特表2022-537200 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

青山学院大学 (神奈川県相模原市中央区淵野辺)

▶ バイオジェン　アイデック　ヘモフィリア　インコーポレイテッドの特許一覧

特表2022-537200血友病および低骨ミネラル密度を処置するための方法および組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14A
14B
15A
15B
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-24

(54)【発明の名称】血友病および低骨ミネラル密度を処置するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 38/37 20060101AFI20220817BHJP

A61K 38/17 20060101ALI20220817BHJP

A61P 19/10 20060101ALI20220817BHJP

A61P 7/04 20060101ALI20220817BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20220817BHJP

C07K 19/00 20060101ALN20220817BHJP

C07K 16/00 20060101ALN20220817BHJP

C07K 14/755 20060101ALN20220817BHJP

【ＦＩ】

A61K38/37

A61K38/17 100

A61P19/10

A61P7/04

C12N15/62 Z ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/755

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021575272

(86)(22)【出願日】2020-06-18

(85)【翻訳文提出日】2022-02-08

(86)【国際出願番号】 US2020038444

(87)【国際公開番号】W WO2020257462

(87)【国際公開日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】62/863,831

(32)【優先日】2019-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/968,785

(32)【優先日】2020-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブセラピューティクスインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林則幸

(72)【発明者】

【氏名】スス・デュアン

(72)【発明者】

【氏名】カタリン・キス－トス

(72)【発明者】

【氏名】ガウラヴ・マノハール・ラジャニ

(72)【発明者】

【氏名】ジョー・サラス

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA39

4C084DC15

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C084ZA971

4C084ZA972

4C084ZC541

4C084ZC542

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA66

4H045DA76

4H045EA24

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

血友病および低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する対象を、凝固因子およびＦｃドメインを含むキメラタンパク質で処置する方法を、本明細書に開示する。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質はｒＦＶＩＩＩＦｃである。ある特定の実施形態では、処置される対象は血友病Ａを有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血友病Ａおよび低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する対象を処置する方法であって、
（ｉ）血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と、
（ｉｉ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程と
を含み、
該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤの減少を阻害する、前記方法。

【請求項2】

キメラタンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

キメラタンパク質は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

キメラタンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
配列番号４によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
配列番号４によるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

第１のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

第１のポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインのヒンジ領域における２つのジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

キメラタンパク質はエフモロクトコグアルファである、請求項１または１０に記載の方法。

【請求項12】

キメラタンパク質はヒト細胞によって産生されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

ヒト細胞はヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

キメラタンパク質は３～５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

対象のＢＭＤは二重Ｘ線吸収測定法（ＤＸＡ）によって測定される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

対象は５０歳以上である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

対象のＢＭＤはＴスコアによって判定される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

対象が－１．０未満のＴスコアを有する場合、該対象は低ＢＭＤを有すると判定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

対象が－１．０から－２．４の間のＴスコアを有する場合、該対象は低ＢＭＤおよび骨減少症を有すると判定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

対象が－２．５未満のＴスコアを有する場合、該対象は低ＢＭＤおよび骨粗鬆症を有すると判定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

対象は５０歳未満である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

対象のＢＭＤはＺスコアによって判定される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

対象が－２．０未満のＺスコアを有する場合、該対象は低ＢＭＤを有すると判定される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

骨形成、骨吸収、および／または骨喪失のうちの１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルに基づいて、対象は低ＢＭＤを有すると予測される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

バイオマーカーは対象の末梢血または尿から評価される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

骨形成の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、骨型アルカリホスファターゼ、１型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、１型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（Ｐ１ＣＰ）、および／またはオステオカルシンを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

骨吸収の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、血清の総アルカリホスファターゼ、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン（ＰＹＤ）、骨シアロタンパク質、カテプシンＫ、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、ならびに／または１型コラーゲンのＣ末端および／もしくはＮ末端架橋テロペプチド（ＣＴＸ－１およびＮＴＸ－１）を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

対象はビタミンＤ欠乏症を有していない、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子で予め処置されている、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を処置する方法であって、
（ｉ）血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を選択する工程と、
（ｉｉ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程と
を含み、
該キメラタンパク質の投与は、該対象の該骨折のリスクを減少させる、前記方法。

【請求項32】

対象の骨折のリスクは骨折リスク評価ツール（ＦＲＡＸ）によって判定される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

対象の骨折のリスクは、低ＢＭＤリスク因子の評価によって判定される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

低ＢＭＤリスク因子は、関節症、身体活動の減少、ＨＩＶもしくはＨＣＶによる感染、ビタミンＤ欠乏症、低体重指数（ＢＭＩ）、および／または性腺機能低下症を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）喪失の速度を減少させる方法であって、
（ｉ）低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と、
（ｉｉ）凝固因子およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程と
を含み、
その結果、該キメラタンパク質の投与は、該対象の該ＢＭＤ喪失の速度を減少させる、前記方法。

【請求項36】

対象は軽度の血友病Ａを有する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

対象は中等度の血友病Ａを有する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

対象は重度の血友病Ａを有する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

血友病Ａを有する対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって：
（ｉ）Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質で血友病Ａの処置を受けている対象を特定する工程であって、該対象は処置中では十分な血液凝固を有したが、該対象は低ＢＭＤを有する、工程と；
（ｉｉ）Ｆｃ部分を有しない該ＦＶＩＩＩタンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程と
を含み、
該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項40】

血友病Ａを有する対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって：
（ｉ）ノンファクター補充タンパク質で血友病Ａの処置を受けている対象を特定する工程であって、該対象は処置中では十分な血液凝固を有したが、該対象は低ＢＭＤを有する、工程と；
（ｉｉ）ノンファクター補充タンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程と
を含み、
該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項41】

対照の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、
組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程
を含み、
該対象は血友病Ａおよび低ＢＭＤを有すると特定されており、該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項42】

対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、
組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程
を含み、
該対象は血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有すると特定されており、該キメラタンパク質の投与は、該対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項43】

対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）喪失の速度を減少させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、
組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程
を含み、
該対象は血友病ＡおよびＢＭＤ喪失を有すると特定されており、該キメラタンパク質の投与は、該対象の該ＢＭＤ喪失の速度を減少させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項44】

血友病Ａを有し、Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質で処置されている対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、
Ｆｃ部分を有しない該ＦＶＩＩＩタンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程
を含み、
該対象は、Ｆｃ部分を有しない該ＦＶＩＩＩタンパク質での処置中では低ＢＭＤおよび十分な血液凝固を有すると特定されており、該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項45】

血友病Ａを有し、ノンファクター補充タンパク質で処置されている対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、
ノンファクター補充タンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を該対象に投与する工程
を含み、
該対象は、該ノンファクター補充タンパク質での処置中では低ＢＭＤおよび十分な血液凝固を有すると特定されており、該キメラタンパク質の投与は、該対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、前記方法。

【請求項46】

対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質を使用して血友病Ａに伴う出血を減少させるように予め処置されている、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていないペグ化ＦＶＩＩＩである、請求項３９、４４、または４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていない一本鎖ＦＶＩＩＩである、請求項３９、４４、または４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ヒトにおいてその半減期を延長する部分を含まない組換えＦＶＩＩＩである、請求項３９、４４、または４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、血液由来ＦＶＩＩＩまたは血漿由来ＦＶＩＩＩである、請求項３９、４４、または４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ダモクトコグアルファペゴル、ツロクトコグアルファペゴル、ツロクトコグアルファ、ロノクトコグアルファ、シモクトコグアルファ、ルリオクトコグアルファペゴル、またはオクトコグアルファである、請求項３９、４４、または４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

対象は、ノンファクター補充タンパク質を使用して血友病Ａに伴う出血を減少させるように予め処置されている、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

ノンファクター補充タンパク質はエミシズマブである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

エミシズマブはエミシズマブ－ｋｘｗｈである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはノンファクター補充タンパク質での処置中では十分な血液凝固を有していた、請求項３０または３６～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

対象は、出血が検出されていない骨部位および／または関節にて低ＢＭＤを有する、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１９日出願の米国仮出願第６２／８６３，８３１号、および２０２０年１月３１日出願の米国仮出願第６２／９６８，７８５号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらは両方とも参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出し、参照によってその全体を本明細書に組み入れる配列表を含む。２０２０年６月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、７０６５６４＿ＳＡ９－５０３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、４６，０８０バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

血友病は、凝固因子をコードする遺伝子の欠陥によって引き起こされる出血性障害のグループであり、１０，０００人の男児出生のうち１～２人が罹患する。非特許文献１。血友病Ａは、機能的な内因性凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の非存在によって特徴付けられる。重度の血友病Ａの患者は、コントロール不良外傷性出血だけでなく、関節への特発性出血も患う。血友病の処置向けの現在の標準治療とは、肥大滑液膜炎および軟骨分解（血友病性関節症）を招くおそれのある再発性関節出血（関節血腫）をはじめとした深刻な生命を脅かすおよび四肢を脅かす出血を防ぐことを目的とした、静脈内因子補充療法である。非特許文献２。数十年にわたって、最適な予防法によって関節の出血は減少するが、解消されることはない。非特許文献３。

【0004】

血友病のヒトは、一般集団と比較して、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の減少および骨粗鬆症のリスクがより高い。非特許文献４。一研究によれば、血友病患者の２７％が骨粗鬆症を有し、４３％が低骨密度を有する。同上。ＢＭＤに関して増えつつある世界的な知見が示すところは、ＢＭＤは、多くの場合、症例対照よりも血友病患者では低いか、年齢に対して一般集団で予想されるよりも低いことである。この関連性にもかかわらず、血友病患者のＢＭＤ減少のメカニズムは現在不明である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｇｒａｗら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．６（６）：４８８～５０１頁（２００５）

【非特許文献2】Ｍａｎｃｏ－Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＮＥＪＭ３５７（６）：５３５～４頁（２００７）

【非特許文献3】Ｍａｎｃｏ－Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ１２９（１７）：２３６８～２３７４頁（２０１７）

【非特許文献4】Ｇｅｒｓｔｎｅｒら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、１５（２）：５５９～６５頁（２００９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

血友病患者の腰椎と股関節のＢＭＤ両方の深刻な減少は、小児期に始まる。関節出血を防御し、経時的にＢＭＤの喪失を最小限に抑える、血友病患者向けに治療選択を改善することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書に提供されているのは、とりわけ、血友病および低ＢＭＤを有する対象を処置する方法および組成物である。本開示のある特定の態様は、血友病Ａおよび低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する対象を処置する方法であって、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と、組換え第ＶＩＩＩ因子(FVIII)タンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤの減少を阻害する、方法を対象とする。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインである。一部の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一部の実施形態では、キメラタンパク質はｒＦＶＩＩＩＦｃである。本開示の一部の態様は、血友病Ａおよび低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する対象を処置するのに使用するための組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含むキメラタンパク質を対象とする。

【0008】

一部の実施形態では、対象は軽度の血友病Ａを有する。一部の実施形態では、対象は中等度の血友病Ａを有する。一部の実施形態では、対象は重度の血友病Ａを有する。

【0009】

一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、配列番号１によるアミノ酸配列を含む。

【0010】

一部の実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質のＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２によるアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、配列番号５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号５と同一である第１のポリペプチド鎖と、そのアミノ酸配列が配列番号４と同一である第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、２つのジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している第１のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｆｃドメインのヒンジ領域における２つのジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している第１のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、エフモロクトコグアルファである。一部の実施形態では、エフモロクトコグアルファは、商品名ＥＬＯＣＴＡ（登録商標）もしくはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標）で販売されているか、またはそれらのバイオシミラーである。

【0013】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｆｃドメインのヒンジ領域における２つのジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している第１のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、そのアミノ酸配列が配列番号５と同一である第１のポリペプチド鎖であって、Ｙ３４６、Ｙ７１８、Ｙ７１９、Ｙ７２３、Ｙ７７０、およびＹ７８６に硫酸化チロシン、Ｎ４１、Ｎ２３９、Ｎ９１６、Ｎ１２２４、およびＮ１５１５にＮ－グリコシル化部位を含む第１のポリペプチド鎖と、そのアミノ酸配列が配列番号４と同一である第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ７７にＮ－グリコシル化部位を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0014】

一部の実施形態では、本開示の方法は、（ｉ）ＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含むキメラポリペプチド、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、有効量の医薬組成物を対象に投与する工程を含み、ここで、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩタンパク質の約１％～約４０％は一本鎖ＦＶＩＩＩであり、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩタンパク質の約６０％～約９９％はプロセシングを受けたＦＶＩＩＩであり、ここで、一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は単一のポリペプチド鎖上にＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖を含んでおり、プロセシングを受けたＦＶＩＩＩは、２つのポリペプチド鎖上にＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖を含む。

【0015】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ヒト細胞によって産生されている。一部の実施形態では、ヒト細胞はヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。

【0016】

一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは３～５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、３日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、４日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。

【0017】

一部の実施形態では、対象は５０歳以上である。ある特定の実施形態では、対象は５０歳未満である。

【0018】

一部の実施形態では、対象のＢＭＤは、Ｘ線によって測定される。一部の実施形態では、対象のＢＭＤは、二重Ｘ線吸収測定法（ＤＸＡ）によって測定される。

【0019】

一部の実施形態では、低ＢＭＤを有する対象は、骨減少症および／または骨粗鬆症を有する。一部の実施形態では、低ＢＭＤを有する対象は、骨減少症を有する。一部の実施形態では、低ＢＭＤを有する対象は、骨粗鬆症を有する。一部の実施形態では、対象のＢＭＤはＴスコアによって判定される。一部の実施形態では、対象が－１．０未満のＴスコアを有する場合、対象は低ＢＭＤを有すると判定される。一部の実施形態では、対象が－１．０から－２．４の間のＴスコアを有する場合、対象は、低ＢＭＤおよび骨減少症を有すると判定される。一部の実施形態では、対象が－２．５以下のＴスコアを有する場合、対象は、低ＢＭＤおよび骨粗鬆症を有すると判定される。

【0020】

一部の実施形態では、対象のＢＭＤはＺスコアによって判定される。一部の実施形態では、対象が－２．０未満のＺスコアを有する場合、対象は低ＢＭＤを有すると判定される。

【0021】

一部の実施形態では、骨形成、骨吸収、および／または骨喪失のうちの１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルに基づいて、対象は低ＢＭＤを有すると予測される。一部の実施形態では、バイオマーカーは対象の末梢血または尿から評価される（例えば、タンパク質のレベルまたは量がアッセイで測定される）。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルは、末梢血であるか、または末梢血に由来する生物学的試料（例えば血清または血漿）において測定される。一部の実施形態では、骨形成の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、骨型アルカリホスファターゼ、１型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、１型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（Ｐ１ＣＰ）、および／またはオステオカルシンを含む。一部の実施形態では、骨吸収の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、血清の総アルカリホスファターゼ、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン（ＰＹＤ）、骨シアロタンパク質、カテプシンＫ、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、ならびに／または１型コラーゲンのＣ末端およびＮ末端架橋テロペプチド（それぞれ、ＣＴＸ－１およびＮＴＸ－１）、を含む。

【0022】

一部の実施形態では、対象はビタミンＤ欠乏症を有していない。一部の実施形態では、対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子で予め処置されている。

