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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-26
(54)【発明の名称】ＲＮＡ構築物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20220819BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220819BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220819BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220819BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20220819BHJP
C12N 15/33 20060101ALI20220819BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220819BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220819BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220819BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220819BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220819BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220819BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220819BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20220819BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220819BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220819BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220819BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220819BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/13
C12N15/52
C12N15/33
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61P31/10
A61P31/04
A61P31/12
A61P35/00
A61P35/02
A61P33/00
A61K48/00
A61K35/76
A61P37/04
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575438
(86)(22)【出願日】2020-06-18
(85)【翻訳文提出日】2022-02-16
(86)【国際出願番号】 GB2020051465
(87)【国際公開番号】W WO2020254804
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】1908729.5
(32)【優先日】2019-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519426058
【氏名又は名称】インペリアル カレッジ イノベイションズ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＰＥＲＩＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｖｅｌ １ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｃ／Ｏ Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｒｏａｄ Ｌｏｎｄｏｎ ＳＷ７ ２ＡＺ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ロビン・シャトック
(72)【発明者】
【氏名】アンナ・ブレークニー
(72)【発明者】
【氏名】ポール・マッケイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4C084AA13
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA41
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZB371
4C084ZB372
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA16
4C087MA17
4C087MA22
4C087MA23
4C087MA35
4C087MA37
4C087MA41
4C087MA43
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA56
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB32
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZB37
(57)【要約】
本発明は、(i)少なくとも1種の治療用生体分子;及び(ii)少なくとも1種の生来の阻害タンパク質(IIP)をコードするRNA構築物に関する。構築物は、RNAレプリコン及びsaRNA分子であり、本発明は、このようなRNAレプリコンをコードする遺伝学的構築物又はベクターを含む。本発明は、療法における、例えば疾患を処置すること及び/又はワクチン送達における、このようなRNA構築物及びレプリコンの使用に及ぶ。本発明は、このようなRNA構築物を含む医薬組成物、及びその方法並びに使用に及ぶ。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(i)少なくとも1種の治療用生体分子;及び(ii)少なくとも1種の生来の阻害タンパク質(IIP)をコードするRNA構築物。
【請求項2】
RNA構築物が、自己増幅RNA(saRNA)を含み、好ましくはsaRNA構築物である、請求項1に記載のRNA構築物。
【請求項3】
RNA構築物が、アルファウイルス;ピコルナウイルス;フラビウイルス;ルビウイルス;ペスチウイルス;ヘパシウイルス;カリチウイルス及びコロナウイルスからなる属の群から選択されるプラス鎖RNAウイルスを含むか又はそれから誘導される、請求項1又は2に記載のRNA構築物。
【請求項4】
RNA構築物が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV);エンテロウイルス71;脳心筋炎ウイルス;クンジンウイルス;及び中東呼吸器症候群ウイルスからなる種の群から選択されるウイルスを含むか又はそれから誘導される、請求項1から3のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項5】
構築物が、VEEVから誘導される、請求項1から4のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項6】
少なくとも1種の治療用生体分子が、ワクチン構築物、又は治療用タンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項7】
少なくとも1種の治療用生体分子が、(i)内因性宿主遺伝子の発現を調節することが可能なRNA分子であるか;
(ii)細菌、ウイルス、真菌、原生動物又は寄生体から誘導されるか;
(iii)酵素;酵素阻害剤;ホルモン;免疫系タンパク質;受容体;結合タンパク質;転写又は翻訳因子;腫瘍増殖抑制タンパク質;構造タンパク質;及び血液タンパク質からなる群から選択されるか;
(iv)抗原であり、任意選択で腫瘍抗原である、請求項1から6のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項8】
RNA分子によってコードされる少なくとも1種の治療用生体分子が、細菌、ウイルス、真菌、原生動物;及び寄生虫からなる群から選択される病原体由来のタンパク質又はペプチドである、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項9】
タンパク質又はペプチドが、オルソミクソウイルス;パラミクソウイルス科のウイルス;メタニューモウイルス及びモルビリウイルス;ニューモウイルス;パラミクソウイルス;ポックスウイルス科;メタニューモウイルス;モルビリウイルス;ピコルナウイルス;エンテロウイルス;ブニヤウイルス;フレボウイルス;ナイロウイルス;ヘパドナウイルス;トガウイルス;アルファウイルス;アルテリウイルス;フラビウイルス;ペスチウイルス;ヘパドナウイルス;ラブドウイルス;カリチウイルス科;コロナウイルス;レトロウイルス;レオウイルス;パルボウイルス;デルタ型肝炎ウイルス(HDV);E型肝炎ウイルス(HEV);ヒトヘルペスウイルス及びパポバウイルスからなる群から選択されるウイルス由来のウイルス抗原である、請求項8に記載のRNA構築物。
【請求項10】
コロナウイルスが、SARS CoV-1、SARS-CoV-2、MERS、ヒト呼吸器コロナウイルス、鶏伝染性気管支炎(IBV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)、又はブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)である、請求項9に記載のRNA構築物。
【請求項11】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、(i)メラノーマ分化関連タンパク質5(MDA5)の作用を低減又はブロックすること、及び/又は(ii)PKR活性化タンパク質のRNAへの結合をブロック又は低減することのいずれかが可能である、請求項1から10のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項12】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、中東呼吸器症候群コロナウイルスMERSコロナウイルス(ORF4a)である、請求項1から11のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項13】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、パラインフルエンザウイルス5型Vタンパク質(PIV5V)である、請求項1から12のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項14】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、コロナウイルスORF3bであり、好ましくはSARS-CoV-2 ORF3bである、請求項1から13のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項15】
RNA構築物が、配列番号11、配列番号15及び/又は配列番号20をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項16】
RNA構築物が、配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号56として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項17】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、MDA5活性化の1つ又は複数の下流経路を阻害すること、又はdsRNAのMDA/PACT認識の下流の1つ又は複数の経路をブロックすることが可能である、請求項1から16のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項18】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質が、HSV-2 Us1;HSV-1 Us1;HSV-1 Us11;OV20.0L;BVDV Npro;ランガットウイルスNS5;及びインフルエンザNS1からなる群から選択される、請求項17に記載のRNA構築物。
【請求項19】
RNA構築物が、治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を可能にするように、少なくとも1種の治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター又はサブゲノムプロモーターを含む、請求項1から18のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項20】
プロモーターが、26Sであり、任意選択でプロモーターが、配列番号57に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む、請求項19に記載のRNA構築物。
【請求項21】
RNA構築物が、治療用生体分子をコードする配列と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列との間に配置されたリンカー配列を含み、任意選択でリンカー配列が、消化されることによって、少なくとも1種の治療用生体分子と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質とが分離されるように構成されたペプチドスペーサーをコードし、好ましくはペプチドスペーサーが、2Aペプチド又はフューリン/2Aペプチドである、請求項1から20のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項22】
RNA構築物が、配列番号38又は39に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のRNA構築物。
【請求項23】
請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物をコードする核酸配列であって、任意選択で配列が、配列番号40又は41、又はその断片若しくはバリアントとして実質的に記載される、核酸配列。
【請求項24】
請求項23に記載の核酸配列を含む発現カセット。
【請求項25】
請求項24に記載の発現カセットを含む組換えベクターであって、任意選択で、配列番号35～37のいずれか1つに実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む、組換えベクター。
【請求項26】
請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸配列、請求項24に記載の発現カセット又は請求項25に記載のベクター、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項27】
請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物を調製する方法であって、a)i)請求項25に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
ii)請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物の生産をもたらす条件下で、宿主細胞を培養する工程;又は
b)請求項25に記載のベクターからRNA構築物を転写する工程
を含む、方法。
【請求項28】
医薬として、又は療法において使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項29】
原生動物、真菌、細菌又はウイルス感染の防止、改善又は処置で使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項30】
がんの防止、改善又は処置で使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項31】
請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物、及び任意選択でアジュバントを含むワクチン。
【請求項32】
対象において免疫応答を刺激することに使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項33】
幹細胞療法で使用するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物。
【請求項34】
エクスビボ又はインビトロにおいて細胞を改変する方法であって、請求項1から22のいずれか一項に記載のRNA構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載の発現カセット、請求項25に記載のベクター、又は請求項26に記載の医薬組成物を細胞に送達する工程を含む、方法。
【請求項35】
請求項28に記載の方法から得られた、又はそれによって入手可能な改変された細胞。
【請求項36】
療法、任意選択で細胞療法で使用するための、請求項35に記載の改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、RNA構築物、特に、限定するものではないが、RNAレプリコン及びsaRNA分子、並びにこのようなRNAレプリコンをコードする遺伝学的構築物又はベクターに関する。本発明は、療法における、例えば疾患の処置及び/又はワクチン送達における、このようなRNA構築物及びレプリコンの使用に及ぶ。本発明は、このようなRNA構築物を含む医薬組成物、並びにその方法及び使用に及ぶ。
【背景技術】
【0002】
メッセンジャーRNA(mRNA)は、生物学的療法のための有望なツールである。しかしながら、mRNA療法は、小動物において極めて有効であることが示されているが、これらの配合物をヒトでの用量漸増研究で置き換えても、結果が直線的な比率にならない。更に、インターフェロン応答の誘導に関連する有害事象は、ヒトにおいて有効である可能性が高いRNAの用量増加に関して律速であった。この不一致の理由は不明瞭であるが、本発明者らは、ヒトの生来の感知における固有の差が、実験室から診療施設へのRNA療法の移行にとっての障壁を提起するという仮定を立てている。更に、RNAの生来の感知は、タンパク質発現の阻害に関連してきた。これまで、外因性RNAの生来の認識を克服するための主要なアプローチは、生来の感知メカニズムではそれほど検出できない改変されたリボヌクレオチドを使用することであった。しかしながら、改変されたmRNAは、完全に検出不能というわけではなく、それでもなお、一部にインターフェロンの活性化、タンパク質のサイレンシング及びヒトでの使用に関する忍容性の低減が生じる。
【0003】
別のアプローチは、自己増幅又はsaRNAベクターの使用であり、これらは、典型的には、自身の非構造タンパク質内にポリメラーゼ活性をコードすることによって自身のRNAを自己増幅する能力を有するアルファウイルスの主鎖をベースとするものである。先行技術の方法は、目的の遺伝子(GOI)によってこれらのベクターの構造タンパク質を置き換えることを含み、このような遺伝子は、ワクチン構築物であるか、又は治療用タンパク質をコードすると予想される。saRNAの他のバージョンは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、及びコロナウイルスをベースとしたものである。saRNAが標的細胞の細胞質に取り込まれると、それによりコードされたポリメラーゼ機構によるRNAの増幅と、GOIの非常に高い発現レベルがもたらされる。結果として、saRNAは、mRNAより低い用量(10～100分の1)のsaRNAで免疫応答を誘導することが示され、マウスにおいて最長60日もの長期にわたるタンパク質発現をもたらす。
【0004】
しかしながら、saRNAの欠点は、saRNAがまた、これらの先行技術のsaRNAのタンパク質発現及び自己増幅を制限する抗ウイルス応答を引き起こす生来の認識によっても感知されることである。saRNAの生来の感知は、二本鎖領域(dsRNA)を含む、その大きいサイズ(典型的には>5000塩基)と深い2次構造のために、mRNAの生来の感知と異なる。長鎖二本鎖RNAは、MDA5(メラノーマ分化関連タンパク質5)経路を介して生来の応答を引き起こす。これは、MDA5のオリゴマー化を促進する長いdsRNA RNAへのPACT(PKR活性化タンパク質)の結合と、それに続くsaRNAの複製及び発現を阻害する下流のシグナル伝達カスケードの開始によって促進される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989) editor C Nolan、Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献2】Thompson等、1994、Nucleic Acids Research、22、4673-4680
【非特許文献3】Thompson等、1997、Nucleic Acids Research、24、4876-4882
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、当業界において、患者が自然免疫系のRNAの感知を克服できるように、RNA治療剤を患者に送達して発現させることができる新しい手段を生産する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、自然免疫系機構をブロック又は低減する生来の阻害タンパク質を発現させ、結果として改善されたタンパク質発現及び自己増幅をもたらすことによって、自然免疫系のRNAの感知を有利に克服する新規の自己増幅RNA(saRNA)を開発した。
【0008】
したがって、本発明の第1の態様において、(i)少なくとも1種の治療用生体分子;及び(ii)少なくとも1種の生来の阻害タンパク質(IIP)をコードするRNA構築物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0009】
RNAレプリコン又は構築物は、ワクチン及び療法のための目的の遺伝子の送達及び発現のための見込みのあるツールであると仮定されている。しかしながら、二本鎖RNA(dsRNA)は、タンパク質翻訳を阻害する応答を引き起こす感知メカニズムによって細胞内で検出される。結果として、レプリコンでコードされた目的の遺伝子の発現は、著しく機能が損なわれており、したがって、RNAレプリコンの治療可能性は限定的である。有利には、本発明のRNA構築物は、下流における導入遺伝子発現の阻害を排除する、1種又は複数の生来の阻害タンパク質、すなわちIIPをコードするため、この問題を克服する。インターフェロンの誘導は、生来の認識の下流における結果であるが、他の分子及び経路が誘導されてもよく、それらは誘導されて、これらのいずれかが、RNA構築物に内包される1種又は複数のIIPによって阻害されることが理解されるであろう。これまでに公開された、saRNAでインターフェロン応答を排除する唯一のアプローチは、ワクシニアウイルス、E3、K3及びB18由来のインターフェロン阻害タンパク質を使用していた。しかしながら、この研究において、インターフェロン阻害タンパク質は、saRNAと組み合わされた別個のmRNA分子として送達及び製剤化された。これは、saRNAとmRNAの両方の製造を必要とし、同じ細胞への共送達を確実にし、タンパク質発現における任意の観察可能な強化を提供するために、本発明に係るレプリコンRNA構築物の3～6倍多くのワクシニアmRNAの使用を要する。更に、発現の反応速度は、mRNAから発現されるIIPの任意の有益な作用が本発明のRNA構築物(60日まで)と比較して非常に短い期間(72時間まで)のみの作用になるように、mRNAとsaRNAとで異なっている。
【0010】
有利には、第1の態様のRNA構築物における1種又は複数のIIPの存在は、目的のペプチド又はタンパク質との二重のタンパク質発現を可能にする。先行技術に記載されたようにRNAの2つの異なる鎖、目的のペプチド/タンパク質をコードする鎖と、IIPをコードする鎖を送達することとは対照的に、本発明の構築物を使用して、一本鎖のみが標的細胞に送達され、それによってRNAと生来の阻害タンパク質との共局在が確実になる。IIPは、RNAの生来の感知を阻害し、したがってより多くのタンパク質発現を可能にし、IIP発現それ自体は、サブゲノム鎖で、目的の遺伝子、すなわち治療用生体分子と共発現されることによって自己増幅される。実施例で記載されるように、ルシフェラーゼをコードする本発明のRNA構築物(「ステアルチコン(Stealthicon)」としても公知)は、驚くべきことに、インビトロで、ルシフェラーゼタンパク質発現レベルを、インビボでヒト細胞株において最大2桁増加させること、また、インビボで、ルシフェラーゼのタンパク質発現の規模と期間の両方を、BL/6マウスにおいて従来のVEEV RNAレプリコンと比較して増加させることも示された。当業者は、ルシフェラーゼレポーターは、RNA構築物がインビボで本発明のRNA分子に連結された遺伝子を発現できることを証明していることから、まさしく治療用生体分子の代表であることを容易に認識するであろう。したがって、ルシフェラーゼは、任意の治療的に活性の生体分子を発現させるのに本発明のsaRNA構築物を使用できるという概念の証明の確たる証拠を提供する。
【0011】
当業者は、RNA構築物はまた、自己増殖RNAウイルスベクター、又はRNAレプリコンとも称される場合があることを理解するであろう。RNA構築物は、二本鎖又は一本鎖であってもよい。好ましくは、RNA構築物は、自己増幅RNA(saRNA)を含み、好ましくはsaRNA構築物である。
【0012】
好ましくは、RNA構築物は、アルファウイルス;ピコルナウイルス;フラビウイルス;ルビウイルス;ペスチウイルス;ヘパシウイルス;カリチウイルス又はコロナウイルスからなる属の群から選択されるプラス鎖RNAウイルスを含むか又はそれから誘導される。
【0013】
好適な野生型アルファウイルス配列は、周知である。好適なアルファウイルスの代表的な例としては、アウラ(Aura)、ベバルウイルス、カバソウ(Cabassou)、チクングニアウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、フォートモーガン、ゲタウイルス、キジラガッハ(Kyzylagach)、マヤロ、マヤロウイルス、ミドルバーグ、ムカンボウイルス、ヌドゥム(Ndumu)、ピクスナウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林、シンドビスウイルス、トナテ(Tonate)、トリニティ(Triniti)、ウナ、ベネズエラウマ脳脊髄炎、西部ウマ脳脊髄炎、ワタロア、及びY-62-33が挙げられる。
【0014】
好ましくは、RNA構築物は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV);エンテロウイルス71;脳心筋炎ウイルス;クンジンウイルス;及び中東呼吸器症候群ウイルスからなる種の群から選択されるウイルスを含むか又はそれから誘導される。好ましくは、ベクターは、VEEVから誘導される。
【0015】
RNA構築物は、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列を含む。少なくとも1種の治療用生体分子は、ワクチン構築物、又は治療用タンパク質を含んでいてもよいし、ワクチン構築物、又は治療用タンパク質であってもよい。治療用タンパク質は、治療用途を有する、好ましくはヒトにおいて治療用途を有する任意のタンパク質に関することを当業者は理解するであろう。RNA分子によってコードされ得る例示的な治療用生体分子としては、病原体、例えば細菌、ウイルス、真菌、原生動物/又は寄生虫由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。好ましくは、タンパク質及びペプチドは、抗原である。
【0016】
ウイルス由来のタンパク質及びペプチドは、ウイルス抗原であってもよい。ウイルス抗原は、オルソミクソウイルス;パラミクソウイルス科のウイルス;メタニューモウイルス及びモルビリウイルス;ニューモウイルス;パラミクソウイルス;ポックスウイルス科;メタニューモウイルス;モルビリウイルス;ピコルナウイルス;エンテロウイルス(Enteroviruseses);ブニヤウイルス;フレボウイルス;ナイロウイルス;ヘパドナウイルス(Heparnaviruses);トガウイルス;アルファウイルス;アルテリウイルス;フラビウイルス;ペスチウイルス;ヘパドナウイルス;ラブドウイルス;カリチウイルス科;コロナウイルス;レトロウイルス;レオウイルス;パルボウイルス;デルタ型肝炎ウイルス(HDV);E型肝炎ウイルス(HEV);ヒトヘルペスウイルス並びにパポバウイルスからなる群から選択されるウイルス由来であってもよい。
【0017】
オルソミクソウイルスは、インフルエンザA、B及びCであってもよい。パラミクソウイルス科のウイルスは、ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIV)であってもよい。メタニューモウイルスは、モルビリウイルス(例えば、麻疹)であってもよい。ニューモウイルスは、呼吸系発疹ウイルス(RSV)、ウシ呼吸系発疹ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、又は七面鳥鼻気管炎ウイルスであってもよい。パラミクソウイルスは、パラインフルエンザ(Parainkuenza)ウイルス1～4型(PIV)、流行性耳下腺炎、センダイウイルス、シミアンウイルス5、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス又はニューカッスル病ウイルスであってもよい。ポックスウイルス科は、真正痘瘡、例えば大痘瘡及び小痘瘡であってもよい。メタニューモウイルスは、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)又はトリメタニューモウイルス(aMPV)であってもよい。麻疹ウイルスは、麻疹であってもよい。ピコルナウイルスは、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパドナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス及びアフトウイルスであってもよい。エンテロウイルスは、ポリオウイルス1、2又は3型、コクサッキーAウイルス1～22及び24型、コクサッキーBウイルス1～6型、エコーウイルス(ECHOウイルス)1～9型、11～27及び29～34型又はエンテロウイルス68～71であってもよい。ブニヤウイルスは、カリフォルニア脳炎ウイルスであってもよい。フレボウイルスは、リフトバレー熱ウイルスであってもよい。ナイロウイルスは、クリミア-コンゴ出血性熱ウイルスであってもよい。ヘパドナウイルスは、A型肝炎ウイルス(HAV)であってもよい。トガウイルスは、ルビウイルスであってもよい。フラビウイルスは、ダニ媒介脳炎(TBE)ウイルス、デング熱(1、2、3又は4型)ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、又はポワッサン脳炎ウイルスであってもよい。ペスチウイルスは、ウシウイルス性下痢(BVDV)、ブタコレラ(CSFV)又はボーダー病(BDV)であってもよい。ヘパドナウイルスは、B型肝炎ウイルス又はC型肝炎ウイルスであってもよい。ラブドウイルスは、リ
ッサウイルス(狂犬病ウイルス)又はベシクロウイルス(VSV)であってもよい。カリチウイルス科は、ノーウォークウイルス、又はノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスであってもよい。コロナウイルスは、SARS CoV-1、SARS-CoV-2、MERS、ヒト呼吸器コロナウイルス、鶏伝染性気管支炎(IBV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)、又はブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)であってもよい。レトロウイルスは、オンコウイルス、レンチウイルス又はスプーマウイルスであってもよい。レオウイルスは、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルティウイルスであってもよい。パルボウイルスは、パルボウイルスB19であってもよい。ヒトヘルペスウイルスは、単純疱疹ウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV7)、又はヒトヘルペスウイルス8(HHV8)であってもよい。パポバウイルスは、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス(Adenoviruess)又はアレナウイルスであってもよい。
ッサウイルス(狂犬病ウイルス)又はベシクロウイルス(VSV)であってもよい。カリチウイルス科は、ノーウォークウイルス、又はノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスであってもよい。コロナウイルスは、SARS CoV-1、SARS-CoV-2、MERS、ヒト呼吸器コロナウイルス、鶏伝染性気管支炎(IBV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)、又はブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)であってもよい。レトロウイルスは、オンコウイルス、レンチウイルス又はスプーマウイルスであってもよい。レオウイルスは、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルティウイルスであってもよい。パルボウイルスは、パルボウイルスB19であってもよい。ヒトヘルペスウイルスは、単純疱疹ウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV7)、又はヒトヘルペスウイルス8(HHV8)であってもよい。パポバウイルスは、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス(Adenoviruess)又はアレナウイルスであってもよい。
【0018】
実施例及び図13で示されるように、好ましい実施形態において、ウイルス抗原は、狂犬病ウイルス抗原、好ましくは狂犬病ウイルス糖タンパク質であってもよい。別の好ましい実施形態において、並びに実施例及び図29で示されるように、ウイルス抗原は、コロナウイルス抗原であってもよい。好ましくは、コロナウイルス抗原は、表面糖タンパク質、より好ましくはSARS-CoV-2の表面糖タンパク質である。
【0019】
細菌由来のタンパク質及びペプチドは、細菌抗原であってもよい。
【0020】
細菌抗原は、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、バークホルデリア属の種(例えば、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、バークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)及びバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia))、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus inkuenzae)、破傷風菌(Clostridium tetani)(破傷風)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinums)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Cornynebacterium diphtheriae)(ジフテリア)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、コクシエラ・バーネッティイ(Coxiella burnetii)、ブルセラ属の種(例えば、ウシ流産菌(B. abortus)、イヌ流産菌(B. canis)、ヤギ流産菌(B. melitensis)、B．ネオトメ(B. neotomae)、ヒツジ流産菌(B. ovis)、ブタ流産菌(B. suis)及びB．ピニペディアエ(B. pinnipediae))、フランシセラ属の種(例えば、F．ノビシダ(F. novicida)、F．フィロミラギア(F. philomiragia)及びF．ツラレンシス(F. tularensis))、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、ナイセリア・ゴノロエエ(Neiserria gonorrhoeae)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)(梅毒)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enter ocolitica)、大腸菌(E．coli)、炭疽菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、ペスト菌(Yersinia pestis)(ペスト)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、リケッチア属、リステリア属、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、チフス菌(Salmonella typhi)(腸チフス)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorfer)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)及びクレブシエラ属種からなる群から選択される細菌由来であってもよい。
【0021】
真菌由来のタンパク質及びペプチドは、真菌抗原であってもよい。
【0022】
真菌抗原は、皮膚糸状菌、例えば:エピデルモフィトン・コックサム(Epidermophyton koccusum)、オーズアン小胞子菌(Microsporum audouini)、イヌ小胞子菌(Microsporum canis)、ミクロスポルム・ジストルツム(Microsporum distortum)、ミクロスポルム・エクイナム(Microsporum equinum)、ミクロスポルム・ギプセウム(Microsporum gypsum)、ミクロスポルム・ナヌム(Microsporum nanum)、トリコフィトン・コンセントリクム(Trichophyton concentricum)、トリコフィトン・エクイヌム(Trichophyton equinum)、トリコフィトン・ガリネ(Trichophyton gallinae)、トリコフィトン・ジプセウム(Trichophyton gypseum)、トリコフィトン・メグニニイ(Trichophyton megnini)、トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)、トリコフィトン・クインケアナム(Trichophyton quinckeanum)、トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・シェーンライニイ(Trichophyton schoenleini)、トリコフィトン・トンスランス(Trichophyton tonsurans)、トリコフィトン・ベルコースム(Trichophyton verrucosum)、T.ベルコースムvar．アルブム(T verrucosum var. album)、var．ディスコイデス(discoides)、var．オクラセウム(ochraceum)、トリコフィトン・ビオラセウム(Trichophyton violaceum)、及び/若しくはトリコフィトン・ファヴィフォルメ(Trichophyton faviforme)等からなる群から;又はアスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・カブス(Aspergillus kavus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニダランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、アスペルギルス・シドウィ(Aspergillus sydowi)、アスペルギルス・カバタス(Aspergillus kavatus)、アスペルギルス・グラウクス(Aspergillus glaucus)、ブラストシゾミセス・カピタツス(Blastoschizomyces capitatus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・エノラーゼ(Candida enolase)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・パラシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ステラトイデア(Candida stellatoidea)、カンジダ・クセイ(Candida kusei)、カンジダ・パラクワセイ(Candida parakwsei)、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・プソイドトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondi)、クラドスポリウム・カリオニイ(Cladosporium carrionii)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマチジス(Blastomyces dermatidis)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ゲオトリクム・クラバツム(Geotrichum clavatum)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、微胞子虫目、エンセファリトゾーン属の種、セプタータ・インテスティナリス(Septata intestinalis)及びエンテロシトゾーン・ビエヌーシ(Enterocytozoon bieneusi);ブラキオラ属の種、ミクロスポリジウム属の種、ノゼマ属の種、プレイストフォラ属の種、トラキプレイストフォラ属の種、ビタフォルマ属の種、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、フィチウム・インシディオサム(Pythiumn insidiosum)、ピチロスポルム・オバーレ(Pityrosporum ovale)、サッカロマイセス・セレビシエ(Sacharomyces cerevisae)、サッカロマイセス・ブラウディ(Saccharomyces boulardii)、サッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)、スケドスポリウム・アピオスペルム(Scedosporium apiosperum)、スポロトリックス・シェンキィ(Sporothrix schenckii)、バイゲル毛芽胞菌(Trichosporon beigelii)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ペニシリウム・マルネッフェイ(Penicillium marneffei)、マラセチア属の種、フォンセカエア属の種、ワンジエラ属(Wangiella)の種 、スポロトリクス属の種、バシジオボラス属の種、コニジオボルス属の種、クモノスカビ属の種、ムコール属の種、アブシディア属の種、モルティエラ属の種、カニングハメラ属の種、サクセナエア属の種、アルテルナリア属の種、クルブラリア属の種、ヘルミントスポリウム属の種、フザリウム属の種、アスペルギルス属の種、ペニシリウム属の種、モノリニア属(Monolinia)の種、リゾクトニア属の種、ペシロミセス属の種、ピソマイセス属の種、並びにクラドスポリウム属の種から選択される真菌由来であってもよい。
【0023】
原生動物由来のタンパク質及びペプチドは、原生動物抗原であってもよい。
【0024】
原生動物抗原は、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、ランブル鞭毛虫(Giardia lambli)、クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)、シクロスポラ・カイエタネンシス(Cyclospora cayatanensis)、及びトキソプラズマ属からなる群から選択される原生動物由来であってもよい。
【0025】
治療用生体分子は、植物由来のタンパク質及びペプチドであってもよい。好ましくは、タンパク質及びペプチドは、植物抗原である。植物抗原は、ヒマ(Ricinus communis)由来であってもよい。
【0026】
別の実施形態において、治療用生体分子は、免疫原又は抗原であってもよい。好ましくは、免疫原又は抗原は、腫瘍免疫原若しくは抗原、又はがん免疫原若しくは抗原である。腫瘍免疫原及び抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、例えばポリペプチド腫瘍抗原又は糖タンパク質腫瘍抗原であってもよい。
【0027】
腫瘍抗原は、(a)がん細胞に関連する全長分子、(b)そのホモログ及び改変された形態、例えば、欠失した、付加された、及び/又は置換された部分を有する分子等、並びに(c)その断片であってもよい。
【0028】
好適な腫瘍免疫原としては、CD8+リンパ球によって認識されるクラスI制限抗原、又はCD4+リンパ球によって認識されるクラスII制限抗原が挙げられる。
【0029】
