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特表2022-538217昆虫細胞及び哺乳動物細胞におけるタンパク質発現のための組換え導入ベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-01
(54)【発明の名称】昆虫細胞及び哺乳動物細胞におけるタンパク質発現のための組換え導入ベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20220825BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220825BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220825BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220825BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220825BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220825BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12P21/02 C
C12N15/12
C12N15/09 Z
C12N5/10
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021573156
(86)(22)【出願日】2020-06-25
(85)【翻訳文提出日】2022-01-20
(86)【国際出願番号】 US2020039584
(87)【国際公開番号】W WO2020264137
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/867,468
(32)【優先日】2019-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511197774
【氏名又は名称】エックス－ケム インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】リトブチック アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】チャンドラン ラグナス
(72)【発明者】
【氏名】フォン レーヒェンベルク モーリッツ
(72)【発明者】
【氏名】コゾー ジョン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
本明細書において、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現に使用するための組換えベクター及び方法を記載する。本発明は、いずれもベクター内の単一の発現カセット内に存在しかつ宿主細胞により条件付きで活性である昆虫細胞コンピテントプロモーター及び哺乳動物細胞コンピテントプロモーターによって１つ以上の導入遺伝子の発現が指示されることを可能にする組換え導入ベクターに基づいている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’から３’方向に向かって、（ａ）哺乳動物細胞コンピテントプロモーター；
（ｂ）人工イントロンに作動可能に連結された非コードエクソンであって、前記人工イントロンが、スプライスドナー配列、昆虫細胞コンピテントプロモーター、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列を含む、前記非コードエクソン；ならびに
（ｃ）前記哺乳動物細胞コンピテントプロモーター及び前記昆虫細胞コンピテントプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の導入遺伝子
を含む、組換えＤＮＡベクター。
【請求項2】
前記哺乳動物細胞コンピテントプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、伸長因子１（ＥＦ１－α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモーター、β－アクチンプロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ｅＩＦ４Ａ１）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルスロングターミナルリピート（ＨＩＶ ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項3】
前記哺乳動物細胞コンピテントプロモーターが、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項4】
前記昆虫細胞コンピテントプロモーターが、ポリヘドリン（ＰＨ）プロモーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｐ９プロモーター、ｐ１０プロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－１（ＯｐＩＥ１）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－２（ＯｐＩＥ２）プロモーター、及び最初期０（ＩＥ０）プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項5】
前記昆虫細胞コンピテントプロモーターが、ＰＨプロモーターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項6】
Ｋｏｚａｋ配列を有する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項7】
３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項8】
前記３’ＵＴＲが、エンハンサー配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
前記エンハンサー配列が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項８に記載のベクター。
【請求項10】
前記３’ＵＴＲが、１つ以上のターミネーター配列をさらに含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項11】
前記１つ以上のターミネーター配列が、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ターミネーター配列及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネーター配列からなる群から選択される、請求項１０に記載のベクター。
【請求項12】
１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項13】
前記１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ノーセオトリシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、及びスペクチノマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項14】
２つの転座エレメントをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項15】
前記２つの転座エレメントが、細菌トランスポゾンＴｎ７Ｒ及びＴｎ７Ｌ転座エレメントである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項16】
前記１つ以上の導入遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項17】
前記１つ以上の導入遺伝子が昆虫遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項18】
宿主細胞内での組換えタンパク質の発現方法であって、前記宿主細胞を、請求項１～１７のいずれか一項に記載のベクターと接触させる工程；及び、前記宿主細胞内で前記組換えタンパク質を発現させる工程を含む、前記発現方法。
【請求項19】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
宿主細胞内での組換えタンパク質の発現方法であって、前記宿主細胞を、請求項１～１７のいずれか一項に記載のベクターを用いて産生された組換えウイルスと接触させる工程；及び、前記宿主細胞内で前記組換えタンパク質を発現させる工程を含む、前記発現方法。
【請求項21】
前記宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２０年６月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０７１９－０５９ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿６＿２４＿２０＿ＳＴ２５という名称であり、サイズは８，８６４バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２０年６月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０７１９－０５９ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿６＿２４＿２０＿ＳＴ２５という名称であり、サイズは８，８６４バイトである。
【0002】
発明の分野
本発明は、昆虫細胞及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に使用するための組換えベクターについての方法及び組成物に関する。
本発明は、昆虫細胞及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に使用するための組換えベクターについての方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
遺伝子導入ベクターは、研究、バイオテクノロジー、及び臨床応用における導入遺伝子の送達及び発現のための強力なツールとして採用されてきた。そのようなベクターは、標的細胞におけるタンパク質の異種生産用発現カセットへの単一または複数の遺伝子の挿入を容易にする。組換え発現系の重要性を考えると、複数の宿主生物内での導入遺伝子の発現を可能にする改良された導入ベクターが必要である。
遺伝子導入ベクターは、研究、バイオテクノロジー、及び臨床応用における導入遺伝子の送達及び発現のための強力なツールとして採用されてきた。そのようなベクターは、標的細胞におけるタンパク質の異種生産用発現カセットへの単一または複数の遺伝子の挿入を容易にする。組換え発現系の重要性を考えると、複数の宿主生物内での導入遺伝子の発現を可能にする改良された導入ベクターが必要である。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、昆虫細胞及び哺乳動物細胞において組換えタンパク質を発現させるための方法及び組成物を提供する。本発明は、いずれもベクター内の単一の発現カセット内に存在しかつ宿主細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞）により条件付きで活性である昆虫細胞コンピテントプロモーター及び哺乳動物細胞コンピテントプロモーターによって１つ以上（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）の導入遺伝子の発現が指示されることを可能にする組換え導入ベクターに基づく。本明細書に記載のベクターまたは前記ベクターから産生される組換えウイルスを使用して組換えタンパク質を発現させる方法も本明細書に記載する。
【0005】
第１の態様では、本発明は、５’から３’方向に向かって、以下を含む組換えＤＮＡベクターを提供する：（ａ）哺乳動物細胞コンピテントプロモーター、（ｂ）人工イントロンに作動可能に連結された非コードエクソン（人工イントロンは、スプライスドナー配列、昆虫細胞コンピテントプロモーター、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列を含む）、ならびに（ｃ）哺乳動物細胞コンピテントプロモーター及び昆虫細胞コンピテントプロモーターに作動可能に連結された１つ以上（例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子。
【0006】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、伸長因子１（ＥＦ１－α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモーター、β－アクチンプロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ｅＩＦ４Ａ１）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルスロングターミナルリピート（ＨＩＶ ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターである。
