特表 2022-537572 ＣＡＭＫＩＩデルタ９のアンタゴニストおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-26

(54)【発明の名称】ＣＡＭＫＩＩデルタ９のアンタゴニストおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20220819BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220819BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220819BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220819BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220819BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20220819BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20220819BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220819BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220819BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20220819BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220819BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220819BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P43/00 111

A61P9/00

A61P43/00 107

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/713

A61K31/7115

A61K31/712

A61K31/7125

A61K35/76

A61K35/761

A61P9/10

A61P9/04

A61P9/06

A61P9/12

A61P29/00 101

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61P27/02

A61P19/06

C07K16/40 ZNA

C12N5/071

C07K16/46

C12N15/864 100Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/63 Z

C12Q1/02

C07K14/47

G01N33/53 D

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021575976

(86)(22)【出願日】2020-06-11

(85)【翻訳文提出日】2022-02-04

(86)【国際出願番号】 CN2020095555

(87)【国際公開番号】W WO2020253608

(87)【国際公開日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/091685

(32)【優先日】2019-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/103678

(32)【優先日】2019-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513187900

【氏名又は名称】北京大学

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１ ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】チャン，マオ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，ルイ－ピン

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，フア

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR07

4B063QS15

4B063QX10

4B065AA90X

4B065BA30

4B065BD32

4B065BD44

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA361

4C084ZA371

4C084ZA381

4C084ZA401

4C084ZA421

4C084ZA701

4C084ZB221

4C084ZC202

4C084ZC311

4C084ZC331

4C084ZC351

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA37

4C086ZA38

4C086ZA40

4C086ZA42

4C086ZA70

4C086ZB22

4C086ZC20

4C086ZC31

4C086ZC33

4C086ZC35

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087NA14

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA37

4C087ZA38

4C087ZA40

4C087ZA42

4C087ZA70

4C087ZB22

4C087ZC20

4C087ZC31

4C087ZC33

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

Ｃａ^２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）介在性疾患を治療または予防する方法、心損傷を緩和する方法、ユビキチン結合酵素の活性を刺激する方法、ユビキチン結合酵素の分解を防ぐ方法、心筋細胞死を防ぐ方法、細胞中でのＤＮＡ損傷を軽減する方法、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するための方法、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのキット、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカー、およびＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカーとしてのＣａＭＫＩＩδ９の使用を提供する。分子を同定するための方法、単離ペプチド、単離核酸、およびそれらのアンタゴニストも本明細書中で提供される。
【選択図】図２－２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項2】

対象において心損傷を緩和する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項3】

対象においてユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を刺激する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項4】

対象においてユビキチン結合酵素の分解を防ぐ方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項5】

試料中での心筋細胞死を防ぐ方法であって、前記試料を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法。

【請求項6】

細胞中でのＤＮＡ損傷を軽減する方法であって、前記細胞を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法。

【請求項7】

前記アンタゴニストが、ユビキチン結合酵素のリン酸化を阻害するアンタゴニストである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ユビキチン結合酵素がユビキチン結合酵素２Ｔである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記アンタゴニストが、Ｓｅｒ１１０でのユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化を阻害するアンタゴニストである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特異的アンタゴニストである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を阻害するが、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３のレベルまたは活性を有意に阻害しない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ９に結合する小分子化合物、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ分子、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、またはＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する薬剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によってコードされるアミノ酸配列に結合する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＮＡｉ分子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記ＲＮＡｉ分子が１０～１００塩基を有する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記アンチセンスヌクレオチドが、その安定性を改善するために修飾されている、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

前記ＲＮＡｉ分子および前記アンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６に結合する、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

前記ＲＮＡｉ分子および前記アンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６およびエクソン１７、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６およびエクソン１７に結合する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する前記薬剤が、リン酸化または酸化の機能を有しないＣａＭＫＩＩ－δ９を発現するベクターである、請求項１２に記載の方法。

【請求項22】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはプラスミドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記対象がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記非ヒト霊長類がアカゲザルである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性の上昇と関連する、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、心疾患または代謝性疾患である、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記心疾患が、心筋症、心筋炎、糖尿病性心疾患、心筋虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心肥大、心損傷、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、狭心症、心筋炎、冠動脈心疾患および心膜炎からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記代謝性疾患が、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病性足病変、高インスリン血症、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、痛風および高尿酸血症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断する方法であって、
（ａ）前記対象の検査生体試料を取得する工程；
（ｂ）前記検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を検出する工程であって、前記対象の前記検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の前記レベルまたは活性が、前記対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、工程
を含む方法。

【請求項31】

前記検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９の前記レベルまたは活性が、ＣａＭＫＩＩ－δ９と特異的に結合する試薬と前記試料を接触させることにより検出される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の前記レベルまたは活性が、基準試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性と比較される、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の、ＣａＭＫＩＩ－δ９の前記基準のレベルまたは活性よりも高いレベルまたは活性が、前記対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記基準試料が、健常対象からであるか、または前記同一対象から、前記検査生体試料よりも先にもしくは後に取得した試料である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記検査生体試料が、前記対象の心臓からである、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記対象がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体または抗体断片を含む、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのキット。

【請求項38】

ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害する分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項39】

ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化を阻害する分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項40】

ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項41】

心損傷を緩和する分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項42】

心筋細胞死を防ぐ分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項43】

ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定するための方法であって、前記分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびユビキチン結合酵素２Ｔと接触させる工程、ならびにユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法。

【請求項44】

ユビキチン結合酵素２Ｔのリン酸化が、Ｓｅｒ１１０においてである、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

ＣａＭＫＩＩ－δ９の全長タンパク質配列またはその断片を含む、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカー。

【請求項46】

配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のバイオマーカー。

【請求項47】

対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカーとしてのＣａＭＫＩＩ－δ９の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[001]本発明は、生物医学分野に関する。特に、本発明は、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストおよびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

[002]生物の寿命にわたり絶えず、ゲノムは様々な内部ストレス信号および外部ストレス信号によって攻撃され、ＤＮＡ損傷に至る。過剰なＤＮＡ損傷は、ゲノム完全性を損ない、ＤＮＡの複製および転写を妨げる（Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｊ． ＆ ｄ’Ａｄｄａ ｄｉ Ｆａｇａｇｎａ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ８，７２９－７４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ２２３３（２００７））。予防として、ＤＮＡ修復が、有害なＤＮＡ損傷から守り、ゲノム安定性および細胞生存性を維持する。異常なＤＮＡ修復は、ＤＮＡ損傷の蓄積およびゲノム不安定性を引き起こし、細胞死をもたらす。哺乳類の心筋細胞は、再生能力がほとんどないか、またはまったくないため、最終分化心筋細胞の損失は、心筋梗塞、心筋症および心不全を含む多数の型の心疾患の一般的な病因である。しかしながら、心筋細胞のＤＮＡ修復機構は、多くが不明なままである。

【0003】

[003]Ｃａ^２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）は、多機能性セリン／スレオニンプロテインキナーゼのファミリーであり、心臓の細胞生存および細胞死の調節に関与する（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｒｕｍｂａｃｈ，Ｉ．Ｍ． ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ９１，８８９－９１５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１８．２０１０（２０１１））。ＣａＭＫＩＩは、４つの遺伝子、ＣａＭＫＩＩ－α、β、γおよびδによってコードされ、ＣａＭＫＩＩ－δが、主に心臓で発現される。ＣａＭＫＩＩ－δは、２つの可変ドメインである、エクソン１３から１７の間（可変ドメイン１）およびエクソン２０から２２の間（可変ドメイン２）において選択的スプライシングされて、１１個の異なるスプライスバリアントを生成する。特に、ＣａＭＫＩＩ－δ２（ＣａＭＫＩＩ－δＣとも呼ばれる）およびＣａＭＫＩＩ－δ３（またはＣａＭＫＩＩ－δＢ）が、心臓の主要スプライスバリアントとして以前に同定されており、それぞれ、細胞質および核に局在する。明らかになってきた証拠は、ＣａＭＫＩＩ－δ２およびＣａＭＫＩＩ－δ３が、心筋細胞生存性に対して異なる作用、拮抗作用さえも誘発することを示唆する（Ｐｅｎｇ，Ｗ．等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ １０６，１０２－１１０，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１０９．２１０９１４（２０１０））。しかしながら、心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δ９の生理学的機能および病理学的機能についてはほとんど知られていない。

【発明の概要】

【0004】

[004]本発明では、本発明者が、ヒト心臓での主なＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントとして、よく研究されたＣａＭＫＩＩ－δ２およびδ３よりむしろ、ＣａＭＫＩＩ－δ９を同定した。様々な刺激に反応してＣａＭＫＩＩ－δ９はアップレギュレートされ、心筋細胞のＤＮＡ損傷、ゲノム不安定性の誘発および心臓病理において、別のスプライスバリアント（ＣａＭＫＩＩ－δ２およびδ３）よりもはるかに強力である。本発明者はさらに、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特徴配列であるエクソン１３－１６－１７によりコードされるペプチドが、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化および分解のスプライスバリアント特異的調節を与えることを解明した。

【0005】

[005]一態様では、本発明は、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。

【0006】

[006]別の態様では、本発明は、対象において心損傷を緩和する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。
[007]さらに別の態様では、本発明は、対象においてユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を刺激する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。

【0007】

[008]さらに別の態様では、本発明は、対象においてユビキチン結合酵素の分解を防ぐ方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。

【0008】

[009]さらに別の態様では、本発明は、試料中での心筋細胞死を防ぐ方法であって、該試料を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法を開示する。

【0009】

[0010]さらに別の態様では、本発明は、細胞中でのＤＮＡ損傷を軽減する方法であって、該細胞を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法を開示する。

【0010】

[0011]いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性化を阻害できるか、またはＣａＭＫＩＩ－δ９のキナーゼ活性を阻害できる。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、ＣａＭＫＩＩ－δ９それ自体のリン酸化および／または酸化によって活性化される。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９のキナーゼ活性を、その基質、例えば、ユビキチン結合酵素、特にユビキチン結合酵素２Ｔ（ＵＢＥ２Ｔ）のリン酸化能として示す。いくつかの実施形態では、本発明のアンタゴニストが、ユビキチン結合酵素のリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該ユビキチン結合酵素が、ＵＢＥ２Ｔである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０におけるリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特異的アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を阻害するが、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３のレベルまたは活性を有意に阻害しない。

【0011】

[0012]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ９に結合する小分子化合物、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ分子、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、またはＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する薬剤である。

【0012】

[0013]いくつかの実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によってコードされるアミノ酸配列に結合する。

【0013】

[0014]いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子が１０～１００塩基を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスヌクレオチドが、その安定性を改善するために修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子およびアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子およびアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６（本発明では「エクソン１３－１６」とも呼ばれる）、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６およびエクソン１７（本発明では「エクソン１６－１７」とも呼ばれる）、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６およびエクソン１７（本発明では「エクソン１３－１６－１７」とも呼ばれる）に結合する。

【0014】

[0015]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する薬剤が、リン酸化または酸化の機能を有しないＣａＭＫＩＩ－δ９を発現するベクターである。いくつかの実施形態では、該ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはプラスミドである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０である。

【0015】

[0016]いくつかの実施形態では、対象がヒトまたは非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、該非ヒト霊長類がアカゲザルである。いくつかの実施形態では、対象が、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスである。

【0016】

[0017]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性の上昇と関連する。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、心疾患または代謝性疾患である。いくつかの実施形態では、該心疾患が、心筋症、心筋炎、糖尿病性心疾患、心筋虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心肥大、心損傷、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、狭心症、心筋炎、冠動脈心疾患および心膜炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該心疾患が、肥大型心筋症である。いくつかの実施形態では、該代謝性疾患が、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病性足病変、高インスリン血症、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、痛風および高尿酸血症からなる群から選択される。

【0017】

[0018]別の態様では、本発明が、対象のＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するための方法であって、（ａ）該対象の検査生体試料を取得する工程；（ｂ）該検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を検出する工程であって、該対象の該検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の該レベルまたは活性が、該対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、工程を含む方法に関する。

【0018】

[0019]いくつかの実施形態では、検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性は、ＣａＭＫＩＩ－δ９に特異的に結合する試薬と試料を接触させることにより検出される。いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性が、基準試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性と比較される。いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の、ＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性よりも高いレベルまたは活性が、対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す。いくつかの実施形態では、基準試料が、健常対象からであるか、または同一対象から、検査生体試料よりも先にもしくは後に取得した試料である。いくつかの実施形態では、検査生体試料が、対象の心臓からである。いくつかの実施形態では、対象がヒトまたは非ヒト霊長類である。

【0019】

[0020]別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体または抗体断片を含む、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのキットを開示する。

【0020】

[0021]別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の全長タンパク質配列またはその断片を含む、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカーを開示する。いくつかの実施形態では、該バイオマーカーが、配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0021】

[0022]別の態様では、本発明が、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのバイオマーカーとしてのＣａＭＫＩＩ－δ９の使用を開示する。
[0023]別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法を開示する。

【0022】

[0024]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化能を阻害する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化能を阻害する分子を同定する、方法を開示する。

【0023】

[0025]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９それ自体のリン酸化および／または酸化を阻害する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９、およびＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化の状態を検出できる抗体と接触させる工程、ならびにリン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルが低下するかどうかを決定する工程を含み、リン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルの低下が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化を阻害する分子を同定する、方法を開示する。

【0024】

[0026]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定する、方法を開示する。

【0025】

[0027]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９、およびＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化の状態を検出できる抗体と接触させる工程、ならびにリン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルが低下するかどうかを決定する工程を含み、リン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルの低下が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定する、方法を開示する。

【0026】

[0028]さらに別の態様では、本発明が、心損傷を緩和する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、心損傷を緩和する分子を同定する、方法を開示する。

【0027】

[0029]さらに別の態様では、本発明が、心損傷を緩和する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９、およびＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化の状態を検出できる抗体と接触させる工程、ならびにリン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルが低下するかどうかを決定する工程を含み、リン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルの低下が、心損傷を緩和する分子を同定する、方法を開示する。

【0028】

[0030]さらに別の態様では、本発明が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定する、方法を開示する。

【0029】

[0031]さらに別の態様では、本発明が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９、およびＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化の状態を検出できる抗体と接触させる工程、ならびにリン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルが低下するかどうかを決定する工程を含み、リン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルの低下が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定する、方法を開示する。

【0030】

[0032]さらに別の態様では、本発明が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔと接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定する、方法を開示する。

【0031】

[0033]いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、Ｓｅｒ１１０においてである。
[0034]さらに別の態様では、本発明が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定するための方法であって、該分子を、ＣａＭＫＩＩ－δ９、およびＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および／または酸化の状態を検出できる抗体と接触させる工程、ならびにリン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルが低下するかどうかを決定する工程を含み、リン酸化および／または酸化されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルの低下が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定する、方法を開示する。

【0032】

[0035]別の態様では、本発明が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む単離ＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドを開示する。

【0033】

[0036]さらに別の態様では、本発明が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ＣａＭＫＩＩ－δ核酸を開示する。いくつかの実施形態では、該ＣａＭＫＩＩ－δ核酸が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号６～１９に対する少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列の１つを含む。

【0034】

[0037]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を阻害できるＣａＭＫＩＩアンタゴニストを開示する。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ユビキチン結合酵素のリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該ユビキチン結合酵素が、ＵＢＥ２Ｔである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０におけるリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特異的アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を阻害するが、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３のレベルまたは活性を有意に阻害しない。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によりコードされるアミノ酸配列に結合する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６を標的とするＲＮＡｉ分子、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６によりコードされるアミノ酸配列に結合する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６を標的とするＲＮＡｉ分子、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３およびエクソン１６を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６およびエクソン１７によりコードされるアミノ酸配列に結合する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６およびエクソン１７を標的とするＲＮＡｉ分子、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６およびエクソン１７を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３、エクソン１６およびエクソン１７によりコードされるアミノ酸配列に結合する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３、エクソン１６およびエクソン１７を標的とするＲＮＡｉ分子、またはＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３、エクソン１６およびエクソン１７を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のアミノ酸配列に結合する抗体、全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ分子、または全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。

【0035】

[0038]さらに別の態様では、本発明が、本発明のアンタゴニストおよび薬学上許容される担体を含む医薬組成物を開示する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】[0039]図１は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、重要な心臓細胞質基質ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントであることを示す。図１ａは、スプライシングのランドスケープならびにマウス、ラット、アカゲザルおよびヒトの心臓における全ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントの発現レベルの図である。転写産物地図が、ＳＭＲＴシーケンシングにより得られた１１個の報告されている選択的スプライシングバリアント（行）を視覚化する。エクソン（列）が存在する場合は黒色であり、下部に番号を付けた（低い方の列、ＵＴＲ領域；黒線、エクソン結合）。各ボックスの長さは、各エクソンの長さに比例し、各スプライシングバリアントの百分率を棒グラフに示し（右図、ＣａＭＫＩＩ－δ９は灰色）、主要バリアントのいくつかの絶対的リード数をバー上に示す（各種において３つの試料をまとめた）。図１ｂは、エクソン２１抗体によるマウス心臓からの総タンパク質をエクソン１６抗体で検査、およびその逆の場合の相互免疫沈降の図である。入力レーンは、同じ膜の長時間の露出である。ｎ＝３の生物学的独立サンプル。図１ｃは、抗エクソン２１抗体または抗エクソン１６抗体で免疫沈降したヒト心臓中の、定量的質量分析によりアッセイしたＣａＭＫＩＩ－δエクソンジャンクションの相対的ペプチド量の図である。ｎ＝３（左図）およびｎ＝８（右図）の生物学的独立サンプル。図１ｄは、Ａｄ－Ｆｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させたＮＲＶＭ中でのＦｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ９（右上図）およびＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ２（左下図）の細胞質基質局在を示す共焦点免疫蛍光顕微鏡画像である。スケールバー、１０μｍ。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図１ｅは、１μＭのドキソルビシン（２４ｈ）に曝したＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルの図である（図１ｅ、ｎ＝１２（媒介物）および１０（Ｄｏｘ）の生物学的独立サンプル）。図１ｆは、２００μＭのＨ_２Ｏ_２（２４ｈ）に曝したＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルの図である（図１ｆ、ｎ＝７（媒介物）および５（Ｈ_２Ｏ_２）の生物学的独立サンプル）。図１ｇは、肥大心マウス（ＴＡＣを２週間）中でのＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルを、対応する対照と共に示した図である（図１ｇ、ｎ＝５（シャム）および６（ＴＡＣ）の生物学的独立サンプル）。図１ｈは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）を患うヒトからの心筋組織中でのＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルを、対応する対照と共に示した図である（図１ｈ、ｎ＝７（正常ヒト）および６（ＨＣＭ）の生物学的独立サンプル）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析（図１ｃの左図）、スチューデントの両側ｔ検定（図１ｃの右図、図１ｅ～図１ｈ）。

【図2-1】[0040]図２は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションにより、心筋細胞死を誘導することを示す。図２ａは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。図２ｂは、Ｄｏｘ（１μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図２ｃは、表示するＭＯＩ（感染多重度）のＡｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で４８ｈにわたり感染させたＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６（Ａｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９）、ｎ＝４（Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２）の生物学的独立サンプル。図２ｄは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中で、ＣａＭＫＩＩ－δ９によりアップレギュレートされたがＣａＭＫＩＩ－δ２によってはアップレギュレートされなかった３遺伝子のリアルタイムＰＣＲによりアッセイしたｍＲＮＡレベルの平均化データの図である。ｎ＝１４の生物学的独立サンプル。図２ｅは、ＣａＭＫＩＩ－δ９は用量依存性にＵＢＥ２Ｔを低下させるが、ＣａＭＫＩＩ－δ２は低下させないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。図２ｆは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｇは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＡｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｈは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡで６０ｈにわたり処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｉは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｊは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＨ_２Ｏ_２（２００μＭ）に曝したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置分散分析（ａ、ｂ、ｇ、ｊ）、一元配置分散分析（ｃ、ｄ、ｅ、ｈ）、またはスチューデントの両側ｔ検定（ｆ、ｉ）。

【図2-2】[0040]図２は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションにより、心筋細胞死を誘導することを示す。図２ａは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。図２ｂは、Ｄｏｘ（１μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図２ｃは、表示するＭＯＩ（感染多重度）のＡｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で４８ｈにわたり感染させたＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６（Ａｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９）、ｎ＝４（Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２）の生物学的独立サンプル。図２ｄは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中で、ＣａＭＫＩＩ－δ９によりアップレギュレートされたがＣａＭＫＩＩ－δ２によってはアップレギュレートされなかった３遺伝子のリアルタイムＰＣＲによりアッセイしたｍＲＮＡレベルの平均化データの図である。ｎ＝１４の生物学的独立サンプル。図２ｅは、ＣａＭＫＩＩ－δ９は用量依存性にＵＢＥ２Ｔを低下させるが、ＣａＭＫＩＩ－δ２は低下させないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。図２ｆは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｇは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＡｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｈは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡで６０ｈにわたり処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｉは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｊは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＨ_２Ｏ_２（２００μＭ）に曝したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置分散分析（ａ、ｂ、ｇ、ｊ）、一元配置分散分析（ｃ、ｄ、ｅ、ｈ）、またはスチューデントの両側ｔ検定（ｆ、ｉ）。

