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特表2022-538253連結剤としての使用のためのビス（２－ハロアセトアミド）化合物および抗体、半抗体、および抗体断片を含む得られた生成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-01
(54)【発明の名称】連結剤としての使用のためのビス（２－ハロアセトアミド）化合物および抗体、半抗体、および抗体断片を含む得られた生成物
(51)【国際特許分類】
C07C 233/54 20060101AFI20220825BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20220825BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220825BHJP
C07C 233/43 20060101ALI20220825BHJP
C07C 247/04 20060101ALI20220825BHJP
C07C 237/32 20060101ALI20220825BHJP
【ＦＩ】
C07C233/54 CSP
C07K16/00
A61K47/68
C07C233/43
C07C247/04
C07C237/32
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576793
(86)(22)【出願日】2020-06-25
(85)【翻訳文提出日】2022-02-22
(86)【国際出願番号】 EP2020067922
(87)【国際公開番号】W WO2020260514
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】1909103.2
(32)【優先日】2019-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514007092
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ バース
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100187540
【弁理士】
【氏名又は名称】國枝 由紀子
(72)【発明者】
【氏名】ワッツ，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】アルカワジャ，バヤン
【テーマコード（参考）】
4C076
4H006
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB81
4H006BJ20
4H006BJ50
4H006BM10
4H006BM72
4H006BM73
4H006BM74
4H006BP10
4H006BT32
4H006BV25
4H006BV72
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA51
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA50
(57)【要約】
複数のチオール基、特に、限定されないが、ペプチド鎖中のシステインアミノ酸のチオール基を化学的に架橋するためのリンカーとしての使用のためのビス（２－ハロアセトアミド）化合物、さらには、連結剤としてのそれらの使用、ならびに前記リンカーに結合されたチオール基を有する抗体、半抗体、および抗体断片を含む得られた生成物（例えば、抗体－タンパク質コンジュゲートおよび抗体－薬物コンジュゲート）、ならびに前記コンジュゲートおよび生成物（式Ｉ）を作製する方法が記載される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
各Ｘは、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、ＣＯＮＲＡ ２、ＣＯＮＨＬ、またはＣＯＮＲＡＬであり、
Ｌは、存在する場合、反応性基Ｒ３を末端とする鎖であり、
各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、
ｎは、０、１、２、または３であり、
各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択されるか、またはＲ２は、Ｒ１について定義されたとおりの基である）
のリンカー化合物またはその塩。
【請求項2】
Ｌが、Ｒ３を末端とするポリエーテルまたはポリチオエーテルであり、Ｒ３が、Ｎ３、Ｃ≡Ｃ結合を含む基、保護アミン、脱離基、および式（Ｈ）：【化2】
各Ｘは、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
ｎは、０、１、２、または３であり、
各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択されるか、またはＲ２は、請求項１でＲ１について定義されたとおりの基である）
の部分から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ｎが０である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｘが、ＢｒまたはＩである、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項5】
式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、または（ＩＩｃ）：【化3】
Ｘは、ＢｒまたはＩであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬである）
の化合物である、請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項6】
式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）【化4】
各ＸはＢｒであるか、
各ＸはＩであるか、または
２つのＸ、一方のアリーレンはＢｒであり、２つのＸまたは他方のアリーレンはＩである）
の化合物である、請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項7】
例（１）～（１８）：【化5】
【請求項8】
ヒンジ領域の重鎖－重鎖内システイン残基を架橋するリンカー残基を含む半抗体であって、リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分である、半抗体。
【請求項9】
重鎖と軽鎖を架橋するリンカー残基を含む単官能化抗体であって、リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分である、単官能化抗体。
【請求項10】
２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分であるリンカー残基を含むチオ架橋ｆａｂ抗体断片。
【請求項11】
リンカー残基が、式（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、または（ＩＸｄ）：【化6】
ｍは、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択され、----は、タンパク質鎖への結合点を表す）の部分である、請求項１０に記載のチオ架橋ｆａｂ抗体断片。
【請求項12】
重鎖と軽鎖を架橋するリンカー残基を含む単官能化抗体を生成するための方法であって、リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている式（Ｉａ）の部分であり、前記方法が、完全に還元された抗体を、約１～１．１当量の式Ｉａ：【化7】
【請求項13】
重鎖と軽鎖を架橋するリンカー残基を含む単官能化抗体を生成するための方法であって、リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分であり、前記方法が、（ｉ）約１～１．１当量の還元剤を使用して抗体を還元することによって部分的に還元された抗体を準備するステップと、次に
（ｉｉ）前記部分的に還元された抗体を、請求項１から７のいずれか一項に記載のリンカー化合物を用いて処理するステップと
を含む方法。
【請求項14】
ヒンジ領域の重鎖－重鎖内システイン残基を架橋するリンカー残基および重鎖と軽鎖を架橋するリンカー残基を含む半抗体を生成する方法であって、リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分であり、前記方法が、完全に還元された抗体を、少なくとも４当量の請求項１から７のいずれか一項に記載のリンカー化合物を用いて処理するステップを含む方法。
【請求項15】
リンカー残基が、ヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋する式（Ｉｂ）の部分である半抗体を生成する方法であって、完全に還元された抗体を、約２～２．２当量の式（Ｉｂ）：【化8】
【請求項16】
ヒンジ領域の重鎖－重鎖内システイン残基を架橋する第１のリンカー残基および軽鎖と重鎖を架橋する第２のリンカー残基を有するヘテロ－二官能化半抗体を生成する方法であって、各リンカー残基が、２つのＸがチオール基によって置き換えられている請求項１から７のいずれかに記載の部分であり、前記方法が、（ｉ）部分的に還元された抗体を、請求項１から７のいずれかに記載の第１のリンカー化合物を用いて処理し、第１のコンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉ）前記第１のコンジュゲートをさらに還元し、還元コンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉｉ）前記還元コンジュゲートを、請求項１から７のいずれかに記載の第２のリンカー化合物を用いて処理し、前記ヘテロ－二官能化半抗体コンジュゲートを生成するステップとを含み、前記第１と第２のリンカー化合物が異なる、方法。
【請求項17】
リンカー化合物のうちの少なくとも１つがＬを含み、方法が、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または蛍光標識もしくは放射性標識から選択される追加の部分を結合するステップを含む、請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
Ｆａｂ－ＭａｂまたはＦａｂ－タンパク質コンジュゲートを生成する方法であって、還元されたか、もしくは部分的に還元された抗体またはタンパク質を、請求項１０または請求項１１に記載のチオ架橋ｆａｂ抗体断片を用いて処理するステップを含む方法。
【請求項19】
Ｒ１が、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬであり、ｎが０である、請求項１２から１８のいずれかに記載の方法、または請求項８から１１に記載の抗体、半抗体、もしくは抗体断片。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複数のチオール基、特に、限定されないが、ペプチド鎖中のシステインアミノ酸のチオール基を化学的に架橋するための化合物としてのビス（２－ハロアセトアミド）誘導体の使用に関する。
【0002】
したがって、本発明は、連結化合物としての使用のためのアリールビス（２－ハロアセトアミド）化合物、前記リンカーに結合されたチオール基を有する抗体、半抗体、および抗体断片コンジュゲート、前記リンカーに結合されたチオール基を有する抗体、半抗体、および抗体断片を含む生成物（例えば、抗体－タンパク質コンジュゲートおよび抗体－薬物コンジュゲート）、ならびに前記コンジュゲートおよび生成物を作製する方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、最先端の抗体を基にした治療的手法のうちの１つである。したがって、これらは、この２０年間にわたって大いに注目を集めてきた。ＡＤＣは、細胞毒性薬を特異的な悪性細胞または組織へと移動させるビヒクルとして採用されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。血漿安定性抗体薬物コンジュゲートを実現するためのＡＤＣの構築には、特異的なリンカー特性が必要とされる。
【0004】
第一世代のＡＤＣの構築には、その抗体内のアミノ酸残基、主にシステインおよびリジンアミノ酸の固有の求核官能性が利用された。システインを基にしたコンジュゲートを生成するために、鎖間ジスルフィド結合の前還元ステップが必要とされる。免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ）のＩｇＧ１サブクラスは、ヒト血清中で最も多いサブクラスであり、ｍＡｂを基にした治療法で採用される最も一般的な種類である。ＩｇＧ１は、合計４つの鎖間ジスルフィド結合を有し、２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖／軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）の間であり、２つの鎖間ジスルフィド結合は、ヒンジ領域の重鎖／重鎖（ＨＣ／ＨＣ）の間である。
【0005】
多くの研究が、ｍＡｂの構造および最適な抗原結合を維持するだけでなく、さらにｍＡｂｓのエフェクター機能を保有するための４つの鎖間ジスルフィド結合の重要性を示してきた。重鎖間ジスルフィド結合が欠如している変異ＩｇＧが試験された際に、キメラマウス／ヒトＩｇＧにおける補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減が認められた。
【0006】
半抗体の有用性がますます認識されている一方で、ＩｇＧの４つの鎖間ジスルフィド結合の部分的な還元でさえも、その補体結合機能およびＣＤＣにおける劇的な低減を招く結果となることが見出されている。
【0007】
ジスルフィド結合が、適切な折り畳み、構造、およびより重要な点として、ｍＡｂの機能を維持するために必須であるとすれば、ｍＡｂコンジュゲートの構築前に組換え抗体の還元後の構造を維持することは必須である。ｍＡｂの還元後の構造を維持し、規定のコンジュゲーション手法を維持するために、ｍＡｂの複雑で高価な遺伝子再構築を回避する試みにおいて、Ａｂｚｅｎａは、還元された鎖間ジスルフィド結合の再架橋に基づく、均質で安定したＡＤＣの生成に関する新規手法を（ＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（登録商標）技術）開発した。
【0008】
ＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（登録商標）技術は、３－炭素橋を形成しているｍＡｂの還元された鎖間ジスルフィド結合を再アニールするビス－スルホン系試薬であり、そうすることによって、ＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（登録商標）は、抗体の還元後のジスルフィド構造を維持する。利用可能な還元ジスルフィド結合は、最初に、この還元ジスルフィド結合のチオレート基に対するマイケル付加によって開始され、続いて、第２のマイケルアクセプター（α－β不飽和カルボニル）を生成するｐ－トルエンスルフィン酸の脱離を生じる、連続した付加－脱離機序を介して架橋される。次に、隣位のチオレート基が、第２のマイケル付加を介して反応し、システインの２つのチオール間に３－炭素結合を形成する。
【0009】
ビス－スルホンリンカーを使用する主な目的が、ＡＤＣのより良い血漿安定性を実現することであることから、増強された血漿安定性は、マレイミド結合を使用した蛍光標識トラスツズマブを、蛍光標識ビス－アルキル化トラスツズマブと比較することによって評価された。後者は、高濃度のアルブミン存在下で、（マレイミド結合抗体と比較して）５日間にわたる顕著な血清安定性を示した。
【0010】
さらに、トラスツズマブのＡＤＣの構築において、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を有するビス－スルホン試薬を使用することは、トラスツズマブのＨＥＲ２受容体に対する結合活性を完全に保持し、ＨＥＲ２陽性細胞株における強力な増殖抑制活性を示したことが確認されている。
【0011】
ビス－反応性マレイミドリンカーは、ビス－チオスクシンアミド結合を得るための２－炭素橋を介したジスルフィド再架橋剤として開発された。ビス－反応性マレイミド誘導体の高速反応速度は、ビス－スルホン誘導体に比べて、タンパク質のより高い構造完全性およびより広い反応ｐＨ範囲（６～８）を提供する。
【0012】
ビス－スルホン試薬およびジブロモマレイミド誘導体は、還元ジスルフィドのための最も速く、最も確立された再架橋試薬とみなされている。それにもかかわらず、各々は、関連した欠点を有する。これらには、試薬の難水溶性および還元ジスルフィド結合と還元状態下の不対システイン残基の間の選択性の欠如が含まれる。架橋は、重鎖－軽鎖および重鎖－重鎖にわたる両方において可能であり、生成物が混合物となる。
【0013】
このため、抗体におけるスルフィド架橋に取って代わるさらなるリンカーを発見することに関心が持たれている。
他の骨格の例には、２－炭素橋を介したジスルフィド結合を架橋するジブロモピリダジンジオンのようなピリダジンジオンを基にした化合物が含まれる。ジ－ＴＣＥＰ置換ジチオフェノールピリダジンジオンも使用されており、還元剤および安定した架橋剤の両方として同時に機能することが可能である。他の手法は、追加の官能性の受け入れを可能にするために、クリック可能な化学的性質を、ピリダジンジオンを基にしたリンカーに導入した。
他の骨格の例には、２－炭素橋を介したジスルフィド結合を架橋するジブロモピリダジンジオンのようなピリダジンジオンを基にした化合物が含まれる。ジ－ＴＣＥＰ置換ジチオフェノールピリダジンジオンも使用されており、還元剤および安定した架橋剤の両方として同時に機能することが可能である。他の手法は、追加の官能性の受け入れを可能にするために、クリック可能な化学的性質を、ピリダジンジオンを基にしたリンカーに導入した。
【0014】
ＥＰ３３３５７３４は、チオエーテルを形成するための脱離基の置き換えを介して抗－薬物コンジュゲートを形成するために使用され得るリンカーに結合された薬物部分の使用に関する。例えば、アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびアウリスタチンＦは、アミドカップリングを介してリンカーに結合された。ハーセプチン－リンカー－薬物単位は開示されている。
【0015】
再架橋戦略は、ｍＡｂの明確に定義された還元後の構造を維持しつつ、還元ｍＡｂへの反応性官能基の導入を可能にする洗練された手法であると考えられている。この分野における最近の進歩および多大な研究努力にもかかわらず、２－および３－炭素橋のいずれかの形成を介した前述の再架橋手法は、さらなる対処を必要とする実用上の制限を未だに有する。これには、低い収率および生成される生成物が混合物であることが含まれる。
【0016】
本発明は、上記の留意点を考慮に入れて考案された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明は、次世代の再架橋剤としてアリールビス（２－ハロアセトアミド）誘導体を提供する。これらのビス－ハロアセトアミド誘導体は、上記のとおり、従来の再架橋において有用性を有するが、完全ｍＡｂのヘテロ再架橋（２つ以上の異なる再架橋リンカーの結合）および半抗体コンジュゲートの生成において特に有用であり得る。
【0018】
完全に架橋された抗体（１５０ＫＤａ）を得るために、重鎖－軽鎖および重鎖－重鎖の鎖間ジスルフィド結合を完全に架橋することに、できる限り重点をおいた前述の（背景技術を参照）再架橋方法は、意図された生成物としての半抗体（７５ＫＤａ）の構築における潜在的利点を見落としてきた。例えば、半抗体は、エンドソームリサイクリングおよび腫瘍浸透において有用性を有する場合がある。加えて、本発明者らが知る限りでは、従来の再架橋手法は、重鎖－重鎖と重鎖－軽鎖ジスルフィド結合の間に特段の選択性が認められなかった。したがって、ヘテロ二機能性ｍＡｂを得るための部位選択的タンパク質標識化は、過去に未解決の課題であった。
【0019】
これらの問題に対処することが、本発明の目的である。
リンカー化合物
第１の側面において、本発明は、ビス－（２－ハロアセトアミド）モチーフを有するリンカー化合物を提供する。リンカーは、抗体構造におけるスルフィド架橋を再架橋（連結）すること、および／または半抗体を形成するために重鎖間というよりも、重鎖内を連結することに適している。これらの連結された抗体構造は、「コンジュゲート」と呼ばれる。
リンカー化合物
第１の側面において、本発明は、ビス－（２－ハロアセトアミド）モチーフを有するリンカー化合物を提供する。リンカーは、抗体構造におけるスルフィド架橋を再架橋（連結）すること、および／または半抗体を形成するために重鎖間というよりも、重鎖内を連結することに適している。これらの連結された抗体構造は、「コンジュゲート」と呼ばれる。
【0020】
したがって、第１の側面において、本発明は、式（Ｉ）：
【0021】
【化1】
【0022】
（式中、
各Ｘは、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、ＣＯＮＲＡ ２、ＣＯＮＨＬ、またはＣＯＮＲＡＬであり、
Ｌは、存在する場合、反応性基Ｒ３を末端とする鎖であり、
各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、
ｎは、０、１、２、または３であり、
各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択されるか、またはＲ２は、Ｒ１について定義されたとおりの基である）のリンカー化合物またはその塩を提供する。
各Ｘは、独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、ＣＯＮＲＡ ２、ＣＯＮＨＬ、またはＣＯＮＲＡＬであり、
Ｌは、存在する場合、反応性基Ｒ３を末端とする鎖であり、
各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、
ｎは、０、１、２、または３であり、
各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択されるか、またはＲ２は、Ｒ１について定義されたとおりの基である）のリンカー化合物またはその塩を提供する。
【0023】
Ｌが存在する場合、鎖には、ポリエーテルまたはポリチオエーテルが適切である。
好ましくは、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、より好ましくは、ＢｒまたはＩである。これは、ブロモ基およびヨード基が、クロロ基よりも優れた脱離基であるためである。
好ましくは、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、より好ましくは、ＢｒまたはＩである。これは、ブロモ基およびヨード基が、クロロ基よりも優れた脱離基であるためである。
【0024】
各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択されるか、またはＲ２は、Ｒ１について定義されたとおりの基である。Ｒ２がＲ１について定義されたとおりの基である場合、好ましくは、ｎは１である。言い換えると、リンカー化合物は、Ｒ１についての定義に従った２つの基を有する場合がある。
【0025】
好ましくは、各Ｒ２は、存在する場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｍｅ、ＣＦ３、ＯＭｅ、およびＯＣＦ３から独立して選択される。
各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、好ましくは、メチルまたはエチルであり、最も好ましくは、メチルである。
各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、好ましくは、メチルまたはエチルであり、最も好ましくは、メチルである。
【0026】
ハロアセトアミド基は、互いに対してオルトまたはメタ位に適切に配置される。例えば、リンカー化合物は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
【0027】
【化2】
【0028】
の化合物であってもよい。
式（Ｉａ）のリンカー化合物は、オルトまたは１，２－と呼ばれることがあり、一方、式（Ｉｂ）のリンカー化合物は、メタまたは１，３－と呼ばれることがある。
式（Ｉａ）のリンカー化合物は、オルトまたは１，２－と呼ばれることがあり、一方、式（Ｉｂ）のリンカー化合物は、メタまたは１，３－と呼ばれることがある。
【0029】
好ましくは、ｎは０である。すなわち、Ｒ２は存在しない。
好ましくは、式（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ１基および２つのハロアセトアミド基は、１，３，５配置に置かれる。
好ましくは、式（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ１基および２つのハロアセトアミド基は、１，３，５配置に置かれる。
【0030】
したがって、リンカー化合物は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、または（ＩＩｃ）：
【0031】
【化3】
【0032】
の化合物であってもよい。
Ｒ１がＨである場合、式（ＩＩａ）および（ＩＩｃ）の化合物は同等であると理解されるであろう。
Ｒ１がＨである場合、式（ＩＩａ）および（ＩＩｃ）の化合物は同等であると理解されるであろう。
【0033】
式ＩＩａのリンカー化合物は、３，４－置換と称される。式（ＩＩｂ）のリンカー化合物は、３，５－置換と称される。式（ＩＩｃ）のリンカー化合物は、２，３－置換と称される。これらの名称は、Ｒ１がＨではない場合に通常使用される。
【0034】
リンカー化合物において、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、ＣＯＮＲＡ
２、ＣＯＮＨＬ、またはＣＯＮＲＡＬであり、Ｌは、存在する場合、反応性基Ｒ３（－Ｓｐ－Ｒ３）を末端とするスペーサーＳｐであり、各ＲＡは、存在する場合、Ｃ１～４アルキルから独立して選択され、好ましくは、メチルまたはエチルであり、最も好ましくは、メチルである。
【0035】
本発明の好ましい化合物において、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬであり、より好ましくは、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬである。
Ｌ基
Ｌは、反応性基を末端とする鎖である。このように、追加の官能性は、反応性基における反応を介して、コンジュゲートに導入され得る。反応性基は、Ｒ３と呼ばれることがある。
Ｌ基
Ｌは、反応性基を末端とする鎖である。このように、追加の官能性は、反応性基における反応を介して、コンジュゲートに導入され得る。反応性基は、Ｒ３と呼ばれることがある。
【0036】
言い換えると、Ｌは－Ｓｐ－Ｒ３であってもよい（式中、Ｓｐはスペーサーであり、Ｒ３は反応性基である）。
スペーサーＳｐは、例えば、最大３２原子長のポリエーテルまたはチオエーテルであってもよい。例えば、スペーサーＳｐは、１０～３２原子長、例えば、１０～２３原子長のポリエーテルまたはチオエーテルであってもよい。
スペーサーＳｐは、例えば、最大３２原子長のポリエーテルまたはチオエーテルであってもよい。例えば、スペーサーＳｐは、１０～３２原子長、例えば、１０～２３原子長のポリエーテルまたはチオエーテルであってもよい。
【0037】
例えば、スペーサーＳｐは、ポリエチレングリコールであってもよい。したがって、いくつかの態様において、スペーサーＳｐは、式：
【0038】
【化4】
【0039】
（式中、----は結合点である）のポリエーテルである。
言い換えると、スペーサーは、ＰＥＧ鎖であってもよい。ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択されてもよい。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５、６、および７から選択される。ｍが３であり、ｍが７であるスペーサーは、本明細書で例示されており、好ましい場合がある。