【0007】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞コンピテントプロモーターは、ポリヘドリン（ＰＨ）プロモーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｐ９プロモーター、ｐ１０プロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－１（ＯｐＩＥ１）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－２（ＯｐＩＥ２）プロモーター、及び最初期０（ＩＥ０）プロモーターを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、昆虫細胞コンピテントプロモーターは、ＰＨプロモーターである。
【0008】
いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｋｏｚａｋ配列を有する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、ベクターは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、エンハンサー配列を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、１つ以上のターミネーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のターミネーター配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ターミネーター配列及びＳＶ４０ターミネーター配列を含む群から選択される。
【0010】
いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ヌルセオトリシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む群から選択される。
【0011】
いくつかの実施形態では、ベクターはさらに２つの転座エレメントを含む。いくつかの実施形態では、２つの転座エレメントは、細菌トランスポゾンＴｎ７Ｒ及びＴｎ７Ｌ転座エレメントである。
【0012】
いくつかの実施形態では、１つ以上（例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子は、哺乳動物遺伝子である。いくつかの実施形態では、１つ以上（例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子は、昆虫遺伝子である。
【0013】
別の態様では、本発明は、宿主細胞内での組換えタンパク質の発現方法を提供し、方法は、宿主細胞を前述の態様及び実施形態のいずれか１つのベクターと接触させる工程；及び、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させる工程を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
【0014】
さらに別の態様では、本発明は、宿主細胞内での組換えタンパク質の発現方法を提供し、方法は、宿主細胞を、前述の態様及び実施形態のいずれか１つのベクターを使用して生成する組換えウイルスと接触させる工程；及び、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させる工程を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】図１Ａ～１Ｃは、昆虫及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の産生に使用するための導入ベクターを示す一連の概略図を示す。図１Ａは、この例示的な遺伝子発現カセットの個々のエレメントを概説する例示的な導入ベクターの概略図を示しており、導入ベクターは、Ｋｏｚａｋ配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、開始コドンＡＴＧ、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）モデルタンパク質として例示される遺伝子コード配列、続いて終止コドンＴＡＡ、次いで３’ＵＴＲ発現エンハンサーウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルを有する。５’ＵＴＲの上流は、ＰＨプロモーターを含む人工イントロンであり、その上流には非コードミニエクソン配列があり、さらに上流にはＣＭＶエンハンサー／プロモーターがある。このベクターの他のエレメントには、転座部位Ｔｎ７Ｌ及びＴｎ７Ｒ、ゲンタマイシン及びアンピシリン耐性遺伝子、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点が含まれる。図１Ｂは、昆虫細胞内で図１Ａの導入ベクターから生成されるｍＲＮＡの概略図を示す。図１Ｃは、哺乳動物細胞内で同じベクターから生成されるｍＲＮＡの概略図を示す。
【図2】図２Ａ～２Ｂは、本発明の組換えベクターに感染させた昆虫及び哺乳動物細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子の用量依存的発現を示す一連の蛍光画像を示す。昆虫ＳＦ９細胞（図２Ａ）及び哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図２Ｂ）の培養物を、様々な用量で図１Ａのベクターによって表されるゲノムを宿すウイルス粒子に感染させた。アラビア数字は、ウイルス投与計画に対応する（例えば、１＝ウイルスなしの対照；２＝２００ｕＬウイルス；３＝４００ｕＬウイルス）。感染の１６時間後に蛍光画像を取得したが、同じ組換えウイルスに感染させた昆虫細胞と哺乳動物細胞の両方において、ロバストかつ用量依存的なＧＦＰ発現を示している。
【図3】臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲルの画像を示しており、哺乳動物細胞内での図１Ａに示したベクターによって生成された転写産物におけるスプライシング事象を示している。培養したＨＥＫ２９３細胞を、ＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターに感染させた。全ＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後、ＰＣＲ増幅を行った。対照として、プラスミドのみからのＰＣＲ増幅も行った。スプライシング産物の予想される長さは１８６ｂｐであり、一方、スプライシングされていない前駆体（プラスミド内と同様に）は３５７ｂｐの長さであった。遺伝子特異的（レーン２）及びオリゴｄＴ／ランダムヘキサマー（レーン３）の両方のＲＴ－ＰＣＲ反応物がスプライシングされ、それらの長さは、イントロンが除去された場合の予想と同様に、ゲル上で約１８０～１９０ｂｐであった。イントロンが存在する場合に予想されるように、プラスミドの増幅により３５０ｂｐの産物が生成された（レーン４）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本明細書中で使用する場合、用語「人工」とは、天然に存在しないことを意味する。例えば、イントロン配列が、ポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターを含むヌクレオチド配列などの組換えヌクレオチド配列で修飾され（例えば、置換、挿入、連結、または隣接され）、その修飾された配列が天然に存在することが見出されていない場合、それは人工的であると見なされ得る。人工イントロン配列の非限定的な例として、５’から３’方向に向かって、スプライスドナー配列、異種プロモーター（例えば、昆虫細胞コンピテントプロモーターまたはＰＨプロモーターなどの強力なプロモーター）、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列を有するイントロンが挙げられる。
本明細書中で使用する場合、用語「人工」とは、天然に存在しないことを意味する。例えば、イントロン配列が、ポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターを含むヌクレオチド配列などの組換えヌクレオチド配列で修飾され（例えば、置換、挿入、連結、または隣接され）、その修飾された配列が天然に存在することが見出されていない場合、それは人工的であると見なされ得る。人工イントロン配列の非限定的な例として、５’から３’方向に向かって、スプライスドナー配列、異種プロモーター（例えば、昆虫細胞コンピテントプロモーターまたはＰＨプロモーターなどの強力なプロモーター）、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列を有するイントロンが挙げられる。
【0017】
本明細書中で使用する場合、用語「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡ分子の終止コドンに対する３’領域を指す。３’ＵＴＲはタンパク質に翻訳されないが、ｍＲＮＡのポリアデニル化、局在化、安定化、及び／または翻訳効率に重要な調節配列が含まれている。３’ＵＴＲの調節配列には、エンハンサー、サイレンサー、ＡＵリッチエレメント、ポリＡテール、ターミネーター、マイクロＲＮＡ認識配列が含まれ得る。用語「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子の対応する領域を指す場合もある。
【0018】
本明細書中で使用する場合、用語「５’非翻訳領域」及び「５’ＵＴＲ」とは、開始コドンに対して５’であるｍＲＮＡ分子の領域を指す。この領域は、翻訳開始の調節に不可欠である。５’ＵＴＲは完全に翻訳されない場合もあれば、一部の生物でその領域の一部が翻訳される場合もある。転写開始部位は５’ＵＴＲの開始を示し、開始コドンの１ヌクレオチド前で終了する。真核生物では、５’ＵＴＲには、ＡＵＧ開始コドンを含むＫｏｚａｋコンセンサス配列が含まれる。５’ＵＴＲには、翻訳の調節に重要な上流オープンリーディングフレームとしても知られるシス作用性調節エレメントが含まれる場合がある。この領域には、上流のＡＵＧコドン及び終止コドンも含まれる場合がある。その高いＧＣ含有量を考えると、５’ＵＴＲは、翻訳の調節に役割を果たすヘアピンループなどの二次構造を形成し得る。
【0019】
本明細書中で使用する場合、用語「バキュロウイルス」及び「バキュロウイルス」とは、節足動物、鱗翅目、膜翅目、双翅目、及び十脚目に感染することが知られているバキュロウイルス科ウイルスの二本鎖ＤＮＡウイルスを指す。これらの用語は、野生型または組換えバキュロウイルスゲノム、ウイルス粒子（例えば、ビリオン）、及び／またはバキュロウイルス由来のＤＮＡまたはタンパク質を指し得る。天然に存在するバキュロウイルスは、主に無脊椎動物（例えば、昆虫）を標的とすることが知られており、細胞培養で哺乳動物細胞に侵入する能力があるにもかかわらず、そこで天然では複製することができない。
【0020】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞型」とは、遺伝子発現データに基づいて統計的に分離可能な表現型を共有する細胞群を指す。例えば、一般的な細胞型の細胞は、同様の構造的特徴及び／または機能的特徴、例えば、同様の遺伝子活性化パターン及び抗原提示特性を共有している場合がある。一般的な細胞型の細胞には、一般的な生物（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞）、一般的な組織（例えば、上皮組織、神経組織、結合組織、または筋肉組織）及び／または一般的な臓器、組織系、血管、または生物内の他の構造及び／または領域から分離された細胞が含まれ得る。
【0021】
本明細書中で使用する場合、用語「保存的変異」、「保存的置換」、及び「保存的アミノ酸置換」とは、１つ以上のアミノ酸から、極性、静電荷、及び立体体積などの同様の物理化学的特性を示す１つ以上の異なるアミノ酸への置換を指す。
【0022】
本明細書中で使用する場合、用語「発現する」とは、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からの転写によるＲＮＡ一次転写産物の産生；（２）ＲＮＡ転写産物から成熟ｍＲＮＡへのプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシング）；（３）ｍＲＮＡからポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【0023】
本明細書中で使用する場合、用語「エクソン」とは、スプライシング後に成熟ｍＲＮＡにおいて保存されている遺伝子の領域を指す（例えば、５’ＵＴＲ）。一次ＲＮＡ転写産物には、エクソンとイントロンの両方が含まれる。さらにイントロンがスプライシングされて除かれ、一次転写産物の処理後、成熟ｍＲＮＡにはエクソンのみが含まれている。いくつかのエクソンの配列がタンパク質に翻訳され、その場合、エクソンの配列がタンパク質のアミノ酸組成を決定する。成熟ｍＲＮＡに含まれるいくつかのエクソンは非コード性であり得る（例えば、５’及び／または３’ＵＴＲ）。
【0024】
