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特表2022-538389遠心マイクロ流体チップ、キットおよびオンチップガス供給システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-02
(54)【発明の名称】遠心マイクロ流体チップ、キットおよびオンチップガス供給システム
(51)【国際特許分類】
G01N 35/00 20060101AFI20220826BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20220826BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220826BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220826BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20220826BHJP
【ＦＩ】
G01N35/00 D
G01N37/00 101
C12M1/00 A
C12M3/00 A
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021574813
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(85)【翻訳文提出日】2021-12-22
(86)【国際出願番号】 IB2020056095
(87)【国際公開番号】W WO2020261229
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/867,931
(32)【優先日】2019-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595006223
【氏名又は名称】ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】マリック， リディヤ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェレス， テオドール
(72)【発明者】
【氏名】クライム， リヴィウ
(72)【発明者】
【氏名】ダウド， ジャマル
【テーマコード（参考）】
2G058
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G058DA07
2G058DA09
2G058EA17
4B029AA02
4B029BB11
4B029CC02
4B029DA04
4B029GA08
4B029GB09
4B029GB10
4B065AA93X
4B065AC14
4B065AC20
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
チップ上のチャンバがチップの別のチャンバに加湿制御、またはより一般的にはガス組成制御を提供することを可能にする遠心マイクロ流体チップが提供される。これは、低コストで効率的な遠心デバイス、例えば、マルチポート空気圧チップコントローラ、シングルまたはマルチポート空気圧スリップリング、および空気圧スリップリングを備えた関節式遠心ブレードを使用するマイクロ流体インキュベーションを可能にする。デバイスは、細胞培養、微生物試験、または制御された微小環境を有する生物学的試料からの化学種の生成のために使用されてもよい。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遠心マイクロ流体チップであって、各々が０．１μＬ～１ｍＬの容積、および基準軸位置に関して規定された公称充填ラインを有する複数のマイクロ流体チャンバと、
各チャンバを相互接続する複数のマイクロ流体チャネルと、
各ポートが一つ又は複数のチャンバと流体連通する複数のポートと、
を備え、
前記チャンバの１つは、チャンバ１、２、３、および少なくとも１つのポートにチャネルを介して接続された調節済みチャンバであり、
チャンバ１は、その充填ラインまたはそれより上のポートからの第１の開口部と、第１のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第１のチャネルは、その充填ラインより下の前記チャンバ１を前記調節済みチャンバに接続し、
チャンバ２は、その充填ラインまたはそれより上のポートからの第１の開口部と、その充填ラインまたはそれより上の第２のチャネルへの第２の開口部と、充填ラインの下のいずれの相互接続チャネルまたはポートへの開口部も有さず、前記第２のチャネルは、チャンバ２のいずれの部分よりも基準軸に近接して延びる経路セグメントをみ、その充填ラインより上の調節済みチャンバとその充填ラインより上の前記チャンバ２とを接続し、前記第２のチャネルは、バルブを有さず、毛細管流は収縮を測定せず、
チャンバ３は、その充填ラインの上方に、ポートへの第１の開口部と、第３のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第３のチャネルは、前記チャンバ３を、前記調節済みチャンバの充填ラインの下方の前記調節済みチャンバに接続する、チップ。
【請求項2】
遠心マイクロ流体チップであって、各々が０．１μＬ～１ｍＬの体積を有する複数のマイクロ流体チャンバと、
各チャンバを相互接続する複数のマイクロ流体チャネルと、
各ポートが一つ又は複数のチャンバと流体連通する複数のポートと、
を備え、
前記チャンバの１つは調節済みチャンバであり、前記調節済みチャンバは、チャンネルを介してチャンバ１およびチャンバ２に接続され、少なくとも１つのポートに直接接続されており、
チャンバ１は、チャンバ１の充填ラインの上方のポートからの第１の開口部と、第１のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第１のチャネルは、前記チャンバ１を、その充填ラインよりもチャンバ１の軸遠位点に近接して、前記調節済みチャンバの充填ラインの上方の前記調節済みチャンバに接続し、
チャンバ２は、前記チャンバ２のための充填ラインを画定する余水吐開口部、充填ラインの上方のポートからの第１の開口部、充填ラインの上方の第２のチャネルへの第２の開口部、および充填レベルより下の任意のチャネルへの開口部も有さず、
前記第２のチャネルは、経路セグメントをみ、前記経路セグメントは、前記調節済みチャンバまたはチャンバ２のいずれかよりも前記チップの基準軸位置に近接して延び、かつ前記調節済みチャンバに接続する、チップ。
【請求項3】
前記チップの基準軸位置は、前記チャンバの上方の区域内部にあり、前記チップの頂端から２Ｌ未満であり、前記チップの中心線から０．６５Ｌ未満である（Ｌはチップの長さ）、請求項１又は２に記載のチップ。
【請求項4】
前記チップの前記基準軸位置は、前記チャンバの上方の区域内部にあり、前記チップの頂縁部から３／２Ｌ未満であり、前記チップの中心線から０．５Ｌ未満である（Ｌはチップの長さ）、請求項１又は２に記載のチップ。
【請求項5】
前記チップの前記基準軸位置は、前記チャンバの上方の区域内部にあり、前記チップの頂縁部からＬ未満であり、前記チップの中心線から０．５Ｗ未満である（Ｌはチップの長さ、Ｗはチップの幅）、請求項１又は２に記載のチップ。
【請求項6】
前記基準軸位置は、前記チャンバ２の２つの開口部の中点を通る２本の線の間にあり、前記２本の線は、前記２つの開口部の垂直二等分線によって二等分され、それぞれ、前記垂直二等分線に対して３０°および－３０°の角度をなす、請求項３～５のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項7】
