特表 2022-537214 メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）の処置のおける使用のための酵素の生合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-24

(54)【発明の名称】メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）の処置のおける使用のための酵素の生合成

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20220817BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 9/06 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20220817BHJP

   C12P 7/04 20060101ALI20220817BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220817BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N9/06 B

C12N15/60

C12N9/88

C12N9/04 E

C12P7/04

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576258

(86)(22)【出願日】2020-06-19

(85)【翻訳文提出日】2022-02-08

(86)【国際出願番号】 US2020038813

(87)【国際公開番号】W WO2020257707

(87)【国際公開日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】62/864,875

(32)【優先日】2019-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/865,129

(32)【優先日】2019-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516286741

【氏名又は名称】ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】517196203

【氏名又は名称】シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ジャイン，リシ

(72)【発明者】

【氏名】パットマン，ライアン

(72)【発明者】

【氏名】ジマーマン，コレア

(72)【発明者】

【氏名】ボイル，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】カーリン，ディラン アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ストーン，ローラ

(72)【発明者】

【氏名】タッカー，アレックス シー

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050EE10

4B064AC02

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD13

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA05

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本開示において提供するものは、いくつかの実施形態において、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）および過剰な分岐鎖アミノ酸を特徴とするその他の症状を処置するための方法および組成物である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで該ＬｅｕＤＨ酵素が、配列番号２、４、６、８、１０、および１２から選択された配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、宿主細胞。

【請求項2】

該ＬｅｕＤＨ酵素が、配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞

【請求項3】

該ＬｅｕＤＨ酵素が配列番号２を含む、請求項２に記載の宿主細胞。

【請求項4】

該ＬｅｕＤＨ酵素が以下：
ａ） 配列番号２７の残基１３に対応する残基におけるＶ；
ｂ） 配列番号２７の残基１６に対応する残基におけるＷ；
ｃ） 配列番号２７の残基４２に対応する残基におけるＱ；
ｄ） 配列番号２７の残基４３に対応する残基におけるＴ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、またはＷ；
ｅ） 配列番号２７の残基４４に対応する残基におけるＩ、Ｈ、Ｋ、またはＹ；
ｆ） 配列番号２７の残基６７に対応する残基におけるＴ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＫ；
ｇ） 配列番号２７の残基７１に対応する残基におけるＫ；
ｈ） 配列番号２７の残基７３に対応する残基におけるＳ；
ｉ） 配列番号２７の残基７６に対応する残基におけるＲ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、またはＷ；
ｊ） 配列番号２７の残基９２に対応する残基におけるＹ；
ｋ） 配列番号２７の残基９３に対応する残基におけるＨ；
ｌ） 配列番号２７の残基９５に対応する残基におけるＧ；
ｍ） 配列番号２７の残基１００に対応する残基におけるＧ；
ｎ） 配列番号２７の残基１０５に対応する残基におけるＣ；
ｏ） 配列番号２７の残基１１１に対応する残基におけるＧ；
ｐ） 配列番号２７の残基１１３に対応する残基におけるＭ；
ｑ） 配列番号２７の残基１１５に対応する残基におけるＮまたはＶ；
ｒ） 配列番号２７の残基１１６に対応する残基におけるＲ、Ｎ、またはＷ；
ｓ） 配列番号２７の残基１２０に対応する残基におけるＡ；
ｔ） 配列番号２７の残基１２２に対応する残基におけるＤ；
ｕ） 配列番号２７の残基１３６に対応する残基におけるＥ；
ｖ） 配列番号２７の残基１４０に対応する残基におけるＤ；
ｗ） 配列番号２７の残基１４１に対応する残基におけるＭ；
ｘ） 配列番号２７の残基１６０に対応する残基におけるＳ；
ｙ） 配列番号２７の残基１８５に対応する残基におけるＦ；
ｚ） 配列番号２７の残基１９６に対応する残基におけるＮ；
ａａ） 配列番号２７の残基２２８に対応する残基におけるＹ；
ｂｂ） 配列番号２７の残基２４８に対応する残基におけるＭ；
ｃｃ） 配列番号２７の残基２５６に対応する残基におけるＣ；
ｄｄ） 配列番号２７の残基２９３に対応する残基におけるＱまたはＣ；
ｅｅ） 配列番号２７の残基２９６に対応する残基におけるＫまたはＮ；
ｆｆ） 配列番号２７の残基２９７に対応する残基におけるＲ、Ｑ、またはＫ；
ｇｇ） 配列番号２７の残基３００に対応する残基におけるＣまたはＤ；
ｈｈ） 配列番号２７の残基３０２に対応する残基におけるＴまたはＳ；
ｉｉ） 配列番号２７の残基３０５に対応する残基におけるＣ；
ｊｊ） 配列番号２７の残基３１９に対応する残基におけるＦ； および／または
ｋｋ） 配列番号２７の残基３３０に対応する残基におけるＭ、
を含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。

【請求項5】

該ＬｅｕＤＨ酵素が（ａ）－（ｋｋ）の全てを含む、請求項４に記載の宿主細胞。

【請求項6】

ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＬｅｕＤＨ酵素が、配列番号２７と比較して、アミノ酸残基４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７および／または３００においてアミノ酸置換を含む、宿主細胞。

【請求項7】

該ＬｅｕＤＨ酵素が、以下：
ａ） 残基４２におけるＡ、Ｑ、またはＴ；
ｂ） 残基４３におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；
ｃ） 残基４４におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；
ｄ） 残基６７におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；
ｅ） 残基７１におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；
ｆ） 残基７６におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；
ｇ） 残基７８におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；
ｈ） 残基１１３におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；
ｉ） 残基１１５におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；
ｊ） 残基１１６におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；
ｋ） 残基１３６におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；
ｌ） 残基２９３におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；
ｍ） 残基２９６におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；
ｎ） 残基２９７におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；および／または
ｏ） 残基３００におけるＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ、
を含む、請求項６に記載の宿主細胞。

【請求項8】

配列番号２７と比較して、アミノ酸残基４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７および／または３００においてアミノ酸置換を含む、非天然ＬｅｕＤＨ酵素。

【請求項9】

該ＬｅｕＤＨ酵素が以下：
ａ） 残基４２におけるＡ、Ｑ、またはＴ；
ｂ） 残基４３におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；
ｃ） 残基４４におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；
ｄ） 残基６７におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；
ｅ） 残基７１におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；
ｆ） 残基７６におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；
ｇ） 残基７８におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；
ｈ） 残基１１３におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；
ｉ） 残基１１５におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；
ｊ） 残基１１６におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；
ｋ） 残基１３６におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；
ｌ） 残基２９３におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；
ｍ） 残基２９６におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；
ｎ） 残基２９７におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；および／または
ｏ） 残基３００におけるＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ、
を含む、請求項８に記載の非天然ＬｅｕＤＨ酵素。

【請求項10】

分岐鎖α－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＫｉｖＤ酵素が、配列番号１４、１６、および１８から選択された配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、宿主細胞。

【請求項11】

該ＫｉｖＤ酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

該ＫｉｖＤ酵素が配列番号１８を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

該ＫｉｖＤ酵素が以下：
ａ） 配列番号２９の残基３３に対応する残基におけるＹ；
ｂ） 配列番号２９の残基４４に対応する残基におけるＱ；
ｃ） 配列番号２９の残基１１７に対応する残基におけるＭ；
ｄ） 配列番号２９の残基１２９に対応する残基におけるＩ；
ｅ） 配列番号２９の残基１８５に対応する残基におけるＷ；
ｆ） 配列番号２９の残基１９０に対応する残基におけるＩ；
ｇ） 配列番号２９の残基２２５に対応する残基におけるＩ；
ｈ） 配列番号２９の残基２２７に対応する残基におけるＹ；
ｉ） 配列番号２９の残基３１１に対応する残基におけるＬ；
ｊ） 配列番号２９の残基３１２に対応する残基におけるＧ；
ｋ） 配列番号２９の残基３１３に対応する残基におけるＴ；
ｌ） 配列番号２９の残基３２８に対応する残基におけるＰ；
ｍ） 配列番号２９の残基３４１に対応する残基におけるＷ；
ｎ） 配列番号２９の残基３４５に対応する残基におけるＨ；
ｏ） 配列番号２９の残基３４７に対応する残基におけるＣ；
ｐ） 配列番号２９の残基４２０に対応する残基におけるＲ；
ｑ） 配列番号２９の残基４９４に対応する残基におけるＤ；
ｒ） 配列番号２９の残基５０８に対応する残基におけるＣ；および／または
ｓ） 配列番号２９の残基５５０に対応する残基におけるＦ、
を含む、請求項１０または１１に記載の宿主細胞。

【請求項14】

該ＫｉｖＤ酵素が（ａ）－（ｓ）の全てを含む、請求項１３に記載の宿主細胞。

【請求項15】

アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該Ａｄｈ酵素が配列番号２０、２２、および２４から選択された配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、宿主細胞。

【請求項16】

該Ａｄｈ酵素が、配列番号２４に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の宿主細胞。

【請求項17】

該Ａｄｈ酵素が配列番号２４を含む、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

該Ａｄｈ酵素が以下：
ａ） 配列番号３１の残基９に対応する残基におけるＰ；
ｂ） 配列番号３１の残基１６に対応する残基におけるＧ；
ｃ） 配列番号３１の残基２３に対応する残基におけるＱ；
ｄ） 配列番号３１の残基２８に対応する残基におけるＲ；
ｅ） 配列番号３１の残基３０に対応する残基におけるＡ；
ｆ） 配列番号３１の残基９３に対応する残基におけるＫ；
ｇ） 配列番号３１の残基９８に対応する残基におけるＬ；
ｈ） 配列番号３１の残基９９に対応する残基におけるＲ；
ｉ） 配列番号３１の残基１１４に対応する残基におけるＰ；
ｊ） 配列番号３１の残基１１５に対応する残基におけるＫ；
ｋ） 配列番号３１の残基１１９に対応する残基におけるＹ；
ｌ） 配列番号３１の残基１９４に対応する残基におけるＹ；
ｍ） 配列番号３１の残基２４２に対応する残基におけるＰ；
ｎ） 配列番号３１の残基２４９に対応する残基におけるＫ；
ｏ） 配列番号３１の残基２５５に対応する残基におけるＥ；
ｐ） 配列番号３１の残基２６０に対応する残基におけるＤ；
ｑ） 配列番号３１の残基２６９に対応する残基におけるＨ；
ｒ） 配列番号３１の残基２８１に対応する残基におけるＱ；
ｓ） 配列番号３１の残基３２５に対応する残基におけるＬ；
ｔ） 配列番号３１の残基３３３に対応する残基におけるＭ；
ｕ） 配列番号３１の残基３３４に対応する残基におけるＰ；および／または
ｖ） 配列番号３１の残基３４８に対応する残基におけるＱ、
を含む、請求項１５または１６に記載の宿主細胞。

【請求項19】

該Ａｄｈ酵素が（ａ）－（ｖ）の全てを含む、請求項１８に記載の宿主細胞。

【請求項20】

該宿主細胞が、植物細胞、藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、または動物細胞である、請求項１－７および１０－１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項21】

該宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。

【請求項22】

該酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞またはＰｉｃｈｉａ細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。

【請求項23】

該宿主細胞が、細菌細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。

【請求項24】

該細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、またはＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。

【請求項25】

該宿主細胞が、分岐鎖アミノ酸輸送系２キャリアタンパク質（ＢｒｎＱ）をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１－７、および１０－２４のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項26】

該ＢｒｎＱタンパク質が、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

該異種ポリヌクレオチドが誘導性プロモーターと作動可能に連結する、請求項１－７および１０－２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項28】

該異種ポリヌクレオチドがオペロンにおいて発現される、請求項１－７および１０－２７のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項29】

該オペロンが１以上の異種ポリヌクレオチドを発現し、およびリボソーム結合部位が各異種ポリヌクレオチド間に存在する、請求項２８に記載の宿主細胞。

【請求項30】

該宿主細胞が、ＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１－７のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項31】

該宿主細胞が、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０－１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項32】

該宿主細胞が、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５－１９のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項33】

該宿主細胞が、ロイシンからイソペンタノールを産生できる、請求項１－７および１０－３２のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項34】

該宿主細胞が、配列番号２７の配列を含むコントロールＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、配列番号２９の配列を含むコントロールＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、配列番号３１の配列を含むコントロールＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、および配列番号３５の配列を含むコントロールＢｒｎＱタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド、を含むコントロール宿主細胞と比較して、少なくとも２倍以上のロイシンを消費する、請求項３３に記載の宿主細胞。

【請求項35】

請求項１－７および１０－３４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。

【請求項36】

ロイシンからイソペンタノールを生産するための方法であって、請求項１－７および１０－３４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。

【請求項37】

配列番号１、３、５、７、９および１１から選択された核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸。

【請求項38】

配列番号１３、１５、および１７から選択された核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸。

【請求項39】

配列番号１９、２１、および２３から選択された核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸。

【請求項40】

配列番号２、４、６、８、１０、および１２から選択された配列に対して少なくとも９０％同一である配列をコードする非天然核酸。

【請求項41】

配列番号１４、１６、および１８から選択された配列に対して少なくとも９０％同一である配列をコードする非天然核酸。

【請求項42】

配列番号２０、２２、および２４から選択された配列に対して少なくとも９０％同一である配列をコードする非天然核酸。

【請求項43】

請求項３７－４２のいずれか一項に記載の非天然核酸を含むベクター。

【請求項44】

請求項３７－４２のいずれか一項に記載の非天然核酸を含む発現カセット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年６月２１日に出願された、「メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）の処置における使用のための酵素の生合成」と題する米国仮出願シリアル番号第６２／８６５、１２９号、および２０１９年６月２１日に出願された「ロイシン、イソロイシン、および／またはバリンの異化に関する疾患を処置するための操作された最適化細菌」と題する米国仮出願シリアル番号第６２／８６４、８７５号の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。

【0002】

ＥＳＦ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、およびここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。このＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年６月１９日に作成され、名称がＧ０９１９．７００３３ＷＯ００－ＳＥＱ－ＯＭＪ．ｔｘｔあり、およびサイズは１．７６メガバイト（ＭＢ）である。

【0003】

発明の分野
本開示は、ロイシンをイソペンタノールに変換するために有用な酵素、核酸、および細胞に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）は、分岐鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＢＣＫＤＣ）の欠損によって、分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）およびその有害副産物（ケト酸）が血中および尿中に蓄積する代謝性疾患である。ＭＳＵＤは、特に診断前や急性疾患時において、罹患者の尿から特有の甘い匂いがする事からその名がついた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＭＳＵＤおよびその他の過剰な分岐鎖アミノ酸を特徴とする症状に対する処置の改善が依然必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

概要
本開示は、少なくとも部分的に、例えばロイシンをイソペンタノールに変換することによってロイシンを消費するための酵素を含む操作された細胞を生成する事に基づく。このような操作された細胞は、ＭＳＵＤなどのロイシンの蓄積に関連する疾患の処置のために有用である。

【0007】

本開示の態様は、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、ＬｅｕＤＨ酵素は配列番号２、４、６、８、１０および１２から選択された配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このＬｅｕＤＨ酵素は配列番号２に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。をいくつかの実施形態では、このＬｅｕＤＨ酵素は配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、このＬｅｕＤＨ酵素は；配列番号２７の残基１３に対応する残基におけるＶ；配列番号２７の残基１６に対応する残基におけるＷ；配列番号２７の残基４２に対応する残基におけるＱ；配列番号２７の残基４３に対応する残基におけるＴ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、またはＷ；配列番号２７の残基４４に対応する残基におけるＩ、Ｈ、Ｋ、またはＹ；配列番号２７の残基６７に対応する残基におけるＴ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＫ；配列番号２７の残基７１に対応する残基におけるＫ；配列番号２７の残基７３に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基７６に対応する残基におけるＲ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、またはＷ；配列番号２７の残基９２に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基９３に対応する残基におけるＨ；配列番号２７の残基９５に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１００に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基１１１に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１１３に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１１５に対応する残基におけるＮ、またはＶ；配列番号２７の残基１１６に対応する残基におけるＲ、Ｎ、またはＷ；配列番号２７の残基１２０に対応する残基におけるＡ；配列番号２７の残基１２２に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１３６に対応する残基におけるＥ；配列番号２７の残基１４０に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１４１に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１６０に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基１８５に対応する残基におけるＦ；配列番号２７の残基１９６に対応する残基におけるＮ；配列番号２７の残基２２８に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基２４８に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基２５６に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基２９３に対応する残基におけるＱまたはＣ；配列番号２７の残基２９６に対応する残基におけるＫまたはＮ；配列番号２７の残基２９７に対応する残基におけるＲ、Ｑ、またはＫ；配列番号２７の残基３００に対応する残基におけるＣまたはＤ；配列番号２７の残基３０２に対応する残基におけるＴまたはＳ；配列番号２７の残基３０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基３１９に対応する残基におけるＦ；および／または配列番号２７の残基３３０に対応する残基におけるＭ、を含む。