【0023】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を処置する方法であって、血友病および骨折のリスク増大を有する対象を選択する工程と、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象の骨折のリスクを減少させる、方法を対象とする。本開示の一部の態様は、血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を処置するのに使用するための組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含むキメラタンパク質を対象とする。

【0024】

一部の実施形態では、対象の骨折のリスクは骨折リスク評価ツール（ＦＲＡＸ）によって判定される。一部の実施形態では、対象の骨折のリスクは、低ＢＭＤリスク因子の評価によって判定される。一部の実施形態では、低ＢＭＤリスク因子は、関節症、身体活動の減少、ＨＩＶもしくはＨＣＶによる感染、ビタミンＤ欠乏症、低体重指数（ＢＭＩ）、および／または性腺機能低下症を含む。

【0025】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａおよび骨折を有する対象を処置する方法であって、血友病および骨折を有する対象を選択する工程と、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含む方法を対象とする。本開示の一部の態様は、血友病Ａおよび骨折を有する対象を処置するのに使用するための組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含むキメラタンパク質を対象とする。

【0026】

本開示のある特定の態様は、対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）喪失の速度を減少させる方法であって、低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と；凝固因子およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、その結果、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤ喪失の速度を減少させる、方法を対象とする。本開示の一部の態様は、血友病Ａを有する対象を処置し、対象のＢＭＤ喪失の速度を減少させるのに使用するための、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含むキメラタンパク質を対象とする。

【0027】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａを有する対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、（ｉ）Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質で血友病Ａの処置を受けている対象を特定する工程であって、対象は処置中では十分な血液凝固を有したが、対象は低ＢＭＤを有する、工程と；（ｉｉ）Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0028】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａを有する対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、（ｉ）ノンファクター補充タンパク質（non-factor replacement protein）で血友病Ａの処置を受けている対象を特定する工程であって、対象は処置中では十分な血液凝固を有したが、対象は低ＢＭＤを有する、工程と；（ｉｉ）ノンファクター補充タンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0029】

本開示のある特定の態様は、対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、ここで、対象は血友病Ａおよび低ＢＭＤを有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0030】

本開示のある特定の態様は、対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、対象は血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0031】

本開示のある特定の態様は、対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）喪失の速度を減少させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、対象は血友病ＡおよびＢＭＤ喪失を有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤ喪失の速度を減少させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0032】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａを有し、Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質で処置されている対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、対象は、Ｆｃ部分を有しないＦＶＩＩＩタンパク質での処置中では低ＢＭＤおよび十分な血液凝固を有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0033】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａを有し、ノンファクター補充タンパク質で処置されている対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、ノンファクター補充タンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、対象は、ノンファクター補充タンパク質での処置中では低ＢＭＤおよび十分な血液凝固を有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0034】

一部の実施形態では、対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質を使用して血友病Ａに伴う出血を減少させるように予め処置されている。

【0035】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていないペグ化ＦＶＩＩＩである。

【0036】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていない一本鎖ＦＶＩＩＩである。

【0037】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ヒトにおいてその半減期を延長する部分を含まない組換えＦＶＩＩＩである。

【0038】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、血液由来ＦＶＩＩＩまたは血漿由来ＦＶＩＩＩである。

【0039】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ダモクトコグアルファペゴル、ツロクトコグアルファペゴル、ツロクトコグアルファ、ロノクトコグアルファ、シモクトコグアルファ、ルリオクトコグアルファペゴル、またはオクトコグアルファである。

【0040】

一部の実施形態では、対象は、ノンファクター補充タンパク質を使用して血友病Ａに伴う出血を減少させるように予め処置されている。

【0041】

一部の実施形態では、ノンファクター補充タンパク質はエミシズマブである。

【0042】

一部の実施形態では、エミシズマブはエミシズマブ－ｋｘｗｈである。

【0043】

一部の実施形態では、対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはノンファクター補充タンパク質での処置中では十分な血液凝固を有した。

【0044】

一部の実施形態では、対象は、出血が検出されていない骨部位および／または関節にて低ＢＭＤを有する。

【0045】

前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、ある特定の実施形態では、対象は、軽度の血友病Ａを有する。あるいは、前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、ある特定の実施形態では、対象は、中等度の血友病Ａを有する。あるいは、前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、ある特定の実施形態では、対象は、重度の血友病Ａを有する。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】図１Ａ～Ｂは、単球由来の細胞タイプを使用して、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色、破骨細胞骨吸収活性、遺伝子発現プロファイリング、破骨細胞特異的遺伝子、および抗酸化経路関連遺伝子によりマクロファージおよび破骨細胞の形態を調べる、実験的ｉｎｖｉｔｒｏモデルの概略図表示の図である。図１Ａは、Ｍ－ＣＳＦ単独を５０ｎｇ／ｍｌで７日間にわたって投与することによる、ＣＤ１４^＋単球を単球由来マクロファージに分化させるためのプロトコルを表示する概略図である。図１Ｂは、Ｍ－ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍｌでおよびＲＡＮＫＬ１００ｎｇ／ｍｌを７日間にわたって投与することによる、ＣＤ１４^＋単球を単球由来破骨細胞に分化させるためのプロトコルを表示する概略図である。

【図2】図２Ａ～Ｂは、単球由来の細胞タイプを使用して酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を調べる、実験的ｉｎｖｉｔｒｏモデルの概略図表示の図である。図２Ａは、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）単独を５０ｎｇ／ｍｌで７日間にわたって投与することにより単球由来マクロファージに分化し、ＴＲＡＰ染色について調べられた、ＣＤ１４^＋単球の対照群を表示する概略図である。図２Ｂは、Ｍ－ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍｌでおよびＲＡＮＫＬ１００ｎｇ／ｍｌを７日間にわたって投与することにより単球由来破骨細胞に分化し、ビヒクル、ＩｇＧ１（２５ｎＭ）、ｒＦＶＩＩＩ（２５ｎＭ）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（２５ｎＭ）で０日目に処置された、ＣＤ１４^＋単球の試験群を表示する概略図である。

【図3】図３Ａ～Ｅは、単球由来マクロファージ（図３Ａ）および単球由来破骨細胞（図３Ｂ～３Ｅ）のＴＲＡＰ染色の視覚的図説の図である。図３Ｂは、ビヒクルで処置された単球由来破骨細胞のＴＲＡＰ染色の視覚的図説である。図３Ｃは、ＩｇＧ１単独で処置された単球由来破骨細胞のＴＲＡＰ染色の視覚的図説である。図３Ｄは、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）単独で処置された単球由来破骨細胞のＴＲＡＰ染色の視覚的図説である。図３Ｅは、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球由来破骨細胞のＴＲＡＰ染色の視覚的図説である。

【図4】ＣＤ１４^＋単球が、単球由来破骨細胞に分化する前に：ビヒクル処置、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃの４つの処置のうちの１つで１日間処置されている場合、破骨細胞形成を判定するウォッシュアウト実験の概略図表示の図である。７日目に形態について細胞を解析した。

【図5】図５Ａ～Ｄは、分化する前にビヒクル（図５Ａ）、ＩｇＧ１（図５Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ（図５Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（図５Ｄ）で１日間処置した場合、分化の７日後の単球由来破骨細胞形態の視覚的図説の図である。

【図6】ＣＤ１４^＋単球を、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬならびに４つの処置パラダイムのうちの１つで３日間処置し（ビヒクル、ＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ）、その後、単球をウシ皮質骨スライス上にプレーティングし、さらなる７～１０日間培養し、次いでトルイジンブルーで染色して骨吸収を測定した場合の、骨吸収実験の概略図表示の図である。

【図7】図７Ａ～Ｄは、ビヒクル（図７Ａ）、ＩｇＧ１単独（図７Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ（図７Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（図７Ｄ）で予め処置された単球由来破骨細胞と培養した骨スライスの視覚的図説の図である。

【図8】ＣＤ１４^＋単球を０日目にビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬを７日間添加することを通して単球由来破骨細胞へと分化させ、目的の遺伝子の発現を測定することによって、単球由来破骨細胞の遺伝子発現を決定する実験の、概略図表示の図である。

【図9】０日目にビヒクル（黒色のバー）、ＩｇＧ１（暗灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩ（明灰色のバー）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（白色のバー）で処置し、処置後７日目に単球由来破骨細胞に分化させたＣＤ１４^＋単球の遺伝子発現の図形表示の図である。分化のマーカー（ＲＡＮＫ、ＮＦＡＴＣ１）および骨吸収活性のマーカー（ＣＡＴＫ、ＴＲＡＰ、ＭＭＰ９）を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定し、未処置群に正規化した。ｎｓ＝有意ではない；^＊＊＊＊ｐ＜．００５；ｎ＝６～１０。

【図10】ＣＤ１４^＋単球を０日目にビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬを７日間添加することを通して単球由来破骨細胞へと分化させ、７日目に目的の酵素活性および遺伝子の発現を測定することによって、単球由来破骨細胞の遺伝子発現および酵素活性を決定する実験の、概略図表示の図である。

【図11】図１１Ａ～Ｂは、０日目にビヒクル（黒色のバー）、ＩｇＧ１（暗灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩ（明灰色のバー）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（白色のバー）で処置され、処置後７日目に単球由来破骨細胞に分化させたＣＤ１４^＋単球の遺伝子発現（図１１Ａ）および酵素活性（図１１Ｂ）の図形表示の図である。図１１Ａは、ｑＰＣＲによって測定され、ビヒクル処置群に正規化された抗酸化経路関連遺伝子（ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ）を図示する。図１１Ｂは、測定され、ビヒクル処置群に正規化されたＮＱＯ１レダクターゼ比活性を図示する。ｎｓ＝有意ではない；^＊＊＊＊ｐ＜．００５；ｎ＝１０（図１１Ａ）；ｎ＝３（図１１Ｂ）。

【図12】ＣＤ１４^＋単球を０日目にビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａで処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬを７日間添加することを通して単球由来破骨細胞へと分化させ、破骨細胞関連遺伝子の遺伝子発現を測定することによって、破骨細胞の遺伝子発現および酵素活性を決定する実験の、概略図表示の図である。

【図13】０日目にビヒクル（黒色のバー）、ＩｇＧ１（暗灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩ（明灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（白色のバー）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ（破線のバー）で処置され、処置後７日目に単球由来破骨細胞に分化させたＣＤ１４^＋単球の遺伝子発現の図形表示の図である。ＲＡＮＫ、ＮＦＡＴＣ１、ＣＡＴＫ、およびＴＲＡＰの各レベルはｑＰＣＲによって測定した。ｎｓ＝有意ではない；^{＊＊＊＊ｐ}＜．００５；＊ｐ＜．０．０５；ｎ＝５。

【図14A】様々な用量でｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１で処置され、ＣＤ１４およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。図１４Ａは、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１の７５ｎＭから７．５ｎＭのへの用量減量を表示する。

【図14B】様々な用量でｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１で処置され、ＣＤ１４およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。図１４Ｂは、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１の４．２ｎＭから０ｎＭ（ビヒクル対照）への用量減量を表示する。

【図15A】様々な用量でｒＦＶＩＩＩＦｃで処置され、ＣＤ１４およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。図１５Ａは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの７５ｎＭから７．５ｎＭのへの用量減量を表示する。

【図15B】様々な用量でｒＦＶＩＩＩＦｃで処置され、ＣＤ１４およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。図１５Ｂは、ｒＦＶＩＩＩＦｃの４．２ｎＭから０ｎＭ（ビヒクル対照）への用量減量を表示する。

【図16】様々な用量でのｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１（円を含む線）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（四角を含む線）での処置後のフローサイトメトリーによってＣＤ５１／６１^ｈｉｇｈ細胞として特徴付けられた、ビヒクル対照と比較した破骨細胞のパーセンテージの図形表示の図である。

【図17】図１７Ａ～Ｄは、ビヒクル（図１７Ａ）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（図１７Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１（図１７Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ（図１７Ｄ）で処置され、ＣＤ１６およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。

【図18】図１８Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ１遮断抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ）（図１８Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ１に非特異的に結合するアイソタイプ対照Ｆａｂ（図１８Ｃ～Ｄ）の存在下で、ｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ１６およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。

【図19】図１９Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ２遮断抗体（図１９Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ２に非特異的に結合するアイソタイプ対照抗体（図１９Ｃ～Ｄ）の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ１６およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。

【図20】図２０Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ３遮断抗体（図２０Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ３に非特異的に結合するアイソタイプ対照抗体（図２０Ｃ～Ｄ）の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ１６およびＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連の密度プロットの図である。

【図21】図２１Ａ～Ｄは、ビヒクル（図２１Ａ）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（図２１Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１（図２１Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ（図２１Ｄ）で処置され、ＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する図１７に対応する一連のヒストグラムの図である。ｙ軸は、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏによって計算された、最大カウント（１００％）のパーセンテージとして調整されたフローイベントを表す。

【図22】図２２Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ１遮断抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ）（図２２Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ１に非特異的に結合するアイソタイプ対照Ｆａｂ（図２２Ｃ～Ｄ）の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する図１８に対応する一連のヒストグラムの図である。ｙ軸は、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏによって計算された、最大カウント（１００％）のパーセンテージとして調整されたフローイベントを表す。

【図23】図２３Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ２遮断抗体（図２３Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ２に非特異的に結合するアイソタイプ対照抗体（図２３Ｃ～Ｄ）の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する図１９に対応する一連のヒストグラムの図である。ｙ軸は、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏによって計算された、最大カウント（１００％）のパーセンテージとして調整されたフローイベントを表す。

【図24】図２４Ａ～Ｄは、ＦｃγＲ３遮断抗体（図２４Ａ～Ｂ）もしくはＦｃγＲ３に非特異的に結合するアイソタイプ対照（図２４Ｃ～Ｄ）の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置され、ＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する図２０に対応する一連の密度プロットの図である。ｙ軸は、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏによって計算された、最大カウント（１００％）のパーセンテージとして調整されたフローイベントを表す。

【図25】図２５Ａ～Ｊは、ＦＶＩＩＩのＡ２領域を遮断する抗体（ＧＭＡ８０１７；図２５Ｂおよび２５Ｇ）、ＦＶＩＩＩのＡ３領域を遮断する抗体（ＧＭＡ８０１０；図２５Ｃおよび２５Ｈ）の存在下で、もしくは、Ｃ２領域を遮断する抗体（ＧＭＡ８００６；図２５Ｄおよび２５Ｉ；ＧＭＡ８０２６；図２５Ｅおよび２５Ｊ）の存在下で、ｒＦＶＩＩＩ（図２５Ａ～Ｅ）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（図２５Ｆ～Ｊ）の存在下での単球および単球由来破骨細胞の視覚的図説の図である。