前記チップの前記基準軸位置は、Ｐ１および前記第２のチャネルへの開口部から分離され、これらの分離は、２の係数以下であり、前記チャンバ２の前記充填ラインは、前記充填ラインより下のチャンバ２の容積の少なくとも３３％の容積をむ、請求項１～５のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項8】
前記充填ラインは、チャンバ２の前記容積の少なくとも５０％または６０％または６６％または７０％または７５％をむことが好ましい、請求項７に記載のチップ。
【請求項9】
前記チャンバ２内の前記充填ラインの表面積は、チャンバ１の表面積よりも少なくとも２倍、より好ましくは４倍、より好ましくは１０倍大きい、請求項１～８のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項10】
前記調節済みチャンバおよびチャンバ２のうちの少なくとも１つは、前記チップの他のどのチャンバまたはチャネルよりも大きいエッチング深さを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項11】
前記チャンバ２の形状は、その液体含有物の自由表面積の変化が１０％未満となり、前記充填ラインからの前記液体含有物の容積が１０％減少する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項12】
前記調節済みチャンバは、異なる遠心分留物を抽出するために前記充填ラインを越えて異なる軸方向距離にある出口チャネルへの複数の開口部を備える、請求項１～１１のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項13】
ポートのサブセットは、アドレス指定可能な空気圧作動のために提供され、これらのポートは、同時クランプシール接続のために前記チップの縁部に沿って整列される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項14】
前記チャンバ２の前記ポートは、密封された供給管に結合するのに適した形態を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項15】
前記調節済みチャンバは、微生物または細胞の支持体、前記第２のチャネルおよび基準軸位置への前記開口部と同一線上にあるガストラップであって、ガスが液体中に拡散する間にガス気泡を保持するために、前記基準軸位置と前記開口部との間に置かれる、ガストラップ、のうちの１つを備える、請求項１～１４のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項16】
熱吸収および分配材料が、前記調節済みチャンバおよび前記チャンバ２のうちの１つに隣接して提供される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項17】
２つの別々にアドレス指定可能な帯域の材料が、前記調節済みチャンバおよびチャンバ２を独立して加熱するために提供される、請求項１６に記載のチップ。
【請求項18】
前記チップは被覆され、遠心機の加圧キャリアガス供給源に結合された前記チップの少なくとも１つの空気でアドレス可能なポートと共に前記遠心機に装着するように適合されたマイクロ流体カートリッジを形成する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項19】
前記第２のチャネルは、その充填ラインより下方の開口部で前記調節済みチャンバと合流する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項20】
前記第２のチャネルは、毛細管効果および流体力学的抵抗が無視できる自由流動を受けやすく、親水性コーティングも疎水性コーティングも有していない、請求項１～１９のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項21】
各チャンバ１は、各調節済みチャンバの軸近位側に位置され、任意のチャンバ３は、各調節済みチャンバの軸遠位側に位置される、請求項１～２０のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項22】
前記チップは、適当なガス不透過性層を有する熱可塑性、熱可塑性エラストマ、またはＰＤＭＳから構成される、請求項１～２１のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項23】
前記チップは熱可塑性エラストマで構成され、前記チップの１つ以上のポートが前記チップ内部の空気圧バルブを作動させるために使用される、請求項１～２１のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項24】
前記空気圧バルブは、常閉バルブ、常開バルブ、または開いた状態、閉じた状態、半永久的に閉じた状態のトライステートバルブである、請求項２３に記載のチップ。
【請求項25】
前記第２のチャネル以外の３つ以上のチャネルは、それぞれの軸近位セグメントを有し、前記調節済みチャンバを、前記チップの前記面に垂直な傾斜軸を中心とする前記チップの傾斜角度が、前記調節済みチャンバとこれらのチャンバのうちの１つとの間の流体移動を可能にするように選択された形状、位置、および充填ラインを有するそれぞれのチャンバに接続する、請求項１～２４のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項26】
４５°未満の傾斜角度の範囲は、前記調節済みチャンバと前記３つのそれぞれのチャンバとの間を連続的に移動するのに十分である、請求項２５に記載のチップ。
【請求項27】
前記第１のチャネルは、流体力学的収縮および計量チャンバを備える、請求項１～２６のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか一項に記載のチップを備えたキットであって、前記チップ上に搭載するための液体と、
遠心マイクロ流体チップコントローラのうちの１つに結合するように適合されたチップ形態カートリッジと組み合わされた一つ又は複数のカートリッジ形成要素と、
空気圧スリップリングを備えた遠心ブレード、または、空気圧スリップリングを備えた関節式遠心ブレードと、
カートリッジ、前記チップ、またはチップ支持体に適用するための材料であって、前記調節済みチャンバを熱制御するための組成および寸法を有する材料と、
チャンバ２と、
または、それらの充填ラインの下にあるこれらのうちの一つの一部と、
を伴う、キット。
【請求項29】
前記液体は、前記チャンバ２の揮発性液体含有物、前記調節済みチャンバの為の生物学的サンプルを有する、または有する可能性のある液体、チャンバ１の為の一つ又は複数の試薬、緩衝液、または溶液、のうちの一つをむ、請求項２８に記載のキット。
【請求項30】
前記キットは、組み立てられ、前記遠心マイクロ流体チップコントローラ、空気圧スリップリング付き遠心ブレード、または、空気圧スリップリングを備えた関節式遠心ブレードに装着される、請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項31】
前記チャンバの１つにその充填ラインまで液体が有されている、請求項１～２７のいずれか一項に記載のチップを備えた遠心マイクロ流体システム。
【請求項32】