【図2-3】[0040]図２は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションにより、心筋細胞死を誘導することを示す。図２ａは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。図２ｂは、Ｄｏｘ（１μＭ）の存在下または不在下にスクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図２ｃは、表示するＭＯＩ（感染多重度）のＡｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で４８ｈにわたり感染させたＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝６（Ａｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９）、ｎ＝４（Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２）の生物学的独立サンプル。図２ｄは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中で、ＣａＭＫＩＩ－δ９によりアップレギュレートされたがＣａＭＫＩＩ－δ２によってはアップレギュレートされなかった３遺伝子のリアルタイムＰＣＲによりアッセイしたｍＲＮＡレベルの平均化データの図である。ｎ＝１４の生物学的独立サンプル。図２ｅは、ＣａＭＫＩＩ－δ９は用量依存性にＵＢＥ２Ｔを低下させるが、ＣａＭＫＩＩ－δ２は低下させないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。図２ｆは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｇは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＡｄ－β－ｇａｌおよびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｈは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡで６０ｈにわたり処理したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｉは、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔの発現を示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝５の生物学的独立サンプル。図２ｊは、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現と共にまたは伴わずにＨ_２Ｏ_２（２００μＭ）に曝したＮＲＶＭ中での細胞カスパーゼ３／７活性の図である。ｎ＝８の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置分散分析（ａ、ｂ、ｇ、ｊ）、一元配置分散分析（ｃ、ｄ、ｅ、ｈ）、またはスチューデントの両側ｔ検定（ｆ、ｉ）。

【図3】[0041]図３は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、ＵＢＥ２Ｔ介在性ＤＮＡ修復を破壊することにより、心筋細胞のＤＮＡ損傷およびゲノム不安定性を誘導することを示す。図３ａは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）γＨ２ＡＸ陽性ＮＲＶＭの代表的免疫染色および統計データの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。矢印は、γＨ２ＡＸ陽性の核を示す。スケールバー、２０μｍ。図３ｂは、ＮＲＶＭ中のＣａＭＫＩＩ－δ９が、用量依存性にγＨ２ＡＸを増加させることを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝１０の生物学的独立サンプル。図３ｃは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中でのコメットアッセイにより評価したＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。矢印が、ＤＮＡ損傷を伴う核を示す。スケールバー、２０μｍ。図３ｄは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理した、Ｈ_２Ｏ_２（１００μＭ、１０分間）を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのγＨ２ＡＸ免疫染色により評価したＤＮＡ損傷の図である。図３ｅは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理した、Ｈ_２Ｏ_２（１００μＭ、１０分間）を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのコメットアッセイにより評価したＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図３ｆは、Ａｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＵＢＥ２Ｔで感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのγＨ２ＡＸ免疫染色により評価したＤＮＡ損傷の図である。図３ｇは、Ａｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＵＢＥ２Ｔで感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのコメットアッセイにより評価したＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図３ｈは、Ａｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＵＢＥ２Ｔで感染させた、Ｈ_２Ｏ_２（１００μＭ、１０分間）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのγＨ２ＡＸ免疫染色により評価したＤＮＡ損傷の図である。図３ｉは、Ａｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＵＢＥ２Ｔで感染させた、Ｈ_２Ｏ_２（１００μＭ、１０分間）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのコメットアッセイにより評価したＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図３ｊは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡで６０ｈにわたり処理したＮＲＶＭ中でのγＨ２ＡＸ免疫染色により評価したＤＮＡ損傷の図である。図３ｋは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡで６０ｈにわたり処理したＮＲＶＭ中でのコメットアッセイにより評価したＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図３ｌは、スクランブル、ＦＡＮＣＤ２ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのＨ２ＡＸのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。図３ｍは、スクランブル、ＦＡＮＣＩ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのＨ２ＡＸのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析（ａ、ｂ、ｃ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ）または二元配置分散分析（ｄ～ｉ）。

【図4】[0042]図４は、心筋症および心不全におけるＣａＭＫＩＩ－δ９－ＵＢＥ２Ｔ－ＤＮＡ損傷シグナル伝達の増強を示す。図４ａは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心筋組織のＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルの図である（ｎ＝８の生物学的独立動物）。図４ｂは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスのカプラン・マイヤー生存曲線の図である（ｎ＝２０（ｗｔ）および２２（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）の生物学的独立動物）。図４ｃは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓肉眼形態の図である（ｎ＝１５（ｗｔ）および９（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）の生物学的独立動物）。図４ｄは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓ＴＵＮＥＬ染色の統計データの図である（ｎ＝５の生物学的独立動物）。スケールバー、２ｍｍ。図４ｅは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの６週齢および１０週齢での代表的な心エコー画像である。図４ｆは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの６週齢および１０週齢での統計データの図である。ｎ＝１３（ｗｔ６週齢）、１５（ｗｔ１０週齢）、１５（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ６週齢）および９（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ１０週齢）の生物学的独立動物。ＥＦ、駆出率；ＦＳ、短縮率；ＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓ、拡張期左室内径および収縮期左室内径；ＬＶＰＷｄおよびＬＶＰＷｓ、拡張期左室後壁厚および収縮期左室後壁厚。図４ｇは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの１０週齢での心臓γＨ２ＡＸ染色の統計データの図である。ｎ＝６の生物学的独立動物。図４ｈは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの１０週齢での心臓ＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルの図である。ｎ＝５（ｗｔ）およびｎ＝６（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）の生物学的独立動物。図４ｉは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｈＲＮＡトランスジェニック（ｓｈＲＮＡ ｔｇ）マウスの１０週齢での心臓中のＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルの図である。ｎ＝１４（ｗｔ）およびｎ＝１１（ｓｈＲＮＡ ｔｇ）の生物学的独立動物。図４ｊは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスのＥＦおよびＦＳの統計データの図である（ｎ＝１０（シャム）、１６（ｗｔ ＴＡＣ）、９（ｓｈＲＮＡ ｔｇ ＴＡＣ）の生物学的独立動物）。図４ｋは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスのカプラン・マイヤー生存曲線の図である（ｎ＝１７（ｗｔ）および２８（ｓｈＲＮＡ ｔｇ）の生物学的独立動物）。図４ｌは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスの心臓γＨ２ＡＸの図である（ｎ＝５の生物学的独立動物）。図４ｍは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスのＴＵＮＥＬ染色の図である（ｎ＝５の生物学的独立動物）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スチューデントの両側ｔ検定（ａ、ｄ、ｇ～ｉ、ｌ、ｍ）、ログランク（マンテル・コックス）検定（ｂ、ｋ）、または二元配置分散分析（ｆ、ｊ）。

【図5】[0043]図５は、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現が、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性のＤＮＡ損傷、心筋細胞死および心筋症を和らげることを示す。図５ａは、ＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスの構築の略図である。図５ｂは、ｗｔおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスと交配させたｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスのカプラン・マイヤー生存曲線の図である。ｎ＝６（ｗｔ＋ｗｔ）、５（ｗｔ＋ＵＢＥ２Ｔ ｔｇ）、２２（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ＋ｗｔ）および８（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ＋ＵＢＥ２Ｔ ｔｇ）の生物学的独立動物。図５ｃは、ｗｔおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスと交配させたｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心エコー検査により評価した左室の駆出率（ＥＦ）および短縮率（ＦＳ）の図である。ｎ＝６（ｗｔ＋ｗｔ）、５（ｗｔ＋ＵＢＥ２Ｔ ｔｇ）、１０（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ＋ｗｔ）および７（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ＋ＵＢＥ２Ｔ ｔｇ）の生物学的独立動物。図５ｄは、ｗｔおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスと交配させたｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスからの心臓中のＴＵＮＥＬ陽性細胞を指標とする細胞死の統計データの図である。図５ｅは、ｗｔおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスと交配させたｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスからの心臓中のγＨ２ＡＸ陽性細胞により明示されるＤＮＡ損傷の図である。ｎ＝５の生物学的独立動物。図５ｆは、ｗｔおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスと交配させたｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓からのＵＢＥ２Ｔのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４の生物学的独立動物。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ログランク（マンテル・コックス）検定（ｂ）または二元配置分散分析（ｃ～ｆ）。

【図6】[0044]図６は、肥大型心筋症を患う患者からの心筋、およびドキソルビシンで処理したヒト心筋細胞中でのＣａＭＫＩＩ－δ９－ＵＢＥ２Ｔ－ＤＮＡ損傷シグナル伝達の増強を示す。図６ａは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）を患うヒトまたは正常対照からの心筋組織中での切断型カスパーゼ３の代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４（正常ヒト）および８（ＨＣＭ）の生物学的独立サンプル。図６ｂは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）を患うヒトまたは正常対照からの心筋組織中でのＵＢＥ２Ｔの代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４（正常ヒト）および８（ＨＣＭ）の生物学的独立サンプル。図６ｃは、肥大型心筋症（ＨＣＭ）を患うヒトまたは正常対照からの心筋組織中でのγＨ２ＡＸの代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４（正常ヒト）および８（ＨＣＭ）の生物学的独立サンプル。図６ｄは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ１００、４８ｈ）ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのカスパーゼ３／７活性によりアッセイした細胞生存率の図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図６ｅは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ１００、４８ｈ）ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのγＨ２ＡＸのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図６ｆは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ１００、４８ｈ）ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのＵＢＥ２Ｔのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図６ｇは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで感染させた、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）処理（１ｍＭ、２４ｈ）を伴うまたは伴わないヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのカスパーゼ３／７活性によりアッセイした細胞生存率の図である（ｎ＝６の生物学的独立サンプル）。図６ｈは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで感染させた、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）処理（１ｍＭ、２４ｈ）を伴うまたは伴わないヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのγＨ２ＡＸのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図６ｉは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで感染させた、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）処理（１ｍＭ、２４ｈ）を伴うまたは伴わないヒト胚性幹細胞由来心筋細胞中でのＵＢＥ２Ｔのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スチューデントの両側ｔ検定（ａ～ｃ）、一元配置分散分析（ｄ～ｆ）、または二元配置分散分析（ｇ～ｉ）。

【図7】[0045]図７は、ＣａＭＫＩＩ－δ９がＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０でのリン酸化を上昇させ、その分解を促進することを示す。図７ａは、プロテアソーム阻害剤β－ｌａｃが、ＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９介在性のＵＢＥ２Ｔ分解およびγＨ２ＡＸアップレギュレーションを防ぐことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（５μＭ、ｎ＝８の生物学的独立サンプル）。図７ｂは、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２が、ＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９介在性のＵＢＥ２Ｔ分解およびγＨ２ＡＸアップレギュレーションを防ぐことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（１０μＭ、ｎ＝６の生物学的独立サンプル）。図７ｃは、ＣａＭＫＩＩ－δ９の不在下および存在下、ＭＧ１３２（１０μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭ中でのｍｙｃタグ付きＵＢＥ２Ｔの局在を示す代表的免疫染色画像の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。スケールバー、２０μｍ。図７ｄは、Ａｄ－Ｆｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃで感染させたＮＲＶＭ中での、ＵＢＥ２ＴによるＣａＭＫＩＩ－δ９の共免疫沈降の図である。入力は、各免疫沈降に使用した全細胞溶解物の６％を表す。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図７ｅは、ＣａＭＫＩＩ－δ９がＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔのセリンリン酸化を上昇させることを示す代表的ウエスタンブロットの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図７ｆは、ＣａＭＫＩＩ－δ９がＮＲＶＭ中でのスレオニンリン酸化は上昇させないことを示す代表的ウエスタンブロットの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図７ｇは、ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａ変異体はＣａＭＫＩＩ－δ９介在性分解に抵抗するが、ＷＴ ＵＢＥ２ＴまたはＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａ変異体は抵抗しないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび平均データの図である（ＭＯＩ５０、４８ｈ）。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図７ｈは、ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＣａＭＫＩＩ－δ２タンパク質の共インキュベーションを伴うまたは伴わない無細胞系中での、ＵＢＥ２Ｔ組換えタンパク質のセリンリン酸化および総レベルを例証する典型的ウエスタンブロットおよび平均データの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図７ｉは、Ａｄ－ＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃおよびＡｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させたＮＲＶＭの溶解物中でのＵＢＥ２ＴおよびＣａＭＫＩＩ－δ２の共免疫沈降の図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。二元配置分散分析（ａ、ｂ）または一元配置分散分析（ｇ、ｈ）。

【図8】[0046]図８は、ＣａＭＫＩＩ－δ９によるＵＢＥ２Ｔの特異的リン酸化を示す。図８ａは、Ａｄ－Ｆｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ１およびＡｄ－ＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃで感染させたＮＲＶＭ中での、ＵＢＥ２ＴによるＣａＭＫＩＩ－δ１の共免疫沈降の図である。入力は、各免疫沈降に使用した全細胞溶解物の６％を表す。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図８ｂは、ＣａＭＫＩＩ－δ９はＮＲＶＭ中のＵＢＥ２Ｔを低下させるが、ＣａＭＫＩＩ－δ１は低下させないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図８ｃは、Ａｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ３およびＡｄ－ＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃで感染させたＮＲＶＭ中での、ＵＢＥ２ＴによるＣａＭＫＩＩ－δ３の共免疫沈降の図である。入力は、各免疫沈降に使用した全細胞溶解物の６％を表す。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図８ｄは、ＣａＭＫＩＩ－δ９はＮＲＶＭ中のＵＢＥ２Ｔを低下させるが、ＣａＭＫＩＩ－δ３は低下させないことを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図８ｅは、エクソン１３－１６－１７のＣａＭＫＩＩ－δ９エクソンジャンクション（Ｆｌａｇ－ＧＦＰのタグ付き）またはＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中での、ＵＢＥ２Ｔによる、対応するエクソンジャンクションによりコードされるペプチドの共免疫沈降の図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図８ｆは、ＣａＭＫＩＩ－δ９介在性の心臓ＤＮＡ損傷および心筋細胞死シグナル伝達を示す略図である。正常状態では、ＵＢＥ２Ｔが、心筋細胞の生存を維持するために様々な型のＤＮＡ損傷からゲノムを守る。心筋細胞が損傷を受けると、ＣａＭＫＩＩ－δ９がアップレギュレートおよび過活性化され、それにより、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０リン酸化とそれに続く分解が高まる。ＵＢＥ２Ｔレベルの低下が、ＤＮＡ修復機構を損ない、ＤＮＡ損傷の蓄積、ゲノム不安定性および細胞死をもたらす。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析。

【図9】[0047]図９は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が心臓に存在することを示す。図９ａは、ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントの略図である。ＣａＭＫＩＩ－δは、主に、２つの可変ドメイン（一方はエクソン１３とエクソン１７との間で他方はエクソン２０以降）において選択的スプライシングイベントを受ける。エクソンには番号を付け、フルサイズのボックスはコーディングエクソンを表し、小さい緑色ボックスは非翻訳領域（ＵＴＲ）を意味し、特別なエクソンには彩色した。図９ｂは、全長ＣａＭＫＩＩ－δ転写産物のＳＭＲＴシーケンシングの戦略の図である。ＣａＭＫＩＩ－δ転写産物は、異なる種の心臓から単離された全ＲＮＡから逆転写した。各ｃＤＮＡを、異なる色の矢印でその位置を示した対プライマーで増幅した。フォワードプライマー（左側）はエクソン１上に位置し、リバースプライマー（右側）は、エクソン２２上に位置する。ＰＣＲ産物を濃縮し、ＳＭＲＴシーケンシング用に精製した。図９ｃは、ＲＮＡ－ｓｅｑによりアッセイした、ヒト、アカゲザル、イヌ、ラットおよびマウスの心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δの可変ドメイン１（エクソン１３からエクソン１７の間）中のエクソンジャンクションの百分率の図である。図９ｄは、ＲＮＡ－ｓｅｑによりアッセイした、ヒト、アカゲザル、イヌ、ラットおよびマウスの心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δの可変ドメイン１（エクソン１４からエクソン１７の間）中のエクソンジャンクションの百分率の図である。図９ｅは、ＲＮＡ－ｓｅｑによりアッセイした、ヒト、アカゲザル、イヌ、ラットおよびマウスの心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δの可変ドメイン２（エクソン２０からエクソン２２の間）中のエクソンジャンクションの百分率の図である。パネルｅでのサルおよびヒトの心臓において、エクソン２０ｂは、典型的なエクソン２０よりも１４７塩基長く、かつ以前に記載されていない、エクソン２０の別型である。データは平均値ｓ．ｅ．ｍ．である（ｎ＝８（ヒトおよびラット）、７（アカゲザル）、６（イヌおよびマウス）の生物学的独立サンプル）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析。

【図10】[0048]図１０は、心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質の同定を示す。図１０ａは、抗体を産生するための抗原として使用したエクソン１６および２１のペプチド配列の図である。図１０ｂは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ２、Ａｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ３、またはＡｄ－Ｆｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ９でトランスフェクトしたＮＲＶＭの、抗エクソン１６または抗エクソン２１を含有する血清による免疫ブロットの図である。ｎ＝３の生物学的独立サンプル。図１０ｃは、ＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質に対する相応する抗原ペプチドの比率を上昇させた際の、Ｆｌａｇタグ付きＣａＭＫＩＩ－δ９組換えタンパク質の、抗エクソン１６によるウエスタンブロットの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．。一元配置分散分析。図１０ｄは、ＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質に対する相応する抗原ペプチドの比率を上昇させた際の、Ｆｌａｇタグ付きＣａＭＫＩＩ－δ９組換えタンパク質の、抗エクソン２１によるウエスタンブロットの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．。一元配置分散分析。図１０ｅは、抗エクソン２１で免疫沈降した、１０週齢マウスの心臓溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに続いてクマシーブルー染色した図である。図１０ｆは、抗エクソン１６で免疫沈降した、１０週齢マウスの心臓溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに続いてクマシーブルー染色した図である。約５０ｋＤのバンド（ボックス）をＭＳ分析用にカットした。図１０ｇは、抗エクソン２１で免疫沈降したマウス心臓からのＣａＭＫＩＩ－δエクソン１３－１６－１７のジャンクションに一致するペプチドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳスペクトルの図である。図１０ｈは、抗エクソン１６で免疫沈降したマウス心臓からのＣａＭＫＩＩ－δエクソン２０－２１のジャンクションに一致するペプチドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳスペクトルの図である。上方のペプチド配列は、相当するエクソンジャンクションであり、特異的なエクソン１６およびエクソン２１を太字で示す。ｂ_ｎイオンは、ｎ番目のペプチド結合での、ペプチドのアミノ末端部を含有する断片であり、ｙ_ｎイオンは、カルボキシ末端部を含有する。ＮＬ、正規化した強度レベル（カウント毎秒）。図１０ｉは、アカゲザルにおけるＣａＭＫＩＩ－δ９の組織分布の図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図１０ｊは、ｗｔマウスにおけるＣａＭＫＩＩ－δ９の組織分布の図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。ＣａＭＫＩＩ－δ９組換えタンパク質を、陽性対照（ＰＣ）として利用した。両種ともにおいて、分子量が大きいバンドが脳内で検出され、それは、脳に濃縮されたスプライスバリアントＣａＭＫＩＩ－δ１（エクソン１３－１５－１６－１７）であった。図１０ｋは、ラットの成体（左側）および新生仔（右側）の心室心筋細胞中の内在性ＣａＭＫＩＩ－δ９（灰色）の細胞質基質局在を示す共焦点免疫蛍光顕微鏡画像である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１０ｌは、Ａｄ－ＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ３で感染させたＮＲＶＭ中でのＨＡ－ＣａＭＫＩＩ－δ３（灰色）の核局在を示す共焦点免疫蛍光顕微鏡画像である（ｎ＝６の生物学的独立サンプル）。スケールバー、１０μｍ。図１０ｍは、ＮＲＶＭの核分画および細胞質基質分画中のＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。

【図11】[0049]図１１は、心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δ９の病理学的な関連性を示す。図１１ａは、Ｄｏｘ処理（１μＭ、３０分間および６０分間）を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化レベルを示すウエスタンブロットの図である（ｎ＝８の生物学的独立サンプル）。図１１ｂは、Ｄｏｘ処理（１μＭ、３０分間および６０分間）を伴うまたは伴わないＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９の酸化レベルを示すウエスタンブロットの図である（ｎ＝７の生物学的独立サンプル）。ＮＲＶＭをＡｄ－Ｆｌａｇ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させて、溶解物を、Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降してウエスタンブロット解析した。図１１ｃは、Ｉ／Ｒ傷害（３０分間の虚血に続く６０分間の再灌流）を伴うまたは伴わない灌流マウス心臓中でのＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化レベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。心臓溶解物を、エクソン１６抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロット解析を行った。図１１ｄは、Ｉ／Ｒ傷害（３０分間の虚血に続く６０分間の再灌流）を伴うまたは伴わない灌流マウス心臓中でのＣａＭＫＩＩ－δ９の酸化レベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。心臓溶解物を、エクソン１６抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロット解析を行った。図１１ｅは、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡの配列の図である。黒色配列が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のエクソン１６中のｓｉＲＮＡ標的である。ｓｉＲＮＡ配列は、灰色でその下にある。図１１ｆは、ｍＲＮＡレベルにより確認したＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡのノックダウン効率の図である（ｎ＝５（スクランブル）および８（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡ）の生物学的独立サンプル）。図１１ｇは、タンパク質レベルにより確認したＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡのノックダウン効率の図である（ｎ＝３の生物学的独立サンプル）。図１１ｈは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中での、リアルタイムＰＣＲによりアッセイしたＣａＭＫＩＩ－δ２およびＣａＭＫＩＩ－δ３のｍＲＮＡレベルの平均化データの図である。ｎ＝１８（ＣａＭＫＩＩ－δ２）およびｎ＝１５（ＣａＭＫＩＩ－δ３）の生物学的独立サンプル。図１１ｉは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理した、Ｈ_２Ｏ_２（２００μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭの培養培地中のＬＤＨ濃度により評価した細胞生存率の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図１１ｊは、スクランブルまたはＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｉＲＮＡで処理した、Ｄｏｘ（１μＭ）を含むまたは含まないＮＲＶＭの培養培地中のＬＤＨ濃度により評価した細胞生存率の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図１１ｋは、表示するＭＯＩのＡｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で４８ｈにわたり感染させたＮＲＶＭの培地中でのＬＤＨ濃度により評価した細胞生存率の図である。ｎ＝１０の生物学的独立サンプル。図１１ｌは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ発現の代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である。ｎ＝３の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析（ａ、ｂ、ｇ、ｋ）、スチューデントの両側ｔ検定（ｃ、ｄ、ｆ、ｈ、ｌ）、または二元配置分散分析（ｉ、ｊ）。

