【0158】

ＮＢ０２４のさらなる試験は、図６Ｄに描写されるＢＨＩＳ培地におけるポルフィラン濃度依存性増殖応答を実証した。まとめると、これらの結果は、ポルフィラン応答性ＨＴＣＳ（配列番号１８及び１９）の機能的連結及び必須遺伝子ｔｈｙＡの発現を実証する。

【0159】

ＮＢ０２４生物学的封じ込めのエスケープ率を評価した。ＮＢ０２４を、チミジンを添加したＢＨＩＳプレート上にプレーティングし、５つの個々のコロニーを採取した。コロニーを、０．２％ノリ抽出物（ポルフィラン）を添加したＢＨＩＳ中で１４時間、３７℃で増殖させた。次いで、飽和培養物をポルフィラン欠損ＢＨＩＳ寒天上に均一に又は連続希釈によりプレーティングした。嫌気性増殖の４８時間後に見えるコロニーを、エスケープコロニーとみなした。３，５００，００個中約１個の細胞が、ポルフィラン添加を欠くプレート上で増殖を示した。

【0160】

実施例３－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）における必須天然遺伝子の優先栄養素プロモーター制御の設計
生物学的封じ込め戦略を追加の必須遺伝子に拡張するために、必須遺伝子の内因性プロモーターを、図７（配列番号３２）に示すポルフィラン誘導性プロモーターで置き換えるベクターを開発した。この置換法では、相同組換えを用いて、目的の遺伝子のプロモーターをポルフィラン誘導性プロモーター及び変性ＲＢＳライブラリーを含むカセットで置換し、増殖に許容可能な適切な翻訳強度を見出す。テトラサイクリン選択は、プラスミドの組み込みの同定を可能にする一方、４－クロロフェニルアラニンに対する対抗選択及びＧＦＰ陽性コロニーの選択は、天然のプロモーター置換の同定を可能にする。

【0161】

プラスミドｐＷＤ０３５（配列番号３３）を使用して、ポルフィラン利用遺伝子座を、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ｅｔ ａｌ，（２０１８）ＮＡＴＵＲＥ ５５７：４３４－４３８に記載されるように組み込んで、株ＮＢ０７５を作製した。４つの必須遺伝子、アルギニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａｒｇＳ）、システイニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ｃｙｓＳ）、ペニシリン耐性タンパク質（ｌｙｔＢ）又はペプチド鎖放出因子（ＲＦ－２）の１つの天然プロモーターを、プロモーター置換系（それぞれ配列番号３２、３４、３５及び３６）を用いて置換した。０．２％ポルフィラン存在下で増殖可能な株を適切な翻訳強度を同定するために単離し、配列決定を行った。各必須遺伝子のコンストラクトは、以下の通りである：ａｒｇＳ、配列番号３２；ｃｙｓＳ、配列番号３４；ｌｙｔＢ、配列番号３５；ＲＦ－２、配列番号３６。生物学的に封じ込めされた株のｓＷＷ０９０（ｔｈｙＡ）、ｓＷＷ１８０（ａｒｇＳ）、ｓＷＷ２０２（ｃｙｓＳ）、ｓＷＷ２０５（ｌｙｔＢ）及びｓＷＷ２０６（ＲＦ－２）は、ＢＨＩＳのみの培地で増殖しないが、ポルフィランを添加したＢＨＩＳで増殖する。結果を図８に示す。