【図26】図２６Ａ～Ｅは、ｒＦＶＩＩＩ（図２６Ａ）もしくはｒＦＶＩＩＩＦｃ（図２６Ｂ）単独でまたはフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ；図２６Ｃ～Ｅ）の存在下で処置され、ＣＤ５１／６１の表面発現について解析した単球における蛍光活性化フローサイトメトリーによって収集した免疫表現型を表示する一連のヒストグラムの図である。ｙ軸は、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏによって計算された、最大カウント（１００％）のパーセンテージとして調整されたフローイベントを表す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本開示は、低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有する対象を処置するために使用される方法を対象とする。一態様では、血友病および低ＢＭＤを有する対象を処置する方法を、本明細書に開示する。本開示のある特定の態様は、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を処置する方法であって、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と、凝固因子およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含む、方法を対象とする。また、本明細書は、血友病Ａを有する対象をキメラタンパク質で処置するための方法であって、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤの減少を阻害する、方法を開示する。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩおよびＦｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩおよびＦｃ領域からなる。様々な実施形態では、キメラタンパク質はｒＦＶＩＩＩＦｃである。

【0048】

１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学的用語は、本開示に関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、ＴｈｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第５版、２０１３年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；およびｔｈｅＯｘｆｏｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２版（改訂）、２００６年、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓによって、本開示において使用される用語の多くに関する一般的な辞書が当業者に提供される。

【0049】

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途規定しない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）も、用語「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」も、本明細書において交換可能に使用することができる。特定の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」とは「単一（ｓｉｎｇｌｅ）」を意味する。他の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」とは、「２つ以上」または「複数」を含む。さらに、本明細書において使用される場合の「および／または」は、他方をも含め、または含めずに、特定の２つの特性またはコンポーネントのそれぞれの具体的な開示と解釈されるものとする。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」のような語句で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（単独）」および「Ｂ（単独）」を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」のような語句で使用される用語「および／または」は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0050】

「約」という用語は、本明細書および本特許請求の範囲の全体を通して数値と連結して使用される場合、当業者によく知られかつ許容可能な精度の間隔を表示するものである。本明細書の特許請求の範囲、要約書、および発明を実施するための形態において全体的に、かかる精度の間隔は、±１０％である。一部の実施形態では、記述した特定の数値に関して使用される場合、「約」とは、その値は記述した値から１０％以下だけ変化し得ることを意味する。一部の実施形態では、記述した特定の数値に関して使用される場合、「約」とは、その値は記述した値から１％以下だけ変化し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、表現「約１００」とは、９９および１０１ならびに間にあるすべての値（例えば、９９．１，９９．２，９９．３，９９．４等）を含む実施形態を開示する。

【0051】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）の認可した形態で示される。数値範囲は、当該範囲を定義する数を含む。ある範囲の値が記述される場合、当該範囲の記述された上限値と下限値の間にある介在する各整数値、およびこの各分数も、かかる値の間の各部分範囲とともに具体的に開示されることが理解されるべきである。いかなる範囲の上限値および下限値も独立して、当該範囲に含まれることができ、または当該範囲から除外することができ、いずれかの限界値が含まれ、いずれの限界値も含まれず、またはいずれの限界値も含まれる各範囲も、本開示内に包含される。値が、明白に記述される場合、記述された値とほぼ同じ数量または量も本開示の範囲内にあることも理解されるべきである。組合せが開示される場合、当該組合せの要素の各部分的組合せも具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、その組合せも開示される。開示の何らかの要素が複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単一でまたは他の代替物との何らかの組合せで除外される、当該開示の例も、本明細書により開示される；開示の２つ以上の要素は、かかる除外を有することができ、かかる除外を有する要素の組合せはすべて、本明細書により開示される。

【0052】

当技術分野で知られるように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」とは、一方のポリペプチドのアミノ酸配列と、第二のポリペプチドの配列とを比較することにより判定される。本明細書で論議の場合、特定の任意のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または、１００％同一であるか否かは、それに限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ｆｏｒＵｎｉｘ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）のような、当技術分野で知られる方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア、を使用して判定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２～４８９頁（１９８１）の部分的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の最良の相同性セグメントを見いだす。特定の配列が、本開示に従う基準配列と、例えば、９５％同一であるか否かを判定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の任意の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが基準ポリペプチド配列の完全長にわたって算出されるように、かつ、基準配列中のアミノ酸の総数のうちの５％までの相同性ギャップが許可されるように、セットされる。配列同一性および配列類似性のパーセントの判定に適するアルゴリズムの他の非限定的な例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮｕｃｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９～３４０２頁（１９９７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載されたパラメータとともに使用して、核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを判定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、当技術分野で知られるように、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは最初に、データベース配列内で同じ長さのワードとアライメントを取られた場合、いくつかの正値閾値スコアＴに一致するかまたは満たすかのいずれかで、クエリー配列内で長さＷの短いワードを特定することによる、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の特定を含む。Ｔは、近傍単ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見いだす検索を開始するためのシードとして機能する。当該ワードヒットを、その累積アラインメントスコアが増大することができる限り、各配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下がる；累積スコアが、１またはそれ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因してゼロ以下になる；または、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ある特定の実施形態では、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して配列のアライメントを取る。ある特定の実施形態では、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰプログラムは、ＮＣＢＩで使用されるデフォルトを使用する。ある特定の実施形態では、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして以下を使用する：ワードサイズ（Ｗ）２８；期待閾値（Ｅ）１０；０に設定されたクエリー範囲での最大一致；１、－２の一致／不一致スコア；線形ギャップコスト；低複雑性領域用フィルターを使用；およびルックアップテーブルのみのマスクを使用。ある特定の実施形態では、ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列の場合）は、デフォルトとして以下を使用する：ワードサイズ（Ｗ）３；期待閾値（Ｅ）１０；０に設定されたクエリー範囲における最大一致；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５頁（１９９２）を参照されたい）；存在のギャップコスト：１１および拡張：１；ならびに条件付き組成スコアマトリックス調整。

【0053】

２．キメラタンパク質
「融合」または「キメラ」ポリペプチドまたはタンパク質は、第１のアミノ酸配列であって、これが本来自然には連結していない第２のアミノ酸配列に連結された、第１のアミノ酸配列を含む。通常には別々のタンパク質に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドに融合させてもよく、または、通常には同じタンパク質に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドに例えば、第ＶＩＩＩ因子ドメインのＩｇＦｃドメインとの融合に、新規な構成で配置させてもよい。融合タンパク質は、例えば化学合成によって、または、ペプチド領域が所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを創製し、翻訳することによって、創製する。キメラポリペプチドは、第１のアミノ酸配列と共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって会合している第２のアミノ酸配列をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質とは、ＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃ領域を含むキメラタンパク質である。例えば、キメラタンパク質は、Ｆｃ二量体のポリペプチド鎖のうちの１つに融合された１つのＦＶＩＩＩタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｆｃ二量体のポリペプチド鎖のうちの１つのＮ末端に直接融合された１つのＦＶＩＩＩタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｆｃ二量体に融合されている唯一のタンパク質である。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｆｃ二量体のポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端に直接融合された１つのＦＶＩＩＩタンパク質を含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、リンカー配列を介在させることなく、ヒトＩｇＧ１の二量体Ｆｃドメインの１つのポリペプチド鎖に融合された組換えＢドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ－ｒＦＶＩＩＩ）の単一分子を含むまたはそれからなる。例えば、参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる米国特許第９，０５０，３１８号および第９，２４１，９７８号を参照されたい。様々な実施形態では、キメラタンパク質はｒＦＶＩＩＩＦｃである。様々な実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ＥＬＯＣＴＡ（登録商標）またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標）と呼ばれるｒＦＶＩＩＩＦｃである。ｒＦＶＩＩＩＦｃは、例えば、米国特許出願公開第２０１８／０３６０９８２（Ａ１）号および米国特許第９，０５０，３１８号および第９，２４１，９７８号に詳細に開示されており、ここに参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる。

【0054】

一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは配列番号１によるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、配列番号１のアミノ酸１～１６６５によるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは配列番号５によるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含んでおり、キメラポリペプチドのＦｃ部分は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドのＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含んでおり、キメラポリペプチドのＦｃ部分は、配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む。

【0055】

一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩ部分および第１のＦｃ部分を含み、かつ第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃ部分を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは第２のＦｃ部分からなる。一部の実施形態では、第１のＦｃ部分は、第２のＦｃ部分と同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含み、ここで、ＦＶＩＩＩ部分はＦｃ部分のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩ部分およびＦｃ部分を含み、ここで、ＦＶＩＩＩ部分はＦｃ部分のＣ末端に融合されている。

【0056】

一部の実施形態では、キメラポリペプチドは第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩ部分および第１のＦｃ部分を含み、かつ、第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃ部分を含み、ここで、第１のＦｃ部分および第２のＦｃ部分は共有結合によって互いに会合している。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、Ｆｃ部分のヒンジ領域における２つのジスルフィド結合を介して第２のポリペプチド鎖に共有結合している。

【0057】

一部の実施形態では、キメラポリペプチドは第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖はＦＶＩＩＩ部分および第１のＦｃ部分を含み、かつ、第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃ部分を含み、ここで、ＦＶＩＩＩ部分は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含んでおり、キメラポリペプチドのＦｃ部分は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、第２のＦｃ部分は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0058】

一部の実施形態では、キメラタンパク質はエフモロクトコグアルファである。

【0059】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＶＷＦまたはその断片、バリアント、または変異体を含まない。

【0060】

哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、分泌シグナルペプチドと会合しており、このペプチドは、粗面小胞体を通って成長するタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、シグナルペプチドは一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合し、完全型または「完全長」のポリペプチドから正常には切断されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生成することを知っている。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチドまたはこの配列の機能的誘導体は、これと作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持する。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドを、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスのβ－グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれらの機能的誘導体を、使用することができる。

【0061】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、１個の哺乳動物細胞または複数個の哺乳動物細胞によって産生されている。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、１個のヒト細胞または複数個のヒト細胞によって産生されている。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞によって産生されている。

【0062】

本出願全体を通して「ＦＶＩＩＩ」と略される「第ＶＩＩＩ因子」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、凝固におけるその正常な役割における機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。したがって、用語ＦＶＩＩＩには、機能的であるバリアントポリペプチドが含まれる。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、「ＦＶＩＩＩポリペプチド」または「ＦＶＩＩＩ」と交換可能に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例には、それらに限定されないが、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ^２＋およびリン脂質の存在下で第ＩＸ因子と共に、次いで第Ｘ因子を活性化型Ｘａに変換するテナーゼ複合体を形成する能力、が含まれる。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質とすることができる。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に由来する。ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に由来することができるＦＶＩＩＩタンパク質の非限定的な例が、本明細書に開示されており、それには、ＦＶＩＩＩＢドメインの部分的または完全な欠失を有するＦＶＩＩＩタンパク質、ならびに、ＦＶＩＩＩタンパク質のようにＦＶＩＩＩＢドメインに変異を有するＦＶＩＩＩタンパク質が含まれるが、その結果、ＦＶＩＩＩタンパク質は、対応する野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、トロンビンによって切断されないか、またはトロンビン切断の減少を有する。加えて、ヒトと他の種由来のＦＶＩＩＩどうしを比較すると、機能性に必要と思われる保存された残基が特定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７～２２頁（１９９８）；米国特許第６，２５１，６３２号）。多くの機能的断片、変異体および改変バージョンと同様に、完全長のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列が知られる。種々のＦＶＩＩＩのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、例えば、米国公開第２０１５／０１５８９２９（Ａ１）号、第２０１４／０３０８２８０（Ａ１）号、および第２０１４／０３７００３５（Ａ１）号および国際公開第ＷＯ２０１５／１０６０５２（Ａ１）号に開示されており、これらのそれぞれはその全体を参照によって本明細書に組み入れる。様々な実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質、またはその機能的バリアントである。ＦＶＩＩＩポリペプチドには、例えば、完全長ＦＶＩＩＩ、Ｎ末端のＭｅｔのない完全長ＦＶＩＩＩ、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列のない）、Ｎ末端にさらなるＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ、および／またはＢドメインの完全または部分的欠失を有するＦＶＩＩＩ、が含まれる。ＦＶＩＩＩバリアントには、部分的または完全な欠失であるか否かに関わりなく、Ｂドメインの欠失が含まれる。

【0063】

一部の実施形態では、本開示のキメラタンパク質または組成物のＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含む。ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」とは、本明細書で使用される場合、内部アミノ酸配列同一性と、トロンビンによるタンパク質分解切断の部位、例えば、成熟ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１～Ａｒｇ１６４８と、によって定義される当技術分野で知られるＢドメインと同じものである。その他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、成熟ヒトＦＶＩＩＩに関連して、以下のアミノ酸残基によって定義される、成熟ＦＶＩＩＩの：Ａ１、残基Ａｌａ１～Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３～Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０～ｌｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３～Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３～Ｔｙｒ２３３２。なんらの配列番号も参照せずに本明細書で使用される配列残基の番号は、特に明記しない限り、シグナルペプチド配列（１９個のアミノ酸）を含有しないＦＶＩＩＩ配列に対応する。ＦＶＩＩＩ重鎖としても知られるＡ３－Ｃ１－Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０～Ｔｙｒ２３３２を含む。残部の配列、残基Ｇｌｕ１６４９～Ａｒｇ１６８９は、通常にはＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドまたは単にＦＶＩＩＩ軽鎖と呼ばれる。例えば、ブタ、マウス、およびイヌのＦＶＩＩＩのＢドメインを含めて、ドメインのすべての境界の位置もまた、当技術分野で知られる。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインを欠失する（「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」または「ＢＤＤＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤＦＶＩＩＩ）である。

【0064】

一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、第６，４５８，５６３号、または国際公開第ＷＯ２０１５１０６０５２（Ａ１）号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１０７３８）に開示される完全または部分的な欠失を有することができる。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ほとんどのＢドメインの欠失を有するが、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、一次翻訳産物の２つのポリペプチド鎖へのｉｎｖｉｖｏタンパク質分解プロセシングにとって必須であるＢドメインのアミノ末端配列を依然として含有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７～１６３８の欠失、すなわち、事実上、Ｂドメインの完全な欠失を持って構築される。ＨｏｅｂｅｎＲ．Ｃ．、らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８～７３２３頁（１９９０）。Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１～１６６６またはアミノ酸８６８～１５６２の欠失も含有する場合がある。ＭｅｕｌｉｅｎＰ．、らＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．２（４）：３０１～６ページ（１９８８）。ある特定の実施形態の一部とすることができるさらなるＢドメイン欠失には：９８２から１５６２または７６０から１６３９（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３、５９３９～５９４２頁）、７９７から１５６２（Ｅａｔｏｎ，らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３～８３４７頁）、７４１から１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ公開出願第ＷＯ８７／０４１８７号））、７４７～１５６０（Ｓａｒｖｅｒ，ら、ＤＮＡ（１９８７）６：５５３～５６４頁）、７４１から１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号））、または８１６から１５９８または７４１から１６４８（Ｌａｇｎｅｒ（ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ８２：１６～２５、ＥＰ２９５５９７））のアミノ酸の欠失が含まれる。