【0008】

本開示のさらなる態様は、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、このＬｅｕＤＨ酵素は、配列番号２７の残基１３に対応する残基におけるＶ；配列番号２７の残基１６に対応する残基におけるＷ；配列番号２７の残基４２に対応する残基におけるＱ；配列番号２７の残基４３に対応する残基におけるＴ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、またはＷ；配列番号２７の残基４４に対応する残基におけるＩ、Ｈ、Ｋ、またはＹ；配列番号２７の残基６７に対応する残基におけるＴ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＫ；配列番号２７の残基７１に対応する残基におけるＫ；配列番号２７の残基７３に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基７６に対応する残基におけるＲ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、またはＷ；配列番号２７の残基９２に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基９３に対応する残基におけるＨ；配列番号２７の残基９５に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１００に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基１１１に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１１３に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１１５に対応する残基におけるＮ、またはＶ；配列番号２７の残基１１６に対応する残基におけるＲ、Ｎ、またはＷ；配列番号２７の残基１２０に対応する残基におけるＡ；配列番号２７の残基１２２に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１３６に対応する残基におけるＥ；配列番号２７の残基１４０に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１４１に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１６０に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基１８５に対応する残基におけるＦ；配列番号２７の残基１９６に対応する残基におけるＮ；配列番号２７の残基２２８に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基２４８に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基２５６に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基２９３に対応する残基におけるＱまたはＣ；配列番号２７の残基２９６に対応する残基におけるＫまたはＮ；配列番号２７の残基２９７に対応する残基におけるＲ、Ｑ、またはＫ；配列番号２７の残基３００に対応する残基におけるＣまたはＤ；配列番号２７の残基３０２に対応する残基におけるＴまたはＳ；配列番号２７の残基３０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基３１９に対応する残基におけるＦ；および配列番号２７の残基３３０に対応する残基におけるＭ、を含む。

【0009】

本開示のさらなる態様は、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、配列番号２７と比較して、このＬｅｕＤＨ酵素は、アミノ酸残基４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７および／または３００においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、このＬｅｕＤＨ酵素は、残基４２におけるＡ、Ｑ、またはＴ；残基４３におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基４４におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；残基６７におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基７１におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；残基７６におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基７８におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；残基１１３におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；残基１１５におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；残基１１６におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；残基１３６におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；残基２９３におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基２９６におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；残基２９７におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基３００におけるおよび／またはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ、を含む。

【0010】

本開示のさらなる態様は、非天然ＬｅｕＤＨ酵素に関し、ここで、配列番号２７と比較して、このＬｅｕＤＨ酵素はアミノ酸残基４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７および／または３００においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、このＬｅｕＤＨ酵素は以下：残基４２におけるＡ、Ｑ、またはＴ；残基４３におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基４４におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；残基６７におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基７１におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；残基７６におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基７８におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；残基１１３におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；残基１１５におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；残基１１６におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；残基１３６におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；残基２９３におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基２９６におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；残基２９７におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基３００におけるおよび／またはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ、を含む。

【0011】

本開示のさらなる態様は、分岐鎖α－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、このＫｉｖＤ酵素は配列番号１４、１６、および１８から選択された配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このＫｉｖＤ酵素は配列番号１８に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このＫｉｖＤ酵素は配列番号１８を含む。いくつかの実施形態では、このＫｉｖＤ酵素は、以下：配列番号２９の残基３３に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基４４に対応する残基におけるＱ；配列番号２９の残基１１７に対応する残基におけるＭ；配列番号２９の残基１２９に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基１８５に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基１９０に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２５に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２７に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基３１１に対応する残基におけるＬ；配列番号２９の残基３１２に対応する残基におけるＧ；配列番号２９の残基３１３に対応する残基におけるＴ；配列番号２９の残基３２８に対応する残基におけるＰ；配列番号２９の残基３４１に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基３４５に対応する残基におけるＨ；配列番号２９の残基３４７に対応する残基におけるＣ；配列番号２９の残基４２０に対応する残基におけるＲ；配列番号２９の残基４９４に対応する残基におけるＤ；配列番号２９の残基５０８に対応する残基におけるＣ；および／または配列番号２９の残基５５０に対応する残基におけるＦ、を含む。

【0012】

本開示のさらなる態様は、分岐鎖α－ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、このＫｉｖＤ酵素は以下：配列番号２９の残基３３に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基４４に対応する残基におけるＱ；配列番号２９の残基１１７に対応する残基におけるＭ；配列番号２９の残基１２９に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基１８５に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基１９０に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２５に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２７に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基３１１に対応する残基におけるＬ；配列番号２９の残基３１２に対応する残基におけるＧ；配列番号２９の残基３１３に対応する残基におけるＴ；配列番号２９の残基３２８に対応する残基におけるＰ；配列番号２９の残基３４１に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基３４５に対応する残基におけるＨ；配列番号２９の残基３４７に対応する残基におけるＣ；配列番号２９の残基４２０に対応する残基におけるＲ；配列番号２９の残基４９４に対応する残基におけるＤ；配列番号２９の残基５０８に対応する残基におけるＣ；および配列番号２９の残基５５０に対応する残基におけるＦ、を含む。

【0013】

本開示のさらなる態様は、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、このＡｄｈ酵素は配列番号２０、２２、および２４から選択された配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このＡｄｈ酵素は配列番号２４に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このＡｄｈ酵素は配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、このＡｄｈ酵素は以下：配列番号３１の残基９に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１６に対応する残基におけるＧ；配列番号３１の残基２３に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基２８に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基３０に対応する残基におけるＡ；配列番号３１の残基９３に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基９８に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基９９に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基１１４に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１１５に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基１１９に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基１９４に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基２４２に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基２４９に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基２５５に対応する残基におけるＥ；配列番号３１の残基２６０に対応する残基におけるＤ；配列番号３１の残基２６９に対応する残基におけるＨ；配列番号３１の残基２８１に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基３２５に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基３３３に対応する残基におけるＭ；配列番号３１の残基３３４に対応する残基におけるＰ；および／または配列番号３１の残基３４８に対応する残基におけるＱを含む。

【0014】

本開示のさらなる態様は、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、このＡｄｈ酵素は以下：配列番号３１の残基９に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１６に対応する残基におけるＧ；配列番号３１の残基２３に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基２８に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基３０に対応する残基におけるＡ；配列番号３１の残基９３に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基９８に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基９９に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基１１４に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１１５に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基１１９に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基１９４に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基２４２に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基２４９に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基２５５に対応する残基におけるＥ；配列番号３１の残基２６０に対応する残基におけるＤ；配列番号３１の残基２６９に対応する残基におけるＨ；配列番号３１の残基２８１に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基３２５に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基３３３に対応する残基におけるＭ；配列番号３１の残基３３４に対応する残基におけるＰ；および配列番号３１の残基３４８に対応する残基におけるＱ、を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、植物細胞、藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、または動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、この酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞、またはＰｉｃｈｉａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、この細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞またはＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である。

【0016】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、分岐鎖アミノ酸輸送系２キャリアタンパク質（ＢｒｎＱ）をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢｒｎＱタンパク質は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＢｒｎＱタンパク質は配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは誘導性プロモーターと作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドはオペロンにおいて発現する。いくつかの実施形態では、このオペロンは１以上の異種ポリヌクレオチドを発現し、および各異種ポリヌクレオチド間にはリボソーム結合部位が存在していてもよい。

【0018】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はロイシンからイソペンタノールを産生し得る。いくつかの実施形態では、配列番号２７の配列を含むコントロールＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、配列番号２９の配列を含むコントロールＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、配列番号３１の配列を含むコントロールＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、および配列番号３５の配列を含むコントロールＢｒｎＱをコードする異種ポリヌクレオチドを含むコントロール宿主細胞と比較して、宿主細胞は２倍以上のロイシンを消費する。

【0022】

本開示のさらなる態様は、本願に開示される任意の宿主細胞を培養する工程を含む、方法に関する。

【0023】

本開示のさらなる態様は、本願に開示される任意の宿主細胞を培養する工程を含む、ロイシンからイソペンタノールを産生する方法に関する。

【0024】

本開示のさらなる態様は、配列番号１、３、５、７、９、および１１から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸に関する。

【0025】

本開示のさらなる態様は、配列番号１３、１５、および１７から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸に関する。

【0026】

本開示のさらなる態様は、配列番号１９、２１、および２３から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含む非天然核酸に関する。

【0027】

本開示のさらなる態様は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２から選択される配列に対して少なくとも９０％同一な配列をコードする非天然核酸に関する。

【0028】

本開示のさらなる態様は、配列番号１４、１６、および１８から選択される配列に対して少なくとも９０％同一な配列をコードする非天然核酸に関する。

【0029】

本開示のさらなる態様は、配列番号２０、２２、および２４から選択される配列に対して少なくとも９０％同一な配列をコードする非天然核酸に関する。

【0030】

本開示のさらなる態様は、本願に開示される任意の非天然核酸を含むベクターに関する。

【0031】

本開示のさらなる態様は、本願に開示される任意の非天然核酸を含む発現カセットに関する。

【0032】

本発明の各限定事項には、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の１の要素または要素の組み合わせに関連する本発明の各限定事項は、本発明の各態様の中に含まれ得るものと予想される。本発明は、以下の記載または図の説明に記載される構成の詳細および要素の配置にその応用が限定されるものではない。本発明はその他の実施形態が可能であり、および様々な方法で実施または実行されることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0033】

図面の簡単な説明
添付の図面は、縮尺通りに描かれている事を意図していない。図面において、様々な図に図示されている同一またはほとんど同一の各構成要素は同じ数字で表される。明確さのために、すべての図面にすべての構成要素が表示されていない場合がある。図面において、以下を参照する。

【0034】

【図1-1】図１Ａ－１Ｃは配列類似性ネットワークを示す。個々の点は配列データベースから取得可能な単一のアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列がより密接に相関しているほど、互いの点が接近する。個々の配列類似性ネットワークは、酵素のアノテーションまたはソースに関する情報を持つ対応するクラスターキーを有する。図１Ａはロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）についての配列類似性ネットワークを示す。このクラスターキーは酵素のアノテーションを示す。

【0035】

【図1-2】図１Ｂはケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）についての配列類似性ネットワークを示す。各点のアノテーションは、その酵素が由来する系統学的クレードを示す

【0036】

【図1-3】図１Ｃはアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）についての配列類似性ネットワークを示す。各点のアノテーションは、その酵素が由来する系統学的クレードを示す。

【0037】

【図2】図２ＬｅｕＤＨ酵素のスクリーニングから得られたデータを示すグラフである。２２０のＬｅｕＤＨ酵素を生物学的複製（ｎ＝４）でスクリーニングし、酵素活性およびその順位を検証した。活性はＢ． ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨ活性との相対値で報告される。

【0038】

【図3】図３はＬｅｕＤＨ酵素の活性および特異性の比較から得られたデータを示すグラフである。上位２００のＬｅｕＤＨ酵素を、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅに対する活性についてスクリーニングした。ＬｅｕＤＨ酵素のＬｅｕに対する活性は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨ酵素の活性に対する相対値として報告される。特異性は、Ｖａｌ／Ｌｅｕと比較した、Ｌｅｕに対する活性の比として測定される。左側のパネルでは、Ｌｅｕに対する酵素活性は、Ｌｅｕ／Ｖａｌ特異性との比較として示された。右側のパネルでは、酵素活性は、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ特異性との比較として示された。合理的に操作された活性部位変異体を塗りつぶされない円で示した。元となったＬｅｕＤＨ酵素を塗りつぶされた実線の円で示した。ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールのＢ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨについても示した。

【0039】

【図4】図４はＬｅｕＤＨ酵素について特異性の比較から得られたデータを示す。上位２００のＬｅｕＤＨ酵素を、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅに対する活性についてスクリーニングした。特異性はＶａｌ／Ｌｅｕと比較した、Ｌｅｕに対する活性の比として測定される。合理的に操作された活性部位変異体を塗りつぶされない円として示した。元となったＬｅｕＤＨ酵素を塗りつぶされた円で示した。ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールのＢ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨを示した。

【0040】

【図5】図５は、ＫｉｖＤ酵素のスクリーニングから得られたデータを示すグラフである。５５種類のＫｉｖＤ酵素を生物学的複製（ｎ＝４）で活性についてスクリーニングした。活性は、外因的に発現されたＳ． ａｕｒｅｕｓのｋｉｖＤを含む溶解液の活性に対して相対的に示された（Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｋｉｖＤ酵素の活性は、測定可能な溶解液のバックグラウンド活性と区別不能であったため、バックグラウンドと同等視した。）

【0041】

【図6】図６はＡｄｈ酵素のスクリーニングから得られたデータを示す。５５種類のＡｄｈ酵素を生物学的複製（ｎ＝４）でスクリーニングした。活性は、外因的に発現されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２を含む溶解液の活性に対して相対的に示された（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２活性は、測定可能な溶解液のバックグラウンド活性と区別不能であったため、バックグラウンドと同等視した）。

【0042】

【図7】図７はＬｅｕＤＨ酵素の選択性のデータを示す。計２１種類の候補ＬｅｕＤＨ酵素を試験した。棒グラフの各セットは、左から右へ、消費されたＬｅｕ、消費されたＩｌｅ、および消費されたＶａｌを示す。

【0043】

【図8】図８はＬｅｕ消費上位の株（５９４１、５９４２、および５９４３）および試作株（１９８０）間の経時的なＬｅｕ消費率の比較を示す。最小培地に８ｍＭのロイシンを添加し、および嫌気培養後０、２、および４時間の時点でサンプルを採取した。

【0044】

【図9】図９はロイシンをイソペンタノールに変換するＭＳＵＤ経路を示したものである。

【0045】

【図10】図１０は、Ａｍｂｒ１５生体反応器（ｎ＝２）中でアッセイした、株５９４１のイソペンタノール経路中間体の細胞外プロファイルを示す。エラーバーは２連の生体反応間の標準偏差を反映する。「合計」に対応するデータは、示された中間体の濃度の総計を表す。Ｌｅｕ＝ロイシン、酸＝２－オキソイソカプロエート、アルデヒド＝イソバレルアルデヒド、アルコール＝イソペンタノール。

【発明を実施するための形態】

【0046】

発明の詳細な説明
本開示は、いくつかの態様において、ロイシン消費のために操作した分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）経路の細胞および酵素の組み合わせを提供する。これらのＢＣＡＡ経路の酵素には、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）、ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を含む。このような酵素を含む開示された酵素および宿主細胞は、例えば、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）等のＢＣＡＡ（例えばロイシン）の蓄積に関連する疾患を患う対象において、並びにその他の医療および工業的な環境において、ロイシン消費を促進するために使用され得る。

【0047】

ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）
本開示で使用する場合、「ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）」とは、分岐鎖－Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン）から、それらの２－オキソアナログへの可逆的な脱アミノ化を触媒する酵素を意味する。ＬｅｕＤＨ酵素はＬ－ロイシンを基質として使用し得る。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨは、Ｌ－バリンおよび／またはＬ－イソロイシンと比較してＬ－ロイシンに対して特異性を示す。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨはＬ－ロイシンからケトイソカプロエート（２－オキソイソカプロエートとしても知られる）を産生する。

【0048】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＬｅｕＤＨ酵素、およびこの酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、もしくは２５７－４７５のいずれか１つ、表３もしくは表４に記載のＬｅｕＤＨ酵素、またはその他の本開示に記載のＬｅｕＤＨ酵素、に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を含むＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、３、５、７、９、１１、または３７－２５５のいずれか１つ、または表３もしくは表４に記載のＬｅｕＤＨ酵素、またはその他の本開示に記載のＬｅｕＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチド、に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一な異種ポリヌクレオチドを含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに由来するＬｅｕＤＨを含む。その他の実施形態では、宿主細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに由来するＬｅｕＤＨを含まない。

【0050】

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに由来するＬｅｕＤＨは以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ -Ｐ０Ａ３９２（配列番号２７）のアミノ酸配列を含み得る：
ＭＴＬＥＩＦＥＹＬＥＫＹＤＹＥＱＶＶＦＣＱＤＫＥＳＧＬＫＡＩＩＡＩＨＤＴＴＬＧＰＡＬＧＧＴＲＭＷＴＹＤＳＥＥＡＡＩＥＤＡＬＲＬＡＫＧＭＴＹＫＮＡＡＡＧＬＮＬＧＧＡＫＴＶＩＩＧＤＰＲＫＤＫＳＥＡＭＦＲＡＬＧＲＹＩＱＧＬＮＧＲＹＩＴＡＥＤＶＧＴＴＶＤＤＭＤＩＩＨＥＥＴＤＦＶＴＧＩＳＰＳＦＧＳＳＧＮＰＳＰＶＴＡＹＧＶＹＲＧＭＫＡＡＡＫＥＡＦＧＴＤＮＬＥＧＫＶＩＡＶＱＧＶＧＮＶＡＹＨＬＣＫＨＬＨＡＥＧＡＫＬＩＶＴＤＩＮＫＥＡＶＱＲＡＶＥＥＦＧＡＳＡＶＥＰＮＥＩＹＧＶＥＣＤＩＹＡＰＣＡＬＧＡＴＶＮＤＥＴＩＰＱＬＫＡＫＶＩＡＧＳＡＮＮＱＬＫＥＤＲＨＧＤＩＩＨＥＭＧＩＶＹＡＰＤＹＶＩＮＡＧＧＶＩＮＶＡＤＥＬＹＧＹＮＲＥＲＡＬＫＲＶＥＳＩＹＤＴＩＡＫＶＩＥＩＳＫＲＤＧＩＡＴＹＶＡＡＤＲＬＡＥＥＲＩＡＳＬＫＮＳＲＳＴＹＬＲＮＧＨＤＩＩＳＲＲ（配列番号２７）

【0051】

いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列は、以下の核酸配列によってコードされる：
ＡＴＧＡＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＣＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＴＧＧＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＡＣＴＡＣＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＴＴＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＴＣＧＴＣＡＣＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＧＴＡＧＧＴＡＡＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＴＧＴＣＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＴＧＣＧＡＴＡＴＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＡＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＴＡＡＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＴＧＣＡＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＴＣＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＡ（配列番号２８）

