▶ クリスタル バイオサイエンス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-29
(54)【発明の名称】抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20220822BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20220822BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220822BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220822BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220822BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220822BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220822BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220822BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220822BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20220822BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20220822BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20220822BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20220822BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20220822BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20220822BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20220822BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20220822BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220822BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N5/09
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P35/02
A61P17/00
A61P11/00
A61P13/12
A61P13/10
A61P11/02
A61P11/04
A61P1/02
A61P27/16
A61K47/60
A61K47/54
A61K47/61
A61K9/127
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021572687
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(85)【翻訳文提出日】2022-01-19
(86)【国際出願番号】 US2020039931
(87)【国際公開番号】W WO2021003075
(87)【国際公開日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】62/870,549
(32)【優先日】2019-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518059392
【氏名又は名称】クリスタル バイオサイエンス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＲＹＳＴＡＬ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(72)【発明者】
【氏名】コラリニ，エレン
(72)【発明者】
【氏名】イスキエルド，シェリー
(72)【発明者】
【氏名】イフラント，クリステル
(72)【発明者】
【氏名】ハリマン，ウィリアム ドン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA19
4C076DD41
4C076DD66
4C076EE23
4C076EE30
4C076EE59
4C076FF34
4C085AA14
4C085AA16
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、様々な治療、診断、および監視用途で用途を見出し、これらについても説明される。本開示は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗体を提供する。対象抗体は、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばサルおよびマウスからのＢ７－Ｈ３に特異的に結合する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ７－Ｈ３に結合する抗体であって、前記抗体は、（ａ）
ｉ．図１から選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と、
ｉｉ．図２から選択される前記抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と、を含む可変ドメイン、または
（ｂ）前記（ａ）の可変ドメインの集合的ＣＤＲ領域における最大１０個のアミノ酸置換を除いて、他の点では前記抗体可変ドメインと同一である前記（ａ）の可変ドメインの変異体、を含む、抗体。
【請求項2】
前記抗体が、図１から選択される抗体の前記重鎖可変ドメインの前記アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、
図２から選択される前記抗体の前記軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、別個のポリペプチドに存在する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項4】
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、単一のポリペプチドに存在する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、１０７Ｍ－１～１０１２Ｍ－１の範囲の親和性でＢ７－Ｈ３と結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が共有結合した非ペプチド合成ポリマーを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記合成ポリマーがポリ（エチレングリコール）ポリマーである、請求項６に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体が共有結合した脂質または脂肪酸部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体が共有結合した多糖または炭水化物部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
前記ｓｃＦｖが多量体化されている、請求項１０に記載の抗体。
【請求項12】
ａ）任意の先行請求項に記載の抗体と、ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項13】
前記抗体がリポソームにカプセル化されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
Ｂ７－Ｈ３を阻害するための方法であって、Ｂ７－Ｈ３を含む細胞を、任意の先行する抗体の請求項に記載の抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項15】
対象においてＢ７－Ｈ３を阻害する方法であって、有効量の、任意の先行する抗体の請求項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項16】
がんを治療する方法であって、がん患者に、有効量の、任意の先行する抗体の請求項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項17】
前記がんが多発性骨髄腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記がんが、皮膚の黒色腫、非小細胞肺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、またはホジキンリンパ腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記患者が免疫チェックポイント阻害剤でも治療されているか、または免疫チェックポイント阻害剤で治療されたことがある、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤である、請求項１９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１９年７月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７０，５４９号の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７０，５４９号の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
Ｂ７－Ｈ３（別名ＣＤ２７６）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現する主要な糖タンパク質である。ヒトの場合、このタンパク質は１５番染色体上の遺伝子によってコードされている。Ｂ７－Ｈ３は、腫瘍細胞のＴ細胞浸潤を阻害する可能性があり（例えば、Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１３ ２１：７０７－７１７およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ ３１９：９６－１０２を参照されたい）、それゆえ免疫チェックポイント阻害剤と考えられる。このタンパク質はＢ７ファミリーの分子に由来し、その多くはＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、およびＣＤ２８などの既知のチェックポイントマーカーと相互作用する。Ｂ７－Ｈ３およびＰＤ－１は、どちらもＢ７／ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである。Ｂ７－Ｈ３およびＰＤ－１はどちらも、Ｔ細胞に対する阻害効果を誘発し、それらの微小環境を変化させて抗腫瘍免疫応答を逃れるため、Ｂ７－Ｈ３はＰＤ－１のような免疫療法の標的と考えられる。
【0003】
Ｂ７－Ｈ３は多くのがんでも過剰発現しているが、現在、Ｂ７－Ｈ３の受容体の特徴は明らかにされていない。その過剰発現は、ヒト患者の予後不良と、インビトロモデルにおける腫瘍の浸潤性および転移性の可能性に関連している。最近の証拠は、Ｂ７－Ｈ３が免疫調節の役割を超えてがんの進行に影響を与えることを示している（例えば、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ ６：６６－７５を参照されたい）。そのため、Ｂ７－Ｈ３阻害は、悪性細胞の増殖、進行、および転移を減少させる可能性がある。
【0004】
がんの発生および免疫チェックポイントとしてのＢ７－Ｈ３の役割のため、Ｂ７－Ｈ３は、特に肺、乳房、脳、腎臓、および前立腺のがん、ならびに他の免疫チェックポイント阻害剤に耐性がある、または耐性になった腫瘍に対して興味深い治療標的になっている。Ｂ７－Ｈ３抗体は、転移性神経芽細胞腫の治療に関する臨床試験で肯定的な結果を示している（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２０１０ ９７：４０９－４１８）。
【0005】
したがって、Ｂ７－Ｈ３機能を阻害する新しい治療用抗体が必要である。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、様々な治療、診断、および監視用途に有用であり、これらも提供される。
【0007】
いくつかの実施形態において、抗体は、（ａ）ｉ．図１から選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と、ｉｉ．図２から選択される抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と、を含む可変ドメイン、または（ｂ）（ａ）の可変ドメインの集合的ＣＤＲ領域における最大１０（例えば、最大９、８、７、６、５、４、３、２、または１）個のアミノ酸置換を除いて、他の点では当該抗体可変ドメインと同一である当該（ａ）の可変ドメインの変異体、を含み得る。
【0008】
いくつかの実施形態において、抗体は、図１から選択される抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、図２から選択される抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、を含む。
【0009】
可変ドメイン配列が図１および２に示されている抗体は、本質的にニワトリで作製された「ヒト」抗体であり、したがって、ヒト、マウス、およびサルなどの様々な哺乳動物のＢ７－Ｈ３中のエピトープに結合することができる。これらのエピトープは哺乳動物では免疫原性ではなく（すでに存在しているため）、そのため、本抗体はいくつかの新しいエピトープに結合すると考えられる。さらに、本抗体は複数の哺乳動物由来のＢ７－Ｈ３に結合することができ、それらの治療可能性をがんの哺乳動物モデルシステム（例えば、マウス）で容易に試験することができるため、本抗体は、有利であり得る。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1-1】５４個の抗Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を示しており、Ｃｈｏｔｈｉａ法で定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で示している。上から下へ：配列番号１－５４。
【図1-2】５４個の抗Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を示しており、Ｃｈｏｔｈｉａ法で定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で示している。上から下へ：配列番号１－５４。
【図2-1】５４個の抗Ｂ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、Ｃｈｏｔｈｉａ法で定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で示している。上から下へ：配列番号５５～１０８。
【図2-2】５４個の抗Ｂ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、Ｃｈｏｔｈｉａ法で定義された相補性決定領域（ＣＤＲ）を四角で示している。上から下へ：配列番号５５～１０８。
【図3】配列比較（１００残基当たりのアミノ酸置換）に基づく５４個の抗Ｂ７－Ｈ３抗体の系統発生関係を示す樹状図。樹状図の分析は、９つの系統グループが表されていることを示している。各系統グループは、１００残基に対して１０未満のアミノ酸置換を有する。各系統グループの抗体は、親和性成熟を介して共通の祖先から派生した可能性がある。各系統グループのＣＤＲのコンセンサス配列を以下に提供する。
【0011】
定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的な結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体もまた包含される。抗体は、一価または二価であってもよい。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的な結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体もまた包含される。抗体は、一価または二価であってもよい。
【0012】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））、単鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合部位がある「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメントが生成され、名称は、容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。
【0013】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合にある１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのはこの構成である。まとめると、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【0014】
「Ｆａｂ」フラグメントも、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されているという点で、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた既知である。
【0015】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分類することができる。
【0016】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
【0017】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対にされ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により完全に説明されている。
【0018】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性より少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍大きい、またはそれ以上である。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）またはそれ以上であり得る。本明細書で使用される場合、「アビディティ」という用語は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、本明細書では、抗体および／または抗原結合フラグメントに関して交換可能に使用される。
