特表 2022-538089 組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-31

(54)【発明の名称】組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20220824BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220824BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220824BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220824BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220824BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220824BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220824BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220824BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220824BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20220824BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220824BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

C07K16/28 ZNA

A61K39/395 D

A61P43/00 121

A61K47/68

A61P37/02

A61P29/00

A61P1/04

A61P17/00

A61P37/08

C12P21/08

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576307

(86)(22)【出願日】2020-06-19

(85)【翻訳文提出日】2022-02-17

(86)【国際出願番号】 GB2020051497

(87)【国際公開番号】W WO2020254828

(87)【国際公開日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】19181869.9

(32)【優先日】2019-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】521555823

【氏名又は名称】ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】クロウ，スコット

(72)【発明者】

【氏名】ウェスト，マイク

(72)【発明者】

【氏名】ロバーツ，ケビン

(72)【発明者】

【氏名】カールトン，ティム

(72)【発明者】

【氏名】マッジョーレ，ルアナ

(72)【発明者】

【氏名】キュービット，マリオン

(72)【発明者】

【氏名】ドゥアルテ，ルルデス

(72)【発明者】

【氏名】レイ，キース

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC06

4B064CC10

4B064CC12

4B064CC24

4B064CE03

4B064DA01

4C076BB01

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC16

4C076CC18

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA15

(57)【要約】

【解決手段】
とりわけ、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物であって、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、組成物。

【請求項2】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号９と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

（ａ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は配列番号１を含み、ＣＤＲ２は配列番号２を含み、ＣＤＲ３は配列番号３を含み、ならびに
（ｂ）前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は配列番号９を含み、ＣＤＲ２は配列番号１０を含み、ＣＤＲ３は配列番号１１を含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

（ａ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は配列番号１からなり、ＣＤＲ２は配列番号２からなり、ＣＤＲ３は配列番号３からなり、ならびに
（ｂ）前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は配列番号９からなり、ＣＤＲ２は配列番号１０からなり、ＣＤＲ３は配列番号１１からなる、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ポリペプチドがそれぞれ、免疫グロブリン鎖可変ドメインを含む、または該ドメインからなる、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記ポリペプチドがそれぞれ、ＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬから選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記ポリペプチドがそれぞれ、ＶＨＨまたはＶＨから選択される、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＴＮＦ－αに結合し、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＩＬ－７Ｒに結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってＬ９２９アッセイにおいてヒトＴＮＦ－α細胞毒性を中和し、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってヒトリンパ球においてＩＬ－７Ｒ依存性、ＩＬ－７誘導型のＳＴＡＴ５リン酸化を中和する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

（ａ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも７５％の同一性を共有する配列を含む、または該配列からなり、
（ｂ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、配列番号１６に対して少なくとも７５％の同一性を共有する配列を含む、または該配列からなる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

（ａ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、配列番号８を含む、または配列番号８からなり、
（ｂ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、配列番号１６を含む、または配列番号１６からなる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよび前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、結合される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよび前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、プロテアーゼ不安定ペプチドリンカーにより結合される、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記プロテアーゼ不安定ペプチドリンカーが、Ｋおよび／またはＲ残基を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記プロテアーゼ不安定リンカーが、フォーマット－（Ｇ_４Ｓ）_ｘ－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_ｙ－の配列（配列番号３４）を含む、または該配列からなり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、１～５である、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記プロテアーゼ不安定リンカーが、フォーマット－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_２－の配列（配列番号２１）を含む、または該配列からなる、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記ポリペプチドが、小腸または大腸に存在する１つ以上のプロテアーゼに対して実質的に耐性を示す、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記プロテアーゼが、トリプシンおよびキモトリプシンである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項23】

薬剤として使用するための、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に使用するためのものである、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防のための薬剤の製造における、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項26】

自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置または予防する方法であって、必要とする人に請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項27】

前記自己免疫疾患および／または炎症性疾患が、炎症性腸疾患および／または粘膜炎である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の組成物、使用、または方法。

【請求項28】

前記自己免疫疾患および／または炎症性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の組成物、使用、または方法。

【請求項29】

前記組成物が、経口投与用である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の組成物、使用、または方法。

【請求項30】

前記組成物が、局所投与用である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の組成物、使用、または方法。

【請求項31】

ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に使用されるＴＮＦ－α結合ポリペプチドであって、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、ＴＮＦ－α結合ポリペプチド。

【請求項32】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に使用されるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドであって、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物ならびに構築物に関する。本発明はまた、かかる構築物をコードする核酸、かかる組成物および構築物を調製する方法、かかる構築物をコードする核酸を含むｃＤＮＡおよびベクター、かかる構築物を発現するか発現可能な宿主細胞、ならびにかかる組成物および構築物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子αは、可溶性形態と膜結合形態の両方に存在する全身性炎症に関与するホモ三量体炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦ－αは、主に単球およびマクロファージにより分泌されるが、腫瘍細胞株のほか、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球、ならびに一部の培養ＴおよびＢ細胞株により分泌される。ＴＮＦ－αは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、悪性病変、および／または神経変性疾患に関係するものであり、関節リウマチやクローン病（ＣＤ）などの自己免疫／自己炎症性疾患を対象とする特異的な生物学的治療の標的である。

【0003】

インターロイキン－７（ＩＬ－７）は、非造血性の間質細胞および上皮細胞により構成上産生され、胸腺でのＴリンパ球の発達、および末梢性Ｔ細胞の生存およびホメオスタシス調節に不可欠なものである。腸管粘膜では、ＩＬ－７はさらに、病原性微生物チャレンジに対する免疫応答の最初のプライミングに重要な自然リンパ球細胞のほか、リンパ系組織器官形成および一部の樹状細胞集団を促進する能力を有するＣＤ４＋リンパ組織誘導物質（ＬＴｉ）細胞の、表現型的かつ機能的に別個の集団を調節する。Ｔ細胞に対するＩＬ－７の効果は機能的であるため、ＩＬ－７は、防御免疫のほか、自己免疫および炎症の重要な強化因子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）となる。異なる標的細胞に対するＩＬ－７の効果は、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－７Ｒαサブユニット（ＣＤ１２７）を含むヘテロ二量体複合体、および共通のサイトカイン受容体γ鎖（γｃ）（ＣＤ１３２）を介して媒介される。ＩＬ－７Ｒαは、細胞膜結合型のフォーマットだけでなく、可溶性形態（ｓＩＬ－７Ｒα）でも利用可能である。前臨床試験では、ヒトＴ細胞発達およびホメオスタシスにおいてＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒαが果たす役割に加えて、異なる自己免疫および炎症性疾患の動物モデルにおけるＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα経路の関与を実証した。

【0004】

ＴＳＬＰは、身体の粘膜表面での炎症プロセスの調節に関与すると考えられているサイトカインである。ＴＳＬＰは、樹状細胞（ＤＣ）および自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）を刺激してＴｈ２サイトカイン類（ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３）の分泌を誘導し、Ｔｈ２型炎症の進行を促進する。ＴＳＬＰは現在、アトピー性皮膚炎や鼻炎を含む一部のアレルギー障害発症の基礎をなすとともに、エオシン好性食道炎（ＥｏＥ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む腸障害を促進すると考えられている。逆説的には、ＴＳＬＰはさらに、胃腸管における免疫ホメオスタシスおよび粘膜保護の維持に重要なものであるとも報告された。近年では、ＴＳＬＰは２つの異なるアイソフォームとして発現される場合があるという発見は、このサイトカインの明らかに対照的な活性についての生物学的な説明を提供している。分子試験では、ＴＳＬＰ遺伝子は、２つの異なるプロモータ領域により調節される２つのコーディングＲＮＡを生じさせる場合があると認められている。転写産物の１つは、１５９ａａのＴＳＬＰ（Ｌ－ＴＳＬＰ）の長いアイソフォーム（ＵＮＩＰＲＯＴ ｅｎｔｒｙ Ｑ９６９Ｄ９、配列番号２２）をコードし、第２の転写産物は、Ｌ－ＴＳＬＰのＣ末端６３ａａを包含するＴＳＬＰ（Ｓ－ＴＳＬＰ）の短い形態（ＵＮＩＰＲＯＴ ｅｎｔｒｙ Ｑ９６９Ｄ９－２、配列番号２３）をコードする。Ｌ－ＴＳＬＰは、ＴＳＬＰ特異的受容体鎖（ＴＳＬＰＲ）およびＩＬ－７Ｒα鎖を含む受容体複合体を介して、標的細胞に作用する。近年の構造試験では、ＩＬ－７およびＬ－ＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体複合体のＩＬ－７Ｒα鎖との相互作用は、共通のＩＬ－７Ｒα結合部位を対象とすることが認められている（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ ｅｔ ａｌ ２０１７）。Ｓ－ＴＳＬＰは、ＴＳＬＰＲに結合せず、この受容体に対するＬ－ＴＳＬＰの結合を阻害することができない。著者の知る限りでは、Ｓ－ＴＳＬＰに特異的な受容体は、現在まで特定されていない。重要なことに、Ｓ－ＴＳＬＰは、主に健康な皮膚により、および上皮細胞と基底膜細胞により健康な腸粘膜組織に発現されることが認められている。Ｓ－ＴＳＬＰは抗炎症性活性を有している。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＳ－ＴＳＬＰは、単球由来のＤＣにより炎症促進性のサイトカインの産生を阻害し、免疫寛容原性表現型に対するＣＤ１０３＋ＤＣの調整に寄与する。

【0005】

このため、ＴＮＦα、ＩＬ－７、およびＬ－ＴＳＬＰはすべて、ＩＢＤにおける腸炎症の発症と維持に関与する細胞の種類と経路を調節するサイトカインである。抗ＴＮＦ－α抗体は、クローン病および潰瘍性大腸炎の処置を変えた。しかし、抗ＴＮＦ－α薬剤を処方された患者の約３分の１は、一次不応答者である。一次応答者において、その後の反応損失は、１年あたり１０～５０％変動する場合がある（二次不応答）。一次不応答を認めた患者は、２回目の抗ＴＮＦ－α薬剤に切り替えても恐らく利益を受けない。その結果、このような患者において満たされていない臨床的必要性に対してより良く対処するために、新たな有効な治療が必要とされている。現在、ＩＬ－７Ｒ遮断抗体の有効性試験は、腸炎症疾患の患者を対象に行われていない。しかし、前臨床試験では、ＩＬ－７Ｒ遮断抗体の短期全身投与は、胃腸炎症モデルにおいて有効な処置となり得ることを実証した。マウスＩＢＤモデルでは、ＩＬ－７Ｒアンタゴニスト投与後の有効性に関する一次機構は、中程度～高度のＩＬ－７Ｒαを発現するとともに、炎症腸組織でのＩＬ－７の産生増加に起因して活性化される病原性Ｔ細胞（ＩＬ－７Ｒ＋作用因子／記憶Ｔ細胞）の局所的な枯渇または機能的阻害に関与している。ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ経路の阻害は、ＴＮＦ－α中和抗体の動作に関与するものとは異なる機構により炎症促進性Ｔ細胞に対処するための新規な戦略を表す。このため、抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－７Ｒ抗体の効果の組合せを完遂する組成物または構築物は、より幅広いＩＢＤ患者群において有効性が改善する可能性を有している。

【0006】

ＷＯ２００４０４１８６２、ＷＯ２００６１２２７８６、およびＣｏｐｐｉｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２００６（本明細書ではそれら全体が参照により組み込まれる）は、ＴＮＦ－αおよび関連する態様を対象とする単一ドメイン抗体を開示する。ＷＯ２０１３０５６９８４、ＷＯ２０１５１８９３０２、ＷＯ２０１１０９４２５９、およびＷＯ２０１１１０４６８７（本明細書ではそれら全体が参照により組み込まれる）は、ＩＬ－７Ｒおよび関連する態様を対象とする抗体を開示する。

【0007】

本発明の組成物または構築物は、少なくともいくつかの実施形態では、先行技術の物質と比較して以下の利点のうち１つ以上を有する場合がある。これら利点は、本発明の組成物中の成分であるポリペプチドそれぞれによりそれ自体で実現することができ、あるいは、本発明の組成物中のポリペプチド同士の組合せにより、以下の利点のうち１つ以上に関して相加的またはさらに相乗的な効果が生じる場合がある。
（ａ）ＴＮＦ－αおよび／またはＩＬ－７Ｒの親和性および／または結合活性の増加、
（ｂ）ＴＮＦ－αおよび／またはＩＬ－７Ｒに対する中和能の増加、
（ｃ）シグナル伝達タンパク質のリン酸化阻害の増加、
（ｄ）サイトカイン産生阻害の増加、
（ｅ）例えばマウス、カニクイザル、またはヒトに投与したときの免疫原性の低下、
（ｆ）例えば（ａ）小腸および／または大腸に見られるプロテアーゼ、ならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１２、他のＭＭＰ、およびカテプシンの存在下、ならびに／あるいは（ｂ）細胞膜付着プロテアーゼ、分泌プロテアーゼ、および小腸および／または大腸に見られる腸共生マイクロフローラおよび／または病原性菌からの細胞溶解に放出されたプロテアーゼなどのプロテアーゼの存在下での安定性の増加、
（ｇ）産生中のプロテアーゼ分解に対する安全性（例えば、酵母菌プロテアーゼに対する耐性）の増加、
（ｈ）経口投与の適切性の増加、
（ｉ）経口投与後の腸管および基底膜への局所送達の適切性の増加、
（ｊ）細菌（例えば大腸菌）または酵母菌（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの異種の宿主における発現の適切性の増加、
（ｋ）医薬品における使用の適切性、および特性の改善、
（ｌ）機能性食品における使用の適切性、および特性の改善、
（ｍ）粘膜下基底膜にアクセスするための、炎症を起こした結腸粘膜上皮および粘膜下組織の浸透などの組織浸透の改善、
（ｎ）例えばヒト免疫グロブリンに対する配列類似性の増加に起因するヒトの免疫原性の低下、
（ｏ）特に経口投与したときに、具体的には炎症性腸疾患および／または粘膜炎を含む自己免疫疾患および／または炎症性疾患のより有効な予防または処置、その症状の改善、ならびに
（ｐ）新規なエピトープへの結合。

【発明の概要】

【0008】

本発明者は、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ７Ｒ結合ポリペプチドを含む、驚くほどに有効な組成物ならびに構築物を提供する。具体的には、単一の組成物中でのＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの提供は、各結合ポリペプチドを個別に提供するよりも有効な可能性があることが認められている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中でのこれらポリペプチドの組合せには相加効果があり、さらなる実施形態では、本発明の組成物中でのこれらポリペプチドの組合せには相乗効果がある可能性がある。

【0009】

本明細書に開示される発見に基づき、炎症性腸疾患患者（実施例４および５）からｅｘ ｖｉｖｏで培養した腸の粘膜組織を使用すると、これらの組成物は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の予防あるいは処置において特に有効であると予想することができる。より具体的には、本明細書に開示される発見は、これら組成物が、特に経口投与されたときに、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、またはチェックポイント阻害剤誘導型大腸炎）の予防または処置、あるいは粘膜炎もしくは食道炎の予防または処置において特に有効であることを示している。

【0010】

疾患の処置においてＴＮＦ－α結合ポリペプチドをＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに使用することにより、同じ利益が導き出される可能性があると予想することができ、この場合、ポリペプチドは同じ組成物中で組み合わされていない。同様に、疾患の処置においてＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドをＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに使用することにより、同じ利益が導き出される可能性があると予想することができ、この場合、ポリペプチドは同じ組成物中で組み合わされていない。

【0011】

本発明は、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物を提供する。

【0012】

また、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド、ならびにこの構築物をコードするポリヌクレオチドも提供される。

【0013】

さらに、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに使用されるＴＮＦ－α結合ポリペプチド、ならびに自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに使用されるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドも、提供される。

【0014】

特異的なＴＮＦ－α結合ポリペプチド、および本明細書に開示されるデータの一部は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ／２０１６／１５６４６５にも開示される（特にこの出願がＴＮＦ－α結合ポリペプチドＩＤ－３８Ｆに関係がある限りでは、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる）。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】胃腸抽出物におけるＶ７Ｒ－２Ｅ９およびＩＤ－Ａ４０Ｕの生存率の図である。

【図2】ヒトの便の上清におけるＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－Ａ４１Ｕの生存率の図である。

【図3】ＵＣ生検組織（Ｌｃｋに対するリンタンパク質ｐ３８α）でのリン酸化に対するＩＤ－３８ＦとＩＤ－Ａ６２Ｕの組合せの効果の図である。

【図4】ＵＣ生検組織（ｈｓｐ６０に対するリンタンパク質ＳＴＡＴ５ａ）でのリン酸化に対するＩＤ－３８ＦとＩＤ－Ａ６２Ｕの組合せの効果の図である。

【図5】薬剤を個別および組み合わせて投与した後、患者ＵＣ２７４７、ＵＣ２７４８、ＵＣ２７４９、およびＵＣ２７５０の生検を対象に測定したホスホ強度（ｐｈｏｓｐｈｏ－ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の合計値の図である。

【図6】薬剤（ＩＬ－１βおよびＩＬ－６）を個別および組み合わせて投与した後、全患者の生検を対象に測定した平均サイトカイン産生の図である。

【図7】薬剤（ＩＬ－８およびＴＮＦ－α）を個別および組み合わせて投与した後、全患者の生検を対象に測定した平均サイトカイン産生の図である。

【図8】薬剤（ＩＬ－１７ＡおよびＩＬ－１０）を個別および組み合わせて投与した後、全患者の生検を対象に測定した平均サイトカイン産生の図である。

【図9】トリプシン処置を行う前後での、両頭（ｂｉｈｅａｄ）構築物ＦＵ３ＫからのＩＤ－３８ＦおよびＩＤ－Ａ６２Ｕの放出に対するＳＤＳ ＰＡＧＥ解析の図である。

【図10】ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ ＥＬＩＳＡを使用するトリプシン処置の前後でのＦＵ３ＫおよびＩＤ－Ａ６２Ｕの効力の図である。

【図11】ビオチン化Ｈｕｍｉｒａ競合ＥＬＩＳＡを使用するトリプシン処置の前後でのＦＵ３ＫおよびＩＤ－３８Ｆの効力の図である。

【図12】ヒトの便の上清における、（ａ）ＩＤ－Ａ６２Ｕ、（ｂ）ＩＤ－３８Ｆ、（ｃ）ＦＵ３Ｋからの放出後のＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－３８Ｆ、ならびに（ｄ）ＩＤ－Ａ４１Ｕの生存率の図である。