【0052】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は、ロイシンからケトイソカプロエートへの変換を、コントロールと比較して、０．５倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または６倍以上（例えば、２倍から６倍以上）増加させ得る。いくつかの実施形態では、コントロールは配列番号２７をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞である。いくつかの実施形態では、コントロールは、米国特許出願公開第２０１７０２３２０４３号に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１９８０ ΔｌｅｕＥ、ΔｉｌｖＣ、ｌａｃＺ：ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｉｖＫＨＭＧＦ、ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｅｕＤＨ（Ｂｃ）－ｋｉｖＤ－ａｄｈ２－ｂｒｎＱ－ｒｒｎＢ ｔｅｒ （ｐＳＣ１０１）である。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は、バリンに比して少なくとも０．５倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または６倍以上（例えば、２倍から６倍以上）、ロイシンに対する活性を示し得る。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は、イソロイシンに比して、少なくとも０．５倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または６倍以上（例えば、２倍から６倍以上）、ロイシンに対する活性を示し得る。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨは、配列番号２７、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは２５７－４７５のいずれか１つ、配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは３７－２５５のいずれか１つ、または表３もしくは表４に記載のＬｅｕＤＨ酵素、またはその他の本開示に記載のＬｅｕＤＨ酵素のアミノ酸もしくはポリヌクレオチド配列、に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、このようなＬｅｕＤＨ酵素は以下：配列番号２７の残基１３に対応する残基におけるＶ；配列番号２７の残基１６に対応する残基におけるＷ；配列番号２７の残基４２に対応する残基におけるＱ；配列番号２７の残基４３に対応する残基におけるＴ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、またはＷ；配列番号２７の残基４４に対応する残基におけるＩ、Ｈ、Ｋ、またはＹ；配列番号２７の残基６７に対応する残基におけるＴ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＫ；配列番号２７の残基７１に対応する残基におけるＫ；配列番号２７の残基７３に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基７６に対応する残基におけるＲ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、またはＷ；配列番号２７の残基９２に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基９３に対応する残基におけるＨ；配列番号２７の残基９５に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１００に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基１１１に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１１３に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１１５に対応する残基におけるＮ、またはＶ；配列番号２７の残基１１６に対応する残基におけるＲ、Ｎ、またはＷ；配列番号２７の残基１２０に対応する残基におけるＡ；配列番号２７の残基１２２に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１３６に対応する残基におけるＥ；配列番号２７の残基１４０に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１４１に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１６０に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基１８５に対応する残基におけるＦ；配列番号２７の残基１９６に対応する残基におけるＮ；配列番号２７の残基２２８に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基２４８に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基２５６に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基２９３に対応する残基におけるＱまたはＣ；配列番号２７の残基２９６に対応する残基におけるＫまたはＮ；配列番号２７の残基２９７に対応する残基におけるＲ、Ｑ、またはＫ；配列番号２７の残基３００に対応する残基におけるＣまたはＤ；配列番号２７の残基３０２に対応する残基におけるＴまたはＳ；配列番号２７の残基３０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基３１９に対応する残基におけるＦ；および／または配列番号２７の残基３３０に対応する残基におけるＭ、を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は以下：配列番号２７の残基１３に対応する残基におけるＶ；配列番号２７の残基１６に対応する残基におけるＷ；配列番号２７の残基４２に対応する残基におけるＱ；配列番号２７の残基４３に対応する残基におけるＴ、Ｙ、Ｆ、Ｅ、またはＷ；配列番号２７の残基４４に対応する残基におけるＩ、Ｈ、Ｋ、またはＹ；配列番号２７の残基６７に対応する残基におけるＴ、Ｅ、Ａ、Ｓ、またはＫ；配列番号２７の残基７１に対応する残基におけるＫ；配列番号２７の残基７３に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基７６に対応する残基におけるＲ、Ｈ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、またはＷ；配列番号２７の残基９２に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基９３に対応する残基におけるＨ；配列番号２７の残基９５に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１００に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基１１１に対応する残基におけるＧ；配列番号２７の残基１１３に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１１５に対応する残基におけるＮ、またはＶ；配列番号２７の残基１１６に対応する残基におけるＲ、Ｎ、またはＷ；配列番号２７の残基１２０に対応する残基におけるＡ；配列番号２７の残基１２２に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１３６に対応する残基におけるＥ；配列番号２７の残基１４０に対応する残基におけるＤ；配列番号２７の残基１４１に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基１６０に対応する残基におけるＳ；配列番号２７の残基１８５に対応する残基におけるＦ；配列番号２７の残基１９６に対応する残基におけるＮ；配列番号２７の残基２２８に対応する残基におけるＹ；配列番号２７の残基２４８に対応する残基におけるＭ；配列番号２７の残基２５６に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基２９３に対応する残基におけるＱ またはＣ；配列番号２７の残基２９６に対応する残基におけるＫ またはＮ；配列番号２７の残基２９７に対応する残基におけるＲ、Ｑ、またはＫ；配列番号２７の残基３００に対応する残基におけるＣまたはＤ；配列番号２７の残基３０２に対応する残基におけるＴまたはＳ；配列番号２７の残基３０５に対応する残基におけるＣ；配列番号２７の残基３１９に対応する残基におけるＦ；および配列番号２７の残基３３０に対応する残基におけるＭ、を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は、配列番号２７、配列番号２、４、６、８、１０、１２、もしくは２５７－４７５のいずれか１つ、表３もしくは表４に記載のＬｅｕＤＨ酵素、またはその他の本開示に記載のＬｅｕＤＨ酵素、と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸の置換、欠失、挿入、または追加を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は配列番号２７と比較して１以上の残基におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は配列番号２７の４２位に対応する残基、配列番号２７の４３位に対応する残基、配列番号２７の４４位に対応する残基、配列番号２７の６７位に対応する残基、配列番号２７の７１位に対応する残基、配列番号２７の７６位に対応する残基、配列番号２７の７８位に対応する残基、配列番号２７の１１３位に対応する残基、配列番号２７の１１５位に対応する残基、配列番号２７の１１６位に対応する残基、配列番号２７の１３６位に対応する残基、配列番号２７の２９３位に対応する残基、配列番号２７の２９６位に対応する残基、配列番号２７の２９７位に対応する残基、および／または配列番号２７の３００位に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は以下：配列番号２７の４２位に対応する残基におけるＡ、Ｑ、またはＴ；配列番号２７の４３位に対応する残基におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；配列番号２７の４４位に対応する残基におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；配列番号２７の６７位に対応する残基におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；配列番号２７の７１位に対応する残基におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；配列番号２７の７６位に対応する残基におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；配列番号２７の７８位に対応する残基におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；配列番号２７の１１３位に対応する残基におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；配列番号２７の１１５位に対応する残基におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；配列番号２７の１１６位に対応する残基におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；配列番号２７の１３６位に対応する残基におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；配列番号２７の２９３位に対応する残基におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；配列番号２７の２９６位に対応する残基におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；配列番号２７の２９７位に対応する残基におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；および／または配列番号２７の３００位に対応する残基におけるＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ、を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、配列番号２７と比較して、ＬｅｕＤＨ酵素は以下のアミノ酸残基においてアミノ酸置換を含む：残基４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７および／または３００。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ酵素は、残基４２におけるＡ、Ｑ、またはＴ；残基４３におけるＥ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基４４におけるＨ、Ｉ、Ｋ、またはＹ；残基６７におけるＡ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基７１におけるＣ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴ；残基７６におけるＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；残基７８におけるＣ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＹ；残基１１３におけるＦ、Ｍ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；残基１１５におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；残基１１６におけるＡ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＷ；残基１３６におけるＥ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、またはＹ；残基２９３におけるＡ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、またはＴ；残基２９６におけるＡ、Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、またはＴ；残基２９７におけるＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹおよび／または；残基３００におけるＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹを含む。

【0060】

ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）
本明細書で使用する場合、「ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）」とは、アミノ酸のアミノ基転移によって得られるアルファ－ケト酸のアルデヒドへの脱カルボキシル化を触媒する酵素を意味する。ＫｉｖＤはケトイソカプロエートを基質として使用し得る。いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤはケトイソカプロエートからイソバレルアルデヒドを産生する。

【0061】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はＫｉｖＤ酵素および／またはこの酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１４、１６、１８、もしくは５３３－５８８のいずれか１つ、表３もしくは表５に記載のＫｉｖＤ酵素、またはその他の本開示に記載のＫｉｖＤ酵素、に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を含むＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１３、１５、１７もしくは４７７－５３２のいずれか１つ、または表３もしくは表５に記載のＫｉｖＤ酵素、またはその他の本開示に記載のＫｉｖＤ酵素をコードするポリヌクレオチド、に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一な異種ポリヌクレオチドを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来するＫｉｖＤを含む。その他の実施形態では、宿主細胞は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに由来するＫｉｖＤを含まない。

【0063】

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに由来するＫｉｖＤは以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ-Ｑ６８４Ｊ７（配列番号２９）の配列を含み得る：
ＭＹＴＶＧＤＹＬＬＤＲＬＨＥＬＧＩＥＥＩＦＧＶＰＧＤＹＮＬＱＦＬＤＱＩＩＳＨＫＤＭＫＷＶＧＮＡＮＥＬＮＡＳＹＭＡＤＧＹＡＲＴＫＫＡＡＡＦＬＴＴＦＧＶＧＥＬＳＡＶＮＧＬＡＧＳＹＡＥＮＬＰＶＶＥＩＶＧＳＰＴＳＫＶＱＮＥＧＫＦＶＨＨＴＬＡＤＧＤＦＫＨＦＭＫＭＨＥＰＶＴＡＡＲＴＬＬＴＡＥＮＡＴＶＥＩＤＲＶＬＳＡＬＬＫＥＲＫＰＶＹＩＮＬＰＶＤＶＡＡＡＫＡＥＫＰＳＬＰＬＫＫＥＮＳＴＳＮＴＳＤＱＥＩＬＮＫＩＱＥＳＬＫＮＡＫＫＰＩＶＩＴＧＨＥＩＩＳＦＧＬＥＫＴＶＴＱＦＩＳＫＴＫＬＰＩＴＴＬＮＦＧＫＳＳＶＤＥＡＬＰＳＦＬＧＩＹＮＧＴＬＳＥＰＮＬＫＥＦＶＥＳＡＤＦＩＬＭＬＧＶＫＬＴＤＳＳＴＧＡＦＴＨＨＬＮＥＮＫＭＩＳＬＮＩＤＥＧＫＩＦＮＥＲＩＱＮＦＤＦＥＳＬＩＳＳＬＬＤＬＳＥＩＥＹＫＧＫＹＩＤＫＫＱＥＤＦＶＰＳＮＡＬＬＳＱＤＲＬＷＱＡＶＥＮＬＴＱＳＮＥＴＩＶＡＥＱＧＴＳＦＦＧＡＳＳＩＦＬＫＳＫＳＨＦＩＧＱＰＬＷＧＳＩＧＹＴＦＰＡＡＬＧＳＱＩＡＤＫＥＳＲＨＬＬＦＩＧＤＧＳＬＱＬＴＶＱＥＬＧＬＡＩＲＥＫＩＮＰＩＣＦＩＩＮＮＤＧＹＴＶＥＲＥＩＨＧＰＮＱＳＹＮＤＩＰＭＷＮＹＳＫＬＰＥＳＦＧＡＴＥＤＲＶＶＳＫＩＶＲＴＥＮＥＦＶＳＶＭＫＥＡＱＡＤＰＮＲＭＹＷＩＥＬＩＬＡＫＥＧＡＰＫＶＬＫＫＭＧＫＬＦＡＥＱＮＫＳ（配列番号２９）

【0064】

いくつかの実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列は、以下の核酸配列によってコードされる：
ＡＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＧＧＡＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＧＣＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＴＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＡＴＣＴＣＣＣＧＧＴＴＧＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＧＴＣＣＧＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＴＡＡＧＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＧＴＴＧＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＣＣＧＡＧＴＡＡＣＧＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＧＡＡＡＣＧＡＴＴＧＴＣＧＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＡＧＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＡＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＴＡＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＣＴＡＡＴＣＧＡＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＡＡＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号３０）

【0065】

いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は、ケトイソカプロエートからイソバレルアルデヒドへの変換を、コントロールと比較して０．５倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または６倍以上（例えば、２倍から６倍以上）増加させ得る。いくつかの実施形態では、コントロールは、配列番号２９をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞である。いくつかの実施形態では、コントロールは、米国出願公開第２０１７０２３２０４３号に記載されるような、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１９８０ ΔｌｅｕＥ、ΔｉｌｖＣ、ｌａｃＺ：ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｉｖＫＨＭＧＦ、ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｅｕＤＨ（Ｂｃ）－ｋｉｖＤ－ａｄｈ２－ｂｒｎＱ－ｒｒｎＢ ｔｅｒ （ｐＳＣ１０１）である。

【0066】

いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤ酵素は、配列番号２９、配列番号１４、１６、１８、もしくは５３３－５８８のいずれか１つ、配列番号１３、１５、１７、もしくは４７７－５３２の何れか1つ、または表３もしくは表５に記載のＫｉｖＤ酵素、またはその他の本開示に記載のＫｉｖＤ酵素をコードするアミノ酸またはポリヌクレオチド配列、に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤ酵素は、配列番号２９、配列番号１４、１６、１８、もしくは５３３－５８８のいずれか１つ、表３もしくは表５に記載のＫｉｖＤ酵素、またはその他の本開示に記載のＫｉｖＤ酵素、と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸の置換、欠失、挿入、または追加を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤ酵素は以下：配列番号２９の残基３３に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基４４に対応する残基におけるＱ；配列番号２９の残基１１７に対応する残基におけるＭ；配列番号２９の残基１２９に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基１８５に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基１９０に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２５に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２７に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基３１１に対応する残基におけるＬ；配列番号２９の残基３１２に対応する残基におけるＧ；配列番号２９の残基３１３に対応する残基におけるＴ；配列番号２９の残基３２８に対応する残基におけるＰ；配列番号２９の残基３４１に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基３４５に対応する残基におけるＨ；配列番号２９の残基３４７に対応する残基におけるＣ；配列番号２９の残基４２０に対応する残基におけるＲ；配列番号２９の残基４９４に対応する残基におけるＤ；配列番号２９の残基５０８に対応する残基におけるＣ；および／または配列番号２９の残基５５０に対応する残基におけるＦ、を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＫｉｖＤ酵素は以下：配列番号２９の残基３３に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基４４に対応する残基におけるＱ；配列番号２９の残基１１７に対応する残基におけるＭ；配列番号２９の残基１２９に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基１８５に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基１９０に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２５に対応する残基におけるＩ；配列番号２９の残基２２７に対応する残基におけるＹ；配列番号２９の残基３１１に対応する残基におけるＬ；配列番号２９の残基３１２に対応する残基におけるＧ；配列番号２９の残基３１３に対応する残基におけるＴ；配列番号２９の残基３２８に対応する残基におけるＰ；配列番号２９の残基３４１に対応する残基におけるＷ；配列番号２９の残基３４５に対応する残基におけるＨ；配列番号２９の残基３４７に対応する残基におけるＣ；配列番号２９の残基４２０に対応する残基におけるＲ；配列番号２９の残基４９４に対応する残基におけるＤ；配列番号２９の残基５０８に対応する残基におけるＣ；および配列番号２９の残基５５０に対応する残基におけるＦ、を含む。

【0070】

アルコールデヒドロゲナーゼＡｄｈ）
本明細書で使用される場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）」とは、エタノールからアセトアルデヒドへの変換を触媒する酵素を意味する。Ａｄｈはイソバレルアルデヒドを基質として使用し得る。いくつかの実施形態では、Ａｄｈはイソバレルアルデヒドからイソペンタノールを産生する。

【0071】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はＡｄｈ酵素および／またはこの酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２０、２２、２４、もしくは６４５－７００のいずれか１つ、表３もしくは表６に記載のＡｄｈ酵素、またはその他の本開示に記載のＡｄｈ酵素、に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を含むＡｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１９、２１、２３もしくは５８９－６４４のいずれか１つ、または表３もしくは表６に記載のＡｄｈ酵素、またはその他の本開示に記載のＡｄｈ酵素をコードするポリヌクレオチド、に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一な異種ポリヌクレオチドを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｄｈを含む、その他の実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｄｈを含まない。

【0073】

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡｄｈは、以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ-Ｐ００３３１（配列番号３１）のアミノ酸配列を含み得る：
ＭＳＩＰＥＴＱＫＡＩＩＦＹＥＳＮＧＫＬＥＨＫＤＩＰＶＰＫＰＫＰＮＥＬＬＩＮＶＫＹＳＧＶＣＨＴＤＬＨＡＷＨＧＤＷＰＬＰＴＫＬＰＬＶＧＧＨＥＧＡＧＶＶＶＧＭＧＥＮＶＫＧＷＫＩＧＤＹＡＧＩＫＷＬＮＧＳＣＭＡＣＥＹＣＥＬＧＮＥＳＮＣＰＨＡＤＬＳＧＹＴＨＤＧＳＦＱＥＹＡＴＡＤＡＶＱＡＡＨＩＰＱＧＴＤＬＡＥＶＡＰＩＬＣＡＧＩＴＶＹＫＡＬＫＳＡＮＬＲＡＧＨＷＡＡＩＳＧＡＡＧＧＬＧＳＬＡＶＱＹＡＫＡＭＧＹＲＶＬＧＩＤＧＧＰＧＫＥＥＬＦＴＳＬＧＧＥＶＦＩＤＦＴＫＥＫＤＩＶＳＡＶＶＫＡＴＮＧＧＡＨＧＩＩＮＶＳＶＳＥＡＡＩＥＡＳＴＲＹＣＲＡＮＧＴＶＶＬＶＧＬＰＡＧＡＫＣＳＳＤＶＦＮＨＶＶＫＳＩＳＩＶＧＳＹＶＧＮＲＡＤＴＲＥＡＬＤＦＦＡＲＧＬＶＫＳＰＩＫＶＶＧＬＳＳＬＰＥＩＹＥＫＭＥＫＧＱＩＡＧＲＹＶＶＤＴＳＫ（配列番号３１）

