特表 2022-537337 金属錯体試薬を介するＨｉｓタグ付タンパク質などの標的分子への標識および／または担体の部位特異的、速度論的に不活性なコンジュゲーション

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-25

(54)【発明の名称】金属錯体試薬を介するＨｉｓタグ付タンパク質などの標的分子への標識および／または担体の部位特異的、速度論的に不活性なコンジュゲーション

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20220818BHJP

   C07K 4/00 20060101ALI20220818BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13 ZNA

C07K4/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021575268

(86)(22)【出願日】2020-06-18

(85)【翻訳文提出日】2022-02-16

(86)【国際出願番号】 EP2020067047

(87)【国際公開番号】W WO2020254540

(87)【国際公開日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】19180999.5

(32)【優先日】2019-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】598165611

【氏名又は名称】マックス－プランク－ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ

(71)【出願人】

【識別番号】509223977

【氏名又は名称】ウニベルジテート ハイデルベルク

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(72)【発明者】

【氏名】ベンク，アメリエ・エス

(72)【発明者】

【氏名】ベンク，ルーツィア・テー

(72)【発明者】

【氏名】ベグナー，セラフィーネ

(72)【発明者】

【氏名】コンバ，ペーター

(72)【発明者】

【氏名】シュパッツ，ヨアヒム・ペー

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045EA61

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、タンパク質などの標的分子を標識および／または担体にコンジュゲートする／結合させるための手段および方法に関する。具体的には、本発明は、（ｉ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン、ならびに（ｉｉ）キレート化リガンドと、標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメインを配位する金属カチオンを含む錯体を提供する。この錯体は、標識および／または担体を、標的分子、好ましくは、タンパク質に結合させるために使用することができる。本発明の錯体を介する標識または担体の結合は、金属カチオンの配位圏中の主要リガンドとしての標的分子との生成物錯体が形成されるような、金属カチオンリガンドと、標的分子の配位基との置き換えを含む。したがって、本発明はまた、標識および／または担体の標的分子への結合を含む使用および方法も提供する。また、本発明の標識化および／または担体結合方法によって得られる生成物ならびにその使用も提供される。本発明はさらに、本発明の錯体を生産するための方法および本発明の錯体を生産するための成分を含むキットに関する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）金属カチオン；
ｂ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体。

【請求項2】

金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドが、１つもしくは複数のカルボン酸基および／または１つもしくは複数のアミン基および／または１つもしくは複数の芳香族アミンおよび／またはリン酸イオンを含む多座リガンドである、請求項１に記載の錯体。

【請求項3】

ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドが、
ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）、コンセンサス配列（ＧＨＨＰＨ）_ｎＧ（式中、ｎは１～３である；配列番号１～３も参照されたい）を有するペプチドなどのキレート化ペプチドまたはカジスチン、トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、ジエチレントリアミン－五酢酸（ＤＴＰＡ）、フィトケラチン、カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭＡ）、リン酸イオン、タンニン酸（ＴＡ）、ポルフィリン、ジピリジルアミン（ＤＰＡ）、フィチン酸、ニトリロプロピオン二酢酸（ＮＰＤＡ）、ニトリロイソプロピオン二酢酸（ＮＩＰＤＡ）、Ｎ－（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリス（カルボキシメチル）－１０－（２’－ヒドロキシプロピル）－１，４，７，１０－テトラアゾシクロデカン、１，４，７－トリアザシクロナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１－（１，３－カルボキシプロピル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＴＥＴＡ）、エチレンジシステイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＤＡＣＴ）、ビス（アミノエタンチオール）カルボン酸、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン－六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）、プリン、ピリジミジンおよびその誘導体
から選択される、請求項１に記載の錯体。

【請求項4】

ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドが、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、コンセンサス配列（ＧＨＨＰＨ）_ｎＧを有するキレート化ペプチド、ジエチレントリアミン－五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロプロピオン二酢酸（ＮＰＤＡ）、ニトリロイソプロピオン二酢酸（ＮＩＰＤＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭＡ）およびその誘導体から選択される、請求項１に記載の錯体。

【請求項5】

ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドが、ＮＴＡ、ＩＤＡおよびその誘導体を含むか、またはそれから選択される、請求項１に記載の錯体。

【請求項6】

金属カチオンが、遷移金属カチオンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項7】

錯体の金属カチオンが、二価、三価または四価金属カチオンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項8】

金属カチオンが、１０^－１ｓ^－１以下、好ましくは、１０^－２ｓ^－１以下の水リガンド交換速度を有する金属カチオンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項9】

金属カチオンが、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｐｔ^２＋、Ｐｔ^４＋、Ｒｕ^２＋、Ｒｕ^３＋、Ｌａ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｏｓ^２＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｒｕ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｃ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｓｍ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｃｅ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｎｄ^３＋、Ｐｍ^３＋、Ｄｙ^３＋、Ｈｏ^３＋、Ｅｒ^３＋、Ｔｍ^３＋、Ｙｂ^３＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋、Ｆｅ^２＋およびＬｕ^３＋からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項10】

金属カチオンが、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｉｒ^４＋、Ｐｔ^２＋、Ｐｔ^４＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｒｕ^２＋、Ｌａ^３＋、Ｒｕ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｒｅ^４＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋、Ｆｅ^２＋およびＯｓ^２＋からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項11】

金属カチオンが、Ｃｏ^３＋またはＰｔ^４＋である、請求項１から７のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項12】

錯体が［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）ＮＯ_３］^－錯体を含み、標識および／または担体がＮＴＡに結合される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項13】

標識が、フルオロフォア、診断剤、標的化部分、治療剤、ＰＥＧ分子、脂質、ビオチンおよび／またはその誘導体、タンパク質、ペプチド、毒素ならびに／またはチオール、アジド、アルキン、ニトロン、テトラジンおよびテトラゾールから選択される反応基を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項14】

標識が、フルオロフォアを含む、またはそれである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項15】

標識が、ビオチンまたはその誘導体を含む、またはそれである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項16】

担体が、ポリマー、ヒドロゲル、マイクロ粒子、ナノ粒子、スフィア（ナノおよびマイクロスフィアを含む）、ビーズ、量子ドット、人工物または固体表面である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項17】

金属カチオンキレート化ドメインが、キレート化リガンドと、標識および／または担体との間にリンカーを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の錯体。

【請求項18】

請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体を含む組成物。

【請求項19】

標的分子の標識化のための請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物の使用であって、標的分子が、タンパク質、ペプチドまたは核酸、好ましくは、錯体中の金属カチオンリガンドを交換することができるタンパク質またはＤＮＡを含み、さらにより好ましくは、前記標的分子が、配列［Ｈ_ｎＳ_ｍ］_ｋ（式中、Ｈは、ヒスチジン残基またはヒスチジン様残基であり、Ｓは、スペーサーアミノ酸残基であり、ｎは、いずれの場合も独立に１～４であり、ｍは、いずれの場合も独立に０～６であり、ｋは２～６である）の形態で少なくとも４個のヒスチジン残基またはヒスチジン様残基を含む、使用。

【請求項20】

標的分子の標識化のための請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物の使用であって、前記標的分子が、少なくとも２個のヒスチジン残基を含むヒスチジンリッチ領域を含有し、前記ヒスチジンリッチ領域が、前記少なくとも２個のヒスチジン残基を空間的に近接した状態にする標的分子の３次元フォールディングによって形成され、少なくとも２個のヒスチジン残基が、０～５オングストロームの距離を有し、アミノ酸配列中で連続していない、使用。

【請求項21】

ヒスチジンリッチ領域が、抗体のＦｃ領域である、請求項２０に記載の使用。

【請求項22】

標識および／または担体を、抗体、そのドメイン（例えば、Ｆｃ領域）またはその断片に結合させるための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物の使用。

【請求項23】

標識が毒素である、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

標的分子の標識化のための請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物の使用であって、前記標的分子が、ヒスチジン様残基が空間的に近接した状態になるときに標的分子の３次元フォールディング中に生じる、ヒスチジン様残基に富む領域を含有し、少なくとも２個のヒスチジン様残基が、０～５オングストロームの距離を有し、アミノ酸配列中で連続していない、使用。

【請求項25】

標的分子が、医薬品、診断剤、研究剤、化粧品および／または環境処理（例えば、水処理）のためのタンパク質である、請求項１９、２０または２４に記載の使用。

【請求項26】

標的分子が、ペプチドまたはタンパク質を含む、またはそれである、請求項１９、２０または２４に記載の使用。

【請求項27】

標的分子が、酵素、抗体などの標的化タンパク質、サイトカイン、脂肪酸輸送のためのＦＡＢＳなどの輸送タンパク質、フェリチンなどの貯蔵タンパク質、コラーゲンなどの機械的支持タンパク質、増殖因子、インスリンもしくはＴＳＨなどのホルモン、インターフェロン、糖タンパク質、合成的に操作されたタンパク質またはその断片を含む、またはそれである、請求項１９、２０、２４、２５または２６に記載の使用。

【請求項28】

標的分子が、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部配列領域に、ヒスチジン残基またはヒスチジン様残基を含む、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項29】

ヒスチジン残基またはヒスチジン様残基が、Ｈｉｓタグの形態で含まれ、好ましくは、Ｈｉｓタグが、２～１０個、好ましくは、４～８個、最も好ましくは、６～８個の連続する残基からなる、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項30】

医薬品、診断剤および／または化粧品を生産するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物の使用。

【請求項31】

ａ）金属カチオン、好ましくは、請求項５から１１のいずれか一項に記載の金属カチオン；
ｂ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと、標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン、好ましくは、請求項２から５および請求項１３から１７のいずれか一項に記載の金属カチオンキレート化ドメイン
を含むキット。

【請求項32】

請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体を生産するための方法であって、溶液中で、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）請求項１のｂ）に記載の金属カチオンリガンド；および（ｉｉｉ）請求項１のｃ）に記載の金属カチオンキレート化ドメインをインキュベートするステップを含む、方法。

【請求項33】

請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体を収集および／または精製するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

金属カチオンキレート化ドメインが、請求項２から５および請求項１３から１７のいずれか一項に記載の金属カチオンキレート化ドメインである、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

金属カチオンが、請求項５から１１のいずれか一項に記載の金属カチオンである、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

金属カチオンがＰｔ^４＋であり、金属カチオンリガンドがＮＯ_３ ^－錯体であり、金属カチオンキレート化ドメインがＮＴＡを含む、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項37】

請求項１から１７のいずれか一項に記載の錯体または請求項１８に記載の組成物を、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の標的分子である標的分子と共にインキュベートするステップを含む、標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法。

【請求項38】

標識および／または担体が連結された標的分子を回収および／または精製するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

溶液が、４．０～９．５、好ましくは、５．５～８．０のｐＨを有する、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

インキュベーションが、少なくとも１０秒、好ましくは、１分、最も好ましくは、１０分にわたって実施される、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

インキュベーションが、０～９５℃、好ましくは、０～６０℃、最も好ましくは、０～４２℃の温度で実施される、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

インキュベーションが、水または水性溶液中で実施される、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

インキュベーションが、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＳ、アセトニトリルおよびイソプロパノールからなる群から選択される１つまたは複数の有機溶媒を含む溶液中で実施される、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

インキュベーションが、１つまたは複数のＧｏｏｄの緩衝物質、Ｔｒｉｓ、リン酸イオンおよび／または炭酸イオン／重炭酸イオンを含有する水性溶液中で実施される、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

インキュベーションが、好ましくは、ＣａＣｌ_２の形態で提供される、Ｃａ^２＋の存在下で実施される、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

インキュベーションが、１つまたは複数の緩衝物質を含有する水性溶液中で実施され、緩衝物質が、アミン、カルボン酸、芳香族アミンおよび／またはリン酸基を含まない、請求項３７から４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

インキュベーションが、ＡＣＥＳ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＢｉｓＴｒｉｓプロパン、ホウ酸、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＴＥＳ、炭酸／重炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）およびＴｒｉｓからなる群から選択される１つまたは複数の緩衝物質を含有する水性溶液中で実施される、請求項３７から４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

インキュベーションが、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、リン酸緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）およびＴｒｉｓからなる群から選択される１つまたは複数の緩衝物質を含有する水性溶液中で実施される、請求項３７から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

インキュベーションが、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝物質を含む水性溶液中で実施される、請求項３７から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

標識および／または担体の存在下でのＨ_２Ｏ_２を用いた処理などの酸化ステップを含まない、請求項３７から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

請求項３７から５０のいずれか一項に記載の方法によって得られる標識された、または担体に結合した標的分子。

【請求項52】

請求項５１に記載の標識された、または担体に結合した標的分子を含む組成物。

【請求項53】

研究試薬としての、請求項５１に記載の標識された、もしくは担体に結合した標的分子または請求項５２に記載の組成物の使用。

【請求項54】

薬剤としての使用のための、請求項５１に記載の標識された、もしくは担体に結合した標的分子または請求項５２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質などの標的分子を標識および／または担体にコンジュゲートする／結合させるための手段および方法に関する。具体的には、本発明は、（ｉ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン、ならびに（ｉｉ）キレート化リガンドと、標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメインを配位する金属カチオンを含む錯体を提供する。この錯体は、標識および／または担体を、標的分子、好ましくは、タンパク質に結合させるために使用することができる。本発明の錯体を介する標識または担体の結合は、金属カチオンの配位圏中の主要リガンドとしての標的分子との生成物錯体が形成されるような、金属カチオンリガンドと、標的分子の配位基との置き換えを含む。したがって、本発明はまた、標識および／または担体の標的分子への結合を含む使用および方法も提供する。また、本発明の標識化および／または担体結合方法によって得られる生成物ならびにその使用も提供される。本発明はさらに、本発明の錯体を生産するための方法および本発明の錯体を生産するための成分を含むキットに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、化学的に修飾されたタンパク質が、多くの生物学的適用にとって非常に重要な手段となってきた。蛍光に基づくアッセイ、ウェスタンブロットおよびタンパク質精製などの生命科学研究における様々な生化学および細胞技術は、標識または固定されたタンパク質に依拠する。しかし、バイオ医薬品（例えば、抗体－薬物コンジュゲート、ＰＥＧ化および脂質化）、バイオセンサー、生体イメージングおよびさらには医用工学を含む医療診断の開発のためにも、タンパク質コンジュゲーションは重要な生産ステップである。それにより、あらゆる適用分野において、タンパク質機能を妨げない、単純で、安定で、部位特異的な修飾方法が望ましい。さらに、核酸などの他の生体分子も、標識されるか、または担体に結合されることが多い。

【0003】

古典的な標識化／固定化手順では、低分子は、迅速かつ効率的な方法で、例えば、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）由来試薬またはマレイミドを介して、目的の非修飾タンパク質中の反応基（リシンにおける一次アミンまたはシステインにおけるチオールなど）に共有的に結合される（ＣｈｅｎおよびＷｕ、２０１６）。しかしながら、これらの手法は全て、タンパク質中のこれらの反応部位の遍在的な利用可能性のため、固有の欠点を有する。したがって、部位特異性の欠如、不均一な固定化／標識化化学量論ならびにさらには、タンパク質機能の脱安定化および喪失と共に、大きなバッチ間変動性をもたらす、これらの標識化反応の制御は限られる（Ｌｉｎｄｈｏｕｄら、２０１２）。この問題に対処するために、近年では、部位特異的タンパク質コンジュゲーションのためのいくつかの新しい技術が開発された。

【0004】

それにより、最も顕著なものは、ビオチン部分が、ビオチンリガーゼＢｉｒＡを含む酵素触媒作用によって短いペプチドタグに部位特異的に結合される、Ａｖｉタグシステムである（Ｔｉｒａｔら、２００６）。しかし、他の方法でも、ソルターゼ（Ｐｏｐｐら、２００７）、トランスグルタミナーゼ（ＬｉｎおよびＴｉｎｇ、２００６）、リポ酸リガーゼ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｓｕａｒｅｚ，Ｍ．ら、２００７）およびホスホ－パンテイニル－トランスフェラーゼ（Ｙｉｎら、２００５）などの酵素が、短い認識ペプチドタグを介するタンパク質の配向的コンジュゲーションを触媒するために使用される。

【0005】

別の手法は、非天然アミノ酸を介した、テトラチン、アルキン、アジドまたはノルボルネンなどの生体直交型官能基のリボソーム組込みによる遺伝子コードの拡大である（Ｏｕら、２０１１；Ｄｅｉｔｅｒｓら、２００３；Ｌａｎｇら、２０１２）。特異的連結化学を使用して、標的タンパク質を、非常に正確な方法で組み込まれる基において修飾することができる。

【0006】

あるいは、非天然アミノ酸に対して、タンパク質表面上の独特の反応性および低い存在量を示す従来のアミノ酸を、部位特異的標識化のために使用することができる。この文脈における多くの方法は、選択的標的化のために接近可能なチオール基を提供する操作されたシステイン置換を使用する（Ｊｕｎｕｔｕｌａら、２００８；Ｃａｌら、２０１４）。表面露出したアミノ酸だけでなく、Ｎ末端アミノ酸も、タンパク質コンジュゲーションのための有用な反応点であってよい。例えば、Ｎ末端システインを、チオエステル誘導体との天然の化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎら、１９９４）によって選択的に標的化するか、または短いＮ末端タグ中に組み込まれる場合、タンパク質を、ペルフルオロ芳香族試薬（Ｚｈａｎｇら、２０１６）によって標識することができる。あるいは、標的化可能な独特のアルデヒド基をもたらすＮ末端セリンの酸化（ＧａｅｒｔｎｅｒおよびＯｆｆｏｒｄ、１９９６）によって、またはＮ末端グリシン－ヒスチジンタグのアシル化（Ｍａｒｔｏｓ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏら、２０１８）によって、タンパク質を部位特異的にコンジュゲートすることができる。

【0007】

上記方法は、それらが他の適用のために使用されることがあまりない特殊な分子タグ、非天然アミノ酸および／またはさらなるアミノ酸が組み込まれる必要があるという共通点がある。したがって、骨の折れる遺伝子操作およびタンパク質の再発現が必要であることが多い。さらにより重要なことには、これらの方法の主に多段階の化学的コンジュゲーション反応は、タンパク質の安定性および機能に負に影響し得るかなり過酷な反応条件で実施されることが多い。

【0008】

さらに、タンパク質生化学の分野で広く使用される親和性タグであるＨｉｓタグとの相互作用に依拠するいくつかの標識化戦略が開発された。Ｈｉｓタグは、通常、６～８個のヒスチジン部分からなり、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびヒスチジンのイミダゾール基のＮｉ^２＋媒介性配位に基づく確立された精製技術（Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８８）のため、Ｈｉｓタグ付タンパク質は普及している。［Ｎｉ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓタグ）］錯体の形成によってＨｉｓタグ付タンパク質をＮｉ^２＋－ＮＴＡ基質に結合する原理も、表面上でのタンパク質の固定化（Ｋａｎｇら、２００７；Ｒｕｓｍｉｎｉら、２００７）、ならびにフルオロフォアおよび他の分子のタンパク質へのコンジュゲーション（Ｋａｍｏｔｏら、２００８）などの多くの他の適用のために適合された。しかしながら、これらの方法の主な欠点は、改良されたトリス－ＮＴＡ試薬（Ｈｕａｎｇら、２００９）を使用する場合であっても、これらのＮｉ^２＋媒介性錯体の低い親和性および急速なリガンド交換速度である。ＥＤＴＡまたはイミダゾールのような、既に少量の一般的なキレーターは、錯体を破壊し、タンパク質コンジュゲーションを妨害する。

【0009】

いくつかのさらなる文献は、速度論的に不活性でもなく、さらには不安定性を必要ともしない同様の錯体を記載する；例えば、ＷＯ２００５／１１２９７７Ａ２、ＷＯ０３／０７２１４３Ａ１、ＷＯ２００５／１２０７００Ａ２、ＷＯ２００９／１１４５２０、ＷＯ９８／０６７３９Ａ１、米国特許第４，５６９，７９４号Ａ、Ｂｌｏｃｋら、２００９、ＷＯ０３／０１８７５６Ａ２、ＵＳ２０１０／０６９２９３Ａ１、ＷＯ２００４／１０４０２３Ａ２、ＷＯ０２／３３０４４Ａ２、ＵＳ２０１３／１３１２８３Ａ１、ＷＯ２０１１／０３１７７１Ａ１、ＵＳ２００８／０１５２６３を参照されたい。

【0010】

ＷＯ２００３／０７２１４３Ａ１も、担体がヒスチジンタグを有するポリペプチドを含んでもよい、担体と、目的の活性薬剤とを接続するための金属架橋の使用を記載する。
Ｎｉ^２＋媒介性錯体の制限を克服するために、一般的に使用されるＮｉ^２＋またはＣｏ^２＋の代わりにＣｏ^３＋が、錯体形成を媒介するための金属イオンとして提唱された（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３；Ｈａｌｅ、１９９５）。４個の配位部位がＮＴＡなどのキレーターによって占有され、２個がＨｉｓタグのヒスチジンによって占有される、Ｃｏ^３＋の低スピン８面体常磁性錯体（ｅ_ｇ ^６ｔ_２ｇ ^０）の使用により、Ｈｉｓタグ付タンパク質のＮＴＡ部分への速度論的に不活性な連結を達成することができる。Ｃｏ^３＋に基づく錯体は、Ｎｉ^２＋に基づく錯体（３×１０^６ｓ^－１）よりも有意に低いリガンド交換速度（約１０^－６ｓ^－１）を有することが見出された（ＬｉｐｐａｒｄおよびＢｅｒｇ、１９９４）。

【0011】

しかしながら、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体のリガンド交換速度は極端に低いが、逆に、錯体の形成も遅い。したがって、間接的で多段階の調製方法は現在、そのような［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を生産するための選択方法である（ＷＯ２０１４／０７２５２５Ａ１；ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３；Ｈａｌｅ、１９９５；図２Ａ中の反応スキームの略図を参照されたい）。第１に、全体の［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の過酸化水素を用いた酸化ステップ後に、Ｃｏ^２＋とのプレ錯体が形成され、Ｃｏ^２＋は最終的な錯体中で直接的にＣｏ^３＋に酸化される。この方法は非常に速く、単純であるが、タンパク質の存在下での酸化プロセスは、アミノ酸酸化のため、タンパク質機能の喪失を引き起こし得る。さらに、過酸化水素と、コバルトイオンとの組合せはまた、タンパク質骨格の切断または分解をもたらし、Ｈｉｓタグの除去および標識を含む錯体からのタンパク質の遊離をもたらし得る、フェントン反応を誘発し得る（Ａｎｄｂｅｒｇら、２００７）。

【0012】

酸化ステップを含む間接的で多段階の調製方法を用いて生産されたＨｉｓタグ付タンパク質とのＣｏ^３＋に基づく錯体も、表面上にタンパク質を固定化するために用いられてきた（Ｗｅｇｎｅｒら、２０１６；Ｄｉ Ｒｕｓｓｏら、２０１８）。しかし、表面固定化の文脈でも、この方法は、タンパク質機能に負に影響し、また、ある特定の表面構造を妨害し得る、過酷な酸化剤Ｈ_２Ｏ_２の使用に悩まされる。

【0013】

上記の文献と同様、ＥＰ０４９７５８５Ａ２は、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体が形成された後にのみ、Ｃｏ^２＋のＣｏ^３＋への酸化を用いる。［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を、数時間にわたってＯ_２ガスと接触させて、Ｃｏ^２＋のＣｏ^３＋への酸化を容易にする。しかしながら、不安定なタンパク質は、高濃度の酸素への数時間の曝露によって損傷され得ることが当業界で公知である。さらに、本発明者らは、前記方法を再現することができなかった。すなわち、本発明者らは、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体をＯ_２ガスと接触させた場合、安定な錯体を観察しなかった。

【0014】

ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａは、タンパク質の存在下での酸化を回避することができる、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タグ）（Ｈ_２Ｏ）］錯体を形成させるための手順を提唱した（ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａ、２００６）。この手順では、Ｃｏ^２＋中心を、ＩＤＡとのプレ錯体中で過酸化水素を用いてＣｏ^３＋に酸化した後、得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_３］^＋をＨｉｓタグ付タンパク質と配位させて、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓタグ）（Ｈ_２Ｏ）］錯体を形成させる（反応スキームの略図については図２Ｂを参照されたい；ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａ、２００６）。しかし、この方法は依然として大きな欠点を有する。水リガンドとのＣｏ^２＋に基づくプレ錯体と比較して、水リガンドとのＣｏ^３＋に基づくプレ錯体は、有意に遅く配位し、添付の実施例において本発明者らによって示されるように、特に、多くのタンパク質にとって必要とされる低温では、錯体形成の最終的な有効性も低い。さらに、ＩＤＡコンジュゲートの存在下での過酸化水素の使用は、酸化によって、ＩＤＡコンジュゲートに結合させようとするコンジュゲート、すなわち、標識および／または担体の機能に依然として負に影響し得る。例えば、フルオロフォアの蛍光は、酸化時に減少し得る。さらに、プロトコールは、さらなる下流の適用のために過酸化水素からの酸化したプレ錯体の精製を必要とする。これらの精製プロセスは、材料および時間を消費するものであり、下流の適用において修飾しようとするタンパク質を酸化し、損傷し得る残留酸化剤のリスクを負う。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

かくして、本発明の基礎となる技術的課題は、標識／担体および標的分子の機能および／または安定性の阻害を防止する容易かつ効率的な様式で錯体形成によって標識および／または担体の、タンパク質などの標的分子への結合を可能にする改良された手段および方法の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0016】

この技術的課題は、特許請求の範囲で特徴付けられ、本明細書の以下に提供される実施形態の提供によって解決される。
第１の態様では、本発明は、
ａ）金属カチオン；
ｂ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体の形態の化合物を提供する。

【0017】

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の錯体は、標識および／または担体を、Ｈｉｓタグ付タンパク質などの標的分子に結合させるための有利な手段であることを見出した。標識化は、錯体の第１配位圏中での、錯体の金属カチオンリガンドの標的分子との交換によって達成される。この交換により、キレート化リガンドと、第１のリガンドとしての標識および／または担体と、第２のリガンドとしての標的分子とを含む金属カチオンキレート化ドメインを有する新しい錯体が形成される。遷移金属カチオンＣｏ^３＋またはＰｔ^４＋を含む本発明の錯体を用いる、添付の実施例に例示されるように、本発明の錯体は、速度論的に不活性な様式で、標識および／または担体の標的分子への結合を可能にする。ヒスチジン残基は、特に、Ｃｏ^３＋またはＰｔ^４＋などの遷移金属との、金属錯体の形成に関与し得るリガンドであるため、好ましい標的分子は、Ｈｉｓタグ付タンパク質またはヒスチジンリッチ領域を有するタンパク質である。添付の実施例はまた、標的分子によって交換される金属カチオンリガンドとして硝酸イオンを使用することができることも示す。ヒスチジンタグは、２座および／または多座リガンドとして機能することができる。

【発明を実施するための形態】

【0018】

添付の実施例に示されるように、本発明の手段および方法は、特に、金属カチオン、硝酸イオン（金属カチオンリガンドとしての）およびキレート化リガンドを含む金属カチオンキレート化ドメインならびに標識および／または担体を含む、および／またはそれからなる新規性かつ進歩性のある錯体に関する。「硝酸イオン」の代わりに「炭酸イオン」（ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－）を用いる対応する錯体を用いることもできることが、本明細書の開示ならびに添付の実施例から明らかである。したがって、本発明は、対応する「硝酸イオン錯体」に基づくが、対応する「炭酸イオン錯体」も本明細書に記載される。本発明の文脈における炭酸イオンおよび硝酸イオンは、両金属カチオンが対応するプレ錯体からの遊離後にプロトン化されるため、等価であると考えてよい。さらなる詳細は、本明細書の以下に提供される。