【図12】[0050]図１２は、ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＣａＭＫＩＩ－δ２の遺伝子発現プロファイルのＲＮＡ－ｓｅｑ解析を示す。図１２ａは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ間での、Ａｄ－β－ｇａｌとＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９との間での発現変動遺伝子に基づく遺伝子発現署名を表すヒートマップの図である。各遺伝子の発現値は、マッピングされた１００万断片当たりの転写産物のキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）として計算した。７７個の遺伝子を列挙する。これらの遺伝子発現は、Ａｄ－β－ｇａｌで感染させた細胞中と比べてＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた細胞中では差次的かつ有意に変化した（＞１．５倍または＜０．６７倍、ｎ＝３の生物学的独立サンプル）。Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２において差次的に調節された１５個の遺伝子を灰色で示す。ヒートマップは、Ｒパッケージ「ピートマップ」により、オプション「スケール＝行」で生成し、それは、各遺伝子の発現値が、ＦＰＫＭ値によりＺスコア標準化されたことを意味する。図１２ｂは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中で、ＣａＭＫＩＩ－δ９により調節されるがＣａＭＫＩＩ－δ２によっては調節されないとＲＮＡ－ｓｅｑにより同定された１５遺伝子のうちの１２遺伝子のリアルタイムＰＣＲによりアッセイしたｍＲＮＡレベルのデータの図である。ｎ＝１４の生物学的独立サンプル。図１２ｃは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（表示の用量、４８ｈ）培養ＮＲＶＭ中でのＣＯＸ－２のタンパク質レベルの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図１２ｄは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２で感染させた（表示の用量、４８ｈ）培養ＮＲＶＭ中でのＰＡＩ－２のタンパク質レベルの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図１２ｅは、スクランブルまたはＣＯＸ－２ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＲＶＭ中でのＣＯＸ－２のタンパク質レベルを示す典型的ウエスタンブロットおよび平均化データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。図１２ｆは、ＣＯＸ－２ ｓｉＲＮＡの存在下または不在下にＡｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させたＮＲＶＭ中でのカスパーゼ３／７活性を指標とする細胞生存率の図である。ｎ＝３の生物学的独立サンプル。図１２ｇは、ＣＯＸ－２ ｓｉＲＮＡの存在下または不在下にＡｄ－β－ｇａｌまたはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させたＮＲＶＭ中での培養培地中のＬＤＨ濃度の図である。ｎ＝６の生物学的独立サンプル。図１２ｈは、スクランブルまたはＵＢＥ２Ｔ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＲＶＭ中でのＵＢＥ２Ｔのタンパク質レベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび平均化データの図である。ｎ＝４の生物学的独立サンプル。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ）または二元配置分散分析（ｆ、ｇ）。

【図13】[0051]図１３は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が心筋細胞ＤＮＡ損傷を誘導したことを示す。図１３ａは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中でのγＨ２ＡＸの完全な代表的免疫染色の図である。スケールバー、２０μｍ。図１３ｂは、Ａｄ－β－ｇａｌ、Ａｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＡｄ－ＣａＭＫＩＩ－δ９で感染させた（ＭＯＩ５０、４８ｈ）ＮＲＶＭ中での完全なコメットアッセイの図である。スケールバー、２０μｍ。代表的画像の一部および平均化データを図３ａおよび図３ｃに示す。図１３ｃは、スクランブル、ＦＡＮＣＤ２ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのＦＡＮＣＤ２のレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１３ｄは、スクランブル、ＦＡＮＣＩ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのＦＡＮＣＩのレベルを示す代表的ウエスタンブロットおよび統計データの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１３ｅは、スクランブル、ＦＡＮＣＤ２ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのカスパーゼ３／７活性を示す統計データの図である（ｎ＝５の生物学的独立サンプル）。図１３ｆは、スクランブル、ＦＡＮＣＩ ｓｉＲＮＡで感染させたＮＲＶＭ中でのカスパーゼ３／７活性を示す統計データの図である（ｎ＝５の生物学的独立サンプル）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。一元配置分散分析。

【図14】[0052]図１４は、心臓病態生理におけるＣａＭＫＩＩ－δ９－ＵＢＥ２Ｔシグナル伝達の役割を示す。図１４ａは、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの構築の略図である。図１４ｂは、ｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスのＰＣＲジェノタイピングの図である。図１４ｃは、１０週齢のｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓重量・体重比の図である（ｎ＝１５（ｗｔ）および９（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）の生物学的独立サンプル）。図１４ｄは、１０週齢のｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心室の遺伝子発現の図である（ｎ＝７（ｗｔ）および６（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）の生物学的独立サンプル）。図１４ｅは、１０週齢のｗｔおよびＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓γＨ２ＡＸの免疫染色の図である。矢印、γＨ２ＡＸ陽性細胞。右側ウィンドウ、表示の視野の拡大画像。平均化データは図４ｇにある。スケールバー、２０μｍ。図１４ｆは、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｈＲＮＡトランスジェニック（ｓｈＲＮＡ ｔｇ）マウスの構築の略図である。図１４ｇは、ｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスのＰＣＲジェノタイピングの図である。図１４ｈは、１０週齢のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスの心臓エクソン２１タンパク質レベルの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１４ｉは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスの心臓重量・体重比の図である（ｎ＝１６（ｗｔ）および８（ｓｈＲＮＡ ｔｇ）の生物学的独立サンプル）。図１４ｊは、ＴＡＣ手術から４週間後のｗｔおよびｓｈＲＮＡ ｔｇマウスの心臓ＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１４ｋは、１０週齢のＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスの心臓ＣａＭＫＩＩ－δタンパク質レベルの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１４ｌは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからの心臓ＴＵＮＥＬ染色の図である（ｎ＝８の生物学的独立サンプル）。図１４ｍは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからの心エコー検査の図である（ｎ＝８の生物学的独立サンプル）。図１４ｎは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからの、心臓重量・体重比の図である（ｎ＝８の生物学的独立動物）。図１４ｏは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからのカプラン・マイヤー生存曲線の図である（ｎ＝１０（ｗｔ）、１９（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）および１２（ＣａＭＫＩＩ－δ２）の生物学的独立サンプル）。図１４ｐは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからの心臓γＨ２ＡＸ染色の図である（ｎ＝８の生物学的独立サンプル）。図１４ｑは、ｗｔ、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇおよびＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスからの心臓ＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スチューデントの両側ｔ検定（ｃ、ｄ、ｉ）、一元配置分散分析（ｋ～ｎ、ｐ、ｑ）、二元配置分散分析（ｊ）、またはログランク（マンテル・コックス）検定（ｏ）。

【図15】[0053]図１５は、ＣＡＭＫＩＩ－δ９が、ＵＢＥ２ＴをＳｅｒ１１０部位でリン酸化することを示す。図１５ａは、ＣＡＭＫＩＩ－δ９によって仲介される、ＵＢＥ２Ｔの２つの潜在的なリン酸化部位（Ｓｅｒ１１０およびＳｅｒ１９３、円）を示す質量分析データの図である（ｎ＝３の生物学的独立サンプル）。ＨＥＫ２９３細胞を、対照ベクターまたはＦｌａｇタグ付きＣＡＭＫＩＩ－δ９の存在下にｍｙｃタグ付きＵＢＥ２Ｔでトランスフェクトし、全細胞溶解物をｍｙｃ抗体で免疫沈降してから、免疫複合体を翻訳後修飾質量分析した。図１５ｂは、１２種でのＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１９３部位はそうではないが、Ｓｅｒ１１０部位の保存を示す（矢印）ＵＢＥ２Ｔタンパク質の配列アライメントの図である。図１５ｃは、ＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質の共インキュベーションを伴うまたは伴わない無細胞系中での、ＵＢＥ２ＴおよびＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａ組換えタンパク質のセリンリン酸化および総レベルを示す典型的ウエスタンブロットおよび平均化データの図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。二元配置分散分析。図１５ｄは、Ａｄ－ＵＢＥ２Ｔ、Ａｄ－ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０ＡまたはＡｄ－ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａで感染させたＮＲＶＭ中での、ｗｔ ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０ＡおよびＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａ（すべてｍｙｃタグ付き）の代表的免疫蛍光画像の図である（ｎ＝６の生物学的独立サンプル）。ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａが分解に対して抵抗性であり、細胞質にも核にも分布したことは、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０部位がその分解の原因であるがその細胞内分布の原因ではないことを示すことに留意。スケールバー、１０μｍ。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。

【図16】[0054]図１６は、ＣＡＭＫＩＩ－δエクソンジャンクションによってコードされるペプチドとＵＢＥ２Ｔとの間の相互作用を示す。図１６ａは、ＣＡＭＫＩＩ－δエクソン１３－１７のエクソンジャンクション（Ｆｌａｇ－ＧＦＰのタグ付き）またはＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中での、ＵＢＥ２Ｔによる、対応するエクソンジャンクションによりコードされるペプチドの共免疫沈降の図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１６ｂは、ＣＡＭＫＩＩ－δエクソン１３－１４－１７のエクソンジャンクション（Ｆｌａｇ－ＧＦＰのタグ付き）またはＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中での、ＵＢＥ２Ｔによる、対応するエクソンジャンクションによりコードされるペプチドの共免疫沈降の図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。図１６ｃは、ＣＡＭＫＩＩ－δエクソン１３－１５－１６－１７のエクソンジャンクション（Ｆｌａｇ－ＧＦＰのタグ付き）またはＵＢＥ２Ｔ－ｍｙｃのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中での、ＵＢＥ２Ｔによる、対応するエクソンジャンクションによりコードされるペプチドの共免疫沈降の図である（ｎ＝４の生物学的独立サンプル）。

【図17】[0055]図１７は、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６のアミノ酸配列（配列番号１）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６のアミノ酸配列（配列番号２）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６－１７のアミノ酸配列（配列番号３）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６－１７のアミノ酸配列（配列番号４）、ＣＡＭＫＩＩ－δ９の全長アミノ酸配列（配列番号５）を示す。

【図18】[0056]図１８は、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のヒトおよびラットのエクソン１６の核酸配列（配列番号６）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のマウスのエクソン１６の核酸配列（配列番号７）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のヒトのエクソン１３－１６の核酸配列（配列番号８）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のラットのエクソン１３－１６の核酸配列（配列番号９）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のマウスのエクソン１３－１６の核酸配列（配列番号１０）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のヒトのエクソン１６－１７の核酸配列（配列番号１１）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のラットのエクソン１６－１７の核酸配列（配列番号１２）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のマウスのエクソン１６－１７の核酸配列（配列番号１３）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のヒトのエクソン１３－１６－１７の核酸配列（配列番号１４）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のラットのエクソン１３－１６－１７の核酸配列（配列番号１５）、ＣＡＭＫＩＩ－δ遺伝子のマウスのエクソン１３－１６－１７の核酸配列（配列番号１６）を示す。

【図19】[0057]図１９は、全長ヒトＣＡＭＫＩＩ－δ９の核酸配列（配列番号１７）を示す。

【図20】[0058]図２０は、全長ラットＣＡＭＫＩＩ－δ９の核酸配列（配列番号１８）を示す。

【図21】[0059]図２１は、全長マウスＣＡＭＫＩＩ－δ９の核酸配列（配列番号１９）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

[0060]本発明をより詳細に記載する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、それ自体、当然のことながら異なり得ると理解される。同じく、本明細書で使用する術語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定的であるとは意図されないと理解される。なぜなら、本発明の範囲は、添付クレームによってのみ限定されるからである。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間にある、間の各々の値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｖａｌｕｅ）が、文脈が明らかに異なる指定をしない限り下限値の単位の１０分の１まで、およびその記載される範囲内の別の任意の記載される値または間の値が、本開示の範囲内に含まれると理解される。それらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立にそのより小さい範囲に含まれ得て、同じく本発明の範囲内に含まれ、該記載される範囲における任意の特に除外される範囲の対象となる。該記載される範囲が、限界値の一方または両方を含む場合、含まれるそれらの限界値の一方または両方を除いた範囲も本発明に含まれる。

【0038】

[0061]異なる定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．１９９４年）およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２年）が、技術分野の当業者に、本発明で使用する用語の多くに対する一般的ガイドを提供する。本明細書に記載されるのと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実践または試験において使用できるが、好ましい方法および材料をここで記載する。

【0039】

[0062]本明細書で引用されるすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が明確かつ個別に参照によって組み込まれていると示されるように、参照によって組み込まれており、それと関連して該刊行物が引用される方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれている。どの刊行物の引用も、出願日前のその開示に関し、事前開示の理由で本発明がそのような刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なり得て、独立に確認される必要があり得る。

【0040】

[0063]本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載および例証される個々の実施形態の各々は、個別の成分および特徴を有し、それらは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、容易に分離され得る、またはいくつかの別の実施形態のいずれかの特徴と合体され得る。列挙される任意の方法は、列挙されるイベントの順番または論理的に可能な別の任意の順番で行い得る。

【0041】

[0064]本発明の実施形態は、異なる指定がない限り、当該分野の技術範囲内にある、化学、固体化学、無機化学、有機化学、物理化学、分析化学、物質化学、生化学、生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、薬理学、イメージング等の技術を使用する。そのような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編，１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編，１９８７年，および定期的更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓ等編，１９９４年）において完全に説明されている。本発明で使用するプライマー、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、技術分野では公知の標準的技術を使用して生成できる。

【0042】

[0065]本明細書で開示および特許請求される、方法の行い方ならびにバイオマーカーおよびキットの使用のし方に関する完全な開示および記載を当業者に提供するために、以下の実施形態を提示する。数（例えば、量、温度等）に関する正確さを確保するように努めたが、いくつかの誤りおよび偏差が考慮される。

【0043】

[0066]本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる指定をしない限り、同一物の複数形も含むと明記する。したがって、例えば、「１つの化合物」への言及は、複数の化合物を含む。本明細書およびそれに続く特許請求の範囲では、多数の用語に言及し、それらの用語は、反対の意図が明らかでない限りは以下の意味を有すると定義される。

【0044】

[0067]一態様では、本発明は、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。別の態様では、本発明が、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防するための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象におけるＣａＭＫＩＩ介在性疾患の治療または予防に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。

【0045】

[0068]本明細書で使用する用語「治療する」、「治療すること」、「治療」は、治療対象の対象における疾患、状態または障害の自然経過を変える試みにおける臨床的介入に関し、予防用、または臨床病理の過程において行い得る。治療の望ましい効果は、疾患、状態または障害の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患、状態または障害の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の軽減、疾患、状態または障害の進行速度の低下、病態の改善または緩和、および寛解または予後の改善を含む。

【0046】

[0069]本明細書で使用する用語「予防する」、「予防すること」、「予防」は、疾患、状態または障害を有しないが、発症する危険性があるか、または発症しやすい対象における疾患、状態または障害の発症する可能性の低下に関する。

【0047】

[0070]本明細書で使用する用語「ＣａＭＫＩＩ介在性疾患」は、対象におけるＣａＭＫＩＩの異常な活性化または破壊に起因するＣａＭＫＩＩの異常に高いまたは低いレベルおよび／または活性により引き起こされるか、または促進される、ＣａＭＫＩＩの異常なレベルおよび／または活性に伴う疾患、状態または障害に関する。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルおよび／または活性の上昇と関連する。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患が、心疾患または代謝性疾患である。いくつかの実施形態では、該心疾患が、心筋症、心筋炎、糖尿病性心疾患、心筋虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心肥大、心損傷、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、狭心症、心筋炎、冠動脈心疾患および心膜炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該心疾患が、肥大型心筋症である。いくつかの実施形態では、該代謝性疾患が、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病性足病変、高インスリン血症、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、痛風および高尿酸血症からなる群から選択される。

【0048】

[0071]本明細書で使用する用語「投与する」、「投与すること」、「投与した」および「投与」は、物質を必要とする対象へのその送達に関する。投与経路は、局所、経口、鼻腔内、非経口、腸内、直腸、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋内、バッカル、舌下または眼球であり得る。いくつかの実施形態では、末梢全身性送達を使用して、静脈内、腹腔内、または皮下注射により、物質を対象に投与してもよい。

【0049】

[0072]本明細書で使用する用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類を含む。「対象」は、飼育動物、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽およびウマ、またはげっ歯動物、例えば、ラット、マウス、または非ヒト霊長類、例えば、類人猿、サル、アカゲザル、または飼い慣らした動物、例えば、イヌもしくはネコであり得る。用語「対象」は、いかなる側面においても限定的である意図はなく、任意の年齢、性別、および健康状態であり得て、例えば、男性または女性であり得て、年配者、成人、青年、子供または幼児であり得る。ヒト「対象」は、コーカサス人、アフリカ人、アジア人、ユダヤ人、または別の人種、または前記の人種的背景の混血であり得る。いくつかの実施形態では、対象がヒトまたは非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、該非ヒト霊長類がアカゲザルである。いくつかの実施形態では、対象がヒトである。

【0050】

[0073]本明細書で使用する用語「有効量」は、対象の疾患、状態もしくは障害の抑制もしくは緩和により、または疾患、障害もしくは症状の発症を予防的に抑制するかもしくは防ぐことにより治療効果または予防効果を達成する医薬品の量に関する。有効量は、対象における疾患または障害の１つ以上の症状をある程度和らげる；疾患もしくは障害と関連するか、または疾患もしくは障害を引き起こす１つ以上の生理学的もしくは生化学的パラメーターを、部分的もしくは完全に正常レベルに戻す；および／または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させる、医薬品の量であり得る。熟練した技術を有する臨床医は、特定の疾患または障害を治療または予防するための医薬品の有効量を、投与時に特定できる。効果的であるために必要とされる、医薬品の正確な量は、多くの患者特有の考慮に加えて、多数の要素、例えば、活性物質の比活性、使用する送達装置、物質の物理的特性、投与の目的に依存する。有効量であるために投与されるべき、医薬品の量の決定は、当該分野における日常であり、熟練した技術を有する臨床医の技量の範囲内である。

【0051】

[0074]本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現レベルまたは活性を抑制することにより、該タンパク質、該ポリペプチドまたは該ペプチドの量、形成、機能および／または下流シグナル伝達を低下させる分子に関する。例えば、本発明の「ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニスト」は、ＣａＭＫＩＩ－δ９の発現レベルまたは活性を抑制することにより、ＣａＭＫＩＩ－δ９の量、形成、機能および／または下流シグナル伝達を低下させる分子に関する。

【0052】

[0075]分子は、その分子が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の発現（転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれか一方での）レベルまたは活性の著しい低下を引き起こす場合に、ＣａＭＫＩＩ－δ９の発現レベルまたは活性を抑制すると見なされる。同じく、分子は、その分子が、ＣａＭＫＩＩ－δ９とその基質との間の結合の著しい低下を引き起こす場合に、ＣａＭＫＩＩ－δ９とその基質との間の結合を抑制すると見なされ、それは、ＣａＭＫＩＩ－δ９が介在する下流シグナル伝達および機能の著しい低下を引き起こす（例えば、ユビキチン結合酵素のリン酸化の低下）。低下が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であれば、その低下は著しいと見なされる。

【0053】

[0076]結合アンタゴニストは、２つのやり方で作用し得る。いくつかの実施形態では、本発明の結合アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質と結合し、それにより、ＣａＭＫＩＩ－δ９の、その基質への結合に干渉、ブロック、または妨害する。基質に結合するが、見込まれるシグナル伝達形質導入を誘発しないこの型のアンタゴニストは、「競合アンタゴニスト」としても知られ、例えば、リン酸化または酸化の機能を有しないＣａＭＫＩＩ－δ９を発現するベクターを含み得る。別の実施形態では、本発明の結合アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９に、十分な親和性および特異性で結合し封鎖し得て、ＣａＭＫＩＩ－δ９の、その基質への結合に実質的に干渉、ブロック、または妨害する。この型のアンタゴニストは、「中和アンタゴニスト」としても知られ、例えば、ＣａＭＫＩＩ－δ９に特異的に結合するＣａＭＫＩＩ－δ９に対する抗体またはアプタマーを含み得る。

【0054】

[0077]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ユビキチン結合酵素のリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該ユビキチン結合酵素が、ＵＢＥ２Ｔである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０におけるリン酸化を阻害するアンタゴニストである。

【0055】

[0078]ユビキチン化は、ユビキチン・プロテアソーム系により細胞タンパク質の分解を調節し、タンパク質の半減期および発現レベルを制御する。この過程は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の連続作用を含む。ユビキチン結合酵素は、タンパク質を、プロテアソームによる分解に向けて標的とするユビキチン化反応における第２のステップを行う。リン酸化は、リン酸基が、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）残基に添加される、かつプロテインキナーゼ酵素により触媒される生化学反応である。例えば、ＣａＭＫＩＩ－δ９は、ＵＢＥ２ＴをＳｅｒ１１０においてリン酸化する。リン酸化は、通常、標的タンパク質の機能を修飾し、頻繁には活性化を引き起こす。細胞の恒常性維持機構の一部として、リン酸化は、単なる過渡的過程であり、ホスファターゼと呼ばれる別の酵素によって逆転される。したがって、タンパク質リン酸化レベルは、経時的に変化し、多数の周知のやり方で、例えば免疫学的アプローチにより評価可能である。例えば、リン酸化されたＵＢＥ２Ｔの量は、リン酸化ＵＢＥ２Ｔに特異的に結合する試薬を使用した免疫アッセイにより測定される。そのような免疫アッセイは、多数の周知の形態を有し得て、制限なしに、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイを含む。