言い換えると、スペーサーは、ＰＥＧ鎖であってもよい。ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択されてもよい。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５、６、および７から選択される。ｍが３であり、ｍが７であるスペーサーは、本明細書で例示されており、好ましい場合がある。
【0040】
Ｒ３は反応性基である。Ｒ３は、式（Ｈ）の頭部基、または別の分子を結合する目的のために、続いて置き換えられ得るか、もしくは修飾され得る任意の基であってもよい。頭部基という用語は、本明細書で使用する場合、式（Ｈ）
【0041】
【化5】
【0042】
（式中、Ｘ、Ｒ２、およびｎは、上記で定義されたとおりであり、----は、結合点を表す）に記載のアリールビス（２－ハロアセトアミド）部分を指すか、または式（Ｉ）～（ＶＩＩ）の任意の化合物における対応する部分を指す。
【0043】
上記の式（Ｉ）のための選択肢および選好性は、式（Ｈ）に適用される。したがって、Ｒ３は、（Ｈｉ）または（Ｈｉｉ）：
【0044】
【化6】
【0045】
に記載の部分であってもよい
好ましくは、ＸはＢｒまたはＩである。好ましくは、ｎは０である。好ましくは、（Ｈｉ）における配置は１，３，４（さらに任意のＲ２基）である。
好ましくは、ＸはＢｒまたはＩである。好ましくは、ｎは０である。好ましくは、（Ｈｉ）における配置は１，３，４（さらに任意のＲ２基）である。
【0046】
リンカー化合物が、スペーサーＳｐによって結び付けられた２つのアリーレンビスハロアセトアミド頭部基を含む場合、これらのアリーレンビスハロアセトアミド頭部基は、同じ場合か、または異なる場合がある。
【0047】
言い換えると、式（Ｈ）、または別の分子を結合する目的のために、続いて置き換えられ得るか、もしくは修飾され得る任意の基である場合がある。例えば、Ｒ３は、－Ｎ３（アジド）、アルキニル（例えば、－Ｃ≡Ｃ－ＨまたはＣ≡Ｃ結合を含有する他の基、例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）置換基）、保護アミン（例えば、ＮＨＢｏｃ、ＮＨＦｍｏｃ、ＮＨＣｂｚのようなＮＨＰ基）、脱離基、または式（Ｈ）の部分、好ましくは、Ｒ３は、Ｎ３（アジド）、アルキニル（例えば、－Ｃ≡Ｃ－Ｈ）、または式（Ｈ）の部分であってもよい。
【0048】
適切な脱離基は、当業者には明らかであろうし、例えば、－Ｉ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＯＰ、－Ｏ－アリール（例えば、フェノキシド脱離基）、－ＯＴｓ、－ＯＭｓ、－ＳＰ、－Ｓ－Ｃ１～４アルキル、－ＯＳＯ２－Ｃ１～４アルキルを含むことがある。
【0049】
Ｐは保護基である。適切な保護基は、当該分野で既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第４版）（Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）中に記載されており、この内容は参照によって組み込まれる。
【0050】
いくつかの態様において、Ｒ３は、－Ｎ３またはＣ≡Ｃ結合、例えば、－Ｃ≡Ｃ－ＨもしくはＤＢＣＯを含有する基である。これらの場合、その化合物は、当該分野で既知の方法を用いたクリックケミストリーによる反応に適している。－Ｎ３およびＤＢＣＯは、クリックケミストリーが銅触媒を使用することなく達成され得るため、好まれる場合がある。
【0051】
いくつかの態様において、Ｒ３は－Ｎ３である。アジド基は、クリックケミストリー反応で使用されることがあり、アミンを脱マスキングするために還元されることがある。
したがって、リンカー化合物は、式（ＩＩＩ）：
したがって、リンカー化合物は、式（ＩＩＩ）：
【0052】
【化7】
【0053】
（ｎが０ではない場合、ｎＲ２基は式（Ｉ）におけるとおり存在することがあり、好ましくは、ｎは０である）の化合物であってもよい。
例えば、リンカー化合物は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
例えば、リンカー化合物は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【0054】
【化8】
【0055】
（ｎが０ではない場合、ｎＲ２基は式（Ｉ）におけるとおり存在することがあり、好ましくは、ｎは０である）の化合物であってもよい。
好ましくは、式（ＩＩＩａ）における位置化学的配置は１，３，４である。
好ましくは、式（ＩＩＩａ）における位置化学的配置は１，３，４である。
【0056】
いくつかの態様において、Ｒ３は式（Ｈ）の部分である。式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関する上記のすべての選好性および選択肢は、同等に適用する。
したがって、リンカー化合物は、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）：
したがって、リンカー化合物は、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）：
【0057】
【化9】
【0058】
（ｎが０ではない場合、ｎＲ２基は式（Ｉ）におけるとおり存在することがあり、好ましくは、ｎは０である）の化合物であってもよい。
好ましくは、式（ＩＶａ）および（ＩＶｃ）（左手の頭部基）における位置化学的配置は１，３，４である。Ｘ基は、同じ場合か、または異なる場合がある。いくつかの態様の、各ＸはＢｒまたはＩである。いくつかの態様において、２つのＸ、一方のアリーレンはＢｒであり、２つのＸまたは他方のアリーレンはＩである。
好ましくは、式（ＩＶａ）および（ＩＶｃ）（左手の頭部基）における位置化学的配置は１，３，４である。Ｘ基は、同じ場合か、または異なる場合がある。いくつかの態様の、各ＸはＢｒまたはＩである。いくつかの態様において、２つのＸ、一方のアリーレンはＢｒであり、２つのＸまたは他方のアリーレンはＩである。
【0059】
式（ＩＶ）の化合物は、チオ架橋ｆＡｂコンジュゲートの調製において有用であることがあり、次にこれは、追加の部分、例えば、実施例１０に示される抗体にコンジュゲートされ得る。
【0060】
いくつかの態様において、Ｌは存在しない。言い換えると、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、およびＣＯＮＲＡ
２から選択され、好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＲＡ、およびＣＯＮＨ２から選択され、最も好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、およびＣＯＮＨ２から選択される。
【0061】
いくつかの態様において、Ｒ１はＨである。したがって、リンカー化合物は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：
【0062】
【化10】
【0063】
の化合物であってもよい。
いくつかの態様において、Ｒ１はＣＯＯＲＡである。したがって、リンカー化合物は、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）：
いくつかの態様において、Ｒ１はＣＯＯＲＡである。したがって、リンカー化合物は、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）：
【0064】
【化11】
【0065】
（ｎが０ではない場合、ｎＲ２基は式（Ｉ）におけるとおり存在することがあり、好ましくは、ｎは０である）の化合物であってもよい。
好ましくは、ＲＡはＭｅである。
好ましくは、ＲＡはＭｅである。
【0066】
いくつかの態様において、Ｒ１は、以下の図中のＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲＡ、またはＣＯＮＲＡ
２（すべてＣＯＮＲ２で表される）である。したがって、リンカー化合物は、式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、または（ＶＩＩｃ）：
【0067】
【化12】
【0068】
（ｎが０ではない場合、ｎＲ２基は式（Ｉ）におけるとおり存在することがあり、好ましくは、ｎは０である）の化合物であってもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の式の化合物における各Ｘは、クロロである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の式の化合物における各Ｘは、クロロである。
【0069】
いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の式の化合物における各Ｘは、ブロモである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の式の化合物における各Ｘは、ヨードである。
本発明の例示的なリンカー化合物
例示的なリンカー化合物１～１８は、以下に示される。化合物１、２、３、４、５、６、および７は、メチルエステルで置換された式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、および（ＶＩｃ）の化合物である。化合物８、９、１０、１１、１２、および１３は、Ｒ１がＨである化合物である。これらは、式（Ｖａ）および（Ｖｂ）の化合物である。
いくつかの態様において、本明細書に記載される任意の式の化合物における各Ｘは、ヨードである。
本発明の例示的なリンカー化合物
例示的なリンカー化合物１～１８は、以下に示される。化合物１、２、３、４、５、６、および７は、メチルエステルで置換された式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、および（ＶＩｃ）の化合物である。化合物８、９、１０、１１、１２、および１３は、Ｒ１がＨである化合物である。これらは、式（Ｖａ）および（Ｖｂ）の化合物である。
【0070】
化合物１４、１５、１６、１７、および１８は、アリール環からのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖ペンダントを含む。これは、スペーサーＳｐに相当する。このスペーサーは、使用される場合、第２のアリールビス（２－ハロアセトアミド）部分を末端とすることがあり（例えば、化合物１８）、これは式（ＩＶａ）の化合物である。または、このスペーサーは、さらなる反応に適している異なる基（本明細書でＲ３と称される）を末端とすることがあり、これは、前記ハロアセトアミド基のハロゲンよりもチオール置換に対するそれ自体の反応性が低い。この後者のタイプにおいて、化合物は、直交的に活性化されると考えられ得る。このアリールビス（２－ハロアセトアミド）基は、２つのチオール基間に架橋を形成することがあり、次に、そのスペーサー末端基は、別の化合物と反応するか、または脱マスキングし、さらに反応して、抗体、抗体断片、薬物、および／もしくは他のタンパク質のさらなるチオール基、または抗体、抗体断片、薬物、および／もしくは他のタンパク質の異なる官能基と結合する。化合物１４、１５、１６、および１７において、その末端基はアジドであり、これらの化合物は、式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）の化合物である。
【0071】
いくつかの態様において、本発明のリンカー化合物は：
【0072】
【化13】
【0073】
から選択される。
コンジュゲート
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載のリンカーを有する抗体、半抗体、または抗体断片を提供することがある。これらは、抗体コンジュゲート、半抗体コンジュゲート、または抗体断片コンジュゲートと呼ばれることがある。
コンジュゲート
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載のリンカーを有する抗体、半抗体、または抗体断片を提供することがある。これらは、抗体コンジュゲート、半抗体コンジュゲート、または抗体断片コンジュゲートと呼ばれることがある。
【0074】
リンカーは、通常、抗体構造中のジスルフィド架橋の還元によって生成される２つのチオールを架橋する。この架橋は、重鎖－軽鎖架橋、重鎖－重鎖架橋である場合か、またはリンカーが、同じ重鎖上内に架橋を形成する場合がある。
【0075】
したがって、本発明は、----が抗体鎖への結合点を示す式（ＶＩＩＩ）：
【0076】
【化14】
【0077】
（式中、すべての置換基は本明細書に記載のとおりであり、リンカーは任意選択で式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の式中に描かれているとおりである場合がある）に記載のモチーフを含むコンジュゲートを提供することがある。これらの構造のそれぞれに対する選好性は、同等に適用する。
【0078】
モチーフは、本明細書に記載のリンカー化合物の残基であると考えられ、すなわち、反応後に残っているリンカー化合物の構造である。言い換えると、「リンカー」または「残基」は、ハロゲン化物脱離基の置き換え後に残っている部分である。いくつかの態様において、本発明の任意のコンジュゲートのリンカーは、例示的な化合物１～１８のうちの任意の１つの残基である。
【0079】
図１は、本発明の特定のコンジュゲート構造を概略的に示す。図１（１）は、重鎖と軽鎖を再架橋するリンカーおよび重鎖間というよりも、重鎖内ジスルフィドを連結する第２の（同一の）リンカーを有する半抗体を示す。図１（３）は、それらのリンカーが異なる半抗体コンジュゲートを示す。これは、ヘテロ－二官能化半抗体を指すことがある。図１（２）は、単独のリンカーが重鎖－軽鎖を架橋している全長抗体であるコンジュゲートを示す。そのリンカーが、（特許請求の範囲において「Ｌ」と定義される）反応性基を末端とする鎖を有する場合に、そのリンカーは、さらにクロスカップリングさせるため、例えば、三特異性抗体または抗体－タンパク質コンジュゲートを生成するために直交的に活性化され得る。図１（４）および図１（８）を参照すること。リンカーの頭部基部分は、同じ場合か、または異なる場合があると理解されるであろう。図１（５）は、図１（１）に示される構造と化学的に同一であるが、その半抗体が観察され得る物理的状態を示す。図１（６）は、図１（３）に示される構造と化学的に同一であるが、これもその半抗体が観察され得る物理的状態を示す。図１（７）は、２つのリンカーが重鎖－軽鎖を架橋する全長抗体であるコンジュゲートを示す。
【0080】
このため、いくつかの態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する抗体を含む生成物を提供することがある。
このため、いくつかの態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体を含む生成物を提供することがある。言い換えると、本発明は、同じ重鎖上の２つのスルフィド部分内を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体を提供することがある。
このため、いくつかの態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体を含む生成物を提供することがある。言い換えると、本発明は、同じ重鎖上の２つのスルフィド部分内を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体を提供することがある。
【0081】
いくつかの態様において、本発明は、重鎖上の２つのスルフィド部分内を架橋する上記で定義された式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカー、および重鎖と軽鎖を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載の追加のリンカーを有する半抗体を提供する。式（ＶＩＩＩ）のこれらのリンカーは、同じ場合（図１（１））か、または異なる（図１（３））場合がある。
【0082】
このため、いくつかの態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカーまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する抗体断片を含む生成物を提供することがある。
【0083】
いくつかの態様において、本発明は三重特異性抗体に関する。このように、特異的なＦａｂ－Ｍａｂコンジュゲートは生成され得る（図１の（４）を参照）。
したがって、いくつかの態様において、本発明は、チオ架橋Ｆａｂを提供する。言い換えると、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカー化合物または本明細書に記載の任意のリンカーによって再架橋されたＦａｂ断片である。好ましくは、リンカー化合物はＬを含む。例えば、それは、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）のリンカー化合物であってもよい。
したがって、いくつかの態様において、本発明は、チオ架橋Ｆａｂを提供する。言い換えると、式（ＶＩＩＩ）に記載のリンカー化合物または本明細書に記載の任意のリンカーによって再架橋されたＦａｂ断片である。好ましくは、リンカー化合物はＬを含む。例えば、それは、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）のリンカー化合物であってもよい。
【0084】
言い換えると、本発明は、チオ架橋Ｆａｂであって、その架橋が式（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、または（ＩＸｃ）
【0085】
【化15】
【0086】
（式中、----がタンパク質鎖への結合点を表し、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される）の架橋である、チオ架橋Ｆａｂを提供し得る。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５，６，７，８，９，および１０から選択される。いくつかの場合において、ｍは、３、４、５，６，および７から選択される。ｍが３であるか、またはｍが７であることは、好ましい場合がある。
【0087】
いくつかの態様において、本発明は、薬物および／またはタンパク質もしくは他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）に結合される抗体コンジュゲート、半抗体コンジュゲート、または抗体断片コンジュゲート（例えば、チオ架橋Ｆａｂ）を提供することがある。このような化合物は、本明細書で生成物と呼ばれることがある。本発明の生成物を作製する方法に関するさらなる考察は、以下を参照すること。したがって、いくつかの態様において、本発明は、生成物であって、そのリンカー化合物がＬを含み、Ｒ３が抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または蛍光標識もしくは放射性標識によって取って代わられる、生成物を提供する。
【0088】
いくつかの態様において、本発明は、上記の式（ＩＸａ）に示されるとおりのリンカーモチーフを含む生成物を提供する（式中、Ｘ基は、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または蛍光標識もしくは放射性標識によって取って代わられる）。例えば、各Ｘは、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、またはポリペプチドのチオール基によるＸ脱離基の置き換えの結果として生じるＳ－----によって取って代わられることがある。
方法
さらなる態様において、本発明は、コンジュゲートを作製する方法および本明細書に記載のコンジュゲートを含む生成物を提供することがある。
方法
さらなる態様において、本発明は、コンジュゲートを作製する方法および本明細書に記載のコンジュゲートを含む生成物を提供することがある。
【0089】
したがって、さらなる側面において、本発明は、コンジュゲートを形成する方法、還元または部分的還元をもたらすＴＣＥＰのような還元剤を用いて抗体、半抗体、または抗体断片を処理するステップ、その後、対応するコンジュゲートを得るために、還元されたか、もしくは部分的に還元された抗体、半抗体、または抗体断片を、本明細書に記載される任意の式に記載のリンカー化合物を用いて処理するステップを含む方法に関する。
【0090】
適切には、還元ステップ後に、反応は、リンカー化合物の添加前にクエンチされる。これは、何らかの残留ＴＣＥＰとリンカー化合物との反応を防ぐ。適切なクエンチング剤は、Ｋａｎｔｎｅｒら［２０１７］に記載のペンタ－ＰＥＧアジドである。
抗体コンジュゲート
いくつかの態様において、本発明は、図１（２）に示される単官能化抗体を生成するための方法に関する。すなわち、重鎖と軽鎖を架橋する単独のリンカーを有するコンジュゲートである。これは：
（ｉ）ＴＣＥＰのような還元剤を用いた抗体の部分的還元、続く本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理するステップ、または
（ｉｉ）重鎖－軽鎖の選好的な再架橋のための、本発明の特定のリンカー化合物の選択性を利用するステップ
によって得ることができる。
抗体コンジュゲート
いくつかの態様において、本発明は、図１（２）に示される単官能化抗体を生成するための方法に関する。すなわち、重鎖と軽鎖を架橋する単独のリンカーを有するコンジュゲートである。これは：
（ｉ）ＴＣＥＰのような還元剤を用いた抗体の部分的還元、続く本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理するステップ、または
（ｉｉ）重鎖－軽鎖の選好的な再架橋のための、本発明の特定のリンカー化合物の選択性を利用するステップ
によって得ることができる。
【0091】
したがって、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に示されるモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する単官能化抗体を生成する方法であって、部分的に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理することを含む方法を提供することがある。いくつかの態様において、方法は、約１～１．１当量、例えば、約１．１当量のＴＣＥＰのような還元剤を使用して抗体を還元することによって、部分的に還元された抗体を準備するステップをさらに含む。このような生成物は図１（１）に示される。
【0092】
いくつかの態様において、本発明の方法は、それぞれ式（ＶＩＩＩ）に示される２つのモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する二官能化抗体を生成する方法であって、部分的に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理するステップを含む方法を提供することがある。少なくとも２当量のリンカー化合物が使用されるであろう。通常、このリンカー化合物は、２当量を上回って提供されるであろう。いくつかの態様において、方法は、約２～２．２当量、例えば、約２．２当量のＴＣＥＰのような還元剤を使用して抗体を還元することによって、部分的に還元された抗体を準備するステップをさらに含む。
【0093】
いくつかの態様において、リンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡまたはＨである化合物である。上記のとおり、本発明者らは、軽鎖－重鎖架橋に対して、非置換リンカーが好ましい場合があることを認めた。したがって、いくつかの方法において、化合物は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）、好ましくは、（Ｖａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＨであり、ｎは０である。好ましくは、Ｘはブロモである。したがって、リンカーは、化合物９および１２から選択されてもよく、好ましくは、化合物１２であってもよい。
【0094】
他の態様において、リンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡ、好ましくは、ＣＯＯＭｅである化合物である。したがって、いくつかの方法において、化合物は、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）、好ましくは、（ＶＩａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＣＯＯＭｅであり、ｎは０である。好ましくは、Ｘはブロモである。したがって、リンカーは、化合物２および５から選択されてもよく、好ましくは、化合物５であってもよい。
【0095】
いくつかの態様において、Ｒ１はＬを含む。例えば、Ｒ１は、脱マスキングされ、薬物部分、追加の抗体、半抗体、もしくは抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物にコンジュゲートされ得る直交官能化に起因する、リンカー化合物１４、１５、１６、１７、および１８、好ましくは、リンカー化合物１４、１５、１６、および１７におけるとおりＣＯＮＨＬであってもよい。このため、方法は、追加の部分、例えば、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）を結合するステップをさらに含んでもよい。このような方法において、図１（４）および図１（８）に示される構造が生成されることがあり、図１（４）は、２つの頭部基が同じである場合に得られる生成物を明示し、図１（８）は、２つの頭部基が異なる場合に得られる生成物を明示する。
【0096】
いくつかの態様において、図１（２）に示される単官能化抗体を生成するための方法は、選択的に部分的に還元された抗体を用いて開始される。これらの方法は、本発明の特定のリンカー化合物、特に、重鎖－軽鎖を再架橋するための式（Ｉａ）のオルト化合物であるリンカー化合物の選好性を利用する。Ｘは、ＢｒおよびＩから選択されてもよく、好ましくは、ＸはＢｒである。
【0097】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩ）に示されるモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する単官能化抗体を生成するための方法であって、完全に還元された抗体を、約１～１．１当量の式Ｉａのリンカー化合物を用いて処理することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、ＸはＢｒである。
【0098】
好ましくは、リンカー化合物は式（ＩＩａ）の化合物である。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡまたはＨである化合物である。上記のとおり、本発明者らは、軽鎖－重鎖架橋に対して、非置換リンカーが好ましい場合があること認めた。したがって、いくつかの方法において、化合物は、式（Ｖａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＨであり、ｎは０である。したがって、第１のリンカーは、化合物１２であってもよい。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡまたはＨである化合物である。上記のとおり、本発明者らは、軽鎖－重鎖架橋に対して、非置換リンカーが好ましい場合があること認めた。したがって、いくつかの方法において、化合物は、式（Ｖａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＨであり、ｎは０である。したがって、第１のリンカーは、化合物１２であってもよい。
【0099】
他の態様において、リンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡ、好ましくは、ＣＯＯＭｅである化合物である。したがって、いくつかの方法において、化合物は、式（ＶＩａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＣＯＯＭｅであり、ｎは０である。したがって、第１のリンカーは、化合物５であってもよい。
【0100】
いくつかの態様において、Ｒ１はＬを含む。例えば、Ｒ１は、脱マスキングされ、薬物部分、追加の抗体、半抗体、もしくは抗体断片、またはタンパク質にコンジュゲートされ得る直交官能化に起因する、リンカー化合物１６、１７、および１８、好ましくは、リンカー化合物１６または１７におけるとおりＣＯＮＨＬであってもよい。このため、方法は、追加の部分、例えば、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）を結合するステップをさらに含んでもよい。