【0019】
「結合」という用語は、例えば、塩橋および水橋などの相互作用を含む、共有結合、静電、疎水性、およびイオン結合、および／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指す。抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。非特異的結合とは、約１０－７Ｍ未満の親和性での結合、例えば、１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍなどの親和性での結合を指す。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）に記述されており、定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体または移植された抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることが意図されている。図１および図２に示されているＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法によって定義されている。しかしながら、以下に示すように、ＫａｂａｔおよびＭａｃＣａｌｌｕｍ法を使用してＣＤＲを定義することもできる。
【表1】
【0021】
本明細書で使用される場合、抗体可変領域に関して使用される場合の「フレームワーク」という用語は、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域の外側のすべてのアミノ酸残基を意味することを意図している。可変領域フレームワークは、一般に、長さが約１００～１２０アミノ酸の間の不連続なアミノ酸配列であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを参照することを意図している。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲによって分離されたフレームワークの各ドメインを意味することを意図している。
【0022】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され、分離され、かつ／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク性または非タンパク性溶質が含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、（１）ローリー法によって決定される際に、９０重量％を超える、９５重量％を超える、もしくは９８重量％を超える抗体まで、例えば、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用してＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度、または（３）クマシーブルーもしくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による均一性までで精製されるであろう。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内にインサイチュに抗体が含まれる。場合によっては、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【0023】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、および同様の用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を取得することを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得、疾患に起因する疾患および／または有害作用の部分的または完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいかなる治療を含み、（ａ）疾患にかかりやすい素因があるが、まだ罹患していると診断されていない対象において疾患の発生を防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと、を含む。
【0024】
本明細書で交換可能に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は交換可能に使用され、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
【0025】
「治療有効量」または「有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与された場合に、疾患のそのような治療を行うのに十分である抗Ｂ７－Ｈ３抗体の量を指す。「治療有効量」は、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、疾患およびその重症度、ならびに治療対象の年齢、体重などによって異なる。
【0026】
「生体試料」という用語は、個体から得られた様々な種類の試料のタイプを包含し、診断または監視アッセイで使用することができる。定義には、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検標本または組織培養物などの固形組織試料、またはそれらに由来する細胞、ならびにそれらの子孫が包含される。また、この定義には、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドなどの特定の成分の濃縮など、獲得後に何らかの方法で操作された試料も含まれる。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、および組織試料も含む。
【0027】
本明細書で使用される場合、「抗体可変ドメインの集合的ＣＤＲ領域における」定義された数のアミノ酸置換を除いて、他の点では抗体可変ドメインと同一である抗体可変ドメインの変異体の文脈における「集合的」という用語は、６つのＣＤＲすべてを使用してアミノ酸置換の数がカウントされることを示す。実施例によって説明されるように、変異体が抗体可変ドメインに対して５つのアミノ酸置換を有する場合、変異体の６つのＣＤＲを合わせて、抗体可変ドメインに対して合計５つのアミノ酸置換を有する。この句は、各ＣＤＲが定義された数のアミノ酸置換を有することを意味することを意図していない。
【0028】
本発明がさらに説明を説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら、変化する可能性があることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【0029】
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り、それぞれの介在値は、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間であり、その記載された範囲内の記載された他の値または介在値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲に含めることができ、また本発明に包含され、記載された範囲内で特に除外された制限を受ける。記載された範囲が限界の片方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【0030】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料はまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及されるすべての公表物は、公表物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
【0031】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「抗体」への言及は、そのような複数の抗体を含み、「抗Ｂ７－Ｈ３抗体」への言及は、当業者に既知の１つ以上の抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその等価物への言及を含む、などである。特許請求の範囲は、いかなる任意選択的な要素も排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図する。
【0032】
本明細書で論議される公表物は、本出願の出願日の前の公表物の開示のためだけに提供される。本明細書内のいかなるものも、先行の発明によるこのような公表物に、本発明が先行する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要がある。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本開示は、ヒトＢ７－Ｈ３に特異的な抗体を提供する。抗体は、様々な治療、診断、および監視用途に役立ち、これらもまた提供される。
【0034】
抗体
対象抗体は、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばサルおよびマウスからのＢ７－Ｈ３に特異的に結合する。
対象抗体は、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばサルおよびマウスからのＢ７－Ｈ３に特異的に結合する。
【0035】
対象抗体は、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばサルおよびマウスからのＢ７－Ｈ３に高い親和性の結合を有し得る。例えば、対象抗体は、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、もしくは少なくとも約１０－１２Ｍ、または１０－１２Ｍを超える親和性でヒト、サルおよび／またはマウスＢ７－Ｈ３に結合し得る。対象抗体は、約１０－７Ｍ～約１０－８Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－９Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍ、もしくは約１０－１１Ｍ～約１０－１２Ｍ、または１０－１２Ｍを超える親和性でヒト、サルおよび／またはマウスＢ７－Ｈ３に存在するエピトープに結合する。
【0036】
対象抗体は、いくつかの実施形態において、Ｂ７－Ｈ３のＢ７－Ｈ３リガンドへの結合を減少させ得る。例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、Ｂ７－Ｈ３のＢ７－Ｈ３リガンドへの結合を減少させるか、またはＢ７－Ｈ３の活性をＢ７－Ｈ３とＢ７－Ｈ３リガンドとの間の結合度もしくは抗体の非存在下でのＢ７－Ｈ３活性と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくはそれ以上減少させる。
【0037】
「抗体」という用語は、エピトープに結合することができる１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の重鎖可変領域（ＶＨ）および／もしくは１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはそのサブフラグメントを含むタンパク質を指す。ＶＨおよびＶＬ領域は、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができ、「フレームワーク領域（ＦＲ）」と呼ばれるより保存された領域が点在する。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７を参照されたい）。ＶＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でＮ末端からＣ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含むことができる。同様に、ＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でＮ末端からＣ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含むことができる。
【0038】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部をさらに含み、それによって、それぞれ、重鎖または軽鎖の免疫グロブリン鎖を形成することができる。一実施形態において、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖の四量体であり、ここで、重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインで構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞および補体系の第１成分を含む、宿主組織および因子への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびそれらのサブタイプのインタクトな免疫グロブリンを含む。いくつかの実施形態において、対象抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。
【0039】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、および多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約２５ｋＤまたは２１４アミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣ末端のカッパまたはラムダ定常領域によってコードされている。全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤまたは４４６アミノ酸）は、Ｎ末端の可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびＣ末端の他の前述の定常領域遺伝子のうちの１つである、例えばガンマ（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされている。いくつかの実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含む。
【0040】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含まず、代わりに、全長免疫グロブリン重鎖および／または全長免疫グロブリン軽鎖の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントは、別個のポリペプチド鎖に含有され、他の実施形態において、抗原結合フラグメントは、単一のポリペプチド鎖内に含有される。「抗原結合フラグメント」という用語は、上記のようにＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができる全長抗体の１つ以上のフラグメントを指す。結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成される）、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の単腕のＶＨおよびＶＬドメインで構成される）、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインからなる）、（ｖｉ）分離されたＣＤＲ、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（ＶＨおよびＶＬドメイン対が一価分子を形成するように組換え手段を使用して合成リンカーによって結合される抗体の単腕のＶＨおよびＶＬドメインからなる）、（ｖｉｉｉ）ダイアボディ（ＶＨドメインとＶＬドメインとが対になって一価分子を形成しないように結合された２つのｓｃＦｖからなる、ｓｃＦｖ対のそれぞれの１つのＶＨは他のｓｃＦｖのＶＬドメインと対になって二価分子を形成する）、（ｉｘ）二重特異性抗体（少なくとも２つの抗原結合領域からなり、各領域は異なるエピトープに結合する）が含まれる。いくつかの実施形態において、対象抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。いくつかの実施形態において、対象抗体フラグメントは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
【0041】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、組換え抗体または修飾抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化、またはインビトロで生成された抗体である。本明細書で使用される「組換え」または「修飾」抗体という用語は、（ｉ）宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、（ｉｉ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または（ｉｖ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体、などの組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべての抗体を含むことを意図する。そのような組換え抗体には、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、キメラ、脱免疫化、およびインビトロで生成された抗体が含まれ、任意選択的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含めることができる。
【0042】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、ａ）ｉ．図１および２に示される抗体から選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１領域の配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域の配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域、を含む重鎖可変ドメイン、ならびにｂ）ｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域の配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択された抗体配列の軽鎖ＣＤＲ２領域のアミノ酸配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域、を含む軽鎖可変ドメイン、を含む可変ドメインを含み、抗体は、ヒト、サル、ラット、および／またはマウスのＢ７－Ｈ３に特異的に結合する。
【0043】