本明細書中で使用する場合、用語「イントロン」とは、そのヌクレオチド配列が切り出されるか、またはｍＲＮＡ成熟中にスプライシングされる遺伝子の領域を指す。用語イントロンはまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域も指す。イントロンはエクソンと一緒に一次ＲＮＡ転写産物に転写されるが、スプライシングによってさらに除去され、成熟ｍＲＮＡには含まれない。２種類のスプライシング機構：１）核内低分子リボ核タンパク質によって支援されるスプライソソームプロセス；及び２．）自己スプライシングが知られている。スプライソソームスプライシングの対象となるイントロンには、通常、５’スプライスドナー部位と、分岐点及びポリピリミジントラクトなどの他の調節配列とともにイントロンの３’末端にあるスプライスアクセプター部位が含まれる。本明細書中で使用する場合、用語「イントロン」とはまた、スプライソソームによる認識の標的とされる、スプライスドナー配列、アクセプター配列、分岐点、及びポリピリミジントラクトなどの調節配列を、宿主細胞内で発現させるＤＮＡ構築物へ挿入することによって構築される人工イントロン（例えば、非天然に存在する）を指し得る。人工イントロンの非限定的な例として、５’から３’方向に向かって、５’スプライスドナー部位、スプライシングの標的となる配列（例えば、ポリヘドリンプロモーター配列などの異種プロモーター配列）、分岐点、ポリピリミジントラクト、及び３’スプライスアクセプター部位を有するヌクレオチド配列が挙げられる。
【0025】
本明細書中で使用する場合、用語「異種」とは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に通常含まれず、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）内で通常発現せず、及び／または天然には通常存在が見出されない核酸配列を指す。本明細書中で使用する場合、異種核酸とは、例えば、プロモーター配列、人工イントロン、非コードエクソン、導入遺伝子、または任意の個々にもしくは組み合わせで関連する調節配列であり得る。さらに、用語「異種」とはまた、細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）において通常発現しない、及び／または天然には通常存在が見出されないタンパク質のアミノ酸配列を指し得る。
【0026】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主」及び「宿主細胞」とは、本明細書に記載のベクターによる感染が可能な任意の原核生物または真核生物（例えば、哺乳動物、無脊椎動物、細菌、及び鳥類など）を指す。これらの用語は、野生型宿主または本発明の組換えベクターに感染させた宿主を指し得る。
【0027】
本明細書中で使用する場合、用語「感染する」及び「感染」とは、ウイルス粒子（例えば、ビリオン）が宿主細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）に侵入して入り込むプロセスを指す。一般的に、このプロセスは、細胞接着、浸透、コーティング解除、複製、組み立て、及び放出を含むいくつかの段階に分けることができる。接着段階では、ウイルス粒子がウイルスキャプシドタンパク質を介して宿主の細胞表面受容体に結合する。受容体へ接着することにより、ウイルス粒子が、エンドサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、または宿主の細胞膜との融合によって内在化される浸透段階へと移行する。細胞内に入ると、ウイルス粒子はコーティングを解除する過程でキャプシドタンパク質を脱落させ、それによって宿主細胞内にゲノムを放出する。ウイルスが宿主細胞の細胞内で複製可能である場合、複製段階に移行し得る。この段階では、ウイルスゲノムが自身のＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのゲノムを複製し、このプロセスでは、ウイルスタンパク質の合成及び組み立てが必要になる場合がある。続く組み立て段階では、新しく合成されたウイルスタンパク質が新規ウイルス粒子（例えば、ビリオン）に組み立てられ、さらに翻訳後修飾を受ける場合がある。最終的な放出段階では、ウイルス粒子は、宿主細胞膜の一部を利用し、修飾することによってウイルスエンベロープを獲得する。この最終段階で、ウイルス粒子は細胞溶解によって宿主細胞から離脱する。
【0028】
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結された」とは、第２の分子に結合する第１の分子を指し、その場合、第１の分子が第２の分子の機能に影響を与えるように分子を配置する。２つの分子は、単一の切れ目のない分子の一部であってもよく、そうでなくてもよく、隣接していても、隣接していなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、そのプロモーターは転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。さらに、転写調節エレメントの２つの部分は、一方の部分の転写活性化機能が他方の部分の存在により悪影響を受けないようにそれらが結合している場合、互いに作動可能に連結している。２つの転写調節エレメントは、リンカー核酸（例えば、介在非コード核酸）を介して互いに作動可能に連結してもよく、または介在ヌクレオチドが存在せずに互いに作動可能に連結してもよい。非限定的な例として、一次ＲＮＡ転写産物または前記転写産物をコードするＤＮＡ配列中のエクソンとイントロンは、エクソンがイントロンのスプライシングを促進する場合、互いに作動可能に連結させてもよい。
【0029】
本明細書中で使用する場合、用語「モノシストロン性」とは、単一のタンパク質またはポリペプチド産物のコード配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物を指す。
【0030】
本明細書中で使用する場合、用語「プラスミド」とは、追加のＤＮＡセグメントを挿入（例えば、ライゲート）し得る染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドとは、ベクターのタイプであり、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌プラスミド及びエピソーム性プラスミド）。他のプラスミド（例えば、非エピソーム性ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。
【0031】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリシストロン性」とは、少なくとも２つのタンパク質またはポリペプチド産物のコード配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物を指す。
【0032】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリピリミジントラクト」とは、スプライスアクセプター部位の約５～４０ヌクレオチド上流（例えば５’）に位置し、一般的に１５～２０ピリミジンヌクレオチド（例えば、Ｃ及びＴ／Ｕ）を含む、イントロンの領域を指す。ポリピリミジントラクトは、スプライソソームの組織化を促進することにより、スプライシング中に機能する。
【0033】
本明細書中で使用する場合、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは、導入遺伝子の転写を促進する。プロモーターは、「哺乳動物細胞コンピテントプロモーター」であってもよく、これは、プロモーターが哺乳動物細胞内で遺伝子発現を駆動することができることを意味する。哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、哺乳動物細胞のみで駆動可能である場合もあれば、哺乳動物細胞及び他の細胞型で駆動可能である場合もある。プロモーターはまた、「昆虫細胞コンピテントプロモーター」であってもよく、これは、プロモーターが昆虫細胞内で遺伝子発現を駆動することができることを意味する。昆虫細胞コンピテントプロモーターは、昆虫細胞のみで駆動可能である場合もあれば、昆虫細胞及び他の細胞型で駆動可能である場合もある。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び／またはシグマ因子に対する親和性、転写開始の速度、及び転写レベルに応じて、強力なプロモーターまたは弱いプロモーターであってもよい。プロモーターの強度は、ＲＮＡポリメラーゼの理想的なコンセンサス配列に対するプロモーターヌクレオチド配列の類似性に関連している。強力なプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの頻繁かつ強力な結合、高レベルの転写、及びその結果として、その制御下での高レベルの転写産物を呈する。プロモーターの強度は、特定のレベルのＲＮＡ発現を有する特定の宿主細胞型内での、その制御下のＲＮＡ発現レベルを、参照プロモーター（例えば、アデノウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、またはヒト免疫不全ウイルスロングターミナルリピート（ＨＩＶ ＬＴＲ）プロモーターなど）と比較することによって決定し得る。導入遺伝子の発現を、特定の細胞型内の参照プロモーターによって駆動される発現レベル以上で駆動するプロモーターは、強力なプロモーターと見なされ得る。強力なプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ＥＦ１－αプロモーター、及びＣＡＧプロモーター、ＰＨプロモーター、及びＡｃ５プロモーターが挙げられる。弱いプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのまれな及び／または弱い結合、低レベルの転写、及びその結果として、その制御下での低レベルの転写産物を呈する。弱いプロモーターの非限定的な例として、ユビキチンＣプロモーター及びホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーターが挙げられる。さらに、用語「プロモーター」は、生物系では天然に存在しない調節ＤＮＡ配列である合成プロモーターを指す場合がある。合成プロモーターには、天然には存在しないポリヌクレオチド配列と組み合わせた天然プロモーターの一部が含まれ、多くの場合、様々な導入遺伝子、ベクター、及び標的細胞型を用いて組換えＤＮＡを発現するように最適化され得る。当業者であれば、プロモーターの強度が、プロモーターが活性である特定の細胞型、組織、及び生物に依存し得ることを理解するであろう。
【0034】
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を達成した後、参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列内の核酸またはアミノ酸と同一である候補配列内の核酸またはアミノ酸の割合と定義される。核酸またはアミノ酸配列同一性の割合を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の能力の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較している配列の全長にわたる最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性の割合の値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成してもよい。実例として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれに対しての配列同一性の割合（あるいは、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれに対しての特定の割合の配列同一性を有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢとのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性の割合は、Ａに対するＢの配列同一性の割合と等しくないと考えられる。
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢとのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性の割合は、Ａに対するＢの配列同一性の割合と等しくないと考えられる。
【0035】
本明細書中で使用する場合、用語「調節配列」には、遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されており；参照により本明細書に援用される。
【0036】
本明細書中で使用する場合、用語「選択可能なマーカー」及び「選択可能なマーカー遺伝子」とは、細胞の選択を容易にするために細胞に導入される遺伝子を指す。例えば、１つ以上の選択可能なマーカーを本明細書に記載の組換えベクターに導入して、ベクターを含む細胞を選択できるようにしてもよい。選択可能なマーカーは、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはノーセオトリシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子であり得る。
【0037】
本明細書中で使用する場合、用語「スプライスアクセプター配列」または「スプライスアクセプター部位」とは、一次転写産物からイントロンをスプライシングするために必要なイントロンの３’末端にあるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。スプライスアクセプター配列は、通常、不変のＡＧ配列で終結する。
【0038】
本明細書中で使用する場合、用語「スプライス分岐点」とは、一次転写産物からイントロンをスプライシングするために必要なアデニンヌクレオチドを含むイントロンの領域を指す。スプライス分岐点は、スプライシング中にイントロン内で生じるラリアット形成に重要である。スプライス分岐点は、通常、スプライスアクセプター配列の上流（例えば、５’）の２０～５０ヌクレオチド以内に配置される。