【0016】

配列の説明
配列番号１ ＩＤ－３８ＦのＣＤＲ１のポリペプチド配列
配列番号２ ＩＤ－３８ＦのＣＤＲ２のポリペプチド配列
配列番号３ ＩＤ－３８ＦのＣＤＲ３のポリペプチド配列
配列番号４ ＩＤ－３８ＦのＦＲ１のポリペプチド配列
配列番号５ ＩＤ－３８ＦのＦＲ２のポリペプチド配列
配列番号６ ＩＤ－３８ＦのＦＲ３のポリペプチド配列
配列番号７ ＩＤ－３８ＦのＦＲ４のポリペプチド配列
配列番号８ ＩＤ－３８Ｆのポリペプチド配列
配列番号９ ＩＤ－Ａ６２ＵのＣＤＲ１のポリペプチド配列
配列番号１０ ＩＤ－Ａ６２ＵのＣＤＲ２のポリペプチド配列
配列番号１１ ＩＤ－Ａ６２ＵのＣＤＲ３のポリペプチド配列
配列番号１２ ＩＤ－Ａ６２ＵのＦＲ１のポリペプチド配列
配列番号１３ ＩＤ－Ａ６２ＵのＦＲ２のポリペプチド配列
配列番号１４ ＩＤ－Ａ６２ＵのＦＲ３のポリペプチド配列
配列番号１５ ＩＤ－Ａ６２ＵのＦＲ４のポリペプチド配列
配列番号１６ ＩＤ－Ａ６２Ｕのポリペプチド配列
配列番号１７ ＩＤ－３８Ｆ（２つの停止コドンを含む）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１８ ＩＤ－Ａ６２Ｕ（２つの停止コドンを含む）をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１９ エンテロキナーゼ切断部位のポリペプチド配列
配列番号２０ エンテロキナーゼ切断部位を含むポリペプチド配列
配列番号２１ ＦＵ３Ｋに使用される特定の不安定リンカーのポリペプチド配列
配列番号２２ Ｌ－ＴＳＬＰのポリペプチド配列
配列番号２３ Ｓ－ＴＳＬＰのポリペプチド配列
配列番号２４ ＩＤ－Ａ４０Ｕのポリペプチド配列
配列番号２５ Ｖ７Ｒ－２Ｅ９のポリペプチド配列
配列番号２６ ＦＵ３Ｋ両頭のポリペプチド配列
配列番号２７ ＦＵ３Ｋ両頭をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号２８ 配列番号９の残基１での任意選択の保存的置換を伴うＣＤＲ１のポリペプチド配列
配列番号２９ 配列番号１０の残基２、３、７、１２、および１６での任意選択の保存的置換を伴うＣＤＲ２のポリペプチド配列
配列番号３０ 配列番号１１の残基３および９での任意選択の保存的置換を伴うＣＤＲ３のポリペプチド配列
配列番号３１ 非プロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列
配列番号３２ トリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列
配列番号３３ トリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列
配列番号３４ 第２のトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列
配列番号３５ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号３６ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号３７ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号３８ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号３９ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号４０ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号４１ 例となるトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーのポリペプチド配列
配列番号４２ 第３のトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列
配列番号４３ キモトリプシンプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーフォーマットのポリペプチド配列

【発明を実施するための形態】

【0017】

ＶＨおよびＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメイン（ＩＣＶＤ）を含む抗体および抗体フラグメントなどのポリペプチド

【0018】

ポリペプチドは、鎖の中で一体的に結合した多数のアミノ酸残基からなる有機高分子である。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」は、「タンパク質」および「ペプチド」と交換可能に使用される。ポリペプチドは、結合部位を形成するアミノ酸残基の１つ以上の伸張部を含有し、一定の親和性（適切なものでは、本明細書にさらに記載されるようなＫｄ値、Ｋａ値、ｋ_ｏｎ率、および／またはｋ_ｏｆｆ率）をもって標的上でエピトープに結合可能であるときは、結合ポリペプチドであると言われる。

【0019】

結合ポリペプチドは、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３）、Ａｆｆｉｍｅｒｓ（商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１２）、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（商標）（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ ２００７）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ ２０１６）、Ａｆｆｉｔｉｎｓ（例えば、Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ（登録商標）、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ ２００８）、環状ペプチド、抗体、および抗体フラグメントなどのポリペプチドを含む。結合ポリペプチドはさらに、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（Ｎｙｇｒｅｎ ２００８）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．２００７）、Ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ ２０１４）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ ２００８）、Ａｖｉｍｅｒｓ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２００５）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ ２００６）、Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ ２００７）、ｎａｎｏＣＬＡＭＰｓ（Ｓｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１７）、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ２０１１）、および二環式ペプチドなどのポリペプチドを含む。

【0020】

従来の抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、４つのポリペプチド鎖として、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各鎖は、定常領域と可変ドメインとに分割される。重鎖可変ドメインは、本明細書ではＶＨＣと省略され、軽（Ｌ）鎖可変ドメインは、本明細書ではＶＬＣと省略される。これらドメイン、これに関連するドメイン、およびこれに由来するドメインは、本明細書では免疫グロブリン鎖可変ドメイン（「ＩＣＶＤ」）と呼ばれる。

【0021】

ＶＨＣおよびＶＬＣドメインはさらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性領域に細分され、さらに保存されるドメインに散在する場合があり、このドメインは「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と称される。フレームワークおよび相補性決定領域は、正確に定義されている（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ９１－３２４２）。従来の抗体では、ＶＨＣとＶＬＣはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される。２つの重免疫グロブリン鎖および２つの軽免疫グロブリン鎖からなる従来の抗体四量体は、例えばジスルフィド結合により重および軽免疫グロブリン鎖を相互に接続し、重鎖を同様に（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）接続した状態で形成される。重鎖定常領域は、３つのドメインとしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインとしてＣＬで構成される。

【0022】

重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、抗原と相互に作用する結合ドメインである。抗体の定常領域は一般的に、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の要素（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合を媒介するものである。抗体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型の免疫グロブリン（ならびにこれらの亜型）を含み、ここで免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ型の場合がある。２つの同一の重（Ｈ）鎖および２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てた免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体の全体構造は、十分に確立されており、哺乳動物において高度に保存されている（Ｐａｄｌａｎ １９９４ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：１６９－２１７）。

【0023】

従来の抗体構造の例外は、ラクダの血清に見出されている。これら血清は、従来の抗体に加えて特殊なＩｇＧ抗体を持つ。これらＩｇＧ抗体は、重鎖抗体（ＨＣＡｂｓ）と知られており、Ｌ鎖ポリペプチドがなく、第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を欠く。そのＮ末端領域では、ホモ二量体タンパク質の重鎖が、ＶＨＨと称される専用の免疫グロブリン鎖可変ドメインを含有しており、このドメインは、その同種抗原と会合する役割を果たす（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ ２０１３、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９３、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ １９９４）。

【0024】

抗体フラグメントは、本明細書で使用するとき、標的（例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長でないが、特異的に標的に結合する分子）に特異的に結合する抗体の一部を指す。抗体フラグメント（または「抗原結合フラグメント」）という用語に包含される結合フラグメントの例は、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメント）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨＣおよびＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の単一群のＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなる）、
（ｖ）ｓｃＦｖフラグメント（ＶＬＣおよびＶＨＣ領域が対になり単価分子を形成する単一タンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、組換え法を使用して結合されるＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなる）、
（ｖｉ）ＶＨ（従来の４つの鎖免疫グロブリンのＶＨＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ １９８９）、
（ｖｉｉ）ＶＬ（ＶＬＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン、
（ｖｉｉｉ）Ｖ－ＮＡＲ（軟骨魚鋼ＩｇＮＡＲ由来のＶＨＣドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ １９９８ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ ２０１３）、
（ｉｘ）ＶＨＨ
を含む。

【0025】

ＶＨＨまたはＶＨのアミノ酸残基の合計数は、１１０～１４０、より適切には１１０～１２０の領域にある場合がある。

【0026】

本明細書に提供される例は、ＴＮＦ－αに結合する免疫グロブリン鎖可変ドメインと、ＩＬ－７Ｒに結合する免疫グロブリン鎖可変ドメインとを含む組成物に関する。しかし、本明細書に開示される本発明の原理は、抗体および抗体フラグメントなど、ＴＮＦ－αに結合するポリペプチドと、ＩＬ－７Ｒに結合するポリペプチドとを含むあらゆる組成物に対して等しく適用可能である。例えば、免疫グロブリン鎖可変ドメインは、完全長の抗体などのポリペプチドに組み込むことができる。このような手法は、ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４により実証されており、ヒトＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む）との融合として操作され、二量体構築物として発現される抗ＨＩＶ ＶＨＨを提供している。

【0027】

適切には、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン鎖可変ドメインを含む。より適切には、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン鎖可変ドメインからなる。適切には、本発明のポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントである。より適切には、本発明のポリペプチドは、抗体フラグメントである。適切には、抗体フラグメントは、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。適切には、抗体フラグメントは、免疫グロブリン鎖可変ドメイン（ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬなど）である。適切には、抗体フラグメントは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインである。より適切には、抗体フラグメントは、ＶＨＨまたはＶＨであり、最も適切にはＶＨＨである。

【0028】

特異性、親和性、結合活性、効力、阻害、および中和
特異性は、特定の結合ポリペプチドが結合可能である様々な標的（抗原や抗原決定基など）の数を指す。結合ポリペプチドの特異性は、結合ポリペプチドが特定の標的を固有の分子実体として認識し、これを別のものと区別する能力である。

【0029】

親和性は、結合ポリペプチド（Ｋｄ）からの標的の解離に関する平衡定数により表されるものであり、結合ポリペプチド上の標的と結合部位との結合強度の測定値である。Ｋｄ値が低いほど、標的と結合ポリペプチドとの結合強度は高くなる（代替的に、親和性は、１／Ｋｄである結合定数（Ｋａ）として表すこともできる）。親和性は、目的の特異性抗原に応じて既知の方法により求めることができる。適切には、親和性は、動的に切替え可能なバイオ表面を用いて（例えば「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥＲ」、Ｋｎｅｚｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ ２０１２を参照）、または表面プラズモン共鳴により求められる。

【0030】

結合活性は、結合ポリペプチドと関連する標的との結合強度の測定値である。結合活性は、結合ポリペプチド上での標的とその結合部位との親和性、および結合ポリペプチドに存在する関連する結合部位の数の両方に関係する。

【0031】

１０^－６Ｍ未満のＫｄ値は、結合を示すと考えられる。標的（抗原または抗原決定基など）への結合ポリペプチドの特異的結合は、例えば、スキャチャード解析、および／または放射免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイなどの競合結合測定法を含む適切な既知の様式、ならびに当該技術分野で知られるこれらの様々な変形において求めることができる。

【0032】

効力は、所与の強度の効果をもたらすのに必要な量の観点における発現された治療薬（結合ポリペプチドなど）の活性の測定値である。高度に有力な薬剤は、低濃度で小さな反応を誘発する効力が低い薬剤と比較して、低濃度でも高い反応を誘発する。効力は、親和性および効果に左右される。効果は、治療薬が標的への結合に際して生体応答をもたらす能力、およびこの反応の定量的規模を指す。半数効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、特定の暴露時間後に下限と最大との間の半分で反応を生じさせる治療薬の濃度を指す。治療薬は、阻害（具体的には半数阻害濃度「ＩＣ５０」と称される場合がある）または刺激を引き起こす場合がある。ＥＣ５０およびＩＣ５０はよく使用されるものであり、本明細書では効力の測定値として使用される。ＥＣ５０およびＩＣ５０は、両方の結合ポリペプチドが標的の阻害を生じさせることに起因して、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドに関して本明細書では交換可能に使用される。

【0033】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの効力を確認するのに適した特異的な分析は、それぞれ「ＴＮＦα結合ポリペプチド」および「ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド」という表題の下で以下に詳述する。

【0034】

ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列
密接に関連する２つのポリペプチド配列を比較するために、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との「配列同一性％」は、ポリペプチド配列に対する標準設定を用いるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰ）を使用して、算出することができる。密接に関連する２つのポリヌクレオチド配列を比較するために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との「配列同一性％」は、ヌクレオチド配列に対する標準設定を用いるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＮ）を使用して、算出することができる。

【0035】

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、その全体の長さにわたり１００％の配列同一性を共有する場合、他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列と同じまたは同一であると言われる。配列中の残基は、左から右、すなわちポリペプチドではＮ末端からＣ末端、ポリヌクレオチドでは５’末端から３’末端へと番号を付けられる。

【0036】

配列間の「差」は、第１の配列と比較した場合の第２の配列の一部における単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を指す。２つのポリペプチド配列が、このようなアミノ酸差を１、２、またはそれより多く伴う場合がある。その他の点では第１の配列と同一（１００％の配列同一性）である第２の配列の挿入、欠失、または置換は、配列同一性％の低下をもたらす。例えば、同一の配列が９のアミノ酸残基長である場合、第２の配列における１つの置換は、８８．９％の配列同一性をもたらす。同一の配列が１７のアミノ酸残基長である場合、第２の配列における２つの置換は、８８．２％の配列同一性をもたらす。同一の配列が７のアミノ酸残基長である場合、第２の配列における３つの置換は、５７．１％の配列同一性をもたらす。第１および第２のポリペプチド配列が９のアミノ酸残基長であり、６の同一残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は、６６％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は、６６．７％の同一性を共有する）。第１および第２のポリペプチド配列が１７のアミノ酸残基長であり、１６の同一残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は、９４％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は、９４．１％の同一性を共有する）。第１および第２のポリペプチド配列が７のアミノ酸残基長であり、３の同一残基を共有する場合、第１および第２のポリペプチド配列は、４２％超の同一性を共有する（第１および第２のポリペプチド配列は、４２．９％の同一性を共有する）。

【0037】

代替的に、第１の基準ポリペプチド配列を第２の比較ポリペプチド配列と比較するために、第２の配列を産生するために第１の配列に行われる付加、置換、および／または欠失の数が、確認される場合がある。付加とは、第１のポリペプチド配列への１つのアミノ酸残基の付加（第１のポリペプチドのいずれかの末端における付加を含む）である。置換とは、１つの異なるアミノ酸残基を伴う第１のポリペプチド配列における１つのアミノ酸残基の置換である。欠失とは、第１ポリペプチド（第１ポリペプチドのいずれの終点における欠失を含む）の配列からの１つのアミノ酸残基の欠失である。

【0038】

「保存的」アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同様の化学構造を持つ別のアミノ酸残基と置き換えられ、およびポリペプチドの機能、活性、またはその他の生物学的特性にほとんど影響が無いと予測されるアミノ酸置換である。このような保存的置換は、以下の基にある１つのアミノ酸が、同じ基にある別のアミノ酸残基により置換される置換である。

【0039】

【表1】

【0040】

適切には、疎水性アミノ酸残基は、非極性アミノ酸である。より適切には、疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、またはＣから選択される。

【0041】

本明細書で使用するとき、ＣＤＲおよびＦＲのポリペプチド配列の番号付けは、Ｋａｂａｔシステムに従い定められるとおりである（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ９１－３２４２）。第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「対応する」アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔシステムに従い同じ位置を第２の配列と共有される第１の配列のアミノ酸残基であるが、第２の配列のアミノ酸残基の同一性は、第１の配列と異なる場合がある。適切には、対応する残基は、フレームワークおよびＣＤＲがＫａｂａｔ定義に従い同じ長さである場合、同じ数（および文字）を共有することになる。アライメントは、手動で、または例えば、標準設定を使用したＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮ）などの配列アライメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用することにより、達成可能である。

【0042】

Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、以下のように、本明細書に提供される例に使用される特定のＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドに適用される。

【0043】

【表2】

【0044】

Ｎ末端からＣ末端への残基の番号付けは、下の列に提供される。Ｋａｂａｔナンバリングは、接頭辞「Ｈ」を含み、第２の列に提供される。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ「ＣＤＲ－Ｈ１」、「ＣＤＲ－Ｈ２」、および「ＣＤＲ－Ｈ３」と標識される。ＣＤＲまたはＦＲそれぞれの残基はまた、そのＣＤＲまたはＦＲのＮ末端からＣ末端へと番号付け可能である。

【0045】

【表3-1】

【0046】

【表3-2】

【0047】

接頭辞「Ｈ」により上にあるＩＤ－３８Ｆ図の番号付けは、Ｋａｂａｔナンバリングであり、一方でアミノ酸配列より上にある番号付けは、Ｎ末端からＣ末端まで連続するアミノ酸の番号付けである。ＣＤＲまたはＦＲそれぞれの残基はまた、そのＣＤＲまたはＦＲのＮ末端からＣ末端へと番号付け可能である。

【0048】

ＩＤ－３８Ｆは、配列番号１７のポリヌクレオチド配列によりコードされる。ＩＤ－Ａ６２Ｕは、配列番号１８のポリヌクレオチド配列によりコードされる。適切には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは、単離される。「単離された」ポリヌクレオチドは、その元の環境から取り除かれたポリヌクレオチドである。例えば、自然発生のポリヌクレオチドは、自然系に共存する物質の一部またはすべてから分離される場合に、単離される。ポリヌクレオチドは、例えば、その自然環境の一部でないベクターへとクローニングされる場合、またはｃＤＮＡ内に含まれる場合に、単離されると考えられる。

【0049】

ＴＮＦα結合ポリペプチド
機能特性
抗ＴＮＦ－αポリペプチド、ＴＮＦ－αと相互作用するポリペプチド、またはＴＮＦ－αに対するポリペプチドはすべて、有効なＴＮＦ－α結合ポリペプチドである。ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、ＴＮＦ－α上の線状または配座エピトープに結合する場合がある。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、ヒトＴＮＦ－αに結合する。

【0050】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１０^－６Ｍ以下、より適切には１０^－７Ｍ以下、さらに適切には１０^－８Ｍ以下、またさらに適切には１０^－９Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）をもってＴＮＦ－αに結合する。

【0051】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドの親和性は、動的に切替え可能なバイオ表面（例えば「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥＲ」、Ｋｎｅｚｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ ２０１２を参照）を使用して求められる。