【0065】

一部の実施形態では、ＢＤＤＦＶＩＩＩには、１つまたはそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位、例えば、残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３、または場合により９４３を保持する、Ｂドメインの断片を含有するＦＶＩＩＩポリペプチドが含まれるが、これらの残基は、完全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応する。Ｂドメイン断片の例には、Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、ら、Ｂｌｏｏｄ１０３（ａ）：３４１２～３４１９頁（２００４）、Ｋａｓｕｄａ，Ａ、ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１３５２～１３５９頁（２００８）、およびＰｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．、ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５～２２４２頁（２０１１）に開示されるように、Ｂドメインの２２６個のアミノ酸または１６３個のアミノ酸が含まれる（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６個のアミノ酸または１６３個のアミノ酸が保持される）。ある特定の実施形態では、ＢＤＤＦＶＩＩＩは、残基３０９に点突然変異（ＰｈｅからＳｅｒへ）をさらに含んで、ＢＤＤＦＶＩＩＩタンパク質の発現を改善する。Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、ら、Ｂｌｏｏｄ１０３（ａ）：３４１２～３４１９頁（２００４）を参照されたい。様々な実施形態では、ＢＤＤＦＶＩＩＩには、Ｂドメインの一部を含有するが、１つまたはそれ以上のフーリン切断部位（例えば、Ａｒｇ１３１３およびＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドが含まれる。Ｐｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．、ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５～２２４２頁（２０１１）を参照されたい。一部の実施形態では、ＢＤＤＦＶＩＩＩは、成熟した完全長ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎおよびＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）としても知られる）に対応するアミノ酸７６５～１６５２に欠失を含有する一本鎖ＦＶＩＩＩを含む。米国特許第７，０４１，６３５号を参照されたい。前述の欠失のそれぞれは、任意のＦＶＩＩＩ配列で行うことができる。

【0066】

当技術分野では多数の機能的ＦＶＩＩＩバリアントが知られる。加えて、血友病患者ではＦＶＩＩＩの数百もの非機能的変異が特定されており、これらの変異がＦＶＩＩＩ機能に及ぼす影響は、変異の性質上というよりも変異がＦＶＩＩＩの３次元構造内のどこにあるかによるものであると判断されてきた（その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｃｕｔｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４～８頁（２００２））。加えて、ヒト由来と他種由来のＦＶＩＩＩどうしを比較すると、機能性に必要と思われる保存された残基が特定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７～２２ページ（１９９８）；米国特許第６，２５１，６３２号、それぞれがその全体を参照によって本明細書に組み入れる）。

【0067】

第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、「プロセシングを受けた」ＦＶＩＩＩまたは「一本鎖」ＦＶＩＩＩのいずれかとして活性型で存在することができる。そのようなタイプのプロセシングを受けかつ一本鎖の形態は、米国特許公開第２０１８／０３６０９８２（Ａ１）号で議論されており、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0068】

一部の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質および第２の部分を含み、ここで、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、２つの鎖、重鎖を含む第１の鎖および軽鎖を含む第２の鎖を含む、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子であり、ここで、前記第１の鎖および前記第２の鎖は金属結合によって会合している。例えば、キメラポリペプチドのうちの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％が、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子の部分を含み、この場合、キメラポリペプチドの残部は、プロセシングを受けていない第ＶＩＩＩ因子の部分（すなわち、一本鎖ＦＶＩＩＩ）を含む。

【0069】

一部の実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含み、ここで、第ＶＩＩＩ因子の部分は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、一本鎖第ＶＩＩＩ因子はインタクトの細胞内プロセシング部位を含有することができる。一部の実施形態では、キメラポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子の部分のうちの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％は一本鎖第ＶＩＩＩ因子である。別の実施形態では、キメラポリペプチドのうちの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子の部分を含み、この場合、キメラポリペプチドの残部がプロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子の部分を含む。別の態様では、一本鎖ＦＶＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩＩ）は、細胞内プロセシング部位を含有しない。例えば、ｓｃＦＶＩＩＩは、完全長第ＶＩＩＩ因子の、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置に置換または変異、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置に置換または変異、または、アルギニン１６４５およびアルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置に置換または変異、を含む。一部の実施形態では、アルギニン１６４５に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸は、アルギニン１６４８に対応するアミノ酸位置で置換されたアミノ酸とは異なるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、置換または変異は、アルギニンからアラニンへの置換である。

【0070】

一部の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子活性を発色アッセイによってｉｎｖｉｔｒｏで測定する場合、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つに融合しているプロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドに匹敵するレベルで、第ＶＩＩＩ因子活性を有する。一部の実施形態では、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つに融合しているプロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドに匹敵する、ｉｎｖｉｖｏでの第ＶＩＩＩ因子活性を有する。一部の実施形態では、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を含むキメラポリペプチドは、２つのＦｃ部分と、この２つのＦｃ部分のうちの１つに融合しているプロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドに匹敵する、第Ｘａ因子生成速度を有する。ある特定の実施形態では、キメラポリペプチドにおける一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分と、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドにおいて、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、活性化プロテインＣによって不活化される。ある特定の実施形態では、キメラポリペプチドにおける一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分と、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドにおいて、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子に匹敵する、第ＩＸａ因子相互作用速度を有する。一部の実施形態では、キメラポリペプチドにおける一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、２つのＦｃ部分と、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子と、からなるキメラポリペプチドにおいて、プロセシングを受けた第ＶＩＩＩ因子に匹敵するレベルで、フォンウィルブランド因子に結合する。

【0071】

本開示は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するキメラポリペプチドを含む組成物を含み、ここで、前記ポリペプチドのうちの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子の部分と、第２の部分とを含み、ここで、前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９９％同一であるか、またはそれと同一である。一部の実施形態では、第２の部分はＦｃとすることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドを含むハイブリッドの形態であり、ここで、前記第２のポリペプチドは、本質的にＦｃからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子からなるポリペプチドに対して、少なくとも１．５倍から６倍長い、１．５倍から５倍長い、１．５倍から４倍長い、１．５倍から３倍長い、または１．５倍から２倍長い半減期を有する。

【0072】

３．骨ミネラル密度
本明細書で使用される場合、「骨ミネラル密度」または「ＢＭＤ」とは、特定の骨領域で測定された骨ミネラル含有量として定義される。骨は、比較的高い代謝回転を備える動的な組織である。骨代謝は、それぞれ骨芽細胞と破骨細胞によって媒介される、骨形成と骨吸収の間の平衡によって特徴付けられる。これらの骨リモデリング細胞間の相互作用は、サイトカイン、増殖因子およびその他のタンパク質によって媒介される。

【0073】

本明細書で使用される場合、「骨粗鬆症」とは、骨の密度および質が減少している状態の広く認められている疾患を指す。本明細書で使用される場合、用語「骨粗鬆症」とは、原発性骨粗鬆症と続発性骨粗鬆症の両方を含めて、すべての形態の骨粗鬆症を包含する。骨粗鬆症は、ＢＭＤの激しい減少によって特徴付けられ、患者を骨折およびさらなる病的状態にかかりやすくする。骨粗鬆症はいくつかの要因によって、最も顕著には年齢、性別、その他の疾患の存在によって、影響を受ける。活性酸素種（ＲＯＳ）も、破骨細胞形成中では細胞内シグナル伝達においてある役割を演じる（Ｄｏｍａｚｅｔｏｖｉｃら、ＣｌｉｎＣａｓｅｓＭｉｎｅｒＢｏｎｅＭｅｔａｂ２０１７）。ビタミンＤ欠乏症またはビタミンＤ不足もまた、ある特定の血友病集団の低ＢＭＤと関連付けられてきた（Ｋｅｍｐｔｏｎら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ２０１５、２１、５６８～５７７頁）。一部の実施形態では、骨粗鬆症は原発性骨粗鬆症である。ある特定の実施形態では、骨粗鬆症は続発性骨粗鬆症である。様々な実施形態では、骨粗鬆症は血友病Ａと関連付けられる。一部の実施形態では、骨粗鬆症は、血友病Ａの結果であるか、またはその結果らしいと疑われる。

【0074】

骨粗鬆症は、最も一般的な炎症性骨喪失状態の１つであり、免疫系によって能動的に媒介される（ＳｒｉｖａｓｔａｖａＲＫら、ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ２０１８）。転写因子核因子Ｅ２関連因子２（ＮＲＦ２）は、ＲＡＮＫＬによって能動的に阻害されるメカニズムである、抗酸化酵素のアップレギュレーションを介して破骨細胞形成を負に調節する（Ｋａｎｚａｋｉら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２０１３）。また、ＮＲＦ２調節酵素ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）は、マウスの破骨細胞形成を阻害するようである（Ｆｌｏｒｃｚｙｋ－Ｓｏｌｕｃｈら、ＳｃｉＲｅｐｏｒｔｓ２０１８）。

【0075】

ある特定の実施形態では、対象はビタミンＤ欠乏症を有する。一部の実施形態では、２０ナノグラム／ミリリットル～５０ｎｇ／ｍＬのビタミンＤレベルが、健康なヒトにとって十分であるとされている。一部の実施形態では、１２ｎｇ／ｍＬ未満のビタミンＤレベルは一般に、ビタミンＤ欠乏症を示すとされている。一部の実施形態では、ビタミンＤ欠乏症とは約１２ｎｇ／ｍＬ未満のビタミンＤレベルを指す。ある特定の実施形態では、対象はビタミンＤ欠乏症を有していない。一部の実施形態では、対象のビタミンＤ摂取量および／またはレベルは考慮されておらずかつ／または不明である。一部の実施形態では、対象のビタミンＤレベルは不明である。

【0076】

骨形成の例示的なバイオマーカーは、骨型アルカリホスファターゼ、１型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、１型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（Ｐ１ＣＰ）およびオステオカルシンである。骨吸収の例示的なバイオマーカーは、血清の総アルカリホスファターゼ、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン（ＰＹＤ）、骨シアロタンパク質、カテプシンＫ、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、および１型コラーゲンのＣ末端およびＮ末端架橋テロペプチド（それぞれ、ＣＴＸ－１およびＮＴＸ－１）である。骨形成インヒビターの例示的なバイオマーカーは、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＤＫ－１）の血清レベルおよびスクレロスチンの血清レベルである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－ＭｅｒｃｈａｎａｎｄＶａｌｅｎｔｉｎｏ、ＢｌｏｏｄＲｅｖ２０１９；ＫｕｏａｎｄＣｈｅｎ、ＢｉｏｍａｒｋｅｒＲｅｓ２０１７）。

【0077】

様々な実施形態では、骨形成、骨吸収、および／または骨喪失の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、対象の末梢血から評価することができる。様々な実施形態では、骨形成、骨吸収、および／または骨喪失の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、対象の尿から評価することができる。様々な実施形態では、骨形成、骨吸収、および／または骨喪失の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、対象由来の末梢血または尿の試料から評価することができる。

【0078】

末梢血からのバイオマーカーレベルの評価は、例えば、様々ないくつかのアッセイのいずれかを使用して行うことができる。バイオマーカーレベルを決定するのに使用することができるアッセイの非限定的な例には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイおよび化学発光イムノアッセイが含まれる。一部の実施形態では、化学分析器も使用して、標準ＴｅｃｈｎｉｃｏＡｕｔｏ－アナライザー、ＲｏｃｈｅＣＯＢＡＳＩｎｔｅｇｒａ８００、ＯｌｙｍｐｕｓＡＵ５２００アナライザーを含めて、対象試料のバイオマーカーのレベルを決定することができる。

【0079】

一部の実施形態では、バイオマーカーはヒドロキシプロリンである。一部の実施形態では、ヒドロキシプロリンは末梢血から評価される。一部の実施形態では、ヒドロキシプロリンは、対象の尿から評価される。一部の実施形態では、ヒドロキシプロリンは、末梢血または尿から評価され、ＢｅｒｇｍａｎａｎｄＬｏｘｌｅｙ法（ＢｅｒｇｍａｎａｎｄＬｏｘｌｅｙ、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６３）によって分析される。

【0080】

破骨細胞は、大型多核細胞であり、骨吸収活性、骨組織を破壊する能力を備える、身体で唯一の細胞である。破骨細胞は、単球を始めとした造血前駆細胞に由来し、ＲＡＮＫＬ（核因子κＢリガンドの受容体活性化因子）とＭ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）の２つの最未分化因子を必要とする（ＫａｎｚａｋｉＨ．ら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２０１３）。単球とは、受け取った刺激因子に応じて、マクロファージ、樹状細胞および破骨細胞に分化することができる前駆細胞の一種である。

【0081】

最近の一研究では、組換えＦＶＩＩＩ単独ではなく、Ｆｃドメインに連結した組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）が、ヒト単球由来マクロファージをＭ２／Ｍｏｘ様マクロファージ調節表現型に歪めることが示された。Ｋｉｓ－Ｔｏｔｈら、ＢｌｏｏｄＡｄｖ．、２（２１）：２９０４～２９１６頁（２０１８）。しかし、血友病におけるＢＭＤの喪失のメカニズムに関する詳細な理解は現在不明である。

【0082】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、骨折のリスク増大を有する対象を処置するために使用される。血友病患者は、健康な個体と比較してより骨折しやすい。一研究では、重度の血友病患者は、中等度および軽度の血友病患者と比較して、骨折を患っている可能性が４４％より高いことがわかった。Ｇａｙら、ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ．１７０：５８４～５９３頁（２０１５）。一部の実施形態では、対象は重度の血友病を有する。ある特定の実施形態では、対象は中等度の血友病を有する。様々な実施形態では、対象は軽度の血友病を有する。

【0083】

本明細書で使用される場合、用語「骨折リスク」とは、既知のリスク因子に基づく骨折の可能性の増大として定義される。既知のリスク因子に基づく骨折リスクは、臨床医によっておよび／またはＦＲＡＸ骨折リスク評価ツールのような標準化ツールによって判定することができる。ＢＭＤを骨折リスクのリスク因子としてもよい。一般的に、ＢＭＤは低下するにつれ、骨折のリスクは増大する。

【0084】

本明細書で使用される場合、ＦＲＡＸとは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｈｅｆｆｉｅｌｄで開発された骨折リスク評価ツールを指す。全体として、Ｋａｎｉｓ，Ｊ．Ａ．、らＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓＩｎｔ’ｌ．２１．２：４０７～４１３頁（２０１０）を参照されたい。ＦＲＡＸによって、股関節または骨粗鬆症の骨折の１０年確率が算出される。ＦＲＡＸによって、年齢、性別、体重、身長、骨折の病歴、骨折股関節の家族歴、喫煙状況、グルココルチコイドの使用、関節リウマチの有無、続発性骨粗鬆症、アルコール摂取量および骨ミネラル密度に基づいて骨折リスクが算出される。１年間のリスク骨折は１０年間のリスク骨折の結果の１０％に等しい（すなわち、６０％の１０年間のリスク骨折は６％の１年間のリスク骨折に等しいことになる）。

