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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-26
(54)【発明の名称】β－グルカン組成物およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/716 20060101AFI20220819BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220819BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220819BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220819BHJP
【ＦＩ】
A61K31/716
A61P37/02
A61P35/00
A61P29/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021574227
(86)(22)【出願日】2020-06-15
(85)【翻訳文提出日】2022-02-09
(86)【国際出願番号】 CN2020096224
(87)【国際公開番号】W WO2020249133
(87)【国際公開日】2020-12-17
(31)【優先権主張番号】201910526252.0
(32)【優先日】2019-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521544883
【氏名又は名称】正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】521544894
【氏名又は名称】青▲島▼▲海▼洋生物医▲薬▼研究院股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】于 ▲廣▼利
(72)【発明者】
【氏名】▲呂▼ 友晶
(72)【発明者】
【氏名】曲 ▲顯▼俊
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ 晨▲陽▼
(72)【発明者】
【氏名】▲ハオ▼ 杰杰
(72)【発明者】
【氏名】李 全才
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ 峡
(72)【発明者】
【氏名】胡 ▲ティン▼
(72)【発明者】
【氏名】菅 ▲華▼▲詩▼
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086NA14
4C086ZB07
4C086ZB11
4C086ZB26
(57)【要約】
β－グルカン組成物およびその用途。具体的には、免疫関連疾患を改善または治療するための組成物の調製におけるβ－グルカン組成物の応用を提供し、前記β－グルカンは、分子内にβ－１，３およびβ－１，６グルコシド結合を含むβ－グルカンであり、その分子量は、１～５０ｋＤａである。前記β－グルカンは、新しい構造、制御可能な品質、豊富な供給源、簡単な調製プロセス、高い製品純度、強力な生物学的活性および容易な工業生産等の利点を有し、得られた水溶性β－グルカン組成物は、より優れた抗腫瘍活性を有し、安全で効果的な新しい免疫関連疾患の改善または治療用および抗腫瘍薬として開発されることが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
β－グルカン組成物であって、前記組成物は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に示される構造を有するβ－グルカンを含み、
【化1】
【請求項2】
前記式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造におけるＲは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）または式（Ｖ）または式（ＶＩ）の構造のうちの一つまたは複数であり、ここで、式（ＩＩＩ）：Ｇｌｃβ１－、
式（ＩＶ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（Ｖ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６－Ｇｌｃβ１－、
式（ＶＩ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６－Ｇｌｃβ１－３－Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ－であることを特徴とする、請求項１に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項3】
前記β－グルカン組成物において、重合度５～１０の重量含有量は、０～５０．０％であり、重合度１０～２０の重量含有量は、０～８０．０％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、０～２５．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、０～４５．０％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、０～３０．０％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、０～１５．０％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、０．１％～５５．０％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、０．１％～２０．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．１％～１５．０％であり、重合度＞８０の重量含有量は、０～４０．０％であることを特徴とする、請求項１に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項4】
前記β－グルカン組成物において、重合度５～１０の重量含有量は、０～４５．０％であり、重合度１０～２０の重量含有量は、０～７５．０％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、０～２０．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、０～４０．０％であり、重合度が３０～４０であるβ－グルカンの重量含有量は、０～２５．０％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、０～１０．０％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、０．１％～５０．０％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、０．１％～１５．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．１％～１０．０％であり、重合度＞８０の重量含有量は、０～３５．０％であることを特徴とする、請求項３に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項5】
前記β－グルカン組成物は、重合度が２０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度２０～２５の重量含有量は、１３．２％～１９．８％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、２９．１～４３．７％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、１８．２～２７．４％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、７．３～１０．９％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、４．５％～６．７％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、３．５％～５．３％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、４．２％～６．２％であることを特徴とする、請求項４に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項6】
前記β－グルカン組成物は、重合度が２０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度２０～２５の重量含有量は、１６．５％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、３６．４％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、２２．８％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、９．１％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、５．６％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、４．４％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、５．２％であることを特徴とする、請求項４に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項7】
前記β－グルカン組成物は、重合度が１０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度１０～２０の重量含有量は、４０．６％～６０．８％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、１３．４％～２０．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、７．７％～１１．５％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、７．６％～１１．４％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、４．２％～６．２％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、２．３％～３．５％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、１．６％～２．４％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．８％～１．２％であることを特徴とする、請求項４に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項8】
前記β－グルカン組成物は、重合度が１０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度１０～２０の重量含有量は、５０．７％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、１６．７％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、９．６％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、９．５％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、５．２％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、２．９％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、２．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、１．０％であることを特徴とする、請求項４に記載のβ－グルカン組成物。
【請求項9】
免疫関連疾患を改善または治療するための組成物の調製における、請求項１～８のいずれか１項に記載のβ－グルカンの使用。
【請求項10】
前記免疫関連疾患は、腫瘍または炎症であることを特徴とする、免疫関連疾患を改善または治療するための組成物の調製における、請求項９に記載のβ－グルカンの使用。
【請求項11】
前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、線維肉腫、黒色腫、腎臓がん、肝臓がん、乳がん、またはその組み合わせから選択されることを特徴とする、免疫関連疾患を改善または治療するための組成物の調製における、請求項１０に記載のβ－グルカンの使用。
【請求項12】
免疫関連疾患を改善または治療するための組成物であって、前記組成物は、
（１）上記請求項中に記載のβ－グルカン、および
（２）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物の分野に関し、具体的には、β－グルカン組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