【0162】

これらの生物学的に封じ込めされた株のエスケープダイナミクス及び潜在的機構をモニターするために、生物学的に封じ込めされていない株及び生物学的に封じ込めされた株を、０．５％ポルフィランを含有するケモスタット中で増殖させ、連続的に希釈し、８．７時間ごとに培地容量を交換した。野生型株ｓＺＲ０１０３は、１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌを超える密度に急速に到達し、その密度を維持した。ａｒｇＳ生物学に的封じ込めされた株ｓＺＲ０２０５も、１０^９ＣＦＵ／ｍｌを超える密度に到達したが、ポルフィランが消費され、培地から希釈されるにつれて、光学密度が急速に低下した（約５００倍）。図９に示すように、ポルフィラン補充への依存性をエスケープした生物学的に封じ込めされた株の突然変異細胞は、アッセイの２日目までに出現し、４日目までに野生型に匹敵するレベルに近づいた。エスケープ株の配列決定の結果、評価した３３１のエスケープコロニーのうち、エスケープコロニーの９４％は、ＨＴＣＳを恒常的に活性化するＨＴＣＳに対する４８のユニークな突然変異の１つであり、４％は、ポルフィラン誘導性プロモーターへのトランスポゾン挿入であり、２％は、生物学的に封じ込めされた遺伝子の直接上流のゲノム再編成であった。

【0163】

実施例４－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）のインビトロ優先栄養素依存性生物学的封じ込め
インビボでの生物学的閉じ込めの有効性を実証するために、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにポルフィランを添加した食餌を与え、非生物学的封じ込め株であるｓＷＷ８０８又は追加の抗生物質マーカーを有する生物学的封じ込め株ｓＷＷ１８０の改変体であるｓＷＷ８０５のいずれかに１０^９ＣＦＵを投与した。両方の株は、ポルフィランを消費するように改変され、両方の株は、競合環境を確保するために非ポルフィラン消費野生株と共投与された。コロニー形成は、各群のラットの半分は、ポルフィランを有さない食餌に切り替える前に３日間起こったが、残りの半分は、ポルフィラン添加食餌に残った。毎日糞便中の株量をモニターしたところ、生物学的封じ込め株は、ポルフィラン非存在下で腸管から速やかに除去されることが観察された一方、野生型株では、図１０に示した優先栄養素であるポルフィランが存在しないため、１０倍の個体数の減少が認められた。生物学的封じ込め株を非競合環境で試験した場合、ポルフィランの除去後、エスケープ株は、実施例３で特徴付けられたものと同様に、必須遺伝子の恒常的発現をもたらす突然変異を有することが見出された。

【0164】

実施例５－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）におけるハイブリッド２成分優先栄養素制御の操作
生物学的封じ込め株のエスケープ率を減少させるために、第２の優先栄養素制御を用いて冗長性を組み込んだ。ポルフィラン誘導性プロモーターによって駆動されるｃｙｓＳ発現を有する株ｓＷＷ２０２を用いて、ａｒｇＳ発現のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導性制御を導入した。株ｓＣＧ０３７を生成するために、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ，（２０１７）ＣＥＬＬ １６９：５４７－５５８に以前に記載されたａＴｃ誘導性プロモーター及びＲＢＳライブラリーを使用して、実施例３に記載されたものと同様にａＴｃ生物学的封じ込めプラスミド（配列番号３７、図１１）の組み込みを行った。ｓＣＧ０３７は、増殖のためにポルフィラン及びａＴｃ補充の両方を必要とすることが予測され、これは、インビトロで観察され、図１２に示された。

【0165】

エスケープダイナミクスをモニターし、冗長性がエスケープ率を低下させるかどうかを評価するために、非生物学的封じ込め株（ＮＢ０７５）及び二重生物学的封じ込め株ｓＣＧ０３７を、０．２％ポルフィラン及び１０ｎｇ／ｍｌ ａＴｃを含有するケモスタット中で増殖させ、これを培地から連続希釈した。両方の株は、最初に１０^９ＣＦＵを超える濃度に達し、４日目までに培地からポルフィラン及びａＴｃを除去すると減少し、検出限界（１０^３．５細胞／フラスコ）に達した。７日目にポルフィラン及びａＴｃを培地に戻して添加し、生物学的封じ込め細胞が生存し、増殖可能であったかどうかを評価した。２日後、生物学的封じ込め株の増殖は、検出されず、これは、全ての二重生物学的封じ込め細胞が除去されたことを示唆する。結果を図１３に示す。