前記チャンバの１つに有される前記液体は、チャンバ２の揮発性液体含有物、前記調節済みチャンバ内に生物学的サンプルを有する、または有する可能性のある液体、またはチャンバ１内の一つ又は複数の試薬、緩衝液、または溶液、である、請求項３１に記載の遠心マイクロ流体システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［０００１］本発明は、一般に、遠心マイクロ流体チップのチャンバへの制御されたガス供給に関し、特に、調節済みチャンバと、それに結合された３つのリザーバを一定のレイアウトで有するチップに関するが、このレイアウトでは、１つのリザーバがガスを調節済みチャンバに供給し、別のリザーバが液体を供給し、第３のリザーバが調節済みチャンバからの出力を受けることを可能にする。
【0002】
【発明の背景】
【0003】
［０００２］マイクロ流体処理には多くの利点がある。試料や試薬の節約的な使用、非常に狭い空間での試験／反応／培養などがある。多くの用途において、コンディショニングされたチャンバの組成、および場合によっては液相と固相の両方の組成（温度および／または圧力）を制御する必要がある。たとえば、微生物学的試験、生成または反応チャンバにおいて、調節済みチャンバ内の微生物（細胞、細胞小器官、細菌、ウイルス、古細菌、真菌、原虫、オルガノイド、または小さな組織生検）、または上記のいずれかを潜在的に有する食物または水性試料は、液体（栄養素、触媒、または反応物）を供給可能であり、同時に、ガスの組成、温度および圧力を制御して、微生物を処理、試験、処理、またはインキュベートする。
【0004】
［０００３］そのため、調節済みチャンバは、基本的な研究（細胞生物学、生化学、生理学、生態学、進化）だけでなく、微生物による合成が困難な種の細胞生成にも必要である。特に、細胞ベースのアッセイを自動化し、統合することは、薬物スクリーニング、臨床診断および細胞ベースの治療に必要である。
【0005】
［０００４］従来のマイクロタイタープレート法は労働集約的であり、大型で高価なロボット式液体処理システムを使用せずに自動化することは困難である。非常に低い流体容積の操作を容易にし、従って細胞培養アッセイの小型化に成功するために、種々のラブオンチップ（ｌａｂ ｏｎ ｃｈｉｐ）マイクロ流体システムが開発されている。
【0006】
［０００５］細胞捕捉、細胞ベースのアッセイおよび検出を統合しながら、前述の問題の幾つかを克服し、連続的な細胞培養およびインキュベーションを可能にするために、過去２０年間にわたって多くのマイクロ流体システムが開発されてきた［Ｈａｌｌｄｏｒｓｓｏｎ，Ｓ．， Ｌｕｃｕｍｉ， Ｅ．， Ｇｏｍｅｚ－Ｓｊｏｂｅｒｇ， Ｒ． ＆ Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｒ． Ｍ． Ｔ． Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．６３， ２１８－２３１ （２０１５）］。マイクロ流体システムは、細胞培養を小型化し、試薬消費を低減し、従って、アッセイの全体的なコストを低減する。また、それらは、細胞外対細胞内液体積の比を減少させる能力を有し、細胞外微小環境の正確な操作を可能にして、外部刺激に対する細胞応答の遅れを減少させ、それによってアッセイ時間を短縮する［Ｋａｎｅ，Ｋ． Ｉ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０９９５７ （２０１７）］。さらに、小型化された細胞培養は、幾何学的に閉じ込められた小さなフットプリント内での多重化を可能にし、並行して複数の条件の実験的複製またはスクリーニングを可能にする［Ｒｅｉｃｈｅｎ，Ｍ．， Ｖｅｒａｉｔｃｈ， Ｆ． Ｓ． ＆ Ｓｚｉｔａ， Ｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ． Ｌａｂ． Ａｕｔｏｍ． １８， ５１９－５２９ （２０１３）］。最後に、マイクロ流体デバイスは、流体操作のための本質的に閉じたチャネルおよびチャンバを有するので、それらは、細胞培養培地の持続灌流および栄養素および刺激物質の送達を可能にしながら、蒸発の影響を最小限にすることができる［Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． １２４， ２３４－２４１ （２０１７）； Ｋｈｏｕｒｙ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｔｒａｐｓ ｓｙｓｔｅｍ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ １２，１００１－１００８ （２０１０）］。
【0007】
［０００６］これらの開発にもかかわらず、従来技術のマイクロ流体デバイスを使用する気相調節は、チップの雰囲気と容易にガスを交換する透過性マイクロ流体チップを使用することをむので、マイクロ流体の利点の一部は、まだ実現されていない。これは、これらのチップを大きな補助機器（インキュベータ、シリンジポンプなど）に入れることを直接要求することにつながる。実際、文献に記載されているマイクロ流体システムのほとんどは、培養チャンバにＣＯ２緩衝媒体を供給するために外部シリンジポンプの使用に依存しており、デバイス操作の全体的な複雑さを増大させ、それらの実際の適用を制限する［Ｋｙｕ Ｂｙｕｎ，Ｃ．， Ａｂｉ－Ｓａｍｒａ， Ｋ．， Ｃｈｏ， Ｙ．－Ｋ．＆ Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．Ｐｕｍｐｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ３５， ２４５－２５７ （２０１４）； Ｔａｋａｎｏ，Ａ．， Ｔａｎａｋａ， Ｍ． ＆ Ｆｕｔａｉ， Ｎ．Ｏｎ－ｃｈｉｐ ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｃｋｅｔ－ｓｉｚｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ． Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ １２，９０７－９１５ （２０１２）］。さらに、これらのデバイスは、ガス微小環境の制御を可能にするその透明性、生体適合性およびガス透過性のために、ＰＤＭＳを用いて作製される［Ｔｏｒｉｎｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． ＰＤＭＳ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ ３， ６５ （２０１８）］。ＰＤＭＳデバイスは学術研究において豊富であるが、この材料は、スケーラブルな製造とは適合しないので、ＰＳおよびＣＯＣのような生体適合性の硬質熱可塑性物質が普及している医薬および臨床研究をむ産業においては、ほとんど使用されない。硬質熱可塑性プラスチックは、ＰＤＭＳよりも数桁低いガス透過性を有する。さらに、ＰＤＭＳはタンパク質および小分子を吸収することができ、一部のアッセイ結果を偏らせる。チップが加湿器チャンバ内にない限り、ＰＤＭＳのガス透過性は、時間の経過とともに試料の蒸発をもたらすことができる。長期の細胞培養を必要とする用途には、常に湿度制御が必要である。実際、文献における実験のほとんどは、加湿された細胞培養インキュベータ内部でＰＤＭＳチップを使用し、「ラボオンチップ」を「実験室内のチップ」に低減する。
【0008】
［０００７］先行技術の研究者、たとえば、Ｂｕｎｇｅ，Ｆ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｒｉｓｃｈｅ，Ｓ．＆Ｖｅｌｌｅｋｏｏｐ，Ｍ．Ｊ．は、この正確な問題に取り組んでろ、ＰＤＭＳをまないマイクロ流体細胞培養は、陽極酸化アルミニウムの多孔質膜を通して統合されたガス供給を伴う。マイクロデバイス２０、９８（２０１８）は、細胞を成長させるために、インキュベータ内でチップを支持するための改良されたガス透過性培地を提供するように動機付けられた。