腫瘍抗原は、精巣がん、メラノーマ、肺がん、頭頸部がん、NSCLC、乳がん、消化器がん、膀胱がん、結腸直腸がん、膵臓がん、リンパ腫、白血病、腎臓がん、肝がん、卵巣がん、胃がん及び前立腺がんからなる群から選択されるがんに関連する抗原であってもよい。
【0030】
腫瘍抗原は、
(a)がん精巣抗原、例えば、NY-ESO-I、SSX2、SCPl、加えて、RAGE、BAGE、GAGE及びMAGEファミリーポリペプチド、例えば、GAGE-I、GAGE-2、MAGE-I、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、及びMAGE-12(これらは、例えば、メラノーマ、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、及び膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる);
(b)突然変異した抗原、例えば、p53(様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部がんに関連する)、p21/Ras(例えば、メラノーマ、膵臓がん及び結腸直腸がんに関連する)、CDK4(例えば、メラノーマに関連する)、MUMl(例えば、メラノーマに関連する)、カスパーゼ-8(例えば、頭頸部がんに関連する)、CIA0205(例えば、膀胱がんに関連する)、HLA-A2-R1701、ベータカテニン(例えば、メラノーマに関連する)、TCR(例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫に関連する)、BCR-abl(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、トリオースリン酸イソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、及びLDLR-FUT;
(c)過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン4(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガレクチン9(例えば、ホジキン病に関連する)、プロテイナーゼ3(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、WT1(例えば、様々な白血病に関連する)、炭酸脱水酵素(例えば、腎臓がんに関連する)、アルドラーゼA(例えば、肺がんに関連する)、PRAME(例えば、メラノーマに関連する)、HER-2/neu(例えば、乳房、結腸、肺及び卵巣がんに関連する)、アルファ-フェトプロテイン(例えば、肝がんに関連する)、KSA(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガストリン(例えば、膵臓及び胃がんに関連する)、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-I(例えば、乳房及び卵巣がんに関連する)、G-250(例えば、腎細胞がんに関連する)、p53(例えば、乳房、結腸がんに関連する)、及びがん胎児性抗原(例えば、乳がん、肺がん、及び結腸直腸がん等の消化管のがんに関連する);
(d)共通の抗原、例えば、メラノーマ-メラニン細胞分化抗原、例えばMART-1/メランA、gplOO、MClR、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRPl及びチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2(例えば、メラノーマに関連する);
(e)前立腺関連抗原、例えばPAP、PSA、PSMA、PSH-Pl、PSM-Pl、PSM-P2、例えば前立腺がんに関連するもの;及び/又は
(f)免疫グロブリンイディオタイプ(例えば、骨髄腫及びB細胞リンパ腫に関連する)
から選択されてもよい。
(a)がん精巣抗原、例えば、NY-ESO-I、SSX2、SCPl、加えて、RAGE、BAGE、GAGE及びMAGEファミリーポリペプチド、例えば、GAGE-I、GAGE-2、MAGE-I、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、及びMAGE-12(これらは、例えば、メラノーマ、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、及び膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる);
(b)突然変異した抗原、例えば、p53(様々な固形腫瘍、例えば、結腸直腸、肺、頭頸部がんに関連する)、p21/Ras(例えば、メラノーマ、膵臓がん及び結腸直腸がんに関連する)、CDK4(例えば、メラノーマに関連する)、MUMl(例えば、メラノーマに関連する)、カスパーゼ-8(例えば、頭頸部がんに関連する)、CIA0205(例えば、膀胱がんに関連する)、HLA-A2-R1701、ベータカテニン(例えば、メラノーマに関連する)、TCR(例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫に関連する)、BCR-abl(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、トリオースリン酸イソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、及びLDLR-FUT;
(c)過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン4(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガレクチン9(例えば、ホジキン病に関連する)、プロテイナーゼ3(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、WT1(例えば、様々な白血病に関連する)、炭酸脱水酵素(例えば、腎臓がんに関連する)、アルドラーゼA(例えば、肺がんに関連する)、PRAME(例えば、メラノーマに関連する)、HER-2/neu(例えば、乳房、結腸、肺及び卵巣がんに関連する)、アルファ-フェトプロテイン(例えば、肝がんに関連する)、KSA(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガストリン(例えば、膵臓及び胃がんに関連する)、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-I(例えば、乳房及び卵巣がんに関連する)、G-250(例えば、腎細胞がんに関連する)、p53(例えば、乳房、結腸がんに関連する)、及びがん胎児性抗原(例えば、乳がん、肺がん、及び結腸直腸がん等の消化管のがんに関連する);
(d)共通の抗原、例えば、メラノーマ-メラニン細胞分化抗原、例えばMART-1/メランA、gplOO、MClR、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRPl及びチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2(例えば、メラノーマに関連する);
(e)前立腺関連抗原、例えばPAP、PSA、PSMA、PSH-Pl、PSM-Pl、PSM-P2、例えば前立腺がんに関連するもの;及び/又は
(f)免疫グロブリンイディオタイプ(例えば、骨髄腫及びB細胞リンパ腫に関連する)
から選択されてもよい。
【0031】
治療用生体分子は、真核生物ポリペプチドであってもよい。一実施形態において、真核細胞ポリペプチドは、哺乳類ポリペプチドである。哺乳類ポリペプチドは、酵素;酵素阻害剤;ホルモン;免疫系タンパク質;受容体;結合タンパク質;転写又は翻訳因子;腫瘍増殖抑制タンパク質;構造タンパク質及び血液タンパク質からなる群から選択さてもよい。
【0032】
酵素は、キモシン;胃リパーゼ;組織プラスミノゲン活性化因子;ストレプトキナーゼ;コレステロール生合成又は分解性のステロイド産生(steriodogenic)酵素;キナーゼ;ホスホジエステラーゼ;メチラーゼ;デメチラーゼ;デヒドロゲナーゼ;セルラーゼ;プロテアーゼ;リパーゼ;ホスホリパーゼ;アロマターゼ;シトクロム;アデニレート又はグアニル酸シクラーゼ(guanylaste cyclases)及びノイラミニダーゼ(neuramidases)からなる群から選択さてもよい。
【0033】
酵素阻害剤は、メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織阻害剤であってもよい。ホルモンは、成長ホルモンであってもよい。
【0034】
免疫系タンパク質は、サイトカイン;ケモカイン;リンフォカイン;エリスロポイエチン;インテグリン;アドレシン;セレクチン;ホーミング受容体;T細胞受容体及び免疫グロブリンからなる群から選択さてもよい。
【0035】
サイトカインは、インターロイキン、例えばIL-2、IL-4及び/若しくはIL-6、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)又は腫瘍壊死因子(TNF)であってもよい。
【0036】
ケモカインは、マクロファージ炎症性タンパク質-2及び/又はプラスミノゲン活性化因子であってもよい。
【0037】
リンフォカインは、インターフェロンであってもよい。
【0038】
免疫グロブリンは、天然の、改変された、若しくはキメラ免疫グロブリン又はこれらの断片であってもよい。好ましくは、免疫グロブリンは、二重の活性を有するキメラ免疫グロブリンであり、例えば抗体酵素又は抗体-毒素のキメラである。
【0039】
ホルモンは、インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン;成長ホルモン(例えば、ヒト成長ホルモン)、増殖因子(例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子等)からなる群から選択さてもよい。
【0040】
受容体は、ステロイドホルモン受容体又はペプチド受容体であってもよい。好ましくは、受容体は、増殖因子受容体である。
【0041】
結合タンパク質は、増殖因子結合タンパク質であってもよい。
【0042】
腫瘍増殖抑制タンパク質は、血管新生を阻害するタンパク質であってもよい。
【0043】
構造タンパク質は、コラーゲン;フィブロイン;フィブリノーゲン;エラスチン;チューブリン;アクチン;及びミオシンからなる群から選択さてもよい。
【0044】
血液タンパク質は、トロンビン;血清アルブミン;第VII因子;第VIII因子;インスリン;第IX因子;第X因子;組織プラスミノゲン活性化因子;プロテインC;フォンウィルブランド(von Wilebrand)因子;アンチトロンビンIII;グルコセレブロシダーゼ;エリスロポイエチン顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)又は改変された第VIII因子;及び抗凝血剤からなる群から選択されてもよい。
【0045】
好ましい一実施形態において、治療用生体分子は、リンパ球のホメオスタシスを調節することが可能なサイトカインであり、好ましくは、T細胞の発生、プライミング、拡大、分化及び/又は生存に関与する、好ましくはそれを誘導又は強化するサイトカインである。したがって、好ましくは、サイトカインは、インターロイキンである。最も好ましくは、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、又はIL-21。
【0046】
治療用生体分子は、幹細胞の特徴を有する細胞への体細胞の再プログラミングを強化することが可能なタンパク質であってもよい。
【0047】
幹細胞の特徴を有する細胞への体細胞の再プログラミングを強化することが可能なタンパク質は、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、p53、ART-4、BAGE、ss-カテニン/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CD4/m、CEA、CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、GaplOO、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(又はhTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、ミオシン/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90マイナーBCR-abL、Plac-1、Pml/RARa、PRAME、プロテイナーゼ3、PSA、PSM、RAGE、RU1又はRU2、SAGE、SART-1又はSART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE及びWT、好ましくはWT-1からなる群から選択さてもよい。
【0048】
好ましくは、MAGE-Aは、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、又はMAGE-A12からなる群から選択される。
【0049】
好ましくは、幹細胞の特徴を有する細胞への体細胞の再プログラミングを強化することが可能なタンパク質は、OCT4、SOX2、LF4;c-MYC;NANOG;LIN28である。
【0050】
治療用生体分子は、細胞療法の指示のためにエクスビボで細胞の改変に利用される生体分子であってもよい。したがって、好ましくは、治療用生体分子は、免疫グロブリン、T細胞受容体及びNK受容体からなる群から選択されてもよい。
【0051】
治療用生体分子は、内因性宿主遺伝子の発現を調節することが可能なRNA分子であってもよく、例えば干渉RNA、例えば小分子RNA、siRNA又はマイクロRNAであってもよい。
【0052】
好ましくは、RNA構築物は、RNAに対する自然免疫応答を低減又はブロックすることが可能な少なくとも1種の生来の阻害タンパク質(IIP)をコードする遺伝子を含む。RNAに対する自然免疫応答の低減又はブロックは、本発明のRNA構築物を有する宿主細胞によるRNA(好ましくは、長鎖RNA(これは、長さが少なくとも1kbであるRNAを意味することが当業者により理解されるであろう)又はdsRNA)の認識を低減又はブロックすることによって、IIPによって好ましくは達成される。より好ましくは、生来の阻害タンパク質は、それがRNAに対する、好ましくは第1の態様のRNA構築物のRNAに対する生来の応答を低減又はブロックできるような、生来の阻害タンパク質である。生来の阻害タンパク質は、インターフェロン調節因子3及び7(IRF3及びIRF7)及びNF-κB転写因子の活性化を引き起こすパターン認識受容体によってサイトゾルsaRNAの認識を低減又は防止すること、様々な抗ウイルス遺伝子(例えばsaRNA発現を抑制することが公知のIFIT1-3、Mx1、Mx2)、その生成物が自然免疫応答を統括する炎症促進性遺伝子を直接駆動させること、並びに標準的には任意のインターフェロン依存性カスケードの上流におけるIFN刺激遺伝子(ISG)を直接活性化することが可能であってもよい。これらの経路は、抗ウイルス応答の多くを更に増幅する正のフィードバックループを提供するI及びIII型インターフェロンの誘導によって強化される場合もある。
【0053】
RNAは、一本鎖RNA又は二本鎖RNAであってもよい。好ましくは、RNAは、saRNAである。
【0054】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、(i)例えばMDA5のオリゴマー化及びMDA5のRNAへの結合を防止することによって、メラノーマ分化関連タンパク質5(MDA5)の作用を低減又はブロックすること、及び/又は(ii)PKR活性化タンパク質と称される場合もあるPACTのRNAへの結合をブロック又は低減することのいずれかが可能であってもよい。当業者は、これらのセンサーは、シグナルを送って、シグナルを下流のミトコンドリアアダプターに変換し、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達(MAVS)は、転写因子(NF-κB、IRF-3、-7)の活性化を含む下流のカスケードを活性化することを理解するであろう。これは順に、適切な抗ウイルスシグナル伝達応答、及びsaRNA発現を抑制することが公知のIFIT1を含む抗ウイルス活性を有する分子をコードするI型インターフェロン刺激遺伝子の活性化をもたらす。
【0055】
MDA5の作用をブロックする少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、パラミクソウイルスVタンパク質、コクサッキーウイルスA16、コクサッキーウイルスA6、及びエンテロウイルスD68ウイルスの3Cタンパク質;ビルナウイルスのVP3タンパク質;ブタデルタコロナウイルスのアクセサリータンパク質NS6;脳心筋炎ウイルスの2Cタンパク質;並びにこれらのオルソログからなる群から選択さてもよい。
【0056】
好ましくは、MDA5の作用をブロックする少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、パラミクソウイルスVタンパク質である。最も好ましくは、MDA5の作用をブロックする少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、パラインフルエンザウイルス5型Vタンパク質(PIV5V)である。
【0057】
PACTのRNAへの結合をブロック又は低減する少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、任意のコロナウイルスのORF4a(NS4a)、任意のコロナウイルスのORF3b、又はマウス肝炎ウイルス及びSARS(コロナウイルス)のヌクレオカプシドタンパク質;並びにこれらのオルソログからなる群から選択さてもよい。
【0058】
好ましくは、ORF4a(NS4a)は、中東呼吸器症候群コロナウイルスMERSコロナウイルス(ORF4a)である。
【0059】
好ましくは、コロナウイルスORF3bは、SARS-CoV2 ORF3bである。
【0060】
以下に、PIV5V、ORF4a及びORF3bのそれぞれのタンパク質、DNA並びにRNA配列を提供する。
【0061】
一実施形態において、PIV5Vポリペプチドは、以下の通り、配列番号11として本明細書で提供される:
MDPTDLSFSPDEINKLIETGLNTVEYFTSQQVTGTSSLGKNTIPPGVTGLLTNAAEAKIQESTNHQKGSVGGGAKPKKPRPKIAIVPADDKTVPGKPIPNPLLGLDSTPSTQTVLDLSGKTLPSGSYKGVKLAKFGKENLMTRFIEEPRENPIATSSPIDFKRGRDTGGFHRREYSIGWVGDEVKVTEWCNPSCSPITAAARRFECTCHQCPVTCSECERDT[配列番号11]
MDPTDLSFSPDEINKLIETGLNTVEYFTSQQVTGTSSLGKNTIPPGVTGLLTNAAEAKIQESTNHQKGSVGGGAKPKKPRPKIAIVPADDKTVPGKPIPNPLLGLDSTPSTQTVLDLSGKTLPSGSYKGVKLAKFGKENLMTRFIEEPRENPIATSSPIDFKRGRDTGGFHRREYSIGWVGDEVKVTEWCNPSCSPITAAARRFECTCHQCPVTCSECERDT[配列番号11]
【0062】
したがって、好ましくは、PIV5Vポリペプチドは、配列番号11に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号11をコードするRNAヌクレオチド配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0063】
一実施形態において、PIV5Vポリペプチドは、以下の通り、配列番号12のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGGACCCTACCGACCTGAGCTTCAGCCCCGACGAGATCAACAAGCTGATCGAGACAGGCCTGAACACCGTGGAATACTTCACCAGCCAGCAAGTGACCGGCACAAGCAGCCTGGGCAAGAACACAATTCCTCCAGGCGTGACCGGCCTGCTGACAAATGCTGCCGAGGCCAAGATCCAAGAGAGCACCAACCACCAGAAGGGCTCTGTTGGAGGCGGAGCCAAGCCTAAGAAGCCCAGACCTAAGATCGCCATCGTGCCCGCCGACGATAAGACAGTGCCTGGCAAGCCCATTCCTAATCCTCTGCTGGGCCTCGACAGCACCCCTAGCACACAGACAGTGCTGGATCTGAGCGGCAAGACACTGCCTAGCGGCAGCTATAAGGGCGTGAAGCTGGCCAAGTTCGGCAAAGAAAACCTGATGACCCGGTTCATCGAGGAACCCAGAGAGAACCCTATCGCCACCAGCTCTCCCATCGACTTCAAGAGAGGCAGAGACACCGGCGGCTTCCACAGAAGAGAGTACAGCATTGGCTGGGTCGGAGATGAAGTGAAAGTGACCGAGTGGTGCAACCCCAGCTGCAGCCCTATTACAGCCGCCGCTAGAAGATTCGAGTGCACCTGTCACCAGTGTCCTGTGACCTGTAGCGAGTGCGAGCGGGACACA[配列番号12]
ATGGACCCTACCGACCTGAGCTTCAGCCCCGACGAGATCAACAAGCTGATCGAGACAGGCCTGAACACCGTGGAATACTTCACCAGCCAGCAAGTGACCGGCACAAGCAGCCTGGGCAAGAACACAATTCCTCCAGGCGTGACCGGCCTGCTGACAAATGCTGCCGAGGCCAAGATCCAAGAGAGCACCAACCACCAGAAGGGCTCTGTTGGAGGCGGAGCCAAGCCTAAGAAGCCCAGACCTAAGATCGCCATCGTGCCCGCCGACGATAAGACAGTGCCTGGCAAGCCCATTCCTAATCCTCTGCTGGGCCTCGACAGCACCCCTAGCACACAGACAGTGCTGGATCTGAGCGGCAAGACACTGCCTAGCGGCAGCTATAAGGGCGTGAAGCTGGCCAAGTTCGGCAAAGAAAACCTGATGACCCGGTTCATCGAGGAACCCAGAGAGAACCCTATCGCCACCAGCTCTCCCATCGACTTCAAGAGAGGCAGAGACACCGGCGGCTTCCACAGAAGAGAGTACAGCATTGGCTGGGTCGGAGATGAAGTGAAAGTGACCGAGTGGTGCAACCCCAGCTGCAGCCCTATTACAGCCGCCGCTAGAAGATTCGAGTGCACCTGTCACCAGTGTCCTGTGACCTGTAGCGAGTGCGAGCGGGACACA[配列番号12]
【0064】
したがって、好ましくは、PIV5Vポリペプチドは、配列番号12に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0065】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号47のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGGACCCUACCGACCUGAGCUUCAGCCCCGACGAGAUCAACAAGCUGAUCGAGACAGGCCUGAACACCGUGGAAUACUUCACCAGCCAGCAAGUGACCGGCACAAGCAGCCUGGGCAAGAACACAAUUCCUCCAGGCGUGACCGGCCUGCUGACAAAUGCUGCCGAGGCCAAGAUCCAAGAGAGCACCAACCACCAGAAGGGCUCUGUUGGAGGCGGAGCCAAGCCUAAGAAGCCCAGACCUAAGAUCGCCAUCGUGCCCGCCGACGAUAAGACAGUGCCUGGCAAGCCCAUUCCUAAUCCUCUGCUGGGCCUCGACAGCACCCCUAGCACACAGACAGUGCUGGAUCUGAGCGGCAAGACACUGCCUAGCGGCAGCUAUAAGGGCGUGAAGCUGGCCAAGUUCGGCAAAGAAAACCUGAUGACCCGGUUCAUCGAGGAACCCAGAGAGAACCCUAUCGCCACCAGCUCUCCCAUCGACUUCAAGAGAGGCAGAGACACCGGCGGCUUCCACAGAAGAGAGUACAGCAUUGGCUGGGUCGGAGAUGAAGUGAAAGUGACCGAGUGGUGCAACCCCAGCUGCAGCCCUAUUACAGCCGCCGCUAGAAGAUUCGAGUGCACCUGUCACCAGUGUCCUGUGACCUGUAGCGAGUGCGAGCGGGACACA[配列番号47]
AUGGACCCUACCGACCUGAGCUUCAGCCCCGACGAGAUCAACAAGCUGAUCGAGACAGGCCUGAACACCGUGGAAUACUUCACCAGCCAGCAAGUGACCGGCACAAGCAGCCUGGGCAAGAACACAAUUCCUCCAGGCGUGACCGGCCUGCUGACAAAUGCUGCCGAGGCCAAGAUCCAAGAGAGCACCAACCACCAGAAGGGCUCUGUUGGAGGCGGAGCCAAGCCUAAGAAGCCCAGACCUAAGAUCGCCAUCGUGCCCGCCGACGAUAAGACAGUGCCUGGCAAGCCCAUUCCUAAUCCUCUGCUGGGCCUCGACAGCACCCCUAGCACACAGACAGUGCUGGAUCUGAGCGGCAAGACACUGCCUAGCGGCAGCUAUAAGGGCGUGAAGCUGGCCAAGUUCGGCAAAGAAAACCUGAUGACCCGGUUCAUCGAGGAACCCAGAGAGAACCCUAUCGCCACCAGCUCUCCCAUCGACUUCAAGAGAGGCAGAGACACCGGCGGCUUCCACAGAAGAGAGUACAGCAUUGGCUGGGUCGGAGAUGAAGUGAAAGUGACCGAGUGGUGCAACCCCAGCUGCAGCCCUAUUACAGCCGCCGCUAGAAGAUUCGAGUGCACCUGUCACCAGUGUCCUGUGACCUGUAGCGAGUGCGAGCGGGACACA[配列番号47]
【0066】
したがって、それゆえに、好ましくはRNA構築物は、配列番号47として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0067】
一実施形態において、MERS-CoV ORF4aポリペプチドは、以下の通り、配列番号15として本明細書で提供される:
MDYVSLLNQIWQKYLNSPYTTCLYIPKPTAKYTPLVGTSLHPVLWNCQLSFAGYTESAVNSTKALAKQDAAQRIAWLLHKDGGIPDGCSLYLRHSSLFAQSEEEESFSN[配列番号15]
MDYVSLLNQIWQKYLNSPYTTCLYIPKPTAKYTPLVGTSLHPVLWNCQLSFAGYTESAVNSTKALAKQDAAQRIAWLLHKDGGIPDGCSLYLRHSSLFAQSEEEESFSN[配列番号15]
【0068】
したがって、好ましくは、MERS-CoV ORF4aポリペプチドは、配列番号15に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号15をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0069】
一実施形態において、MERS-CoV ORF4aポリペプチドは、以下の通り、配列番号16のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGGACTACGTGTCCCTGCTGAACCAGATTTGGCAGAAGTACCTGAACAGCCCCTACACCACCTGTCTGTACATCCCCAAGCCTACCGCCAAGTACACACCTCTCGTGGGCACATCTCTGCACCCCGTGCTGTGGAATTGCCAGCTGAGCTTTGCCGGCTACACCGAGTCTGCCGTGAACAGCACAAAGGCCCTGGCCAAACAGGACGCCGCTCAGAGAATTGCCTGGCTGCTGCACAAGGATGGCGGCATCCCTGATGGCTGTAGCCTGTACCTGAGACACAGCAGCCTGTTCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAATCCTTCAGCAAC[配列番号16]
ATGGACTACGTGTCCCTGCTGAACCAGATTTGGCAGAAGTACCTGAACAGCCCCTACACCACCTGTCTGTACATCCCCAAGCCTACCGCCAAGTACACACCTCTCGTGGGCACATCTCTGCACCCCGTGCTGTGGAATTGCCAGCTGAGCTTTGCCGGCTACACCGAGTCTGCCGTGAACAGCACAAAGGCCCTGGCCAAACAGGACGCCGCTCAGAGAATTGCCTGGCTGCTGCACAAGGATGGCGGCATCCCTGATGGCTGTAGCCTGTACCTGAGACACAGCAGCCTGTTCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAATCCTTCAGCAAC[配列番号16]
【0070】
したがって、好ましくは、MERS-CoV ORF4aポリペプチドは、配列番号16に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0071】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号48のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGGACUACGUGUCCCUGCUGAACCAGAUUUGGCAGAAGUACCUGAACAGCCCCUACACCACCUGUCUGUACAUCCCCAAGCCUACCGCCAAGUACACACCUCUCGUGGGCACAUCUCUGCACCCCGUGCUGUGGAAUUGCCAGCUGAGCUUUGCCGGCUACACCGAGUCUGCCGUGAACAGCACAAAGGCCCUGGCCAAACAGGACGCCGCUCAGAGAAUUGCCUGGCUGCUGCACAAGGAUGGCGGCAUCCCUGAUGGCUGUAGCCUGUACCUGAGACACAGCAGCCUGUUCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAAUCCUUCAGCAAC[配列番号48]
AUGGACUACGUGUCCCUGCUGAACCAGAUUUGGCAGAAGUACCUGAACAGCCCCUACACCACCUGUCUGUACAUCCCCAAGCCUACCGCCAAGUACACACCUCUCGUGGGCACAUCUCUGCACCCCGUGCUGUGGAAUUGCCAGCUGAGCUUUGCCGGCUACACCGAGUCUGCCGUGAACAGCACAAAGGCCCUGGCCAAACAGGACGCCGCUCAGAGAAUUGCCUGGCUGCUGCACAAGGAUGGCGGCAUCCCUGAUGGCUGUAGCCUGUACCUGAGACACAGCAGCCUGUUCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAAUCCUUCAGCAAC[配列番号48]
【0072】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号48として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0073】
一実施形態において、SARS-CoV-2 ORF3bポリペプチドは、以下の通り、配列番号20として本明細書で提供される:
MMPTIFFAGILIVTTIVYLTIVQLLQLSLLQVMAQQVLFLNMTTRLVVILKNGNLEQKTVLYYTVTSLQTITSCTQLN[配列番号20]
MMPTIFFAGILIVTTIVYLTIVQLLQLSLLQVMAQQVLFLNMTTRLVVILKNGNLEQKTVLYYTVTSLQTITSCTQLN[配列番号20]
【0074】
したがって、好ましくは、SARS-CoV-2 ORF3bポリペプチドは、配列番号20に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号20をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0075】
一実施形態において、SARS-CoV-2 ORF3bポリペプチドは、以下の通り、配列番号55のヌクレオチド配列(Wuhan-Hu-1受託番号NC_045512.2;ヌクレオチド25814-26050)によってコードされる:
ATGATGCCAACTATTTTCTTTGCTGGCATACTAATTGTTACGACTATTGTATACCTTACAATAGTGCAACTTCTTCAATTGTCATTACTTCAGGTGATGGCACAACAAGTCCTATTTCTGAACATGACTACCAGATTGGTGGTTATACTGAAAAATGGGAATCTGGAGCAAAAGACTGTGTTGTATTACACAGTTACTTCACTTCAGACTATTACCAGCTGTACTCAACTCAATTGA[配列番号55]
ATGATGCCAACTATTTTCTTTGCTGGCATACTAATTGTTACGACTATTGTATACCTTACAATAGTGCAACTTCTTCAATTGTCATTACTTCAGGTGATGGCACAACAAGTCCTATTTCTGAACATGACTACCAGATTGGTGGTTATACTGAAAAATGGGAATCTGGAGCAAAAGACTGTGTTGTATTACACAGTTACTTCACTTCAGACTATTACCAGCTGTACTCAACTCAATTGA[配列番号55]
【0076】
したがって、好ましくは、SARS-CoV-2 ORF3bポリペプチドは、配列番号55に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0077】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号56のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGAUGCCAACUAUUUUCUUUGCUGGCAUACUAAUUGUUACGACUAUUGUAUACCUUACAAUAGUGCAACUUCUUCAAUUGUCAUUACUUCAGGUGAUGGCACAACAAGUCCUAUUUCUGAACAUGACUACCAGAUUGGUGGUUAUACUGAAAAAUGGGAAUCUGGAGCAAAAGACUGUGUUGUAUUACACAGUUACUUCACUUCAGACUAUUACCAGCUGUACUCAACUCAAUUGA[配列番号56]
AUGAUGCCAACUAUUUUCUUUGCUGGCAUACUAAUUGUUACGACUAUUGUAUACCUUACAAUAGUGCAACUUCUUCAAUUGUCAUUACUUCAGGUGAUGGCACAACAAGUCCUAUUUCUGAACAUGACUACCAGAUUGGUGGUUAUACUGAAAAAUGGGAAUCUGGAGCAAAAGACUGUGUUGUAUUACACAGUUACUUCACUUCAGACUAUUACCAGCUGUACUCAACUCAAUUGA[配列番号56]
【0078】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号56として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0079】
別の実施形態において、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、MDA5活性化の下流経路を阻害すること、又はdsRNAのMDA/PACT認識の下流経路をブロックすることが可能であってもよい。
【0080】
MDA5活性化の下流経路を阻害すること、又はdsRNAのMDA/PACT認識の下流経路をブロックすることが可能な少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、HSV-2 Us1;HSV-1 Us11;OV20.0L;BVDV Npro;ランガットウイルスNS5;及びインフルエンザNS1からなる群から選択されてもよい。
【0081】
当業者は、MDA5活性化の下流経路を阻害すること、又はdsRNAのMDA/PACT認識の下流経路をブロックすることが可能な少なくとも1種の生来の阻害タンパク質は、MDA5の作用をブロックする少なくとも1種の生来の阻害タンパク質、及び/又はPACTのRNAへの結合をブロック又は低減する少なくとも1種の生来の阻害タンパク質と組み合わせて使用してもよいことを理解するであろう。
【0082】
一実施形態において、HSV-2 Us1ポリペプチドは、以下の通り、配列番号1として本明細書で提供される:
VRDCYLMGYCRTRLGPRTWGRLLQISGGTWDVRLRNAIREVEAHFEPAAEPVCELPCLNARRYGPECDVGNLETNGGSTSDDEISDATDSDDTLASHSDTEGGPSPAGRENPESASGGAIAARLECEFGTFDWTSEEGSQPWLSAVVADTSSAERSGLPAPGACRATEAPEREDGCRKMRFPAACPYPCGHTFLRP[配列番号1]
VRDCYLMGYCRTRLGPRTWGRLLQISGGTWDVRLRNAIREVEAHFEPAAEPVCELPCLNARRYGPECDVGNLETNGGSTSDDEISDATDSDDTLASHSDTEGGPSPAGRENPESASGGAIAARLECEFGTFDWTSEEGSQPWLSAVVADTSSAERSGLPAPGACRATEAPEREDGCRKMRFPAACPYPCGHTFLRP[配列番号1]
【0083】
したがって、好ましくは、HSV-2 Us1ポリペプチドは、配列番号1に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号1をコードするRNAヌクレオチド配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0084】
一実施形態において、HSV-2 Us1ポリペプチドは、以下の通り、配列番号2のヌクレオチド配列によってコードされる:
GTGAGAGACTGCTACCTGATGGGCTACTGCCGGACAAGACTGGGACCTAGAACATGGGGCAGACTGCTGCAGATCAGCGGCGGAACATGGGATGTGCGGCTGAGAAACGCCATCAGAGAGGTGGAAGCCCACTTCGAGCCTGCCGCTGAACCTGTGTGTGAACTGCCCTGTCTGAACGCTAGAAGATACGGCCCTGAGTGCGACGTGGGCAACCTGGAAACAAATGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGATTTCCGATGCCACCGACAGCGACGATACACTGGCCAGCCACAGCGATACAGAAGGCGGACCATCTCCTGCCGGAAGAGAGAATCCTGAGTCTGCCTCTGGCGGAGCCATTGCCGCTAGACTGGAATGCGAGTTCGGCACCTTCGACTGGACAAGCGAGGAAGGCTCTCAGCCTTGGCTGTCTGCTGTGGTGGCCGATACAAGCTCTGCCGAGAGAAGTGGACTTCCTGCTCCTGGCGCCTGTAGAGCTACAGAGGCTCCTGAAAGAGAGGACGGCTGCAGAAAGATGCGGTTCCCTGCCGCCTGTCCTTATCCTTGCGGCCACACATTTCTGCGGCCC[配列番号2]
GTGAGAGACTGCTACCTGATGGGCTACTGCCGGACAAGACTGGGACCTAGAACATGGGGCAGACTGCTGCAGATCAGCGGCGGAACATGGGATGTGCGGCTGAGAAACGCCATCAGAGAGGTGGAAGCCCACTTCGAGCCTGCCGCTGAACCTGTGTGTGAACTGCCCTGTCTGAACGCTAGAAGATACGGCCCTGAGTGCGACGTGGGCAACCTGGAAACAAATGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGATTTCCGATGCCACCGACAGCGACGATACACTGGCCAGCCACAGCGATACAGAAGGCGGACCATCTCCTGCCGGAAGAGAGAATCCTGAGTCTGCCTCTGGCGGAGCCATTGCCGCTAGACTGGAATGCGAGTTCGGCACCTTCGACTGGACAAGCGAGGAAGGCTCTCAGCCTTGGCTGTCTGCTGTGGTGGCCGATACAAGCTCTGCCGAGAGAAGTGGACTTCCTGCTCCTGGCGCCTGTAGAGCTACAGAGGCTCCTGAAAGAGAGGACGGCTGCAGAAAGATGCGGTTCCCTGCCGCCTGTCCTTATCCTTGCGGCCACACATTTCTGCGGCCC[配列番号2]
【0085】
したがって、好ましくは、HSV-2 Us1ポリペプチドは、配列番号2に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0086】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号42のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
GUGAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGACAAGACUGGGACCUAGAACAUGGGGCAGACUGCUGCAGAUCAGCGGCGGAACAUGGGAUGUGCGGCUGAGAAACGCCAUCAGAGAGGUGGAAGCCCACUUCGAGCCUGCCGCUGAACCUGUGUGUGAACUGCCCUGUCUGAACGCUAGAAGAUACGGCCCUGAGUGCGACGUGGGCAACCUGGAAACAAAUGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGAUUUCCGAUGCCACCGACAGCGACGAUACACUGGCCAGCCACAGCGAUACAGAAGGCGGACCAUCUCCUGCCGGAAGAGAGAAUCCUGAGUCUGCCUCUGGCGGAGCCAUUGCCGCUAGACUGGAAUGCGAGUUCGGCACCUUCGACUGGACAAGCGAGGAAGGCUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCUGUGGUGGCCGAUACAAGCUCUGCCGAGAGAAGUGGACUUCCUGCUCCUGGCGCCUGUAGAGCUACAGAGGCUCCUGAAAGAGAGGACGGCUGCAGAAAGAUGCGGUUCCCUGCCGCCUGUCCUUAUCCUUGCGGCCACACAUUUCUGCGGCCC[配列番号42]
GUGAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGACAAGACUGGGACCUAGAACAUGGGGCAGACUGCUGCAGAUCAGCGGCGGAACAUGGGAUGUGCGGCUGAGAAACGCCAUCAGAGAGGUGGAAGCCCACUUCGAGCCUGCCGCUGAACCUGUGUGUGAACUGCCCUGUCUGAACGCUAGAAGAUACGGCCCUGAGUGCGACGUGGGCAACCUGGAAACAAAUGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGAUUUCCGAUGCCACCGACAGCGACGAUACACUGGCCAGCCACAGCGAUACAGAAGGCGGACCAUCUCCUGCCGGAAGAGAGAAUCCUGAGUCUGCCUCUGGCGGAGCCAUUGCCGCUAGACUGGAAUGCGAGUUCGGCACCUUCGACUGGACAAGCGAGGAAGGCUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCUGUGGUGGCCGAUACAAGCUCUGCCGAGAGAAGUGGACUUCCUGCUCCUGGCGCCUGUAGAGCUACAGAGGCUCCUGAAAGAGAGGACGGCUGCAGAAAGAUGCGGUUCCCUGCCGCCUGUCCUUAUCCUUGCGGCCACACAUUUCUGCGGCCC[配列番号42]
【0087】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号42として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
【0088】
一実施形態において、HSV-1 Us1ポリペプチドは、以下の通り、配列番号3として本明細書で提供される:
VRDCYLMGYCRTRLGPRTWGRLLQISGGTWDVRLRNAIREVEAHFEPAAEPVCELPCLNARRYGPECDVGNLETNGGSTSDDEISDATDSDDTLASHSDTEGGPSPAGRENPESASGGAIAARLECEFGTFDWTSEEGSQPWLSAVVADIRDCYLMGYCRARLAPRTWCRLLQVSGGTWGMHLRNTIREVEARFDATAEPVCKLPCLETRRYGPECDLSNLEIHLSATSDDEISDATDLEAAGSDHTLASQSDTEDAPSPVTLETPEPRGSLAVRLEDEFGEFDWTPQEGSQPWLSAVVADTSSVERPGPSDSGAGRAAEDRKCLDGCRKMRFSTACPYPCSDTFLRPTSSAERSGLPAPGACRATEAPEREDGCRKMRFPAACPYPCGHTFLRP[配列番号3]