【0085】

ある特定の実施形態では、血友病患者のＢＭＤは、出血イベントまたは骨折を含めて、特定のイベントに続いて判定される。ＢＭＤは、例えば、二重Ｘ線吸収測定法（ＤＸＡ）または二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって試験することができる。ＢＭＤは、グラム毎平方センチメートル（ｇ／ｃｍ^２）として測定することができる。集団にわたってＢＭＤを解析するために、ＢＭＤを健康な若年成人の平均的な「Ｔスコア」と比較することができる。このＴスコアは、患者と、同性の健康な平均的な若年成人の群との間の平均ＢＭＤの差異であり、標準偏差（ＳＤ）で測定される。例えば、－１．０以上（小さな負）のＴスコアは正常と考慮することができる。－１．０未満（より大きな負）のＴスコアは、骨減少症を示すとすることができる。－２．５未満のＴスコアは、骨粗鬆症を示すと考慮することができる。ＢＭＤ試験によって、股関節または腰椎の骨ミネラル密度を測定することができる。ＢＭＤ試験によって、下腕、手首、指、または踵の骨ミネラル密度も測定することができる。ＢＭＤはまた、平均的な「Ｚスコア」と比較することができる。このＺスコアは、患者と、健康な年齢および性別が一致する対照の群との間の平均ＢＭＤの差異であり、標準偏差で測定される。Ｚスコアは続発性骨粗鬆症の診断に有用であるとすることができる。－２．０未満のＺスコアは、低骨ミネラル密度を示すとすることができる。ＴスコアおよびＺスコアを含めて、骨ミネラル密度測定法に関するさらなる詳細については、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる、Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、ＪＡＭＡ２８８（１５）：１８８９～１８９７頁（２００２）を参照されたい。

【0086】

ある特定の実施形態では、Ｔスコアを使用して、少なくとも２０歳である対象のＢＭＤを評価する。ある特定の実施形態では、Ｔスコアを使用して、少なくとも３０歳である対象のＢＭＤを評価する。ある特定の実施形態では、Ｔスコアを使用して、少なくとも４０歳である対象のＢＭＤを評価する。ある特定の実施形態では、Ｔスコアを使用して、少なくとも５０歳である対象のＢＭＤを評価する。

【0087】

ある特定の実施形態では、Ｚスコアを使用して、３０歳未満である対象のＢＭＤを評価する。ある特定の実施形態では、Ｚスコアを使用して、２０歳未満である対象のＢＭＤを評価する。

【0088】

一部の実施形態では、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象は、若年成人の平均を下回る１から２．５の間の標準偏差である骨密度を有する。一部の実施形態では、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象は、若年成人の平均を下回る２．５以上の標準偏差である骨密度を有する。一部の実施形態では、対象は、同じ年齢および性別の対象の平均骨密度よりも低い骨密度を有する。一部の実施形態では、対象は、同じ年齢および性別の対象の平均骨密度よりも少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、または１０％低い骨密度を有する。一部の実施形態では、対象は、同じ年齢および性別の対象の平均骨密度よりも少なくとも１０％低い骨密度を有する。一部の実施形態では、ＢＭＤは腰椎で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは股関節で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは腕で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは脚で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは膝で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは手首で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは指で測定される。一部の実施形態では、ＢＭＤは踵で測定される。一部の実施形態では、低ＢＭＤを有する対象は、血友病Ａを有していない対応する対象（または対応する対象の集団）と比較して、特定の部位で１０％または１５％より低いＢＭＤを有する。

【0089】

一部の実施形態では、対象は、リスク因子を使用して、低ＢＭＤを有すると特定することができる。低ＢＭＤのリスク因子には、年齢、性別、民族性、血友病性関節症、身体活動の減少、慢性ウイルス感染症（例えばＨＩＶまたはＨＣＶ）、ビタミンＤ欠乏症、低体重指数（ＢＭＩ）、および／または性腺機能低下症が含まれる。ＫｅｍｐｔｏｎＣＬらＨａｅｍｏｐｈｉｌｉａ２１（５）：５６８～７７頁（２０１５）を参照されたい。他のリスク因子については、当技術分野で知られる現在認められている臨床ガイドラインおよび診療に従って評価することができる。

【0090】

対象が低ＢＭＤを有すると判定される場合、本明細書に開示される方法を使用して、対象のＢＭＤの減少を阻害し、および／または対象のＢＭＤのさらなる減少を防御することができる。対象が別のＦＶＩＩＩ補充療法または別の血友病Ａ療法で現在処置中である場合、対象のＢＭＤの減少を阻害し、および／または時間の経過に伴う対照のＢＭＤのさらなる減少を防御するために、本明細書に開示される方法への治療計画の変更を考慮することができる。

【0091】

本明細書に開示される実施例に詳述のように、ヒトマクロファージ処置へのｒＦＶＩＩＩＦｃの投与によって、ｉｎｖｉｔｒｏで単球由来破骨細胞の形成および機能が効果的に阻害された。本発見が示唆するところは、ｒＦＶＩＩＩＦｃによる補充療法は、血友病Ａ患者の骨の健康に免疫調節効果の可能性を秘めることができる、ということである。正確なメカニズムは依然として不明であるが、そして科学理論になんら拘束されるものではないが、ｒＦＶＩＩＩＦｃによって、血友病患者の免疫環境を抗酸化の、寛容原性の、および骨粗鬆症ではない状態に促進することによって、血友病Ａ患者のＢＭＤの減少を防御することができる。

【0092】

４．血友病
血友病の主たる３つの形態とは、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠乏症、軽度の出血傾向）である。他の止血障害には、例えば、フォンウィルブランド病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏症または構造的異常、ＧＰＩｂの欠陥または欠乏症であるベルナール・スリエ症候群が含まれる。フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の受容体であるＧＰＩｂは、不完全である場合があり、一次血栓形成の不足（一次止血および出血傾向の増加）、およびグランツマンおよびネーゲリの血小板無力症（グランツマン血小板無力症）につながる恐れがある。肝不全（急性および慢性型）では、肝臓による凝固因子の産生が不十分である；これは出血のリスクを高める恐れがある。本明細書で使用される場合、血友病はカテゴリーによってグレード分けすることができる。例をあげると、「軽度」、「中程度」、「重度」と分類することができる。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ血漿レベル１％以下（正常と比較して）（「重度」）、２％～５％（「中程度」）、および６～３０％（「軽度」）によって定義される重症度に関する３つのグレードを有する。ＷｈｉｔｅらＴｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：５６０頁（２００１）。

【0093】

「処置する」、「処置」、「処置すること」とは、本明細書において使用されるように、例えば疾患もしくは状態の重症度の減少；疾病経過の持続期間の短縮；疾患もしくは状態に伴う１つもしくはそれ以上の兆候の改善；疾患もしくは状態を必ずしも治癒するわけではないが当該疾患もしくは状態を有する対象に対する有益な効果の提供、または疾患もしくは状態に伴う１つもしくはそれ以上の兆候の予防、を指す。一態様では、本明細書に開示される方法は、血友病Ａを有する対象を処置する方法である。ある特定の実施形態では、処置する工程は、対象の出血エピソードの可能性を減少させることまたは防止すること、およびまた例えば、ｒＦＶＩＩＩ補充で処置されている対応する対照と比較して、対象のＢＭＤを改善すること、またはＢＭＤの減少を遅延させることを含む。ある特定の実施形態では、処置する工程は、例えば、ｒＦＶＩＩＩ補充で処置されている対応する対象と比較して、対象の出血エピソードのリスクを減少させることおよびまた対象の骨折のリスクを減少させることを含む。ある特定の実施形態では、処置する工程は、例えば、ｒＦＶＩＩＩ補充で処置されている対応する対象と比較して、対象の出血エピソードの重症度を減少させることおよびまた対象のＢＭＤを改善することまたはＢＭＤの減少を遅延させることを含む。ある特定の実施形態では、処置する工程は、例えば、ｒＦＶＩＩＩ補充で処置されている対応する対象と比較して、対象の出血エピソードの重症度を減少させることおよびまた対象の骨折のリスクを減少させることを含む。一部の実施形態では、処置は予防処置を含む。一部の実施形態では、処置はオンデマンド療法を含む。

【0094】

血友病Ａについてはいくつかの治療選択肢が現在利用可能であり、これには以下が含まれる：従来のＦＶＩＩＩ補充（例えばＡＤＶＡＴＥ（登録商標）／オクトコグアルファ、ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）／ロノクトコグアルファＮＵＷＩＱ（登録商標）／シモクトコグアルファ）および半減期延長ＦＶＩＩＩ補充療法（例えばＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標）／エフモロクトコグアルファ、ＥＳＰＥＲＯＣＴ（登録商標）／ツロクトコグアルファペゴル、およびＡＤＹＮＯＶＡＴＥ（登録商標）／ルリオクトコグアルファペゴル）。エミシズマブのような、他の非補充療法も今では利用できる。総説については、Ｐｅｔｅｒｓ＆Ｈａｒｒｉｓ、ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃ．（２０１８）；Ｗｅｙａｎｄ＆Ｐｉｐｅ、Ｂｌｏｏｄ、１３３（５）：３８９～３９８頁（２０１９）を参照されたい。オクトコグアルファ、ロノクトコグアルファ、シモクトコグアルファ、ツロクトコグアルファ、およびルリオクトコグアルファペゴルのような処置のＢＭＤおよび骨粗鬆症に及ぼす影響は不明である。

【0095】

本明細書で提供のデータが実証したところは、ｒＦＶＩＩＩＦｃを使用する処置が、経時的なＢＭＤ喪失を阻害することによって、血友病Ａ患者にさらなる骨保護効果を提供することができることである。こういった骨の健康上の効果は、ｒＦＶＩＩＩ単独での処置を使用しては観察されなかったが、このことにより、キメラタンパク質にＦｃドメインが存在することに起因する可能性が最も高いが、こういった効果はｒＦＶＩＩＩＦｃに固有であることが、示唆される。したがって、ＦＶＩＩＩＦｃは、低ＢＭＤ、骨粗鬆症、および／または骨折リスクの増大を有する血友病Ａの対象の処置に関する優れた選択とすることができる。さらに、ＢＭＤの減少は進行性疾患であり、血友病Ａを有する対象では若年で開始するので、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、低ＢＭＤを発症するまたは有するリスクのあるあらゆる血友病Ａの対象の処置に関する優れた選択とすることができる。

【0096】

様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ以外の処置による十分な凝固を有するが、低ＢＭＤ、骨粗鬆症、および／または骨折リスクの増大を有する。一部の実施形態では、血友病Ａを有する対象は、ｒＦＶＩＩＩおよび半減期延長部分（例えばアルブミンまたはポリエチレングリコール）を含む融合タンパク質による十分な凝固を有するが、低ＢＭＤ、骨粗鬆症、および／または骨折リスクの増大を有する。一部の実施形態では、血友病Ａを有する対象は、ｒＦＶＩＩＩによる十分な凝固を有するが、低ＢＭＤ、骨粗鬆症、および／または骨折リスクの増大を有する。ある特定の実施形態では、血友病Ａを有する対象は、凝固促進性二重特異性抗体（例えば、エミシズマブまたはエミシズマブ－ｋｘｗｈのような、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を結合する二重特異性抗体）による十分な凝固を有するが、低ＢＭＤ、骨粗鬆症、および／または骨折リスクの増大を有する。一部の実施形態では、対象は骨減少症を有する。一部の実施形態では、対象は骨粗鬆症を有する。一部の実施形態では、対象は骨折リスクの増大を有する。

【0097】

様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、用量間で少なくとも１％、２％、３％、４％、または少なくとも５％のＦＶＩＩＩ活性である。例えば、一部の実施形態では、用量間のＦＶＩＩＩ活性は、用量間で１％、２％、３％、４％、または５％未満に低下しない。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイで測定される。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、５以下の出血の年換算出血率（ＡＢＲ）である。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、４以下の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、３以下の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象における十分な凝固とは、２以下の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、１以下の出血のＡＢＲである。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性は、発色アッセイで測定される。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、５未満の出血の年換算出血率（ＡＢＲ）である。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、４未満の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、３未満の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、２未満の出血のＡＢＲである。様々な実施形態では、血友病Ａを有する対象の十分な凝固とは、１未満の出血のＡＢＲである。

【0098】

本明細書で使用される場合、用語「予防処置」とは、血友病の処置のための療法の投与を指し、かかる処置は、血友病の１つまたはそれ以上の症状、例えば、出血エピソード、例えば１つまたはそれ以上の特発性出血エピソード、および／または関節損傷の重症度を防止するまたは減少させることを意図する。Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｙｕｓｔｅら、ＢｌｏｏｄＴｒａｎｓｆｕｓ．１２（３）：３１４～１９頁（２０１４）を参照されたい。かかる症状の、例えば、出血エピソードの重症度および関節疾患の進行を防止するまたは減少させるために、血友病Ａ患者は、予防処置レジメンの一部として凝固因子の定期的な注入を受けてもよい。かかる予防処置の基礎とは、凝固因子レベル、例えば、ＦＶＩＩＩレベルが１％以上の血友病患者は、重度の血友病患者と比較して、特発性出血エピソードに見舞われることはめったになく、血友病関連併存疾患がより少ないという、観察である。例えば、ＣｏｐｐｏｌａＡ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３８（１）：７９～９４頁（２０１２）を参照されたい。このような血友病患者を取り扱う医療関係者は、定期的な注入で因子レベルをおよそ１％に維持することにより、出血エピソードや関節損傷を含めて、血友病症状のリスクをもしかすると減少させる可能性があると推測した。同上を参照されたい。その後の研究によって、凝固因子による予防処置を受けている小児血友病患者においてこういった効果が確認され、その結果、予防処置は重度血友病のヒトにとってのゴールであるとしている。同上を参照されたい。

【0099】

「予防」処置とはまた、血友病Ａの１つまたはそれ以上の症状の、例えば、出血エピソードの、発生または重症度を制御、管理、防止、または減少するために、本明細書に記載の組成物、例えば、キメラポリペプチドの対象への先行投与を指す場合もある。凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩによる予防処置は、重度血友病Ａを有する対象の標準治療である。例えば、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ、Ｂｌｏｏｄ１２５：２０３８～４４頁（２０１５）を参照されたい。一部の実施形態では、予防処置とは、血友病Ａの１つまたはそれ以上の症状の発生を減少させるのに、それを必要とする対象に本明細書に開示される組成物を投与する工程を指す。予防処置には、複数用量の投与を含めることができる。予防処置に使用される複数用量は典型的には、特定の投薬間隔で投与される。ある特定の実施形態では、年換算出血率を、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下に減少させることができる。ある特定の実施形態では、年換算出血率を、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満、または１未満に減少させることができる。

【0100】

用語「オンデマンド療法」または「エピソード処置」とは、血友病Ａの症状、例えば出血エピソードに応答した、または出血を引き起こす恐れのある活動に前もった、キメラ分子の「必要に応じた」投与を指す。一態様では、オンデマンド療法を、傷害後のような出血が開始する場合、または術前のような出血が予想される場合に対象に与えることができる。一態様では、オンデマンド療法を、コンタクトスポーツのような出血のリスクを高める活動に先立って与えることができる。一部の実施形態では、オンデマンド療法を、単回用量として与える。一部の実施形態では、オンデマンド療法を、第１の用量として、これに続いて、１つまたはそれ以上のさらなる用量として与える。キメラポリペプチドをオンデマンドで投与する場合、１つまたはそれ以上のさらなる用量は、第１の用量の、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約３６時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約６０時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約８４時間後、少なくとも約９６時間後、少なくとも約１０８時間後、または少なくとも約１２０時間後に投与することができる。しかし、オンデマンド療法に関連する投薬間隔は、予防処置に使用される投薬間隔と同じではないことに、留意されたい。