【0019】

本発明の錯体の利点は、Ｈ_２Ｏ_２を使用する酸化反応が、標識および／または担体が存在する錯体の生産ステップにとっても、標識および／または担体の標的分子への結合にとっても必要ではないということである。Ｈ_２Ｏ_２処理などの酸化ステップの回避は、酸化による標的分子、標識および／または担体の機能を妨害することなく、標識および／または担体の結合を達成することができる利点を有する。これは、金属錯体媒介性標識化および／または担体結合を、特に、タンパク質などの酸化感受性標的分子に対しても、より広く適用可能にする。さらに、それはまた、酸化剤を除去するための煩わしく時間消費的な洗浄ステップの必要性を低減させる。

【0020】

低いリガンド交換速度を有するＣｏ（ＩＩＩ）または他の遷移金属について、いかなる中間ステップも用いない直接的な錯体形成は極端に遅く、非効率的である。したがって、これらの速度論的に不活性な錯体の形成のための現在の最先端の方法は、２段階の手順に焦点を合わせる。それにより、最初に、速度論的に不安定な酸化状態にある金属中心（例えば、Ｃｏ（ＩＩ））が形成された後、一般的には過酸化水素を用いる酸化プロセスが行われる。このように、酸化プロセスはタンパク質、金属結合ドメインおよび／または担体の予測不可能な機能障害をもたらし得る。

【0021】

これらの制限を克服するために、本発明は、速度論的に不活性な錯体の直接的形成のためのプロセスを記載する。所望の酸化状態にある金属から直接出発して、タンパク質、金属結合ドメインまたはタンパク質の存在下での酸化試薬の使用を回避することができる。それにより、選択された金属を、炭酸イオンまたは硝酸イオンである３つの金属カチオンリガンドと予め錯体化された金属結合ドメインに導入する。第１のステップでは、２つの金属カチオンリガンドを、金属カチオンキレート化ドメインによって置き換えた後、タンパク質の配位を介して最後の金属カチオンリガンドの置き換えを行う。金属と、炭酸イオンまたは硝酸イオンとの予備配位は、より高い錯体形成効果と対になった有意により速い錯体形成速度をもたらす、最終的な錯体の形成を容易にする。炭酸イオンまたは硝酸イオンリガンドが配位されたプレ錯体を使用する改善された直接錯体形成プロセスは、これらの金属カチオンリガンドが、プレ錯体からの遊離後にプロトン化される能力を起源とする。炭酸イオンの場合、リガンド遊離時のプロトン化は形成プロセスをさらに増強し得るガス形成をもたらすことができる。したがって、本発明者らによって示されるように、炭酸イオンまたは硝酸イオンプレ錯体を使用して、水を含む他のリガンドよりも有意に速く、より効率的に速度論的に不活性な金属錯体を直接形成させることができる。

【0022】

上記のＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ（同箇所）ならびにＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａ（同箇所）の先行技術では、Ｃｏ^３＋媒介性錯体の形成によってタンパク質を標識するための方法が記載される。しかしながら、本発明とは対照的に、これらの方法は両方とも、Ｈ_２Ｏ_２を使用する酸化ステップを含んでいた（図２ＡおよびＢを参照されたい）。酸化ステップは、標識（例えば、フルオロフォア）および／または担体および標識しようとするタンパク質の安定性および機能に負に影響し得る有害な処理である（添付の実施例を参照されたい）。本発明の錯体は、これらの先行技術のプロトコールに含まれる酸化ステップの回避を可能にする。さらに、本発明の錯体は、標識および／または担体を金属カチオンによって媒介される相互作用によって標的分子に結合させることができるように、迅速かつ効率的に、標的分子、好ましくは、Ｈｉｓタグ付タンパク質またはヒスチジンリッチ領域を有するタンパク質に結合する金属を配位させる。標識および／または担体は、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚならびにＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａによって記載された同様の速度論的に不活性な様式で最終生成物中の標的分子に結合される。標的分子の結合は、金属カチオン配位リガンドを標的分子と交換して、本明細書では「生成物錯体」と称される、新しい錯体を形成させることによって達成される。ＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンまたは硝酸イオンである金属配位リガンドを選択することによって、本発明者らは、金属カチオンキレート化ドメインを含む標識／担体と、金属カチオンに配位した標的分子とを含む「生成物錯体」を、非常に効率的かつ迅速に形成させることができることを見出した。特に、本発明者らは、標的分子の結合が、特に低温で、ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａの方法に記載されたように、金属カチオンリガンドとして水を使用する錯体と比較して、より完全で、より速いことを見出した。かくして、本発明の錯体は、標的分子（例えば、Ｈｉｓタグ付タンパク質）に標識および／または担体をより速く、より完全に結合させる。要するに、本発明の錯体の重要な利点は、錯体が迅速かつ効率的な結合を可能にし、同時に、標識および／または担体の存在下で酸化試薬を使用するための要求を防止するということである。

【0023】

本発明の錯体またはそれを含む組成物は、限定されるものではないが、フルオロフォア、毒素、診断部分、標的化部分、安定化ドメインおよび／または反応基を用いたタンパク質の標識化などのいくつかの適用において特に有用である。錯体を使用して、特に、毒素で標識された抗体などのバイオ医薬品、および診断剤を製造することもできる。標識化は、速度論的に不活性であり（すなわち、リガンド交換速度が１０^－１ｓ^－１であるか、またはそれより低い）、Ｎｉ^２＋またはＣｏ^２＋に基づく錯体を用いた場合に問題となることが多いリガンド交換を防止することができる。標識化は、Ｎｉ^２＋またはＣｏ^２＋に基づく錯体を用いる場合よりも、さらに熱力学的に安定である。

【0024】

本発明の錯体を使用して、標的分子、好ましくは、タンパク質の担体への安定な結合を達成することもできる。担体は、例えば、表面、ビーズ、ナノ粒子、人工物（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）、量子ドット、ポリマー、ヒドロゲル、マイクロ粒子、スフィア（例えば、ナノおよび／もしくはマイクロスフィア）またはその組合せであってもよい。例えば、実施例１９は、Ｈｉｓタグ付ＧＦＰを、金ナノ構造ガラス表面に結合することができることを示す。最初に、金ナノ構造ガラス表面を、金粒子とチオール基との相互作用によってＮＴＡ－リンカー－チオール試薬をカップリングすることによって、ＮＴＡで官能化する。続いて、本発明の錯体を、表面上で作製し、Ｈｉｓ－ＧＦＰを結合させる（図２１）。さらに、非限定的な実施例２０において、Ｈｉｓタグ付ＧＦＰを、本発明の錯体にリンカーを介してカップリングされたビオチン基に結合させることができることが示される。続いて、ビオチン基、リンカー、本発明の錯体およびＨｉｓタグ付ＧＦＰを含む生成物を、ストレプトアビジン基を含むビーズにカップリングした（図２２）。

【0025】

添付の実施例は、様々な（Ｈｉｓタグ付）タンパク質を、本発明の錯体を使用してビーズにカップリングすることができることを示す。１つの試験したタンパク質（ソルターゼＡ）について、酵素活性が固定化の際に保存されることが証明された（実施例１４、図１６Ｃ）。また、抗体のＦｃ領域のヒスチジンリッチ領域を使用して、抗体を本発明の錯体を介してビーズにカップリングすることができることも示される。図１６Ｄに示されるように、固定された抗体は、その抗原に結合する能力を保持する。

【0026】

本発明の錯体が、標識しようとする標的分子ならびに／またはＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚならびにＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａによって記載されたような標識および／もしくは担体の存在下での酸化ステップを必要とすることなく、迅速かつ効率的な金属カチオン媒介性標識化または標的分子への担体結合を達成することができることにより、本発明の錯体は、標的タンパク質ならびに／または標識および／もしくは担体の酸化を回避することが典型的には非常に重要である上記の適用にとって特に好適なものになる。

【0027】

本発明の錯体を、溶液中で、または固体として提供することができる。本発明の錯体は、特に、溶液中で提供される場合、電荷を担持してもよい。電荷は、金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメインの電荷に依存するであろう。例えば、金属カチオンとしてのＣｏ^３＋、金属カチオンリガンドとしてのＣＯ_３ ^２－、およびキレート化リガンドとしてのＮＴＡと非荷電標識とからなる金属カチオンキレート化ドメインを含む錯体は、電荷「２－」（すなわち、二価の負電荷）を有する。錯体を、対抗イオンと共に提供することもできる。錯体が１つまたは複数の対抗イオンをさらに含む場合、それを固体として提供することもできる。対抗イオンは、好ましくは、一価イオンである。特に好ましいものは、アルカリ金属の群に由来する一価イオンである。最も好ましいものは、錯体が負に荷電する場合、対抗イオンとしてのＮａ^＋およびＫ^＋である。

【0028】

本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメイン（あるいは、第１のリガンドまたはキレーターと称してもよい）は、キレート化リガンドを含む。キレート化リガンドは、錯体の金属カチオンによって配位させることができる少なくとも２つの結合部位を提供することによって錯体の金属カチオンとの配位を媒介する（すなわち、換言すれば、２座または多座である）。好ましい実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、３座（例えば、ＩＤＡ）または４座（例えば、ＮＴＡ）であってもよい。「３座」とは、キレート化リガンドが、金属イオンに基づく錯体中でドナー原子（すなわち、Ｌｅｗｉｓドナー）として機能することができる３個の原子を含むことを意味する。「４座」とは、キレート化リガンドが、金属イオンに基づく錯体中でドナー原子（すなわち、Ｌｅｗｉｓドナー）として機能することができる４個の原子を含むことを意味する。したがって、換言すれば、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、好ましくは、錯体の金属カチオンによって配位させることができる、３個または４個、より好ましくは、４個の結合部位を有してもよい。理論によって束縛されるものではないが、錯体中でドナー原子（すなわち、Ｌｅｗｉｓドナー）として機能することができるより多くの原子を有するキレート化リガンドの使用は、金属カチオンが錯体中でより強く結合するという利点を有する。より強力な結合は、錯体からの金属カチオンの望ましくない遊離、すなわち、錯体の望ましくない分解の頻度を防止する。これは、本発明の使用および方法によって形成される、本発明の錯体ならびに「生成物錯体」にも適用される。一般に、３座および４座錯体が、本明細書では好ましい。添付の実施例によれば、４座が最も好ましい。

【0029】

本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメインは、標識および／または担体、すなわち、標的分子に結合させようとする機能的部分をさらに含む。キレート化リガンドを、標識および／もしくは担体と直接的に、またはリンカーを介して連結することができる。

【0030】

金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、原理的には、当業界で公知の任意のキレート化リガンドであってもよい。好ましいキレート化リガンドは、少なくとも１つもしくは複数のカルボン酸基および／または１つもしくは複数のアミン基を含む。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、ポリカルボン酸、ポリアミンまたはアミノポリカルボン酸であってもよい。

【0031】

例示的であるが、非限定的なキレート化リガンドは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８７）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）（Ｐｏｒａｔｈら、１９７５、Ａｒｎｏｌｄ、１９９１、Ｆｒａｎｚｒｅｂら、２００６）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）（ＰｏｒａｔｈおよびＯｌｉｎ、１９８３）、キレート化ペプチド（例えば、コンセンサス配列（ＧＨＨＰＨ）_ｎＧ（式中、Ｇはグリシンを指し、Ｈはヒスチジンを指し、Ｐはプロリンを指し、ｎは１～３の整数である）を有するペプチド；配列番号１～３も参照されたい）（ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ、１９９２）、キレート化タンパク質（例えば、ｈｉｓタグ付タンパク質もしくは本明細書の他の箇所に定義される間隔のあるＨｉｓタグを有するタンパク質）またはカジスチン（Ｈａｙａｓｈｉら、１９８６）、トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）（ＳｏｂｉｅｓｃｉａｋおよびＺｉｅｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ、２０１０）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（ＲａｈｈａｌおよびＲｉｃｈｔｅｒ、１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、１９８２、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、１９８３）、フィトケラチン（Ｓｏｎｇら、２０１４）、カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭＡ）（Ｐｏｒａｔｈら、１９７５、Ｈｕｔｓｃｈｅｎｒｅｉｔｅｒら、２００３）、タンニン酸（ＴＡ）（Ｚｈａｎｇら、２０１５、Ｈａｎ，Ｌｉｕら、２０１７）、ポルフィリン（Ｓｈａｏら、２０１５）、ジピリジルアミン（ＤＰＡ）（Ｃｌｅｒａｃら、２０００）、フィチン酸（ＥｖａｎｓおよびＰｉｅｒｃｅ、１９８２）、ニトリロプロピオン二酢酸（ＮＰＤＡ）（Ｍｉｔｓｕｏら、１９７０）、ニトリロイソプロピオン二酢酸（ＮＩＰＤＡ）（Ｍｉｔｓｕｏら、１９７０）、Ｎ－（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）（ＷｕｂｓおよびＢｅｅｎａｃｋｅｒｓ、１９９３、Ｇｒａｆｆら、１９９５）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ＷｕｂｓおよびＢｅｅｎａｃｋｅｒｓ、１９９３）、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）（Ｂｏｒｄｅｒら、１９７６、Ｏｋａｚａｋｉら、２０１１）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）（Ｋｌｉｎｅら、１９９１、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２００３）、１，４，７－トリス（カルボキシメチル）－１０－（２’－ヒドロキシプロピル）－１，４，７，１０－テトラアゾシクロデカン（Ｆｉｌｉｐｐｉら、２０１４）、１，４，７－トリアザシクロノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）（Ｓｉｍｅｃｅｋら、２０１２）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラ－デカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＴＥＴＡ）（ＹｕａｎｆａｎｇおよびＣｈｕａｎｃｈｕ、１９９１）、エチレンジシステイン（Ｋｏｎｇら、２０１０）、ビス（アミノエタンチオール）カルボン酸（Ｓｕｎら、１９９６）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）（ＨａｒｊｕおよびＲｉｎｇｂｏｍ、１９７０、Ａｃｈｏｕｒら、１９９８）、１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＤＡＣＴ）（Ｋｒｚｅｋら、２００７）、リン酸イオン（Ｒｉｚｋａｌｌａら、１９８０）、１，４，７－トリアザシクロナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）（Ｓｔｒａｎｄら、２０１３；Ｓｉｍｅｃｅｋら、２０１２）、１－（１，３－カルボキシプロピル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）（Ｓｔｒａｎｄら、２０１３）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（Ｐａｇｅｓら、２０１５）、リボ核酸（ＲＮＡ）（Ａｌｂｅｒｔｉら、２０１６）、プリン（ＣｉｎｉおよびＧｉｏｇｉ、１９８７）およびピリジミジン（ＳａｈａおよびＭｕｋｈｅｒｊｅｅ、１９８４）である。

【0032】

したがって、ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインに含まれるキレート化リガンドを、例えば、以下の非限定的な一覧：ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）、コンセンサスアミノ酸配列（ＧＨＨＰＨ）_ｎＧ（式中、Ｇはグリシンを指し、Ｈはヒスチジンを指し、Ｐはプロリンを指し、ｎは１～３の整数である；配列番号１～３も参照されたい）を有するペプチドなどのキレート化ペプチドまたはカジスチン、トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）、ジエチレントリアミン－五酢酸（ＤＴＰＡ）、フィトケラチン、カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭＡ）、リン酸イオン、タンニン酸（ＴＡ）、ポルフィリン、ジピリジルアミン（ＤＰＡ）、フィチン酸、ニトリロプロピオン二酢酸（ＮＰＤＡ）、ニトリロイソプロピオン二酢酸（ＮＩＰＤＡ）、Ｎ－（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリス（カルボキシメチル）－１０－（２’－ヒドロキシプロピル）－１，４，７，１０－テトラアゾシクロデカン、１，４，７－トリアザシクロナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１－（１，３－カルボキシプロピル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＴＥＴＡ）、エチレンジシステイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＤＡＣＴ）、ビス（アミノエタンチオール）カルボン酸、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン－六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）、プリン、ピリジミジンおよびその誘導体から選択することができる。

【0033】

これらのキレート化リガンドは全て、それらが金属カチオンとの配位錯体を形成するためのＬｅｗｉｓ塩基ドナーとして作用することができる少なくとも２個の配位部位を提供する（すなわち、キレート化剤である）という共通点を有する。したがって、一実施形態では、キレート化リガンドは、金属カチオンに配位することができる、すなわち、それらがルイス塩基として作用することができる、少なくとも２、３、４、５個またはそれより多い化学基を有してもよい。

【0034】

好ましい実施形態では、ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、コンセンサス配列（ＧＨＨＰＨ）_ｎＧ（式中、ｎは１～３である；配列番号１～３も参照されたい）を有するキレート化ペプチド、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロプロピオン二酢酸（ＮＰＤＡ）、ニトリロイソプロピオン二酢酸（ＮＩＰＤＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭＡ）およびその誘導体から選択される。

【0035】

別の好ましい実施形態では、キレート化リガンドは、アミノポリカルボン酸であってよい。好ましくは、アミノポリカルボン酸は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、エチレン－ビス（オキシエチレン－ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、およびトリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）、トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）またはその誘導体から選択される。

【0036】

特に好ましい実施形態では、ｃ）の金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、ＮＴＡ、ＩＤＡ、ＴＡＬＯＮおよびその誘導体を含むか、またはそれから選択される。キレート化リガンドとして最も好ましいのは、ＮＴＡおよびＩＤＡであり、特に最も好ましいのは、ＩＤＡである。ＮＴＡは、４座リガンドであり、かくして、金属カチオンに特に強力に結合する。ＩＤＡは、３座であり、これも金属カチオンに強力に結合するが、ＮＴＡよりは弱い。金属カチオンへの強力な結合は、錯体の望ましくない分解または標的分子からの標識および／もしくは担体の遊離をもたらす金属カチオンの遊離を防止する。ある特定の実施形態では、高い安定性のパーセンテージを有する錯体を、ＮＴＡとの錯体よりも速く形成させることができるため、ＩＤＡが好ましい。第２の金属カチオンリガンドは、依然として金属に半分配位したままであるが、４座金属結合ドメインを使用する場合には、それは完全に置換されるため、３座金属結合ドメインについて、タンパク質の配位は、さらに容易になると推定される。部分的配位のため、リガンドを、タンパク質の１個のヒスチジン残基によって容易に置換することができる。ここで、ごく近くにある１個または２個の他のヒスチジン残基も、最後のリガンドを遊離し、安定な錯体を形成することができる。

【0037】

キレート化リガンドの文脈では、用語「誘導体」は、同じリード構造を有するが、さらなる化学反応基によって置換されていてもよい化合物を指す。好ましくは、この文脈における用語「誘導体」は、カルボキシル、アミン、アジド、アクリレート、マレイミド、ヒドロキシル、チオール、芳香族、脂肪族、ジスルフェート、およびビニルスルホン基からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる化学基による置換を含む。誘導体という用語はまた、同位体置換を有する分子を含んでもよい。「同位体置換」は、１個または複数の原子が同位体標識されることを意味する。

【0038】

金属カチオンは、好ましくは、それぞれの酸化状態で安定である金属カチオンである。酸化状態は、用いられる金属に応じて、＋２、＋３または＋４であってもよい。したがって、錯体の金属カチオンは、二価、三価または四価金属カチオンであってもよい。好ましい実施形態では、カチオンは、三価金属カチオン（例えば、Ｃｏ^３＋）である。別の好ましい実施形態では、カチオンは、四価金属カチオン（例えば、Ｐｔ^４＋）である。

【0039】

金属カチオンは、例えば、Ｃｏ^３＋などの、低スピン８面体常磁性錯体（ｅ_ｇ ^６ｔ_２ｇ ^０）を形成することができる金属カチオンであってもよい。したがって、一実施形態では、錯体は、低スピン８面体常磁性錯体（ｅ_ｇ ^６ｔ_２ｇ ^０）、好ましくは、Ｃｏ^３＋低スピン８面体常磁性錯体（ｅ_ｇ ^６ｔ_２ｇ ^０）であってもよい。金属カチオンは、例えば、Ｐｔ^４＋などの、反磁性８面体低スピン錯体（ｔ_２ｇ ^６ｅ_ｇ ^０）を形成することができる金属カチオンであってもよい。したがって、一実施形態では、錯体は、反磁性８面体低スピン錯体（ｔ_２ｇ ^６ｅ_ｇ ^０）、好ましくは、反磁性８面体低スピンＰｔ^４＋（ｔ_２ｇ ^６ｅ_ｇ ^０）であってもよい。

【0040】

好ましくは、金属カチオンは、１０^－１ｓ^－１以下（例えば、１０^－２ｓ^－１以下または１０^－３ｓ^－１以下）の水リガンド交換速度を有する金属カチオンである。そのような低い水リガンド交換速度を有する金属カチオンは、速度論的に不活性である、すなわち、非常に低い速度でのみ標的分子リガンドを交換し、共有結合に近いもの（すなわち、速度論的に不活性な結合）を提供する、標的分子との非常に堅い錯体を形成する利点を有する。

【0041】

金属カチオン（およびそれを含む錯体）の水交換速度を決定するための方法は、当業界で公知である。水交換速度を決定するために用いることができる方法の概説は、Ａ．Ｄｕｎａｎｄおよび共同研究者（Ｄｕｎａｎｄら、２００３）によって記載されている。本発明の文脈において使用される遅い交換速度を評価するために、測定方法は、^１７Ｏ ＮＭＲ分析を含んでもよい（Ｃｕｓａｎｅｌｌｉら、１９９６）。そのようなアッセイでは、金属と、^１７Ｏ標識された水との錯体を生成し、Ｈ_２Ｏ中に溶解する。水交換速度を決定するために、経時的な^１７Ｏの喪失を、Ｈ_２Ｏとの交換から生じるピークシフトによって測定する。

【0042】

好ましい実施形態では、錯体の金属カチオンは、遷移金属カチオンであってもよい。遷移金属カチオンは、好ましくは、１０^－１ｓ^－１以下の水リガンド交換速度を示す酸化状態にある。この範囲の水交換速度を有する、および／または速度論的に不活性であることが当業界で公知である遷移金属カチオンとしては、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｉｒ^４＋、Ｐｔ^２＋、Ｐｔ^４＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｒｕ^２＋、Ｌａ^３＋、Ｒｕ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｒｅ^４＋、Ｏｓ^２＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋およびＦｅ^２＋が挙げられる。かくして、遷移金属カチオンに属する本発明の文脈で用いることができる金属イオンの好ましいが、非限定的な例は、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｉｒ^４＋、Ｐｔ^２＋、Ｐｔ^４＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｒｕ^２＋、Ｌａ^３＋、Ｒｕ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｒｅ^４＋、Ｏｓ^２＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋およびＦｅ^２＋である。

【0043】

一実施形態では、金属カチオンは、三価遷移金属カチオン、好ましくは、上に列挙された三価遷移金属カチオン、さらにより好ましくは、Ｃｏ^３＋であってもよい。
別の実施形態では、金属カチオンは、四価遷移金属カチオン、好ましくは、上に列挙された四価遷移金属カチオン、さらにより好ましくは、Ｐｔ^４＋であってもよい。

【0044】

一実施形態では、錯体の金属カチオンは、ランタノイド（内部遷移金属とも称される）カチオンであってもよい。ランタノイドは、遷移金属の亜群であり、以下の金属：Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、ＹｂおよびＬｕが挙げられる。本発明において用いることができるランタノイドカチオンは、好ましくは、１０^－１ｓ^－１以下、好ましくは、１０^－２ｓ^－１以下の水リガンド交換速度を有する酸化状態を有する。この範囲の水交換速度を有する、および／または速度論的に不活性であることが当業界で公知であるランタノイドカチオンは、Ｌａ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｇｄ^３＋およびＴｂ^３＋である。したがって、本発明の文脈における金属カチオンは、Ｌａ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｇｄ^３＋およびＴｂ^３＋からなる群から選択されるランタノイドカチオンであってもよい。かくして、一実施形態では、錯体の金属カチオンはまた、三価ランタノイドカチオンであってもよい。

【0045】

一実施形態では、金属カチオンは、Ｐｔ^４＋、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｐｔ^２＋、Ｒｕ^２＋、Ｒｕ^３＋、Ｌａ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｏｓ^２＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｒｕ^２＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｃ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｓｍ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｃｅ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｎｄ^３＋、Ｐｍ^３＋、Ｄｙ^３＋、Ｈｏ^３＋、Ｅｒ^３＋、Ｔｍ^３＋、Ｙｂ^３＋、Ｌｕ^３＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋およびＦｅ^２＋からなる群から選択することができる。当業者であれば、これらの金属カチオンが非常に低い水リガンド交換速度を特徴とすることを知っている。本発明者らは、低い水リガンド交換速度を有する特にそのような金属カチオンが、本発明の錯体を標的分子と共にインキュベートすることによって形成される生成物錯体中で標識および／または担体含有金属カチオンキレート化ドメインと、標的分子との相互作用を媒介するための有用な金属カチオンであることを見出した。これは、これらの金属が、熱力学的に安定であり、速度論的に不活性である生成物錯体中での非常に安定な相互作用を容易にするためである。

【0046】

好ましい実施形態では、金属カチオンは、Ｐｔ^４＋、Ｃｏ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ｉｒ^３＋、Ｉｒ^４＋、Ｐｔ^２＋、Ｐｄ^４＋、Ｍｏ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｒｕ^２＋、Ｌａ^３＋、Ｒｕ^３＋、Ｒｅ^３＋、Ｒｅ^４＋、Ｏｓ^２＋、Ｖ^２＋、Ｍｎ^４＋およびＦｅ^２＋からなる群から選択される。これらの金属カチオンは、１０^－１ｓ^－１以下の水リガンド交換速度を有する、および／または速度論的に不活性な金属カチオンであることが文献中に記載されている：Ｃｏ^３＋（ＬｉｐｐａｒｄおよびＢｅｒｇ、１９９４）、Ｃｒ^３＋（ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、２００２；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｒｈ^３＋（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９３；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｉｒ^３＋（Ｃｕｓａｎｅｌｌｉら、１９９６；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｉｒ^４＋（Ｓａｉｔｏら、１９９０）、Ｐｔ^２＋（Ｈｅｌｍら、１９８４；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｐｔ^４＋（Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏら、１９９５）、Ｐｄ^４＋（Ｓａｉｔｏら、１９９０）、Ｍｏ^３＋（Ｓａｉｔｏら、１９９０）、Ｆｅ^３＋（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１８）、Ｇｄ^３＋（Ｃａｒａｖａｎら、２００１）、Ｔｂ^３＋（Ｊｕｎｋｅｒら、２０１８）、Ｅｕ^３＋（ＭｏｒｒｏｗおよびＣｈｉｎ、１９９３）、Ｒｕ^２＋（Ｈｕｇｉ－Ｃｌｅａｒｙら、１９８７；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｌａ^３＋（ＭｏｒｒｏｗおよびＣｈｉｎ、１９９３）、Ｒｕ^３＋（Ｈｕｇｉ－Ｃｌｅａｒｙら、１９８７；ＨｅｌｍおよびＭｅｒｂａｃｈ、１９９９）、Ｒｅ^３＋（ＨｏｕｓｅおよびＨｏｕｓｅ、２０１５）、Ｒｅ^４＋（Ｓａｉｔｏら、１９９０）およびＯｓ^２＋（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、１９７３）、Ｖ^２＋（ＨｏｕｓｅおよびＨｏｕｓｅ、２０１５）、Ｍｎ^４＋（ＨｏｕｓｅおよびＨｏｕｓｅ、２０１５）、Ｆｅ^２＋（ＨｏｕｓｅおよびＨｏｕｓｅ、２０１５）。かくして、これらの金属カチオンは、標的分子との同様に安定な生成物錯体を形成することができ、標識および／または担体が標的分子に安定的に結合することが妥当である。