半抗体コンジュゲート
いくつかの態様において、方法は、同じ重鎖にあるスルフィド部分内を架橋するリンカーモチーフを有する半抗体を生成する（例は図１（１）および（３）に示される）。
半抗体コンジュゲート
いくつかの態様において、方法は、同じ重鎖にあるスルフィド部分内を架橋するリンカーモチーフを有する半抗体を生成する（例は図１（１）および（３）に示される）。
【0101】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、ヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体（いわゆる、半抗体コンジュゲート）を生成する方法であって、完全に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理することを含む方法を提供する。このような半抗体は図の標識されたＨＣ－ＬＣであり、例えば、図５を参照すること。
【0102】
本発明者らは、過剰（４当量以上）な本明細書に記載のオルトおよびメタ化合物の両方を用いた主な生成物は、式（ＶＩＩＩ）に記載の２つのモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体コンジュゲートであることを認めた。したがって、半抗体生成物は、図１（１）に示されるとおり、２つの同じリンカーを含み、１つ目は重鎖にあるスルフィド部分内を架橋し、２つ目は重鎖と軽鎖を架橋する。
【0103】
オルト化合物を用いた場合、認められる副生成物は少ない。したがって、リンカー化合物は、好ましくは、式（Ｉａ）の化合物、例えば、式（ＩＩａ）または（ＩＩｃ）の化合物であってもよい。好ましくは、ｎは０である。化合物は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｃ）、（ＶＩＩａ）、または（ＶＩＩｃ）、好ましくは、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）、（ＶＩａ）、または（ＶＩＩａ）の化合物であってもよい。
【0104】
好ましくは、ＸはＢｒまたはＩ、好ましくは、Ｂｒである。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、化合物２、５、９、１２、１６、および１７、好ましくは、化合物５および１２から選択される。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、化合物２、５、９、１２、１６、および１７、好ましくは、化合物５および１２から選択される。
【0105】
リンカー化合物は、少なくとも４当量、例えば、少なくとも５当量の化学量論で提供され、例えば、約８当量が提供されることがある。
リンカー化合物が、４当量未満、例えば、約１～１．１または２～２．２当量の化学量論で提供される場合、本発明者らは、本発明の化合物における位置選択性を認めた。例えば、本発明者らは、メタ化合物、特にＸがＩであるメタ化合物における－ＨＣ内の架橋に対する明確な選好性を認めた。
リンカー化合物が、４当量未満、例えば、約１～１．１または２～２．２当量の化学量論で提供される場合、本発明者らは、本発明の化合物における位置選択性を認めた。例えば、本発明者らは、メタ化合物、特にＸがＩであるメタ化合物における－ＨＣ内の架橋に対する明確な選好性を認めた。
【0106】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、ヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーを有する半抗体を生成する方法であって、完全に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉｂ）のリンカー化合物を用いて処理することを含む方法を提供する。
【0107】
好ましくは、ｎは０である。すなわち、リンカー化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物である。例えば、リンカー化合物は、式（ＩＩＩｂ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖｂ）、または（ＶＩｂ）、好ましくは、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖｂ）、または（ＶＩｂ）の化合物であってもよい。
【0108】
好ましくは、ＸはＩまたはＢｒ、最も好ましくは、Ｉである。
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬである。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、化合物２、３、９、１０、１４、および１５、好ましくは、化合物３、１０、および１５から選択される。
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＬである。
いくつかの態様において、リンカー化合物は、化合物２、３、９、１０、１４、および１５、好ましくは、化合物３、１０、および１５から選択される。
【0109】
リンカー化合物のうちの少なくとも１つがＬを含む場合、方法は、追加の部分、例えば、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）を結合するステップを含むことがある。化合物１５は、好ましい例である。
【0110】
いくつかの態様において、リンカー化合物の量は、約２～２．２当量である。次に、方法は、ＨＣ－ＬＣジスルフィドを再架橋するステップをさらに含んでもよい。この再架橋は、可能な場合、酸化によって、またはより好ましくは、半抗体を、本発明に記載の追加のリンカー化合物を用いて処理することによってジスルフィド架橋を生成することがある。この後者の場合、リンカー化合物は、本明細書に記載の任意のリンカー化合物であってもよく、図１（３）に示されるコンジュゲートを作成するために、半抗体コンジュゲートあたり約１～１．１当量以上、すなわち、完全に還元された抗体あたり約２～２．２当量以上で使用されることがある。
【0111】
いくつかの態様において、方法は、（図１（３）に示されるとおり）重鎖にあるスルフィド部分内を架橋するリンカーおよび重鎖と軽鎖を架橋する異なるリンカーを有する半抗体を生成する。
【0112】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、重鎖と軽鎖を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーである第１のリンカーを有し、ヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋する式（ＶＩＩＩ）に記載のモチーフまたは本明細書に記載の任意のリンカーである第２のリンカーを有するヘテロ－二官能化半抗体を生成する方法であって、
（ｉ）部分的に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載の第１のリンカー化合物を用いて処理し、第１のコンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉ）前記第１のコンジュゲートをさらに還元し、還元コンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉｉ）前記還元コンジュゲートを、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載の第２のリンカー化合物を用いて処理し、前記ヘテロ－二官能化半抗体コンジュゲートを生成するステップとを含み、前記第１と第２のリンカー化合物が異なる、方法を提供する。
（ｉ）部分的に還元された抗体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載の第１のリンカー化合物を用いて処理し、第１のコンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉ）前記第１のコンジュゲートをさらに還元し、還元コンジュゲートを生成するステップと、次に
（ｉｉｉ）前記還元コンジュゲートを、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載の第２のリンカー化合物を用いて処理し、前記ヘテロ－二官能化半抗体コンジュゲートを生成するステップとを含み、前記第１と第２のリンカー化合物が異なる、方法を提供する。
【0113】
いくつかの態様において、第１および第２のリンカー化合物のうちの１つはＬ基を含む。言い換えると、リンカー化合物のうちの少なくとも１つは、式（ＩＩＩ）（例えばＩＩＩａまたはＩＩＩｂ、好ましくは、ＩＩａ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）（好ましくは、ＩＶｂ）の化合物であってもよい。好ましくは、第２のリンカー化合物は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、および（ＩＶｃ）、より好ましくは、（ＩＩｂ）および（ＩＩＩｂ）におけるとおりＬを含む。例えば、第２のリンカー化合物は、化合物１４、１５、１６、および１７から選択されてもよく、好ましくは、化合物１５であってもよい。
【0114】
いくつかの態様において、第１のリンカー化合物は、Ｌを含まない。いくつかの態様において、第１のリンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡまたはＨである化合物である。本発明者らは、軽鎖－重鎖架橋に対して、非置換リンカー化合物が好ましい場合があることを認めた。したがって、いくつかの方法において、リンカー化合物は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）、好ましくは、（Ｖａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＨであり、ｎは０である。好ましくは、Ｘはブロモである。したがって、第１のリンカー化合物は、化合物９および１２から選択されてもよく、好ましくは、化合物１２であってもよい。
【0115】
リンカー化合物のうちの少なくとも１つがＬを含む場合、方法は、追加の部分、例えば、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）を結合するステップを含むことがある。
【0116】
いくつかの態様において、第１のリンカー化合物は、Ｒ１がＣＯＯＲＡ、好ましくは、ＣＯＯＭｅである化合物である。したがって、いくつかの方法において、リンカー化合物は、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）、好ましくは、（ＶＩａ）の化合物である。すなわち、Ｒ１はＣＯＯＭｅであり、ｎは０である。好ましくは、Ｘはブロモである。したがって、第１のリンカー化合物は、化合物２および５から選択されてもよく、好ましくは、化合物５であってもよい。
【0117】
いくつかの態様において、方法は、約２～２．２当量、例えば、約２．２当量のＴＣＥＰのような還元剤を使用して抗体を部分的に還元することによって、部分的に還元された抗体を準備するステップをさらに含む。
【0118】
いくつかの態様において、前記コンジュゲートをさらに還元するステップは、約２～２．２当量、例えば、約２．２当量のＴＣＥＰのような還元剤を使用する。
適切には、還元ステップ後に、反応は、リンカー化合物の添加前に、例えば、ペンタ－ＰＥＧアジドを使用してクエンチされる。
適切には、還元ステップ後に、反応は、リンカー化合物の添加前に、例えば、ペンタ－ＰＥＧアジドを使用してクエンチされる。
【0119】
いくつかの態様において、本発明は、ヘテロ－二官能化半抗体コンジュゲートを生成する方法であって、完全に還元された抗体を、ＸがＢｒである式（Ｉａ）に記載の第１のリンカー化合物およびＸがＩである式（Ｉｂ）の第２のリンカー化合物を用いて処理するステップを含む方法を提供する。第１および第２のリンカー化合物は、同時に加えられてもよい。第１のリンカー化合物は、重鎖と軽鎖を再架橋し、第２のリンカー化合物は、ヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋する。生成物は、図１（３）に示され、Ｌ１は第１のリンカーを表し、Ｌ２は第２のリンカーを表す。いくつかの態様において、第１のリンカー化合物は、式（ＩＩａ）に記載の化合物であり、第２のリンカー化合物は、式（ＩＩｂ）に記載の化合物である。
Ｆａｂコンジュゲート
いくつかの態様において、本発明は、安定したチオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを生成するための方法に関する。すなわち、本明細書に記載の式（ＶＩＩＩ）のリンカーによって連結された軽鎖および消化された（切断された）重鎖を含む生成物である。
Ｆａｂコンジュゲート
いくつかの態様において、本発明は、安定したチオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを生成するための方法に関する。すなわち、本明細書に記載の式（ＶＩＩＩ）のリンカーによって連結された軽鎖および消化された（切断された）重鎖を含む生成物である。
【0120】
ｆＡｂ出発物質は、市販で得られるか、当該分野で説明される方法を用いた、例えば、パパインを使用する抗体の消化によって得られ得る。Ａｎｄｒｅｗ＆Ｔｉｔｕｓ［２０００］を参照すること。
【0121】
チオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを生成する方法は、
（ｉ）ｆＡｂ断片を還元し、還元ｆＡｂ前駆体を生成するステップと、次に
（ｉｉ）前記還元ｆＡｂ前駆体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理し、前記チオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを生成するステップと
を含んでよい。
（ｉ）ｆＡｂ断片を還元し、還元ｆＡｂ前駆体を生成するステップと、次に
（ｉｉ）前記還元ｆＡｂ前駆体を、本明細書に記載の式（Ｉ）～（ＶＩＩ）のうちの任意の１つに記載のリンカー化合物を用いて処理し、前記チオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを生成するステップと
を含んでよい。
【0122】
好ましくは、リンカー化合物は、追加の官能化／コンジュゲーションのためのＬ基を含む。すなわち、Ｒ１はＬを含む。例えば、Ｒ１は、リンカー化合物１４、１５、１６、１７、および１８、好ましくは、化合物１８におけるとおりＣＯＮＨＬであってもよい。
【0123】
言い換えると、リンカー化合物は、式（ＩＩＩ）（好ましくは、ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（Ｖｃ）（好ましくは、ＶＩａ）の化合物であってもよい。最も好ましくは、リンカー化合物は、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）、好ましくは、（ＩＶａ）の化合物である。ＸはＢｒであってもよく、好ましくは、ＸはＢｒである。
【0124】
このため、方法は、コンジュゲートされた生成物、例えば、ｆＡｂ－ｍＡｂまたはｆＡｂ－タンパク質生成物を形成するために、還元されたか、もしくは部分的に還元された抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物を、前記チオ架橋ｆＡｂコンジュゲートを用いて処理することをさらに含んでもよい。
【0125】
本発明者らは、本明細書に記載の方法において、反応のｐＨが約７．５である場合、選択性が改善されることを認めた。したがって、本明細書に記載のいくつかの方法において、ｐＨは、約８を下回り、好ましくは、約６～約８の間、最も好ましくは、約７．５である。好ましいｐＨ値は、より高い収率をもたらすことが認められた。本発明者らは、反応がさらに完了に向かい、恐らく、高いｐＨでは試薬の加水分解および低いｐＨではより低い反応性の結果となる（チオールプロトン化のため）ことに注目している。
【0126】
いくつかの態様において、本明細書に記載の任意の方法における抗体は、トラスツズマブおよびリツキシマブから選択される。
本発明は、記載の側面および好ましい特徴の組合せを含み、このような組合せが明らかに許容されないか、または明確に回避される場合を除く。
本発明は、記載の側面および好ましい特徴の組合せを含み、このような組合せが明らかに許容されないか、または明確に回避される場合を除く。
【0127】
本発明の原理を例証する態様および実験は、添付の図面を参照してこれより論じられるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0128】
【図1】本発明に記載の特定のコンジュゲート生成物の代表的な図形であって、ラベルＬ１およびＬ２は、ジスルフィドにおいて再架橋するか、または内部架橋する頭部基を表記し、黒い曲線は、スペーサーを示す図形である。天然ジスルフィドは、黒点で繋がる黒線によって示される。
【図2】メチルエステル誘導体化された３，４－および３，５－リンカー化合物の水溶液安定性の比較を示す図である。
【図3】エステルおよびアミド誘導体化されたアリールビス－ハロアセトアミドリンカーの水溶液安定性の間の比較を示す図である。
【図4】リン酸緩衝水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中、グルタチオン（２．２当量）存在下におけるビス－ハロアセトアミド誘導体１４～１７の残存パーセンテージを示す図である。
【図5】様々な化学量論下で、過剰なリンカー化合物２、５、８、および１２を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例４を参照すること。
【図6】様々なｐＨ下で、過剰なリンカー化合物２、５、８、および１２を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例５を参照すること。
【図7】リンカー化合物３、６、１０、および１３を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例６を参照すること。
【図8】リンカー化合物１４、１５、１６、および１７を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例７を参照すること。
【図9】リンカー化合物３、６、９、および１２を用いた完全に還元されたリツキシマブの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例８を参照すること。
【図10】化合物２、５、９、および１２を用いた部分的に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。図説のために実施例９を参照すること。
【図11】リンカー化合物５および１５用いた逐次法を用いた二官能性架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ａ）および生成物の略図（ｂ）を示す図である。図説のために実施例９を参照すること。
【図12-1】チオ架橋Ｆａｂ誘導体の略図（ａ）、イピリムマブ－ｆＡｂを用いた部分的に還元されたＴｍａｂのコンジュゲーションに関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ｂ）（図説のために実施例１０を参照）、および本発明に記載の三重特異性ｍＡｂの略図（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１２を参照すること。
【図12-2】チオ架橋Ｆａｂ誘導体の略図（ａ）、イピリムマブ－ｆＡｂを用いた部分的に還元されたＴｍａｂのコンジュゲーションに関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ｂ）（図説のために実施例１０を参照）、および本発明に記載の三重特異性ｍＡｂの略図（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１２を参照すること。
【図13-1】化合物１５および１７を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ａ）、化合物１５からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｂ）、および化合物１７からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１１を参照すること。
【図13-2】化合物１５および１７を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ａ）、化合物１５からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｂ）、および化合物１７からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１１を参照すること。
【図13-3】化合物１５および１７を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ａ）、化合物１５からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｂ）、および化合物１７からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１１を参照すること。
【図13-4】化合物１５および１７を用いた完全に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（ａ）、化合物１５からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｂ）、および化合物１７からの反応生成物の質量分析を使用した特性評価（ｃ）を示す図である。図説のために実施例１１を参照すること。
【図14】スフェロイドモデルの共焦点顕微鏡検査を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0129】
本発明の側面および態様は、添付の図面を参照してこれより論じられるであろう。さらなる側面および態様は、当業者にとって明白であろう。本文に言及されたすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
化合物の安定性
本発明のリンカー化合物は、水中で望ましい安定性を有し、容易には加水分解されない。
化合物の安定性
本発明のリンカー化合物は、水中で望ましい安定性を有し、容易には加水分解されない。
【0130】
ｐＨ＝７のリン酸緩衝液中で保存されるビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの水溶液安定性に著しい差異が認められた。概して、３，５－化合物（メタ配置）は、２，３－および３，４－化合物（オルト配置）よりもはるかに安定していた。興味深いことに、安定性は、化合物の各基内のハロゲン化物脱離基と直接相関することはなかった。３，４－置換安息香酸における安定性は、Ｉ＜Ｂｒ＜Ｃｌ（最も安定）の順であった。３，５－置換安息香酸における安定性は、Ｂｒ＜Ｃｌ＜Ｉ（最も安定）の順であった。
【0131】
興味深いことに、アリールがアミド基を有する（すなわち、Ｒ１がアミドである）場合、ハロゲン化物安定性における普通の傾向に反して、ヨードは、対応するブロモ化合物より安定している。
【0132】
Ｒ１アミド基を有する化合物において、オルトおよび対応するメタ化合物の安定性はより類似していた。エステル官能基をアミド官能基と交換することは、ハロゲン化物安定性における傾向を逆転させ（ヨード－はブロモ－より安定している）、２，３－修飾は、１，３－修飾と類似の安定性を有していた。Ｌ基の存在は、溶解性を改善する。
【0133】
非置換化合物（Ｒ１がＨ）は、エステル誘導体と同じ安定性の傾向を示したが、概して、安定性がより低い。いずれの特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、誘導的な電子供与性基／メソメリー的な（ｍｅｓｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）電子吸引性基Ｒ１の存在が安定性を高めることがあると考えている。したがって、記載されるいくつかの化合物、コンジュゲート、および方法において、Ｒ１はＨではない。
【0134】
すべてのものが、使用にあたって十分に安定している。
チオールに対する反応性
ペプチドであるグルタチオンを含む小さなチオールに対する化合物の相対的な反応性が評価された（ｐＨ＝７、室温）。ビス－（２－クロロアセトアミド）は、ブロモ－またはヨード－誘導体より著しく遅い反応速度を示す。３，４－ビス－Ｃｌ化合物（４）は、３，５－ビス－Ｃｌ化合物（１）より著しく速く反応することが認められた。いずれの特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、オルトおよびメタ化合物の反応性および安定性における差異は、各化合物の３Ｄ構造における差異に起因する場合があると推測する。３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（１）は、平面の立体配座を有すると予測される。このため、立体障害は、（ＳＮ２機構を介した）ハロゲンに結合された炭素におけるチオレートの背面攻撃を遅らせ得る。これは、３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（４）のようなオルト化合物のより大きな反応性を説明し得る。化合物（４）は平面ではなく、背面攻撃においてより接近しやすい炭素を提供し得る。
チオールに対する反応性
ペプチドであるグルタチオンを含む小さなチオールに対する化合物の相対的な反応性が評価された（ｐＨ＝７、室温）。ビス－（２－クロロアセトアミド）は、ブロモ－またはヨード－誘導体より著しく遅い反応速度を示す。３，４－ビス－Ｃｌ化合物（４）は、３，５－ビス－Ｃｌ化合物（１）より著しく速く反応することが認められた。いずれの特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、オルトおよびメタ化合物の反応性および安定性における差異は、各化合物の３Ｄ構造における差異に起因する場合があると推測する。３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（１）は、平面の立体配座を有すると予測される。このため、立体障害は、（ＳＮ２機構を介した）ハロゲンに結合された炭素におけるチオレートの背面攻撃を遅らせ得る。これは、３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（４）のようなオルト化合物のより大きな反応性を説明し得る。化合物（４）は平面ではなく、背面攻撃においてより接近しやすい炭素を提供し得る。
【0135】
したがって、本明細書に記載されるいくつかの化合物、コンジュゲート、および方法において、リンカー化合物は、式（ＶＩｂ）の化合物ではないように選択されることがある。
【0136】
クロロ－誘導体はチオールと反応し、実行可能な連結化合物であるが、本明細書に記載の実施例では、反応速度がより速いため、主にブロモ－およびヨード－アセトアミドが使用される。言い換えると、好ましくは、ＸはＢｒまたはＩである。
すべてのものが、本発明の方法で使用されるために十分な反応性がある。
すべてのものが、本発明の方法で使用されるために十分な反応性がある。
【0137】
化合物の選択性
エステルおよびアミド置換化合物および非置換アリーレン化合物では、トラスツズマブと反応した場合に、オルト－およびメタ－置換リンカー化合物におけるチオール架橋のパターンが異なる。
エステルおよびアミド置換化合物および非置換アリーレン化合物では、トラスツズマブと反応した場合に、オルト－およびメタ－置換リンカー化合物におけるチオール架橋のパターンが異なる。
【0138】
リンカー化合物が過剰に提供される場合、この反応は、１つが重鎖内（Ｈ－Ｈ）ジスルフィドを架橋する２つのリンカーに結合された半抗体生成物を生成する。本発明者らは、メタ（すなわち、１，３－ビス－（２－ハロアセトアミド）－）配置を有するリンカー化合物は、より多くのＬＣ－ＬＣおよびＨ－Ｈ間が生成されることで、より多く副生成物を生成することを認めた。したがって、抗体が完全に還元され、リンカーが過剰に（４当量以上）提供される場合、式（Ｉａ）のオルトリンカー化合物を使用することが望ましいことがある。