【0166】

実施例６－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）におけるキメラハイブリッド２成分系優先栄養素制御の操作
単一の制御分子の投与が複数の必須遺伝子の発現と連結するように治療株を単純化するために、キメラＨＴＣＳを設計した。このようなキメラＨＴＣＳの一実施形態では、１つのＨＴＣＳのセンサーが第２のＨＴＣＳのＤＮＡ結合領域に連結される。これは、キメラＨＴＣＳが第１のＨＴＣＳの制御分子を感知するが、第１のＨＴＣＳと異なるプロモーターを標的とするように、第２のＨＴＣＳのセンサードメインを第１のＨＴＣＳのセンサードメインで置き換えることによって行うことができる。

【0167】

ポルフィランＹ＿Ｙ＿Ｙドメイン（配列番号１９、残基６８３～７４７）に対して高い相同性を有するシグナル伝達Ｙ＿Ｙ＿Ｙドメインを有するＨＴＣＳをキメラＨＴＣＳの生成における使用について試験した。新しく設計されたプロモーターは、キメラＨＴＣＳのみに応答し、宿主によって産生されるか若しくは宿主によって一般的に遭遇される分子又は宿主に天然の他のＨＴＣＳ若しくは他のレギュレーターに応答しないことを考慮することが重要であるため、ＨＴＣＳは、生物学的封じ込め株に存在しないか又は稀にのみ見出される調節ドメインを含むべきである。従って、このセットは、他のＨＴＣＳ調節ドメイン、特に標的株中のＨＴＣＳ調節ドメインに対して高い相同性を有するＨＴＣＳを除去することによって精密化された。

【0168】

バクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）由来の第１のＨＴＣＳ（配列番号５１）、バクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）由来の第２のＨＴＣＳ（配列番号３８）及びバクテロイデス・サリエルシアエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）由来のＨＴＣＳ（配列番号５２）を実験のために選択した。これらの３つのＨＴＣＳのそれぞれのＣ末端領域（調節ドメインを含む）をポルフィランＨＴＣＳ（配列番号１９、実施例１に記載の通り）のＮ末端領域（ポルフィランセンサードメインを含む）に融合させた。本発明者らは、多くの異なる融合位置を試験し、ポルフィランＨＴＣＳのＹ＿Ｙドメインの直接下流の、内膜の推定ペリプラズム側の５残基内の位置（ポルフィランＨＴＣＳの残基７５３、配列番号１９）が、機能的キメラを生成するための最も確かな位置であることを見出した。ポルフィランＨＴＣＳのセンサードメイン及びバクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）由来の第１のＨＴＣＳの調節ドメインを含むキメラＨＴＣＳを生成した。このＨＴＣＳは、ＨＴＣＳ－１７１０６（配列番号５３）と呼ばれ、ＨＴＣＳ－１７１０６をコードする例示的なベクターは、ｐＷＷ１２６６（配列番号５５）と呼ばれる。バクテロイデス・サリエルシアエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）由来のポルフィランＨＴＣＳのセンサードメイン及びＨＴＣＳの調節ドメインを含むキメラＨＴＣＳを生成した。このＨＴＣＳは、ＨＴＣＳ－１０８０９（配列番号５４）と呼ばれ、ＨＴＣＳ－１０８０９をコードする例示的なベクターは、ｐＷＷ１２６５（配列番号５６）と呼ばれる。ポルフィランＨＴＣＳのセンサードメイン及びバクテロイデス・ノルジイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｎｏｒｄｉｉ）由来の第２のＨＴＣＳの調節ドメインを含むキメラＨＴＣＳを生成した。このＨＴＣＳは、ＨＴＣＳ－１７１５０（配列番号３９）と呼ばれ、ＨＴＣＳ－１７１５０をコードする例示的なベクターは、ｐＷＷ１２６７（配列番号４０）と呼ばれる。ｐＷＷ１２６７の概略図を図１４Ｂに示す。