【0056】

[0079]いくつかの実施形態では、酵素イムノアッセイが、ＵＢＥ２Ｔと特異的に結合する捕捉抗体またはその断片、およびリン酸化ＵＢＥ２Ｔと特異的に結合する検出抗体またはその断片を使用する、サンドイッチ酵素イムノアッセイである。そのような酵素イムノアッセイは特に有利である。なぜなら、関連キナーゼファミリーメンバーまたはアイソフォーム間でのタンパク質レベルの差異の同定は、キナーゼそれ自体の間でのおよびそれらのリン酸化型の間での比較的高い相同関係を与えるからである。

【0057】

[0080]リン酸化型および非リン酸化型の両方のＵＢＥ２Ｔを同定するため、ならびにＣａＭＫＩＩ－δ９を検出するための免疫試薬は、技術分野では周知であり、標準的技術を使用して、例えば、抗ＣａＭＫＩＩ－δ９抗体、抗ＵＢＥ２Ｔ抗体および／または抗ホスホＵＢＥ２Ｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）を生成するための適切な、ＵＢＥ２Ｔの断片での宿主動物の接種により生成できる。そのような抗ＣａＭＫＩＩ－δ９抗体、抗ＵＢＥ２Ｔ抗体および／または抗ホスホＵＢＥ２Ｔ抗体試薬を、例えば細胞溶解物中でのそれぞれのタンパク質を単離および／またはその量を決定するために使用し得る。そのような試薬はさらに、臨床試験方法の一部として、例えば、阻害剤の最適用量を監視するために、細胞または組織、例えば、白血球細胞またはリンパ球中のタンパク質レベルの監視に使用することができる。検出は、検出可能物質への抗体のカップリング（例えば、物理的結合）により促進できる。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、適切な放射性物質の例は、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈを含む。

【0058】

[0081]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特異的アンタゴニストである。
[0082]本明細書で使用する用語「特異的アンタゴニスト」は、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９以外の任意のペプチド、ポリペプチドまたは物質を有意に阻害しないことを意味する。いくつかの実施形態では、該特異的アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９に対して、別の任意の関連するペプチドまたはポリペプチドに対するよりも少なくとも３倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍以上の阻害効果を有する。例えば、該アンタゴニストは、ＣａＭＫＩＩ－δ９に対して、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３に対するよりも少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍以上の阻害効果を有する。いくつかの実施形態では、該アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を阻害するが、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３のレベルまたは活性を有意に阻害しない。本明細書で使用する用語「有意に」は、統計的に有意な差異、または当業者が認識できる顕著な差異に関する。

【0059】

[0083]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体である。
[0084]本明細書で特に指定がない限り、用語「抗体」は、広く、天然型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）および組換え抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および多重特異性抗体、ならびにその断片および誘導体が少なくとも１つの抗原結合部位を有する前記のすべての断片および誘導体を含む。抗体誘導体は、抗体に結合させたタンパク質または化学的部分を含み得る。

【0060】

[0085]本明細書で使用する用語「抗体」はさらに、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）を含む。本明細書で使用する用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合する能力を維持する、抗体の１つ以上の断片に関する（例えば、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片）。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により行い得ることが示された。用語抗体の「抗原結合部分」の範囲内に含まれる結合断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等，（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、合成リンカーにより結合可能であり、その合成リンカーは、ＶＬおよびＶＨを一本タンパク質鎖として生成させ、その中ではＶＬ領域とＶＨ領域とが一対になり一価ポリペプチドを形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；およびＯｓｂｏｕｒｎ等１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：７７８を参照）。そのような一本鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」の範囲内に含まれると意図される。完全ＩｇＧポリペプチドまたは別のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬの核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列に結合し得る。ＶＨおよびＶＬはさらに、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれか一方を使用して、Ｆａｂ、Ｆｖまたは免疫グロブリンの別の断片の生成において使用できる。別の型の一本鎖抗体、例えば、ダイアボディも含まれる。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、その場合、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、一本ポリペプチド鎖上で発現するが、同一鎖上の２つのドメイン間でペアリングさせるには短すぎるリンカーを使用することにより、それらのドメインに、別の鎖の相補性ドメインとの対形成を強いて、２つの抗原結合部位を創生する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．等（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照）。

【0061】

[0086]さらに、抗体またはその抗原結合部分は、該抗体または抗体部分の、１つ以上の別のタンパク質またはペプチドとの共有会合または非共有会合によって形成される、かなり大きい免疫接着ポリペプチドの一部であり得る。そのような免疫接着ポリペプチドの例は、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを生成するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．等（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１）、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを生成するためのシステイン残基、バイオマーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）を含む。抗体部分、例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）_２断片は、従来の技術、例えば、それぞれ、抗体全体のパパイン消化またはペプシン消化を使用して抗体全体から調製し得る。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載される標準的組換えＤＮＡ技術を使用して得られる。

【0062】

[0087]抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体；異種抗体、同種抗体または同系抗体；またはそれらの修飾型であり得る（例えば、ヒト化、キメラ等）。抗体はさらに、完全にヒトであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ９またはその断片に対して特異的にまたは実質的に特異的に結合する。

【0063】

[0088]本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ある抗原の特定エピトープと免疫反応し得る、唯一の種類の抗原結合部位を含有する抗体ポリペプチドの集団に関し、用語「ポリクローナル抗体」は、特定抗体と相互作用し得る、複数種類の抗原結合部位を含有する抗体ポリペプチドの集団に関する。モノクローナル抗体は、典型的には、その抗体が免疫反応する特定抗原に対する単一の結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体が、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ただし、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含む工程によって得られる。例えば、選択工程は、複数のクローン、例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールからの唯一のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、ｉｎ ｖｉｖｏでのその免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を創生する等のためにさらに変更可能である、かつ変更させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であると理解される。目的の抗体が結合した抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるようなルーチンクロスブロッキングアッセイを行い得る。

【0064】

[0089]抗体はさらに「ヒト化」されてもよく、それは、ヒト細胞に作製させた抗体に酷似するように変更させた可変領域および定常領域を有する、非ヒト細胞に作製させた抗体を含むと意図される。例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に見出されるアミノ酸を組み込むために、非ヒト抗体アミノ酸配列を変更させる。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的な変異導入によるか、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を、例えば、ＣＤＲ中に含み得る。本明細書で使用する用語「ヒト化抗体」はさらに、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列由来のＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上にグラフトした抗体を含む。

【0065】

[0090]本明細書で使用する用語「特異的に認識する」は、抗体が、別のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（「交差反応」）しないことを意味する。いくつかの実施形態では、特異的に認識されるペプチドまたはポリペプチドに、別の任意の関連するペプチドまたはポリペプチドよりも少なくとも３倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍以上の親和性で結合する。例えば、アンタゴニストは、ＣａＭＫＩＩ－δ９に、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３よりも少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍以上の親和性で特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害するが、ＣａＭＫＩＩ－δ２またはＣａＭＫＩＩ－δ３の活性を有意に阻害しない。

【0066】

[0091]本明細書で使用する用語「阻害／抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害／抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」および「阻害／抑制」は、生物活性または生物過程のベースライン活性の低下に関する。「ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性の阻害」は、本発明のアンタゴニストの不在下でのＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性と比べた、本発明のアンタゴニストの存在に対する直接的または間接的な応答としてのＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性の低下に関する。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性が、当業者によって測定可能である、ＣａＭＫＩＩ－δ９の、リン酸化および／または酸化の活性を含む。

【0067】

[0092]いくつかの実施形態では、抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によってコードされるアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６によってコードされるアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６－１７によってコードされるアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６－１７によってコードされるアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のアミノ酸配列に結合する。

【0068】

[0093]本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、そのもっとも広い意味で、例えば、１つ以上のペプチド結合の形成によってポリペプチド鎖内に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質に関する。いくつかの実施形態では、アミノ酸が、一般構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸が天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸が合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸がＤ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸がＬ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸が標準アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸が非標準アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然ペプチド中に一般的に見出される２０個の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかに関する。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されたか、または天然源から得られたかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸に関する。いくつかの実施形態では、アミノ酸が、ポリペプチド内のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含め、前記の一般構造と比べて、構造修飾を含有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸を、一般構造と比べて、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または置換により修飾してもよい。いくつかの実施形態では、そのような修飾が、例えば、その他の点では同一の非修飾アミノ酸を含有するポリペプチドと比べて、該修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾が、その他の点では同一の非修飾アミノ酸を含有するポリペプチドと比べて、該修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連活性を有意に変更しない。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態では、用語「アミノ酸」は遊離アミノ酸に関して使用し、いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸残基に関して使用する。アミノ酸の名称はさらに、本開示では標準的な１文字表記または３文字表記として表し、以下にまとめる。

【0069】

【表1】

【0070】

[0094]本明細書で使用する用語「コードされる」または「コードする」は、ｍＲＮＡへの転写能および／またはペプチドもしくはタンパク質への翻訳能を意味する。用語「コード配列」または「遺伝子」は、ペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に関する。これら２つの用語は、本発明では交換可能に使用できる。いくつかの実施形態では、コード配列が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写される相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列である。いくつかの実施形態では、コード配列がｍＲＮＡである。

【0071】

[0095]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６、エクソン１３－１６、エクソン１６－１７およびエクソン１３－１６－１７、ならびに全長ＣａＭＫＩＩ－δ９の核酸配列が、配列番号６～１９に記載される核酸配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含み、かつさらに配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列の１つをコードする。

【0072】

[0096]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列が、配列番号６～１９に記載される核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明が、配列番号１～５をコードする核酸配列を提供するが、それらの配列は、遺伝暗号の縮重に起因し、配列番号６～１９に記載される核酸配列のいずれか１つとは異なる。

【0073】

[0097]本明細書で使用する用語「遺伝暗号の縮重」は、１つのアミノ酸が、２つ以上の対応する遺伝暗号を有する現象に関する。例えば、プロリンは、４つの同義コドン、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧを有する。当該分野では、遺伝暗号の縮重ゆえ、コードされるアミノ酸配列が変わることなしに特定位置での核酸を任意の核酸配列に置換できることが周知である。遺伝暗号の縮重の置換を、例えば、塩基の部位特異的変異導入により行うことは当業者にはありふれたことである。異なる生物は、異なるコドンに対する異なる好みをもつようになった。本発明のポリペプチドを、選択した生物細胞中で発現させるためには、対応するコード配列を得るために該生物細胞の好ましいコドンを選択することができ、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列番号１～５）が、組換え発現により得られる。

【0074】

[0098]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９に結合する小分子化合物である。
[0099]本明細書で使用する用語「小分子化合物」は、酵素基質または生物過程のレギュレーターとして機能し得る低分子量化合物を意味する。概して、「小分子化合物」は、大きさが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態では、該小分子化合物が、約４ｋＤ、約３ｋＤ、約２ｋＤまたは約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、該小分子化合物が、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄまたは約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態では、小分子が、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、小分子が非重合性である。いくつかの実施形態では、本発明に従って、小分子は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン等でない。いくつかの実施形態では、小分子が治療薬である。いくつかの実施形態では、小分子がアジュバントである。いくつかの実施形態では、小分子が薬物である。

【0075】

[00100]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）分子、またはＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該ＲＮＡｉ分子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。

【0076】

[00101]本発明のＲＮＡｉは、ＣａＭＫＩＩ－δ９に対する特異性を有する１つまたは２つ以上の種類の核酸分子を含み得る。例えば、ＣａＭＫＩＩ－δ９をダウンレギュレートするために唯一の種類のｓｉＲＮＡを使用し得て、ＣａＭＫＩＩ－δ９の発現レベルを調節するために２種類のｓｉＲＮＡ（例えば、異なる配列を有する）を組み合わせて使用し得て、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルを低下させるためにｓｉＲＮＡと組み合わせてもよい。

【0077】

[00102]本発明のＲＮＡｉは、ＣａＭＫＩＩ－δ９を様々なレベル、例えば、転写後レベル、転写前レベルまたはエピジェネティックレベルでダウンレギュレートする。非限定的な例では、本発明のＲＮＡｉ分子による、遺伝子発現のエピジェネティック制御が、遺伝子発現を変える、クロマチン構造のＲＮＡｉ分子介在性修飾に起因し得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ等，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２－６７６；Ｐａｌ－Ｂｈａｄｒａ等，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９－６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８－１８１９；Ｖｏｌｐｅ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３－１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５－２２１８；およびＨａｌｌ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２－２２３７を参照）。

【0078】

[00103]本発明のＲＮＡｉ分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。ＲＮＡｉが二本鎖である場合、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖である。アンチセンス鎖は、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列またはその部分に対して相補性であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列またはその部分に相当するヌクレオチド配列を含む。その代わりに、ＲＮＡｉ分子は、単一オリゴヌクレオチドからアセンブルされ、その場合、ＲＮＡｉ分子の、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域が、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーを用いて連結される。ＲＮＡｉ分子は、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン二次構造または非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ＲＮＡｉは、２つ以上のループ構造ならびに自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。該環状ポリヌクレオチドは、活性ＲＮＡｉ分子を生成するためにｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれか一方でプロセスされ得る。

【0079】

[00104]いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子が１０～１００塩基を有する、例えば、長さ約１０～約１００塩基、約１５～約９０塩基、約２０～約８０塩基、約２５～約７０塩基、約３０～約６０塩基、約３５～約５０塩基を有し得る。

【0080】

[00105]低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、相同性を共有する遺伝子の発現を抑制するまたは低下させることができる二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡの各鎖は、長さ約１０～約１００塩基、約１５～約９０塩基、約２０～約８０塩基、約２５～約７０塩基、約３０～約６０塩基、約３５～約５０塩基を有し得る。二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１０～約５０塩基対、約１２～約４５塩基対、約１５～約４０塩基対、約２０～約３５塩基対、約２０～約３０塩基対、または約２０～約２５塩基対を有し得る。

【0081】

[00106]小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子発現をサイレンス化するために使用できる、緊密ヘアピンカーブを有する人工ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、細胞中でのｓｈＲＮＡの発現が、プラスミドの送達またはウイルスベクターもしくは細菌ベクターにより達成される。ｓｈＲＮＡは、典型的には、長さ約１０～１００塩基対、例えば、長さ約１０～約１００塩基対、約１５～約９０塩基対、約２０～約８０塩基対、約２５～約７０塩基対、約３０～約６０塩基対、または約３５～約５０塩基対を有する。

【0082】

[00107]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その標的ｍＲＮＡの分解および／またはその翻訳の抑制により、転写後レベルでの遺伝子発現の制御に関与する小分子非コードＲＮＡの類である。ｍｉＲＮＡは、典型的には、長さ約１０～１００塩基、例えば、長さ約１０～約１００塩基、約１５～約９０塩基、約２０～約８０塩基、約２５～約７０塩基、約３０～約６０塩基、または約３５～約５０塩基を有する。

【0083】

[00108]本明細書で使用する用語「アンチセンスヌクレオチド」は、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイズできるオリゴマー化合物に関する。例えば、「ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド」は、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列またはその部分にハイブリダイズできるヌクレオチドに関する。

【0084】

[00109]いくつかの実施形態では、アンチセンスヌクレオチドが、その安定性を改善するために修飾され得る。アンチセンスヌクレオチドに対する修飾は、ヌクレオシド間結合、糖部もしくは核酸塩基への置換または変化を含む。修飾されたアンチセンスヌクレオチドは、望ましい特性、例えば、細胞取込みの高まり、核酸標的に対する親和性の高まり、ヌクレアーゼの存在下での安定性の上昇、または抑制活性の上昇により、頻繁に、天然型よりも好まれる。

【0085】

[00110]いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６に対して相補性である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６に対して相補性である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６－１７に対して相補性である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１７に対して相補性である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列に対して相補性である。

【0086】

[00111]本明細書で使用する用語「相補性の」または「相補性」は、第１の核酸の核酸塩基と第２の核酸の核酸塩基との間の対合能に関する。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドが、標的核酸に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補性であり、ただし、該標的核酸は、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１６、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６－１７、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１３－１７、および全長ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード配列からなる群から選択される。ＲＮＡｉ分子またはアンチセンスヌクレオチドの、標的核酸との相補性％は、当該分野の日常的方法を使用して決定できる。

【0087】

[00112]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する薬剤である。
[00113]本明細書で使用する用語「競合する」または「～と競合する」は、ＣａＭＫＩＩ－δ９の基質への結合についてそれと競合することにより、ＣａＭＫＩＩ－δ９の効果を部分的または完全に阻害する薬剤に関する。その基質へのＣａＭＫＩＩ－δ９の結合の阻害は、そのような阻害なくその基質にＣａＭＫＩＩ－δ９が結合する場合に起こる正常なレベルまたは種類の細胞シグナル伝達を低下または変化させる。阻害はさらに、本明細書に開示されるアンタゴニストと接触していないＣａＭＫＩＩ－δ９と比べて、そのアンタゴニストの存在下、その基質に対するＣａＭＫＩＩ－δ９の結合の、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の任意の測定可能な低下を含むと意図される。

【0088】

[00114]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９と競合してその基質に結合する薬剤が、リン酸化または酸化の機能を有しないＣａＭＫＩＩ－δ９を発現するベクターである。いくつかの実施形態では、本発明のベクターが、当該分野では公知の任意の遺伝子導入ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、本発明のベクターが、ＣａＭＫＩＩ－δ９のコード遺伝子を含む、本質的にＣａＭＫＩＩ－δ９のコード遺伝子からなる、またはＣａＭＫＩＩ－δ９のコード遺伝子からなる外来遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるベクターによって発現するＣａＭＫＩＩ－δ９が、リン酸化または酸化の機能を有しない。なぜなら、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化または酸化の機能を担うコード遺伝子が変異、サイレンス化または欠失しているからである。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるベクターによって発現するＣａＭＫＩＩ－δ９が、リン酸化または酸化の機能を有しない。なぜなら、そのＣａＭＫＩＩ－δ９は、翻訳後プロセシングを受けるため、そのリン酸化または酸化の機能が消失しているからである。いくつかの実施形態では、該ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはプラスミドである。

【0089】

[00115]ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーであり、かつ約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率よい複製のために、ヘルパーウイルス（すなわちアデノウイルスもしくはヘルパーウイルス）との共感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用の核酸の投与に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製およびパッケージング用の認識シグナルを含有する末端反復配列（ＩＴＲ）のみが残存するように、親ゲノムの約９６％が欠失している。それが、ウイルスゲノムの発現による、免疫性または毒性の副作用を排除する。さらに、特異的ＡＡＶタンパク質の、産生細胞への送達は、望ましければ、ＡＡＶ ＩＴＲを含む該ＡＡＶベクターを、細胞ゲノムの特異的領域へと組み込むことを可能にする（例えば、米国特許第６３４２３９０号および米国特許第６８２１５１１号を参照）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞増殖または形態において変化を示さない（例えば米国特許第４７９７３６８号を参照）。

【0090】

[00116]ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の任意のＡＡＶ血清型を使用して生成可能である。いくつかのＡＡＶ血清型および１００超のＡＡＶバリアントが、アデノウイルスストックまたはヒト組織もしくは非ヒト霊長類組織から単離された（例えばＷｕ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１４（３）：３１６－３２７（２００６）に概説）。概して、ＡＡＶ血清型は、核酸配列レベルおよびアミノ酸配列レベルでの相同性が著しいゲノム配列を有するため、異なる血清型は、同一の一組の遺伝機能を有し、物理的および機能的に本質的に同等でありかつ事実上同一の機構により複製およびアセンブルするビリオンを産生する。いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０である。

【0091】

[00117]別の態様では、本発明は、対象において心損傷を緩和する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象の心損傷を緩和するための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象の心損傷の緩和に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。

【0092】

[00118]本明細書で使用する用語「緩和する」、「緩和すること」または「緩和」は、例えば、特定の作用、機能または相互作用の低下、制限または妨害を含む。いくつかの実施形態では、心損傷の少なくとも１つの症状を終結、減速、予防した場合、心損傷が緩和された状態である。いくつかの実施形態では、心損傷を引き起こし得るタンパク質（例えばＣａＭＫＩＩ－δ９）のレベルまたは活性が、基準状態と比べて低下している場合、心損傷が緩和された状態である。そのような緩和は、部分的または完全であり得る。

【0093】

[00119]別の態様では、本発明は、対象においてユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を刺激する方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象においてユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を刺激するための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象におけるユビキチン結合酵素のレベルまたは活性の刺激に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。「ユビキチン結合酵素のレベルまたは活性」は、対象におけるユビキチン結合酵素の量、または対象におけるユビキチン結合酵素の、ユビキチン化反応中にタンパク質をプロテアソームによる分解の標的とする能力に関する。