特定の実施形態において、抗体は（ａ）ｉ．図１および２に示される抗体から選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域、を含む可変ドメイン、ならびにｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域、ｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域、およびｉｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域、を含む軽鎖可変ドメイン、または（ｂ）（ａ）の可変ドメインの集合的ＣＤＲ領域における最大１０（例えば、最大９、８、７、６、５、４、３、２、または１）個のアミノ酸置換を除いて、他の点ではパート（ａ）の可変ドメインと同一であるパート（ａ）の可変ドメインの変異体、を含み、抗体はＢ７－Ｈ３に結合する。
【0044】
いくつかの実施形態において、抗体は、本明細書に記載される重鎖可変ドメインのみを含有し得る。これらの実施形態において、抗体は「重鎖のみ」の抗体であり得る。
【0045】
以下のコンセンサス配列は、図３の樹状図または系統ツリーを使用して決定されました。任意の実施形態において、ＣＤＲは、表２のコンセンサス配列のいずれかに含まれ得る。例えば、抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、以下の表２で定義されている、グループＩコンセンサス配列、グループＩＩコンセンサス配列、グループＩＩＩコンセンサス配列、グループＩＶコンセンサス配列、グループＶコンセンサス配列、グループＶＩコンセンサス配列、グループＶＩＩコンセンサス配列、グループＶＩＩＩコンセンサス配列、またはグループＩＶコンセンサス配列、に含まれるＣＤＲを有する場合がある。
【表2-1】
【表2-2】
【0046】
いくつかの実施形態において、対象抗体（例えば、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する対象抗体）は、ａ）ｉ）選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域配列からの１つ、２つ、または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびｉｉ）軽鎖フレームワーク領域、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖からのフレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）選択された抗体の重鎖可変領域配列からの１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、およびｉｉ）重鎖フレームワーク領域、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖からのフレームワーク領域を含む重鎖領域、を含み得る。
【0047】
対象抗体は、図１に示され、配列番号１～５５に示される配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。対象抗体は、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、または３つを含む重鎖可変領域を含み得る。
【0048】
対象抗体は、図２に示され、配列番号５６～１１０に示される配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。対象抗体は、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、または３つを含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【0049】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、単一のポリペプチド鎖における抗Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖ＣＤＲおよび抗Ｂ７－Ｈ３抗体軽鎖ＣＤＲを含み、例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、対象抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第１のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ１、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第２のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ２、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第３のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ３、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第４のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ１、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第５のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ２、長さが約５アミノ酸～約２５アミノ酸の第６のアミノ酸配列、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ３、約５アミノ酸～約２５アミノ酸の長さの第７のアミノ酸配列、を含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、軽鎖ＦＲ１領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＦＲ２領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＦＲ３領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖ＣＤＲ３、任意選択的に軽鎖ＦＲ４領域、リンカー領域、任意選択的に重鎖ＦＲ１領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＦＲ２領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＦＲ３領域、選択された抗Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖ＣＤＲ３、および重鎖ＦＲ４領域、を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＦＲ領域のそれぞれは、ヒトＦＲ領域である。リンカー領域は、長さが約５アミノ酸～約５０アミノ酸、例えば、約５ａａ～約１０ａａ、約１０ａａ～約１５ａａ、約１５ａａ～約２０ａａ、約２０ａａ～約２５ａａ、約２５ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、または約４５ａａ～約５０ａａであり得る。
【0051】
対象抗体の使用に適したリンカーには、「柔軟なリンカー」が含まれる。存在する場合、リンカー分子は、一般に、連結された領域間のいくらかの柔軟な動きを可能にするのに十分な長さである。リンカー分子は、一般に約６～５０原子の長さである。リンカー分子はまた、例えば、アリルアセチレン、２～１０個の単量体単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり得る。ポリペプチドに結合することができる他のリンカー分子は、本開示に照らして使用され得る。
【0052】
好適なリンカーは容易に選択することができ、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸などの異なる長さの好適なもののいずれかであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。
【0053】
例示的な柔軟なリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当技術分野で知られている他の柔軟なリンカーが含まれる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的構造化されておらず、したがって、成分間の中性テザーとして機能する可能性があるため、興味深いものである。グリシンはアラニンよりもはるかに多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ないため、グリシンポリマーは特に興味深いものである（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。当業者は、上記の任意の要素に複合体化したペプチドの設計が、全体的または部分的に柔軟なリンカーを含み得、その結果リンカーが柔軟なリンカーならびに柔軟性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。
【0054】
図１および図２に示す抗体は、主にヒトの生殖細胞系列配列で構成されているため、すでにヒトのものである。いくつかの実施形態において、対象抗体は「ヒト化」されている。「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト体鎖に由来する可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖（アクセプター免疫グロブリンまたは抗体と呼ばれる）および実質的にマウス抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲ（ドナー免疫グロブリンまたは抗体と呼ばれる）を含む抗体を指す。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９ １００３３（１９８９）、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、ＷＯ９０／０７８６１、および米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。定常領域は、存在する場合、実質的または完全にヒト免疫グロブリンに由来することができる。いくつかの実施形態において、対象抗体は、ヒト抗体からのＣＤＲのうちの１つ以上および１つ以上のＦＲ領域を含む。ヒト化抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第７，２５６，２７３号を参照されたい。
【0055】
マウスＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークに置き換えると、それらの正しい空間的配向を保持することができ、例えば、ヒト可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークと同じまたは類似の立体構造を採用する。これは、そのフレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変ドメインを取得することによって達成することができる。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３（１９９１）、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９７１（１９９３）を参照されたい。
【0056】
マウスドナー免疫グロブリンおよび適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域を同定したら、次のステップは、もしあるとすれば、これらの成分のどの残基を置換して、得られるヒト化抗体の特性を最適化するかを決定することである。一般に、ヒトアミノ酸残基のマウスによる置換は最小限に抑える必要があり、これは、マウス残基の導入により、抗体がヒトにおいてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発するリスクが高まるためである。免疫応答を決定する技術的に認められた方法は、特定の患者または臨床試験中にＨＡＭＡ応答を監視するために実行することができる。ヒト化抗体を投与された患者は、当該療法の投与の開始時および投与全体を通して免疫原性評価を与えることができる。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当業者に知られている方法を使用して、患者からの血清試料中のヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態において、対象ヒト化抗体は、ヒト対象においてＨＡＭＡ応答を実質的に誘発しない。
【0057】
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸は、ＣＤＲ立体構造および／または抗原への結合に対するそれらの起こり得る影響に基づいて置換のために選択される。マウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域の不自然な並置は、不自然な立体構造拘束をもたらす可能性があり、特定のアミノ酸残基の置換によって修正されない限り、結合親和性の喪失につながる。
【0058】
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、コンピュータモデリングによって決定することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェアおよびソフトウェアは、当技術分野で知られている。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解決された構造から開始して作成される。モデル化される鎖は、解決された三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列類似性について比較され、最大の配列類似性を示す鎖またはドメインが、分子モデルの構築の開始点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖またはドメインがモデリングのために選択され、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を共有するものがモデリングのために選択される。解決された開始構造は、免疫グロブリン鎖またはモデル化されたドメインの実際のアミノ酸と開始構造のアミノ酸との違いを許容するように変更される。次に、修飾された構造が複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、エネルギー最小化、およびすべての原子が互いに適切な距離内にあり、結合長と角度とが化学的に許容できる範囲内にあることを確認することにより、モデルが改良される。
【0059】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１）によって定義されている。代替の構造定義が、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８（１９８９）、およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８９）（総称して「Ｃｈｏｔｈｉａ」と呼ばれる）によって提案されている。上記のＫａｂａｔによって定義されるフレームワーク残基が、上記のＣｈｏｔｈｉａによって定義される構造ループ残基を構成する場合、マウス抗体に存在するアミノ酸を、ヒト化抗体への置換のために選択することができる。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基には、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のＣＤＲの１つ以上に直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ、または、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ ＪＭＢ １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）に直接隣接する位置にあるアミノ酸残基が含まれる。これらのアミノ酸は、特にＣＤＲ内のアミノ酸と特に相互作用し、アクセプターから選択された場合、ドナーＣＤＲを歪め、親和性を減少させる可能性がある。さらに、隣接するアミノ酸は抗原と直接相互作用する可能性があり（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７（１９８６））、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体の親和性を提供するすべての抗原接触を維持するために望ましい場合がある。
【0060】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、ｓｃＦｖ多量体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、ｓｃＦｖ二量体（例えば、２つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）を含む）、ｓｃＦｖ三量体（例えば、３つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３）を含む）、ｓｃＦｖ四量体（例えば、４つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ４））、または４つを超えるｓｃＦｖの多量体（例えば、タンデム）である。ｓｃＦｖ単量体は、長さが約２アミノ酸～約１０アミノ酸、例えば、長さが２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、または１０ａａのリンカーを介してタンデムに連結することができる。好適なリンカーには、例えば、（Ｇｌｙ）ｘ（ｘは２～１０までの整数である）が含まれる。他の好適なリンカーは、上で論じたものである。いくつかの実施形態において、対象のｓｃＦＶ多量体中のｓｃＦｖ単量体のそれぞれは、上記のようにヒト化されている。
【0061】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、免疫グロブリンの定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含む。Ｆｃ領域は、存在する場合、ヒトＦｃ領域であり得る。定常領域が存在する場合、抗体は軽鎖定常領域および重鎖定常領域の両方を含有することができる。好適な重鎖定常領域には、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域が含まれる。本明細書に記載の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むすべてのタイプの定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを有する抗体が含まれる。好適な重鎖Ｆｃ領域の例は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１ Ｆｃである。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。対象抗体（例えば、対象ヒト化抗体）は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含むことができる。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとがスペーサーを介して連結されている単鎖抗体として表現することができる。