【0169】

キメラＨＴＣＳのそれぞれに応答するプロモーターを同定した。ＨＴＣＳ－１７１０６に応答するプロモーターを配列番号６２に示し、ＨＴＣＳ－１０８０９に応答するプロモーターを配列番号６３に示す。キメラＨＴＣＳのそれぞれについてのルシフェラーゼレポーターを、対応するプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子に結合することによって生成した。ＨＴＣＳ－１７１０６のルシフェラーゼレポーターは、配列番号５７に示され、ＨＴＣＳ－１０８０９のルシフェラーゼレポーターは、配列番号５８に示され、ＨＴＣＳ－１７１５０のルシフェラーゼレポーターは、配列番号４１に示される。ポルフィラン利用遺伝子座（実施例３に記載の通り）及び上記のルシフェラーゼレポーターの１つを含むバクテロイデス・ブルガツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）株を、空のベクター又は関連するキメラＨＴＣＳを発現するコンストラクトのいずれかでさらに改変した。キメラＨＴＣＳの存在下において、ポルフィラン応答性ルシフェラーゼ発現は、図１４Ｃに示されるように、各キメラＨＴＣＳについて観察された。キメラＨＴＣＳは、例えば、実施例５に記載される系と同様に、単一の制御分子を使用するという利点を伴って、生物学的封じ込めのエスケープ率を減少させるために、野生型ポルフィラン応答性ＨＴＣＳと組み合わせて使用され得る。

【0170】

実施例７－標的化変異を介する改善されたキメラハイブリッド２成分系の操作
生物学的封じ込め株の生成を補助するために、ＨＴＣＳ－１７１５０（配列番号３９、実施例６に記載の通り）を、ポルフィラン応答性を改善するために変異させた。膜貫通領域の残基（残基７５３～７７７）を変性オリゴでの増幅による変異の標的とし、得られたｐＷＷ１２６７発現コンストラクトの改変体（配列番号４０）を、図１５Ａに示すように、ポルフィラン利用遺伝子座（実施例３に記載の通り）及びキメラＨＴＣＳ関連ルシフェラーゼレポーター（配列番号４１、実施例６に記載の通り）を含有するバクテロイデス・ブルガツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）株に付加した。次いで、ＨＴＣＳ－１７１５０変異体を含む株をポルフィランの存在下又は非存在下での活性についてスクリーニングした。結果を図１５Ｂに示す。図１５Ｂの各点は、ＨＴＣＳ－１７１５０変異体を発現する株を表し、対角線に沿った点は、もはやポルフィランに応答せず、プロットの左上部分の点は、ポルフィランの存在下で所望のより高い活性を示し、ポルフィランの非存在下でより低い活性を示す。対照（非変異ＨＴＣＳ－１７１５０を発現する株、図１５Ｂに正方形として示される）と比較して、改善されたポルフィラン応答性を有する多数の株が同定された。図１５Ｃに示すように、選択した株を再画線し、反復試験した。コンストラクトｐＷＷ１３３３（配列番号６０）を含む例示的な株は、ポルフィランの非存在下でより低い活性を示し、ポルフィランの存在下でより高い活性を示した。ｐＷＷ１３３３は、ＨＴＣＳ－１７１５０ｖ２と呼ばれ、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する変異体ＨＴＣＳ－１７１５０を発現した。ＨＴＣＳ－１７１５０ｖ３－ＨＴＣＳ－１７１５０ｖ１０と呼ばれるさらなる改善された変異体ＨＴＣＳは、それぞれ配列番号６４～７１に示されるアミノ酸配列を有する。

【0171】

実施例８－操作されたキメラハイブリッド２成分系の直交性
第１及び第２のＨＴＣＳ（例えば、野生型ＨＴＣＳ及びキメラＨＴＣＳ）を用いて二重生物学的封じ込めを実施する場合、第１のＨＴＣＳの活性化は、第２のＨＴＣＳに関連するプロモーターを活性化しないことが重要である。さもなければ、単一のＨＴＣＳにおける活性化エスケープ変異は、エスケープのために十分であり得る。本実施例に記載されるＨＴＣＳの直交性を実証するために、本発明者らは、（ｉ）ＨＴＣＳ－１７１５０ｖ２応答性プロモーター（配列番号４５）と組み合わせた野生型ポルフィラン応答性ＨＴＣＳ（配列番号１９）、及び（ｉ）野生型ポルフィラン応答性プロモーター（配列番号８）と組み合わせたキメラＨＴＣＳ－１７１５０ｖ２（実施例７に記載の通り）を試験した。各ＨＴＣＳは、対照としてその関連プロモーターも用いて試験した。結果を図１６に示し、野生型ポルフィラン応答性ＨＴＣＳ及びＨＴＣＳ－１７１５０ｖ２に関連するプロモーターは、他のＨＴＣＳの存在下で活性化されず、関連するＨＴＣＳ及びポルフィランの両方が存在する場合にのみ活性化されることを示す。