VRDCYLMGYCRTRLGPRTWGRLLQISGGTWDVRLRNAIREVEAHFEPAAEPVCELPCLNARRYGPECDVGNLETNGGSTSDDEISDATDSDDTLASHSDTEGGPSPAGRENPESASGGAIAARLECEFGTFDWTSEEGSQPWLSAVVADIRDCYLMGYCRARLAPRTWCRLLQVSGGTWGMHLRNTIREVEARFDATAEPVCKLPCLETRRYGPECDLSNLEIHLSATSDDEISDATDLEAAGSDHTLASQSDTEDAPSPVTLETPEPRGSLAVRLEDEFGEFDWTPQEGSQPWLSAVVADTSSVERPGPSDSGAGRAAEDRKCLDGCRKMRFSTACPYPCSDTFLRPTSSAERSGLPAPGACRATEAPEREDGCRKMRFPAACPYPCGHTFLRP[配列番号3]
【0089】
したがって、好ましくは、HSV-1 Us1ポリペプチドは、配列番号3に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号3をコードするRNAヌクレオチド配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号3をコードするRNAヌクレオチド配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0090】
一実施形態において、HSV-1 Us1ポリペプチドは、以下の通り、配列番号4のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATCAGAGACTGCTACCTGATGGGCTACTGCCGGGCTAGACTGGCCCCTAGAACATGGTGCAGACTGCTGCAAGTGTCTGGCGGCACATGGGGCATGCACCTGAGAAACACCATCAGAGAGGTGGAAGCCAGATTCGACGCCACAGCCGAGCCTGTGTGCAAGCTGCCTTGTCTGGAAACTCGGAGATACGGCCCCGAGTGCGACCTGAGCAATCTGGAAATTCACCTGAGCGCCACCAGCGACGACGAGATTTCTGATGCCACCGACCTGGAAGCCGCCGGATCTGATCATACACTGGCCAGCCAGAGCGACACCGAGGATGCTCCATCTCCAGTGACTCTGGAAACCCCTGAGCCTAGAGGATCTCTGGCCGTGCGACTGGAAGATGAGTTCGGCGAGTTCGACTGGACCCCTCAAGAGGGATCTCAGCCTTGGCTGTCTGCCGTGGTGGCCGATACAAGCAGCGTGGAAAGACCCGGACCTAGCGATTCTGGTGCTGGCAGAGCCGCCGAGGATAGAAAGTGCCTGGATGGCTGCCGGAAGATGCGGTTCTCTACCGCCTGTCCATATCCTTGCAGCGACACCTTCCTGCGGCCT[配列番号4]
ATCAGAGACTGCTACCTGATGGGCTACTGCCGGGCTAGACTGGCCCCTAGAACATGGTGCAGACTGCTGCAAGTGTCTGGCGGCACATGGGGCATGCACCTGAGAAACACCATCAGAGAGGTGGAAGCCAGATTCGACGCCACAGCCGAGCCTGTGTGCAAGCTGCCTTGTCTGGAAACTCGGAGATACGGCCCCGAGTGCGACCTGAGCAATCTGGAAATTCACCTGAGCGCCACCAGCGACGACGAGATTTCTGATGCCACCGACCTGGAAGCCGCCGGATCTGATCATACACTGGCCAGCCAGAGCGACACCGAGGATGCTCCATCTCCAGTGACTCTGGAAACCCCTGAGCCTAGAGGATCTCTGGCCGTGCGACTGGAAGATGAGTTCGGCGAGTTCGACTGGACCCCTCAAGAGGGATCTCAGCCTTGGCTGTCTGCCGTGGTGGCCGATACAAGCAGCGTGGAAAGACCCGGACCTAGCGATTCTGGTGCTGGCAGAGCCGCCGAGGATAGAAAGTGCCTGGATGGCTGCCGGAAGATGCGGTTCTCTACCGCCTGTCCATATCCTTGCAGCGACACCTTCCTGCGGCCT[配列番号4]
【0091】
したがって、好ましくは、HSV-1 Us1ポリペプチドは、配列番号4に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0092】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号43のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
GUGAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGACAAGACUGGGACCUAGAACAUGGGGCAGACUGCUGCAGAUCAGCGGCGGAACAUGGGAUGUGCGGCUGAGAAACGCCAUCAGAGAGGUGGAAGCCCACUUCGAGCCUGCCGCUGAACCUGUGUGUGAACUGCCCUGUCUGAACGCUAGAAGAUACGGCCCUGAGUGCGACGUGGGCAACCUGGAAACAAAUGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGAUUUCCGAUGCCACCGACAGCGACGAUACACUGGCCAGCCACAGCGAUACAGAAGGCGGACCAUCUCCUGCCGGAAGAGAGAAUCCUGAGUCUGCCUCUGGCGGAGCCAUUGCCGCUAGACUGGAAUGCGAGUUCGGCACCUUCGACUGGACAAGCGAGGAAGGCUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCUGUGGUGGCCGAUAUCAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGGCUAGACUGGCCCCUAGAACAUGGUGCAGACUGCUGCAAGUGUCUGGCGGCACAUGGGGCAUGCACCUGAGAAACACCAUCAGAGAGGUGGAAGCCAGAUUCGACGCCACAGCCGAGCCUGUGUGCAAGCUGCCUUGUCUGGAAACUCGGAGAUACGGCCCCGAGUGCGACCUGAGCAAUCUGGAAAUUCACCUGAGCGCCACCAGCGACGACGAGAUUUCUGAUGCCACCGACCUGGAAGCCGCCGGAUCUGAUCAUACACUGGCCAGCCAGAGCGACACCGAGGAUGCUCCAUCUCCAGUGACUCUGGAAACCCCUGAGCCUAGAGGAUCUCUGGCCGUGCGACUGGAAGAUGAGUUCGGCGAGUUCGACUGGACCCCUCAAGAGGGAUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCCGUGGUGGCCGAUACAAGCAGCGUGGAAAGACCCGGACCUAGCGAUUCUGGUGCUGGCAGAGCCGCCGAGGAUAGAAAGUGCCUGGAUGGCUGCCGGAAGAUGCGGUUCUCUACCGCCUGUCCAUAUCCUUGCAGCGACACCUUCCUGCGGCCUUGAUAAACAAGCUCUGCCGAGAGAAGUGGACUUCCUGCUCCUGGCGCCUGUAGAGCUACAGAGGCUCCUGAAAGAGAGGACGGCUGCAGAAAGAUGCGGUUCCCUGCCGCCUGUCCUUAUCCUUGCGGCCACACAUUUCUGCGGCCC[配列番号43]
GUGAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGACAAGACUGGGACCUAGAACAUGGGGCAGACUGCUGCAGAUCAGCGGCGGAACAUGGGAUGUGCGGCUGAGAAACGCCAUCAGAGAGGUGGAAGCCCACUUCGAGCCUGCCGCUGAACCUGUGUGUGAACUGCCCUGUCUGAACGCUAGAAGAUACGGCCCUGAGUGCGACGUGGGCAACCUGGAAACAAAUGGCGGCAGCACCAGCGACGACGAGAUUUCCGAUGCCACCGACAGCGACGAUACACUGGCCAGCCACAGCGAUACAGAAGGCGGACCAUCUCCUGCCGGAAGAGAGAAUCCUGAGUCUGCCUCUGGCGGAGCCAUUGCCGCUAGACUGGAAUGCGAGUUCGGCACCUUCGACUGGACAAGCGAGGAAGGCUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCUGUGGUGGCCGAUAUCAGAGACUGCUACCUGAUGGGCUACUGCCGGGCUAGACUGGCCCCUAGAACAUGGUGCAGACUGCUGCAAGUGUCUGGCGGCACAUGGGGCAUGCACCUGAGAAACACCAUCAGAGAGGUGGAAGCCAGAUUCGACGCCACAGCCGAGCCUGUGUGCAAGCUGCCUUGUCUGGAAACUCGGAGAUACGGCCCCGAGUGCGACCUGAGCAAUCUGGAAAUUCACCUGAGCGCCACCAGCGACGACGAGAUUUCUGAUGCCACCGACCUGGAAGCCGCCGGAUCUGAUCAUACACUGGCCAGCCAGAGCGACACCGAGGAUGCUCCAUCUCCAGUGACUCUGGAAACCCCUGAGCCUAGAGGAUCUCUGGCCGUGCGACUGGAAGAUGAGUUCGGCGAGUUCGACUGGACCCCUCAAGAGGGAUCUCAGCCUUGGCUGUCUGCCGUGGUGGCCGAUACAAGCAGCGUGGAAAGACCCGGACCUAGCGAUUCUGGUGCUGGCAGAGCCGCCGAGGAUAGAAAGUGCCUGGAUGGCUGCCGGAAGAUGCGGUUCUCUACCGCCUGUCCAUAUCCUUGCAGCGACACCUUCCUGCGGCCUUGAUAAACAAGCUCUGCCGAGAGAAGUGGACUUCCUGCUCCUGGCGCCUGUAGAGCUACAGAGGCUCCUGAAAGAGAGGACGGCUGCAGAAAGAUGCGGUUCCCUGCCGCCUGUCCUUAUCCUUGCGGCCACACAUUUCUGCGGCCC[配列番号43]
【0093】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号43として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0094】
一実施形態において、HSV-1 Us11ポリペプチドは、以下の通り、配列番号5として本明細書で提供される:
MSQTQPPAPVGPGDPDVYLKGVPSAGMHPRGVHAPRGHPRMISGPPQRGDNDQAAGQCGDSGLLRVGADTTISKPSEAVRPPTIPRTPRVPREPRVPRPPREPREPRVPRAPRDPRVPRDPRDPRQPRSPREPRSPREPRSPREPRTPRTPREPRTARGSV[配列番号5]
MSQTQPPAPVGPGDPDVYLKGVPSAGMHPRGVHAPRGHPRMISGPPQRGDNDQAAGQCGDSGLLRVGADTTISKPSEAVRPPTIPRTPRVPREPRVPRPPREPREPRVPRAPRDPRVPRDPRDPRQPRSPREPRSPREPRSPREPRTPRTPREPRTARGSV[配列番号5]
【0095】
したがって、好ましくは、HSV-1 Us11ポリペプチドは、配列番号5に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号5をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0096】
一実施形態において、HSV-1 Us11ポリペプチドは、以下の通り、配列番号6のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGAGCCAGACACAGCCTCCAGCTCCAGTTGGACCTGGCGACCCTGATGTGTATCTGAAGGGCGTGCCAAGCGCCGGCATGCATCCTAGAGGTGTTCATGCCCCTAGAGGACACCCCAGAATGATCTCTGGCCCTCCTCAGAGAGGCGACAACGATCAGGCTGCTGGACAGTGTGGCGATAGCGGACTGCTGAGAGTGGGCGCCGATACCACAATCAGCAAGCCATCTGAGGCTGTGCGGCCTCCTACAATCCCCAGAACACCTAGAGTGCCCCGCGAGCCAAGAGTGCCTAGACCTCCTAGAGAGCCCAGAGAACCCAGAGTGCCAAGGGCTCCCAGAGATCCTAGAGTCCCTCGGGACCCTAGGGACCCAAGACAACCTAGATCACCCAGAGAGCCTCGGAGCCCAAGAGAGCCAAGAAGCCCTAGGGAACCCCGGACACCAAGAACACCCAGGGAACCTAGAACCGCCAGAGGCAGCGTG[配列番号6]
ATGAGCCAGACACAGCCTCCAGCTCCAGTTGGACCTGGCGACCCTGATGTGTATCTGAAGGGCGTGCCAAGCGCCGGCATGCATCCTAGAGGTGTTCATGCCCCTAGAGGACACCCCAGAATGATCTCTGGCCCTCCTCAGAGAGGCGACAACGATCAGGCTGCTGGACAGTGTGGCGATAGCGGACTGCTGAGAGTGGGCGCCGATACCACAATCAGCAAGCCATCTGAGGCTGTGCGGCCTCCTACAATCCCCAGAACACCTAGAGTGCCCCGCGAGCCAAGAGTGCCTAGACCTCCTAGAGAGCCCAGAGAACCCAGAGTGCCAAGGGCTCCCAGAGATCCTAGAGTCCCTCGGGACCCTAGGGACCCAAGACAACCTAGATCACCCAGAGAGCCTCGGAGCCCAAGAGAGCCAAGAAGCCCTAGGGAACCCCGGACACCAAGAACACCCAGGGAACCTAGAACCGCCAGAGGCAGCGTG[配列番号6]
【0097】
したがって、好ましくは、HSV-1 Us11ポリペプチドは、配列番号6に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0098】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号44のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGAGCCAGACACAGCCUCCAGCUCCAGUUGGACCUGGCGACCCUGAUGUGUAUCUGAAGGGCGUGCCAAGCGCCGGCAUGCAUCCUAGAGGUGUUCAUGCCCCUAGAGGACACCCCAGAAUGAUCUCUGGCCCUCCUCAGAGAGGCGACAACGAUCAGGCUGCUGGACAGUGUGGCGAUAGCGGACUGCUGAGAGUGGGCGCCGAUACCACAAUCAGCAAGCCAUCUGAGGCUGUGCGGCCUCCUACAAUCCCCAGAACACCUAGAGUGCCCCGCGAGCCAAGAGUGCCUAGACCUCCUAGAGAGCCCAGAGAACCCAGAGUGCCAAGGGCUCCCAGAGAUCCUAGAGUCCCUCGGGACCCUAGGGACCCAAGACAACCUAGAUCACCCAGAGAGCCUCGGAGCCCAAGAGAGCCAAGAAGCCCUAGGGAACCCCGGACACCAAGAACACCCAGGGAACCUAGAACCGCCAGAGGCAGCGUG[配列番号44]
AUGAGCCAGACACAGCCUCCAGCUCCAGUUGGACCUGGCGACCCUGAUGUGUAUCUGAAGGGCGUGCCAAGCGCCGGCAUGCAUCCUAGAGGUGUUCAUGCCCCUAGAGGACACCCCAGAAUGAUCUCUGGCCCUCCUCAGAGAGGCGACAACGAUCAGGCUGCUGGACAGUGUGGCGAUAGCGGACUGCUGAGAGUGGGCGCCGAUACCACAAUCAGCAAGCCAUCUGAGGCUGUGCGGCCUCCUACAAUCCCCAGAACACCUAGAGUGCCCCGCGAGCCAAGAGUGCCUAGACCUCCUAGAGAGCCCAGAGAACCCAGAGUGCCAAGGGCUCCCAGAGAUCCUAGAGUCCCUCGGGACCCUAGGGACCCAAGACAACCUAGAUCACCCAGAGAGCCUCGGAGCCCAAGAGAGCCAAGAAGCCCUAGGGAACCCCGGACACCAAGAACACCCAGGGAACCUAGAACCGCCAGAGGCAGCGUG[配列番号44]
【0099】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号44として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0100】
一実施形態において、OV20.0Lポリペプチドは、以下の通り、配列番号7として本明細書で提供される:
MACECASLILELLRKSDDKLPAKQIAKELGISKHEANRQLYRLLDSDEVCCEDGNPPRWFVECAPSAPTEEDENSDTEPMETEAGCDTLFGGDIDIMTQSAVIRLKSLNPVSAVNEFCMMTHRPLEFCETRAGGEDHCPRFTCTITISGKVVAVADGASKKLARHTACSSALTILINNCGISF[配列番号7]
MACECASLILELLRKSDDKLPAKQIAKELGISKHEANRQLYRLLDSDEVCCEDGNPPRWFVECAPSAPTEEDENSDTEPMETEAGCDTLFGGDIDIMTQSAVIRLKSLNPVSAVNEFCMMTHRPLEFCETRAGGEDHCPRFTCTITISGKVVAVADGASKKLARHTACSSALTILINNCGISF[配列番号7]
【0101】
したがって、好ましくは、OV20.0Lポリペプチドは、配列番号7に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号7をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0102】
一実施形態において、OV20.0Lポリペプチドは、以下の通り、配列番号8のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGGCCTGTGAATGCGCCAGCCTGATCCTGGAACTGCTGAGAAAGAGCGACGACAAGCTGCCCGCCAAGCAGATCGCCAAAGAGCTGGGCATCTCTAAGCACGAGGCCAACCGGCAGCTGTACCGGCTGCTGGATTCTGACGAAGTGTGCTGCGAGGACGGCAATCCTCCTCGTTGGTTCGTGGAATGTGCCCCTAGCGCTCCCACCGAAGAGGACGAGAATAGCGACACCGAGCCTATGGAAACCGAGGCCGGCTGCGATACACTGTTTGGCGGAGACATCGACATCATGACCCAGAGCGCCGTGATCCGGCTGAAGTCCCTGAATCCTGTGTCCGCCGTGAACGAGTTCTGCATGATGACCCACCGGCCTCTGGAATTTTGCGAGACAAGAGCCGGCGGAGAGGATCACTGCCCCAGATTCACCTGTACCATCACCATCAGCGGCAAGGTGGTGGCTGTTGCCGATGGCGCCTCTAAGAAACTGGCCAGACACACCGCCTGTAGCAGCGCCCTGACAATCCTGATCAACAACTGCGGCATCAGCTTC[配列番号8]
ATGGCCTGTGAATGCGCCAGCCTGATCCTGGAACTGCTGAGAAAGAGCGACGACAAGCTGCCCGCCAAGCAGATCGCCAAAGAGCTGGGCATCTCTAAGCACGAGGCCAACCGGCAGCTGTACCGGCTGCTGGATTCTGACGAAGTGTGCTGCGAGGACGGCAATCCTCCTCGTTGGTTCGTGGAATGTGCCCCTAGCGCTCCCACCGAAGAGGACGAGAATAGCGACACCGAGCCTATGGAAACCGAGGCCGGCTGCGATACACTGTTTGGCGGAGACATCGACATCATGACCCAGAGCGCCGTGATCCGGCTGAAGTCCCTGAATCCTGTGTCCGCCGTGAACGAGTTCTGCATGATGACCCACCGGCCTCTGGAATTTTGCGAGACAAGAGCCGGCGGAGAGGATCACTGCCCCAGATTCACCTGTACCATCACCATCAGCGGCAAGGTGGTGGCTGTTGCCGATGGCGCCTCTAAGAAACTGGCCAGACACACCGCCTGTAGCAGCGCCCTGACAATCCTGATCAACAACTGCGGCATCAGCTTC[配列番号8]
【0103】
したがって、好ましくは、OV20.0Lポリペプチドは、配列番号8に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0104】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号45のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGGCCUGUGAAUGCGCCAGCCUGAUCCUGGAACUGCUGAGAAAGAGCGACGACAAGCUGCCCGCCAAGCAGAUCGCCAAAGAGCUGGGCAUCUCUAAGCACGAGGCCAACCGGCAGCUGUACCGGCUGCUGGAUUCUGACGAAGUGUGCUGCGAGGACGGCAAUCCUCCUCGUUGGUUCGUGGAAUGUGCCCCUAGCGCUCCCACCGAAGAGGACGAGAAUAGCGACACCGAGCCUAUGGAAACCGAGGCCGGCUGCGAUACACUGUUUGGCGGAGACAUCGACAUCAUGACCCAGAGCGCCGUGAUCCGGCUGAAGUCCCUGAAUCCUGUGUCCGCCGUGAACGAGUUCUGCAUGAUGACCCACCGGCCUCUGGAAUUUUGCGAGACAAGAGCCGGCGGAGAGGAUCACUGCCCCAGAUUCACCUGUACCAUCACCAUCAGCGGCAAGGUGGUGGCUGUUGCCGAUGGCGCCUCUAAGAAACUGGCCAGACACACCGCCUGUAGCAGCGCCCUGACAAUCCUGAUCAACAACUGCGGCAUCAGCUUC[配列番号45]
AUGGCCUGUGAAUGCGCCAGCCUGAUCCUGGAACUGCUGAGAAAGAGCGACGACAAGCUGCCCGCCAAGCAGAUCGCCAAAGAGCUGGGCAUCUCUAAGCACGAGGCCAACCGGCAGCUGUACCGGCUGCUGGAUUCUGACGAAGUGUGCUGCGAGGACGGCAAUCCUCCUCGUUGGUUCGUGGAAUGUGCCCCUAGCGCUCCCACCGAAGAGGACGAGAAUAGCGACACCGAGCCUAUGGAAACCGAGGCCGGCUGCGAUACACUGUUUGGCGGAGACAUCGACAUCAUGACCCAGAGCGCCGUGAUCCGGCUGAAGUCCCUGAAUCCUGUGUCCGCCGUGAACGAGUUCUGCAUGAUGACCCACCGGCCUCUGGAAUUUUGCGAGACAAGAGCCGGCGGAGAGGAUCACUGCCCCAGAUUCACCUGUACCAUCACCAUCAGCGGCAAGGUGGUGGCUGUUGCCGAUGGCGCCUCUAAGAAACUGGCCAGACACACCGCCUGUAGCAGCGCCCUGACAAUCCUGAUCAACAACUGCGGCAUCAGCUUC[配列番号45]
【0105】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号45として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0106】
一実施形態において、BVDV Nproポリペプチドは、以下の通り、配列番号9として本明細書で提供される:
MELITNELLYKTYKQKPVGVEEPVYDQAGDPLFGERGAVHPQSTLKLPHKRGERDVPTNLASLPKRGDCRTGNSRGPVSGIYLKPGPLFYQDYKGPVYHRAPLELFEEGSMCETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCIDGCIIIKSATRSYQRVFRWVHNRLDCPLWVTSC[配列番号9]
MELITNELLYKTYKQKPVGVEEPVYDQAGDPLFGERGAVHPQSTLKLPHKRGERDVPTNLASLPKRGDCRTGNSRGPVSGIYLKPGPLFYQDYKGPVYHRAPLELFEEGSMCETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCIDGCIIIKSATRSYQRVFRWVHNRLDCPLWVTSC[配列番号9]
【0107】
したがって、好ましくは、BVDV Nproポリペプチドは、配列番号9に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号9をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0108】
一実施形態において、BVDV Nproポリペプチドは、以下の通り、配列番号10のヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGGAACTGATCACCAACGAGCTGCTGTACAAGACCTACAAGCAGAAACCCGTGGGCGTCGAGGAACCCGTGTATGATCAAGCTGGCGACCCTCTGTTTGGCGAGAGAGGCGCTGTTCACCCTCAGAGCACACTGAAGCTGCCCCACAAGCGGGGCGAAAGAGATGTGCCTACCAACCTGGCCAGCCTGCCTAAGAGAGGCGATTGCAGAACCGGCAATAGCAGAGGCCCTGTGTCCGGCATCTACCTGAAACCTGGACCACTGTTCTACCAGGACTACAAGGGACCCGTGTACCACAGAGCCCCTCTGGAACTGTTTGAAGAGGGCAGCATGTGCGAAACCACCAAGCGGATCGGAAGAGTGACCGGCTCTGACGGCAAGCTGTACCACATCTACGTGTGCATCGACGGCTGCATCATCATCAAGAGCGCCACCAGATCCTACCAGCGGGTGTTCAGATGGGTGCACAACAGACTGGACTGCCCTCTGTGGGTCACCAGCTGC[配列番号10]
ATGGAACTGATCACCAACGAGCTGCTGTACAAGACCTACAAGCAGAAACCCGTGGGCGTCGAGGAACCCGTGTATGATCAAGCTGGCGACCCTCTGTTTGGCGAGAGAGGCGCTGTTCACCCTCAGAGCACACTGAAGCTGCCCCACAAGCGGGGCGAAAGAGATGTGCCTACCAACCTGGCCAGCCTGCCTAAGAGAGGCGATTGCAGAACCGGCAATAGCAGAGGCCCTGTGTCCGGCATCTACCTGAAACCTGGACCACTGTTCTACCAGGACTACAAGGGACCCGTGTACCACAGAGCCCCTCTGGAACTGTTTGAAGAGGGCAGCATGTGCGAAACCACCAAGCGGATCGGAAGAGTGACCGGCTCTGACGGCAAGCTGTACCACATCTACGTGTGCATCGACGGCTGCATCATCATCAAGAGCGCCACCAGATCCTACCAGCGGGTGTTCAGATGGGTGCACAACAGACTGGACTGCCCTCTGTGGGTCACCAGCTGC[配列番号10]
【0109】
したがって、好ましくは、BVDV Nproポリペプチドは、配列番号10に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0110】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号46のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
AUGGAACUGAUCACCAACGAGCUGCUGUACAAGACCUACAAGCAGAAACCCGUGGGCGUCGAGGAACCCGUGUAUGAUCAAGCUGGCGACCCUCUGUUUGGCGAGAGAGGCGCUGUUCACCCUCAGAGCACACUGAAGCUGCCCCACAAGCGGGGCGAAAGAGAUGUGCCUACCAACCUGGCCAGCCUGCCUAAGAGAGGCGAUUGCAGAACCGGCAAUAGCAGAGGCCCUGUGUCCGGCAUCUACCUGAAACCUGGACCACUGUUCUACCAGGACUACAAGGGACCCGUGUACCACAGAGCCCCUCUGGAACUGUUUGAAGAGGGCAGCAUGUGCGAAACCACCAAGCGGAUCGGAAGAGUGACCGGCUCUGACGGCAAGCUGUACCACAUCUACGUGUGCAUCGACGGCUGCAUCAUCAUCAAGAGCGCCACCAGAUCCUACCAGCGGGUGUUCAGAUGGGUGCACAACAGACUGGACUGCCCUCUGUGGGUCACCAGCUGC[配列番号46]
AUGGAACUGAUCACCAACGAGCUGCUGUACAAGACCUACAAGCAGAAACCCGUGGGCGUCGAGGAACCCGUGUAUGAUCAAGCUGGCGACCCUCUGUUUGGCGAGAGAGGCGCUGUUCACCCUCAGAGCACACUGAAGCUGCCCCACAAGCGGGGCGAAAGAGAUGUGCCUACCAACCUGGCCAGCCUGCCUAAGAGAGGCGAUUGCAGAACCGGCAAUAGCAGAGGCCCUGUGUCCGGCAUCUACCUGAAACCUGGACCACUGUUCUACCAGGACUACAAGGGACCCGUGUACCACAGAGCCCCUCUGGAACUGUUUGAAGAGGGCAGCAUGUGCGAAACCACCAAGCGGAUCGGAAGAGUGACCGGCUCUGACGGCAAGCUGUACCACAUCUACGUGUGCAUCGACGGCUGCAUCAUCAUCAAGAGCGCCACCAGAUCCUACCAGCGGGUGUUCAGAUGGGUGCACAACAGACUGGACUGCCCUCUGUGGGUCACCAGCUGC[配列番号46]
【0111】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号46として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0112】
一実施形態において、ランガットNS5ポリペプチドは、以下の通り、配列番号17として本明細書で提供される:
VFKDKVDTKAQEPQPGTKIIMRAVNDWLLERLVKKSRPRMCSREEFIAKVRSNAALGAWSDEQNKWKSAREAVEDPEFWSLVEAERERHLQGRCAHCVYNMMGKREKKLGEFGVAKGSRAIWYMWLGSRFLEFEALGFLNEDHWASRASSGAGVEGISLNYLGWHLKKLASLSGGLFYADDTAGWDTKITNADLDDEEQILRYMDGDHKKLAATVLRKAYHAKVVRVARPSREGGCVMDIITRRDQRGSGQVVTYALNTITNIKVQLVRMMEGEGVIEVADSHNPRLLRVEKWLEEHGEERLSRMLVSGDDCVVRPVDDRFSKALYFLNDMAKTRKDTGEWEPSTGFASWEEVPFCSHHFHELVMKDGRALVVPCRDQDEL[配列番号17]
VFKDKVDTKAQEPQPGTKIIMRAVNDWLLERLVKKSRPRMCSREEFIAKVRSNAALGAWSDEQNKWKSAREAVEDPEFWSLVEAERERHLQGRCAHCVYNMMGKREKKLGEFGVAKGSRAIWYMWLGSRFLEFEALGFLNEDHWASRASSGAGVEGISLNYLGWHLKKLASLSGGLFYADDTAGWDTKITNADLDDEEQILRYMDGDHKKLAATVLRKAYHAKVVRVARPSREGGCVMDIITRRDQRGSGQVVTYALNTITNIKVQLVRMMEGEGVIEVADSHNPRLLRVEKWLEEHGEERLSRMLVSGDDCVVRPVDDRFSKALYFLNDMAKTRKDTGEWEPSTGFASWEEVPFCSHHFHELVMKDGRALVVPCRDQDEL[配列番号17]
【0113】
したがって、好ましくは、ランガットNS5ポリペプチドは、配列番号17に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号17をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0114】
一実施形態において、ランガットNS5ポリペプチドは、以下の通り、配列番号18のヌクレオチド配列によってコードされる:
GTGTTCAAGGACAAGGTGGACACCAAGGCTCAAGAGCCTCAGCCTGGCACCAAGATCATCATGAGAGCCGTGAACGACTGGCTGCTGGAACGGCTGGTCAAGAAAAGCAGACCCCGGATGTGCAGCCGGGAAGAGTTTATCGCCAAAGTGCGGAGCAATGCCGCTCTCGGAGCTTGGAGTGACGAGCAGAACAAGTGGAAGTCCGCCAGAGAAGCCGTGGAAGATCCCGAGTTTTGGAGCCTGGTGGAAGCCGAGAGAGAGAGGCATCTGCAGGGAAGATGTGCCCACTGCGTGTACAACATGATGGGCAAGAGAGAGAAGAAGCTGGGCGAGTTCGGAGTGGCCAAAGGCAGCAGAGCCATCTGGTATATGTGGCTGGGCAGCCGCTTCCTGGAATTTGAGGCCCTGGGCTTCCTGAACGAGGATCACTGGGCTAGCAGAGCCTCTTCTGGTGCTGGCGTGGAAGGCATCAGCCTGAATTATCTCGGCTGGCACCTGAAGAAACTGGCCTCTCTGTCTGGCGGCCTGTTCTACGCCGATGATACAGCCGGATGGGACACAAAGATCACCAACGCCGACCTGGACGACGAGGAACAGATCCTGAGATATATGGACGGCGACCACAAAAAGCTGGCCGCCACCGTGCTGAGAAAGGCCTATCACGCCAAGGTCGTCAGAGTGGCCAGACCTAGTAGAGAAGGCGGCTGCGTGATGGACATCATCACCAGAAGGGACCAGCGCGGCTCTGGCCAGGTTGTGACATACGCCCTGAACACCATCACCAACATCAAGGTGCAGCTCGTGCGGATGATGGAAGGCGAGGGCGTGATCGAAGTGGCCGACAGCCATAATCCTCGGCTGCTGAGAGTGGAAAAGTGGCTGGAAGAACACGGCGAAGAACGGCTGAGCAGAATGCTGGTGTCCGGCGACGATTGTGTTGTGCGGCCCGTGGACGACAGATTCAGCAAGGCCCTGTACTTTCTGAATGACATGGCCAAGACCAGAAAGGACACCGGCGAGTGGGAGCCTTCTACAGGCTTTGCCAGCTGGGAAGAAGTGCCTTTCTGCAGCCACCACTTCCACGAGCTGGTCATGAAGGATGGCAGAGCCCTGGTGGTGCCCTGCAGAGATCAGGACGAACTG[配列番号18]
GTGTTCAAGGACAAGGTGGACACCAAGGCTCAAGAGCCTCAGCCTGGCACCAAGATCATCATGAGAGCCGTGAACGACTGGCTGCTGGAACGGCTGGTCAAGAAAAGCAGACCCCGGATGTGCAGCCGGGAAGAGTTTATCGCCAAAGTGCGGAGCAATGCCGCTCTCGGAGCTTGGAGTGACGAGCAGAACAAGTGGAAGTCCGCCAGAGAAGCCGTGGAAGATCCCGAGTTTTGGAGCCTGGTGGAAGCCGAGAGAGAGAGGCATCTGCAGGGAAGATGTGCCCACTGCGTGTACAACATGATGGGCAAGAGAGAGAAGAAGCTGGGCGAGTTCGGAGTGGCCAAAGGCAGCAGAGCCATCTGGTATATGTGGCTGGGCAGCCGCTTCCTGGAATTTGAGGCCCTGGGCTTCCTGAACGAGGATCACTGGGCTAGCAGAGCCTCTTCTGGTGCTGGCGTGGAAGGCATCAGCCTGAATTATCTCGGCTGGCACCTGAAGAAACTGGCCTCTCTGTCTGGCGGCCTGTTCTACGCCGATGATACAGCCGGATGGGACACAAAGATCACCAACGCCGACCTGGACGACGAGGAACAGATCCTGAGATATATGGACGGCGACCACAAAAAGCTGGCCGCCACCGTGCTGAGAAAGGCCTATCACGCCAAGGTCGTCAGAGTGGCCAGACCTAGTAGAGAAGGCGGCTGCGTGATGGACATCATCACCAGAAGGGACCAGCGCGGCTCTGGCCAGGTTGTGACATACGCCCTGAACACCATCACCAACATCAAGGTGCAGCTCGTGCGGATGATGGAAGGCGAGGGCGTGATCGAAGTGGCCGACAGCCATAATCCTCGGCTGCTGAGAGTGGAAAAGTGGCTGGAAGAACACGGCGAAGAACGGCTGAGCAGAATGCTGGTGTCCGGCGACGATTGTGTTGTGCGGCCCGTGGACGACAGATTCAGCAAGGCCCTGTACTTTCTGAATGACATGGCCAAGACCAGAAAGGACACCGGCGAGTGGGAGCCTTCTACAGGCTTTGCCAGCTGGGAAGAAGTGCCTTTCTGCAGCCACCACTTCCACGAGCTGGTCATGAAGGATGGCAGAGCCCTGGTGGTGCCCTGCAGAGATCAGGACGAACTG[配列番号18]
【0115】
したがって、好ましくは、ランガットNS5ポリペプチドは、配列番号18に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0116】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号49のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
GUGUUCAAGGACAAGGUGGACACCAAGGCUCAAGAGCCUCAGCCUGGCACCAAGAUCAUCAUGAGAGCCGUGAACGACUGGCUGCUGGAACGGCUGGUCAAGAAAAGCAGACCCCGGAUGUGCAGCCGGGAAGAGUUUAUCGCCAAAGUGCGGAGCAAUGCCGCUCUCGGAGCUUGGAGUGACGAGCAGAACAAGUGGAAGUCCGCCAGAGAAGCCGUGGAAGAUCCCGAGUUUUGGAGCCUGGUGGAAGCCGAGAGAGAGAGGCAUCUGCAGGGAAGAUGUGCCCACUGCGUGUACAACAUGAUGGGCAAGAGAGAGAAGAAGCUGGGCGAGUUCGGAGUGGCCAAAGGCAGCAGAGCCAUCUGGUAUAUGUGGCUGGGCAGCCGCUUCCUGGAAUUUGAGGCCCUGGGCUUCCUGAACGAGGAUCACUGGGCUAGCAGAGCCUCUUCUGGUGCUGGCGUGGAAGGCAUCAGCCUGAAUUAUCUCGGCUGGCACCUGAAGAAACUGGCCUCUCUGUCUGGCGGCCUGUUCUACGCCGAUGAUACAGCCGGAUGGGACACAAAGAUCACCAACGCCGACCUGGACGACGAGGAACAGAUCCUGAGAUAUAUGGACGGCGACCACAAAAAGCUGGCCGCCACCGUGCUGAGAAAGGCCUAUCACGCCAAGGUCGUCAGAGUGGCCAGACCUAGUAGAGAAGGCGGCUGCGUGAUGGACAUCAUCACCAGAAGGGACCAGCGCGGCUCUGGCCAGGUUGUGACAUACGCCCUGAACACCAUCACCAACAUCAAGGUGCAGCUCGUGCGGAUGAUGGAAGGCGAGGGCGUGAUCGAAGUGGCCGACAGCCAUAAUCCUCGGCUGCUGAGAGUGGAAAAGUGGCUGGAAGAACACGGCGAAGAACGGCUGAGCAGAAUGCUGGUGUCCGGCGACGAUUGUGUUGUGCGGCCCGUGGACGACAGAUUCAGCAAGGCCCUGUACUUUCUGAAUGACAUGGCCAAGACCAGAAAGGACACCGGCGAGUGGGAGCCUUCUACAGGCUUUGCCAGCUGGGAAGAAGUGCCUUUCUGCAGCCACCACUUCCACGAGCUGGUCAUGAAGGAUGGCAGAGCCCUGGUGGUGCCCUGCAGAGAUCAGGACGAACUG[配列番号49]
GUGUUCAAGGACAAGGUGGACACCAAGGCUCAAGAGCCUCAGCCUGGCACCAAGAUCAUCAUGAGAGCCGUGAACGACUGGCUGCUGGAACGGCUGGUCAAGAAAAGCAGACCCCGGAUGUGCAGCCGGGAAGAGUUUAUCGCCAAAGUGCGGAGCAAUGCCGCUCUCGGAGCUUGGAGUGACGAGCAGAACAAGUGGAAGUCCGCCAGAGAAGCCGUGGAAGAUCCCGAGUUUUGGAGCCUGGUGGAAGCCGAGAGAGAGAGGCAUCUGCAGGGAAGAUGUGCCCACUGCGUGUACAACAUGAUGGGCAAGAGAGAGAAGAAGCUGGGCGAGUUCGGAGUGGCCAAAGGCAGCAGAGCCAUCUGGUAUAUGUGGCUGGGCAGCCGCUUCCUGGAAUUUGAGGCCCUGGGCUUCCUGAACGAGGAUCACUGGGCUAGCAGAGCCUCUUCUGGUGCUGGCGUGGAAGGCAUCAGCCUGAAUUAUCUCGGCUGGCACCUGAAGAAACUGGCCUCUCUGUCUGGCGGCCUGUUCUACGCCGAUGAUACAGCCGGAUGGGACACAAAGAUCACCAACGCCGACCUGGACGACGAGGAACAGAUCCUGAGAUAUAUGGACGGCGACCACAAAAAGCUGGCCGCCACCGUGCUGAGAAAGGCCUAUCACGCCAAGGUCGUCAGAGUGGCCAGACCUAGUAGAGAAGGCGGCUGCGUGAUGGACAUCAUCACCAGAAGGGACCAGCGCGGCUCUGGCCAGGUUGUGACAUACGCCCUGAACACCAUCACCAACAUCAAGGUGCAGCUCGUGCGGAUGAUGGAAGGCGAGGGCGUGAUCGAAGUGGCCGACAGCCAUAAUCCUCGGCUGCUGAGAGUGGAAAAGUGGCUGGAAGAACACGGCGAAGAACGGCUGAGCAGAAUGCUGGUGUCCGGCGACGAUUGUGUUGUGCGGCCCGUGGACGACAGAUUCAGCAAGGCCCUGUACUUUCUGAAUGACAUGGCCAAGACCAGAAAGGACACCGGCGAGUGGGAGCCUUCUACAGGCUUUGCCAGCUGGGAAGAAGUGCCUUUCUGCAGCCACCACUUCCACGAGCUGGUCAUGAAGGAUGGCAGAGCCCUGGUGGUGCCCUGCAGAGAUCAGGACGAACUG[配列番号49]
【0117】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号49として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0118】
一実施形態において、インフルエンザNS1ポリペプチド(受託番号DQ508893)は、以下の通り、配列番号13として本明細書で提供される:
MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKQVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGSTLGLNIETATCVGKQIVERILKEESDEAFRMTMASALASRYLTDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCVRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLTLLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTNEDVKNAIGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGGPPLTPTQKRKMAGKIRSEV[配列番号13]
MDSNTVSSFQVDCFLWHVRKQVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLKGRGSTLGLNIETATCVGKQIVERILKEESDEAFRMTMASALASRYLTDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCVRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLTLLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTNEDVKNAIGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGGPPLTPTQKRKMAGKIRSEV[配列番号13]
【0119】