【0101】

本明細書で使用される場合、用語「用量」とは、対象への組成物の単一の投与を指す。単回用量は、例えばボーラスとして、またはある期間にわたって、例えば静脈内注入を介して、一度にすべて投与することができる。用語「複数用量」とは、２以上の用量、例えば、２以上の投与を意味する。２種以上の組成物の共投与に言及する場合、組成物Ａの用量は、組成物Ｂの用量と同時に投与することができる。あるいは、組成物Ａの用量は、組成物Ｂの用量の前または後に投与することができる。一部の実施形態では、組成物Ａおよび組成物Ｂは、単一の製剤に組み合わされる。

【0102】

ある特定の実施形態では、「用量」とは、治療有効量のキメラタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、用量とは、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃを指す。ある特定の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約１０ＩＵ／Ｋｇから約３００ｌＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２０ＩＵ／Ｋｇから約３００ｌＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２０ＩＵ／ｋｇから約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約２００ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１９０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１８０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１７０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１６０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１５０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１４０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１３０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１２０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１１０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約９０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約８０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約７０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約６０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇから約９０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇから約８０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇから約７０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇから約６５ＩＵ／ｋｇ、である。一実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２５ＩＵ／ｋｇから約６５ＩＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇから約１００ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約９０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約８０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約７０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約６０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約５０ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇから約４０ＩＵ／ｋｇ、または約２０ＩＵ／ｋｇから約３０ＩＵ／ｋｇ、である。

【0103】

他の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約２５ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約５５ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約６５ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇ、約８５ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約９５ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１０５ＩＵ／ｋｇ、約１１０ＩＵ／ｋｇ、約１１５ＩＵ／ｋｇ、約１２０ＩＵ／ｋｇ、約１２５ＩＵ／ｋｇ、約１３０ＩＵ／ｋｇ、約１３５ＩＵ／ｋｇ、約１４０ＩＵ／ｋｇ、約１４５ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１５５ＩＵ／ｋｇ、約１６０ＩＵ／ｋｇ、約１６５ＩＵ／ｋｇ、約１７０ＩＵ／ｋｇ、約１７５ＩＵ／ｋｇ、約１８０ＩＵ／ｋｇ、約１８５ＩＵ／ｋｇ、約１９０ＩＵ／ｋｇ、約１９５ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、または約３００ＩＵ／ｋｇ、である。一実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約５０ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約１００ＩＵ／ｋｇである。別の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２００ＩＵ／ｋｇである。

【0104】

本明細書で使用される場合、用語「間隔」または「投薬間隔」とは、対象に投与される組成物Ａの第１の用量と同じ組成物のその後の用量との間に経過する時間の量を指す。投薬間隔は、第１の用量と第２の用量の間に経過する時間を指す場合もあり、または、投薬間隔は、複数用量の間に経過する時間の量を指す場合もある。

【0105】

本明細書で使用される用語「投薬頻度」とは、特定の投薬間隔あたりに投与される用量の数を指す。例えば、投薬頻度は、週に１回、２週間毎に１回等と定めることができる。したがって、７日の投薬間隔は、７日に１回、または１週間毎に１回、または週に１回の投薬間隔と定めることもできる。

【0106】

一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ｒＦＶＩＩＩＦｃであり、以下の投薬間隔で対象に投与される、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、または約２４日。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約４５日、または約６０日の投薬間隔でヒトに投与される。

【0107】

一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは以下の投薬間隔で投与される、約１～約１４日、約１～約１３日、約１～約１２日、約１～約１１日、約１～約１０日、約１～約９日、約１～約８日、約１～約７日、約１～約６日、約１～約５日、約１～約４日、約１～約３日、約１～約２日、約２～約１４日、約３～約１４日、約４～約１４日、約５～約１４日、約６～約１４日、約７～約１４日、約８～約１４日、約９～約１４日、約１０～約１４日、約１１～約１４日、約１２～約１４日、約１３～約１４日、または約５～約１０日。他の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは以下の投薬間隔で投与される、約１～約２１日、約１～約２０日、約１～約１９日、約１～約１８日、約１～約１７日、約１～約１６日、約１～約１５日、約１～約１４日、約１～約１３日、約１～約１２日、約１～約１１日、約１～約１０日、約１～約９日、約１～約８日、約１～約７日、約１～約６日、約１～約５日、約１～約４日、約１～約３日、約１～約２日、約２～約２１日、約３～約２１日、約４～約２１日、約５～約２１日、約６～約２１日、約７～約２１日、約８～約２１日、約９～約２１日、約１０～約２１日、約１１～約２１日、約１２～約２１日、約１３～約２１日、約１４～約２１日、約１５～約２１日、約１６～約２１日、約１７～約２１日、約１８～約２１日、約１９～約２１日、約２０～約２１日、約５～約１０日、約１０～約１５日、約１５～約２０日。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２～約６日の投薬間隔で投与される。一部の実施形態では、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、約３～約５日の投薬間隔で投与される。

【0108】

様々な実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、２５～６５ＩＵ／ｋｇ（２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５ＩＵ／ｋｇ）であり、投薬間隔は３～５、３～６、３～７、３、４、５、６、７、もしくは８日またはこれ超毎に１回、または週毎に３回、または週毎に３回以下、である。一部の実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、６５ＩＵ／ｋｇであり、投薬間隔は、週に１回、または６～７日毎に１回である。用量は、必要である限り繰り返し投与することができる（例えば、少なくとも１０、２０、２８、３０、４０、５０、５２、または５７週間、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年）。様々な実施形態では、治療有効量のｒＦＶＩＩＩＦｃは、約２５～６５ＩＵ／ｋｇであり、投薬間隔は、３～５日毎に１回である。

【0109】

５．方法
方法
本開示の一態様は、血友病および低ＢＭＤを有する対象を処置する方法である。本開示の方法は、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と、組換え第ＶＩＩＩ因子(FVIII)タンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤの減少を阻害する。一部の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１である。一部の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一部の実施形態では、キメラタンパク質はｒＦＶＩＩＩＦｃである。

【0110】

同様に、本開示の一態様は、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を処置するのに使用するための組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含むキメラタンパク質である。

【0111】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号１と１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0112】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２と１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0113】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５と１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0114】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、３～５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。

【0115】

ある特定の実施形態では、対象のＢＭＤは、二重Ｘ線吸収測定法（ＤＸＡ）によって測定される。

【0116】

ある特定の実施形態では、対象は５０歳以上である。

【0117】

ある特定の実施形態では、対象は５０歳未満である。

【0118】

ある特定の実施形態では、対象のＢＭＤはＴスコアによって判定される。ある特定の実施形態では、対象のＢＭＤはＴスコアによって判定される。ある特定の実施形態では、対象は５０歳以上であり、対象のＢＭＤはＴスコアによって判定される。

【0119】

ある特定の実施形態では、対象が－１．０未満のＴ－スコアを有する場合、対象は低ＢＭＤを有すると判定される。ある特定の実施形態では、対象が－１．０から－２．４の間のＴスコアを有する場合、対象は、低ＢＭＤおよび骨減少症を有すると判定される。ある特定の実施形態では、対象が－２．５未満のＴスコアを有する場合、対象は、低ＢＭＤおよび骨粗鬆症を有すると判定される。

【0120】

ある特定の実施形態では、対象のＢＭＤはＺスコアによって判定される。ある特定の実施形態では、対象は５０歳未満であり、対象のＢＭＤはＺスコアによって判定される。

【0121】

ある特定の実施形態では、対象が－２．０未満のＺスコアを有する場合、対象は低ＢＭＤを有すると判定される。

【0122】

ある特定の実施形態では、対象は、骨形成、骨吸収、および／または骨喪失のうちの１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルに基づいて、低ＢＭＤを有すると予測される。

【0123】

ある特定の実施形態では、バイオマーカーは対象の末梢血または尿から評価される。

【0124】

ある特定の実施形態では、骨形成の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、骨型アルカリホスファターゼ、１型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、１型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（Ｐ１ＣＰ）、オステオカルシンおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0125】

ある特定の実施形態では、骨吸収の１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、血清の総アルカリホスファターゼ、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン（ＰＹＤ）、骨シアロタンパク質、カテプシンＫ、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、１型コラーゲンのＣ末端架橋テロペプチド（ＣＴＸ－１）、１型コラーゲンのＮ末端架橋テロペプチド（ＮＴＸ－１）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0126】

本開示の一態様は、血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を処置する方法である。本開示の方法は：（ｉ）血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有する対象を選択する工程と、（ｉｉ）組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象の骨折のリスクを減少させる。

【0127】

【0128】

【0129】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５によるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号５と１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0130】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は３～５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。

【0131】

ある特定の実施形態では、対象の骨折のリスクは骨折リスク評価ツール（ＦＲＡＸ）によって判定される。

【0132】

ある特定の実施形態では、対象の骨折のリスクは、低ＢＭＤリスク因子の評価によって判定される。ある特定の実施形態では、低ＢＭＤリスク因子は、関節症、身体活動の減少、ＨＩＶもしくはＨＣＶによる感染、ビタミンＤ欠乏症、低体重指数（ＢＭＩ）、性腺機能低下症、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0133】

本開示の一態様は、対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）喪失の速度を減少させる方法である。本開示の方法は、（ｉ）低ＢＭＤを有する対象を選択する工程と；（ｉｉ）凝固因子およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、その結果、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤ喪失の速度を減少させる。

【0134】

【0135】

【0136】

【0137】

ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は３～５日毎に２５～６５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。

【0138】

本開示の一態様は、血友病Ａおよび骨折を有する対象を処置する方法である。本開示の方法は、血友病および骨折を有する対象を選択する工程と、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメインを含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含む。

【0139】

【0140】

【0141】

【0142】

本開示の前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、一部の実施形態では、対象は軽度の血友病Ａを有する。

【0143】

本開示の前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、一部の実施形態では、対象は中程度の血友病Ａを有する。

【0144】

本開示の前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、一部の実施形態では、対象は重度の血友病Ａを有する。

【0145】

本開示の前述の態様および実施形態のそれぞれによれば、一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0146】

【0147】

本開示のある特定の態様は、血友病Ａを有する対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、（ｉ）ノンファクター補充タンパク質で血友病Ａの処置を受けている対象を特定する工程であって、対象は処置中では十分な血液凝固を有したが、対象は低ＢＭＤを有する、工程と；（ｉｉ）ノンファクター補充タンパク質での処置を中止し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程とを含み、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0148】

本開示のある特定の態様は、対象の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増大させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、対象は血友病Ａおよび低ＢＭＤを有すると特定されており、キメラタンパク質の投与は、対象のＢＭＤを増大させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0149】

本開示のある特定の態様は、対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する方法であって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質およびＦｃドメイン（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）を含む治療有効量のキメラタンパク質を対象に投与する工程を含み、ここで、対象は血友病Ａおよび骨折のリスク増大を有すると特定されており、かつキメラタンパク質の投与は、対象の骨折のリスクを減少させ、出血エピソードを予防的に処置する、方法を対象とする。

【0150】

【0151】

【0152】

【0153】

【0154】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていないペグ化ＦＶＩＩＩである。Ｆｃ部分を有しないペグ化第ＶＩＩＩ因子分子の例には、それらに限定されないが、ＡＤＹＮＯＶＡＴＥ（登録商標）、ＥＳＰＥＲＯＣＴ（登録商標）、およびＪＩＶＩ（登録商標）が含まれる。

【0155】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃドメインに融合されていない一本鎖ＦＶＩＩＩである。Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子分子の例には、それに限定されないが、ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）が含まれる。

【0156】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ヒトにおいてその半減期を延長する部分を含まない組換えＦＶＩＩＩである。ヒトにおいて半減期を延長する部分を含まない第ＶＩＩＩ因子分子の例には、それらに限定されないが、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＸＹＮＴＨＡ（登録商標）、ＮＯＶＯＥＩＧＨｔ（登録商標）、およびＫＯＶＡＬＴＲＹ（登録商標）が含まれる。

【0157】

一部の実施形態では、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、血液由来ＦＶＩＩＩまたは血漿由来ＦＶＩＩＩである。

【0158】

【0159】

一部の実施形態では、対象は、ノンファクター補充タンパク質を使用して血友病Ａに伴う出血を減少させるように予め処置されている。

【0160】

一部の実施形態では、ノンファクター補充タンパク質はエミシズマブである。

【0161】

一部の実施形態では、エミシズマブはエミシズマブ－ｋｘｗｈである、

【0162】

一部の実施形態では、対象は、Ｆｃ部分を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはノンファクター補充タンパク質での処置中では十分な血液凝固を有していた。

【0163】

一部の実施形態では、対象は、出血が検出されていない骨部位および／または関節にて低ＢＭＤを有する。

【0164】

６．製剤
本明細書で使用される「投与する」または「投与する工程」とは、本明細書に記載の組成物、例えば、キメラタンパク質を対象に送達することを指す。組成物、例えば、キメラタンパク質は、当技術分野において知られる方法を使用して、対象に投与することができる。特に、組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口的に、舌下的に、口腔的に、経鼻的に、直腸的に、経膣的に、または肺の経路を介して、投与することができる。一部の実施形態では、投与は静脈内である。一部の実施形態では、投与は皮下である。一部の実施形態では、投与は自己投与である。一部の実施形態では、親が子に組成物を投与する。一部の実施形態では、組成物は、医師、インターンまたは看護師のような医療関係者によって対象に投与される。

【0165】

本明細書で使用される用語「非経口」には、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液嚢内および腹腔内の各注射または各注入、ならびに類似の任意の注射または注入の技法、が含まれる。組成物はまた、例えば、懸濁液、乳濁液、徐放性製剤、クリーム剤、ゲル剤または散剤とすることができる。組成物は、トリグリセリドのような従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として製剤してもよい。

【0166】

一例では、医薬製剤は、液剤、例えば、緩衝化等張水溶液である。別例では、医薬組成物は、生理的または生理的に近いｐＨを有する。一例では、水性製剤は、生理的または生理的に近い浸透圧および塩分を有する。一例では、水性製剤は、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含有してもよい。

【0167】

一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるＦＶＩＩＩおよびＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、以下を含む医薬組成物に製剤化される：（ａ）キメラポリペプチド；（ｂ）スクロース、トレハロース、ラフィノース、アルギニンから選択される１つもしくはそれ以上の安定剤、またはそれらの混合物；（ｃ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；（ｄ）Ｌ－ヒスチジン；（ｅ）塩化カルシウム；および（ｆ）ポリソルベート２０またはポリソルベート８０。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、以下を含む：（ａ）キメラポリペプチド５０ＩＵ／ｍｌ～２５００ＩＵ／ｍｌ；（ｂ）スクロース１０ｍｇ／ｍｌ～２５ｍｇ／ｍｌ；（ｃ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）８．８ｍｇ／ｍｌ～１４．６ｍｇ／ｍｌ；（ｄ）Ｌ－ヒスチジン０．７５ｍｇ／ｍｌ～２．２５ｍｇ／ｍｌ；（ｅ）塩化カルシウム二水和物０．７５ｍｇ／ｍｌ～１．５ｍｇ／ｍｌ；（ｆ）ポリソルベート２０またはポリソルベート８００．０８ｍｇ／ｍｌ～０．２５ｍｇ／ｍｌ。一部の例では、本開示の方法で使用される医薬組成物は、凍結乾燥されている。