【0039】
本明細書中で使用する場合、用語「スプライスドナー配列」または「スプライスドナー部位」とは、一次転写産物からイントロンをスプライシングするために必要なイントロンの５’末端にあるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を指す。スプライスドナー配列は、通常、イントロンの５’末端にある不変のＧＵ配列である。
【0040】
本明細書中で使用する場合、用語「ターミネーター」及び「ターミネーター配列」とは、転写ユニット（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の末端をマークし、転写タンパク質のアンサンブルからの新規合成ＲＮＡの遊離を開始させるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を指す。ターミネーターは、目的の遺伝子の下流（例えば、３’）かつ３’調節エレメントの下流にある。ターミネーター配列は、ＲＮＡ分子の半減期に寄与し、その結果、遺伝子発現のレベルに寄与する。
【0041】
本明細書中で使用する場合、用語「形質移入」とは、原核生物または真核生物の宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される任意の多種多様な技術、例えば、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン形質移入法、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、スクイーズポレーション、ソノポレーション、光学形質移入法、Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ、インパレフェクションなどを指す。
【0042】
本明細書中で使用する場合、用語「形質導入」及び「形質導入する」とは、ベクター構築物またはその一部を細胞に導入する方法を指す。ベクター構築物が、例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターに含まれる場合、形質導入とは、細胞のウイルス感染、及びその後のベクター構築物またはその一部の細胞ゲノムへの移入及び／または組み込みを指す。
【0043】
本明細書中で使用する場合、用語「導入遺伝子」とは、遺伝子産物（例えば、組換えタンパク質）をコードする組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質であってもよい。遺伝子産物のコード領域に加えて、導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー（複数可）、不安定化ドメイン（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インシュレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）及び／または他の機能エレメントなどの発現を促進または増強するための１つ以上のエレメントを含むか、またはそれらに作動可能に連結され得る。本開示の実施形態は、任意の既知の適切なプロモーター、エンハンサー（複数可）、不安定化ドメイン（複数可）、応答エレメント（複数可）、レポーターエレメント（複数可）、インシュレーターエレメント（複数可）、ポリアデニル化シグナル（複数可）、及び／または他の機能エレメントを利用してもよい。
【0044】
本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」には、核酸を移入するための生物学的ビヒクル、例えば、プラスミドなどのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスまたは他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）が含まれる。外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核生物または真核生物の細胞に送達するために、様々なベクターが開発されてきた。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、及び、例えば、タンパク質の発現及び／または細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の組み込みに使用する追加の配列エレメントを含み得る。本明細書に記載の導入遺伝子の発現に使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター及びエンハンサー領域などの調節配列を含むベクターが含まれる。組換え遺伝子の発現に有用な他のベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を向上させるポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、発現ベクター上に組み込まれた遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’及び３’非翻訳領域ならびにポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するための１つ以上のマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの非限定的な例として、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ノーセオトリシン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ゼオシン、ストレプトマイシン、またはスペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。用語「ベクター」とは、シャトルベクターまたは導入ベクターを指し得る。シャトルベクターは、プラスミドなどのベクターの一種であり、２つの異なる宿主種において増殖できるように構築されているため、２つ以上の異なる細胞型での操作が容易になる。シャトルベクターは、第２の宿主細胞型（例えば、昆虫または哺乳動物細胞）で発現させるために、第１の宿主細胞型（例えば、大腸菌細胞）内で異種遺伝子を増幅させるために使用し得る。導入ベクターは、標的細胞に送達するための異種核酸配列を組み込んだプラスミドなどのベクターである。
【0045】
本明細書中で使用する場合、用語「野生型」とは、所与の生物における特定の遺伝子について最も出現頻度が高い遺伝子型を指す。
【0046】
詳細な説明
本明細書において、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現を可能にする組成物及び方法を記載する。本発明は、複数の宿主細胞型（例えば、哺乳動物細胞及び昆虫細胞）内でタンパク質を発現させるための単一または複数の遺伝子の挿入に対応する組換え導入ベクター（例えば、プラスミド）に基づく。ベクターは、哺乳動物細胞と昆虫細胞の両方でタンパク質発現を促進することができる組換えウイルス粒子の調製を容易にする。そのようなウイルス粒子を、本発明の方法に従って使用して、細胞をウイルスに感染させ、組換えタンパク質を産生可能にする条件下で宿主細胞を感染させてもよい。さらに、本発明のベクターを使用して、ベクターを侵入させ、その後に組換えタンパク質を発現させることを可能にする条件下で、細胞をベクターと接触させることにより、宿主細胞内でのタンパク質発現を一時的に駆動することができる。
本明細書において、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現を可能にする組成物及び方法を記載する。本発明は、複数の宿主細胞型（例えば、哺乳動物細胞及び昆虫細胞）内でタンパク質を発現させるための単一または複数の遺伝子の挿入に対応する組換え導入ベクター（例えば、プラスミド）に基づく。ベクターは、哺乳動物細胞と昆虫細胞の両方でタンパク質発現を促進することができる組換えウイルス粒子の調製を容易にする。そのようなウイルス粒子を、本発明の方法に従って使用して、細胞をウイルスに感染させ、組換えタンパク質を産生可能にする条件下で宿主細胞を感染させてもよい。さらに、本発明のベクターを使用して、ベクターを侵入させ、その後に組換えタンパク質を発現させることを可能にする条件下で、細胞をベクターと接触させることにより、宿主細胞内でのタンパク質発現を一時的に駆動することができる。
【0047】
本発明は、昆虫細胞コンピテントプロモーター及び哺乳動物細胞コンピテントプロモーター（いずれも目的の導入遺伝子の上流（例えば５’）に配置され、カセット内で同じ方向に配向される）の下流（例えば３’）に目的の導入遺伝子が挿入される発現カセットを含む導入ベクターを提供することにより、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の両方において組換えタンパク質の発現を促進する。昆虫細胞コンピテントプロモーターは、昆虫細胞で導入遺伝子の発現を駆動し、哺乳動物細胞では駆動せず、一方、哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、哺乳動物細胞で導入遺伝子の発現を駆動し、昆虫細胞では駆動しない。そのようなベクターは、宿主細胞において２つの異なる誘導性プロモーターによって遺伝子発現を示差的に制御することを可能にする。
【0048】
さらに、本発明のベクターで利用されるプロモーター構成はユニークであり、両方の宿主細胞型内での効率的な遺伝子発現を促進する。具体的には、ベクターデザインは、昆虫細胞コンピテントプロモーターを、非コードエクソン（例えば、非コードミニエクソン）のすぐ下流（例えば、３’）の人工イントロンに配置し、次いでこれを、哺乳動物の細胞コンピテントプロモーターのすぐ下流に配置することを特徴とする。この構成により、昆虫細胞における導入遺伝子の発現を、哺乳動物細胞コンピテントプロモーターからの干渉を受けることなく、昆虫細胞コンピテントプロモーターによって直接調節することができる。哺乳動物細胞内で哺乳動物細胞コンピテントプロモーターから生成される転写産物には、人工イントロンへの挿入の結果として、ＲＮＡスプライシング中に除去される昆虫細胞コンピテントプロモーターが含まれる。このベクターデザインにより、昆虫細胞のコンピテントプロモーターが哺乳動物細胞の翻訳に干渉しないことが保証される。
【0049】
１つの特定のベクターデザインでは、昆虫細胞コンピテントプロモーターを含む人工イントロンは、その５’末端にスプライスドナー配列を有する昆虫細胞コンピテントプロモーター、さらに５’から３’方向に向かって、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、そして、その３’末端にスプライスアクセプター配列を隣接させることによって作成される。哺乳動物細胞及び昆虫細胞内で発現させるために選択した導入遺伝子を、昆虫細胞コンピテントプロモーターの下流に配置し、導入遺伝子には、その５’末端にＫｏｚａｋ配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、ならびにその３’末端に、５’から３’方向に向かって、終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及びエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリＡテールなどを含むがこれらに限定されない任意選択の調節配列を隣接させる。本発明のベクターはまた、抗生物質耐性遺伝子、及び転座エレメントなどの１つ以上の選択可能なマーカーをコードする核酸配列、ならびに複製起点配列を含み得る。
【0050】
イントロン配列エレメント
本発明のベクターは、カセット内で同じ方向に向けられた２つのプロモーターを使用して、単一の発現カセットからの単一または複数の導入遺伝子の発現を可能にする。第１のプロモーターは、例えば、哺乳動物細胞においてのみ活性であり得（例えば、哺乳動物細胞コンピテントプロモーター）、一方、第２のプロモーターは、例えば、昆虫細胞においてのみ活性であり得る（例えば、昆虫細胞コンピテントプロモーター）。哺乳動物細胞に導入する場合、このベクターから生成される一次転写産物は、第１のプロモーターによって駆動され、転写産物内に第２のプロモーターを含んでいる。第２のプロモーター内に非生産的開始コドン及び／または未成熟終止コドンが潜在的に存在することに起因する翻訳干渉を回避するために、本発明は、スプライシング事象によって一次転写産物から第２のプロモーターを除去するためのベクター内の人工イントロン配列エレメントを提供する。具体的には、本明細書に記載の組換えベクターには、細胞内でベクターが転写されるとスプライシングされ得る人工イントロンに、第２のプロモーターが組み込まれている。人工イントロンは、その５’末端にスプライスドナー配列、そしてその３’末端に、５’から３’方向に向かって、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列が隣接する第２のプロモーターを含む。人工イントロンのすぐ上流かつ第１のプロモーターのすぐ下流に、人工イントロンからのスプライシングを促進する非コードエクソン（例えば、非コードミニエクソン）が配置される。非コードエクソンは、調節エレメントまたはＡＵＧ開始コドンを含まない任意の核酸配列を含み得る。非コードエクソン内に含まれ得る配列として、例えば、Ｋｏｚａｋ配列が挙げられる。非コードエクソンはタンパク質に翻訳されず、本明細書に記載のベクターの発現カセットにおける導入遺伝子のタンパク質翻訳にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない。本発明のベクターに関して、ＲＮＡスプライシングによるイントロンの除去を容易にするために、非コードエクソンを人工イントロンの上流に配置する。