【0139】
しかし、本発明者らは、オルトがより少ない「副生成物」（ＬＣ－ＬＣ、－ＨＣ間）をもたらす一方で、メタ化合物は、－ＨＣ内結合の選好性および半抗体の生成を有することを認めた。したがって、完全に還元された抗体を４当量未満のリンカーで処理する場合、半抗体コンジュゲートの生成のためには、メタ化合物（すなわち、式（Ｉｂ）のリンカー化合物）を使用することが望ましい。
【0140】
本発明者らは、位置化学的構造に関係なく、アリールビス（２－ヨードアセトアミド）化合物（ＸはＩ）は、対応するアリールビス（２－ブロモアセトアミド）化合物（ＸはＢｒ）よりも－ＨＣ内連結に対する高い選好性を示すことにも注目した。したがって、半抗体コンジュゲート（図１中（１）および（３））の選好的な生成のためには、ＸがＩである化合物が好まれる。
【0141】
ＨＣ－ＬＣコンジュゲート（すなわち、重鎖と軽鎖を架橋しているリンカーを有する抗体）の生成において、本発明者らは、オルト化合物がより高い選択性を示すことを認めた。したがって、完全に還元された抗体を４当量未満のリンカー化合物で処理する場合、単官能化ＨＣ－ＬＣ抗体コンジュゲート（すなわち、１つのリンカーが重鎖と軽鎖を架橋している）の生成のためには、オルト化合物（すなわち、式（Ｉａ）のリンカー化合物）を使用することが望ましい。
【0142】
本発明者らは、位置化学的構造に関係なく、アリールビス（２－ブロモアセトアミド）化合物（ＸはＢｒ）は、対応するアリールビス（２－ヨードアセトアミド）化合物（ＸはＩ）よりもＨＣ－ＬＣ連結に対する高い選好性を示すことも認めた。したがって、ＨＣ－ＬＣ抗体コンジュゲート（図１中（２））の選好的な生成のためには、ＸがＢｒである化合物が好まれる。
【0143】
化学量論量およびほぼ化学量論（わずかに過剰な）量の還元剤が使用される場合、コンジュゲートにおけるリンカーの位置は、ジスルフィド架橋還元の位置選択性によって決定され得る。
【0144】
本発明者らは、化合物が単独のＨＣ－ＬＣジスルフィド架橋の選択的な還元を経て、ｍＡｂあたり１つのＨＣ－ＬＣコンジュゲートを生成することを認めた。このように部分的に還元された抗体を使用する反応において、非置換アリーレンリンカーは、反応をより良好に進行することが示された。４当量未満の還元剤が使用される場合、ＨＣ－ＬＣコンジュゲートの生成において非置換アリーレンリンカーは好ましい場合がある。
【0145】
実施例１１は、この位置選択性の良い例示を提供する。完全に還元されたＴｍａｂ（還元された４つのジスルフィド）は、２当量のみのリンカー化合物で処理された。３，４－化合物（Ｘ＝Ｉ）は、ＬＣ－ＨＣに対する高い選好性を示し、－ＨＣ内架橋に対する選好性はほぼない。３，５－化合物（Ｘ＝Ｉ）は、－ＨＣ内に対する高い選好性を示し、ほぼすべてのＨＣが１つのリンカーを有するが、２つのリンカーを用いたＨＣ－ＬＣコンジュゲートも形成する（これは、１つのリンカーを有する最初の－ＨＣ内生成物は、次に、別のリンカーと反応してＬＣを結合することが可能であることを意味する）。１つのリンカー分子のみを含有するＨＣ－ＬＣ生成物は認められなかった。
【0146】
本発明者らは、これらの選好性が、本明細書に記載のリツキシマブに関する実施例によって、他のｍＡｂにまで及ぶと考えている。
このため、リンカー化合物の選択性を利用することで、完全に還元されたｍＡｂを、限られた量（４当量未満）の本発明の任意のリンカー化合物を用いて処理することによって、トラスツズマブのようなｍＡｂの部位選択的な単官能化を得ることが可能であることが認識されているであろう。本発明は、連続する還元とリンカー化合物を用いた処理を介するか、または異なる部位選択性を有するリンカー化合物の混合物を使用して複数のｍＡｂを同時にヘテロ－二官能化することによってのいずれかで、ｍＡｂのヘテロ－二官能化を達成する可能性をさらに示す。
このため、リンカー化合物の選択性を利用することで、完全に還元されたｍＡｂを、限られた量（４当量未満）の本発明の任意のリンカー化合物を用いて処理することによって、トラスツズマブのようなｍＡｂの部位選択的な単官能化を得ることが可能であることが認識されているであろう。本発明は、連続する還元とリンカー化合物を用いた処理を介するか、または異なる部位選択性を有するリンカー化合物の混合物を使用して複数のｍＡｂを同時にヘテロ－二官能化することによってのいずれかで、ｍＡｂのヘテロ－二官能化を達成する可能性をさらに示す。
【0147】
コンジュゲートの安定性
ジアセトアミド化合物の位置化学は、そのコンジュゲート（本発明のリンカーを含む抗体、半抗体、および抗体断片）の安定性に小さな差異がある。この３，４－連結コンジュゲートは、２，３－および３，５－連結コンジュゲートよりわずかに安定している。すべてのジアセトアミドコンジュゲーション生成物は、グルタチオンを用いたマレイミドのコンジュゲーション生成物より著しく安定していることが認められた。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で保存した場合、すべてのコンジュゲートは、ＤＴＴなしで保存されたサンプルと同程度の安定性を示す。
ジアセトアミド化合物の位置化学は、そのコンジュゲート（本発明のリンカーを含む抗体、半抗体、および抗体断片）の安定性に小さな差異がある。この３，４－連結コンジュゲートは、２，３－および３，５－連結コンジュゲートよりわずかに安定している。すべてのジアセトアミドコンジュゲーション生成物は、グルタチオンを用いたマレイミドのコンジュゲーション生成物より著しく安定していることが認められた。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で保存した場合、すべてのコンジュゲートは、ＤＴＴなしで保存されたサンプルと同程度の安定性を示す。
【0148】
定義
抗体
抗体という用語は、当該分野で十分に理解されており、免疫グロブリン（Ｉｇ）と同意語である。ヒトでは、５種類の抗体、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤがある。抗体という用語は、すべての種類を含むことが意図されるが、本明細書における抗体の種類は、もっぱらＩｇＧであろうことが認識されているであろう。本発明者らは、ＩｇＧアイソタイプの間に共通の特徴を認め、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４を試験し、リンカー化合物および生成物に対する同等の選択性を認めた。抗体という用語は、モノクローナル抗体を包含することが意図されることも当業者にとって明白であろう。実施例は、モノクローナル抗体であるトラスツズマブ、イピリムマブ、およびリツキシマブを使用する。これらのモノクローナル抗体は、場合によって好まれることがあるが、本発明がそられに限定されることを意図するものではないことは、理解されるべきである。
抗体
抗体という用語は、当該分野で十分に理解されており、免疫グロブリン（Ｉｇ）と同意語である。ヒトでは、５種類の抗体、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤがある。抗体という用語は、すべての種類を含むことが意図されるが、本明細書における抗体の種類は、もっぱらＩｇＧであろうことが認識されているであろう。本発明者らは、ＩｇＧアイソタイプの間に共通の特徴を認め、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４を試験し、リンカー化合物および生成物に対する同等の選択性を認めた。抗体という用語は、モノクローナル抗体を包含することが意図されることも当業者にとって明白であろう。実施例は、モノクローナル抗体であるトラスツズマブ、イピリムマブ、およびリツキシマブを使用する。これらのモノクローナル抗体は、場合によって好まれることがあるが、本発明がそられに限定されることを意図するものではないことは、理解されるべきである。
【0149】
本明細書で使用する場合、文脈上別段の指示がない限り、抗体という用語は、全体の抗体、つまり、Ｙ－配置の単量体形態である両重鎖および両軽鎖を指す。
【0150】
半抗体
半抗体という用語は、当該分野で理解されており、重鎖－軽鎖ペアを述べるために本明細書で使用される。
半抗体という用語は、当該分野で理解されており、重鎖－軽鎖ペアを述べるために本明細書で使用される。
【0151】
抗体断片
本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、抗体断片という用語は、抗体の可変領域から生成され得る抗原架橋断片を指す。このため、抗体断片という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ抗体断片を包含することが意図される。抗体断片は、目的に応じて選択されるであろうが、適切な抗体断片の選択および連結は、当業者の能力の範囲内であることは理解されるであろう。特に好ましい断片は、Ｆａｂ断片である。
本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、抗体断片という用語は、抗体の可変領域から生成され得る抗原架橋断片を指す。このため、抗体断片という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ抗体断片を包含することが意図される。抗体断片は、目的に応じて選択されるであろうが、適切な抗体断片の選択および連結は、当業者の能力の範囲内であることは理解されるであろう。特に好ましい断片は、Ｆａｂ断片である。
【0152】
いくつかの態様において、本発明は三重特異性抗体に関する。このように、特異的なＦａｂ－Ｍａｂコンジュゲートは生成され得る（図１の（４）および（８）参照）。
抗体コンジュゲート
「コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用する場合、生成物中の本発明に記載のリンカーの存在を指す。このリンカーは、抗体、半抗体、または抗体断片に結合される。結合され得るリンカーは、２つの鎖を再架橋する場合があるか、または重鎖間というよりも、重鎖内ジスルフィドを連結する場合がある。
抗体コンジュゲート
「コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用する場合、生成物中の本発明に記載のリンカーの存在を指す。このリンカーは、抗体、半抗体、または抗体断片に結合される。結合され得るリンカーは、２つの鎖を再架橋する場合があるか、または重鎖間というよりも、重鎖内ジスルフィドを連結する場合がある。
【0153】
リンカーは、追加の部分、例えば、抗体、半抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、薬物、または他の化合物（例えば、蛍光標識または放射性標識）に結合することがある。例えば、リンカー化合物１８のようなリンカー化合物は、チオール架橋を再架橋することができる２つのビス（ハロアセトアミド）頭部基を含み、そのため、例えば、ｍＡｂタンパク質コンジュゲートの形成のために使用され得るが（実施例１０参照）、リンカー化合物１４、１５、１６、および１７は、例えば、クリックケミストリーまたはアミドカップリングを介して、追加の部分を結合するために使用され得るアジドを含む。
【0154】
本明細書に記載のコンジュゲートが追加の部分と連結される場合、「コンジュゲート生成物」という用語が使用される。コンジュゲート生成物の例には、ｆＡｂ－ｍＡｂコンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、ｍＡｂ－タンパク質コンジュゲート、および標識されたコンジュゲート（例えば、ｍＡｂ－フルオロフォアコンジュゲート）が含まれる。
【0155】
タンパク質またはポリペプチド
本発明のリンカーは、例えば、ｍＡｂ－タンパク質コンジュゲートを生成するために使用され得る。タンパク質という用語は、抗体、半抗体、または抗体断片を包含するが、本明細書で使用する場合、この用語は、非抗体タンパク質を包含することが意図される。ポリペプチドという用語は、短鎖のアミノ酸を指す。これは、例えば、リンカー化合物１４、１５、１６、および１７のアジド部分を介して（還元およびペプチドカップリングを介して）コンジュゲートされ得るか、または化合物１８の使用を介して直接導入され得る。多くのポリペプチド薬物は、当該分野で既知であり、本発明の方法および生成物において有用である場合がある。
本発明のリンカーは、例えば、ｍＡｂ－タンパク質コンジュゲートを生成するために使用され得る。タンパク質という用語は、抗体、半抗体、または抗体断片を包含するが、本明細書で使用する場合、この用語は、非抗体タンパク質を包含することが意図される。ポリペプチドという用語は、短鎖のアミノ酸を指す。これは、例えば、リンカー化合物１４、１５、１６、および１７のアジド部分を介して（還元およびペプチドカップリングを介して）コンジュゲートされ得るか、または化合物１８の使用を介して直接導入され得る。多くのポリペプチド薬物は、当該分野で既知であり、本発明の方法および生成物において有用である場合がある。
【0156】
略語
当該分野において、抗体命名法の大文字は変化することは理解されるであろう。以下の定義は、以下の一覧で使用されている大文字と小文字の組合せに限定されることを意図するものではない。
当該分野において、抗体命名法の大文字は変化することは理解されるであろう。以下の定義は、以下の一覧で使用されている大文字と小文字の組合せに限定されることを意図するものではない。
【0157】
Ａｂ－抗体
Ｍａｂ／ｍＡｂ－モノクローナル抗体
ＴＣＥＰ－トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＨＣｌ塩とし供給されることが多い）。
Ｍａｂ／ｍＡｂ－モノクローナル抗体
ＴＣＥＰ－トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＨＣｌ塩とし供給されることが多い）。
【0158】
Ｔｍａｂ／ＴｍＡｂ－トラスツズマブ
ＩＦａｂ／ＩｆＡｂ－イピリムマブのＦａｂフラグメント
Ｉｍａｂ／ＩｍＡｂ－イピリムマブ
前述の説明、以下の特許請求の範囲、もしくは添付の図面で開示された特徴、それらの具体的な形態または開示された機能を実行するための手段、もしくは開示された結果を得るための方法もしくは工程の用語で表現された特徴は、必要に応じて、このような特徴を個別に、または任意の組合せで、多様なその形態における本発明を理解するために利用され得る。
ＩＦａｂ／ＩｆＡｂ－イピリムマブのＦａｂフラグメント
Ｉｍａｂ／ＩｍＡｂ－イピリムマブ
前述の説明、以下の特許請求の範囲、もしくは添付の図面で開示された特徴、それらの具体的な形態または開示された機能を実行するための手段、もしくは開示された結果を得るための方法もしくは工程の用語で表現された特徴は、必要に応じて、このような特徴を個別に、または任意の組合せで、多様なその形態における本発明を理解するために利用され得る。
【0159】
本発明は、上述の例示的な態様によるコンジュゲーションにおいて説明されているが、この開示が与えられる場合、多くの同等の修正および変形は、当業者にとって明白であろう。したがって、上記の本発明の例示的な態様は、例示的であり、限定しないとみなされる。記載の態様に対する種々の変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われることがある。
【0160】
あらゆる疑念を回避するために、本明細書で提供されるすべての理論的説明は、読者の理解を高める目的のために提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれかによって束縛されることを望まない。
【0161】
本明細書で使用されたすべての項の見出しは、組織化の目的のみのためであり、記載の主題を限定するとみなされるべきではない。
以下に続く特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のような変化形は、定めた整数またはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の整数またはステップまたは整数もしくはステップの群を除外することを意味するのではないと理解されるであろう。
以下に続く特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のような変化形は、定めた整数またはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の整数またはステップまたは整数もしくはステップの群を除外することを意味するのではないと理解されるであろう。
【0162】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことは留意するべきである。範囲は、本明細書において「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までと表現されることがある。このような範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または別の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「約」の使用によって、特定の値が別の態様を形成することは理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は、任意的であり、例えば、±１０％を意味する。
【実施例】
【0163】
実施例１
３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの一般的合成
本発明の化合物を連結する３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルは、以下の一般的合成に従って作製され得る（式中、必要に応じて、ＸはＢｒまたはＣｌである）。
３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの一般的合成
本発明の化合物を連結する３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルは、以下の一般的合成に従って作製され得る（式中、必要に応じて、ＸはＢｒまたはＣｌである）。
【0164】
【化16】
【0165】
化合物１
２－塩化クロロアセチル（１．３５ｇ、１２．０４ｍｍｏｌ、２当量）を、３，５－ジアミノ安息香酸メチル（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた溶液を、水、飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１）を淡黄色の固体として得た（１．７ｇ、８９％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 8.31 (s, 2H, NH), 8.20 (s, 1H, Ar), 7.93 (s, 2H, Ar), 4.16 (s, 2H, 2x CH2), 3.88 (s, 3H, Me). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.82, 164.10, 137.58, 131.88, 117.45, 115.56, 52.45, 42.71.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３４１．００６６。実測値：ｍ／ｚ３４１．００７７。
２－塩化クロロアセチル（１．３５ｇ、１２．０４ｍｍｏｌ、２当量）を、３，５－ジアミノ安息香酸メチル（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた溶液を、水、飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１）を淡黄色の固体として得た（１．７ｇ、８９％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 8.31 (s, 2H, NH), 8.20 (s, 1H, Ar), 7.93 (s, 2H, Ar), 4.16 (s, 2H, 2x CH2), 3.88 (s, 3H, Me). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.82, 164.10, 137.58, 131.88, 117.45, 115.56, 52.45, 42.71.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３４１．００６６。実測値：ｍ／ｚ３４１．００７７。
【0166】
化合物２
３，５－ジアミノ安息香酸メチル（１．０ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、１０分間にわたって撹拌しながら臭化ブロモアセチル（２．４当量、１．２６ｍＬ、１４．４５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。溶液を２４時間撹拌放置し、次に、酢酸エチルで１５０ｍＬにメスアップし、水（４×３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。この溶媒を減圧下で留去し、淡橙色の結晶を得た（２）（１．８６ｇ、収率７６％）。1H NMR, 400 MHz, CDCl3: δ 9.48 (s, 1H), 8.1 (s, 1H), 7.9 (s, 2H) 3.88 (s, 4H), 3.77 ppm (s, 3H); 13C NMR, 500MHz, CDCl3: δ166.3, 165.0, 138.8, 131.2, 116.5, 115.1, 52.1, 26.8 ppm;ＨＲＭＳ－ＥＳＩ：計算値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２＋：４０６．９２３７；実測値：４０６．９２６１。
３，５－ジアミノ安息香酸メチル（１．０ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、１０分間にわたって撹拌しながら臭化ブロモアセチル（２．４当量、１．２６ｍＬ、１４．４５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。溶液を２４時間撹拌放置し、次に、酢酸エチルで１５０ｍＬにメスアップし、水（４×３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。この溶媒を減圧下で留去し、淡橙色の結晶を得た（２）（１．８６ｇ、収率７６％）。1H NMR, 400 MHz, CDCl3: δ 9.48 (s, 1H), 8.1 (s, 1H), 7.9 (s, 2H) 3.88 (s, 4H), 3.77 ppm (s, 3H); 13C NMR, 500MHz, CDCl3: δ166.3, 165.0, 138.8, 131.2, 116.5, 115.1, 52.1, 26.8 ppm;ＨＲＭＳ－ＥＳＩ：計算値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２＋：４０６．９２３７；実測値：４０６．９２６１。
【0167】
化合物３
ＫＩ（１．５６ｇ、９．４３ｍｍｏｌ、２当量）を、３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（１）（１ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（３）を黄色の固体として得た（１ｇ、６３％）。1H NMR (CD3COCD3, 500 MHz): δ 9.91 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.16 (s, 2H), 4 (s, 4H), 3.89 (s, 3H). 13C NMR (CD3COCD3, 126 MHz): δ 166.82, 166.09, 140.01, 127.53, 131.52, 115.56, 114.00, 51.85, -0.00.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１３Ｉ２Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０２．８９６９、実測値：ｍ／ｚ５０２．８９５９。
３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの合成
本発明の化合物を連結する３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルは、以下の一般的合成に従って作製され得る（式中、必要に応じて、ＸはＢｒまたはＣｌである）。
ＫＩ（１．５６ｇ、９．４３ｍｍｏｌ、２当量）を、３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（１）（１ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（３）を黄色の固体として得た（１ｇ、６３％）。1H NMR (CD3COCD3, 500 MHz): δ 9.91 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.16 (s, 2H), 4 (s, 4H), 3.89 (s, 3H). 13C NMR (CD3COCD3, 126 MHz): δ 166.82, 166.09, 140.01, 127.53, 131.52, 115.56, 114.00, 51.85, -0.00.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１３Ｉ２Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０２．８９６９、実測値：ｍ／ｚ５０２．８９５９。
３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの合成
本発明の化合物を連結する３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルは、以下の一般的合成に従って作製され得る（式中、必要に応じて、ＸはＢｒまたはＣｌである）。
【0168】
【化17】
【0169】
化合物４
２－塩化クロロアセチル（１．３５ｇ、１２．０４ｍｍｏｌ、２当量）を、３，４－ジアミノ安息香酸メチル（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた溶液を、水、飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（Ｘ）を淡黄色の固体として得た（１．５ｇ、７９％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.84 (s, 1H, NH), 8.54 (s, 1H, NH), 8.04 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar), 7.94 (dd, J = 8.4, 2 Hz, 1H, Ar), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar), 4.19 (d, J = 12 Hz, 4H, 2 x CH2), 3.88 (s, 3H, Me). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.82, 164.10, 137.58, 131.88, 117.45, 115.56, 52.45, 42.71.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３４１．００６６。実測値：ｍ／ｚ３４１．００８６。
２－塩化クロロアセチル（１．３５ｇ、１２．０４ｍｍｏｌ、２当量）を、３，４－ジアミノ安息香酸メチル（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた溶液を、水、飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（Ｘ）を淡黄色の固体として得た（１．５ｇ、７９％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.84 (s, 1H, NH), 8.54 (s, 1H, NH), 8.04 (d, J = 2 Hz, 1H, Ar), 7.94 (dd, J = 8.4, 2 Hz, 1H, Ar), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar), 4.19 (d, J = 12 Hz, 4H, 2 x CH2), 3.88 (s, 3H, Me). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.82, 164.10, 137.58, 131.88, 117.45, 115.56, 52.45, 42.71.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３４１．００６６。実測値：ｍ／ｚ３４１．００８６。