【0168】

本開示はまた、医薬品キットのコンポーネントを提供する。かかるキットは、１つまたはそれ以上の容器および場合による付属部品を含む。本明細書で提供のキットによって、それを必要とする対象への有効量のキメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の投与が容易となる。ある特定の実施形態では、キットによって、静脈内注入を介したキメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の投与が容易となる。ある特定の実施形態では、キットによって、静脈内注入を介したキメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）の自己投与が容易となる。

【0169】

一部の実施形態では、本開示は、凍結乾燥粉末または塊を含む第１の容器、ここで、粉末または塊は：（ｉ）キメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）、（ｉｉ）スクロース（および／またはトレハロース、ラフィノースまたはアルギニン）；（ｉｉｉ）ＮａＣｌ；（ｉｖ）Ｌ－ヒスチジン；（ｖ）塩化カルシウム二水和物；および（ｖｉ）ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含み；ならびに、第１の容器の凍結乾燥粉末と一緒にされる、希釈剤、例えば注射用の滅菌水を含む第２の容器、を含む医薬キットを提供する。一部の実施形態では、十分な希釈剤を供給して、本明細書に開示される所望の特性を備えるキメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）製剤約３ｍｌを作製する。一部の実施形態では、第２の容器は、プランジャーと結び付いているプレフィルドシリンジであり、これによって、希釈剤を第１の容器に添加し、その結果、第１の容器の内容物を再構成し、シリンジ内に移し戻すことが可能となる。一部の実施形態では、キットは、シリンジを第１の容器に取り付けるためのアダプターをさらに供給する。一部の実施形態では、キットは、再構成されたＦＶＩＩＩポリペプチド（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）製剤を含有するシリンジに取り付けるニードル及ぶ注入チュービングをさらに供給し、これによって、製剤のＩＶ注入が可能となる。

【0170】

一部の実施形態では、キメラタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩＦｃ）は、約２００ＩＵから約６０００ＩＵ、例えば、約２５０ＩＵ、約５００ＩＵ、約７５０ＩＵ、約１０００ＩＵ、約１５００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約５０００ＩＵ、または約６０００ＩＵの総量で供給される。

【0171】

本明細書で使用される凝固因子のＦＶＩＩＩ部分またはキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性は、当技術分野で知られる任意の方法によって測定することができる。凝固系の機能を評価するいくつかの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲの判定にも使用）、フィブリノーゲン試験（多くの場合、クラウス法による）、血小板数、血小板機能検査（多くの場合ＰＦＡ－１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合検査（患者の血漿を正常な血漿と混合する場合に異常が矯正されるか否か）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子検査（例えば、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、種々の血小板機能検査、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリ（（ＴＥＭ（登録商標）、例えばＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはユーグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。

【0172】

ａＰＴＴ試験とは、「内因系」凝固経路（接触活性化経路とも呼ばれる）と共通凝固経路の双方の有効性を測定する性能指標である。この試験は、市販の組み換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定するのに普通に使用される。この試験は、外因系経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と併せて使用される。

【0173】

ＲＯＴＥＭ分析は、止血の全動態に関する情報：凝固時間、血栓形成、血栓安定性および溶解を提供する。トロンボエラストメトリの様々なパラメータは、血漿凝固系の活性、血小板機能、フィブリン溶解、またはこれらの相互作用に影響を与える多くの因子に依存性である。このアッセイで、二次止血の全体像を提供することができる。

【0174】

発色アッセイ機構は血液凝血カスケードの原則に基づいており、この場合、活性化ＶＩＩＩが、活性化第ＩＸ因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を加速する。第Ｘａ因子活性は、第Ｘａ因子に特異的なｐ－ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎｍにて測定したｐ－ニトロアニリンの放出の初期速度は、第Ｘａ因子活性に、故に試料中のＦＶＩＩＩ活性に直接比例する。

【0175】

発色アッセイは、国際血栓止血学会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｎＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＩＳＴＨ）の学術標準化委員会（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＳＳＣ）の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子小委員会、によって推奨されるものである。１９９４年以来、発色アッセイはまた、ＦＶＩＩＩ濃縮製剤の効力の帰属に関する、欧州薬局方（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の参照方法でもある。したがって、一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するＦＶＩＩＩ活性を有する。

【0176】

ある特定の実施形態では、有効量または有効用量は、単回用量として投与される。一部の実施形態では、有効量または有効用量は、１日を通して２以上の用量で投与される。

【0177】

本開示について詳細に記載してきたが、以下の実施例を参照することで同等のことが明確に理解されるが、それらは例示のみを目的として本明細書に含まれるものであり、本開示を限定することを意図するものではない。本明細書で参照されるすべての特許、刊行物、および記事は、参照によって明示的かつ具体的に本明細書に組み入れる。

【実施例】

【0178】

本開示は、とりわけ、血友病Ａおよび低ＢＭＤを有する対象を処置するための組成物、化合物、キット、および方法を提供するが、特定の科学理論によってなんら限定されるものではない。

【実施例1】

【0179】

組換え第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合タンパク質（ｒＦＶＩＩＩＦｃ）はｉｎｖｉｔｒｏで炎症性破骨細胞形成を負に調節する
重度の血友病Ａ（ＨｅｍＡ）患者で観察される骨ミネラル密度の低下から示唆されるところは、ＦＶＩＩＩ活性の非存在および関連する出血エピソードは骨の恒常性に多大な影響を及ぼすことである。

【0180】

いかなる科学理論にも拘束されるものではないが、そういった患者の炎症促進性環境が、関節炎関連骨粗鬆症の場合に報告されるイベントと同様に、憎悪した単球／マクロファージ由来の破骨細胞形成およびその後の骨侵食の一因であるかもしれない、と仮説を立てた。単球由来破骨細胞形成に及ぼすｒＦＶＩＩＩ対ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置の効果について調査して、ｒＦＶＩＩＩＦｃが抗酸化剤ＮＲＦ２経路をアップレギュレートすることによって炎症促進性破骨細胞形成を阻害するか否かを判定した。

【0181】

本仮説を試験するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のヒト単球を分離し、ｒｈＭ－ＣＳＦおよびｒｈＲＡＮＫＬと培養して、未処置でまたはｈＩｇＧ１、ｒＦＶＩＩＩもしくはｒＦＶＩＩＩＦｃの存在下で、破骨細胞形成を行った。処置によって誘発された遺伝子発現の変化を、Ｑ－ＰＣＲによって測定した。破骨細胞の表現型決定に続いて、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を行い、多核化を観察した。処置された破骨細胞の機能を、骨吸収アッセイを使用して調べた。

【0182】

総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してマクロファージから分離し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＶｉｌｏＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを使用して実行し、７５００Ｆａｓｔ機器で行った。比較サイクル閾値（comparative cycle threshold）法を使用して、内因性対照遺伝子３６Ｂ４に対して転写物を定量化した。

【0183】

ヒト単球由来マクロファージを、健康なヒトドナーの末梢血単核細胞から分離したＣＤ１４^＋単球から生成した。

【0184】

精製したＣＤ１４^＋単球を、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。単球を、特に記載がない限り、ヒトＩｇＧ１、Ｂドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（各２５ｎＭ）またはビヒクル（ＰＢＳ）と７日培養期間、処置した処置濃度については予備実験で決定した。ＦｃγＲに結合できないｒＦＶＩＩＩＦｃ分子の変異型であるｒＦＶＩＩＩＦｃＮ２９７Ａも一部の実験で使用して、Ｆｃ部分の効果を判定した。ＫｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙＳ、らＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．２０１６；３０１：３０～３９頁。研究の設計の概略図を図１に示す。

【0185】

結果
ＣＤ１４^＋単球を、Ｍ－ＣＳＦ単独の存在下で７日間培養する、または０日目に４つの処置群のうちの１つで処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養する、のいずれかとした（図２）。次に、各処置群の細胞を、ＴＲＡＰ染色によって形態学的特徴について観察した（図３）。ＲＡＮＫＬなしで処置した対照細胞は、明確なマクロファージ形態を呈した（図３Ａ）。ビヒクル（図３Ｂ）、ＩｇＧ１単独（図３Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩ単独（図３Ｄ）で処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬと培養した細胞は、破骨細胞に特徴的な大きな多核細胞体を呈した。ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞（図３Ｅ）は依然として小さいままであり、単一の核を含有したが、このことが示すところは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置が多核破骨細胞の形成を阻害したことである。

【0186】

破骨細胞形成に及ぼす処置タイミングの効果を調べるために、ＣＤ１４^＋単球を、４つの処置のうちの１つで－１日目に処置した。２４時間の処置後、培養培地を除去し、細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬを含有する培養培地に再懸濁し、再プレーティングした（図４）。ビヒクル（図５Ａ）、ＩｇＧ１単独（図５Ｂ）、またはｒＦＶＩＩＩ単独（図５Ｃ）で－１日目に処置し、０日目に洗浄し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬと培養し、ＴＲＡＰ染色によって調べた、ＣＤ１４^＋単球は、破骨細胞の形態に特徴的な大きな多核細胞に分化した。ｒＦＶＩＩＩＦｃで同様に処置し（図５Ｄ）、ＴＲＡＰ染色で調べたＣＤ１４^＋単球は、特徴的な大型多核細胞がほとんど観察されなかったので、破骨細胞に分化してはいなかったが、このことが示すところは、わずか１日間単球をｒＦＶＩＩＩＦｃ処置することによって、７日間の分化後のｉｎｖｉｔｒｏでの破骨細胞の形成が実質的に阻害されたことである。このことは、ＦＶＩＩＩと単球の血液循環特性の両方に生理学的に関連しているが、なぜなら、ｒＦＶＩＩＩＦｃは血液循環中の単球とのみ相互作用すると予想されるからである。ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置は、完全に分化した単球由来破骨細胞に対して検出可能な影響をまったく示さなかった（データ示さず）。

【0187】

まとめ
単球由来破骨細胞の発生は、ｒＦＶＩＩＩＦｃの存在下で著しく損なわれた。形態学的観察によれば、単球をｒＦＶＩＩＩＦｃでわずか１日間処置すれば、破骨細胞の形成を阻害するのに十分であった。

【実施例2】

【0188】

ｒＦＶＩＩＩＦｃはｉｎｖｉｔｒｏで破骨細胞の骨吸収活性を阻害する
ｒＦＶＩＩＩＦｃは破骨細胞形成を阻害することができたので、本発明者らは次に、破骨細胞の骨吸収活性に及ぼすｒＦＶＩＩＩＦｃの効果について調べた。ＣＤ１４^＋単球をビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ単独、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で３日間培養した。３日目に、単球をウシ皮質骨スライスに再プレーティングし、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７～１０日間共培養した。７～１０日の共培養期間の後、単球由来細胞を除去し、骨スライスをトルイジンブルー染色によって調べた（図６）。ビヒクル（図７Ａ）、ＩｇＧ１（図７Ｂ）、またはｒＦＶＩＩＩ（図７Ｃ）で処置された単球と共培養した骨スライスは、明確な骨吸収を提示し（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ；円で囲まれた領域）、この処置プールに由来する破骨細胞は依然として骨を能動的に破壊することができたことを示した。ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球と共培養した骨スライス（図７Ｄ）は、対照の３群と比較した場合、著しく少ない骨吸収を提示したが（図７Ｄ、円で囲まれた領域）、このことより、単球を０日目にｒＦＶＩＩＩＦｃを処置すると、分化の７～１０日後、細胞の骨再吸収化成が実質的に阻害されることが示唆された。

【0189】

まとめ
破骨細胞分化因子（Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ）と培養した単球をｒＦＶＩＩＩＦｃ処置すると、処置された細胞の骨吸収活性の低下にいたる。

【実施例3】

【0190】

破骨細胞形成における遺伝子発現および機能に及ぼすｒＦＶＩＩＩＦｃの効果
本発明者らは次に、ｒＦＶＩＩＩＦｃの破骨細胞活性および形態の減少が破骨細胞関連遺伝子の低下と一致するか否かについて調査した。ＣＤ１４^＋単球をビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ単独、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養した。次いで、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化した（図８）。次いで、破骨細胞関連遺伝子を、ビヒクル処置（図９、黒色のバー）、ＩｇＧ１処置（図９、暗灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩ処置（図９、明灰色のバー）、およびｒＦＶＩＩＩＦｃ処置（図９、白色のバー）の各細胞で測定し、ビヒクル処置群の発現レベルに正規化した。破骨細胞分化（図９、ＲＡＮＫ、ＮＦＡＴＣ１）および骨吸収活性（図９、ＣＡＴＫ、ＴＲＡＰ、ＭＭＰ９）のマーカーを解析した。解析した遺伝子のいずれについても、ビヒクル、ＩｇＧ１、またはｒＦＶＩＩＩの各処置群間で有意な変化は観察されなかった。しかし、他の処置群と比較した場合、破骨細胞分化（ＲＡＮＫ、ＮＦＡＴＣ１）マーカーと活性（ＣＡＴＫ、ＴＲＡＰ、ＭＭＰ９）マーカーの両方において、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞については遺伝子発現の有意な低下が観察された。図９を参照されたい、白色のバー。

【0191】

本発明者らは次に、上記の４つの処置群における破骨細胞形成中のＮＲＦ２関連遺伝子の応答について調査した。ＮＲＦ２は、破骨細胞形成中にダウンレギュレーションされる抗酸化経路を調節する上である役割を演じることが知られる（ＫａｎｚａｋｉＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）。ＮＲＦ２は、ＧＣＬＣやＮＱＯ１のような凍結保護酵素の発現を制御する。ＣＤ１４^＋単球をビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ単独、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養した。次いで、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化した（図１０）。ＮＲＦ２制御遺伝子ＮＱＯ１およびＧＣＬＣの発現は、ビヒクル処置細胞（図１１Ａ、黒色のバー）と比較した場合、ＩｇＧ１単独（図１１Ａ、暗灰色のバー）またはｒＦＶＩＩＩ単独（図１１Ａ、明灰色のバー）で処置された単球において有意に変化していなかった。しかし、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球は、ビヒクルで処置した群と比較して、ＮＱＯ１とＧＣＬＣの両方の発現の有意な増大を呈した。図１１Ａを参照されたい、白色のバー。

【0192】

本発明者らは次に、ビヒクル（図１１Ｂ、黒色のバー）、ＩｇＧ１単独（図１１Ｂ、暗灰色のバー）、ｒＦＶＩＩＩ単独（図１１Ｂ、明灰色のバー）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した（図１１Ｂ、白色のバー）各単球におけるＮＱＯ１レダクターゼ活性について調査した。ビヒクル処置群と比較して、ＩｇＧ１単独またはｒＦＶＩＩＩのいずれも、ＮＱＯ１比活性の有意な増大を呈さなかった（図１１Ｂ）。しかし、ＮＱＯ１比活性は、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞で有意に増大し、この重要な経路の調節は破骨細胞形成のｒＦＶＩＩＩＦｃ媒介性阻害においてある役割を演じる可能性があることを示した。

【0193】

まとめ
ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞の遺伝子およびタンパク質の発現が示したところは、破骨細胞形成および骨吸収においてある役割を演じることが知られる、抗酸化剤ＮＲＦ２経路のアップレギュレーションならびに破骨細胞特異的マーカーおよび遺伝子のダウンレギュレーション、である。逆に、凍結保護酵素（ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ）の増大が、未処置、ＩｇＧ１単独、またはｒＦＶＩＩＩ処置の各細胞と比較して、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置破骨細胞で観察された。