本発明のベクターは、カセット内で同じ方向に向けられた２つのプロモーターを使用して、単一の発現カセットからの単一または複数の導入遺伝子の発現を可能にする。第１のプロモーターは、例えば、哺乳動物細胞においてのみ活性であり得（例えば、哺乳動物細胞コンピテントプロモーター）、一方、第２のプロモーターは、例えば、昆虫細胞においてのみ活性であり得る（例えば、昆虫細胞コンピテントプロモーター）。哺乳動物細胞に導入する場合、このベクターから生成される一次転写産物は、第１のプロモーターによって駆動され、転写産物内に第２のプロモーターを含んでいる。第２のプロモーター内に非生産的開始コドン及び／または未成熟終止コドンが潜在的に存在することに起因する翻訳干渉を回避するために、本発明は、スプライシング事象によって一次転写産物から第２のプロモーターを除去するためのベクター内の人工イントロン配列エレメントを提供する。具体的には、本明細書に記載の組換えベクターには、細胞内でベクターが転写されるとスプライシングされ得る人工イントロンに、第２のプロモーターが組み込まれている。人工イントロンは、その５’末端にスプライスドナー配列、そしてその３’末端に、５’から３’方向に向かって、スプライス分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプター配列が隣接する第２のプロモーターを含む。人工イントロンのすぐ上流かつ第１のプロモーターのすぐ下流に、人工イントロンからのスプライシングを促進する非コードエクソン（例えば、非コードミニエクソン）が配置される。非コードエクソンは、調節エレメントまたはＡＵＧ開始コドンを含まない任意の核酸配列を含み得る。非コードエクソン内に含まれ得る配列として、例えば、Ｋｏｚａｋ配列が挙げられる。非コードエクソンはタンパク質に翻訳されず、本明細書に記載のベクターの発現カセットにおける導入遺伝子のタンパク質翻訳にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない。本発明のベクターに関して、ＲＮＡスプライシングによるイントロンの除去を容易にするために、非コードエクソンを人工イントロンの上流に配置する。
【0051】
プロモーター
本発明のベクターは、単一の発現カセット内に、目的の単一または複数の導入遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結された昆虫細胞コンピテントプロモーター配列及び哺乳動物細胞コンピテントプロモーター配列を含む。哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼタンパク質に結合し、哺乳動物細胞でのみ遺伝子の転写を駆動することができる。逆に、昆虫細胞コンピテントプロモーターは、昆虫細胞でのみ遺伝子発現を制御することができる。
本発明のベクターは、単一の発現カセット内に、目的の単一または複数の導入遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結された昆虫細胞コンピテントプロモーター配列及び哺乳動物細胞コンピテントプロモーター配列を含む。哺乳動物細胞コンピテントプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼタンパク質に結合し、哺乳動物細胞でのみ遺伝子の転写を駆動することができる。逆に、昆虫細胞コンピテントプロモーターは、昆虫細胞でのみ遺伝子発現を制御することができる。
【0052】
例示的な哺乳動物細胞コンピテントプロモーターとして、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、伸長因子１（ＥＦ１－α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモーター、β－アクチンプロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ｅＩＦ４Ａ１）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルスロングターミナルリピート（ＨＩＶ ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどが挙げられる。
【0053】
昆虫細胞コンピテントプロモーターの非限定的な例として、ポリヘドリン（ＰＨ）プロモーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｐ９プロモーター、ｐ１０プロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－１（ＯｐＩＥ１）プロモーター、オルジイア・シュードツガタ・マルチキャプシド核多角体病ウイルス最初期－２（ＯｐＩＥ２）プロモーター、最初期０（ＩＥ０）プロモーターなどが挙げられる。例示的な昆虫細胞コンピテントプロモーターは、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６５（１）：１１－１７（２０１３）に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。当業者であれば、他の哺乳動物細胞コンピテントプロモーター及び昆虫細胞コンピテントプロモーターもまた、本発明での使用に適し得ることを認識するであろう。
【0054】
本発明と組み合わせて使用することに適したプロモーターは、強力なプロモーターであってもよい。プロモーターの強度は、ＲＮＡポリメラーゼに対する親和性、転写開始の速度、及び一次転写産物の発現レベルに基づいて分類される。強力なプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１－αプロモーター、及びＣＡＧプロモーター、ＰＨプロモーター、Ａｃ５プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーターが挙げられる。あるいは、本発明は、当技術分野で確立されており、周知である、弱いプロモーターを使用してもよい。
【0055】
導入遺伝子の発現
本明細書に記載のベクターを使用して、目的の１つ以上（例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子を宿主細胞（例えば、昆虫細胞及び／または哺乳動物細胞）に送達し、発現させてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、単一の導入遺伝子を発現させるためのモノシストロン性発現カセットを含む。したがって、本明細書に記載のベクターは、５’に開始コドン及び５’ＵＴＲが隣接し、３’末端に終止コドン及び３’ＵＴＲが隣接している目的の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明の単一のベクターからのポリシストロン性発現カセットにおける２つ以上（例えば、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子の発現を対象とした用途では、２つ以上の導入遺伝子を、２Ａ自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ自己切断ペプチド）をコードする１つ以上（例えば、１、２、３個、またはそれ以上）の核酸配列によって分離してもよい。ポリシストロン性発現カセットで使用するための２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列の例示的な使用方法は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（１）：２１９３（２０１７）に記載されており、その開示はその全体が参照により援用される。本発明のベクターへの２Ａ自己切断ペプチドコード配列の組み込みは、当業者に周知の方法に従って実施し得る。
本明細書に記載のベクターを使用して、目的の１つ以上（例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子を宿主細胞（例えば、昆虫細胞及び／または哺乳動物細胞）に送達し、発現させてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、単一の導入遺伝子を発現させるためのモノシストロン性発現カセットを含む。したがって、本明細書に記載のベクターは、５’に開始コドン及び５’ＵＴＲが隣接し、３’末端に終止コドン及び３’ＵＴＲが隣接している目的の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明の単一のベクターからのポリシストロン性発現カセットにおける２つ以上（例えば、２、３、４個、またはそれ以上）の導入遺伝子の発現を対象とした用途では、２つ以上の導入遺伝子を、２Ａ自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ自己切断ペプチド）をコードする１つ以上（例えば、１、２、３個、またはそれ以上）の核酸配列によって分離してもよい。ポリシストロン性発現カセットで使用するための２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列の例示的な使用方法は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（１）：２１９３（２０１７）に記載されており、その開示はその全体が参照により援用される。本発明のベクターへの２Ａ自己切断ペプチドコード配列の組み込みは、当業者に周知の方法に従って実施し得る。
【0056】
目的の導入遺伝子は、昆虫細胞及び哺乳動物細胞での発現に適したタンパク質をコードしていてもよい。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載のベクターに関して異種である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞に対して異種である。一般的に、限定されないが、導入遺伝子は、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、シンターゼ、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ、デアミナーゼ、サイトカイン、ユビキチナーゼ、脱ユビキチナーゼ、膜貫通受容体、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、Ｅ３－リガーゼ、分泌タンパク質、細胞骨格タンパク質、オキシダーゼ、レダクターゼ、及びタンパク質－タンパク質相互作用標的などを含むタンパク質クラスに属するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、膜タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、膜受容体、輸送タンパク質、膜酵素、及び／または細胞接着タンパク質である。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、核内受容体、イオンチャネル、及び／またはＡＴＰ結合カセット薬物輸送体などである。本発明のベクターと共に使用するのに適した導入遺伝子はまた、クロマチンリモデリングタンパク質、抗菌タンパク質、及び／またはユビキチンリガーゼタンパク質をコードし得る。本発明での使用に適した導入遺伝子はまた、例えば、マルトース結合タンパク質タグ、ＳＮＡＰタグ、ＦＬＡＧタグ、６×Ｈｉｓタグ、ＨａｌｏＴａｇ、及び蛍光タンパク質タグなどのタンパク質タグを含み得る。本発明のベクターと共に使用するための導入遺伝子の他の例として、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ融合タンパク質、キメラ抗体などのキメラタンパク質が挙げられる。
【0057】
本明細書に記載のベクターと共に使用するのに適した導入遺伝子はまた、タンパク質発現を駆動するベクターの有効性の判定に有用なレポーター遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、及びβ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などである。当業者であれば、他のレポーター遺伝子が本発明と組み合わせて使用するのに適し得ることを理解するであろう。
【0058】