【0009】
［０００８］遠心マイクロ流体チップでなくてもよいが、本クレームと共通の一部の、または幾つかの構造的特徴を有してもよい先行技術のチップは、ＵＳ ２００９／２４６０８２、ＷＯ２０１８／２１５７７７、ＵＳ ２０１８／３６４２７０、ＵＳ ２０１７／１７３５８９、ＵＳ ２０１６／２１４１０５、ＵＳ ２００８／２２６５０４、ＵＳ ２０１８／３１３７６５、ＪＰ ２００３３４４４２１、ＥＰ ２３３２６５３、ＣＮ １０７４６０１２２、ＵＳ ７４５２７２６、およびＵＳ １０２５２２６７である。
【0010】
［０００９］従って、コンパクトであり、好ましくはチップの材料組成の制限がほとんどない（例えば、大量製造技術、不活性、低コストの形成および封止などに適合する）、液体栄養補給およびその調節済みチャンバ内でのガス供給制御を可能にするように設計された遠心マイクロ流体チップが必要である。特に、チップは、遠心マイクロ流体チップの調節済みチャンバへのガス供給を、透過性膜を通過することなく、したがって他の揮発性物質の吸収および脱着を受けることなく、直接制御することを可能にする。
【発明の概要】
【0011】
［００１０］全てのタイプのマイクロ流体チップにおいて、チャンバを提供することは非常に一般的であり、チャンバ内に細胞または微生物支持構造体を有する可能性があり、チャンバは、チャンバを栄養補給または灌流するための一つ又は複数の液体供給リザーバ、および廃棄物リザーバから流体を受けるための一つ又は複数の廃棄物リザーバと接続されているが、マイクロ流体リザーバを適応させて、調節済みチャンバの為にガスを供給するオンチップコントローラとして機能させるという考えは、特に、空気圧制御を伴う遠心マイクロ流体の状況においては、知られていなかった。これは、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２、ＣＨ２、ＣＯ、ＣＨ３などをどのように制御するかという問題に対する驚くほどエレガントな解決策であり、膜を通過しないようにする。
【0012】
［００１１］この溶液は、遠心マイクロ流体デバイスに特有の様式で、調節されたチャンバ（ＣＣ）に接続されたガス供給源（ＧＳ）リザーバを提供することをむ。結合はチャネルを通して行われ、チャネルはＧＳリザーバまたはＣＣのいずれよりもチップの基準軸に近い方を通過する。これは、それらの間で液体を導くことに対して、チャネルを一般的に適さないものにし、不必要に問題を生じさせる。しかしながら、それは液体に対して優れた障壁となり、気体に対してはほとんど障壁とならない。従って、ＧＳリザーバ内の反応性液体または固体前駆体、または揮発性液体は、それ自体はＣＣ内に移動可能ではないが、ガス生成物は移動可能である。ガスの発生は、ＧＳリザーバの温度を制御することによって外部的に制御されてもよい。この発生を、ＧＳリザーバのポートから、チャネルを通って、ＣＣまで、およびＣＣポートを介してチップから出る制御された流量と調整して、ＣＣガス濃度を制御する。
【0013】
［００１２］流量を制御するために、ＧＳポートおよびチャネルへの開口部の両方が、ＧＳリザーバの充填ラインより上方にあり、これは、チャネルへの液体の引き込み（ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ）を排除するためである。ここで、充填ラインは、「完全な」流体の凹凸面（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）を与える又は得るときの、チャンバ／リザーバの液体有物の自由面であると理解される。もちろん、チャンバは過充填される可能性があり、これは、チャンバを特定のプロトコルまたは動作に適さないようにしたり、またはチャンバを完全に使用不可能にしたりする可能性がある。充填ラインは、通常、充填されていないチップの消えないマーキングではないが、１－実際に画定することができること、２－チップベンダーが提供する説明書に記載されたチップのチャンバの容積によって製品内で識別することができること、または、３－以下の手がかり（ｃｕｅｓ）を考慮した検査によって明らかにすることができる。ａ）ＧＳポートの位置及びチャネルに開口している位置、ｂ）その他の全ての機能的に接続されたリザーバの入口、出口及びポートに対する位置、ｃ）ＣＣ内部の材料を支持するための装置の位置、例えば、充填ラインで、又はその下で材料を支持すると自然に仮定されるセル支持体。充填ラインは幾何学的に線ではなく、チップの回転軸から放射される遠心力によって定義されることに注意されたい。チップが「オンエッジ」回転のために設計されている場合、すなわちチップの頂縁部が遠心機の軸と平行である場合、第１のアークは、チャンバの厚さ方向にあり、本質的に無視することができ、その結果、全てのチャンバは、充填ラインとして本質的に平行な幾何学的ラインを有することに留意されたい。チップの他の可能性のある配向は、軸が垂直であり、チップの面の法線からオフセットされ、この場合、全てのチャンバの充填ラインは、本質的に、同じ軸からのそれぞれの円弧である。
【0014】
［００１３］回転軸は、チップを見るだけで定義されてもされなくてもよいが、チャネル相互接続およびチャンバに対するチャネルの位置が与えられれば、そのチャンバの機能的観点と一致して、軸に対して動作可能な範囲の位置を提供する手がかりが存在する。従って、チップの全体的で意図的な見方は、機能的な結果のために整列されかつ相互接続された４つ以上のチャンバを有するほぼ全ての場合において、可能な回転軸の狭いバンドを提供し、狭いバンド内部で、各チャンバに対する充填ラインを規定する。さらに、チップの軸がチップ自体から遠く離れていないので、チップに印加される遠心場の勾配が大幅に減少し、遠心機のモーメントが増加して、より低い勾配を達成するためにより高いトルクを必要とするという事実などの合理的な制限がある。そのため、チップの軸は、一般に、チップの長さの２倍未満だけチップから分離されると予想される。
【0015】
［００１４］また、本発明は、出願人の同時係属中の国際公開第２０１５／１８１７２５号に教示されているように、またはその背景において教示されているように、回転軸に平行な軸上で傾斜するように設計されたチップの可能性をむ（その内容は、法律および慣行によって許可され、かつ他の全ての管轄区域において当該技術分野で公知であると推定される場合には、参照により本明細書に組み込まれる）。そうである場合、チャンバの充填ラインは、チップのベースラインポーズ（存在する場合）、または中間の動作範囲におけるバランスのとれたポーズにおける充填ラインを指す。このようなチップは、傾斜角度に応じて流体を保持または分配する非毛細管駆動の蛇行チャネルを使用することによって識別可能である。
【0016】
［００１５］チャネルは、ＣＣの充填ラインの上方または下方のいずれかで、ＧＳリザーバをＣＣに結合することができる。充填ラインより下方にガスを供給することによって、ガスは、より効率的にＣＣの液体有物に溶解し、充填ラインより上方のＣＣへのガス送達と比較して、ガスをＣＣに「泡立たせる」ためにより高い圧力が必要とされる。バブリングは、有利にはＣＣ量を混合することができ、または幾つかの細胞の培養において所望されるように細胞の付着または沈降を妨げることができる。バブリングは、本出願人の同時係属ＷＯ２０１５／１３２７４３およびその先行技術の部分に教示されており、これはまた、遠心マイクロ流体のための好ましいマルチチャネル空気圧制御アーキテクチャを教示する（その内容は、その内容が、法律および慣行によって許可され、かつ他のすべての管轄区域において当該技術分野において公知であると推定される場合に、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0017】