したがって、好ましくは、インフルエンザNS1ポリペプチドは、配列番号13に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。したがって、第1の態様のRNA構築物は、配列番号13をコードするRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を好ましくは含む。
【0120】
一実施形態において、インフルエンザNS1ポリペプチドは、以下の通り、配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされる:
atggattccaacactgtgtcaagctttcaggtagattgcttcctttggcatgtccgcaaacaagttgcagaccaagagctaggtgatgccccattccttgatcggcttcgccgagatcagaagtccctaaagggaagaggcagcactctcggtctgaacatcgaaacagccacctgtgttggaaagcaaatagtagagaggattctgaaggaagaatccgatgaggcatttagaatgaccatggcctccgcacttgcttcgcgatacctaactgacatgactattgaagagatgtcaagggactggttcatgctcatgcccaagcagaaagtggcaggccctctttgtgtcagaatggaccaggcgataatggataagaacatcatactgaaagcgaatttcagtgtgatttttgaccggttggagactctgacattactaagggctttcaccgaagagggagcaattgttggcgaaatttcaccattgccttctcttccaggacatactaatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcgggggacttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaactctacagagattcgcttggagaagcagtaatgagaatgggggacctccactcactccaacacagaaacggaaaatggcgggaaaaattaggtcagaagtttga[配列番号14]
atggattccaacactgtgtcaagctttcaggtagattgcttcctttggcatgtccgcaaacaagttgcagaccaagagctaggtgatgccccattccttgatcggcttcgccgagatcagaagtccctaaagggaagaggcagcactctcggtctgaacatcgaaacagccacctgtgttggaaagcaaatagtagagaggattctgaaggaagaatccgatgaggcatttagaatgaccatggcctccgcacttgcttcgcgatacctaactgacatgactattgaagagatgtcaagggactggttcatgctcatgcccaagcagaaagtggcaggccctctttgtgtcagaatggaccaggcgataatggataagaacatcatactgaaagcgaatttcagtgtgatttttgaccggttggagactctgacattactaagggctttcaccgaagagggagcaattgttggcgaaatttcaccattgccttctcttccaggacatactaatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcgggggacttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaactctacagagattcgcttggagaagcagtaatgagaatgggggacctccactcactccaacacagaaacggaaaatggcgggaaaaattaggtcagaagtttga[配列番号14]
【0121】
したがって、好ましくは、インフルエンザNS1ポリペプチドは、配列番号14に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0122】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号19のRNAヌクレオチド配列を含んでいてもよい:
auggauuccaacacugugucaagcuuucagguagauugcuuccuuuggcauguccgcaaacaaguugcagaccaagagcuaggugaugccccauuccuugaucggcuucgccgagaucagaagucccuaaagggaagaggcagcacucucggucugaacaucgaaacagccaccuguguuggaaagcaaauaguagagaggauucugaaggaagaauccgaugaggcauuuagaaugaccauggccuccgcacuugcuucgcgauaccuaacugacaugacuauugaagagaugucaagggacugguucaugcucaugcccaagcagaaaguggcaggcccucuuugugucagaauggaccaggcgauaauggauaagaacaucauacugaaagcgaauuucagugugauuuuugaccgguuggagacucugacauuacuaagggcuuucaccgaagagggagcaauuguuggcgaaauuucaccauugccuucucuuccaggacauacuaaugaggaugucaaaaaugcaauugggguccucaucgggggacuugaauggaaugauaacacaguucgagucucugaaacucuacagagauucgcuuggagaagcaguaaugagaaugggggaccuccacucacuccaacacagaaacggaaaauggcgggaaaaauuaggucagaaguuuga[配列番号19]
auggauuccaacacugugucaagcuuucagguagauugcuuccuuuggcauguccgcaaacaaguugcagaccaagagcuaggugaugccccauuccuugaucggcuucgccgagaucagaagucccuaaagggaagaggcagcacucucggucugaacaucgaaacagccaccuguguuggaaagcaaauaguagagaggauucugaaggaagaauccgaugaggcauuuagaaugaccauggccuccgcacuugcuucgcgauaccuaacugacaugacuauugaagagaugucaagggacugguucaugcucaugcccaagcagaaaguggcaggcccucuuugugucagaauggaccaggcgauaauggauaagaacaucauacugaaagcgaauuucagugugauuuuugaccgguuggagacucugacauuacuaagggcuuucaccgaagagggagcaauuguuggcgaaauuucaccauugccuucucuuccaggacauacuaaugaggaugucaaaaaugcaauugggguccucaucgggggacuugaauggaaugauaacacaguucgagucucugaaacucuacagagauucgcuuggagaagcaguaaugagaaugggggaccuccacucacuccaacacagaaacggaaaauggcgggaaaaauuaggucagaaguuuga[配列番号19]
【0123】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号19として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0124】
好ましくは、生来の阻害タンパク質は、HSV-2 Us1;HSV-1 Us11;OV20.0L;BVDV Npro、PIV5V;MERS-CoV ORF4a;SARS-CoV-2 ORF3b;ランガットウイルスNS5及びインフルエンザNS1からなる群から選択される。
【0125】
好ましくは、生来の阻害タンパク質は、HSV-2 Us1;HSV-1 Us11;OV20.0L;BVDV Npro、PIV5V;MERS-CoV ORF4a;及びランガットウイルスNS5からなる群から選択される。
【0126】
好ましくは、生来の阻害タンパク質は、HSV-2 Us1;HSV-1 Us11;OV20.0L;BVDV Npro、PIV5V;及びMERS-CoV ORF4aからなる群から選択される。
【0127】
実施例に記載されるように、広範なIIPをスクリーニングする方法を介して、本発明者らは、驚くべきことにインビトロ及びインビボでsaRNA発現を著しく強化することができた2つの極めて有力なIIP、すなわち、MDA5活性化の阻害剤であるパラインフルエンザウイルス5型Vタンパク質(PIV-5)、及びPACT/MDA活性化の阻害剤である中東呼吸器症候群(MERS)コロナウイルスORF4aを同定した。本発明者らは、これまでレプリコンRNAの生来の感知を軽減するために使用されていない、これらの2つの新規のIIP、すなわちPIV-5及びMERS-CoV ORF4aを利用した。本発明者らは、これらの構築物は、ヒトにおけるRNAワクチン及び療法のより高い効能を可能にするであろう次世代RNAレプリコンであり得ることを示した。本発明者らは、それらが、アルファウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、又はコロナウイルスレプリコンで発現されるかどうかにかかわらず、顕著な有用性を有すると考える。
【0128】
したがって、最も好ましくは、生来の阻害タンパク質は、PIV-5及び/又はMERS-CoV ORF4aであり、当業者は、これらがNS4aと称される場合もあることを理解するであろう。
【0129】
このような構築物は、先行技術に記載された構築物を超える多くの利点を示し、このような利点としては、以下が挙げられる:
i)VEEVレプリコンへの直接的なPIV-5及びORF4aタンパク質の挿入、これは、VPIIタンパク質と目的の遺伝子との二重のタンパク質発現を可能にすること;
ii)RNAの2つの異なる鎖を送達するのとは対照的に、目的の遺伝子(GOI)、すなわち治療用生体分子をコードする1つの鎖と、IIPをコードする1つの鎖の一本鎖が送達され、そのようにして、RNAと生来の阻害タンパク質との共局在が確実になること;
iii)IIPは、RNAの生来の感知を阻害し、したがってより多くのタンパク質発現を可能にすること;
iv)IIP発現それ自体は、サブゲノム鎖で、GOIと共発現されることによって自己増幅されること;及び/又は
v)従来のVEEV RNAレプリコン構築物と比較して、タンパク質発現の規模と持続時間の両方が増加すること。
i)VEEVレプリコンへの直接的なPIV-5及びORF4aタンパク質の挿入、これは、VPIIタンパク質と目的の遺伝子との二重のタンパク質発現を可能にすること;
ii)RNAの2つの異なる鎖を送達するのとは対照的に、目的の遺伝子(GOI)、すなわち治療用生体分子をコードする1つの鎖と、IIPをコードする1つの鎖の一本鎖が送達され、そのようにして、RNAと生来の阻害タンパク質との共局在が確実になること;
iii)IIPは、RNAの生来の感知を阻害し、したがってより多くのタンパク質発現を可能にすること;
iv)IIP発現それ自体は、サブゲノム鎖で、GOIと共発現されることによって自己増幅されること;及び/又は
v)従来のVEEV RNAレプリコン構築物と比較して、タンパク質発現の規模と持続時間の両方が増加すること。
【0130】
少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質をコードする配列が、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列に対して5'又は3'に配置され得るように、RNA構築物又はレプリコン配列内のどこに配置されていてもよい。
【0131】
しかしながら、好ましくは、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質をコードする配列は、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列に対して5'に配置される。
【0132】
好ましくは、第1の態様によるRNA構築物は、少なくとも1つのプロモーターを含み、プロモーターは、ゲノムプロモーター又はサブゲノムプロモーターのいずれかである。好ましくは、プロモーターは、サブゲノムプロモーターである。
【0133】
当業者は、サブゲノムプロモーターは、それが治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を可能にするように、少なくとも1種の治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されているプロモーターに関することを理解するであろう。
【0134】
好ましくは、サブゲノムプロモーターは、26Sであり、これは、以下の通り、配列番号57として本明細書で提供される:
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT[配列番号57]
GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT[配列番号57]
【0135】
したがって、好ましくは、プロモーター(好ましくは、サブゲノムプロモーター)は、配列番号57に実質的に記載された通りであるか、又はそのバリアント若しくは断片である。
【0136】
一実施形態において、同じプロモーターは、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質をコードする配列、及び少なくとも1種の生来の阻害剤をコードする配列に作動可能に連結されている。
【0137】
GOI(すなわち治療用生体分子)とIIPの両方が一本鎖にコードされるという本発明者の設計は、有利には、RNAを感知しており複製も可能な同じ細胞でタンパク質が発現されることを確実にするため、より一層少ない用量のRNAの使用を可能にすることから、生来の阻害性成分の増幅の追加の態様を有する。
【0138】
したがって、一実施形態において、プロモーターは、目的のペプチド又はタンパク質(すなわち治療用生体分子)をコードする配列及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列の5'に、プロモーターが両方の配列に作動可能に連結されるように配置される。
【0139】
別の実施形態において、第1のプロモーターは、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質(すなわち治療用生体分子)をコードする配列に作動可能に連結され、第2のプロモーターは、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている。
【0140】
RNA構築物は、少なくとも2、3、4又は5つのIIPをコードしていてもよい。1つより多くの生来の阻害タンパク質をコードする配列がある実施形態において、生来の阻害タンパク質をコードする全ての配列に、単一のプロモーターが作動可能に連結されていてもよい。代替として、各生来の阻害タンパク質が別個のプロモーターに作動可能に連結されるように、プロモーターが、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの他の配列のそれぞれに連結されていてもよい。この実施形態において、別個のプロモーターは、同じプロモーター配列を含んでいてもよいし、又は異なるプロモーター配列を含んでいてもよい。別の実施形態において、生来の阻害タンパク質をコードする各配列に、異なるプロモーターが作動可能に連結されている。
【0141】
RNA構築物は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質(すなわち治療用生体分子)をコードする配列と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列との間に配置されたリンカー配列を更に含んでいてもよい。
【0142】
一実施形態において、リンカー配列は、消化されることによって、目的の遺伝子によってコードされた少なくとも1種の治療用生体分子と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質とが分離されるように構成されるペプチドスペーサーをコードする配列を含む。それゆえに、好ましくは、スペーサー配列は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質をコードする配列と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列との間に配置される。
【0143】
したがって、スペーサー配列は、好ましくは切断可能なペプチド、例えば2Aペプチドである。好適な2Aペプチドとしては、ブタテッショウウイルス-12A(P2A)-ATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号21)、ソセア・アシグナ(thosea asigna)ウイルス2A(T2A)-QCTNYALLKLAGDVESNPGP(配列番号22)、ウマ鼻炎Aウイルス2A(E2A)、及び口蹄疫ウイルス2A(F2A)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(配列番号23)が挙げられる。好ましくは、2Aペプチドは、ソセア・アシグナウイルス2A(T2A)である。
【0144】
別の実施形態において、切断可能なペプチドは、自己切断ペプチドである。好ましくは、自己切断ペプチドは、フューリン/2Aペプチドである。フューリン配列は、2A配列の3'又は5'に配置されていてもよい。しかしながら、好ましくは、フューリン配列は、2A配列の5'に配置され、好ましくはフューリンと2A配列との間に配置されたGSGスペーサーを伴う。
【0145】
当業者は、フューリンは、特異的な認識配列、標準的にはR-X-R/K/X-R(配列番号24)で前駆体タンパク質を切断する分泌経路(主としてゴルジ及びトランスゴルジネットワーク)に配置された遍在的なカルシウム依存性前駆タンパク質コンバターゼであり、最後のRの後で前駆タンパク質を切断していることを理解するであろう。したがって、一実施形態において、フューリン配列は、R-X-R/K/X-Rである。しかしながら、好ましくは、フューリン配列は、最適化された配列RRRRRR(配列番号25)であり、これはGSG配列である。好ましくは、GSGスペーサーは、フューリン配列の3'及び2A配列の5'に配置される。
【0146】
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、NCBI参照配列:GenBank:AAC97195.1によって提供されるようなフューリン/T2Aであり、以下の通り、配列番号26として本明細書で提供される:
RRRRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP[配列番号26]
RRRRRRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP[配列番号26]
【0147】
したがって、好ましくは、スペーサー配列は、配列番号26に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0148】
RNA構築物又はレプリコンが生来の阻害タンパク質をコードする1つより多くの配列を含む実施形態において、レプリコンは、生来の阻害タンパク質をコードする各配列の間に、又は一部のIIPの間にのみ配置されたリンカー配列を有していてもよい。
【0149】
一実施形態において、治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列は、停止コドン、それに続いて下流配列の翻訳を開始させることが可能な内部リボソーム進入部位(IRES)配列によって分離されていてもよい。典型的なIRES配列としては、例えば、脳心筋炎ウイルス又は血管内皮増殖因子及び1型コラーゲン誘導性タンパク質(VCIP)のIRES配列が挙げられ、これらは当業者に公知であろう。それゆえに、好ましくは、IRES配列は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質をコードする配列と、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列との間に配置される。少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする複数の配列が使用される場合、スペーサー配列は、公知の切断配列及び/又はIRES配列の組合せを含み得る。
【0150】
別の実施形態において、少なくとも1種の治療用生体分子及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列は、停止コドン、それに続いて下流配列の転写を開始させることが可能な第2のサブゲノムプロモーター配列によって分離されていてもよい。
【0151】
RNA構築物は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質及び少なくとも1つの生来の阻害タンパク質をコードする配列の5'又は3'に配置された少なくとも1つの非構造タンパク質(NSP)をコードしてもよい。好ましくは、少なくとも1種のNSPをコードする配列は、目的のペプチド又はタンパク質及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列の5'に配置される。したがって、好ましくは、少なくとも1種のNSPをコードする配列は、RNA構築物の5'末端に配置される。
【0152】
RNA構築物によってコードされる少なくとも1種の非構造タンパク質は、RNAポリメラーゼnsP4であってもよい。好ましくは、構築物は、nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4をコードする。当業者は、nsP1は、複製複合体(RC)のウイルスキャッピング酵素及び膜アンカーであり、一方でnsP2は、RNAヘリカーゼ及びnsポリタンパク質のプロセシングに関与するプロテアーゼであることを理解するであろう。nsP3は、いくつかの宿主タンパク質と相互作用し、タンパク質ポリ及びモノADP-リボシル化をモジュレートすることができ、nsP4は、コアウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼである。
【0153】
一実施形態において、nsP1は、以下の通り、配列番号27として本明細書で提供される:
MEKVHVDIEEDSPFLRALQRSFPQFEVEAKQVTDNDHANARAFSHLASKLIETEVDPSDTILDIGSAPARRMYSKHKYHCICPMRCAEDPDRLYKYATKLKKNCKEITDKELDKKMKELAAVMSDPDLETETMCLHDDESCRYEGQVAVYQDVYAVDGPTSLYHQANKGVRVAYWIGFDTTPFMFKNLAGAYPSYSTNWADETVLTARNIGLCSSDVMERSRRGMSILRKKYLKPSNNVLFSVGSTIYHEKRDLLRSWHLPSVFHLRGKQNYTCRCETIVSCDGYVVKRIAISPGLYGKPSGYAATMHREGFLCCKVTDTLNGERVSFPVCTYVPATLCDQMTGILATDVSADDAQKLLVGLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFARWAKEYKEDQEDERPLGLRDRQLVMGCCWAFRRHKITSIYKRPDTQTIIKVNSDFHSFVLPRIGSNTLEIGLRTRIRKMLEEHKEPSPLITAEDVQEAKCAADEAKEVREAEELRAALPPLAADVEEPTLEADVDLMLQEAGA[配列番号27]
MEKVHVDIEEDSPFLRALQRSFPQFEVEAKQVTDNDHANARAFSHLASKLIETEVDPSDTILDIGSAPARRMYSKHKYHCICPMRCAEDPDRLYKYATKLKKNCKEITDKELDKKMKELAAVMSDPDLETETMCLHDDESCRYEGQVAVYQDVYAVDGPTSLYHQANKGVRVAYWIGFDTTPFMFKNLAGAYPSYSTNWADETVLTARNIGLCSSDVMERSRRGMSILRKKYLKPSNNVLFSVGSTIYHEKRDLLRSWHLPSVFHLRGKQNYTCRCETIVSCDGYVVKRIAISPGLYGKPSGYAATMHREGFLCCKVTDTLNGERVSFPVCTYVPATLCDQMTGILATDVSADDAQKLLVGLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFARWAKEYKEDQEDERPLGLRDRQLVMGCCWAFRRHKITSIYKRPDTQTIIKVNSDFHSFVLPRIGSNTLEIGLRTRIRKMLEEHKEPSPLITAEDVQEAKCAADEAKEVREAEELRAALPPLAADVEEPTLEADVDLMLQEAGA[配列番号27]
【0154】
したがって、nsP1は、好ましくは、配列番号27に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
【0155】
一実施形態において、nsP1は、以下の通り、配列番号28で定義されるヌクレオチド配列によってコードされる:
ATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCC[配列番号28]
ATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCC[配列番号28]
【0156】
したがって、nsP1は、好ましくは、配列番号28に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0157】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号50として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0158】
AUGGAGAAAGUUCACGUUGACAUCGAGGAAGACAGCCCAUUCCUCAGAGCUUUGCAGCGGAGCUUCCCGCAGUUUGAGGUAGAAGCCAAGCAGGUCACUGAUAAUGACCAUGCUAAUGCCAGAGCGUUUUCGCAUCUGGCUUCAAAACUGAUCGAAACGGAGGUGGACCCAUCCGACACGAUCCUUGACAUUGGAAGUGCGCCCGCCCGCAGAAUGUAUUCUAAGCACAAGUAUCAUUGUAUCUGUCCGAUGAGAUGUGCGGAAGAUCCGGACAGAUUGUAUAAGUAUGCAACUAAGCUGAAGAAAAACUGUAAGGAAAUAACUGAUAAGGAAUUGGACAAGAAAAUGAAGGAGCUGGCCGCCGUCAUGAGCGACCCUGACCUGGAAACUGAGACUAUGUGCCUCCACGACGACGAGUCGUGUCGCUACGAAGGGCAAGUCGCUGUUUACCAGGAUGUAUACGCGGUUGACGGACCGACAAGUCUCUAUCACCAAGCCAAUAAGGGAGUUAGAGUCGCCUACUGGAUAGGCUUUGACACCACCCCUUUUAUGUUUAAGAACUUGGCUGGAGCAUAUCCAUCAUACUCUACCAACUGGGCCGACGAAACCGUGUUAACGGCUCGUAACAUAGGCCUAUGCAGCUCUGACGUUAUGGAGCGGUCACGUAGAGGGAUGUCCAUUCUUAGAAAGAAGUAUUUGAAACCAUCCAACAAUGUUCUAUUCUCUGUUGGCUCGACCAUCUACCACGAGAAGAGGGACUUACUGAGGAGCUGGCACCUGCCGUCUGUAUUUCACUUACGUGGCAAGCAAAAUUACACAUGUCGGUGUGAGACUAUAGUUAGUUGCGACGGGUACGUCGUUAAAAGAAUAGCUAUCAGUCCAGGCCUGUAUGGGAAGCCUUCAGGCUAUGCUGCUACGAUGCACCGCGAGGGAUUCUUGUGCUGCAAAGUGACAGACACAUUGAACGGGGAGAGGGUCUCUUUUCCCGUGUGCACGUAUGUGCCAGCUACAUUGUGUGACCAAAUGACUGGCAUACUGGCAACAGAUGUCAGUGCGGACGACGCGCAAAAACUGCUGGUUGGGCUCAACCAGCGUAUAGUCGUCAACGGUCGCACCCAGAGAAACACCAAUACCAUGAAAAAUUACCUUUUGCCCGUAGUGGCCCAGGCAUUUGCUAGGUGGGCAAAGGAAUAUAAGGAAGAUCAAGAAGAUGAAAGGCCACUAGGACUACGAGAUAGACAGUUAGUCAUGGGGUGUUGUUGGGCUUUUAGAAGGCACAAGAUAACAUCUAUUUAUAAGCGCCCGGAUACCCAAACCAUCAUCAAAGUGAACAGCGAUUUCCACUCAUUCGUGCUGCCCAGGAUAGGCAGUAACACAUUGGAGAUCGGGCUGAGAACAAGAAUCAGGAAAAUGUUAGAGGAGCACAAGGAGCCGUCACCUCUCAUUACCGCCGAGGACGUACAAGAAGCUAAGUGCGCAGCCGAUGAGGCUAAGGAGGUGCGUGAAGCCGAGGAGUUGCGCGCAGCUCUACCACCUUUGGCAGCUGAUGUUGAGGAGCCCACUCUGGAAGCCGAUGUCGACUUGAUGUUACAAGAGGCUGGGGCC[配列番号50]
【0159】
一実施形態において、nsP2は、以下の通り、配列番号29として本明細書で提供される:
GSVETPRGLIKVTSYDGEDKIGSYAVLSPQAVLKSEKLSCIHPLAEQVIVITHSGRKGRYAVEPYHGKVVVPEGHAIPVQDFQALSESATIVYNEREFVNRYLHHIATHGGALNTDEEYYKTVKPSEHDGEYLYDIDRKQCVKKELVTGLGLTGELVDPPFHEFAYESLRTRPAAPYQVPTIGVYGVPGSGKSGIIKSAVTKKDLVVSAKKENCAEIIRDVKKMKGLDVNARTVDSVLLNGCKHPVETLYIDEAFACHAGTLRALIAIIRPKKAVLCGDPKQCGFFNMMCLKVHFNHEICTQVFHKSISRRCTKSVTSVVSTLFYDKKMRTTNPKETKIVIDTTGSTKPKQDDLILTCFRGWVKQLQIDYKGNEIMTAAASQGLTRKGVYAVRYKVNENPLYAPTSEHVNVLLTRTEDRIVWKTLAGDPWIKTLTAKYPGNFTATIEEWQAEHDAIMRHILERPDPTDVFQNKANVCWAKALVPVLKTAGIDMTTEQWNTVDYFETDKAHSAEIVLNQLCVRFFGLDLDSGLFSAPTVPLSIRNNHWDNSPSPNMYGLNKEVVRQLSRRYPQLPRAVATGRVYDMNTGTLRNYDPRINLVPVNRRLPHALVLHHNEHPQSDFSSFVSKLKGRTVLVVGEKLSVPGKMVDWLSDRPEATFRARLDLGIPGDVPKYDIIFVNVRTPYKYHHYQQCEDHAIKLSMLTKKACLHLNPGGTCVSIGYGYADRASESIIGAIARQFKFSRVCKPKSSLEETEVLFVFIGYDRKARTHNSYKLSSTLTNIYTGSRLHEAGC[配列番号29]
GSVETPRGLIKVTSYDGEDKIGSYAVLSPQAVLKSEKLSCIHPLAEQVIVITHSGRKGRYAVEPYHGKVVVPEGHAIPVQDFQALSESATIVYNEREFVNRYLHHIATHGGALNTDEEYYKTVKPSEHDGEYLYDIDRKQCVKKELVTGLGLTGELVDPPFHEFAYESLRTRPAAPYQVPTIGVYGVPGSGKSGIIKSAVTKKDLVVSAKKENCAEIIRDVKKMKGLDVNARTVDSVLLNGCKHPVETLYIDEAFACHAGTLRALIAIIRPKKAVLCGDPKQCGFFNMMCLKVHFNHEICTQVFHKSISRRCTKSVTSVVSTLFYDKKMRTTNPKETKIVIDTTGSTKPKQDDLILTCFRGWVKQLQIDYKGNEIMTAAASQGLTRKGVYAVRYKVNENPLYAPTSEHVNVLLTRTEDRIVWKTLAGDPWIKTLTAKYPGNFTATIEEWQAEHDAIMRHILERPDPTDVFQNKANVCWAKALVPVLKTAGIDMTTEQWNTVDYFETDKAHSAEIVLNQLCVRFFGLDLDSGLFSAPTVPLSIRNNHWDNSPSPNMYGLNKEVVRQLSRRYPQLPRAVATGRVYDMNTGTLRNYDPRINLVPVNRRLPHALVLHHNEHPQSDFSSFVSKLKGRTVLVVGEKLSVPGKMVDWLSDRPEATFRARLDLGIPGDVPKYDIIFVNVRTPYKYHHYQQCEDHAIKLSMLTKKACLHLNPGGTCVSIGYGYADRASESIIGAIARQFKFSRVCKPKSSLEETEVLFVFIGYDRKARTHNSYKLSSTLTNIYTGSRLHEAGC[配列番号29]
【0160】
したがって、nsP2は、好ましくは、配列番号29に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
【0161】
一実施形態において、nsP2は、以下の通り、配列番号30で定義されるヌクレオチド配列によってコードされる:
GGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGT[配列番号30]
GGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGT[配列番号30]
【0162】
したがって、好ましくは、nsP2は、配列番号30に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0163】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号51を含んでいてもよい:
GGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGU[配列番号51]
GGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGU[配列番号51]
【0164】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号51として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0165】
一実施形態において、nsP3は、以下の通り、配列番号31として本明細書で提供される:
APSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGESMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVDETPEPSAENQSTEGTPEQPPLITEDETRTRTPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGPPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLEGASVTSGATSAETNSYFAKSMEFLARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPSLAPSRACSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRTPSRSVSRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQRFDAGA[配列番号31]
APSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGESMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVDETPEPSAENQSTEGTPEQPPLITEDETRTRTPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGPPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLEGASVTSGATSAETNSYFAKSMEFLARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPSLAPSRACSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRTPSRSVSRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQRFDAGA[配列番号31]
【0166】
したがって、好ましくは、nsP3は、配列番号31に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
【0167】
一実施形態において、nsP3は、以下の通り、配列番号32で定義されるヌクレオチド配列によってコードされる:
GCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCA[配列番号32]
GCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCA[配列番号32]
【0168】
したがって、好ましくは、nsP3は、配列番号32に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0169】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号52を含んでいてもよい:
GCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAUAUUCAUCCAAGGAAGUAUCUCGUGGAAACACCACCGGUAGACGAGACUCCGGAGCCAUCGGCAGAGAACCAAUCCACAGAGGGGACACCUGAACAACCACCACUUAUAACCGAGGAUGAGACCAGGACUAGAACGCCUGAGCCGAUCAUCAUCGAAGAGGAAGAAGAGGAUAGCAUAAGUUUGCUGUCAGAUGGCCCGACCCACCAGGUGCUGCAAGUCGAGGCAGACAUUCACGGGCCGCCCUCUGUAUCUAGCUCAUCCUGGUCCAUUCCUCAUGCAUCCGACUUUGAUGUGGACAGUUUAUCCAUACUUGACACCCUGGAGGGAGCUAGCGUGACCAGCGGGGCAACGUCAGCCGAGACUAACUCUUACUUCGCAAAGAGUAUGGAGUUUCUGGCGCGACCGGUGCCUGCGCCUCGAACAGUAUUCAGGAACCCUCCACAUCCCGCUCCGCGCACAAGAACACCGUCACUUGCACCCAGCAGGGCCUGCUCGAGAACCAGCCUAGUUUCCACCCCGCCAGGCGUGAAUAGGGUGAUCACUAGAGAGGAGCUCGAGGCGCUUACCCCGUCACGCACUCCUAGCAGGUCGGUCUCGAGAACCAGCCUGGUCUCCAACCCGCCAGGCGUAAAUAGGGUGAUUACAAGAGAGGAGUUUGAGGCGUUCGUAGCACAACAACAAUGACGGUUUGAUGCGGGUGCA[配列番号52]
GCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAUAUUCAUCCAAGGAAGUAUCUCGUGGAAACACCACCGGUAGACGAGACUCCGGAGCCAUCGGCAGAGAACCAAUCCACAGAGGGGACACCUGAACAACCACCACUUAUAACCGAGGAUGAGACCAGGACUAGAACGCCUGAGCCGAUCAUCAUCGAAGAGGAAGAAGAGGAUAGCAUAAGUUUGCUGUCAGAUGGCCCGACCCACCAGGUGCUGCAAGUCGAGGCAGACAUUCACGGGCCGCCCUCUGUAUCUAGCUCAUCCUGGUCCAUUCCUCAUGCAUCCGACUUUGAUGUGGACAGUUUAUCCAUACUUGACACCCUGGAGGGAGCUAGCGUGACCAGCGGGGCAACGUCAGCCGAGACUAACUCUUACUUCGCAAAGAGUAUGGAGUUUCUGGCGCGACCGGUGCCUGCGCCUCGAACAGUAUUCAGGAACCCUCCACAUCCCGCUCCGCGCACAAGAACACCGUCACUUGCACCCAGCAGGGCCUGCUCGAGAACCAGCCUAGUUUCCACCCCGCCAGGCGUGAAUAGGGUGAUCACUAGAGAGGAGCUCGAGGCGCUUACCCCGUCACGCACUCCUAGCAGGUCGGUCUCGAGAACCAGCCUGGUCUCCAACCCGCCAGGCGUAAAUAGGGUGAUUACAAGAGAGGAGUUUGAGGCGUUCGUAGCACAACAACAAUGACGGUUUGAUGCGGGUGCA[配列番号52]
【0170】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号52として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。一実施形態において、nsP4は、以下の通り、配列番号33として本明細書で提供される:
YIFSSDTGQGHLQQKSVRQTVLSEVVLERTELEISYAPRLDQEKEELLRKKLQLNPTPANRSRYQSRKVENMKAITARRILQGLGHYLKAEGKVECYRTLHPVPLYSSSVNRAFSSPKVAVEACNAMLKENFPTVASYCIIPEYDAYLDMVDGASCCLDTASFCPAKLRSFPKKHSYLEPTIRSAVPSAIQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPVLDSAAFNVECFKKYACNNEYWETFKENPIRLTEENVVNYITKLKGPKAAALFAKTHNLNMLQDIPMDRFVMDLKRDVKVTPGTKHTEERPKVQVIQAADPLATAYLCGIHRELVRRLNAVLLPNIHTLFDMSAEDFDAIIAEHFQPGDCVLETDIASFDKSEDDAMALTALMILEDLGVDAELLTLIEAAFGEISSIHLPTKTKFKFGAMMKSGMFLTLFVNTVINIVIASRVLRERLTGSPCAAFIGDDNIVKGVKSDKLMADRCATWLNMEVKIIDAVVGEKAPYFCGGFILCDSVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLAADDEHDDDRRRALHEESTRWNRVGILSELCKAVESRYETVGTSIIVMAMTTLASSVKSFSYLRGAPITLYG[配列番号33]
YIFSSDTGQGHLQQKSVRQTVLSEVVLERTELEISYAPRLDQEKEELLRKKLQLNPTPANRSRYQSRKVENMKAITARRILQGLGHYLKAEGKVECYRTLHPVPLYSSSVNRAFSSPKVAVEACNAMLKENFPTVASYCIIPEYDAYLDMVDGASCCLDTASFCPAKLRSFPKKHSYLEPTIRSAVPSAIQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPVLDSAAFNVECFKKYACNNEYWETFKENPIRLTEENVVNYITKLKGPKAAALFAKTHNLNMLQDIPMDRFVMDLKRDVKVTPGTKHTEERPKVQVIQAADPLATAYLCGIHRELVRRLNAVLLPNIHTLFDMSAEDFDAIIAEHFQPGDCVLETDIASFDKSEDDAMALTALMILEDLGVDAELLTLIEAAFGEISSIHLPTKTKFKFGAMMKSGMFLTLFVNTVINIVIASRVLRERLTGSPCAAFIGDDNIVKGVKSDKLMADRCATWLNMEVKIIDAVVGEKAPYFCGGFILCDSVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLAADDEHDDDRRRALHEESTRWNRVGILSELCKAVESRYETVGTSIIVMAMTTLASSVKSFSYLRGAPITLYG[配列番号33]
【0171】
したがって、好ましくは、nsP4は、配列番号33に実質的に記載された通りのアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なバリアント若しくは断片を含む。
【0172】
一実施形態において、nsP4は、以下の通り、配列番号34で定義されるヌクレオチド配列によってコードされる:
TACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGC[配列番号34]
TACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGC[配列番号34]
【0173】
したがって、好ましくは、nsP4は、配列番号34に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片によってコードされる。
【0174】
したがって、RNA構築物は、以下の通り、配列番号53を含んでいてもよい:
UACAUCUUUUCCUCCGACACCGGUCAAGGGCAUUUACAACAAAAAUCAGUAAGGCAAACGGUGCUAUCCGAAGUGGUGUUGGAGAGGACCGAAUUGGAGAUUUCGUAUGCCCCGCGCCUCGACCAAGAAAAAGAAGAAUUACUACGCAAGAAAUUACAGUUAAAUCCCACACCUGCUAACAGAAGCAGAUACCAGUCCAGGAAGGUGGAGAACAUGAAAGCCAUAACAGCUAGACGUAUUCUGCAAGGCCUAGGGCAUUAUUUGAAGGCAGAAGGAAAAGUGGAGUGCUACCGAACCCUGCAUCCUGUUCCUUUGUAUUCAUCUAGUGUGAACCGUGCCUUUUCAAGCCCCAAGGUCGCAGUGGAAGCCUGUAACGCCAUGUUGAAAGAGAACUUUCCGACUGUGGCUUCUUACUGUAUUAUUCCAGAGUACGAUGCCUAUUUGGACAUGGUUGACGGAGCUUCAUGCUGCUUAGACACUGCCAGUUUUUGCCCUGCAAAGCUGCGCAGCUUUCCAAAGAAACACUCCUAUUUGGAACCCACAAUACGAUCGGCAGUGCCUUCAGCGAUCCAGAACACGCUCCAGAACGUCCUGGCAGCUGCCACAAAAAGAAAUUGCAAUGUCACGCAAAUGAGAGAAUUGCCCGUAUUGGAUUCGGCGGCCUUUAAUGUGGAAUGCUUCAAGAAAUAUGCGUGUAAUAAUGAAUAUUGGGAAACGUUUAAAGAAAACCCCAUCAGGCUUACUGAAGAAAACGUGGUAAAUUACAUUACCAAAUUAAAAGGACCAAAAGCUGCUGCUCUUUUUGCGAAGACACAUAAUUUGAAUAUGUUGCAGGACAUACCAAUGGACAGGUUUGUAAUGGACUUAAAGAGAGACGUGAAAGUGACUCCAGGAACAAAACAUACUGAAGAACGGCCCAAGGUACAGGUGAUCCAGGCUGCCGAUCCGCUAGCAACAGCGUAUCUGUGCGGAAUCCACCGAGAGCUGGUUAGGAGAUUAAAUGCGGUCCUGCUUCCGAACAUUCAUACACUGUUUGAUAUGUCGGCUGAAGACUUUGACGCUAUUAUAGCCGAGCACUUCCAGCCUGGGGAUUGUGUUCUGGAAACUGACAUCGCGUCGUUUGAUAAAAGUGAGGACGACGCCAUGGCUCUGACCGCGUUAAUGAUUCUGGAAGACUUAGGUGUGGACGCAGAGCUGUUGACGCUGAUUGAGGCGGCUUUCGGCGAAAUUUCAUCAAUACAUUUGCCCACUAAAACUAAAUUUAAAUUCGGAGCCAUGAUGAAAUCUGGAAUGUUCCUCACACUGUUUGUGAACACAGUCAUUAACAUUGUAAUCGCAAGCAGAGUGUUGAGAGAACGGCUAACCGGAUCACCAUGUGCAGCAUUCAUUGGAGAUGACAAUAUCGUGAAAGGAGUCAAAUCGGACAAAUUAAUGGCAGACAGGUGCGCCACCUGGUUGAAUAUGGAAGUCAAGAUUAUAGAUGCUGUGGUGGGCGAGAAAGCGCCUUAUUUCUGUGGAGGGUUUAUUUUGUGUGACUCCGUGACCGGCACAGCGUGCCGUGUGGCAGACCCCCUAAAAAGGCUGUUUAAGCUUGGCAAACCUCUGGCAGCAGACGAUGAACAUGAUGAUGACAGGAGAAGGGCAUUGCAUGAAGAGUCAACACGCUGGAACCGAGUGGGUAUUCUUUCAGAGCUGUGCAAGGCAGUAGAAUCAAGGUAUGAAACCGUAGGAACUUCCAUCAUAGUUAUGGCCAUGACUACUCUAGCUAGCAGUGUUAAAUCAUUCAGCUACCUGAGAGGGGCCCCUAUAACUCUCUACGGC[配列番号53]
UACAUCUUUUCCUCCGACACCGGUCAAGGGCAUUUACAACAAAAAUCAGUAAGGCAAACGGUGCUAUCCGAAGUGGUGUUGGAGAGGACCGAAUUGGAGAUUUCGUAUGCCCCGCGCCUCGACCAAGAAAAAGAAGAAUUACUACGCAAGAAAUUACAGUUAAAUCCCACACCUGCUAACAGAAGCAGAUACCAGUCCAGGAAGGUGGAGAACAUGAAAGCCAUAACAGCUAGACGUAUUCUGCAAGGCCUAGGGCAUUAUUUGAAGGCAGAAGGAAAAGUGGAGUGCUACCGAACCCUGCAUCCUGUUCCUUUGUAUUCAUCUAGUGUGAACCGUGCCUUUUCAAGCCCCAAGGUCGCAGUGGAAGCCUGUAACGCCAUGUUGAAAGAGAACUUUCCGACUGUGGCUUCUUACUGUAUUAUUCCAGAGUACGAUGCCUAUUUGGACAUGGUUGACGGAGCUUCAUGCUGCUUAGACACUGCCAGUUUUUGCCCUGCAAAGCUGCGCAGCUUUCCAAAGAAACACUCCUAUUUGGAACCCACAAUACGAUCGGCAGUGCCUUCAGCGAUCCAGAACACGCUCCAGAACGUCCUGGCAGCUGCCACAAAAAGAAAUUGCAAUGUCACGCAAAUGAGAGAAUUGCCCGUAUUGGAUUCGGCGGCCUUUAAUGUGGAAUGCUUCAAGAAAUAUGCGUGUAAUAAUGAAUAUUGGGAAACGUUUAAAGAAAACCCCAUCAGGCUUACUGAAGAAAACGUGGUAAAUUACAUUACCAAAUUAAAAGGACCAAAAGCUGCUGCUCUUUUUGCGAAGACACAUAAUUUGAAUAUGUUGCAGGACAUACCAAUGGACAGGUUUGUAAUGGACUUAAAGAGAGACGUGAAAGUGACUCCAGGAACAAAACAUACUGAAGAACGGCCCAAGGUACAGGUGAUCCAGGCUGCCGAUCCGCUAGCAACAGCGUAUCUGUGCGGAAUCCACCGAGAGCUGGUUAGGAGAUUAAAUGCGGUCCUGCUUCCGAACAUUCAUACACUGUUUGAUAUGUCGGCUGAAGACUUUGACGCUAUUAUAGCCGAGCACUUCCAGCCUGGGGAUUGUGUUCUGGAAACUGACAUCGCGUCGUUUGAUAAAAGUGAGGACGACGCCAUGGCUCUGACCGCGUUAAUGAUUCUGGAAGACUUAGGUGUGGACGCAGAGCUGUUGACGCUGAUUGAGGCGGCUUUCGGCGAAAUUUCAUCAAUACAUUUGCCCACUAAAACUAAAUUUAAAUUCGGAGCCAUGAUGAAAUCUGGAAUGUUCCUCACACUGUUUGUGAACACAGUCAUUAACAUUGUAAUCGCAAGCAGAGUGUUGAGAGAACGGCUAACCGGAUCACCAUGUGCAGCAUUCAUUGGAGAUGACAAUAUCGUGAAAGGAGUCAAAUCGGACAAAUUAAUGGCAGACAGGUGCGCCACCUGGUUGAAUAUGGAAGUCAAGAUUAUAGAUGCUGUGGUGGGCGAGAAAGCGCCUUAUUUCUGUGGAGGGUUUAUUUUGUGUGACUCCGUGACCGGCACAGCGUGCCGUGUGGCAGACCCCCUAAAAAGGCUGUUUAAGCUUGGCAAACCUCUGGCAGCAGACGAUGAACAUGAUGAUGACAGGAGAAGGGCAUUGCAUGAAGAGUCAACACGCUGGAACCGAGUGGGUAUUCUUUCAGAGCUGUGCAAGGCAGUAGAAUCAAGGUAUGAAACCGUAGGAACUUCCAUCAUAGUUAUGGCCAUGACUACUCUAGCUAGCAGUGUUAAAUCAUUCAGCUACCUGAGAGGGGCCCCUAUAACUCUCUACGGC[配列番号53]
【0175】
したがって、それゆえに、好ましくは、RNA構築物は、配列番号53として実質的に記載された通りのRNAヌクレオチド配、列又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0176】
好ましくは、本発明のRNA構築物によってコードされる非構造タンパク質は、宿主細胞中に存在するタンパク質と一緒に、ゲノムの複製と、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列の転写に必要な酵素複合体を形成する。例えば、1種又は複数の非構造タンパク質は、少なくとも1種の目的のペプチド又はタンパク質及び少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードするヌクレオチド配列を構築物が増幅することを可能にするように、ポリメラーゼをコードしてもよい。
【0177】
宿主細胞は、真核又は原核宿主細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。
【0178】
RNA構築物は、プロモーターが、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されており、宿主細胞において少なくとも1種の非構造タンパク質の発現を可能にするように、少なくとも1種の非構造タンパク質の5'に配置されたプロモーターを更に含んでいてもよい。
【0179】
好ましくは、プロモーターは、5'UTRが保存された配列エレメントを含み、これは、本明細書では、以下の通り、配列番号54と称される場合がある:
AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAA[配列番号54]
AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAA[配列番号54]
【0180】
したがって、好ましくは、UTRは、少なくとも1種の非構造タンパク質の5'に配置され、配列番号54に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0181】
好ましくは、レプリコンは、ポリAテールを含む。好ましくは、ポリAテールは、レプリコンの3'末端に配置される。レプリコンは、5'キャップを更に含んでいてもよい。本発明の文脈において、用語「5'-キャップ」は、RNAキャップ構造に類似しており、好ましくはインビボ及び/又は細胞中で、そこに取り付けられるとRNAを安定化させる、及び/又はRNAの翻訳を強化する能力を有するように改変された5'-キャップアナログを含む。
【0182】
5'-キャップを有するRNAは、インビトロにおける5'-キャップの存在下でのDNAテンプレートの転写によって達成することができ、この場合、5'-キャップは、共に転写されることによって生成したRNA鎖に取り入れられ、又はRNAは、例えばインビトロにおける転写によって生成してもよく、5'-キャップは、転写後に、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用してRNAに取り付けてもよい。キャップされたRNAにおいて、(キャップされた)RNA分子の第1の塩基の3'位は、リン酸ジエステル結合を介して、RNA分子のそれに続く塩基(「第2の塩基」)の5'位に連結される。
【0183】
一実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、プロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、及び生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列を含む。
【0184】
別の実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、及び生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列を含む。
【0185】
更に別の実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、及びポリAテールを含む。
【0186】
別の実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、任意選択で生来の阻害タンパク質をコードするそれぞれの少なくとも1つの配列の間のスペーサー配列、及びポリAテールを含む。
【0187】
一実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、5'キャップ、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、任意選択で生来の阻害タンパク質をコードするそれぞれの少なくとも1つの配列の間のスペーサー配列、及びポリAテールを含む。
【0188】
一実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、5'キャップ、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、スペーサー、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、及びポリAテールを含む。
【0189】
一実施形態において、RNA構築物は、好ましくは5'から3'に、5'キャップ、プロモーター、少なくとも1種の非構造タンパク質をコードする配列、スペーサー、生来の阻害タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、サブゲノムプロモーター、少なくとも1種の治療用生体分子をコードする配列、スペーサー配列、少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードする配列、任意選択で少なくとも1種の生来の阻害タンパク質をコードするそれぞれの配列の間のスペーサー配列、及びポリAテールを含む。
【0190】
PIV5のVタンパク質は、オリゴマー化を防止するMDA5に直接結合すると考えられ、一方でORF4aは、PACTのdsRNAへの結合をブロックすると考えられる。本発明者らは、生来の感知メカニズムを有利に回避できる構築物が生成されるように、目的の遺伝子(GOI)(すなわち治療用生体分子)の後に、T2A切断部位によって分離させて、これらのタンパク質コード遺伝子をsaRNAに取り込ませた。GOIとIIPとを、発現されるときに内因性プロテアーゼ(T2A)によって切断される単一のオープンリーディングフレームに対合させることによって、同じ反応速度で設定された比率での、同じ細胞内における両方の発現が最大化される。
【0191】
したがって、好ましくは、RNA構築物は、5'から3'に、5'キャップ、51ヌクレオチドの保存された配列エレメントを含むプロモーター、nsP1、nsP2、nsP3v、nsP4、サブゲノムプロモーター26S、治療用生体分子をコードする配列、T2Aスペーサー配列、PIV5V及び/又はMERS-CoV ORF4aをコードする配列、並びにポリAテールを含む。
【0192】
それゆえに、一実施形態において、RNA構築物は、以下の通り、配列番号38を含んでいてもよいし、又はそれからなっていてもよい:
AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAAAUGGAGAAAGUUCACGUUGACAUCGAGGAAGACAGCCCAUUCCUCAGAGCUUUGCAGCGGAGCUUCCCGCAGUUUGAGGUAGAAGCCAAGCAGGUCACUGAUAAUGACCAUGCUAAUGCCAGAGCGUUUUCGCAUCUGGCUUCAAAACUGAUCGAAACGGAGGUGGACCCAUCCGACACGAUCCUUGACAUUGGAAGUGCGCCCGCCCGCAGAAUGUAUUCUAAGCACAAGUAUCAUUGUAUCUGUCCGAUGAGAUGUGCGGAAGAUCCGGACAGAUUGUAUAAGUAUGCAACUAAGCUGAAGAAAAACUGUAAGGAAAUAACUGAUAAGGAAUUGGACAAGAAAAUGAAGGAGCUGGCCGCCGUCAUGAGCGACCCUGACCUGGAAACUGAGACUAUGUGCCUCCACGACGACGAGUCGUGUCGCUACGAAGGGCAAGUCGCUGUUUACCAGGAUGUAUACGCGGUUGACGGACCGACAAGUCUCUAUCACCAAGCCAAUAAGGGAGUUAGAGUCGCCUACUGGAUAGGCUUUGACACCACCCCUUUUAUGUUUAAGAACUUGGCUGGAGCAUAUCCAUCAUACUCUACCAACUGGGCCGACGAAACCGUGUUAACGGCUCGUAACAUAGGCCUAUGCAGCUCUGACGUUAUGGAGCGGUCACGUAGAGGGAUGUCCAUUCUUAGAAAGAAGUAUUUGAAACCAUCCAACAAUGUUCUAUUCUCUGUUGGCUCGACCAUCUACCACGAGAAGAGGGACUUACUGAGGAGCUGGCACCUGCCGUCUGUAUUUCACUUACGUGGCAAGCAAAAUUACACAUGUCGGUGUGAGACUAUAGUUAGUUGCGACGGGUACGUCGUUAAAAGAAUAGCUAUCAGUCCAGGCCUGUAUGGGAAGCCUUCAGGCUAUGCUGCUACGAUGCACCGCGAGGGAUUCUUGUGCUGCAAAGUGACAGACACAUUGAACGGGGAGAGGGUCUCUUUUCCCGUGUGCACGUAUGUGCCAGCUACAUUGUGUGACCAAAUGACUGGCAUACUGGCAACAGAUGUCAGUGCGGACGACGCGCAAAAACUGCUGGUUGGGCUCAACCAGCGUAUAGUCGUCAACGGUCGCACCCAGAGAAACACCAAUACCAUGAAAAAUUACCUUUUGCCCGUAGUGGCCCAGGCAUUUGCUAGGUGGGCAAAGGAAUAUAAGGAAGAUCAAGAAGAUGAAAGGCCACUAGGACUACGAGAUAGACAGUUAGUCAUGGGGUGUUGUUGGGCUUUUAGAAGGCACAAGAUAACAUCUAUUUAUAAGCGCCCGGAUACCCAAACCAUCAUCAAAGUGAACAGCGAUUUCCACUCAUUCGUGCUGCCCAGGAUAGGCAGUAACACAUUGGAGAUCGGGCUGAGAACAAGAAUCAGGAAAAUGUUAGAGGAGCACAAGGAGCCGUCACCUCUCAUUACCGCCGAGGACGUACAAGAAGCUAAGUGCGCAGCCGAUGAGGCUAAGGAGGUGCGUGAAGCCGAGGAGUUGCGCGCAGCUCUACCACCUUUGGCAGCUGAUGUUGAGGAGCCCACUCUGGAAGCCGAUGUCGACUUGAUGUUACAAGAGGCUGGGGCCGGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGUGCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAU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GCUGCUUACAUAGAACUCGCGGCGAUUGGCAUGCCGCCUUAAAAUUUUUAUUUUAUUUUUCUUUUCUUUUCCGAAUCGGAUUUUGUUUUUAAUAUUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号38]
AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAAAUGGAGAAAGUUCACGUUGACAUCGAGGAAGACAGCCCAUUCCUCAGAGCUUUGCAGCGGAGCUUCCCGCAGUUUGAGGUAGAAGCCAAGCAGGUCACUGAUAAUGACCAUGCUAAUGCCAGAGCGUUUUCGCAUCUGGCUUCAAAACUGAUCGAAACGGAGGUGGACCCAUCCGACACGAUCCUUGACAUUGGAAGUGCGCCCGCCCGCAGAAUGUAUUCUAAGCACAAGUAUCAUUGUAUCUGUCCGAUGAGAUGUGCGGAAGAUCCGGACAGAUUGUAUAAGUAUGCAACUAAGCUGAAGAAAAACUGUAAGGAAAUAACUGAUAAGGAAUUGGACAAGAAAAUGAAGGAGCUGGCCGCCGUCAUGAGCGACCCUGACCUGGAAACUGAGACUAUGUGCCUCCACGACGACGAGUCGUGUCGCUACGAAGGGCAAGUCGCUGUUUACCAGGAUGUAUACGCGGUUGACGGACCGACAAGUCUCUAUCACCAAGCCAAUAAGGGAGUUAGAGUCGCCUACUGGAUAGGCUUUGACACCACCCCUUUUAUGUUUAAGAACUUGGCUGGAGCAUAUCCAUCAUACUCUACCAACUGGGCCGACGAAACCGUGUUAACGGCUCGUAACAUAGGCCUAUGCAGCUCUGACGUUAUGGAGCGGUCACGUAGAGGGAUGUCCAUUCUUAGAAAGAAGUAUUUGAAACCAUCCAACAAUGUUCUAUUCUCUGUUGGCUCGACCAUCUACCACGAGAAGAGGGACUUACUGAGGAGCUGGCACCUGCCGUCUGUAUUUCACUUACGUGGCAAGCAAAAUUACACAUGUCGGUGUGAGACUAUAGUUAGUUGCGACGGGUACGUCGUUAAAAGAAUAGCUAUCAGUCCAGGCCUGUAUGGGAAGCCUUCAGGCUAUGCUGCUACGAUGCACCGCGAGGGAUUCUUGUGCUGCAAAGUGACAGACACAUUGAACGGGGAGAGGGUCUCUUUUCCCGUGUGCACGUAUGUGCCAGCUACAUUGUGUGACCAAAUGACUGGCAUACUGGCAACAGAUGUCAGUGCGGACGACGCGCAAAAACUGCUGGUUGGGCUCAACCAGCGUAUAGUCGUCAACGGUCGCACCCAGAGAAACACCAAUACCAUGAAAAAUUACCUUUUGCCCGUAGUGGCCCAGGCAUUUGCUAGGUGGGCAAAGGAAUAUAAGGAAGAUCAAGAAGAUGAAAGGCCACUAGGACUACGAGAUAGACAGUUAGUCAUGGGGUGUUGUUGGGCUUUUAGAAGGCACAAGAUAACAUCUAUUUAUAAGCGCCCGGAUACCCAAACCAUCAUCAAAGUGAACAGCGAUUUCCACUCAUUCGUGCUGCCCAGGAUAGGCAGUAACACAUUGGAGAUCGGGCUGAGAACAAGAAUCAGGAAAAUGUUAGAGGAGCACAAGGAGCCGUCACCUCUCAUUACCGCCGAGGACGUACAAGAAGCUAAGUGCGCAGCCGAUGAGGCUAAGGAGGUGCGUGAAGCCGAGGAGUUGCGCGCAGCUCUACCACCUUUGGCAGCUGAUGUUGAGGAGCCCACUCUGGAAGCCGAUGUCGACUUGAUGUUACAAGAGGCUGGGGCCGGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGUGCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAU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GCUGCUUACAUAGAACUCGCGGCGAUUGGCAUGCCGCCUUAAAAUUUUUAUUUUAUUUUUCUUUUCUUUUCCGAAUCGGAUUUUGUUUUUAAUAUUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号38]
【0193】
したがって、好ましくは、RNA構築物は、配列番号38に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0194】
別の実施形態において、RNA構築物は、以下の通り、配列番号39を含んでいてもよいし、又はそれからなっていてもよい:
AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAAAUGGAGAAAGUUCACGUUGACAUCGAGGAAGACAGCCCAUUCCUCAGAGCUUUGCAGCGGAGCUUCCCGCAGUUUGAGGUAGAAGCCAAGCAGGUCACUGAUAAUGACCAUGCUAAUGCCAGAGCGUUUUCGCAUCUGGCUUCAAAACUGAUCGAAACGGAGGUGGACCCAUCCGACACGAUCCUUGACAUUGGAAGUGCGCCCGCCCGCAGAAUGUAUUCUAAGCACAAGUAUCAUUGUAUCUGUCCGAUGAGAUGUGCGGAAGAUCCGGACAGAUUGUAUAAGUAUGCAACUAAGCUGAAGAAAAACUGUAAGGAAAUAACUGAUAAGGAAUUGGACAAGAAAAUGAAGGAGCUGGCCGCCGUCAUGAGCGACCCUGACCUGGAAACUGAGACUAUGUGCCUCCACGACGACGAGUCGUGUCGCUACGAAGGGCAAGUCGCUGUUUACCAGGAUGUAUACGCGGUUGACGGACCGACAAGUCUCUAUCACCAAGCCAAUAAGGGAGUUAGAGUCGCCUACUGGAUAGGCUUUGACACCACCCCUUUUAUGUUUAAGAACUUGGCUGGAGCAUAUCCAUCAUACUCUACCAACUGGGCCGACGAAACCGUGUUAACGGCUCGUAACAUAGGCCUAUGCAGCUCUGACGUUAUGGAGCGGUCACGUAGAGGGAUGUCCAUUCUUAGAAAGAAGUAUUUGAAACCAUCCAACAAUGUUCUAUUCUCUGUUGGCUCGACCAUCUACCACGAGAAGAGGGACUUACUGAGGAGCUGGCACCUGCCGUCUGUAUUUCACUUACGUGGCAAGCAAAAUUACACAUGUCGGUGUGAGACUAUAGUUAGUUGCGACGGGUACGUCGUUAAAAGAAUAGCUAUCAGUCCAGGCCUGUAUGGGAAGCCUUCAGGCUAUGCUGCUACGAUGCACCGCGAGGGAUUCUUGUGCUGCAAAGUGACAGACACAUUGAACGGGGAGAGGGUCUCUUUUCCCGUGUGCACGUAUGUGCCAGCUACAUUGUGUGACCAAAUGACUGGCAUACUGGCAACAGAUGUCAGUGCGGACGACGCGCAAAAACUGCUGGUUGGGCUCAACCAGCGUAUAGUCGUCAACGGUCGCACCCAGAGAAACACCAAUACCAUGAAAAAUUACCUUUUGCCCGUAGUGGCCCAGGCAUUUGCUAGGUGGGCAAAGGAAUAUAAGGAAGAUCAAGAAGAUGAAAGGCCACUAGGACUACGAGAUAGACAGUUAGUCAUGGGGUGUUGUUGGGCUUUUAGAAGGCACAAGAUAACAUCUAUUUAUAAGCGCCCGGAUACCCAAACCAUCAUCAAAGUGAACAGCGAUUUCCACUCAUUCGUGCUGCCCAGGAUAGGCAGUAACACAUUGGAGAUCGGGCUGAGAACAAGAAUCAGGAAAAUGUUAGAGGAGCACAAGGAGCCGUCACCUCUCAUUACCGCCGAGGACGUACAAGAAGCUAAGUGCGCAGCCGAUGAGGCUAAGGAGGUGCGUGAAGCCGAGGAGUUGCGCGCAGCUCUACCACCUUUGGCAGCUGAUGUUGAGGAGCCCACUCUGGAAGCCGAUGUCGACUUGAUGUUACAAGAGGCUGGGGCCGGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGUGCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAU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AUGGGCGGCGCAUGAGAGAAGCCCAGACCAAUUACCUACCCAAAAUGGAGAAAGUUCACGUUGACAUCGAGGAAGACAGCCCAUUCCUCAGAGCUUUGCAGCGGAGCUUCCCGCAGUUUGAGGUAGAAGCCAAGCAGGUCACUGAUAAUGACCAUGCUAAUGCCAGAGCGUUUUCGCAUCUGGCUUCAAAACUGAUCGAAACGGAGGUGGACCCAUCCGACACGAUCCUUGACAUUGGAAGUGCGCCCGCCCGCAGAAUGUAUUCUAAGCACAAGUAUCAUUGUAUCUGUCCGAUGAGAUGUGCGGAAGAUCCGGACAGAUUGUAUAAGUAUGCAACUAAGCUGAAGAAAAACUGUAAGGAAAUAACUGAUAAGGAAUUGGACAAGAAAAUGAAGGAGCUGGCCGCCGUCAUGAGCGACCCUGACCUGGAAACUGAGACUAUGUGCCUCCACGACGACGAGUCGUGUCGCUACGAAGGGCAAGUCGCUGUUUACCAGGAUGUAUACGCGGUUGACGGACCGACAAGUCUCUAUCACCAAGCCAAUAAGGGAGUUAGAGUCGCCUACUGGAUAGGCUUUGACACCACCCCUUUUAUGUUUAAGAACUUGGCUGGAGCAUAUCCAUCAUACUCUACCAACUGGGCCGACGAAACCGUGUUAACGGCUCGUAACAUAGGCCUAUGCAGCUCUGACGUUAUGGAGCGGUCACGUAGAGGGAUGUCCAUUCUUAGAAAGAAGUAUUUGAAACCAUCCAACAAUGUUCUAUUCUCUGUUGGCUCGACCAUCUACCACGAGAAGAGGGACUUACUGAGGAGCUGGCACCUGCCGUCUGUAUUUCACUUACGUGGCAAGCAAAAUUACACAUGUCGGUGUGAGACUAUAGUUAGUUGCGACGGGUACGUCGUUAAAAGAAUAGCUAUCAGUCCAGGCCUGUAUGGGAAGCCUUCAGGCUAUGCUGCUACGAUGCACCGCGAGGGAUUCUUGUGCUGCAAAGUGACAGACACAUUGAACGGGGAGAGGGUCUCUUUUCCCGUGUGCACGUAUGUGCCAGCUACAUUGUGUGACCAAAUGACUGGCAUACUGGCAACAGAUGUCAGUGCGGACGACGCGCAAAAACUGCUGGUUGGGCUCAACCAGCGUAUAGUCGUCAACGGUCGCACCCAGAGAAACACCAAUACCAUGAAAAAUUACCUUUUGCCCGUAGUGGCCCAGGCAUUUGCUAGGUGGGCAAAGGAAUAUAAGGAAGAUCAAGAAGAUGAAAGGCCACUAGGACUACGAGAUAGACAGUUAGUCAUGGGGUGUUGUUGGGCUUUUAGAAGGCACAAGAUAACAUCUAUUUAUAAGCGCCCGGAUACCCAAACCAUCAUCAAAGUGAACAGCGAUUUCCACUCAUUCGUGCUGCCCAGGAUAGGCAGUAACACAUUGGAGAUCGGGCUGAGAACAAGAAUCAGGAAAAUGUUAGAGGAGCACAAGGAGCCGUCACCUCUCAUUACCGCCGAGGACGUACAAGAAGCUAAGUGCGCAGCCGAUGAGGCUAAGGAGGUGCGUGAAGCCGAGGAGUUGCGCGCAGCUCUACCACCUUUGGCAGCUGAUGUUGAGGAGCCCACUCUGGAAGCCGAUGUCGACUUGAUGUUACAAGAGGCUGGGGCCGGCUCAGUGGAGACACCUCGUGGCUUGAUAAAGGUUACCAGCUACGAUGGCGAGGACAAGAUCGGCUCUUACGCUGUGCUUUCUCCGCAGGCUGUACUCAAGAGUGAAAAAUUAUCUUGCAUCCACCCUCUCGCUGAACAAGUCAUAGUGAUAACACACUCUGGCCGAAAAGGGCGUUAUGCCGUGGAACCAUACCAUGGUAAAGUAGUGGUGCCAGAGGGACAUGCAAUACCCGUCCAGGACUUUCAAGCUCUGAGUGAAAGUGCCACCAUUGUGUACAACGAACGUGAGUUCGUAAACAGGUACCUGCACCAUAUUGCCACACAUGGAGGAGCGCUGAACACUGAUGAAGAAUAUUACAAAACUGUCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAAUACCUGUACGACAUCGACAGGAAACAGUGCGUCAAGAAAGAACUAGUCACUGGGCUAGGGCUCACAGGCGAGCUGGUGGAUCCUCCCUUCCAUGAAUUCGCCUACGAGAGUCUGAGAACACGACCAGCCGCUCCUUACCAAGUACCAACCAUAGGGGUGUAUGGCGUGCCAGGAUCAGGCAAGUCUGGCAUCAUUAAAAGCGCAGUCACCAAAAAAGAUCUAGUGGUGAGCGCCAAGAAAGAAAACUGUGCAGAAAUUAUAAGGGACGUCAAGAAAAUGAAAGGGCUGGACGUCAAUGCCAGAACUGUGGACUCAGUGCUCUUGAAUGGAUGCAAACACCCCGUAGAGACCCUGUAUAUUGACGAAGCUUUUGCUUGUCAUGCAGGUACUCUCAGAGCGCUCAUAGCCAUUAUAAGACCUAAAAAGGCAGUGCUCUGCGGGGAUCCCAAACAGUGCGGUUUUUUUAACAUGAUGUGCCUGAAAGUGCAUUUUAACCACGAGAUUUGCACACAAGUCUUCCACAAAAGCAUCUCUCGCCGUUGCACUAAAUCUGUGACUUCGGUCGUCUCAACCUUGUUUUACGACAAAAAAAUGAGAACGACGAAUCCGAAAGAGACUAAGAUUGUGAUUGACACUACCGGCAGUACCAAACCUAAGCAGGACGAUCUCAUUCUCACUUGUUUCAGAGGGUGGGUGAAGCAGUUGCAAAUAGAUUACAAAGGCAACGAAAUAAUGACGGCAGCUGCCUCUCAAGGGCUGACCCGUAAAGGUGUGUAUGCCGUUCGGUACAAGGUGAAUGAAAAUCCUCUGUACGCACCCACCUCAGAACAUGUGAACGUCCUACUGACCCGCACGGAGGACCGCAUCGUGUGGAAAACACUAGCCGGCGACCCAUGGAUAAAAACACUGACUGCCAAGUACCCUGGGAAUUUCACUGCCACGAUAGAGGAGUGGCAAGCAGAGCAUGAUGCCAUCAUGAGGCACAUCUUGGAGAGACCGGACCCUACCGACGUCUUCCAGAAUAAGGCAAACGUGUGUUGGGCCAAGGCUUUAGUGCCGGUGCUGAAGACCGCUGGCAUAGACAUGACCACUGAACAAUGGAACACUGUGGAUUAUUUUGAAACGGACAAAGCUCACUCAGCAGAGAUAGUAUUGAACCAACUAUGCGUGAGGUUCUUUGGACUCGAUCUGGACUCCGGUCUAUUUUCUGCACCCACUGUUCCGUUAUCCAUUAGGAAUAAUCACUGGGAUAACUCCCCGUCGCCUAACAUGUACGGGCUGAAUAAAGAAGUGGUCCGUCAGCUCUCUCGCAGGUACCCACAACUGCCUCGGGCAGUUGCCACUGGAAGAGUCUAUGACAUGAACACUGGUACACUGCGCAAUUAUGAUCCGCGCAUAAACCUAGUACCUGUAAACAGAAGACUGCCUCAUGCUUUAGUCCUCCACCAUAAUGAACACCCACAGAGUGACUUUUCUUCAUUCGUCAGCAAAUUGAAGGGCAGAACUGUCCUGGUGGUCGGGGAAAAGUUGUCCGUCCCAGGCAAAAUGGUUGACUGGUUGUCAGACCGGCCUGAGGCUACCUUCAGAGCUCGGCUGGAUUUAGGCAUCCCAGGUGAUGUGCCCAAAUAUGACAUAAUAUUUGUUAAUGUGAGGACCCCAUAUAAAUACCAUCACUAUCAGCAGUGUGAAGACCAUGCCAUUAAGCUUAGCAUGUUGACCAAGAAAGCUUGUCUGCAUCUGAAUCCCGGCGGAACCUGUGUCAGCAUAGGUUAUGGUUACGCUGACAGGGCCAGCGAAAGCAUCAUUGGUGCUAUAGCGCGGCAGUUCAAGUUUUCCCGGGUAUGCAAACCGAAAUCCUCACUUGAAGAGACGGAAGUUCUGUUUGUAUUCAUUGGGUACGAUCGCAAGGCCCGUACGCACAAUUCUUACAAGCUUUCAUCAACCUUGACCAACAUUUAUACAGGUUCCAGACUCCACGAAGCCGGAUGUGCACCCUCAUAUCAUGUGGUGCGAGGGGAUAUUGCCACGGCCACCGAAGGAGUGAUUAUAAAUGCUGCUAACAGCAAAGGACAACCUGGCGGAGGGGUGUGCGGAGCGCUGUAUAAGAAAUUCCCGGAAAGCUUCGAUUUACAGCCGAUCGAAGUAGGAAAAGCGCGACUGGUCAAAGGUGCAGCUAAACAUAUCAUUCAUGCCGUAGGACCAAACUUCAACAAAGUUUCGGAGGUUGAAGGUGACAAACAGUUGGCAGAGGCUUAUGAGUCCAUCGCUAAGAUUGUCAACGAUAACAAUUACAAGUCAGUAGCGAUUCCACUGUUGUCCACCGGCAUCUUUUCCGGGAACAAAGAUCGACUAACCCAAUCAUUGAACCAUUUGCUGACAGCUUUAGACACCACUGAUGCAGAUGUAGCCAUAUACUGCAGGGACAAGAAAUGGGAAAUGACUCUCAAGGAAGCAGUGGCUAGGAGAGAAGCAGUGGAGGAGAUAUGCAUAUCCGACGACUCUUCAGUGACAGAACCUGAUGCAGAGCUGGUGAGGGUGCAUCCGAAGAGUUCUUUGGCUGGAAGGAAGGGCUACAGCACAAGCGAUGGCAAAACUUUCUCAUAUUUGGAAGGGACCAAGUUUCACCAGGCGGCCAAGGAUAUAGCAGAAAUUAAUGCCAUGUGGCCCGUUGCAACGGAGGCCAAUGAGCAGGUAUGCAUGUAUAUCCUCGGAGAAAGCAUGAGCAGUAUUAGGUCGAAAUGCCCCGUCGAAGAGUCGGAAGCCUCCACACCACCUAGCACGCUGCCUUGCUUGUGCAUCCAUGCCAUGACUCCAGAAAGAGUACAGCGCCUAAAAGCCUCACGUCCAGAACAAAUUACUGUGUGCUCAUCCUUUCCAUUGCCGAAGUAUAGAAUCACUGGUGUGCAGAAGAUCCAAUGCUCCCAGCCUAUAUUGUUCUCACCGAAAGUGCCUGCGUAU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【0195】
したがって、好ましくは、RNA構築物は、配列番号39に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0196】
本発明の第2の態様において、第1の態様のRNA構築物をコードする核酸配列が提供される。
【0197】
一実施形態において、核酸配列は、以下の通り、配列番号40を含んでいてもよいし、又はそれからなっていてもよい:
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTAT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GCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号40]
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTAT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GCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号40]
【0198】
したがって、好ましくは、核酸配列は、配列番号40に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0199】
一実施形態において、核酸配列は、以下の通り、配列番号41を含んでいてもよいし、又はそれからなっていてもよい:
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTAT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ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGTATGGCCACCATGGAAGATGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGAACAGCCGGCGAGCAGCTGCACAAGGCCATGAAGAGATACGCCCTGGTGCCCGGCACAATCGCCTTCACCGATGCCCACATCGAGGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTGCGGCTGGCCGAAGCTATGAAGCGCTACGGCCTGAACACCAACCACCGGATCGTCGTGTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGCTGGGCGCCCTGTTTATCGGAGTGGCTGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTGGTGTTCGTGTCCAAGAAGGGACTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAAATCATCATCATGGACAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAGAGCATGTACACCTTCGTGACCAGCCATCTGCCCCCTGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACAATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGACTGCCTAAAGGCGTGGCCCTGCCTCACAGAACTGCCTGCGTGCGGTTTAGCCACGCCCGGGACCCTATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTTGCCAAGAGCACCCTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGTCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCATCTGCCTGGCATCAGACAGGGCTATGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGAAAGGTGGTGCCATTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACACTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAACTGTGTGTGCGGGGACCTATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCTGATTGACAAGGATGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATTGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCAGCCGAGCTGGAATCTATCCTGCTGCAGCACCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCAGGACTGCCCGATGATGATGCTGGCGAACTGCCAGCCGCTGTGGTGGTGCTGGAACACGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCGTGGACTACGTGGCCAGCCAAGTGACCACCGCCAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTTGTGGACGAGGTGCCAAAGGGCCTGACAGGCAAGCTGGACGCCCGGAAGATCAGAGAGATCCTGATTAAGGCCAAGAAAGGCGGCAAGATCGCCGTGGATCGGAGAAAGAGAGGCTCTGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGGACTACGTGTCCCTGCTGAACCAGATTTGGCAGAAGTACCTGAACAGCCCCTACACCACCTGTCTGTACATCCCCAAGCCTACCGCCAAGTACACACCTCTCGTGGGCACATCTCTGCACCCCGTGCTGTGGAATTGCCAGCTGAGCTTTGCCGGCTACACCGAGTCTGCCGTGAACAGCACAAAGGCCCTGGCCAAACAGGACGCCGCTCAGAGAATTGCCTGGCTGCTGCACAAGGATGGCGGCATCCCTGATGGCTGTAGCCTGTACCTGAGACACAGCAGCCTGTTCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAATCCTTCAGCAACTGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[配列番号41]
【0200】
したがって、好ましくは、核酸配列は、配列番号41に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0201】