本明細書に記載のベクターを介した発現に適した導入遺伝子は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立して機能することができるタンパク質ドメインをコードし得る。そのようなタンパク質ドメインは、分子シャペロンの助けを借りて、または助けを借りずに、安定した三次元構造に組織化し得る。タンパク質ドメインは、５０～２５０アミノ酸の範囲を含むがこれらに限定されない様々な長さを有し得る。タンパク質ドメインの鎖長の詳細な説明については、例えば、その開示が参照により本明細書に援用されるＸｕ ｅｔ ａｌ． Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ３（１）：１１－７（１９９８）を参照されたい。タンパク質ドメインの非限定的な例として、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、結合パートナー結合ドメイン、デアミナーゼドメイン、イオン結合ドメイン（例えば、Ｃａ２＋結合ドメイン、Ｍｇ２＋結合ドメインなど）、ヌクレオチド結合ドメイン、調節ドメイン、局在化ドメイン、キナーゼドメイン、ホスファターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、トランスフェラーゼドメイン、トランスポータードメイン、阻害剤ドメイン、アクチベータードメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、薬物結合ドメイン、抗体断片結晶化可能ドメイン、抗体可変ドメイン、免疫グロブリンドメイン、抗体様ドメイン、リンカードメイン、触媒ドメイン、塩基性ロイシンジッパードメイン、カドヘリンリピートドメイン、ＮＬＲＰ３ドメイン（例えば、ＮＡＣＨＴドメイン、ＬＲＲドメイン、及び／またはＰＹＤドメイン）、フィブロネクチンドメイン、ＭＨＣクラスＩタンパク質ドメイン、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質ドメイン、デスエフェクタードメイン、ＥＦハンドドメイン、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、Ｓｒｃ相同２ドメイン、及びＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２ Ｚ－ＤＮＡ結合ドメインまたはデアミナーゼドメインなどが挙げられる。当業者であれば、タンパク質ドメインがそれらのタンパク質鎖の残りの部分とは独立して機能することができる限り、タンパク質ドメインをコードする他の導入遺伝子もまた、本発明と組み合わせて使用し得ることを理解するであろう。
【0059】
本明細書に記載のベクターを使用する発現に適した導入遺伝子は、野生型タンパク質及び／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、導入遺伝子は、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、野生型ポリペプチドと比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または１０個以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または１０個以上の保存的アミノ酸置換）を含むタンパク質及び／またはポリペプチドをコードするポリペプチドを含み得る。
【0060】
本明細書に記載のベクターを介した発現に適した導入遺伝子はまた、目的のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドをコードし得る。
【0061】
本明細書に記載のベクターを介した発現に適した導入遺伝子はまた、新規治療薬の同定及び開発、細胞ベースの機能アッセイのための組換えタンパク質発現、ならびに結晶学用途のためのタンパク質生産を含むがこれらに限定されない様々な用途において有用なタンパク質、タンパク質ドメイン、またはポリペプチドをコードし得る。
【0062】
調節エレメント
調節エレメントは、宿主細胞内での核酸分子の侵入、複製、及び／または発現を促進するために使用する送達ビヒクルの成分である。調節エレメントは、ウイルス調節エレメントであってもよく、任意選択で、バキュロウイルス調節エレメントであってもよい。例えば、ウイルス調節エレメントは、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ１）転写エンハンサーであり得る。調節エレメントの他の非限定的な例として、Ｔｎ７Ｌプロモーター及びターミネーター、Ｔｎ７Ｒプロモーター及びターミネーター、３９Ｋプロモーター、ＩＥ１ターミネーター、Ｔ７ターミネーターなどが挙げられる。バキュロウイルス調節エレメントは、バキュロウイルス由来であってもよく、他のゲノム領域から同定された異種配列であってもよい。当業者はまた、他のウイルス調節エレメントが同定された場合、これらを本明細書に記載の核酸分子と共に使用し得ることを理解するであろう。
調節エレメントは、宿主細胞内での核酸分子の侵入、複製、及び／または発現を促進するために使用する送達ビヒクルの成分である。調節エレメントは、ウイルス調節エレメントであってもよく、任意選択で、バキュロウイルス調節エレメントであってもよい。例えば、ウイルス調節エレメントは、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ１）転写エンハンサーであり得る。調節エレメントの他の非限定的な例として、Ｔｎ７Ｌプロモーター及びターミネーター、Ｔｎ７Ｒプロモーター及びターミネーター、３９Ｋプロモーター、ＩＥ１ターミネーター、Ｔ７ターミネーターなどが挙げられる。バキュロウイルス調節エレメントは、バキュロウイルス由来であってもよく、他のゲノム領域から同定された異種配列であってもよい。当業者はまた、他のウイルス調節エレメントが同定された場合、これらを本明細書に記載の核酸分子と共に使用し得ることを理解するであろう。
【0063】
本発明のベクターは、宿主細胞（例えば、細菌細胞、無脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞）内でベクターの複製を可能にする複製起点（ｏｒｉ）配列を含み得る。例示的な細菌ｏｒｉ配列として、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２及びｐ１５Ａ ｏｒｉ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のベクターは、当技術分野で周知の技術を使用して複製してもよい。
【0064】
本発明のベクターは、転写及び／または翻訳を指示し、調節することができる５’及び３’ＵＴＲ配列をさらに含み得る。５’ＵＴＲは、転写及び／または翻訳の制御に重要な調節核酸配列を含み得る。そのような配列は、ポリアデニル化、翻訳効率、ならびにｍＲＮＡの局在及び安定性を調節し得る。３’ＵＴＲ調節配列の非限定的な例として、エンハンサー、ターミネーター（例えば、ＩＥ１ターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター）、サイレンサー、ＡＵリッチエレメント、マイクロＲＮＡ認識エレメントが挙げられる。３’ＵＴＲエンハンサーの非限定的な例として、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）エンハンサーが挙げられる。３’ＵＴＲターミネーター配列の非限定的な例として、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネーターが挙げられる。本発明のベクターは、単一のプロモーターからの複数のポリペプチドの発現を促進する２Ａ自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
【0065】
選択可能なマーカー
本発明での使用に適したベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子などの１つ以上の選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含み得る。本明細書に記載のベクターと共に使用するのに適したマーカーの例は、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、カナマイシン、ノーセオトリシン、テトラサイクリン、ゼオシン、ストレプトマイシン、及びスペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。当業者であれば、他の選択可能なマーカーもまた本発明と組み合わせて使用し得ることを認識するであろう。
本発明での使用に適したベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子などの１つ以上の選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含み得る。本明細書に記載のベクターと共に使用するのに適したマーカーの例は、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、カナマイシン、ノーセオトリシン、テトラサイクリン、ゼオシン、ストレプトマイシン、及びスペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。当業者であれば、他の選択可能なマーカーもまた本発明と組み合わせて使用し得ることを認識するであろう。
【0066】
転座配列
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した組換えベクターはまた、導入遺伝子及び関連する配列のベクターへの挿入に重要な転座配列（例えば、転座部位）を含み得る。転座部位の非限定的な例として、トランスポゾン７（Ｔｎ７）Ｔｎ７Ｒ及びＴｎ７Ｌ配列が挙げられる。当業者であれば、本発明の範囲内で他の転座配列を使用し得ることを理解するであろう。
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した組換えベクターはまた、導入遺伝子及び関連する配列のベクターへの挿入に重要な転座配列（例えば、転座部位）を含み得る。転座部位の非限定的な例として、トランスポゾン７（Ｔｎ７）Ｔｎ７Ｒ及びＴｎ７Ｌ配列が挙げられる。当業者であれば、本発明の範囲内で他の転座配列を使用し得ることを理解するであろう。
【0067】
バキュロウイルス
本発明の組換えベクターは、哺乳動物細胞及び昆虫細胞の両方で組換えタンパク質を発現することができるウイルス粒子の産生を促進するように、またはウイルスの産生を必要とせずにベクター（例えば、プラスミド）から直接一過性のタンパク質発現を可能にするような方法で使用することができる。
本発明の組換えベクターは、哺乳動物細胞及び昆虫細胞の両方で組換えタンパク質を発現することができるウイルス粒子の産生を促進するように、またはウイルスの産生を必要とせずにベクター（例えば、プラスミド）から直接一過性のタンパク質発現を可能にするような方法で使用することができる。
【0068】
本発明で使用するための組換えベクターは、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス、オルジイア・シュードツガタ単核多角体病ウイルス、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）単核多角体病ウイルス、ヘリオスチス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｔｈｉｓ ｚｅａ）バキュロウイルス、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）バキュロウイルス、クリプトフレビア・ロイコトレタ（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｌｅｂｉａ ｌｅｕｃｏｔｒｅｔａ）顆粒病ウイルス、ウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）型バキュロウイルス、ノシメマダラメイガ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）顆粒病ウイルス、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）核多角体病ウイルス、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス、またはブズラ・スプレッサリア（Ｂｕｚｕｒａ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａ）核多角体病ウイルスを含むがこれらに限定されない様々なウイルスゲノムに基づき得る。異種遺伝子エレメントで修飾されたバキュロウイルスの産生手順は当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８８：１８３－９０（１９９７），Ｃｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：６７５９－６２，（１９９４）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0069】
宿主細胞
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用し得る細胞として、本発明の組換えベクターから導入遺伝子を発現することができる細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用することができる１つのタイプの細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の非限定的な例として、初代細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはブタの初代細胞など）またはヒト、マウス、ラット、ブタ、もしくは他の哺乳動物に由来する細胞株が挙げられる。本発明と共に使用するための哺乳動物細胞は、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、平滑筋、膵臓、腸、骨、神経系、血液、結合組織、脂肪、皮膚、子宮頸部、免疫細胞、腫瘍細胞、及び未分化組織などを含むがこれらに限定されない任意のタイプの組織から取得または誘導し得る。