研究によると、様々な供給源のβ－１，３－グルカンは、抗腫瘍、免疫調節、老化防止および抗炎症性特性を含む、様々な生物学的活性を有する。現在、市場に出回っているほとんどのβ－１，３－グルカンは、大麦、オーツ麦、食用キノコ（椎茸、舞茸（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、担子菌（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ））、酵母等の陸生生物に由来し、原料の供給源が異なるため、得られたβ－１，３－グルカンの分子量、結合様式および分枝度等が大きく異なり、品質の管理が困難であり、例えば、注射用のβ－グルカンは、主に椎茸に由来し、β－１，６－分枝を有するβ－１，３－グルカン（ＬＮＴ）であり、その分子量が４００～８００ｋＤａに達するため、水溶性が低く、分離および精製が困難で、不純物含有量が高くなる。β－グルカンの応用分野の継続的な拡大、市場需要量の継続的な増殖により、既存の椎茸β－グルカンは、もはや市場の需要を満たすことはできない。
【0003】
従って、制御可能な品質、豊富な供給源、簡単な調製プロセス，高い製品純度、強力な生物学的活性および容易な工業生産を備えたβ－グルカンを開発することが当技術分野において緊急に必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、β－１，３／１，６－グルカンの具体的な構造および免疫関連疾患を治療するための組成物の調製における当該組成物の応用を分析することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の第１の態様は、β－１，３／１，６－グルカンの組成物を提供し、前記組成物は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）に示される構造を有するβ－グルカンを含み、
ここで、ｎは、１～２０から選択される整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、Ｒは、Ｈおよび／または４個以下のグルコース残基である（例えば、１、２、３または４個のグルコース残基）。
【化1】
【0006】
好ましくは、前記式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造におけるＲは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）または式（Ｖ）または式（ＶＩ）の構造のうちの一つまたは複数であり、ここで、
式（ＩＩＩ）：Ｇｌｃβ１－、
式（ＩＶ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（Ｖ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（ＶＩ）：
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ－である。
式（ＩＩＩ）：Ｇｌｃβ１－、
式（ＩＶ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（Ｖ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（ＶＩ）：
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ－である。
【0007】
好ましくは、前記β－グルカン組成物において、重合度５～１０の重量含有量は、０～５０．０％であり、重合度１０～２０の重量含有量は、０～８０．０％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、０～２５．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、０～４５．０％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、０～３０．０％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、０～１５．０％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、０．１％～５５．０％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、０．１％～２０．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．１％～１５．０％であり、重合度＞８０の重量含有量は、０～４０．０％である。
【0008】
好ましくは、前記β－グルカン組成物において、重合度５～１０の重量含有量は、０～４５．０％であり、重合度１０～２０の重量含有量は、０～７５．０％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、０～２０．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、０～４０．０％であり、重合度が３０～４０であるβ－グルカンの重量含有量は、０～２５．０％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、０～１０．０％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、０．１％～５０．０％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、０．１％～１５．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．１％～１０．０％であり、重合度＞８０の重量含有量は、０～３５．０％である。
【0009】
好ましくは、前記β－グルカン組成物は、重合度が２０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度２０～２５の重量含有量は、１３．２％～１９．８％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、２９．１～４３．７％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、１８．２～２７．４％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、７．３～１０．９％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、４．５％～６．７％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、３．５％～５．３％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、４．２％～６．２％である。
【0010】
好ましくは、前記β－グルカン組成物は、重合度が２０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度２０～２５の重量含有量は、１６．５％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、３６．４％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、２２．８％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、９．１％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、５．６％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、４．４％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、５．２％である。
【0011】
好ましくは、前記β－グルカン組成物は、重合度が１０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度１０～２０の重量含有量は、４０．６％～６０．８％であり，重合度２０～２５の重量含有量は、１３．４％～２０．０％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、７．７％～１１．５％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、７．６％～１１．４％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、４．２％～６．２％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、２．３％～３．５％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、１．６％～２．４％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、０．８％～１．２％である。
【0012】
好ましくは、前記β－グルカン組成物、前記β－グルカン組成物は、重合度が１０～８０であるβ－グルカンで構成され、ここで、重合度１０～２０の重量含有量は、５０．７％であり、重合度２０～２５の重量含有量は、１６．７％であり、重合度２５～３０の重量含有量は、９．６％であり、重合度３０～４０の重量含有量は、９．５％であり、重合度４０～５０の重量含有量は、５．２％であり、重合度５０～６０の重量含有量は、２．９％であり、重合度６０～７０の重量含有量は、２．０％であり、重合度７０～８０の重量含有量は、１．０％である。
【0013】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカン分子量は、１～５０ｋＤａ、好ましくは、２～３０ｋＤａ、より好ましくは、２～１０ｋＤａである。
【0014】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンの比旋光度は、－１５．０°以上、好ましくは、－１５°～－２５°、より好ましくは、－１６°～２１°である。
【0015】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンにおいて、硫酸ラジカルの含有量は、０．０１ｗｔ％～２ｗｔ％、好ましくは、０．０１ｗｔ％～０．５ｗｔ％である。
【0016】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンにおいて、塩素イオンの含有量は、０．０１ｗｔ％～２ｗｔ％、好ましくは、０．０１ｗｔ％～０．５ｗｔ％である。
【0017】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンにおいて、タンパク質の含有量は、０．０１ｗｔ％～５ｗｔ％、好ましくは、０．０１ｗｔ％～０．５ｗｔ％である。
【0018】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンの紫外線全波長走査スペクトルは、３００～９００ｎｍの波長範囲内で明らかな吸収はなく、より好ましくは、２３０～９００ｎｍの波長範囲内で明らかな吸収はない。
【0019】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンの紫外線全波長走査スペクトルは、２６０～２８０ｎｍの波長範囲内で吸収ピークを有さない。
【0020】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンの側鎖において、少なくとも２０％の側鎖の長さは、１または２個のグルコース残基である。
【0021】
好ましくは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に示される構造のβ－グルカンにおいて、少なくとも３～２０個のＲは、それぞれ独立して、１または２個のグルコース残基である。
【0022】
好ましくは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に示される構造のβ－グルカンにおいて、少なくとも３～１０個のＲは、それぞれ独立して、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）等の構造であり、ここで、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）構造は、上記で定義されたとおりである。
【0023】
好ましくは、前記β－１，３／１，６－グルカンの側鎖において（Ｒ≠Ｈの場合）、少なくとも５％の側鎖（Ｒ）の長さは、３または４個のグルコース残基であり（好ましくは、５～１５％、より好ましくは５～１０％の側鎖の長さは、３または４個のグルコース残基である）、残りの側鎖（Ｒ）の長さは、１または２個のグルコース残基である。
【0024】
好ましくは、側鎖（Ｒ）の長さが１または２個のグルコース残基である場合、側鎖（Ｒ）は、それぞれ独立して、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）の構造であり、ここで、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）の構造は、上記で定義されたとおりである。
【0025】
好ましくは、側鎖（Ｒ）の長さが３または４個のグルコース残基である場合、側鎖（Ｒ）は、それぞれ独立して、式（Ｖ）または式（ＶＩ）の構造であり、ここで、式（Ｖ）または式（ＶＩ）構造は、上記で定義されたとおりである。
【0026】
本発明の第２の態様は、免疫関連疾患を改善または治療するための組成物の調製における、第１の態様に記載のβ－グルカンまたは第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物の用途を提供する。
好ましくは、前記免疫関連疾患は、腫瘍または炎症である。
好ましくは、前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、線維肉腫から選択される。
好ましくは、前記免疫関連疾患は、腫瘍または炎症である。
好ましくは、前記腫瘍は、結腸直腸がん、肺がん、線維肉腫から選択される。
【0027】
本発明の第３の態様は、免疫関連疾患を改善または治療するための組成物を提供し、前記組成物は、