第3の態様において、第2の態様による核酸配列を含む発現カセットが提供される。
【0202】
本発明の核酸配列は、組換えベクター中に、例えばRNA構築物の生産を可能にするための目的の宿主細胞への送達のための組換えベクター中に、好ましくは含まれる。
【0203】
したがって、第4の態様において、第3の態様による発現カセットを含む組換えベクターが提供される。
【0204】
一実施形態において、ベクターは、以下の通り、配列番号35の核酸配列を含んでいてもよく、この場合「GOI」は、治療用生体分子をコードする配列の位置を表す:
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACC - - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - TGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号35]
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACC - - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - TGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号35]
【0205】
したがって、好ましくは、ベクターは、配列番号35に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0206】
ベクターがMERS-CoV ORF4aを含むRNA構築物をコードする核酸配列を含む実施形態において、ベクターは、以下の通り、配列番号36の核酸配列を含んでいてもよく、この場合「GOI」は、治療用生体分子をコードする配列の位置を表す:
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCC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- - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - CGGAGAAAGAGAGGCTCTGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGGACTACGTGTCCCTGCTGAACCAGATTTGGCAGAAGTACCTGAACAGCCCCTACACCACCTGTCTGTACATCCCCAAGCCTACCGCCAAGTACACACCTCTCGTGGGCACATCTCTGCACCCCGTGCTGTGGAATTGCCAGCTGAGCTTTGCCGGCTACACCGAGTCTGCCGTGAACAGCACAAAGGCCCTGGCCAAACAGGACGCCGCTCAGAGAATTGCCTGGCTGCTGCACAAGGATGGCGGCATCCCTGATGGCTGTAGCCTGTACCTGAGACACAGCAGCCTGTTCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAATCCTTCAGCAACTGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号36]
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACC - - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - CGGAGAAAGAGAGGCTCTGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGGACTACGTGTCCCTGCTGAACCAGATTTGGCAGAAGTACCTGAACAGCCCCTACACCACCTGTCTGTACATCCCCAAGCCTACCGCCAAGTACACACCTCTCGTGGGCACATCTCTGCACCCCGTGCTGTGGAATTGCCAGCTGAGCTTTGCCGGCTACACCGAGTCTGCCGTGAACAGCACAAAGGCCCTGGCCAAACAGGACGCCGCTCAGAGAATTGCCTGGCTGCTGCACAAGGATGGCGGCATCCCTGATGGCTGTAGCCTGTACCTGAGACACAGCAGCCTGTTCGCCCAGAGCGAGGAAGAGGAATCCTTCAGCAACTGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号36]
【0207】
したがって、好ましくは、ベクターは、配列番号36に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0208】
ベクターがPIV5を含むRNA構築物をコードする核酸配列を含む実施形態において、ベクターは、以下の通り、配列番号37の核酸配列を含んでいてもよく、この場合「GOI」は、治療用生体分子をコードする配列の位置を表す:
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCC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- - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - CGGAGAAAGAGAGGCTCTGGCGAAGGCAGAGGCAGCCTGCTTACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCTATGGACCCTACCGACCTGAGCTTCAGCCCCGACGAGATCAACAAGCTGATCGAGACAGGCCTGAACACCGTGGAATACTTCACCAGCCAGCAAGTGACCGGCACAAGCAGCCTGGGCAAGAACACAATTCCTCCAGGCGTGACCGGCCTGCTGACAAATGCTGCCGAGGCCAAGATCCAAGAGAGCACCAACCACCAGAAGGGCTCTGTTGGAGGCGGAGCCAAGCCTAAGAAGCCCAGACCTAAGATCGCCATCGTGCCCGCCGACGATAAGACAGTGCCTGGCAAGCCCATTCCTAATCCTCTGCTGGGCCTCGACAGCACCCCTAGCACACAGACAGTGCTGGATCTGAGCGGCAAGACACTGCCTAGCGGCAGCTATAAGGGCGTGAAGCTGGCCAAGTTCGGCAAAGAAAACCTGATGACCCGGTTCATCGAGGAACCCAGAGAGAACCCTATCGCCACCAGCTCTCCCATCGACTTCAAGAGAGGCAGAGACACCGGCGGCTTCCACAGAAGAGAGTACAGCATTGGCTGGGTCGGAGATGAAGTGAAAGTGACCGAGTGGTGCAACCCCAGCTGCAGCCCTATTACAGCCGCCGCTAGAAGATTCGAGTGCACCTGTCACCAGTGTCCTGTGACCTGTAGCGAGTGCGAGCGGGACACATGATGAGCGGCCGCGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCG
GAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号37]
CGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGCCACC - - - - - - - - - - - - - - - - GOI - - - - - - - - - - - - - - - - - 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GAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAA[配列番号37]
【0209】
したがって、好ましくは、ベクターは、配列番号37に実質的に記載された通りのヌクレオチド配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む。
【0210】
本発明のsaRNA構築物は、テンプレートとして図7又は8に示されるDNAプラスミドを使用して作製されてもよい。次いでRNAコピーは、ポリメラーゼ、例えばT7ポリメラーゼを使用したインビトロにおける転写によって作製されてもよく、T7プロモーターは、図7又は8のプラスミドマップにおいてsaRNAの上流に示される。したがって、第1の態様のsaRNA構築物は、テンプレートとして、図7又は8に示される配列番号35～37のいずれか1つにされる通りの核酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を有するDNAプラスミドを使用して作製されてもよい。当然ながら、T7ポリメラーゼの代わりに、他のRNAポリメラーゼを使用してもよく、例えばSP6又はT3ポリメラーゼを使用してもよく、この場合、saRNA構築物は、代わりにSP6又はT3プロモーターを含んでいてもよいことが理解されるであろう。
【0211】
第1の態様のRNA構築物をコードする第4の態様のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド又はファージであってもよいし、及び/又はウイルスベクターであってもよい。このような組換えベクターは、ヌクレオチド配列で細胞を形質転換するための本発明の送達系において極めて有用である。ヌクレオチド配列は、好ましくはDNA配列であってもよく、第1の態様のRNA構築物を形成するRNA配列をコードするのはこのDNA配列である。
【0212】
第1の態様のRNA構築物をコードする組換えベクターはまた、他の機能的なエレメントを含んでいてもよい。例えば、それらは、宿主細胞にベクターが導入されると導入遺伝子発現を開始させるための好適なプロモーター等の様々な他の機能的なエレメントを更に含んでいてもよい。例えば、ベクターは、好ましくは、宿主細胞、例えば細菌細胞の核において自律複製が可能である。この場合、DNA複製を誘導又は調節するエレメントが組換えベクターに必要な場合がある。代替として、組換えベクターは、それが宿主細胞のゲノムに統合されるように設計されてもよい。この場合、標的化された統合(例えば、相同組換えによる)に有利なDNA配列が想定される。好適なプロモーターとしては、例として、SV40プロモーター、CMV、EF1a、PGK、ウイルスロングターミナルリピート、加えて、誘導性プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導系を挙げることができる。カセット又はベクターはまた、ターミネーター、例えばベータグロビン、SV40ポリアデニル化配列又は合成ポリアデニル化配列も含んでいてもよい。組換えベクターはまた、必要に応じて核酸の発現を制御するためのプロモーター又はレギュレーター又はエンハンサーも含んでいてもよい。
【0213】
ベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能マーカーとして使用できる遺伝子、すなわち、トランスフェクト又は形質転換された細胞の選択が可能になるように、また、異種DNAを取り込んだベクターを内包する細胞の選択が可能になるように使用できる遺伝子をコードするDNAも含んでいてもよい。例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシン又はクロラムフェニコール耐性が想定される。図7及び8に示されるベクターは、細菌においてプラスミドを選択するのに有用なアンピシリン耐性マーカーを含む。代替として、選択可能なマーカー遺伝子は、導入遺伝子を含有するベクターと同時に使用できるように、異なるベクター中であってもよい。カセット又はベクターはまた、ヌクレオチド配列の発現を調節することに関与するDNA、又は発現されたポリペプチドを宿主細胞の特定の一部に標的化するためのDNAも含んでいてもよい。
【0214】
精製されたベクターは、好適な手段、例えば直接のエンドサイトーシスによる取込みによって、宿主細胞に直接挿入されてもよい。ベクターは、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道衝撃によって、宿主細胞(例えば、真核又は原核細胞)に直接導入されてもよい。代替として、本発明のベクターは、パーティクルガンを使用して宿主細胞に直接導入されてもよい。
【0215】
核酸分子は、宿主細胞のDNAに取り込まれるようになるものであってもよい(ただし必ずしもそうでなくてもよい)。未分化細胞は、安定して形質転換することができ、遺伝子改変された娘細胞の生産をもたらす(この場合、対象における発現の調節は、例えば特異的な転写因子又は遺伝子活性剤を必要とする場合がある)。代替として、送達系は、分化細胞の不安定な、又は一時的な形質転換を選ぶように設計することができる。この場合、形質転換細胞が死ぬか又はタンパク質の発現をやめた場合、DNA分子の発現は止まるであろうことから、発現の調節は、それほど重要ではないことがある。
【0216】
代替として、送達系は、ベクターに取り込ませずに宿主細胞に核酸分子を提供することができる。例えば、核酸分子は、リポソーム又はウイルス粒子内に取り込ませてもよい。代替として、「裸の」核酸分子が、好適な手段、例えば直接のエンドサイトーシスによる取込みによって宿主細胞に挿入されてもよい。
【0217】
第5の態様において、第1の態様のRNA構築物、第2の態様の核酸配列、第3の態様の発現カセット又は第4の態様のベクター、及び薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物が提供される。
【0218】
第6の態様において、第5の態様による医薬組成物を作製するための方法が提供され、この方法は、第1の態様のRNA構築物、第2の態様の核酸配列、第3の態様の発現カセット、又は第4の態様のベクターを、薬学的に許容されるビヒクルと接触させる工程を含む。
【0219】
第7の態様において、第1の態様のRNA構築物を調製する方法であって、
a)i)第4の態様のベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
ii)第1の態様のRNA構築物の生産をもたらす条件下で、宿主細胞を培養する工程;又は
b)第4の態様によるベクターからRNA構築物を転写する工程
を含む、方法が提供される。
a)i)第4の態様のベクターを宿主細胞に導入する工程;及び
ii)第1の態様のRNA構築物の生産をもたらす条件下で、宿主細胞を培養する工程;又は
b)第4の態様によるベクターからRNA構築物を転写する工程
を含む、方法が提供される。
【0220】
工程a)の宿主細胞は、真核又は原核宿主細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、真核宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞であり、例えばヒト胎児腎臓293細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。工程(b)は、インビトロ又はインビボで、好ましくはインビトロで実行してもよい。
【0221】
インビトロにおける転写の好適な方法は当業界において周知であり、当業者に公知であろう。例えば、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989) editor C Nolan、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載された通りである。
【0222】
第1の態様のRNAレプリコンが、療法にとって特に好適である。
【0223】
本発明者らは、第1の態様のRNA構築物は、療法におけるインビボでの使用のためにインビトロでの転写によって生成されることを想定したが、当業者は、RNA構築物は、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクターをインビボで対象に送達することによって、療法に関わる対象においてインビボで生成できることを認識しているであろう。
【0224】
したがって、第8の態様によれば、医薬として、又は療法において使用するための、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物が提供される。
【0225】
本発明の第9の態様において、原生動物、真菌、細菌又はウイルス感染の防止、改善又は処置で使用するための第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物が提供される。
【0226】
原生動物、真菌、細菌又はウイルス感染は、第1の態様で定義された通りの原生動物、真菌、細菌又はウイルスの感染であってもよい。
【0227】
本発明の第10の態様において、がんの防止、改善又は処置で使用するための、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物が提供される。
【0228】
がんは、第1の態様で定義された通りであってもよい。
【0229】
本発明の第11の態様において、原生動物、真菌、細菌又はウイルス感染を処置するための方法であって、治療有効量の、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【0230】
処置しようとする原生動物、真菌、細菌又はウイルス感染は、第1の態様で定義された通りの原生動物、真菌、細菌又はウイルスの感染であってもよい。
【0231】
本発明の第12の態様において、がんを処置するための方法であって、治療有効量の、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【0232】
処置しようとするがんは、第1の態様で定義された通りであってもよい。
【0233】
本明細書に記載されるRNA構築物は、対象にウイルス感染及びがんに対するワクチン接種する有効な手段を提供する。
【0234】
したがって、本発明の第13の態様において、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物を含むワクチンが提供される。
【0235】
好ましくは、ワクチンは、好適なアジュバントを含む。
【0236】
アジュバントは、第1の態様のRNA構築物配列、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物にコードされている、又は送達配合物に取り込まれたアジュバントとしての、コードされた分子アジュバントであってもよい。
【0237】
コードされた分子アジュバントは、サイトカイン、例えばIL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-g、又はエフェクタータンパク質、例えばCD40L、Flt-3又は微生物タンパク質、例えばフラジェリン又はコレラ毒素Bをコードしていてもよい。
【0238】
送達配合物に取り込まれたアジュバントは、細菌のリポペプチド、リポタンパク質及びリポタイコ酸;マイコバクテリアのリポグリカン;酵母ザイモサン、ポリン、リポ多糖、リピドA、モノホスホリルリピドA(MPL)、フラジェリン、CpG DNA、ヘモゾイン、サポニン(Quil-A、QS-21、トマチン、ISCOM、ISCOMATRIXTM)、スクアレンベースのエマルジョン、PEI、カーボポール等のポリマー、脂質ナノ粒子及び細菌毒素(CT、LT)からなる群から選択してもよい。
【0239】
本発明の第14の態様において、対象において免疫応答を刺激することに使用するための、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物が提供される。
【0240】
第1の態様で定義された抗原のように、原生動物、細菌、ウイルス、真菌又はがんに対する免疫応答が刺激されてもよい。
【0241】
第15の態様によれば、幹細胞療法で使用するための、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物が提供される。
【0242】
幹細胞療法は、体細胞を幹細胞の特徴を有する細胞に再プログラミングすることに関するものであってもよい。
【0243】
体細胞は、第1の態様で定義された通りの幹細胞の特徴を有する細胞への体細胞の再プログラミングを強化することが可能な1種又は複数のタンパク質を送達することによって、再プログラムされてもよい。
【0244】
第16の態様によれば、エクスビボ又はインビトロにおいて細胞を改変する方法であって、第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物を細胞に送達する工程を含む、方法が提供される。
【0245】
好ましくは、本方法は、エクスビボで実行される。
【0246】
細胞は、真核又は原核細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、真核細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳類宿主細胞である。最も好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。
【0247】
好ましくは、改変された細胞は、細胞療法の指示に好適である。
【0248】
第17の態様において、第16の態様の方法から得られた、又はそれによって入手可能な改変された細胞が提供される。
【0249】
第18の態様において、療法、任意選択で細胞療法で使用するための、第17の態様の改変された細胞が提供される。
【0250】
第1の態様によるRNA構築物、第2の態様による核酸、第3の態様による発現カセット、第4の態様によるベクター、又は第5の態様による医薬組成物(本明細書では活性薬剤として公知)は、医薬において使用でき、これらは、疾患を処置する、改善する、若しくは防止するための、又はワクチン接種のための単独療法剤として使用できる(すなわち活性薬剤の使用)ことが理解されるであろう。代替として、本発明に係る活性薬剤は、疾患を処置する、改善する、又は防止するための公知の療法への補助剤として、又はそれと組み合わせて使用することができる。
【0251】
本発明のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、特定には組成物が使用されることになる方式に応じて、多数の異なる形態を有する組成物で組み合わせてもよい。したがって、例えば、組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、エアロゾル剤、スプレー剤、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁剤、ポリプレックス、乳剤、脂質ナノ粒子(表面上にRNAを有するか、又はカプセル化された)の形態、又は処置又はワクチン接種が必要なヒト又は動物に投与できる他の任意の好適な形態であってもよい。本発明に係る医薬のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものであるべきであることが理解されるであろう。
【0252】
本発明のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物はまた、持続又は遅延放出デバイス内に取り込まれていてもよい。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上又は下に挿入されてもよく、医薬は、数週間にわたり、又は数か月にもわたって放出させてもよい。デバイスは、少なくとも隣接した処置部位に配置されてもよい。遺伝学的構築物又は組換えベクターでの長期処置が必要であり、通常、その頻繁な投与(例えば少なくとも毎日の注射)を必要とする場合、このようなデバイスは特に有利な場合がある。
【0253】
しかしながら、好ましい実施形態において、本発明に係る医薬は、血流、筋肉、皮膚への注射、又は処置を必要とする部位への直接的な注射によって、対象に投与することができる。最も好ましくは、RNA構築物を含む医薬は、筋肉に注射される。注射は、静脈内(ボーラス又は輸注)、又は皮下(ボーラス又は輸注)、又は皮内(ボーラス又は輸注)、又は筋肉内(ボーラス又は輸注)であってもよい。
【0254】
必要なRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の量は、その生物学的活性及び生物学的利用率によって決定され、これは順に、投与様式、RNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の生理化学特性、及びそれが単独療法として使用されるのか、又は併用療法で使用されるのかに依存することが理解されるであろう。投与の頻度はまた、処置されている対象内での活性薬剤の半減期によっても影響を受けると予想される。投与される最適な投薬量は当業者によって決定することができ、使用される特定のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物、医薬組成物の強度、投与様式、並びにウイルス感染のタイプ及び進行程度に応じて様々であると予想される。処置されている特定の対象に応じて追加の要因、例えば対象の年齢、体重、性別、食事、及び投与時間等によって、投薬量を調整する必要性が生じると予想される。
【0255】
一般的に、疾患を処置する、改善する、又は防止するために、使用される活性薬剤に応じて、0.001μg/体重kgから10mg/体重kgの間、又は0.01μg/体重kgから1mg/体重kgの間の本発明のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の1日用量を使用することができる。
【0256】
1日用量は、単回投与(例えば単回の毎日の注射又は鼻内噴霧の吸入)として与えてもよい。代替として、RNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、1日の間に2回又はそれより多くの回数の投与を必要とする場合もある。一例として、RNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、0.07μgから700mgの間(すなわち体重70kgと仮定して)の2回の(又は処置されている疾患の重症度に応じてそれより多くの)1日用量として投与されてもよい。処置を受ける患者は、起きているときに第1の用量を摂取し次いで第2の用量を、夕方に(2用量レジメンでの場合)、又はその後3又は4時間のインターバルで摂取してもよい。代替として、遅延放出デバイスは、反復用量を投与する必要なくとも、本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の最適な用量を患者に提供するのに使用することができる。
【0257】
しかしながら、好ましくは、本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、週1回の用量、より好ましくは2週間に1回の用量として与えてもよい。
【0258】
公知の手順、例えば医薬産業(例えばインビボにおける実験、臨床治験等)により慣習的に採用される手順を使用して、本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット又はベクターの具体的な配合物及び正確な治療レジメン(例えば薬剤の1日用量及び投与頻度)を形成することができる。
【0259】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、又は飼育動物であってもよい。したがって、本発明に係る組成物及び医薬は、あらゆる哺乳動物、例えば家畜(例えばウマ)、ペットを処置するのに使用でき、又は他の獣医学的用途に使用することができる。しかしながら、最も好ましくは、対象は、ヒトである。
【0260】
RNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の「治療有効量」は、対象に投与される場合、あらゆる所与の疾患を改善、防止又は処置するのに必要な前述のものの量である、任意の量である。
【0261】
例えば、約0.0001mg～約800mg、好ましくは約0.001mg～約500mgの本発明のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物を使用してもよい。レプリコン、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物の量は、好ましくは、約0.01mg～約250mgであり、最も好ましくは約0.01mg～約1mgの量である。好ましくは、本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、1～200μgの用量で投与される。
【0262】
「薬学的に許容されるビヒクル」は、本明細書で言及される場合、医薬組成物を製剤化することにおいて有用であることが当業者公知であるあらゆる公知の化合物又は公知の化合物の組合せである。
【0263】
一実施形態において、薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってもよいし、組成物は、散剤又は錠剤の形態でであってもよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルとしては、矯味矯臭剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、増量剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性な結合剤、甘味料、保存剤、色素、コーティング、又は錠剤崩壊剤として作用し得る1つ又は複数の物質を挙げることができる。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。散剤において、ビヒクルは、本発明に係る微粉化した活性薬剤と混和された状態の微粉化された固体である。錠剤において、活性薬剤(例えば本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物)は、好適な比率で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され、所望の形状及びサイズに圧縮されてもよい。散剤及び錠剤は、好ましくは、最大99%の活性薬剤を含有する。好適な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン(polyvinylpyrrolidine)、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態において、医薬用ビヒクルは、ゲルであってもよく、組成物は、クリーム等の形態でであってもよい。
【0264】
しかしながら、医薬用ビヒクルは、液体であってもよく、医薬組成物は、液剤の形態である。液体ビヒクルは、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤及び加圧された組成物を調製することにおいて使用される。本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば水、有機溶媒、その両方の混合物又は薬学的に許容される油若しくは脂肪中に溶解又は懸濁されていてもよい。液体ビヒクルは、他の好適な医薬用添加剤、例えば可溶化剤、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味料、矯味矯臭剤、懸濁化剤、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定剤又は浸透圧調節剤を含有していてもよい。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例としては、水(一部、上述したような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含有する)、アルコール(一価アルコール及び多価アルコール等、例えばグリコール)及びそれらの誘導体、並びに油(例えば分画されたヤシ油及び落花生油)が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、油性エステル、例えばオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液状組成物において有用である。加圧した組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される噴射剤であってもよい。
【0265】
液体医薬組成物は、滅菌溶液又は懸濁液であり、これらは、例えば、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外、腹膜内、静脈内、特定には筋肉内注射によって利用することができる。本発明の核酸配列、又は発現カセットは、投与のときに、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注射用媒体を使用して溶解又は懸濁が可能な滅菌固体組成物として調製することができる。
【0266】
本発明のRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、他の溶質又は懸濁化剤(例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水又はグルコース)、胆汁酸塩、アラビアガム、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート(sorbitan monoleate)、ポリソルベート80(エチレンオキシドと共重合されたソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル)等を含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で、経口投与してもよい。本発明に係るRNA構築物、核酸配列、発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、液体又は固体組成物の形態のいずれかで経口投与してもよい。経口投与に好適な組成物としては、固体の形態、例えば丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び散剤、並びに液体の形態、例えば液剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳剤、及び懸濁剤が挙げられる。
【0267】
本発明は、それらのバリアント又は断片を含む本明細書で言及された配列のいずれかのアミノ酸又は核酸配列を実質的に含む、あらゆる核酸又はペプチド又はバリアント、それらの誘導体又はアナログに及ぶことが理解されるであろう。用語「実質的にアミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列」、「バリアント」及び「断片」は、本明細書で言及された配列のいずれか1つのアミノ酸/ヌクレオチド/ペプチド配列と少なくとも40%の配列同一性を有する配列、例えば、40配列番号1～55として同定された配列等と%の同一性を有する配列であり得る。
【0268】
また、言及される配列のいずれかと、65%より高い、より好ましくは70%より高い、更により好ましくは75%より高い、更により一層好ましくは80%より高い配列同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと、少なくとも85%の同一性を有し、より好ましくは、本明細書で言及された配列のいずれかと、少なくとも90%の同一性、より一層好ましくは少なくとも92%の同一性、より一層好ましくは少なくとも95%の同一性、より一層好ましくは少なくとも97%の同一性、より一層好ましくは少なくとも98%の同一性、最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【0269】
熟練した技術者であれば、どのように2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算するかを認識しているであろう。2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算するために、まず2つの配列のアライメントを用意しなければならず、それに続いて配列同一性の値が計算される。2つの配列の同一性パーセンテージは、(i)配列をアライメントするのに使用される方法、例えば、ClustalW、BLAST、FASTA、スミス-ウォーターマン(異なるプログラムで実行される)、又は3D比較からの構造的なアライメント;並びに(ii)アライメント方法によって使用されるパラメーター、例えば、ローカルアライメントとそれに対するグローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス(例えばBLOSUM62、PAM250、Gonnet等)、及びギャップペナルティー、例えば機能的な形態及び定数に応じて異なる値をとる場合がある。
【0270】
アライメントが作製されたら、2つの配列間の同一性パーセンテージを計算する多くの様々な方法がある。例えば、1つは、(i)最も短い配列の長さ;(ii)アライメントの長さ;(iii)配列の平均長さ;(iv)非ギャップ位置の数;又は(v)オーバーハングを排除した同等化された位置の数で同一性の数値を割る方法であり得る。更に、同一性パーセンテージはまた、長さにも強く依存することが理解されるであろう。それゆえに、配列の対が短いほど、偶然生じる可能性がある配列同一性がより高くなる。
【0271】
したがって、タンパク質又はDNA配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアライメントプログラムであるClustalW(Thompson等、1994、Nucleic Acids Research、22、4673-4680;Thompson等、1997、Nucleic Acids Research、24、4876-4882)が、本発明に従ってタンパク質又はDNAのマルチプルアライメントを作成するための好ましい方法である。ClustalWのための好適なパラメーターは、以下の通りであり得る:DNAアライメントの場合:GAPオープンペナルティー=15.0、GAP伸長ペナルティー=6.66、及びマトリックス=Identity。タンパク質アライメントの場合:GAPオープンペナルティー=10.0、GAP伸長ペナルティー=0.2、及びマトリックス=Gonnet。DNA及びタンパク質アライメントの場合:ENDGAP=-1、及びGAPDIST=4。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれらの及び他のパラメーターを変更することが必要な場合があることを認識しているであろう。
【0272】
好ましくは、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、次いで、このようなアライメントから(N/T)×100として計算することができ、この場合、Nは、配列が同一な残基を共有する位置の数であり、Tは、ギャップを含めて、更に、オーバーハングを含むか又は排除するかのいずれかで比較した位置の総数である。好ましくは、オーバーハングは、計算に含まれる。したがって、2つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、(i)ClustalWプログラムを使用して、好適なパラメーターのセット、例えば、上記で詳述したようなものを使用して、配列アライメントを用意すること;及び(ii)N及びTの値を以下の式:配列同一性=(N/T)×100に挿入することを含む。
【0273】
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者公知であると予想される。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でDNA配列又はその相補物にハイブリダイズする配列によってコードされると予想される。ストリンジェントな条件は、本発明者らによれば、ヌクレオチドが、3×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、およそ45℃で、フィルターに結合したDNA又はRNAにハイブリダイズし、それに続いて0.2×SSC/0.1%SDS中、およそ20～65℃で少なくとも1回洗浄することを意味する。代替として、実質的に類似したポリペプチドは、例えば配列番号1～57に示される配列と、少なくとも1つ、ただし5、10、20、50又は100個未満のアミノ酸が異なるものであってもよい。
【0274】
遺伝子コードの縮重によって、本明細書に記載されるあらゆる核酸配列を、それによってコードされたタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく変更したり又は変化させたりして、その機能的なバリアントを提供することが可能であることは明らかである。好適なヌクレオチドバリアントは、その配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更され、それによりサイレント(同義の)変化を生じる配列を有するものである。他の好適なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化を生じるように、置換されるアミノ酸と類似の生物物理学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列の全て又は一部を含むものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンが挙げられる。大きい非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正電荷を有する(塩基性)アミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換え可能かは理解されているものと予想され、熟練した技術者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列をわかっているであろう。
【0275】
本明細書に記載される特色(任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む)の全て、及び/又はそのようにして開示され任意の方法又はプロセスの工程の全てが、上記の態様のいずれかと任意の組合せで組み合わせることができるが、このような特色及び/又は工程の少なくとも一部が相互排他的な組合せを除く。
【0276】
本発明をよりよく理解するために、また、どのようにその実施形態を実行できるかを示すために、ここで例として添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0277】
【図1】ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)主鎖をベースとする自己増幅RNAレプリコン又は構築物の一実施形態の概略図を示す。いわゆる「ステアルチコン」ベクターは、GOI(目的の遺伝子)の上流又は下流である、非構造タンパク質(NSP1-4)、及び生来の阻害タンパク質(IIP)をコードするsaRNAレプリコン/構築物である。
【図2】ゲノム複製が、センサー分子であるMDA5及びPACTによって認識されるdsRNAをもたらすことを示す図である。これらのセンサーはシグナルを送って、転写因子(NF-κB、IRF-3、-7)、RNA増幅とタンパク質発現を直接的に阻害する制限因子の活性化(点線)を含む下流のカスケードを活性化する。合成RNAからのレプリコンRNA増幅及びタンパク質発現を制限する下流のカスケードの活性化を防止するMDA5及びPACTによって、PIV-V又はORF4aの発現は、dsRNAの生来の認識をブロックする。
【図3a】インビトロにおけるIIPコードVEEVレプリコンのスクリーニングを示す図である。細胞を、レポータータンパク質としてルシフェラーゼを含有するRNAの2つのバッチでトランスフェクトし、24時間後にタンパク質発現に関して評価した。HeLa及びMRC5は、HEKと比較してより無傷のIFN発現経路を有することが公知である。
【図4】レポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼを使用した、BALB/c及びBL/6マウスにおけるIIPコードレプリコン(#6及び#8)のスクリーニングを示す図である。BL/6マウスは、BALB/cより多くのIFNを発現することが公知であり、したがってIIPは、3日でより多くのルシフェラーゼ発現、更に、14日より長く続くより長い発現を可能にした。
【図5】レポータータンパク質としてガウシアルシフェラーゼを使用した、BALB/c及びBL/6マウスにおけるIIPコードレプリコン(#6及び#8)のスクリーニングを示す図である。BL/6マウスは、BALB/cより多くのIFNを発現することが公知であり、したがってIIPは、14日より長く続く可溶性レポータータンパク質のより長い発現を可能にした。
【図6】GOIを含むRNA構築物をコードする発現ベクターの一実施形態の構築物マップを示す図である。
【図7】GOI-MERS-CoV ORF4aを含むRNA構築物をコードする発現ベクターの一実施形態の構築物マップを示す図である。
【図8】GOI-PIV5を含むRNA構築物をコードする発現ベクターの一実施形態の構築物マップを示す図である。
【図9a】本発明の構築物、及びインビトロにおける野生型及びIIP VEEVレプリコンからのタンパク質発現の概略図を示す図である。野生型及びcisコード化IIP VEEVレプリコンの概略図。
【図9b】本発明の構築物、及びインビトロにおける野生型及びIIP VEEVレプリコンからのタンパク質発現の概略図を示す図である。自己増幅RNAの生来の感知の概略図。
【図9c】本発明の構築物、及びインビトロにおける野生型及びIIP VEEVレプリコンからのタンパク質発現の概略図を示す図である。インビトロにおける相対発光量(RLU)として測定されたHEK293T.17、HeLa及びMRC5細胞におけるホタルルシフェラーゼsaRNAのトランスフェクション。バーは、n=3の場合の野生型VEEV対照に正規化した平均変化倍数±標準偏差を表す。
【図10】C57BL6/JマウスにおけるWT及びMERS CoV-2レプリコンの用量滴定を示す図である。タンパク質発現を、0.2、2又は20μgのRNAのいずれかの筋肉内注射の後の7及び10日目に定量化した。各ドットは、単一のマウスを表し、バーは、n=10での平均±SEMを表す。*は、クラスカル-ウォリスの検定を多重比較と共に使用して評価した場合のp<0.05の有意性を示す。