【0052】

一実施形態では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドの親和性は、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドをそのＣ末端にて単鎖ＤＮＡと融合させ、ＤＮＡ－ポリペプチド融合体を、単鎖ＤＮＡの蛍光標識した相補鎖において被覆される金電極につなげてから、チップが結合したＴＮＦ－α結合ポリペプチドを、１０ｋＨｚの電流、および５つの異なる５０ｐＭ～４．５ｎＭの濃度のヒトＴＮＦ－αに６００秒間さらして、時間分解蛍光により８時間解離を観察することにより、２５℃で確立される。

【0053】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、ＴＮＦ－αを中和する。ＴＮＦ－αを中和するポリペプチドは、例えばＴＮＦ－αの生物学的効果を阻害することにより、細胞をＴＮＦ－αの効果から守るポリペプチドである。従来より、抗ＴＮＦ－α治療用抗体生成物は、中和分析として、細胞死エンドポイントを伴うＬ９２９マウス細胞株を使用している（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ １９９９）。Ｌ９２９分析は、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドの半数効果濃度（ＥＣ５０）を確認することによりＴＮＦ－α細胞毒性の効果を中和する能力を分析するために行われる場合がある。Ｌ９２９分析の詳細なプロトコルは、以下に提供する。

【0054】

Ｌ９２９分析
Ｌ９２９細胞（１００００細胞／ウェル）は、精製ポリペプチドの希釈物とともに可溶性ＴＮＦα（５００ｐｇ／ｍｌ）およびアクチノマイシン（０．７５ｕｇ／ｍＬ）の存在下で、２４時間培養される。実験の終わりに、リザズリンを使用して細胞毒性を求める。マウスＬ９２９細胞の可溶性ヒトＴＮＦ誘導型細胞毒性の阻害に対する試験を行い、ヒトＴＮＦ－αに結合する各ポリペプチドのＴＮＦ－α中和活性を求める。

【0055】

材料
－Ｌ９２９細胞（１００００細胞／ウェル）
－滅菌ポリプロピレン９６ウェルプレート
－ＤＭＥＭ
－ヒトＴＮＦα濃度：５００ｐｇ／ｍｌ
－アクチノマイシンＤ濃度：０．７５ｕｇ／ｍｌ
－精製された被験ポリペプチド
－精製されたポリペプチドの希釈範囲（例えば）：３００ｎＭ～５ｐＭ（１：３希釈）
－ヒトＴＮＦ－αの用量反応曲線：１０ｎｇ／ｍＬ～０．５ｐｇ／ｍＬ
－インキュベーション時間：２２時間
－リザズリン細胞生存率試薬

【0056】

方法
０日目、１００ｕｌ中の１００００細胞／ウェルを、９６ウェルマイクロプレート中のＤＭＥＭ完全培地に蒔き、３７℃で一晩、５％ＣＯ_２で保管した。１日目、精製した各可変ドメインに対する１：３の系列希釈（ＤＭＥＭ＋Ａｃｔ．Ｄ＋ＴＮＦにおける）を設定し（各時点で三通りに十分な量）、３００ｎＭの最上濃度から始める。

【0057】

以下の対照をプレートに加える。
１．ＤＭＥＭ完全＋０．７５ｕｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ
２．ＤＭＥＭ完全＋０．７５ｕｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ＋０．５ｎｇ／ｍＬのｈ－ＴＮＦ－α
３．ＤＭＥＭ完全＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ（ＴＮＦ－α用量応答を含むプレートのみにおける）
４．ＤＭＥＭ完全（ＴＮＦ－α用量応答を含むプレートのみにおける）。

【0058】

マイクロプレートの各ウェルから培地を取り除き、１００ｕｌの各ポリペプチド希釈、または１００ｕｌの異なる対照を用いて細胞をインキュベートする。３７℃および５％ＣＯ_２でのインキュベーションの２２時間後、リザズリン１０ｕｌを各ウェルに加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。続いて、５０ｕｌの３％ＳＤＳを各ウェルに加える。次いで、蛍光プレートリーダＥｘ５４４ｎｍ／Ｅｍ５９０ｎｍを使用して、プレートを読み取る。

【0059】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｍＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下などのＥＣ５０をもって、Ｌ９２９分析において、ヒトＴＮＦ－α細胞毒性を中和する。

【0060】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドの中和能力は、ＥＬＩＳＡによっても確認可能である。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、３０ｎＭ以下、適切には１０ｎＭ以下、より適切には３ｎＭ以下、さらに適切には１ｎＭ以下、また適切には０．６ｎＭ以下、またさらに適切には０．５ｎＭ以下、さらに適切には０．４ｎＭ以下のＥＣ５０をもって、ＥＬＩＳＡ分析において、ＴＮＦＲ１へのヒトＴＮＦ－αの結合を阻害する。

【0061】

代替的に、または付加的に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、２ｎＭ以下、適切には１ｎＭ以下、より適切には０．９ｎＭ以下、さらに適切には０．８ｎＭ以下、また適切には０．７ｎＭ以下、またさらに適切には０．６ｎＭ以下、さらに適切には０．５ｎＭ以下、より適切には０．４ｎＭ以下のＥＣ５０をもって、ＥＬＩＳＡ分析において、ＴＮＦＲ２へのヒトＴＮＦ－αの結合を阻害する。

【0062】

適切には、ＥＬＩＳＡは、ＷＯ２０１８／０６０４５３の実施例２に記載されるように実行される。

【0063】

一実施形態では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（または同等物）のセンサプレートに直接被覆を施すことにより確立され、ここでポリペプチドは、結合を検出するためにプレートの上を流れる。適切には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００プレートは、３０ｕｌ／分でＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のランニングバッファ中、２５℃で使用される。

【0064】

構造特性
適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、抗体フラグメントを含むポリペプチドである。ポリペプチドは、抗体であり得る。適切には、抗体フラグメントは、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＶＬ、ＶＨＨ、およびＶＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインからなる群から選択される。より適切には、抗体フラグメントは、免疫グロブリン鎖可変ドメイン、より適切にはＶＨＨまたはＶＨ、最も適切にはＶＨＨである。

【0065】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含む。

【0066】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、２０％以上、適切には４０％以上、より適切には６０％以上、さらに適切には８０％以上の配列同一性を配列番号１と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0067】

代替的に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と比較して３以下、適切には２以下、より適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0068】

適切には、配列番号１の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＣＤＲ１は、配列番号１を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0069】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、２０％以上、適切には３０％以上、より適切には４０％、さらに適切には５０％以上、また適切には５５％以上、さらに適切には６０％以上、また適切には７０％以上、さらに適切には７５％以上、また適切には８０％以上、さらに適切には８５％以上、またさらに適切には９０％以上の配列同一性を配列番号２と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0070】

代替的には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と比較して８以下、適切には７以下、より適切には６以下、さらに適切には５以下、また適切には４以下、さらに適切には３以下、また適切には２以下、またさらに適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0071】

適切には、配列番号２の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号２の残基番号１０に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２の残基は、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、またはＩ（最も適切にはＨ）である。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0072】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、３０％以上、適切には５０％、より適切には６０％以上、さらに適切には８０％以上の配列同一性を配列番号３と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0073】

代替的に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１と比較して３以下、適切には２以下、より適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0074】

適切には、配列番号３の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号３の残基番号３に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３の残基は、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、またはＩであり、または適切には、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、またはＩ（最も適切にはＨ）である。適切には、配列番号３の残基番号３に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３の残基は、Ｈであり、配列番号３の対応する残基と異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３の他の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0075】

代替的に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、３０％、５０％、６０％、８０％などの配列同一性を配列番号３と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなり、ＣＤＲ３の残基番号３は、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶ（適切にはＨまたはＨの保存的置換、より適切にはＨ）である。代替的に、ＣＤＲ３の残基番号３は、ＨまたはＨの保存的置換（最も適切にはＨ）であり、配列番号３の対応する残基と異なるＣＤＲ３の他の残基は、保存的置換である。

【0076】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１の残基１は、Ｓ、Ｖ、またはＮであり、残基２～４は、ＨＷＭであり、残基５は、ＹまたはＣである。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２の残基１～９は、ＥＩＮＴＮＧＬＩＴであり、残基１０は、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはＮであり、残基１１は、Ｙであり、残基１２は、Ｇ、Ｖ、Ｉ、またはＡであり、残基１３は、Ｄであり、残基１４は、ＳまたはＦであり、残基１５は、ＶまたはＴであり、残基１６は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、またはＧであり、残基１７は、Ｇである。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３の残基１は、Ｎであり、残基２は、ＱまたはＥであり、残基３は、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＲであり、残基４～６は、ＧＬＮである。

【0077】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含む。

【0078】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１は、５％、１２％、１８％、２６％、３２％、３８％、４６％、５２％、５８％、６２％、６６％、６８％、７２％、７５％、７８％、８２％、８５％、９０％、または９５％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号４と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0079】

適切には、配列番号４の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号４の残基番号１に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、またはＮ（より適切にはＤまたはＥ、最も適切にはＤ）である。適切には、配列番号４の残基番号５に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の残基は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、またはＮ（適切にはＶ）である。適切には、配列番号４の残基番号１～５に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の残基は、ＤＶＱＬＶである。適切には、配列番号４の残基番号２０および／または２４に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の残基は、疎水性であるアミノ酸（最も適切には、それぞれＬまたはＡ）である。適切には、配列番号４の残基番号２９に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１の残基は、Ｆである。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ１は、配列番号４を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0080】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ２は、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、７５％、８５％、または９０％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号５と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0081】

適切には、配列番号５の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ２の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号５の残基番号８～１１に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ２の残基は、ＫＥＸＥであり、ここでＸは、ＲまたはＬである。代替的に、配列番号５の残基番号９～１２に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ２の残基は、ＧＬＥＷである。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ２は、配列番号５を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0082】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ３は、８％、１５％、２０％、２６％、３２％、４０％、４５％、５２％、５８％、６５％、７０％、７６％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、または９５％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号６と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0083】

適切には、配列番号６の残基番号２６に対応するＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ３の残基は、疎水性であるアミノ酸（適切には、Ａ）である。適切には、配列番号６の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ３の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ３は、配列番号６を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0084】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ４は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号７と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0085】

適切には、配列番号７の対応する残基とは異なるＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ４の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＦＲ４は、配列番号７を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0086】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号８と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＮ末端は、Ｄである。適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、配列番号８を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0087】

特定の実施形態により、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、自然発生のポリペプチドのアミノ酸配列と正確に同じではない（正確に１００％の配列同一性を共有しない）アミノ酸配列を有する。

【0088】

ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド
機能特性
抗ＩＬ－７Ｒポリペプチド、ＩＬ－７Ｒと相互作用するポリペプチド、またはＩＬ－７Ｒに対するポリペプチドはすべて、有効なＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドである。ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒ上の線状または配座エピトープに結合する場合がある。好ましくは、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒαに結合する。

【0089】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒに結合する。適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、可溶性および膜結合型ＩＬ－７Ｒの両方に結合する。

【0090】

適切には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒに結合するＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰを中和する。

【0091】

適切には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒに結合するヒトＩＬ－７および／またはヒトＬ－ＴＳＬＰを中和する。より適切には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒ、ならびにヒヒＩＬ－７Ｒ、マーモセットＩＬ－７Ｒ、カニクイザルＩＬ－７Ｒ、およびアカゲザルＩＬ－７Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類ＩＬ－７Ｒに結合するヒトＩＬ－７および／またはヒトＬ－ＴＳＬＰを中和する。最も適切には、本発明のポリペプチドは、ヒトＩＬ－７Ｒに結合するヒトＩＬ－７およびヒトＬ－ＴＳＬＰを中和する。

【0092】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ＩＬ－７ＲのＩＬ－７結合部位にある、および／またはその一部を形成するＩＬ－７Ｒ上のエピトープを対象とするものであり、これにより前記ポリペプチドは、ＩＬ－７Ｒへの結合に際して、ＩＬ－７Ｒが媒介するシグナル伝達の阻害または低減をもたらす。

【0093】

ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡにより測定されるようにポリペプチドがＩＬ－７Ｒ（適切にはＩＬ－７Ｒα）に結合し、ＩＬ－７および／またはＬ－ＴＳＬＰへのＩＬ－７Ｒの結合を阻害する場合、本発明の目的ための中和ポリペプチドである。本文脈において阻害のレベルを求めるのに適した特異的なＥＬＩＳＡ法は、以下の実施例１で詳述する。

【0094】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、２．００ｎＭ以下、１．５０ｎＭ以下、１．００ｎＭ以下、０．９０ｎＭ以下、０．８０ｎＭ以下、０．７０ｎＭ以下、０．６５ｎＭ以下、０．６０ｎＭ以下、０．５５ｎＭ以下、０．５０ｎＭ以下、０．４５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３５ｎＭ以下、０．３０ｎＭ以下などのＥＣ５０をもってＩＬ－７に結合するＩＬ－７Ｒを中和する。適切には、ＥＣ５０は、以下の実施例１で詳述されるＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡを使用して確立される。

【0095】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合するポリペプチドは、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下などのＥＣ５０をもって、ヒトリンパ球において、ＩＬ－７Ｒ依存性、ＩＬ－７誘導型のＳＴＡＴ５リン酸化を中和する。適切には、ＥＣ５０は、以下の実施例１で詳述されるＩＬ－７誘導型ＳＴＡＴ５リン酸化分析を使用して確立される。

【0096】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの親和性は、表面プラズモン共鳴により求められる。

【0097】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下、より適切には１０^－８Ｍ以下、さらに適切には１０^－９Ｍ以下、またさらに適切には１０^－１０Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）をもってＩＬ－７Ｒに結合する。

【0098】

一実施形態では、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（または同等物）のセンサプレートに直接被覆を施すことにより確立され、ここでポリペプチドは、結合を検出するためにプレートの上を流れる。適切には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００プレートは、３０ｕｌ／分でＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のランニングバッファ中、２５℃で使用される。

【0099】

構造特性
適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、抗体フラグメントを含むポリペプチドである。ポリペプチドは、抗体であり得る。適切には、抗体フラグメントは、Ｖ－ＮＡＲ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＶＬ、ＶＨＨ、およびＶＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインからなる群から選択される。より適切には、抗体フラグメントは、免疫グロブリン鎖可変ドメイン、より適切にはＶＨＨまたはＶＨ、最も適切にはＶＨＨである。

【0100】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含む。

【0101】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、２０％、４０％、６０％、８０％、またはそれより多くの配列同一性を配列番号９と共有する配列を含む。

【0102】

代替的に、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号９と比較して４以下、適切には３以下、より適切には２以下、さらに適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0103】

適切には、配列番号９の対応する残基とは異なるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ２は、配列番号９を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0104】

適切には、ＣＤＲ１の残基は、以下の同一性（配列番号２８）を有する。

【0105】

【表4】

【0106】

より適切には、ＣＤＲ１は、配列番号９を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0107】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、２０％以上、適切には３０％以上、より適切には４０％、さらに適切には５０％以上、また適切には５５％以上、さらに適切には６０％以上、また適切には６５％以上、さらに適切には７０％以上、また適切には７５％以上、さらに適切には８０％以上、また適切には８５％以上、またさらに適切には９０％以上の配列同一性を配列番号１０と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0108】

代替的には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０と比較して８以下、適切には７以下、より適切には６以下、さらに適切には５以下、また適切には４以下、さらに適切には３以下、また適切には２以下、またさらに適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0109】

適切には、配列番号１０の対応する残基とは異なるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0110】

適切には、ＣＤＲ２の残基は、以下の同一性（配列番号２９）を有する。

【0111】

【表5】

【0112】

適切には、配列番号１０の残基番号１６に対応するＣＤＲ２の残基は、ＱまたはＫ、最も適切にはＫである。適切には、ＣＤＲ２は、配列番号１０を含み、またはこの配列からなる。より適切には、ＣＤＲ２は、配列番号１０を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0113】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、２０％以上、適切には３０％以上、より適切には４０％、さらに適切には５０％以上、また適切には５５％以上、さらに適切には６０％以上、また適切には６５％以上、さらに適切には７０％以上、また適切には７５％以上、さらに適切には８０％以上、また適切には８５％以上、またさらに適切には９０％以上の配列同一性を配列番号１１と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0114】

代替的には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１と比較して６以下、適切には５以下、また適切には４以下、さらに適切には３、また適切には２以下、またさらに適切には１以下の付加、置換、および／または欠失を有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0115】

適切には、配列番号１１の対応する残基とは異なるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。

【0116】

適切には、ＣＤＲ３の残基は、以下の同一性（配列番号３０）を有する。

【0117】

【表6】

【0118】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0119】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含む。

【0120】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ１は、５％、１２％、１８％、２６％、３２％、３８％、４６％、５２％、５８％、６２％、６６％、６８％、７２％、７５％、７８％、８２％、８５％、９０％、または９５％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号１２と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0121】

適切には、配列番号１２の対応する残基とは異なるＦＲ１の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号１２の残基番号１に対応するＦＲ１の残基は、ＤまたはＥ、最も適切にはＤである。適切には、配列番号１２の残基番号１～５に対応するＦＲ１の残基は、ＤＶＱＬＶである。適切には、ＦＲ１は、配列番号１２を含み、さらに適切にはこの配列からなる。適切には、配列番号１２の残基番号２４に対応するＦＲ１の残基は、Ｓである。

【0122】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ２は、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、７５％、８５％、または９０％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号１３と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0123】

適切には、配列番号１３の対応する残基とは異なるＦＲ２の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、配列番号１３の残基番号１０に対応するＦＲ２の残基は、ＲまたはＬ、最も適切にはＬである。適切には、配列番号１３の残基番号８～１１に対応するＦＲ２の残基は、ＫＥＸＥであり、Ｘは、ＲまたはＬ、最も適切にはＬである。代替的に、配列番号１３の残基番号９～１２に対応するＦＲ２の残基は、ＧＬＥＷである。適切には、ＦＲ２は、配列番号１３を含み、さらに適切にはこの配列からなる。適切には、配列番号１３の残基番号２に対応するＦＲ２の残基は、Ｆであり、加えて、より適切には、配列番号１３の残基番号１４に対応するＦＲ２の残基は、Ａである。適切には、配列番号１３の残基９～１４に対応するＦＲ２の残基は、ＥＬＥＦＬＡ（配列番号７９）である。適切には、配列番号１３の残基９～１４に対応するＦＲ２の残基は、ＧＬＥＷＶＳ（配列番号８０）ではない。適切には、配列番号１３の残基番号９に対応するＦＲ２の残基は、Ｇではない。より適切には、配列番号１３の残基番号９に対応するＦＲ２の残基は、Ｅである。