（１）第１の態様に記載のβ－グルカンまたは第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物、および
（２）薬学的に許容されるベクターを含む。
（１）第１の態様に記載のβ－グルカンまたは第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物、および
（２）薬学的に許容されるベクターを含む。
【0028】
本発明の第４の態様は、第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンまたは第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物の調製方法を提供し、次のような段階を含む。
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出：前記脱脂藻類粉末を室温下で水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）等級付け段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、透析または限外ろ過脱塩を実行し、減圧濃縮および乾燥して、粗多糖類を得る。
（４）精製段階：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出：前記脱脂藻類粉末を室温下で水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）等級付け段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、透析または限外ろ過脱塩を実行し、減圧濃縮および乾燥して、粗多糖類を得る。
（４）精製段階：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
【0029】
別の好ましい例において、前記陰イオン樹脂の分離および精製は、強陰イオン子樹脂の分離および精製である。
【0030】
別の好ましい例において、前記陰イオン樹脂の分離および精製は、まず強陰イオン樹脂の分離および精製、次に弱陰イオン樹脂の分離および精製であるか、または，まず弱陰イオン子樹脂の分離および精製、次に強陰イオン樹脂の分離および精製である。弱陰イオン樹脂と強陰イオン樹脂とを組み合わせることで、意外と、不純物をより効果的に除去することができ、より長い側鎖グルコース残基、より高い純度、および三重らせん構造を有するβ－１，３／１，６－グルカンを得ることができる。
【0031】
好ましくは、前記強陰イオン樹脂は、第四級アンモニウム基を含む陰イオン樹脂である。
【0032】
好ましくは、前記弱陰イオン樹脂は、ジエチルアミノエチル基を含む陰イオン樹脂である。
【0033】
好ましくは、前記南極の褐藻は、海のキノコ、海の芽および／またはレッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）、南極のダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）である。
【0034】
本発明の第５の態様は、免疫チェックポイント薬物および／または化学治療剤の併用における、第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物の用途を提供する。
【0035】
好ましくは、前記免疫チェックポイント薬物は、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）拮抗剤、ＰＤ－Ｌ１拮抗剤、細胞毒性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ－４）拮抗剤、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）拮抗剤、Ｔ細胞免疫グロブリン－３（ＴＩＭ－３）拮抗剤、Ｔ細胞免疫グロブリン、ＩＴＩＭドメインタンパク質（ＴＩＧＩＴ）拮抗剤、またはその組み合わせから選択される。
【0036】
好ましくは、前記免疫チェックポイント薬物は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択される。
【0037】
好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＢＭＳ２０２、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、またはその組み合わせから選択される。
【0038】
好ましくは、前記化学治療剤は、細胞毒性化学治療剤から選択される。
【0039】
好ましくは、前記化学治療剤は、アントラサイクリン、５－Ｆｕ、アルカロイドのうちの一つから選択される。
【0040】
好ましくは、前記化学治療剤は、シスプラチン、カルボプラチンのうちの一つまたは複数から選択される。
【0041】
好ましくは、免疫チェックポイント薬物および／または化学治療剤と併用して使用された前記薬物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。
【0042】
本発明の第６の態様は、薬物組み合わせを提供し、前記薬物組み合わせは、次のような成分を含む。
【0043】
（ｉ）第１の有効成分：前記第１の有効成分は、第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物である。
【0044】
（ｉｉ）第２の有効成分：前記第２の有効成分は、免疫チェックポイント薬物および／または化学治療剤を含む。
【0045】
好ましくは、前記第１の有効成分および第２の有効成分は、単一の剤形またはそれぞれ独立した剤形である。
【0046】
好ましくは、前記免疫チェックポイント薬物は、上記で定義されたとおりである。
【0047】
好ましくは、前記化学治療剤は、上記で定義されたとおりである。
【0048】
本発明の第７の態様は、白血球および／または血小板減少症を治療するための薬物または製剤の調製における、第１の態様に記載のβ－１，３／１，６－グルカンの組成物の用途を提供する。
【0049】
好ましくは、前記白血球は、リンパ球である。
【0050】
好ましくは、前記リンパ球は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞である。
【0051】
好ましくは、前記薬物または製剤は、免疫チェックポイント薬物と併用して使用することもできる。
【0052】
好ましくは、免疫チェックポイント薬物と併用して使用された前記薬物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。
【0053】
好ましくは、前記薬物または製剤は、少なくとも一つの化学治療剤と併用して応用されることもできる。
【0054】
好ましくは、化学治療剤と併用して応用された前記薬物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。
【0055】
好ましくは、前記薬物または製剤は、個体の癌を治療するために使用される。
【0056】
好ましくは、前記癌症は、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がんのうちの一つまたは複数である。
【0057】
好ましくは、前記薬物または製剤は、薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤をさらに含む。
【発明の効果】
【0058】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】側鎖が式（ＩＶ）中のＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβである場合のＥＳＩ－ＣＩＤ－ＭＳ／ＭＳグラフを示す。
【図2】側鎖が式（ＩＶ）中のＧｌｃβ１－３Ｇｌｃβである場合のＥＳＩ－ＣＩＤ－ＭＳ／ＭＳグラフを示す。
【図3】側鎖が式（Ｖ）中の構造である場合のＥＳＩ－ＣＩＤ－ＭＳ／ＭＳグラフを示す。
【図4】側鎖が式（ＶＩ）中の構造である場合のＥＳＩ－ＣＩＤ－ＭＳ／ＭＳグラフを示す。
【図5】実施例２の重量平均分子量検出を示す。
【図6】実施例７の重量平均分子量検出を示す。
【図7】実施例７の重合度分布の分析を示す。
【図8】β－グルカン組成物がコンゴーレッド最大吸収波長をシフトできることを示す。
【図9】β－グルカン組成物が式（ＩＩ）の構造を有する場合の１３Ｃ－ＮＭＲグラフを示す。
【図10】β－１，３／１，６－グルカンが顆粒球よりも単球対して高い親和性を有することを示す。（Ａ～Ｃ）リンパ球（赤い点ＣＤ１１ｂ－）、単球（緑の点ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）、顆粒球（青い点ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）のフローサイトメトリー。（Ｄ）血球をβ－１，３／１，６－グルカン－ＦＩＴＣ（２００μｇ／ｍＬ）と３７℃で２時間共培養する。続いて、赤血球は溶解され、細胞は対応するフロースルー抗体で染色する。フローサイトメトリーによって単球（緑の色、ＣＤ１１ｂ＋）および顆粒球（青い色、ＣＤ１１ｂ＋）へのβ－１，３／１，６－グルカン－ＦＩＴＣの結合親和性を検出する。
【図11】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンが、細胞毒性なしに、ＢＭＤＭｓの食作用活性を増加させることを示す。（ＡおよびＢ）β－１，３／１，６－グルカンまたはＬＮＴを使用してＧＭ－ＢＭＤＭ（Ａ）およびＭ－ＢＭＤＭ（Ｂ）を２４時間インキュベートする。ニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）法によって二つのマクロファージの食作用活性を検出する。ＭＴＴ法（Ｃ、Ｄ）によって細胞生存率を検出する。
【図12】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンが、ＤＬＤ１異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍負荷を低減し、脾臓指数を改善することを示す。ＤＬＤ１腫瘍を移植したマウスは、ｖｅｈｉｃｌｅ（ビヒクル）または本発明のβ－１，３／１，６－グルカンで治療される。腫瘍体積（Ａ）および体重（Ｅ）を示す。腫瘍を切除し、写真を撮り（Ｂ）、秤量し（Ｃ）、脾臓指数（Ｄ）を計算する。
【図13】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンがＤＬＤ１異種移植モデルにおいてマクロファージ食作用活性および前炎症性サイトカイン分泌をアップレギュレートすることを示す。（Ａ）ｖｅｈｉｃｌｅまたは本発明のβ－１，３／１，６－グルカンで処理されたマウスの腹腔マクロファージによって貪食された９つの結腸直腸がん細胞株（ＨＣＴ－１１６、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、ＨＴ－２９、ＬＳ１８０、ＨＣＴ－１５、ＬＯＶＯ、Ｔ８４）を検出する。（Ｂ～Ｇ）Ｖ－ＰＬＥＸマウス炎症性因子キット（ＬａｂＥｘ）を使用して、薬物負荷グループおよび本発明のβ－１，３／１，６－グルカングループにおけるマウス血漿前炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルを検出する。
【図14】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンが、腫瘍微小環境において前炎症性マクロファージおよびＢ細胞を増加させることを示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって血液中のＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３５＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を検出する。（Ｂ）血中好中球（ＣＤ１１ｂ＋ＬＹ６Ｇ＋）および前炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）の割合を検出する。（Ｃ～Ｆ）腫瘍浸潤ＣＤ１１ｂ＋細胞、単球由来浸潤マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）、ＴＡＭｓ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８０＋またはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋）、ＣＤ１９＋細胞の割合を検出する。（Ｇ）ｖｅｈｉｃｌｅおよび本発明のΒ－１，３／１，６－グルカン（小さな腫瘍グループおよび大きな腫瘍グループ）で治療されたマウス腫瘍におけるＣＤ４５＋白血球の割合を測定する。
【図15】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンがＡＯＭ－ＤＳＳ誘発性結腸直腸がんモデルにおける腫瘍負荷を低減することを示す。Ｃ５７マウスの未処理グループまたはＡＯＭ／ＤＳＳ誘発グループ、または誘発後の本発明のβ－１，３／１，６－グルカン（１、３および９ｍｇ／ｋｇ）処理グループ。（Ａ）治療後の各グループの体重を記録する。（Ｂ）犠牲後の結腸の長さを測定する。（Ｃ～Ｅ）結腸を縦方向に切開し、腫瘍数（ＣおよびＥ）および直径（Ｄ）を収集する。
【図16】本発明のβ－１，３／１，６－グルカンが、ＡＯＭ－ＤＳＳ投与によって引き起こされる免疫細胞組成物の変化を逆転させることを示す。（Ａ～Ｄ）血液中のＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３５＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１１ｃ＋の割合（Ａ）、脾臓中のＣＤ１９＋の割合（Ｂ）、リンパ節中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋の割合（Ｃ）を検出する。（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）それぞれ本発明のβ－１，３／１，６－グルカンで治療されるか、または本発明のβ－１，３／１，６－グルカンなしで治療される正常またはＡＯＭ／ＤＳＳマウスの血漿中の前炎症性サイトカインおよびケモカインレベルを検出する。