【0094】

[00120]いくつかの実施形態では、検査生体試料中のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性が、基準試料中のユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性と比較される。本明細書で使用する用語「基準のレベルまたは活性」は、対象における物質の閾値レベルまたは閾値活性に関する。例えば、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを得た対象からの検査生体試料のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性が、基準試料中のユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性よりも高い場合、ＣａＭＫＩＩ－δ９の該アンタゴニストが、該対象におけるユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を刺激すると見なされ得る。ユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性は、１つ以上の基準試料に由来し得て、ただし、該基準のレベルまたは活性は、目的の試料を試験するための実験と並行して行った実験から得られる。その代わりに、基準のレベルまたは活性を、データのコレクション、標準、１つ以上の基準試料または疾患基準試料からのレベルまたは活性を含む参照データベースから得てもよい。いくつかの実施形態では、そのようなデータのコレクション、標準、レベルまたは活性が正規化されているため、１つ以上の試料からのデータとの比較目的に使用できることになる。「正規化する」または「正規化」とは、測定の生データを、別のそのように正規化されたデータと直接に比較し得るデータへと変換する処理である。正規化は、アッセイごとに異なり得る要素が引き起こすアッセイ固有誤差、例えば、ロード量の変動、結合効率、検出感度、および別の様々な誤差を克服するために使用する。特定の実施形態では、参照データベースが、１つ以上の基準試料からのユビキチン結合酵素の濃度および／または別の実験室データおよび臨床データを含む。いくつかの実施形態では、参照データベースが、基準試料と同一条件下に試験した、基準試料のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性（例えば、ユビキチン結合酵素の公知の量または活性）のパーセントとして各々が正規化されている、ユビキチン結合酵素のレベルまたは活性を含む。ユビキチン結合酵素のそのように正規化したレベルまたは活性と比較するために、検査生体試料のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性も、測定して、該検査試料と同一条件下に試験した基準試料のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性のパーセントとして計算する。

【0095】

[00121]いかなる理論に拘束されることもないが、対象におけるユビキチン結合酵素のレベルまたは活性の上昇は、該対象にとって有益であると考えられる。いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたユビキチン結合酵素のレベルまたは活性が、ユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性の少なくとも２倍である。いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたユビキチン結合酵素のレベルまたは活性が、ユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性の少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍である。

【0096】

[00122]いくつかの実施形態では、基準試料が、健常被検者からであるか、または同一対象から、検査生体試料よりも先にもしくは後に取得した試料である。
[00123]本明細書で使用する用語「健常対象」は、本発明の方法または組成物をその同定に使用する疾患、状態または障害を患ってないことが公知であるか、または患っていないと信じられている対象に関する。いくつかの実施形態では、基準試料を、本発明の方法または組成物を使用して疾患または状態が同定された同一対象の身体の健常部分から得る。いくつかの実施形態では、検査生体試料が、対象の心臓からである。いくつかの実施形態では、対象がヒトまたは非ヒト霊長類である。

【0097】

[00124]別の態様では、本発明は、対象においてユビキチン結合酵素の分解を防ぐ方法であって、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量を該対象に投与する工程を含む方法を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象においてユビキチン結合酵素の分解を防ぐための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、対象におけるユビキチン結合酵素の分解の防止に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。

【0098】

[00125]本明細書で使用する「ユビキチン結合酵素の分解」は、検査生体試料中のユビキチン結合酵素のレベルまたは活性が、基準試料中のユビキチン結合酵素の基準のレベルまたは活性と比べて低下していることに関する。いかなる理論に拘束されることもないが、対象におけるユビキチン結合酵素の分解は、該対象にとって有害であると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストが、例えば、検査生体試料中のユビキチン結合酵素の量または活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の分解を防止できる。

【0099】

[00126]別の態様では、本発明は、試料中での心筋細胞死を防ぐ方法であって、該試料を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法を開示する。さらに別の態様では、本発明が、試料中での心筋細胞死を防ぐための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、試料中での心筋細胞死の防止に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される方法または使用が、例えば、検査試料中の心筋細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の死を防ぐことができる。

【0100】

[00127]別の態様では、本発明が、細胞中でのＤＮＡ損傷を軽減する方法であって、該細胞を、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの有効量と接触させる工程を含む方法を開示する。さらに別の態様では、本発明が、細胞中でのＤＮＡ損傷を軽減させるための医薬品の製造におけるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストの使用を開示する。さらに別の態様では、本発明が、細胞中でＤＮＡ損傷の軽減に用いるＣａＭＫＩＩ－δ９のアンタゴニストを開示する。本明細書で使用する用語「ＤＮＡ損傷」は、ＤＮＡの化学構造の変化、例えば、ＤＮＡの鎖中の切断、ＤＮＡの骨格からの塩基欠落、または化学的に変化した塩基に関する。

【0101】

[00128]細胞は、ＤＮＡ損傷を引き起こし得る要素、例えば、細胞内活性種および環境要因に絶えず曝される。ＤＮＡ損傷の潜在的な変異結果は、概して３つの型、つまり塩基除去修復（ＢＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）およびヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）に特徴づけられるＤＮＡ修復経路によって最小限に抑えられる（Ｗｏｏｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１２８４－１２８９（２００１））。いくつかの実施形態では、本発明のアンタゴニストが、例えば、細胞内のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルおよび／または活性を抑制することによってＤＮＡ修復経路を活性化し得る。

【0102】

[00129]別の態様では、本発明が、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するための方法であって、（ａ）該対象の検査生体試料を取得する工程；（ｂ）該検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を検出する工程であって、該対象の該検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の該レベルまたは活性が、該対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、工程を含む方法を開示する。

【0103】

[00130]さらに別の態様では、本発明が、対象のＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するための医薬品の製造における薬剤の使用であって、該診断が、（ａ）該対象の検査生体試料を取得する工程；（ｂ）該検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を検出する工程であって、該対象の該検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の該レベルまたは活性が、該対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、工程を含む使用を開示する。

【0104】

[00131]さらに別の態様では、本発明が、対象のＣａＭＫＩＩ介在性疾患の診断に用いる薬剤を開示し、該診断は、（ａ）該対象の検査生体試料を取得する工程；（ｂ）該検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性を検出する工程であって、該対象の該検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の該レベルまたは活性が、該対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す、工程を含む。

【0105】

[00132]本明細書で使用する用語「診断」または「診断する」は、病理学的状態、疾患または状態の同定、例えば、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患の同定に関するか、または特定の治療計画から恩恵を受け得る、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を患う対象の同定に関する。いくつかの実施形態では、診断が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の異常なレベルまたは活性の同定を含有する。いくつかの実施形態では、診断が、対象における心疾患または代謝性疾患の同定に関する。

【0106】

[00133]本明細書で使用する用語「生体試料」は、例えば、物理特性、生化学特性、化学特性および／または生理特性に基づいて特徴づけられるおよび／または同定されるべき細胞実体および／または別の分子実体を含有する、目的の対象から得た、または目的の被検者に由来する生物学的組成物に関する。生体試料は、当業者には公知の任意の方法によって取得される対象の細胞、組織、臓器、および／または生物学的流体を含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該生体試料が流体試料である。いくつかの実施形態では、該流体試料が、全血、血漿、血清、粘液（鼻漏および痰を含む）、腹腔液、胸水、胸液、唾液、尿、滑液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胸腔穿刺液、腹水液、腹水または心嚢液である。いくつかの実施形態では、該生体試料が、該対象の心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、皮膚または血管から得た組織または細胞である。いくつかの実施形態では、該生体試料を、該対象の心臓から取得する。

【0107】

[00134]本発明に従って、検査生体試料中の目的のペプチド（例えば、ユビキチン結合酵素、ＣａＭＫＩＩ－δ９等）のレベルまたは活性の検出は、試料中のペプチドのレベルまたは活性を決定するための任意の適切な手段により達成できる。いくつかの実施形態では、検出方法が、様々なサンドイッチ、競合または別のアッセイフォーマットにおいて標識分子を利用し得る免疫アッセイの装置および方法を含む。該アッセイは、目的のペプチドの存在または不在を示唆するシグナルを発現する。さらに、そのシグナル強度は、試料中に存在する目的のペプチドの量と直接的または間接的（例えば反比例）に相関し得る。さらなる適切な方法は、目的のペプチドに特異的な物理特性または化学特性、例えば、その正確な分子量またはＮＭＲスペクトルの測定を含む。適切な検出方法はさらに、バイオセンサ、免疫アッセイと連結した光学装置、バイオチップ、分析装置、例えば、質量分析計、ＮＭＲ分析装置またはクロマトグラフィー装置を含む。さらに、適切な検出方法は、マイクロプレートＥＬＩＳＡベース法、完全自動式またはロボット式の免疫アッセイ（例えばＥＬＥＣＳＹＳ分析装置で利用可能）、ＣＢＡ（酵素的コバルト結合アッセイ、例えばＲｏｃｈｅ－日立アナライザで利用可能）、およびラテックス凝集アッセイ（例えばＲｏｃｈｅ－日立アナライザで利用可能）を含み得る。いくつかの実施形態では、目的のペプチドのレベルまたは活性は、試料中のペプチドから得られる比強度シグナルの測定により検出される。前記のように、そのようなシグナルは、目的のペプチドに特異的な質量スペクトルまたはＮＭＲスペクトルにおいて観察される、目的のペプチドに特異的なｍ／ｚ（質量電荷比）変数で観察されるシグナル強度であり得る。

【0108】

[00135]いくつかの実施形態では、検査生体試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性は、ＣａＭＫＩＩ－δ９に特異的に結合する試薬と試料を接触させることにより検出される。該試薬は、強度シグナルを生成する。本発明による結合は、共有結合および非共有結合の両方を含む。本発明によりＣａＭＫＩＩ－δ９に結合する試薬は、本明細書に記載されるＣａＭＫＩＩ－δ９に結合する任意の化合物、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸または小分子であり得る。いくつかの実施形態では、該試薬が、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、該ペプチドに対する結合ドメインを含有する、該ペプチドまたはその断片に対する受容体または結合相手、およびアプタマー、例えば、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーを含む。そのような試薬を調製するための方法は、当該分野では周知である。例えば、適切な抗体またはアプタマーの同定および産生は同じく、市販供給者によって提供される。当業者は、より高い親和性または特異性を有する、そのような試薬の誘導体を開発する方法に精通している。例えば、核酸、ペプチドまたはポリペプチドにランダム変異を導入し得る。次いでそれらの誘導体は、当該分野では公知のスクリーニング法、例えばファージディスプレイにより、結合に関して試験し得る。

【0109】

[00136]いくつかの実施形態では、非特異的結合は、例えば、ウエスタンブロット上でのそのサイズにより、または試料中でのその比較的多い存在量により、なおも明解に区別および測定可能であれば許容され得る。試薬の結合は、当該分野では公知の任意の方法により測定可能である。いくつかの実施形態では、該方法が、半定量的または定量的である。適切な方法は、以下を含む。（１）試薬の結合を、例えば、ＮＭＲまたは表面プラズモン共鳴により直接に測定し得る；（２）該試薬がさらに、目的のペプチドの酵素活性の基質として利用される場合、酵素反応生成物を測定し得る（例えば、切断された基質の量を、例えばウエスタンブロット上で測定することにより、プロテアーゼの量を測定できる）。その代わりに、該試薬は、それ自体酵素特性を示し得て、ペプチドが結合した該試薬を、適切な基質と接触させて、強度シグナルの生成による検出を可能にする。いくつかの実施形態では、酵素反応生成物の測定に関して、基質の量が飽和する。該基質をさらに、反応前に、検出可能標識で標識してもよい。いくつかの実施形態では、試料を、適切な期間にわたり基質と接触させる。適切な期間は、生成物の検出可能または測定可能な量を生じさせるために必要な時間に関する。生成物の量を測定する代わりに、任意の（例えば検出可能な）量の生成物の出現に必要な時間を測定してもよい；（３）試薬の検出および測定を可能にする標識に、試薬を共有結合または非共有結合してもよい。ラベリングは、直接法または間接法によって行い得る。直接ラベリングは、試薬への標識の直接的（共有結合的または非共有結合的）なカップリングを含む。間接ラベリングは、一次試薬への二次試薬の結合（共有結合的または非共有結合的）を含む。該二次試薬は、該一次試薬に特異的に結合すべきである。該二次試薬は、適切な標識と結合していてもよい、および／または該二次試薬に結合する三次試薬の標的（受容体）であり得る。二次試薬、三次試薬、しかもさらに高次の試薬の使用は、頻繁にはシグナル強度を高めるためである。適切な二次試薬および高次試薬は、抗体、二次抗体、および周知のストレプトアビジン－ビオチン系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含み得る。試薬または基質はさらに、当該分野では公知の１つ以上のタグによる「タグ付き」であってもよい。そのようなタグが、次いで高次試薬の標的であり得る。適切なタグは、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃタグ、インフルエンザＡウイルス、ヘマグルチニン（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質等を含む。ペプチドまたはポリペプチドの場合、該タグは、Ｎ末端および／またはＣ末端にある。

【0110】

[00137]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ９に特異的に結合する試薬が、抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、該抗体が、モノクローナル抗体である。

【0111】

[00138]いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性が、基準試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性と比較される。

【0112】

[00139]本明細書で使用する用語「比較する」は、分析対象の検査生体試料に含まれる標的タンパク質（例えば、ユビキチン結合酵素、ＣａＭＫＩＩ－δ９等）のレベルまたは活性の、適切な基準試料のレベルまたは活性との比較に関する。本明細書で使用する用語は、対応するパラメーターまたは値の比較に関すると理解され、例えば、絶対量は絶対基準量と比較され、濃度は基準濃度と比較される、または検査試料から得られた強度シグナルは、基準試料の同類の強度シグナルと比較される。該比較は、手動またはコンピュータ支援で行ってもよい。コンピュータ支援の比較では、決定した量の値を、データベースに保存された、適切な基準に対応する値とコンピュータプログラムにより比較してもよい。該コンピュータプログラムがさらに、比較の結果を評価して、適切な出力フォーマットでの望ましい評価を自動的に提供してもよい。検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性の、適切な基準レベルに対する比較に基づいて、該対象におけるＣａＭＫＩＩ介在性疾患の診断が可能である。

【0113】

[00140]いくつかの実施形態では、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９の、ＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性よりも高いレベルまたは活性が、対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症しているかまたは発症する可能性が増加していることを示す。好ましくは、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性の少なくとも２倍である。さらに好ましくは、検査生体試料中で検出されたＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルまたは活性が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の基準のレベルまたは活性の少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍である。

【0114】

[00141]本明細書で使用する用語「可能性が増加している」は、対象がＣａＭＫＩＩ介在性疾患を発症する可能性のレベルの、基準試料が由来する対象と比べて５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１倍、２倍、３倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍以上の全体的増加に関する。

【0115】

[00142]いくつかの実施形態では、基準試料が、健常対象からであるか、または同一対象から、検査生体試料よりも先にもしくは後に取得した試料である。
[00143]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を特異的に認識する抗体または抗体断片を含む、対象においてＣａＭＫＩＩ介在性疾患を診断するためのキットを開示する。いくつかの実施形態では、該抗体または抗体断片が、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によってコードされるアミノ酸配列に特異的に結合する。該キットは、試料中のＣａＭＫＩＩ－δ９の含有量または活性を検出するために適切な任意の手段を使用し得る。

【0116】

[00144]いくつかの実施形態では、キットがさらに、本出願中で定義される対象におけるＣａＭＫＩＩ介在性疾患の診断に関して、任意の測定の結果を解釈するためのユーザマニュアルを含有し得る。特に、そのようなマニュアルは、どの決定したレベルがどのような診断に対応するかについての情報を含み得る。さらに、そのようなユーザマニュアルは、ＣａＭＫＩＩ－δ９のレベルを検出するためのキットの成分の正確な使用に関する説明書を提供し得る。いくつかの実施形態では、キットの検出用手段および取扱説明書が、単一コンテナ内に提供される。

【0117】

[00145]一態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害する分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９を阻害する分子を同定する、方法を開示する。

【0118】

[00146]別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化能を阻害する分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化能を阻害する分子を同定する、方法を開示する。

【0119】

[00147]さらに別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＣａＭＫＩＩ介在性疾患を治療または予防する分子を同定する、方法を開示する。

【0120】

[00148]さらに別の態様では、本発明が、心損傷を緩和する分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、心損傷を緩和する分子を同定する、方法を開示する。

【0121】

[00149]さらに別の態様では、本発明が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、心筋細胞死を防ぐ分子を同定する、方法を開示する。

【0122】

[00150]さらに別の態様では、本発明が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定するための方法であって、該分子を、（ｉ）ＣａＭＫＩＩ－δ９および（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔを含む試料と接触させる工程、ならびにＵＢＥ２Ｔのリン酸化が阻害されるかどうかを決定する工程を含み、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害が、ＤＮＡ損傷を軽減する分子を同定する、方法を開示する。

【0123】

[00151]これらの方法はさらに、本明細書では薬物スクリーニングアッセイと称され、典型的には、ＣａＭＫＩＩ－δ９と相互作用する（例えば結合する）能力、ＣａＭＫＩＩ－δ９によるＵＢＥ２Ｔのリン酸化を調節する能力、および／またはＵＢＥ２Ｔのリン酸化可能残基の、ＣａＭＫＩＩ－δ９介在性細胞内シグナル伝達標的との相互作用を調節する能力に関する候補／試験分子をスクリーニングする工程を含む。

【0124】

[00152]いくつかの実施形態では、本方法がさらに、該分子が、該ＣａＭＫＩＩ－δ９に直接に結合するかどうかを決定する工程を含む。
[00153]いくつかの実施形態では、試料中のリン酸化ＵＢＥ２Ｔの量を対照と比較することにより、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害を決定する。いくつかの実施形態では、該対照が、分子の不在下または試料を分子と接触させた後の早期の時点でのリン酸化ＵＢＥ２Ｔの量に対する、試料中のリン酸化ＵＢＥ２Ｔの量である。いくつかの実施形態では、試料中のＵＢＥ２Ｔのリン酸化の量の、ＵＢＥ２Ｔの総量に対する比率を対照と比較することにより、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化の阻害を決定する。いくつかの実施形態では、該対照が、分子の不在下または試料を分子と接触させた後の早期の時点でのリン酸化ＵＢＥ２Ｔの量の比率に対する、試料中のリン酸化ＵＢＥ２Ｔの量の比率である。

【0125】

[00154]いくつかの実施形態では、試料が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料、ｅｘ ｖｉｖｏ試料およびｉｎ ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料が、細胞（例えば心細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞を患者から取得する。いくつかの実施形態では、試料が、組織、全血、血清、血漿、バッカル掻爬、唾液、脳脊髄液、尿、大便および骨髄からなる群から選択される。

【0126】

[00155]いくつかの実施形態では、薬物スクリーニングアッセイで使用する候補／試験分子が、小分子化合物または抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、候補／試験分子が、リン酸化ＵＢＥ２Ｔの量を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％低下させる。

【0127】

[00156]同定対象である本発明の候補／試験分子は、少なくとも部分的には、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「１－ビーズ－１－化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当該分野では公知の組合せライブラリー法における多数の手法のいずれかを使用して得られる。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、別の４つの手法は、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。

【0128】

[00157]分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当該分野では、例えば、ＤｅＷｉｔｔ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ等（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ等（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ等（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ等（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出され得る。

【0129】

[00158]化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２－４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５－５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５２３３４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５２３３４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ等（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５－１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８－６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ前記））に提示してもよい。

【0130】

[00159]いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、任意の位置のセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）においてである。いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、Ｓｅｒ５、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ８２、Ｓｅｒ１０１、Ｓｅｒ１１０、Ｓｅｒ１２９、Ｓｅｒ１３０、Ｓｅｒ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｓｅｒ１７２、Ｓｅｒ１７４、Ｓｅｒ１７６、Ｓｅｒ１７７、Ｓｅｒ１９３またはＳｅｒ２０４においてである。いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、Ｓｅｒ１１０においてである。いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、Ｔｈｒ２３、Ｔｈｒ４４、Ｔｈｒ５２、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ１０６、Ｔｈｒ１０９、Ｔｈｒ１４４、Ｔｈｒ１７７またはＴｈｒ１７８においてである。いくつかの実施形態では、ＵＢＥ２Ｔのリン酸化は、Ｔｙｒ４６、Ｔｙｒ６１、Ｔｙｒ７４またはＴｙｒ１３４においてである。本明細書で言及されるアミノ酸の位置は、例えば、ヒト、マウスおよびラットの野生型ＵＢＥ２Ｔのセリン、スレオニンおよびチロシンの位置に関する。

【0131】

[00160]一態様では、本発明が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む単離ＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドを開示する。いくつかの実施形態では、該単離ＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドが、全長天然ポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、該単離ＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドの長さが、１４アミノ酸、２７アミノ酸、３０アミノ酸、４３アミノ酸または５１３アミノ酸である。

【0132】

[00161]いくつかの実施形態では、本発明が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離ＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドを開示する。

【0133】

[00162]本明細書で使用する用語「単離した」は、物質（例えば、ポリペプチドまたは核酸）が自然界で通常存在する環境から分離されているか、または自然界で通常見出される環境とは異なる環境にあることに関する。

【0134】

[00163]本明細書で使用する「配列相同性」パーセント（％）は、アミノ酸配列に関しては、候補配列と参照配列とをアライメントし、必要であればギャップを導入して同一アミノ酸数の最大値を達成した後の、２つのアミノ酸配列間の同一性の百分率に関し、ヌクレオチド配列に関しては、候補配列と参照配列とをアライメントし、必要であればギャップを導入して同一ヌクレオチド数の最大値を達成した後の、２つのヌクレオチド配列間の同一性の百分率に関する。

【0135】

[00164]相同性の百分率は、当該分野では周知の様々な方法により決定できる。例えば、配列の比較は、以下の一般に利用可能なツール、つまりＢＬＡＳＴｐソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから利用可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／から利用可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３－４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ ＭＡ等，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７－８（２００７）を参照）およびＴＣｏｆｆｅｅ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのウェブサイトから利用可能、Ｐｏｉｒｏｔ Ｏ．等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３－６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５－１７（２０００）も参照）により達成可能である。ソフトウェアを使用して配列のアライメントを行う場合、ソフトウェアにおいて利用可能なデフォルトパラメーターを使用してもよく、またはアライメント目的に適するように、パラメーターをカスタマイズしてもよい。これらのすべては、当業者の知識の範囲内である。