［００１６］ガスのＧＳリザーバでの流れへの拡散、または流れからＣＣの有物への拡散を促進するために（特にバブリングを使用しない場合）、ガスとの接触の表面積（充填ライン）を拡大してもよい。ＣＣまたはＧＳリザーバの幅は、それぞれの充填ラインまたはその近くで最大であってよい。より大きな効果を得るために、ＣＣおよび／またはＧＳリザーバのエッチング深さは、チャネルおよびチップの幾つかの他のリザーバのエッチング深さよりも実質的に大きくてもよい。候補基準軸位置は、他の候補のものと比較して、ＣＣおよびＧＳリザーバの充填ライン表面積に依存する可能性が高い場合も低い場合もある。
【0018】
［００１７］チップの充填ラインが点検によって確認できることを合理的に期待するために、さらに、種々の用途に対して機能的であるチップを作るために、チップは、少なくとも第１の緩衝液または試薬供給源（ＳＵＰ）リザーバ、および第１の出力（ＯＵＴ）リザーバ（例えば、従来の廃棄物リザーバ、上清、またはＣＣの遠心的に単離された画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ））に結合されたＣＣに限定される。ほとんどの実施形態において、２つ以上のＳＵＰおよびＯＵＴリザーバが好ましい。ＳＵＰリザーバは、その充填ラインの下方で、好ましくは、軸に対してＳＵＰリザーバの遠位面で、ＳＵＰリザーバと合流するＳＵＰチャネルを介してＣＣに結合される。ＳＵＰチャネルは、ＣＣ充填ラインより上方の任意の場所でＣＣに結合することができる。ＯＵＴリザーバは、ＯＵＴチャネルによってＣＣに結合され、これは、収集された試料を優先して、充填ラインの上方のＯＵＴリザーバと、充填ラインの下方のＣＣと合流する。たとえば、ＯＵＴリザーバがＣＣの充填容積に対して小さい容積を有する場合、それは、ある量の遠心分離の後／その間に、充填容積の頂面をスキムするように設計されるか、またはそうでなければ、ＣＣの遠位壁および充填ラインの中間の対応する点から異なる画分を抽出してもよい。
【0019】
［００１８］幾つかの用途において、かなりの量のガスの送達を必要とするか、またはガス送達が非効率的であり、長期間にわたって送達される場合がある。例えば、細胞インキュベーション研究は、数時間または数日を要することがある。その場合、ＧＳリザーバの充填ラインより下方の材料で多くのガスを生成する必要があり、ＧＳリザーバの充填容積を大きくすることが望ましい。遠心マイクロ流体チップ設計の空間的制約は、一般に、充填容積の間のトレードオフを必要とする一方で、充填ラインにおいて十分な表面積を提供し、また、使用中の流れにおける濃度低下が極端でないように、ＧＳレザーバが空になるにつれて自由表面積が徐々に失われることを可能にする。
【0020】
［００１９］そのようなものとして、チップは、それを遠心機に装着し、それを、システム（例えば、出願人の国際公開第２０１５／１３２７４３号明細書に教示されているシステムおよび単一チャネル空気スリップリングをむそこに特定された先行技術に教示されているシステム）と結合することによって使用されるが、このシステムは、制御された流量をＧＳポートに供給し、ＣＣポートを介してチップから供給するように適合されている。
【0021】
［００２０］ＷＯ２０１５／１３２７４３は、回転ステージ上にプログラム可能な電気機械式バルブを有する遠心チップコントローラ、およびバルブの動作を指示するためのバルブの電子コントローラを教示するが、回転ステージは、制御された空気圧を空気圧インターフェースを介してチップの専用の圧力ポートに加えることを可能にする。各圧力ポートは、ポンプまたは通常の大気圧（ベント）から正または負の圧力を加えるようにプログラムすることができる。ポンプは、細胞培養に必要なＣＯ２のような特定のガス環境をカートリッジに提供するために、ガスボンベのようなガス供給源に接続可能であるか、または空気を供給するポンプに接続可能である。遠心チップコントローラを使用して発生された圧力差は、カートリッジ上の任意の能動要素を統合する必要なしに、バルブ形成、フロースイッチング、（遠心力に対して流体を移動させる）逆ポンピング、またはオンデマンドの気泡ベースの混合などの種々の流体機能の実行を可能にする。
【0022】
［００２１］クレームの写しは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0023】
［００２２］本発明の更なる特徴は、以下の詳細な説明の過程で説明されるか、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0024】
本発明をより明確に理解するために、添付の図面を参照して、その実施形態を実施例として詳細に説明する。
【図3】図３は、図１のチップの変形例であって、単一ポートの空気で制御されたマイクロ流体チップコントローラと共に使用するように適合されたものであるか、またはチップ表面に垂直な軸上でのチップの旋回を提供する関節付きブレードホルダを有する空気圧スリップリングである。
【図4】図４は、図１のチップの変形例であって、単一ポートの空気で制御されたマイクロ流体チップコントローラまたは流体で制御された計量および分配システムを備えた空気圧スリップリングと共に使用するように適合されている。
【図7】図７Ａは、本発明を実証するのに使用されるプロトタイプチップを示す写真であり、それぞれ、本発明を実証するのに使用される２つのカートリッジのパターン化されたチップ表面のレイアウトを示す。 図７Ｂは、本発明を実証するのに使用されるプロトタイプチップを示す写真であり、本発明を実証するのに使用される２つのカートリッジのパターン化されたチップ表面のレイアウトを示す。 図７Ｃは、本発明を実証するのに使用されるプロトタイプチップを示す写真であり、本発明を実証するのに使用される２つのカートリッジのパターン化されたチップ表面のレイアウトを示す。 図７Ｄは、本発明を実証するのに使用されるプロトタイプチップを示す写真であり、インキュベーションプロセスの前の充填されたカートリッジを示す。 図７Ｅは、本発明を実証するのに使用されるプロトタイプチップを示す写真であり、インキュベーションプロセスの後の充填されたカートリッジを示す。
【好ましい実施形態の説明】
【0025】
［００３１］本明細書では、所与の濃度、ならびに場合によっては圧力および温度のガスの供給によるチャンバの調節を必要とするプロセスにおいて使用するための特定の価値を有する遠心マイクロ流体チップが記載される。可能性のある汚染の問題またはオフチップ供給の要件を回避し、マイクロ流体システムを単純化するために、ガス供給は、チップの単一のリザーバから提供されるように適合され、このリザーバは、その充填ラインの下に揮発性または他のガス生産性液体容積を有するように適合される。液体容積を局所的に加熱することによって、ガスの直接供給をチップ上に提供することができ、ガスが空気圧スリップリングまたは実質的な温度勾配を横切る他の経路を介して直接供給された場合に生じ得る凝縮または分離の問題を回避する。
【0026】
［００３２］図１は、本発明の一実施形態による遠心マイクロ流体チップ１０の第１の実施形態を示す。本実施形態は、出願人の同時係属中の国際公開第２０１５／１３２７４３号の教示に従って提供されるような、チップ１０の複数（５個または６個）の独立した（すなわち、任意の組のポートを任意の時点で制御することができる）または選択的に（すなわち、任意の１つを制御することができるが、一度に１つのみ）制御されたポートを有する遠心システムと共に使用するのに特に適している。ポートはそれぞれのチャンバに対して局所的に示されているが、一般に、整列を容易にするために、全てのポートをチップ１０の共通縁部に沿って配列することにはほとんど欠点がなく、また、個々の管の手動結合を不要にするために、チップの共通インターフェース設計の一部とすることができる。