【図17】それぞれ調製例１および調製例２の方法に従って調製されたβ－１，３／１，６－グルカンの紫外線全波長走査スペクトルを示す。
【図18】実施例２１の実験結果を示す。（Ａ）は投与後のマウスの体内の平均腫瘍重量および阻害率を示し、（Ｂ）は投与後のマウスの体内の腺重量を示す。
【図19】実施例２２の実験結果を示す。（Ａ）はシスプラチンと併用して使用された場合のβ－１，３／１，６－グルカンおよびその抗腫瘍増殖量を示し、（Ｂ）は、雄の昆明マウスの腫瘍重量の阻害を示す。
【図20】実施例２５（ｉ）のＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの静脈内注射が、マウス結腸がんＭＣ３８マウス皮下移植腫瘍の増殖を効果的に阻害できることを示し、図において、ＰＤ１－２００（ｑｗ）は、ＰＤ－１抗体（２００ｇ／マウス）のグループを表し、ＰＤ１－２００（ｑｗ）＋ＢＧ０．３（ｂｉｗ）、ＰＤ１－２００（ｑｗ）＋ＢＧ１（ｂｉｗ）およびＰＤ１－２００（ｑｗ）＋ＢＧ３（ｂｉｗ）は、それぞれβ－１，３／１，６－グルカン（０．３、１または1ｍｇ／ｋｇ）グループと併用したＰＤ１抗体（２００mｇ／マウス）を表す。
【図21】ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの静脈内注射が、マウス結腸がんＭＣ３マウス移植腫瘍の免疫関連サイトカインの発現量に及ぼす影響を示す。
【図22】ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの経口投与が、マウス結腸がんＭＣ３８マウス移植腫瘍の増殖に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0060】
以下、添付の図面および具体的な実施例と併せて本発明の技術的解決策をされに詳細に説明し、添付の図面と併せて本発明の具体的な実施例を読んだ後、本発明の他の利点および特徴は、より明確であるが、本発明の保護の範囲は、実施例によって説明される範囲に限定されない。当業者は、以下の開示の本質に従って、本発明に対していくつかの修正および調製を行うことができ、これらの調製も本発明の範囲に属する。
【0061】
用語
特に定義しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される以下の用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。特に明記しない限り、本明細書の全体で引用されるすべての特許、特許出願、出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
特に定義しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される以下の用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。特に明記しない限り、本明細書の全体で引用されるすべての特許、特許出願、出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0062】
１）重合度（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）：ｄｐは、ポリマー高分子の繰り返し構造ユニットの数を指し、糖類化合物において、重合度は、一般に化合物の単糖残基の数を指す。
【0063】
２）多糖（Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）：グリコシド結合によって形成される糖鎖を指し、複数の単糖残基の縮合および脱水によって形成される高分子炭水化物である。
【0064】
３）グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）：Ｇｌｃは、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６、自然界で最も広く分布し、最も重要な単糖である。
【0065】
４）オリゴ糖（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）：オリゴ糖とも呼ばれ、グリコシド結合を介して２～２０個の同じまたは異なる単糖残基を結合することによって形成される糖類化合物である。
【0066】
５）糖残基：糖類物質の加水分解後に得られる加水分解された基を指す。
【0067】
６）グルコースオリゴ糖：グリコシド結合によって結合されたグルコース残基から構成されるオリゴ糖を指す。
【0068】
７）グルカン：グリコシド結合によって結合されたグルコース残基で構成される多糖類である。
【0069】
８）ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）は、マススペクトルでより一般的に使用されるイオン化法である。
【0070】
９）ＣＩＤ：衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、中性分子と衝突することによってエネルギーがイオンに移動するプロセスであり、エネルギー伝達が結合の切断および再配列を引き起こすのに十分である。
【0071】
１０）ＭＳ：質量分析法（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、イオンの電荷対質量比（電荷対質量比）を測定する分析方法である。
【0072】
本発明において、「β－１，３／１，６－グルカン」および「β－グルカン」は、交換可能に使用され、その概念表現は、同じ意味を有する。
【0073】
本発明において、「β－１，３／１，６－グルカン」は、式Ｉの構造、式ＩＩの構造、またはその誘発形態、またはその組み合わせを含み、例えば、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン組成物において、式Ｉの構造は、０～１００％であり得、残りは、式ＩＩの構造であり、または式ＩＩの構造は、０～１００％であり得、残りは、式Ｉの構造である。本発明において、式ＩＩの構造は、開環の式Ｉと見なすことができる。さらに、式Ｉおよび式ＩＩは、適切な条件または試薬によって互いに交換することができる。
【0074】
別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンは、２６０～２８０ｎｍの吸収ピークを含まないか、または基本的に含まない。
【0075】
別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの旋光度は、－１５°より大きく、例えば、－１５°～－２５°の間、好ましくは、－１６°～－２１°の間である。
【0076】
本明細書において、「強陰イオン樹脂」および「強陰イオン交換樹脂」は、交換可能に使用され、第四級アミン基等のより強い反応性基を含む陰イオン樹脂を指す。一般的に、強陰イオン樹脂は、スルホン酸基、カルボキシル基等の基を有する不純物を除去するために使用されることができる。
【0077】
本明細書において、「弱陰イオン樹脂」および「弱陰イオン交換樹脂」は、交換可能に使用され、如ジエチルアミノエチル基等のより弱い反応性基を含む陰イオン樹脂を指す。一般的に、弱陰イオン樹脂は、核酸、タンパク質、色素等の不純物を除去するために使用されることができる。
【0078】
本発明の主な利点および有益な効果は次のとおりである。
【0079】
本発明のβ－グルカン組成物は、異なる重合度を有し、異なる分枝および側鎖を有するβ－グルカンの混合物であり、側鎖は、β－１，３－およびβ－１，６－グルコースから構成され、側鎖の長さは、４個の糖残基を超えず、構造は新しく、品質は制御可能であり、本発明によって得られたβ－グルカン組成物は、より優れた抗腫瘍活性を有し、免疫関連疾患を改善または治療するための新しいタイプの安全で効果的な抗腫瘍薬に開発することが期待される。
【0080】
特に、本発明者は、β－１，３／１，６－グルカンの調製方法をさらに改良し、強陰イオンクロマトグラフィーおよび弱陰イオンクロマトグラフィーを組み合わせて精製することにより、紫外線全波長走査スペクトルで末端にのみ吸収ピークが現れ、かつ２３０－９００ｎｍの範囲内（特に２６０～２８０ｎｍの領域）に明らかな吸収ピークがなく、かつ旋光度がさらに増加（例えば、旋光度が－１５°～－２１°の範囲内である）したβ－１，３／１，６－グルカンを得た。
【0081】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常従来の条件または製造業者によって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量パーセンテージと重量部数とで計算される。
【0082】
実施例１．β－１，３／１，６－グルカンの調製
調製例１
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出段階：前記脱脂藻類粉末を室温下で蒸留水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）分級段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、蒸留水で透析または限外ろ過して脱塩し、減圧濃縮および乾燥して粗多糖類を得る。
（４）精製：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、強陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
調製例１
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出段階：前記脱脂藻類粉末を室温下で蒸留水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）分級段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、蒸留水で透析または限外ろ過して脱塩し、減圧濃縮および乾燥して粗多糖類を得る。
（４）精製：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、強陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
【0083】
特に説明しない限り、実施例２～１９で使用されるβ－１，３／１，６－グルカンまたは検証されたβ－１，３／１，６－グルカンは、当該調製例の方法によって調製される。
【0084】
調製例２
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出段階：前記脱脂藻類粉末を室温下で蒸留水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）分級段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、蒸留水で透析または限外ろ過して脱塩し、減圧濃縮および乾燥して、粗多糖類を得る。
（４）精製段階：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、強陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮する。
（５）第２回目の精製：段階（４）に記載の水溶出成分を、蒸留水を移動相として使用し、弱陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集する。
（６）脱色段階：段階（５）のに記載の水溶出成分を活性炭カラムで分離および精製し、蒸留水を移動相として使用し、水溶出成分を収集する。減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥および粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。
（２）水抽出段階：前記脱脂藻類粉末を室温下で蒸留水で攪拌および抽出して水抽出液を得る。
（３）分級段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、蒸留水で透析または限外ろ過して脱塩し、減圧濃縮および乾燥して、粗多糖類を得る。
（４）精製段階：段階（３）に記載の粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、強陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集し、減圧濃縮する。
（５）第２回目の精製：段階（４）に記載の水溶出成分を、蒸留水を移動相として使用し、弱陰イオン交換樹脂で分離および精製し、水溶出成分を収集する。
（６）脱色段階：段階（５）のに記載の水溶出成分を活性炭カラムで分離および精製し、蒸留水を移動相として使用し、水溶出成分を収集する。減圧濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。
【0085】
特に説明しない限り、実施例２０～２５で使用されるβ－グルカンまたは検証済みのβ－グルカンは、当該調製例の方法によって調製される。
【0086】
実施例２～７：β－グルカン組成物の分析
本実施例におけるβ－グルカン組成物は、十八角形レーザー光散乱装置（ＭＡＬＬＳ）および示差検出器（ＲＩ）と併用して、高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を使用して分析する。