【0074】

いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列は、以下の核酸配列によってコードされる：
ＡＴＧＴＣＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＴＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＧＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＧＣＣＧＴＴＡＣＣＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧＧＣＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＧＣＧＣＣＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＧＧＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＴＡＣＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＣＧＣＧＣＧＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＧＡＡＡＴＧＴＡＧＣＴＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＡＣＧＴＡＧＧＧＡＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＴＡＣＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＣＧＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＴＡＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号３２）

【0075】

いくつかの実施形態では、Ａｄｈ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞は、イソバレルアルデヒドからイソペンタノールへの変換を、コントロールと比較して０．５倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または６倍以上（例えば、２倍から６倍以上）増加させ得る。いくつかの実施形態では、コントロールは、配列番号３１をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞である。いくつかの実施形態では、コントロールは、配列番号３１をコードする異種ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞である。いくつかの実施形態では、コントロールは、米国特許出願公開第２０１７０２３２０４３に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１９８０ ΔｌｅｕＥ、ΔｉｌｖＣ、ｌａｃＺ：ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｉｖＫＨＭＧＦ、ｔｅｔＲ－Ｐｔｅｔ－ｌｅｕＤＨ（Ｂｃ）－ｋｉｖＤ－ａｄｈ２－ｂｒｎＱ－ｒｒｎＢ ｔｅｒ（ｐＳＣ１０１）である。

【0076】

いくつかの実施形態では、Ａｄｈは、配列番号３１、配列番号２０、２２、２４、もしくは６４５－７００のいずれか１つ、配列番号１９、２１、２３もしくは５８９－６４４のいずれか１つ、または表３もしくは表６に記載のＡｄｈ酵素、またはその他の本開示に記載のＡｄｈ酵素、をコードするアミノ酸またはポリヌクレオチド配列、に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な配列を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、Ａｄｈは、配列番号３１、配列番号２０、２２、２４、もしくは６４５－７００のいずれか１つ、表３もしくは表６に記載のＡｄｈ酵素、またはその他の本開示に記載のＡｄｈ酵素、と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または追加を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、Ａｄｈは以下；配列番号３１の残基９に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１６に対応する残基におけるＧ；配列番号３１の残基２３に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基２８に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基３０に対応する残基におけるＡ；配列番号３１の残基９３に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基９８に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基９９に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基１１４に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１１５に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基１１９に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基１９４に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基２４２に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基２４９に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基２５５に対応する残基におけるＥ；配列番号３１の残基２６０に対応する残基におけるＤ；配列番号３１の残基２６９に対応する残基におけるＨ；配列番号３１の残基２８１に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基３２５に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基３３３に対応する残基におけるＭ；配列番号３１の残基３３４に対応する残基におけるＰ；および／または配列番号３１の残基３４８に対応する残基におけるＱ、を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、Ａｄｈは以下；配列番号３１の残基９に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１６に対応する残基におけるＧ；配列番号３１の残基２３に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基２８に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基３０に対応する残基におけるＡ；配列番号３１の残基９３に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基９８に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基９９に対応する残基におけるＲ；配列番号３１の残基１１４に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基１１５に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基１１９に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基１９４に対応する残基におけるＹ；配列番号３１の残基２４２に対応する残基におけるＰ；配列番号３１の残基２４９に対応する残基におけるＫ；配列番号３１の残基２５５に対応する残基におけるＥ；配列番号３１の残基２６０に対応する残基におけるＤ；配列番号３１の残基２６９に対応する残基におけるＨ；配列番号３１の残基２８１に対応する残基におけるＱ；配列番号３１の残基３２５に対応する残基におけるＬ；配列番号３１の残基３３３に対応する残基におけるＭ；配列番号３１の残基３３４に対応する残基におけるＰ；および配列番号３１の残基３４８に対応する残基におけるＱ、を含む。

【0080】

分岐鎖アミノ酸輸送系２キャリアタンパク質（ＢｒｎＱ）
本明細書で使用場合、「分岐鎖アミノ酸輸送系２キャリアタンパク質（ＢｒｎＱ）」とは、分岐鎖アミノ酸にかかるＬＩＶ－ＩＩ輸送系の成分を意味する。ＢｒｎＱは分岐鎖アミノ酸、例えばロイシンを細胞、例えば宿主細胞へ輸送するために使用され得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はＢｒｎＱタンパク質および／またはこのタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本願に記載の、例えば配列番号３５の、ＢｒｎＱタンパク質に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を含むＢｒｎＱタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢｒｎＱタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｂ７ＭＤ５９に記載のアミノ酸配列を含む。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｂ７ＭＤ５９は以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＴＨＱＬＲＳＲＤＩＩＡＬＧＦＭＴＦＡＬＦＶＧＡＧＮＩＩＦＰＰＭＶＧＬＱＡＧＥＨＶＷＴＡＡＦＧＦＬＩＴＡＶＧＬＰＶＬＴＶＶＡＬＡＫＶＧＧＧＶＤＳＬＳＴＰＩＧＫＶＡＧＶＬＬＡＴＶＣＹＬＡＶＧＰＬＦＡＴＰＲＴＡＴＶＳＦＥＶＧＩＡＰＬＴＧＤＳＡＬＰＬＦＩＹＳＬＶＹＦＡＩＶＩＬＶＳＬＹＰＧＫＬＬＤＴＶＧＮＦＬＡＰＬＫＩＩＡＬＶＩＬＳＶＡＡＩＩＷＰＡＧＳＩＳＴＡＴＥＡＹＱＮＡＡＦＳＮＧＦＶＮＧＹＬＴＭＤＴＬＧＡＭＶＦＧＩＶＩＶＮＡＡＲＳＲＧＶＴＥＡＲＬＬＴＲＹＴＶＷＡＧＬＭＡＧＶＧＬＴＬＬＹＬＡＬＦＲＬＧＳＤＳＡＳＬＶＤＱＳＡＮＧＡＡＩＬＨＡＹＶＱＨＴＦＧＧＧＧＳＦＬＬＡＡＬＩＦＩＡＣＬＶＴＡＶＧＬＴＣＡＣＡＥＦＦＡＱＹＶＰＬＳＹＲＴＬＶＦＩＬＧＧＦＳＭＶＶＳＮＬＧＬＳＱＬＩＱＩＳＶＰＶＬＴＡＩＹＰＰＣＩＡＬＶＶＬＳＦＴＲＳＷＷＨＮＳＳＲＶＩＡＰＰＭＦＩＳＬＬＦＧＩＬＤＧＩＫＡＳＡＦＳＤＩＬＰＳＷＡＱＲＬＰＬＡＥＱＧＬＡＷＬＭＰＴＶＶＭＶＶＬＡＩＩＷＤＲＡＡＧＲＱＶＴＳＳＡＨ（配列番号３５）

【0082】

いくつかの実施形態では、配列番号３５は以下の核酸配列によってコードされる：
ＡＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＧＡＴＣＧＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＧＴＴＧＴＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＡＣＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＧＴＣＧＣＴＧＧＣＧＴＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＴＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧＴＴＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＴＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＴＡＴＡＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＧＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＴＡＣＣＧＣＴＣＴＣＴＴＡＴＣＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧＴＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＡＡＴＴＣＧＴＣＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＧＧＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＡＡ（配列番号３６）

【0083】

変異体
本開示に記載の酵素およびタンパク質の変異体（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈであり、核酸およびアミノ酸配列の変異体を含む）は本開示に包含される。変異体は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％、その間の全ての数値を含めて、参照配列と配列同一性を共有する。

【0084】

特段の記載が無い限り、当技術分野で公知の用語「配列同一性」とは配列比較（アライメント）によって決定される、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を意味する。いくつかの実施形態では、配列同一性は、配列の全長にわたって決定される（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ配列）。いくつかの実施形態では、配列同一性は配列（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ配列）の領域にわたって決定される（例えば、アミノ酸または核酸のストレッチ、例えば、活性部位にわたる配列）。

【0085】

同一性はまた、２つまたはそれ以上の残基（例えば、核酸またはアミノ酸残基）の文字列間の一致数によって決定される２つの配列間の配列関連性の程度を意味し得る。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって指定されたギャップアライメント（もしあれば）を有する２以上の配列間の一致の割合を計測する。

【0086】

関連するポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者に公知の何れかの方法によって容易に計算する事ができる。２つの配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）の“同一性パーセント”は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７、１９９３に記載のように改変された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８、１９９０のアルゴリズムを用いて決定され得る。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０、１９９０に記載のＮＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}およびＸＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}タンパク質検索は、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本願に記載のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２、１９９７に記載されている、ギャップ付き（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}を利用することができる。ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラムおよびギャップ付きＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラムを利用するとき、各プログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}およびＮＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}）を用いることができるか、またはパラメーターは、当業者によって理解されるであろうように適切に調整することができる。

【0087】

使用され得る他の局所的なアライメント技術は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。使用され得る一般的でグローバルなアライメント技術は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）であり、それは動的プログラミングに基づいている。

【0088】

より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント法よりも高速に核酸およびアミノ酸配列のグローバルアライメントを生成すると称される、高速最適グローバル配列決定アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。いくつかの実施形態では、２つのポリペプチドの同一性は、２つのアミノ酸配列をアライメントし、同一アミノ酸の数を計算し、および１つのアミノ酸配列の長さで除算することによって決定される。いくつかの実施形態では、２つの核酸配列の同一性は、２つの核酸配列をアライメントし、および同一ヌクレオチドの数を計算し、および一方の核酸配列の長さで除算することによって決定される。

【0089】

複数配列のアライメントについて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｏｃｔ １１；７：５３９）を含むコンピュータプログラムが使用され得る。

【0090】

好ましい実施形態では、配列同一性がＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７、１９９３に記載のように改変された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８、１９９０、のアルゴリズム（例えば、各プログラムのデフォルトのパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）} 、ＮＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}、ＸＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}、またはギャップ付き（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラム）を使用して決定された際に、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、本願に開示されるおよび／または請求項に記載される配列などの参照配列に対して特定の同一性パーセントを有する事が判明している

【0091】

いくつかの実施形態では、配列同一性がデフォルトのパラメーターを用いて、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ、Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、または、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定された際に、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、本願に開示されるおよび／または請求項に記載される配列などの参照配列に対して特定の同一性パーセントを有する事が判明している。

【0092】

いくつかの実施形態では、配列同一性がデフォルトのパラメーターを用いて、高速最適グローバル配列決定アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）を使用して決定された際に、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、本願に開示されるおよび／または請求項に記載される配列などの参照配列に対して特定の同一性パーセントを有する事が判明している。

【0093】

いくつかの実施形態では、配列同一性が、デフォルトのパラメーターを用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ （Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｏｃｔ １１；７：５３９）を使用して決定された際に、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、本願に開示されるおよび／または請求項に記載される配列などの参照配列に対して特定の同一性パーセントを有する事が判明している。

【0094】

本開示で使用する場合、配列「Ｘ」中の残基（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）は、配列ＸおよびＹが当技術分野で公知のアミノ酸配列アライメントツール、例えばＣｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}を使用してアライメントされた際に、配列「Ｘ」中の残基が配列「Ｙ」中の「Ｚ」に対応する位置にある場合、異なる配列「Ｙ」中の「Ｚ」位または残基「Ｚ」（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）に対応する事を意味する。

【0095】

本開示で使用される場合、変異体の配列はホモログの配列であってもよい。本開示で使用される場合、ホモログの配列は所定の同一性パーセンテージ（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性パーセンテージであり、その間の全ての数値を含む）を共有する配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）である。ホモログの配列には、非限定的にパラログまたはオルソログの配列を含む。パラログの配列は、ある種のゲノム内で遺伝子の重複から生じ、一方オルソログの配列は種の分化の後に分岐する。

【0096】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドの変異体（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素の変異体）は参照ポリペプチド（例えば、参照ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）と二次構造（例えば、アルファヘリックス、ベータシート）を共有するドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの変異体（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素の変異体）は参照ポリペプチド（例えば、参照ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）と三次構造を共有する。非限定的な例として、変異体ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素の変異体）は、参照ポリペプチドと比較して、低い一次配列の同一性（例えば、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下の配列同一性）を有し得るが、しかし１以上の二次構造（例えば、ループ、アルファヘリックス、またはベータシートを含むがこれに限定されない）を共有するか、または参照ポリペプチドと同じ三次構造を有する。例えば、ループはベータシートおよびアルファヘリックス間、２つのアルファヘリックス間、または２つのベータシート間に位置し得る。２以上の三次構造を比較するために相同性モデリングが使用され得る。

【0097】

循環置換（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）（Ｙｕ ａｎｄ Ｌｕｔｚ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ｊａｎ；２９（１）：１８－２５）を含む好適な方法を、このような変異体の製造のために用いることができる。循環置換では、ポリペプチドの線形一次配列を環化し（例えば、配列のＮ末端およびＣ末端を連結することにより）、ポリペプチドを別の位置で切断する（「切断（ｂｒｏｋｅｎ））し得る。したがって、新規ポリペプチドの線形一次配列は、線形配列アライメント法（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ）により決定される、低い配列同一性（例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％以下または５％未満、その間の全ての値を含む）を有し得る。しかしながら、２つのタンパク質のトポロジー分析は、２つのポリペプチドの三次構造が類似することを明らかにし得る。特定の理論に拘束されるものではないが、参照ポリペプチドの循環置換によって作製され、参照ポリペプチドと同様の三次構造を有する変異ポリペプチドは、類似の機能特性（例えば、酵素活性、酵素動態、基質特異性または生成物特異性）を共有し得る。ある例において、循環置換は、二次構造、三次構造または四次構造を変化させ、異なる機能特性（例えば、増加または減少した酵素活性、異なる基質特異性または異なる生成物特異性）を有する酵素を生成し得る。例えば、Ｙｕ ａｎｄ Ｌｕｔｚ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。２０１１ Ｊａｎ；２９（１）：１８－２５を参照のこと。

【0098】

循環置換されたタンパク質では、そのタンパク質のアミノ線形酸配列は、循環置換されていない参照タンパク質とは異なることが理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、例えば配列をアライメントし、保存されたモチーフを検出し、および／または例えば相同性モデリングによりタンパク質の構造または予測された構造を比較することにより、循環置換されたタンパク質中のどの残基が、循環置換されていない参照タンパク質中の残基に対応しているかを容易に決定することができる。本願に記載される変異体には、本願に記載される配列の循環置換による変異体を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、目的の配列と本開示に記載の参照配列間の同一性パーセンテージを決定するアルゴリズムによって、配列間の循環置換の存在が説明される。循環置換の存在は、例えば、ＲＡＳＰＯＤＯＭ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００５ Ａｐｒ １；２１（７）：９３２－７）を含む、任意の当技術分野で公知の方法を用いて検出され得る。いくつかの実施形態では、本願に記載の配列と目的の配列間の同一性パーセンテージを計算する前に、循環置換の存在が補正される（例えば、少なくとも１つの配列中のドメインが再配置される）。本願の請求項に係る発明は、配列の潜在的な循環置換を考慮した後に参照配列に対する同一性パーセンテージが計算される配列を包含するものと理解されるべきである。

【0100】

本願に開示される組み換えＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素の機能性変異体もまた、本開示に包含される。例えば、機能性変異体は１以上の同じ基質に結合し得るか、または以上の同じ産物を産生し得る。機能性変異体は当分野で公知の任意の方法を用いて同定される。例えば、上記に記載のＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８、１９９０のアルゴリズムは公知の機能を持つタンパク質のホモログを同定するために使用される。

【0101】

推定の機能性変異体もまた、機能がアノテーションされたドメインを持つポリペプチドを調べる事によって同定される。Ｐｆａｍ（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． １９９７ Ｊｕｌ；２８（３）：４０５－２０）を含むデータベースが、特定のドメインを持つポリペプチドを同定するために使用され得る。

【0102】

相同性モデリングもまた、機能に影響する事なく変異しやすいアミノ酸残基を同定するために使用され得る。このような方法の非限定的な例には、位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）およびエネルギー最小化プロトコルの使用が含まれ得る。

【0103】

位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）は位置重み行列を使用してコンセンサス配列（例えば、モチーフ）を同定する。ＰＳＳＭは核酸またはアミノ酸に対して使用し得る。配列はアライメントされ、この方法は、特定の位置における特定の残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）の観測頻度および解析された配列数を考慮する。例えば、Ｓｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８２ Ｍａｙ １１；１０（９）：２９９７－３０１１を参照のこと。所定の位置で特定の残基が観測される尤度を計算し得る。特定の理論に拘束されるものではないが、変動度の高い配列内の位置は、機能性ホモログを生成するための変異（例えば、ＰＳＳＭスコア≧０）を生じやすい可能性がある。

【0104】

ＰＳＳＭは、Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数の計算と対になっていてよく、これは野生型と一点変異体間の差を決定する。Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数は、この差を、（ΔΔＧ_ｃａｌｃ）として算出する。このＲｏｓｅｔｔａ関数では、変異した残基と周囲の原子間の結合相互作用から、変異がタンパク質の安定性を増加させるか、または減少させるかを決定する。例えば、ＰＳＳＭスコア（例えば、ＰＳＳＭスコア≧０）から有利と判定された変異は、その後タンパク質の安定性における当該変異の潜在的な影響を決定するためにＲｏｓｅｔｔａエネルギー関数を用いて解析される。特定の理論に拘束されるものではないが、潜在的に安定化する変異はタンパク質工学（例えば、機能性ホモログの生産）において望ましい。いくつかの実施形態では、潜在的に安定化する変異は、－０．１Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー単位以下（例えば、－０．２以下、－０．３以下、－０．３５以下、－０．４以下、－０．４５以下、－０．５以下、－０．５５以下、－０．６以下、－０．６５以下、－０．７以下、－０．７５以下、－０．８以下、－０．８５以下、－０．９以下、－０．９５以下、または－１．０以下）のΔΔＧ_ｃａｌｃ値を有する。例えば、Ｇｏｌｄｅｎｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１６ Ｊｕｌ ２１；６３（２）：３３７－３４６． Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．０６．０１２を参照のこと。