【0062】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール（－ＳＨ）基を含み、ここで、遊離チオール基を使用して、抗体を第２のポリペプチド（例えば、対象抗体を含む別の抗体）、足場、キャリアなどに結合させることができる。
【0063】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。好適な非天然アミノ酸については、例えば、米国特許第７，６３２，９２４号を参照されたい。天然に存在しないアミノ酸を含むことで、ポリマー、第２のポリペプチド、足場などへの連結を提供することができる。例えば、水溶性ポリマーに連結した対象抗体は、例えば、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含む対象抗体に対するカルボニル基を含む水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を反応させることによって作製することができる。別の例として、水溶性ポリマーに連結した対象抗体は、アルキン含有アミノ酸を含む対象抗体を、アジド部分を含む水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と反応させることによって作製することができ、いくつかの実施形態において、アジドまたはアルキン基は、アミド結合を介してＰＥＧ分子に連結されている。「天然にコードされていないアミノ酸」とは、２０の一般的なアミノ酸またはピロリシンまたはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。「天然にコードされていないアミノ酸」という用語と同義で使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」、「非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」、「非天然アミノ酸（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ－ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」、および様々にハイフンでつながれたおよびハイフンでつながれていないバージョンのものである。「天然にコードされていないアミノ酸」という用語はまた、これらに限定されないが、天然にコードされたアミノ酸の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるアミノ酸（２０の一般的なアミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインを含むがこれに限定されない）を含むが、これらが翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に自然に組み込まれるわけでない。そのような非天然アミノ酸の例には、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニン、およびＯ－ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
【0064】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、ポリマー（例えば、ポリペプチド以外のポリマー）に連結されている（例えば、共有結合されている）。好適なポリマーには、例えば、生体適合性ポリマー、および水溶性生体適合性ポリマーが含まれる。好適なポリマーには、合成ポリマーおよび天然ポリマーが含まれる。好適なポリマーには、例えば、置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐多糖、例えばホモまたはヘテロ多糖が含まれる。好適なポリマーには、例えば、エチレンビニルアルコールコポリマー（一般に、一般名ＥＶＯＨまたは商品名ＥＶＡＬによって知られている）、ポリブチルメタクリレート、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ヒドロキシブチレート－ｃｏ－バレレート）、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸）、ポリ（グリコール酸－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリホスホエステル、ポリホスホエステルウレタン、ポリ（アミノ酸）、シアノアクリレート、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（イミノカーボネート）、コポリ（エーテル－エステル）（例えば、ポリ（エチレンオキシド）－ポリ（乳酸）（ＰＥＯ／ＰＬＡ）コポリマー）、ポリアルキレンシュウ酸塩、ポリホスファゼン；フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン、ヒアルロン酸などの生体分子；ポリウレタン、シリコン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレンおよびエチレン－アルファオレフィン共重合体、アクリルポリマーおよびコポリマー；ポリ塩化ビニルなどのハロゲン化ビニルポリマーおよびコポリマー；ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテルポリフッ化ビニリデンおよびポリ塩化ビニリデンなどのハロゲン化ポリビニリデン；ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン；ポリスチレンなどのポリビニル芳香族；ポリ酢酸ビニルなどのポリビニルエステル；ビニル単量体同士およびオレフィンのコポリマー、例えば、エチレン－メチルメタクリレートコポリマー、アクリロニトリル－スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、およびエチレン－酢酸ビニルコポリマー；ナイロン６６やポリカプロラクタムなどのポリアミド；アルキド樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリイミド、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリウレタン、レーヨン、レーヨン－トリアセテート、セルロース、酢酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、セロハン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースエーテル、アモルファステフロン、ポリ（エチレングリコール）、およびカルボキシメチルセルロース、が含まれる。
【0065】
好適な合成ポリマーには、非置換および置換の直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、およびそれらの誘導体、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）などの置換ポリ（エチレングリコール）、およびそれらの誘導体が含まれる。好適な天然ポリマーには、例えば、アルブミン、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、およびそれらの誘導体が含まれる。
【0066】
好適なポリマーは、５００Ｄａ～５００００Ｄａの範囲、例えば、５０００Ｄａ～４００００Ｄａ、または２５０００～４００００Ｄａの範囲の平均分子量を有することができる。例えば、対象抗体がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを含むいくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーは、約０．５キロダルトン（ｋＤａ）～１ｋＤａ、約１ｋＤａ～５ｋＤａ、５ｋＤａ～１０ｋＤａ、１０ｋＤａ～２５ｋＤａ、２５ｋＤａ～４０ｋＤａ、または４０ｋＤａ～６０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。
【0067】
上記のように、いくつかの実施形態において、対象抗体は、ＰＥＧポリマーに共有結合している。いくつかの実施形態において、対象ｓｃＦｖ多量体は、ＰＥＧポリマーに共有結合している。例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１０：１００を参照されたい。タンパク質のＰＥＧ化に適した方法および試薬は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，８４９，８６０号に見出すことができる。タンパク質への複合体化に適したＰＥＧは、一般に室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒを有し、式中、Ｒは水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは１～１０００までの整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般に１～８個の炭素を有する。
【0068】
対象抗体に複合体化したＰＥＧは線形であり得る。対象タンパク質に複合体化したＰＥＧも分岐している可能性がある。米国特許第５，６４３，５７５号「星形ＰＥＧ」に記載されているような分岐ＰＥＧ誘導体、およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ １９９７－１９９８」に記載されているような多腕ＰＥＧである。星形ＰＥＧは、例えば、当技術分野で米国特許第６，０４６，３０５号を含んで説明されている。
【0069】
対象抗体は、グリコシル化することができ、例えば、共有結合した炭水化物または多糖部分を含むことができる。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ－結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作成される。Ｏ－結合グリコシル化とは、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用することができる。
【0070】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更して、上記のトリペプチド配列（Ｎ－結合グリコシル化部位の場合）の１つ以上を含むようにすることによって便利に達成される。変更は、元の抗体の配列（Ｏ－結合グリコシル化部位の場合）に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を追加または置換することによっても行うことができる。同様に、グリコシル化部位の除去は、抗体の天然のグリコシル化部位内のアミノ酸変更によって達成することができる。
【0071】
対象の抗体は、いくつかの実施形態において、「放射線不透過性」標識、例えば、Ｘ線を使用して容易に視覚化することができる標識を含む。放射線不透過性材料は当業者によく知られている。最も一般的な放射線不透過性材料には、ヨウ化物塩、臭化物塩、またはバリウム塩が含まれる。他の放射線不透過性材料も知られており、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号を参照されたい）、放射線不透過性マルチウレタン（米国特許第５，３４６，９８１号を参照されたい）、有機ビスマス複合材料（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号を参照されたい）、放射線不透過性バリウム多量体複合体（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号を参照されたい）などが含まれるが、それらに限定されない。
【0072】
対象抗体は、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、またはヘテロ二官能性架橋剤を使用して第２部位（例えば、脂質、対象抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、炭水化物など）に共有結合することができる。グルタルアルデヒドは、アミノ部分を介してポリペプチドを架橋する。ホモ二官能性架橋剤（例えば、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、またはホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤）は、２つ以上の同一の反応性部分を含み、連結されるポリペプチドの混合物を含む溶液に架橋剤を加える１ステップの反応手順に使用することができる。ホモ二官能性ＮＨＳエステルおよびイミドエステルは、アミン含有ポリペプチドを架橋する。弱アルカリ性ｐＨでは、イミドエステルは第一級アミンとのみ反応してイミドアミドを形成し、架橋ポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、および１，４－ジ－（３’、２’－ピリジルジチオ）プロピノアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）が含まれる。
【0073】
ヘテロ二官能性架橋剤は、２つ以上の異なる反応性部分（例えば、アミン反応性部分およびスルフヒドリル反応性部分）を有し、アミンまたはスルフヒドリル反応性部分を介してポリペプチドの１つと架橋され、次いで、未反応部分を介して他のポリペプチドと反応する。ピリジルジスルフィド架橋剤と同様に、複数のヘテロ二官能性ハロアセチル架橋剤が利用可能である。カルボジイミドは、カルボキシルをアミンにカップリングするためのヘテロ二官能性架橋試薬の典型的な例であり、アミド結合をもたらす。
【0074】
対象抗体は、固体支持体に固定化することができる。好適な支持体は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップおよびシリコン表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、デュラサイト、ならびに反応トレイ（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む。固体支持体は、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトなどの様々な物質のいずれかを含むことができる。対象抗体を固体支持体に固定化するための好適な方法はよく知られており、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用などが含まれるが、これらに限定されない。固体支持体は、例えば水溶液に可溶または不溶性であり得る。いくつかの実施形態において、好適な固体支持体は、一般に、水溶液に不溶性である。
【0075】
対象抗体は、いくつかの実施形態において、検出可能な標識を含むであろう。好適な検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。好適なものには、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で一般的に使用されるその他のもの）、およびコロイダルゴールドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色ラベルが含まれるが、これらに限定されない。
【0076】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、造影剤または放射性同位体を含み、造影剤または放射性同位体は、画像化、例えば、ヒトで実施される画像化手順での使用に適したものである。標識の非限定的な例には、１２３１Ｉ（ヨウ素）、１８Ｆ（フッ素）、９９Ｔｃ（テクネチウム）、１１１Ｉｎ（インジウム）、および６７Ｇａ（ガリウム）などの放射性同位元素、およびガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム、および鉄などの造影剤が含まれる。放射性Ｇｄ同位体（１５３Ｇｄ）も利用可能であり、非ヒト哺乳動物のイメージング手順に適している。対象抗体は、標準的な技術を使用して標識することができる。例えば、対象抗体は、クロラミンＴまたは１，３，４，６－テトラクロロ－３α、６α－デフェニルグリコウリルを使用してヨウ素化することができる。フッ素化の場合、フッ化物イオン置換反応による合成中に対象抗体にフッ素が添加される。このような放射性同位元素によるタンパク質合成の概説については、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｇａｒｔｎｅｒ、Ｈ．，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．，１６：１２２－１３０（１９９８）およびＳａｊｉ，Ｈ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，１６（２）：２０９－２４４（１９９９）を参照されたい。対象抗体は、標準的な手法を通じて造影剤で標識することもできる。例えば、対象抗体は、Ｇｄジエチレントリアミン五酢酸（ＧｄＤＴＰＡ）またはＧｄテトラアザシクロドデカン四酢酸（ＧｄＤＯＴＡ）などの低分子Ｇｄキレートを抗体に複合体化させることによってＧｄで標識することができる。Ｃａｒａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９９：２２９３－２３５２（１９９９）およびＬａｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ，３：１１－１６（１９８５）を参照されたい。対象抗体は、例えば、ポリリジン－Ｇｄキレートを抗体に複合体化させることによってＧｄで標識することができる。例えば、Ｃｕｒｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．，３３（１０）：７５２－７６１（１９９８）を参照されたい。あるいは、Ｇｄキレート剤脂質を含む常磁性重合リポソームをアビジンおよびビオチン化抗体とインキュベートすることにより、対象抗体をＧｄで標識することができる。例えば、Ｓｉｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，４：６２３－６２６（１９９８）を参照されたい。
【0077】