【0047】

本発明の文脈では、「速度論的に不活性な金属カチオン」は、１０^－１ｓ^－１以下の水リガンド交換速度を有する金属カチオンと理解される。この定義およびカットオフはまた、文献（Ｔａｕｂｅ、１９５２；Ｌｕｔｈｅｒ ＩＩＩ、２０１６）中でのこの表現の一般的な理解に従う。水交換速度を測定するための好ましい方法は、本明細書の他の箇所に記載される。

【0048】

金属錯体中のリガンド、例えば、本明細書で使用される「生成物錯体」中の標的分子の結合の文脈で使用される場合の「速度論的に不活性」は、好ましくは、水性溶液中のリガンド交換速度が１０^－１ｓ^－１以下、さらにより好ましくは、１０^－２ｓ^－１以下であることを意味する。リガンド交換速度を測定するための方法は当業界で公知である。例えば、水交換速度を測定するための本明細書の他の箇所に記載される方法を、変更すべきところは変更して使用することができる。本発明による「生成物錯体」中の標的分子の結合のリガンド交換速度を決定するため、および／または速度論的不活性を評価するためのアッセイは、添付の実施例および図面（例えば、図１、６および７Ｂを参照されたい）に記載のように、競合リガンド（イミダゾールもしくはＥＤＴＡなど）および／または還元剤（例えば、ＤＴＴ）との競合を測定することを含んでもよい。標的分子の錯体（すなわち、「生成物錯体」）への結合の「速度論的不活性」を評価するための好ましいアッセイを、実施例５に記載の例示的方法によって評価することができる。具体的には、アガロースビーズに連結されたＮＴＡとの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を、本明細書ならびに添付の実施例および図面に記載のように生成することができる。続いて、このビーズに結合した［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を、標的分子と共にインキュベートして、アガロースビーズ上に固定された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（標的タンパク質）］「生成物錯体」を形成させることができる。続いて、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（標的タンパク質）］錯体の化学的安定性を、等量の生成されたアガロースビーズをＰＢＳ（＝対照）またはイミダゾール溶液（２５０ｍＭイミダゾールを添加したＰＢＳ）（＝試料）で洗浄することによって評価することができる。必要に応じて、従来のＮｉ^２＋－ＮＴＡに基づくマトリックスを、比較として用いることができる。次いで、結合した標的分子の量を、全ての試料について評価することができる（必要に応じて、洗浄の前後に）。同様に、添付の実施例２１に記載の手法を使用することができる。具体的には、アガロースビーズに連結されたＮＴＡとの［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］^－錯体を、本明細書ならびに添付の実施例および図面に記載のように生成することができる。続いて、このビーズに結合した［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］^－錯体を、標的分子と共にインキュベートして、アガロースビーズ上に固定された［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（標的タンパク質）］「生成物錯体」を形成させることができる。続いて、［ＰＴ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（標的タンパク質）］錯体の化学的安定性を、等量の生成されたアガロースビーズをＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤（＝対照）またはイミダゾール溶液（２５０ｍＭイミダゾールを添加したＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤）（＝試料）で洗浄することによって評価することができる。必要に応じて、従来のＮｉ^２＋－ＮＴＡに基づくマトリックスを、比較として用いることができる。次いで、結合した標的分子の量を、全ての試料について評価することができる（必要に応じて、洗浄の前後に）。標的分子の存在（すなわち、読出し）を決定するための方法は、標的分子の特性に依存し、当業界で公知である。例えば、アッセイは、蛍光測定（例えば、標的分子が蛍光性である場合）を含んでもよい。非蛍光性標的分子については、標的分子を検出する蛍光抗体を、読出しのために使用することができる。読出しのための別の例は、標的分子が酵素である場合、または標的分子に対する酵素標識抗体を使用する場合、酵素反応の使用である。本発明の文脈では、標的分子リガンドは、好ましくは、２５０ｍＭのイミダゾールで洗浄されたビーズ（＝試料）が洗浄後に、ＰＢＳで洗浄されたビーズ（＝対照）に結合した標的分子の量と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、好ましくは、約８５％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、さらにより好ましくは、約９５％、最も好ましくは、少なくとも約９９％の標的分子を含有する場合、「生成物錯体」中の「速度論的に不活性」な結合であることがわかる。

【0049】

一実施形態では、金属カチオンは、Ｃｏ^３＋またはＣｒ^３＋であってもよい。
特に好ましい実施形態では、金属は、Ｃｏ^３＋である。添付の実施例に示されるように、Ｃｏ^３＋は、本発明の錯体の迅速かつ容易な生産にとって特に好適であり、それを可能にし、標的分子への速度論的に不活性な結合を確保する。

【0050】

別の特に好ましい実施形態では、金属は、Ｐｔ^４＋である。添付の実施例に示されるように、Ｐｔ^４＋は、本発明の錯体の迅速かつ容易な生産にとって特に好適であり、それを可能にし、標的分子への速度論的に不活性な結合を確保する。

【0051】

本発明はまた、金属カチオンがＣｏ^３＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＮＴＡ（またはその誘導体）である錯体に関する。
本発明はまた、金属カチオンがＣｏ^３＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＩＤＡ（またはその誘導体）である錯体に関する。

【0052】

本発明はまた、金属カチオンがＣｏ^３＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＴａｌｏｎ（またはその誘導体）である錯体に関する。
本発明はまた、金属カチオンがＰｔ^４＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＮＴＡ（またはその誘導体）である錯体に関する。

【0053】

本発明はまた、金属カチオンがＰｔ^４＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＴａｌｏｎ（またはその誘導体）である錯体に関する。
本発明はまた、金属カチオンがＰｔ^４＋であり、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドがＩＤＡ（またはその誘導体）である錯体に関する。

【0054】

したがって、本発明は、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンまたは硝酸イオンである金属カチオンリガンド；ならびに
ｃ）ＮＴＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0055】

本発明はまた、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）ＮＴＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0056】

本発明はまた、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）ＮＴＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0057】

本発明はまた、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）Ｔａｌｏｎと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0058】

本発明はまた、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）ＩＤＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0059】

本発明はまた、
ａ）Ｐｔ^４＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）ＮＴＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0060】

本発明はまた、
ａ）Ｐｔ^４＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）Ｔａｌｏｎと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0061】

本発明はまた、
ａ）Ｐｔ^４＋；
ｂ）ＮＯ_３ ^－リガンド；ならびに
ｃ）ＩＤＡと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0062】

一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）であり、金属カチオンは、Ｇｄ^３＋、Ｉｎ^３＋、およびＦｅ^３＋から選択される。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、タンニン酸（ＴＡ）であり、金属カチオンはＣｏ^３＋である。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドはジピリジルアミン（ＤＰＡ）であり、金属カチオンはＣｏ^３＋である。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、１，４，７－トリアザシクロノナンホスフィン酸（ＴＲＡＰ）であり、金属カチオンはＧａ^３＋である。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、エチレンジシステインであり、金属カチオンはＲｅ^３＋またはＴｃ^３＋である。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）であり、金属カチオンは、Ｇｄ^３＋、Ｉｎ^３＋、およびＦｅ^３＋からなる群から選択される。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）であり、金属カチオンはＩｎ^３＋である。一実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドは、１－（１，３－カルボキシプロピル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）であり、金属カチオンはＩｎ^３＋である。

【0063】

本発明の錯体の金属カチオンリガンド（第２のリガンドと称してもよい）は、炭酸イオンＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－または硝酸イオンから選択される。本発明者らは、これらの金属カチオンリガンドを使用することが標的分子の配位を容易にすることを見出した。これは、標的分子との錯体からの炭酸イオンまたは硝酸イオンのより迅速かつより容易な交換によって達成される。炭酸イオンおよび硝酸イオンは両方とも、錯体からの遊離後にプロトン化され得る。このプロトン化は、錯体からの遊離を容易にする。

【0064】

好ましい実施形態では、金属カチオンリガンドは、硝酸イオンである。硝酸イオンは、標的分子との生成物錯体の形成を容易にすることが、添付の実施例において示される。換言すれば、本発明の錯体は、標識および／または担体の標的分子への結合に関してより反応性である。

【0065】

特定の実施形態では、本発明の錯体は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＨＣＯ_３］^－錯体またはその水和物を含む。標識および／または担体は、ＮＴＡに結合される。これらの錯体において、４個の配位部位がＮＴＡによって占有され、２個が炭酸イオンによって占有される。炭酸イオンは、２座リガンドである、すなわち、ドナー（すなわち、ルイス塩基）として錯体中の金属カチオンに配位することができる２個の原子を有し、標的分子の結合を容易にする。ＮＴＡは、その４座結合のため、金属カチオンの特に強力な結合を示すキレーターである。かくして、ＮＴＡは、望ましくない金属カチオン遊離による望ましくない錯体および生成物錯体の分解を防止する。

【0066】

好ましい実施形態では、本発明の錯体は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＮＯ_３］^－錯体またはその水和物を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の錯体は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）ＮＯ_３］錯体またはその水和物を含む。

【0067】

別の好ましい実施形態では、本発明の錯体は、［Ｐｔ（ＶＩ）（ＮＴＡ）ＮＯ_３］^－錯体またはその水和物を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の錯体は、［Ｐｔ（ＶＩ）（ＩＤＡ）ＮＯ_３］錯体またはその水和物を含む。

【0068】

本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメインは、標識および／または担体を含む。換言すれば、本発明の錯体は、機能的部分を含む。標識および／または担体は、キレート化リガンドの配位基とは異なる、すなわち、同じ原子を共有しないのが好ましい。しかしながら、一部の実施形態では、キレート化リガンドならびに標識および／または担体はまた、１つまたは複数の原子を共有してもよい。

【0069】

本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメインは、キレート化リガンドおよび標識を含んでもよいが、担体を含まない。あるいは、本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメインは、キレート化リガンドおよび担体を含んでもよいが、標識を含まない。別の実施形態では、本発明の錯体の金属カチオンキレート化ドメインは、担体および標識を含んでもよい。

【0070】

特定の実施形態では、金属カチオンキレート化ドメインは、キレート化リガンドと標識および／または担体との間にリンカーをさらに含んでもよい。そのようなリンカーは、錯体形成を容易にする、ならびに／または標識および／もしくは担体とキレート化リガンドとの間の規定の距離を確立することができる。リンカーは、原理的には、標識／担体を、所望の距離でキレート化リガンドに共有的に連結するのに好適な任意の化学基であってもよい。当業者であれば、環境および意図される使用の条件に対する結合の抵抗性に関する必要性に従ってリンカーを選択することができる。リンカーは、例えば、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）リンカー、負荷電スルホン基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ピロリン酸ジエステル、ペプチドに基づくリンカー（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣもしくはＶａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＣ（式中、ＣｉｔはＬ－シトルリンを指し、ＰＡＢＣはｐ－アミノベンジルオキシカルボニルを指す）などのカテプシンＢ応答性リンカー）、ヒドラゾン、ジスルフィド含有リンカー、チオエーテル含有リンカー、ベータ－グルクロニドまたはそれらの組合せを含んでもよい。一実施形態では、リンカーは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）リンカー、負荷電スルホン基、ピロリン酸ジエステル、ペプチドに基づくリンカー（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣもしくはＶａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＣなどのカテプシンＢ応答性リンカー）、ヒドラゾン、ジスルフィド含有リンカー、チオエーテル含有リンカー、ベータ－グルクロニド、核酸リンカー（好ましくは、ＤＮＡ）またはそれらの組合せからなってもよい。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）リンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈において用いることができる例示的なＡＤＣリンカーは、例えば、ＴｓｕｃｈｉｋａｍａおよびＡｎ、２０１８、ＡＤＣ＿Ｒｅｖｉｅｗ ２０１９；および／またはＪａｉｎら、２０１５に記載されており、それらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。負荷電スルホン基に基づくリンカーも、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる負荷電スルホン基を有する例示的リンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｏら、２０１１に記載されている。ＰＥＧリンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的ＰＥＧリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＬｙｏｎら、２０１５に記載されている。ピロリン酸ジエステルリンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なピロリン酸ジエステルリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｅｒｎら、２０１６に記載されている。ペプチドに基づくリンカー（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣまたはＶａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＣなどのカテプシンＢ応答性リンカー）は、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なペプチドに基づくリンカー（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣまたはＶａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＣなどのカテプシンＢ応答性リンカー）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、２００２および／またはＨａｒｔｌｅｙ、２０１１に記載されている。ヒドラゾンリンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なヒドラゾンは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｌｃｈｅｒら、１９９９に記載されている。ジスルフィド含有リンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なジスルフィド含有リンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｉｔｏら、２００３に記載されている。チオエーテル含有リンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なチオエーテルリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｎｔｏｎら、２０１８に記載されている。ベータ－グルクロニドリンカーは、当業界で公知である。本発明の文脈で用いることができる例示的なベータ－グルクロニドリンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｅｆｆｒｅｙら、２０１０に記載されている。ＤＮＡリンカーなどの核酸リンカーは、当業界で公知である。

【0071】

金属カチオンキレート化ドメインの標識は、フルオロフォア、診断剤、標的化部分、治療剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、脂質、ビオチン（および／または例えば、フォトビオチン：Ｎ－（４－アジド－２－ニトロフェニル）－アミノプロピル－Ｎ’－（Ｎ－ｄ－ビオチニル－３－アミノプロピル）－Ｎ’－メチル－１，３－プロパンジアミン（Ｆｏｓｔｅｒら、１９８５）などのその誘導体）、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチドまたは毒素を含むか、またはそれからなってもよい。標識はまた、好ましくは、クリック化学にとって好適なチオール基または反応基から選択される反応基を含むか、またはそれからなってもよい。クリック化学にとって好適な反応基の非限定例は、アジド、アルキン、ニトロン、テトラジンおよびテトラゾールである。本明細書の他の箇所に記載される用語「誘導体」の定義は、変更すべきところは変更して適用される。

【0072】

標識は、直接検出することができる機能的部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放射活性標識など）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して検出される、酵素またはリガンドなどの部分を含んでもよい。

【0073】

例示的な標識としては、限定されるものではないが、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、および^１３１Ｉ（好ましくは、これらの原子は、キレート化リガンドの一部を形成しない）、フルオロフォア、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素とカップリングした、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリアファージ標識、安定フリーラジカルなどが挙げられる。別の実施形態では、標識は、陽電子放射体である。陽電子放射体としては、限定されるものではないが、^６８Ｇａ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^８６Ｙ、^７６Ｂｒ、^８９Ｚｒ、および^１２４Ｉが挙げられる。特定の実施形態では、陽電子放射体は、^８９Ｚｒである。

【0074】

一実施形態では、前記標識は、酸化試薬（好ましくは、Ｈ_２Ｏ_２）処理に対して感受性である標識である。この文脈での「酸化試薬に対して感受性」とは、標識が、酸化剤処理後に機能／活性（例えば、フルオロフォアの場合、蛍光）および／または安定性の低下を示すことを意味する。好ましくは、酸化剤処理は、２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２溶液を用いた処理であり、標識は、少なくとも０．５時間、１時間、２時間または２４時間の処理後に感受性である。酸化剤に対する感受性の好ましい試験においては、インキュベーションを、少なくとも１時間、例えば、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３に酸化ステップとして記載されたように、正確に１時間にわたって２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２溶液中で実施することができる。あるいは、この試験を、少なくとも９０分、例えば、ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａの酸化ステップについて記載されたように、正確に９０分にわたって０．０５％（ｖ／ｖ）のＨ_２Ｏ_２溶液中で行うことができる。試験を短縮するために、当業者であれば、１％（ｖ／ｖ）のＨ_２Ｏ_２などの、より高いＨ_２Ｏ_２濃度を有する溶液を使用することもできる。Ｈ_２Ｏ_２感受性を評価するために使用することができる時間経過実験を含む、好ましいＨ_２Ｏ_２濃度およびインキュベーション時間は、添付の実施例に記載される。酸化剤感受性を測定するためのアッセイは、処理の前および処理中の様々な時点での、酸化剤（例えば、Ｈ_２Ｏ_２）を含む溶液（好ましくは、水性溶液、さらにより好ましくは、水中の望ましい酸化剤濃度で）とのインキュベーションおよび標識の機能／活性および／または安定性を示す読出しの測定（例えば、フルオロフォアの場合、放射される蛍光を測定する）を含む。標識は、読出し測定が標識の機能／活性および／または安定性の喪失を示す場合、「酸化感受性」であると考えられる。標識の機能／活性および／または安定性の喪失を評価するための好ましい時点は、使用され、上記の酸化剤の存在下でＣｏ^２＋をＣｏ^３＋に酸化するのに必要とされる時間である。Ｈ_２Ｏ_２感受性を評価する場合、Ｈ_２Ｏ_２の好ましい濃度およびインキュベーション時間は、上のこの一節に示されたものである。フルオロフォア標識の酸化感受性を試験するための例示的な方法は、添付の実施例に記載される。当業者であれば、使用される標識に応じてこのアッセイを改変し、Ｈ_２Ｏ_２濃度およびインキュベーション時間としてパラメーターを適合させることができる。

【0075】

一実施形態では、標識は、フルオロフォアを含むか、またはそれからなってもよい。フルオロフォアは、当業界で公知であり、公共的および／または商業的に利用可能である。また、フルオロフォアを金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドにカップリングするための方法も、当業界で公知である。添付の実施例によって示されるように、多くのフルオロフォア（例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ａｔｔｏ４８８およびＡｌｅｘａ４８８）は、Ｈ_２Ｏ_２処理に対して感受性である。この感受性は、本発明の錯体を、標識としてのフルオロフォアの文脈における使用にとって特に好適なものにする。しかし、この利点は、フルオロフォアに限定されない。一実施形態では、金属結合ドメインは、標識としてフルオロフォアを含んでもよく、キレート化リガンドはＮＴＡであってもよい。一実施形態では、金属結合ドメインは、標識としてフルオロフォアを含んでもよく、キレート化リガンドはＩＤＡであってもよい。

【0076】

一実施形態では、フルオロフォアは、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ａｔｔｏ４８８およびＡｌｅｘａ４８８であってもよい。添付の実施例で示されるように、これらのフルオロフォアは、Ｈ_２Ｏ_２処理に対して感受性である。

【0077】

一実施形態では、本発明の錯体と、より具体的には、標識および／または担体は、Ｓｈａｏら（Ｓｈａｏら、２０１５）によって記載されたポルフィリンリン脂質ではないか、またはそれを含まなくてもよい。

【0078】

本発明の文脈における用語「標識」は、金属カチオンキレート化ドメインのキレート化リガンドの一部である水素原子などの単一原子を含まない。好ましくは、標識は、少なくとも２個の原子、少なくとも３個または少なくとも１０個の原子を含む構造に関する。

【0079】

好ましくは、標識は、機能的部分および／または当業界で公知の方法（例えば、ＮＭＲ、蛍光測定、酵素アッセイなど）を用いて検出することができる部分である。
上記のように、金属結合ドメインは、担体を含んでもよい（必要に応じて、標識に加えて）。本発明による担体の非限定例は、ポリマー、ヒドロゲル、マイクロ粒子、ナノ粒子、スフィア（例えば、ナノまたはマイクロスフィア）、ビーズ（例えば、マイクロビーズ）、量子ドット、人工物および固体表面である。一実施形態では、担体は、ナノパターン化金表面を含むか、またはそれであってもよい。そのようなナノパターン化金表面を、チオール残基で官能化してもよい。

【0080】

当業者であれば、キレート化リガンドと担体とを含む金属結合ドメインを形成するために担体上にキレート化リガンドを結合／固定する技術を知っている。例えば、キレート化リガンドがアミノポリカルボン酸（例えば、ＮＴＡ）である場合、キレート化リガンドを、例えば、少なくとも１個のカルボン酸基またはアミノ基を介して、固相に共有結合させることができる。別の実施形態では、キレート化リガンドを、アミドまたはエステル結合を介して担体に連結することができる。

【0081】

好ましい実施形態では、担体は、アガロースビーズなどのビーズ（例えば、マイクロビーズ）である。したがって、本発明は、本発明の錯体（標識および／または担体を含まない）が結合したビーズ（例えば、マイクロビーズ）に関する。これらのビーズを、親和性マトリックスと称することもできる。本発明の錯体を含むそのようなビーズは、標的分子をビーズに結合させる（すなわち、標的分子をビーズに固定する）ためのすぐに使える試薬である。

【0082】

したがって、本発明は、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンまたは硝酸イオンである金属カチオンリガンド；ならびに
ｃ）ＮＴＡとビーズとを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標的分子をビーズに結合させるための錯体）に関する。

【0083】

好ましくは、本発明は、
ａ）Ｃｏ^３＋；
ｂ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン；および
ｃ）ＮＴＡとビーズとを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0084】

より好ましくは、本発明は、
ａ）Ｐｔ^４＋；
ｂ）金属カチオンリガンドとしての硝酸イオン；ならびに
ｃ）ＮＴＡとビーズとを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体（例えば、標識および／または担体を標的分子に結合させるための錯体）に関する。

【0085】

そのような錯体を、添付の実施例に記載のように生成することができる。例えば、ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、１０２２９６３）を、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回、３倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５で１回、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄することができる。続いて、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の、１０倍ビーズ容量の１ｍＭ Ｎａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯまたはＫ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを、ビーズに添加することができる。１１００ｒｐｍで振とうする２３℃でのサーモシェーカー中で４８時間インキュベートした後、ビーズを、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回、１０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄することができる。最後に、ビーズを収集して（例えば、遠心分離によって）、担体としてのビーズに結合した錯体を得ることができる。

【0086】

添付の実施例に示されるように、理論によって束縛されるものではないが、本発明の錯体を形成させるための、金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメインのインキュベーション時間は、本発明の錯体の標的分子との後の会合に影響し得る。本発明の錯体の形成のためのインキュベーション時間は、本発明の文脈では、「錯体形成時間」である。本発明の錯体と標的分子とのインキュベーション時間は、本発明の文脈では、「錯体－標的インキュベーション時間」である。非限定例１８は、例えば、錯体形成時間が１０分である場合、同じ錯体－標的インキュベーション時間であるが、４８時間の錯体形成時間を用いた場合と比較して、３０分の錯体－標的インキュベーション時間後に、実質的により多くの標的分子（すなわち、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）が、本発明の錯体に結合することを示す（図２０Ｂ）。しかしながら、錯体－標的インキュベーション時間が延長される場合（例えば、４８時間に）、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの本発明の錯体への効率的な結合が回復される（例えば、図１０を参照されたい）。当業者であれば、必要に応じて対応するインキュベーション時間を容易に適合させる立場にある。

【0087】

さらに、添付の実施例は、錯体形成時間と、錯体－標的インキュベーション時間との両方が、得られる生成物錯体の安定性、すなわち、本発明の錯体と、標的分子との間の安定正に影響することを示す。実施例１８は、錯体形成時間が１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間が３０分である場合、標的分子は、本発明の錯体に効率的に結合するが、生成物錯体の画分だけが速度論的に不活性である、すなわち、イミダゾール処理に対して抵抗性であることを示す（図２０Ｂ）。速度論的に不活性な生成物錯体の画分は、１つのインキュベーション時間、すなわち、錯体形成時間または錯体－標的インキュベーション時間が延長される（例えば、４８時間に）場合に増加する。

【0088】

また、非限定例１８によって示されるように、１０分の錯体形成時間と、４８時間の錯体－標的インキュベーション時間との組合せは、高い画分の安定な生成物錯体をもたらす。さらに、４８時間の錯体形成時間と、３０分の錯体－標的インキュベーション時間との組合せは、安定な生成物錯体をもたらす（例えば、実施例１０、図１１を参照されたい）。上で考察されたように、４８時間の錯体形成時間は、標的分子の本発明の錯体への結合効率の低下をもたらし得る。

【0089】

したがって、標的分子の性質に応じて、当業者であれば、好適なインキュベーション時間を選択する方法を知っている。標的分子は、例えば、インキュベーション中に変性または凝集する傾向が非常に高いが、速度論的に不活性な生成物錯体が必要である。かくして、必要に応じて、当業者であれば、得られる生成物錯体の量は減少し得るが、長い錯体形成時間（例えば、４８時間）およびより短い錯体－標的インキュベーション時間（例えば、３０分）を選択してもよい。添付の実施例１８は、金属キレート化リガンドとしてＮＴＡを用いて実施されたことに留意されたい。

【0090】

理論によって束縛されるものではないが、上記のインキュベーション時間の影響は、使用される金属キレート化リガンドに依存し得ることに留意されたい。例えば、添付の非限定例１５では、金属キレート化リガンドとしてＩＤＡが使用され、前記実施例は、高い画分の速度論的に不活性な生成物錯体が、２つの短いインキュベーション時間（すなわち、１０分の錯体形成時間および３０分の錯体－標的インキュベーション時間）についても形成されることを実証する。

【0091】

かくして、当業者であれば、インキュベーション時間が、それぞれ個々の金属キレート化リガンドについて決定する必要がある生成物錯体の安定性に対する影響を有し得ることを知っている。しかし、対応するインキュベーション時間のこの適合化は、関連する当業界の技術の範囲内にあり、本発明の教示および実験部分の実例およびその中に提供される科学的詳細を用いて難なく達成することができる。同様に、当業者であれば、速度論的に不活性な生成物錯体を得るために、ｐＨ、温度および緩衝剤系のようなさらなるパラメーターを容易に適合させることもできる。

【0092】

表１は、当業者が、生成物錯体の安定性および安定な、すなわち、速度論的に不活性な生成物錯体の収率に対するインキュベーション時間の効果を決定するのに役立ち得る。
例えば、中程度の安定性は、高い安定性、すなわち、高い画分の速度論的に不活性な生成物錯体をもたらすインキュベーション時間と比較して、より小さい画分の生成物錯体が速度論的に不活性であることを意味する。中程度の安定性はまた、ある特定の適用および技術分野にとって有用であり得る安定な生成物錯体の収率をもたらし得ることに留意されたい。無制限の量の標的分子が入手可能であり、短期間で安定な生成物錯体が必要とされる場合、当業者であれば、好ましくは、ＮＴＡが金属カチオンキレート化リガンドとして使用される場合、以下のプロトコール：
－ ２つのより短いインキュベーション時間を選択する
－ 得られる生成物錯体（例えば、ビーズに結合した）をイミダゾールで処理して、速度論的に不活性ではない生成物錯体を除去する
－ イミダゾール処理に対して抵抗性である生成物錯体、すなわち、速度論的に不活性な生成物錯体を回収する（例えば、ビーズを回収することによって）
を指してもよい。

【0093】

当業者であれば、適用に応じて前記プロトコールを適合化させる方法をよく知っている。
表１をさらに使用して、錯体形成時間および錯体－標的インキュベーション時間を選択することができることが明らかである。

【0094】

したがって、表１に開示される時間を、本発明の錯体、本明細書に記載の方法および使用と組み合わせることができる。
したがって、本発明は、例えば、
ａ）金属カチオン；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－である金属カチオンリガンド；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体であって、錯体形成時間が約４８時間である、錯体に関する。

【0095】

本発明はまた、
ａ）金属カチオン；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－である金属カチオンリガンド；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体であって、錯体形成時間が約１０分である、錯体に関する。

【0096】

さらに、本発明は、例えば、
ａ）金属カチオン；
ｂ）金属カチオンリガンドとしてのＮＯ_３ ^－；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体であって、錯体形成時間が約４８時間である、錯体に関する。

【0097】

本発明はまた、
ａ）金属カチオン；
ｂ）金属カチオンリガンドとしてのＮＯ_３ ^－；ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含む錯体であって、錯体形成時間が約１０分である、錯体に関する。