【0124】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ３は、８％、１５％、２０％、２６％、３２％、４０％、４５％、５２％、５８％、６５％、７０％、７６％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％、または９５％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号１４と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0125】

適切には、配列番号１４の対応する残基とは異なるＦＲ３の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＦＲ３は、配列番号１４を含み、さらに適切にはこの配列からなる。適切には、配列番号１４の残基番号１８、１９、および２０に対応するＦＲ３の残基は、ＮＳＬである。適切には、配列番号１４の残基番号２１に対応するＦＲ３の残基は、Ｒである。適切には、配列番号１４の残基番号２２に対応するＦＲ３の残基は、Ａである。

【0126】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ４は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号１５と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0127】

適切には、配列番号１５の対応する残基とは異なるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ４の任意の残基は、その対応する残基に対して保存的置換である。適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＦＲ４は、配列番号１５を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0128】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、あるいはそれより多くの配列同一性を配列番号１６と共有する配列を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0129】

適切には、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１６を含み、さらに適切にはこの配列からなる。

【0130】

特定の実施形態により、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、自然発生のポリペプチドのアミノ酸配列と正確に同じではない（正確に１００％の配列同一性を共有しない）アミノ酸配列を有する。

【0131】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド両方の構造特性および機能特性の特定の組合せ
適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドはともに、免疫グロブリン鎖可変ドメインであり、ここで、
（ａ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と４０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｂ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と４０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｃ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｄ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号９と４０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｅ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０と４０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｆ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
より適切には、
（ａ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｂ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｃ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｄ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｅ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｆ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
より適切には、
（ａ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｂ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と７０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｃ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と６５％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｄ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｅ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０と７０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｆ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１と６５％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
より適切には、
（ａ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｂ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号２と８５％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｃ）ＴＮＦ－α結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｄ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ１は、配列番号９と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｅ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ２は、配列番号１０と８５％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
（ｆ）ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのＣＤＲ３は、配列番号１１と８０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、
それぞれの場合、最も適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってＬ９２９アッセイにおいてヒトＴＮＦ－α細胞毒性を中和し、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってヒトリンパ球においてＩＬ－７Ｒ依存性、ＩＬ７誘導型のＳＴＡＴ５リン酸化を中和し、ならびに／または、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＴＮＦ－αに結合し、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＩＬ７Ｒに結合する。最も適切には、上記ポリペプチドは、クローン病または潰瘍性大腸炎の処置において経口投与により使用される両頭構築物に提供される。

【0132】

適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドはともに、同じ種類の免疫グロブリン鎖可変ドメイン、例えばＶＨ、ＶＨＨ、またはＶＬ、より適切にはＶＨまたはＶＨＨである。

【0133】

ＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのフォーマット
ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、結合される場合も、されない場合もある。

【0134】

一実施形態では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、本発明の組成物中で互いに独立して存在する場合がある（ＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、互いに結合されていない）。特定の実施形態では、組成物は、（ａ）ＩＤ－３８Ｆ（配列番号８）またはこれに対して少なくとも７５％、より適切には少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチド、および（ｂ）ＩＤ－Ａ６２Ｕ（配列番号１６）またはこれに対して少なくとも７５％、より適切には少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0135】

さらなる実施形態では、本発明の組成物に含まれるＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、互いに結合されている（それにより単一の構築物を形成する）。このようなフォーマットは、組換え発現に都合の良い場合がある。そのため、このような本発明の構築物は、多量体および多価性である。これ以上ポリペプチドが構築物に含まれない場合、かかる構築物は「ヘテロ両頭（ｈｅｔｅｒｏｂｉｈｅａｄ）」と呼ぶことができる。多価構築物は、２つ以上の結合ポリペプチドを含むので、抗原への付着が生じ得る２つ以上の部位を提供する（適切には、かかるリンカーが構築物に存在する場合、不安定ペプチドリンカーの切断の前または後。以下の「リンカー」を参照）。

【0136】

適切には、構築物中の各ポリペプチドの分子量は、３００ｋＤａ以下、２５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａなどである。

【0137】

リンカー
ＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、結合する場合、直接（リンカーを使用しない）またはリンカーを介して互いに結合可能である。適切には、リンカーが使用される。このリンカーは、プロテアーゼ不安定または非プロテアーゼ不安定リンカーであり得る。リンカーは、適切にはポリペプチドとそのエピトープとの結合を可能にするように選択されたペプチドである。適切には、リンカーは可撓性であり、例えば、両結合ポリペプチドがその標的へと同時に結合するのを可能にするのに十分な可撓性である。治療目的に使用される場合、リンカーは、適切にはポリペプチドが投与される対象において非免疫原性である。適切には、ポリペプチドおよびリンカーは、単一の隣接ポリペプチド構築物として発現される。

【0138】

適切には、ペプチドリンカーの長さは、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１３、少なくとも１６、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１などである。適切には、ペプチドリンカーの長さは、４０残基以下、３５残基以下、３０残基以下、２５残基以下などである。

【0139】

適切には、ペプチドリンカーは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される任意のアミノ酸からなる。プロリンは、リンカーに含めるために最適以下のアミノ酸であってもよく、それゆえ、より適切には、ペプチドリンカーは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される任意のアミノ酸からなる。

【0140】

ＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、結合する場合、抗ＴＮＦ－αリンカー－抗ＩＬ－７Ｒの配向（Ｎ末端からＣ末端まで）にあるか、抗ＩＬ－７Ｒリンカー－抗ＴＮＦ－αの配向にあってもよい。最も適切には、これらは、抗ＴＮＦ－αリンカー－抗ＩＬ－７Ｒの配向にある。

【0141】

ペプチドリンカーにより結合されるＴＮＦ－αおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む本発明の組成物は、例えば、核酸合成用の技法を使用して２つの結合ポリペプチドをコードする核酸およびペプチドリンカーを調製し、その後、こうして得られる核酸を発現することにより、得ることができる（以下の「調製法」の見出しの下で詳述されるように）。

【0142】

非プロテアーゼ不安定リンカー
適切には、非プロテアーゼ不安定リンカーは、ペプチドであり、プロテアーゼに対する切断部位を含まない。

【0143】

適切には、非プロテアーゼ不安定リンカーは、フォーマットが－（Ｇ_ａＳ_ｂ）_ｘ－であり、ここで、ａは１～１０であり、ｂは１～５であり、ｘは１～１５である（配列番号３１）。適切には、ａは１～５であり、ｂは１～２であり、ｘは１～１０である。適切には、ａは４であり、ｂは１であり、ｘは１～８である（配列番号３２）。

【0144】

プロテアーゼ不安定リンカー
プロテアーゼ不安定リンカーは、構成モノマーが放出されて、切断に際しその標的へと自由に結合するのを可能にするので、非プロテアーゼ不安定リンカーよりも適切である。プロテアーゼ不安定リンカー（または「不安定ペプチドリンカー」）は、ペプチドであり、プロテアーゼに対する少なくとも１つの切断部位を含む。プロテアーゼ不安定リンカーを本発明の構築物に含めることにより、例えば、構築物を、後に別個の結合ポリペプチドへの投与後に切断されるヘテロ両頭の形態で都合良く産生することが可能となる。

【0145】

本発明の一実施形態では、不安定ペプチドリンカーは、プロテアーゼによる切断を所望の程度耐える、および／または特定の腸管領域への暴露に際してのみ切断されるように、操作することができる。例えば、構築物が酵母菌などの宿主中で組換え産生される場合、酵母菌により産生されるトリプシン様プロテアーゼは、組換え構築生成物を切断する場合がある。これにより、精製が困難となり、調節的、臨床的、および人為的な合併症（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）が生じる場合がある。

【0146】

これは、不安定部位に隣接する不安定ペプチドリンカーへ遮蔽残基を組み込むことにより達成可能である。遮蔽残基は、不安定ペプチドリンカーの不安定部位に隣接して、その不安定性を低減させる。不安定ペプチドリンカー付近またはその外周部に不安定部位を位置決めすることにより、切断耐性も増大させることができる。この概念は、「遮蔽された不安定部位」と呼ばれ、不安定性を調節する。

【0147】

代替的に、不安定ペプチドリンカーは、腸管プロテアーゼによる切断に対して大いに不安定であり、そのため経口投与後に構築物の構成ポリペプチドを速やかに放出するように操作することができる。これは、１つ以上の不安定部位を不安定ペプチドリンカーに組み込むことにより達成され、そうすることで、不安定部位は、例えば不安定部位を不安定ペプチドリンカーのほぼ中心に位置決めすることにより、および／または隣接残基により実質的に遮蔽されていない不安定部位により、タンパク質分解のために暴露される。この概念は、「保護されていない不安定部位」と呼ばれる。

【0148】

ＲまたはＫ残基の直後にＰ残基を本発明の構築物の不安定ペプチドリンカーへ組み込むことは、不安定ペプチドリンカーの切断を実質的に妨げると推測される。適切には、不安定ペプチドリンカーは、Ｐ残基を含まない。

【0149】

トリプシン不安定部位
適切には、不安定ペプチドリンカーは、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼに対する切断部位を含む。適切には、不安定ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などのＫ残基を含む。適切には、不安定ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などのＲ残基を含む。好ましくは、切断部位は、１つ以上のＫ残基である。

【0150】

適切には、プロテアーゼ不安定リンカーは、フォーマット［－（Ｇ_ａＳ_ｂ）_ｖ－（Ｇ_ｃＳ_ｄ）_ｗ－Ｂ_ｔ－（Ｇ_ｅＳ_ｆ）_ｘ－（Ｇ_ｇＳ_ｈ）_ｙ］_ｚを含むか、より適切にはこのフォーマットからなり、ここで、Ｂはリジンまたはアルギニンであり、ｔは１～５であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、０～１０であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、０～５であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、０～１０であり、およびｚは１～５である（配列番号３３）。より適切には、Ｂはリジンまたはアルギニンであり、ｔは１または２であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、１～５であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、１～３であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、１～３であり、およびｚは１～３であり、さらに適切には、Ｂはリジンまたはアルギニンであり、ｔは１～３であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、２～４であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、１～２であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、１～２であり、およびｚは１である。

【0151】

このフォーマットの特に好ましいリンカーは、－（Ｇ_４Ｓ）_ｘ－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_ｙ－から選択され、ここで、ｘとｙはそれぞれ独立して、１～５であり（配列番号３４）、より適切には－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_２－（すなわち－ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－（配列番号２１））から選択される。

【0152】

適切には、不安定ペプチドリンカーは、次のフォーマットのポリペプチド配列を含むか、より適切にはこの配列からなり、
－Ｂ－（Ｇ_ａＳ）_ｘ－Ｂ’－
式中、
ａは１～１０であり、
ｘは１～１０であり、
ＢはＫまたはＲであり、および
Ｂ’はＫまたはＲである（配列番号３５）。

【0153】

一実施形態では、ａは２～５、より適切には４である。さらなる実施形態では、ｘは１～５である。より適切には、ｘは２である。Ｂは、存在する場合も存在しない場合もある。Ｂ’は、存在する場合も存在しない場合もある適切には、ＢはＫである。適切には、Ｂ’はＫである。

【0154】

このフォーマットの特に好ましいリンカーは、－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｋ－（配列番号３６）、－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｋ－（配列番号３７）、－Ｋ－（Ｇ_４Ｓ）_２－（配列番号３８）、－Ｒ－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｒ－（配列番号３９）、－（Ｇ_４Ｓ）_２－Ｒ－（配列番号４０）、および－Ｒ－（Ｇ_４Ｓ）_２－（配列番号４１）からなる群のうち１つから選択される。

【0155】

適切には、不安定ペプチドリンカーは、次のフォーマットのポリペプチド配列を含むか、より適切にはこの配列からなり、
－Ｂ－（Ｇ_ａＳ）_ｘ－Ｂ’－（Ｇ_ｂＳ）_ｙ－Ｂ”－
式中、
ａは１～１０であり、
ｂは１～１０であり、
ｘは１～１０であり、
ｙは１～１０であり、
ＢはＫまたはＲであり、
Ｂ’はＫまたはＲであり、および
Ｂ”はＫまたはＲである（配列番号４２）。

【0156】

一実施形態では、ａは２～５、より適切には４である。一実施形態では、ｂは２～５、より適切には４である。さらなる実施形態では、ｘは１～５である。より適切には、ｘは２である。さらなる実施形態では、ｙは１～５である。より適切には、ｙは２である。適切には、ＢはＫである。適切には、Ｂ’はＫである。適切には、Ｂ”はＫである。

【0157】

キモトリプシン不安定部位
代替的に、またはトリプシン不安定部位に加えて、構築物の不安定ペプチドリンカーは、キモトリプシンまたはキモトリプシン様プロテアーゼに対する切断部位を含む場合がある。適切には、不安定ペプチドリンカーは、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、およびＭ、より適切にはＷ、Ｆ、およびＹからなる群から選択される、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０などの残基を含む。適切には、不安定ペプチドリンカーは、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、およびＹなど、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、およびＭからなる群から選択される残基からなる。

【0158】

適切には、プロテアーゼ不安定リンカーは、フォーマット［－（Ｇ_ａＳ_ｂ）_ｖ－（Ｇ_ｃＳ_ｄ）_ｗ－Ｊ_ｔ－（Ｇ_ｅＳ_ｆ）_ｘ－（Ｇ_ｇＳ_ｈ）_ｙ］_ｚを含むか、より適切にはこのフォーマットからなり、ここで、Ｊは、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、またはＭであり、ｔは１～５であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、０～１０であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、０～５であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、０～１０であり、およびｚは１～５である（配列番号４３）。より適切には、Ｊは、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、またはＭであり、ｔは１または２であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、１～５であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、１～３であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、１～３であり、およびｚは１～３であり、さらに適切には、Ｊは、Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｌ、またはＭであり、ｔは１～３であり、ａ、ｃ、ｅ、およびｇはそれぞれ独立して、２～４であり、ｂ、ｄ、ｆ、およびｈはそれぞれ独立して、１～２であり、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙはそれぞれ独立して、１～２であり、およびｚは１である。

【0159】

エンテロキナーゼ不安定部位
代替的に、あるいはトリプシンおよび／またはキモトリプシン不安定部位に加えて、構築物の不安定ペプチドリンカーは、エンテロキナーゼに対する切断部位を含む場合がある。適切には、不安定ペプチドリンカーは、－Ｇ_４Ｓ－ＤＤＤＤＫ－Ｇ_４Ｓ－（配列番号２０）を含むか、これからなる配列など、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１９）を含む。

【0160】

ＭＭＰ不安定部位
一実施形態では、構築物の不安定ペプチドリンカーは、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、またはＭＭＰ１２に対する切断部位を含む場合がある。

【0161】

他の不安定部位
一実施形態では、構築物の不安定ペプチドリンカーは、切断部位が把握されている他の炎症性または微生物プロテアーゼに対する切断部位を含む場合がある。

【0162】

構築物内のポリペプチドの安定性
構築物が非プロテアーゼ不安定リンカーを含む実施形態では、適切には、構築物は全体として（結合ポリペプチド（免疫グロブリン鎖可変ドメインの場合がある）および非プロテアーゼ不安定リンカー）、トリプシンやキモトリプシンなどのプロテアーゼに耐性を実質的に示す。構築物がプロテアーゼ不安定リンカーを含む実施形態では、適切には、ポリペプチド（免疫グロブリン鎖可変ドメインの場合がある結合ポリペプチド）は、トリプシンやキモトリプシンなどのプロテアーゼに耐性を実質的に示すが、プロテアーゼ不安定リンカーは、トリプシンまたはキモトリプシンなどのプロテアーゼに対し不安定である。

【0163】

発現宿主に対する不安定ペプチドリンカーの安定性
様々な生物体が、組換えポリペプチドを発現するために使用されてもよい。よく使用される発現生物体として、酵母菌、カビ、哺乳動物細胞が挙げられる。しかし、これらの発現生物体の多くは、トリプシン様プロテアーゼなどのプロテアーゼを産生し、これにより発現された組換えポリペプチドを切断する場合もある。発現されたポリペプチドが、腸管に存在する１つ以上のプロテアーゼ不安定ペプチドリンカーを組み込む場合、このペプチドリンカーは、発現生物体により産生されるプロテアーゼに対して不必要に不安定であり、このため、無傷のポリペプチドの有効な発現を妨げる場合もある。

【0164】

不安定ペプチドリンカーでは、構築物の産生に使用される組換え宿主により産生される酵素に対し実質的に不安定でないことが都合が良い。適切には、不安定ペプチドリンカーは、大腸菌などの細菌、あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、もしくはＰｉｃｈｉａ属に属するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母菌またはカビといった組換え宿主により産生されるプロテアーゼに対して実質的に耐性を示す。

【0165】

適切には、組換えの宿主は、酵母菌またはカビである。適切には、酵母菌は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属に属する。適切には、カビは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属に属する。

【0166】

胃腸管および消化酵素
胃腸管（ＧＩＴ）は、食料の消費と消化、栄養素の吸収、および排泄物の排出を担う臓器系である。ヒトおよび他の哺乳動物では、ＧＩＴは、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、および回腸）、ならびに大腸（盲腸、結腸、直腸、および肛門管）からなる。ＧＩＴの様々な領域に、様々な病原体が生着し、様々な疾患が生じる場合がある。腸管（胃腸管と対照的に）は、小腸と大腸からなる。

【0167】

胃腸管の様々な部分はそれぞれ、消化酵素の複合混合物を含有している。プロテアーゼは、アミノ酸残基を結合するペプチド結合を分割すること（タンパク質分解）により、ポリペプチド鎖をより短いフラグメントへと消化することに関与する。一部はタンパク質鎖（エキソペプチダーゼ）から末端アミノ酸を引き離し、その他はタンパク質（エンドペプチダーゼ）の内部ペプチド結合を攻撃する。タンパク質分解は、広範囲のタンパク質基質が加水分解されるように大いに乱雑となる場合がある。これが、腸管で摂取された多様なポリペプチドをより小さなポリペプチドフラグメントへと切断するプロテアーゼの例である。