【0170】
化合物５
２－臭化ブロモアセチル（２．９１ｇ、１４．４４ｍｍｏｌ、２．４当量）を、室温で、３，４－ジアミノ安息香酸メチル（１．０ｇ、６．０２ｍｍｏｌ、１．０当量）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に滴下して加えた。この反応混合物を、室温で２４時間撹拌し続けた。約１５０ｍＬの酢酸エチルを加えて溶液とし、これを蒸留水で３回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、残留溶媒を減圧下で留去して、３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）を帯黄色の粉末として得た（２．４０ｇ、９８％）。さらに、ＤＣＭを用いた再結晶化を行った。1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ 8.75 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, NH), 8.05 (s, 1H, Ar), 7.98 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7.77 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 4.07 (s, 2H, CH2), 4.04 (s, 2H, CH2), 3.91 (s, 3H, CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ167.79, 167.15, 165.31, 134.72, 128.82, 127.21, 126.40, 124.76, 52.43, 29.11.Ｅｓｉ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ４０４．９０９１、実測値：ｍ／ｚ４０４．９１３０。
２－臭化ブロモアセチル（２．９１ｇ、１４．４４ｍｍｏｌ、２．４当量）を、室温で、３，４－ジアミノ安息香酸メチル（１．０ｇ、６．０２ｍｍｏｌ、１．０当量）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に滴下して加えた。この反応混合物を、室温で２４時間撹拌し続けた。約１５０ｍＬの酢酸エチルを加えて溶液とし、これを蒸留水で３回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、残留溶媒を減圧下で留去して、３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）を帯黄色の粉末として得た（２．４０ｇ、９８％）。さらに、ＤＣＭを用いた再結晶化を行った。1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ 8.75 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, NH), 8.05 (s, 1H, Ar), 7.98 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7.77 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 4.07 (s, 2H, CH2), 4.04 (s, 2H, CH2), 3.91 (s, 3H, CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ167.79, 167.15, 165.31, 134.72, 128.82, 127.21, 126.40, 124.76, 52.43, 29.11.Ｅｓｉ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ４０４．９０９１、実測値：ｍ／ｚ４０４．９１３０。
【0171】
化合物６
ＫＩ（１．５６ｇ、９．４３ｍｍｏｌ、２当量）を、３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（４）（１ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（６）を黄色の固体として得た（１ｇ、６３％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 9.73 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 8.02 (1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.86 (s, 4H). 13C NMR (CDCl3, 126 MHz): δ 167.79, 167.15, 165.94, 127.53, 127.36, 126.65, 124.22, 52.11, -0.74, -1.0.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１３Ｉ２Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０２．８９６９、実測値：ｍ／ｚ５０２．８９５９。
ＫＩ（１．５６ｇ、９．４３ｍｍｏｌ、２当量）を、３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（４）（１ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（６）を黄色の固体として得た（１ｇ、６３％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 9.73 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 8.02 (1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.86 (s, 4H). 13C NMR (CDCl3, 126 MHz): δ 167.79, 167.15, 165.94, 127.53, 127.36, 126.65, 124.22, 52.11, -0.74, -1.0.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１３Ｉ２Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０２．８９６９、実測値：ｍ／ｚ５０２．８９５９。
【0172】
化合物７
２，３－ジアミノ安息香酸（１．０ｇ、６．５７ｍｍｏｌ、１当量）を、１０ｍＬの無水メタノール（ＭｅＯＨ）に溶解し、濃縮Ｈ２ＳＯ４を４滴加えてｐＨ＝１に酸性化した。反応液を５０℃に加熱し、撹拌しながら７２時間還流した。続いて、生成物を炭酸ナトリウムで中和し、減圧下で濃縮した。次に、残留溶液を、蒸留水で３回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、過剰な溶媒を減圧下で留去して、２，３－ジアミノ安息香酸メチルを暗褐色の固体として得た（０．７０ｇ、６４％）。次に、２－臭化ブロモアセチル（０．５８ｇ、２．８８ｍｍｏｌ、２．４当量）を、室温で、２，３－ジアミノ安息香酸メチル（０．２ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水ＤＣＭ溶液に滴下して加えた。反応フラスコを、室温で２４時間撹拌し続けた。次に、得られた溶液を、蒸留水で３回、濃縮塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、過剰な溶媒を減圧下で留去して、２，３－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（７）を帯黄色の固体として得た（０．３８ｇ、７８％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 10.70 (s, 1H, NH), 9.07 (s, 1H, NH), 7.92 (d, J = 8 Hz, 2H, Ar), 7.38 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 4.09 (s, 2H, CH2), 3.99 (s, 2H, CH2), 3.95 (s, 3H, CH2). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ167.33, 166.17, 164.80, 131.99, 128.79, 126.38, 122.61, 52.89, 29.28, 28.61.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ４０６．９２３７、実測値：ｍ／ｚ４０６．９２５１。
２，３－ジアミノ安息香酸（１．０ｇ、６．５７ｍｍｏｌ、１当量）を、１０ｍＬの無水メタノール（ＭｅＯＨ）に溶解し、濃縮Ｈ２ＳＯ４を４滴加えてｐＨ＝１に酸性化した。反応液を５０℃に加熱し、撹拌しながら７２時間還流した。続いて、生成物を炭酸ナトリウムで中和し、減圧下で濃縮した。次に、残留溶液を、蒸留水で３回、飽和塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、過剰な溶媒を減圧下で留去して、２，３－ジアミノ安息香酸メチルを暗褐色の固体として得た（０．７０ｇ、６４％）。次に、２－臭化ブロモアセチル（０．５８ｇ、２．８８ｍｍｏｌ、２．４当量）を、室温で、２，３－ジアミノ安息香酸メチル（０．２ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水ＤＣＭ溶液に滴下して加えた。反応フラスコを、室温で２４時間撹拌し続けた。次に、得られた溶液を、蒸留水で３回、濃縮塩化アンモニウムで１回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、過剰な溶媒を減圧下で留去して、２，３－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（７）を帯黄色の固体として得た（０．３８ｇ、７８％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 10.70 (s, 1H, NH), 9.07 (s, 1H, NH), 7.92 (d, J = 8 Hz, 2H, Ar), 7.38 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 4.09 (s, 2H, CH2), 3.99 (s, 2H, CH2), 3.95 (s, 3H, CH2). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ167.33, 166.17, 164.80, 131.99, 128.79, 126.38, 122.61, 52.89, 29.28, 28.61.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｂｒ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ４０６．９２３７、実測値：ｍ／ｚ４０６．９２５１。
【0173】
化合物８
２－塩化クロロアセチル（９．３ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）を、ベンゼン－１，３－ジアミン（１．５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の冷却したＮａＯＨ（０．５５Ｍ）水溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で一晩撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（８）を白色の固体として得た（０．９７ｇ、２７％）。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.34 (s, 2H, NH), 7.96 (t, J = 2.0 Hz, 1H, Ar), 7.37- 7.25 (m, 3H, Ar), 4.25 (s, 4H, 2 x CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ 164.61, 138.82, 129.14, 114.81, 110.36, 45.53.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ２８３．００１２。実測値：ｍ／ｚ２８３．００４９。
２－塩化クロロアセチル（９．３ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）を、ベンゼン－１，３－ジアミン（１．５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の冷却したＮａＯＨ（０．５５Ｍ）水溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で一晩撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（８）を白色の固体として得た（０．９７ｇ、２７％）。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.34 (s, 2H, NH), 7.96 (t, J = 2.0 Hz, 1H, Ar), 7.37- 7.25 (m, 3H, Ar), 4.25 (s, 4H, 2 x CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ 164.61, 138.82, 129.14, 114.81, 110.36, 45.53.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ２８３．００１２。実測値：ｍ／ｚ２８３．００４９。
【0174】
化合物９
２－臭化ブロモアセチル（２．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ベンゼン－１，３－ジアミン（０．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．３５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ、２．２当量）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄した後にエーテルで洗浄した。この固体化合物を、高真空下で乾燥させてアセトアミド（９）を淡黄色の固体として得た（２．４８ｇ、７７％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 10.42 (s, 2H, 2 X NH), 7.96 (t, J = 2.0 1H, Ar), 7.37-7.24 (m 3H, Ar), 4.04 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 164.79, 138.95, 129.14, 114.72, 110.17, 30.36.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｂｒ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３７０．９００１。実測値：ｍ／ｚ３７０．９０３９。
２－臭化ブロモアセチル（２．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ベンゼン－１，３－ジアミン（０．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．３５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ、２．２当量）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄した後にエーテルで洗浄した。この固体化合物を、高真空下で乾燥させてアセトアミド（９）を淡黄色の固体として得た（２．４８ｇ、７７％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 10.42 (s, 2H, 2 X NH), 7.96 (t, J = 2.0 1H, Ar), 7.37-7.24 (m 3H, Ar), 4.04 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 164.79, 138.95, 129.14, 114.72, 110.17, 30.36.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｂｒ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３７０．９００１。実測値：ｍ／ｚ３７０．９０３９。
【0175】
化合物１０
ＫＩ（１．３ｇ、７．７ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（８）（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１０）を黄色の固体として得た（０．６３ｇ、７４％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 10.36 (s, 2H, NH), 7.92 (t, J = 2.0 Hz, 1H, Ar), 7.33-7.22 (m, 3H, Ar), 3.83 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 166.56, 139.18, 129.10, 114.36, 109.86, 1.58.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｉ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４６６．８７２４、実測値：ｍ／ｚ４６６．８７５８。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間、８．８９分間、純度、９３．４％。
ＫＩ（１．３ｇ、７．７ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（８）（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１０）を黄色の固体として得た（０．６３ｇ、７４％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 10.36 (s, 2H, NH), 7.92 (t, J = 2.0 Hz, 1H, Ar), 7.33-7.22 (m, 3H, Ar), 3.83 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 166.56, 139.18, 129.10, 114.36, 109.86, 1.58.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｉ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４６６．８７２４、実測値：ｍ／ｚ４６６．８７５８。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間、８．８９分間、純度、９３．４％。
【0176】
化合物１１
２－塩化クロロアセチル（９．３ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）を、ベンゼン－１，２－ジアミン（１．５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の冷却したＮａＯＨ（０．５５Ｍ）水溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で一晩撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、得られた固体化合物を、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（１１）を白色の固体として得た（１．８ｇ、５１％）。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.69 (s, 2H, NH), 7.55 (dd, J = 7.4, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.23 (dd, J = 6.1, 3.5, 2 Hz, 2H, Ar), 4.34 (s, 4H, 2 x CH2). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.12, 130.17, 125.61, 125.08, 43.19.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ２８３．００１２。実測値：ｍ／ｚ２８３．００１０。
２－塩化クロロアセチル（９．３ｇ、８４ｍｍｏｌ、６当量）を、ベンゼン－１，２－ジアミン（１．５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の冷却したＮａＯＨ（０．５５Ｍ）水溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で一晩撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、得られた固体化合物を、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（１１）を白色の固体として得た（１．８ｇ、５１％）。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.69 (s, 2H, NH), 7.55 (dd, J = 7.4, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.23 (dd, J = 6.1, 3.5, 2 Hz, 2H, Ar), 4.34 (s, 4H, 2 x CH2). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 165.12, 130.17, 125.61, 125.08, 43.19.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ２８３．００１２。実測値：ｍ／ｚ２８３．００１０。
【0177】
化合物１２
２－臭化ブロモアセチル（２．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ベンゼン－１，２－ジアミン（０．５０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．３０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄した後にエーテルで洗浄した。この固体化合物を、真空下で乾燥させてアセトアミド（１２）を黄色の固体として得た（１．８７ｇ、５８％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 9.71 (s, 2H, NH), 753 (dd, J = 7.5, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.23 (dd, J = 6.0, 3.5 Hz 2H, Ar), 4.13 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 165.14, 130.27, 125.56, 124.93, 30.14.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｂｒ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３７０．９００１。実測値：ｍ／ｚ３７０．９０１２。
２－臭化ブロモアセチル（２．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ベンゼン－１，２－ジアミン（０．５０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．３０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、２．２当量）の冷却したＤＣＭ溶液に滴下して加えた。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄した後にエーテルで洗浄した。この固体化合物を、真空下で乾燥させてアセトアミド（１２）を黄色の固体として得た（１．８７ｇ、５８％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 9.71 (s, 2H, NH), 753 (dd, J = 7.5, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.23 (dd, J = 6.0, 3.5 Hz 2H, Ar), 4.13 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 165.14, 130.27, 125.56, 124.93, 30.14.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｂｒ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３７０．９００１。実測値：ｍ／ｚ３７０．９０１２。
【0178】
化合物１３
ＫＩ（１．３ｇ、７．７ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（１１）（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１３）を黄色の固体として得た（０．６３ｇ、４５％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 9.63 (s, 2H, NH), 7.49 (dd, J = 7.4, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.20 (dd, J = 6.1, 3.5 Hz, 2H, Ar), 3.90 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 166.92, 130.42, 125.35, 124.70, 1.49.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｉ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４６６．８７２４。実測値：ｍ／ｚ４６６．８７７０。
ＫＩ（１．３ｇ、７．７ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（１１）（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去してアセトアミド（１３）を黄色の固体として得た（０．６３ｇ、４５％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 9.63 (s, 2H, NH), 7.49 (dd, J = 7.4, 3.7 Hz, 2H, Ar), 7.20 (dd, J = 6.1, 3.5 Hz, 2H, Ar), 3.90 (s, 4H, 2 X CH2). 13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz): δ 166.92, 130.42, 125.35, 124.70, 1.49.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１０Ｈ１０Ｉ２Ｎ２Ｏ２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４６６．８７２４。実測値：ｍ／ｚ４６６．８７７０。