【0098】

表１は、単に例示目的のものであり、いかなる意味でも本発明の範囲について限定するものではないことに留意されたい。

【0099】

【表1】

【0100】

ＮＴＡのＣｏ^３＋への結合を、インキュベーション中の、系へのエネルギーの導入／エネルギーへの曝露によって増強することができる。そのような系へのエネルギーの導入／エネルギーへの曝露は、様々な周波数での電磁気共鳴技術（例えば、ＮＭＲ、ｘ線、ＵＶ－Ｖｉｓ）、熱、超音波、またはプラズモン共鳴技術であってもよい。

【0101】

本発明の担体またはその表面を、アミノ基、カルボン酸基および／またはＮＨＳエステルなどの活性化エステルでさらに官能化することができる。
担体を含む金属結合ドメインに関するさらなる非限定例は、ＷＯ２０１４／０７２５２５Ａ１およびＷＯ２００３／０７２１４３に記載されており、それらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0102】

第２の態様では、本発明は、本発明の錯体を含む組成物に関する。錯体に関して本明細書の他の箇所で言われることは、変更すべきところは変更して適用される。
組成物は、錯体に加えて、追加の化合物を含んでもよい。そのような化合物は、本明細書の他の箇所で特定されるように本発明の錯体を生産するために使用される化学的化合物であってもよい。組成物はまた、同じ金属カチオンを有するが、異なるリガンドを有する錯体などの、他の錯体を含んでもよい。組成物は、溶液または固体の形態にあってもよい。

【0103】

一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の錯体と、ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－とを含む溶液であってもよい。ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－の存在は、錯体の金属カチオンリガンドの遊離を防止する、すなわち、錯体安定性を容易にする。ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－は、好ましくは、金属カチオンリガンドも炭酸イオンである場合、溶液中で用いられる。硝酸イオンが金属カチオンリガンドとして用いられる場合、溶液は、ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－よりもむしろ硝酸イオンを含んでもよい。

【0104】

組成物溶液中のＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－の濃度は、少なくとも１ｍＭ、好ましくは、少なくとも１０ｍＭ、最も好ましくは、１Ｍであってもよい。組成物溶液中の硝酸イオンの濃度は、少なくとも１ｍＭ、好ましくは、少なくとも１０ｍＭ、最も好ましくは、１Ｍであってもよい。

【0105】

本発明者らは、本発明の錯体がまた、例えば、合成後に未精製である場合に、追加成分の存在下で、標識および／または担体を標的分子に結合させるための試薬としてその機能を実行することを見出した。したがって、本明細書に記載の本発明の錯体の使用、ならびに本明細書に記載される本発明の錯体を使用する方法を、変更すべきところは変更して、本発明の組成物を用いて行うことができる。当業者であれば、それぞれの使用または方法の効率および／または反応速度に負に影響し得る組成物中の成分を回避できるであろう。

【0106】

第３の態様では、本発明は、本発明の錯体を生産するための方法を提供する。生産方法は、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）金属カチオンリガンド、および（ｉｉｉ）金属カチオンキレート化ドメインを一緒にインキュベートするステップを含む。溶液中で（すなわち、溶媒、好ましくは、水性溶液の存在下で）これらの成分をインキュベートする間に、本発明の錯体は、難なく形成するであろう。上で考察されたように、前記インキュベーション時間は、本発明の文脈における「錯体形成時間」である。前記インキュベーションの時間は、本発明の文脈における「錯体形成時間」である。表１および添付の実施例は、当業者が好適な錯体形成時間を選択するのに役立ち得る。したがって、本発明はまた、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）金属カチオンリガンド、および（ｉｉｉ）金属カチオンキレート化ドメインを一緒にインキュベートするステップを含み、インキュベーション時間、すなわち、錯体形成時間が約４８時間である、生産方法に関する。本発明はまた、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）金属カチオンリガンド、および（ｉｉｉ）金属カチオンキレート化ドメインを一緒にインキュベートするステップを含み、インキュベーション時間、すなわち、錯体形成時間が約１時間である、生産方法に関する。本発明はさらに、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）金属カチオンリガンド、および（ｉｉｉ）金属カチオンキレート化ドメインを一緒にインキュベートするステップを含み、インキュベーション時間、すなわち、錯体形成時間が約３．５時間である、生産方法に関する。さらに、本発明は、（ｉ）金属カチオン；（ｉｉ）金属カチオンリガンド、および（ｉｉｉ）金属カチオンキレート化ドメインを一緒にインキュベートするステップを含み、インキュベーション時間、すなわち、錯体形成時間が約３０分である、生産方法に関する。再度、他のインキュベーション時間は、当業者の日常的な技術のうちにある。

【0107】

金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメインに関して本明細書の他の箇所で言われることは、変更すべきところは変更して適用される。
好ましい実施形態では、金属カチオンおよび金属カチオンリガンドを、中性錯体、好ましくは、塩（例えば、固体または溶液として）の形態で提供することができる。中性錯体（例えば、塩）はまた、他の成分を含んでもよい。この実施形態では、インキュベーションとは、溶液中で中性錯体（例えば、塩）と、金属カチオンキレート化ドメインとを混合すること、および規定の時間にわたってこの混合物を維持することを意味する。中性錯体（例えば、塩）を使用する場合、方法は、中性錯体（例えば、塩）を生産するステップをさらに含んでもよい。必要に応じて、塩を、固体として誘導し、濾過および／または洗浄してもよい。

【0108】

インキュベーションを、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間または少なくとも４８時間にわたって行うことができる。換言すれば、錯体形成時間は、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間または少なくとも４８時間であってもよい（表１も参照されたい）。インキュベーション時間が長くなるほど、より多くの錯体が形成される。反応のいくつかの時点で、錯体形成の飽和を観察することができる。この飽和が観察される時点および形成される錯体の収率は、例えば、使用される成分の温度および濃度ならびに成分自体（例えば、緩衝剤の選択）に依存する。生産プロセスにとって、飽和への到達は必要ではないが、生産収率を増加させることができる。

【0109】

インキュベーションは、原理的には、反応に使用される溶媒が液体状態にある任意の温度で行うことができる。水性溶液または水を溶媒として使用する場合、温度を、０℃～９９℃から選択することができる。好ましくは、温度は、使用される標識および／または担体の温度安定性に従って選択される。したがって、好ましい温度範囲は、例えば、２℃～４２℃、４℃～３７℃および４℃～２５℃である。理論によって束縛されるものではないが、錯体の形成は、より高い温度によって容易になるため、標識および／または担体の安定性が負に影響されない限り、より高い温度が好ましい。当業者であれば、標識および／または担体の温度安定性の知識に応じて温度を選択することができる。

【0110】

金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメインを、本明細書の他の箇所に記載されるように、それぞれ個別に選択することができる。これらの成分の組合せまたは本明細書の他の箇所に記載されるそのサブセットに関する優先性は、変更すべきところは変更して適用される。

【0111】

本発明の錯体を生産するための方法は、錯体を収集するステップ、および／または精製するステップをさらに含んでもよい。上記のように、本発明の錯体はまた、特に、本発明の生産方法のインキュベーションステップによって生産される反応混合物を含む、他の化合物の存在下でその機能を実行する。しかし、ある特定の設定では、錯体の精製および／または単離が望ましい場合がある。洗浄は、好ましくは、１ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ、さらにより好ましくは、１００ｍＭ、最も好ましくは、１ＭのＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－を含む溶液を用いて行われる。添付の実施例および図面に示されるように、そのような溶液を用いた本発明の錯体の洗浄は、本発明の錯体が標識および／または担体を標的分子（例えば、タンパク質）に結合させるために使用される場合、標識および／または担体の結合の改善をもたらす。理論によって束縛されるものではないが、１Ｍ ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－を含む溶液で洗浄ステップを行うことは、ＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－リガンドが洗浄中に本発明の錯体から遊離するのを防止する。

【0112】

方法が担体を含む場合、精製および／または単離は、１つまたは複数の洗浄ステップを含んでもよい。次いで、最後の洗浄ステップ後に担体から洗浄緩衝剤を除去することによって、担体を単離することができる。例えば、ビーズが用いられる場合、ビーズを遠心分離によって沈降させ、上清を除去することができる。液体を流出させるが、担体に結合した錯体を保持する代替的なフィルターカラムを用いることができる。フィルターカラムは、沈降化および上清の吸引の使用と比較して洗浄ステップにおいて失われる担体（例えば、ビーズ）が少ないという利点を有する。

【0113】

標識が用いられる場合、精製方法は、標識を特異的に認識する親和性マトリックスを使用することを含んでもよい。親和性マトリックスに結合した後、錯体を１回または複数回洗浄して、遊離試薬を除去することができる。最後のステップにおいて、錯体を溶出させることができる。錯体の精製および単離は、さらに、またはあるいは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーをも含んでもよい。あるいは、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３に示されたように、標識されたタンパク質は、遊離Ｈｉｓタグを有する非標識タンパク質と比較して、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡとの相互作用の低下を示すか、相互作用を示さないため、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ樹脂により、標識されたものを標識されていないものから分離することができる。

【0114】

特に、錯体が担体を含まず、Ｃｏ^３＋が金属カチオンとして用いられる場合、本発明の錯体を精製するための方法を、当業界で記載された方法（例えば、Ｓｈｉｂａｔａ Ｍ．、１９８３を参照されたい）によって行うこともできる。

【0115】

本発明の特定の錯体は、金属カチオンとしてＣｏ^３＋を、金属カチオンリガンドとしてＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンを含む。本発明のこの好ましい錯体を生産するための方法は、塩の形態などの、対抗イオンとの中性錯体の形態でＣｏ^３＋およびＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－を提供するステップを含んでもよい。あるいは、Ｃｏ^３＋およびＣＯ_３ ^２－またはＨＣＯ_３ ^－を含む荷電錯体を、溶液中で提供することができる。好ましい実施形態では、中性錯体（および塩）は、ナトリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）またはカリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）から選択される。

【0116】

ナトリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）を、ＢａｕｅｒおよびＤｒｉｎｋａｒｄ（ＢａｕｅｒおよびＤｒｉｎｋａｒｄ、１９６０）により記載されたように合成することができる。簡単に述べると、５０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．１モル（２９．１ｇ）のＣｏ（ＩＩ）（ＮＯ_３）・６Ｈ_２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；１．０２５５４）と、１０ｍｌの３０％過酸化水素（Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｅｎ；１８３１２）との混合物を、５０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．５モル（＝４２．０ｇ）の重炭酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ；１．０６３２９）の氷冷スラリーに撹拌しながら滴下添加することができる。次いで、混合物を、１時間にわたって連続撹拌しながら氷上でインキュベートすることができる。続いて、オリーブ色の生成物を濾過し、冷水、無水エタノールおよび乾燥エーテルのそれぞれで３回洗浄することができる。最後に、生成物を減圧下で一晩乾燥し、必要に応じて、窒素雰囲気中、－２０℃で保存することができる。当業者であれば、使用される濃度および量を適合させることができる。生産の成功を、例えば、添付の実施例で用いられるように、ＮＭＲによって確認することができる。

【0117】

カリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）を、Ｓｈｉｂａｔａ（Ｓｈｉｂａｔａ、１９８３；Ｍｏｒｉら、１９５６の適合化）によって記載されたように溶液中で合成することができる。簡単に述べると、２４ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．１モル（２４ｇ）のＣｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；２５５５９９）と、４０ｍｌの３０％過酸化水素との混合物を、７０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．７モル（７０ｇ）の重炭酸カリウム（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；２３７２０５）の氷冷スラリーに撹拌しながら滴下添加することができる。続いて、得られる緑色の溶液を濾過し（例えば、吸引による）、以下の実験のために直接使用することができる。当業者であれば、使用される濃度および量を適合させることができる。生産の成功を、例えば、添付の実施例で用いられるように、ＮＭＲによって確認することができる。

【0118】

形成させようとする錯体の金属カチオンリガンドがＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－である場合、ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－を含む溶液（好ましくは、緩衝化溶液）中でインキュベーションを実施することができる。好ましくは、ＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－は、少なくとも１ｍＭ、好ましくは、少なくとも１０ｍＭ、最も好ましくは、１Ｍの濃度で提供される。インキュベーションは、形成させようとする錯体の金属カチオンリガンドがＮＣＯ_３ ^－である場合、好ましくは、ＮＯ_３ ^－を含む溶液（好ましくは、緩衝化溶液）中で実施される。好ましくは、ＮＯ_３ ^－は、少なくとも１ｍＭ、好ましくは、少なくとも１０ｍＭ、最も好ましくは、１Ｍの濃度で提供される。

【0119】

本発明の特定の錯体は、金属カチオンとしてＰｔ^４＋を、金属カチオンリガンドとしてＮＯ_３ ^－を含む。前記錯体を、以下に記載されるように調製することができる。ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ；１０２２９６３）を、１）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）１０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および１０倍ビーズ容量の１Ｍ硝酸で１回、洗浄することができる。続いて、１６倍ビーズ容量の、１Ｍ硝酸中の白金（ＩＶ）硝酸溶液（４４ｍｇ／ｌのＰｔ（ＩＶ））（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１５４０７８１７）を添加することができる。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、１０分にわたって試料をインキュベートした後、ビーズを、１６倍ビーズ容量の１Ｍ硝酸で３回洗浄することができる。

【0120】

本発明の錯体を生産するための方法は、本発明の錯体の中心を形成する金属カチオンが、例えば、Ｈ_２Ｏ_２処理によって酸化される、標識および／または担体の存在下での酸化ステップを含まないのが特に好ましい。

【0121】

一態様では、本発明はさらに、
ａ）金属カチオン；
ｂ）ＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンまたは硝酸イオン、好ましくは、硝酸イオンである金属カチオンリガンド、ならびに
ｃ）キレート化リガンドと標識および／または担体とを含む金属カチオンキレート化ドメイン
を含むキットに関する。

【0122】

金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメイン、キレート化リガンドならびに標識および／または担体に関して本明細書の他の箇所で言われることは、変更すべきところは変更して適用される。

【0123】

キットは、本発明の錯体を生産するためのキットであってもよく、すなわち、本発明の錯体を形成するために反応することができる成分を含んでもよい。別の実施形態では、集合した錯体がキットに含まれてもよい。

【0124】

特定の実施形態では、金属カチオンは、Ｃｏ^３＋であり、キットは、金属カチオンと、ナトリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）またはカリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）の形態の金属カチオンリガンドとを含む。好ましくは、金属カチオンキレート化ドメインは、リガンドおよび／または担体にカップリングした、ＮＴＡを含む。このキットを用いれば、本発明による好ましいＣｏ^３＋錯体を生成することができる。

【0125】

一態様では、キットの成分ａ）～ｃ）を、実体として、例えば、本発明の錯体として提供しなくてもよい。
別の態様では、キットはまた、例えば、塩の形態で（例えば、本明細書の他の箇所に示される対抗イオンと共に；または溶液、例えば、本発明の組成物の文脈で定義されるような、例えば、ＮＯ_３ ^－を含む溶液中で）、本発明の錯体として集合させた金属カチオン、金属カチオンリガンドおよび金属カチオンキレート化ドメインを含んでもよい。そのようなキットはさらに、好適な反応緩衝剤（好ましくは、本明細書の他の箇所で本発明の錯体を用いる方法および使用について記載される緩衝剤のいずれか）などの試薬を含んでもよい。必要に応じて、キットは、精製材料（例えば、ビーズ、アガロースビーズ）および／またはフィルターカラムをさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、キットは、担体がビーズ（例えば、マイクロビーズ）である、本発明の錯体を含んでもよい。この実施形態では、錯体は、標的分子結合のためのすぐに使える親和性樹脂として提供される。

【0126】

上で説明した通り、本発明の錯体は、金属カチオン媒介性相互作用によって標識または担体を標的分子に結合させるのに特に有用である。本発明者らは、驚くべきことに、ＣＯ_３ ^２－もしくはＨＣＯ_３ ^－から選択される炭酸イオンまたは硝酸イオンの使用が、金属カチオンリガンドとして水を含む以前に使用された錯体と比較して、標的分子との錯体形成を容易にすることを見出した。当業界では、標識および／または担体を含まない［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体のみが記載された（ＤａｖｉｅｓおよびＨｕｎｇ、１９７６；Ｖｉｓｓｅｒら、２００１）。しかし、これらの先行技術文献は、この錯体を、標識を用いて改変するための動機付けも、タンパク質（例えば、Ｈｉｓタグ付タンパク質）などの標的分子を標識するためのこの錯体の使用についても提供しなかった。特に、これらの先行技術文献はまた、本発明者らによって見出された（添付の実施例を参照されたい）、標識および／または担体を標的分子に結合させる際の有利な特徴も示唆しなかった。

【0127】

第４の態様では、本発明は、錯体中に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用に関する。それにより、標識および／または担体の間の金属カチオン媒介性連結は、標的分子が、錯体の第１配位圏中の金属カチオンリガンドを置き換えることができるように、本発明の錯体を標的分子と接触させることによって達成される。金属カチオンリガンドはＣＯ_３ ^２－、ＨＣＯ_３ ^－および硝酸イオンから選択されるため、これは、本発明の錯体を用いて特に高い速度で達成される。添付の実施例において炭酸イオンＣＯ_３ ^２－および硝酸イオンについて例示されるように、これらの金属カチオンリガンドを、配位圏中の標的分子によって、特に、ルイス塩基として機能する２つの基を含む標的分子（例えば、Ｈｉｓタグ付タンパク質）によって、容易に置き換えることができる。理論によって束縛されるものではないが、本発明の錯体の金属カチオンリガンドは、錯体からの遊離後にプロトン化され、次いで、錯体からのそれらの遊離および標的分子との交換を容易にすると考えられる。金属カチオンリガンドとしての炭酸イオンの場合、炭酸イオンのプロトン化は、金属カチオンリガンド遊離を容易にすることによって標的分子結合をさらに容易にする気体形成をもたらす。したがって、炭酸イオンＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－は、本発明の文脈における好ましい金属カチオンリガンドである。別の特定の好ましい金属カチオンリガンドは、硝酸イオンである。添付の実施例は、硝酸イオンが標的分子によって容易に置き換えられることを実証する。

【0128】

したがって、本発明は、標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体または組成物の使用を提供する。本発明の標的分子は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレオチドアナログから作製されるＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ）、ペプチドまたはタンパク質を含む。特に、本発明による標的分子は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレオチドアナログから作製されるＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ）、ペプチドまたはタンパク質であってもよい。本発明の文脈における標的分子は、タンパク質またはペプチドを含むことが特に好ましい。同様に、標的分子がタンパク質またはペプチドであるのも特に好ましい。標的分子に含まれるタンパク質もしくはペプチドまたは標的分子を形成するタンパク質もしくはペプチドを、それらが金属錯体内のリガンド（ルイス塩基）として作用することができるように構成しなければならない。これは、分子が、１つまたは複数の部分；特に、リガンド／ルイス塩基として作用することができ、錯体の金属カチオンに配位することができるアミノ酸を含有しなければならないことを意味する。換言すれば、標的分子が、リガンドとしての標的分子を含む新しい錯体を形成するために本発明の錯体中の金属カチオンリガンドを交換することができるように、それを構成しなければならない。標的分子のリガンドが本発明の錯体中で金属カチオンリガンドを交換することができるかどうかを、例えば、以下のように、（ｉ）本発明の錯体で官能化されたビーズの使用（そのようなビーズの調製を、添付の実施例に記載のように行うことができる）；（ｉｉ）標的分子の添加（例えば、添付の実施例に記載のようなプロトコールに従う）；（ｉｉｉ）ビーズと標的分子とのインキュベーション（好ましくは、４℃で少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも３．５時間、少なくとも２４時間、好ましくは、４８時間）；（ｉｖ）ビーズと上清との分離；（ｖ）標的特異的方法（例えば、蛍光に基づく、抗体検出、酵素試験、定量的質量分析など）による上清および／またはビーズ中の標的分子の分析によって試験することができる。錯体を含まない陰性対照を含有させるべきである。次いで、上清中の標的分子の量の減少および／またはビーズに結合した標的分子の量の増加を測定することによって、交換を検出することができる。

【0129】

好ましい実施形態では、標的分子のタンパク質またはペプチド（すなわち、標的分子に含まれる、または標的分子を形成する）は、配列［Ｘ_ｎＳ_ｍ］_ｋ（式中、Ｘは、本発明の錯体の金属カチオンと配位する、すなわち、ルイス塩基として機能することができるアミノ酸の基から独立に選択されるそれぞれの位置にあり；Ｓは、アミノ酸の第１の基に含まれないアミノ酸であり（Ｓは、独立にそれぞれの位置にあるアミノ酸のこの一覧から選択される）；ｎは、いずれの場合も独立に１～４であり；ｍは、いずれの場合も独立に０～６であり；ｋは、２～６（配列番号４～８を参照されたい）、好ましくは、２～５（配列番号４～７を参照されたい）である）の形態で少なくとも４個のアミノ酸残基を有する「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」を含み、「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」は、本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基から選択される少なくとも４個、好ましくは、少なくとも６個、最も好ましくは、少なくとも８個を含む。「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」は、規則的な配列を有してもよい、すなわち、ｎおよびｍは、出現するごとに、同じ値を有するか、または不規則な配列を有してもよい、すなわち、ｎおよびｍは、異なる値を有してもよい。したがって、一実施形態では、標的分子は、配列番号４～８に定義されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」であって、本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基から選択される少なくとも４個、好ましくは、少なくとも６個、最も好ましくは、少なくとも８個を含む、「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」を含んでもよい。アミノ酸モチーフ内で本発明の錯体の金属カチオンと配位することができる第１の基のアミノ酸の数が多いほど、金属錯体の結合強度および／または特異性が増大し得る、すなわち、標識および／または担体への結合が容易になり得る。

【0130】

「本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基」は、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アルギニン、セレノシステインおよびピロリシンからなってもよい。好ましくは、「本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基」は、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびヒスチジンからなる。さらにより好ましくは、「本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基」は、グリシン、トリプトファン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびヒスチジンからなる。これらのアミノ酸は、金属カチオンと錯体を形成することができる金属リガンドとして好適であることが公知である（Ｃｈｉｎら、１９９９；ＭｃＡｕｌｉｆｆら、１９６６；Ｓｕｇｉｍｏｒｉら、１９９３；Ｓａｊａｄｉ、２０１０；ＢｅｌｌおよびＳｈｅｌｄｒｉｃｋ、２０１４）。最も好ましくは、「本発明の錯体の金属カチオンと配位することができるアミノ酸の基」は、ヒスチジンからなる；すなわち、「Ｘ」はヒスチジンである。

【0131】

本明細書で使用される場合、「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」は、好ましくは、それが、リガンドとして「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」を含む新しい錯体を形成するために本発明の錯体中の金属カチオンリガンドを交換することができるように構成される。新しい錯体を形成するための金属カチオンリガンドとの交換を、標的分子について上記されたように試験することができる。

【0132】

ヒスチジンは、金属カチオン錯体についてよく研究されたリガンドであり、金属イオンおよびヒスチジンタグとの錯体形成は、タンパク質生化学の分野で、例えば、タンパク質を精製するか、またはそれを表面に結合させるために広く使用される。本発明の文脈では、標的分子（例えば、標的分子を形成するか、またはそこに含まれるタンパク質またはペプチド）は、配列［Ｈ_ｎＳ_ｍ］_ｋ（式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｓは、それぞれの位置で、ヒスチジンとは異なるアミノ酸残基、好ましくは、グリシンおよび／またはセリンおよび／またはトレオニンから独立に選択され、ｎは、いずれの場合も独立に１～４であり、ｍは、いずれの場合も独立に０～６であり、ｋは、２～６（配列番号９～１３を参照されたい）、好ましくは、２～５（配列番号１０～１３を参照されたい）である）の形態で少なくとも４個のヒスチジン残基を含む「間隔のあるヒスチジンタグ」を含んでもよい。間隔のあるヒスチジンタグは、規則的な配列を有してもよい、すなわち、ｎおよびｍは、出現するごとに、同じ値を有するか、または不規則な配列を有してもよい、すなわち、ｎおよびｍは、異なる値を有してもよい。したがって、一実施形態では、標的分子は、配列番号９～１３に定義されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる間隔のあるヒスチジンタグを含んでもよく、「金属カチオンリガンドアミノ酸モチーフ」は、少なくとも４個、好ましくは、少なくとも６個、最も好ましくは、少なくとも８個のヒスチジン残基を含む。ポリヒスチジンタグ内のヒスチジンの数が多いほど、金属カチオン（例えば、Ｃｏ^３＋）に対する結合強度および特異性が増大し得る。しかしながら、連続するヒスチジンが多すぎると、一部の場合、組換えタンパク質、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換え発現されるタンパク質の発現レベルおよび溶解度が低下し得る。これらの問題は、グリシン、セリンまたはトレオニンを含む、短い間隔を有する連続するヒスチジンを中断させることによって、すなわち、間隔のあるヒスチジンタグを用いて克服することができる。

【0133】

特に好ましい実施形態では、標的分子は、Ｈｉｓタグを含んでもよい。Ｈｉｓタグは、２～１４個、好ましくは、３～１０個、さらにより好ましくは、４～８個の連続するヒスチジンまたはヒスチジン様残基を含むか、またはそれからなってもよい。一実施形態では、Ｈｉｓタグは、少なくとも２個、好ましくは、少なくとも３個、好ましくは、少なくとも４個、好ましくは、少なくとも５個、最も好ましくは、少なくとも６個（例えば、２、３、４、５、６、７または８個）の連続するヒスチジンまたはヒスチジン様残基を含んでもよい。「ヒスチジン様」とは、イミダゾール基を含有する非天然アミノ酸誘導体を指す。特定の好ましい実施形態では、Ｈｉｓタグは、少なくとも４個、好ましくは、少なくとも５個、最も好ましくは、少なくとも６個（例えば、４、５、６、７または８個）の連続するヒスチジン残基からなる。

【0134】

Ｈｉｓタグは、天然タンパク質中に存在する配列ストレッチであってよいか、または組換えヒスチジンタグであってもよい。この文脈での「組換え」とは、Ｈｉｓタグが、遺伝子操作によって、例えば、Ｈｉｓタグを含む融合タンパク質が発現されるようにコード核酸配列を変更することによって、人工的に生成されることを意味する。

【0135】

Ｈｉｓタグは、標的分子のＮ末端もしくはＣ末端に含まれるか、または内部配列ストレッチとして提供されてもよい。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグは、Ｎ末端およびＣ末端であってもよい。

【0136】

一実施形態では、本発明の標的分子は、少なくとも２個、好ましくは、少なくとも３個、好ましくは、少なくとも４個、好ましくは、少なくとも５個、最も好ましくは、少なくとも６個のヒスチジンまたはヒスチジン様残基が空間的に近接した状態にある３次元構造を有してもよい。この文脈での「空間的に近接した状態」は、それぞれの残基間の０～５オングストロームの距離を好ましくは意味する。２個の残基間の「距離」は、２個の個々の近隣のヒスチジン側鎖またはヒスチジン様側鎖の２個の最も近い窒素原子間の最短距離である。

【0137】

本発明の標的分子の非限定的な好ましい例は、医薬品、診断剤、研究剤、化粧品および／または環境処理のためのタンパク質（例えば、水処理のためのタンパク質）である。
標的分子の他の非限定的な好ましい例は、酵素、標的化タンパク質（例えば、抗体、ナノボディなど）、サイトカイン、輸送タンパク質（例えば、脂肪酸輸送のためのＦＡＢＳ）、貯蔵タンパク質（例えば、フェリチン）、機械的支持タンパク質（例えば、コラーゲン）、増殖因子、ホルモン（例えば、インスリンもしくはＴＳＨ）、インターフェロン、糖タンパク質、合成的に操作されたタンパク質またはその断片を含むか、またはそれからなる分子である。