【0168】

多くのプロテアーゼは、一般的には基質上で単一のアミノ酸（不安定部位）に結合するため、その残基に対する特異性しかない。腸管に存在するプロテアーゼとして、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、キモトリプシン様プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、およびエンテロペプチダーゼが挙げられる。トリプシン様プロテアーゼは、リジンまたはアルギニン残基の後でペプチド結合を切断する。キモトリプシン様プロテアーゼは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、およびメチオニンなどの疎水性残基の後でペプチド結合を切断する。特に、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファン。

【0169】

特に、経口用薬剤の文脈では、結合ポリペプチドは、腸管の（すべてなどの）１つ以上のプロテアーゼに対して実質的に耐性を示す一方で、不安定ペプチドリンカー（使用される場合）は、腸管の（すべてなどの）１つ以上のプロテアーゼに対して不安定であることが望ましい場合がある。

【0170】

適切には、構築物にあるポリペプチドは、１つ以上のプロテアーゼに対して実質的に耐性を示し、適切には、不安定ペプチドリンカー（存在する場合）は、１つ以上のプロテアーゼに対して不安定であり、この１つ以上のプロテアーゼは、小腸または大腸、より適切には空腸、回腸、および／または盲腸に存在する。実質的に耐性を示すポリペプチドは、１つ以上のプロテアーゼに暴露されると、中和能および／または効力を実質的に保持する。

【0171】

このようなプロテアーゼは、胃腸管に共生するマイクロフローラまたは病原性菌から供給されるプロテアーゼを含み、例えば、このプロテアーゼは、細胞膜に付着したプロテアーゼ、分泌されたプロテアーゼ、および細胞溶解物上に放出されるプロテアーゼである。かかるプロテアーゼはさらに、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、およびＭＭＰ１２などのＩＢＤ炎症性プロテアーゼを含む場合がある。適切には、１つ以上のプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。適切には、１つ以上のプロテアーゼは、エンテロペプチダーゼ、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、およびキモトリプシン様プロテアーゼからなる群から選択される。

【0172】

適切には、ポリペプチドは、経口送達時、および腸管への暴露後（例えば、小腸および／または大腸のプロテアーゼ、ならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼへの曝露後）に、中和能および／または効力を実質的に保持する。小腸および／または大腸のプロテアーゼ、あるいは小腸および／または大腸に産生されるプロテアーゼは、腸に共生するマイクロフローラおよび／または病原性菌から供給されるプロテアーゼを含み、例えば、このプロテアーゼは、細胞膜に付着したプロテアーゼ、分泌されたプロテアーゼ、および細胞溶解物上に放出されるプロテアーゼである。最も適切には、プロテアーゼは、トリプシンおよびキモトリプシンである。

【0173】

適切には、腸管は、イヌ、ブタ、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒト、カニクイザル、またはマウスの腸管である。小腸は、適切には十二指腸、空腸、および回腸からなる。大腸は、適切には盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる。

【0174】

ポリペプチドは、ポリペプチドまたは構築物本来の中和能の少なくとも１０％、適切には２０％、より適切には３０％、また適切には４０％、さらに適切には５０％、また適切には６０％、さらに適切には７０％、また適切には８０％、さらに適切には９０％、また適切には９５％、さらに適切には１００％が、小腸および／または大腸に存在するプロテアーゼならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼへの暴露後、所与の温度での所与の暴露期間後に保持されると、中和能を実質的に保持する。この概念は、本明細書では「生存率」と称される。

【0175】

適切には、ポリペプチドは、小腸および／または大腸に存在するプロテアーゼならびに／あるいはＩＢＤ炎症性プロテアーゼへと、３７℃で例えば少なくとも最大２時間、適切には少なくとも最大３時間、より適切には少なくとも最大４時間、さらに適切には少なくとも最大５時間、また適切には少なくとも最大５．５時間、さらに適切には少なくとも最大６時間、また適切には少なくとも最大１２時間、さらに適切には少なくとも最大１４時間、また適切には少なくとも最大１６時間暴露した後、中和能を実質的に保持する。

【0176】

ポリペプチドは、ポリペプチドまたは構築物本来の中和能の少なくとも１０％、適切には２０％、より適切には３０％、また適切には４０％、さらに適切には５０％、また適切には６０％、さらに適切には７０％、また適切には８０％、さらに適切には９０％、また適切には９５％、さらに適切には１００％が、ヒトの便の上清またはマウスの小腸の流体への暴露後、所与の温度での所与の暴露期間後に保持されると、中和能を実質的に保持する。この概念は、本明細書では「生存率」と称される。

【0177】

適切には、ポリペプチドは、ヒトの便の上清またはマウスの小腸の流体へと、３７℃で例えば少なくとも最大２時間、適切には少なくとも最大３時間、より適切には少なくとも最大４時間、さらに適切には少なくとも最大５時間、また適切には少なくとも最大５．５時間、さらに適切には少なくとも最大６時間、また適切には少なくとも最大１２時間、さらに適切には少なくとも最大１４時間、また適切には少なくとも最大１６時間暴露した後、中和能を実質的に保持する。

【0178】

自己免疫疾患および／または炎症性疾患
本発明により提供される組成物および構築物は、特に自己免疫疾患および／または炎症性疾患の予防または処置における有用性を見出す可能性がある。適切には、自己免疫疾患および／または炎症性疾患は、炎症性腸疾患および／または粘膜炎、最も適切には炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、またはチェックポイント阻害剤誘導型大腸炎、最も適切には潰瘍性大腸炎またはクローン病）である。

【0179】

自己免疫疾患は、免疫系が正常な体内組織に有害に反応するときに発症する。自己免疫疾患は、体内組織への損傷、異常な器官成長、および／または器官機能の変化をもたらすおそれがある。この障害は、わずか１つの器官または組織型に影響を及ぼす、または複数の器官および組織に影響を及ぼす場合がある。自己免疫疾患の影響をよく受ける器官および組織として、赤血球、血管、結合組織、甲状腺や膵臓などの内分泌腺、筋肉、関節、および皮膚といった血液構成成分が挙げられる。炎症性疾患は、炎症を特徴とする疾患である。多くの炎症性疾患は自己免疫疾患であり、その逆も然りである。

【0180】

ＧＩＴの自己免疫疾患および／または炎症性疾患
慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、および潰瘍性大腸炎は、小児および成人の両方を悩ませるものであり、ＧＩＴ（胃腸管）の自己免疫および炎症性疾患の例である（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００２）。潰瘍性大腸炎は、炎症反応および形態学的変化が結腸に存在し続ける疾病として定義される。直腸は、患者の９５％に関係する。炎症の大部分は粘膜に限定されており、結腸の長さに沿って潰瘍、浮腫、および出血を伴う様々な重症度の連続的な関与で構成される（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００２）。潰瘍性大腸炎は通常、排便の通過中に最も重度となる下腹部痙攣に加えて、血液や粘液が混じった糞便の存在により示される。臨床的に、血液や粘液が混じった下痢の存在により、潰瘍性大腸炎と、血液が生じない過敏性腸症候群とが区別される。潰瘍性大腸炎と異なり、クローン病の症状は、通常微細なものであり、後に診断される。関与の位置、程度、および重症度などの因子は、胃腸症状の程度を決定する。回腸結腸が関与する患者には通常、右下腹部の圧痛および時折炎症性腫瘤を伴う食後腹痛が生じる。胃十二指腸のクローン病に関連する症状は、早期の満腹感、悪心、嘔吐、上腹部痛、または嚥下困難を含む。肛門周囲の疾患は一般的に、肛門ポリープに加え、深い肛門裂傷、および痔瘻である（その全体を本明細書に組み込まれる、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００２）。

【0181】

他のＧＩＴ疾患は、例えば、炎症性病変が上皮の密着結合を妨害する粘膜に存在する炎症性疾患である粘膜炎（適切には、薬物および放射線誘導型粘膜炎）を含む。粘膜炎では、病変は、口から肛門までのあらゆる場所に生じるおそれがあり、口腔および食道の病変に対しては、組成物を含有する口内洗浄液またはクリーム調製物が、使用可能である。肛門および直腸の病変に対しては、組成物を含有する局所投与用の坐薬、クリーム、またはフォームが適切である。組成物は、炎症部位における血流への吸収、またはリンパ液の除去とその後の血流への侵入を介して、基底膜または他の炎症性部位から取り除かれる。それゆえ、組成物は、血流を介して肝臓に到達し、腎臓において糸球体濾過を介して取り除かれる。このため、したがって、本発明の組成物が、自己免疫性肝炎、ＩＩ型糖尿病、および糸球体腎炎などの疾患に対して機能するという、優れた理論的根拠が存在する。

【0182】

適切には、本発明の組成物は、ＧＩＴの自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に使用される。

【0183】

適切には、本発明の組成物は、クローン病、潰瘍性大腸炎、刺激反応性腸疾患、ＩＩ型糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、シェーグレン症候群、セリアック病、薬物または放射線誘導型粘膜炎、食道炎、およびチェックポイント阻害剤誘導型大腸炎（より適切には、クローン病、潰瘍性大腸炎、またはチェックポイント阻害剤誘導型大腸炎、最も適切には潰瘍性大腸炎またはクローン病）からなる群から選択されるＧＩＴの自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置に使用されるものである。

【0184】

組成物の経口送達は、理想的には炎症性疾患を処置する。この場合、ＴＮＦ－α（またはＴＮＦ－α受容体）および／またはＩＬ－７Ｒ（あるいはＩＬ－７またはＬ－ＴＳＬＰ）は、病態の少なくとも一部に寄与し、より適切には、免疫グロブリン鎖可変ドメインは、これらサイトカイン類が生物学的に活性である組織にアクセス可能である。

【0185】

皮膚の自己免疫疾患および／または炎症性疾患
乾癬は、衰弱性自己免疫皮膚科学疾患である。この疾患の最もよく見られる形態はプラーク乾癬であり、銀鱗で覆われた赤色の皮膚を特徴とする。組織学的には、像（ｐｉｃｔｕｒｅ）は、炎症細胞浸潤を伴う乾癬プラーク内の角化細胞における分化の乱れおよび超増殖の１つである（Ｏｒｔｏｎｎｅ，１９９９）。乾癬皮膚病変は、特徴的な光沢のある銀鱗を伴う様々な形状の、境界の明瞭な赤色の炎症性プラークである。乾癬という用語は、乾癬、ならびに紅斑、皮膚の肥厚／隆起、および鱗屑を含む乾癬症状を含む。

【0186】

乾癬の処置に使用される生物学的薬剤として、抗ＴＮＦ－α治療薬（ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばアダリムマブやインフリキシマブ、またはエタネルセプトなどのＴＮＦ－α受容体融合タンパク質など）、ＣＤ１１ａに対するヒト化抗体（エファリズマブ）、あるいはＣＤ２に結合する（それによりＣＤ２ ＬＦＡ３相互作用を遮断する）アレファセプトなどの薬剤が挙げられる。本明細書中で列記した生物学的薬剤のすべてが、乾癬の処置に対する使用を承認されていないことに留意されたい。

【0187】

本発明の組成物は、ＴＮＦ－α（またはＴＮＦ－α受容体）および／またはＩＬ－７Ｒ（あるいはＩＬ－７またはＬ－ＴＳＬＰ）が、このような病変の病態に寄与する炎症性皮膚病変に対する投与のために、クリーム／軟膏またはその他局所用担体に組み込まれる場合がある。

【0188】

適切には、本発明の組成物は、天疱瘡、乾癬、湿疹、および強皮症からなる群から選択される皮膚自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置に使用されるものである。

【0189】

一実施形態では、本発明のポリペプチドまたは構築物は、適切には局所送達による、および／あるいは、適切にはクリーム、ナノ粒子、軟膏、またはヒドロゲルの形態で皮膚を介したアトピー性皮膚炎の処置または予防において使用するためのものである。

【0190】

治療用途および送達
適切には、本発明の組成物は、適切には経口投与により投与される薬剤として使用、適切には、ＧＩＴ疾患の処置および／または予防、ならびに／あるいは炎症性腸疾患などの自己免疫疾患および／または炎症性疾患などの疾患の処置または予防に使用されるものである。適切には、本発明の構築物は、適切には経口投与により投与される薬剤として使用されるものである。本発明の組成物はまた、肥満症などの代謝異常といった他の健康状態に対する経口投与による処置または予防に使用されてもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、腸管を対象とする局所効果があるように意図される。一実施形態では、本発明の組成物は、治療上有効量で循環へと送達することによる疾患の処置または予防に使用されるものではない。

【0191】

本発明の一態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置する方法が提供され、該方法は、必要とする人に本発明の組成物を治療上有効量で投与する工程を含む。適切には、自己免疫疾患および／または炎症性疾患は、炎症性腸疾患および／または粘膜炎である。

【0192】

抗ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよび抗ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、本発明の組成物中でともに製剤化されるか、あるいは別個に製剤化されて、別個に、連続的に、または同時に投与される場合がある。

【0193】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、同じ経路、または異なる経路により投与される場合がある。例えば、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは経口投与され、一方でＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは直腸投与される場合がある。

【0194】

本発明の一態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに使用されるＴＮＦ－α結合ポリペプチドが提供される。さらなる態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに使用されるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが提供される。

【0195】

本発明のさらなる態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置する方法が提供され、該方法は、必要とする人に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドをＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに投与する工程を含む。また、必要とする人に、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドをＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに投与する工程を含む、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を処置する方法も提供される。

【0196】

本発明のさらなる態様では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む、炎症性腸疾患および／または粘膜炎の処置あるいは予防に使用される組成物が提供される。

【0197】

本発明のさらなる態様では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む、炎症性腸疾患および／または粘膜炎の処置あるいは予防に使用される組成物が提供され、該組成物は、経口投与される。

【0198】

本発明のさらなる態様では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、適切には炎症性腸疾患および／または粘膜炎の処置あるいは予防のための薬剤の製造における、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物の使用が提供される。

【0199】

本発明のさらなる態様では、経口投与による、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、適切には炎症性腸疾患および／または粘膜炎の処置あるいは予防のための薬剤の製造における、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物の使用が提供される。

【0200】

本発明のさらなる態様では、炎症性腸疾患および／または粘膜炎を処置あるいは予防する方法が提供され、該方法は、必要とする人に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物を投与する工程を含む。

【0201】

本発明のさらなる態様では、炎症性腸疾患および／または粘膜炎を処置あるいは予防する方法が提供され、該方法は、必要とする人に、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物を経口投与する工程を含む。

【0202】

上記実施形態では、炎症性疾患は、適切には粘膜炎または食道炎であり、炎症性腸疾患は、適切にはクローン病、潰瘍性大腸炎、またはチェックポイント阻害剤誘導型大腸炎、最も適切には潰瘍性大腸炎またはクローン病である。さらに、上記実施形態では、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、適切には抗体フラグメントを含むポリペプチドであり、および／またはＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、適切には抗体フラグメントを含むポリペプチドである。より適切には、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、ともに抗体フラグメントを含むポリペプチドである。より適切には、両ポリペプチドは、ＩＣＶＤである。

【0203】

１つの結合ポリペプチドを別の結合ポリペプチドと「ともに」投与することは、各結合ポリペプチドの治療濃度域が互いに重なることを意味する。このことは、例えば、治療上有効量の各結合ポリペプチドが、対象の身体に同時に存在することを意味する。特定の実施形態では、治療上有効量の各結合ポリペプチドは、治療が必要な部位に同時に存在する。

【0204】

本発明の組成物の治療上有効量は、対象への単回または複数回投与後に、対象において選択標的の生物学的効果を有意な程度に中和するのに有効な量である。治療上有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および重量などの要因、ならびに構築物が個体の望ましい反応を誘発する能力に応じて変動する場合がある。治療上有効量は、治療上有益な効果が構築物の有毒または有害な効果を上回る量でもある。本発明の組成物は、対象への経口投与に適した医薬組成物へと組み込むことが可能である。

【0205】

本発明の組成物は、経口送達用に製剤化可能である。本発明の組成物は、様々な形態を呈する場合がある。例えば、液体、液体溶液、分散液、または懸濁液、錠剤、丸剤、および粉末などの半固形および固形剤形が挙げられる。固形剤形が好ましい。適切には、本発明の組成物は、錠剤、より適切には小型錠剤に入れて提供される。適切には、本発明の構築物は、潰瘍性大腸炎またはクローン病の処置用の錠剤、より適切には小型錠剤に入れて提供される。より適切には、本発明の構築物は、経口投与用の腸溶コーティングを施した小型錠剤に入れて提供される。

【0206】

好酸球性食道炎の処置では、ロゼンジの形態での送達が特に好ましい。アトピー性皮膚炎の処置では、クリームの形態での送達が特に好ましい。

【0207】

組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含み、適切には、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形態で使用可能である。

【0208】

一般的に、組成物は、医薬組成物を形成する担体などの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。薬学的に許容可能な担体の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどうち１つ以上、ならびにこれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容可能な担体は、湿潤剤、乳化剤、保存料、または緩衝液などの微量の補助物質を含む場合があり、これにより、本発明のポリペプチドまたは構築物の貯蔵期間または有効性が増強される。医薬組成物は、抗付着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、結合剤、コーティング、崩壊剤、香料、色、潤滑剤、吸着剤、保存料、甘味料、凍結乾燥賦形剤（リオプロテクタントを含む）、または圧縮補助物質（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｉｄｓ）を含む場合がある。適切には、本発明の組成物中のポリペプチドは、凍結乾燥してから医薬組成物に組み込まれる。

【0209】

本発明の組成物はまた、腸溶コーティングとともに提供される場合がある。腸溶コーティングは、経口薬剤に適用されるポリマー障壁であり、胃の低いｐＨからポリペプチドを保護する。腸溶コーティングに使用される材料は、脂肪酸、ワックス、セラック、プラスチック、植物性繊維が挙げられる。適切な腸溶コーティングの構成成分として、メチルアクリレート－メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート－メタクリル酸コポリマー、アルギン酸ナトリウム、およびステアリン酸が挙げられる。適切な腸溶コーティングは、ｐＨ依存性放出ポリマーを含む。これらは、胃で見られる高酸性ｐＨでは溶けないが、低酸性ｐＨでは速やかに溶けるポリマーである。ゆえに、適切には、腸溶コーティングは、酸性の胃液（ｐＨ最大３）では溶けないが、小腸（ｐＨ６超）または結腸（ｐＨ７．０超）にある高ｐＨ環境では溶けることになる。ｐＨ依存性放出ポリマーは、本発明の組成物が、腸管の標的領域に到達するおよその時間に放出されるように選択される。