対象抗体に連結することができる好適な蛍光タンパク質には、例えば、米国特許第６，０６６，４７６号に記載されているように、Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質またはその変異体または誘導体、例えば、米国特許第６，０２０，１９２号、米国特許第５，９８５，５７７号、米国特許第５，９７６，７９６号、米国特許第５，９６８，７５０号、米国特許第５，９６８，７３８号、米国特許第５，９５８，７１３号、米国特許第５，９１９，４４５号、米国特許第５，８７４，３０４号に記載のもの、エンハンスドＧＦＰ、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．から市販されている多くのそのようなＧＦＰ、例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９６９－９７３に記載されている赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、様々な蛍光および着色タンパク質のいずれか、などが含まれるが、これらに限定されない。
【0078】
対象抗体は、いくつかの実施形態において、融合パートナー、例えば、リガンド、エピトープタグ、ペプチド、抗体以外のタンパク質などに連結される（例えば、共有結合または非共有結合される）。好適な融合パートナーには、インビボでの安定性の向上（例えば、血清半減期の向上）を与えるペプチドおよびポリペプチド、精製の容易さを提供するもの、例えば、（Ｈｉｓ）ｎ、例えば、６Ｈｉｓなど、細胞からの融合タンパク質の分泌を提供するもの、例えば、ＧＳＴ、血球凝集素、ＦＬＡＧ、ｃ－ｍｙｃなどのエピトープタグ、検出可能なシグナル、例えば、検出可能な生成物（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）を生成する酵素、またはそれ自体が検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質などを提供するもの、多量体化、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分などの多量体化ドメインを提供するもの、などが含まれる。
【0079】
融合はまた、結合パートナーと相互作用することができるペプチド配列を含む親和性ドメイン、例えば、同定または精製に有用な、固体支持体上に固定化されたものを含み得る。ヒスチジンなどの連続した単一アミノ酸は、タンパク質に融合すると、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムに高親和性で結合することにより、融合タンパク質のワンステップ精製に使用することができる。例示的な親和性ドメインには、Ｈｉｓ５、ＨｉｓＸ６、Ｃ－ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、ＳｔｒｅｐＴａｇ、血球凝集素、グルタチノン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Ｓ－ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ－末端ＲＮＡタグ、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン、またはカルシウム結合タンパク質からのものなどのカルシウム結合ドメイン、例えば、カルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ－モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレケニン、カルトラクチン、カルパインラージサブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルバルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、およびカルレチニン；インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、ロイシンジッパー配列、およびマルトース結合タンパク質、が含まれる。
【0080】
対象抗体は、いくつかの実施形態において、内因性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドに融合されるであろう。内因性ＢＢＢ受容体に結合するポリペプチドに対象抗体を連結することは、例えば、それを必要とする個体への対象抗体の投与を含む対象治療法（以下を参照されたい）において、ＢＢＢを通過することを容易にする。内因性ＢＢＢに結合する好適なポリペプチドには、内因性ＢＢＢ受容体に特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントが含まれる。好適な内因性ＢＢＢ受容体には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様成長因子受容体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開第２００９／０１５６４９８号を参照されたい。
【0081】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、ポリアミン修飾を含む。対象抗体のポリアミン修飾は、ＢＢＢでの修飾抗体の透過性を高める。対象抗体は、天然または合成のいずれかであるポリアミンで修飾することができる。例えば、米国特許第５，６７０，４７７号を参照されたい。有用な天然ポリアミンには、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、１，３－デアミノプロパン、ノルスペルミジン、ｓｙｎ－ホモスペルミジン、テルミン、サーモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、およびカナバルミンが含まれる。プトレシン、スペルミジン、スペルミンは特に有用である。合成ポリアミンは、実験式ＣＸＨＹＮＺで構成され、１～６個のＮＲまたはＮ（Ｒ）２部分（式中、Ｒは、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、フェニル、またはベンジルである）をさらに含む３～１２個の炭素原子の環状または非環状、分岐または非分岐の炭化水素鎖であり得る。ポリアミンは、任意の標準的な架橋方法を使用して抗体に連結することができる。
【0082】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、炭水化物部分を含むように改変され、ここで、炭水化物部分は、抗体に共有結合され得る。いくつかの実施形態において、対象抗体は、脂質部分を含むように改変され、ここで、脂質部分は、抗体に共有結合され得る。好適な脂質部分には、例えば、Ｎ－ラウロイル、Ｎ－オレオイルなどのＮ－脂肪アシル基、ドデシルアミン、オレオイルアミンなどの脂肪アミン、Ｃ３－Ｃ１６長鎖脂肪族脂質、などが含まれる。例えば、米国特許第６，６３８，５１３号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、対象抗体は、リポソームに組み込まれる。
【0083】
対象抗体の生成方法
対象抗体は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法、組換えＤＮＡ法などによって生成することができる。
対象抗体は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法、組換えＤＮＡ法などによって生成することができる。
【0084】
対象抗体が単鎖ポリペプチドである場合、それは標準的な化学ペプチド合成技術を使用して合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行し得る。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合した後、配列中に残りのアミノ酸を逐次的に付加する固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、対象抗体を化学合成するための好適な方法の例である。成分を合成するために、ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどの様々な形態のＳＰＰＳが利用可能である。固相合成の技術は、Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．のｐｐ．３－２８４．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）、ならびにＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０およびＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡ ｅｔ ａｌ．．２００５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８に記載されている。簡潔に述べると、小さな不溶性の多孔質ビーズをペプチド鎖が構築された機能的ユニットで処理することができる。カップリング／脱保護のサイクルを繰り返した後、結合した固相の遊離Ｎ末端アミンを単一のＮ－保護アミノ酸ユニットにカップリングさせる。次いで、このユニットを脱保護して、新たなＮ末端アミンを表出させ、さらなるアミノ酸を結合させることができる。ペプチドは、固相に固定化されたままであり、切断される前に濾過プロセスを受ける。
【0085】
標準的な組換え法を使用して、対象抗体を産生することができる。例えば、軽鎖および重鎖の可変領域をコードする核酸は、場合によっては定常領域に連結されて、発現ベクターに挿入される。軽鎖および重鎖は、同じまたは異なる発現ベクターでクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクターの制御配列に作動可能に連結されている。発現制御配列には、プロモーター（例えば、天然に関連するプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素、および転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御配列は、真核宿主細胞（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核細胞プロモーター系であり得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、および抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。
【0086】
コードの縮退のために、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は、新規の固相ＤＮＡ合成によって、または所望のポリヌクレオチドの以前に調製された変異体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発によって生成することができる。オリゴヌクレオチドを介した突然変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失、および挿入変異体を調製するための好適な方法の例である。Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ２：１８３（１９８３）を参照されたい。簡単に説明すると、標的ポリペプチドＤＮＡは、目的の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズさせることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込んだテンプレートの第２相補鎖全体を合成し、標的ポリペプチドＤＮＡの選択された改変をコードする。
【0087】
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性等）を含む。
【0088】
大腸菌は、対象抗体をコードするポリヌクレオチドのクローニングに使用することができる原核生物の宿主細胞の例である。使用に好適な他の微生物宿主には、枯草菌等の桿菌、およびサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種等の他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主において、発現ベクターを作製することもでき、それは典型的には、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば複製起点）を含有するであろう。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β－ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系等の、任意の数の様々な周知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、場合によってオペレーター配列を用いて発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列等を有するであろう。
【0089】
酵母等の他の微生物もまた、発現に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰｉｃｈｉａ属は、必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列等を有する好適なベクターを含む好適な酵母宿主細胞の例である。典型的なプロモーターには、３－ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
【0090】
微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、インビトロ細胞培養で成長させた哺乳動物細胞）を使用して、本開示のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を発現し、生成することもできる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい。好適な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、および形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが含まれる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【0091】
（化学的または組換え的に）合成されると、抗体全体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の形態の対象抗体（例えば、ｓｃＦｖなど）を、硫酸塩沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動など（一般的にＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２））を参照されたい）を含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる。対照抗体は実質的に純粋であり得、例えば、少なくとも約８０％～８５％純粋、少なくとも約８５％～９０％純粋、少なくとも約９０％～９５％純粋、もしくは９８％～９９％、またはそれ以上純粋であり得、例えば、細胞片、対照抗体以外の高分子等の混入質を含まない。
【0092】
組成物
本開示は、対象抗体を含む組成物を提供する。対照抗体化合物は、対照抗体以外に、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（例えば、トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどのうちの１つ以上を含み得る。
本開示は、対象抗体を含む組成物を提供する。対照抗体化合物は、対照抗体以外に、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（例えば、トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどのうちの１つ以上を含み得る。
【0093】
核酸
本開示は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターおよびエンハンサーなどの１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結することができ、これにより、目的の標的細胞内のヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、コード化された抗体を合成するために遺伝的に改変された細胞）。
本開示は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターおよびエンハンサーなどの１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結することができ、これにより、目的の標的細胞内のヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、コード化された抗体を合成するために遺伝的に改変された細胞）。
【0094】
好適なプロモーターおよびエンハンサー要素は当技術分野で知られている。細菌細胞での発現の場合、好適なプロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、およびｔｒｃが含まれるが、これらに限定されない。真核細胞での発現の場合、好適なプロモーターには、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスの末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、および様々な当技術分野で知られている組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【0095】
いくつかの実施形態において、例えば、酵母細胞における発現のために好適なプロモーターは、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーターなどの構成的プロモーター、または、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、およびＡＯＸ１（例えば、Ｐｉｃｈｉａで使用するため）などの調節可能なプロモーターである。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の水準の範囲内である。
【0096】