本実施例におけるβ－グルカン組成物は、十八角形レーザー光散乱装置（ＭＡＬＬＳ）および示差検出器（ＲＩ）と併用して、高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を使用して分析する。
【0087】
測定方法：０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＳＯ４を使用して、β－グルカン組成物を様々な濃度の溶液に調製し、低濃度から高濃度までＤＮＤＣ機器に順次に注入し、β－グルカン組成物のｄｎ／ｄｃを計算する。十八角形レーザー光散乱装置（ＭＡＬＬＳ）および示差検出器（ＲＩ）を併用して、高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を使用して分析し、クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラムＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ（７．５×３００ｍｍ）、移動相０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＳＯ４、カラム温度３５℃、流速０．５ｍｌ／分間、示差検出器および十八角度レーザー検出器を併用する。β－グルカン組成物のｄｎ／ｄｃ測定値を代入して、β－グルカン組成物の重量平均分子量および分布分析（結果は表１および図５～７に示される）が得られる。
【0088】
重合度５～１０（Ｄｐ５～１０）のβ－グルカン、重合度１０～２０のβ－グルカン、重合度２０～２５のβ－グルカン、重合度２５～３０のβ－グルカン、重合度３０～４０のβ－グルカン、重合度４０～５０のβ－グルカン、重合度５０～６０のβ－グルカン、重合度６０～７０のβ－グルカン、重合度７０～８０のβ－グルカン、重合度＞８０のβ－グルカンの重量パーセンテージを計算する。
【0089】
実施例２～７で得られた結果は、表１に示される。
【0090】
【表1】
【0091】
実施例８：β－グルカン側鎖の長さの同定
１）β－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖の調製：β－グルカン組成物を溶解し、約５％の濃度に調製し、１０μｌのエンド－１，３－β－グルカナーゼを加え、４０℃下で８時間酵素加水分解する。１０分間煮沸し、遠心分離機で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを収集し、凍結乾燥して、β－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖を得る。
１）β－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖の調製：β－グルカン組成物を溶解し、約５％の濃度に調製し、１０μｌのエンド－１，３－β－グルカナーゼを加え、４０℃下で８時間酵素加水分解する。１０分間煮沸し、遠心分離機で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを収集し、凍結乾燥して、β－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖を得る。
【0092】
２）ＥＳＩ－ＣＩＤ－ＭＳ／ＭＳによって本発明のβ－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖の構造を分析する。マススペクトル条件は、ＬＴＱ－ＱｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計、キャピラリー電圧－３０００Ｖ、注入コーン電圧－５０Ｖ、イオン源温度８０℃、解離温度１５０℃、シース流量８ａｒｂ、サンプル流量３～５μＬ／分間である。衝突ガスは、ヘリウムガスであり、衝突電圧は、１５～３０ｅＶである。
【0093】
３）各重合度のβ－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖のマススペクトルグラフは、図１～４に示される。マススペクトルグラフ中の各信号ピークに対して割り当てることにより、β－グルカン組成物中の側鎖オリゴ糖の分子構造、即ち、一般式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）または式（Ｖ）または式（ＶＩ）に示される構造を検証する。ここで、図１は、側鎖が式（ＩＶ）中のＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβである場合のマススペクトルグラフを示し、図２は、側鎖が式（ＩＶ）中のＧｌｃβ１－３Ｇｌｃβである場合のマススペクトルグラフを示し、図３は、側鎖が式（Ｖ）中の構造である場合のマススペクトルグラフを示し、図４は、側鎖が式（ＶＩ）中の構造である場合のマススペクトルグラフを示す。
【0094】
実施例９：高級構造情報
本発明のβ－グルカン組成物は、三重らせん構造を有する。コンゴーレッドは、三重らせん鎖コンフォメーションを有する多糖類と複合体を形成することができ、複合体の最大吸収波長は、コンゴーレッドと比較して赤方偏移が発生する。本発明のβ－グルカン組成物は、塩基性条件下でコンゴーレッドと複合体を形成して、その最大吸収波長の赤方偏移が１５ｎｍを超えるようにすることができる（図８）。
本発明のβ－グルカン組成物は、三重らせん構造を有する。コンゴーレッドは、三重らせん鎖コンフォメーションを有する多糖類と複合体を形成することができ、複合体の最大吸収波長は、コンゴーレッドと比較して赤方偏移が発生する。本発明のβ－グルカン組成物は、塩基性条件下でコンゴーレッドと複合体を形成して、その最大吸収波長の赤方偏移が１５ｎｍを超えるようにすることができる（図８）。
【0095】
本発明のβ－グルカン組成物の還元末端は、糖アルコール構造を有する。式（Ｉ）の構造との違いは、式（ＩＩ）構造が還元末端に糖アルコール構造を有し、１３Ｃ－ＮＭＲにおいて、６３．１６ｐｐｍでの特徴的なシグナルとして現れることである（図９）。
【0096】
実施例１０：骨髄由来のマクロファージの食作用を増強することができるβ－１，３／１，６－グルカン
本実施例において、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン糖の、末梢血自然免疫細胞の二つの主要な集団、即ち、単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ、図１０Ａおよび１０Ｂ）および顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、図１０Ａおよび１０Ｃ）に対する結合親和性および選択性を検出する。図１０Ｄに示されるように、β－１，３／１，６－グルカン－ＦＩＴＣは、単球（１２．８％）によく結合し、ごく少数の顆粒球（１．５％）に結合する。
本実施例において、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン糖の、末梢血自然免疫細胞の二つの主要な集団、即ち、単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ、図１０Ａおよび１０Ｂ）および顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、図１０Ａおよび１０Ｃ）に対する結合親和性および選択性を検出する。図１０Ｄに示されるように、β－１，３／１，６－グルカン－ＦＩＴＣは、単球（１２．８％）によく結合し、ごく少数の顆粒球（１．５％）に結合する。
【0097】
続いて、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンが示差的に分極したＢＭＤＭｓの食作用活性に及ぼす影響を評価する。β－１，３／１，６－グルカンによってわずかにアップレギュレートしたマクロファージＧＭ－ＢＭＤＭｓおよびＭ－ＢＭＤＭｓの食作用活性は、図１１ＡおよびＢに示される。１０μｇ／ｍｌより高い用量の場合、構造的に類似したβ－グルカン（ｇｌｕｃａｎ）ＬＮＴの細胞食作用は、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの細胞食作用よりも高い（図１１Ｂ）。しかしながら、図１１Ｃおよび１１Ｄに示されるように、ＬＮＴは、用量依存の方式でＢＭＤＭｓの細胞生存率を有意に低下させる。本発明のβ－１，３／１，６－グルカンについては、１００μｇ／ｍｌの濃度下でも細胞毒性を観察されない。
【0098】
実施例１１：腫瘍移植マウスモデルにおいて腫瘍負荷を低減し、脾臓指数を改善する本発明のβ－１，３／１，６－グルカン
血液単球は、腫瘍微小環境に動員されてマクロファージに分化し、免疫阻害および腫瘍促進微小環境を生成する。免疫阻害マクロファージを前炎症性状態にリモデリングし、腫瘍微小環境を操作し、インビボでの腫瘍の増殖を阻碍する。ヒト結腸直腸がん細胞ＤＬＤ１異種移植マウスモデルにおける本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検出する。
血液単球は、腫瘍微小環境に動員されてマクロファージに分化し、免疫阻害および腫瘍促進微小環境を生成する。免疫阻害マクロファージを前炎症性状態にリモデリングし、腫瘍微小環境を操作し、インビボでの腫瘍の増殖を阻碍する。ヒト結腸直腸がん細胞ＤＬＤ１異種移植マウスモデルにおける本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検出する。
【0099】
図１２Ａ～Ｃに示されるように、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、腫瘍体積（図１２Ａ、図１２Ｂ）および腫瘍重量（図１２Ｃ）を阻害する。古典的な化学療法化合物とは異なり、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、用量に依存しない方法で腫瘍増殖を阻害することに留意すべきである。２ｍｇ／ｋｇの低用量のβ－１，３／１，６－グルカンは、高用量（４ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）よりも腫瘍増殖に対して強い阻害効果を示す（図１２Ａ）。本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、免疫刺激因子として、担癌マウスの脾臓指数を有意にアップレギュレートし、免疫細胞の活性化および浸潤が増加されたことを示唆する（図１２Ｄ）。どの処理も、マウス体重に有意な影響を与えない（図１２Ｅ）。
【0100】
実施例１２：インビトロでマクロファージの食作用活性および前炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌をアップレギュレートする本発明のβ－１，３／１，６－グルカン
本実施例において、対照グループおよび本発明のβ－１，３／１，６－グルカン処理グループのマウスの腹腔マクロファージを誘発し、９つの異なる結腸直腸がん細胞株と共培養し、マクロファージの食作用を検出する。
本実施例において、対照グループおよび本発明のβ－１，３／１，６－グルカン処理グループのマウスの腹腔マクロファージを誘発し、９つの異なる結腸直腸がん細胞株と共培養し、マクロファージの食作用を検出する。
【0101】
図１３Ａに示されるように、β－１，３／１，６－グルカングループのマウスによって誘発されたマクロファージは、我々が検出したすべての癌細胞株に対してより強い食作用活性を示す。サイトカインおよびケモカインの分泌は、体の免疫機能の活性化の重要な指標である。本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、前炎症性サイトカインの分泌（ＩＬ－１βおよびＴＮＦα、主に単球／マクロファージによって分泌される）を強力に増加させる。β－１，３／１，６－グルカン治療は、マクロファージ等の免疫細胞によって生成されたＩＬ－２、ＩＬ１２ｐ７０等の前炎症性サイトカインおよびケモカインＣＸＣＬ１の発現レベルをアップレギュレートすることもできる。β－１，３／１，６－グルカンの２ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇグループのマウスのＩＦＮγレベルは、増加される。これらのデータは、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンがインビボでマクロファージの食作用活性を誘発するだけでなく、前炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌を促進し、抗腫瘍効果を発揮することを示唆する。
【0102】
実施例１３：腫瘍微小環境において前炎症性マクロファージおよびＢ細胞の浸潤を増加させる本発明のβ－１，３／１，６－グルカン
循環血液系における免疫細胞組成物を検出する。Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）の割合が増加する一方で、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）の割合は、わずかに減少することが分かる（図１４Ａ）。β－１，３／１，６－グルカン治療は、骨髄性亜集団、前炎症性単球由来マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）の形成を誘発する（図１４Ｂ）。
循環血液系における免疫細胞組成物を検出する。Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）の割合が増加する一方で、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）の割合は、わずかに減少することが分かる（図１４Ａ）。β－１，３／１，６－グルカン治療は、骨髄性亜集団、前炎症性単球由来マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）の形成を誘発する（図１４Ｂ）。