【実施例4】

【0194】

破骨細胞形成の阻害におけるｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分の役割
本発明者らは次に、破骨細胞形成の阻害におけるｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分の役割について調査した。ＣＤ１４^＋単球をビヒクル、ＩｇＧ１単独、ｒＦＶＩＩＩ単独、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ（ＦｃγＲに結合できない）で０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養した。次いで、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化した（図１２）。破骨細胞分化（ＲＡＮＫ、ＮＦＡＴＣ１）および活性（ＣＡＴＫ、ＴＲＡＰ）のマーカーを測定し、ビヒクル処置群に正規化した（図１３、黒色のバー）。ＩｇＧ１単独（図１３、暗灰色のバー）またはｒＦＶＩＩＩ単独（図１３、明灰色のバー）で処置した各細胞は、ビヒクルで処置した群と比較して、遺伝子発現になんらの有意な変化を提示しなかった。ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞（図１３、白色のバー）は、すべての破骨細胞関連マーカーの有意な低下を呈した。このような減少は、ＦｃγＲ結合がｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ処置群において消失した場合、観察されなかった（図１３、斜線のバー）。

【0195】

まとめ
単球由来破骨細胞形成および破骨細胞特異的遺伝子発現に及ぼすｒＦＶＩＩＩＦｃの阻害効果には、ＦｃドメインとＦｃγＲの相互作用が必要である。

【実施例5】

【0196】

ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球の用量依存的分化
本発明者らは、ＭＣＳＦ／ＲＡＮＫＬ分化単球の免疫表現型に及ぼすｒＦＶＩＩＩＦｃの投薬量の効果について調査した。ＣＤ１４^＋単球を、用量（７５ｎＭ、４２ｎＭ、２４ｎＭ、１３ｎＭ、７．５ｎＭ、４．２ｎＭ、２．４ｎＭ、１．３ｎＭ、０．７ｎＭ、または０ｎＭ）ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１（図１４Ａ～１４Ｂ）またはｒＦＶＩＩＩＦｃ（図１５Ａ～１５Ｂ）で０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養した。次いで、細胞を収集し、蛍光モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターによる収集に供した。細胞は、ＣＤ１４（単球／マクロファージマーカー）およびＣＤ５１／６１（破骨細胞マーカー）、ならびに他の単球／マクロファージマーカーＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１７２ａｂに対する蛍光抗体で染色した。破骨細胞は、ＣＤ１４の低発現と合わさったＣＤ５１／６１高細胞として特徴付けられる。

【0197】

まとめ
ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１０．７ｎＭで処置された細胞のうちの６１．９％、またはビヒクルで処置された細胞のうちの５８．６％と比較して（図１４Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１７５ｎＭ用量で処置された細胞のうちの５１．６％が破骨細胞に分化した（ＣＤ５１／６１ｈｉｇｈ／ＣＤ１４ｌｏｗ；図１４Ａ）ように、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１での処置は、破骨細胞形成の阻害に対してわずかな効果を呈するだけであった。逆に、ｒＦＶＩＩＩＦｃによる処置は破骨細胞形成の実質的な阻害を呈した。たった０．７ｎＭｒＦＶＩＩＩＦｃでの処置細胞のうちの６２．６％またはビヒクルで処置された細胞のうちの５８．５％（図１５Ｂ）と比較して、７５ｎＭｒＦＶＩＩＩＦｃでの処置細胞のうちのわずか１．４４％が破骨細胞に分化した（図１５Ａ）。加えて、より高用量のｒＦＶＩＩＩＦｃ処置によって、処置細胞のうちではっきりと異なる（ＣＤ５１／６１^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}ＣＤ１４^ｌｏｗ）免疫表現型が明らかとなった（図１５Ａ）。ビヒクル対照に正規化した場合、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置細胞に及ぼす破骨細胞形成の阻害効果に関連して、平均ＩＣ５０７．４９ｎＭ（±０．６６ｎＭ、ｎ＝３）が観察された（図１６）。

【実施例6】

【0198】

破骨細胞形成のＦｃγ受容体媒介性阻害
本発明者らは次に、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球からの破骨細胞形成の阻害におけるＦｃγ受容体の役割について調査した。第１の実験では、ＣＤ１４^＋単球をビヒクル（図１７Ａ、図２１Ａ）、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（図１７Ｂ、図２１Ｂ）、ｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１（図１７Ｃ、図２１Ｃ）、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ（図１７Ｄ、図２１Ｄ；ＦｃγＲに結合することができない）で０日目に処置し、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養した。次いで、細胞を収集し、蛍光モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターによる収集に供した。細胞は、ＣＤ１６（単球／マクロファージマーカー）およびＣＤ５１／６１（破骨細胞マーカー）、に対する蛍光抗体で染色した。第２の実験では、０日目に、ＣＤ１４^＋単球をまず、ＦｃγＲ１（抗ＣＤ６４抗体Ｆａｂ、図１８）、ＦｃγＲ２（抗ＣＤ３２抗体、図１９）、もしくはＦｃγＲ３（抗ＣＤ１６抗体、図２０）に対する遮断抗体または対応する各アイソタイプ対照抗体によって処置し、次いでｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩで処置し、次いでＭ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間さらに培養した。次いで、細胞を収集し、蛍光モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターによる収集に供した。細胞は、ＣＤ１６（単球／マクロファージマーカー）およびＣＤ５１／６１（破骨細胞マーカー）に対する蛍光抗体で染色した。

【0199】

まとめ
ビヒクル処置細胞（図１７Ａ；３７．４％図２１Ａ）とｒＦＶＩＩＩ＋ＩｇＧ１で処置された細胞（図１７Ｃ；３９．６％図２１Ｃ）の両方はそのうちの３９．５％が、ＣＤ５１／６１^ｈｉｇｈ破骨細胞として特徴付けられたが、一方、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された細胞（図１７Ｂ；５．５７％図２１Ｂ）のうちのわずか５．５４％がＣＤ５１／６１^ｈｉｇｈ破骨細胞として特徴付けられた。Ｎ２９７の変異（ｒＦＶＩＩＩＦｃ－Ｎ２９７Ａ）によりＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用が除去されると、破骨細胞形成の部分的なレスキューがもたらされた（図１７Ｄ、図２１Ｄ）。

【0200】

ｒＦＶＩＩＩおよびＦｃγＲ１相互作用を遮断する抗体Ｆａｂで処置された細胞（抗ＣＤ６４抗体、図１８Ａ；４７．１％図２２Ａ）のうちの４７．２％が、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび抗ＣＤ６４抗体Ｆａｂで処置された細胞（図１８Ｂ；３．０２％図２２Ｂ）のうちの２．７３％と比較して、破骨細胞として特徴付けられた。このパターンは、Ｆａｂ対照抗体で処置された細胞（ｒＦＶＩＩＩ＋対照、図１８Ｃ、図２２Ｃ；ｒＦＶＩＩＩＦｃ＋対照、図１８Ｄ、図２２Ｄ）において存続した。このパターンが示すところは、破骨細胞形成のｒＦＶＩＩＩＦｃ阻害とは、ＦｃγＲ１単独との相互作用を通して媒介されることはありそうにもないことである。

【0201】

ｒＦＶＩＩＩおよびＦｃγＲ２相互作用を遮断する抗体で処置された細胞（抗ＣＤ３２抗体、図１９Ａ；３９．１％図２３Ａ）のうちの３９．２％が、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび抗ＣＤ３２抗体で処置された細胞（図１９Ｂおよび図２３Ｂ）のうちの１７．０％と比較して、破骨細胞として特徴付けられた。破骨細胞形成のこういったレスキューは、アイソタイプ対照（ｒＦＶＩＩＩ＋対照、図１９Ｃおよび図２３Ｃ；ｒＦＶＩＩＩＦｃ＋対照、図１９Ｄおよび図２３Ｄ）の処置で除去された。ＦｃγＲ２との相互作用が遮断される後のこういった部分的なレスキューが示すところは、破骨細胞形成の阻害がＦｃγＲ２とのｒＦＶＩＩＩＦｃ相互作用によって制御されていると思われることである。

【0202】

ｒＦＶＩＩＩおよびＦｃγＲ３相互作用を遮断する抗体（抗ＣＤ１６抗体、図２０Ａ；２４．８％図２４Ａ）で処置された細胞のうちの２４．９％が、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよび抗ＣＤ１６抗体（図２０Ｂ；４．０３％図２４Ａ）で処置された細胞のうちの４．１１％と比較して、破骨細胞として特徴付けられた。このパターンは、細胞をアイソタイプ対照抗体（ｒＦＶＩＩＩ＋対照、図２０Ｃおよび図２４Ｃ；ｒＦＶＩＩＩＦｃ＋対照、図２０Ｄおよび図２４Ｄ）で処置した場合に、存続した。いかなる科学理論にも拘束されるものではないが、このパターンが示すところは、破骨細胞形成のｒＦＶＩＩＩＦｃ阻害とは、ＦｃγＲ３単独との相互作用を通して媒介されることはありそうにもないことである。

【実施例7】

【0203】

破骨細胞形成のＦｃγ受容体媒介性阻害におけるＦＶＩＩＩ軽鎖の役割
本発明者らは、ｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球からの破骨細胞形成の阻害におけるＦＶＩＩＩのＣ１ドメインおよびＣ２ドメインの役割について調査した。ＣＤ１４^＋単球を、ｒＦＶＩＩＩ（図２５Ａ）、またはＦＶＩＩＩのＡ２ドメイン（ＧＭＡ８０１７、図２５Ｂ）、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン（ＧＭＡ８０１０、図２５Ｃ）、もしくはＦＶＩＩＩのＣ２ドメイン（ＧＭＡ８００６；図２５Ｄ；ＧＭＡ８０２６、図２５Ｅ）をターゲティングするモノクローナル抗体のうちのそれぞれ単独で０日目に処置し、次いでＭ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養し、次いで、破骨細胞形成について視覚化した。ＣＤ１４^＋単球はまた、ｒＦＶＩＩＩＦｃ（図２５Ｆ）で、または、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメイン（ＧＭＡ８０１７、図２５Ｇ）、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン（ＧＭＡ８０１０、図２５Ｈ）もしくはＦＶＩＩＩのＣ２ドメイン（ＧＭＡ８００６；図２５Ｉ；ＧＭＡ８０２６、図２５Ｊ）をターゲティングする各モノクローナル抗体の存在下でｒＦＶＩＩＩＦｃで０日目に処置し、次いで、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で７日間培養し、次いで、破骨細胞形成について視覚化した。ｒＦＶＩＩＩまたは抗体単独で処置された単球（図２５Ａ～Ｅ）は、７日間の培養後に特徴的な破骨細胞の形態を提示した。単球をｒＦＶＩＩＩＦｃで処置した場合（図２５Ｆ）、先の実施例で論議のように、破骨細胞形態の発生は７日目に効果的に阻害された。ＦＶＩＩＩのＡ２ドメイン（図２５Ｇ）またはＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン（図２５Ｈ）を遮断する抗体の存在下でのｒＦＶＩＩＩＦｃ処置単球によっても、破骨細胞形態の発生が効果的に阻害された。しかし、破骨細胞形成のｒＦＶＩＩＩＦｃ依存性阻害は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインをターゲティングする抗体の存在下で逆転する（図２５Ｉ、２５Ｊ）。ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＣ２ターゲティング抗体で同時に処置された単球（図２５Ｉ、２５Ｊ）は、７日の培養後、対照の破骨細胞形態と同様の特徴的な破骨細胞形態を呈した。

【0204】

本発明者らはまた、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）に結合する場合の、ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩＦｃで処置された単球における破骨細胞形成について調査した。ＣＤ１４＋単球をＶＷＦ単独で０日目に処置した場合（図２６Ａ）、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で培養の７日後、細胞のうちの７２．３％が破骨細胞として特徴付けられた。ＣＤ１４＋単球をＶＷＦの存在下で（図２６Ｂ）またはＶＷＦの非存在下（図２６Ｃ）でｒＦＶＩＩＩで０日目に処置した場合は、細胞の大部分（６９．６％、および７３．３％）は、Ｍ－ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬとの培養の７日後に破骨細胞として同様に特徴付けられた。まとめると、本発明者らは、ｒＦＶＩＩＩ処置とともに添加されたＶＷＦは効果がないことを確認した。ＣＤ１４＋単球をｒＦＶＩＩＩＦｃ単独で０日目に処置した場合、７日目に破骨細胞として特徴付けられた細胞の割合ははるかにより小さく（１４．２％）（図２６Ｅ）、先に論議の破骨細胞形成の阻害と一致した。しかし、破骨細胞として特徴付けられた細胞の割合（４５．７％）が増大したように、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびＶＷＦの両方で細胞を処置した場合（図２６Ｄ）、この阻害は部分的に逆転した。

【実施例8】

【0205】

破骨細胞形成の阻害におけるｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分の役割に関するまとめ
破骨細胞形成の阻害におけるｒＦＶＩＩＩＦｃのＦｃ部分の役割を研究するために、初代ヒト血液単球を、種々の濃度にてｒＦＶＩＩＩＦｃまたはｒＦＶＩＩＩプラスヒトＩｇＧで処置し、次いで、ｉｎｖｉｔｒｏで破骨細胞分化向けに培養した。複数の骨髄系統マーカーを使用して、免疫表現型を決定し、分化した単球と破骨細胞とを区別した。単球とのｒＦＶＩＩＩＦｃ相互作用を媒介する上でのＦｃドメインまたはＦＶＩＩＩドメインの関与を、各タイプのＦｃγＲを遮断する抗体、または抗ＦＶＩＩＩ抗体および種々のＦＶＩＩＩドメインに結合するフォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を使用して探索した。

【0206】

いかなる科学理論にも拘束されるものではないが、結果が示したところは、ｒＦＶＩＩＩＦｃ処置単球から分化した細胞は、表現型的に破骨細胞とははっきりと異なり、大部分が依然として単球性のままであること、であった。この表現型をモジュレートするｒＦＶＩＩＩＦｃと単球との間の相互作用に関して、Ｆｃドメインは細胞表面のＦｃγＲ２に最も効果的に関与した；ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインおよびＣ２ドメインは、単球と相互作用するのに必要であると位置づけられ、これは、ＶＷＦ複合体化ｒＦＶＩＩＩＦｃの免疫調節効果の喪失によっても証明された。

【0207】

いかなる科学理論にも拘束されるものではないが、これらのデータによって、単球と相互作用するｒＦＶＩＩＩＦｃの「デュアルタッチポイント」モデルが示唆される。
ＦＶＩＩＩ部分は、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを介して単球と相互作用し、並行して、Ｆｃドメインは同じ細胞上のＦｃγＲ２に優勢に関与し、その結果、破骨細胞への単球の分化能を続いて減少させる。したがって、ｒＦＶＩＩＩＦｃは、ｒＦＶＩＩＩと比べて特有の生物学的活性を保有することができ、この活性によって、患者の関節の骨侵食および骨量の喪失を軽減することができる。

【0208】

【表1】