原核生物宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターには、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなど、ａｒａＢＡＤプロモーター、インビボプロモーター、例えばｓｓａＧプロモーターまたは関連プロモーター（例えば、米国特許公開第２００４／０１３１６３７号を参照されたい）、ｐａｇＣプロモーター（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１：１７３（１）：８６－９３、Ａｌｐｕｃｈｅ－Ａｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９２；８９（２１）：１００７９－８３）、ｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．６：２８０５－２８１３）など（例えば、Ｄｕｎｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１３３－５１４１、ＭｃＫｅｌｖｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３２４３－３２５５、およびＣｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８８８－８９２を参照されたい）、 ｓｉｇｍａ７０プロモーター、例えば、コンセンサスｓｉｇｍａ７０プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、およびＡＸ７９８１８３を参照されたい）、固定相プロモーター、例えば、ｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーターなど、病原性島ＳＰＩ－２に由来するプロモーター（例えば、ＷＯ９６／１７９５１を参照されたい）、ａｃｔＡプロモーター（例えば、Ｓｈｅｔｒｏｎ－Ｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１０８７－１０９６を参照されたい）、ｒｐｓＭプロモーター（例えば、［１｝Ｖａｌｄｉｖｉａ ａｎｄ Ｆａｌｋｏｗ｛２］（［３｝１９９６｛４］）［１｝Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．｛２］ ［１｝２２｛２］：［３｝３６７を参照されたい）、ｔｅｔプロモーター（例えば、｛４］Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ． ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９）、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．（ｅｄｓ）、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４３－１６２を参照されたい）、ＳＰ６プロモーター（例えば、Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５を参照されたい）などが含まれるが、これらに限定されない。大腸菌などの原核生物で使用するのに適した強力なプロモーターには、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、およびＰＬａｍｂｄａが含まれるがこれらに限定されない。細菌宿主細胞で使用するためのオペレーターの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレーター（ラクトースと接触するとＬａｃＩリプレッサータンパク質が立体構造を変化させ、それによってＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを防ぐ）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体を形成する場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合する立体構造を有し、トリプトファンがない場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しない立体構造を有する）、およびｔａｃプロモーターオペレーター（例えば、ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）が含まれる。
【0097】
対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクターに存在することができる。対象抗体が２つの別個のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別個のベクターにクローニングすることができる。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、ならびにベクターの複製および／または維持を提供する他の特徴を含むことができる。
【0098】
多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、多くが対象組換え構築物を生成するために市販されている。例として以下のベクターが提供される。細菌：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【0099】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主で動作可能な選択可能なマーカーが存在し得る。好適な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクチンウイルス、ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａのＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５、およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルスから誘導されたウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスから誘導されたベクター）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0100】
上記のように、対象核酸は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。対象核酸は、重鎖および軽鎖のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、対象核酸は、重鎖および軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含み、これらのＣＤＲをコードする配列には、ＦＲをコードするヌクレオチド配列が散在している。いくつかの実施形態において、ＦＲをコードするヌクレオチド配列は、ヒトのＦＲをコードするヌクレオチド配列である。
【0101】
細胞
本開示は、対象核酸で遺伝子改変された単離された遺伝子改変宿主細胞（例えば、インビトロ細胞）を提供する。いくつかの実施形態において、対象の単離された遺伝子改変された宿主細胞は、対象抗体を産生することができる。
本開示は、対象核酸で遺伝子改変された単離された遺伝子改変宿主細胞（例えば、インビトロ細胞）を提供する。いくつかの実施形態において、対象の単離された遺伝子改変された宿主細胞は、対象抗体を産生することができる。
【0102】
好適な宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞などの真核生物宿主細胞、および細菌細胞などの原核細胞が含まれる。対象核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の既知の方法によって達成することができる。
【0103】
好適な哺乳動物細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。好適な哺乳動物宿主細胞には、ヒト細胞系、非ヒト霊長類細胞系、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞系等が含まれる。好適な哺乳動物細胞系として、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が含まれるが、これらに限定されない。
【0104】
好適な酵母細胞には、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ， Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉが含まれるが、これらに限定されない。
【0105】
好適な原核細胞には、大腸菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．などの様々な実験室株のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１７６－１１８１、米国特許第６，４４７，７８４号、およびＳｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９－３０２を参照されたい。本発明で使用することができるサルモネラ菌株の例には、チフス菌およびネズミチフス菌が含まれるが、これらに限定されない。好適な赤痢菌株には、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅが含まれるが、これらに限定されない。通常、実験室株は非病原性のものである。他の好適な細菌の非限定的な例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。
【0106】
製剤および薬学的組成物
本開示は、対象抗体を含む、薬学的組成物を含む組成物を提供する。一般に、製剤は、有効量の対象抗体を含む。「有効量」とは、例えば、腫瘍サイズの縮小または症状の改善など、所望の結果を生み出すのに十分な投与量を意味する。一般に、望ましい結果は、対照と比較した、少なくともがんの症状の軽減である。対象抗体は、以下でより詳細に説明するように、血液脳関門を回避するような方法で送達することができる。対象抗体は、必要に応じて、抗体が血液脳関門を通過できるように処方および／または修飾することができる。治療は、すでに病気に苦しんでいる患者に治療を施し、既存の症状の改善、症状の根本的な代謝原因の改善、障害のさらなる発症の延期または防止、および／または発症するであろう、または発症すると予想される症状の重症度の軽減などの治療的に有益な効果を引き起こすことを含む。
本開示は、対象抗体を含む、薬学的組成物を含む組成物を提供する。一般に、製剤は、有効量の対象抗体を含む。「有効量」とは、例えば、腫瘍サイズの縮小または症状の改善など、所望の結果を生み出すのに十分な投与量を意味する。一般に、望ましい結果は、対照と比較した、少なくともがんの症状の軽減である。対象抗体は、以下でより詳細に説明するように、血液脳関門を回避するような方法で送達することができる。対象抗体は、必要に応じて、抗体が血液脳関門を通過できるように処方および／または修飾することができる。治療は、すでに病気に苦しんでいる患者に治療を施し、既存の症状の改善、症状の根本的な代謝原因の改善、障害のさらなる発症の延期または防止、および／または発症するであろう、または発症すると予想される症状の重症度の軽減などの治療的に有益な効果を引き起こすことを含む。
【0107】
製剤
対象の方法において、対象抗体は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して宿主に投与することができる。したがって、薬剤は、治療投与のための様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、対象抗体は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせによって薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、またはガス状形態の調製物に製剤化することができる。
対象の方法において、対象抗体は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して宿主に投与することができる。したがって、薬剤は、治療投与のための様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、対象抗体は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせによって薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、またはガス状形態の調製物に製剤化することができる。
【0108】
薬学的剤形において、対象抗体は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与することができるか、またはそれらは、単独でもしくは他の薬学的に活性な化合物との、適切な会合、および組み合わせでも使用され得る。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【0109】
経口調製物の場合、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
【0110】
対象抗体は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、また所望であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の通常の添加剤を用いて、注射用調製物に製剤化することができる。
【0111】
対象抗体を含む薬学的組成物は、所望の純度を有する抗体を任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤、防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み合わせなどのアミノ酸、単糖、二糖、および他の糖類、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、ゼラチンまたは血清アルブミンなどのタンパク質、ＥＤＴＡなどのキレート剤、トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖、ならびに／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0112】
薬学的組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成されることになる。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と当量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の薬学的組成物の生成に抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。Ｃｈｅｎ（１９９２） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ １８，１３１１－５４もまた参照されたい。
【0113】
対象の薬学的組成物中の例示的な抗体濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【0114】
抗体の水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、または約５．０～約６．０の範囲、またはあるいは、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範囲内のｐＨで好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
【0115】
製剤の張度を調節するために、等張化剤を抗体製剤に含めることができる。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖、ならびにそれらの組み合わせの群からの任意の成分が挙げられる。いくつかの実施形態において、高張または低張溶液が適し得るが、水性製剤は等張性である。「等張性」という用語は、生理的食塩水または血清など、それが比較されるといくつかの他の溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｎＭの量で使用され得る。
【0116】
界面活性剤はまた、製剤化された抗体の凝集を減少させるために、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最小限にするために、かつ／または吸着を低減するために、抗体製剤に添加されてもよい。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好適なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート ２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標で販売）、およびポリソルベート ８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標で販売）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【0117】
凍結乾燥プロセス中の不安定化条件に対して不安定化な活性成分（例えば、タンパク質）を保護するために、凍結保護剤も添加してもよい。例えば、既知の凍結保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が含まれる。リオプロテクタントは、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれ得る。
【0118】
いくつかの実施形態において、対象組成物は、対象抗体、および上記で定義された薬剤（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびこれらの組み合わせ等の、１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態において、防腐剤が、製剤中に、例えば約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含まれる。
【0119】
例えば、対象製剤は、非経口投与に適した液体または凍結乾燥製剤であり得、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの対象抗体、約０．００１％～約１％の少なくとも１つの界面活性剤、約１ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、場合により約１０ｍＭ～約５００ｍＭの安定剤、約５ｍＭ～約３０５ｍＭの張性剤を含み得、約４．０～約７．０のｐＨを有する。
【0120】
別の例として、対象の非経口製剤は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％のＴｗｅｅｎ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭスクロース含み、ｐＨは５．５である、液体または凍結乾燥製剤である。
【0121】