【0105】

いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素をコードする配列は、参照（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）をコードする配列に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００以上の位置において変異を含む。いくつかの実施形態では、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素をコードする配列は、コード配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のコドンにおいて、参照（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）をコードする配列と比較して変異を含む。当業者に理解されるように、コドン内の変異は、遺伝暗号の縮退によって、当該コドンにコードされるアミノ酸を変更する事もあり、変更しないこともある。いくつかの実施形態では、コード配列内の１以上の変異は、参照ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列と比較して、当該コード配列（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列を変更しない。

【0106】

いくつかの実施形態では、組み換えＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素配列内の１以上の変異は、ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列を、参照ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列と比較して、変更する。いくつかの実施形態では、１以上の変異は、組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列を、参照ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のアミノ酸配列と比較して、変更し、および参照ポリペプチドと比較して、当該ポリペプチドの活性を変化（増強または減少）させる。

【0107】

本開示に記載の任意の組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）の活性（例えば、比活性）は常套の方法を用いて測定され得る。非限定的な例として、組み換えポリペプチドの活性は、その基質特異性、生産された産物、生産された産物の濃度、またはその任意の組み合わせ、を測定することで決定され得る。本明細書で使用する場合、組み換えポリペプチドの「比活性」とは、所定の量（例えば、濃度）の組み換えポリペプチドによって単位時間あたりに生産された特定の産物の量（例えば、濃度）を意味する。

【0108】

組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）をコードする配列における変異は保存的アミノ酸置換をもたらし、前記ポリペプチドと機能的に等価な変異体、例えば、当該ポリペプチドの活性を保持する変異体を提供し得ることを、当業者はまた理解するはずである。本開示において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷またはサイズ特性または機能的活性を変化させないアミノ酸置換を意味する。

【0109】

いくつかの例では、アミノ酸は、そのＲ基によって特徴付けられる（例えば、表１参照）。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷をもつＲ基、負電荷をもつＲ基、非極性芳香族Ｒ基、または極性非荷電Ｒ基を含み得る。非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンが挙げられる。正電荷をもつＲ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷をもつＲ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。非極性、芳香族性Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。極性非荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的な例としては、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。

【0110】

変異体は、ポリペプチド配列を改変するための方法をまとめた文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１２、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１０に記載のような、当業者に公知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って製造することができる。

【0111】

ポリペプチドの機能的に等価な変異体の非限定的な例には、本願に開示されるタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換を含み得る。本開示で使用する場合、「保存的置換」とは「保存的アミノ酸置換」と互換的に用いられ、および表１に記載のアミノ酸置換の任意の１つを指す。

【0112】

いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０以上の残基が、変異体ポリペプチドを調製する際に変更され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は保存的アミノ酸置換によって置換される。

【0113】

【表1】

【0114】

望ましい性質および／または活性を有する組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）変異体を生産するための、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、当該ポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のコード配列の変更によって行われる。同様に、ポリペプチドの機能的に等価な変異体を生産するための、ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、典型的には、組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）のコード配列の変更によって行われる。

【0115】

変異（例えば、置換）は、当業者に知られた種々の方法によりヌクレオチド配列中において行われ得る。例えば、変異は、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８－４９２、１９８５）の方法に従うＰＣＲ特異的変異導入、部位特異的変異導入、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、遺伝子編集技術、または挿入、例えばタグ（例えばＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ）の挿入によって行われ得る。

【0116】

分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）経路の酵素をコードする核酸
本開示の態様は組み換え酵素、機能的な改変およびその変異体、およびそれらに関する使用、に関する。例えば、本願に記載の酵素および細胞は、例えばロイシンからイソペンタノールへの変換によるロイシンの消費を促進するために使用され得る。方法には、本願に記載の１以上の酵素を含む宿主細胞、細胞溶解液、単離酵素、またはその任意の組み合わせ、の使用を含み得る。本願に記載の酵素をコードするポリヌクレオチドの、宿主細胞における組み換え発現を含む方法は、本開示に包含される。少なくとも１つのＢＣＡＡ経路酵素（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素）を含む宿主細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法は、本開示に包含される。１以上の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を、本願に開示されるＢＣＡＡ経路の酵素と反応混合液中で反応させる工程を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法もまた、本開示に包含される。いくつかの実施形態では、ＢＣＡＡ経路の酵素はＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈ酵素、またはその組み合わせである。

【0117】

任意の１以上の組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈ、および／またはＢｒｎＱ）をコードする核酸は本開示に包含され、および宿主細胞に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、この核酸はオペロンの形態である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボソーム結合部位が、この核酸中に存在する１以上のコード配列の間に存在する

【0118】

いくつかの実施形態では、本開示に包含されるＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈ、および／またはＢｒｎＱの核酸配列は、本開示において供されるＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈ、および／またはＢｒｎＱ核酸配列に対して、高度または中程度に厳しい条件下でハイブリダイズする核酸であり、かつ生物学的に活性な核酸である。例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈおよび／またはＢｒｎＱをコードする核酸に対して、０．２～１×ＳＳＣ、６５℃であり、その後０．２×ＳＳＣ、６５℃で洗浄する、高度に厳しい条件下でハイブリダイズする核酸を使用し得る。ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈおよび／またはＢｒｎＱをコードする核酸に対して、６×ＳＳＣ、室温であり、その後２×ＳＳＣ、室温で洗浄する、低度に厳しい条件下でハイブリダイズする核酸を使用し得る。その他のハイブリダイゼーション条件には、３×ＳＳＣ、４０℃または５０℃、その後１または２×ＳＳＣ、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、または６５℃を含む。

【0119】

ハイブリダイゼーションは、ホルムアルデヒドの存在下で、例えば、１０％、２０％、３０％４０％または５０％で、行うことができ、ハイブリダイゼーションの厳しさをさらに向上させ得る。核酸ハイブリダイゼーションの理論および実施は、例えば、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ （ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ ２０；ａｎｄ Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ－ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅｓに記載されており、例えば、ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ、”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋは核酸ハイブリダイゼーションの基本的なガイドを提供する。例示的なタンパク質は、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈタンパク質またはそのドメイン、例えば触媒ドメイン、に対して少なくとも約５０％、７０％、８０％、９０％、好ましくは少なくとも約９５％、さらに好ましくは少なくとも約９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。その他の例示的なタンパク質は、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、またはＡｄｈの核酸、例えば本願に記載のもの、に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、さらに好ましくは少なくとも約９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の相同性または同一性を有する核酸によってコードされ得る。

【0120】

本開示に記載の組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈおよび／またはＢｒｎＱ）のいずれか１つ以上をコードする核酸は、当分野で公知の任意の方法によって任意の適当なベクターに組み込まれてもよい。例えば、ベクターは発現ベクターであってよく、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）、一過性発現に好適な任意のベクター、構成的発現に好適な任意のベクター、または誘導性発現に好適な任意のベクター（例えば、ガラクトース誘導性ベクターもしくはドキシサイクリン誘導性ベクター）を含むが、これらに限定されない。

【0121】

いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内で自律的に複製される。いくつかの実施形態では、ベクターは細胞内の染色体に統合される。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断される１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み、本願に記載の遺伝子を含む核酸を挿入および連結して、細胞内で複製できる組換えベクターを生産することができる。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。クローニングベクターとしては、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。本願で使用される場合、“発現ベクター”または“発現構築物”とは、酵母細胞などの宿主細胞（例えば、微生物）、における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を有する、組換え的または合成的に生成された核酸構築物を意味する。いくつかの実施形態では、本願に記載の遺伝子の核酸配列は、作動可能に調節配列と連結されるようにクローニングベクターに挿入され、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物として発現される。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を同定するために、本願に記載の選択可能マーカーなどの１以上のマーカーを含む。いくつかの実施形態では、本願に記載の遺伝子の核酸配列はコドン最適化される。コドン最適化は、コドン最適化されない参照配列と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（その間の全ての数値を含む）、遺伝子産物の生産を増加し得る。

【0122】

いくつかの実施形態では、本願に記載の核酸配列はプラスミドで発現され得る。例えば、本願に記載の核酸配列はクローニングプラスミドで発現され得る。本願に記載の核酸配列は一過性発現のためにプラスミドで発現され得る。本願に記載の核酸配列はまた、核酸配列のゲノムＤＮＡへの組み込みのためにプラスミドで発現され得る。

【0123】

コード配列および調節配列が共有結合し、コード配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下にあるとき、このコード配列と調節配列は“作動可能に結合された”または“作動可能に連結された”と言われる。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されるべき場合において、５’調節配列のプロモーターの誘導がコード配列の転写を許し、そしてコード配列と調節配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合、該コード配列および調節配列は、作動可能に結合されていると言われる。

【0124】

いくつかの実施形態では、本願に記載のタンパク質のいずれか１つ以上をコードする核酸は、調節配列（例えば、エンハンサー配列）の制御下にある。いくつかの実施形態では、核酸はプロモーターの制御下で発現される。プロモーターは、天然のプロモーター、例えば、遺伝子のその内因性の状況におけるプロモーターであって、当該遺伝子の発現の通常の調節を供するプロモーターであり得る。あるいは、プロモーターは遺伝子の天然プロモーターとは異なるプロモーターであってもよい、例えば、プロモーターは遺伝子のその内因性の状況におけるプロモーターとは異なる。

【0125】

いくつかの実施形態では、プロモーターは真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの非限定的な例には、当業者には公知であるような（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ ｗｅｂｓｉｔｅ：ｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｌａｓｍｉｄｓ－１０１－ｔｈｅ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｒｅｇｉｏｎ参照）、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ３、ＧＡＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＵＰ１－１、ＥＮＯ２、およびＳＯＤ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは原核生物プロモーター（例えば、バクテリオファージまたは細菌プロモーター）である。バクテリオファージプロモーターの非限定的な例には、Ｐｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびＰＬが挙げられる。細菌プロモーターの非限定的な例には、Ｐｂａｄ、ＰｍｇｒＢ、Ｐｔｒｃ２、ＰＣＩ８５７、Ｐｌａｃ／ａｒａ、Ｐｌａｃ／ｆｎｒ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｅｔ、Ｐｃｍｔ、およびＰｍが挙げられる。

【0126】

いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。本願で使用する場合、「誘導性プロモーター」は、ある分子の存在または不存在によって制御されるプロモーターである。これは、例えば、酵素の発現を制御可能に誘導するために使用されてよい。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤおよび／またはＡｄｈと連結され、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤおよび／またはＡｄｈの発現は、ある時点において誘導されてよく、または誘導されなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ロイシン消費を制限するため、ある時点での発現は誘導されなくてよい（例えば、細胞の増殖期）。誘導性プロモーターの非限定的な例には、化学的に調節されたプロモーターおよび物理的に調節されたプロモーターが含まれる。化学的に調節されたプロモーターの場合、転写活性は、アルコール、テトラサイクリン、ガラクトース、ステロイド、金属または他の化合物などの１以上の化合物によって調節することができる。物理的に調節されるプロモーターの場合、転写活性は光または温度などの現象によって調節できる。テトラサイクリン調節型プロモーターの非限定的な例には、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系（例えば、テトラサイクリン抑制性タンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質（ｔＴＡ））が含まれる。ステロイド調節型プロモーターの非限定的な例には、ラットのグルココルチコイド受容体、ヒトのエストロゲン受容体、ガのエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーターが含まれる。金属調節型プロモーターの非限定的な例には、メタロチオネイン（金属イオンを結合および隔離するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。病因調節型（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｇｕｒａｔｅｄ）プロモーターの非限定的な例には、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導されるプロモーターが含まれる。温度／熱誘導性プロモーターの非限定的な例には、熱ショックプロモーターが含まれる。光調節型プロモーターの非限定的な例には、植物細胞由来の光応答性プロモーターが含まれる。特定の実施形態では、誘導性プロモーターはガラクトース誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、１以上の生理学的条件（例えば、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、生理食塩水濃度勾配、細胞表面結合、または１以上の外因性もしくは内因性誘導剤の濃度）によって誘導される。外因性誘導物質または誘導剤の非限定的な例には、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、糖類および多糖類、核酸、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0127】

いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。本願で使用される場合、「構成的プロモーター」とは、遺伝子の連続的な転写を可能にする調節されないプロモーターを意味する。構成的プロモーターの非限定的な例には、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＥＮＯ２、およびＳＯＤ１が含まれる。

【0128】

当業者に公知の他の誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターもまた、本願において企図される。

【0129】

遺伝子発現に必要な調節配列の細かな性質は、種または細胞タイプ間で異なるが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列が含まれる。特に、そのような５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含み得る。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含み得る。本願に開示されるベクターは、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。調節配列はまた、ターミネーター配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ターミネーター配列は、転写過程におけるＤＮＡ内の遺伝子の終端を示す。異種生物において本願に記載の１以上の遺伝子の発現を誘導するのに好適な１以上の適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

【0130】

発現に必要な要素を含む発現ベクターは市販されており、当業者に知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１２を参照のこと）。

【0131】

宿主細胞
開示の方法および組成物および宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７）を用いて例示されるが、いくつかの実施形態では、その他の宿主細胞にも適用可能である。

【0132】

好適な宿主細胞には以下を含むが、これに限定されない：酵母細胞、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および動物細胞（哺乳類細胞を含む）。１つの例示的な実施形態では、好適な宿主細胞には Ｅ．ｃｏｌｉを含む（例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ｉｎ Ｉｐｓｗｉｃｈ、 Ｍａｓｓから入手可能なＳｈｕｆｆｌｅ^商標ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ、またはＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から入手可能なＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＳＭ ６６０１）。

【0133】

好適な酵母宿主細胞には、以下を含むがこれに限定されない：Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａ。いくつかの実施形態では、酵母細胞はＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、または Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。

【0134】

いくつかの実施形態では、酵母株は工業用倍数体酵母株である。真菌細胞のその他の非限定的な例にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｓｏｒｄａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｓｐｐ．、Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｐｐ．、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．から取得された細胞を含む。

【0135】

特定の実施形態では、宿主細胞はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、 Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）および Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ （Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。

【0136】

その他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。好適な原核細胞には、グラム陽性、グラム陰性及びグラム可変性細菌細胞を含む。宿主細胞は以下の種であり得るが、これに限定されない：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ。

【0137】

いくつかの実施形態では、細菌宿主株は工業用菌株である。多数の細菌の工業用菌株が知られており、本願に記載の方法および組成物に適している。

【0138】

いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。特定の実施形態では、宿主細胞は工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、などである。

【0139】

本開示はまた、哺乳類細胞、例えば、ヒト（２９３、ＨｅＬａ、ＷＩ３８、ＰＥＲ．Ｃ６およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞を含む）、マウス（３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む）、ハムスター（ＣＨＯ、ＢＨＫ）、サル（ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ）、およびハイブリドーマ細胞株を含む種々の動物細胞タイプでの使用に適している。

【0140】

様々な実施形態では、本開示の実施に使用され得る株は、原核および真核細胞株の両者を含み、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＮＲＲＬ）などの多数の培養コレクションから容易に一般に入手できる。本開示はまた、様々な植物細胞タイプでの使用にも適している。

【0141】

本願で用いる用語「細胞」は、同じ細胞株または系統に属する細胞の集団などの単一の細胞または細胞集団を意味し得る。単数形の用語「細胞」の使用が、細胞の集団ではなく単一の細胞を明示的に意味すると解釈されるべきではない。宿主細胞には、野生型ものと比較して、遺伝子の改変を含んでいてもよい。

【0142】

本願に記載の組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈ酵素および／またはＢｒｎＱ）のいずれか１つをコードするベクターは当分野で公知の任意の方法を用いて、好適な宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、当業者に理解されるような任意の適切な条件下で培養され得る。例えば、当分野で公知の任意の培地、温度およびインキュベート条件が使用され得る。誘導性ベクターを含む宿主細胞については、細胞は、発現を促進するための適切な誘導剤と共に培養されてよい。

【0143】

本願に記載の細胞のいずれも、核酸の接触および／または挿入の、前、その途中、および／またはその後において、任意のタイプ（リッチまたはミニマム）および任意の組成の培地中で培養することができる。培養または培養プロセスの条件は、当業者によって理解されるような常套の試験によって最適化され得る。いくつかの実施形態では、選択された培地には、様々な成分が補充される。いくつかの実施形態では、補充成分の濃度および量が最適化される。いくつかの実施形態では、培地および増殖条件のそのほかの態様（例えば、ｐＨ、温度など）は、常套の試験により最適化される。いくつかの実施形態では、培地に１以上の補充成分が添加される頻度、および細胞の培養時間の長さが最適化される。

【0144】

本願に記載の細胞の培養は、当分野で知られかつ用いられている培養器で行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞を培養するために、曝気反応器（例えば、撹拌槽反応器）が用いられる。いくつかの実施形態では、細胞を培養するために、バイオリアクターまたは発酵槽が用いられる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は発酵に用いられる。本願において使用される場合、用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は互換的に用いられ、生物または生物の一部を含み、生物学的、生化学的および／または化学反応が行われる限定空間または部分的限定空間を意味する。「大規模バイオリアクター」または「工業規模バイオリアクター」は、商業規模または準商業規模で製品を産生するために用いられるバイオリアクターである。大規模バイオリアクターは、典型的には、数リットル、数百リットル、数千リットルまたはそれ以上の容量である。

【0145】

いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、本明細書に記載の細胞または細胞培養物などの、細胞（例えば、細菌細胞）または細胞培養物（例えば、細菌細胞培養物）を含む。ある態様において、バイオリアクターは、単離された微生物の芽胞（ｓｐｏｒｅ）および／または休眠細胞型（例えば、乾燥状態の休眠細胞）を含む。