【0027】
［００３３］チップ１０は、細胞培養若しくは組織成長のために、または生きた組織、細胞小器官、微生物若しくは試料の成長若しくは試験のために、調節済みチャンバ（ＣＣ）１３を有する。ＣＣ１３は、供給源（ＳＵＰ）リザーバ１２、出口（ＯＵＴ）リザーバ１４／１５、およびガス供給源（ＧＳ）リザーバ１１をむ、それに流体的に結合された多数のリザーバを有する。各リザーバ１２、１４／１５、１１は、ＣＣ１３に結合するためのそれぞれのチャネル（ＳＵＰ１７、ＯＵＴ１８／１９、ＧＳ１６）を有する。各リザーバは、ＣＣ１３（Ｐ３）と同様に、液体装填のためのそれぞれのポート（Ｐ２、Ｐ４／Ｐ５、Ｐ１）を有する。アッセイプロトコルまたはマイクロ流体プロセスによって必要とされるように、正または負の圧力を付加するために、同じポートをベントに使用してもよく、または空気圧源で各チャンバに個別にアドレス指定してもよい。ＧＳリザーバ１１は、ＧＳリザーバ１１が加湿を中断することなく連続的に補充できるように、揮発性液体を供給するための別個のポートＰ６および空気圧源に結合するためのポートＰ１を有してもよい。これは、ＷＯ２０１５／１３２７４３に教示されているように、オフチップ装填によって実行することができる。好ましくは、ポートＰ６は、ＧＳリザーバ１１からの排気を提供しないように、使用中の揮発性液体でプラグ接続される。
【0028】
［００３４］ポートＰ６、または任意選択的にＳＵＰリザーバ１２も、遠心マイクロ流体プラットフォームのための出願人の同時係属中の米国特許第６２／７６０２５６号明細書”ＷＯＲＬＤ－ＴＯ－ＣＨＩＰ ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ”に教示されているように、静止した非接触の点滴送達システムによって供給可能である。ＧＳリザーバ１１は加圧されたチャンバであるので、Ｐ１を通る蒸発損失と同様に、Ｐ１のキャリアガスとＰ７の液体の両方の流量に対する独立した制御にいくらか注意する。特に、これは、液体プラグでＰ７をブロックし、Ｐ７の開口部に実質的な流体抵抗またはバルブを提供することによって達成することができる。ＳＵＰリザーバ１２に対して、Ｐ２は、二重流れの問題を緩和する必要も、加圧を維持する必要もなく使用可能である。
【0029】
［００３５］ＧＳリザーバ（１１）は、たとえば、細胞のインキュベーションまたは増殖過程を通してＣＣ１３の湿度を維持するために、または充填ラインより上の ＣＣ１３内部のガス組成を制御するために、ＣＣ１３にガスを供給する。ＧＳリザーバ１１は、ＣＣ１３の充填ライン２０の下方または上方のいずれかで、ＧＳチャネル１６を介してＣＣ１３に接続される。充填ラインより下方にある場合は、ポートＰ１でより高い圧力を供給して、ＣＣ１３の液体含有物を通してガスを押し出す（その結果、「気泡バブリング」が生じる）。これの利点は、気泡の表面積が大きく、液体内部のガスの溶解が高くなることである。ＧＳリザーバ１１から出力されるガスが、Ｐ１からＰ３への加圧された流れを提供するキャリアガスよりも高い溶解速度を有する場合、ガスのより高い効率の送達を行うことができる。バブリングは混合を促進し、微生物または細胞の沈降または付着を回避することができる。渦を混合することは、幾つかの細胞培養にとって不利である場合があり、これらは、気泡から細胞骨格／支持体を保護し、気泡を細胞から離れるように向ける障壁によって回避可能である。あるいは、示されるように、ＣＣ１３の液体有物の（充填ライン２０において又はそれより下方での）自由表面間の拡散が、液体有物をガスに供給するために依拠されてもよい。
【0030】
［００３６］チャネル１６は、ＧＳリザーバ１１の充填ライン２０より上方の任意の場所で、その頂部または側部のいずれかで、ＧＳリザーバ１１と合流することができる。原理的には、チャネル１５は、充填ライン２０の下方でＧＳリザーバ１１と合流して、効率的なガス引き込み（ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ）に関して同様の利点を達成することができるが、バブリング中のチャネル１６の液体閉塞を防止するために、保護手段が必要とされる。なぜなら、この経路における障害物は不便であり、水性液体などのほとんどの液体のバブリングは、これらの障害物を生じさせる可能性があるからである。ＧＳチャネル１６は蛇行チャネルであり、チャネル１６は液体を導くことを意図していないが、ガス輸送に対して最小抵抗を供給するので、高い流体力学的抵抗を有するか、または実質的にゼロであってもよい。高い流体力学的抵抗が提供される場合、それは、装填中にチャネル１６に入る液体のリスクを防止または低減することが可能であり、これは、遠心分離の前に行われる。流体抵抗が低い場合、チャネル１６のいかなる一時的な封鎖も、より少ない圧力および時間で除去することができる。従って、ＧＳチャネル１６は、ＧＳリザーバ１１への開口部付近を除いて、より低い流体抵抗を有してもよい。
【0031】
［００３７］ＧＳチャネル１６は、当技術分野で周知のサイフォンバルブに類似した蛇行構造を規定するが、サイフォンバルブに関連するほとんどの問題を必ずしも有するとは限らない。チャネル１６は、サイフォンバルブの信頼できる作動に不可欠である特定の親水性または流体力学的抵抗を有さない。したがって、厳密な寸法制御および表面機能化は不要である。しかし、蛇行経路は、ＧＳリザーバ１１またはＣＣ１３よりもチップの回転軸またはその基準軸に近いセグメント１６ａをむ。平行線であるＧＳリザーバ１１およびＣＣ１３に示される充填ライン２０を考慮すると、シャフトは、チップ１０の頂縁部に対して推定的に平行であるが、図２を参照して示されかつ説明されるように、チップ１０は、充填ラインの形状に影響を及ぼす位置の範囲内に位置される軸を中心に回転するために均等に配備され得る。これは、ポートＰ１およびチャネル１６への開口部の位置とともに、遠心力の下でＣＣ１３へと駆動されるＧＳリザーバ１１からの液体からガードする。
【0032】
［００３８］ＳＵＰチャネル１７は、充填ライン２０の上方で、ＳＵＰリザーバ１２の軸方向遠位点からＣＣ１３まで延びる。ポートＰ２は、ＳＵＰリザーバ１２の軸近位点から延びる。このように、リザーバ１２の充填ラインは、リザーバの頂縁部でもよい。ＳＵＰリザーバ１２の過充填のリスクはない。ＳＵＰチャネル１７は、好ましくは低い流体力学的抵抗を有するチャネルであり、それに拘わらず、一度プライミングされると、遠心分離下でのその液体有物の急速な分配を回避するために、（ＣＣ１３に対して）連続的に負圧に供される。
【0033】
［００３９］ＯＵＴチャネル１８， １９は両方とも、ＣＣ１３から、充填ライン２０の下方で、それぞれのＯＵＴリザーバまで延びるように示されている。ＯＵＴリザーバ１４は、上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のためのものであり、所望の遠心分離特性に関連する充填ラインに関して特定の位置（典型的には、細胞デトリタスおよび粒子が高速遠心分離の間に収集し得る位置より上）を有するが、上清の所望の容積を収集するのには十分に低い。ＯＵＴチャネル１８は、その充填ライン２０でリザーバ１４と合流する。ＯＵＴリザーバ１４は、ＣＣ１３の充填ラインの軸近位にあるので、それに上清を引き寄せる唯一の方法は、逆ポンピングを用いることであり、上清の慣性を克服するために、ＣＣ１３に対して十分に負のＰ４の圧力を加える。上清チャンバが過剰に満たされている場合、遠心分離下にある間に単にＰ４での圧を解放することによって、過剰な液体が確実にＣＣ１３に戻る。そのようなチャネル１８は、低流体力学的チャネルであることが好ましい。
【0034】