別の例として、対象の非経口製剤は、以下の凍結乾燥製剤を含む：１）１５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または２）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または３）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または４）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０４％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または６）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５である。
【0122】
別の例として、対象の非経口製剤は、以下の液体製剤である、：１）７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、１２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０の１２５ｍＭスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または２）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および１２５ｍＭのスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または３）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および１２５ｍＭのスクロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または４）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、１２５ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または５）３７．５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および１２５ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または６）５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または７）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのマンニトールを含み、ｐＨは５．５であるか、または８）７５ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬヒスチジン、および１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ｐＨは５．５である、または９）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのトレハロースを含み、ｐＨは５．５であるか、または１０）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および２５０ｍＭのマンニトールを含み、ｐＨは５．５であるか、または１１）１５０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ｐＨは５．５であるか、または１２）１０ｍｇ／ｍＬの対象抗体、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０ ｗ／ｖ、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、および４０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ｐＨは５．５である。
【0123】
対象抗体は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に利用することができる。対象抗体は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容される噴霧剤中に配合することができる。
【0124】
さらに、乳化母材や水溶性母材などの様々な母材と混合することにより、対象抗体を坐剤にすることができる。対象抗体は、坐剤を介して直腸投与することができる。坐剤には、体温で溶けるが室温で固化するカカオバター、カーボワックス、ポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【0125】
シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤等の経口または直腸投与のための単位剤形は、各服用量単位、例えば小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤または坐剤が１つ以上の阻害剤を含有する所定量の組成物を含有するように提供され得る。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として組成物中に対象抗体を含んでもよい。
【0126】
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象の単一投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと共同して所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された、所定量の本発明の化合物を含有する。対象抗体の仕様は、使用される特定の抗体および達成される効果、ならびに宿主における各抗体に関連する薬力学に依存し得る。
【0127】
他の投与様式もまた、本発明での使用を見出すであろう。例えば、対象抗体は、坐剤、場合によってはエアロゾルおよび鼻腔内組成物に処方することができる。坐剤の場合、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を含む。そのような坐剤は、約０．５％～約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％～約２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成することができる。
【0128】
鼻腔内製剤には通常、鼻粘膜への刺激を引き起こさず、毛様体機能を著しく乱さないビヒクルが含まれる。水、生理食塩水または他の既知の物質などの希釈剤を本発明で使用することができる。経鼻製剤はまた、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤を含み得るが、これらに限定されない。鼻粘膜による対象タンパク質の吸収を増強するために、界面活性剤が存在し得る。
【0129】
対象抗体は、注射可能な製剤として投与することができる。通常、注射可能な組成物は、液体の溶液または懸濁液として調製され、注射前の液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適した固体形態もまた調製され得る。調製物を乳化するか、または抗体をリポソームビヒクルにカプセル化することもできる。
【0130】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかになるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を参照されたい。投与される組成物または製剤は、いずれにせよ、治療される対象において所望の状態を達成するのに適切な量の対象抗体を含むであろう。
【0131】
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。
【0132】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、制御放出製剤で製剤化される。徐放性調製物は、当技術分野で周知の方法を使用して調製することができる。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放性調製物に含まれる抗体の生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性は、適切な添加剤を使用し、水分含有量を制御し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって防ぐことができる。
【0133】
本発明の範囲内の制御放出は、いくつかの拡張放出剤形のいずれか１つを意味すると解釈することができる。以下の用語は、本発明の目的のために、制御放出と実質的に同等であると見なされ得る：連続放出、制御放出、遅延放出、デポー、段階的放出、長期放出、プログラム放出、持続放出、比例放出、苒延性放出、リポジトリ、遅延、徐放、間隔放出、維持放出、タイムコート、時限放出、遅延作用、拡張作用、層状時限放出、長時間作用型、延長作用、反復作用、遅延作用性、持続性作用、持続性作用薬品、および延長放出。これらの用語の詳細は、Ｌｅｓｃｚｅｋ Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ，Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１９８７（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出され得る。
【0134】
様々な制御放出技術は、非常に広範囲の薬物剤形をカバーしている。制御放出技術には、物理システムおよび化学システムが含まれるが、これらに限定されない。
【0135】
物理的システムには、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、および膜システムなどの速度制御膜を備えたリザーバーシステム；中空繊維、超ミクロポーラスセルローストリアセテート、多孔質ポリマー基板およびフォームなどの速度制御膜のないリザーバーシステム；非多孔性、高分子、またはエラストマーマトリックスに物理的に溶解したシステム（例、非腐食性、侵食性、環境因子の侵入、および分解性）を含むモノリシックシステム、および非多孔性、高分子、またはエラストマーマトリックスに物理的に分散した材料（例、非腐食性、侵食性、環境因子の侵入、および分解性）、外側の制御層と化学的に類似または異なるリザーバー層を含む積層構造、および浸透圧ポンプなどの他の物理的方法、またはイオン交換樹脂への吸着などが含まれるが、これらに限定されない。
【0136】
化学的システムには、ポリマーマトリックスの化学的侵食（例えば、不均一または均一な侵食）、またはポリマーマトリックスの生物学的侵食（例えば、不均一または均一）が含まれるが、これらに限定されない。制御放出システムのカテゴリーに関する追加の議論は、Ａｇｉｓ Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８０（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出される。
【0137】
経口投与用に開発された制御放出製剤がいくつかある。これらには、浸透圧制御された胃腸送達システム、流体力学的圧力制御胃腸送達システム、ミクロポーラス膜透過制御胃腸送達デバイスを含む膜透過制御胃腸送達システム、胃液耐性のある腸を標的とした制御放出胃腸送達装置、ゲル拡散制御胃腸送達システム、および陽イオン性および陰イオン性薬物を含むイオン交換制御胃腸送達システムが含まれるが、これらに限定されない。制御放出薬物送達システムに関する追加情報は、Ｙｉｅ Ｗ． Ｃｈｉｅｎ，Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９２（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に記載されている。これらの製剤のいくつかは、本明細書で論じられている。
【0138】
投与量
好適な投与量は、様々な臨床的要因に基づいて、主治医または他の資格のある医療関係者が決定することができる。医学でよく知られているように、１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、患者の性別、時間、および投与経路、健康、および同時に投与されている他の薬を含む多くの要因に依存する。対象抗体は、１用量当たり１ｎｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与することができるが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量が想定されている。レジメンが連続注入である場合、それはまた、１分当たり体重１キログラム当たり１μｇ～１０ｍｇの範囲であり得る。
好適な投与量は、様々な臨床的要因に基づいて、主治医または他の資格のある医療関係者が決定することができる。医学でよく知られているように、１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、患者の性別、時間、および投与経路、健康、および同時に投与されている他の薬を含む多くの要因に依存する。対象抗体は、１用量当たり１ｎｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与することができるが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量が想定されている。レジメンが連続注入である場合、それはまた、１分当たり体重１キログラム当たり１μｇ～１０ｍｇの範囲であり得る。
【0139】
当業者は、用量レベルが特定の抗体、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性の関数として変化する可能性があることを容易に理解するであろう。所与の化合物の好適な投与量は、当業者によって様々な手段によって容易に決定することができる。
【0140】
投与経路
対象抗体は、インビボおよびエクスビボでの方法、および全身および局所的な投与経路を含め、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与される。
対象抗体は、インビボおよびエクスビボでの方法、および全身および局所的な投与経路を含め、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与される。
【0141】
いくつかの実施形態において、抗体は、製薬上許容される担体、例えば、ＰＢＳ中で、静脈内注入（２００ｍｇまたは２ｍｇ／ｋｇ、最大２００ｍｇ）として、１０～６０（例えば、３０分）にわたって、２～４（例えば、３）週ごとに患者に投与され得る。
【0142】
従来のおよび薬学的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができるか、または抗体および／もしくは所望の効果に応じて調節することができる。対象抗体組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、経口投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、局所的に投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は頭蓋内に投与される。いくつかの実施形態において、対象抗体組成物は、静脈内投与される。
【0143】
薬剤は、全身経路または局所経路を含む、従来の薬物の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を使用して宿主に投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸、非経口、または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【0144】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内内、脊髄内、胸骨内、および静脈内経路、すなわち消化管以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、対象抗体の全身的または局所的送達をもたらすために実施することができる。全身送達が望まれる場合、投与は通常、薬学的調製物の侵襲的または全身的に吸収された局所または粘膜投与を伴う。
【0145】
対象抗体はまた、経腸投与によって対象に送達することができる。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【0146】
「治療」とは、宿主を苦しめている病態に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、あるパラメータの大きさ、例えば、がんおよびそれに関連する疼痛などの治療される病態に関連する症状の少なくとも軽減を指すために広義で使用される。そのため、治療はまた、宿主が病態、または少なくともその病態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病態または少なくともそれに関連する症状が完全に阻害された、例えば、発生するのを防止された、または停止された、例えば、終了された状況も含む。
【0147】
いくつかの実施形態において、対象抗体は、注射および／または送達によって、例えば、脳動脈の部位に、または脳組織に直接投与される。対象抗体はまた、例えば、標的部位への微粒子銃による送達によって、標的部位に直接投与することができる。
【0148】
様々な宿主（ここで「宿主」という用語は、本明細書では「対象」、「個人」、および「患者」という用語と交換可能に使用される）は、主題の方法に従って治療可能である。一般に、そのような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱内の生物を説明するために広く使用される。いくつかの実施形態において、宿主はヒトである。
【0149】
対象抗体の単位用量、例えば経口または注射可能な用量を備えたキットが提供される。そのようなキットでは、単位用量を含む容器に加えて、関心のある病態の治療における抗体の使用および付随する利点を説明する情報の添付文書がある。好ましい化合物および単位用量は、本明細書で以前に記載されたものである。
【0150】
治療法
本開示は、一般にそれを必要とする個体（例えば、がんを有する個体）に、有効量の対象抗体を単独で（例えば、単剤療法で）または１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて（例えば、併用療法）投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。
本開示は、一般にそれを必要とする個体（例えば、がんを有する個体）に、有効量の対象抗体を単独で（例えば、単剤療法で）または１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて（例えば、併用療法）投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。
【0151】