【0210】

本発明の医薬組成物は、組成物のｐＨを安定させるために、５～５０、より適切には１５～４０，またはさらに適切には２５～３０ｇ／リットルの濃度で、緩衝液に入れて製剤化される場合がある。適切な緩衝液構成成分の例として、クエン酸ナトリウムおよび／またはクエン酸などの生理塩が挙げられる。適切には、緩衝液は、１００～２００、より適切には１２５～１７５ｍＭの塩化ナトリウムなどの生理塩を含有する。適切には、緩衝液は、組成物のｐＨまたは患者の生理ｐＨに近いｐＫａを有するように選択される。

【0211】

典型的な医薬組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬに及ぶ場合がある。

【0212】

本発明の医薬組成物の水性製剤は、例えば約４．０～約７．０、約５．０～約６．０、あるいは約５．５のｐＨ範囲で、ｐＨ緩衝液に入れて製剤化される場合がある。適切な緩衝液の例として、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液、および製剤の所望の張度に依存して、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭにあってもよい。

【0213】

医薬組成物の張度は、張度改質薬を含めることにより改質可能である。このような張度改質薬は、帯電または未帯電の化学種であってもよい。典型的な未帯電張度改質薬として、糖類、糖アルコール、または他のポリオール、好ましくはトレハロース、スクロース、マンニトール、グリセロール、１，２－プロパンジオール、ラフィノース、ソルビトールまたは、ラクチトール（特にトレハロース、マンニトール、グリセロール、または１，２－プロパンジオール）が挙げられる。典型的な帯電張度改質薬として、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、またはマレイン酸塩イオン（特に塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウム）を伴うナトリウム、カリウム、またはカルシウムイオンの組合せなどの塩、あるいはアルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸が挙げられる。適切には、水性製剤は等張であるが、高張液または低張液が適切な場合もある。「等張」という用語は、生理的食塩水または血清など、比較対象である一部の他の溶液と張度が同じである溶液を表す。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭ、例えば１ｍＭ～５００ｎＭの量で使用可能である。適切には、少なくとも１つの等張剤が、組成物に含まれる。

【0214】

製剤化された構築物の凝集を低減し、製剤中の粒子形成を最小限にし、および／または吸収を低下させるために、医薬組成物に界面活性剤が添加される場合もある。典型的な界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０、およびポリソルベート８０である。典型的な界面活性剤の濃度は、約０．００１％～約１０％ｗ／ｖに及ぶ場合がある。

【0215】

凍結乾燥プロセス中にポリペプチドを不安定条件から保護するために、リポプロテクタントも添加される場合がある。例えば、既知のリポプロテクタントは、糖類（グルコース、スクロース、マンノース、およびトレハロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む）、およびアミノ酸（アラニン、グリシン、およびグルタミン酸を含む）を含む。リポプロテクタントは、約１０ｍＭ～５００ｍＭの量で含めることができる。

【0216】

本発明の医薬組成物の投与量範囲は、所望の治療効果を産み出すための範囲である。必要な用量範囲は、医薬組成物または構築物の正確な性質、腸管の標的領域、製剤の性質、患者の年齢、患者の疾病の性質、程度、または重症度、存在する場合は禁忌、および主治医の判断に左右される。これら用量レベルの変動は、最適化のための標準の経験的なルーチンを使用して調整可能である。

【0217】

適切な本発明の医薬組成物の一日量は、５０ｕｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、５～３０ｍｇ／ｋｇなど、５０ｎｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。単位用量は、１００ｍｇ未満まで変動可能であるが、一般的には、一回の投与につき２５０～２０００ｍｇの領域にあり、この量は、一日以上にわたり頻繁に、例えば、一日二回、三回、または四回、あるいは一日おきの頻度、または週一回の頻度で投与されてもよい。

【0218】

ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、本発明の組成物に存在するが、互いに結合されていないとき、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドのモル比が２０：１～１：２０、例えば１５：１～１：１５、適切には１０：１～１：１０、より適切には５：１～１：５、さらに適切には３：１～１：３、また適切には２：１～１：２、さらに適切には１．５：１～１：１．５の状態で存在してもよい。

【0219】

疾患の処置はさらに、疾患の悪化の処置、症状の改善、および病徴の再発を防ぐために病徴からの寛解における患者の処置を包含する。

【0220】

併用療法
本発明の医薬組成物はまた、１つ以上の活性薬剤（例えば、本明細書に記載のものなどの疾患を処置するのに適した活性薬剤）を含む場合がある。自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置のための治療方法に本発明の医薬組成物を、細菌性疾患、自己免疫疾患、および／または炎症性疾患の処置に通常使用される他の確立された治療薬に対する補助剤として、あるいはこの治療薬と併用して使用することは、本発明の範囲内である。

【0221】

炎症性腸疾患（クローン病や潰瘍性大腸炎など）の処置において、考えられ得る組合せとして、例えば、５－アミノサリチル酸またはそのプロドラッグ（スルファサラジン、オルサラジン、またはビサラジドなど）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはブデソニド）、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、アザチオプリン、または６－メルカプトプリン）、抗ＴＮＦ－α抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、またはゴリムマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＩＬ－２３ｐ１９特異抗体（例えば、ブラジクマブ、リサンキズマブ、またはミリキズマブ）、抗ＩＬ６Ｒ抗体、または小分子ＩＬ１２／ＩＬ２３阻害剤（例えばアピリモド）、抗オンコスタチンＭ抗体（抗α－４－β－７抗体（例えばベドリズマブ））、ＭＡｄＣＡＭ－１遮断薬（例えばＰＦ－００５４７６５９）、細胞接着分子α－４－インテグリンに対する抗体（例えばナタリズマブ）、ＩＬ２受容体αサブユニットに対する抗体（例えばダクリズマブまたはバシリキシマブ）、ＪＡＫ１阻害剤（例えばフィルゴチニブまたはウパダシチニブ）、ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）、Ｓｙｋ阻害剤およびそのプロドラッグ（例えばフォスタマチニブおよびＲ－４０６）、ホスホジエステラーゼ－４阻害剤（例えばテトミラスト）、ＨＭＰＬ－００４、プロバイオティクス、デルサラジン、セマピモド／ＣＰＳＩ－２３６４、およびプロテインキナーゼＣ阻害剤（例えばＡＥＢ－０７１）を含む群から選択される１つ以上の活性薬剤との組合せが挙げられる。最も適切な併用薬剤は、ＪＡＫ１阻害剤（例えばフィルゴチニブまたはウパダシチニブ）、ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＩＬ－２３ｐ１９特異抗体（例えば、ブラジクマブ、リサンキズマブ、またはミリキズマブ）、あるいは抗α－４－β－７抗体（例えばベドリズマブ）である。

【0222】

したがって、本発明の他の態様は、１つ以上のさらなる活性薬剤、例えば上述の１つ以上のさらなる活性薬剤と併用して、本発明の医薬組成物を提供する。本発明のさらなる態様では、医薬組成物または構築物は、上記の群から選択した少なくとも１つの活性薬剤と連続的に、同時に、または別個に投与される。

【0223】

同様に、本発明の他の態様は、配合医薬品を提供し、該配合医薬品は、
（Ａ）本発明の医薬組成物と、
（Ｂ）１つ以上の他の活性薬剤と
を含み、成分（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させて製剤化される。この本発明の態様では、配合医薬品は、単一（併用）製剤、またはキットの一部であってもよい。このため、この本発明の態様は、本発明の医薬組成物または構築物および別の治療薬を、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させて含む併用製剤を包含する。

【0224】

本発明はまた、キットの一部を包含しており、このキットの一部は、
（ｉ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させた本発明の医薬組成物と、
（ｉｉ）１つ以上の他の活性薬剤を薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させて含んでいる製剤と
を含み、構成要素（ｉ）と（ｉｉ）はそれぞれ、他方と組み合わせての投与に適した形態で投与される。

【0225】

このため、キットの一部の構成要素（ｉ）は、上記成分（Ａ）を薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させたものである。同様に、構成要素（ｉｉ）は、上記成分（Ｂ）を薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、または担体と混合させたものである。１つ以上の他の活性薬剤（すなわち、上記成分（Ｂ））は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症などの細菌感染症、ＩＢＤなどの自己免疫疾患および／または炎症性疾患（例えばクローン病および／または潰瘍性大腸炎）などの処置に関連して上述した薬剤のうちいずれかであってもよい。成分（Ｂ）が２以上のさらなる活性薬剤である場合、これらの活性薬剤は、互いに製剤化されるか、成分（Ａ）とともに製剤化されるか、別個に製剤化される場合がある。一実施形態では、成分（Ｂ）は、１つの他の治療薬である。別の実施形態では、成分（Ｂ）は、２つの他の治療薬である。この本発明の態様の配合医薬品（複合成分製剤またはキットの一部のいずれか）は、自己免疫疾患（例えば本明細書に記載の自己免疫疾患）の処置または予防に使用されてもよい。

【0226】

ベクターおよび宿主
用語「ベクター」は、本明細書で使用するとき、それが結合される他の核酸を運ぶことが可能な核酸分子を指すように意図される。ベクターの一種はプラスミドであり、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。他の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムへとライゲートされる場合がある。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、ならびにエピソーム哺乳動物および酵母菌ベクター）において自律複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムへと統合され、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが動作可能に結合される遺伝子の発現を方向付けることが可能である。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技法に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態を呈する。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最もよく使用されるベクターの形態であるため、交換可能に使用される場合がある。しかし、本発明は、同等の役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ウイルス、ならびにバクテリオファージおよびファージミド系の他の形態を含むように意図されている。本発明はまた、本発明の組成物中のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。「組換え体宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用するとき、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すように意図される。かかる用語は、特定の対象細胞以外に、この細胞の後代も指すように意図される。

【0227】

本発明の一態様では、本発明の構築物をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡを含んでいるベクターが提供される。本発明のさらなる態様では、前記ベクターにより形質転換される宿主細胞が提供され、本発明の構築物を発現することが可能である。適切には、宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ属に属する酵母菌などの、酵母菌である。

【0228】

調製法
ポリペプチド、およびポリペプチドを含む構築物は、例えばＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ２０１２に開示される技法を使用して取得および操作可能である。

【0229】

モノクローナル抗体は、特異抗体を産生するＢ細胞を、組織培養における成長能、および抗体鎖合成の欠如について選択される骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と融合することにより、ハイブリドーマ技術を使用して産生可能である（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。

【0230】

決定された抗原に向けられるモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原、不死細胞、好ましくは骨髄腫細胞で事前に免疫化させた動物の末梢血から得たリンパ球を不死化すること、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回復させること
により、取得可能である。

【0231】

代替的に、ハイブリドーマ細胞の使用は、必要ではない。したがって、モノクローナル抗体は、
ａ）ベクターへ、具体的にはファージへ、より具体的には、リンパ球、特に（適切には、決定された抗原で事前に免疫化される）動物の末梢血リンパ球から得た糸状バクテリオファージ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ配列へとクローニングする工程、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で上記ベクターを伴う原核細胞を形質転換する工程、
ｃ）抗原親和性選択にかけることにより抗体を選択する工程、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回復させる工程
を含むプロセスにより取得可能である。

【0232】

ラクダを免疫化し、血液を循環するＢ細胞のＶＨＨレパートリーをクローニングし（Ｃｈｏｍｅｚｙｎｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ならびにファージ、酵母菌、またはリボソームディスプレイを用いて抗原特異的ＶＨＨを免疫（Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）および非免疫（Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ ２００２）ライブラリから単離する方法が、知られている（ＷＯ９２／０１０４７、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、およびＨａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これら参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれている。

【0233】

ｓｃＦｖおよびＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントは、大腸菌において単離かつ発現可能である（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｅｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８、およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。

【0234】

突然変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関して無変化であるが特定の宿主の翻訳に好ましいコドンを提供するポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたはｃＤＮＡに対してなされる場合がある。例えば大腸菌、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける核酸の翻訳に好ましいコドンが、知られている。ポリペプチドの突然変異は、例えばポリペプチドをコードする核酸の置換、付加、または欠失により達成可能である。ポリペプチドをコードする核酸の置換、付加、または欠失は、多くの方法、例えば、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチドを対象とする突然変異、アセンブリＰＣＲ、ＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、回帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ １９９７）、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはこれら方法の組合せにより、導入することができる。核酸の修飾、付加、または欠失はさらに、組換え、回帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップドデュプレックス突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射性突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸多量体作成、またはこれらの組合せを含む方法によっても導入可能である。

【0235】

特に、人工遺伝子合成が使用される場合がある（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ １９８４、Ｓａｋａｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５、およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば固相ＤＮＡ合成により合成的に産生可能である。遺伝子全体は、前駆物質鋳型ＤＮＡを必要とすることなく、ｄｅ ｎｏｖｏ合成可能である。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、ビルディングブロックは、生成物の配列に必要な順序で成長オリゴヌクレオチド鎖へと連続的に結合される。鎖のアセンブリが完了すると、生成物は、固相から溶液へと放出され、脱保護され、集められる。生成物は、高純度で所望のオリゴヌクレオチドを得るために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単離可能である（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。

【0236】

ＶＨおよびＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインの発現は、（例えば、参照により本明細書に組み込まれるとともに以下に詳述されるＷＯ９４／０４６７８に開示されるプロトコルに従い）細菌、例えば大腸菌などの原核細胞といった適切な発現ベクターを使用して達成可能である。ＶＨおよびＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインの発現はまた、真核細胞、例えば昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ベロ細胞、あるいは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母菌などの酵母菌を使用して達成可能である。適切には、（例えば、参照により本明細書に組み込まれるとともに以下に詳述されるＷＯ９４／０２５５９１に開示されるプロトコルに従い）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが使用される。

【0237】

具体的には、ＶＨＨは、次の工程を含むプロセスにより、大腸菌細胞を使用して、ＷＯ９４／０４６７８に開示される方法に従い調製可能である：
ａ）ブルースクリプトベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、任意選択でＨｉｓタグを含む（例えば、ラクダのリンパ球から得られるか、合成的に産生される）ＶＨＨをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列をクローニングする工程、
ｂ）ＸｈｏＩ部位を含有するＶＨＨに特異的な５’プライマー、および配列ＴＣ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＧ（配列番号１３）を有するＳｐｅＩ部位を含有する３’プライマーを使用した増幅後に、クローニングされたフラグメントを回復させる工程、
ｃ）ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素でのベクターの消化後にＩｍｍｕｎｏ ＰＢＳベクター（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）において、回復されたフラグメントを同位相でクローニングする工程、
ｄ）工程ｃの組換えＩｍｍｕｎｏ ＰＢＳベクターでのトランスフェクションにより宿主細胞、特に大腸菌を形質転換する工程、
ｅ）ＶＨＨコーディング配列の発現産物を、例えば、プロテインＡを用いたカラムクロマトグラフィー、陽イオン交換、またはＶＨＨがＨｉｓタグを含む場合にはニッケル親和性レジンなどの親和性精製により回復させる工程。

【0238】

代替的に、ＶＨやＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、
ａ）判定された特異性抗原結合部位を有するＶＨＨをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列を得る工程、
ｂ）開始コドンおよびＨｉｎｄｌｌｌ部位を含む５’プライマー、ならびにＸｈｏＩ部位を有する終止コドンを含有する３’プライマーを使用して、得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅する工程、
ｃ）増幅されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを、プラスミドｐＭＭ９８４（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８３）のＨｉｎｄｌｌｌ（２６５０位）およびＸｈｏＩ（４０６７位）部位へと再び組み合わせる工程、
ｄ）許容細胞を特にＮＢ－Ｅ細胞（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｉｓｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）にトランスフェクトする工程、
ｅ）得られた生成物を回復する工程
を含むプロセスにより取得可能である。

【0239】

さらに、ＶＨＨまたはＶＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、次のように、Ｆｒｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００およびＷＯ９９／２３２２１（その全体を参照により本明細書に組み込まれる）に開示される方法に従い、大腸菌またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用して産生可能である。

【0240】

免疫化されたラマからの血液試料を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ（水溶液に溶けやすい中性で、高度に分枝し、高質量で、親水性のポリサッカリド－Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での不連続勾配遠心分離を介してリンパ球集団を富化させ、不連続の勾配遠心分離、酸性グアニジウムチオシアネート抽出（Ｃｈｏｍｅｚｙｎｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）により全ＲＮＡを単離し、第１の鎖ｃＤＮＡ合成（例えば、ＲＰＮ １２６６（Ａｍｅｒｓｈａｍ）などのｃＤＮＡキットを使用）を行った後、ＶＨＨおよびＶＨフラグメント、ならびに短いまたは長いヒンジ領域の一部をコードするＤＮＡフラグメントは、ＷＯ９９／２３２２１の２２頁および２３頁に詳述される特異的なプライマーを使用するＰＣＲにより増幅される。ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＢｓｔＥＩＩを用いたＰＣＲフラグメントの消化に際して、長さ約３００～４５０ｂｐのＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動を介して精製され、それぞれ大腸菌ファージミドベクターｐＵＲ４５３６またはエピゾームのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＵＲ４５４８にてライゲートされる。ｐＵＲ４５３６は、ｐＨＥＮ（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１）に由来するものであり、ラマＶＨＨおよびＶＨ遺伝子のクローニングを可能とするためにｌａｃＩ^ｑ遺伝子および固有の制限部位を包含している。ｐＵＲ４５４８は、ｐＳＹ１（その全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に由来するものである。ｌｅｕ２遺伝子におけるＢｓｔＥＩＩ部位は、このプラスミドからＰＣＲを介して取り除かれ、ＳＵＣ２シグナル配列とターミネーターとの間にあるクローニング部位は、ＶＨ／ＶＨＨ遺伝子フラグメントのクローニングを容易にするために置き換えられる。ＶＨ／ＶＨＨは、検出対象Ｃ末端にｃ－ｍｙｃタグを有している。個々の大腸菌ＪＭ１０９コロニーは、１％グルコースおよびＬ^－１アンピシリンを補足した２ＴＹ培地１５０ｍｌを包含する９６ウェル微量定量プレートに移される。一晩かけて成長（３７℃）させた後、プレートは、Ｌ^－１アンピシリン１００ｍｇおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを包含する２ＴＹ培地に複製される。さらに一晩インキュベーションを行い、任意選択で凍結解凍した後、細胞は遠心分離されてペレット状になり、上清はＥＬＩＳＡで使用可能である。個々のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコロニーは、選択的な最少培地（０．７％酵母窒素原基礎培地、２％グルコースを含み、必須アミノ酸および塩基が補足されている）を包含する試験管に移され、３０℃で４８時間かけて成長される。続いて、培養物は、ＹＰＧａｌ培地（１％酵母抽出物、２％のｂａｃｔｏペプトン、および５％ガラクトースを含む）の中、１０倍希釈される。成長の２４時間と４８時間後、細胞はペレット状にされ、培養液上清はＥＬＩＳＡで解析可能である。６００ｎｍ（ＯＤ６００）の吸光度が、任意選択で測定される。