【0179】
化合物１４
３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸（１９）の合成
３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸（１９）の合成
【0180】
【化18】
【0181】
２－塩化クロロアセチル（１．６２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、２．２当量）を、３，４－ジアミノ安息香酸（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）の冷却したＴＨＦ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、次に、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（１９）を淡黄色の固体として得た（１．８ｇ、９０％）。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz): δ 9.64 (s, 2H, NH), 8.24 (d, J = 78.3 Hz, 3H, Ar), 4.30 (s, 4H, CH2). 13C NMR (CD3COCD3, 101 MHz) δ 166.91, 140.07, 132.58, 117.11, 115.48, 44.07.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１１Ｈ９Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４（Ｍ－Ｈ＋）＝ｍ／ｚ３０２．９９３９。実測値：ｍ／ｚ３０２．９９５６。
３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２０）の合成
３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２０）の合成
【0182】
【化19】
【0183】
ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．６３ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を、室度で、酸（１９）（１ｇ、３ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．３８ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌されているＴＨＦ溶液に加えた。次に、反応液を室温で２時間撹拌した後に、減圧下で濃縮した。得られた残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去して泡状の固体を得た。この粗製物を、析出（ＥｔＯＡｃ／石油エーテル）によってさらに精製してアセトアミド（２０）を黄色の固体として得た（０．７５ｇ、５７％）。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz,): δ 9.78 (s, 2H, NH), 8.34 (d, J = 64.1 Hz, 3H, Ar), 4.32 (s, 4H, 2 x ClCH
2CO), 2.99 (s, 4H, COCH2CH2CO). 13C NMR (CD3COCD3, 101 MHz): δ 170.86, 170.43, 170.37, 165.95, 162.44, 140.81, 127.32, 117.21, 117.15, 44.06, 26.40.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１５Ｈ１３Ｃｌ２Ｎ３Ｏ６Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４２４．００７４。実測値：ｍ／ｚ４２４．０１０６。
２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（２２）
２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（２２）
【0184】
【化20】
【0185】
Ｐｈ３Ｐ（０．５４ｇ、２．１ｍｏｌ、１当量）のエーテル（５ｍＬ）溶液を、トリ－ＰＥＧアジド（２１）（０．５０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）のＨＣｌ（５％、５ｍＬ）水溶液に滴下して加え、この混合物を２４時間撹拌放置した。次に、エーテルを減圧下で除去し、Ｐｈ３Ｐオキシドが水層中に検出されなくなるまで、水層をＤＣＭで抽出した。水層をｐＨ＝１２に調整し、アジド連結アミンをＤＣＭで水層から抽出した。このＤＣＭ溶液を合わせたものを、減圧下で留去してアジド連結アミン（２２）を薄黄色の液体として得た（０．２５ｇ、５６％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.65 - 3.53 (m, 11H), 3.44 (td, J = 5.2, 1.3 Hz, 2H), 3.41 - 3.22 (m, 3H), 2.79 (td, J = 5.3, 1.4 Hz, 2H). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz): δ 73.41, 70.65, 70.60, 70.58, 70.23, 69.95, 50.63, 41.75.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ８Ｈ１９Ｎ４Ｏ３（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ２１９．１４５２。実測値：ｍ／ｚ２１９．１４６４。
Ｎ，Ｎ’－（５（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２３）
Ｎ，Ｎ’－（５（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２３）
【0186】
【化21】
【0187】
２－（２－アジドエトキシ）エタン－１－アミン（２２）（０．３４ｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．３当量）を、活性化エステル（２０）（０．５０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液に加えた。次に、反応混合物を室温で１時間撹拌した後に、減圧下で濃縮した。得られた残渣をＤＣＭに溶解し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５％～２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド（２３）を白色の固体として得た（０．３９ｇ、６２％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz,): δ 8.78 (s, 2H, NHCH), 8.02 (s, 1H, Ar), 7.68 (s, 2H, Ar), 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 1H, CONHCH2), 4.13 (s, 4H, 2 x ClCH
2CO), 3.75 - 3.41 (m, 14H), 3.27 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2
CH2N3). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz): δ166.77, 164.69, 137.88, 135.96, 115.04, 114.31, 70.57, 70.51, 70.47, 70.24, 69.84, 69.55, 50.57, 42.96, 40.08.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１５Ｈ１３Ｃｌ２Ｎ３Ｏ６Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４２４．００７４。実測値：ｍ／ｚ４２４．０１０６。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：６．５４分間、純度：９９．３％。
Ｎ，Ｎ’－（５－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１４）
Ｎ，Ｎ’－（５－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１４）
【0188】
【化22】
【0189】
ＫＢｒ（１．４ｇ、１２ｍｍｏｌ、６当量）を、Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２３）（１．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を４日間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５０％～７０％アセトン／クロロホルム）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド１４を黄色の固体として得た（０．６ｇ、５１％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz,): δ 8.79 (s, 2H, 2 x NHCH), 7.96 (s, 1H, Ar), 7.67 (s, 2H, Ar), 7.10 (s, 1H, NHCH), 3.95 (s, 4H, BrCH
2CO), 3.84 - 3.44 (m, 14H), 3.27 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CHCH2N3). 13C NMR (CDCl3,126 MHz): δ 167.04, 164.62, 138.22, 135.84, 114.87, 114.14, 70.67, 70.59, 70.55, 70.36, 69.94, 69.59, 50.64, 40.24, 29.42.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１９Ｈ２７Ｂｒ２Ｎ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５９３．０３５３。実測値：ｍ／ｚ５９３．０３４４。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、４０％ＭｅＣＮ：６０％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：６．５２分間、純度：９９．４％。
【0190】
化合物１５
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）
【0191】
【化23】
【0192】
ＫＩ（１．０ｇ、８．０ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２３）（１．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５０％～７０％アセトン／クロロホルム）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド（１５）を黄色の固体として得た（１．１９ｇ、８８％）。1H NMR (CD3COCD3, 500 MHz): δ 9.98 (s, 2H, 2 x NHCH), 7.93 (d, J = 3.7 Hz, 3H, Ar), 7.69 (d, J = 5.3 Hz, 1H, CONHCH2), 3.95 (s, 4H, ICH
2CO), 3.60 - 3.11 (m, 16H). 13C NMR (CD3COCD3, 126 MHz): δ 170.49, 167.51, 140.48, 137.24, 114.46, 113.41, 71.14, 70.58, 51.42, 40.42, 1.34.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１９Ｈ２７Ｃｌ２Ｎ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０５．１３６４。実測値：ｍ／ｚ５０５．１４１６００。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：１０．３１分間、純度：９７．８％。
【0193】
化合物１６
３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸（２４）
３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸（２４）
【0194】
【化24】
【0195】
２－塩化クロロアセチル（１．６２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、２．２当量）を、３，４－ジアミノ安息香酸（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）の冷却したＴＨＦ溶液に滴下して加えた。この混合物を加温して、室温で２時間撹拌した。得られた析出物を濾過し、水で５～６回洗浄し、得られた固体化合物を、高真空下で完全に乾燥させてアセトアミド（２４）を白色の固体として得た（１．８ｇ、９０％）。1H NMR (DMF-d7, 500 MHz): δ 10.09 (d, J = 20.4 Hz, 2H, NH), 8.30 (d, J = 1.9 Hz, 1H, Ar), 8.00 - 7.83 (m, 2H, Ar), 4.45 (d, J = 7.7 Hz, 4H, CH2). 13C NMR (126 MHz, DMF-d7): δ 166.86, 166.02, 165.84, 135.31, 129.94, 128.03, 127.15, 127.00, 124.12, 43.64, 43.56.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１１Ｈ１１Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ３０５．００９０。実測値：ｍ／ｚ３０５．００９２。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：４．３８分間、純度：９３％。
３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２５）
３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２５）
【0196】
【化25】
【0197】
ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．６３ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を、室度で、酸（２４）（１ｇ、３ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．３８ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌されているＴＨＦ溶液に加えた。次に、反応混合物を室温で２時間撹拌した後に、減圧下で濃縮した。得られた残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去して泡状の固体を得た。この粗製物を、析出（ＥｔＯＡｃ／石油エーテル）によってさらに精製してアセトアミド（２５）を黄色の固体として得た（０．６ｇ、４５％）。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz): δ 9.51 (d, J = 16.2 Hz, 2H, NH), 8.34 (s, 1H, Ar), 8.18 - 7.89 (m, 2H, Ar), 4.38 (s, 4H, 2 x ClCH
2CO), 2.98 (s, 4H, COCH2CH2CO). 13C NMR (CD3COCD3, 100 MHz): δ 170.48, 166.85, 166.31, 161.95, 138.26, 130.66, 129.04, 128.65, 125.21, 122.83, 43.88, 26.39.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１５Ｈ１３Ｃｌ２Ｎ３Ｏ６Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ４２４．００７４。実測値：ｍ／ｚ４２４．００９４。
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２６）
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２６）
【0198】
【化26】
【0199】
２－（２－アジドエトキシ）エタン－１－アミン（２２）（０．３４ｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．３当量）を、活性化エステル（２５）（０．５０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液に加えた。次に、反応混合物を室温で１時間撹拌した後に、減圧下で濃縮した。得られた残渣をＤＣＭに溶解し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５％～２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド（２６）を白色の固体として得た（０．２５ｇ、４０％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 9.05 (s, 2H, 2 x NHCH), 7.66 (s, 1H, Ar), 7.58 - 7.40 (m, 2H, Ar), 7.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H, CONHCH2), 4.15 (d, J = 10.6 Hz, 4H, 2 x ClCH
2CO), 3.69 - 3.46 (m, 14H), 3.26 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2CH
2
N3). 13C NMR (CDCl3, 126 MHz): δ166.29, 166.09, 165.49, 132.96, 132.74, 129.15, 125.57, 125.10, 124.86, 70.63, 70.60, 70.51, 70.24, 69.94, 69.65, 50.63, 42.91, 42.68, 40.01.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１９Ｈ２７Ｃｌ２Ｎ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５０５．１３６４。実測値：ｍ／ｚ５０５．１３６５。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：６．７６分間、純度：９９．８％。
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１６）
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１６）
【0200】
【化27】
【0201】
ＫＢｒ（１．４ｇ、１２ｍｍｏｌ、６当量）を、Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２６）（１．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を４日間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５０％～７０％アセトン／クロロホルム）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド１６を白色の固体として得た（０．５ｇ、４３％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz,): δ 9.02 (s, 1H, NHCH), 8.96 (s, 1H, NHCH), 7.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H, Ar), 7.70 - 7.60 (m, 2H, Ar), 7.15 (s, 1H, CONHCH2), 4.09 (d, J = 12.2 Hz, 4H, BrCH
2CO), 3.78 - 3.50 (m, 14H), 3.37 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CHCH2N3). 13C NMR (CDCl3,126 MHz): δ 166.31, 165.79, 165.13, 133.28, 132.55, 132.28, 125.68, 125.14, 124.79, 70.64, 70.62, 70.52, 70.26, 69.96, 69.63, 50.65, 40.10, 29.71, 29.09, 28.71.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１９Ｈ２７Ｂｒ２Ｎ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ５９３．０３５３。実測値：ｍ／ｚ５９３．０３４４。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：７．６２分間、純度：９９．１％。
【0202】
化合物１７
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）
【0203】
【化28】
【0204】
ＫＩ（１．０ｇ、８．０ｍｍｏｌ、４当量）を、Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－クロロアセトアミド）（２６）（１．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水アセトン（２０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５０％～７０％アセトン／クロロホルム）によってさらに精製してアジド連結アセトアミド（１７）を黄色の固体として得た（１ｇ、７３％）。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 9.30 (s, 1H, 2 x NHCH), 9.17 (s, 1H, NH), 7.61 (s, 1H, Ar), 7.41 (s, 1H, CONHCH2), 7.27 (s, 2H, Ar), 3.93 (d, J = 10.8 Hz, 4H, 2 x ICH
2CO), 3.75 - 3.48 (m, 14H), 3.36 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2CH
2N3). 13C NMR (CDCl3, 126 MHz): δ170.97, 168.13, 166.49, 129.71, 125.31, 125.01, 70.48, 70.31, 70.24, 69.73, 50.60, 40.09, -0.33, -0.53.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１９Ｈ２７Ｉ２Ｎ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ６８９．００７６。実測値：ｍ／ｚ６８９．０１０８。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：９．１０分間、純度：９６．２％。
【0205】
化合物１８
３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン－１，２３－二トシレート（２７）
３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン－１，２３－二トシレート（２７）
【0206】
【化29】
【0207】
４－トルエンスルホニルクロリド（１．３３ｇ、７．０２ｍｍｏｌ、２．６当量）を、無水ピリジン（０．５１ｇ、６．５ｍｍｏｌ、２．４当量）および３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン－１，２３ジオール（１．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液に加え、この混合物を、室温のＮ２下で一晩撹拌放置した。次に、溶液を減圧下で濃縮し、標準的な後処理（ＥｔＯＡｃ）を行った。次に、得られた残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（４０～８０％ＥｔＯＡｃ／石油エーテル）によって精製して３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン－１，２３－二トシレート（２７）を無色の油状物として得た（１．１ｇ、６０％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.81 - 7.68 (m, 4H, Ar), 7.34 - 7.26 (m, 4H, Ar), 4.23 - 4.01 (m, 4H, 2x SO2OCH
2), 3.70 - 3.48 (m, 28H), 2.39 (d, J = 1.5 Hz, 6H, CHCCH
3). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz): δ 144.74, 132.87, 129.77, 127.92, 70.67, 70.54, 70.49, 70.44, 69.20, 68.60, 21.60.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ３０Ｈ４７Ｏ１３Ｓ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ６７９．２４５３。実測値：ｍ／ｚ６７９．２４４８。
１，２３－ジアジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン（２８）
１，２３－ジアジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン（２８）
【0208】
【化30】
【0209】
アジ化ナトリウム（２ｇ、３０ｍｍｏｌ、１０当量）を、二トシレート（２７）（２．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に加え、この混合物を８０℃で一晩撹拌した。次に、混合物を減圧下で濃縮してＤＭＦを除去し、この生成物を、酢酸エチルを使用して（３×２０ｍＬ）抽出した。次に、有機抽出液を飽和ブライン溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮してジアジド（２８）を無色の油状物として得た（１ｇ、８０．６％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.66 - 3.54 (m, 28H), 3.36 - 3.28 (m, 4H, 2x N3CH2). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz): δ 13C NMR δ 70.62, 69.96, 50.60.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１６Ｈ３３Ｏ７Ｎ６（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ４２１．２４０５。実測値：ｍ／ｚ４２１．２４６６。