［００４０］ＯＵＴチャネル１９は、廃棄物リザーバ１５の軸近位点に通じるＯＵＴリザーバ１５はＣＣ１３の軸遠位にあり、チャネル１９は低い流体力学的抵抗を有するので、たとえば、チャネル１９が（ＣＣ１３に対して）プライミングされるまでＰ５における圧力を減少させ、次いで、過剰な液体が抽出された後に圧力を増加させて、ＣＣを空にすることを防止することによって、過剰な液体有物を抽出して、新鮮な緩衝物のための余地を作ることができる。ＯＵＴチャネル１９内の液体がサイフォンの上方に後退すると、Ｐ５での圧力が解放され、液体はＣＣ１３に戻る。
【0035】
［００４１］また、図１は、任意選択的にＧＳリザーバ１１に組み込まれる余水吐１１ｂも例示しているが、全ての特徴付けにおいて本発明に必須ではない。余水吐１１ｂは、チャンバの充填レベルの、容易に識別可能なマーカーである。過剰充填を回避するために、余水吐を追加的または代替的にＣＣ１３にめることができる。図３に関して以下に説明するように、関節式遠心ブレードで使用するために設計された実施形態において、関節式遠心ブレードの動作がチャンバの充填レベルに特に敏感であり得るので、余水吐が特に好ましい。
【0036】
［００４２］余水吐１１ｂの主な利点は、ＧＳリザーバ１１の過剰な充填がチップ１０の機能に影響を与えないようにすることである揮発性流体が遠心分離に先立ってＧＳリザーバ１１内に供給され、かつ揮発性流体の高精度計量を提供することが望ましくないか、または好都合でない場合、または更に揮発性流体が蒸発速度に対して十分な精度で制御されない速度で連続的に供給される場合、遠心分離が適用されると同時に／その間に、余水吐１１ｂは、過剰な流体を隣接するリザーバ内に吸引する。したがって、ＧＳチャネル１６を閉塞するリスクを有することなく、充填容積の僅かな誤差に対処することができる。従って、余水吐１１ｂの使用は、揮発性液体の容積を増大させ、これは、閉塞のリスクを増大させることなく、又は揮発性液体２５の慎重な計量を必要とすることなく使用することができる。
【0037】
［００４３］任意に表現されるチップの幾つかの特性がある。各リザーバ／チャンバのサイズ、形状、配向およびレイアウト（相対位置）は、図示されるようである必要はない。一般に、ＧＳリザーバ１１の形状は、液体が充填ライン２０より下方の容積の２０％から１００％の間を占める場合に、液体有物の自由表面の表面積の低い変動を提供することが好ましい。これは、ＧＳリザーバ１１内の容積が、ＣＣ１３に引き込まれるガス生成から低下するにつれて、ガス生成および同伴の速度が感知できるほど変化しないことを確実にする。さらに、ＧＳリザーバ１１がチップ１０のディープエッチング構造であり、他のチャンバよりも大きな表面積を占めることができるように、比較的高い自由表面積が好ましい場合がある。ＧＳリザーバ１１は軸近位のＣＣ１３を示しているが、これは逆にすることもできるし、軸から等間隔にすることもできる。
【0038】
［００４４］ＣＣ１３は、液体有物の高い自由表面積を提供するために、比較的大きく、また好ましくは深く示されている。しかしながら、ＧＳチャネル１６が充填レベルより下方のＣＣ１３と合流する場合、ＣＣは、自由表面積制約を回避して、充填ラインより上方の遙かに少ない容積を必要とする。ＣＣ１３が設計されるプロセスに依存して、それは多くの異なる特徴を有することができる。それは、完全に充填ラインの下に細胞、微生物または組織のトラップ、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）または支持体を有してもよく、または自由表面での細胞培養を提供してもよい。
【0039】
［００４５］チップ動作中、ＣＣ１３内部の圧力および温度を独立して制御することが望ましい場合がある。温度制御は、当該技術分野で周知の様々なオンチップ及びオフチップ加熱システムによって達成することができる。マイクロ流体デバイスにおける加熱のための多くの技術が、文献［Ｖ．ミラレス、Ａ・Ｈｕｅｒｒｅ、Ｆ．Ｍａｌｌｏｇｇｉ、Ｍ．－Ｃ． Ｊｕｌｌｉｅｎ， “Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｈｅａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１３，ｖｏｌ．３］に記載されている。オフチップ加熱技術には、ペルチェ素子、抵抗素子、レーザダイオード（アルゴンイオンレーザ、赤外線レーザ）などがある。オンチップ技術には、薄いメタライゼーション層（金、白金、銅、クロム）を使用する集積マイクロヒータ、抵抗素子としてマイクロチャネルに埋め込まれた液体金属、および小型化されたマイクロ波加熱素子がまれる。この要望に従って、金属などのコーティングまたは埋め込み材料をＣＣ１３（および任意選択的にリザーバ１２，１４）内に適用して、加熱されるべき容積を横切る熱の吸収、保持、および分布を補助することができる。この容積は、少なくとも６０％が、ＣＣ１３または充填ラインより下方のＣＣ１３、またはそれに加えて、一つ又は複数のＳＵＰリザーバと整列してもよく、好ましくは、ＧＳリザーバ１１の任意の部分を除外して、ＧＳリザーバ１１およびＣＣ１３の独立した熱制御を可能にする。チップ内部から加熱する代わりに、吸収材料および導電材料をチップの裏に塗布してもよく、またはチップの材料と一体化してもよい。後者の場合、材料は、好ましくは、（ＧＳリザーバ１１から離れた）チップ上の他の場所にある場合よりも、容積の周りで少なくとも１０倍以上吸収するので、チップ１０の環状ストリップを横切るレーザ、ダイオード、渦電流または同様の源による熱の付加が、これらの独立に制御された熱ゾーンの１つを選択的に加熱する。最後に、材料は、チップのための意図された装着位置に沿って、チップのための支持体上に提供されてもよい。より高い精度の温度制御を提供するために、材料とチップとの間の間隔に対する幾らかの注意は、たとえば、熱結合流体またはクランプを介して制御されるべきである。
【0040】
［００４６］圧力制御は、ガスのスループットと同様に、全てのポートでの圧力を同時に制御し、フリーベントされたチップポートをチップの加圧限界内に提供しないことによって行うことができる。同様に、圧力変動は、ポートで供給される圧力をパルス化することによってＣＣ１３に供給することができる。
【0041】
［００４７］細胞培養または幾つかの他の生物学的プロセスについては、３５－４０℃、より好ましくは３６－３９℃、３７－３８℃または約３７．５℃での加熱が、ＣＣ１３にとって理想的である。ＧＳリザーバ１１を通る空気流のＣＯ２又は湿度の制御は、室温と３５－４０℃との間で温度を制御することをむのが便利である。本発明の用途の１つは、ＣＣ１３を通過する空気を加湿して、多くの生物学的試料研究で必要とされるように、ガス交換を必要とする水性液体を有する暖かいチャンバ内での蒸発損失を防止することである。ＧＳリザーバ１１内の水を加熱し、キャリアガス流量を制限することによって、充填ライン２０の上方でＣＣ１３を通過する流れは、蒸発損失を大幅に低減するのに十分な高湿度を有する。
【0042】
［００４８］適切な遠心マイクロ流体コントローラによって遠心機に装着されたチップ１０は、遠心分離が連続的である間に、様々な機能を実行することができる。たとえば、生物学的試料がＣＣ１３に装填され、ＧＳリザーバ１１およびＳＵＰリザーバ１２が装填されると、遠心分離を開始することができる。遠心分離速度が閾値より上方である間、各リザーバ中の液体は、それぞれの充填ラインにあるか、またはそれより下方にある。要求に応じて、またはスケジュールされたプロトコルに従って、空気圧作動正圧（ＣＣ１３に対して）をポートＰ２で供給して、ＳＵＰリザーバ１２からＣＣ１３に一部の流体を移送することができる。ＣＣ１３に移送された培地の点滴に基づく計量は、所定の間隔でＰ２において負の圧力の中間にある短い正の圧力パルスを付加することによって達成することができる。あるいは、アッセイ要件に従って、全ての培地を一度に移送することができる。