【0103】
腫瘍を解剖し、腫瘍浸潤免疫細胞のパーセンテージを計算する。腫瘍内において、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療後に骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）のパーセンテージをわずかにアップレギュレートする（図１４Ｃ）。さらに、β－１，３／１，６－グルカンは、前炎症性単球由来マクロファージ亜集団（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）の浸潤を促進する（図１４Ｄ）。対照グループと比較して、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンマウスにおいて、抗腫瘍前炎症性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８０＋）は、アップレギュレートされ、元の腫瘍免疫阻害ＴＡＭｓ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋）はダウンレギュレートされる（図１４Ｅ）。これらのデータは、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療が腫瘍における抗腫瘍骨髄細胞の割合を調節することを示す。血液系におけるＢ細胞の誘発と一致し、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療後に、浸潤Ｂ細胞の割合も増加される（図１４Ｆ）。従って、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、全身性および腫瘍内免疫細胞の組成物を調節して、前炎症性および抗腫瘍状態にすることにより、インビボでの腫瘍増殖を阻害することができる。
【0104】
β－１，３／１，６－グルカンによって治療された腫瘍の体積に従ってそれをグループ化して、免疫細胞（ＣＤ４５＋）の浸潤を検出する。大きな腫瘍とは、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療グループにおいて体積が平均レベルより大きい腫瘍を指し、その逆も同様である。図１４Ｆに示されるように、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンによって治療されたすべての腫瘍は、より多くの免疫細胞（ＣＤ４５＋）を含む。さらに、大きな腫瘍は、小さな腫瘍よりも免疫細胞の浸潤が多かった。とにかく、これらのデータは、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンがインビボで前炎症性マクロファージ等の免疫細胞の腫瘍浸潤を誘発し、癌細胞増殖を阻害する可能性がある。
【0105】
実施例１４：ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発性結腸直腸がんモデルにおける腫瘍負荷を低減する本発明のβ－１，３／１，６－グルカン
免疫担当マウスの体内における本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検証するために、ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス結腸直腸がんモデルにおいて、β－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検出する。腫瘍進行の後期において、β－１，３／１，６－グルカングループは、１および３ｍｇ／ｋｇの用量下でｖｅｈｉｃｌｅグループよりも体重が高く、これらの治療されたマウスがより良い体調にあったことを示す（図１５Ａ）。３ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカン治療によって結腸の長さがわずかに増加されたことを除いて（図１５Ｂ）、結腸の長さに有意差は見られない。１ｍｇ／ｋｇの低用量のβ－１，３／１，６－グルカンによって治療された後でも、マウスあたりに誘発された結腸直腸腫瘍の数は減少する（図１５Ｃ）。図１５Ｄに示されるように、β－１，３／１，６－グルカンによって治療された後、３ｍｇ／ｋｇの用量下で、腫瘍直径が２ｍｍ～４ｍｍおよび４ｍｍ以上である腫瘍の数が減少する。ＡＯＭ／ＤＳＳを使用した後、本発明の１ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンは、ｖｅｈｉｃｌｅよりも直径が４ｍｍより大きい腫瘍の数をより少なく誘発する（図１５Ｅ）。
免疫担当マウスの体内における本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検証するために、ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス結腸直腸がんモデルにおいて、β－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を検出する。腫瘍進行の後期において、β－１，３／１，６－グルカングループは、１および３ｍｇ／ｋｇの用量下でｖｅｈｉｃｌｅグループよりも体重が高く、これらの治療されたマウスがより良い体調にあったことを示す（図１５Ａ）。３ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカン治療によって結腸の長さがわずかに増加されたことを除いて（図１５Ｂ）、結腸の長さに有意差は見られない。１ｍｇ／ｋｇの低用量のβ－１，３／１，６－グルカンによって治療された後でも、マウスあたりに誘発された結腸直腸腫瘍の数は減少する（図１５Ｃ）。図１５Ｄに示されるように、β－１，３／１，６－グルカンによって治療された後、３ｍｇ／ｋｇの用量下で、腫瘍直径が２ｍｍ～４ｍｍおよび４ｍｍ以上である腫瘍の数が減少する。ＡＯＭ／ＤＳＳを使用した後、本発明の１ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンは、ｖｅｈｉｃｌｅよりも直径が４ｍｍより大きい腫瘍の数をより少なく誘発する（図１５Ｅ）。
【0106】
実施例１５：ＡＯＭ－ＤＳＳによって誘発された免疫細胞組成物の変化を逆転させる本発明のβ－１，３／１，６－グルカン
ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発および本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療後に、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）を含む様々な免疫細胞の変化を観察する。ＡＯＭ／ＤＳＳは、循環血液系における骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）の割合を増加させ、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療によってこの傾向を逆転する（図１６Ａ）。同時に、β－１，３／１，６－グルカンは、インビボでＡＯＭ／ＤＳＳ投与によって引き起こされた血液（図１６Ａ）および脾臓（図１６Ｂ）でダウンレギュレートされたＢ細胞を増加させ、血液（図１６Ａ）およびリンパ節（図１６Ｃ）におけるＣＤ４Ｔ細胞の減少を逆転させる。従って、β－１，３／１，６－グルカン治療は、ＡＯＭ／ＤＳＳ投与によって引き起こされた免疫細胞組成の変化を逆転させる。さらに、本発明のΒ－１，３／１，６－グルカンは、炎症性因子ＩＦＮγ（図１６Ｄ）、ＴＮＦ－α等、およびケモカインＣＸＣＬ１の分泌のアップレギュレーションを誘発する（図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ、図１６Ｈ、および図１６Ｉ）。
ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発および本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療後に、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）を含む様々な免疫細胞の変化を観察する。ＡＯＭ／ＤＳＳは、循環血液系における骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）の割合を増加させ、本発明のβ－１，３／１，６－グルカン治療によってこの傾向を逆転する（図１６Ａ）。同時に、β－１，３／１，６－グルカンは、インビボでＡＯＭ／ＤＳＳ投与によって引き起こされた血液（図１６Ａ）および脾臓（図１６Ｂ）でダウンレギュレートされたＢ細胞を増加させ、血液（図１６Ａ）およびリンパ節（図１６Ｃ）におけるＣＤ４Ｔ細胞の減少を逆転させる。従って、β－１，３／１，６－グルカン治療は、ＡＯＭ／ＤＳＳ投与によって引き起こされた免疫細胞組成の変化を逆転させる。さらに、本発明のΒ－１，３／１，６－グルカンは、炎症性因子ＩＦＮγ（図１６Ｄ）、ＴＮＦ－α等、およびケモカインＣＸＣＬ１の分泌のアップレギュレーションを誘発する（図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ、図１６Ｈ、および図１６Ｉ）。
【0107】
これらのデータは、免疫担当マウスに対する本発明のΒ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果は、免疫細胞組成物の調節および免疫刺激因子としての前炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌に関連することを表す。
【0108】
実施例１６：ヌードマウスにおける散発性ヒト結腸がん細胞株の接種に対する本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの阻害効果
液体窒素で冷凍保存されたマウス結腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６を蘇生させ、１０％のウシ胎児血清を含む５Ａ培地で培養し、培養フラスコ内で培養細胞を増殖させ、必要な量の細胞に達した後、細胞を消化して収集し、１０％ウシ胎児血清を含む５Ａ培地で２５０００万／ｍｌの細胞懸濁液に希釈し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの右前肢腋窩に皮下接種し、腫瘍が１ｇの組織塊に増殖した場合、動物を犠牲にして腫瘍組織を剥がし、約２～３立方ミリメートルの腫瘍塊に切断し、カテーテル法によって継代ヌードマウスの皮下に移植し、２回連続継代する。表に示されるＨＴ－２９、ＳＷ－４８０、ＤＬＤ－１およびＲＫＯ細胞株を同じ方法でモデリングおよび実験する。担癌ヌードマウスを約１ｇの腫瘍増殖で継代させた後、上記の方法を用いて腫瘍塊移植モデリングを実行し、移植後２日目にマウスをランダムにグループに分けて投与を開始する。
液体窒素で冷凍保存されたマウス結腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６を蘇生させ、１０％のウシ胎児血清を含む５Ａ培地で培養し、培養フラスコ内で培養細胞を増殖させ、必要な量の細胞に達した後、細胞を消化して収集し、１０％ウシ胎児血清を含む５Ａ培地で２５０００万／ｍｌの細胞懸濁液に希釈し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの右前肢腋窩に皮下接種し、腫瘍が１ｇの組織塊に増殖した場合、動物を犠牲にして腫瘍組織を剥がし、約２～３立方ミリメートルの腫瘍塊に切断し、カテーテル法によって継代ヌードマウスの皮下に移植し、２回連続継代する。表に示されるＨＴ－２９、ＳＷ－４８０、ＤＬＤ－１およびＲＫＯ細胞株を同じ方法でモデリングおよび実験する。担癌ヌードマウスを約１ｇの腫瘍増殖で継代させた後、上記の方法を用いて腫瘍塊移植モデリングを実行し、移植後２日目にマウスをランダムにグループに分けて投与を開始する。
【0109】
ランダムのグループ分け法によって動物をグループに分け、各グループに８匹の動物がいる。各グループの動物の投与量は、次の表に示されるようである。
【0110】
【表2】
【0111】
投与経路は、尾静脈内注射によって投与され、各動物の用量は、投与前の各動物の最後の体重に従って決定される。各グループは、週に２回投与され、実験が完了するまで投与され続ける。実験を完了し、偶発的に死亡した動物および生存した動物を安楽死させた後、腫瘍組織を剥がし、腫瘍重量を秤量し、各グループの腫瘍重量の差を計算し、腫瘍阻害率ＩＲＴＷを参照指標としてさらに計算し、計算公式は、次のとおりである。
ＩＲＴＷ（％）＝（Ｗモデルグループ－Ｗ投与グループ）／Ｗモデルグループ×１００％
ＩＲＴＷ（％）＝（Ｗモデルグループ－Ｗ投与グループ）／Ｗモデルグループ×１００％
【0112】
表の結果から、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇの投与量、および週２回の実験条件下でＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＳＷ－４８０、ＤＬＤ－１およびＲＫＯ細胞ヒト結腸がん異種ＢＡＬＢ／ｃｎｕｄｅヌードマウス移植腫瘍の増殖を有意に阻害することが分かる。
【0113】
【表3】
【0114】
実施例１７：マウスＳ１８０肉腫残存癌モデルに対する本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの阻害効果