１，２３－ジアミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン（２９）
１，２３－ジアミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン（２９）
【0210】
【化31】
【0211】
トリフェニルホスフィン（１．８７ｇ、７．１４ｍｍｏｌ、３当量）を、ジアジド（２８）（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の撹拌されている無水ＴＨＦ溶液に少しずつ加えた。この反応液を室温で一晩撹拌した。水（５０ｍＬ）を加え、反応液を、室温で一晩撹拌放置した。ＴＨＦを減圧下で留去し、反応液を濾過し、次に、この濾液をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で洗浄してホスフィンオキシドを除去した。この濾液を、減圧下で留去してジアミノ－ＰＥＧ（２９）を黄色の油状物として得た（０．５０ｇ、５７％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz,): δ 3.58 (dd, J = 2.4, 1.1 Hz, 24H), 3.44 (t, J = 5.2 Hz, 4H, 2x NH2CH2CH
2O), 2.80 (t, J = 5.2 Hz, 4H, 2x NH2CH
2CH2O), 1.67 (s, 4H, 2x NH
2). 13C NMR (CDCl3,101 MHz,): δ 73.27, 70.48, 70.18, 41.68.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ１６Ｈ３７Ｏ７Ｎ２（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ３６９．２６００。実測値：ｍ／ｚ３６９．２８５０。
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－（（５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２，２６－ジアザヘプタコサンジオイル）ビス（ベンゼン－４，１，２－トリイル））テトラキス（２－クロロアセトアミド）（３０）
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－（（５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２，２６－ジアザヘプタコサンジオイル）ビス（ベンゼン－４，１，２－トリイル））テトラキス（２－クロロアセトアミド）（３０）
【0212】
【化32】
【0213】
１，２３－ジアミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン（２９）（１５０ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ）を、活性化エステル（２５）（４０９ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、２．５当量）の無水ＴＨＦ無水溶液に加えた。次に、反応混合物を室温で２時間撹拌した後に、減圧下で濃縮した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５％～２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製してアセトアミド（３０）を白色の固体として得た（３４０ｍｇ、８９％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz,): δ 9.81 (d, J = 25.2 Hz, 4H), 8.54 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 7.98 (s, 2H), 7.73 (d, J = 1.4 Hz, 4H), 4.35 (d, J = 9.3 Hz, 8H), 3.64 - 3.45 (m, 28H), 3.41 (q, J = 5.9 Hz, 4H).13C NMR (DMSO-d6,126 MHz): δ 172.72, 165.38, 165.20, 165.17, 133.26, 131.12, 129.13, 124.98, 124.59, 123.79, 69.71, 69.56, 68.83, 43.28, 43.21.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ３８Ｈ５３Ｃｌ４Ｎ６Ｏ１３（Ｍ＋Ｈ＋）＝ｍ／ｚ９４１．２４１９。実測値：ｍ／ｚ９４１．２４５１。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：５．８３分間、純度：９８％。
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－（（５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２，２６－ジアザヘプタコサンジオイル）ビス（ベンゼン－４，１，２－トリイル））テトラキス（２－ヨードアセトアミド）（１８）
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－（（５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２，２６－ジアザヘプタコサンジオイル）ビス（ベンゼン－４，１，２－トリイル））テトラキス（２－ヨードアセトアミド）（１８）
【0214】
【化33】
【0215】
ＫＩ（１７６ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１０当量）を、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－（（５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２，２６－ジアザヘプタコサンジオイル）ビス（ベンゼン－４，１，２－トリイル））テトラキス（２－クロロアセトアミド）（３０）（１００ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）の無水アセトン（４００ｍＬ）の混合溶液に加えた。この混合物を３時間還流した。得られた混合物を濾過し、溶媒を減圧下で留去した。この粗製物を、シリカゲルクロマトグラフィー：（５０％～７０％アセトン／クロロホルム）によって精製してアセトアミド（１８）を白色の固体として得た（１３０ｍｇ、９３．５％）。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz,): δ 9.62 (d, J = 16.8 Hz, 4H), 8.31 (d, J = 4.9 Hz, 3H), 7.98 (s, 2H), 7.84 - 7.59 (m, 4H), 3.98 (d, J = 7.0 Hz, 8H), 3.75 - 3.30 (m, 32H). 13C NMR (DMSO-d6,126 MHz): δ 167.18, 167.09, 165.31, 133.53, 130.78, 129.30, 124.57, 124.29, 123.34, 69.64, 68.87, 1.67, 1.59.ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：予測値Ｃ３８Ｈ５２Ｉ４Ｎ６Ｏ１３Ｎａ１（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ１３３０．９６６９。実測値：ｍ／ｚ１３３０．９７６５。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（０．７５ｍＬ／分）、３５％ＭｅＣＮ：６５％水。２８０ｎｍで検出。保持時間：９．５５分間、純度：９８％。
【0216】
実施例２
水溶液安定性
エステルおよびアミド官能化リンカー化合物の安定性が測定され、比較された。
水溶液安定性
エステルおよびアミド官能化リンカー化合物の安定性が測定され、比較された。
【0217】
最初の実験において、４日間にわたるリンカー化合物１～６の水溶液安定性が観察された。１０％ＤＭＦ－ｄ７存在下のリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中における安定性は、１Ｈ ＮＭＲ溶媒抑制法を使用して測定された。このデータは、オルト－置換されている（１，２－）ジ－ハロアセトアミドが、メタ－置換されている（１，３－）ものより低い水溶液安定性を有することを示している。図２を参照すること。
【0218】
次に、エステルおよびアミド官能化アリールビス－ハロアセトアミドリンカーの水溶液安定性の比較が、４日間にわたるビス－ハロアセトアミド誘導体（２、３、５、６および１４～１６）の残存パーセンテージを求めることよって行われた。再び、最終濃度が１０％のＤＭＦ－ｄ７を用いたリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中における安定性が、溶媒抑制法を使用して評価された。図３を参照すること。
【0219】
驚くべきことに、本発明者らは、エステル官能基をアミド官能基と交換することは、ハロゲン化物安定性における傾向を逆転させ（ヨード－はブロモ－より安定している）、３，４－修飾は、３，５－修飾と類似の安定性を有することを認めた。
【0220】
実施例３
アミノ酸のチオール側鎖との反応性
本発明のリンカー化合物の反応性は、グルタチオンとの反応によって試験された。以下の代表的な反応が説明される。類似の反応が、アミド官能化リンカー化合物を用いて実施された。
グルタチオンと３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
アミノ酸のチオール側鎖との反応性
本発明のリンカー化合物の反応性は、グルタチオンとの反応によって試験された。以下の代表的な反応が説明される。類似の反応が、アミド官能化リンカー化合物を用いて実施された。
グルタチオンと３，５－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
【0221】
【化34】
【0222】
グルタチオン（２９０ｍｇ、０．９４３ｍｍｏｌ、３当量）を、リン酸ナトリウム緩衝水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５、８ｍＬ）に溶解した。３，５－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（１）（１００ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、グルタチオン水溶液に徐々に加え、室温で一晩維持した。続いて、反応液を減圧下で濃縮し、Ｃ－１８クロマトグラフィー（１００％Ｈ２Ｏ～２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製して生成物４．１７を粘着性の固体として得た（０．２０ｍｇ、７４％）。1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 7.73 (s, 1H, Ar), 7.56 (s, 2H, Ar), 4.57-4.54 (m, 2H, 2 x NHCHCO), 3.79 (s, 3H, OMe), 3.73 - 3.63 (m, 6H, 2 x NHCH
2COOH, CH2CHNH2), 3.40 (s, 4H, 2 x SCH
2CO), 3.13-2.89 (m, 4H, 2 x SCH
2CH), 2.43 (t, J = 8 Hz, 4H, 2 x CH2CH
2CO), 2.06-2.01 (m, 4H, 2 x CH
2CH2CO). 13C NMR (126 MHz, D2O): δ 176.17, 174.81, 174.00, 171.69, 170.39, 167.65, 137.89, 130.43, 117.32, 54.11, 52.92, 52.89, 43.42, 36.24, 33.77, 31.37, 26.19.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ３２Ｈ４４Ｏ１６Ｓ２Ｎ８Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ８８３．２２０９。実測値：ｍ／ｚ８８３．２１８７。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（１ｍＬ／分）、１０％ＭｅＣＮ：９０％水：０．１％ＴＦＡ。２１４ｎｍで検出。保持時間：３６．３９分間、純度：９９％。
グルタチオンと３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
グルタチオンと３，４－ビス（２－ハロアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
【0223】
【化35】
【0224】
グルタチオン（２９０ｍｇ、０．９４３ｍｍｏｌ、３当量）を、リン酸ナトリウム緩衝水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５、８ｍＬ）に溶解した。３，４－ビス（２－クロロアセトアミド）安息香酸メチル（４）（１００ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、グルタチオン水溶液に徐々に加え、室温で一晩維持した。続いて、反応液を減圧下で濃縮し、Ｃ－１８クロマトグラフィー（１００％Ｈ２Ｏ～２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製して生成物（３２）を粘着性の固体として得た（０．１７ｍｇ、６３％）。1H NMR (500 MHz, D2O): δ 8.00 (s, 1H, Ar), 7.93 (dd, J = 8.5, 2 Hz, 1H, Ar), 7.63 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 4.70-4.56 (m, 2H, 2 x NHCHCO), 3.86 (s, 3H, OMe), 3.76-3.65 (m, 6H, 2 x NHCH
2COOH, CH2CHNH2), 3.52-3.45 (m, 4H, 2 x SCH
2CO), 3.15-2.90 (m, 4H, 2 x SCH
2CH), 2.47-2.43 (m, 4H, 2 x CH2CH
2CO), 2.07 -2.02 (m, 4H, 2 x CH
2CH2CO). 13C NMR (126 MHz, D2O): δ 176.11, 174.88, 173.88, 171.63, 171.22, 167.95, 135.56, 128.79, 128.22, 128.04, 125.81, 54.08, 52.90, 52.81, 43.35, 35.72, 35.52, 33.85, 33.79, 31.36, 26.09.ＨＲＭＳ：予測値Ｃ３２Ｈ４４Ｏ１６Ｓ２Ｎ８Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝ｍ／ｚ８８３．２２０９。実測値：ｍ／ｚ８８３．２１８７。ＨＰＬＣ：カラム：ＨｉＱ Ｓｉｌ ＨＳ（１５０×４．６０ｍｍ）。移動相：アイソクラティック：（１ｍＬ／分）、１０％ＭｅＣＮ：９０％水：０．１％ＴＦＡ。２１４ｎｍで検出。保持時間：１４．２５分間、純度：９９％。
グルタチオンと２，３－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
グルタチオンと２，３－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチルの反応性
【0225】
【化36】
【0226】
グルタチオン（０．１１ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、３当量）を、６ｍＬのリン酸緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝７に溶解し、４ｍＬの２，３－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（７）（０．０５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ溶液に加えた。この混合物を、室温で２４時間撹拌し続けた。得られた生成物を逆相カラム（Ｃ１８）を使用して精製し、１０％アセトニトリル／水を用いて得られた画分から生成物を得た（０．０５ｇ、４８％）。
アミド官能化化合物の比較
本発明者らは、グルタチオン（２．２当量）の存在下のリン酸緩衝水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中におけるビス－ハロアセトアミド誘導体１４～１７の残存パーセンテージを求めることによって、本発明の種々のリンカー化合物の反応性を比較した。図４を参照すること。
アミド官能化化合物の比較
本発明者らは、グルタチオン（２．２当量）の存在下のリン酸緩衝水溶液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中におけるビス－ハロアセトアミド誘導体１４～１７の残存パーセンテージを求めることによって、本発明の種々のリンカー化合物の反応性を比較した。図４を参照すること。
【0227】
本発明者らは、加水分解（水との反応）における３，４－と３，５－アミド修飾誘導体の間に差異がないにもかかわらず、グルタチオンのチオールとそれらの反応の間に著しい差異があることを認めた。３，４－修飾誘導体は、３，５－修飾化合物よりもチオールとの反応が速い。
エステル化合物は、非常に速やかに反応するため、反応速度を測定することができなかった。
エステル化合物は、非常に速やかに反応するため、反応速度を測定することができなかった。
【0228】
実施例４
ブロモアセトアミドリンカーのトラスツズマブとの反応
リンカー化合物２、５、９、および１２を、様々な化学量論下でトラスツズマブと反応させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して反応生成物を分析した。
ブロモアセトアミドリンカーのトラスツズマブとの反応
リンカー化合物２、５、９、および１２を、様々な化学量論下でトラスツズマブと反応させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して反応生成物を分析した。
【0229】
【化37】
【0230】
ビス－ブロモアセトアミドリンカーとのこの反応は、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の完全に還元されたＴｍａｂ（０．０３４ｍＭ）を使用した。Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
【0231】
この分析および属する生成物は、図５に示される。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン２：８当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン３：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン４：８当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン５：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン６：８当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン７：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン８：８当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン２：８当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン３：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン４：８当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン５：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン６：８当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン７：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ
レーン８：８当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ。
【0232】
図説：ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１２％ゲル）で分解した。
本発明者らは、オルト－（１，２－および３，４－）とメタ－（１，３－および３，５－）置換連結化合物の間でチオール架橋のパターンが異なることを認めた。過剰な（５または８当量）リンカーを使用する場合、メタ－置換リンカーは、より多くのＬＣ－ＬＣ（４７ｋＤａ）およびＨＣ－ＨＣ（１０６ｋＤａ）が生成されるため、選択性がより低い。すべての反応における主な生成物は、半抗体コンジュゲートである、２つのリンカーが結合したＨＣ－ＬＣ（７５ｋＤａ）である。
本発明者らは、オルト－（１，２－および３，４－）とメタ－（１，３－および３，５－）置換連結化合物の間でチオール架橋のパターンが異なることを認めた。過剰な（５または８当量）リンカーを使用する場合、メタ－置換リンカーは、より多くのＬＣ－ＬＣ（４７ｋＤａ）およびＨＣ－ＨＣ（１０６ｋＤａ）が生成されるため、選択性がより低い。すべての反応における主な生成物は、半抗体コンジュゲートである、２つのリンカーが結合したＨＣ－ＬＣ（７５ｋＤａ）である。
【0233】
リンカー化合物５（標識されたＨＣ－ＬＣ）との反応における生成物は、質量分析法によって分析された。３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）で架橋されたＴｍａｂは、７４，５２８．０３Ｄａに主なピークを示し、７４ＫＤａ領域におけるスペクトルの拡大によって、７４，５２８．０３Ｄａおよび７４，６８９．２４Ｄａ（グリコフォーム）に主なピークが示された。粗反応生成物の質量分光分析は、２つのリンカーが結合しており、１つのリンカーはヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋していることを明確にした。
【0234】
図１（１）は、鎖内重鎖－重鎖および重鎖－軽鎖（標識されたＨＣ－ＬＣ）の２つの再架橋されたジスルフィド結合で生成された半抗体の略図を示す。図１（５）は、図１（１）に示される構造と化学的に同一であるが、半抗体に認められ得る物理的状態を表す。サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、この生成物は、１５０ｋＤａの分子量を有するようにみえるであろうが、各共有結合構造は、図１（１）に表されるように、７５ｋＤａ（半抗体）の質量を有する。
【0235】
非官能化リンカー化合物１２との反応における反応生成物の分析は、２つのリンカーが結合しており、この場合も１つのリンカーはヒンジ領域の－ＨＣ－ＨＣ内システイン残基を架橋していることを明確にした。
【0236】
Ｎ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）で架橋されたＴｍａｂのデコンボリューションスペクトルによるタンパク質ＭＳ。架橋されたＴｍａｂのＭＳスペクトルは、７４，５７２．５７Ｄａに主なピークを示す一方で、７４ＫＤａ領域におけるスペクトルの拡大によって、７４，５７２．５７Ｄａおよび７４，４１０．９１Ｄａに主なピークが示された。
【0237】
実施例５
ビス－（２－ブロモアセトアミド）－リンカーの選択性におけるｐＨの影響
化合物を連結するビス－（２－ブロモアセトアミド）との反応におけるｐＨの影響は、ビス－ハロアセトアミドリンカーと共にインキュベートされたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６、７．５、または８）中の完全に還元されたＴｍａｂ（０．０３３ｍＭ）の架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施することによって、検討された。Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
ビス－（２－ブロモアセトアミド）－リンカーの選択性におけるｐＨの影響
化合物を連結するビス－（２－ブロモアセトアミド）との反応におけるｐＨの影響は、ビス－ハロアセトアミドリンカーと共にインキュベートされたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６、７．５、または８）中の完全に還元されたＴｍａｂ（０．０３３ｍＭ）の架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施することによって、検討された。Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
【0238】
この分析および属する生成物は、図５に示される。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１、５、および９：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２、６、および１０：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン３、７、および１１：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４、８、および１２：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１、５、および９：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２、６、および１０：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン３、７、および１１：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４、８、および１２：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
【0239】
ｐＨ＝７．５において、最高レベルのコンジュゲーションが達成された。すべての事例において、オルト－（１，２－および３，４－）置換リンカー化合物は、メタ－（１，３－および３，５－）修飾リンカー化合物より選択性が高い（ＬＣ－ＬＣおよび－ＨＣ－ＨＣ間がより少ない）。
【0240】
実施例６
過剰なビス－（２－ヨードアセトアミド）リンカーのトラスツズマブとの反応
リンカー化合物３、６、１０、および１３を、過度にトラスツズマブと反応させ、この反応生成物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。
過剰なビス－（２－ヨードアセトアミド）リンカーのトラスツズマブとの反応
リンカー化合物３、６、１０、および１３を、過度にトラスツズマブと反応させ、この反応生成物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。
【0241】
【化38】
【0242】
ビス－ヨードアセトアミドリンカーとのこの反応は、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の完全に還元されたＴｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を使用した。Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
【0243】
この分析および属する生成物は、図７に示される。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：Ｔｍａｂ対照（非還元色素）、
レーン２：Ｔｍａｂ対照（還元色素）、