【0138】

また、本発明の文脈で用いられる標的分子は、核酸であってもよい。核酸は、プリンおよびピリミジン塩基を含む。両方とも、本発明の金属カチオンと錯体を形成することができることが知られている。好ましくは、核酸は、少なくとも２個、好ましくは、少なくとも５個、さらにより好ましくは、少なくとも１０個の塩基を含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよび当業界で公知の他の核酸誘導体を含む。最も好ましいのは、ＤＮＡである。特に、標的分子は、折り紙構造、すなわち、３次元の折畳みを有する核酸構造である。そのような折り紙構造は、典型的には、足場鎖とステープル鎖とを含むいくつかの核酸鎖の塩基対形成によって形成される。

【0139】

標的分子の標識化のための本発明の錯体または組成物の使用は、本発明の錯体の金属カチオンリガンドを標的分子と交換することによる、標識および／または担体の標的分子への結合を含む。前記交換は、本発明の錯体を標的分子と接触させることによって達成される。したがって、前記使用は、好ましくは、本発明の錯体を、溶液中で標的分子と接触させることを含む。

【0140】

したがって、一態様では、本発明は、本発明の錯体または本発明の錯体を含む組成物を、標的分子と共にインキュベートするステップを含む、標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法に関する。標的分子は、本明細書の他の箇所で定義される標的分子である。

【0141】

「インキュベートすること」は、錯体と標的分子とを、溶液中で混合し、混合物を規定の時間にわたって反応させることを意味する。錯体が標的分子と共にインキュベートされる時間は、本発明の文脈では「錯体－標的インキュベーション時間」である。表１および添付の実施例は、当業者が錯体－標的インキュベーション時間を選択するのに役立ち得る。したがって、本発明は例えば、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体－標的インキュベーション時間が約４８時間であってもよい、使用に関する。本明細書に記載のように、錯体形成時間も、生成物錯体形成に対する影響を有し得る。また、本明細書に記載のように、錯体形成時間を、表１または添付の実施例に基づいて選択することができる。したがって、本発明は、例えば、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体形成時間が約４８時間であり、錯体－標的インキュベーション時間が約３．５時間である、使用に関する。別の実証例では、本発明は、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体形成時間が約１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間が約４８時間である、使用に関する。本発明はさらに、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体形成時間が約１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間が約３０分である、使用に関する。本発明はまた、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体形成時間が約１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間が約３時間である、使用に関する。本発明はまた、錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用であって、錯体形成時間が約４８時間であり、錯体－標的インキュベーション時間が約１時間である、使用にも関する。

【0142】

錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用の特定の実施形態では、金属キレート化リガンドはＩＤＡであり、錯体形成時間は１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間は約３０分である。

【0143】

錯体に含まれる標識および／または担体を標的分子に結合させるための本発明の錯体の使用の別の好ましい実施形態では、金属キレート化リガンドはＩＤＡであり、錯体形成時間は１０分であり、錯体－標的インキュベーション時間は約３時間である。

【0144】

標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法は、標識および／または担体が連結された標的分子を回収および／または精製するステップを含んでもよい。これは、標識および／または担体が結合した単離された標的分子を提供することである。

【0145】

方法が担体を結合させるステップを含む場合、担体が結合している標的分子の精製および／または単離を、担体を単離することによって達成することができる。例えば、固体担体が用いられる場合、ビーズを遠心分離によって沈降させ、上清を除去することができる。あるいは、液体を流出させるが、担体に結合した錯体を保持するフィルターカラムを用いることができる。必要に応じて、担体を緩衝剤溶液で洗浄して、不純物を除去することができる。

【0146】

一般的には、担体または標識が用いられるかどうかに関係なく、単離および／または精製を、クロマトグラフィーによって実施することができる。前記クロマトグラフィーは、担体および／または標識に結合される標的分子ならびに遊離標的分子ならびに本発明の錯体の間での分子サイズおよび形状の差異を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを含むか、またはそれからなってもよい。

【0147】

標識および／または担体が結合した本発明による標的分子を精製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０７２５２５にも記載されている。

【0148】

一実施形態では、精製を、ＷＯ２０１４／０７２５２５に記載された従来のＮｉ－ＮＴＡカラムを用いて実行することもできる。
本発明の錯体またはそれを含む組成物のインキュベーションを、異なるｐＨ値を有する溶液中で行うことができる。しかし、標識および／または担体の標的分子への結合は、多様なｐＨ値で行ってもよい。ｐＨ値が小さくなるほど、金属カチオンリガンド（すなわち、炭酸イオンまたは硝酸イオン）の遊離が容易になる。これは、遊離されるリガンドがプロトン化されるためである。炭酸イオンＣＯ_３ ^２－およびＨＣＯ_３ ^－はさらに、それらがプロトン化される場合に遊離される気体を形成する。

【0149】

原理的には、ｐＨ値が低いほど、交換反応は容易になるが、インキュベーション中のｐＨは、典型的には、用いられる標的分子と適合する範囲で選択される。特に、タンパク質は、多くの場合、低すぎるか、または高すぎるｐＨ値には感受性である。ｐＨは、好ましくは、標的分子の安定性（例えば、タンパク質の３次元フォールディングおよび／またはタンパク質の生物学的機能）が維持されるように選択される。しかし、ｐＨは依然として好ましくは、リガンド交換、すなわち、標識および／または担体の標的分子への結合を容易にする標的分子のｐＨ安定性範囲の下端で選択される。当業者であれば、異なるｐＨ値でのタンパク質の安定性および機能を試験するためのアッセイを知っている。

【0150】

好ましい実施形態では、本発明の錯体の標的分子とのインキュベーション中のｐＨは、４．０～９．５、好ましくは、５．５～８．０である。これらのｐＨ範囲では、多くの標的分子、特に、多くのタンパク質は安定および／または機能的である。

【0151】

金属カチオンリガンドと、標的分子との交換は、典型的には、短時間で起こる。かくして、必要とされる結合効率および使用される標的分子に応じて、本発明に従って標識および／または担体を結合させるための方法のインキュベーションステップを、わずか少なくとも約１０秒、好ましくは、少なくとも約１分、最も好ましくは、少なくとも約１０分の短さで行うことができる。好ましい実施形態では、インキュベーションは、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約７時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間または少なくとも約４８時間で実施される。理論によって束縛されるものではないが、より長いインキュベーションは、より高い結合収率をもたらすと考えられる。しかしながら、ある特定のインキュベーション時間後、標識化および／または担体結合の飽和が認識される。好ましいインキュベーション時間は、使用される標的分子および所望の結合有効性に依存してもよい。当業者であれば、遊離標識および／もしくは担体の枯渇を測定すること、ならびに／または標識および／もしくは担体が結合した標的分子を定量することによって結合有効性を試験することができる。

【0152】

標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法のインキュベーションステップを、異なる温度で行うことができる。金属カチオンリガンドと、標的分子との交換は、原理的には、０～９５℃の任意の温度で機能する。温度が高いほど、リガンド交換反応は速くなる。しかしながら、標的分子は温度感受性であるタンパク質などの生体分子を含むか、またはそれからなるため、標的分子の安定性および／または機能を確保するように温度を選択しなければならない。例えば、好熱性細菌を起源とするタンパク質は、非好熱菌起源に由来するタンパク質より高い反応温度を許容するであろう。同様に、ＤＮＡは、ＲＮＡよりも高い熱耐性を有する。したがって、温度は、用いられる標的分子に依存する。用いることができる非限定的な温度範囲は、０℃～約９５℃、０℃～約６０℃、０℃～約４２℃、０℃～約２５℃および約４℃～約２５℃である。温度は、インキュベーション中に一定のままであってもよい。あるいは、１つまたは複数の異なる温度または温度勾配を用いてもよい。一実施形態では、標的分子はタンパク質であり、温度は０℃～約２５℃、好ましくは、約２℃～約８℃から選択される。

【0153】

上記のように、インキュベーションステップは、溶液中で行われる。純水または水性溶液を含む、異なる溶液をこの文脈で用いることができる。かくして、一実施形態では、インキュベーションを、水または水性溶液中で実施することができる。あるいは、またはさらに、溶液は、１つまたは複数の有機溶媒を含んでもよい。有機溶媒の非限定的な好ましいセットは、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＳ、アセトニトリル、およびイソプロパノールを含む。したがって、一実施形態では、インキュベーションを、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＳ、アセトニトリルおよびイソプロパノールからなる群から選択される１つまたは複数の有機溶媒を含む溶液中で実施することができる。当業者であれば、下流の適用および／または標的分子の安定性もしくは活性を阻害しないような溶液を選択するであろう。タンパク質の文脈では、好ましくは、生理的条件と共に、水性溶液が特に好ましい。

【0154】

添付の実施例に示されるように、標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法を、異なる緩衝試薬の存在下で行うことができる。したがって、好ましい実施形態では、方法のインキュベーションステップを、１つまたは複数のＧｏｏｄの緩衝物質を含む水性溶液中で行うことができる。

【0155】

Ｇｏｏｄの緩衝物質は、１９６６～１９８０年にＮｏｒｍａｎ Ｇｏｏｄおよび同僚によって選択および記載された生化学および生物学研究のための２０種の緩衝剤である（Ｇｏｏｄら、１９６６；Ｇｏｏｄら、１９７２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、１９８０を参照されたい）。これらの緩衝剤は、当業界で公知である。

【0156】

例示的であるが、非限定的な緩衝剤は、ＡＣＥＳ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＢｉｓＴｒｉｓプロパン、ホウ酸、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＴＥＳおよびＴｒｉｓであり、ならびにそれらの誘導体を用いてもよい。「誘導体」は、同じ構造的骨格を有するが、追加の化学部分によって置換されている緩衝物質に関する。あるいは、またはさらに、Ｔｒｉｓ緩衝剤、炭酸／重炭酸緩衝剤またはリン酸緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）を用いてもよい。

【0157】

一実施形態では、ＢｉｓＴｒｉｓおよび誘導体、炭酸／重炭酸緩衝剤、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、リン酸緩衝剤（ＰＢＳなど）、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、およびＴｒｉｓから選択される緩衝物質を用いることができる。

【0158】

これらの例示的な緩衝剤を使用する場合、溶液のｐＨは、以下のように選択することができる：
ＡＣＥＳ：６．０～７．８；ＡＭＰＳＯ：８．０～１０．０；ＢＥＳ：６．２～８．０；ＢｉｓＴｒｉｓ：５．５～７．５；ＢｉｓＴｒｉｓプロパン：６．０～９．８；ホウ酸：８．２～１０．５；ＣＡＰＳ：９．５～１１．５；ＣＡＰＳＯ：８．５～１０．５；ＣＨＥＳ：８．４～１０．２；ＤＩＰＳＯ：６．８～８．５；ＥＰＰＳ：７．０～９．０；ＨＥＰＥＳ：７．２～９．５；ＨＥＰＢＳ：７．４～９．２；ＭＥＳ：５．２～７．０；ＭＯＰＳ：６．２～８．２；ＭＯＰＳＯ：６．０～８．０；リン酸：５．５～８．２；ＰＩＰＥＳ：５．９～７．８；ＰＯＰＳＯ：７．０～８．７；ＴＡＰＳ：７．４～９．４；ＴＡＰＳＯ：６．７～８．５；ＴＥＡ：７．０～８．５；ＴＥＳ：６．５～８．５；Ｔｒｉｓ：６．８～９．５；炭酸緩衝剤：８．５～１１．０。

【0159】

緩衝能力が絶対的に要求されないような広範囲のｐＨ値で反応を行うことができるため、原理的には、他のｐＨ値を、上記の緩衝剤のそれぞれと共に用いることもできる。しかしながら、ｐＨを一定に保ち、反応をより良好に制御するために、緩衝剤が緩衝能力を有する、上記のｐＨ範囲におけるｐＨが好ましい。

【0160】

１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは、１ｍＭ～２５０ｍＭ、最も好ましくは、１ｍＭ～１００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ）などの様々な濃度で緩衝剤を用いることができる。当業者であれば、結合有効性を評価し、様々な緩衝剤濃度を使用することによって、理想的な緩衝剤濃度を試験することができる。

【0161】

添付の実施例に示されるように、緩衝物質／緩衝剤の選択は、標識および／または担体の標的分子への結合効率に影響し得る。理論によって束縛されるものではないが、低い金属結合定数を有する緩衝剤は、結合の効率の増加を示す。低い金属カチオン結合定数は、緩衝剤が金属に配位し、第１配位圏中のリガンド位置を遮断するのを防止する。

【0162】

かくして、一実施形態では、本発明の文脈において使用される緩衝物質／緩衝剤は、低い金属結合定数を有する緩衝物質／緩衝剤であってもよい。「低い金属結合定数」によって理解されるもの、およびそのような緩衝物質／緩衝剤の好ましい例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２０１５に開示されている。

【0163】

さらに、好ましい実施形態では、インキュベーションステップは、アミン基およびカルボニル基から選択される１つまたはそれ未満（好ましくは、なし）の基を含む緩衝物質／緩衝剤の存在下で実施される。これらの基は、錯体中の金属カチオンへの結合を媒介することができるルイス塩基を含む。かくして、これらの基の非存在は、緩衝物質の金属カチオンへの結合を減少させるか、または防止し、それによって、標的分子の結合を容易にする。

【0164】

添付の実施例によって示されるように、以下の緩衝剤が、標識および／または担体結合を容易にするために有利である：ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－ＴｒｉｓおよびＰＩＰＥＳ。実施例は、これらの緩衝剤が、Ｔｒｉｓに基づく緩衝剤よりも高い結合効率をもたらすことを示す。したがって、特に好ましい実施形態では、インキュベーション中の溶液中に存在する緩衝物質を、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－ＴｒｉｓおよびＰＩＰＥＳから選択することができる。これらの緩衝物質は、標識および／または担体結合にとって特に有利である。非限定例１３は、インキュベーションのために使用されるｐＨに応じて、緩衝剤を選択する必要があり得ることを実証する。本発明の錯体および標的分子のインキュベーションが約７．５のｐＨで実施される場合、ＢｉｓＴｒｉｓではなくＨＥＰＥＳを使用することができる。本発明の錯体および標的分子のインキュベーションが約５．５のｐＨで実施される場合、ＢｉｓＴｒｉｓを使用することができる。最も好適な緩衝剤およびｐＨの決定は、関連する当業界の技術の範囲内にあり、本発明の教示および実験部分の実例およびその中に提供される科学的詳細を用いて難なく達成することができる。

【0165】

これらの結果を考慮して、また、金属カチオンに結合する緩衝剤を可能な限り低く保持する理論的考慮に基づいて、緩衝物質を、好ましくは、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳおよびＴＥＳから選択することができる。

【0166】

好ましい実施形態では、本発明の錯体またはそれを含む組成物の標的分子とのインキュベーションを、溶液中でＣａ^２＋イオンの存在下で行うことができる。本発明の錯体の金属カチオンリガンドがＨＣＯ_３ ^－またはＣＯ_３ ^２－から選択される炭酸イオンである場合、Ｃａ^２＋イオンの存在が特に好ましい。これは、Ｃａ^２＋イオンが、溶液から沈降し、それによって錯体からの炭酸イオンの遊離を容易にする、不溶性のＣａＣＯ_３を形成し得るからである。これは次いで、リガンドとしての標的分子の結合を容易にし、それによって、標識および／または担体の標的分子への結合を容易にする。好ましくは、反応溶液中に溶解するＣａＣｌ_２を溶解させることによって、Ｃａ^２＋イオンを提供する。Ｃａ^２＋イオンを、反応の開始時に添加する、すなわち、本発明の錯体と標的分子とを接触させる場合、直接添加することができる。あるいは、あまり好ましくはないが、Ｃａ^２＋イオンを、反応中に塩の形態（好ましくは、ＣａＣｌ_２）で添加してもよい。Ｃａ^２＋イオン（好ましくは、ＣａＣｌ_２の形態にある）は、０．１～５０ｍＭ、さらにより好ましくは、０．１～１０ｍＭ、最も好ましくは、１ｍＭの濃度で添加されるのが好ましい。

【0167】

本発明に従って標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法は、本発明の錯体の金属カチオンが、例えば、Ｈ_２Ｏ_２処理によって酸化される酸化ステップを必要としない。そのような好ましい実施形態では、本発明に従って標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法は、Ｈ_２Ｏ_２を用いた処理などの酸化ステップを含まない。これは、Ｃｏ^３＋媒介性標識および／または担体結合を形成させる文脈において特に好ましい。以前に報告された方法（例えば、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３）では、機能的部分のＣｏ^３＋媒介性結合は、リガンドとしてのｈｉｓタグ付標的タンパク質とのＣｏ^２＋錯体を形成させた後にのみ、Ｃｏ^２＋をＣｏ^３＋に酸化することによって達成された。添付の実施例に示されるように、Ｃｏカチオンの存在下でのそのような酸化ステップは、タンパク質分解をもたらし得る自発的なフェントン反応をもたらし得る。さらに、タンパク質の酸化は、タンパク質のフォールディングおよび機能を阻害し得る。かくして、酸化ステップが必要とされないことは、本発明の方法の特定の利点である。

【0168】

標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法はまた、本明細書の他の箇所に記載される本発明の錯体（および必要に応じて、したがって使用される塩などの中性錯体）の生産を含んでもよい。

【0169】

本発明に従って標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法は、標識されたもの、および／または担体に結合したものの生産をもたらす。したがって、方法はまた、標識および／または担体が結合される標的分子を生産するための方法と称してもよい。本明細書の他の箇所に示される標的分子に関する優先性は、変更すべきところは変更して適用される。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、標識および／または担体を、タンパク質、例えば、Ｈｉｓタグ付タンパク質、抗体、その誘導体（例えば、ｓｃＦｖ断片およびナノボディを含む）またはそのドメインに結合させるための方法であってもよい。

【0170】

標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法の好ましい実施形態は、標的分子がＨｉｓタグ付タンパク質であり、Ｈｉｓタグ付タンパク質が、表面である担体（例えば、チップ）に結合されるものである。好ましくは、金属カチオンとしてのＣｏ^３＋またはＰｔ^４＋、金属カチオンリガンドとしての本明細書に定義される炭酸イオンまたは硝酸イオン、好ましくは、硝酸イオンおよびキレート化リガンドとしてのＮＴＡ、ＴａｌｏｎまたはＩＤＡを用いるこの方法では、Ｈｉｓタグ付タンパク質は、表面に結合される。標的分子の高い安定性および速度論的に不活性な結合のため、タンパク質を、共有に近い様式で、イミダゾールおよび他のキレート（例えば、ＥＤＴＡ）ならびに還元等価処理に関して不活性である表面に結合させることができる。

【0171】

さらに別の態様では、本発明は、本発明に従って標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法によって得られる、または得られた、標識および／または担体が結合した標的分子に関する。本発明の方法によって得られた標識および／または担体に結合した標的分子は、標的分子も、標識および／または担体も、酸化ステップ（例えば、Ｈ_２Ｏ_２による処理）を受けていないことを特徴とする。対照的に、そのような構造を生成する以前に報告された方法は、ｉ）標的分子と、ｉｉ）標識および／または担体との少なくとも一方または両方の存在下での酸化ステップを含んでいた。したがって、本発明の方法の生成物は、酸化されない、およびＨ_２Ｏ_２などの酸化剤を含まないという利点を有する。これはまた、生産される標識された、および／または担体に結合した標的分子の医学的使用にとって重要な利点を有する。

【0172】

錯体、その成分、標的分子ならびに本発明に従って標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法に関して本明細書の他の箇所で言われたことは、変更すべきところは変更して適用される。

【0173】

本発明の方法によって得られる、標識および／または担体が結合した標的分子も、錯体である。この得られた「生成物錯体」は、本発明の錯体の金属カチオンを含み、ｉ）本発明の錯体の金属結合ドメインおよびｉｉ）標的分子に配位している。

【0174】

本発明はまた、標識および／または担体を標的分子に結合させるための方法によって得られる、または得られた、標識された、および／または担体に結合した標的分子を含む組成物も提供する。

【0175】

本発明の方法によって得られる、もしくは得られた標識および／もしくは担体に結合した標的分子またはそれを含む組成物を、研究試薬として使用することができる。かくして、本発明はまた、研究試薬としての本発明の方法によって得られる、または得られた標識された、または担体に結合した標的分子の使用にも関する。同様に、研究試薬として本発明の方法によって生成された標識された、または担体に結合した標的分子を使用するステップを含む方法が提供される。例えば、標的分子は、細胞培養のために固体担体に固定される細胞外マトリックスタンパク質であってもよい。

【0176】

一実施形態では、本発明の方法によって得られる、もしくは得られた標識された、および／もしくは担体に結合した標的分子またはそれを含む組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断剤として使用することができる。例えば、標的分子は、分析物（例えば、分析物としての抗原を認識する抗体）を特異的に認識する検出タンパク質であってもよく、標識および／または担体を、当業界で公知の測定方法を順守するように構成することができる。

【0177】

本発明は、薬剤としての使用のための、本発明の方法によって得られる、もしくは得られた標識された、および／または担体に結合した標的分子またはそれを含む組成物に関する。同様に、本発明の方法によって得られる、もしくは得られた標識された、および／もしくは担体に結合した標的分子またはそれを含む組成物の有効量を患者に投与するステップを含む、処置方法が提供される。好ましくは、標的分子は、酵素、抗体などの標的化タンパク質、サイトカイン（例えば、Ｇ－ＣＳＦ）、脂肪酸輸送のためのＦＡＢＳなどの輸送タンパク質、フェリチンなどの貯蔵タンパク質、コラーゲンなどの機械的支持タンパク質、増殖因子、インスリンもしくはＴＳＨなどのホルモン、インターフェロン、糖タンパク質、合成的に操作されたタンパク質またはその断片から選択される。

【0178】

本発明は特に、標的分子および／または標識を、ｉｎ ｖｉｖｏで薬剤として使用される場合、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの錯体の標的構造への結合の際に、標的分子を含む「生成物錯体」から遊離させることができる実施形態も包含する。したがって、本発明の方法によって得られる、標識および／または担体が結合した標的分子を、標識および／または標的分子を、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏで遊離させることができるように構成することができる。生成物錯体中の金属カチオンの還元、ｐＨ変化ならびに／または標的分子および／もしくは標識の標的構造（例えば、受容体またはがん細胞特異的表面タンパク質などの細胞表面タンパク質）への結合によって、遊離を誘発することができる。

【0179】

本発明の「錯体」は、金属カチオンとリガンドとによって形成される錯体を指す。かくして、錯体という用語は、好ましくは、配位錯体または金属錯体に関する。錯体は、金属カチオンの形態にあるルイス酸と、１つまたは複数のリガンドの形態にある１つまたは複数のルイス塩基とを含む。本発明の錯体は、本明細書の他の箇所で定義される少なくとも２個のリガンドを有する。

【0180】

本明細書で使用される用語「タンパク質」および「ペプチド」は両方とも、アミノ酸からなるポリペプチドに関する。用語「ペプチド」は、２０個以下のアミノ酸を有するポリペプチドを指す。用語「タンパク質」は、２０個より多いアミノ酸を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドという用語は、「ペプチド」と「タンパク質」との両方を包含する。本明細書において「タンパク質またはペプチド」が記載される場合、ポリペプチドも含まれる。

【0181】

本明細書で使用される場合、「抗体」は、標的タンパク質に特異的または選択的に結合することができる任意の分子である。抗体は、抗体または完全長抗体と実質的に同じ結合活性を示すその一部／断片を含んでもよいか、またはそれであってもよい。抗体はまた、多価分子、多重特異性分子（例えば、ダイアボディ）、融合分子、アプチマー、アビマー、または他の天然に存在する、もしくは組換え的に作出された分子を含んでもよい。本発明において有用な例示的抗体は、抗体様分子を含む。抗体様分子は、標的分子に結合することによって機能を示すことができる分子であり（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６、１７：６５３～６５８頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７、１８：１～１０頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７、７：４６３～４６９頁；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６、１５：１４～２７頁を参照されたい）、例えば、ＤＡＲＰｉｎ（ＷＯ２００２／０２０５６５）、アフィボディ（ＷＯ１９９５／００１９３７）、アビマー（ＷＯ２００４／０４４０１１；ＷＯ２００５／０４０２２９）、アドネクチン（ＷＯ２００２／０３２９２５）およびフィノマー（ＷＯ２０１３／１３５５８８）を含む。一般に、用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書で使用され、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト抗体および抗体断片を含む種々の抗体構造を包含する。本発明のうちにある抗体はまた、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片またはヒト化抗体であってもよい。

【0182】

抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、インタクト抗体の一部を含み、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0183】

用語「リガンド」とは、一部の様式で別の種と相互作用する種を指す。本発明の文脈では、錯体の文脈で使用される場合の「リガンド」は、ルイス酸との配位結合を形成することができるルイス塩基を含む分子を指す。他の例では、リガンドは、金属イオンとの配位結合を形成する基を含む、有機物であることが多い種である。金属イオンに配位する場合、リガンドは、例えば、末端（すなわち、単一の金属イオンに結合する）および架橋（すなわち、ルイス塩基の１個の原子が１個より多い金属イオンに結合する）を含む、当業者には公知の様々な結合様式を有してもよい。

【0184】

用語「ルイス酸」および「ルイス酸性」は、当業界で認識されており、上で定義されたルイス塩基から一対の電子を受け取ることができる化学部分を指す。
用語「ルイス塩基」および「ルイス塩基性」とは、一般に、ある特定の反応条件下で一対の電子を供与することができる化学部分を指す。ルイス塩基を、ルイス塩基および金属イオンの同一性に応じて、ある特定の錯体中で単一の電子を供与するものとして特徴付けることができるが、多くの目的にとって、ルイス塩基は、２個の電子供与体として最良に理解される。ルイス塩基部分の例としては、アルコール、チオール、およびアミンなどの非荷電化合物、ならびにアルコキシド、チオレート、カルバニオン、および種々の他の有機アニオンなどの荷電部分が挙げられる。ある特定の例では、ルイス塩基は、オキシドなどの単一原子からなってもよい。

【0185】

用語「配位」または「配位すること」は、リガンドと金属カチオンとの相互作用を指す。
本発明の文脈における用語「診断剤」または「複数の診断剤」は、診断型の薬剤に関する。非限定例は、後にポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）もしくは単一光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングまたは当業者には公知の他の方法を使用して検出することができる、放射性ヌクレオチド、当業界で公知の方法によって検出することができる蛍光部分および酵素活性部分である。診断剤はまた、それに結合した放射性ヌクレオチド、フルオロフォアまたは酵素を含む抗体も含む。

【0186】

用語「医薬品」は、限定されるものではないが、低分子、バイオ医薬品（例えば、抗体）を含む、任意の薬剤または予防剤に関する。好ましい医薬品は、抗体である。
本発明は、以下の図面および実施例によって実証される。

【図面の簡単な説明】

【0187】

【図1】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の化学反応性。Ｃｏ^２＋およびＣｏ^３＋錯体中心にＨｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）が固定されたＮＴＡビーズを、２５０ｍＭイミダゾールと共に異なるキレーターおよび還元剤と共にインキュベートし、溶出したＨｉｓ_６－ＧＦＰの量を測定した。Ｃｏ^３＋中心の速度論的不活性のため、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］の形態でビーズ上に固定された場合、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰはほとんど溶出しない。グラフは、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３）から適合させたものである。