Ｓ１８０マウス線維肉腫細胞を使用し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地を使用して培養増殖する。細胞が対数増殖期に入ると、次の試験を実行することができる。対数増殖期の細胞を収集して遠心分離し、カウントする。細胞濃度を調整し、第１世代の繁殖マウスとして昆明マウスの腹腔に１匹あたり０．２ｍｌを接種する。１週間飼育した後、第１世代の繁殖マウスの腹腔内の腹水を遠心分離してカウントし、細胞濃度を調整して、第２世代の繁殖マウスとして昆明マウスの腹腔に１匹あたり０．２ｍｌを接種し、さらに１週間飼育した後、第２世代の繁殖マウスの腹腔内の腹水を遠心分離してカウントし、細胞濃度を調整して、昆明マウスの背中に１匹あたり０．２ｍｌを皮下接種する。すべての接種プロセスは、超クリーンなワークベンチで無菌的に実行される。接種後、マウスの増殖状況を観察し、マウスの増殖状態に応じてスクリーニングし、村主―ニング後、ランダムにクループに分ける。実験結果は、次の表に示され、３ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンは、手術後の腫瘍の再増殖を有意に阻害する可能性がある。
Ｓ１８０マウス線維肉腫細胞を使用し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地を使用して培養増殖する。細胞が対数増殖期に入ると、次の試験を実行することができる。対数増殖期の細胞を収集して遠心分離し、カウントする。細胞濃度を調整し、第１世代の繁殖マウスとして昆明マウスの腹腔に１匹あたり０．２ｍｌを接種する。１週間飼育した後、第１世代の繁殖マウスの腹腔内の腹水を遠心分離してカウントし、細胞濃度を調整して、第２世代の繁殖マウスとして昆明マウスの腹腔に１匹あたり０．２ｍｌを接種し、さらに１週間飼育した後、第２世代の繁殖マウスの腹腔内の腹水を遠心分離してカウントし、細胞濃度を調整して、昆明マウスの背中に１匹あたり０．２ｍｌを皮下接種する。すべての接種プロセスは、超クリーンなワークベンチで無菌的に実行される。接種後、マウスの増殖状況を観察し、マウスの増殖状態に応じてスクリーニングし、村主―ニング後、ランダムにクループに分ける。実験結果は、次の表に示され、３ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンは、手術後の腫瘍の再増殖を有意に阻害する可能性がある。
【0115】
【表4】
【0116】
実施例１８：マウスルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺がん残存癌モデルに対する本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの阻害効果
マウス肺がんルイス細胞を使用し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地を使用して培養増殖する。細胞が対数増殖期に入ると、次の段階の試験を実行することができる。対数増殖期の細胞を収集して遠心分離し、カウントする。細胞濃度を調整し、繁殖マウスとしてマウス１匹あたり０．２ｍｌをＣ５７ＢＬ／６マウスの右側の腋窩に皮下接種する。腫瘍が１０００ｍｍ３より大きく増殖すると、無菌的に取り出し、秤量し，質量対体積比１：４の塩化ナトリウム注射液を加えて希釈して粉砕し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの右前肢腋窩に皮下接種して継代する。腫瘍が１０００ｍｍ３より大きく増殖すると、第２世代の腫瘍を取り出し、無菌的に取り出し、秤量し，質量対体積比１：４の塩化ナトリウム注射液を加えて希釈して粉砕し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの背中に皮下接種し、接種後、マウスの増殖状況を観察し、マウスの増殖状態に応じてスクリーニングし、スクリーニングした後ランダムにグループに分けて投与する。実験結果は、次に表に示されるようであり、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇでの手術後の腫瘍の再増殖を有意に阻害することができる。
マウス肺がんルイス細胞を使用し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地を使用して培養増殖する。細胞が対数増殖期に入ると、次の段階の試験を実行することができる。対数増殖期の細胞を収集して遠心分離し、カウントする。細胞濃度を調整し、繁殖マウスとしてマウス１匹あたり０．２ｍｌをＣ５７ＢＬ／６マウスの右側の腋窩に皮下接種する。腫瘍が１０００ｍｍ３より大きく増殖すると、無菌的に取り出し、秤量し，質量対体積比１：４の塩化ナトリウム注射液を加えて希釈して粉砕し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの右前肢腋窩に皮下接種して継代する。腫瘍が１０００ｍｍ３より大きく増殖すると、第２世代の腫瘍を取り出し、無菌的に取り出し、秤量し，質量対体積比１：４の塩化ナトリウム注射液を加えて希釈して粉砕し、従来の消毒後、０．２ｍｌの各マウスをマウスの背中に皮下接種し、接種後、マウスの増殖状況を観察し、マウスの増殖状態に応じてスクリーニングし、スクリーニングした後ランダムにグループに分けて投与する。実験結果は、次に表に示されるようであり、本発明のβ－１，３／１，６－グルカンは、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇでの手術後の腫瘍の再増殖を有意に阻害することができる。
【0117】
【表5】
【0118】
実施例１９：ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性マウス炎症関連結腸直腸がんに対するβ－１，３／１，６－グルカンの阻害効果
癌は、人間の死の主要な原因の一つであり、癌症例の約１／４の病因および発病のメカニズムは、慢性炎症に関連する。炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）は、病院や発病メカニズムが不明な腸の炎症性疾患の一種であり、その病理学的特徴から、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ、ＵＣ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＤ）と分けられ、年々増加し、かつ若くなりつつある。ＩＢＤ患者の結腸直腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）の発生リスク率は増加し、８～１０年後に毎年年０．５％～１％増加し、３０年後にＩＢＤ患者の最大１８％がＣＲＣに発展する可能性がある。ＩＢＤ関連ＣＲＣは、すべての結腸直腸がんの１％～２％しか占めていないが、それは、ＩＢＤ患者が死亡する従来の原因である。アゾキシメタン（ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ、ＡＯＭ）／デキストラン硫酸ナトリウム（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、ＤＳＳ）によって誘発された大腸炎関連の癌（ｃｏｌｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ、ＣＡＣ）動物モデルは、ＩＢＤ誘発性ＣＲＣのプロセス全体をうまくシミュレートするため、新薬の有効性およびメカニズムを研究するために広く使用され、その病理学的変化および発癌を解明することは、結腸直腸がん治療の新しい候補標的を発見するのに役立つ。
癌は、人間の死の主要な原因の一つであり、癌症例の約１／４の病因および発病のメカニズムは、慢性炎症に関連する。炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）は、病院や発病メカニズムが不明な腸の炎症性疾患の一種であり、その病理学的特徴から、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ、ＵＣ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＤ）と分けられ、年々増加し、かつ若くなりつつある。ＩＢＤ患者の結腸直腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）の発生リスク率は増加し、８～１０年後に毎年年０．５％～１％増加し、３０年後にＩＢＤ患者の最大１８％がＣＲＣに発展する可能性がある。ＩＢＤ関連ＣＲＣは、すべての結腸直腸がんの１％～２％しか占めていないが、それは、ＩＢＤ患者が死亡する従来の原因である。アゾキシメタン（ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ、ＡＯＭ）／デキストラン硫酸ナトリウム（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、ＤＳＳ）によって誘発された大腸炎関連の癌（ｃｏｌｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ、ＣＡＣ）動物モデルは、ＩＢＤ誘発性ＣＲＣのプロセス全体をうまくシミュレートするため、新薬の有効性およびメカニズムを研究するために広く使用され、その病理学的変化および発癌を解明することは、結腸直腸がん治療の新しい候補標的を発見するのに役立つ。
【0119】
本実験は、ＡＯＭの腹腔内注射およびＤＳＳ飲料液の定期投与の方法により、マウス結腸直腸がんモデルを確立し、実験の開始時に、６～８週齢の７０匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをランダムにグループに分け、各グループは、１０匹で、合計七つのグループである。通常の対照である第１のグループを除いて、残りのグループは、ＡＯＭ／ＤＳＳでモデリングされる。モデリンググループのマウス実験が開始した初日に、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの用量のアゾキシメタン（ＡＯＭ）を１回腹腔内注射し、７日後に、マウスに１％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を含む飲料水を与える。７日後に、１４日間の通常の飲料水を与え、７日間１％のＤＳＳ飲料水および１４日間の通常の飲料水をサイクルとして循環し、そのように、これを合計３サイクルを繰り返し、最後にマウスを誘発してＣＡＣを形成される。
【0120】
実験を完了させ、マウスを解剖し、結腸直腸全体を除去し、腸間膜および付着した脂肪組織を注意深く取り除き、その長さを測定し、次に結腸直腸内腔全体を通常の生理食塩水で洗浄し、縦方向に解剖し、解剖顕微鏡下でノギスで肉眼で見える腫瘍をカウントして測定し、最後に、結腸の長さ、腫瘍形成率、腫瘍の総数等の観点から本発明のβ－１，３／１，６－グルカンの効果を評価する。
【0121】
実験結果は、次の図に示されるようであり、空白グループと比較して、モデルグループの結腸の長さは、有意に短縮され（Ｐ＜０．０１）、腫瘍形成率は、７７．７８％に達し、ＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性マウス結腸直腸がんモデルは成功的である。β－１，３／１，６－グルカン（３ｍｇ／ｋｇ）グループの腫瘍形成率は、１６．６７％であり、モデルグループと比較して、腫瘍形成率は低下し、β－１，３／１，６－グルカン（３ｍｇ／ｋｇ）がＡＯＭ／ＤＳＳ誘発性マウス結腸直腸がんに対して阻害効果を有することを示す。
【0122】
【表6】
【0123】
実施例２０．調製例１および調製例２で得られたβ－１，３／１，６－グルカンの特性化
試験方法は、次のとおりである。
試験方法は、次のとおりである。
【0124】
（ｉ）紫外線全波長走査スペクトル：β－グルカン組成物を溶解し、５ｗｔ％の濃度に調製し、純水でベースラインを確立し、走査波長を１９０～９００ｎｍに設定し、走査精度を１ｎｍに設定し、紫外線全波長走査を行う。
【0125】
（ｉｉ）側鎖の長さを実施例８の方法で測定する。
【0126】
【表7】
【0127】
実施例２１．β－１，３／１，６－グルカン抗マウスＳ－１８０実験の尾静脈内注射
免疫機能が正常なマウスでの動物実験（尾椎の静脈内投与）
１．実験方法：
腫瘍細胞：Ｓ－１８０、接種部位：肩甲骨、マウス種：ＫＭ（雄のマウス）、マウス数：各グループ１３匹、腫瘍細胞接種の翌日から投与開始、投与頻度：毎日投与、投与サイクル：２０日、投与方法：尾椎の静脈内注射。
空白対照グループ：モデルグループ（ＣＮグループ）
陽性対照グループ：シスプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）（ＰＣまたはＣＰグループ）、椎茸多糖類ＬＮＴ（１．５ｍｇ／ｋｇ）
実験グループ：ＢＬ：β－１，３／１，６－グルカン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＢＭ：β－１，３／１，６－グルカン中度用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＨ：β－１，３／１，６－グルカン高用量（７．５ｍｇ／ｋｇ）。
免疫機能が正常なマウスでの動物実験（尾椎の静脈内投与）
１．実験方法：
腫瘍細胞：Ｓ－１８０、接種部位：肩甲骨、マウス種：ＫＭ（雄のマウス）、マウス数：各グループ１３匹、腫瘍細胞接種の翌日から投与開始、投与頻度：毎日投与、投与サイクル：２０日、投与方法：尾椎の静脈内注射。
空白対照グループ：モデルグループ（ＣＮグループ）
陽性対照グループ：シスプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）（ＰＣまたはＣＰグループ）、椎茸多糖類ＬＮＴ（１．５ｍｇ／ｋｇ）
実験グループ：ＢＬ：β－１，３／１，６－グルカン低用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＢＭ：β－１，３／１，６－グルカン中度用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＨ：β－１，３／１，６－グルカン高用量（７．５ｍｇ／ｋｇ）。
【0128】
２．実験結果
結果は、図１８Ａ～Ｂに示されるようである。陽性対照グループおよび実験グループのマウスは、接種後２０日でもまだ良好な生理学的状態にあり、動物は、犠牲になる前に非常に活発で、行動が機敏である。