レーン３：５当量の３，４－ビス（２－ヨードアセトアミド）安息香酸メチル（６）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４：５当量の３，５－ビス（２－ヨードアセトアミド）安息香酸メチル（３）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン５：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１３）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン６：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１０）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：Ｔｍａｂ対照（非還元色素）、
レーン２：Ｔｍａｂ対照（還元色素）、
レーン３：５当量の３，４－ビス（２－ヨードアセトアミド）安息香酸メチル（６）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４：５当量の３，５－ビス（２－ヨードアセトアミド）安息香酸メチル（３）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン５：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１３）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン６：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１０）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
【0244】
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
類似したブロモリンカー化合物の場合と同様の選択性が認められた。
類似したブロモリンカー化合物の場合と同様の選択性が認められた。
【0245】
実施例７
アミド置換リンカーのトラスツズマブとの反応の選択性
アミド官能化リンカー化合物１４、１５、１６、および１７のトラスツズマブとの反応が検討された。
アミド置換リンカーのトラスツズマブとの反応の選択性
アミド官能化リンカー化合物１４、１５、１６、および１７のトラスツズマブとの反応が検討された。
【0246】
【化39】
【0247】
５当量のＴＣＥＰを用いて室温で一晩還元されたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中のＴｍａｂ（０．０１３ｍＭ）の架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、図８に示される。
Ｌ：ラダー、
レーン１：５当量の１６と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：５当量の１４と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン３：５当量の１７と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４：５当量の１５と共にインキュベートされたＴｍａｂ。
Ｌ：ラダー、
レーン１：５当量の１６と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：５当量の１４と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン３：５当量の１７と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン４：５当量の１５と共にインキュベートされたＴｍａｂ。
【0248】
化合物１７リンカーで再架橋されたＴｍａｂのデコンボリューションスペクトルによるタンパク質ＭＳは、７５，０５９．８２Ｄａに主なピークを示し、半抗体生成物に対する２つのリンカーの結合を明確にした。
【0249】
実施例８
他のモノクローナル抗体との選択性
ビス－ブロモアセトアミドリンカーを用いたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液中の完全に還元されたリツキシマブ（０．０３５ｍＭ）の架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、図９に示される。リツキシマブ（０．０３５ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（６）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン２：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（３）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン３：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン４：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＲｍａｂ。
他のモノクローナル抗体との選択性
ビス－ブロモアセトアミドリンカーを用いたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液中の完全に還元されたリツキシマブ（０．０３５ｍＭ）の架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、図９に示される。リツキシマブ（０．０３５ｍＭ）を、５当量のＴＣＥＰを用いて室温で２時間還元した。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：５当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（６）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン２：５当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（３）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン３：５当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）と共にインキュベートされたＲｍａｂ、
レーン４：５当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）と共にインキュベートされたＲｍａｂ。
【0250】
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
同様の選択性および反応生成物がトラスツズマブとの反応に認められた。１，２－化合物は、７５ｋＤａにおいてＨＣ－ＬＣ生成物のより有効な形成と共に、ＬＣ－ＬＣおよびＨＣ－ＨＣ生成物がより少ないことを示す。このため、トラスツズマブを使用して認められた結果は、抗体に関する妥当な代表例と判断され得る。
同様の選択性および反応生成物がトラスツズマブとの反応に認められた。１，２－化合物は、７５ｋＤａにおいてＨＣ－ＬＣ生成物のより有効な形成と共に、ＬＣ－ＬＣおよびＨＣ－ＨＣ生成物がより少ないことを示す。このため、トラスツズマブを使用して認められた結果は、抗体に関する妥当な代表例と判断され得る。
【0251】
実施例９
抗体の選択的官能化
本発明者らは、リンカーの選択性が、トラスツズマブのような抗体を選択的に単官能化すること、およびヘテロ－二官能化することに利用され得ることを実証した。
抗体の選択的官能化
本発明者らは、リンカーの選択性が、トラスツズマブのような抗体を選択的に単官能化すること、およびヘテロ－二官能化することに利用され得ることを実証した。
【0252】
トラスツズマブの位置選択的官能化が検討された。図１０は、ビス－ブロモアセトアミドリンカーを用いたＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６、７．５、または８）中の部分的に還元されたＴｍａｂの架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。Ｔｍａｂを、１．１当量のＴＣＥＰを用いて４℃で２時間還元し、１．１当量の各リンカーと共に室温で一晩インキュベートした。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１、９、および１７：１当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）、
レーン２、１０、および１８：１．１当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）、
レーン３、１１、および１９：１．１当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）、
レーン４、１２、および２０：１．１当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１、９、および１７：１当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）、
レーン２、１０、および１８：１．１当量の３，５－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（２）、
レーン３、１１、および１９：１．１当量のＮ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（１２）、
レーン４、１２、および２０：１．１当量のＮ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビス（２－ブロモアセトアミド）（９）。
【0253】
レーン５～８、１３～１６、および２１～２４は、上記と同じ順番であるが、非還元状態下（非還元色素）で行われた同じ反応を示している。
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、ＬＣ－ＬＣ：軽鎖ホモ二量体、ＨＣ－ＨＣ：重鎖ホモ二量体。タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
【0254】
７５ｋＤａおよび５０ｋＤａにおけるバンドの強度が同程度であることは、ｍＡｂあたり１つのＨＣ－ＬＣコンジュゲートを生成するために、単一のジスルフィド架橋が選択的に官能化されたことを示唆する。言い換えると、単官能化である。非官能化リンカー１２および９は、非還元状態下において、より低い分子量のバンドがあまり見られないことから、反応が大いに進行したことを示唆しており、より良い結果を出すようである。
【0255】
連続する部分的還元、インキュベーション、さらなる還元、およびインキュベーションを介して、トラスツズマブの選択的ヘテロ－二官能化が達成された。図１１ａは、逐次法を使用したＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のＴｍａｂ（０．０３３ｍＭ）の二官能性架橋に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、２．２当量のＴＣＥＰを用いて２時間還元し、２．２当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共に室温で一晩インキュベートした（レーン１）。次に、官能化Ｔｍａｂ（０．０３３ｍＭ）を、２．２当量のＴＣＥＰを用いてさらに２時間還元し、４当量のＮ，Ｎ’－（５－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）と共に室温で一晩インキュベートした（レーン２）。
【0256】
タンパク質試料を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分解した。
デコンボリューションスペクトルによるタンパク質ＭＳは、１分子のリンカー５および１分子のリンカー１５との反応に相当する７４，７１１．９９Ｄａに主なピークを示す。
デコンボリューションスペクトルによるタンパク質ＭＳは、１分子のリンカー５および１分子のリンカー１５との反応に相当する７４，７１１．９９Ｄａに主なピークを示す。
【0257】
これは、２つの異なるリンカーの逐次的な付加を介してヘテロ－二官能化半抗体を形成する能力の実証である。
この構造は、図１１ｂで形式的に表される。リンカー５は、抗体の軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドの再架橋を示す。リンカー１５は、本明細書では「鎖内」再架橋として言及され、抗体のヒンジ領域を形成する２つのチオールを連結している。
この構造は、図１１ｂで形式的に表される。リンカー５は、抗体の軽鎖と重鎖を連結するジスルフィドの再架橋を示す。リンカー１５は、本明細書では「鎖内」再架橋として言及され、抗体のヒンジ領域を形成する２つのチオールを連結している。
【0258】
実施例１０
安定したチオ架橋Ｆａｂ誘導体の形成およびｍＡｂ－タンパク質コンジュゲートの選択的調製
本発明のリンカー化合物は、安定したチオ架橋Ｆａｂ誘導体を形成することが可能である。続いて、これらは、還元されたか、もしくは部分的に還元された抗体または他のタンパク質にコンジュゲートされ得る。
安定したチオ架橋Ｆａｂ誘導体の形成およびｍＡｂ－タンパク質コンジュゲートの選択的調製
本発明のリンカー化合物は、安定したチオ架橋Ｆａｂ誘導体を形成することが可能である。続いて、これらは、還元されたか、もしくは部分的に還元された抗体または他のタンパク質にコンジュゲートされ得る。
【0259】
最初に、ＩＦａｂを、コンジュゲーションＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に緩衝液を交換し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－０．５ｍＬ（３ＫＤａ）遠心式フィルターを使用して（５ｍｇ／ｍＬ、０．１μｍｏｌ）に希釈した。ＴＣＥＰの原液（４．０ｍｇ／ｍＬ、０．０４２ｍｍｏｌ、１４ｍＭ）を、同じコンジュゲーション緩衝液で調製した。ＩＦａｂを、ＴＣＥＰ（ＩＦａｂに対して２当量）と共に室温で１時間インキュベートすることによって還元した。次に、ペンタ－ＰＥＧアジドを使用した１時間のＴＣＥＰのクエンチングステップを続けて実施した。
【0260】
還元ＩＦａｂを、ビス－ｏ－ジヨードアセトアミド（ＰＥＧ）７リンカー１８（１０μＬの原液（７ｍｇ／ｍＬ）、５当量）と共に室温で３時間インキュベートした。
過剰な試薬を、プロテインＡカラム（１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ、ＦＦ）を使用した迅速な精製ステップを用いて除去し、部分的に還元されたＴｍａｂとのコンジュゲーション前に官能化ＩＦａｂ溶液から過剰なリンカーを除去した。結合緩衝液Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（２０ｍＭ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を使用してＦａｂ画分を回収し、次に、この回収された画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－１５ｍＬ（３ＫＤａ）遠心式フィルターを使用して濃縮し、最終的にコンジュゲーション緩衝液に緩衝液を交換した。
過剰な試薬を、プロテインＡカラム（１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ、ＦＦ）を使用した迅速な精製ステップを用いて除去し、部分的に還元されたＴｍａｂとのコンジュゲーション前に官能化ＩＦａｂ溶液から過剰なリンカーを除去した。結合緩衝液Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（２０ｍＭ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を使用してＦａｂ画分を回収し、次に、この回収された画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－１５ｍＬ（３ＫＤａ）遠心式フィルターを使用して濃縮し、最終的にコンジュゲーション緩衝液に緩衝液を交換した。
【0261】
ＩｆＡｂ対照（非還元）のデコンボリューションしたタンパク質ＭＳスペクトルは、４７，６３６．３２Ｄａに主なピークを示したが、ビス－ｏ－ジヨードアセトアミド（ＰＥＧ）７リンカー（１８）を有する官能化ＩｆＡｂのデコンボリューションしたタンパク質ＭＳスペクトルは、４８，６９０．９０Ｄａに主なピークを示し、官能化が生じたことを明確にした。概略構造として図１２ａに示される。
【0262】
Ｔｍａｂを、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（１００ｍＭ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に緩衝液を交換し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－０．５ｍＬ（１０ＫＤａ）遠心式フィルターを使用して（５．０ｍｇ／ｍＬ、０．０３μｍｏｌ）に希釈した。Ｔｍａｂを、ＴＣＥＰ（Ｔｍａｂに対して１．１当量）と共に４℃で２時間インキュベートすることによって還元した。次に、官能化ＩＦａｂ（Ｔｍａｂに対して４当量）を、還元されたＴｍａｂに加え、室温で一晩放置した。次に、反応生成物の精製のために、ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＨｉＬｏａｄ１６／６００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＥＣを実施した。カラムに充填する前に、試料を２０，０００ｇで１０分間遠心分離した。コンジュゲートを含有する回収された画分を、コンジュゲーション緩衝液に緩衝液を交換し、０．４５μｍ濾過膜を使用して滅菌した。
【0263】
図１２ｂを参照すること。
Ｌ：タンパク質ラダー
レーン１：対照として１．１当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：ＩｆＡｂコンジュゲート、
レーン３：サイズ排除クロマトグラフィーを実施する前の、７５ＫＤａバンド（半抗体）の顕著な減少と共に、コンジュゲートの正確な推定質量である約１２５ＫＤａを示す、室温で一晩行われたＩｆＡｂとのＴｍａｂコンジュゲーション、
レーン４：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｆ６～Ｇ２）、
レーン５：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｇ４～Ｇ１３）、
レーン６：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｈ１～Ｈ７）。
Ｌ：タンパク質ラダー
レーン１：対照として１．１当量の３，４－ビス（２－ブロモアセトアミド）安息香酸メチル（５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：ＩｆＡｂコンジュゲート、
レーン３：サイズ排除クロマトグラフィーを実施する前の、７５ＫＤａバンド（半抗体）の顕著な減少と共に、コンジュゲートの正確な推定質量である約１２５ＫＤａを示す、室温で一晩行われたＩｆＡｂとのＴｍａｂコンジュゲーション、
レーン４：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｆ６～Ｇ２）、
レーン５：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｇ４～Ｇ１３）、
レーン６：サイズ排除カラム精製によって回収された画分（Ｈ１～Ｈ７）。
【0264】
レーン４および５は、望ましいｍＡｂ－ｆＡｂコンジュゲートを含有する（レーン５には若干のＨＣ－ＨＣ不純物）。この抗体コンジュゲートの略図は、図１２ｃに示される。これは、ｍＡｂ－タンパク質コンジュゲートまたは三官能性モノクローナル抗体とも呼ばれることがある。本発明者らは、その選択的調製およびプロテインＡカラムにおけるＡＫＴＡ精製に対する安定性を実証した。
【0265】
実施例１１
チオ架橋化合物の選択性は、それら位置化学によって異なる：オルト置換対メタ置換。
完全に還元されたＴｍａｂ（４当量）を、２当量のみのビス－ヨードアセトアミドリンカー１５および１７それぞれと共にインキュベートした場合の化合物１５および１７の選択性が評価された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて反応生成物を分解し（図１３ａに示される）、タンパク質ＭＳによってさらに特徴付けた（図１３ｂおよびｃに示される）。
チオ架橋化合物の選択性は、それら位置化学によって異なる：オルト置換対メタ置換。
完全に還元されたＴｍａｂ（４当量）を、２当量のみのビス－ヨードアセトアミドリンカー１５および１７それぞれと共にインキュベートした場合の化合物１５および１７の選択性が評価された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて反応生成物を分解し（図１３ａに示される）、タンパク質ＭＳによってさらに特徴付けた（図１３ｂおよびｃに示される）。
【0266】
最初に、Ｔｍａｂを、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に緩衝液を交換し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－０．５ｍＬ（１０ＫＤａ）遠心式フィルターを使用して（５ｍｇ／ｍＬ、３４μＭ、１ｍＬ）に希釈した。Ｔｍａｂを、ＴＣＥＰ（Ｔｍａｂに対して４当量）と共に４℃で２時間インキュベートすることによって還元した。この還元タンパク質を、各反応に対して試料１００μＬに等分した。Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）の原液を、ＤＭＦ中の最終濃度（１．０ｍｇ／ｍＬ、１．４μｍｏｌ、１．４ｍＭ）に調製した。１７の使用液（０．６８ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＦを用いた連続希釈によって調製した。２当量の１７の使用液（７μＬ、Ｔｍａｂ一定量に対して２当量）を、還元タンパク質に加えて、室温で一晩維持した。化合物１５のＴｍａｂとの反応のための類似の手順に従った。
【0267】
アジド修飾ビス－ヨードアセトアミド化合物１５および１７は、興味深い選択性を示した。メタ置換化合物１５との反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＴｍａｂのＨＣ（内部架橋された半抗体）が存在する主なタンパク質生成物であることを示した（図１３ａ、レーン２）。タンパク質ＭＳを用いた特徴付けは、このＨＣタンパク質生成物が、重鎖－重鎖内ジスルフィドの再架橋を介した、１分子の１５とのコンジュゲーションを受けていることを明確にした（図１３ｂ）。
【0268】
これに対し、オルト置換化合物１７は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって認められた顕著な量のより高い分子量の生成物を伴う、重鎖－軽鎖ジスルフィド結合を架橋することに対するより高い選好性を示した（図１３ａ、レーン１）。タンパク質ＭＳを用いた特徴付けは、このタンパク質生成物が、１分子の１７を用いたＨＣ－ＬＣジスルフィド再架橋を受けていることを明確にした（図１３ｃ）。重要な点として、ＭＳ分析は、残存するＨＣタンパク質が未変性であり、化合物１７とのいかなる検出可能なコンジュゲーションも受けていないことも明らかにした。
【0269】
図１３ａは、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中のＴｍａｂ（５ｍｇ／ｍＬ、３４μＭ）であって、４当量のＴＣＥＰ（１３６μＭ）で還元され、各ビス－ヨードアセトアミドリンカー（６．８μＭ、２当量）と共に室温で一晩インキュベートされたＴｍａｂを架橋することにおける、ビス－ヨードアセトアミドリンカーの選択性を評価するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１０％）を示す。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）－エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）（図１３ｂ）および
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）（図１３ｃ）を用いて架橋されたＴｍａｂのデコンボリューションしたタンパク質ＭＳスペクトル。
Ｌ：タンパク質ラダー、
レーン１：２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）－エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
レーン２：２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）と共にインキュベートされたＴｍａｂ、
２当量のＮ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，３－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１５）（図１３ｂ）および
Ｎ，Ｎ’－（４－（（２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）－１，２－フェニレン）ビス（２－ヨードアセトアミド）（１７）（図１３ｃ）を用いて架橋されたＴｍａｂのデコンボリューションしたタンパク質ＭＳスペクトル。
【0270】
参考文献
多くの出版物は、本発明および本発明の属する最新技術をより完全に説明し、開示するために上述されている。これらの参考文献の完全な引用は、以下に提示される。これらの参考文献のそれぞれの全体は、本明細書に組み込まれる。
EP333573
S M Andrew and J A Titus Current Protocols in Cell Biology (2000) 16.4.1-16.4.10.
E J Smith, L Visai, S W Kerrigan, P Speziale, and T J Foster* Infect Immun. 2011, 79(9): 3801-3809.
T Kantner, B Alkhawaja, A G Watts (2017) ACS Omega, 2, 5785-5791.
保護基ならびにそれらの合成および使用の考察に関しては、Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓおよびＴｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４版、２００６年、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌを参照すること。
多くの出版物は、本発明および本発明の属する最新技術をより完全に説明し、開示するために上述されている。これらの参考文献の完全な引用は、以下に提示される。これらの参考文献のそれぞれの全体は、本明細書に組み込まれる。
EP333573
S M Andrew and J A Titus Current Protocols in Cell Biology (2000) 16.4.1-16.4.10.
E J Smith, L Visai, S W Kerrigan, P Speziale, and T J Foster* Infect Immun. 2011, 79(9): 3801-3809.
T Kantner, B Alkhawaja, A G Watts (2017) ACS Omega, 2, 5785-5791.
保護基ならびにそれらの合成および使用の考察に関しては、Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓおよびＴｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４版、２００６年、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌを参照すること。
【0271】
標準的な分子生物学的技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照すること。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図14】
【国際調査報告】