【0172】

実施例９－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）における二重ハイブリッド２成分系優先栄養素制御の操作
この実施例は、二重生物学的封じ込めを実施するための、第１及び第２のＨＴＣＳ（ポルフィラン応答性野生型ＨＴＣＳ及びポルフィラン応答性キメラＨＴＣＳ）を含む株の生成を記載する。

【0173】

バクテロイデス・ブルガツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）株（ｓＷＷ８１０）を、（実施例３に記載のプラスミドｐＷＤ０３５（配列番号３３）を使用し、またキメラＨＴＣＳ（実施例７に記載の配列番号５９）も発現する）ポルフィラン消費が可能であるように改変した。この株をさらに改変して、必須遺伝子ペニシリン耐性タンパク質（ｌｙｔＢ）の天然プロモーターを、ＨＴＣＳ（配列番号４５）に応答するプロモーターで置き換えた。プロモーターは、実施例３で上記したプロモーター置換系を用いて置き換えた。簡潔には、この置換方法は、相同組換えを用いて、天然プロモーターを、目的のプロモーター及び変性ＲＢＳライブラリーを含むカセットで置き換え、増殖に許容される適切な翻訳強度を見出す。０．２％ポルフィランの存在下でのみ増殖することができる生物学的封じ込め株が単離され、ｓＷＷ９３９と呼ばれる。適切な結果として生じる翻訳強度を有する、ｓＷＷ９３９由来のカセットを含むコンストラクトは、ｐＺＲ３００７（配列番号６１）と呼ばれる。

【0174】

株ｓＷＷ１８０（実施例３に記載の通りであり、ａｒｇＳの発現を駆動する野生型ポルフィランＨＴＣＳで生物学的に封じ込めされた）をｐＺＲ３００７でさらに改変して、キメラＨＴＣＳの制御下でｌｙｔＢも有する二重生物学的封じ込め株（ｓＷＷ９４２）を生成した。非生物学的封じ込め株（ＮＢ０７５）、２つの単一生物学的封じ込め株（ｓＷＷ１８０及びｓＷＷ９３９）及び二重生物学的封じ込め株（ｓＷＷ９４２）を、ＢＨＩＳ培地のみ及びポルフィランを添加したＢＨＩＳ培地中での増殖について試験した。結果を図１７に示す。

【0175】

増殖ダイナミクス及び潜在的エスケープ能力を比較するために、非生物学的封じ込め株（ＮＢ０７５）、単一生物学的封じ込め株（ｓＷＷ１８０）及び二重生物学的封じ込め株（ｓＷＷ９４２）を、最初に０．５％ポルフィランを含有するケモスタット中で増殖させ、これを、ポルフィランを欠く培地で連続的に希釈し、１１時間毎に培地容量を交換した（図９に関連する実験設定と同様）。結果を図１８に示す。非生物学的封じ込め株（ＮＢ０７５）は、１０^９ＣＦＵ／ｍｌを超える濃度に迅速に達し、これを維持した。単一生物学的封じ込め株（ｓＷＷ１８０）も、１０^９ＣＦＵ／ｍｌを超える密度に達したが、ポルフィランが消費され、培地から希釈されるにつれて、最初に密度が急速に低下した（１００倍を超える）。しかしながら、生物学的封じ込め株の変異体細胞は、ポルフィラン補充に対するそれらの依存性をエスケープしたため、単一生物学的封じ込め株は、４日目までに野生型に匹敵するレベルに近づいた。二重生物学的封じ込め株（ｓＷＷ９４２）は、最初に、単一生物学的封じ込め株と同様に密度が低下したが、エスケープ変異体は、決して現れず、密度は、検出限界未満に低下した。３２日後、ポルフィランを培地に添加して、任意の生存する二重生物学的封じ込め細胞の増殖を促進したが、ポルフィランでの３日後、二重生物学的封じ込めケモスタットから細胞を回収することはできなかった。これは、ある時点で３００億個を超える細胞を保有していたケモスタットが、ポルフィランを欠くリッチ培地中で二重生物学的封じ込めによって滅菌されたことを示している。