【図2-1】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）］化学によるＨｉｓタグ付タンパク質の標識化のための方法の概略図。Ａ：Ｗｅｇｎｅｒ ＆ Ｓｐａｔｚ（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３）によって２０１３年に公開された、予め形成された［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の酸化による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成。ＮＴＡに、Ｃｏ^２＋イオン（Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２由来）を予めロードし、Ｈｉｓタグ付タンパク質と共にインキュベートする。最後に、Ｃｏ^２＋中心を、２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を用いて１時間にわたって全タンパク質錯体を酸化することによってＣｏ^３＋に変換する。しかしながら、酸化ステップが、コンジュゲートされたタンパク質の機能および安定性に影響し得るため、この方法は大きな欠点を有する。さらに、ＮＴＡ部分に結合したコンジュゲートは、酸化プロセスによって影響され得る。Ｂ：Ｚａｔｌｏｕｋａｌｏｖａ ＆ Ｋｕｃｅｒｏｖａ（ＺａｔｌｏｕｋａｌｏｖａおよびＫｕｃｅｒｏｖａ、２００６）によって２００６年に公開された、予め形成された［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_３］錯体の酸化による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成。ＩＤＡに、Ｃｏ^２＋イオン（Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２由来）を予めロードし、Ｃｏ^２＋中心を、２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を用いて１時間にわたって［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_３］錯体を酸化することによってＣｏ^３＋に変換する。続いて、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_３］^＋錯体を、Ｈｉｓタグ付タンパク質と共にインキュベートする。非常に遅い錯体形成および結合有効性の低下のため、この手順は制限される。さらに、ＩＤＡ部分に結合したコンジュゲートは、酸化プロセスによって影響され得る。Ｃ：コバルト（ＩＩＩ）炭酸イオンを使用することによる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成。ＮＴＡに、コバルト（ＩＩＩ）炭酸イオン（例えば、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）に由来するＣｏ^３＋を予めロードして、本発明の錯体を形成させる。次いで、錯体をＨｉｓタグ付タンパク質と共にインキュベートする。この手順は、温和な反応条件下で実施することができるＨｉｓタグ付タンパク質のコンジュゲーションのための非常に単純なワークフローである。反応を生理的緩衝条件で連続的に実施することができるため、タンパク質ならびにＮＴＡコンジュゲート、すなわち、標識（例えば、フルオロフォア）および／または担体の機能を完全に保持することができる。さらに、炭酸イオンリガンドは、手順Ｂにおける２つの水リガンドと比較して、迅速かつ効率的なタンパク質結合を可能にする。

【図2-2】Ｄ：白金（ＩＶ）硝酸イオンを使用することによる［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成。ＮＴＡに、白金（ＩＶ）硝酸イオン溶液に由来するＰｔ^４＋を予めロードして、本発明の錯体を形成させる。次いで、錯体をＨｉｓタグ付タンパク質と共にインキュベートする。この手順は、温和な反応条件下で実施することができるＨｉｓタグ付タンパク質のコンジュゲーションのための非常に単純なワークフローである。それにより、硝酸イオンリガンドは、手順Ｂにおける２つの水リガンドと比較して、迅速かつ効率的なタンパク質結合を可能にする。

【図3】過酸化水素を用いたフルオロフォアの酸化。様々なフルオロフォアを、１％Ｈ_２Ｏ_２中でのインキュベーション後、０．０５％Ｈ_２Ｏ_２と共に約２１時間にわたってインキュベートした。フルオロフォアの蛍光を、１５（０．０５％Ｈ_２Ｏ_２）から３０（１％Ｈ_２Ｏ_２）分毎に測定した。全てのフルオロフォアが、Ｈ_２Ｏ_２処理中に蛍光強度の低下を示し、これは、Ｈ_２Ｏ_２を用いる酸化ステップが標識の機能および安定性を阻害し得ることを示している。

【図4】Ｈ_２Ｏ_２によるコバルト酸化中のタンパク質分解およびＨｉｓタグ切断。Ｈｉｓタグ付タンパク質（３．３μＭ）を、６６μＭのＣｏＣｌ_２および２０ｍＭのＨ_２Ｏ_２を用いて、または用いずに、１時間にわたってインキュベートした。西洋わさびペルオキシダーゼにカップリングしたα－Ｈｉｓ_６－タグ抗体（クローンＨ－３）を使用するウェスタンブロットにより、タンパク質の安定性およびＨｉｓタグの切断を分析した。コバルトおよびＨ_２Ｏ_２への曝露時に、タンパク質は、分解の部分的兆候ならびにＨｉｓタグの切断を自発的に示した。提示された画像に由来するゲルレーンは、同じゲル／膜を起源とする。

【図5】ＮＴＡおよびそのコバルト錯体の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル。Ａ：ＮＴＡの^１Ｈ－ＮＭＲ測定値は、約３．６ｐｐｍでピークを示し、これは、ソフトウェアＮＭＲ Ｐｒｅｄｉｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｍｒｄｂ．ｏｒｇ／ｎｅｗ＿ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ？ｖ＝ｖ２．１０３．０；２０１９年４月バージョン）を使用してｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作出されたスペクトル（３．５７ｐｐｍのピーク計算値）と相関する。ＢａｎｆｉおよびＰａｔｉｎｙ、２００８；Ｃａｓｔｉｌｌｏら、２０１１；Ａｉｒｅｓ－ｄｅ－Ｓｏｕｓａら、２００２を参照されたい。Ｂ：ＮＴＡを、Ｃｏ^２＋およびＤ_２Ｏを用いて［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｄ_２Ｏ）_２］^－に錯体化する場合（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを用いて合成）、約３．６ｐｐｍからのピークは、約３．８ｐｐｍにシフトする。Ｃ＋Ｄ：錯体を、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ（Ｃ）またはＫ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ（Ｄ）と共に生産する場合、ピークは約１．９ｐｐｍにさらにシフトし、これは所望のカルボナト錯体［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－の存在を示す。全てのｐｐｍシフトを、４．７ｐｐｍで残存するＨ_２Ｏのピークに対して正規化する。

【図6】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－により得られた［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体の安定性。Ｎｉ^２＋およびＣｏ^３＋錯体中心にＨｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（配列番号１５）が固定されたＮＴＡビーズ（後者はＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを用いて生産された）を、ＰＢＳまたはイミダゾール（２５０ｍＭ）で洗浄し、ビーズ上に残存するＨｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲの量を、蛍光測定によって決定した。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］塩によって生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体は、それにより、Ｈ_２Ｏ_２酸化手順により形成された錯体についてと類似するイミダゾール中での化学的安定性を示す（図１と比較する）。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図7-1】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）］錯体へのタンパク質結合。［Ｎｉ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたアガロースビーズを、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートした。Ａ：残存する未結合のタンパク質を、様々な時点での上清の蛍光測定によって決定した。炭酸イオン分子が会合した［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）］錯体は、水分子が会合した［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）］錯体よりも有意に速くタンパク質に結合する。

【図7-2】Ｂ：３１２時間のインキュベーション後、ビーズを、緩衝剤または２５０ｍＭイミダゾールで洗浄し、ビーズ上に残存するＨｉｓ_６－ＧＦＰの量を、蛍光測定によって決定した。それにより、全ての［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体は、類似するイミダゾール中での化学的安定性を示す。しかしながら、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体で官能化されたビーズは、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］を予めロードしたビーズよりも有意に多くのタンパク質に結合する。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図8-1】タンパク質結合に対する緩衝物質の効果。Ａ＋Ｂ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたアガロースビーズを、異なる緩衝剤中でＨｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートした。残存する未結合のタンパク質を、様々な時点での上清の蛍光測定によって決定した。ＭＥＳおよびＢｉｓ－Ｔｒｉｓに基づく緩衝溶液中で、錯体形成はＴｒｉｓに基づく緩衝剤と比較して速く、ＴｒｉｓおよびＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤と比較して効率的であった。グラフＢは、時点０および実験開始後３時間でのグラフＡからのズームである。エラーバー：±ＳＤ。

【図8-2】タンパク質結合に対する緩衝物質の効果。Ａ＋Ｂ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたアガロースビーズを、異なる緩衝剤中でＨｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートした。残存する未結合のタンパク質を、様々な時点での上清の蛍光測定によって決定した。ＭＥＳおよびＢｉｓ－Ｔｒｉｓに基づく緩衝溶液中で、錯体形成はＴｒｉｓに基づく緩衝剤と比較して速く、ＴｒｉｓおよびＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤と比較して効率的であった。グラフＢは、時点０および実験開始後３時間でのグラフＡからのズームである。エラーバー：±ＳＤ。

【図9】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］のＵＶ－Ｖｉｓスペクトル。室温で水性溶液中での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］の可視光吸収スペクトル。ＮＴＡをＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと共にインキュベートすることによって［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－を生産し、ＮＴＡをＣｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏと共にインキュベートすることによって形成された［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体のＨ_２Ｏ_２を用いた酸化によって［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］を生産する。２つの最大値のそれぞれのピークシフトは、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体での炭酸イオンリガンドの存在を示す。

【図10-1】Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯとＮＴＡとのインキュベーション時間および温度に依存する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および安定性。ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズを、４℃（Ａ）、２５℃（Ｂ）および７０℃（Ｃ）で様々な期間にわたってインキュベートする。続いて、得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰと共に４８時間インキュベートする。ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ＢＣＡアッセイによって決定した。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡのインキュベーション時間の増大と共に、その後、タンパク質を２５℃で４８時間にわたってインキュベートする場合、安定な錯体ならびにビーズ上の固定されたＨｉｓ_６－ＧＦＰのパーセンテージが増大する。温度の上昇と共に、固定されたタンパク質は、より早く飽和に達する。エラーバー：±ＳＤ。

【図10-2】Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯとＮＴＡとのインキュベーション時間および温度に依存する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および安定性。ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズを、４℃（Ａ）、２５℃（Ｂ）および７０℃（Ｃ）で様々な期間にわたってインキュベートする。続いて、得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰと共に４８時間インキュベートする。ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ＢＣＡアッセイによって決定した。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡのインキュベーション時間の増大と共に、その後、タンパク質を２５℃で４８時間にわたってインキュベートする場合、安定な錯体ならびにビーズ上の固定されたＨｉｓ_６－ＧＦＰのパーセンテージが増大する。温度の上昇と共に、固定されたタンパク質は、より早く飽和に達する。エラーバー：±ＳＤ。

【図11-1】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－とＨｉｓ_６－ＧＦＰとのインキュベーション時間および温度に依存する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および安定性。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって４、２５および３７℃でインキュベートし、タンパク質結合緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な「Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：相対蛍光に基づくイミダゾール処理後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。より長いタンパク質インキュベーション時間と共に、より多くのタンパク質をビーズ上に固定することもでき、３．５時間で飽和プラトーに達し始めた。最終的な錯体の収率に対するタンパク質インキュベーション温度の効果は観察することができなかった。Ｂ：緩衝剤洗浄と比較したイミダゾール処理後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰのパーセンテージ。全ての生産された錯体は、２５０ｍＭイミダゾール処理に対して高い安定性を示す。エラーバー：±ＳＤ。

【図11-2】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－とＨｉｓ_６－ＧＦＰとのインキュベーション時間および温度に依存する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および安定性。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって４、２５および３７℃でインキュベートし、タンパク質結合緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な「Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：相対蛍光に基づくイミダゾール処理後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。より長いタンパク質インキュベーション時間と共に、より多くのタンパク質をビーズ上に固定することもでき、３．５時間で飽和プラトーに達し始めた。最終的な錯体の収率に対するタンパク質インキュベーション温度の効果は観察することができなかった。Ｂ：緩衝剤洗浄と比較したイミダゾール処理後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰのパーセンテージ。全ての生産された錯体は、２５０ｍＭイミダゾール処理に対して高い安定性を示す。エラーバー：±ＳＤ。

【図12】Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを用いた［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および安定性。ＮＴＡで官能化された磁気アガロースビーズを、示された時間にわたってＫ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと共にインキュベートした後、生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体と共にＨｉｓ_６－ＧＦＰをインキュベートする。タンパク質緩衝剤（「緩衝剤」）または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏによって生産される［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体もまた、Ｈｉｓ－ＧＦＰと配位して、安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体を形成することができる。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図13】異なる緩衝剤系における［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成およびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡとの１０分のインキュベーションに伴うその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの１０分のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、異なる緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。緩衝溶液（「緩衝剤」）、次いで、緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ：イミダゾール処理の前後での１５分のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのタンパク質結合緩衝剤系に関して可能であるが、結合したタンパク質に関する効率および最終的な錯体の安定性のパーセンテージについては変化する。エラーバー：±ＳＤ。

【図14-1】異なる緩衝剤系における［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成およびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡとの４８時間のインキュベーションに伴うその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの４８時間のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、異なる緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。分析緩衝剤（「緩衝剤」）または分析緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ～Ｅ：イミダゾール処理を用いた、または用いない、１分（Ｂ）、１５分（Ｃ）、１時間（Ｄ）または２４時間（Ｅ）のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのタンパク質結合緩衝剤系に関して可能であるが、結合したタンパク質に関する効率は変化する。エラーバー：±ＳＤ。

【図14-2】異なる緩衝剤系における［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成およびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡとの４８時間のインキュベーションに伴うその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの４８時間のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、異なる緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。分析緩衝剤（「緩衝剤」）または分析緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ～Ｅ：イミダゾール処理を用いた、または用いない、１分（Ｂ）、１５分（Ｃ）、１時間（Ｄ）または２４時間（Ｅ）のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのタンパク質結合緩衝剤系に関して可能であるが、結合したタンパク質に関する効率は変化する。エラーバー：±ＳＤ。

【図14-3】異なる緩衝剤系における［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成およびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡとの４８時間のインキュベーションに伴うその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの４８時間のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、異なる緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。分析緩衝剤（「緩衝剤」）または分析緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ～Ｅ：イミダゾール処理を用いた、または用いない、１分（Ｂ）、１５分（Ｃ）、１時間（Ｄ）または２４時間（Ｅ）のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのタンパク質結合緩衝剤系に関して可能であるが、結合したタンパク質に関する効率は変化する。エラーバー：±ＳＤ。

【図15-1】様々なｐＨ値での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成およびその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの４８時間のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、様々なｐＨ値でＢｉｓＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。分析緩衝剤（「緩衝剤」）または分析緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ：イミダゾール処理を用いた、または用いない１５分のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのｐＨ値で可能であるが、結合したタンパク質に関する効率は変化する。それにより、効率は、タンパク質インキュベーションと共に、また、タンパク質インキュベーション中のｐＨ値の低下と共に増大する。エラーバー：±ＳＤ。

【図15-2】様々なｐＨ値での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成およびその錯体安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡの４８時間のインキュベーション時間後の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、様々な期間にわたって、様々なｐＨ値でＢｉｓＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤系中でＨｉｓ_６－ＧＦＰと共にインキュベートする。分析緩衝剤（「緩衝剤」）または分析緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール（「イミダゾール」）を用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性を試験する。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：イミダゾール処理後のビーズ上に固定されたタンパク質の量。Ｂ：イミダゾール処理を用いた、または用いない１５分のタンパク質インキュベーション後のビーズ上に固定されたＨｉｓ－ＧＦＰ。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成は、全てのｐＨ値で可能であるが、結合したタンパク質に関する効率は変化する。それにより、効率は、タンパク質インキュベーションと共に、また、タンパク質インキュベーション中のｐＨ値の低下と共に増大する。エラーバー：±ＳＤ。

【図16-1】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－によるＨｉｓタグまたはヒスチジンリッチ領域を有する様々なタンパク質の安定な固定化。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズを、Ｈｉｓ－ＧＦＰ、Ｈｉｓ－プロテインＡ、Ｈｉｓ－ソルターゼ、Ｈｉｓ－ヒト血清アルブミンまたは抗ＧＦＰマウスＩｇＧ１と共にインキュベートし、タンパク質結合緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄によって、最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（タンパク質）］錯体の安定性を試験する。Ａ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－とのタンパク質インキュベーション後のタンパク質上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。マーカー：２００、１５０、１００、７５、５０、３７、２５ｋＤａ。レーン１、４、７、１０および１３：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－インキュベーション後に残存するタンパク質。レーン２、５、８、１１および１４：［Ｎｉ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－インキュベーション後に残存するタンパク質。レーン３、６、９、１２および１５：ＮＴＡインキュベーション後に残存するタンパク質。レーン１～３：Ｈｉｓ－ＧＦＰ、レーン４～６：Ｈｉｓ－プロテインＡ、レーン７～９：Ｈｉｓ－ソルターゼ、レーン１０～１２：Ｈｉｓ－ＨＳＡ、レーン１３～１５：抗ＧＦＰマウスＩｇＧ１。単に高いパーセンテージであるＨｉｓ－プロテインＡについてを除いて、全てのタンパク質を、タンパク質インキュベーション後に上清から除去することができた。Ｂ：イミダゾール処理後のＢＣＡアッセイによって決定されたビーズ上のタンパク質の量。安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（タンパク質）］錯体形成を、全てのタンパク質について達成することができた。

【図16-2】Ｃ：ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）５２０ Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて蛍光測定的に決定されたイミダゾール処理の前後の固定されたソルターゼの活性。ソルターゼは、固定後も依然として活性であり、形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ソルターゼ）］錯体は２５０ｍＭイミダゾールを用いた処理に抵抗することができた。

【図16-3】Ｄ＋Ｅ：ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定された、ＮＴＡ（Ｄ）またはＩＤＡ（Ｅ）で官能化されたビーズ上に固定された抗ＧＦＰマウスＩｇＧ１へのＧＦＰ結合（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。固定された抗体は、ＧＦＰ結合によって示されるように依然として機能的であった。

【図17】金属結合ドメインとしてのＩＤＡおよびＴＡＬＯＮ。それぞれ、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＴＡＬＯＮ）（ＣＯ_３）］錯体により生産されたＡ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］およびＢ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＴＡＬＯＮ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および化学的安定性。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ、次いで、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰタンパク質のインキュベーション時間を、括弧内に示す（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／タンパク質インキュベーション時間）。ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄により、化学的安定性を試験した。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて測定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。金属処理を用いないビーズと比較して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＴＡＬＯＮ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を使用してビーズ上に固定された、有意により多くのＨｉｓ_６タンパク質が化学的に安定であった。それにより、３座金属結合ドメインＩＤＡを用いた錯体の化学的安定性は、４座ＴＡＬＯＮ錯体に対して劇的に増大した。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図18】［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の化学反応性。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体を用いて官能化されたビーズを、２５０ｍＭイミダゾールと組み合わせたキレーターまたは還元剤を含む様々な条件を用いてインキュベートし、ビーズ上に残存するＨｉｓ－ＧＦＰの量を、ビーズスラリーの蛍光によって測定する（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ｃｏ^３＋中心の速度論的不活性のため、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰはほとんど溶出されず、生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の高い安定性を示している。エラーバー：±ＳＤ。

【図19-1】Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋への固定化効率。Ｈｉｓ_６－ＧＦＰインキュベーションのＡ：３時間およびＢ：２４時間後の磁気ビーズ上での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体により生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の錯体形成効率および化学的安定性。示された時間（１０分または４８時間）にわたってＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと共にＩＤＡで官能化された磁気ビーズをインキュベートすることによって、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体を生産した。ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄により、化学的安定性を試験した。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて測定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体で官能化されたビーズと比較して１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏインキュベーションを用いて調製された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体を使用してビーズ上に固定された、有意により多くのＨｉｓ_６タンパク質が化学的に安定であった。４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏインキュベーションを用いて調製された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体は、２４時間のタンパク質インキュベーション時間後に［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体を打ち負かした。全ての［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体が、イミダゾールに対して高い化学的安定性を示した。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図19-2】Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋への固定化効率。Ｈｉｓ_６－ＧＦＰインキュベーションのＡ：３時間およびＢ：２４時間後の磁気ビーズ上での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体により生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の錯体形成効率および化学的安定性。示された時間（１０分または４８時間）にわたってＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと共にＩＤＡで官能化された磁気ビーズをインキュベートすることによって、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体を生産した。ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄により、化学的安定性を試験した。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて測定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体で官能化されたビーズと比較して１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏインキュベーションを用いて調製された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体を使用してビーズ上に固定された、有意により多くのＨｉｓ_６タンパク質が化学的に安定であった。４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏインキュベーションを用いて調製された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体は、２４時間のタンパク質インキュベーション時間後に［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体を打ち負かした。全ての［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体が、イミダゾールに対して高い化学的安定性を示した。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図20】［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の酸素処理に対する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の化学的に安定な錯体形成。磁気ビーズ上での、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（ＣＯ_３）］^２－錯体（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／タンパク質インキュベーション時間）または酸素（８時間）もしくは過酸化水素（２０ｍＭ、１時間）処理を用いた［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の酸化により生産されたＡ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］またはＢ：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性を、ＨＥＰＥＳに基づく緩衝剤または緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールの処理を用いてチャレンジした。ビーズ上に固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて測定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の８時間の酸素処理と比較して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（ＣＯ_３）］錯体を使用してビーズ上に固定された、有意により多くのＨｉｓ６タンパク質が化学的に安定であった。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図21】表面上での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成。Ｈｉｓ－ＧＦＰを、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＮＴＡ（ＣＯ_３）］^２－錯体により金ナノ構造ガラス表面に固定した。ナノ構造金ドットを、チオール－ＰＥＧ－ＮＴＡにより官能化した後、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと共にインキュベートして、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＮＴＡ（ＣＯ_３）］^２－錯体を形成させた後、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰを、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成によって固定する。金ドットが、ガラス表面との非特異的タンパク質相互作用を回避する間、全ての表面を、短いＰＥＧ層を用いて不動態化する。固定されたＨｉｓ－ＧＦＰの量を、表面上での蛍光に基づいて決定し（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）、表面上でのＧＦＰ固定化を確認した。「ＰＥＧのみ」：不動態化された表面；「ＰＥＧ／ＧＦＰ」：Ｈｉｓ－ＧＦＰと共にインキュベートした不動態化された表面；「金属なし」：チオール－ＰＥＧ－ＮＴＡおよびＨｉｓ－ＧＦＰと共にインキュベートした不動態化された表面；「［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」：チオール－ＰＥＧ－ＮＴＡ、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯおよびＨｉｓ－ＧＦＰと共にインキュベートした不動態化された表面。

【図22】溶液中での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成。Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯをＮＴＡ－Ｘ－ビオチンと共にインキュベートした後、様々なインキュベーション時間にわたってＨｉｓ－ＧＦＰを得られる錯体と共にインキュベートすることによって生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（ＣＯ_３）］錯体を介してＨｉｓ－ＧＦＰをビオチン部分にカップリングした。最終的な錯体を、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用によってストレプトアビジンで官能化されたビーズに固定した。ビオチン化されたタンパク質に関する尺度としての固定されたタンパク質の量を、ビーズスラリーの蛍光に基づいて決定した（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）。Ａ：ストレプトアビジンビーズ上に固定された、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡ－Ｘ－ビオチンおよび３０分の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（ＣＯ_３）］／Ｈｉｓ－ＧＦＰインキュベーション後に生成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）」錯体。全てのＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯのＮＴＡに対する比について、有意な量のＨｉｓ－ＧＦＰをビオチン化し、ビーズ上に固定することができた。それにより、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ比が高いほど、標識化の速度が増大する。Ｂ：緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールを用いたストリンジェントな洗浄後にストレプトアビジンビーズ上に固定された、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡ－Ｘ－ビオチンおよび３０分または４８時間の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（ＣＯ_３）］／Ｈｉｓ－ＧＦＰインキュベーション後に生成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ－Ｘ－ビオチン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体。タンパク質インキュベーション時間が増加すると共に、固定された、したがって、化学的に安定な錯体の量が増加する。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【図23】［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］官能化ビーズ上でのＨｉｓ_６－ＧＦＰ固定化。ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズを、白金（ＩＶ）硝酸イオンと共に１０分インキュベートした後、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰと共に３０分インキュベートした。形成された［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性を、２５０ｍＭイミダゾールを用いてチャレンジし、ビーズ上の固定されたタンパク質をＢＣＡアッセイによって決定した。［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］錯体による有意な量のタンパク質の安定な固定化を示すことができた。さらに、金属結合リガンド硝酸イオンの使用は、容易かつ迅速な、錯体へのタンパク質結合を可能にした。エラーバー：±ＳＤ；ｐ値：＜０．００１：^＊＊＊；＜０．０１：^＊＊；＜０．０５：^＊；≧０．０５：有意でない。

【実施例】

【0188】

実施例１：［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性の比較
［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］が固定されたビーズのアリコートを、２５０ｍＭイミダゾールと組み合わせた、強力なキレーターまたは広く使用される還元剤と共にインキュベートして、Ｃｏ^３＋に基づく錯体が、化学的安定性に関して一般的に使用されるＮｉ^２＋またはＣｏ^２＋に基づく錯体よりも優れていることを示した。

【0189】

Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）を、プラスミドｐＥＴ Ｈｉｓ_６ ＧＦＰ ＴＥＶ ＬＩＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２９６６３）（Ｐｅｄｅｌａｃｑら、２００６）を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３）により記載されたＮｉ^２＋－ＮＴＡビーズにより精製した。

【0190】

Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、１）９倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）３倍ビーズ容量の０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５で、３）９倍ビーズ容量の緩衝剤Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で３回、４）１．５倍ビーズ容量の０．１Ｍ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏで、５）９倍ビーズ容量の緩衝剤Ｂ（緩衝剤Ａ＋２５０ｍＭイミダゾール）で、および６）９倍ビーズ容量の緩衝剤Ａで３回、洗浄した。最後に、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰを、１倍ビーズ容量の、緩衝剤Ａ中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ中でインキュベートすることによって、それらをビーズ上にロードした。各ステップの間に、ビーズスラリーを３００ｇで１分遠心分離し、上清をデカンテーションした。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体を得るために、Ｃｏ^２＋－ＮＴＡ上にＨｉｓ_６－ＧＦＰが固定されたビーズを、２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を含む緩衝剤Ａ中、室温で１時間インキュベートした（Ｃｏ^２＋を含有する対照として後に使用されるビーズを、Ｈ_２Ｏ_２を含まない緩衝剤Ａ中でインキュベートした）。続いて、ビーズを緩衝剤Ａで数回洗浄した後、ビーズを、２倍ビーズ容量の緩衝剤Ａ中に再懸濁し、安定性実験のために１５０μｌのアリコート中に分配した。最後に、５０μｌの各試験試薬（最終濃度：キレーター：２５０ｍＭイミダゾール、２５ｍＭ ＮＴＡ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ；還元剤（システアミン、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、アスコルビン酸イオン）：２５０ｍＭイミダゾールを添加した１ｍＭ）を、アリコートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、１００μｌの上清を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２０００）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４８０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５１０ｎｍ）について分析した。全ての実験を、二重に実施した。

【0191】

図１に示されるように、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰをＣｏ^３＋中心に結合させた場合、試験したキレーターまたは還元剤とのインキュベーション時に、非常に少量の溶出タンパク質しか観察されなかった。対照的に、Ｃｏ^２＋ビーズに結合したＨｉｓ_６－ＧＦＰは、同じ条件下で完全に溶出された。かくして、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体は、強力なキレーターによる破壊およびＣｏ^２＋への還元に対して両方とも不活性である。

【0192】

実施例２：過酸化水素によるフルオロフォアの酸化
実施例１に記載され、先行技術において以前に記載された方法（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３を参照されたい）において用いられるような、Ｃｏ^２＋をＣｏ^３＋に酸化するためのＨ_２Ｏ_２の利用は、結合したタンパク質を害するだけでなく、標識または担体などのＮＴＡコンジュゲートの機能にも負に影響し得る。例えば、いくつかのフルオロフォアの蛍光は、以下に示されるようにＨ_２Ｏ_２による酸化時に減少し得る。