【図11】C57BL6/JマウスにおけるWT及びMERS CoV_2レプリコンとJAK阻害剤であるルキソリチニブとの共配合物を示す図である。タンパク質発現を、5μgのRNAのいずれかと100ugのルキソリチニブの筋肉内注射の後の4、7、10及び14日目(それぞれa、b、c、及びd)に定量化した。各ドットは、単一のマウスの脚を表し、バーは、n=10での平均±SEMを表す。
【図12】ヒト皮膚外植片におけるeGFP±MERS CoV_2RNA(これはMERS-CoV ORF4aに対応する)(0.2、2又は20μg)(a、b)又は±ルキソリチニブ(0.1、1、10又は100μg)(c、d)のタンパク質発現を示す図である。eGFP発現細胞(GFP+細胞の%)の数(a、c)及び細胞当たりの総タンパク質発現(GFP蛍光強度中央値(MFI))(b、d)を、注射後の72時間に定量化した。各ドットは、n=3での平均±SEMを表す。*は、クラスカル-ウォリスの検定を多重比較と共に使用して評価した場合のp<0.05の有意性を示す。
【図13】ウサギにおけるRABV±MERS-CoV_2(これはMERS-CoV ORF4aに対応する)の免疫原性を示す図である。a)n=5での、0及び4週における20μgのプライム及びブーストでの筋肉内免疫化の後のRABV抗原特異的なIgGの抗体力価。b)n=5でのシュードタイプ化RABVウイルスに対する中和IC50であり、灰色の点線は、検出限界を表す。*は、クラスカル-ウォリスの検定を多重比較と共に使用して評価した場合のp<0.05の有意性を示す。
【図14】インビトロにおける相対発光量(RLU)として測定されたHEK293T.17、HeLa及びMRC5細胞におけるホタルルシフェラーゼsaRNAのトランスフェクションを示す図である。バーは、n=3での平均±標準偏差対照を表す。「a」及び「b」は、2つの別々に調製されたRNAのバッチを示す。
【図15】インビトロにおける相対発光量(RLU)として測定されたa)マウス(MEF)、b)ウサギ(RK13)、c)非ヒト霊長類(LLC)及びd)ヒト(MRC5)細胞におけるWT fLuc、MERS-CoV_2 ORF4a及びPIV-5RNAのトランスフェクションを示す図である。バーは、n=3での平均±標準偏差対照を表す。
【図16】インビボにおけるBALB/c及びC57BL6/Jマウスにおける細胞内(ホタルルシフェラーゼ)及び分泌された(ガウシアルシフェラーゼ)タンパク質のルシフェラーゼ発現を示す図である。タンパク質発現を、インビボにおける画像化システム(IVIS)を使用して筋肉(a、c、e)又は血清(b、d、f)のいずれかにおいて、3日目(a、b)、7日目(c、d)及び14日目(e、f)に定量化した。各ドットは、単一のマウスを表し、バーは、fLucではn=10での、及びgLucではn=5での平均±SEMを表す。
【図17】0.2μgのeGFP RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図18】2μgのeGFP RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図19】20μgのeGFP RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図20】0.2μgのeGFP-PIV-5 RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図21】2μgのeGFP-PIV-5 RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図22】20μgのeGFP-PIV-5 RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図23】0.2μgのeGFP-MERS-CoV_2 RNA(これはMERS-CoV ORF4aに対応する)で処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図24】2μgのeGFP-MERS-CoV_2 RNAで処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図25】20μgのeGFP-MERS-CoV_2 RNA(これはMERS-CoV ORF4aに対応する)で処置したヒト皮膚外植片の表現型(青色)によって分離したeGFP+細胞(緑色)のゲーティングを上に重ねた生細胞(灰色)の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)プロットを示す図である。
【図26a】フローサイトメトリーによって決定された、eGFP±ruxo配合物の皮内(ID)注射後におけるヒト皮膚外植片に存在する細胞及びGFP+細胞の表現型の同一性を示す図である。ヒト皮膚外植片から抽出された総細胞の集団における細胞と、n=3での2μgのeGFPをコードするsaRNA±0.1、1、10又は100μgのruxoで処置された外植片からのGFPを発現する皮膚細胞における同一性。
【図26b】フローサイトメトリーによって決定された、eGFP±ruxo配合物の皮内(ID)注射後におけるヒト皮膚外植片に存在する細胞及びGFP+細胞の表現型の同一性を示す図である。GFPを発現する各表現型の細胞のパーセンテージ。以下の抗体:上皮細胞(CD45-)、線維芽細胞(CD90+)、NK細胞(CD56+)、白血球(CD45+)、ランゲルハンス細胞(CD1a+)、単球(CD14+)、樹状細胞(CD11c+)、T細胞(CD3+)、及びB細胞(CD19+)を使用して同定された細胞。
【図27】マウス及びラットにおけるRABV±MERS-CoV_2(これはMERS-CoV ORF4aに対応する)の免疫原性を示す図である。a)n=5での0及び4週における1μgのプライム及びブーストでのマウスの筋肉内免疫化の後のRABV抗原特異的なIgGの抗体力価。b)n=5でのシュードタイプ化RABVウイルスに対するマウスの中和IC50であり、灰色の点線は、検出限界を表す。a)n=5での0及び4週における20μgのプライム及びブーストでのラットの筋肉内免疫化の後のRABV抗原特異的なIgGの抗体力価。b)n=5でのシュードタイプ化RABVウイルスに対するラットの中和IC50であり、灰色の点線は、検出限界を表す。
【図28】saRNA感知におけるPIV-5 V及びMERS-CoV ORF4aの提唱されているメカニズムの概略図を示す図である。
【図29】生来の阻害タンパク質、MERS-ORF4aと共に発現させた場合の、SARS-CoV-2糖タンパク質のみをコードするsaRNA(すなわちIIPなし)と比較した、HeLa細胞における本発明の一実施形態によるsaRNAからのSARS-CoV-2糖タンパク質の発現の増加を示す蛍光強度中央値(MFI)データを示す図である。
【実施例】
【0278】
本発明者らは、saRNAの生来の認識を阻害することが公知であるウイルスからのcisコード化タンパク質が、生来の感知を低下させ、saRNAワクチンのタンパク質発現と免疫原性の両方を強化するとという仮説を立てた。したがって、本発明者らは、様々な生来の阻害タンパク質(IIP)及び目的の遺伝子を含有するRNAレプリコンを設計し、試験し、次いで、これらのレプリコンが、細胞内タンパク質と分泌されたタンパク質(目的の遺伝子によってコードされた)の両方の発現を強化するかどうかを特徴付けた。
【0279】
材料及び方法
生来の阻害タンパク質(IIP)レプリコンのクローニング
ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)、狂犬病糖タンパク質(RABV)及びベネズエラウマ脳炎由来のレプリカーゼをコードする自己増幅RNAを、これまでに記載されたようにして(53)、プラスミドベクターにクローニングした。インターフェロン阻害タンパク質のライブラリーを、T2A切断部位を有する目的の遺伝子(fLuc、GLuc、eGFP又はRABV)の一部として、これらのベクター主鎖にクローニングした(GenBank受託番号AAC97195.1)。インターフェロン阻害タンパク質は、以下のGenBank受託番号:HSV-2Us1(Z86099.2)、HSV-1Us1(AWO69381.1)、HSV-1Us11(YP_009137147.1)、OV20.0L(AF053969.1)、BVDV Npro(AIE38066.1)、PIV-5V(YP_138513.1)、MERS-CoV M(AHC74104.1)、MERS-CoV ORF4a(AHC74090.1)、ランガットウイルスNS5(AF253420)及びインフルエンザウイルスNS1(DQ508893.1)で見出すことができる。マウスにおける研究のために、N100D突然変異を有するPIV-5Vタンパク質を使用した(45)。
生来の阻害タンパク質(IIP)レプリコンのクローニング
ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)、狂犬病糖タンパク質(RABV)及びベネズエラウマ脳炎由来のレプリカーゼをコードする自己増幅RNAを、これまでに記載されたようにして(53)、プラスミドベクターにクローニングした。インターフェロン阻害タンパク質のライブラリーを、T2A切断部位を有する目的の遺伝子(fLuc、GLuc、eGFP又はRABV)の一部として、これらのベクター主鎖にクローニングした(GenBank受託番号AAC97195.1)。インターフェロン阻害タンパク質は、以下のGenBank受託番号:HSV-2Us1(Z86099.2)、HSV-1Us1(AWO69381.1)、HSV-1Us11(YP_009137147.1)、OV20.0L(AF053969.1)、BVDV Npro(AIE38066.1)、PIV-5V(YP_138513.1)、MERS-CoV M(AHC74104.1)、MERS-CoV ORF4a(AHC74090.1)、ランガットウイルスNS5(AF253420)及びインフルエンザウイルスNS1(DQ508893.1)で見出すことができる。マウスにおける研究のために、N100D突然変異を有するPIV-5Vタンパク質を使用した(45)。
【0280】
インビトロにおけるsaRNAの転写
自己増幅RNAを、インビトロにおける転写を使用して生産した。プラスミドDNA(pDNA)を、大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)(New England BioLabs、UK)に形質転換し、100μg/mLのカルベニシリン(Sigma Aldrich、UK)を含む100mLのルリア液体培地(LB)中で培養した。その後pDNAを、Plasmid Plus MaxiPrepキット(QIAGEN、UK)を使用して単離し、NanoDrop One(ThermoFisher、UK)でpDNAの最終濃度を測定した。pDNAを、MluIを使用して、37℃で3時間直鎖状化にした。インビトロにおけるトランスフェクションのためのRNAを、mMachine(商標)T7トランスクリプション(Invitrogen、UK)中で、1μgの直鎖状化したpDNAテンプレートを使用して調製し、製造元のプロトコールを使用して、MEGAclear(商標)トランスクリプションクリーンアップキット(Invitrogen、UK)を使用して精製した。エクスビボ及びインビボの実験のためのRNAを、これまでに記載されたようにして調製した(2)。キャップされていないRNA転写物を、製造元のプロトコールを使用して、1μgの直鎖状化したpDNAテンプレートを使用して、MEGAScript(商標)T7トランスクリプションリアクション(Invitrogen、UK)を使用して、37℃で2時間、生産した。次いで転写物を、-20℃での一晩のLiCl沈殿によって精製し、14,000RPMで、4℃で20分遠心分離して、RNAをペレット化し、一度70%EtOHで濯ぎ、再び、14,000RPMで、4℃で5分遠心分離し、UltraPure H2O(Ambion、UK)UltraPure H2O(Ambion、UK)に再懸濁した。精製された転写物を、製造元のプロトコールを使用して、ScriptCap(商標)キャップ1キャッピングシステムキット(CellScript、WI、USA)を使用して、37℃で2時間キャップした。次いでキャップされた転写物を、最後に上述したようにLiCl沈殿で精製し、 RNA貯蔵緩衝液(10mMのHEPES、0.1mMのEDTA及び100mg/mLのトレハロース)に再懸濁し、さらなる使用まで-80℃で貯蔵した。
自己増幅RNAを、インビトロにおける転写を使用して生産した。プラスミドDNA(pDNA)を、大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)(New England BioLabs、UK)に形質転換し、100μg/mLのカルベニシリン(Sigma Aldrich、UK)を含む100mLのルリア液体培地(LB)中で培養した。その後pDNAを、Plasmid Plus MaxiPrepキット(QIAGEN、UK)を使用して単離し、NanoDrop One(ThermoFisher、UK)でpDNAの最終濃度を測定した。pDNAを、MluIを使用して、37℃で3時間直鎖状化にした。インビトロにおけるトランスフェクションのためのRNAを、mMachine(商標)T7トランスクリプション(Invitrogen、UK)中で、1μgの直鎖状化したpDNAテンプレートを使用して調製し、製造元のプロトコールを使用して、MEGAclear(商標)トランスクリプションクリーンアップキット(Invitrogen、UK)を使用して精製した。エクスビボ及びインビボの実験のためのRNAを、これまでに記載されたようにして調製した(2)。キャップされていないRNA転写物を、製造元のプロトコールを使用して、1μgの直鎖状化したpDNAテンプレートを使用して、MEGAScript(商標)T7トランスクリプションリアクション(Invitrogen、UK)を使用して、37℃で2時間、生産した。次いで転写物を、-20℃での一晩のLiCl沈殿によって精製し、14,000RPMで、4℃で20分遠心分離して、RNAをペレット化し、一度70%EtOHで濯ぎ、再び、14,000RPMで、4℃で5分遠心分離し、UltraPure H2O(Ambion、UK)UltraPure H2O(Ambion、UK)に再懸濁した。精製された転写物を、製造元のプロトコールを使用して、ScriptCap(商標)キャップ1キャッピングシステムキット(CellScript、WI、USA)を使用して、37℃で2時間キャップした。次いでキャップされた転写物を、最後に上述したようにLiCl沈殿で精製し、 RNA貯蔵緩衝液(10mMのHEPES、0.1mMのEDTA及び100mg/mLのトレハロース)に再懸濁し、さらなる使用まで-80℃で貯蔵した。
【0281】
saRNA配合物
タンパク質発現実験のためのfLuc、gLuc及びeGFPsaRNAを、これまでに記載されたような滴定方法(2)を使用して、100kDaのpABOLと複合体化した。インビボにおける免疫原性実験のためのRABV saRNAを、8kDaのpABOLと複合体化した。簡単に言えば、RNA及びpABOLを、HEPES緩衝液(20mMのHEPES、H2O中の5wt.%のグルコース、pH7.4)で希釈し、NanoAssemblrベンチトップ配合装置(Precision Nanosystems, Inc.、Vancouver、Canada)で、4:1(RNA:ポリマー)の体積比で、10mL/分の流速で合わせた。ポリマーのsaRNAに対する最終的な比率は45:1(w/w)であった。ポリプレックスを新たに調製し、調製の1時間以内に使用した。同時配合のために、ルキソリチニブ(ruxo、Selleck Chemicals、UK)を、ポリプレックスに直接、指定された用量で添加した。
タンパク質発現実験のためのfLuc、gLuc及びeGFPsaRNAを、これまでに記載されたような滴定方法(2)を使用して、100kDaのpABOLと複合体化した。インビボにおける免疫原性実験のためのRABV saRNAを、8kDaのpABOLと複合体化した。簡単に言えば、RNA及びpABOLを、HEPES緩衝液(20mMのHEPES、H2O中の5wt.%のグルコース、pH7.4)で希釈し、NanoAssemblrベンチトップ配合装置(Precision Nanosystems, Inc.、Vancouver、Canada)で、4:1(RNA:ポリマー)の体積比で、10mL/分の流速で合わせた。ポリマーのsaRNAに対する最終的な比率は45:1(w/w)であった。ポリプレックスを新たに調製し、調製の1時間以内に使用した。同時配合のために、ルキソリチニブ(ruxo、Selleck Chemicals、UK)を、ポリプレックスに直接、指定された用量で添加した。
【0282】
インビトロにおけるトランスフェクション
トランスフェクションを、HEK293T.17細胞(ATCC、USA)、HeL細胞(ATCC、USA)、MRC5細胞(ATCC、USA)、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)細胞(SigmaAldrich、UK)、RK13ウサギ腎臓細胞(Public Health England、UK)及びLLC-MK2アカゲザル(rhesus macaque)腎臓細胞(ATCC、USA)で実行した。細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、5mg/mLのL-グルタミン及び5mg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher、UK)を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地(cDMEM)(Gibco、ThermoFisher、UK)(HEK、HeLa、MEF細胞)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、5mg/mLのL-グルタミン及び5mg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher、UK)を含む完全改変イーグル培地(cMEM)(MRC5、RK13細胞)又は1%ウマ血清(Gibco、ThermoFisher、UK)を含む完全培地199(cM199、SigmaAldrich、UK)(LLC細胞)中で培養した。トランスフェクション前の24時間に、透明な96ウェルプレート中、ウェル1つ当たり細胞50,000個の密度で細胞を平板培養した。次いで培養培地を完全に除去し、50μLの予め温めたトランスフェクション培地(DMEM+5mg/mLのL-グルタミン、MEM+5mg/mLのL-グルタミン又はM199)で交換した。次いで各ウェルに100μLのポリプレックス溶液(100ngのsaRNAを含有する)を添加し、そのまま4時間インキュベートした。次いでトランスフェクション培地を完全に除去し、cDMEM、cMEM又はcM199で交換した。24時間後、各ウェルから50μLの培地を除去し、50μLのONE-Glo D-ルシフェリン基質(Promega、UK)を添加し、ピペッティングによってよく混合した。次いで各ウェルからの総体積を、分析のために白色の96ウェルプレート(Costar)に移し、FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で定量化した。各ウェルから、対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を引いた。
トランスフェクションを、HEK293T.17細胞(ATCC、USA)、HeL細胞(ATCC、USA)、MRC5細胞(ATCC、USA)、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)細胞(SigmaAldrich、UK)、RK13ウサギ腎臓細胞(Public Health England、UK)及びLLC-MK2アカゲザル(rhesus macaque)腎臓細胞(ATCC、USA)で実行した。細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、5mg/mLのL-グルタミン及び5mg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher、UK)を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地(cDMEM)(Gibco、ThermoFisher、UK)(HEK、HeLa、MEF細胞)、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、5mg/mLのL-グルタミン及び5mg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher、UK)を含む完全改変イーグル培地(cMEM)(MRC5、RK13細胞)又は1%ウマ血清(Gibco、ThermoFisher、UK)を含む完全培地199(cM199、SigmaAldrich、UK)(LLC細胞)中で培養した。トランスフェクション前の24時間に、透明な96ウェルプレート中、ウェル1つ当たり細胞50,000個の密度で細胞を平板培養した。次いで培養培地を完全に除去し、50μLの予め温めたトランスフェクション培地(DMEM+5mg/mLのL-グルタミン、MEM+5mg/mLのL-グルタミン又はM199)で交換した。次いで各ウェルに100μLのポリプレックス溶液(100ngのsaRNAを含有する)を添加し、そのまま4時間インキュベートした。次いでトランスフェクション培地を完全に除去し、cDMEM、cMEM又はcM199で交換した。24時間後、各ウェルから50μLの培地を除去し、50μLのONE-Glo D-ルシフェリン基質(Promega、UK)を添加し、ピペッティングによってよく混合した。次いで各ウェルからの総体積を、分析のために白色の96ウェルプレート(Costar)に移し、FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で定量化した。各ウェルから、対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を引いた。
【0283】
インビボでのマウスにおけるfルシフェラーゼ発現
全ての動物を、UK Home Office Animals Scientific Procedures Act 1986並びに地元の倫理委員会及び英国政府が承認したプロジェクトライセンス(P63FE629C)及び個人ライセンス(IC37CBB8F)に従って操作した。食物と水は適宜供給した。6～8週齢の雌BABL/cマウス(Charles River、UK)又はC57BL/6マウス(Charles River、UK)をグループで格納し(ケージ1つ当たりn=5)、十分順化させた部屋に格納した。マウスの両方の後肢に、50μLの総体積で、pABOLと複合体化した5μgのfLuc saRNA、又は一方の後肢に5μgのGLucのいずれかを筋肉内(IM)注射した。3、4、7、10又は14日後、これまでに記載されたようにして(54、55)、マウスをfLucに関して画像化するか、又はGLuc分析のために、ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット(Pierce、Thermo Scientific、UK)を使用して、製造元のプロトコールに従って血液を収集した。FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で、血清中でのタンパク質発現を定量化した。各ウェルから、対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を引いた。fLuc分析のために、マウスに150μLのXenoLight RediJect D-ルシフェリン基質(PerkinElmer、UK)を腹腔内(IP)注射し、そのまま10分休ませた。次いでマウスを、イソフルランを使用して麻酔し、分子イメージングソフトウェアバージョン5.0(Carestream Health、USA)を備えたIn Vivo Imaging System(IVIS)FX Pro(Kodak Co.、Rochester、NY、USA)で2分間画像化した。各注射部位からのシグナルをMolecular Imagineソフトウェアを使用して定量化し、総フラックス(p/s)として表した。
全ての動物を、UK Home Office Animals Scientific Procedures Act 1986並びに地元の倫理委員会及び英国政府が承認したプロジェクトライセンス(P63FE629C)及び個人ライセンス(IC37CBB8F)に従って操作した。食物と水は適宜供給した。6～8週齢の雌BABL/cマウス(Charles River、UK)又はC57BL/6マウス(Charles River、UK)をグループで格納し(ケージ1つ当たりn=5)、十分順化させた部屋に格納した。マウスの両方の後肢に、50μLの総体積で、pABOLと複合体化した5μgのfLuc saRNA、又は一方の後肢に5μgのGLucのいずれかを筋肉内(IM)注射した。3、4、7、10又は14日後、これまでに記載されたようにして(54、55)、マウスをfLucに関して画像化するか、又はGLuc分析のために、ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット(Pierce、Thermo Scientific、UK)を使用して、製造元のプロトコールに従って血液を収集した。FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で、血清中でのタンパク質発現を定量化した。各ウェルから、対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を引いた。fLuc分析のために、マウスに150μLのXenoLight RediJect D-ルシフェリン基質(PerkinElmer、UK)を腹腔内(IP)注射し、そのまま10分休ませた。次いでマウスを、イソフルランを使用して麻酔し、分子イメージングソフトウェアバージョン5.0(Carestream Health、USA)を備えたIn Vivo Imaging System(IVIS)FX Pro(Kodak Co.、Rochester、NY、USA)で2分間画像化した。各注射部位からのシグナルをMolecular Imagineソフトウェアを使用して定量化し、総フラックス(p/s)として表した。
【0284】
インビボでのマウスにおけるgルシフェラーゼ発現
6～8週齢の雌BALB/cマウス又はC57BL/6マウス(Charles River、UK)をグループ(n=5)に入れ、十分順化させた部屋に格納した。マウスの1つの後肢に、50μLの総体積で5μgのgLucを筋肉内(IM)注射した。3、7及び14日後、マウスの尾静脈から採血した。血液を凝固させ、10,000RPMで5分遠心分離し、血清を除去した。次いで全てのタイムポイントからの血清を、単一の96ウェルの白色のプレート(Costar)で、Pierce(商標)ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキットを使用して、20μLの血清及び製造元のプロトコールに従って調製された100uLの使用溶液を使用してアッセイした。発光(luminescne)をFLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で分析し、各試料からナイーブ動物からのバックグラウンドを引いた。
6～8週齢の雌BALB/cマウス又はC57BL/6マウス(Charles River、UK)をグループ(n=5)に入れ、十分順化させた部屋に格納した。マウスの1つの後肢に、50μLの総体積で5μgのgLucを筋肉内(IM)注射した。3、7及び14日後、マウスの尾静脈から採血した。血液を凝固させ、10,000RPMで5分遠心分離し、血清を除去した。次いで全てのタイムポイントからの血清を、単一の96ウェルの白色のプレート(Costar)で、Pierce(商標)ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキットを使用して、20μLの血清及び製造元のプロトコールに従って調製された100uLの使用溶液を使用してアッセイした。発光(luminescne)をFLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で分析し、各試料からナイーブ動物からのバックグラウンドを引いた。
【0285】
マウス、ラット及びウサギのワクチン接種。
BALB/cマウス、スプラギー・ダーレーラット及びニュージーランドホワイトウサギを、50μL(マウス)又は100μL(ラット、ウサギ)の総体積で、pABOLと共に製剤化された1μg(マウス)又は20μg(ラット、ウサギ)のRABVをコードするsaRNAで、1つの後肢におけるIMで免疫化した。最初のプライムの4週後に、ブースト注射を与えた。研究開始から0、4及び6週間後に血液を収集し、10,000RPMで5分遠心分離した。次いで血清をデカントし、さらなる分析まで-80℃で貯蔵した。
BALB/cマウス、スプラギー・ダーレーラット及びニュージーランドホワイトウサギを、50μL(マウス)又は100μL(ラット、ウサギ)の総体積で、pABOLと共に製剤化された1μg(マウス)又は20μg(ラット、ウサギ)のRABVをコードするsaRNAで、1つの後肢におけるIMで免疫化した。最初のプライムの4週後に、ブースト注射を与えた。研究開始から0、4及び6週間後に血液を収集し、10,000RPMで5分遠心分離した。次いで血清をデカントし、さらなる分析まで-80℃で貯蔵した。
【0286】
RABV特異的なELISA。
半定量的免疫グロブリンELISAプロトコールを、これまでに記載されたようにして(56)実行した。簡単に言えば、0.5μg/mLのRABVでコーティングされたELISAプレートを、PBS中の1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%(v/v)Tween-20でブロックした。洗浄後、プレートに希釈した血清試料を添加し、2時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、マウスELISAの場合、抗マウスIgG-HRP(Southern Biotech、UK)の1:4000希釈物を添加し、ラットELISAの場合、ヤギ抗ラットIgG-HRP(Southern Biotech、UK)の1:4000希釈物を添加し、ウサギELISAの場合、マウス抗ウサギIgG-HRP(Sigma、UK)の1:10000希釈物を添加した。ELISAプレートウェルを抗マウスカッパ(1:1,000)及びラムダ(1:1,000)軽鎖(Serotec、UK)でコーティングすること、PBS中の1%(w/v)BSA/0.05%(v/v)Tween-20でブロックすること、洗浄すること、及び精製したIgG(Southern Biotech、UK)を1000ng/mLから開始して添加すること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、マウス標準を調製した。ELISAプレートウェルを、精製したラットIgG(R & D Sytems、UK)で1000ng/mLから開始してコーティングすること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、ラット標準を調製した。ELISAプレートウェルを1:1250の抗ウサギIgG Fc(Milipore)でコーティングすること、PBS中の1%(w/v)BSA/0.05%(v/v)Tween-20でブロックすること、洗浄すること、及び精製したウサギIgG(AbD Serotech、UK)を1000ng/mLから開始して添加すること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、ウサギ標準を調製した。試料及び標準を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を使用して展開した。5分後に停止溶液(Insight Biotechnologies、UK)で反応を止めた。吸光度を、分光光度計(VersaMax、Molecular Devices、UK)でSoftMax Pro GxP v5ソフトウェアを用いて読んだ。
半定量的免疫グロブリンELISAプロトコールを、これまでに記載されたようにして(56)実行した。簡単に言えば、0.5μg/mLのRABVでコーティングされたELISAプレートを、PBS中の1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%(v/v)Tween-20でブロックした。洗浄後、プレートに希釈した血清試料を添加し、2時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、マウスELISAの場合、抗マウスIgG-HRP(Southern Biotech、UK)の1:4000希釈物を添加し、ラットELISAの場合、ヤギ抗ラットIgG-HRP(Southern Biotech、UK)の1:4000希釈物を添加し、ウサギELISAの場合、マウス抗ウサギIgG-HRP(Sigma、UK)の1:10000希釈物を添加した。ELISAプレートウェルを抗マウスカッパ(1:1,000)及びラムダ(1:1,000)軽鎖(Serotec、UK)でコーティングすること、PBS中の1%(w/v)BSA/0.05%(v/v)Tween-20でブロックすること、洗浄すること、及び精製したIgG(Southern Biotech、UK)を1000ng/mLから開始して添加すること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、マウス標準を調製した。ELISAプレートウェルを、精製したラットIgG(R & D Sytems、UK)で1000ng/mLから開始してコーティングすること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、ラット標準を調製した。ELISAプレートウェルを1:1250の抗ウサギIgG Fc(Milipore)でコーティングすること、PBS中の1%(w/v)BSA/0.05%(v/v)Tween-20でブロックすること、洗浄すること、及び精製したウサギIgG(AbD Serotech、UK)を1000ng/mLから開始して添加すること、及び一連の5倍希釈物で下方に滴定することによって、ウサギ標準を調製した。試料及び標準を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を使用して展開した。5分後に停止溶液(Insight Biotechnologies、UK)で反応を止めた。吸光度を、分光光度計(VersaMax、Molecular Devices、UK)でSoftMax Pro GxP v5ソフトウェアを用いて読んだ。
【0287】
RABVマイクロ中和アッセイ。
0、4及び6週目の試料に、シュードタイプ化狂犬病マイクロ中和を実行した。BHK-21細胞を、96ウェルプレートで、cDMEM中に細胞10,000個/ウェルで植え付けた。血清を56℃で熱不活性化し、次いで、cDMEMで1:5の連続希釈で希釈した。次いで試料を、等しい体積のシュードウイルスで、50μL中100TCID50の濃度で希釈し、37℃で1時間インキュベートし、次いでBHK-21細胞に添加し、37℃で48時間培養した。次いで細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性をBright-Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、UK)を使用して定量化した。次いで各ウェルからの総体積を、分析のための白色の96ウェルプレート(Costar)に移し、FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で定量化し、各試料につきIC50を計算した。
0、4及び6週目の試料に、シュードタイプ化狂犬病マイクロ中和を実行した。BHK-21細胞を、96ウェルプレートで、cDMEM中に細胞10,000個/ウェルで植え付けた。血清を56℃で熱不活性化し、次いで、cDMEMで1:5の連続希釈で希釈した。次いで試料を、等しい体積のシュードウイルスで、50μL中100TCID50の濃度で希釈し、37℃で1時間インキュベートし、次いでBHK-21細胞に添加し、37℃で48時間培養した。次いで細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性をBright-Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、UK)を使用して定量化した。次いで各ウェルからの総体積を、分析のための白色の96ウェルプレート(Costar)に移し、FLUOstar OMEGAプレートリーダー(BMG LABTECH、UK)で定量化し、各試料につきIC50を計算した。
【0288】
ヒト皮膚の外植片培養及び注射。
エクスビボの研究のために、Charing Cross Hospital、Imperial NHS Trust、London、UKでヒト皮膚組織の外科的に切除した試料を収集した。Imperial College Londonにおいて、地元の調査倫理委員会(MED_RS_11_014)によって承認されたプロトコール下で、選択的な腹壁形成術又は乳房切除術を受けている患者から署名したインフォームドコンセントを受け取った後に全ての組織を収集した。皮膚組織を使用まで冷凍し、1cm2の断片に切り出し、12ウェルプレートで2mLのcDMEMと共に、37℃、5%CO2と共に培養した。外植片を、Micro-Fine Demi 0.3mLシリンジ(Becton Dickinson、UK)を使用して、50μLの総体積の2μgのsaRNAの用量で皮内(ID)注射した。培地を、培養期間にわたり毎日交換した。
エクスビボの研究のために、Charing Cross Hospital、Imperial NHS Trust、London、UKでヒト皮膚組織の外科的に切除した試料を収集した。Imperial College Londonにおいて、地元の調査倫理委員会(MED_RS_11_014)によって承認されたプロトコール下で、選択的な腹壁形成術又は乳房切除術を受けている患者から署名したインフォームドコンセントを受け取った後に全ての組織を収集した。皮膚組織を使用まで冷凍し、1cm2の断片に切り出し、12ウェルプレートで2mLのcDMEMと共に、37℃、5%CO2と共に培養した。外植片を、Micro-Fine Demi 0.3mLシリンジ(Becton Dickinson、UK)を使用して、50μLの総体積の2μgのsaRNAの用量で皮内(ID)注射した。培地を、培養期間にわたり毎日交換した。
【0289】
フローサイトメトリー
注射時から72時間後、皮膚外植片をトリミングして皮下脂肪層を除去し、表皮及び皮層をはさみで十分細かく刻み、回転振盪機で、1mg/mLコラゲナーゼP(Sigma Aldrich、UK)及び5mg/mLディスパーゼII(Sigma Aldrich、UK)が補充された2mLのDMEM中で37℃で4時間インキュベートした。次いで消化物を70μmセルストレーナーに通過させてろ過し、1,750RPMで5分遠心分離した。次いで細胞を100μLのFACS緩衝液(PBS+2.5%FBS)に再懸濁し、FACS緩衝液で1:400に希釈したfixable aqua live/dead cell stain(ThermoFisher、UK)で氷上で20分間染色した。次いで試料を1mLのFACS緩衝液で洗浄し、1,750RPMで分遠心分離し、以下の抗体:CD3-V450(BioLegend、UK)、CD14-Qdot605(BioLegend、UK)、CD19-BV650(BioLegend、UK)、CD56-BV711(BioLegend、UK)、CD1a-PerCP-eFluor710(BioLegend、UK)、CD11c-PE(BioLegend、UK)、CD90-PE-Cy7(BioLegend、UK)及びCD45-AF700(BioLegend、UK)の混合物で染色した。次いで試料を1mLのFACS緩衝液で洗浄し、1,750RPMで5分遠心分離し、250μLのPBSに再懸濁し、次いで1.5%パラホルムアルデヒドの最終濃度になるように250μLの3%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー分析まで冷凍した。LSRFortessa(BD Biosciences、UK)フローサイトメーターで、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences、UK)を用いて、100,000個の獲得された細胞事象を用いて、試料を分析した。ゲーティング戦略をこれまでに記載されたようにして(58)実行し、GFP+細胞の表現型の同一性を、FlowJoバージョン10(FlowJo LLC、Oregon、USA)を使用して定量化した。生細胞の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)分析を、FlowJoで、1000回の反復、30のパープレキシティ、15196の学習率、Exact(バンテージポイントツリー)KNNアルゴリズム、及びバーンズ-ハット勾配アルゴリズムを使用して実行した。
注射時から72時間後、皮膚外植片をトリミングして皮下脂肪層を除去し、表皮及び皮層をはさみで十分細かく刻み、回転振盪機で、1mg/mLコラゲナーゼP(Sigma Aldrich、UK)及び5mg/mLディスパーゼII(Sigma Aldrich、UK)が補充された2mLのDMEM中で37℃で4時間インキュベートした。次いで消化物を70μmセルストレーナーに通過させてろ過し、1,750RPMで5分遠心分離した。次いで細胞を100μLのFACS緩衝液(PBS+2.5%FBS)に再懸濁し、FACS緩衝液で1:400に希釈したfixable aqua live/dead cell stain(ThermoFisher、UK)で氷上で20分間染色した。次いで試料を1mLのFACS緩衝液で洗浄し、1,750RPMで分遠心分離し、以下の抗体:CD3-V450(BioLegend、UK)、CD14-Qdot605(BioLegend、UK)、CD19-BV650(BioLegend、UK)、CD56-BV711(BioLegend、UK)、CD1a-PerCP-eFluor710(BioLegend、UK)、CD11c-PE(BioLegend、UK)、CD90-PE-Cy7(BioLegend、UK)及びCD45-AF700(BioLegend、UK)の混合物で染色した。次いで試料を1mLのFACS緩衝液で洗浄し、1,750RPMで5分遠心分離し、250μLのPBSに再懸濁し、次いで1.5%パラホルムアルデヒドの最終濃度になるように250μLの3%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー分析まで冷凍した。LSRFortessa(BD Biosciences、UK)フローサイトメーターで、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences、UK)を用いて、100,000個の獲得された細胞事象を用いて、試料を分析した。ゲーティング戦略をこれまでに記載されたようにして(58)実行し、GFP+細胞の表現型の同一性を、FlowJoバージョン10(FlowJo LLC、Oregon、USA)を使用して定量化した。生細胞の教師なしクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(tSNE)分析を、FlowJoで、1000回の反復、30のパープレキシティ、15196の学習率、Exact(バンテージポイントツリー)KNNアルゴリズム、及びバーンズ-ハット勾配アルゴリズムを使用して実行した。
【0290】
インビトロでの作業におけるSARS-CoV-2糖タンパク質
本発明者らは、トリニダードドンキー(Trinidad donkey)ベネズエラウマ脳炎ウイルス株(VEEV)アルファウイルスゲノムをベースとした自己増幅RNA(saRNA)レプリコンを合成するために、プラスミドベクターを使用した。サブゲノムプロモーターから駆動されるウイルス構造タンパク質を、新規の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2):GenBank受託番号:QHD43416.1の表面「スパイク」糖タンパク質で置き換えた。本発明者らは、SARS-CoV-2遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド断片を、オリゴヌクレオチド鎖(GeneArt、ドイツ)を使用して合成し、ギブソンアセンブリ方法(NEB Ltd、UK)を用いてこれらをプラスミドベクターに組み立てた。SARS-CoV-2レプリコンベクターのさらなる改変において、MERS-CoV ORF4a(AHC74090.1)をコードするオリゴヌクレオチド鎖を合成し(GeneArt、Germany)、連続的なオープンリーディングフレーム中に、フューリン/T2A配列(配列番号26)のバリアントを使用して、連結されるSARS-CoV-2コード領域の3'に挿入し、新しいSARS-CoV-2 ORF4aベクターを生成した。細胞を、SARS-CoV-2及びSARS-CoV-2 ORF4a saRNAの両方で別々にトランスフェクトし、次いでポリクローナル抗体で染色して発現を検査した。簡単に言えば、トランスフェクション後の24時間に、細胞を回収し、1mLのFACS緩衝液(PBS+2.5%FBS)に細胞1×107個/mLの濃度で再懸濁した。100マイクロリットルの再懸濁した細胞をFACSチューブに添加し、50μLのLive/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain(Thermo Fisher Scientific、UK)で、1:400の希釈率で、氷上で20分染色した。次いで細胞を2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離した。遠心分離後、細胞を、2.5μgのSARS-CoVスパイクタンパク質ポリクローナル抗体(PA1-41165、Thermo Fisher Scientific、UK)で、氷上で30分染色し、その後、2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離した。次いで細胞を、0.4μgのFITCヤギ抗ウサギIgG(BD Pharmigen、UK)で、氷上で30分染色した。インキュベーション後、細胞を2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離し、250μLのPBSで再懸濁した。細胞を、1.5%の最終濃度になるように250μLの3%パラホルムアルデヒドで固定した。試料を、LSRForterssa(BD Biosciences、UK)で、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences、UK)を用いて分析した。データを、FlowJoバージョン10(FlowJo LLC、USA)を使用して分析し、SARS-CoV-2又はSARS-CoV-2 ORF4aレプリコンsaRNAが使用されなかったことを除き上記と同じ手法を使用して、生きた単一細胞として、及び擬似トランスフェクトされた細胞としてゲーティングされた細胞に設定された陰性/陽性カットオフを用いて細胞の陽性集団の蛍光強度中央値(MFI)を測定した。