【0136】

[00165]アミノ酸残基の保存的置換は、類似の特性を有するアミノ酸間の置換、例えば、極性アミノ酸間の置換（例えば、グルタミンとアスパラギンとの間の置換）、疎水性アミノ酸間の置換（例えば、アルギニン、イソロイシン、メチオニンおよびバリン間の置換）、ならびに同じ電荷を有するアミノ酸間の置換（例えば、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間の置換、またはグルタミンとアスパラギン酸塩との間の置換）等に関する。

【0137】

[00166]別の態様では、本発明が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ＣａＭＫＩＩ－δ核酸を開示する。

【0138】

[00167]本明細書で使用する用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシド－デオキシリボ核酸の混合物、例えばＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドに関する。該核酸またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであり得る。核酸またはポリヌクレオチドは、直鎖または環状であり得る。

【0139】

[00168]いくつかの実施形態では、ＣａＭＫＩＩ－δ核酸が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号６～１９に対する少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列からなる群から選択される核酸配列の１つを含む。

【0140】

[00169]いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される単離ＣａＭＫＩＩ－δ核酸が、配列番号６～１９に記載される核酸配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含み、かつさらに配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドをコードする。

【0141】

[00170]いくつかの実施形態では、本発明が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、配列番号３に記載されるアミノ酸配列、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣａＭＫＩＩ－δポリペプチドをコードするＣａＭＫＩＩ－δ核酸配列を提供するがそれらの配列は、遺伝暗号の縮重に起因し、配列番号６～１９に記載される核酸配列のいずれか１つとは異なる。

【0142】

[00171]別の態様では、本発明が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害できるＣａＭＫＩＩアンタゴニストを開示する。
[00172]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ９によるユビキチン結合酵素のリン酸化を阻害するアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、該ユビキチン結合酵素がＵＢＥ２Ｔである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０におけるリン酸化を阻害するアンタゴニストである。

【0143】

[00173]いくつかの実施形態では、アンタゴニストが、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６によりコードされるアミノ酸配列に結合する抗体、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６を標的とするＲＮＡｉ分子、ＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子のエクソン１６を標的とするアンチセンスヌクレオチドである。

【0144】

[00174]別の態様では、本発明が、本発明に開示されるＣａＭＫＩＩ－δ９の活性を阻害できるアンタゴニストを含む医薬組成物を開示する。
[00175]いくつかの実施形態では、医薬組成物がさらに、薬学上許容される担体を含む。

【0145】

[00176]本明細書で使用する表現「薬学上許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触に用いるために適切である、過剰の毒性、炎症、アレルギー応答または別の問題もしくは合併症を伴わない、妥当な利益／リスク比に応じた化合物、材料、組成物、および／または剤形に関する。いくつかの実施形態では、薬学上許容される化合物、材料、組成物、および／または剤形は、動物、特にヒトでの使用向けに、監督機関（例えば、米国食品医薬品局、中国食品医薬品局または欧州医薬品庁）によって認可されたか、または一般的に承認された薬局方（例えば、米国薬局方、中国薬局方または欧州薬局方）に列挙されているようなものに関する。

【0146】

[00177]本発明の医薬組成物に用いる薬学上許容される担体は、例えば、薬学上許容される液体、ゲル、または固体担体、水性媒介物（例えば、塩化ナトリウム注、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注、滅菌水注、ブドウ糖乳酸リンゲル注射液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ））、非水性媒介物（例えば、植物由来固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油もしくは落花生油）、抗菌剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウムもしくは右旋糖）、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液）、抗酸化剤（例えば硫酸水素ナトリウム）、麻酔剤（例えば塩酸プロカイン）、懸濁化剤／分散剤（dispending agents）（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくポリビニルピロリドン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸））、乳化剤（例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０））、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助剤、当該分野では公知の別の成分、またはそれらの様々な組合せを含み得るが、それらに限定されない。適切な成分は、例えば、充填剤、バインダ、崩壊剤、緩衝液、保存剤、滑剤、香味料、増粘剤、着色剤または乳化剤を含み得る。

【0147】

[00178]いくつかの実施形態では、医薬組成物が、経口製剤である。該経口製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（味のある基材の場合、通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガント）、散剤、顆粒剤、または水性もしくは非水性の液剤もしくは懸濁剤、または油中水型乳剤もしくは水中油型乳剤、またはエリキシル剤、またはシロップ剤、または製菓トローチ剤（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒｙ ｌｏｚｅｎｇｅ）（不活性塩基用、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースまたはアカシア）および／またはうがい薬およびその類似物を含むが、それらに限定されない。

【0148】

[00179]いくつかの実施形態では、経口固形剤（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤等）が、活性物質および１つ以上の薬学上許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、ならびに／または以下：（１）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／もしくはケイ酸；（２）バインダ、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／もしくはアカシア；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）切断剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）遅延剤液（ｒｅｔａｒｄｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ａｂｓｏｒｂｅｒ）、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）滑剤、例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト；（９）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物；（１０）着色剤を含む。

【0149】

[00180]いくつかの実施形態では、経口液剤が、薬学上許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。活性物質に加えて、液体剤形はさらに、従来の不活性希釈剤、例えば、水または別の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンゼン（メタ）アクリレート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、コーン油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビトール脂肪酸エステル、およびそれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物はさらに、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味料、香味料、着色剤、香味剤および保存剤を含有してもよい。

【0150】

[00181]いくつかの実施形態では、医薬組成物が、無菌水性の溶液、分散液、懸濁液または乳剤を含む注射剤であり得る。いずれの場合も、注射剤は、無菌であり、かつ注射を容易にする液体である。医薬組成物は、製造および貯蔵の条件下に安定であり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の感染に対して抵抗性である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびに適切な混合物、ならびに／またはそれらの植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。注射剤は、様々なやり方で、例えば、レシチンのようなコーティングを使用して、界面活性剤等を使用して維持され得る適切な流動性を維持するべきである。抗菌性汚染は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等）の添加により生じ得る。

【0151】

[00182]いくつかの実施形態では、医薬組成物が、経口スプレー製剤または鼻腔スプレー製剤である。そのようなスプレー製剤は、水性エアロゾル、非水性懸濁剤、リポソーム製剤、または固体粒子製剤等を含むが、それらに限定されない。水性エアロゾルは、薬剤の水性溶液または水性懸濁液を、従来の薬学上許容される担体および安定剤と合体させることにより調合する。該担体および安定剤は、特定の化合物の必要性に応じて異なり得るが、概して、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール）、オレイン酸、レシチン、アミノ酸、例えば、グリシン、緩衝液、塩、糖、または糖アルコールを含む。エアロゾルは、通常、等張溶液から調製され、ネブライザによって送達され得る。

【0152】

[00183]いくつかの実施形態では、医薬組成物を、１つ以上の別の薬物と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、組成物が、少なくとも１つの別の薬物を含む。いくつかの実施形態では、該別の薬物が、心臓血管薬、腎疾患治療用の薬物、細胞膜修復用の薬物等である。

【0153】

[00184]いくつかの実施形態では、医薬組成物を、経口経路、注射経路（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、くも膜下注射、胸腔内注射、腹腔内注射等）、粘膜経路（例えば、鼻腔内投与、経口投与等）、舌下経路、直腸経路、経皮経路、眼内経路、経肺経路を含むがそれらに限定されない適切な経路により、対象に送達してもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、注射経路で投与し得る。

【実施例】

【0154】

実施形態
[00185]すべての実施例で使用した生物材料、様々なクローン、および発現プラスミド、培地、酵素、緩衝液、および様々な培養方法、タンパク質抽出・精製方法、および別の分子生物学的な操作方法はすべて、当業者には周知である。さらなる詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」および「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｙａｎ Ｚｉｙｉｎｇ等による翻訳，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ），１９９８）を参照のこと。

【0155】

[00186]一般的な方法および材料
[00187]１．１ 動物
[00188]動物は、北京大学（北京、中国）の実験動物センター（実験動物ケア評価認証協会認定の実験動物施設）で飼育した。動物は、実験群へとランダムに割り当てた。オスのみを使用した。我々の研究では、非含有パラメーターまたは除外パラメーターは使用しなかった。調査者は、治療に対して盲検化されなかったが、主観的評価は行わなかった。実験動物（マウス、ラットおよびアカゲザル）を含むすべての方法は、北京大学の動物実験委員会によって承認され、かつ実験動物の管理と使用に関する指針に準拠したプロトコールに従った。

【0156】

[00189]成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットは、Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（北京、中国）によった。アカゲザルは、以前に報告した自組織内コホートによった（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２４，７７－８６，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１１０．９９０３３３（２０１１））。動物は、ペントバルビタールナトリウムの過剰用量の静脈内注射により安楽死させ、タンパク質および全ＲＮＡの抽出に向けて、組織を液体窒素中で素早く凍結した。

【0157】

[00190]１．２ 動物の外科手術および処理
[00191]横大動脈狭窄（ＴＡＣ）は、６週齢の雄性マウスで行った。挿管による３％イソフルランでマウスを麻酔し、開胸し、大動脈弓を視覚化し、７－０絹縫合糸を、弓の下方で無名動脈と左総頸動脈との間に通した。大動脈と２８ゲージ針の両方の周囲に縫合糸を固定し、針を除去し、閉胸し、マウスを抜管した。偽手術マウスには、大動脈の結紮を除くと、同じ手順を行った。マウスには、回復期間中、腹腔内注射により、ブプレノルフィンを与えた。

【0158】

[00192]１．３ ＳＭＲＴシーケンシング用のライブラリー調製、シーケンシング、およびデータ収集
[00193]ＲＮｅａｓｙ線維組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：７４７０４）を使用して、正常なマウス、ラットおよびアカゲザルの左室から全ＲＮＡを調製した。正常成人の左室からの全ＲＮＡは、ＭＹ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（カタログ番号：ＭＢＳ５３７５７０）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号：Ｔ５５９５－７３２５）およびＢｉｏｃｈａｉｎ（カタログ番号：Ｒ１２３４１３８－５０）によった。第１鎖の合成には、全ＲＮＡ ２マイクログラムを使用した。第１コードエクソンおよび最終コードエクソンにアニールするＣａＭＫＩＩ－δ特異的プライマーを、ｃＤＮＡ増幅に使用した（図９ｂ）。ＰＣＲ産物精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：２８００４）を使用して、全長ＣａＭＫＩＩ－δ（約１６００ｂｐ）に相当するＰＣＲ産物を濃縮した。標準ＰａｃＢｉｏガイドラインに従って、ＳＭＲＴｂｅｌｌシーケンシングライブラリーを調製した。シーケンシングは、武漢バイオテクノロジー研究所公共技術サービスプラットフォームにおいて、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓリアルタイムシーケンサーを用い、Ｃ２シーケンシング試薬を使用して行った。Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴ解析ソフトウェア（ｖ２．２）を使用して、サブリードフィルタリングを行った。ＧＭＡＰ（２０１４－０９－２９バージョン）を使用し、以下のパラメーター：－形式＝１－バッチ＝２－ｎｔｈｒｅａｄｓ＝６－ｔｒｉｍｅｎｄｅｘｏｎｓ＝４－ｏｒｄｅｒｅｄを用いて、ＦＡＳＴＱ形式の循環コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードを、全試料種からのＣａＭＫＩＩ－δ遺伝子座にマッピングした。その間に、ｆｌｅｘｂａｒ（バージョン２．５）を使用し、以下のパラメーター：－ｔｈｒｅａｄｓ ６－ｂａｒｃｏｄｅ－ｍｉｎ－ｏｖｅｒｌａｐ ８－ｂａｒｃｏｄｅ－ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ２－ｌｏｇ－ｌｅｖｅｌ ＴＡＢ－ｂａｒｃｏｄｅ－ｋｅｅｐ－ｂａｒｃｏｄｅ－ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄを用いて、プライマー／バーコードを検出した。アライメントは、同種に由来した場合にのみ、ベストマッピングおよび示されるプライマーとして維持した。以下の解析は、Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ等 ＰＮＡＳ １１１，Ｅ１２９１－１２９９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４０３２４４１１１（２０１４）を参照した。アライメントを、スプライスジャンクション（すなわちバリアント構造）に関して、ギャップ許容値３ｂｐで解析した。明確で一致したスプライスジャンクションに関して解析されたＣＣＳリードのみを維持した。次いで、スプライスジャンクションの頻度を計算した。

【0159】

[00194]プライマーは以下のとおり：

【0160】

【表2】

【0161】

[00195]１．４ ヒト試料
[00196]肥大型心筋症の患者からヒト心室組織は、阜外病院（北京、中国）での肥大型心室中隔心筋切除術中に取得し、プロトコールは、阜外病院、中国医科学アカデミーおよび北京協和医学院の倫理委員会によって承認された。本研究は、すべての倫理規定に準拠している。全患者は、書面による同意書を提供した。正常ヒト心室組織は、メリーランド大学（ボルチモア、ＭＤ）のＮＩＨ ＮｅｕｒｏＢｉｏＢａｎｋによった。

【0162】

[00197]１．５ ＲＮＡ－ｓｅｑ（第２世代シーケンシング）およびＣａＭＫＩＩ－δエクソンジャンクション解析
[00198]マウス組織の全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：７４１０４）を使用して調製し、シーケンシング工程は、以前に報告されたとおりであった（Ｌｉｕ，Ｆ．等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １３１，７９５－８０４，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１１４．０１２２８５（２０１５））。別種のＲＮＡ－ｓｅｑデータは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）シーケンスリードアーカイブデータベースにより、以下のとおり：ヒト左室（ＳＲＲ８３０９６５、ＳＲＲ８３０９６６、ＳＲＲ８３０９６７、ＳＲＲ８３０９６８、ＳＲＲ８３０９６９、ＳＲＲ８３０９７０、ＳＲＲ８３０９７１、およびＳＲＲ８３０９７２）、アカゲザル心臓（ＳＲＸ１９６３１９、ＳＲＸ１９６３２８、ＳＲＸ１９６３３７、ＳＲＸ０８１９２７、ＳＲＸ０８１９２８、ＳＲＸ４９４６３９、およびＳＲＸ０６６５７３）、イヌ左室（ＳＲＲ１７３５８８０、ＳＲＲ１７３５８８１、ＳＲＲ１７３５８８２、ＳＲＲ１７３５８８３、ＳＲＲ１７３５８８４、およびＳＲＲ１７３５８８５）ならびにラット心臓（ＳＲＸ４７１４４４、ＳＲＸ４７１４４５、ＳＲＸ４７１４４６、ＳＲＸ４７１４４７、ＳＲＸ４７１４６０、ＳＲＸ４７１４６１、ＳＲＸ４７１４６２、およびＳＲＸ４７１４６３）。図９ａに示す、ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントのエクソン構造は、ＲｅｆＳｅｑ、Ｕｎｉｐｒｏｔ、およびＵＣＳＣ ＫｎｏｗｎＧｅｎｅのデータベースからまとめた。ＣａＭＫＩＩ－δの分類は、Ｍａｙｅｒを参照した（Ｍａｙｅｒ，Ｐ．等，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ２９８ 第３部，７５７－７５８（１９９４））。マウスＣａＭＫＩＩ－δの構造は、ＬｉｆｔＯｖｅｒを使用しデフォルトパラメーターを用いて検索した。多重配列アラインメントにおいて、本発明者は、２つの主要選択的スプライシングドメインを見出し、一方はエクソン１３とエクソン１７との間であり、他方はエクソン２０とエクソン２２との間であった。ＲＮＡ－ｓｅｑリードは、ＴｏｐＨａｔ－２．０．８を使用しデフォルトパラメーターを用いて、マウス（ｍｍ９）、ラット（ｒｎ４）、イヌ（ｃａｎＦａｍ２）、アカゲザル（ｒｈｅＭａｃ２）、またはヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングされた。すべての潜在的なジャンクションリードをカウントし、寸法係数（ｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒ）で正規化した（標的組織の１か所にのみマップされたリードと最小シーケンシングを含む組織との比率）。

【0163】

[00199]１．６ ＣａＭＫＩＩ－δのエクソン１６またはエクソン２１に特異的な抗体の生成
[00200]ウサギで抗体を作製するために、ペプチドを、市販で合成および精製させた（Ａｂｃａｍ、米国）。抗原エピトープは、以下のアミノ酸配列：ＣａＭＫＩＩ－δのスプライスバリアントの一サブクラスに特有のＣ末端であるエクソン２１に相当するＰＰＣＩＰＮＧＫＥＮＦＳＧＧＴＳＬＷ（配列番号２８）、およびＣａＭＫＩＩ－δのエクソン１６に相当するＣＥＰＱＴＴＶＩＨＮＰＤＧＮＫ（配列番号２９）を含んだ。３つの異なる担体タンパク質との結合には、内部システインを使用した。２匹のニュージーランド産月齢３か月の白ウサギを免疫化するために、各ペプチドを、スカシガイ由来ヘモシアニンまたはオボアルブミンと結合した。カスタマイズした、５～６回の注射のプロトコールを使用してウサギを免疫化した。精製用アフィニティーカラムを調製するために、本来の抗原を、予備活性化マトリクス（アガロースビーズ、１．５ｍｌ）に結合した。抗血清すべてを捕集し、調製済みペプチドアフィニティーカラム上にロードして、溶出バッファー（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出したポリ抗体を捕集し、ＵＶ２８０吸収に基づいて中和した。

【0164】

[00201]１．７ 質量分析によるＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントの絶対定量
[00202]ヒト左室を、ＲＩＰＡバッファーでホモジナイズし、溶解物を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。エクソン２１またはエクソン１６を認識する抗体でＣａＭＫＩＩ－δを免疫沈降してから、アガロースペレットを洗浄し溶出した。溶出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥし、ＣａＭＫＩＩ－δに相当するバンドを、質量分析のために切り出した。ＣａＭＫＩＩ－δスプライシングバリアントの絶対定量は、以前に報告されたように行った（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．等，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １００，６９４０－６９４５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８３２２５４１００（２００３）；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｈ．等 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００，３４１－３５２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２２２５５（２０１１））。特に、最良の作業条件を試験するために、トリプシン（４００ｎｇ）を用いて異なる時間（０．５ｈ、１ｈ、２ｈまたは４ｈ）にわたり、ゲル内消化を行ってから、質量分析を行った。２ｈトリプシン消化を選んだ。なぜなら、この条件下にもっとも多くのユニークペプチドが認められたからであり、その条件下で、各標的バリアントからいくつかのユニークペプチドを、定量用の標準ペプチドとして選択した（表１）。合成ペプチドは、１３Ｃおよび１５Ｎ標識リジンを含有した。トリプシン消化して免疫沈降した心臓試料との、合成ペプチドの段階希釈（０．７８、１．５６、３．３１、６．２５、１２．５、２５、５０、１００および２００ｆｍｏｌ）の混合に続いて質量分析を行うことにより検量線を作成した。負荷量およびピーク面積に基づき、どの合成ペプチドも、Ｒ２が０．９９２超の直線検量線を得た。各標的ペプチドの定量化値は、ピーク面積の、同位元素標識ペプチド（５０ｆｍｏｌを添加した標準）のピーク面積に対する比率を計算して求めた。エクソン２１免疫沈降試料中の平均ペプチド量は、エクソン１３－１７に関して２．３２±０．２７ｆｍｏｌ、エクソン１３－１４に関して４．０２±１．５０ｆｍｏｌ、およびエクソン１３－１６に関して９．５２±０．８８ｆｍｏｌである。エクソン１６免疫沈降試料中の平均ペプチド量は、エクソン２０－２１に関して１１．８７±３．７３ｆｍｏｌ、およびエクソン２０－２２に関して１．７３±０．７１ｆｍｏｌである。相対的データを図１ｃに示す。

【0165】

【表3】

【0166】

[00203]Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１０００液体クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を伴ったＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ）質量分析計を使用して、すべての試料を分析した。ペプチドを、内径１００μｍｘ２ｃｍのＣ１８トラップカラムから溶出し、内径１５０μｍｘ１５ｃｍの手製カラム（Ｃ１８樹脂、１．９μｍ、１２０Å、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）上で、７５分の５～３５％アセトニトリル直線勾配を用いて６００ｎＬ／分で分離した。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのＭＳ分析は、自動ゲイン制御ターゲット３ｅ６イオンにおけるフルスキャン（３００～１４００ｍ／ｚ、２００ｍ／ｚでのＲ＝１２０，０００）で行い、続いて、高エネルギー衝突解離により、最高で２０のデータ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンを行い（ＡＧＣターゲット２ｅ４イオン、最大許容注入時間４０ｍｓ、単離ウィンドウ１．６ｍ／ｚ、２７％の正規化衝突エネルギー）、オービトラップで検出した（２００ｍ／ｚでのＲ＝１５，０００）。事前に取得した前駆イオンのダイナミックエクスクルージョンは、１２ｓで可能であった。

【0167】

[00204]ペプチドは、＜１％の誤検出率を達成するために、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（バージョン２．３．０１、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で適合させたＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン１．４．１．１４、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して同定した。質量許容差は、前駆体に関しては２０ｐｐｍに設定し、生成イオンの許容差に関しては５０ｍｍｕに設定した。修飾の種類としては、酸化（Ｍ）、アセチル（タンパク質Ｎ末端）、およびＤｅＳｔｒｅａｋ（Ｃ）を選択し、トリプシンによる２つの未切断を許容した。