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用し得る細胞として、本発明の組換えベクターから導入遺伝子を発現することができる細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用することができる１つのタイプの細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の非限定的な例として、初代細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはブタの初代細胞など）またはヒト、マウス、ラット、ブタ、もしくは他の哺乳動物に由来する細胞株が挙げられる。本発明と共に使用するための哺乳動物細胞は、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、平滑筋、膵臓、腸、骨、神経系、血液、結合組織、脂肪、皮膚、子宮頸部、免疫細胞、腫瘍細胞、及び未分化組織などを含むがこれらに限定されない任意のタイプの組織から取得または誘導し得る。
【0070】
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて使用することができる別のタイプの細胞は、昆虫細胞である。昆虫細胞発現系の一般的で非限定的な例として、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） ＳＦ９細胞、ｍｉｍｉｃ ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、イラクサギンウワバＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞としても知られる）、及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓ２細胞などが挙げられる。昆虫細胞は野生型昆虫細胞であってもよく、組換えタンパク質の発現のために遺伝子工学によって最適化されていてもよい。そのような最適化戦略は、特定の用途に望ましい特性を有する組換えタンパク質を生成するように調整してもよく、昆虫細胞のグリコシル化特性の改変、タンパク質発現レベルの最適化、形質移入及び／または形質導入戦略、投薬、ならびにタンパク質精製及び濃縮などを含み得る。昆虫宿主細胞の最適化戦略は、参照により本明細書に援用されるＧｏｗｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｔ．（２０１７，Ｎｅｗ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２．ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎに詳細に記載されている。本発明のベクターを使用する組換えタンパク質発現はまた、昆虫の幼虫で発現させるために調整してもよい。
【0071】
宿主細胞へのベクター送達の方法
本発明のベクターを宿主細胞に導入するために使用することができる技術は、当技術分野で周知である。例えば、電気穿孔法は、目的の細胞に静電ポテンシャルを印加することにより、標的細胞を透過性にするために使用することができる。このようにして外部電場にさらされた哺乳動物細胞または昆虫細胞などの標的細胞は、その後、外来性核酸を取り込みやすくなる。哺乳動物細胞の電気穿孔法は、例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、真核細胞の核への外来性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために印加する電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びこの技術を実施するのに有用なプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １４：３１５（２００５）、及びＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されており、それぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
本発明のベクターを宿主細胞に導入するために使用することができる技術は、当技術分野で周知である。例えば、電気穿孔法は、目的の細胞に静電ポテンシャルを印加することにより、標的細胞を透過性にするために使用することができる。このようにして外部電場にさらされた哺乳動物細胞または昆虫細胞などの標的細胞は、その後、外来性核酸を取り込みやすくなる。哺乳動物細胞の電気穿孔法は、例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、真核細胞の核への外来性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために印加する電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びこの技術を実施するのに有用なプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １４：３１５（２００５）、及びＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されており、それぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【0072】
標的細胞の形質移入に有用なさらなる技術は、スクイーズポレーション法である。この技術は、加えられたストレスに応答して形成される膜状の細孔を介した外来性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞などの細胞への核酸の送達にベクターを必要としないという点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ８１：ｅ５０９８０ （２０１３）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0073】
リポフェクションは、標的細胞の形質移入に有用な別の技術である。この方法は、リポソームへの核酸のローディングを含み、この方法は、多くの場合、第四級アミンまたはプロトン化アミンなどの陽イオン性官能基をリポソームの外部に向かって提示する。これにより、細胞膜の陰イオン性によってリポソームと細胞との間の静電相互作用が促進され、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接融合または複合体のエンドサイトーシスによって外来性核酸が取り込まれる。リポフェクションは、例えば、ＵＳ７，４４２，３８６に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に援用される。細胞膜とのイオン相互作用を利用して外来性核酸の取り込みを誘発する同様の技術は、細胞を陽イオン性ポリマー－核酸複合体と接触させることである。細胞膜との相互作用に有利な正電荷を与えるようにポリヌクレオチドと会合させる例示的な陽イオン性分子は、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ，Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２８：２２７（２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される）ポリエチレンイミン、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストランであり、形質移入剤としてのこれらの使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０：Ｉ：９．２：９．２．１（１９９７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。磁気ビーズは、穏やかで効率的な方法で標的細胞を形質移入するために使用することができる別のツールであり、なぜなら、この方法論は、核酸の取り込みを指示するために磁場の印加を利用するためである。この技術は、例えば、ＵＳ２０１０／０２２７４０６に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0074】
標的細胞による外来性核酸の取り込みを誘発するための別の有用なツールは、レーザーフェクションであり、これは光学形質移入法とも呼ばれ、細胞を穏やかに透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透できるようにするために、細胞を特定の波長の電磁放射に曝露することを含む技術である。この技術の生物活性は、電気穿孔法に類似しており、いくつかの場合では電気穿孔法よりも優れていることがわかる。
【0075】
インパレフェクションは、遺伝物質を標的細胞に送達するために使用することができる別の技術である。この技術は、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ、及びナノワイヤーなどのナノ材料の使用に依存する。針状のナノ構造を、基板の表面に対して垂直に合成する。細胞内送達を目的とした遺伝子を含むＤＮＡを、ナノ構造の表面に付着させる。次いで、これらの針の配列を備えたチップを細胞または組織に押し付ける。ナノ構造を刺入された細胞は、送達された遺伝子（複数可）を発現することができる。この技術の実施例は、Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７：１８７０（２０１０）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0076】
マグネトフェクションを使用して標的細胞に核酸を送達することもできる。マグネトフェクションの原理は、核酸を陽イオン性磁性ナノ粒子と会合させることである。磁性ナノ粒子は、完全に生分解性の酸化鉄でできており、用途に応じて異なる特定の独自の陽イオン性分子でコーティングされている。遺伝子ベクター（ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスベクターなど）とのそれらの会合は、塩によって誘発されるコロイド凝集及び静電相互作用によって達成される。次いで、磁石によって生成された外部磁場の影響により、磁性粒子が標的細胞上に濃縮される。この技術は、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１０２（２００２）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0077】
標的細胞による外来性核酸の取り込みを誘発するための別の有用なツールは、ソノポレーションであり、これは細胞膜の透過性を改変するために音波（通常は超音波周波数）を使用することを含む技術であり、細胞を透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透することを可能にする。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：３０９（２００７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【0078】
本発明の方法及び組成によれば、培養中の宿主細胞を、本明細書に記載の組換えベクターを保有するウイルスに接触させることによって、組換えウイルス粒子を宿主細胞に直接導入することができる。宿主細胞と接触すると、ウイルスは、ウイルスキャプシドタンパク質と宿主細胞上の細胞表面受容体との間の特定の相互作用によって宿主細胞表面に付着し、ウイルス粒子のエンドサイトーシス及び細胞侵入を生じさせる。細胞質内で、ウイルス粒子はそのキャプシドを脱落させ、ウイルスゲノムを宿主細胞に放出する。ウイルスゲノムが露出されると、その配列はタンパク質発現のためにｍＲＮＡに転写され得るか、または宿主細胞がウイルス複製を許容する場合はウイルスゲノムが複製され得る。
【実施例】
【0079】
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法をどのように使用し、製造し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示し、純粋に本発明を例示することを意図するものであり、発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。
【0080】
実施例１：昆虫細胞及び哺乳動物細胞内でのタンパク質発現のための組換えベクターの構築
昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターを構築した。哺乳動物細胞コンピテントプロモーターと昆虫細胞コンピテントプロモーターをユニークな設計に統合することにより、両方の細胞型で導入遺伝子の発現が促進されるベクター設計を選択した。図１Ａに示すように、１つの例示的なベクターは、５’から３’方向に向かって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、非コードミニエクソン、５’末端にスプライスドナー配列、３’末端にスプライス分岐点、ポリミリミジントラクト、及び３’スプライスアクセプター配列が隣接するポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターを含む人工イントロン、続いてＫｏｚａｋ配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、開始コドン（ＡＵＧ）、導入遺伝子（例えば、エメラルドＧＦＰ（ｅｍＧＦＰ））をコードする配列、終止コドン（例えば、ＴＡＡ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネーター配列を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含んでいた。さらに、ベクターは、アンピシリン（ＡＭＰ／ＣＡＲＢ）及びゲンタマイシン（Ｇｅｎｔ）抗生物質耐性遺伝子、大腸菌の複製起点（ｏｒｉ）、ならびに２つの転座部位Ｔｎ７Ｌ及びＴｎ７Ｒをコードする核酸配列を含んでいた。上記の例示的なベクター内に含まれる核酸配列は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、非コードミニエクソン、ＰＨプロモーターを含む人工イントロン、ｅｍＧＦＰ導入遺伝子、及びＷＰＲＥ配列を含み、以下に記載される。
昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターを構築した。哺乳動物細胞コンピテントプロモーターと昆虫細胞コンピテントプロモーターをユニークな設計に統合することにより、両方の細胞型で導入遺伝子の発現が促進されるベクター設計を選択した。図１Ａに示すように、１つの例示的なベクターは、５’から３’方向に向かって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター、非コードミニエクソン、５’末端にスプライスドナー配列、３’末端にスプライス分岐点、ポリミリミジントラクト、及び３’スプライスアクセプター配列が隣接するポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターを含む人工イントロン、続いてＫｏｚａｋ配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、開始コドン（ＡＵＧ）、導入遺伝子（例えば、エメラルドＧＦＰ（ｅｍＧＦＰ））をコードする配列、終止コドン（例えば、ＴＡＡ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネーター配列を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含んでいた。さらに、ベクターは、アンピシリン（ＡＭＰ／ＣＡＲＢ）及びゲンタマイシン（Ｇｅｎｔ）抗生物質耐性遺伝子、大腸菌の複製起点（ｏｒｉ）、ならびに２つの転座部位Ｔｎ７Ｌ及びＴｎ７Ｒをコードする核酸配列を含んでいた。上記の例示的なベクター内に含まれる核酸配列は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、非コードミニエクソン、ＰＨプロモーターを含む人工イントロン、ｅｍＧＦＰ導入遺伝子、及びＷＰＲＥ配列を含み、以下に記載される。
【0081】
昆虫細胞では、導入遺伝子のｍＲＮＡ（例えば、ｅｍＧＦＰ）は強力なバキュロウイルスＰＨプロモーターから転写され、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼによって達成される。昆虫細胞内ではＣＭＶプロモーターからの転写はなく；すべての転写はＰＨプロモーターに由来し、ＰＨプロモーターは図１Ｂに示すｍＲＮＡ転写産物を生成する。哺乳動物細胞では、ｍＲＮＡは哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってＣＭＶプロモーターから転写される。相反的に、ＣＭＶプロモーターは昆虫細胞では不活性であり、一方、ＰＨプロモーターは哺乳動物細胞では不活性である。したがって、生成される転写産物は、図１Ｃに示すエレメントを含む。ＰＨプロモーター及びイントロンは、哺乳動物細胞における連続的なリーディングフレームの翻訳を阻害する１つ以上の開始コドン及び終止コドンを含む。しかしながら、イントロンは、哺乳動物細胞でのｍＲＮＡ成熟中にスプライシングを受け、ＰＨプロモーターを含むイントロンが、すべての関連するオープンリーディングフレーム及び終止コドンとともに除去される。したがって、ＣＭＶプロモーターから転写されたすべてのｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、成熟ｍＲＮＡのすべての同じエレメントに加えて、タンパク質の翻訳にほとんどまたはまったく影響を与えない短い５’非コードミニエクソンを含む。
【0082】
実施例２：昆虫細胞及び哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の発現
昆虫細胞と哺乳動物細胞の両方で導入遺伝子の発現を促進する組換えベクターの有効性を示すために、ｅｍＧＦＰ遺伝子をコードする組換えベクターを含む様々な用量のウイルス粒子の存在下で、昆虫ＳＦ９細胞と哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で別々の細胞培養アッセイを実施した。最初に、実施例１に記載したように、ＧＦＰ導入遺伝子を有する発現カセットを含むドナープラスミドを調製することによって組換えプラスミドを生成した。続いて、Ｔｎ７トランスポザーゼ酵素を産生するヘルパープラスミド、及びβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム内にミニａｔｔＴｎ７部位を有し、バキュロウイルスＤＮＡを含むプラスミド（例えば、バクミド）を含むＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞株にドナープラスミドを形質転換した。ドナープラスミドからバクミドへの発現カセットの転位を介した組み込みに続いて、この新しく形成された組換えプラスミドを、その大きな分子サイズ（約１３０ｋｂ）に基づいて、ＬａｃＺ陰性大腸菌細胞から人工的に選択し、増幅し、精製した。続いて、ウイルスを増幅させるために、単離された組換えプラスミドをＳＦ９細胞培養物に形質移入した。２～３世代のウイルス産生に続いて、培養ＳＦ９細胞（図２Ａ）及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図２Ｂ）を２００μＬまたは４００μＬの組換えウイルス粒子に感染させ、１６時間インキュベートした。別の対照群には、ウイルス投与を行わなかった。図２Ａ～２Ｂに認められるように、強力なＧＦＰ発現が昆虫細胞及び哺乳動物細胞の培養の両方で観察された。これらの結果は、本明細書に記載の組換えベクターから産生されたウイルスが、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内でのタンパク質発現を駆動することができることを示している。
昆虫細胞と哺乳動物細胞の両方で導入遺伝子の発現を促進する組換えベクターの有効性を示すために、ｅｍＧＦＰ遺伝子をコードする組換えベクターを含む様々な用量のウイルス粒子の存在下で、昆虫ＳＦ９細胞と哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で別々の細胞培養アッセイを実施した。最初に、実施例１に記載したように、ＧＦＰ導入遺伝子を有する発現カセットを含むドナープラスミドを調製することによって組換えプラスミドを生成した。続いて、Ｔｎ７トランスポザーゼ酵素を産生するヘルパープラスミド、及びβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム内にミニａｔｔＴｎ７部位を有し、バキュロウイルスＤＮＡを含むプラスミド（例えば、バクミド）を含むＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞株にドナープラスミドを形質転換した。ドナープラスミドからバクミドへの発現カセットの転位を介した組み込みに続いて、この新しく形成された組換えプラスミドを、その大きな分子サイズ（約１３０ｋｂ）に基づいて、ＬａｃＺ陰性大腸菌細胞から人工的に選択し、増幅し、精製した。続いて、ウイルスを増幅させるために、単離された組換えプラスミドをＳＦ９細胞培養物に形質移入した。２～３世代のウイルス産生に続いて、培養ＳＦ９細胞（図２Ａ）及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞（図２Ｂ）を２００μＬまたは４００μＬの組換えウイルス粒子に感染させ、１６時間インキュベートした。別の対照群には、ウイルス投与を行わなかった。図２Ａ～２Ｂに認められるように、強力なＧＦＰ発現が昆虫細胞及び哺乳動物細胞の培養の両方で観察された。これらの結果は、本明細書に記載の組換えベクターから産生されたウイルスが、昆虫細胞及び哺乳動物細胞内でのタンパク質発現を駆動することができることを示している。
【0083】
実施例３：哺乳動物細胞内で組換えベクターによってコードされる人工イントロンのスプライシング
哺乳動物細胞内で、ＰＨプロモーターを含む人工イントロンが、スプライシング事象を介してｍＲＮＡ転写産物から除去されることを確認するために、ＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。続いて、実施例２に記載したように、ＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えベクターにＨＥＫ２９３細胞を感染させ、１６時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して、約２００万個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と遺伝子特異的プライマー、またはオリゴｄＴ／ランダムヘキサマーミックスを使用して逆転写を実施し、続いてネステッドプライマーを使用して３０サイクルのＰＣＲ増幅を実施した。対照として、ベクターのみからのＰＣＲ増幅を行った。スプライシング産物の予想される長さは１８６ｂｐであり、一方、スプライシングされていない前駆体（プラスミド内と同様に）は３５７ｂｐの長さであった。図３に示すように、遺伝子特異的（レーン２）及びオリゴｄＴ／Ｎ６（レーン３）の両方のＲＴ－ＰＣＲ反応物がスプライシングされ、それらの長さは、イントロンが除去された場合の予想と同様に、ゲル上で約１８０～１９０ｂｐであった。イントロンが存在する場合に予想されるように、プラスミドの増幅により３５０ｂｐの産物が生成された（レーン４）。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供し、スプライシングの正確性を確認した（図４Ａ～４Ｂ）。したがって、これらの発見は、ＣＭＶプロモーター及び非コードミニエクソンの下流の人工イントロンにＰＨプロモーターを組み込むベクター設計戦略により、スプライシング事象を通じて哺乳動物細胞内でＰＨプロモーターを成功裏に除去することができることを示した。
哺乳動物細胞内で、ＰＨプロモーターを含む人工イントロンが、スプライシング事象を介してｍＲＮＡ転写産物から除去されることを確認するために、ＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。続いて、実施例２に記載したように、ＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えベクターにＨＥＫ２９３細胞を感染させ、１６時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して、約２００万個の細胞から全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と遺伝子特異的プライマー、またはオリゴｄＴ／ランダムヘキサマーミックスを使用して逆転写を実施し、続いてネステッドプライマーを使用して３０サイクルのＰＣＲ増幅を実施した。対照として、ベクターのみからのＰＣＲ増幅を行った。スプライシング産物の予想される長さは１８６ｂｐであり、一方、スプライシングされていない前駆体（プラスミド内と同様に）は３５７ｂｐの長さであった。図３に示すように、遺伝子特異的（レーン２）及びオリゴｄＴ／Ｎ６（レーン３）の両方のＲＴ－ＰＣＲ反応物がスプライシングされ、それらの長さは、イントロンが除去された場合の予想と同様に、ゲル上で約１８０～１９０ｂｐであった。イントロンが存在する場合に予想されるように、プラスミドの増幅により３５０ｂｐの産物が生成された（レーン４）。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供し、スプライシングの正確性を確認した（図４Ａ～４Ｂ）。したがって、これらの発見は、ＣＭＶプロモーター及び非コードミニエクソンの下流の人工イントロンにＰＨプロモーターを組み込むベクター設計戦略により、スプライシング事象を通じて哺乳動物細胞内でＰＨプロモーターを成功裏に除去することができることを示した。
【0084】
他の実施形態
記載される本開示の様々な改変及び変形が、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示を特定の実施形態に関連して記載したが、請求される本開示は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかである本開示を実施するために記載する様式の様々な改変は、本開示の範囲内であることが意図される。他の実施形態は、特許請求の範囲に見出される。
記載される本開示の様々な改変及び変形が、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示を特定の実施形態に関連して記載したが、請求される本開示は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかである本開示を実施するために記載する様式の様々な改変は、本開示の範囲内であることが意図される。他の実施形態は、特許請求の範囲に見出される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【国際調査報告】