本発明者らは、トリニダードドンキー(Trinidad donkey)ベネズエラウマ脳炎ウイルス株(VEEV)アルファウイルスゲノムをベースとした自己増幅RNA(saRNA)レプリコンを合成するために、プラスミドベクターを使用した。サブゲノムプロモーターから駆動されるウイルス構造タンパク質を、新規の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2):GenBank受託番号:QHD43416.1の表面「スパイク」糖タンパク質で置き換えた。本発明者らは、SARS-CoV-2遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド断片を、オリゴヌクレオチド鎖(GeneArt、ドイツ)を使用して合成し、ギブソンアセンブリ方法(NEB Ltd、UK)を用いてこれらをプラスミドベクターに組み立てた。SARS-CoV-2レプリコンベクターのさらなる改変において、MERS-CoV ORF4a(AHC74090.1)をコードするオリゴヌクレオチド鎖を合成し(GeneArt、Germany)、連続的なオープンリーディングフレーム中に、フューリン/T2A配列(配列番号26)のバリアントを使用して、連結されるSARS-CoV-2コード領域の3'に挿入し、新しいSARS-CoV-2 ORF4aベクターを生成した。細胞を、SARS-CoV-2及びSARS-CoV-2 ORF4a saRNAの両方で別々にトランスフェクトし、次いでポリクローナル抗体で染色して発現を検査した。簡単に言えば、トランスフェクション後の24時間に、細胞を回収し、1mLのFACS緩衝液(PBS+2.5%FBS)に細胞1×107個/mLの濃度で再懸濁した。100マイクロリットルの再懸濁した細胞をFACSチューブに添加し、50μLのLive/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain(Thermo Fisher Scientific、UK)で、1:400の希釈率で、氷上で20分染色した。次いで細胞を2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離した。遠心分離後、細胞を、2.5μgのSARS-CoVスパイクタンパク質ポリクローナル抗体(PA1-41165、Thermo Fisher Scientific、UK)で、氷上で30分染色し、その後、2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離した。次いで細胞を、0.4μgのFITCヤギ抗ウサギIgG(BD Pharmigen、UK)で、氷上で30分染色した。インキュベーション後、細胞を2.5mLのFACS緩衝液で洗浄し、1750RPMで7分遠心分離し、250μLのPBSで再懸濁した。細胞を、1.5%の最終濃度になるように250μLの3%パラホルムアルデヒドで固定した。試料を、LSRForterssa(BD Biosciences、UK)で、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences、UK)を用いて分析した。データを、FlowJoバージョン10(FlowJo LLC、USA)を使用して分析し、SARS-CoV-2又はSARS-CoV-2 ORF4aレプリコンsaRNAが使用されなかったことを除き上記と同じ手法を使用して、生きた単一細胞として、及び擬似トランスフェクトされた細胞としてゲーティングされた細胞に設定された陰性/陽性カットオフを用いて細胞の陽性集団の蛍光強度中央値(MFI)を測定した。
【0291】
統計的分析。
グラフ及び統計表を、GraphPad Prism、バージョン8で作成した。統計学的差異を、二元配置ANOVA又は多重比較用に調整されたクラスカル-ウォリスの検定のいずれかを使用して分析し、有意性を示すのにp<0.05が使用された。
グラフ及び統計表を、GraphPad Prism、バージョン8で作成した。統計学的差異を、二元配置ANOVA又は多重比較用に調整されたクラスカル-ウォリスの検定のいずれかを使用して分析し、有意性を示すのにp<0.05が使用された。
【0292】
結果及び考察
RNAレプリコンは、ワクチン及び療法のための目的の遺伝子の送達及び発現のための見込みのあるツールであると仮定されている。しかしながら、二本鎖RNA(dsRNA)は、タンパク質翻訳を阻害するシグナル伝達カスケードを開始させる感知メカニズムによって細胞内で検出される。結果として、レプリコンでコードされた目的の遺伝子の発現は、著しく機能が損なわれており、したがって、RNAレプリコンの治療上の可能性は限定的である。
RNAレプリコンは、ワクチン及び療法のための目的の遺伝子の送達及び発現のための見込みのあるツールであると仮定されている。しかしながら、二本鎖RNA(dsRNA)は、タンパク質翻訳を阻害するシグナル伝達カスケードを開始させる感知メカニズムによって細胞内で検出される。結果として、レプリコンでコードされた目的の遺伝子の発現は、著しく機能が損なわれており、したがって、RNAレプリコンの治療上の可能性は限定的である。
【0293】
本発明者らは、saRNAの生来の認識を低減させるために生来の阻害タンパク質をコードするRNAレプリコンを開発することによってこの問題を克服することを試みた。saRNAを用いてインターフェロン応答を低減するためにこれまでに公開された唯一のアプローチは、ワクシニアウイルス、E3、K3及びB18由来のインターフェロン阻害タンパク質を使用した。しかしながら、この研究では、インターフェロン阻害タンパク質は、saRNAと組み合わされた別個のmRNA分子として送達され、製剤化された。これは、saRNA及びmRNAの両方の製造を必要とし、同じ細胞への共送達を確実にし、タンパク質発現におけるあらゆる観察可能な強化を提供するために、レプリコンRNAの3～6倍もの多くのワクシニアmRNAの使用を要する。更に、発現の反応速度は、mRNAから発現されるIIPのいずれかの有益な作用が、付随するレプリコンと比較して短い期間の作用になるように、mRNAとsaRNAとで異なっている。
【0294】
療法においてsaRNAを使用する現状の困難さを考慮して、本発明者らは、免疫応答を先行技術の方法より効果的にそれに制限して、ワクチン接種及び療法におけるその有用性を増加させると予想される新規のsaRNAを設計した。
【0295】
新規のIIPとしてのPIV-5及びORF4aの使用
PIV-5及びORF4aは、MDA-5をブロックすることが公知であり、MDA-5は、それぞれ導入された合成saRNAの翻訳を減少させる制限因子の生産を引き起こすインターフェロン調節因子3及び7(IRF3及びIRF7)の誘導をもたらすMAVと呼ばれるアダプター分子を介してシグナル伝達する細胞質内RNAヘリカーゼである(図1)。インビトロにおける様々な異なるウイルス由来の10種のIIPの最初のスクリーニングで、これらの2つのIIPを同定した。
PIV-5及びORF4aは、MDA-5をブロックすることが公知であり、MDA-5は、それぞれ導入された合成saRNAの翻訳を減少させる制限因子の生産を引き起こすインターフェロン調節因子3及び7(IRF3及びIRF7)の誘導をもたらすMAVと呼ばれるアダプター分子を介してシグナル伝達する細胞質内RNAヘリカーゼである(図1)。インビトロにおける様々な異なるウイルス由来の10種のIIPの最初のスクリーニングで、これらの2つのIIPを同定した。
【0296】
1.HSV-2 Us1 - これは、IRF-3のIFN-βプロモーターとの会合を抑制することによってIFN-B生産を阻害する[1]
2.HSV-1 Us1(HSV-1由来の調節因子)
3.HSV-1 Us11 - RIG-Iシグナル伝達を防止する[2、3]
4.OV20.0L - dsRNAに結合し、PKRとPACTの両方を阻害し、RIG-Iシグナル伝達をブロックする[4、5]
5.BVDV Npro:IRF3リン酸化及びS100A9シグナル伝達をブロックする[6、7]
6.PIV5V:MDA-5に結合することによってMDA-5及びIRF3をブロックする[8、9]
7.MERS-CoV M:TRAF3と相互作用し、TRAF3-TBK1会合を崩壊させ、低減したIRF3活性化をもたらす[10～12]
8.MERS-CoV ORF4a:dsRNAに結合する(長いRNAへの選択性を有する)、MDA5及びRIG-IのPACT始動、PKR及びストレス応答を抑制する[13、14]。
9.ランガットウイルスNS5:IFNA1Rを下方調節し、JAK-STATシグナル伝達を損なう[15～16]
10.インフルエンザNS1:dsRNAに結合し、RIG-Iシグナル伝達をブロックする[17]。
2.HSV-1 Us1(HSV-1由来の調節因子)
3.HSV-1 Us11 - RIG-Iシグナル伝達を防止する[2、3]
4.OV20.0L - dsRNAに結合し、PKRとPACTの両方を阻害し、RIG-Iシグナル伝達をブロックする[4、5]
5.BVDV Npro:IRF3リン酸化及びS100A9シグナル伝達をブロックする[6、7]
6.PIV5V:MDA-5に結合することによってMDA-5及びIRF3をブロックする[8、9]
7.MERS-CoV M:TRAF3と相互作用し、TRAF3-TBK1会合を崩壊させ、低減したIRF3活性化をもたらす[10～12]
8.MERS-CoV ORF4a:dsRNAに結合する(長いRNAへの選択性を有する)、MDA5及びRIG-IのPACT始動、PKR及びストレス応答を抑制する[13、14]。
9.ランガットウイルスNS5:IFNA1Rを下方調節し、JAK-STATシグナル伝達を損なう[15～16]
10.インフルエンザNS1:dsRNAに結合し、RIG-Iシグナル伝達をブロックする[17]。
【0297】
これらのIIPを、本発明者の標準VEEV saRNAレプリコン(図1)内に、GOIとしてfルシフェラーゼと共に取り込ませ、発現のマーカーとして使用した。構築物を、3つのヒト細胞株:生来の感知経路の機能が損なわれたHEK293T細胞、HeLa細胞及び初代MRC5胎児上皮細胞(図3a及び図3b)で評価した。IIP候補saRNAの全てを、生来の認識の非存在下でHEK293T細胞中の野生型saRNAと同様に複製した。様々なIIP(ただしMERS-CoV M及びインフルエンザNS1を除く)は、HeLa細胞において発現を強化することができたが、最も顕著な強化(3log)はPIV-V及びORF4aで見られた。最も重要なことに、初代MRC5細胞における評価から、PIV-V及びORF4aのみがルシフェラーゼ発現を2log強化することが可能であったことが示された。これらのデータから、PIV-V及びORF4aは、初代ヒト細胞においてGOIの発現を強化するそれらの能力において固有であることが示唆される。RNAベクターに含ませるためのPIV-5及びORF4aの同定は、これらの実験データに基づいており、評価された他のIIPが類似のメカニズムを介して機能すると考えられることを考慮すれば、それらの活性は予測不可能であった。遺伝子送達におけるそれらの使用を更に裏付けるために、本発明者らは、マウスでインビボにおける実験を実行した。ここで本発明者らは、Black 6(BL6)マウスを利用したが、このマウスは、BalBcマウスよりロバストな生来の感知メカニズム及び下流のインターフェロン応答を有することが公知であり、それゆえに2つのモデルにおける比較は有益である。本発明者らは、レポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼ(fLuc)を使用して、BL/6マウスにおけるWT、PIV-5及びORF4aレプリコンの相対的な発現を評価した(図4)。
【0298】
fLucは細胞内で発現されるため、この目的の遺伝子の発現は、基質D-ルシフェリンを腹腔内(IP)注射した後にルシフェラーゼ発現に基づき可視化され、総フラックス(p/s)として表される(方法を参照)。これらのインビボにおける実験は、PIV5及びORF4aがBL/6細胞におけるルシフェラーゼ発現期間を14日まで増加させながら、このタイムポイントまでWT構築物は陰性であったことを実証する。さらなる研究において、本発明者らは、gルシフェラーゼ(図5)又はgLuc(GOIとして)の発現へのこれらの2つのRNAレプリコン構築物の影響を評価した。gLucは、可溶性タンパク質として分泌され、その活性が、血液中で指標となる(方法を参照)。これらのインビボにおける実験は、PIV5及びORF4aがBL/6細胞におけるルシフェラーゼ発現期間を14日まで増加させたことを実証する。gLucの発現は、14日目において、PIV5及びORF4a RNAレプリコンの両方で、より有意に高い(それぞれp=0.0244及び0.00422)。14日にわたる「濃度曲線下面積」の計算は、以下の値を示した。AUCは、以下の通りである:fLuc BALBc=1950;PIV5 BALBc=2742;ORF4a BALBc=1596;fLuc BL6=2012;PIV5 BL6=4513;ORF4a BL6=6972(総フラックス(p/s))。これらのインビボにおける実験は裏付けとなり得るが、生来の制限因子及びインターフェロンで刺激された遺伝子の特異性に関してヒトとマウスとで有意差がある(>100の有意差がある)ことに留意することが重要であり、したがって、これらのデータは、ヒト細胞株で見られるインビトロにおける観察に基づいてヒトにおける可能性がある影響を過小評価する可能性が高い。
【0299】
インターフェロン阻害タンパク質はインビトロでsaRNAのタンパク質発現を強化する。
本発明者らは、インターフェロン阻害タンパク質のライブラリーがインビトロでホタルルシフェラーゼ(fLuc)タンパク質発現を強化するかどうかの決定を試みた。本発明者らは、T2A切断部位を有する(図9a)fLucから分離されたIIPを含むsaRNA VEEVレプリコンのライブラリーを、IRF-3、MDA5、RIG-I、及びJAK/STATを含む様々な細胞質内インターフェロン標的(Table 1(表1))を用いて調製した(図9b)。
本発明者らは、インターフェロン阻害タンパク質のライブラリーがインビトロでホタルルシフェラーゼ(fLuc)タンパク質発現を強化するかどうかの決定を試みた。本発明者らは、T2A切断部位を有する(図9a)fLucから分離されたIIPを含むsaRNA VEEVレプリコンのライブラリーを、IRF-3、MDA5、RIG-I、及びJAK/STATを含む様々な細胞質内インターフェロン標的(Table 1(表1))を用いて調製した(図9b)。
【0300】
【表1】
【0301】
次いで本発明者らは、pABOL(図9c、補充された図1)を使用して、saRNAをHEK293T.17、HeLa及びMRC5細胞にトランスフェクトした。pABOLは、相対的に高いタンパク質発現をもたらすが、その生物学的に分解されやすい性質のために相対的に免疫サイレントであるとこれまでに特徴付けられたポリマー送達系である(2)。本発明者らは、IFN経路の完全性におけるそれらのバリエーションのために、これらの3つの細胞株を選択した;HEK293T.17細胞は、内因性RIG-I及びMDA5発現を欠如しているため、完全な経路を有さず(37)、したがってこの経路に影響を及ぼすタンパク質に対する感受性は比較的低いはずであり、それに対してHeLa及びMRC5は、より高度な識別性を有する(38、39)。本発明者らは、IIPレプリコンのどれもが、HEK293T.17細胞におけるタンパク質発現を強化しなかったが(図1c)、興味深いことに、ランガット及びインフルエンザIIPの両方が、それぞれp=0.0097及び0.0061でタンパク質発現を0.06分の1も有意に減少させたことを観察した。HeLa細胞において、IIPの多くが、タンパク質発現;HSV-2、HSV-1_1、HSV-1_2、Orf及びBVDVを強化し、20～150倍の範囲でfLuc発現を増加させた。しかしながら、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質は、タンパク質発現をそれぞれ796及び893倍に最も高く強化したが、PIV-5グループのみが統計学的に有意であり(p=0.0272)一方でORF4aグループはそうではなかった(p=0.0689)。MRC5細胞において、本発明者らは同様に、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質から最大の強化を観察し、それぞれp=0.0485及び0.025で72及び109倍大きいfLuc発現であった。全ての細胞型において、更に各構築物につき、2つの別々に作製されたRNAのバッチからの発現レベル間で十分な一致がみられた(図14)。
【0302】
本発明者らは更に、どのようにPIV～5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質への2つの突然変異が、マウス(MEF)、ウサギ(RK13)、非ヒト霊長類(LLC)及びヒト細胞(MRC5)におけるタンパク質発現に影響を与えるかを調査した(図15a～図15d)。PIV-5VにおけるR172A突然変異は、STATではなくMDA5をブロックする能力を排除し(40)、MERS-CoV ORF4aにおけるK63A/K67A突然変異はdsRNAへの結合をブロックする(41)。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質が、MEF又はRK13細胞においてタンパク質発現を強化しなかったことを観察した。MERS-CoV ORF4aタンパク質は、LLC及びMRC5細胞においてタンパク質発現を強化せず(図15c、図15d)、K63A/K67A突然変異は、タンパク質発現を大きく減少させた。PIV-5Vタンパク質は、MRC5細胞においてタンパク質発現を強化したが、LLC細胞では強化せず、R172A突然変異は、MRC5細胞においてタンパク質発現を減少させた。全体的なこれらのデータは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質が、インターフェロンコンピテントヒト細胞においてタンパク質発現を強化し、タンパク質をK63A/K67A及びR172A置換で突然変異させるとsaRNA発現が弱まることを示す。
【0303】
MERS-CoV ORF4aタンパク質はインビボにおいて用量増加の非直線性を部分的に低減する。
インビトロにおけるPIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質からのタンパク質発現の強化を考慮して、本発明者らは次いで、これらの構築物がインビボでタンパク質発現を強化し、saRNAの用量増加の非直線性を低減できるかどうかの決定を試みた。本発明者らは、細胞内タンパク質であるホタルルシフェラーゼと、分泌されたタンパク質であるガウシアルシフェラーゼの両方をコードするsaRNAをインビボで試験した(Table 2(表2))。
インビトロにおけるPIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質からのタンパク質発現の強化を考慮して、本発明者らは次いで、これらの構築物がインビボでタンパク質発現を強化し、saRNAの用量増加の非直線性を低減できるかどうかの決定を試みた。本発明者らは、細胞内タンパク質であるホタルルシフェラーゼと、分泌されたタンパク質であるガウシアルシフェラーゼの両方をコードするsaRNAをインビボで試験した(Table 2(表2))。
【0304】
【表2】
【0305】
本発明者らは、インターフェロンを生成する能力における差によってBALB/c及びC57BL/6マウスの両方でこれらの構築物を試験するために、以下を選択した:BALB/cは、IFNの劣ったプロデューサーであるが、それに対してC57BL/6マウスは、IFN-α/β及びIFN-γの高度なプロデューサーであることがこれまでに見出されており(42)、これは、インビトロにおけるHEK293T.17及びHeLa/MRC5細胞の不均衡と類似している。発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質の取り込みは、BALB/cマウスにおいてfLuc又はGLucのいずれのタンパク質発現も強化しなかったことを観察した(表2、図16)。本発明者らは、C57BL/6マウスにおけるMERS-CoV ORF4aタンパク質を伴うfLucのタンパク質発現、及びPIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質の両方を伴うGLucのタンパク質発現の総濃度曲線下面積(AUC)のわずかな強化を観察したが、差は統計学的に有意ではなかった。
【0306】
本発明者らは、これまでに、saRNAの用量増加は最終的により低いレベルのタンパク質発現をもたらすことを観察しており、したがって、MERS-CoV ORF4aタンパク質が、インビボにおいてsaRNAの非線形の用量依存性を低減できるかどうかを特徴付けることを試みた。本発明者らは、野生型fLuc及びfLuc+MERS-CoV ORF4aレプリコンの0.2、2及び20μgの用量を試験し、筋肉内(IM)注射の後、7及び10日目にタンパク質発現を定量化した(図10)。本発明者らは、両方の構築物が、7日後に0.2μgの用量で類似のタンパク質発現(約5000p/s)を示し、用量を2μgに増加させたところ、両方でタンパク質発現が増加したが(WTの場合、約50,000p/sに、MERS-CoV ORF4a構築物の場合、約200,000p/sに)、MERS-CoV ORF4aタンパク質の取り込みが、p=0.0029でタンパク質発現を4倍強化したことを観察した。興味深いことに、両方の構築物は、7日後に20μgの用量でより低いタンパク質発現を示したが、WTは、p<0.0001でMERS-CoV構築物の18分の1であった。10日後、タンパク質発現レベルは、2μgの用量で均一化され、0.2及び20μg用量で発現は観察されなかった。いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、MERS-CoV ORF4aタンパク質が、インビボにおけるsaRNAの非線形の用量依存性の部分的な奪回を可能にすることを示す。
【0307】
ルキソリチニブはインビボにおいてsaRNAのタンパク質発現を強化する。
下流のインターフェロン応答におけるJAK/STAT経路の役割を考慮して、本発明者らは次いで、どのようにsaRNA、MERS-CoV ORF4aインターフェロン阻害タンパク質及びJAK1及びJAK2プロテインキナーゼの有力な選択的阻害剤であるルキソリチニブを組み合わせることが(36)、インビボでタンパク質発現に影響を与えるかを特徴付けることを試みた(図3)。それらを、100μgのルキソリチニブを同時に配合した、又はしていないfLuc±MERS-CoV ORF4aをコードする5μgのsaRNAと共にマウスにIM注射し、注射後の4、7、10及び14日にタンパク質発現を定量化した。4日後(図11a)、ルキソリチニブを含有する配合物の両方が、WT又はMERS-CoV ORF4a構築物(約5×105p/s)と比較してわずかに多くのタンパク質発現(約106p/s)を示したが、それは統計学的に有意ではなかった。しかしながら、7日後、両方のルキソリチニブを含有する配合物は、saRNAのみの並行グループと比較して、それぞれp=0.0347及び0.0447で、より多くのタンパク質発現を示した。10日目までに、これらのグループはそれでもなおわずかに上昇したが、差はもはや統計学的に有意ではなかった。14日後、ルキソリチニブなしのsaRNAグループでタンパク質発現は観察されず、ルキソリチニブグループで、極めてわずかな陽性試料しか観察されなかった。いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、ルキソリチニブが、saRNAタンパク質発現における顕著な増加を可能にするが、組み合わせたところ、MERS-CoV ORF4aタンパク質とルキソリチニブとの間に相加効果はないことを示す。
下流のインターフェロン応答におけるJAK/STAT経路の役割を考慮して、本発明者らは次いで、どのようにsaRNA、MERS-CoV ORF4aインターフェロン阻害タンパク質及びJAK1及びJAK2プロテインキナーゼの有力な選択的阻害剤であるルキソリチニブを組み合わせることが(36)、インビボでタンパク質発現に影響を与えるかを特徴付けることを試みた(図3)。それらを、100μgのルキソリチニブを同時に配合した、又はしていないfLuc±MERS-CoV ORF4aをコードする5μgのsaRNAと共にマウスにIM注射し、注射後の4、7、10及び14日にタンパク質発現を定量化した。4日後(図11a)、ルキソリチニブを含有する配合物の両方が、WT又はMERS-CoV ORF4a構築物(約5×105p/s)と比較してわずかに多くのタンパク質発現(約106p/s)を示したが、それは統計学的に有意ではなかった。しかしながら、7日後、両方のルキソリチニブを含有する配合物は、saRNAのみの並行グループと比較して、それぞれp=0.0347及び0.0447で、より多くのタンパク質発現を示した。10日目までに、これらのグループはそれでもなおわずかに上昇したが、差はもはや統計学的に有意ではなかった。14日後、ルキソリチニブなしのsaRNAグループでタンパク質発現は観察されず、ルキソリチニブグループで、極めてわずかな陽性試料しか観察されなかった。いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、ルキソリチニブが、saRNAタンパク質発現における顕著な増加を可能にするが、組み合わせたところ、MERS-CoV ORF4aタンパク質とルキソリチニブとの間に相加効果はないことを示す。
【0308】
PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質は、エクスビボでヒト皮膚外植片における用量増加の非直線性を低減する。
本発明者らはインビトロにおいてIIPは細胞型の種に応じてタンパク質発現において差を呈することを観察したことから、本発明者らは、より臨床的に関連の高いヒト皮膚外植片モデルでsaRNA IIP構築物の試験を試みた。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質(図ではMERS-CoV_2と称される)、加えてルキソリチニブとの同時配合物の取り込みを用いて、ヒト常在皮膚細胞におけるタンパク質発現の量(eGFP+細胞の%)と品質(細胞当たりのeGFP蛍光強度中央値)の両方を特徴付けた(図12)。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質と共に0.2、2及び20μgの用量のeGFP saRNAを試験したところ(図12a、図12b)、0.2から2μgへのWT構築物の用量増加は、10%から18%へのeGFP+細胞のパーセンテージの増加をもたらしたが、用量を20μgに増加させたところ、eGFP+細胞のパーセンテージは約5%に落ち込んだことを観察した。しかしながら、PIV-5及びMERS-CoV ORF4a構築物の場合、saRNAの用量の増加に伴い用量は直線状に増加する。0.2μg用量は同様に、これらの構築物のどちらでも約12%のeGFP+をもたらし、これは更に、2μgで15%に、20μgで25%に増加したことから、この時点でPIV-5及びMERS-CoV ORF4a構築物の両方は、それぞれp<0.0001で、より統計学的に有意に高いパーセンテージのeGFP+細胞を有していた。興味深いことに、PIV-5又はMERS-CoV ORF4aタンパク質の用量も取込みもeGFPのMFIに影響を与えず、全ての試料で約350であった(図12b)。
本発明者らはインビトロにおいてIIPは細胞型の種に応じてタンパク質発現において差を呈することを観察したことから、本発明者らは、より臨床的に関連の高いヒト皮膚外植片モデルでsaRNA IIP構築物の試験を試みた。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質(図ではMERS-CoV_2と称される)、加えてルキソリチニブとの同時配合物の取り込みを用いて、ヒト常在皮膚細胞におけるタンパク質発現の量(eGFP+細胞の%)と品質(細胞当たりのeGFP蛍光強度中央値)の両方を特徴付けた(図12)。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質と共に0.2、2及び20μgの用量のeGFP saRNAを試験したところ(図12a、図12b)、0.2から2μgへのWT構築物の用量増加は、10%から18%へのeGFP+細胞のパーセンテージの増加をもたらしたが、用量を20μgに増加させたところ、eGFP+細胞のパーセンテージは約5%に落ち込んだことを観察した。しかしながら、PIV-5及びMERS-CoV ORF4a構築物の場合、saRNAの用量の増加に伴い用量は直線状に増加する。0.2μg用量は同様に、これらの構築物のどちらでも約12%のeGFP+をもたらし、これは更に、2μgで15%に、20μgで25%に増加したことから、この時点でPIV-5及びMERS-CoV ORF4a構築物の両方は、それぞれp<0.0001で、より統計学的に有意に高いパーセンテージのeGFP+細胞を有していた。興味深いことに、PIV-5又はMERS-CoV ORF4aタンパク質の用量も取込みもeGFPのMFIに影響を与えず、全ての試料で約350であった(図12b)。
【0309】
本発明者らは更に、定義されたタンパク質及び表現型ゲーティングを上に重ねて、細胞の教師なしクラスタリングにより可視化を可能にするフローサイトメトリーデータのための主成分分析の一種であるt分布型確率的近傍埋め込みを使用して、どの細胞がsaRNAを発現しているかを特徴付けた(図17～図25)(43)。本発明者らは、saRNAの最大用量(20μg)で、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質は、常在上皮細胞及び線維芽細胞とは対照的に、T細胞、樹状細胞、単球、B細胞、ランゲルハンス細胞、白血球及びNK細胞を含む免疫細胞におけるタンパク質発現を可能にしたことを観察した。
【0310】
次に本発明者らは、どのように0～100μgの範囲のルキソリチニブ(ruxolinitib)の用量を取り入れると、ヒト皮膚常在細胞におけるsaRNA発現に影響が与えられるかを試験した。本発明者らは、ルキソリチニブとsaRNAの同時配合物はeGFP+細胞のパーセンテージに対していかなる作用も有さなかったが(図4c)、実際にはルキソリチニブの用量増加がeGFP+細胞のパーセンテージを約8%から約5%に減少させるわずかな傾向があったことを観察した。しかしながら、本発明者らは、eGFP発現の細胞ごとの品質に対する顕著な作用を観察した(図12d);ルキソリチニブの用量を増加させると、10μgの用量のルキソリチニブでeGFP MFIが約100から約2000に増加したが、100μgの用量のルキソリチニブでMFIは約1000に減少した。saRNA PIV-5及びMERS-CoV ORF4aタンパク質を発現する細胞と同様に、本発明者らは、ルキソリチニブが、上皮細胞及び線維芽細胞とは対照的に免疫細胞においてタンパク質発現を強化したこと、及びT細胞、ランゲルハンス細胞、白血球及びNK細胞において取り込みを特に増加させたことを見出した(図26a、図26b)。
【0311】
総合すると、更に、いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、saRNAを発現する細胞のパーセンテージを増加させることによって、IIPレプリコンが免疫細胞において発現を強化するが、ルキソリチニブは、細胞に応じてタンパク質発現を強化することを示す。
【0312】
MERS-CoV ORF4aタンパク質がウサギにおいてインビボでRABV糖タンパク質の免疫原性を強化する
核酸配合物のタンパク質発現は必ずしも免疫原性の直接の予測変数とは限らないため(2)、本発明者らは次いで、本発明のsaRNA構築物においてMERS-CoV ORF4aタンパク質(生来の阻害タンパク質又はIIPとして作用する)と組み合わせた場合の、治療用生体分子として作用するモデルタンパク質、すなわちGeneBank識別番号NP_056796.1によって表される狂犬病糖タンパク質(RABV)の免疫原性を特徴付けることを試みた。加えて細胞のp75NTR表面受容体への結合を防止するアミノ酸置換、F318V改変を有するRABVタンパク質を使用した。本発明者らは、ウサギに20μgのsaRNAの一次用量を注射し、4週間後にブーストを注射し、次いで0、4、及び6週間後にその血液中のRABV特異的なIgG抗体をサンプリングした(図13a)。本発明者らは、野生型及びMERS-CoV ORF4a構築物の両方の全てのウサギが、単回注射後に血清変換したことを観察した。MERS-CoVグループのIgG力価は、4週間後、野生型(約5×103ng/mL)と比較してわずかに高かったが(約104ng/mL)、これは統計学的に有意ではなかった。しかしながら、6週間後、MERS-CoV ORF4aグループにおける動物の抗体力価は、WT(約104ng/mL)と比較して、p=0.0061で有意に高かった(約105ng/mL)。RABVシュードタイプ化中和は、抗体の傾向を反映させた(図13b)。4週間後、WTグループは約103の平均IC50を有していたが、それに対してMERS-CoVグループは約104のIC50を有していた。6週間後、MERS-CoVグループは約105のより一層高いIC50を有していたが、それに対してWTグループは約103で安定化された。これらはまた、マウス及びラットにおけるWT RABV及びRABV-MERS-CoV ORF4a saRNAの免疫原性とも比較したが(図27)、これらの種のいずれかにおいて、抗体力価にも中和IC50にもまったく差が観察されなかった。いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、MERS-CoV ORF4aタンパク質がウサギにおいてsaRNAによってコードされるRABV糖タンパク質の免疫原性を強化することを示す。
核酸配合物のタンパク質発現は必ずしも免疫原性の直接の予測変数とは限らないため(2)、本発明者らは次いで、本発明のsaRNA構築物においてMERS-CoV ORF4aタンパク質(生来の阻害タンパク質又はIIPとして作用する)と組み合わせた場合の、治療用生体分子として作用するモデルタンパク質、すなわちGeneBank識別番号NP_056796.1によって表される狂犬病糖タンパク質(RABV)の免疫原性を特徴付けることを試みた。加えて細胞のp75NTR表面受容体への結合を防止するアミノ酸置換、F318V改変を有するRABVタンパク質を使用した。本発明者らは、ウサギに20μgのsaRNAの一次用量を注射し、4週間後にブーストを注射し、次いで0、4、及び6週間後にその血液中のRABV特異的なIgG抗体をサンプリングした(図13a)。本発明者らは、野生型及びMERS-CoV ORF4a構築物の両方の全てのウサギが、単回注射後に血清変換したことを観察した。MERS-CoVグループのIgG力価は、4週間後、野生型(約5×103ng/mL)と比較してわずかに高かったが(約104ng/mL)、これは統計学的に有意ではなかった。しかしながら、6週間後、MERS-CoV ORF4aグループにおける動物の抗体力価は、WT(約104ng/mL)と比較して、p=0.0061で有意に高かった(約105ng/mL)。RABVシュードタイプ化中和は、抗体の傾向を反映させた(図13b)。4週間後、WTグループは約103の平均IC50を有していたが、それに対してMERS-CoVグループは約104のIC50を有していた。6週間後、MERS-CoVグループは約105のより一層高いIC50を有していたが、それに対してWTグループは約103で安定化された。これらはまた、マウス及びラットにおけるWT RABV及びRABV-MERS-CoV ORF4a saRNAの免疫原性とも比較したが(図27)、これらの種のいずれかにおいて、抗体力価にも中和IC50にもまったく差が観察されなかった。いずれの特定の理論にも関連付けることは望まないが、これらのデータは、MERS-CoV ORF4aタンパク質がウサギにおいてsaRNAによってコードされるRABV糖タンパク質の免疫原性を強化することを示す。
【0313】
MERS-CoV ORF4aタンパク質はインビトロでSARS-CoV-2糖タンパク質の発現を強化する
本発明者らはまた、本発明のsaRNA構築物においてMERS-CoV ORF4aタンパク質(すなわち生来の阻害タンパク質又はIIP)と組み合わせた場合の、別のモデルタンパク質(すなわち治療用生体分子)、Genbank識別番号QHD43416.1によって表されるSARS-CoV-2糖タンパク質の免疫原性も特徴付けた。
本発明者らはまた、本発明のsaRNA構築物においてMERS-CoV ORF4aタンパク質(すなわち生来の阻害タンパク質又はIIP)と組み合わせた場合の、別のモデルタンパク質(すなわち治療用生体分子)、Genbank識別番号QHD43416.1によって表されるSARS-CoV-2糖タンパク質の免疫原性も特徴付けた。
【0314】
HeLa細胞株へのトランスフェクションの24時間後に、SARS-CoV-2(IIPなし)とMERS-CoV ORF4a(IIP)と組み合わせたSARS-CoV-2との間で表面発現のレベルを比較した。図29を参照すると、細胞の陽性集団の蛍光強度中央値を測定し、ここで陰性/陽性カットオフは、生きた単一の細胞として、及び擬似トランスフェクトされた細胞としてゲーティングされた細胞に設定された。驚くべきことに、MERS-CoV ORF4aタンパク質は、SARS-CoV-2糖タンパク質のみをコードするsaRNA(すなわちIIPなし)と比較した場合、SARS-CoV-2糖タンパク質の細胞ごとの発現レベルのほぼ2倍になった。
【0315】
考察
本発明者らは、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒト細胞においてインビトロでの、ヒト皮膚外植片においてエクスビボでの、及びマウスにおいてインビボでのタンパク質発現に関して、加えて、マウス、ラット及びウサギにおける免疫原性に関して、cisコード化インターフェロン阻害タンパク質を用いて自己増幅RNAのライブラリーをスクリーニングした。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質が、インビトロで、IFNコンピテントHeLa及びMRC5細胞においてタンパク質発現を100～500倍強化したことを観察した。本発明者らは、MERS-CoV ORF4aタンパク質がインビボにおいて部分的に用量非直線性を低減すること、及びIIPSではなくルキソリチニブがインビボにおいてsaRNAのタンパク質発現を強化することを見出した。PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質の両方が、ヒト皮膚外植片におけるsaRNAを発現する常在細胞のパーセンテージを強化することが見出され、saRNAの用量非直線性を十分奪回したが、ルキソリチニブは、細胞に応じてタンパク質発現を増加させる。最終的に、本発明者らは、MERS-CoV ORF4aが、ウサギにおいてRABV特異的なIgG力価及び中和IC50を約10倍増加させたが、ただしマウス又はラットでは増加させなかったことを観察した。
本発明者らは、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒト細胞においてインビトロでの、ヒト皮膚外植片においてエクスビボでの、及びマウスにおいてインビボでのタンパク質発現に関して、加えて、マウス、ラット及びウサギにおける免疫原性に関して、cisコード化インターフェロン阻害タンパク質を用いて自己増幅RNAのライブラリーをスクリーニングした。本発明者らは、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質が、インビトロで、IFNコンピテントHeLa及びMRC5細胞においてタンパク質発現を100～500倍強化したことを観察した。本発明者らは、MERS-CoV ORF4aタンパク質がインビボにおいて部分的に用量非直線性を低減すること、及びIIPSではなくルキソリチニブがインビボにおいてsaRNAのタンパク質発現を強化することを見出した。PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質の両方が、ヒト皮膚外植片におけるsaRNAを発現する常在細胞のパーセンテージを強化することが見出され、saRNAの用量非直線性を十分奪回したが、ルキソリチニブは、細胞に応じてタンパク質発現を増加させる。最終的に、本発明者らは、MERS-CoV ORF4aが、ウサギにおいてRABV特異的なIgG力価及び中和IC50を約10倍増加させたが、ただしマウス又はラットでは増加させなかったことを観察した。
【0316】
これらの実験で特徴付けられたタンパク質の設計、細胞及び突然変異は、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aタンパク質がタンパク質発現を増加させるメカニズムへの識見を提供する。PIV-5Vタンパク質は、MDA-5に結合することによってMDA-5及びIRF3をブロックするが(26、27)、それに対してMERS-CoV ORF4aタンパク質は、dsRNAに結合し、MDA-5及びRIG-IのPACTの駆動を抑制する(29～31)。本発明者らのインビトロにおけるスクリーニングの後、インビボで全ての10種の候補をスクリーニングすることは実現不可能であり、PIV-5Vタンパク質は種間で保存されないが(例えばマウスへの適合のために必要なN100D突然変異(44))、それに対してORF4aタンパク質は、種間でより高度に保存されていることから(29～31)、本発明者らは、MERS-CoV ORF4aレプリコンを用いて前進することを選択した。本発明者らは、PIV-5Vタンパク質へのR172A突然変異は、STATではなくMDA-5への結合をブロックする能力を排除するものであり(45)、これは、MRC5細胞においてタンパク質発現をわずかに阻害することを観察し(図15d)、したがってMDA5への結合は、タンパク質発現の強化に部分的に関与することが示される。同様にMERS-CoV ORF4aタンパク質へのK63A/K67A突然変異は、dsRNAと結合する能力を制限し(46、47)、これは、非ヒト霊長類及びヒト細胞の両方においてタンパク質発現を低減することが観察された(図15c、図15d)。様々なIIPが、PIV-5V及びMERS-CoV ORF4aと類似したメカニズムによってインターフェロンを阻害するが、タンパク質発現強化を予測する作用メカニズムは、必ずしも観察されない。
【0317】
本発明者らは、これまでに、saRNA配合物のタンパク質発現は、必ずしも免疫原性を予測するわけではないことを観察したことから(2)、どのようにMERS-CoV ORF4aタンパク質がマウス、ラット及びウサギにおいて狂犬病糖タンパク質の免疫原性に影響を与えるかも特徴付けた。本発明者らは、ウサギにおいてRABV及びMERS-CoV ORF4aをコードするsaRNAを用いた抗体力価及び中和IC50の両方における増加を観察したが(図13a、図13b)、マウス又はラットにおける免疫原性の増加は観察しなかった。ヒト応答を完全に予測する前臨床動物モデルはないが、ウサギは、マウス又はラットよりも免疫学的にヒトに類似しているとみなされている(48～50)。更に、本発明者らは、マウス細胞においてPIV-5V又はMERS-CoV ORF4aタンパク質のいずれによってもタンパク質発現の強化をまったく観察しなかったことから(図15a)、免疫原性の強化の欠如は予想外ではない。本発明者らは、前臨床動物モデルにおける特徴付けを、細胞が天然の組織構造を有し、固有のヒトIFN応答を有するヒト外植片モデルに対応させた。本発明者らが知る限り、IIPがsaRNAを発現する細胞のパーセンテージを強化し、それに対してルキソリチニブが細胞に応じて発現を強化することを観察したのは本発明者らが最初である。これらの有望な結果を考慮して、本発明者らは、MERS-CoV ORF4aタンパク質が、ヒトにおいてsaRNAワクチンの免疫原性を強化でき、タンパク質補充療法へのsaRNA適用にも有用であり得ると仮定する(51、52)。
【0318】
これらの実験は、IIPが、saRNAベクターに直接コードさせることができ、非線形の用量依存性を効果的に低減し、免疫原性を強化するという概念実証を提供する。機械論的な研究によって示されるように、インターフェロン経路の異なる態様を標的化し、saRNA発現を増加させることができ、したがってこれは、IIPと他のIFN阻害戦略、例えばルキソリチニブとの組合せを探索する動機づけとなる。
【0319】
財政援助の記述
この出願に残っているプロジェクトは、Marie Sklodowska-Curie助成金契約番号794059に基づく欧州連合のHorizon 2020 research and innovation programmeからの資金提供を受けた。
この出願に残っているプロジェクトは、Marie Sklodowska-Curie助成金契約番号794059に基づく欧州連合のHorizon 2020 research and innovation programmeからの資金提供を受けた。
【0320】
[参考文献]
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15a)】
【図15b)】
【図15c)】
【図15d)】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26a】
【図26b】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】
【国際調査報告】