【0146】

バイオリアクターの非限定的な例には、攪拌タンク発酵槽、回転混合装置によって攪拌されるバイオリアクター、ケモスタット、振とう装置によって撹拌されるバイオリアクター、エアリフト発酵槽、充填床リアクター、固定床リアクター、流動床バイオリアクター、波動撹拌を採用するバイオリアクター、遠心バイオリアクター、ローラーボトル、および中空糸バイオリアクター、ローラー装置（例えば、ベンチトップ、カート搭載型および／または自動化型など）、垂直に積み重ねられたプレート、スピナーフラスコ、撹拌フラスコまたは振動（ｒｏｃｋｉｎｇ）フラスコ、振盪マルチウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔフラスコ、ルーボトル、多表面（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｓｕｒｆａｃｅ）組織培養増殖器、改変型発酵槽およびコーティングされたビーズ（例えば、細胞の付着を防ぐために血清タンパク質、ニトロセルロースまたはカルボキシメチルセルロースでコーティングされたビーズ）が含まれる。

【0147】

いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、移動する液体および／または気泡と細胞（例えば、細菌細胞）が接触している細胞培養系を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞培養物は、懸濁液中で増殖する。その他の実施形態では、細胞または細胞培養物は、固相キャリアに付着する。キャリア系の非限定的な例には、マイクロキャリア（例えば、ポリマー球体、マイクロビーズ、および多孔性または非多孔性であり得るマイクロディスク）、特定の化学基（例えば、第三級アミン）で荷電された架橋ビーズ（例えば、デキストラン）、非多孔質ポリマー繊維内に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロキャリア、３Ｄキャリア（例えば、キャリア繊維、中空繊維、マルチカートリッジ反応器、および多孔性繊維を含み得る半透膜）、低減されたイオン交換能を有するマイクロキャリア、カプセル化細胞、キャピラリーおよび凝集体が挙げられる。いくつかの実施形態では、キャリアは、デキストラン、ゼラチン、ガラスまたはセルロースなどの材料から作製される。

【0148】

いくつかの実施形態では、工業規模のプロセスは、連続、半連続または非連続モードで操作される。操作モードの非限定的な例は、バッチ、供給バッチ、拡張バッチ、反復バッチ、ドロー／フィル、回転壁、回転フラスコ、および／または灌流操作モードである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、基質ストック、例えば、炭水化物源の連続的または半連続的補充および／またはバイオリアクターからの生成物の連続的または半連続的分離を可能にする。

【0149】

いくつかの実施形態では、バイオリアクターまたは発酵槽は、反応パラメーターを測定および／または調整するためのセンサーおよび／または制御系を含む。反応パラメーターの非限定的な例には、生物学的パラメーター（例えば、増殖速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞タイプまたは細胞状態など）、化学的パラメーター（例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物の濃度、酸素濃度およびＣＯ_２濃度などの溶存ガスの濃度、栄養素濃度、代謝産物濃度、オリゴペプチド濃度、アミノ酸濃度、ビタミン濃度、ホルモン濃度、添加剤濃度、血清濃度、イオン強度、イオン濃度、相対湿度、モル濃度、浸透圧、他の化学物質、例えば緩衝剤、アジュバントまたは反応副産物の濃度）、物理的／機械的パラメーター（例えば、密度、導電率、撹拌の程度、圧力、および流量、せん断応力、せん断速度、粘度、色、濁度、光吸収、混合速度、変換速度ならびに光の強度／質などの熱力学的パラメーター）が含まれる。本願に記載のパラメーターを測定するためのセンサーは、関連する機械および電子技術分野の当業者によく知られている。本願に記載のセンサーからの入力に基づいてバイオリアクター内のパラメーターを調整するための制御系は、バイオリアクター工学分野における当業者によく知られている。

【0150】

いくつかの実施形態では、方法はバッチ発酵（例えばフラスコ振とう発酵）に関する。バッチ発酵（例えばフラスコ振とう発酵）についての一般的な考慮事項には、酸素およびグルコースの量を含む。例えば、バッチ発酵（例えばフラスコ振とう発酵）では酸素およびグルコースが限定されている、そのためいくつかの実施形態では、十分に設計された供給バッチ発酵における細胞株の実行能力は過小評価される。また、最終生産物は、溶解性、毒性、細胞蓄積及び分泌の点で基質と何らかの違いを示す可能性があり、いくつかの実施形態では、異なる発酵動態を有し得る。

【0151】

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてロイシンを消費するように適合される。いくつかの実施形態では、細胞はイソペンタノールへの転換を通じてロイシンを消費するための１以上の酵素（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、および／またはＡｄｈ）を産生するように適合される。このような実施形態では、酵素はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのプロセスにおいて、バイオコンバージョンによるロイシンの消費のための反応を触媒することができる。

【0152】

本開示の任意のタンパク質または酵素は、宿主細胞によって発現されてよい。本願において使用する場合、宿主細胞は少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド（例えば、本願に記載のタンパク質または酵素をコードする）を発現するために使用され得る細胞である。遺伝子を含むポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドについての用語「異種」は、用語「外因性」および用語「組み換え」と互換的に用いられ、以下を意味する：生物系に人工的に供給されたポリヌクレオチド；生物系内で改変されたポリヌクレオチド；または生物系内でその発現または制御が操作されたポリヌクレオチド。宿主細胞に導入されるかまたは宿主細胞において発現される異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞とは異なる生物または種に由来するポリヌクレオチドであり得る、または合成ポリヌクレオチドであり得る、または宿主細胞と同じ生物または種において内因的に発現されるポリヌクレオチドでもあり得る。宿主細胞内で内因的に発現されるポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞において非天然の位置にある場合；宿主細胞において安定的または一過性に組み替え発現される場合；宿主細胞内で修飾をうける場合；宿主細胞内で選択的に編集される場合；宿主細胞で天然に生じるコピー数とは異なるコピー数で発現される場合；または、例えばポリヌクレオチドの発現を制御する調節領域を操作する事によって、宿主細胞内で非天然の経路で発現される場合、においては、異種ポリヌクレオチドと考えられる。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは宿主細胞において内因的に発現されるポリヌクレオチドであるが、その発現はポリヌクレオチドの発現を天然には制御しないプロモーターによって駆動される。その他の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは宿主細胞において内因的に発現されるポリヌクレオチドであり、その発現はポリヌクレオチドの発現を天然に制御するプロモーターによって駆動されるが、このプロモーターまたは別の調節領域が改変されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは組み換えにより亢進または抑制されている。例えば、遺伝子編集に基づく技術を使用して、内因性プロモーターはを含むプロモーターから発現される、内因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現を制御し得る。例えば、Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１６ Ｊｕｌ；１３（７）：５６３-５６７を参照のこと。異種ポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列と比較して、野生型配列または変異配列を含んでいてよい。

【0153】

本願に開示される組み換えポリペプチド（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、および／またはＡｄｈ）のいずれかを産生するために、任意の好適な宿主細胞が使用されてよく、これには真核細胞または原核細胞を含む。

【0154】

組成物
本開示は、本願に記載の宿主細胞（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈからなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞）、または本願に記載される１つ以上の酵素（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、および／またはＡｄｈ）、および任意には薬学的に許容される賦形剤、を含む組成物であって、医薬組成物を含む、組成物を提供する。

【0155】

特定の実施形態では、本願に記載される宿主細胞は、医薬組成物などの組成物中に有効量で提供される。特定の実施形態では、本願に記載される１つ以上の酵素は、医薬組成物などの組成物中に有効量で提供される。特定の実施形態では、有効量は治療有効量である。特定の実施形態では、有効量は予防的に有効な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１つ以上のＭＳＵＤの症状を処置または改善するために十分な量である。

【0156】

特定の実施形態では、対象は動物である。特定の実施形態では、対象は人である。その他の実施形態では、体象は非ヒトの動物である。特定の実施形態では、対象は哺乳類である。特定の実施形態では、対象は非ヒトの哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象は非哺乳類である。特定の実施形態では、対象はイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、またはヤギなどの家畜化動物である。特定の実施形態では、対象はイヌまたはネコなどの伴侶動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌ）である。 特定の実施形態では、対象はウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、またはヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象は動物園の動物である。別の実施形態では、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、イヌ、ブタ、または非ヒトの霊長類などの、研究動物である。

【0157】

本願に記載の、医薬組成物などの組成物は、当分野で公知の任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法には、本願に記載される化合物（例えば、「有効成分」）をキャリアまたは賦形剤、および／または１つ以上のその他の付属成分と混合する工程、およびその後、必要であれば、および／または望ましい場合には、産物を望ましい単回または複数回投与単位に成形、および／または包装する工程を含む。

【0158】

方法
いくつかの態様では、本開示は宿主細胞を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は本願に記載の宿主細胞（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈからなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞）を培養する工程を含む方法を提供する。細胞培養のための方法は、本願の別の部分に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示はロイシンからイソペンタノールを生産する方法であって、本願に記載の宿主細胞（例えば、ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞）を培養する工程を含む方法、を提供する。いくつかの実施形態では、この生産と培養はｉｎ ｖｉｖｏで生じる、例えば、宿主細胞を投与されたヒト対象において生じる。いくつかの実施形態では、この生産はｅｘ ｖｉｖｏで生じる、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養環境において生じる。本願に記載される組成物、細胞、酵素、および方法はまた、分岐鎖アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）蓄積が生じている可能性があるような任意の用途を含む、工業的環境にも適用可能である。

【0159】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは決して限定的であると解釈されるべきではない。本願を通して引用された全ての文献（参考文献、発行済み特許、公開特許出願および共同係属中の特許出願を含む）の内容全体は、引用により本願に明示的に包含させる。本願に組み込まれた参考文献が、ある用語の定義が、本開示で定義された同じ用語の定義と不調和であるか互換性のない用語を含む場合、本開示においてその用語に付与された意味が適用されるものとする。ただし、本願で引用した任意の参考文献、論文、出版物、特許、特許公開、および特許出願の記載は、それらが有効な先行技術であること、または世界の任意の国における一般的な一般知識の一部を形成していることを認めるものでも、いかなる形でも示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきでもない。

【実施例】

【0160】

実施例
本願に記載される発明がより十分に理解され得るために以下の実施例は記載される。本願に記載の実施例は本願に提供される系および方法を説明するために提示され、および決してそれらの範囲を限定するように解釈されるものではない。

【0161】

実施例１：酵素ライブラリーの設計および合成
材料と方法
メタゲノム解析による酵素の探索
機械学習に基づくバイオインフォマティクスツールを用いて、公共の配列データベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬ、合わせてＵｎｉＰｒｏｔとして知られる）から、３つの望ましい活性（ロイシンデヒドロゲナーゼ、１．４．１．９；ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ、４．１．１．１；およびアルコールデヒドロゲナーゼ１．１．１．１）それぞれについて、酵素の候補を同定した。ＬｅｕＤＨおよびＡｄｈについて、先行して開発されたアルゴリズムを用いて配列多様性を最大化した。ＫｉｖＤについては層化抽出法を使用した。酵素候補の総数は、１１７５個のＬｅｕＤＨ配列、１２９６個のＫｉｖＤ配列、および１１７７個のＡｄｈ配列であった。

【0162】

合理的酵素設計
ＬｅｕＤＨおよびＡｄｈについて、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアを用いて、酵素－遷移状態複合体の分子モデルを構築し、および活性部位の残基の規則的な変異を、２０個のアミノ酸それぞれについて設計した。

【0163】

ライブラリーの合成
全てのＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤおよびＡｄｈ酵素のＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した。コード配列を、誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中に合成し、Ｔ７プロモーターの制御下においた。

【0164】

結果
ロイシン消費型分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）経路を改善するために、実験を行い、試作株（ＳＹＮ１９８０としても知られる１９８０）において親株の酵素に比して優れた活性を持つＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈ酵素を同定した、ここで親株はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのＫｉｖＤ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２を含む。試作株はまた、ロイシンなどの分岐鎖アミノ酸を細胞に輸送できる分岐鎖アミノ酸輸送体である、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢｒｎＱを含む。親株のＬｅｕＤＨ酵素はロイシンに加え、バリンおよびイソロイシンを脱アミノ化する、基質の乱雑さ（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を示した。ＢＣＡＡ経路による特異的なロイシン消費を向上させるための、経路設計のさらなる目的はバリン（Ｖａｌ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）に比してロイシン（Ｌｅｕ）への特異性が増したＬｅｕＤＨ酵素を同定する事である。

【0165】

各酵素ファミリー（ＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈ）のライブラリーを設計するために２つの相補的なアプローチを用いた：メタゲノムソーシングおよび合理的設計（表２）。各酵素について、配列データベースにおいて入手可能な完全なメタゲノム配列空間をサンプリングするために＞１０００個の酵素のメタゲノムライブラリーを設計した（図１Ａ－１Ｃ）。ＬｅｕＤＨおよびＡｄｈライブラリーについて、入手可能な構造データをＢ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｄｈ酵素の合理的設計のために使用した。全ライブラリーの酵素配列はＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化され、および誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中に合成され、およびハイスループットスクリーニングのために、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換された。

【0166】

【表2】

【0167】

実施例２：経路酵素ライブラリーの特徴づけ
材料と方法
細胞の増殖および酵素の調製
スクリーニングした各酵素ライブラリーについて、ライブラリープラスミドを保持する株をＥ．ｃｏｌｉ Ｔ７発現宿主細胞に形質転換した。５μＬ／ウェルの冷凍のグリセロールストックを、半分の高さのディープウェルプレート中の５００μＬ／ウェルのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ＬＢ－Ｃａｒｂ１００）中に入れ、およびＡｅｒａＳｅａｌを用いて密封した。サンプルを３７℃でインキュベートし、および８０％湿度中、１０００ＲＰＭで一晩振とうした。５０μＬ／ウェルの得られた前培養物を、半分の高さのディープウェルプレート中の４５０μＬ／ウェルのＬＢ－Ｃａｒｂ１００＋１ｍＭ ＩＰＴＧ中に入れ、およびＡｅｒａＳｅａｌを用いて密封した。サンプルを３０℃でインキュベートし、および８０％湿度中、１０００ＲＰＭで一晩振とうした。２５０μＬ／ウェルの得られた培養産物を、５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を入れたディープウェルプレートに入れ、４０００Ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り除き、得られた細胞のペレットを２００μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬＋１μＬ／ｍＬの精製Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ＋１μＬ／６ｍＬの精製リゾチームに再懸濁した。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイに使用する細胞溶解液を生成した。

【0168】

ＬｅｕＤＨ 活性アッセイ
ＬｅｕＤＨライブラリー株の溶解液１０μＬを、９０μＬ／ウェルのアッセイ緩衝液（２０Ｍｍアミノ酸［Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、またはＬ－イソロイシン］、２００ｍＭ グリシン、２００ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ ＮＡＤ、ｐＨ １０．５）を入れた半面積の平底プレートに移した。光学測定はプレートリーダーで行い、吸光度は３４０ｎＭで１０分間測定した。得られた反応動態データを使用し、ＬｅｕＤＨ活性の代わりとしてＮＡＤ＋還元の最大速度を算出した。

【0169】

ＫｉｖＤ 活性アッセイ
ＫｉｖＤライブラリー株の溶解液１０μＬを、９０μＬ／ウェルのアッセイ緩衝液（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＫＯＨ、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、１ｍＭ ジチオトレイトール、０．４ｍＭ ＮＡＤ、１．５ｍＭ チアミンピロリン酸、１０ｍＭ グルタミン酸マグネシウム、２０ｍＭケトイソカプロエート（ＫＩＣ）、ｐＨ ７．５）を入れた半面積の平底プレートに移した、ＫＩＣに対するＫｉｖＤ活性を間接的に測定するために、カップリング酵素を使用した。光学吸光度を１０分間測定した。得られた反応動態データを使用して、ＫｉｖＤ活性を決定した。

【0170】

Ａｄｈ活性アッセイ
Ａｄｈライブラリー株の溶解液１０μＬを、９０μＬ／ウェルのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、および３０ｍＭ イソバレルアルデヒド、ｐＨ７．０）を入れた半面積の平底プレートに移した。光学吸光度を３４０ｎＭで１０分間測定した。得られた反応動態データを使用し、ＡＤＨ活性の代わりとしてＮＡＤＨ酸化の最大速度を算出した。

【0171】

ＬｅｕＤＨ 選択性アッセイ
ＬｅｕＤＨの選択性（Ｌ－ＩｌｅおよびＬ－Ｖａｌの存在下における特異的なＬ－Ｌｅｕの脱アミノ化）を測定するために、溶解液を溶解緩衝液で４倍に希釈し、この新しく希釈した溶解液１０μＬ／ウェルを、９０μＬ／ウェルのアッセイ緩衝液（上記から調整し、特に０．５ｍＭの各アミノ酸（Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリン）、２００ｍＭ グリシン、２００ｍＭ 塩化カリウム、および４ｍＭ ＮＡＤを含む）、に入れた。反応は異なる時点で停止され、かつＬＣ－ＭＳによるロイシン、イソロイシンおよびバリンの定量に供された。

【0172】

結果
３×～１３００個の酵素ライブラリーをスクリーニングするために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞溶解液中のＬｅｕＤＨ、ＫｉｖＤ、およびＡｄｈ酵素活性をスクリーニングするために、ハイスループット（ＨＴＰ）な方法を開発した。簡単に説明すると、９６ディープウェルプレートで株を培養し、タンパク質産生を誘導した、ここで各プレートにはポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。細胞を溶解し、本明細書に記載の酵素特異的な分光高度法アッセイを用いて細胞溶解液中の酵素活性を測定した。酵素アッセイは完全に自動化されたロボット型ワークセル上で行われた。各酵素ファミリーについて、完全なライブラリー（各～１３００個）を２連の生物学的複製で測定し、および各酵素ファミリーにおいて最も高い活性を持つ５０～２００個の酵素をそのファミリーの一次「ヒット」として選出した。酵素の順位を検証するために、さらに複製（４連の生物学的複製）を加えて、二次スクリーニングにおいて一次ヒットを再度スクリーニングした。