【0241】

さらに、ＶＨ／ＶＨＨなどの免疫グロブリン鎖可変ドメインは、次のような手順を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにより産生可能である。

【0242】

ＶＨ／ＶＨＨをコードする自然発生のＤＮＡ配列を単離するか、５’－ＵＴＲ、シグナル配列、停止コドンを含み、ならびにＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接するＶＨ／ＶＨＨをコードするＤＮＡ配列を合成により産生する（このような合成配列は、上記に概説されるように産生可能であるか、例えばＧｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販のサプライヤから注文される場合がある）。

【0243】

次のように、制限部位を使用して、ＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を多コピー統合（ＭＣＩ）ベクターｐＵＲ８５６９またはｐＵＲ８５４２に移す。２５ｕｌのＶＨＨ ＤＮＡ（ＧｅｎｅａｒｔプラスミドまたはＭＣＩベクター）、１ｕｌのＳａｃＩ、１ｕｌのＨｉｎｄＩＩＩ、ＮＥＢ緩衝液１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの二重消化に適した３ｕｌの緩衝液を使用して、３７℃で一晩、シャトルベクター、カセット、または他の合成遺伝子構築物内に任意選択で包含されるＶＨＨ、ならびにＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを伴うＭＣＩベクターをコードするＤＮＡ配列を、切断する。１ｘＴＡＥ緩衝液を有する１．５％アガロースゲル上で、ＶＨＨをコードする消化ＤＮＡ２５ｕｌ、および消化ＭＣＩベクター２５ｕｌを実施し、次いで、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル抽出を行う。次のように、ＶＨ／ＶＨＨをコードする消化ＭＣＩベクターおよび消化ＤＮＡのライゲーションを設定する：ベクター１００ｎｇ、ＶＨＨ遺伝子３０ｎｇ、１０×リガーゼ緩衝液１．５ｕｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｌ、およびｄｄＨ_２Ｏ。次いで、１６℃で一晩、ライゲーションを行う。

【0244】

次に、大腸菌細胞を形質転換する。化学コンピテントＸＬ－１青色細胞では、熱コンピテントＸＬ－１青色細胞２００ｕｌを解凍し、氷の上に５ｕｌライゲーション混合物を約３０分かけて添加し、続いて熱ショックを４２℃で９０秒間かけて添加する。次いで、２％グルコースを補足した８００ｕｌのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ低塩培地を添加し、細胞を３７℃で２時間かけて回復する。Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ寒天およびアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）上に細胞を蒔き、温度を一晩３７℃に維持する。電気コンピテントＴＧ１大腸菌細胞では、エレクトロポレーションキュベットを使用する。エレクトロポレーションキュベットにおいて、氷の上にある５０ｕｌの電気コンピテントＴＧ１細胞および１ｕｌのライゲーション混合物を、約１５分間かけて解凍する。ホルダーおよびパルスにキュベットを配置する。５００ｕｌの２ＴＹ培地を添加し、細胞を３７℃で３０分かけて回復させる。Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ、寒天、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）、および２％グルコースに、１００ｕｌの細胞を蒔く。プレートの温度を３７℃で一晩維持する。

【0245】

上記で詳述したようにＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を大腸菌へとクローニングした後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、線形化されたＭＣＩベクターで形質転換可能である。形質転換を行う前に、いくつかの工程が実行される。（ｉ）ＤＮＡは、消化により環状から線形へと変更される必要があるか、酵母ゲノムへと統合することはできない、および（ｉｉ）消化ＤＮＡは、エタノール沈澱により不純物を取り除く必要がある。また、形質転換プロセス中、酵母菌は半透過性とされ、そうすることでＤＮＡは膜を通過可能となる。

【0246】

酵母菌形質転換の調製物：次のように、ＶＨ／ＶＨＨ遺伝子を発現する選択された大腸菌コロニーから調製したｍｉｄｉ－ｐｒｅｐのＨｐａＩ消化を行う。２０ｎｇのｍｉｄｉ－ｐｒｅｐ、５ｕｌのＨｐａＩ、ＮＥＢ４緩衝液（ＢｉｏＬａｂｓ）などの適切な緩衝液１０ｕｌ、およびｄｄＨ_２Ｏを含有する１００ｕｌの溶液を調製する。

【0247】

ＨｐａＩでＤＮＡを、室温で一晩かけて切断する。次に、エタノール沈澱を行う（および片側に、ＨｐａＩ消化からの５ｕｌ試料を添加する）。３００ｕｌのエタノール１００％を９５ｕｌのＨｐａＩ消化ｍｉｄｉｐｒｅｐに添加し、ボルテックス処理を行い、５分間全速力で回転させる。ペレットが存在するときは慎重にデカントし、１００ｕｌのエタノール７０％を添加し、次いで５分間全速力で回転させる。再び試料をデカントし、ペレットが乾燥するまで５０～６０℃に保つ。ペレットを５０ｕｌのｄｄＨ_２Ｏ中で再懸濁させる。５ｕｌのＨｐａＩ消化試料の傍、ゲル上で５ｕｌを実行する。

【0248】

酵母菌の形質転換：ＹＮＢｇｌｕプレートを調製する。寒天１０ｇ＋水４２５ｍｌ（殺菌済）、２５ｍｌの濾過した２０×ＹＮＢ（２５ｍｌの滅菌Ｈ_２Ｏ中の３．３５ｇのＹＮＢ（酵母窒素原基礎培地））、および５０ｍｌの滅菌２０％グルコースを使用し、ペトリ皿へと流し込む。マスタープレートから１つの酵母菌コロニーを取り上げ、３ｍｌのＹＰＤ（酵母抽出物ペプトンデキストロース）中で一晩、３０℃で成長させる。翌日、約６００ｍｌのＹＰＤを調製し、これを使用して、３つのフラスコを２７５ｍｌ、２２５ｍｌ、および１００ｍｌのＹＰＤで満たす。２７．５ｕｌの酵母菌ＹＰＤ培養物を第１のフラスコに添加し、軽く混合する。第１のフラスコから７５ｍｌを取り、これを第２のフラスコに入れて軽く混合する。第２のフラスコから１００ｍｌを取り、これを第３のフラスコに入れて軽く混合する。１～２のＯＤ６６０に到達するまで成長させる。このＯＤに達するフラスコを、４つのＦａｌｃｏｎ管に対して、それぞれ±４５ｍｌで分割する。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。上清を捨てる。２つのＦａｌｃｏｎ管内のペレットを、４５ｍｌのＨ_２Ｏで溶かす（管の数は４から２に減少）。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。ペレットを４５ｍｌのＨ_２Ｏに溶かす（管の数は２から１に減少）。４２００ｒｐｍで２分間回転させる。ペレットを酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）５ｍｌ（１００ｍＭ）に軽く溶かし、数秒間回転させる。一部のＬｉＡｃを慎重に捨て、ＬｉＡｃの半分以上を管に保持しておく。細胞をボルテックスし、キャリアＤＮＡを５分間煮沸し、氷水の中で急冷する。２４０ｕｌのＰＥＧ、５０ｕｌの細胞、３６ｕＬｉＡｃ（１Ｍ）、２５ｕｌのキャリアＤＮＡ、４５ｕｌのエタノール沈殿ＶＨ／ＶＨＨを含有する１５ｍｌ管に添加する。各工程後、軽く混合する（同じブランク試料を処理するが、エタノール沈殿させたＶＨ／ＶＨＨのみを使用しない）。３０℃に３０分間インキュベートし、管を３～４回軽く反転し、次いで４２℃で２０～２５分間、熱ショックを与える。最大６０００ｒｐｍで短時間回転させる。上清を軽く取り除き、２５０ｕｌのｄｄＨ_２Ｏを添加し、混合する。プレートが乾燥するまですべてをＹＮＢｇｌｕプレート上で線を付け（Ｓｔｒｅａｋ）、３０℃で４～５日間成長させる。最後に、プレートを６等分にすることによりＹＮＢｇｌｕプレートを調製し、これに１～６の番号を付け、最大コロニーを播種し、番号１をストリークアウト（ｓｔｒｅａｋ ｏｕｔ）する。１～６の大きなものから小さなものまで他のコロニーに対して繰り返す。コロニーが産生されるまで、３０℃で３～４日間、大きな方を成長させる。炭素源としてグルコースを使用してＶＨ／ＶＨＨクローンを成長させ、ＶＨ／ＶＨＨ発現の誘導は、０．５％ガラクトースを添加することによりガラクトース－７－プロモータを開くことで行われる。３ｍＬの小規模培養を行い、コロニーを試験し、どれがＶＨまたはＶＨＨの最良の発現を示すかを選択する。次いで、このコロニーは精製に使用される。

【0249】

精製：ＶＨ／ＶＨＨは、強力なアニオン樹脂（Ｃａｐｔｏ Ｓなど）でのカチオン交換クロマトグラフィーにより精製される。１日目、ＶＨ／ＶＨＨを発現する選択酵母菌コロニーを５ｍｌのＹＰＤ培地（ＹＰ培地＋２％グルコース）に播種し、細胞を２５ｍＬ滅菌密封管の中、３０℃で一晩成長させる（１８０ｒｐｍで振盪させる）。２日目、５ｍｌの培養物を一晩、新たに調製した５０ｍＬのＹＰ培地＋２％グルコース＋０．５％ガラクトースに希釈し、細胞を通気済の２５０ｍｌのバッフルドフラスコの中、３０℃で二晩かけて成長させる（１８０ｒｐｍで振盪させる）。４日目、細胞を遠心分離機の中、４２００ｒｐｍで２０分間沈降させる。強力なアニオン樹脂を使用するカチオン交換精製の工程：リガンドを含有する上清のｐＨを３．５に調整する。上清５０ｍＬにつき０．７５ｍｌの樹脂（＋／－０．５ｍＬのスラリー）を、５０ｍＬのｄｄＨ_２Ｏで洗浄し、続いて結合緩衝液で３回洗浄する。洗浄した樹脂を上清に添加し、懸濁液をシェーカーの中、４℃で１．５時間インキュベートする。５００ｇで２分間の遠心分離により、樹脂に結合したＶＨ／ＶＨＨをペレット状にし、これを洗浄緩衝液で洗浄する。上清をデカントし、樹脂を結合緩衝液１０ｍＬで再懸濁させる。フィルタをＰＤ－１０カラムに入れ、樹脂をカラムに注ぎ、しばらくの間静置し、次いで樹脂の上にフィルタを添加する。結合緩衝液がすべて流れるまで待つ。６×０．５ｍｌ溶出緩衝液でＶＨ／ＶＨＨを溶出する。溶出分画をエッペンドルフ管に集める。６つの溶出分画のタンパク濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定する。ＶＨＨを含有するとともに、溶液を３，５００Ｄａのカットオフ透析膜に移す分画をプールする。精製タンパク質溶液を３ＬのＰＢＳに対し、４℃で一晩かけて透析する。５日目、精製タンパク質溶液を、２Ｌの新たなＰＢＳに対し、４℃でさらに３時間かけて透析する。最後に、ＢＣＡにより最終濃度を算出する。

【0250】

ＶＨ／ＶＨＨの文脈で論じられているが、上述の技法は、必要な場合にはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、および他の抗体フラグメントにも使用可能である。

【0251】

複数の抗原結合フラグメント（適切にはＶＨ／ＶＨＨ）は、Ｂｌａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５（その全体を参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの有機誘導体化剤にアミノ酸残基を反応させることによる化学架橋により、融合可能である。代替的に、抗原結合フラグメントは、ＤＮＡレベルで遺伝的に融合可能であり、すなわち、１つ以上の抗原結合フラグメントを含む完全なポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物が、形成される。遺伝学的経路を介した複数の抗原結合フラグメントを結合する方法の１つは、抗原結合フラグメントコーディング配列を直接またはペプチドリンカーを介して結合させることにより行われる。例えば、第１の抗原結合フラグメントのカルボキシ末端は、次の抗原結合フラグメントのアミノ末端に結合される場合がある。この結合形態は、トリ－、テトラ－などの機能的構築物の構築に対して抗原結合フラグメントを結合するために伸長される場合がある。多価（二価など）ＶＨＨポリペプチド構築物を産生する方法は、ＷＯ９６／３４１０３（その全体を参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。

【0252】

適切には、ポリペプチドは、ＷＯ０２／４８３８２に開示される方法に従い、炭素源を含む培地上の真菌成長を含む酵母菌（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌類において、産生可能であり、前記炭素源の５０～１００ｗｔ％は、エタノールである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＶＨＨフラグメントの大規模産生は、Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２（その全体を参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0253】

本発明の一態様では、本発明の組成物を作製する方法が提供され、該方法は、適切な宿主を使用してＴＮＦ－αをコードするポリヌクレオチドを発現させる工程と、適切な宿主を使用してＩＬ－７Ｒをコードするポリヌクレオチドを発現させる工程と、両ポリヌクレオチドを比較する工程とを含む。本発明のさらなる態様では、本発明の構築物を作製する方法が提供され、該方法は、適切な宿主を使用して本発明の構築物をコードするポリヌクレオチドを発現させる工程を含む。

【0254】

本発明のさらなる実施形態を、以下の節に述べる。

【0255】

節
１．ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含む組成物。
２．（ａ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ～ＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ならびに
（ｂ）前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ～ＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲ１は、配列番号９と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０と５０％以上の配列同一性を共有する配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１と６０％以上の配列同一性を共有する配列を含む、節１に記載の組成物。
３．抗体フラグメントを含むポリペプチドは、免疫グロブリン鎖可変ドメインである、節１または２に記載の組成物。
４．前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＴＮＦ－αに結合し、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１０^－７Ｍ以下のＫｄをもってＩＬ－７Ｒに結合する、節１から３のいずれか１つに記載の組成物。
５．前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってＬ９２９アッセイにおいてヒトＴＮＦ－α細胞毒性を中和し、前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＥＣ５０をもってヒトリンパ球においてＩＬ－７Ｒ依存性、ＩＬ－７誘導型のＳＴＡＴ５リン酸化を中和する、節１から４のいずれか１つに記載の組成物。
６．前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよび前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、結合される、節１から５のいずれか１つに記載の組成物。
７．前記ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよび前記ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドが、プロテアーゼ不安定ペプチドリンカーにより結合される、節６に記載の組成物。
８．前記プロテアーゼ不安定ペプチドリンカーが、Ｋおよび／またはＲ残基を含む、節７に記載の組成物。
９．前記ポリペプチドが、小腸または大腸に存在する１つ以上のプロテアーゼに対して実質的に耐性を示す、節１から８のいずれか１つに記載の組成物。
１０．節１から９のいずれか１つに記載の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
１１．腸溶コーティングを含む、節１から１０のいずれか１つに記載の組成物。
１２．経口投与に適している、節１から１１のいずれか１つに記載の組成物。
１３．自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または予防に使用するためのものである、節１から１２のいずれか１つに記載の組成物。
１４．自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとともに使用されるＴＮＦ－α結合ポリペプチド、
１５．自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置あるいは予防において、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドとともに使用されるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチド。

【0256】

本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに記載される。

【実施例】

【0257】

実施例１～３は、特異的なＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの特性に関する情報を提供する。実施例４と５は、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドとＴＮＦ－α結合ポリペプチドとの併用を対象とする実験に関する情報を提供する。実施例６は、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドおよびＴＮＦ－α結合ポリペプチドを含む構築物の産生を詳述する。

【実施例1】

【0258】

先行技術のＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドと比較した、ＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドＩＤ－Ａ４０Ｕ、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９、およびＩＤ－Ａ６２Ｕの効力
ともに大腸菌に産生されるＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドＩＤ－Ａ４０Ｕ（配列番号２４）およびＶ７Ｒ－２Ｅ９（配列番号２５）の阻害効力と有効性（最大阻害）を、Ｌ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで分析し、ｍＡｂ８２９、臨床的抗ＩＬ－７Ｒ抗体（「ＧＳＫ２６１８９６０」としても知られており、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１９に開示される抗ＩＬ－７Ｒαモノクローナル抗体である）と比較した。

【0259】

３００ｎＭから出発し、３．２の希釈係数を使用して、１％ＢＳＡ（２ｘのアッセイ濃度）において、ＩＣＶＤの７点希釈系列を調製した。ｍＡｂ８２９対照薬抗体は、１０ｎＭ～０．０８８ｎＭの濃度範囲（２ｘのアッセイ濃度）でＥＬＩＳＡにおいて陽性対照として使用した。トリプリケートに十分な体積を各ＩＣＶＤ希釈に対して調製し、一方で２つのトリプリケート（２つのプレート）に十分な体積をｍＡｂ８２９に対して調製した。８５μＬ（または１７０μＬ）の各ＩＣＶＤ（またはｍＡｂ８２９）希釈を、８５μＬ（または１７０μＬ）の１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７（２ｘのアッセイ濃度）と混合した。８５μＬのＩＬ－７を８５μＬのブロック緩衝液と混合させ、各プレートにＩＬ－７（１ｘ）完全結合シグナルを含ませた。ブロック緩衝液も、ブランクとして各プレートに添加した。次いで、ビオチン化抗－ｈＩＬ－７、続いてＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを使用して、結合したＩＬ－７を測定した。ＴＭＢ反応を３０分後に止めた。