【0168】

[00205]１．８ 質量分析
[00206]ＵＢＥ２Ｔリン酸化の分析には、ＨＥＫ２９３細胞を、対照ベクターまたはｆｌａｇタグ付きＣａＭＫＩＩ－δ９プラスミドの存在下にｍｙｃタグ付きＵＢＥ２Ｔでトランスフェクトした。細胞収穫の１２ｈ前に、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を添加してから、総タンパク質をＲＩＰＡバッファーで抽出した。総ＵＢＥ２Ｔを抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、次いでアガロースペレットを洗浄し溶出した。溶出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥし、ＵＢＥ２Ｔに相当するバンドを、質量分析のために切り出した。

【0169】

[00207]ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ質量分析計と直接にインタフェース接続されたＤｉｏｎｅｘ ３０００ ｎａｎｏ－ＨＰＬＣシステムを用いて、消化産物を、０．３μＬ／分の流速での６５分の勾配溶出により分離した。分析カラムは、溶融シリカキャピラリーカラムであった（内径７５μｍ、１５０ｍｍ長、Ｃ１８樹脂充填）。移動相Ａは０．１％ギ酸からなり、移動相Ｂは、８０％アセトニトリルと０．０８％ギ酸とからなった。質量分析計は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ２．１．３ソフトウェアを使用してデータ依存性取得モードで操作し、オービトラップ（４００～１８００ｍ／ｚ、分解能３０，０００）でのシングルフルスキャンマススペクトルに続いて１０のデータ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンが存在した。各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳランからのＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ検索アルゴリズム（バージョン１．３）を使用して、選択したデータベースに対して検索した。

【0170】

[00208]１．９ コメットアッセイ
[00209]培養新生仔ラット心室心筋細胞（ＮＲＶＭ）を、指示どおりに処理し、次いで冷ＰＢＳで洗浄し、アルカリ性条件下、コメットアッセイキット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、カタログ番号４２５０－０５０－Ｋ）のプロトコールに従った。各実験において試料当たり３００～５００細胞に対して、コメットアッセイソフトウェアプロジェクト（ｖ１．２．３ｂ１）を用いて、平均テールモーメントを定量化した。

【0171】

[00210]１．１０ ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの生成
[00211]Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有する全長ヒトＣａＭＫＩＩ－δ９ ｃＤＮＡコード配列を、αＭＨＣプロモータを含有する発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの線状化後、ゲル精製を行った。この構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵の前核にマイクロインジェクトした。ジェノタイピングにはＰＣＲを使用した。プライマー配列は、５’－ＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’（フォワード）（配列番号３５）および５’－ＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＡＧＧ－３’（リバース）（配列番号３６）であった。

【0172】

[00212]１．１１ ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｈＲＮＡ ｔｇマウスの生成
[00213]ｍｉＲ３０ベースのＣａＭＫＩＩ－δ９ ｓｈＲＮＡの配列は、５’－ＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧ－３’であった（配列番号３７）。Ｎ末端ＥＧＦＰタグおよびＣ末端ＢＧＨポリＡ配列を有するｓｈＲＮＡを、Ｕ６プロモータを含有するｐＬＫＯ．１プラスミドにクローニングした。線状化後、ゲル精製を行った。この構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵の前核にマイクロインジェクトした。ジェノタイピングにはＰＣＲを使用した。プライマー配列は、５’－ＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣ－３’（フォワード）（配列番号３８）および５’－ＣＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＣ－３’（リバース）（配列番号３９）であった。

【0173】

[00214]１．１２ ＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスの生成
[00215]Ｎ末端ＨＡタグを有する全長ヒトＣａＭＫＩＩ－δ２ ｃＤＮＡコード配列を、αＭＨＣプロモータを含有する発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの線状化後、ゲル精製を行った。この構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵の前核にマイクロインジェクトした。ジェノタイピングにはＰＣＲを使用した。プライマー配列は、５’－ＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣ－３’（フォワード）（配列番号４０）および５’－ＴＣＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＧＧＴＧＣＴＴＣ－３’（リバース）（配列番号４１）であった。

【0174】

[00216]１．１３ ＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスの生成
[00217]Ｃ末端ｍｙｃタグを有する全長ラットＵＢＥ２Ｔ ｃＤＮＡコード配列を、αＭＨＣプロモータを含有する発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの線状化後、ゲル精製を行った。この構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵の前核にマイクロインジェクトした。ジェノタイピングにはＰＣＲを使用した。プライマー配列は、５’－ＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＣ－３’（フォワード）（配列番号４２）および５’－ＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＡＡＴＧ－３’（リバース）（配列番号４３）であった。

【0175】

[00218]１．１４ 心エコー検査
[00219]６週齢および１０週齢において、１％イソフルラン下、Ｖｅｖｏ２１００デジタルイメージングシステム（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ、トロント、ＯＮ、カナダ）を使用して、乳頭筋のレベルでの傍胸骨短軸像において取得された、心室中部ＭおよびＢモード測定結果により、心エコー解析を行った。マウスが手法に慣れたら、検査および解析に向けて、画像を、光磁気ディスク上にデジタル形式で保存した。ＬＶ拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）の測定は、左室見かけ最大拡張径の時に測定し、ＬＶ収縮末期内径（ＬＶＩＤｓ）の測定は、後壁の収縮期前方変動が最大の時に行った。ＬＶ駆出率（ＥＦ）は、キュービック法：ＬＶＥＦ（％）＝｛（ＬＶＩＤｄ）^３－（ＬＶＩＤｓ）^３｝／（ＬＶＩＤｄ）^３ｘ１００により計算し、ＬＶ短縮率（ＦＳ）は、ＦＳ（％）＝（ＬＶＩＤｄ－ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄｘ１００により計算した。データは、５心周期から平均化した。

【0176】

[00220]１．１５ 組織学的解析
[00221]心臓組織の組織学的解析は、以前に記載した（Ｚｈａｎｇ，Ｔ．等 Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，１７５－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０１７（２０１６））。ＴＵＮＥＬ染色には、以前に記載したように（Ｚｈａｎｇ，Ｔ．等 Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，１７５－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０１７（２０１６））、ＣａｒｄｉｏＴＡＣＳＴＭ ｉｎ ｓｉｔｕアポトーシス検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１１６８４７９５９１０）を使用した。

【0177】

[00222]１．１６ 遺伝子発現解析およびプライマー
[00223]定量的リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー対は、表２のとおりであった。増幅は以下のとおりに行った：９５℃を３０ｓ、９５℃で１５ｓおよび６０℃で３０ｓを４０サイクル。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均値である。

【0178】

【表4-1】

【0179】

【表4-2】

【0180】

[00224]１．１７ プラスミド構築
[00225]ＣａＭＫＩＩ－δ９を発現するベクターを、ヒト左室のｃＤＮＡからクローニングした。ラットＵＢＥ２Ｔは、ラット心臓のｃＤＮＡからクローニングし、ラットＵＢＥ２ＴのＳ１１０Ａ点変異またはＳ９１３Ａ変異を有するプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的変異導入キットを使用して生成した。それぞれ、ＣａＭＫＩＩ－δ１、δ２、δ３およびδ９の特徴配列であるエクソン１３－１５－１６－１７、エクソン１３－１７、エクソン１３－１４－１７、およびエクソン１３－１６－１７を発現するプラスミドを、ＧＦＰタグと共にｐｃＤＮＡ５／ｆｌａｇプラスミドにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞が８０％のコンフルエンスに達したらプラスミドをトランスフェクトした。

【0181】

[00226]ヒトＣａＭＫＩＩ－δ９、ラットＵＢＥ２Ｔ、ラットＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａ、またはラットＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａを発現するアデノウイルスベクターは、Ｓｉｎｏ Ｇｅｎｏ Ｍａｘ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．が構築した。ＣａＭＫＩＩ－δ２を発現するアデノウイルスベクターは、以前に記載した（Ｚｈｕ，Ｗ．等，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２，１０８３３－１０８３９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ６１１５０７２００（２００７））。

【0182】

[00227]ヒトＵＢＥ２Ｔを発現するプラスミドは、ＯｒｉＧｅｎｅ（カタログ番号：ＴＰ３００７４８の発現プラスミド）からであり、Ｓ１１０Ａ点変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的変異導入キットを使用して生成した。Ｓ１１０Ａ点変異を有する陽性クローンは、シーケンシングにより確認し、次いでタンパク質を精製するためにプラスミドを増幅した。

【0183】

[00228]１．１８ 心室筋細胞の単離、培養、およびアデノウイルス感染
[00229]ＮＲＶＭは、１日齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットから単離し、アデノウイルス媒介遺伝子導入は、以前に記載された方法を使用して実施した（Ｚｈａｎｇ，Ｔ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，１７５－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０１７（２０１６））。ＮＲＶＭを、２４ｈにわたってＨ_２Ｏ_２（２００μＭ）またはＤｏｘ（１μＭ）に曝した。

【0184】

[00230]１．１９ 単離したマウス心臓灌流
[00231]成体マウス（１０～１２週齢）を、ペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。心臓を切除して、ランゲンドルフ装置を用いて、５５ｍｍＨｇの定圧で灌流した。緩衝液には、連続的に９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２（ｐＨ７．４）でガス供給し、熱浴／循環装置で加温した。心臓温度を連続的に監視し、３７±０．５℃に維持した。３０分間にわたり灌流を中断してから再灌流することにより、全虚血を誘導した。

【0185】

[00232]１．２０ 亜細胞分画
[00233]核／細胞質分画キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号：Ｋ２６６、米国）により、メーカ説明書に従って細胞質タンパク質と核タンパク質とを分離した。

【0186】

[00234]１．２１ 細胞生存率分析
[00235]心筋細胞生存率は、以前に記載したように（Ｚｈａｎｇ，Ｔ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，１７５－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０１７（２０１６））、カスパーゼ３／７活性および培養培地中のＬＤＨ濃度によりアッセイした。カスパーゼ３／７活性は、Ｐｒｏｍｅｇａのキット（カタログ番号：Ｇ８０９１）により、メーカ説明書に従って測定した。培養培地中のＬＤＨ濃度は、Ｓｉｇｍａのキット（カタログ番号：ＭＡＫ０６６）を使用して分光測定でアッセイした。

【0187】

[00236]１．２２ 心臓および心筋細胞の組織学
[00237]心臓は、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、５μｍで連続切片を作製した。それらの切片を用いて、標準的なヘマトキシリン・エオシン染色または免疫組織染色を行った。

【0188】

[00238]心筋細胞の免疫蛍光は、以前に記載したように測定した（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．等，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ９１，８８９－９１５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１８．２０１０（２０１１））。

【0189】

[00239]１．２３ ウエスタンブロットおよび共免疫沈降
[00240]ウエスタンブロットおよび共免疫沈降は、以前に記載したように行った（Ｚｈａｎｇ，Ｔ．等 Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２，１７５－１８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０１７（２０１６））。

【0190】

[00241]１．２４ ＲＮＡ干渉介在性遺伝子サイレンシング
[00242]遺伝子サイレンシングアッセイには、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウェブサイトを使用して、３’末端にｄＴｄＴオーバーハングを有する長さ１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを設計した。心筋細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用しメーカ説明書に従って、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．等，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ９１，８８９－９１５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１８．２０１０（２０１１））。遺伝子ノックダウンの効率は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションから７２ｈ後にウエスタンブロットで評価した。ｓｉＲＮＡの配列は表３のとおりであった。

【0191】

【表5】

【0192】

[00243]１．２５ ＣａＭＫＩＩ－δのセルフリーキナーゼアッセイ
[00244]ヒトＣａＭＫＩＩ－δ２タンパク質はＡｂｃａｍ（カタログ番号：ａｂ８４５５２）製、ヒトＵＢＥ２Ｔタンパク質はＯｒｉＧｅｎｅ（カタログ番号：ＴＰ３００７４８）製であり、ヒトＣａＭＫＩＩ－δ９およびＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａタンパク質はＯｒｉＧｅｎｅで産生した。セルフリーキナーゼアッセイは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および４ｍＭ ＤＴＴを含有するキナーゼバッファ中で行った。ＣａＭＫＩＩ－δ９またはδ２のタンパク質を、２００μＭ ＣａＣｌ_２および１μＭ ＣａＭ（Ｓｉｇｍａ）と共に氷上で１分間インキュベートしてから、ＵＢＥ２Ｔタンパク質の存在下に、３０℃で３０分間、１ｍＭ ＡＴＰに曝した。ＳＤＳローディングバッファの添加により反応を停止させた。試料を５分間沸騰させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。免疫ブロット分析には、リン酸化セリンおよびＵＢＥ２Ｔに対する市販抗体を使用した。

【0193】

[00245]１．２６ 心筋細胞へと誘導されたヒト胚性幹細胞
[00246]ヒト胚性幹細胞Ｈ９は、以前に報告されたように（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，Ｐ．Ｗ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １１，８５５－８６０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２９９９（２０１４））、既知組成、異種物不含、小分子ベースの方法を使用して心筋細胞に分化させた。簡単に言うと、Ｈ９細胞を、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：３５４２７７）でプレコートした６ウェルプレート上のＥ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：Ａ１５１７００１）中に維持した。細胞が７０％のコンフルエンスに増殖したら、培地を、６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号：Ｓ１２６３－２５ｍｇ）を補足した基本培地で置換し、４８ｈ後にその培地を、次の４８ｈにわたり、２μＭ Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号：ｏｒｂ１８１１３２）を補足した基本培地に交換した。次いで、細胞を基本培地に維持し、４８ｈごとに新鮮培地に交換した。約８日目に、拍動する心筋細胞が出現した。１０日目に、心筋細胞を精製するために、その基本培地を、グルコースを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１１８７９０２０）で置換した。２日後、心筋細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）発現酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０分間にわたり混ぜて、マトリゲルプレコートしたウェルプレートに移した。

【0194】

[00247]１．２７ 材料
[00248]次のタンパク質に対する抗体を使用した：ラット／ヒトＵＢＥ２Ｔおよびｐ－スレオニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２９９２（ロット番号：１、１：１０００）および９３８１（ロット番号：２２、１：１０００））；マウスＵＢＥ２Ｔ（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＲＰ－４３１４５（ロット番号：ＱＣ１３５８５－４０５０６、１：１０００））；ｐ－ＣａＭＫＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１－０４７（ロット番号：ＱＣ２０７７７２、１：１０００））、ｔ－ＣａＭＫＩＩ－δ（ＧｅｎｅＴｅｘ、ＧＴＸ１１１４０１（ロット番号：４００５８、１：１０００））、ＭｙｃおよびＦｌａｇ（Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ４７００４４７（ロット番号：５２２１３７、ウエスタンブロット用には１：５０００、免疫組織染色用には１：２００））、ならびにＦ１８０４（ロット番号：ＳＬＢＲ７９３６Ｖ、ウエスタンブロット用には１：５０００、免疫組織染色用には１：２００））、γＨ２ＡＸ、ｐ－セリンおよびｏｘ－ＣａＭＫＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５－６３６、クローンＪＢＷ３０１（ロット番号：２８８４５３７、ウエスタンブロット用には１：１０００、免疫組織染色用には１：２００）、０５－１０００、クローン４Ａ４（ロット番号：２６９１１９５、１：１０００）および０７－１３８７（ロット番号：２７３９１５０、１：１０００））、ＣＯＸ－２、ＨＡおよびラミンＡ／Ｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１７４７（ロット番号：Ｈ１９１１、１：１０００）、ｓｃ－７３９２（ロット番号：Ｌ１１１５、ウエスタンブロット用には１：１０００、免疫組織染色用には１：２００）およびｓｃ－６２１５（ロット番号：Ｊ２６１５、１：１０００））、ＰＡＩ－２（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＢＳ３７０２（ロット番号：ＣＡ３６１３１、１：１０００））、β－アクチン（ＥＡＲＴＨＯＸ、Ｅ０２１０７０－０１（ロット番号：０ａ１４０１、免疫組織染色用には１：１００））、ＦＡＮＣＤ２およびＦＡＮＣＩ（ａｂｃａｍ、ａｂ１０８９２８（ロット番号：ＧＲ１３００３９－３２、１：１０００）およびａｂ７４３３２（ロット番号：ＧＲ２５１８１２－８、１：１０００））、ならびにＧＡＰＤＨ（ＥＡＳＹＢＩＯ、ＢＥ００２３、クローン２Ｂ８（１：１００００））。ＭＧ１３２、クラスト－ラクタシスチンβ－ラクトン（β－ｌａｃ）、ドキソルビシンおよびＨ_２Ｏ_２は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。

【0195】

[00249]１．２８ 統計および再現性
[00250]データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）およびＳＰＳＳ１８．０ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。データセットの分布の正規性は、コルモゴロフ－スミルノフ検定を用いて検定した。正規分布を有するデータ群（２群）は、スチューデントの対応なし両側ｔ検定を使用して比較した。ノンパラメトリックデータには、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。多群間の比較は、テューキーの多重比較検定を用いる一元または二元の配置分散分析により評価した。所定標本数に対しては統計手法を使用しなかった。

【0196】

[00251]
実施例１
ヒト心臓におけるＣａＭＫＩＩ－δ９の存在
[00252]本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δのスプライスバリアントの濃度を検出するために、マウス、ラット、アカゲザルおよびヒトからの心臓組織の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｓｈａｒｏｎ，Ｄ．等，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，１００９－１０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７０５（２０１３））を行った。ＳＭＲＴシーケンシング用のライブラリー調製、シーケンシング、およびデータ収集は、一般的な方法および材料の第１．３項に記載した。ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントの定量化は、一般的な方法および材料の第１．７項に記載した方法に従って行った。

【0197】

[00253]驚くべきことに、本発明者は、十分に研究されたスプライスバリアントであるＣａＭＫＩＩ－δ２が、マウスおよびラットでは、それぞれ、全心臓ＣａＭＫＩＩ－δ転写産物の２９％および２２．５％を占めたものの、アカゲザルの心臓（３．１％）およびヒトの心臓（６．３％）では非常に少ないことを見出した。以前に報告されているが機能的に見落とされていたＣａＭＫＩＩ－δ９が、アカゲザル、ヒト、マウスおよびラットにおいてそれぞれ、３３．５％、３１．９％、３２．９％および１４．９％を占め、すべての場合にＣａＭＫＩＩ－δ３に匹敵し、かつ霊長類ではδ２よりもはるかに量が多い、非常に豊富なスプライスバリアントとして出現した（図１ａ）。

【0198】

[00254]さらに、タンパク質レベルでの心臓ＣａＭＫＩＩ－δ９発現を、それぞれ、エクソン１６に相当するペプチドおよびエクソン２１に相当するペプチドと反応する２つのカスタム抗体（抗エクソン１６、抗エクソン２１）により検出した。該抗体は、一般的な方法および材料の第１．６項に記載した方法に従って調製された。一方の抗体によるマウス心筋タンパク質の免疫沈降に続く他方の抗体での免疫ブロットアッセイにより、５０ｋＤに近い単一バンドが現れた。抗エクソン２１によりマウス心臓から免疫沈降した約５０ｋＤのバンドの質量分析（ＭＳ）は、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特徴配列であるエクソン１３－１６－１７によってコードされるペプチドを同定した（図１０ｅ、ｇ）。その代わりに、エクソン２０－２１によってコードされるペプチドは、抗エクソン１６により免疫沈降した試料中に検出された（図１０ｆ、ｈ）。重要なことに、本発明者は、ヒト心臓組織の絶対定量ＭＳ分析を行い（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．等，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １００，６９４０－６９４５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８３２２５４１００（２００３）；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｈ．等 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００，３４１－３５２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２２２５５（２０１１））（表１）、抗エクソン２１で免疫沈降した場合、エクソン１３－１６（δ９）およびエクソン１３－１４（δ３およびδ１１）を含有するペプチドのレベルが、エクソン１３－１７（δ２）のレベルよりも４．１倍および１．７倍であることを見出した（図１ｃ）。同じく、抗エクソン１６で免疫沈降した場合、エクソン２０－２１（δ１、δ９およびδ１１）によりコードされるペプチドのレベルが、エクソン２０－２２（δ５およびδ１０）によりコードされるペプチドの９．２倍であって（図１ｃ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９をδ１０から区別する。したがって、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、哺乳類、特に非ヒト霊長類およびヒトでは、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、心臓の主要ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントをなすと結論づける。

【0199】

[00255]ＣａＭＫＩＩ－δ９の組織分布を特定するために、本発明者は、抗エクソン１６を使用して、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、アカゲザルでは、心臓および骨格筋の両方の横紋筋中に検出されることを見出した（図１０ｉ）。しかしながら、マウスでは、ＣａＭＫＩＩ－δ９が心臓に特異的に発現した（図１０ｊ）。免疫蛍光イメージングは、心筋細胞中のＣａＭＫＩＩ－δ９の、ＣａＭＫＩＩ－δ２と部分的に重複する（図１ｄ）細胞質分布パターンを明らかにし（図１ｄおよび図１０ｋ）、ＣａＭＫＩＩ－δ３は核分画に濃縮された（図１０ｌ）。ＣａＭＫＩＩ－δ９の細胞質分布は、培養新生仔ラット心室心筋細胞（ＮＲＶＭ）の（一般的な方法および材料の第１．２０項に記載した方法に従って行った）亜細胞分画のウエスタンブロットによって確証された（図１０ｍ）。したがって、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、哺乳類、特に非ヒト霊長類およびヒトの心臓での細胞質分布を有する重要なＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントをなすと結論づける。