【0173】

ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）
計１３７８個のｌｅｕＤＨ酵素を、Ｌｅｕを脱アミノ化する能力について一次スクリーニングした。初回のスクリーニングによって、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の親株のＬｅｕＤＨ酵素と同程度か、よりよい活性もつ２２０個の酵素が同定された（表４）。これらの一次ヒットを二次スクリーニングによってさらに解析した（図２）。二次スクリーニングでは、最大１．８倍の上昇したＬｅｕに対するＬｅｕＤＨ活性をもつＬｅｕＤＨ酵素が確認された。

【0174】

活性は以下のようにして算出された：（酵素活性／バックグラウンド酵素活性）－１
コントロールは０と設定し、および値が＞０の株を潜在的なヒットとみなした。値はコントロールに対する向上の割合を表す。非限定的な例として、５０％向上した株は表４において値が０．５として示される。

【0175】

いずれの一次ＬｅｕＤＨヒットも、ＩｌｅおよびＶａｌよりもＬｅｕに対しての上昇した特異性を示すのかを決定するために、２２０個全ての一次ヒットを、ＶａｌおよびＩｌｅに対する活性についてもスクリーニングした。特異性は、Ｌｅｕに対する活性とＩｌｅまたはＶａｌに対する活性の比として測定された。図３に示すように、一次スクリーニングでヒットした酵素はＶａｌよりもＬｅｕに対して最大で２．７倍の嗜好性を示し、ＩｌｅよりもＬｅｕに対して最大で５倍の嗜好性を示した。このアッセイでは、コントロールのＢ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨはＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅに対して同程度の嗜好性を示した。

【0176】

このライブラリーにおいて、Ｌｅｕ活性に対するＬｅｕ特異性のトレードオフが観察され、最も特異的なＬｅｕＤＨ酵素は最も活性のあるＬｅｕＤＨ酵素ではなかった。Ｌｅｕ／Ｉｌｅに対する特性をＬｅｕ／Ｖａｌと比較することにより、ＬｅｕおよびＶａｌの両者に対してよりもＬｅｕに対して向上した特異性をもつヒットが同定された（図４）。コントロールのＢ．ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨはＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅに対しておおよそ同程度の嗜好性を示した。

【0177】

ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）
計１２４８個のＫｉｖＤ酵素を、ケトイソカプロエートに対する脱カルボキシル化活性についてスクリーニングした。初回のスクリーニングによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来の親株のＫｉｖＤ酵素よりも高い活性を持つ５５個の酵素が同定され（表５）、親株のＫｉｖＤ酵素は、このアッセイではバックグラウンド溶解液中のデカルボキシラーゼ活性よりも高い活性を示さず、０ではない計測可能なバックグラウンド活性と同じとみなした。これらの一次ＫｉｖＤヒットを二次スクリーニングによってさらに解析した（図５）（表５）。二次スクリーニングでは、このアッセイにおいてバックグラウンド溶解液の活性と比較して、少なくとも６から８倍上昇したＫｉｖＤ活性を持つ酵素が＞４０個同定された。ＫｉｖＤ活性は以下のようにして算出した：（酵素活性／バックグラウンド酵素活性）－１

【0178】

アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）
計１２１５個のＡｄｈ酵素を、イソバレルアルデヒドをイソペンタノールへと還元する能力についてスクリーニングした。初回のスクリーニングによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の親株のＡＤＨ２酵素よりも高い活性を持つ５５個の酵素が同定され（表６）、親株のＡＤＨ２酵素は、このアッセイではバックグラウンド溶解液中のアルコールデヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を示さず、０ではない計測可能なバックグラウンド活性と同じとみなした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２の活性は、溶解液のバックグラウンド活性と差が無いため、バックグラウンド活性よりも高い活性を持つ、Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓのＡｄｈをスクリーニングのポジティブコントロールとして用いた。これらの一次ヒットを二次スクリーニングによってさらに解析した（図６）（表６）。二次スクリーニングでは、バックグラウンド溶解液の活性と比較して少なくとも２０倍上昇したＡｄｈ活性を持つ５つの酵素が同定された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２酵素を二次スクリーニングのコントロールとして用いた。Ａｄｈ活性は以下のようにして算出した：（酵素活性／バックグラウンド酵素活性）－１

【0179】

実施例３：上位のＬｅｕＤＨ候補酵素の選択性
材料と方法
ＬｅｕＤＨ選択性アッセイ
ＬｅｕＤＨの選択性（Ｌ－ＩｌｅおよびＬ－Ｖａｌの存在下における特異的なＬ－Ｌｅｕの脱アミノ化）を測定するために、溶解液を溶解緩衝液で４倍に希釈し、この新しく希釈した溶解液１０μＬ／ウェルを、９０μＬ／ウェルのアッセイ緩衝液（上記から調整し、特に０．５ｍＭの各アミノ酸（Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリン）、２００ｍＭ グリシン、２００ｍＭ 塩化カリウム、および４ｍＭ ＮＡＤを含む）、に入れた。反応は異なる時点で停止され、かつＬＣ－ＭＳによるロイシン、イソロイシンおよびバリンの定量に供された。

【0180】

結果
ＬｅｕＤＨはＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅの脱アミノ化を触媒し、およびその結果、基質プールが混合されているｉｎ ｖｉｖｏ環境では、全ての基質が競合物質として作用する可能性がある。混合基質プールに対しての、上位のＬｅｕＤＨヒットの性能をよりよく予測するために、ＬｅｕＤＨ酵素のＬｅｕに対する選択性（すなわち、反応液中にＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅの全てが存在する場合における、ＬｅｕＤＨのＬｅｕ嗜好性）を測定した。反応混合液がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅを１：１：１のモル比で含む事を除いてＨＴＰスクリーニングと似た細胞溶解液アッセイにおいて、計２１個のＬｅｕＤＨ酵素をスクリーニングした。反応溶液中のＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅの減少速度を計測した。図７は各ＬｅｕＤＨ酵素の、反応混合液中でのＬｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌの消費を示す。親のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＬｅｕＤＨと比較した際に、少なくとも１０個のＬｅｕＤＨ酵素がＶａｌおよびＩｌｅよりもＬｅｕに対して向上した嗜好性を示した。ほとんど全てのＬｅｕＤＨ酵素がバリンについては最小の嗜好性を示した。

【0181】

実施例４：経路酵素ヒットの選択およびオペロンの組み立て。
ＢＣＡＡ経路の全体的なロイシン消費を向上させるため、各段階について親株の酵素よりも優れた性能を示した複数の酵素を選択した。ＬｅｕＤＨについて、以下の２つの基準に基づいて６個のヒットを選出した：Ｌｅｕに対する酵素活性、およびＶａｌおよびＩｌｅに比したＬｅｕに対する特異性。ＬｅｕＤＨ選択性解析はオペロンの組み立てと並行して行ったため、選択性のデータセットはこのＬｅｕＤＨ選出の要素としていない。ＫｉｖＤおよびＡＤＨについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素活性に基づいて、各酵素ファミリーについて３個のヒットを選出した。合計して１２個の酵素を最終的なオペロンの設計に進めた（表３）。オペロンは４つの酵素のコード配列から以下の順番で構成される：ＬｅｕＤＨ－ＫｉｖＤ－Ａｄｈ－ＢｒｎＱ。以下に記載するように、Ｌｅｕ消費に好ましいオペロンを選出し、以下に記載するようにさらに試験した。

【表3】

【0182】

実施例５：オペロンの試験
材料と方法
細胞調製
分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）経路のオペロンプラスミドを、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ およびＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ ６６０１）から購入したＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株１９１７に形質転換した。形質転換した細胞を氷上で解凍し、および細胞密度を６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ_６００）で測定した。この方法では、ＯＤ_６００の値１．０を１０^９細胞／ｍＬと等しいとみなした。２×１０^９細胞／ｍＬの細胞懸濁液の１ｍＬを目標として容量を計算し、この細胞を９６－ディープウェルプレートに移し、および冷やしたＰＢＳで一度洗浄した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、１０分）の後、ＰＢＳを捨て、細胞のペレットを１ｍＬの１ｘＭ９＋５０ｍＭ ＭＯＰＳ＋０．５％ グルコース（ＭＭＧ）緩衝液で懸濁させた。８００μＬの各サンプルを新しい９６－ディープウェルプレートに移し、１６ｍＭのロイシンを含む８００μＬのＭＭＧを加え、ピペッティングしてよく混合した。時間０として割り当てられたサンプル（２００μＬ）をこの時点で回収した。プレートを通気性のある膜で覆い、嫌気チャンバーに移し、３７℃でインキュベートした。嫌気チャンバーでのインキュベート中にサンプルを２時間および４時間の時点についても回収した。回収直後にサンプルを４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清１００μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、さらなる解析のために－８０℃で保存した。

【0183】

ロイシン活性アッセイ
Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ－ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ またはＶａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣ－ＴＳＱ Ａｌｔｉｓシステムをそれぞれ用いた、液体クロマトグラフィーおよび共役したタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、細菌上清中のロイシンを定量した。サンプルは、１μｇ／ｍＬのロイシン－ｄ３を内部標準として含む、９部の２：１アセトニトリル：水で抽出し、ボルテックスし、および遠心分離した。上清を９部の０．１％ギ酸で希釈し、０．８から１０００μｇ／ｍＬまで上記のように処理した標準品と同時に分析した。サンプルを、Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４ ｕｍ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａ、７５ｘ２ ｍｍ上で、０．１％ギ酸（Ａ）、０．１％ギ酸／アセトニトリル（Ｂ）を用いて、０．３ｍＬ／分、および５０℃で分離した。２μＬ注入後、初めに５％Ｂで０から０．５分間保持し、分析物は、５から９０％のＢで０．５から１．５分間にわたってグラジエント溶出し、続けて高濃度有機洗浄と水系平衡化の工程を行った。エレクトロスプレーポジティブイオンモードで化合物特異的衝突誘導フラグメントの選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）により分析物を検出した（ロイシン：１３２＞８６、イソロイシン：ロイシン－ｄ３：１３５＞８９）。ＳＲＭクロマトグラムを積算し、未知／内部標準のピーク面積比を用いて、標準曲線に対する濃度を算出した。

【0184】

結果
ＨＴＰスクリーニングから同定された上位のＬｅｕ消費オペロンをＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に形質転換し（および株５９４１、株５９４２、株５９４３とラベルした）、試作株１９８０と比較した。株５９４１は、Ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｔｉのＬｅｕＤＨ酵素、Ｅｒｗｉｎｉａ ｉｎｉｅｃｔａのＫｉｖＤ酵素、およびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｄｉｅｓｅｌｏｌｅｉのＡｄｈ酵素を含む。株５９４２は、Ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｔｉのＬｅｕＤＨ酵素、Ｅｒｗｉｎｉａ ｉｎｉｅｃｔａのＫｉｖＤ酵素、およびＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＲＬ２のＡｄｈ酵素を含む。株５９４３は、Ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｔｉのＬｅｕＤＨ酵素、Ｅｒｗｉｎｉａ ｉｎｉｅｃｔａのＫｉｖＤ酵素、およびＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＲＬ２のＡｄｈ酵素を含む。オペロンはＥ．ｃｏｌｉのＢｒｎＱをさらに含む。試作株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓのＬｅｕＤＨ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのＫｉｖＤ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２、およびＥ．ｃｏｌｉのＢｒｎＱを含む。

【0185】

上位のＬｅｕ消費オペロンおよび試作株からのサンプルをＬｅｕ消費について解析した（図８）。上位のＬｅｕ消費オペロンを含む株（５９４１、５９４２および５９４３）は、試作株（１９８０）と比べて、著しく早い速度でＬｅｕを消費する事が見出された。

【0186】

実施例６：ＬｅｕＤＨ酵素工学および活性なＬｅｕＤＨ酵素のバイオインフォマティクス解析
表４に示すように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０Ａ３９２（配列番号２７）の変異体を生成し、およびこれらの変異体がＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０Ａ３９２（配列番号２７）と比較して向上した活性または酵素発現を示すのかを決定するために試験を行った。実施例２に記載のＬｅｕＤＨ活性アッセイを用いた。以下の固有の位置における点変異が、活性または酵素発現のいずれかを向上させることが観察された：４２、４３、４４、６７、７１、７６、７８、１１３、１１５、１１６、１３６、２９３、２９６、２９７、および３００。

【0187】

ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０Ａ３９２（配列番号２７）における以下の点変異は、活性またはタンパク質の発現のいずれかを向上させることが観察された：Ａ１１５Ｎ、Ａ１１５Ｑ、Ａ１１５Ｓ、Ａ１１５Ｔ、Ａ１１５Ｖ、Ａ２９７Ｃ、Ａ２９７Ｄ、Ａ２９７Ｅ、Ａ２９７Ｆ、Ａ２９７Ｈ、Ａ２９７Ｋ、Ａ２９７Ｌ、Ａ２９７Ｍ、Ａ２９７Ｎ、Ａ２９７Ｑ、Ａ２９７Ｒ、Ａ２９７Ｔ、Ａ２９７Ｗ、Ａ２９７Ｙ、Ｅ１１６Ａ、Ｅ１１６Ｌ、Ｅ１１６Ｍ、Ｅ１１６Ｎ、Ｅ１１６Ｒ、Ｅ１１６Ｓ、Ｅ１１６Ｖ、Ｅ１１６Ｗ、Ｇ４３Ｅ、Ｇ４３Ｆ、Ｇ４３Ｔ、Ｇ４３Ｗ、Ｇ４３Ｙ、Ｇ４４Ｈ、Ｇ４４Ｉ、Ｇ４４Ｋ、Ｇ４４Ｙ、Ｉ１１３Ｆ、Ｉ１１３Ｍ、Ｉ１１３Ｑ、Ｉ１１３Ｖ、Ｉ１１３Ｗ、Ｉ１１３Ｙ、Ｌ３００Ａ、Ｌ３００Ｃ、Ｌ３００Ｄ、Ｌ３００Ｆ、Ｌ３００Ｈ、Ｌ３００Ｋ、Ｌ３００Ｍ、Ｌ３００Ｎ、Ｌ３００Ｑ、Ｌ３００Ｒ、Ｌ３００Ｓ、Ｌ３００Ｔ、Ｌ３００Ｗ、Ｌ３００Ｙ、Ｌ４２Ａ、Ｌ４２Ｑ、Ｌ４２Ｔ、Ｌ７６Ｅ、Ｌ７６Ｆ、Ｌ７６Ｈ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ７６Ｋ、Ｌ７６Ｍ、Ｌ７６Ｒ、Ｌ７６Ｓ、Ｌ７６Ｔ、Ｌ７６Ｗ、Ｌ７６Ｙ、Ｌ７８Ｃ、Ｌ７８Ｆ、Ｌ７８Ｈ、Ｌ７８Ｋ、Ｌ７８Ｑ、Ｌ７８Ｖ、Ｌ７８Ｙ、Ｍ６７Ａ、Ｍ６７Ｅ、Ｍ６７Ｋ、Ｍ６７Ｑ、Ｍ６７Ｓ、Ｍ６７Ｔ、Ｎ７１Ｃ、Ｎ７１Ｄ、Ｎ７１Ｈ、Ｎ７１Ｋ、Ｎ７１Ｍ、Ｎ７１Ｔ、Ｔ１３６Ｅ、Ｔ１３６Ｆ、Ｔ１３６Ｌ、Ｔ１３６Ｒ、Ｔ１３６Ｓ、Ｔ１３６Ｙ、Ｖ２９３Ａ、Ｖ２９３Ｃ、Ｖ２９３Ｑ、Ｖ２９３Ｓ、Ｖ２９３Ｔ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｓ、およびＶ２９６Ｔ。

【0188】

配列番号２７の変異体およびメタゲノムライブラリーからヒットした配列についてバイオインフォマティクス解析を実施した。ヒットに見られた固有の残基のリストを以下の表７に示す。配列番号２７における対応する位置を示す。ヒットは、配列番号２７と比較して活性が上昇（０より大きい）したＬｅｕＤＨである。多重配列アライメントの各位置について、個々の残基の同一性をヒットと非ヒットにビン化し、セット差を算出した。これらは、規則的な点変異ライブラリーまたはメタゲノム配列のいずれを介して、ヒットセットに固有である残基である。

【0189】

実施例７：活性なＫｉｖＤ酵素のバイオインフォマティクス解析
配列番号２９と比較して上昇した活性を示すヒットＫｉｖＤ酵素についてバイオインフォマティクス解析を行った。ヒットに見られた固有の残基のリストを表８に示した。多重配列アライメントの各位置について、個々の残基の同一性をヒットと非ヒットにビン化し、セット差を算出した。これらは、ヒットセットに固有である残基である。配列番号２９における対応する位置を表８に示した。

【0190】

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓに由来するＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６８４Ｊ７は、バターミルクおよびチーズの生産に広く用いられている微生物である。天然酵素に名付けられた反応ではないが、ＫｉｖＤは、４－メチル－２－オキソペンタン酸の脱カルボキシル化を触媒し、イソペンタノールを生成する。ＫｉｖＤ酵素ライブラリーのヒットは、その天然の基質、ケトイソバレレートを超えた広い基質特異性を有する事が見出された。

【0191】

実施例８：活性なＡＤＨ酵素のバイオインフォマティクス解析
配列番号３１と比較して上昇した活性を示すヒットＡｄｈ酵素についてバイオインフォマティクス解析を行った。ヒットに見られた固有の残基のリストを表９に示した。多重配列アライメントの各位置について、個々の残基の同一性をヒットと非ヒットにビン化し、セット差を算出した。これらは、ヒットセットに固有の残基である。配列番号３１における対応する位置を表９に示した。