【0176】

実施例１０－ヒト微生物叢を有するマウスにおけるインビボ生物学的封じ込め
この実施例は、ヒト微生物叢を有するマウスにおけるインビボでの生物学的封じ込めを記載する。

【0177】

バクテロイデス・ブルガツス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）株を、（プラスミドｐＷＤ０３５（配列番号３３）を使用して）ポルフィラン消費が可能であるように改変して、株ＮＢ１４４を生成した。ＮＢ１４４を、プラスミドｐＺＲ２８３７（配列番号７２）を使用して生物学的封じ込めのためにさらに改変して、株ｓＺＲ０３２３を生成した。ｓＺＲ０３２３株において、ａｒｇＳは、ＲＢＳ（配列番号４７）に関連し、ポルフィランＨＴＣＳ（配列番号１９）に応答するプロモーター（配列番号７３）の制御下にある。

【0178】

無菌Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを無記名の健常ヒトドナー４名（ドナーＡ～Ｄ）のうちの１名からの微生物叢でコロニー形成させた。３週間の微生物叢安定化後、マウスに１０^９ＣＦＵのＮＢ１４４又はｓＺＲ０３２３のいずれかを投与し、ポルフィランを補充した食餌を給餌した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を介して糞便中の株存在量を毎日モニターして、ポルフィラン利用遺伝子座のコピー数を定量した。結果を図１９に示す。両方の株は、１週間以内に少なくとも１０^９細胞／ｇ糞便のコロニー形成レベルに達し、食餌にポルフィランを含めた間、１０^９～１０^１０細胞／ｇに留まった。４週間後、ポルフィランを食餌から除去した。食餌切り替え後、ドナーＢ及びＣ由来の微生物叢を含むマウス群において、非生物学的封じ込め株及び生物学的封じ込め株の両方が実質的に大量に低下し、非生物学的封じ込め株は、１００倍を超えて低下し、生物学的封じ込め株は、１０^６細胞／ｇ糞便の検知限度未満にさらに低下することが観察された。ドナーＡ及びＤ由来の微生物叢を含むマウスの他の群では、非生物学的封じ込め株は、約１０^９細胞／ｇ糞便の高存在量のままであったが、生物学的封じ込め株は、存在量が約１０００倍低下したことが観察された。このデータは、生物学的封じ込め株がヒト微生物叢を有するマウスに関連して実質的に減弱されることを示す。

【0179】

実施例１１－バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）における優先栄養素制御による相補的な生物学的封じ込め機構の操作
先の実施例に記載した生物学的封じ込め戦略は、相補的な生物学的封じ込め機構を加えることによってさらに改変することができる。そのような機構の１つは、ポルフィラン上で増殖する能力を欠くが、他の全ての多糖利用能力を保持する、操作されていない競合株の導入による競合生態系の確立である。もう１つのこのような機構は、多糖代謝に関与する多糖利用遺伝子座など、ポルフィランの存在下で増殖しないと株の適応度を著しく損なう、生物学的封じ込め株の遺伝子の欠失を介するものである。

【0180】

参照による援用
本明細書で言及された各特許および科学文書の開示全体は、すべての目的のために参照により援用される。
等価物
本開示は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化することができる。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載された開示について限定するのではなく、あらゆる点で例示的であると見なされる。したがって、本開示の範囲は、前述の説明によってではなく、添付の請求項によって示され、請求項の意味および同等の範囲内に入るすべての変更は、そこに包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】