【0193】

フルオロフォアコンジュゲートを、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ；１８９１２０１４）（最終濃度：５μｇ／ｍｌフルオレセイン（Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ；２８８０２）；１８５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ４８８結合抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１０３９）；９μｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ結合抗体（Ｔｈｅｒｍｏ；ＭＡ１－８１８９１）；５μｍ ａｔｔｏ４８８結合Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ（Ｓｉｇｍａ；３９６２５））中に希釈し、１００μｌの各フルオロフォア溶液を、０．０５％Ｈ_２Ｏ_２と共に約２１時間インキュベートした後、黒色の９６ウェルプレート中、１％Ｈ_２Ｏ_２中で別に２２時間インキュベートした。蛍光強度（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ；Ｓｐａｒｋ）上で１５分（０．０５％Ｈ_２Ｏ_２）または３０分（１％Ｈ_２Ｏ_２）毎に測定した。

【0194】

図３に示される蛍光測定値は、全ての分析したフルオロフォアが、Ｈ_２Ｏ_２とのインキュベーション時に蛍光強度の顕著な低下を示したことを示す。
実施例３：Ｈ_２Ｏ_２によるコバルト酸化中のタンパク質分解およびＨｉｓタグ切断
実施例１に記載され、ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ（ＷｅｇｎｅｒおよびＳｐａｔｚ、２０１３）によって以前に記載された方法において用いられるような、Ｃｏ^２＋をＣｏ^３＋に酸化するためのＨ_２Ｏ_２の利用は、抗Ｈｉｓタグウェスタンブロットにおいて示されるように、タンパク質分解およびヒスチジン残基の切断（Ｄａｖｉｅｓ、１９８７、Ｓｔａｄｔｍａｎ、１９９０）をもたらし得る、フェントン様反応（Ｈａｎｎａ、Ｋａｄｉｉｓｋａら、１９９２）を自発的に誘発し得る。

【0195】

蛍光タンパク質ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（配列番号１５）を、プラスミドｐＲｓｅｔＢ－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４９０８１）（Ｔａｎｔａｍａら、２０１３）を使用して大腸菌ＤＨ５α中で発現させ、（Ｔａｎｔａｍａら、２０１３）に記載されたようにＮｉ^２＋－ＮＴＡカラムにより精製した。

【0196】

３．３μＭのＨｉｓ_７タグ付ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲタンパク質を、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の３３μＭのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏと混合し、室温で２分インキュベートした。続いて、２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を添加し、混合物を、２１℃で１．５時間インキュベートした。コバルトおよび／またはＨ_２Ｏ_２を含まない対照試料については、等量のタンパク質緩衝剤を使用した。最後に、反応を、３３ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を用いてクエンチした。

【0197】

ウェスタンブロット分析のために、タンパク質試料を、ＳＤＳ試料緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、１９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１００ｍＭ ＤＴＴ（最終濃度））と混合し、７０℃で１０分変性させ、８４ｐｍｏｌのタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（７％（ｗ／ｖ）アクリルアミド－ビスアクリルアミド（３７．５：１）、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．８、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ；泳動条件：１２０Ｖ一定、Ｌａｅｍｍｌｉの泳動緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．８、１９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ））上にロードした。タンパク質分離後、タンパク質を、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ、１０４０１１９６）上にブロットし、膜を、ＴＢＳ－Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて室温で５分洗浄した後、ＴＢＳ－Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて室温で１時間ブロックした。最後に、膜を、２００ｎｇ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（クローンＨ－３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－８０３６ＨＲＰ）と共にインキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで１０分、３回洗浄し、ルミノールに基づく増強化学発光西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、３４０７６）中、室温で５分インキュベートした。Ｈｉｓタグ付タンパク質からの化学発光シグナルを、ＬＡＳ３０００システム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を使用して検出した。

【0198】

図４におけるウェスタンブロットは、スメアであまり強くないバンドによる、タンパク質と、Ｈ_２Ｏ_２と組み合わせたコバルトとのインキュベーション時のあり得るタンパク質分解ならびに自発的なＨｉｓタグ切断を示す。

【0199】

実施例４：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の合成
Ｈ_２Ｏ_２の使用を完全に回避するために、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成のためにＣｏ（ＩＩＩ）炭酸イオン（例えば、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯおよびＫ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）を用いる新しい方法が開発された。錯体形成プロセスは、図２Ｃ中に概略的に図示される。第１のステップでは、Ｃｏ（ＩＩＩ）塩を、ＮＴＡと共にインキュベートして、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－を形成させる。プロトン磁気共鳴分光法（^１Ｈ－ＮＭＲ）を適用して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体の形成の成功を示した。

【0200】

ナトリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物の合成
ナトリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）を、ＢａｕｅｒおよびＤｒｉｎｋａｒｄ（ＢａｕｅｒおよびＤｒｉｎｋａｒｄ、１９６０）により記載されたように合成した。簡単に述べると、５０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．１モル（２９．１ｇ）のＣｏ（ＩＩ）（ＮＯ_３）・６Ｈ_２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；１．０２５５４）と、１０ｍｌの３０％過酸化水素（Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｅｎ；１８３１２）との混合物を、５０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．５モル（＝４２．０ｇ）の重炭酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ；１．０６３２９）の氷冷スラリーに撹拌しながら滴下添加した。混合物を、連続撹拌しながら氷上で１時間インキュベートした。続いて、オリーブ色の生成物を濾過し、冷水、無水エタノールおよび乾燥エーテルのそれぞれで３回洗浄した。最後に、生成物を減圧下で一晩乾燥し、窒素雰囲気中、－２０℃で保存した。

【0201】

カリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物の合成
カリウムトリス－カルボナトコバルト（ＩＩＩ）三水和物（Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ）を、Ｓｈｉｂａｔａ（Ｓｈｉｂａｔａ、１９８３；Ｍｏｒｉら、１９５６の適合化）によって記載されたように溶液中で合成した。簡単に述べると、２４ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．１モル（２４ｇ）のＣｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；２５５５９９）と、４０ｍｌの３０％過酸化水素との混合物を、７０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の０．７モル（７０ｇ）の重炭酸カリウム（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；２３７２０５）の氷冷スラリーに撹拌しながら滴下添加した。続いて、得られる緑色の溶液を吸引により濾過し、以下の実験のために直接使用する。

【0202】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の調製
ナトリウム塩から［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を生産するために、５８０μモル（２１０ｍｇ）のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを、ｄｄＨ_２Ｏ中の２ｍｌの１Ｍ重炭酸ナトリウムおよび２Ｍニトリロ三酢酸三ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ；Ｎ０２５３）に添加し、スラリーを３０分超音波処理した。７０℃で７２時間のインキュベーション後、３ｍｌの１Ｍ重炭酸ナトリウムを新しいピンク色がかったスラリーに添加し、混合物を７０℃で２時間超音波処理した。続いて、スミレ色の上清を、ＮＭＲ分析に提出した。カリウム塩から生産された錯体については、Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを、０．１モルのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（上を参照されたい）から溶液中で合成した後、０．１モルのニトリロ三酢酸三ナトリウム塩（２５．７ｇ）を、（Ｓｈｉｂａｔａ、１９８３）に記載のように６０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏと共に添加した。６０℃での連続撹拌下で３時間のインキュベーション後、得られたスミレ色の溶液を濾過し、水性酢酸でｐＨをｐＨ７．３に調整した。最後に、溶液を４℃で一晩インキュベートし、白色の沈降物から除去し、ＮＭＲ分析に提出した。錯体［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｄ_２Ｏ）］－を得るために、５ｍＭのニトリロ三酢酸（Ｓｉｇｍａ；７２５５９）と、５ｍＭのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏとの混合物を、Ｄ_２Ｏ中のストック溶液から生産し、ＮＭＲ測定の前に室温で１５分インキュベートした。Ｄ_２Ｏ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ；ＨＮ８１．３）中にニトリロ三酢酸を溶解するために、少量の１０Ｍ ＮａＯＨを、対応するストック溶液に添加した。純粋なＮＴＡの測定のために、Ｄ_２Ｏ中の５ｍＭ溶液を、上記のように調製されたストック溶液から調製した。^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚの共鳴周波数でＪｅｏｌ ＥＣＺ４００Ｓ分光計上、室温で測定した。シグナルノイズ比を改善するために、最大３２のシグナルをフーリエ変換の前に付加した。得られたスペクトルの強度を、７ｐｐｍで正規化し、全てのｐｐｍ値を、４．７０ｐｐｍでの水ピークに調整した。

【0203】

純粋なＮＴＡならびにコバルトおよび水または炭酸イオンリガンドとのその錯体のＨ^１－ＮＭＲスペクトルを測定することにより、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体の形成を確認した（図５）。純粋なＮＴＡの水素のスペクトルは、４．７０ｐｐｍでの遍在性の水ピークの他に、約３．６ｐｐｍでのピークを示し、これは、ソフトウェアＮＭＲ Ｐｒｅｄｉｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｍｒｄｂ．ｏｒｇ／ｎｅｗ＿ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ？ｖ＝ｖ２．１０３．０）（ＢａｎｆｉおよびＰａｔｉｎｙ、２００８；Ｃａｓｔｉｌｌｏら、２０１１；Ａｉｒｅｓ－ｄｅ－Ｓｏｕｓａら、２００２）によって実施されたシミュレーション（計算値３．５７ｐｐｍ）と一致している。ＮＴＡが、コバルトおよび水（ここで、Ｈ^１－ＮＭＲ測定値のため、重水（Ｄ_２Ｏ）が使用される）との錯体（［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｄ_２Ｏ）_２］^－；図５Ｂ）または炭酸イオンとの錯体（［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－；図Ｃ＋Ｄ）を形成する場合、約３．６ｐｐｍでの元のピークは、それぞれ、リガンドとしてのＤ_２Ｏについては約３．８ｐｐｍに、炭酸イオンに関しては約１．９ｐｐｍにシフトした。錯体の生産のためにナトリウムまたはカリウムコバルト（ＩＩＩ）炭酸イオンを使用したかどうかに関係なく、類似するピークシフトが観察された。ＮＴＡピークのシフトは、さらなる原子が錯体化プロセス中に水素原子のごく近くに来るため、ＮＴＡ中の水素原子の磁気環境が変化することを示す。したがって、コバルト（ＩＩＩ）炭酸イオンを用いて生産された錯体に関する異なるピークシグとの観察は、最終的なコバルト－ＮＴＡ錯体中の水リガンドの代わりに炭酸イオンリガンドの存在を強く示す。

【0204】

実施例５：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］により形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体の化学的安定性
アガロースビーズに連結されたＮＴＡとの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を、Ｈｉｓタグ付タンパク質ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲと共にインキュベートして、アガロースビーズ上に固定された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］を形成させた。続いて、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体の化学的安定性を評価した。対照として、従来のＮｉ^２＋ＮＴＡに基づくマトリックスを用いた。

【0205】

蛍光タンパク質ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（配列番号１５）を、プラスミドｐＲｓｅｔＢ－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４９０８１）（Ｔａｎｔａｍａ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２０１３）を使用して大腸菌ＤＨ５α中で発現させ、（Ｔａｎｔａｍａ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｆｒａｎｃｏｉｓら、２０１３）に記載されたようにＮｉ^２＋－ＮＴＡカラムにより精製した。

【0206】

ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、１０２２９６３）を、１）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）３倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５で、３）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した後、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１０倍ビーズ容量の１ｍＭ Ｎａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは１ｍＭ Ｎｉ（ＩＩ）ＳＯ_４を添加した。１１００ｒｐｍで振とうする２３℃でのサーモシェーカー中で４８時間インキュベートした後、ビーズを、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回、１０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。最後に、タンパク質緩衝剤中の１倍ビーズ容量の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ（配列番号１５）を添加し、サーモシェーカー上、１１００ｒｐｍで振とうしながら４℃で４８時間インキュベートして、タンパク質をマトリックスに結合させた。１０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で２回洗浄した後、３倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤を添加し、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２０００）を使用してＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ蛍光（λ_ｅｘ＝５００ｎｍ、λ_ｅｍ＝５４５ｎｍ）について分析した。錯体の安定性を試験するために、１０倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールまたはタンパク質緩衝剤のみを添加した後、ビーズを、１０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で洗浄することによって除去した。最後に、ビーズを、３倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１０μｌのビーズスラリーを、残存する蛍光について分析した。全ての実験を、三重に実施した。

【0207】

図６に示されるように、対照として使用した［Ｎｉ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体は、キレーターイミダゾール処理に対して低い安定性を示した。際だって対照的に、コバルト（ＩＩＩ）炭酸イオンにより形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］プレ錯体は、イミダゾールに対して強い安定性を示す。錯体の測定された安定性は、間接的な酸化方法（実施例１で用いられたもの）を用いて生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］錯体と類似する。したがって、このデータは、驚くべきことに、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＰｅｒｃｅｖａｌＨＲ）］を、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－プレ錯体を使用することによって高い効率で酸化ステップなしに形成させることができることを確認する。

【0208】

実施例６：Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－に対する結合速度
実施例４は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を形成させることができることを実証する。さらに、実施例５は、ＮＴＡによりビーズに連結された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を合成し、驚くべきことに、これを使用して、ビーズ上で［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を形成させることができることを示す。本発明者らは、コバルト（ＩＩＩ）中心でのリガンドとしての炭酸イオンは、［ＣｏＩＩＩ（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成を容易にし得ると推測した。この知見を確認するために、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－に対する結合効率を直接比較した。

【0209】

ＮＴＡアガロースビーズの官能化
ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、１０２２９６３）を、１）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）１０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５で、３）それぞれ、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体については、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および６．７倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体については、１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および６．７倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、８．７倍ビーズ容量の、ｄｄＨ_２Ｏ中の１ｍＭ Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体について）または１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体について）を添加した。１１００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中で１８時間インキュベートした後、ビーズを、それぞれ、６．７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）（［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の１試料について）または１Ｍ ＮａＨＣＯ_３（図７中の「１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］」と称される［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の１試料について）で洗浄した。最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体を含む試料については、２回目の洗浄を、６．７倍ビーズ容量の、ｄｄＨ_２Ｏ中の２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２を用いて実施し、サーモシェーカー（１１００ｒｐｍ）上、２５℃で１時間インキュベートした。

【0210】

Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの、官能化されたＮＴＡアガロースビーズに対する結合速度
生産されたビーズを、３．３倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中の２０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートし、サーモシェーカー上、１１００ｒｐｍで振とうしながら４℃でインキュベートした。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－の１試料（図７において「１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］」と称される）については、タンパク質緩衝剤の代わりに１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を使用した。未結合のタンパク質の画分を、種々の時点でプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）において１００μｌ上清の蛍光強度（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）を測定することによって分析した。

【0211】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
上記のような、官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーションが終結した後、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを、６．７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で３回洗浄し、６．７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、最後に、１００μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）について分析した。錯体の安定性を試験するために、１．７倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤中の１．２５Ｍイミダゾール（最終濃度２５０ｍＭ）を添加し、６．７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤でビーズを３回洗浄した後、サーモシェーカー上、１１００ｒｐｍ、２５℃で１０分インキュベートした。最後に、ビーズを、６．７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１００μｌのビーズスラリーを、残存する蛍光について分析した。全ての実験を、三重に実施した。

【0212】

これらの実験の結果は、炭酸イオン分子が会合したＣｏ^３＋錯体が、水分子がＣｏ^３＋に結合した錯体よりも有意に速くタンパク質に結合することを明確に示している（図７Ａ）。一致して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体で官能化されたビーズは、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］を予めロードしたビーズよりも有意に多くのタンパク質に結合する（図７Ｂ）。さらに、図７Ｂは再度、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体が、キレーター（ここではイミダゾール）に対する強い安定性を示すことを確認するものである。

【0213】

実験はさらに、タンパク質結合前に１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を用いてビーズに結合した［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－を洗浄することにより、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ結合がさらに容易になることを示す。理論によって束縛されるものではないが、緩衝剤中のＨＣＯ_３ ^－および／またはＣＯ_３ ^２－の存在は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の、より遅く増強する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体への変換を防止すると考えられる。本発明の実験では、Ｈｉｓ－タンパク質結合を、「１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］」試料（上記参照）については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３の存在下でも実施したが、タンパク質結合中の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３の存在は、仮にあったとしても、非常に小さい程度で寄与するに過ぎないと想定される。これは、タンパク質結合中に、炭酸イオンリガンドがＣｏ^３＋錯体から遊離するのが望ましく、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３の存在によって容易になるよりもむしろ妨害され得るからである。

【0214】

実施例７：様々な緩衝剤系中でのＨｉｓタグ付タンパク質の、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－への結合速度
［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成を、反応緩衝剤の組成を変化させることによって改善することができるかどうかを決定した。

【0215】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたビーズを、小さく改変して実施例６に記載のように調製した：ビーズ洗浄ステップ１）～３）を、５倍ビーズ容量の対応する溶液で実施した。３）においては、２回目および３回目の洗浄ステップを、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を用いて行った。金属を、６．５倍ビーズ容量でロードした。金属結合後、ビーズを、５倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。

【0216】

また、Ｈｉｓタグ付ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーションを、５倍ビーズ容量の１０μＭタンパク質溶液を使用し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４を５０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０または５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５で置き換えることによってタンパク質緩衝剤を適合させたこと以外は、実施例６に記載のように実施した。さらに、タンパク質インキュベーションの最初の２４時間を、４℃の代わりに室温で実施した。

【0217】

実験は、Ｔｒｉｓに基づく緩衝剤を、ＨＥＰＥＳまたは特に、ＭＥＳもしくはＢｉｓＴｒｉｓに基づく緩衝剤などの非配位緩衝剤によって置き換えた場合、反応速度および効率を有意に改善することができることを示した。２４時間のインキュベーション後、Ｔｒｉｓに基づく緩衝剤に関する７５％と比較して、ＭＥＳおよびＢｉｓＴｒｉｓに基づく緩衝剤を使用した場合に、全タンパク質の９５％がビーズ上に固定された（図８Ａ）。さらに、図７Ａと図８Ａとの結果の比較は、タンパク質インキュベーションの最初の２４時間の温度の増大および／または１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を用いた洗浄は、Ｈｉｓ－タンパク質配位を容易にすることを示す。インキュベーションの既に３時間後、ＭＥＳまたはＢｉｓＴｒｉｓに基づく緩衝剤を使用した場合、約８０％のタンパク質をビーズに結合させることができた。対照的に、Ｔｒｉｓに基づく緩衝剤中では、５０％未満のタンパク質がビーズ上に固定された。合理的な時間尺度で非常に高効率でＨｉｓタグ付タンパク質を［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体と配位することができることが示された。

【0218】

様々なタンパク質緩衝剤について示されたｐＨ値は、溶液をビーズに添加する前のｐＨを示すことに注目されたい。ビーズ上に残存する２回目の洗浄ステップからの残留ＮａＨＣＯ_３のため、全試料中のｐＨは、タンパク質とのインキュベーション中に８．５～９であった（ｐＨ測定によって検証した）。したがって、全ての緩衝溶液中の非常に類似するｐＨ値のため、実験は、緩衝物質自体がＨｉｓ－タンパク質結合に対する影響を有することを明確に示す。Ｔｒｉｓ緩衝剤と比較してＧｏｏｄの緩衝剤ＭＥＳおよびＢｉｓＴｒｉｓの観察されたより良好な性能は、Ｃｏ３^＋と錯体を形成することができないＧｏｏｄの緩衝剤の使用が、Ｔｒｉｓ緩衝剤などの、そのような錯体を形成することができる緩衝剤の使用と比べて有利であることを示唆する。

【0219】

実施例８：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－のＵＶ－Ｖｉｓ分析
実施例４は、ＮＭＲによって、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を形成させることができることを実証する。以下の実施例では、別の技術、すなわち、ＵＶ－Ｖｉｓによる吸光度測定によって、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体の形成を証明する。

【0220】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の調製：
［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を生産するために、１時間の超音波処理を用いて溶液中に塩を溶解した後、０．２２μｍフィルターを通す濾過ステップを行うことによって、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭのＮａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏの溶液を調製する。続いて、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３溶液中の０．９５ｍＭのＮａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏと、ｄｄＨ_２Ｏ中に溶解した０．９５ｍＭのＮＴＡ三ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ；Ｎ０２５３）との混合物を、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中で調製する。２５℃で１時間のインキュベーション後、明るいスミレ色の溶液の可視光吸収を、ＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ分光光度計（Ｃａｒｙ５０００）上、１ｃｍのキュベット（Ｂｒａｎｄ；７５９１５０）中で測定した。

【0221】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体の調製：
［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体を生産するために、０．９５ｍＭのＣｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．９５ｍＭのＮＴＡ三ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ；Ｎ０２５３）および２０ｍＭのＨ_２Ｏ_２の混合物を、ｄｄＨ_２Ｏ中で調製する。２５℃で２４時間のインキュベーション後、明るいスミレ色の溶液の可視光吸収を、ｄｄＨ_２Ｏを用いるブランクに対して、ＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ分光光度計（Ｃａｒｙ５０００）上、１ｃｍのキュベット（Ｂｒａｎｄ；７５９１５０）中で測定した。

【0222】

図９における結果は、それぞれ、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体についての４０２ｎｍから、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体についての３９０ｎｍへの、または５６７ｎｍから５７３ｎｍへの２つのピークのシフトにより、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体中の金属結合リガンドとしての炭酸イオンの配位を明確に示している。

【0223】

実施例９：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－へのＨｉｓ_６－ＧＦＰの配位ならびにＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯとＮＴＡとの様々なインキュベーション時間および温度後の形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性
実施例４は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を、ＮＴＡと、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏとのインキュベーションによって形成させることができることを実証する。以下の実施例では、得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体へのＨｉｓ_６－ＧＦＰ配位に対する、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯとＮＴＡとの様々なインキュベーション時間および温度の効果ならびにイミダゾールに対する最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性を精査する。

【0224】

ＮＴＡアガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ；１０２２９６３）を、１）２７倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）２７倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）２７倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回および２７倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回、洗浄した。続いて、１６倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを添加し、ビーズを１４００ｒｐｍでサーモシェーカー中、示されたように４℃、２５℃または７０℃で１分、１０分、３０分、１時間、２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回洗浄した。

【0225】

官能化された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－アガロースビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１２倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら４８時間、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0226】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７．２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。２５μｌのビーズスラリー上の固定されたタンパク質の量を、製造業者の指針に基づいてマイクロプレート中でのＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ、２３２２７）によって決定した。実験を、三重に実施した。

【0227】

図１０に示されるこれらの実験の結果は、タンパク質を４８時間のような長期間にわたってインキュベートした場合、緩衝剤ならびにイミダゾール処理後に、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯおよびＮＴＡのインキュベーション時間と、アガロースビーズ上の固定されたＨｉｓ－ＧＦＰの量との間に正の相関があることを明確に示している。７０℃でのインキュベーションについては、ＮＴＡへのＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏの配位は高温では当然加速されるため、反応は、既に１分後にはその飽和点に達すると考えられる。さらに、図１０ＡおよびＢに示される４℃および２５℃で実施されるインキュベーションについては、インキュベーション時間は、錯体安定性と正に相関する。２５℃でのインキュベーションについては、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーションで既に高い錯体安定性に達するが、４℃のインキュベーションについては、この安定性は２４時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション後にのみ達する。したがって、安定な錯体形成は、より高い温度で加速されると想定される。

【0228】

実施例１０：様々な温度での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたビーズへのＨｉｓ－タンパク質結合の速度
以下の実施例では、様々なＨｉｓ－タンパク質インキュベーション時間後、および３つの異なる温度での、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズへのタンパク質結合ならびに得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体のイミダゾールに対する安定性を検査する。

【0229】

ＮＴＡ磁気アガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８６０５）を、１）２６倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）２６倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）２６倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および２６倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を添加し、ビーズを、１４００ｒｐｍでサーモシェーカー上、２５℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で３回洗浄した。

【0230】

官能化された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－磁気アガロースビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら示されるように４、２５または３７℃で、示されるように１分、１０分、３０分、１時間、２時間、３．５時間または２４時間にわたって、１２０倍ビーズ容量の、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、最終的に、１６０倍ビーズ容量の対応する洗浄緩衝剤中に再懸濁した。

【0231】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分に分割し、それぞれ、倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤を用いた最後の洗浄後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。最後に、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0232】

図１１Ａに記載されるように、イミダゾール処理されたビーズ上の固定されたタンパク質の量は、Ｈｉｓ－ＧＦＰと、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化されたビーズとのインキュベーション時間と共に増加する。全てのタンパク質インキュベーション時間および温度について、イミダゾールに対する得られた錯体の高い安定性を観察することができた（図１１Ｂ）。

【0233】

実施例１１：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を形成するためのＫ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを使用する安定性
実施例４は、Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯをＮＴＡと共にインキュベートすることによる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体の形成を示す。以下の実施例では、Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを用いて生産された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体へのＨｉｓ－ＧＦＰの配位ならびに得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体のイミダゾールに対する化学的安定性を検査する。

【0234】

ＮＴＡ磁気アガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化された磁気アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８６０５）を、１）６００倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）６００倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）６００倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回および６００倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ３中の１ｍＭ Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３のみを添加した。Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを、実施例４に記載のように生産した。濃度の計算は、合成プロセスの１００％の還元効率の仮定に基づく。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、示されるように１０分または４８時間にわたって示されるような試料をインキュベートした後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で３回洗浄した。

【0235】

官能化されたＮＴＡ磁気ビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１２０倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、示されるように１時間または４８時間、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0236】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0237】

図１２に記載される結果は、Ｈｉｓ－ＧＦＰが、Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯとＮＴＡとのインキュベーションによって形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体に配位することができることを明確に示す。得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体は、イミダゾール処理に対する高い化学的安定性を示す。Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏはより高い濃度で可溶性であるため、Ｋ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏの使用は、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏよりも高い濃度で金属結合ドメインとのインキュベーションを実施する可能性を提供する。

【0238】

実施例１２：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－へのＨｉｓ_６－ＧＦＰの配位および様々なタンパク質結合緩衝剤中での形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性
実施例７は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－へのＨｉｓタグ付タンパク質の結合速度に対する様々な緩衝物質の効果を示す。以下の実施例では、様々な異なる緩衝剤系中、２つの異なるＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズへのタンパク質結合ならびに得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体のイミダゾールに対する安定性を検査する。

【0239】

ＮＴＡ磁気アガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８６０５）を、１）１８２倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）１８２倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料については、１８２倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回および１８２倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回、または、４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料については、１８２倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および１８２倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を添加し、ビーズを、１４００ｒｐｍでサーモシェーカー上、示されたように１０分または４８時間、２５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料については２回または４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料については３回洗浄した。

【0240】

官能化された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－磁気アガロースビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢｉｓＴｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＣＡＰＳ、ＴＡＰＳに基づくタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ緩衝剤ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）またはＰＢＳ中の、１２０倍ビーズ容量の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、示されたように１分、１５分、１時間または２４時間にわたって２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料についてはタンパク質緩衝剤で、または４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間分析を用いる試料については分析緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄し、最後に、１６０倍ビーズ容量の対応する洗浄緩衝剤中に再懸濁した。

【0241】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料のためのビーズを、２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。１０μｌのビーズスラリー上の固定されたタンパク質の量を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）により分析した。１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料については、ビーズを、最初の１６０倍ビーズ容量の、タンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール、次いで、１６０倍ビーズ容量のタンパク質結合緩衝剤を用いる洗浄処理の前後に分析した。実験を、三重に実施した。

【0242】

結果は、全ての緩衝剤系において、ｈｉｓタグ付タンパク質を、化学的に安定な様式でビーズに固定することができることを明確に示していた。それにより、安定な錯体の割合は、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料（図１３）と比較して、４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料（図１４）において、より高い。全ての緩衝剤系およびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間について、イミダゾール処理後の固定されるタンパク質の量は、タンパク質インキュベーション時間と共に増加する。それにより、異なる緩衝剤系は、１０分のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間と比較して、４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料において反応速度に対するより大きな影響を有する。４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料上でのＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＰＩＰＥＳ緩衝剤の使用は、短いタンパク質インキュベーション時間でビーズ上に安定に固定されるタンパク質の量の増加をもたらすことが想定される（図１４Ｂ～Ｄ）。より長いインキュベーション時間について、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳまたはＡＣＥＳが良好な緩衝剤の選択であると想定される（図１４Ｅ）。