【0192】

実施例９：イソペンタノール経路のモルバランスの閉鎖
株５９４１におけるイソペンタノール経路の性能およびモルバランスの閉鎖を、ＡＭＢＲ（登録商標）１５バイオリアクターで評価した。株５９４１は配列番号２のＬｅｕＤＨ酵素、配列番号１８のＫｉｖＤ酵素、および配列番号２４のＡｄｈ酵素を含む。リアクターを、０．５％グルコース、１０ｍＭ Ｌｅｕ、１０ｍＭ Ｖａｌ、および５ｍＭ Ｉｌｅを含む１７ｍＬのＭ９培地で満たした。条件は、溶存酸素０％、ｐＨ ７．０に調整した。活性化したバイオマスをＯＤ６００が１となるように植菌し、および上清サンプルを経時的に採取し、代謝産物の濃度を監視した。

【0193】

経路中間体の細胞外濃度のグラフを図１０に示す。１８０分の間に、４．１±０．３ｍＭのロイシンが消費され、および４．４±０．５ｍＭのイソペンタノールが培地中に蓄積された。ケト酸（２－オキソイソカプロエート）およびアルデヒド（イソバレルアルデヒド）は上清中に観察されなかった。よって、経路の流量は釣り合っており、そのことが確認された。これはまた経路中間体の合計モル量が保存されていることからも示される（図１０の「合計」に対応するデータ）。

【0194】

方法－発酵
このアッセイは、ＡＭＢＲ１５ｆ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のマイクロバイオリアクターシステムで行われた。容器には、２．０ｍｍ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ、５％ グルコース、１０ｍＭ Ｌ－ロイシン、５ｍＭ Ｌ－イソロイシン、および１０ｍＭ バリンを添加した、１７ｍＬの１×ｍ９塩類培地を満たした。容器は、ｐＨおよびＤＯの光学式検出デバイス（ｏｐｔｏｄｅ）の両者を水和させるために、植菌の１８時間前に満たしておいた。リアクターの温度は３７℃を保ち、２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７で維持し、および０．１４ｖｖｍ Ｎ２の流量で溶存酸素を０に保った。５００ＲＰＭで撹拌を設定し、実験中は十分に攪拌されるようにした。バイオリアクターにＯＤ６００が１となるようにＳｙｎｌｏｇｉｃ社から供された活性なバイオマスを植菌した。バイオリアクターは、植菌から０、３０、９０、１５０、および１８０分後にサンプリングした。サンプルはすぐに１５０００ｘｇで３０秒間、微量遠心機で遠心分離し、および上清を取り除き解析に供した。上清は解析の準備ができるまで－２０℃で保存した。

【0195】

方法－解析法
２つの方法についての解析法を開発した。１つの方法はロイシン（Ｌｅｕ）、ケトイソカプロン酸（Ｌｅｕ酸）、およびイソバレルアルデヒト（Ｌｅｕアルデヒド）の定量のための液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）に関するものである。この方法はまた、バリンおよびイソロイシン（およびそれらの酸およびアルデヒド産物）の定量のためにも有効であり、使用された。２つ目の方法は、イソペンタノールの定量のためのガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）に関するものである。合わせて、これらの分析方法により株５９４１の全ての経路中間体の定量が可能であった。ＧＣＭＳ法はまた、バリンおよびイソロイシンのアルコール産物の定量のためにも有効であり、使用された。

【0196】

ＬＣＭＳ解析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＰＬＣシステムと、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｏ Ａｃｃｕｃｏｒｅ ＰＦＰカラム（２．１ｘ１００ｍｍ、２．６μｍパッキング）で、以下の溶出溶媒を用いて行われた：Ａ＝０．１％ ギ酸および０．１％ ＴＦＡ（水中）；Ｂ＝０．１％ ギ酸（アセトニトリル中）。グラジエントは０．５ｍＬ／ｍｉｎでＡに対して１％のＢで６０秒間、その後２７０秒間でＡに対して１％から４０％のＢまで直線的に上昇させた。その後、カラムにＡに対して９５％のＢを６０秒間流し、Ａに対して１％のＢで１８０秒間再平衡化した。ＭＳの取得時間は０．８分から５．３分であった。

【0197】

カラムの流出液は、Ｔｈｅｒｍｏ社の標準的なＥＳＩソースを介して質量分析計に導入され、ポジティブモードイオン化電圧＋３８００Ｖ、気化器温度４００℃、およびイオン伝導管温度３７５℃の条件であった。Ｔｈｅｒｍｏ社は、ガス流量を任意単位で報告しているが、おそらくＳＴＰでＬ／ｍｉｎに近似たものである。設定値は以下であった：シースガス６０、補助ガス３０、スイープガス１。データ取得速度を上げるため、ｏｒｂｉｔｒａｐの分解能を１７５００に設定。四重極の分解能は１ｍ／ｚであった。

【0198】

この方法ではまた、アルデヒドおよびケト酸の両者を誘導体化し、これらの分析物の安定性を向上させる。多数の誘導体化剤が検討され、メタノール中の２－（ジメチルアミノ）エチルヒドラジンが、ポジティブモードで最もよい感度をもたらす事が見出された。メタノール中の０．５Ｍ酢酸および０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液は、ＬＥＵ酸およびＬＥＵアルデヒドの定量に使用されるとともに、非誘導体化ＬＥＵの測定にも使用された。

【0199】

ＧＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣＭＳ／ＭＳＤとＧｅｒｓｔｅｌａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを使用し、Ｊ＆Ｗ ＤＢ－ＷＡＸ ＧＣカラム（１５ｍ）と抽出溶媒としてクロロホルムを用いて実施した。フロントインジェクターは２５０℃、および流速１ｍＬ／分に設定した。オーブンの温度を４０℃で１分間保持した後、１３０℃まで上昇（１５℃／分）させ、その後２００℃まで急上昇（６５℃／分）させた。Ｍｓの取得スキャンウィンドウは４０－１５０ｍｚで、ＭＳソースとＭＳクワッドはそれぞれ２５０℃と２００℃に設定した。

【0200】

ハイスループットおよび自動化を促進するために、Ｇｅｒｓｔｅｌ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用いて、抽出した底部クロロホルム層を９６ウェルプレートの形式に注入し、その上に水性ａｍｂｒ１５培養マトリックスを覆いとして機能させ、産物の蒸発を防止した。その他の潜在的なアルコール産物の蒸発を考慮して、内側の覆いとして２－ヘプタノールを添加した。

【0201】

表３に記載の酵素の配列
ＬｅｕＤＨ（識別子：ｔ１６０９４６；アクセッション番号：Ａ０Ａ１Ｔ４ＰＧＧ９）

ＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＡＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＴＴＡＣＡＡＡＧＣＧＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＧＧＣＧＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＴＣＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＴＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＴＴＡＣＧＧＴＧＣＡＴＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＡＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＴＴＡＣＴＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＴＴＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＣＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＧＴＡＴＣＡＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＣ（配列番号１）

ＭＮＩＦＫＫＭＥＥＦＮＹＥＱＬＶＹＦＹＤＳＥＴＥＬＫＧＩＴＣＩＨＮＴＴＬＧＰＡＬＧＧＴＲＬＷＮＹＮＳＥＥＤＡＶＥＤＶＩＲＬＡＲＧＭＴＹＫＡＡＣＡＧＬＮＬＧＧＧＫＴＶＬＩＧＤＡＫＫＩＫＳＥＳＹＦＲＧＬＧＲＹＶＱＳＬＮＧＲＹＩＴＡＥＤＶＮＴＳＴＫＤＭＡＹＶＡＭＥＴＤＹＶＶＧＬＧＧＫＳＧＮＰＳＰＶＴＡＹＧＡＦＭＧＩＫＡＡＬＭＫＫＦＥＤＳＳＩＥＧＲＴＦＡＶＱＧＡＧＱＴＧＹＹＬＩＤＹＬＬＧＮＮＫＦＫＥＫＡＫＫＩＹＦＴＥＩＮＥＳＹＩＥＲＭＮＫＥＨＰＥＶＥＦＩＳＰＤＫＩＹＳＬＥＶＤＶＦＶＰＣＡＬＧＫＩＶＮＤＫＴＩＤＥＦＫＣＰＩＩＡＧＴＡＮＮＶＬＥＲＥＡＨＧＮＭＬＫＥＲＧＩＬＹＡＰＤＹＶＩＮＡＧＧＬＩＮＶＹＨＥＬＮＧＹＮＫＥＮＡＩＬＥＶＥＬＩＹＤＲＬＬＥＩＦＮＩＡＤＳＬＮＩＳＴＮＩＡＡＮＥＦＡＥＫＲＩＫＱＩＫＳＬＫＮＮＦＩＫＲ（配列番号２）

ＬｅｕＤＨ（識別子：ｔ１６０３８９；アクセッション番号：Ａ０Ａ１Ｍ６ＢＥ５９）

ＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＣＧＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＴＡＡＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＴＣＣＣＣＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＴＡＣＧＴＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡＴＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＧＡＴＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＣＧＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＡＴＴＧＴＧＴＡＣＧＣＴＣＣＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＴＴＡＣＴＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＴＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＡＴＴＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣ（配列番号３）

ＭＶＥＩＫＡＬＴＤＴＳＶＦＧＱＩＡＥＨＱＨＥＱＶＶＦＣＨＤＨＥＴＧＬＲＡＩＩＧＩＨＮＴＶＬＧＰＡＬＧＧＴＲＭＷＨＹＡＳＤＡＥＡＬＮＤＶＬＲＬＳＲＧＭＴＹＫＡＡＩＳＧＬＮＬＧＧＧＫＡＶＩＩＧＤＡＫＴＬＫＴＥＡＬＬＲＫＦＧＲＦＶＫＮＬＮＧＫＹＩＴＡＥＤＶＮＭＴＴＫＤＭＥＹＩＲＭＥＴＫＨＶＡＧＬＰＥＳＭＧＧＳＧＤＰＳＰＶＴＡＦＧＴＹＭＧＭＫＡＡＡＫＫＡＦＧＳＤＳＬＡＧＫＲＩＡＶＱＧＶＧＨＶＧＴＹＬＬＥＹＬＱＫＥＧＡＫＬＶＬＴＤＹＹＥＤＲＡＬＥＡＡＴＲＦＧＡＫＭＶＧＬＤＥＩＹＤＱＤＶＤＩＹＳＰＣＡＬＧＡＴＩＮＤＤＴＩＧＲＬＫＣＱＶＩＡＧＣＡＮＮＱＬＱＮＥＮＶＨＧＰＡＬＶＥＲＧＩＶＹＡＰＤＦＬＩＮＡＧＧＬＩＮＶＹＳＥＶＶＧＳＳＲＱＧＡＬＮＱＴＥＫＩＦＤＩＴＴＱＶＬＮＫＡＥＱＥＧＳＨＰＱＡＡＡＴＫＱＡＥＥＲＩＡＳＬＧＫＶＫＳＴＹ（配列番号４）

ＬｅｕＤＨ（識別子：ｔ１６０２８３；アクセッション番号：Ａ０Ａ１Ｓ９Ｂ６３６）

ＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＣＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＡＴＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＧＧＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＧＴＣＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡＡＧＧＡＡＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＡＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＧＣＧＣＧＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＣＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡＡＣＧＴＧＴＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＴＡＡＣＴＣＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＧＣＡＴＣＧＣＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＡＣ（配列番号５）

ＭＶＥＩＱＡＬＰＥＴＳＩＦＧＱＩＡＤＨＱＨＥＱＶＶＦＣＨＤＨＥＴＧＬＲＡＩＩＧＩＨＮＴＶＬＧＰＡＬＧＧＴＲＭＷＨＹＡＴＥＡＥＡＬＮＤＶＬＲＬＳＲＧＭＴＹＫＡＡＩＳＧＬＮＬＧＧＧＫＡＶＩＩＧＤＡＫＴＩＫＴＥＡＬＬＲＫＦＧＲＦＶＱＮＬＮＧＫＹＩＴＡＥＤＶＮＭＴＴＫＤＭＥＹＩＲＭＥＴＫＨＶＡＧＬＰＥＳＭＧＧＳＧＤＰＳＰＶＴＡＹＧＴＹＭＧＭＫＡＡＡＫＫＡＦＧＳＤＳＬＡＧＫＲＩＡＶＱＧＶＧＨＶＧＴＹＬＬＥＨＬＴＫＥＧＡＱＩＶＬＴＤＹＹＫＥＲＡＥＥＡＧＡＲＦＧＡＱＶＶＧＬＤＤＩＹＤＱＥＶＤＩＹＳＰＣＡＬＧＡＴＩＮＤＤＴＩＤＲＬＲＣＡＶＶＡＧＣＡＮＮＱＬＫＥＥＮＶＨＧＰＡＬＶＥＲＧＩＶＹＡＰＤＦＬＩＮＡＧＧＬＩＮＶＹＳＥＶＴＧＳＴＲＱＧＡＬＴＱＴＥＫＩＹＤＹＴＬＱＶＬＥＫＡＡＡＥＧＬＨＰＱＱＡＡＩＲＱＡＥＱＲＩＡＡＩＧＫＶＫＳＴＹ（配列番号６）

ＬｅｕＤＨ（識別子：ｔ１６０４３４；アクセッション番号：Ａ０Ａ１Ｄ２ＲＸＢ２）

ＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＧＴＡＴＴＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＧＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＡＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＴＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＴＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＡＴＴＣＧＧＴＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＴＴＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＧＴＡＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＣＧＧＴＣＡＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＧＴＣＧＣＡＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＡＡＣＧＧＣＣＡＴＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧＣＡＴＴＴＧＧＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＣＡＡＣ（配列番号７）

ＭＩＦＥＴＩＳＴＳＮＨＥＥＶＶＹＣＨＮＫＤＡＧＬＫＡＩＩＡＩＨＮＴＶＬＧＰＡＬＧＧＴＲＭＷＰＹＡＳＥＥＥＡＬＫＤＶＬＲＬＳＲＧＭＴＹＫＡＡＶＳＧＬＮＬＧＧＧＫＡＶＩＷＧＤＰＮＫＤＫＳＥＡＬＦＲＡＦＧＲＦＶＮＳＬＧＧＲＹＩＴＡＥＤＶＧＩＤＶＮＤＭＥＹＶＬＲＥＴＤＹＶＴＧＶＨＱＶＨＧＧＳＧＤＰＳＰＦＴＡＹＧＴＬＱＧＬＭＡＡＬＱＶＫＦＧＮＥＤＶＧＮＹＳＹＡＶＱＧＶＧＨＶＧＭＥＦＶＫＬＬＲＥＲＧＡＫＶＦＶＴＤＩＮＫＤＡＶＱＲＡＶＤＥＦＧＣＥＡＶＡＬＤＥＩＹＤＶＤＣＤＶＹＳＰＴＡＬＧＧＴＶＮＤＫＴＬＰＲＬＫＣＫＶＩＣＧＡＡＮＮＱＬＡＮＤＥＩＧＶＥＬＥＫＫＧＩＬＹＡＰＤＹＡＶＮＡＧＧＬＭＮＶＳＬＥＩＤＧＹＮＲＥＲＡＭＲＭＭＲＴＩＹＹＮＬＧＲＩＦＥＩＳＫＲＤＧＩＰＴＦＲＡＡＤＲＭＡＥＥＲＩＴＡＩＧＫＬＲＬＰＨＬＧＡＡＡＰＲＦＱＧＲＲＧＮ（配列番号８）

ＬｅｕＤＨ （識別子：ｔ１６００４８）

ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＡＧＣＧＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＴＡＣＡＣＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＡＴＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＡＣＧＣＡＣＴＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＣＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＴＧＧＣＧＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＧＴＴＡＴＣＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＧＴＡＣＴＡＧＣＧＴＡＣＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＡＣＧＧＧＣＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＴＡＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＣＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＧＣＴＡＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＣＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＣＧＣＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＣＧＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＴＡＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＧＴＧＡＧＣＧＴＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＡＣＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＣＣＣＣＧＴＣＴＡＴＴＣＧＣＧＧＡＧＴＡ（配列番号９）

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ＬｅｕＤＨ（識別子：ｔ１６０１４１；アクセッション番号：Ａ０Ａ０Ｊ１ＦＥＥ３）

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ＭＴＡＬＴＥＧＡＫＬＦＥＫＥＩＰＹＩＴＥＬＥＧＤＶＥＧＭＫＦＩＩＫＧＥＧＴＧＤＡＴＴＧＴＩＫＡＫＹＩＣＴＴＧＤＬＰＶＰＷＡＴＬＶＳＴＬＳＹＧＶＱＣＦＡＫＹＰＳＨＩＫＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＴＱＥＲＴＩＳＦＥＧＤＧＶＹＫＴＲＡＭＶＴＹＥＲＧＳＩＹＮＲＶＴＬＴＧＥＮＦＫＫＤＧＨＩＬＲＫＮＶＡＦＱＣＰＰＳＩＬＹＩＬＰＤＴＶＮＮＧＩＲＶＥＦＮＱＡＹＤＩＥＧＶＴＥＫＬＶＴＫＣＳＱＭＮＲＰＬＡＧＳＡＡＶＨＩＰＲＹＨＨＩＴＹＨＴＫＬＳＫＤＲＤＥＲＲＤＨＭＣＬＶＥＶＶＫＡＶＤＬＤＴＹＱ（配列番号２６）

【0202】

酵素のスクリーニングデータ

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表5-1】

【表5-2】

【表6-1】

【表6-2】

【表7】

【表8】

【表9】

【0203】

均等物
当業者であれば、本願に記載される発明の特定の実施形態の多数の均等物を、常套の試験を超えることなく認識するはずであり、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含される事が意図される。

【0204】

本願で開示された特許文献を含む全ての参考文献、特に本開示で参照される開示については、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2022537214000001.app

【国際調査報告】