いくつかの実施形態において、有効量の対象抗体は、単独で（例えば、単剤療法において）、または１つ以上のさらなる治療薬剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回以上の用量で投与されたときに、抗体による治療が無い場合の有害症状の重症度と比較して、がんの有害症状を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上減少するのに有効な量である。
【0152】
いくつかの実施形態において、対象抗体の有効量は、単独で（例えば、単剤療法で）または１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて（例えば、併用療法で）、１以上の用量で投与される量であり、治療を受ける個人の腫瘍サイズを縮小するのに効果的な量である。例えば、有効量の対象抗体は、抗体による治療がない場合の腫瘍サイズと比較して、個体の腫瘍サイズを少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、またはそれ以上減少させることができる。
【0153】
併用療法
いくつかの実施形態において、対象の治療方法は、対象抗体および１以上の追加の治療薬を投与することを含む。好適な追加の治療薬には、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、坑ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＩＤＯ抗体、または抗ＫＩＲ抗体などの免疫チェックポイント阻害剤（他にも知られているが）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療はまた、例えば、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、またはＩＣＯＳに対する抗体などの共刺激抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。このような抗体の例には、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ニボルマブ（ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、およびデュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１）が含まれるが、これらに限定されない。これらの療法は、互いにおよび／または他の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、投与される用量は、患者の体重に応じて、数週間ごと（例えば、３週間ごと）に１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または５０ｍｇ～１．５ｇの範囲であり得る。特定の実施形態において、患者は、腫瘍のＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、ＩＤＯまたはＫＩＲの状態を知ることなく、抗体（複数可）で治療されるであろう。
いくつかの実施形態において、対象の治療方法は、対象抗体および１以上の追加の治療薬を投与することを含む。好適な追加の治療薬には、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、坑ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＩＤＯ抗体、または抗ＫＩＲ抗体などの免疫チェックポイント阻害剤（他にも知られているが）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療はまた、例えば、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、またはＩＣＯＳに対する抗体などの共刺激抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。このような抗体の例には、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ニボルマブ（ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、およびデュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１）が含まれるが、これらに限定されない。これらの療法は、互いにおよび／または他の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、投与される用量は、患者の体重に応じて、数週間ごと（例えば、３週間ごと）に１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または５０ｍｇ～１．５ｇの範囲であり得る。特定の実施形態において、患者は、腫瘍のＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、ＩＤＯまたはＫＩＲの状態を知ることなく、抗体（複数可）で治療されるであろう。
【0154】
治療に適した対象
主題の方法による治療には、様々な対象が適している。好適な対象には、例えば、がんを有する、がんと診断された、がんを発症するリスクがある、以前にがんを有し、がんの再発のリスクがある、またはがんから回復しているヒトなどの任意の個人が含まれる。いくつかの実施形態において、患者は、肺、乳房、脳、腎臓、および前立腺がんを有し得る。これらの実施形態において、Ｂ７－Ｈ３抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃ依存性免疫エフェクターメカニズムを有し得る。これらの実施形態において、抗体は、それが結合する細胞を殺す部分に結合され得る。
主題の方法による治療には、様々な対象が適している。好適な対象には、例えば、がんを有する、がんと診断された、がんを発症するリスクがある、以前にがんを有し、がんの再発のリスクがある、またはがんから回復しているヒトなどの任意の個人が含まれる。いくつかの実施形態において、患者は、肺、乳房、脳、腎臓、および前立腺がんを有し得る。これらの実施形態において、Ｂ７－Ｈ３抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃ依存性免疫エフェクターメカニズムを有し得る。これらの実施形態において、抗体は、それが結合する細胞を殺す部分に結合され得る。
【0155】
他の実施形態において、抗体は、別の免疫チェックポイント阻害剤と可能な組み合わせで免疫チェックポイント阻害剤として使用され、例えば、皮膚の黒色腫、非小細胞肺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫（すべて免疫遮断によって治療することができる）を有する患者を治療できる。
【実施例】
【0156】
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように作成および使用するのかに関する完全な開示および説明を提供するように提案されており、本発明者らが自分らの発明としてみなすものの範囲を制限するよう意図されておらず、本発明者らが、以下の実験が、すべてであるかまたは実施された唯一の実験であることを表すよう意図しているのでもない。使用された数字（例えば量、温度等）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部分は、重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。標準的な略語が使用され得、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下などである。
【0157】
実施例１
抗Ｂ７－Ｈ３アンタゴニスト抗体の生成と特性評価
抗Ｂ７－Ｈ３ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体遺伝子（重鎖のニワトリ定常領域を発現しつつヒト軽鎖（ＶＬＣＬまたはＶＫＣＫ）およびヒトＶＨを発現するトランスジェニックニワトリ（ＯＭＮＩＣＨＩＣＫＥＮ（商標））（Ｃｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＭＡｂｓ．２０１８ １０：７１－８０）を使用して生成された。
抗Ｂ７－Ｈ３アンタゴニスト抗体の生成と特性評価
抗Ｂ７－Ｈ３ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体遺伝子（重鎖のニワトリ定常領域を発現しつつヒト軽鎖（ＶＬＣＬまたはＶＫＣＫ）およびヒトＶＨを発現するトランスジェニックニワトリ（ＯＭＮＩＣＨＩＣＫＥＮ（商標））（Ｃｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＭＡｂｓ．２０１８ １０：７１－８０）を使用して生成された。
【0158】
３羽のトランスジェニックニワトリを２００ｕｇのＦｃタグ付きヒトＢ７－Ｈ３（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＣＤ８－Ｈ５２５３）で免疫し、１４日ごとに１００ｕｇの抗原で３回追加免疫した。血清免疫応答は、ヒトおよびマウスのヒストンタグ付きＢ７－Ｈ３（それぞれ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃Ｂ７３－Ｈ５２Ｅ２および＃Ｂ７３－Ｍ５２Ｈ４）でＥＬＩＳＡによって監視された。
【0159】
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ ｅｔ ａｌ． ２０１６ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｘｆ）２０１６ ６５：３４１－３５２に記載されているように、脾細胞を単離し、ＧＥＭアッセイを使用して試験した。簡単に説明すると、大きなビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ３７３０６）をＨｉｓタグ付きヒトＢ７－Ｈ３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ３７２９６）でコーティングし、小さなビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ３７２９６）をＨｉｓタグ付きマウスＢ７－Ｈ３で一晩コーティングした。ビーズをＤＰＢＳ中の３％ミルクで室温にて１時間ブロックし、次にＤＰＢＳで３回洗浄した。ビーズは、検出のために１ｅ７初代脾細胞およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４複合体化ヤギ抗ニワトリＩｇＹ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ－１１０４２）と５：１（大きいビーズに対する小さいビーズ）の比率で混合された。混合物をプレーティングし、ＣＹ３フィルターを使用して顕微鏡下で陽性クローンを検出した。ビーズに結合したＩｇＹを分泌する細胞を選択した。
【0160】
陽性クローンを、ｄＮＴＰ、プライマー、および酵素ミックスからなるＰＣＲ混合物を含む９６ウェルプレートに移した。
【0161】
重鎖および軽鎖の可変領域をクローニングし、単鎖Ｆｖ－Ｆｃ（ＳｃＦｖ－Ｆｃ）哺乳類発現ベクターに組み入れた。サンガーシーケンシングはＧｅｎｅＷｉｚによって実行され、配列はＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ １５を使用して評価された。ユニークなｓｃＦｖ－Ｆｃｓが、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬およびサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１４５２４）を使用したトランスフェクション後、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１４３５１０１）で増殖したＥｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ１４５２７）中で一過性に発現した。細胞を５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で３７℃で振とうしながら３～５日間インキュベートした。上清を回収し、Ｂｌｉｔｚ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して定量し、様々な種（ヒト、マウス、およびカニクイザル（それぞれＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＣＤ８－Ｈ５２２４、ＣＤ８－Ｍ５２２３、およびＣＤ８－Ｃ５２２３））またはウサギ抗ｈｕＦｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＃６０９－４１０３、陽性対照）または無関係なｈｉｓタグ付きタンパク質（陰性対照）のＨｉｓタグ付きＢ７－Ｈ３タンパク質でコーティングされたプレート上でＥＬＩＳＡによって結合活性を試験した。
【0162】
細胞株への抗Ｂ７－Ｈ３抗体の結合は、フローサイトメトリーによって評価された。簡単に説明すると、約１．５ ｅ５のＢ７－Ｈ３発現ＣＨＯ細胞（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）または親ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０ｕｇ／ｍｌの抗Ｂ７－Ｈ３抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０１％ ＮａＮ３）に再懸濁し、氷上で６０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７複合体化ロバ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃７０９－６０５－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液に氷上で６０分間再懸濁した。次に、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で読み取った。データは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。合計５４の抗体が細胞への有意な結合を示した。これらのうち２つはＥＬＩＳＡで有意な結合を示さなかったため、種の交差反応性を決定することはできない。残りの５２のうち、すべてがｃｙｎｏ Ｂ７－Ｈ３に結合し、１つだけがマウスＢ７－Ｈ３に結合しなかった。
【0163】
抗Ｂ７－Ｈ３抗体のＢ７－Ｈ３への結合親和性は、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体は、ＨＣ３０Ｍチップにアミン結合した。ＳｃＦｖ－Ｆｃ上清をＨＢＳＴＥで３０倍に希釈し、抗ヒトＦｃ結合ＨＣ３０Ｍチップで捕捉した。４００ｎＭから始まるｈｉｓタグ付きＢ７－Ｈ３の１：２希釈系列を、結合のためにチップに注入した。Ｃａｒｔｅｒｒａ（商標）Ｋｉｎｅｔｉｃｓソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0164】
エピトープビニングでは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（リガンドｓｃＦｖ－Ｆｃと呼ばれる）を含む上清を５０倍に希釈し、ｓｕｌｐｈｏ－ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングケミストリーを介してＨＣ２０００Ｍチップにカップリングし、エタノールアミンでブロックした。ビニング実験の各サイクルで、１００ｎＭのｈｉｓタグ付きヒトＢ７－Ｈ３をアレイ全体に注入し、次にＨＢＳＴＥ＋ＢＳＡで４０倍に希釈した個々の上清ｓｃＦｖ－Ｆｃ（分析物ｓｃＦｖ－Ｆｃと呼ばれる）をリガンドｓｃＦｖ－Ｆｃに結合した抗原を挟むために、アレイ全体に注入した。各サイクルの終わりに、チップを１０ｍＭグリシンｐＨ ２で再生して、結合した抗原と分析物ｓｃＦｖ－Ｆｃを除去した。この手順は、すべての分析物の上清に対して繰り返された。エピトープビニング分析は、Ｃａｒｔｅｒｒａエピトープソフトウェアを使用して実行された。この抗体コホートでは、５つのエピトープビンが同定された。
【0165】
ＡＤＣＣレポーターアッセイは、エフェクター細胞としてヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８（高親和性）（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７０１０）を発現するレポーター細胞を使用して実施した。標的細胞は、Ａ４９８細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ－４４、腎がん細胞）、またはＢ７－Ｈ３と安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＃Ｍ００５３６）のいずれかであった。精製された抗Ｂ７－Ｈ３抗体（上記のｓｃＦｖ－ＦｃｓはＩｇＧに変換され、発現され、精製された）が１０μｇ／ｍｌの最高濃度で標的細胞に添加され、続いて７ポイントの対数希釈系列、および未処理試料対照を添加した。エフェクター細胞を添加し、プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて６時間インキュベートした。試料は３回実行された。Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を添加して１０分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２３００ ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダーで化学発光を測定した。データをグラフ化し、各抗体のＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用したカーブフィッティングによって決定した。試験した５４個の抗体のうち３７個がＡ４９８標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を示し、５４個の抗体のうち５２個がＣＨＯ－Ｋ１／Ｂ７－Ｈ３標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を示した。
【0166】
これらのアッセイの結果を以下の表３～５に示す。
【表3-1】
【表3-2】
【表4-1】
【表4-2】
【表5-1】
【表5-2】
【0167】
本発明がその特定の実施形態に関連して説明されているが、様々な変更が行われ得、等価物が本開示の真の主旨および範囲から逸脱することなく代用され得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの変更は、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ（複数可）を、本開示の対象の主旨および範囲に適合するように行われ得る。すべてのそのような変更は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】