【0243】

実施例１３：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－へのＨｉｓ_６－ＧＦＰの配位に対するｐＨの効果および形成された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の安定性
実施例７は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－へのＨｉｓタグ付タンパク質の結合速度に対する、タンパク質結合緩衝剤のｐＨの効果を示す。以下の実施例では、それぞれ５つの異なるｐＨ値を有する２つのタンパク質結合緩衝剤系中での、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－で官能化された磁気アガロースビーズへのタンパク質結合ならびに得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体のイミダゾールに対する安定性を検査する。

【0244】

ＮＴＡ磁気アガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８６０５）を、１）２６倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）２６倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）２６倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および２６倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を添加し、ビーズを、１４００ｒｐｍでサーモシェーカー中、２５℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で、４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡインキュベーション時間を用いる試料について３回洗浄した。

【0245】

官能化された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－磁気アガロースビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、ＢｉｓＴｒｉｓに基づく系についてはｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０または７．５およびＨＥＰＥＳに基づく系についてはｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０または９．５を有するＢｉｓＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳに基づくタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ緩衝剤、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の、１２０倍ビーズ容量の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と混合し、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、示されたように１分、１５分、１時間または２４時間にわたって２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズとＨｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の分析緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄し、最後に、１６０倍ビーズ容量の分析緩衝剤中に再懸濁した。

【0246】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0247】

結果は、全てのｐＨ値において、ｈｉｓタグ付タンパク質を、化学的に安定な様式でビーズに固定することができることを明確に示していた。それにより、高いパーセンテージのＨｉｓ－ＧＦＰを、化学的に安定な様式で固定することができ、イミダゾール処理の前後での固定されるタンパク質の量は、タンパク質インキュベーション時間と共に増加する（図１５Ａ）。最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の錯体形成効率は、より低いｐＨ値でタンパク質結合緩衝剤と共に劇的に増加する（図１５Ｂ）。それにより、ｐＨに基づくだけでなく、緩衝剤系を起源とする効率の差異も観察することができた（ｐＨ７．５のＢｉｓＴｒｉｓ対ＨＥＰＥＳ）。

【0248】

実施例１４：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ）_３］^２－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ）_３］^－で官能化されたビーズへの、Ｈｉｓタグまたはヒスチジンリッチ領域による様々なタンパク質の固定化
いくつかの実施例は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ）_３］^２－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ）_３］^－によるＨｉｓ_６－ＧＦＰのビーズへの固定化を示す。以下の実施例では、様々なｈｉｓタグ付タンパク質ならびにｈｉｓ Ｆｃ部分のそのヒスチジンリッチ領域と配位した抗体のビーズへの固定化を試験する。さらに、固定された酵素（ソルターゼ）および抗体（固定された抗ＧＦＰ ＩｇＧ１へのＧＦＰ結合）の機能を精査する。

【0249】

ＮＴＡで官能化された磁気アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ；７８６０５）またはＩＤＡで官能化された磁気ビーズ（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；３０８０５）を、１）３３倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）３３倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）３３倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回ならびに金属を含まない、およびコバルト中心を含む試料については、３３倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で２回またはニッケル中心を含む試料については３３倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで３回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３またはニッケル中心を含む試料についてはｄｄＨ_２Ｏ中の１ｍＭ ＮｉＳＯ_４を添加し、ビーズを、１４００ｒｐｍでサーモシェーカー中、２５℃で１０分インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３またはニッケル中心を含む試料についてはｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した。

【0250】

官能化された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ／ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^２－磁気アガロースビーズへのタンパク質の固定化
生産されたビーズを、１２０倍ビーズ容量の、タンパク質結合緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中のタンパク質（１０μＭ Ｈｉｓ－ＧＦＰ（配列番号１４）；１０μＭ Ｈｉｓ－プロテインＡ（Ａｂｃａｍ；ａｂ５２９５３）；１０μＭ Ｈｉｓ－ソルターゼＡ（配列番号１６）；１μＭ Ｈｉｓ－ヒト血清アルブミン（ａｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒｏｎｌｉｎｅ；ＡＢＩＮ２１８１２２８）；０．２μＭ抗ＧＦＰマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；９０２６０５））と混合し、それぞれ、４８時間またはＩＤＡ試料については３０分にわたってサーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、タンパク質とのインキュベーション後、タンパク質上清の試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる後の分析のために保存し、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、最後に、１６０倍ビーズ容量の分析緩衝剤中に再懸濁するか、または抗体試料については、別の部分に記載されるようにＧＦＰインキュベーションを継続した。

【0251】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ／ＩＤＡ）（タンパク質）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ／ＩＤＡ）（タンパク質）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレス後に、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを、１７８倍ビーズ容量の、タンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。２５μｌのビーズスラリー上のタンパク質の量を、製造業者の指針に基づいてマイクロプレート中でのＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ、２３２２７）によって決定した。

【0252】

ビーズ上に固定されたソルターゼＡの機能の決定
２０μｌのビーズスラリー上の固定されたソルターゼＡの活性を、ＡｎａｓｐｅｃからのＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）５２０ Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔ（＃７２２２８）を用いて製造業者により記載されたように決定した。

【0253】

固定されたα－ＧＦＰ抗体へのＧＦＰ結合
固定された抗体の機能を評価するために、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ／ＩＤＡ）（ＩｇＧ１）］で官能化されたビーズを、１２０倍ビーズ容量の、タンパク質結合緩衝剤中の０．５４μＭ ＧＦＰ（Ｈｉｓタグを含まない）（Ａｂｃａｍ；ａｂ８４１９１）と共に、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、最後に１６０倍ビーズ容量の分析緩衝剤中に再懸濁し、ＩＤＡを含む試料の場合、上記のような化学的安定性の決定にかけた。最後に、固定された抗体に結合したＧＦＰを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用して１０μｌのビーズスラリーのＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）に基づいて決定した。

【0254】

タンパク質上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
タンパク質インキュベーション後のタンパク質上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥを、１２％（ｗ／ｖ）アクリルアミド－ビスアクリルアミド（３７．５：１）ゲルを使用し、ウェルあたり６μｌのタンパク質上清をロードすること以外は、実施例３に記載のように実施した。バンドの可視化を、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（Ｅｘｐｅｄｉｏｎ；ＩＳＢ１Ｌ）を用いて実施した。

【0255】

Ｈｉｓ－ソルターゼの精製
ソルターゼＡ酵素（配列番号１６）を、プラスミドｐＥＴ２９＿ｅＳｒｔＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃７５１４４）（Ｃｈｅｎ，Ｄｏｒｒら、２０１１）を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、（Ｃｈｅｎ，Ｄｏｒｒら、２０１１）に記載のようにＮｉ^２＋－ＮＴＡカラムにより精製した。

【0256】

図１６に提示される結果は、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの他に、他のＨｉｓタグ付タンパク質またはさらにはヒスチジンリッチ領域を介する抗体も、タンパク質結合中に上清から除去し（図１６Ａ）、最終的に、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ）_３］^２－または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ）_３］^－で官能化されたビーズ上に安定に固定することができる（図１６Ｂ）ことを明確に示している。さらに、例えば、ソルターゼＡ酵素は依然として活性である（図１６Ｃ）か、またはＮＴＡもしくはＩＤＡビーズ上に固定された抗ＧＦＰ抗体は依然としてその抗原であるＧＦＰに結合することができるため、固定されたタンパク質は依然として機能的であることを示すことができた。

【0257】

実施例１５：ＮＴＡ以外の他の金属結合ドメインを使用する錯体の形成および安定性
実施例４は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を形成させることができることを実証する。さらに、実施例５は、ＮＴＡによりビーズに連結された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を合成し、驚くべきことに、これを使用して、ビーズ上で［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を形成させることができることを示す。本発明者らは、ＮＴＡ以外の他の金属結合ドメインを使用して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を形成させることもできると推測した。イミノ二酢酸（ＩＤＡ）を用いた錯体形成方法の多用途性を試験するために、３座金属結合ドメイン、および市販の４座金属結合ドメインであるＴＡＬＯＮを検査した。

【0258】

ＩＤＡ／ＴＡＬＯＮ磁気ビーズの官能化
ＩＤＡで官能化された磁気ビーズ（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；３０８０５）またはＴＡＬＯＮで官能化された磁気アガロース樹脂（Ｔａｋａｒａ、６３５６３６）を、１）２０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）２０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）２０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および２０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３のみを添加した。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、１０分または４８時間にわたって示されるような試料をインキュベートした後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で３回洗浄した。

【0259】

官能化されたＩＤＡ／ＴＡＬＯＮ磁気ビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１６０倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、示されるように３０分、１時間または４８時間、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0260】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＴＡＬＯＮ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］または［Ｃｏ（ＩＩ）（ＴＡＬＯＮ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。両実験を、三重に実施した。

【0261】

実験は、金属結合ドメインとしてのＩＤＡ（図１７Ａ）およびＴＡＬＯＮ（図１７Ｂ）を用いたタンパク質固定化を明確に示す。したがって、コバルト（ＩＩＩ）炭酸イオン錯体によるコバルト（ＩＩＩ）媒介性タンパク質固定化は、金属結合ドメインとしてのＮＴＡの使用に限定されない。さらに、３座金属結合ドメインＩＤＡは、（図２０Ｂを参照されたい）と比較して短いインキュベーション時間にわたる改善された安定性などのさらに改善された特徴を示す。４座金属結合ドメインであるＴＡＬＯＮもまた、タンパク質固定化を示す。

【0262】

実施例１６：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性の精査
実施例１は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性を示す。実施例１５では、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の形成およびイミダゾールに対するその安定性が証明されている。以下の実施例では、「Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］で官能化されたビーズを、２５０ｍＭイミダゾールと組み合わせた、強力なキレーターまたは広く使用される還元剤と共にインキュベートして、ＩＤＡと、Ｃｏ^３＋金属中心との錯体が、ＮＴＡおよびＣｏ^３＋から構成される錯体が実施例１で示されたようにできるように、化学的に安定な錯体を形成することを示した。

【0263】

ＩＤＡ磁気ビーズの官能化
ＩＤＡで官能化された磁気ビーズ（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；３０８０５）を、１）２０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）２０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）２０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および２０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。続いて、１６０倍ビーズ容量の、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を添加し、ビーズを、１４００ｒｐｍでサーモシェーカー中、２５℃で１０分インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、２０倍ビーズ容量の１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で３回洗浄した。生産されたビーズを、１６０倍ビーズ容量の、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら３０分、２５℃でインキュベートした。Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共にインキュベートした後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で３回洗浄した。

【0264】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
続いて、１６０倍ビーズ容量の各試験試薬（最終濃度：タンパク質緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾール、２５ｍＭ ＮＴＡもしくは２５ｍＭ ＥＤＴＡまたはタンパク質緩衝剤中の１ｍＭ ＤＴＴ、ＴＣＥＰもしくは２５０ｍＭイミダゾールを添加したアスコルビン酸イオンまたは示されるような５０ｍＭグリシンｐＨ１０．０）を、対応する試料に添加した。１４００ｒｐｍで振とうしながら２５℃で１時間インキュベートした後、上清を除去し、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で３回洗浄し、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に溶解した。最後に、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその残存する固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0265】

実験は、キレーターおよび還元剤を含む異なる化学物質に対する［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の高い化学的安定性を明確に示す。図１８に記載されるように、緩衝剤のみで処理したビーズと比較して、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰを［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］錯体に結合させた場合、試験したキレーターまたは還元剤とのインキュベーション時に、固定されたものの非常にわずかな還元が観察された。かくして、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体は、強力なキレーターによる破壊およびＣｏ^２＋への還元に対して両方とも不活性である。

【0266】

実施例１７：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－対［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成の比較
実施例４は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を形成させることができることを実証する。さらに、実施例５は、ＮＴＡによりビーズに連結された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）ＣＯ_３］^２－錯体を合成し、驚くべきことに、これを使用して、ビーズ上で［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を形成させることができることを示す。実施例６では、Ｈｉｓ－ＧＦＰの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－への結合速度が、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］を使用する錯体形成に関する速度と比較して改善されることが示される。実施例１５では、ＩＤＡが、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）ＣＯ_３］^－による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成にとって可能な金属結合ドメインであることが示される。本発明者らは、コバルト（ＩＩＩ）中心でのリガンドとしての炭酸イオンは、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成を容易にし得ると推測した。この知見を確認するために、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－へのＨｉｓ_６－ＧＦＰの錯体形成効率ならびに最終的な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性を直接比較した。

【0267】

ＩＤＡ磁気ビーズの官能化
ＩＤＡで官能化された磁気ビーズ（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；３０８０５）を、１）８０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）８０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）それぞれ、８０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および８０倍ビーズ容量の、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３または［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^－錯体もしくは金属を含まない試料についてはｄｄＨ_２Ｏで１回、洗浄した。

【0268】

続いて、１６０倍ビーズ容量の、脱気したｄｄＨ_２Ｏ中の１ｍＭ Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋試料について）または１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［ＣＯ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体について）を添加した。金属を含まない試料に、１６０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏを添加した。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、１０分（または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体を用いる示された試料については４８時間）インキュベートした後、ビーズを、それぞれ、１６０倍ビーズ容量の、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を用いる試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で、または［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］試料もしくは金属を含まない試料についてはｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した。［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋を、１６０倍ビーズ容量で１回洗浄し、１４００ｒｐｍを用いるサーモシェーカー上、２５℃で１時間にわたって１６０倍ビーズ容量の２０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２中でインキュベートし、最後に、１６０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで１回洗浄した。

【0269】

官能化されたＩＤＡ磁気ビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１６０倍ビーズ容量の、示されたようなタンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）またはＰＢＳ中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、示されるように３時間または２４時間、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0270】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0271】

これらの実験の結果は、ＮＴＡおよびＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏを１０分インキュベートすることによって得られた［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体で官能化されたビーズが、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋を予めロードしたビーズよりも有意に多くタンパク質に結合することを明確に示す（図１９）。４８時間のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏインキュベーション後に得られた［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体で官能化されたビーズについて、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋錯体を超える有意な利点は、２４時間のタンパク質インキュベーション後にのみ見える。ＩＤＡに関する好ましいインキュベーション時間は、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ／ＮＴＡについては１０分であり、その後のタンパク質インキュベーションについては３０分～３時間であると強調される。これらのインキュベーション時間の組合せに関して、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］^＋と比較して［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^－錯体の有意な改善された固定化効率が達成される。さらに、図１９は再度、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体が、キレーター（ここではイミダゾール）に対する強い安定性を示すことを確認するものである。

【0272】

実施例１８：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（ＣＯ_３）］^２－による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の化学的に安定な錯体形成と、［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の酸素処理との比較
実施例５は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－により形成される高いパーセンテージの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体が化学的に安定であることを実証する。本発明者らは、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）ＣＯ_３］^２－から始まる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体形成が、［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］の酸素による処理よりも増大した量の化学的に安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体をもたらし得ると推測した。この知見を確認するために、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（ＣＯ_３）］による、または［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］の８時間の酸素処理による、形成された化学的に安定な［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の量を、それぞれ、金属結合ドメインとしてＮＴＡまたはＩＤＡを使用して直接比較した。

【0273】

ＩＤＡ／ＮＴＡ磁気アガロースビーズの官能化
ＩＤＡで官能化された磁気ビーズ（Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；３０８０５）またはＮＴＡで官能化された磁気アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ、７８６０５）を、１）８０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）８０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）８０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回およびそれぞれ、１６０倍ビーズ容量の、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体についてはｄｄＨ_２Ｏまたは［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体もしくは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で１回、洗浄した。［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］錯体を含む試料については、全ての洗浄を、脱気した、２０分窒素通気した溶液を用いて、ならびに窒素を上に載せたチューブ中で実施した。

【0274】

続いて、１６０倍ビーズ容量の、脱気した、２０分窒素通気したｄｄＨ_２Ｏ中の１ｍＭ Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］について）または１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏ（［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体について）を添加した。金属を含まない試料に、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を添加した。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、１０分（または［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体を含む示された試料については４８時間）インキュベートした後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量の、それぞれ、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈ_２Ｏ）_２］試料についてはｄｄＨ_２Ｏまたは［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体を含む試料もしくは金属を含まない試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３で３回洗浄した。

【0275】

官能化されたＩＤＡ／ＮＴＡ磁気ビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１２０倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら、金属を含まない試料について、または図９に示されるように３０分または４８時間、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で２回（「Ｈ_２Ｏ_２による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」試料については１回のみ）洗浄し、最後に、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤を添加した。［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の１つの試料（図２０中で「Ｏ_２による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」と称される）に、８時間にわたってＯ_２を通気したが、［Ｃｏ（ＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の別の試料（図９中で「Ｈ_２Ｏ_２による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」と称される）では、６．４倍ビーズ容量の５００ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２（最終２０ｍＭ）を添加し、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍ、２５℃で１時間インキュベートした後、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で洗浄した。

【0276】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ／ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］または［Ｃｏ（ＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６０倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、２つの部分（それぞれ、７２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁し、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。ＩＤＡ実験を、三重に実施した；ＮＴＡ実験を、３つの独立した実験において一重に実施した。

【0277】

図２０で実証されるこれらの実験の結果は、酸素を用いて８時間にわたって［Ｃｏ（ＩＩ）（金属結合ドメイン）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体で官能化されたビーズに通気する場合よりも、有意に多くのＨｉｓ_６－ＧＦＰタンパク質を、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＩＤＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体（図２０Ａ）および［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体（図２０Ｂ）を使用してビーズ上に化学的に安定に固定することができることを明確に示す。高いパーセンテージの安定な錯体の他に、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（金属結合ドメイン）（ＣＯ_３）］^２－の使用も、酸化方法よりも速い。

【0278】

実施例１９：表面上への［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体によるタンパク質固定化
本発明のいくつかの実施例は、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－による［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成を示す。本実施例では、この原理を用いたタンパク質固定化を、ナノ構造金ドットを用いたガラス表面上で試験する。

【0279】

ナノ構造ガラス表面の生産および不動態化
ナノ構造表面を、走査電子顕微鏡によって決定された場合に５８ｎｍの平均粒子空間を有する、以前に記載された（Ｓｐａｔｚ、Ｍｏｓｓｍｅｒら、２０００、Ｒｏｍａｎ、Ｍａｒｔｉｎら、２００３、Ｌｏｈｍｕｌｌｅｒ、Ａｙｄｉｎら、２０１１）ジブロックコポリマーミセルナノリソグラフィーによって生産した。簡単に述べると、それぞれ、５ｍｇ／ｍｌのポリスチレン（５０１）－ｂ－ポリ－２－ビニルピリジン（３２３）（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｎａｄａ）を、ｏ－キシレンに溶解した。続いて、０．５のテトラクロロ金酸のビニルピリジンモノマーに対する比で溶液に添加し、２４時間撹拌した。溶液を、２０ｘ２０ｍｍのＮ１ガラスカバースリップ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でスピンコーティングした。その後、基質を、プラズマ手順（１０％Ｈ_２／９０％Ａｒ、３５０Ｗ、０．４ｍｂａｒ、４５分）にかけた。

【0280】

金ナノ構造の間のガラス基質への任意のタンパク質の非特異的接着を防止するために、ガラス表面を、以前に記載のような手順（Ｂｌｕｍｍｅｌ、Ｐｅｒｓｃｈｍａｎｎら、２００７）に従って不動態化した。したがって、ナノパターン化された表面を、酸素プラズマ（１５０Ｗ、０．４ｍｂａｒ、１０分）中で活性化し、窒素雰囲気下、０．２５ｍＭのα－メトキシ－ω－トリメトキシシリルポリ（エチレングリコール）（分子量２０００ｇ／ｍｏｌ）（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５．５μＭの水および２０ｍＭの乾燥トリメチルアミン（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＵＳＡ）を含有する乾燥トルエンｐ．ａ．（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＵＳＡ）中、８０℃で一晩インキュベートした。最後に、基質を、酢酸エチル（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＵＳＡ）で３回、メタノール（ＶＷＲ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）で１回洗浄し、Ｎ_２流下で乾燥した。

【0281】

チオール－ＰＥＧ－ＮＴＡを用いた表面の官能化
不動態化後、９９．８％エタノール中の１００μｌの０．５ｍＭ ＨＳ－（ＣＨ_２）_１１－ＥＧ_３－ＮＴＡ（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ；ＴＨ００７）または「ＰＥＧのみ」および「ＰＥＧ／ＧＦＰ」試料についてはエタノールのみを、それぞれの表面上にピペットで加えた。室温で１時間インキュベートした後、表面を、ｄｄＨ_２Ｏ浴中で、または「［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」試料については、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中で３回洗浄した。

【0282】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成
官能化後、表面を、「［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の４００μｌの１ｍＭ Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは他の試料についてはｄｄＨ_２Ｏで覆い、室温で１０分インキュベートした。続いて、表面を、「［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］」試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３または他の試料についてはｄｄＨ_２Ｏの浴中で３回洗浄した。最後に、タンパク質結合緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の３００μｌの１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰを、表面の頂部に添加し、室温で３０分インキュベートした。タンパク質結合緩衝剤の浴中で３回洗浄した後、表面を、透明な６ウェルプレート中に入れ、タンパク質結合緩衝剤で覆い、表面上の固定されたタンパク質の尺度としてのＧＦＰ－蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用して分析した。

【0283】

実験の結果を、図２１に提示する。それにより、他の対照試料と比較して、チオール－ＰＥＧ－ＮＴＡ、Ｎａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２ＯおよびＨｉｓ－ＧＦＰで処理した表面に関するはるかにより高い蛍光シグナルを測定することができたが、これは、表面上での［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の形成の成功を示す。

【0284】

実施例２０：［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体を用いたＨｉｓ－ＧＦＰの部位特異的ビオチン化
いくつかの実施例では、Ｈｉｓタグ付タンパク質のビーズへの固定化および実施例１９では、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］^２－錯体によるＮＴＡで官能化された表面が示される。以下の実施例では、溶液中での、［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体によるそのＨｉｓタグでのＨｉｓ－ＧＦＰのビオチン化を試験する。

【0285】

Ｈｉｓ－ＧＦＰのビオチン化
６０μＭのビオチン－Ｘ－ＮＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；５１４１０）を、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の３０μＭ（試料１：２）、６０μＭ（試料１：１）もしくは６００μＭ（試料１０：１）のＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏまたは金属を含む試料については１Ｍ ＮａＨＣＯ_３のみと混合し、回転ホイール上、室温で１０分インキュベートする。続いて、得られる［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（ＣＯ_３）］錯体を、回転ホイール上で３０分または４８時間、タンパク質結合緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の６μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）の溶液と共に室温でインキュベートする。

【0286】

ストレプトアビジンで官能化されたセファロースへの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］の固定化
インキュベーション後、得られた［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体を、室温で回転させながら示されたような３０分または４８時間のインキュベーションステップにおいて、１６６倍ビーズ容量のタンパク質結合緩衝剤で３回洗浄することによって調製された、ストレプトアビジンで官能化されたセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５１１３－０１）に結合させた。インキュベーション後、ビーズを、１６倍ビーズ容量のタンパク質結合緩衝剤で３回洗浄し、１６倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0287】

［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
ビーズへの［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ビオチン－Ｘ－ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－ＧＦＰ）］錯体の固定化プロセスの後、化学的ストレスを用いて、または用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分に分割し、それぞれ、１７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。最後に、１０μｌのビーズスラリーを、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｓｐａｒｋ）を使用してＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３５ｎｍ）によりその固定されたタンパク質の量について分析した。実験を、三重に実施した。

【0288】

図２２Ａに提示されるように、溶液中で、Ｈｉｓタグ付ＧＦＰのビオチン化を、全てのＣｏ／ＮＴＡ比について示すことができた。しかしながら、ストレプトアビジンビーズ上に固定されたビオチン化されたタンパク質の蛍光に基づいて測定された場合、ビオチン－Ｘ－ＮＴＡのＮａ_３［Ｃｏ（ＩＩＩ）（ＣＯ_３）_３］・３Ｈ_２Ｏに対する比が高いほど、より良好な標識化効率を達成することもできた。図２２Ｂでは、４８時間のタンパク質インキュベーション後により多くの錯体が、１０分のタンパク質インキュベーションを用いた試料と比較して、ストリンジェントなイミダゾール洗浄後にストレプトアビジンビーズ上に固定されるため、タンパク質インキュベーションが長いほど、安定な形成される錯体の量が多いことが示される。

【0289】

実施例２１：白金（ＩＶ）硝酸イオンを使用する［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］の錯体形成および化学的安定性
本発明者らは、リガンドとしての炭酸イオンだけでなく、金属中心にある硝酸イオンも、［（金属）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体の形成を容易にすることができると推測した。さらに、本発明者らは、Ｃｏ^３＋の他に、低いリガンド交換速度を示す他の遷移金属も、化学的に安定な［（金属）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ－タンパク質）］錯体を形成することができると推測する。この知見を確認するために、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰの［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］の結合効率を検査した。

【0290】

ＮＴＡアガロースビーズの官能化
ＮＴＡで官能化されたアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ；１０２２９６３）を、１）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで、２）１０倍ビーズ容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で、３）１０倍ビーズ容量のｄｄＨ_２Ｏで２回および１０倍ビーズ容量の１Ｍ硝酸で１回、洗浄した。続いて、１６倍ビーズ容量の、１Ｍ硝酸中の白金（ＩＶ）硝酸イオン溶液（４４ｍｇ／ｌのＰｔ（ＩＶ））（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１５４０７８１７）または金属を含まない試料については１Ｍ硝酸のみを添加した。１４００ｒｐｍ、２５℃でサーモシェーカー中、１０分にわたって試料をインキュベートした後、ビーズを、１６倍ビーズ容量の１Ｍ硝酸で３回洗浄した。

【0291】

官能化された［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（ＮＯ_３）］アガロースビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化
生産されたビーズを、１６倍ビーズ容量の、タンパク質緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１０μＭ Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）と共に、サーモシェーカー上、１４００ｒｐｍで振とうしながら３０分、２５℃でインキュベートした。官能化されたビーズと、Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ（配列番号１４）とのインキュベーション後、ビーズを、１６倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で１回洗浄し、１６倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。

【0292】

［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体の化学的安定性
示された［Ｐｔ（ＩＶ）（ＮＴＡ）（Ｈｉｓ_６－ＧＦＰ）］錯体形成プロセスを実施した後、化学的ストレスを用いて、および用いずに、ビーズに結合したタンパク質の量を分析した。このために、ビーズを２つの部分（それぞれ、７．２倍ビーズ容量）に分割し、それぞれ、１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤またはタンパク質結合緩衝剤中の２５０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤で最後に洗浄した後、ビーズを、１７．８倍ビーズ容量のタンパク質緩衝剤中に再懸濁した。２５μｌのビーズスラリー上のタンパク質の量を、製造業者の指針に基づいてマイクロプレート中でのＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ、２３２２７）によって決定した。実験を、三重に実施した。

【0293】

図２３に記載される結果は、白金（ＩＶ）が、化学的に安定な様式でＮＴＡで官能化されたビーズへのＨｉｓ_６－ＧＦＰの固定化を媒介したことを明確に示す。これは、コバルト（ＩＩＩ）だけでなく、白金（ＩＶ）も、ＮＴＡおよびｈｉｓタグ付タンパク質と速度論的に不活性な錯体を形成することができることを証明する。さらに、非常に速い錯体形成を、金属結合リガンドとしての硝酸イオンの使用によって示すことができた。

【0294】

上記の本文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に言及する。
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【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

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【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

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【図12】

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【図14-2】

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【図15-1】

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【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2022537337000001.app

【国際調査報告】