【0260】

ＥＬＩＳＡシグナルブランクを補正したＡ_４５０データおよび「対数（阻害剤）ｖｓ反応－－可変勾配（４つのパラメータ）」を使用して、ＥＣ_５０値をＧｒａｐｈｐａｄプリズムにおいて生成し、曲線に適合させ、ＥＣ_５０を生成した。

【0261】

加えて、ＩＬ－７Ｒαに結合するＩＬ－７を阻害してＳＴＡＴ５リン酸化を妨げるＩＤ－Ａ４０ＵおよびＶ７Ｒ－２Ｅ９の能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒトリンパ球を対象に試験した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ＩＬ－７Ｒシグナル伝達を介した細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化の刺激により外生ＩＬ－７に反応するが、この反応は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ結合を妨げるＩＬ－７Ｒαに特異的なＩＣＶＤにより無効にすることができる。

【0262】

リンパ球が豊富な集団をヒトバフィーコートから単離し、液体窒素中の９０％ＦＢＳ １０％ＤＭＳＯに保管した。回復のために、細胞を完全ＲＰＭＩ－１６４０において解凍し、静置させた。回復後、丸底９６ウェルプレート中の１００μｌ、２．５ｘ１０^５細胞／ウェル）に細胞を蒔き、ＦＢＳを含まない完全ＲＰＭＩ中で１時間飢餓させた。飢餓後、所望のＩＣＶＤ濃度を各ウェル（５０μＬ／ウェル）に添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。次いで、５０μＬ／ウェルのＩＬ－７を各ウェルに加え、プレートを１５分間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。氷の上でプレートを急冷して反応を止め、続いて遠心分離を行い、上清を取り除いた。次いで、固着、透過化、およびｐＳＴＡＴ５細胞内染色のために、細胞を処理した。氷の上で２０分間、１００μＬ／ウェルのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５４７２２）で細胞をインキュベートし、１５０μｌ／ウェルの１ｘ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５４７２３）で２回洗浄し、氷の上で３０分間、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５５８０５０）でインキュベートし、１５０μＬ／ウェルの１ｘＰＢＳ２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄した。続いて、室温で１時間、２５μＬ／ウェルのｐＳＴＡＴ５抗体（［４７／Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）］（Ａ４８８）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃６１２５９８））またはアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（［Ｂ１１／６］（ＦＩＴＣ）（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ９１３５６））で細胞を染色した。１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液を添加することにより、反応を止めた。１回の洗浄／遠心分離工程の後、最終的に２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液の中で細胞を再懸濁し、データをＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）中で獲得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ解析を行った。

【0263】

対照薬とともに、これら実験の結果を表１ａに示す。

【0264】

【表7】

【0265】

別個の実験では、この同じＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡを、対照薬とともにＩＤ－Ａ６２Ｕ（配列番号１６）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生）上で実施した。結果を表１ｂに示す。ＩＤ－Ａ６２Ｕは、ＩＤ－Ａ４０Ｕに対してＥ１ＤおよびＲ４５Ｌの突然変異を含む。

【0266】

【表8】

【0267】

ＩＬ－７Ｒαに結合するＬ－ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒ複合体をＶ７Ｒ－２Ｅ９が中和する能力を、試験した。９６ウェルプレートを０．２５μｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ_６－Ｆｃ＋５μｇ／ｍＬのＢＳＡで被覆し、次いで遮断した。Ｖ７Ｒ－２Ｅ９を連続希釈し、組換えヒトＬ－ＴＳＬＰ（最終濃度１５ｎｇ／ｍＬ）およびヒトＴＳＬＰ－Ｒ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）と１：１：１で混合した。次いで、混合物を３０分間インキュベートし、結合を可能にしてから、ＩＬ－７Ｒαで被覆したプレートに添加する。２時間のインキュベーション後、結合したＬ－ＴＳＬＰを、５０μＬ／ウェルの０．３μｇ／ｍＬビオチン化ウサギ抗ｈＴＳＬＰ抗体、次いで５０μＬ／ウェルの１／２０００のＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰで検出し、ＩＣＶＤによりＩＬ－７Ｒαに結合するＬ－ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ－Ｒ複合体の中和レベルを、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを使用して判定した。結果を以下の表１ｃに示す。

【0268】

【表9】

【0269】

まとめると、ＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－Ａ４０Ｕは、対照薬である臨床的抗ＩＬ－７Ｒ抗体ｍＡｂ８２９以上の効力を有することを認めた。ＩＤ－Ａ４０ＵとＩＤ－Ａ６２Ｕはともに、同じＩＣＶＤファミリーに属するものであり、同一の配列を有しておらず（ＩＤ－Ａ６２ＵはＩＤ－Ａ４０Ｕに対してＥ１ＤおよびＲ４５Ｌの突然変異を含む）、異なる生物体を使用して産生されたとしても、高い効力を維持することに留意されたい。

【実施例2】

【0270】

ＩＣＶＤ－ＩＬ－７Ｒ結合親和性のＢｉｏｃｏｒｅ推計
ＩＤ－Ａ４０Ｕの結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ試験においてｍＡｂ８２９臨床的抗体と比較した。ＩＬ－７Ｒα－Ｈｉｓ_６－Ｆｃを、Ｂｉａｃｏｒｅセンサプレート（ｍＡｂ８２９解析用）に直接被覆するか、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＩＣＶＤ解析用）で捕捉して、ＩＣＶＤ／Ａｂをプレート上に流して結合を検出した。ＩＤ－Ａ４０Ｕの親和性（ＫＤ）は７．８ｘ１０^－１１Ｍであり、ｍＡｂ８２９の親和性（ＫＤ）は、５．６７ｘ１０^－１０Ｍとわずかに低かった。この結果より、ＩＤ－Ａ４０Ｕは抗原への強力な結合を呈することを認める。ＩＤ－Ａ６２Ｕは、ＩＤ－Ａ４０Ｕに対してＥ１ＤおよびＲ４５Ｌの突然変異を含む。

【実施例3】

【0271】

胃腸抽出物への耐性
腸の上清でのｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションにより、カニクイザルおよびヒトの腸管におけるＩＣＶＤの安定性を予測可能である。哺乳動物種を介して主要な小腸プロテアーゼ、トリプシン、およびキモトリプシンの活性を保存し、一方で大腸に存在するプロテアーゼは、宿主に特異的な腸マイクロフローラより産生される可能性が高い。これらの２つの環境を反映する試験マトリクスを生成するために、プールされたマウス小腸の上清、およびプールされた便の上清を、調製した。これらマトリクスはともに、未選別かつ未操作のＩＣＶＤに対して高度に消化性（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ）である。

【0272】

以前に、 抗ＴＮＦ－αＩＣＶＤ ＩＤ－３８Ｆの安定性はこれらマトリクス中で高いこと（ＷＯ２０１６／１５６４６５を参照）、この特性がＩＤ－３８Ｆの腸の通過中に高い安定性を予測することが、認められている。

【0273】

マウス源とヒト源からの胃腸抽出物中での生存について、Ｖ７Ｒ－２Ｅ９およびＩＤ－Ａ４０Ｕを試験した。ＩＣＶＤを、３７℃で６時間、マウス小腸上清でインキュベートし、そしてヒトの便の上清で１６時間インキュベートした。実施例１において上述したＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ中和ＥＬＩＳＡにより、生存を測定した。両構築物は、試験した消化マトリクスでの良好な生存を実証した（図１。「ＳＩ」＝マウス小腸液、「ＨＦ」＝ヒトの便の上清）。

【0274】

別個の実験では、ＩＤ－Ａ４１Ｕ（不安定な対照薬ＩＣＶＤ）とともに、同じヒトの便の上清アッセイにおいて生存に関してＩＤ－Ａ６２Ｕを試験した。ＩＤ－Ａ６２Ｕは、ＩＤ－Ａ４１Ｕでの約４０％の生存と比較して約１００％の生存を示した（図２。ＩＤ－Ａ６２Ｕのラベルを付けた「Ａ６２Ｕ」、およびＩＤ－Ａ４１Ｕのラベルを付けた「Ａ４１Ｕ」）。

【0275】

これらは、拡張インキュベーション時間に関与する厳密な試験であった。そのため、これらＩＣＶＤのうちいずれかは、胃腸環境で非常によく残存すると推計されることになる。

【実施例4】

【0276】

培養したＩＢＤ組織中のシグナル伝達タンパク質のリン酸化に対する、別個および併用して投与されるＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの阻害効果の調査
試験を行い、リンタンパク質バイオマーカーのレベル、およびＵＣ患者から得た炎症結腸粘膜組織のｅｘ ｖｉｖｏ培養物中での炎症性サイトカインの自発的な産生に対する、ＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの阻害効果を調べた。試験したポリペプチドはともにＩＣＶＤであった。ＩＣＶＤは、ＩＤ－Ａ６２Ｕ（上記実施例１～３で論じたＩＬ－７Ｒ結合ＩＣＶＤ）およびＩＤ－３８Ｆ（ＷＯ２０１６／１５６４６５において開示されるＴＮＦ－α結合ＩＣＶＤ）であった。個々のＩＣＶＤの効果を、２つのＩＣＶＤの混合物、および陰性対照ＩＣＶＤ（「ＩＤ－２Ａ」、どちらの標的にも結合しない無関係のＩＣＶＤ）と比較して、様々な抗サイトカイン機構を組み合わせた効果を評価する。

【0277】

４つの異なるＵＣ患者それぞれの生検を、様々なＩＣＶＤ（対照ＩＤ－２Ａ ５０ｎＭ、ＩＤ－３８Ｆ ５０ｎＭ、ＩＤ－Ａ６２Ｕ ５０ｎＭ、またはＩＤ－３８Ｆ＋ＩＤ－Ａ６２Ｕ（それぞれ５０ｎＭ））で２４時間インキュベートし、処置後、組織溶解物をリンタンパク質抗体アレイで解析した。結果生じるヒストグラム（図３～４）は、生検（１つの処置あたり４つ）それぞれに対して得たホスホ強度データの組合せの視覚的表現を提供する。様々なＩＣＶＤ処置の阻害効果を、対照ＩＣＶＤ ＩＤ－２Ａで処置した生検での優勢的に高いホスホ強度値から、抗ＴＮＦ－αまたは抗ＩＬ－７Ｒ ＩＣＶＤあるいはこれらの組合せで処置した生検での比較的低いホスホ強度値への推移により実証する。これら平均結果は、組織リン酸化レベルに対するＩＤ－Ａ６２ＵおよびＩＤ－３８Ｆの一貫した全体阻害効果を示し、２つのＩＣＶＤを組み合わせたときに効果はさらに高くなる。リンタンパク質のいずれかが本解析でより重要であり得る場合に、各生検でのタンパク質リン酸化に対する処置の全体効果を評価したことは知られていない。

【0278】

図５に示した結果は、各患者の４つの生検に対して測定したホスホ強度の合計値を示す。各生検において、アレイ上で４５のタンパク質すべてに対して測定した強度値を合計することにより、全リン酸化レベルを算出した。各患者において、各処置に対して測定した全リン酸化レベルを示す。３例（ＵＣ２７４８、ＵＣ２７４９、およびＵＣ２７５０）では顕著な阻害を認め（組合せで約５０％）、第４のＵＣ２７４７でも顕著な阻害を認めたが、一般的に反応性は少なかった。

【0279】

ＩＤ－３８ＦとＩＤ－Ａ６２Ｕを併用した処置における阻害効果は、１つのＩＣＶＤで達成した効果を超えるものであり、その結果、大半のリンタンパク質に対してほぼ最大の阻害を達成した。この実験で観察した予想外に高い阻害レベルに起因して、ＵＣ組織における併用薬剤の相乗効果に関する決定的な証拠は、さらに調査が必要となる。しかし、ＩＬ－７ＲおよびＴＮＦ－α結合ポリペプチドによるＵＣ組織における炎症性バイオマーカーの顕著阻害に関する証拠は、有望なものであり、より低濃度のポリペプチドを組み合わせたときに観察可能な相乗作用が生じる可能性が高いことを示唆する。

【0280】

全体的に、これらの結果は、共投与した抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－７Ｒポリペプチドにおける少なくとも相加的で、場合により相乗的な効果を実証する。

【実施例5】

【0281】

ＩＢＤ組織のｅｘ ｖｉｖｏ培養物中のサイトカイン産生に対する、別個および併用して投与されるＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドの阻害効果の調査
上記実施例４で論じられる生検中の自発的サイトカイン産生平均に対する様々な処置の効果を、図６～８に示す。ＩＤ－３８ＦまたはＩＤ－Ａ６２Ｕ単独の処置は、ＩＬ－８、ＴＮＦα、およびＩＬ－１７Ｆの産生を阻害したが、他のサイトカインには効果がほとんどなかった。しかし、ＩＤ－３８ＦとＩＤ－Ａ６２Ｕを組み合わせると、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＬ－３３に対する阻害効果は、個々のＩＣＶＤで認めたものよりも明らかに高かった。ＴＮＦαおよびＩＬ－１７Ｆ産生に対する組合せの阻害効果は、上述の個々のＩＣＶＤの効果以下であった。

【0282】

結論として、本試験で患者３例から得た結果は、ＩＤ－３８ＦまたはＩＤ－Ａ６２Ｕのいずれか個別での処置が、一部の炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ｆ）の産生を阻害したことを示した。他のサイトカインに対する阻害効果は小さく／部分的であり、このことは恐らく、本試験で選択したＩＣＶＤの最大以下の濃度を反映した。重要なことに、２つのＩＣＶＤを組み合わせると、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＬ－３３を含む大半のサイトカインの産生に対する阻害効果は、増大した。

【0283】

全体的に、これらの結果は、共投与した抗ＴＮＦ－αおよび抗ＩＬ－７Ｒポリペプチドにおける少なくとも相加的で、場合により相乗的な効果を実証する。

【実施例6】

【0284】

不安定リンカーにより結合されるＴＮＦ－α結合ポリペプチドおよびＩＬ－７Ｒ結合ポリペプチドを含むヘテロ両頭（ｈｅｔｅｒｏｂｉｈｅａｄ）の産生、切断、ならびに試験
ＩＤ－３８ＦおよびＩＤ－Ａ６２Ｕを組み合わせた「ＦＵ３Ｋ」と呼ばれる両頭構築物を産生し、中央リジン（Ｋ）残基（配列番号２１）を有するフレキシブル（Ｇ_４Ｓ）_２リンカーにより分離して、トリプシン切断部位を作製した。

【0285】

ＦＵ３ＫをＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上でベクターｐＵＲ９０１３へとクローニングし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現株の染色体への安定した多コピーの統合を容易にした。標準のクローニング手順に従いこれを達成した。この統合および発現系を使用して、ＦＵ３Ｋをガラクトース誘導可能なプロモータの制御下に置き、酵母菌交配因子αシグナル配列を介して両頭分泌を達成した。酵母菌染色体からのＦＵ３Ｋの発現を、誘導培養物５０ｍＬにおいて評価した。完全長のＦＵ３Ｋが、小規模の酵母菌培養物中で十分に発現した。

【0286】

トリプシンを用いた３７℃でのＦＵ３Ｋのインキュベーションの結果、ＩＤ－３８ＦおよびＩＤ－Ａ６２Ｕ単量体腕は速やかに分離された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析を実施した（図９。レーンは時間（分）であり、Ｓｔ＝標準（トリプシンの添加なし）、Ｌ＝分子量マーカー、レーンごとに充填される等しい体積）。未切断のＦＵ３Ｋ両頭（約２７ｋＤａ）および切断単量体（約１３．５ｋＤａ）に対応する帯が、はっきりと視認視可能である。これにより、ヒト小腸中でのトリプシンへの曝露に際した両単量体腕、または結腸中での微生物トリプシン様プロテアーゼの速やかな放出に対して、ＦＵ３Ｋが十分にフォーマット化されることを確認する。

【0287】

ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒ ＥＬＩＳＡを、上記実施例１に記載の方法を使用して実施した。消化前のＦＵ３ＫにおけるＩＬ－７Ｒに対する効力は、ＩＤ－Ａ６２Ｕおよび消化後と同程度であり、ＦＵ３Ｋは、ＩＬ－７Ｒに対して高い（ナノモル以下）効力を保持した（図１０。ＩＤ－Ａ６２Ｕは「Ａ６２Ｕ」とラベル付けする）。

【0288】

ビオチン化Ｈｕｍｉｒａ競合ＥＬＩＳＡを実施し、ＴＮＦα上でのＩＤ－３８ＦおよびＨｕｍｉｒａの重複エピトープに対する競合を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（１ｘＰＢＳ）中の２５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）における１００ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαで、ＥＬＩＳＡプレートを被覆し、１ｘＰＢＳ中の１％ＢＳＡで遮断した。ビオチン化アダリムマブを１：１ですべての標準および試料と混合して、最終濃度が２ｎＭのビオチン化アダリムマブを得てから、混合物をプレートに添加した。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ－ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、結合したビオチン化アダリムマブを検出し、ＴＭＢ Ｍｉｃｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して視覚化してから、０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で中止し、４５０ｎｍで読み取りを行った。

【0289】

消化前と後のＦＵ３Ｋの効力は、この競合ＥＬＩＳＡではＩＤ－３８Ｆと同程度であったことを認めた（図１１）。

【0290】

ＦＵ３Ｋの単量体腕はともに、上記実施例２に記載されるように実行されるヒトの便の上清を対象とする４時間のインキュベーション後に、親単量体であるＩＤ－３８ＦおよびＩＤ－Ａ６２Ｕの好意的な安定特性を保持することを認めた。

【0291】

これらのデータは、ＦＵ３Ｋが、ヒトの結腸を対象とする二重治療としてこれら単量体それぞれを高濃度で送達するのに適切なフォーマットであることを実証する。

【0292】

その他
本出願で言及される、特許および特許出願を含む参考文献はすべて、参照により可能な限り完全な程度にまで組み込まれている。

【0293】

本明細書、および続く特許請求の範囲全体では、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、明示した整数、工程、整数群、または工程群を包含するが、他の整数、工程、整数群、または工程群を除外するものではないことが理解される。

【0294】

本明細書および特許請求の範囲が一部を形成する出願は、あらゆる後出願に関する優先権の根拠として使用される場合がある。かかる後出願の特許請求の範囲は、本明細書に記載の特徴またはその組合せを対象とする場合がある。これらは、生成物、組成物、プロセス、または使用の請求項の形態を呈する場合があり、一例ではあるが限定されないものとして以下の請求項を含む場合がある。

【0295】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】