【0200】

[00256]
実施例２
ＣａＭＫＩＩ－δ９のアップレギュレーションは、様々な心疾患と関連する
[00257]ＣａＭＫＩＩ－δ９の病理学的な関連性を調べるために、本発明者はまず、いくつかの心損傷モデルにおけるそのレベルを評価した。本発明者は、血行動態の圧負荷を模倣するために、マウスにおける横大動脈狭窄（transverse thoracic constriction）（ＴＡＣ）手術を行った。この実施例に使用した実験方法、動物および材料は、一般的な方法および材料の第１．１項、第１．２項、第１．４項、第１．１５項、第１．１８項、第１．１９項、第１．２６項および第１．２７項に記載した。

【0201】

[00258]ＣａＭＫＩＩ－δ９の発現は、化学療法薬ドキソルビシン（Ｄｏｘ、１μＭ）またはＨ_２Ｏ_２（２００μＭ）による酸化ストレスに曝したＮＲＶＭ中では、有意に上昇した（図１ｅ、ｆ）。ＣａＭＫＩＩ－δ９のタンパク質レベルは、ＴＡＣ心臓では、シャム群と比べて明らかに上昇した（図１ｇ）。さらに重要なことに、ＣａＭＫＩＩ－δ９は、肥大型心筋症（ＨＣＭ）の患者からの心臓組織中では、対照と比べて非常に上昇した（図１ｈ）。ＣａＭＫＩＩは、リン酸化および酸化の両方によって活性化されることが公知である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．等，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ９１，８８９－９１５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１８．２０１０（２０１１）；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．等，Ｃｅｌｌ １３３，４６２－４７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００８．０２．０４８（２００８））。急性のＤｏｘ処理は、心筋細胞中でのＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化レベルも酸化レベルも上昇させた（図１１ａ、ｂ）。さらに、ＣａＭＫＩＩ－δ９のリン酸化および酸化は、急性虚血／再灌流傷害（３０分の虚血に続く６０分の再灌流）を受けたマウス心臓においても上昇した（図１１ｃ、ｄ）。したがって、心臓ＣａＭＫＩＩ－δ９は、様々な病理的ストレスに応じてアップレギュレートおよび過活性化され、心臓中でのＣａＭＫＩＩ－δ９の病理学的な関連性を明白にする。

【0202】

[00259]
実施例３
ＣａＭＫＩＩ－δ９シグナル伝達の増強が心筋細胞死を誘発する
[00260]次に、本発明者は、心細胞運命の制御におけるＣａＭＫＩＩ－δ９の可能な役割の特定に努めた。本発明者は、心筋細胞中でのＣａＭＫＩＩ－δ２またはδ３の発現レベルを変化させることなしに（図１１ｈ）ＣａＭＫＩＩ－δ９レベルを特異的に低下させるために（図１１ｅ～ｇ）、ＣａＭＫＩＩ－δのエクソン１６を標的とするｓｉＲＮＡを設計した。該ｓｉＲＮＡは、一般的な方法および材料の第１．２４項に記載した方法に従って設計した。細胞生存率分析は、一般的な方法および材料の第１．２１項に記載した方法に従って行った。

【0203】

[00261]ＣａＭＫＩＩ－δ９のノックダウンは、カスパーゼ３／７活性および培養培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）濃度により示されるように（図２ａ、ｂおよび図１１ｉ、ｊ）、Ｈ_２Ｏ_２誘導性およびＤｏｘ誘導性の心筋細胞死の両方を有意に緩和することが分かり、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、酸化ストレスおよびＤｏｘによって誘導される心損傷に関与することを示唆する。さらに、ＣａＭＫＩＩ－δ９のアデノウイルス遺伝子導入が、力価依存性に強固な心筋細胞死を引き起こすために十分であった（図１１ｋ）。さらに、匹敵するレベルで過剰発現させた場合（図１１ｌ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９は、心筋細胞死の誘導において、ＣａＭＫＩＩ－δ２よりもはるかに強力であり（図１１ｋ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９を、酸化損傷および肥大型心筋症に関与する重要な病原因子として特徴づけることが特筆に値する。

【0204】

[00262]
実施例４
ＣａＭＫＩＩ－δ９は、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションにより心筋細胞のＤＮＡ損傷および細胞死を誘発する
[00263]ＣａＭＫＩＩ－δ９誘発性心筋細胞死を担う機構を解明するため、かつその機構をＣａＭＫＩＩ－δ２の機構と区別するために、本発明者は、匹敵するタンパク質レベルでＣａＭＫＩＩ－δ９またはＣａＭＫＩＩ－δ２を過剰発現する培養ＮＲＶＭを用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、一般的な方法および材料の第１．５項に記載した方法に従って行った。

【0205】

[00264]対照群（Ａｄ－β－ｇａｌ）に対する正規化後、ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現により１５個の遺伝子が変化したが、δ２によっては変化しなかった（図１２ａおよび表４）。リアルタイムＰＣＲを使用して（一般的な方法および材料の第１．１６項に記載した方法に従って行い）、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９対ＣａＭＫＩＩ－δ２による遺伝子発現の示差的制御を検証した。特に、ＵＢＥ２Ｔ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｔ）、ＣＯＸ－２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２）、およびＰＡＩ－２（プラスミノーゲン活性化抑制因子２のＡ型）が、ＣａＭＫＩＩ－δ９によってアップレギュレートされたが、δ２によってはされなかった（図２ｄおよび図１２ｂ）。タンパク質レベルでは、ＣＯＸ－２は、ＣａＭＫＩＩ－δ９によって上昇したがδ２によっては上昇せず、そのｍＲＮＡレベルと一致したが（図１２ｃ）、ＰＡＩ－２タンパク質レベルは、ＣａＭＫＩＩ－δ９またはδ２の過剰発現のいずれによっても不変であった（図１２ｄ）。

【0206】

【表6-1】

【0207】

【表6-2】

【0208】

[00265]ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現は、培養心筋細胞中でのＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルを、そのｍＲＮＡレベルの上昇にもかかわらず（図２ｄ）、有意に低下させ（図２ｅ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９のノックダウンは、ＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルを上昇させることができた（図２ｆ）。それに対して、別の細胞質スプライスバリアント、ＣａＭＫＩＩ－δ２の過剰発現は、同じ実験設定において、ＵＢＥ２Ｔのタンパク質レベルを変化させなかった（図２ｅ）。さらに、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現は、カスパーゼ３／７活性により明示されるように、心筋細胞を、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘発性の細胞死から救済した一方（図２ｇ）、ＵＢＥ２Ｔのノックダウンは、心細胞死の誘発に十分であった（図２ｈおよび図１２ｈ）。さらに、ＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルは、酸化ストレスを受けたＮＲＶＭ中で低下し（図２ｉ）、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現は、Ｈ_２Ｏ_２誘導性の心筋細胞死を低下させた（図２ｊ）。したがって、本発明者は、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションが、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性の心細胞死の仲介において重要な役割を担うことの一連の複数の証拠を提供する。

【0209】

[00266]ＵＢＥ２Ｔは、ファンコニ貧血（ＦＡ）ＤＮＡ修復経路におけるユビキチン結合酵素（Ｅ２）であり、ＦＡＮＣＬによる、ＦＡＮＣＤ２およびＦＡＮＣＩのモノユビキチン化とそれに続くＤＮＡ修復に必要とされる。本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９による心細胞運命の制御が、ＵＢＥ２Ｔ依存性のＤＮＡ修復経路の障害およびそれがもたらすＤＮＡ損傷に起因するのかを調べた。ＤＮＡ損傷は、一般的な方法および材料の第１．９項に記載した方法に従って行ったコメットアッセイにより評価した。

【0210】

[00267]ＤＮＡ二本鎖切断マーカー、γＨ２ＡＸの増加（Ｋｕｏ，Ｌ．Ｊ． ＆ Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｘ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ ２２，３０５－３０９（２００８））およびコメットアッセイ（Ｏｌｉｖｅ，Ｐ．Ｌ． ＆ Ｂａｎａｔｈ，Ｊ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，２３－２９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．５（２００６））により明示されるように、ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現は、心筋細胞中でＤＮＡ損傷を誘発するが、δ２はそうでないことが見出された（図３ａ～ｃおよび図１３ａ、ｂ）。それに対して、ＣａＭＫＩＩ－δ９のノックダウンは、培養心筋細胞中での酸化ストレス誘導性のＤＮＡ損傷を緩和し（図３ｄ、ｅ）、同じく、ＣａＭＫＩＩ－δ９欠損は、心細胞死の低下をもたらした（図２ａ、ｂ）。さらに、ＵＢＥ２Ｔ過剰発現は、ＣａＭＫＩＩ－δ９および酸化ストレスによって誘導される心臓ゲノム不安定性を低下させたが（図３ｆ～ｉ）、ＵＢＥ２Ｔのノックダウンは、心筋細胞中での重大なＤＮＡ損傷をもたらした（図３ｊ、ｋ）。さらに、本発明者は、ＦＡＮＣＤ２およびＦＡＮＣＩという２つのＵＢＥ２Ｔの下流分子の、ｓｉＲＮＡによるサイレンシングが、ＤＮＡ損傷を顕著に高めて、心筋細胞死の増加を伴うことを見出した（図３ｌ、ｍおよび図１３ｃ～ｆ）。したがって、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９による心細胞運命の制御は、主として、ＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションとそれに続くＤＮＡ損傷の増加に起因することを示した。

【0211】

[00268]
実施例５
心筋症および心不全におけるＣａＭＫＩＩ－δ９－ＵＢＥ２Ｔ－ＤＮＡ損傷シグナル伝達の増強
[00269]心損傷および心不全におけるＣａＭＫＩＩ－δ９の役割をさらに評価するために、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９の心臓特異的過剰発現を有するトランスジェニックマウス（ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇ）を生成した（図１４ａ、ｂ）。ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスおよびＵＢＥ２Ｔ ｔｇマウスをそれぞれ、一般的な方法および材料の第１．１０項および第１．１３項に記載した方法に従って生成した。

【0212】

[00270]ＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質レベルが、ｔｇマウス中では、野生型（ｗｔ）同腹仔と比べて、約８倍だけ上昇しており（図４ａ）、ＨＣＭを患う患者におけるそのスプライスバリアントの上昇と同様であることが分かった。ｔｇマウスは、２週齢で死亡し始め、１５週までにはすべて死亡した一方、ｗｔマウスのいずれも同じ期間中に死亡しなかった（図４ｂ）。１０週齢で、ｔｇマウスは重大な心筋症を示し、心肥大、心室拡張および心筋細胞死により明らかになった（図４ｃ、ｄ）。心筋症は、心臓重量・体重比の上昇および肥大型遺伝子発現プロファイルによっても示された（図１４ｃ、ｄ）。その結果、ｔｇマウスでの心機能は、経時的に低下した（図４ｅ、ｆ）。１０週齢までに、ｔｇマウスは重度の心不全になり、ｗｔマウスと比べて非常に低下した駆出率（ＥＦ）および短縮率（ＦＳ）により示された（図４ｅ、ｆ）。さらに、ｔｇマウスでの心室拡張および心臓壁薄肉化が、心エコー検査により確証された（図４ｅ、ｆ、一般的な方法および材料の第１．１４項に記載した方法に従って行った）。重要なことに、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの心臓では、ＤＮＡ損傷が明らかに上昇し（図４ｇおよび図１４ｅ）、かつそれには、ｗｔマウスと比べた、ＵＢＥ２Ｔタンパク質存在量の低下が伴った（図４ｈ）。それに対して、ＣａＭＫＩＩ－δのエクソン１６を標的としたｓｈＲＮＡのトランスジェニック発現による、ＣａＭＫＩＩ－δ９の心臓特異的ノックダウン（一般的な方法および材料の第１．１１項に記載した方法に従って行った）は、ＴＡＣ誘導性の心肥大、収縮不全およびマウスの早期死亡を顕著に減衰させた（図４ｉ～ｋおよび図１４ｆ～ｉ）。ＴＡＣ誘導性の心臓ＤＮＡ損傷および心筋細胞死も、ＣａＭＫＩＩ－δ９のノックダウンにより低下した（図４ｌ、ｍ）。同時に、ＵＢＥ２Ｔタンパク質存在量が、ＣａＭＫＩＩ－δ９欠損マウスの心臓では増加した（図１４ｊ）。ＵＢＥ２Ｔの心臓特異的過剰発現それ自体は、肉眼で識別できる表現型を示さなかったが（図５）、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスと交配すると、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性の心損傷および心機能不全を効果的に改善し、マウスの生存率を顕著に高めた（図５）。したがって、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性のＵＢＥ２Ｔのダウンレギュレーションは、複合的な損傷刺激に誘導される、心不全およびマウスの死につながる、心臓ＤＮＡ損傷、細胞死および心筋症の根拠となる主要な機構である。

【0213】

[00271]ＣａＭＫＩＩ－δ９およびＣａＭＫＩＩ－δ２の機能およびシグナル伝達機構をｉｎ ｖｉｖｏでさらに比較して対比させるために、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの場合と同様に、ｗｔマウスの発現に対して約８倍のＣａＭＫＩＩ－δ２の心臓特異的過剰発現を有するトランスジェニックマウスを構築した（図１４ｋ）。該ＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスは、一般的な方法および材料の第１．１２項に記載した方法に従って生成した。

【0214】

[00272]ＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇマウスは、心筋細胞死、心肥大、心機能不全、およびマウスの死亡を示したが、すべてのパラメーターにより判断すると、有害効果は、ＣａＭＫＩＩ－δ９ ｔｇマウスの有害効果よりもはるかに重度が低かったことを見出した（図１４ｌ～ｏ）。さらに、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ２ ｔｇ心臓中では、ＵＢＥ２Ｔ存在量の低下もＤＮＡ損傷の増加も検出しなかった（図１４ｐ、ｑ）。これらの結果は、２つの細胞質ＣａＭＫＩＩスプライスバリアントが、異なるシグナル伝達経路を活性化し、心臓生理学および心臓病理学において異なる役割を果たすということを示す。

【0215】

[00273]ＨＣＭ患者からの心筋中では、ＣａＭＫＩＩ－δ９の上昇（図１ｈ）に、ＵＢＥ２Ｔ存在量の低下およびＤＮＡ損傷の上昇（γＨ２ＡＸが指標）と共に、心筋細胞アポトーシスの増加が伴った（切断型カスパーゼ３が指標）（図６ａ～ｃ）。さらに、ヒト胚性幹細胞に由来する心筋細胞（一般的な方法および材料の第１．２６項に記載した方法に従って取得した）中では、ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現が、ＣａＭＫＩＩ－δ２の過剰発現よりも重大な細胞死をもたらした（図６ｄ）。同時に、ＣａＭＫＩＩ－δ９は、ＵＢＥ２Ｔの分解と、それに続くＤＮＡ損傷を誘発したが、δ２はそうではなかった（図６ｅ、ｆ）。それに対して、ＣａＭＫＩＩ－δ９ノックダウンは、それらのヒト細胞中におけるＤｏｘ誘導性のＵＢＥ２Ｔ分解、ＤＮＡ損傷および細胞死を効果的に改善した（図６ｇ～ｉ）。

【0216】

[00274]
実施例６
ＣａＭＫＩＩ－δ９はＵＢＥ２ＴをＳｅｒ１１０においてリン酸化しその分解を促進する
[00275]ＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現によってＵＢＥ２ＴのｍＲＮＡレベルは上昇したため、ＵＢＥ２Ｔの、タンパク質レベルでのダウンレギュレーションは、タンパク質分解の上昇によって仲介されるのかもしれない。この仮説を試験するために、本発明者は、プロテアソーム阻害剤β－ｌａｃおよびＭＧ１３２を使用し、両方ともが、ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性のＵＢＥ２Ｔタンパク質レベルの低下を完全に無効にすることを見出した（図７ａ、ｂ）。ＵＢＥ２Ｔは、主に心筋細胞の核中に局在する（図７ｃ）。ＣａＭＫＩＩ－δ９を過剰発現する細胞中では、ＵＢＥ２Ｔがなおも核に富むが、その存在量は低下した（図７ｃ）。特に、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、ＵＢＥ２Ｔを、核分画および細胞質分画の両方に存在させた（図７ｃ）。これらの結果は、ＵＢＥ２Ｔが、心筋細胞の細胞質および核の両方に分布すること、ならびに明らかな核中での濃縮は、細胞質中でのＵＢＥＴ２のＣａＭＫＩＩ－δ９介在性分解の結果であることを示唆する。ＣａＭＫＩＩ－δ９誘導性のＵＢＥ２ＴのｍＲＮＡレベルの上昇は、おそらく、そのタンパク質存在量の低下に対する細胞補償による。

【0217】

[00276]本発明者は、心筋細胞中でのＣａＭＫＩＩ－δ９とＵＢＥ２Ｔとの潜在的な物理的相互作用を調べた。共免疫沈降アッセイは、ＣａＭＫＩＩ－δ９とＵＢＥ２Ｔとがタンパク質複合体を形成することを明らかにした（図７ｄ）。ＮＲＶＭ中でのＣａＭＫＩＩ－δ９の過剰発現は、ＵＢＥ２Ｔのセリンリン酸化を特異的に高めたが（図７ｅ）、スレオニンリン酸化は高めなかった（図７ｆ）。ＣａＭＫＩＩ－δ９に対するＵＢＥ２Ｔのリン酸化部位を詳細に記すために、本発明者は、ＣａＭＫＩＩ－δ９フリーのＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎臓細胞）を、ｍｙｃタグ付きＵＢＥ２ＴプラスミドとＣａＭＫＩＩ－δ９プラスミドとでトランスフェクトした。細胞溶解物を、ｍｙｃ抗体で免疫沈降してから、ＭＳ分析をした。ＭＳ分析は、一般的な方法および材料の第１．８項に記載した方法に従って行った。ＵＢＥ２Ｔの２つのセリン部位（Ｓｅｒ１１０およびＳｅｒ１９３）が、ＣａＭＫＩＩ－δ９の標的候補として同定された（図１５ａ）。本発明者は、ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａ変異はそうではないが、ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａ変異はＣａＭＫＩＩ－δ９介在性分解に対して抵抗性であることを見出し（図７ｇ）、複数種での高度に保存された部位であるＳｅｒ１１０でのＵＢＥ２Ｔのリン酸化（図１５ｂ）が、ＣａＭＫＩＩ－δ９介在性のＵＢＥ２Ｔ分解に不可欠であることを示す。

【0218】

[00277]次に、本発明者は、セルフリーキナーゼアッセイ（一般的な方法および材料の第１．２５項に記載した方法に従って行った）により、ＣａＭＫＩＩ－δ９の存在下または不在下に組換えＵＢＥ２Ｔタンパク質を使用して、ＵＢＥ２Ｔが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の直接基質であるかを特定した。組換えＣａＭＫＩＩ－δ９タンパク質の存在は、ｗｔＵＢＥ２Ｔのセリンリン酸化レベルを有意に増強したが、そのＳ１１０Ａ変異では増強しなかった（図７ｈおよび図１５ｃ）。この結果は、ＣａＭＫＩＩ－δ９がＵＢＥ２ＴのＳｅｒ１１０でのリン酸化を介在することの直接的証拠を提供する。さらに、Ｓ１１０でのリン酸化の破壊（ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１１０Ａ）は、ＵＢＥ２Ｔを細胞質にも核にも存在させたがＳ１９３でのリン酸化の破壊（ＵＢＥ２Ｔ－Ｓ１９３Ａ）はそうではなく（図１５ｄ）、ＣａＭＫＩＩ－δ９が、Ｓｅｒ１１０でＵＢＥ２Ｔをリン酸化し、細胞質中でのプロテアソーム依存性のＵＢＥ２Ｔ分解を促進することが、核内でのＵＢＥ２Ｔの濃縮をもたらすことを確証する。まとめると、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのデータは、心損傷の後、ＣａＭＫＩＩ－δ９が活性化およびアップレギュレートされ、Ｓｅｒ１１０リン酸化とそれに続くＵＢＥ２Ｔの分解を促進させ、最終的に、心筋ＤＮＡ損傷、ゲノム不安定性および細胞死をもたらすことを示す。

【0219】

[00278]
実施例７
ＵＢＥ２Ｔは、ＣａＭＫＩＩ－δ１、δ２またはδ３によっては制御されない
[00279]少ない方の細胞質ＣａＭＫＩＩ－δスプライスバリアントであるＣａＭＫＩＩ－δ２は、ＵＢＥ２Ｔと相互作用もせず（図７ｉ）、そのセリンのリン酸化も上昇させず（図７ｈ）、ＵＢＥ２Ｔが、ＣａＭＫＩＩ－δ２ではなくδ９の特異的基質であることを示唆する。さらに、ＣａＭＫＩＩ－δ１もδ３もＵＢＥ２Ｔと相互作用しない、またはその分解を誘導せず（図８ａ～ｄ）、ＵＢＥ２Ｔが、ＣａＭＫＩＩ－δ９の選択的標的であることを再確認する。ＣａＭＫＩＩ－δ９による、ＵＢＥ２Ｔのスプライスバリアント特異的制御の分子基盤を正確に示すために、本発明者は、それぞれ、ＣａＭＫＩＩ－δ１、δ２、δ３およびδ９の特徴配列であるエクソン１３－１５－１６－１７、１３－１７、１３－１４－１７、および１３－１６－１７によりコードされるペプチドを発現するプラスミドを構築した（図９ａ）。該プラスミドは、一般的な方法および材料の第１．１７項に記載した方法に従って構築した。エクソン１３－１６－１７によりコードされるペプチドはＵＢＥ２Ｔと相互作用したが別のペプチドは相互作用せず（図８ｅおよび図１６）、ＣａＭＫＩＩ－δ９の特徴配列（エクソン１３－１６－１７）が、その基質選択性を担うことを示唆する。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】