モデルグループと比較して、β－１，３／１，６－グルカンは、低用量、中度用量、高用量でＳ－１８０腫瘍の増殖を有意に阻害することができ、腫瘍阻害率は、６０％～７０％に達する。シスプラチングループのマウスの胸腺重量は、モデルグループよりも有意に低く、β－１，３／１，６－グルカン投与グループ（０．３、１．５、７．５ｍｇ／ｋｇ）の胸腺重量は、シスプラチングループよりも有意に高く、高用量ＢＧ１３６投与グループのマウスの胸腺重量は、モデルグループと同等である。これは、β－１，３／１，６－グルカンがマウスの免疫系を活性化することにより、抗腫瘍効果を発揮する可能性があることを示す。
結果は、図１８Ａ～Ｂに示されるようである。陽性対照グループおよび実験グループのマウスは、接種後２０日でもまだ良好な生理学的状態にあり、動物は、犠牲になる前に非常に活発で、行動が機敏である。
モデルグループと比較して、β－１，３／１，６－グルカンは、低用量、中度用量、高用量でＳ－１８０腫瘍の増殖を有意に阻害することができ、腫瘍阻害率は、６０％～７０％に達する。シスプラチングループのマウスの胸腺重量は、モデルグループよりも有意に低く、β－１，３／１，６－グルカン投与グループ（０．３、１．５、７．５ｍｇ／ｋｇ）の胸腺重量は、シスプラチングループよりも有意に高く、高用量ＢＧ１３６投与グループのマウスの胸腺重量は、モデルグループと同等である。これは、β－１，３／１，６－グルカンがマウスの免疫系を活性化することにより、抗腫瘍効果を発揮する可能性があることを示す。
【0129】
実施例２２．β－１，３／１，６－グルカン抗腫瘍試験の経口投与
１．実験方法：
腫瘍細胞：Ｓ－１８０、接種部位：腋窩、マウス種：昆明マウス（Ｋｕｎｍｉｎｇ）、マウス数：各グループ１３匹（雌マウス７匹および雄マウス６匹）、投与開始時間：接種翌日から投与開始、投与頻度：毎日投与、投与サイクル：１０日、投与方法：経口投与、投与量（ｍｇ／ｋｇ）：１ モデル（ＣＮ）、２ シスプラチン（ＣＰまたはＰＣ）：１．５ｍｇ、３ β－１，３／１，６－グルカン：１ｍｇ（Ｂ１）、４ β－１，３／１，６－グルカン：５ｍｇ（Ｂ５）、５ β－１，３／１，６－グルカン：２５ｍｇ（Ｂ２５）、６ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ１ｍｇ（ＣＰＢ１）、７ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ５ｍｇ（ＣＰＢ５）、８ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ２５ｍｇ（ＣＰＢ２５）。
１．実験方法：
腫瘍細胞：Ｓ－１８０、接種部位：腋窩、マウス種：昆明マウス（Ｋｕｎｍｉｎｇ）、マウス数：各グループ１３匹（雌マウス７匹および雄マウス６匹）、投与開始時間：接種翌日から投与開始、投与頻度：毎日投与、投与サイクル：１０日、投与方法：経口投与、投与量（ｍｇ／ｋｇ）：１ モデル（ＣＮ）、２ シスプラチン（ＣＰまたはＰＣ）：１．５ｍｇ、３ β－１，３／１，６－グルカン：１ｍｇ（Ｂ１）、４ β－１，３／１，６－グルカン：５ｍｇ（Ｂ５）、５ β－１，３／１，６－グルカン：２５ｍｇ（Ｂ２５）、６ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ１ｍｇ（ＣＰＢ１）、７ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ５ｍｇ（ＣＰＢ５）、８ シスプラチン１．５ｍｇ＋ＢＧ２５ｍｇ（ＣＰＢ２５）。
【0130】
２．実験結果：
実験結果は、図１９ＡおよびＢに示されるようである。当該実験結果から、β－１，３／１，６－グルカンの経口投与は、Ｓ－１８０腫瘍に対して有意な阻害効果があり、β－１，３／１，６－グルカンの経口投与量が１ｍｇ／ｋｇである場合、全体の阻害率は、５８％以上であり、雄マウスの腫瘍阻害率は、７０．４％に達することが分かる。ＢＧ１３６を２５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン（１．５ｍｇ／ｋｇ）薬物と併用すると、阻害率は、さらに改善され、腫瘍阻害率は、７７．３％に達する。
実験結果は、図１９ＡおよびＢに示されるようである。当該実験結果から、β－１，３／１，６－グルカンの経口投与は、Ｓ－１８０腫瘍に対して有意な阻害効果があり、β－１，３／１，６－グルカンの経口投与量が１ｍｇ／ｋｇである場合、全体の阻害率は、５８％以上であり、雄マウスの腫瘍阻害率は、７０．４％に達することが分かる。ＢＧ１３６を２５ｍｇ／ｋｇのシスプラチン（１．５ｍｇ／ｋｇ）薬物と併用すると、阻害率は、さらに改善され、腫瘍阻害率は、７７．３％に達する。
【0131】
実施例２３．マウス腫瘍モデルのための化学療法と併用したβ－１，３／１，６－グルカン
白血球和血小板に対する化学療法と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの効果
３ｘ１０５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社）に皮下注射する（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ、２００１）。腫瘍移植から約２日後、カルボプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ、週２回）の腹腔内注射およびＢＧ１３６（４ｍｇ／ｋｇ）または椎茸多糖類ＬＮＴ（２ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈内注射を実行し、投与期間中に腫瘍体積を検出し、１５日目に、動物を犠牲にした後、腫瘍質量を検出する。動物を犠牲にした後、心臓から採血し、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合した後、５０μｌの全血を採集し、血液分析器で免疫細胞の濃度を検出する。
白血球和血小板に対する化学療法と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの効果
３ｘ１０５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社）に皮下注射する（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ、２００１）。腫瘍移植から約２日後、カルボプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ、週２回）の腹腔内注射およびＢＧ１３６（４ｍｇ／ｋｇ）または椎茸多糖類ＬＮＴ（２ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈内注射を実行し、投与期間中に腫瘍体積を検出し、１５日目に、動物を犠牲にした後、腫瘍質量を検出する。動物を犠牲にした後、心臓から採血し、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合した後、５０μｌの全血を採集し、血液分析器で免疫細胞の濃度を検出する。
【0132】
試験結果は、調製例２で調製されたβ－１，３／１，６－グルカンがカルボプラチンの腫瘍阻害効果を増強し、免疫応答を刺激し、カルボプラチン投与後の免疫阻害を逆転させ、血小板を減少させることができることを示す。
【0133】
実施例２４
免疫細胞は様々な種類の腫瘍細胞で重要な役割を果たすため、β－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍、白血球および血小板増加効果は、様々な腫瘍細胞（例えば、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がん等）で役割をはたし、かつ免疫細胞は、腫瘍の転移および発生においても調節的な役割を果たすことにより、β－１，３／１，６－グルカンは、腫瘍細胞の転移および発生を阻害することができる。
免疫細胞は様々な種類の腫瘍細胞で重要な役割を果たすため、β－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍、白血球および血小板増加効果は、様々な腫瘍細胞（例えば、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がん等）で役割をはたし、かつ免疫細胞は、腫瘍の転移および発生においても調節的な役割を果たすことにより、β－１，３／１，６－グルカンは、腫瘍細胞の転移および発生を阻害することができる。
【0134】
実施例２５．マウス腫瘍モデルに対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの影響
使用されたＰＤ－１抗体：名称：インビボＭＡｂ抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）、Ｂｉｏｘｃｅｌｌから購入
（ｉ）結腸がんＭＣ３８マウス皮下移植腫瘍に対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの静脈内注射の効果
本実施例でマウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を選択し、ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンがマウス移植腫瘍増殖に及ぼす影響を検出し、試験結果は、図２０Ａ～Ｃに示されるようである。
使用されたＰＤ－１抗体：名称：インビボＭＡｂ抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）、Ｂｉｏｘｃｅｌｌから購入
（ｉ）結腸がんＭＣ３８マウス皮下移植腫瘍に対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの静脈内注射の効果
本実施例でマウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を選択し、ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンがマウス移植腫瘍増殖に及ぼす影響を検出し、試験結果は、図２０Ａ～Ｃに示されるようである。
【0135】
図２０ＡおよびＢの結果は、ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの尾静脈内注射が、ＭＣ３８移植腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、阻害効果が単独で投与されたＰＤ－１抗体グループよりも有意に優れ、有意な相乗効果を有し、明らかな薬物毒性はなく（図1Ｃ）、良好な薬物安全性を有することを示す。
【0136】
（ｉｉ）マウス腫瘍免疫関連サイトカインの発現に対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの静脈内注射の影響
本実施例において、ＲＴ－ＰＣＲ方法によって、マウス前立腺がん細胞ＭＣ３８移植腫瘍における様々なサイトカインの発現を定量化する。結果は、図２１Ａ～Ｆに示されるようである。
本実施例において、ＲＴ－ＰＣＲ方法によって、マウス前立腺がん細胞ＭＣ３８移植腫瘍における様々なサイトカインの発現を定量化する。結果は、図２１Ａ～Ｆに示されるようである。
【0137】
図２１Ａ、ＢおよびＣの結果から、β－１，３／１，６－グルカンをＰＤ－１抗体と併用した後、マウス腫瘍のマクロファージによって生成された腫瘍壊疽因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１β（ＩＬ１－β）および一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現量は有意に増加され、β－１，３／１，６－グルカンは、ＰＤ－１抗体と相乗作用して、腫瘍内の免疫活性化を刺激することができることを示すことが分かる。
【0138】
図２１Ｄ、ＥおよびＦの結果から、β－１，３／１，６－グルカンをＰＤ－１抗体と併用した後、前炎症性Ｔｈ１極性かサイトカイン（インターフェロンγ、ＩＦＮ－γ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）およびグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）の発現量は増加され、ＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンは、体の自然免疫および適応免疫を橋渡しし、最高の抗腫瘍免疫を発揮することができることをさらに説明されることが分かる。
【0139】
（ｉｉｉ）マウス腫瘍モデルに対するＰＤ－１抗体と併用した経口投与β－１，３／１，６－グルカンの影響
マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を選択し、マウス移植腫瘍の増殖に対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの影響を検出する。結果は、図２２Ａ～Ｃに示されるようである。
マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を選択し、マウス移植腫瘍の増殖に対するＰＤ－１抗体と併用したβ－１，３／１，６－グルカンの影響を検出する。結果は、図２２Ａ～Ｃに示されるようである。
【0140】
図２２ＡおよびＢの結果から、ＰＤ－１抗体と併用してβ－１，３／１，６－グルカンを経口投与すると、ＭＣ３８移植腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、阻害効果は、単独で投与されたＰＤ－１抗体グループよりも有意に優れ、有意な相乗効果を有し、明らかな薬物毒性はなく（図２２Ｃ）、良好な薬物安全性を有することを示す。
【0141】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】