【0043】
［００４９］チップ１０は、異なる速度で、異なる時点で遠心分離することができる。たとえば、細胞をＣＣ１３の底に沈降させるために、またはその支持体に沈降させるために、または溶解後に別個の異なる構造に分離するために、高い速度を使用してもよく、インキュベーション期間中に低い速度を使用してもよい。ＣＣ１３からの液体有物は、ポートＰ５に負圧を加えることによって、サイホンチャンネル１９を介して廃棄物１５に移送させることができ、またはチャネル１８（ポートＰ４で負圧）を介して上清チャンバ１４に移送される。
【0044】
［００５０］チップ１０は、以下のうちの１つ以上と共にキットの一部として供給されてもよい。ＧＳレザーバ１１のための揮発性液体有物２５、ＣＣ１３のための生物学的試料２６を有する、または潜在的に有する液体、一つ又は複数の試薬、緩衝液、ＳＵＰリザーバ１４のための溶液などの流体供給源；チップ１０と組み合わされた１つ以上のカートリッジ形成要素であって、チップコントローラに、直接遠心ブレードに、関節付きブレードに、または空気圧スリップリングを備えた遠心機に容易に結合されるカートリッジを形成するもの；カートリッジ、チップ、またはチップ支持体に適用するための材料であって、充填ラインの下方のＧＳリザーバ１１、ＣＣ１３のうちの１つ、またはこれらのうちの１つの一部に対して熱制御を提供するように寸法決めされた材料。特に、流体を有するチップ１０は、図１にも図示されるマイクロ流体システムである。このチップ１０は、ポートＰ１－Ｐ７をチップコントローラまたは空気スリップリングの圧力供給ラインに結合するのを容易にするためのカバー蓋、カートリッジ、または他の構造要素を有することができる。
【0045】
［００５１］図２は、図１のチップの変形例の概略図であり、チップの回転の軸が予想される３つの好ましい区域、およびその軸の選択から生じる５つの特定の充填ラインを示す。本明細書において、本発明の異なる変形例および実施形態の特徴に関連する同様の参照番号は、同様の特徴を特定し、それらの説明は、相違に留意しない限り、本明細書では繰り返さない。
【0046】
［００５２］図２の変形例は、ポートＰ７がＰ２の代わりに空気圧バルブ２１を介して移送を制御するために提供されるという点で、Ｄ１のものと示されるように、単に異なる。そのようなＰ２は、（Ｐ６と同様に）チップのベントまたは装填経路であるが、ＳＵＰリザーバ１２からＣＣ１３へ液体を計量または選択的に移送するために必要とされない。典型的には、空気圧バルブは、ＴＰＥまたは他の弾性材料から構成されるチップに埋め込むことができる。ＴＰＥは、熱可塑性プラスチックよりも高いガス透過性を有することができ、特に薄い場合には、その透過性は、典型的には、ＰＤＭＳよりもはるかに低く、典型的には、生成されたときに満足なガスバリアを提供する。マイクロ流体チャンバ（少なくとも１１および１３）の内側または背面上のいずれかで、蒸気バリアでコーティングして、これらのチップを本発明で使用できるようにすることが有用であり得る。図１のチップ１０は、非多孔質または低ガス透過性で構成されてもよいが、バルブ２１を有するパターン化されたフィルム、図２の方が柔らかい。チップを形成し、ボンディングしてデバイスを形成する際のＴＰＥの利点は、出願人の米国特許第９２３８３４６号明細書に説明されており、埋め込み型ＴＰＥバルブの利点は、移送および計量を制御するためのより単純なプロセスをむ。
【0047】
［００５３］Ｐ７は、バルブ２１を作動させるのに適した能動圧源を必要とする。バルブ２１は、常閉バルブ、常開バルブ、または開いた状態、閉じた状態、および半永久的に閉じた状態を有するトライステートバルブであってよい。空気圧バルブは、出願人（米国特許第９４３５４９０号、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１７３１号、米国特許第９２３８３４６号）に教示されているようにすることができる。バルブ２１の圧力マニホールドの分離が幾分概略的に示されており、それはチャネル１６よりもチャネル１７に遙かに近く、従って、チャネル１６はその中にバルブを有さず、このマニホールドの加圧によって実質的に影響されないことに留意されたい。
【0048】
［００５４］図２ではチャネル１７のみがバルブによって制御されるように示されているが、別の変形例ではチャネル１８および１９がバルブで調節される。多数のバルブが使用される場合、レイアウトは、当該技術分野において従前通り、並列空気圧制御層を提供することによって単純化することができる。
【0049】
［００５５］好ましくは、チップ１０の基準軸位置は、チップ１０の頂縁部バンド２２内部または上方に位置され、このバンド２２は、頂縁部から頂縁部に近接したチャンバまで矩形として延びる。典型的には、遠心マイクロ流体チップは、３－２０ｃｍ（最も一般的には４－１８ｃｍ、４－８または１２－１８ｃｍ、または約５、１０または１５ｃｍ）の長さ（Ｌ）を有し、基準軸位置は、頂縁部から１－５ｃｍ以内である。しかしながら、チップが遠心的に装着されたコントローラを有する場合、それは、この軸からチップを変位させる機械類を有してもよく、その結果、チップ１０の頂縁部上の高さ２Ｌ×幅１．３Ｌの第１のボックスａの頂縁部バンドの内部にあってもよい。より好ましくは、軸は、バンド２２または第２のボックスｂの内部にあり、これは、中心に置かれた頂縁部において、高さ１．５Ｌ、幅Ｌである。最も好ましくは、軸は、バンド２２または第３のボックスｃ内にあり、これは、並進の底縁部が元のチップ位置の頂縁部に合致するように、チップ１０の並進によって覆われる。ボックスのスケーリングは、見やすくするために垂直方向に圧縮されていることに留意されたい。
【0050】
［００５６］ボックスａ、ｂ、ｃは、軸が位置される空間の境界を形成するが、チップ１０は、具体的には、軸基準位置への手がかり（ｃｕｅ）を有する。最初の手がかりは、ＧＳリザーバ１０のポートＰ１およびチャネル１６への開口部によって見出される。これらの２点は幾何学的垂直二等分線ｌ１を有し、基準位置の最適場所はｌ１上にある。この最適な場所は、どちらの開口部もブロックしない最大充填容積に対応する。たとえば、延長されたインキュベーション期間が必要であり、ＧＳリザーバ１０内の揮発性液体の連続的補充（例えば、Ｐ６を介して）が回避される場合には、一般に、最大容積が望まれる。他の状況において、ガス送達の効率が主要な関心事であってもよい。用途によっては、２点の中点を通る線で囲まれた各ボックスａ、ｂ、ｃまたはストリップ２２のサブセットが、ｌ１から＋／－４５°、より好ましくは＋／－３０°、＋／－２０°、＋／－１５°、＋／－１２°、および＋／－１０°の角度で優先される。
【0051】
［００５７］基準軸の場所が充填ラインに及ぼす影響は、充填ライン２０ａ－ｆのサンプリングによって示される。ｌ１の屈折は、ボックスのスケーリングの人為結果であり、本明細書に示される各充填ラインは、凹凸面によって引き起こされる補正を有することなく、基準軸からの円の弧によって示されることに留意されたい。充填ライン２０ａは、最適で好ましい基準軸位置における充填ラインを示すが、この充填ラインは、チップの頂縁部の（ラインｌ１が屈折する）中心にある。形式的には、軸までの距離を増加させることによって、非常に高い充填容積を達成することができるが、２０ａは、軸上の好ましい点である。なぜなら、チップが軸に近いほど、遠心力場が高くなり、遠心機のブレード上のモーメントが低くなるからである。充填ライン２０ａは理想的であるが、充填ライン２０ｂ－ｅの各々は、充填ラインより下方に適度に高い容積を与える代替物を示す。各充填ラインの２つの特徴は、充填ラインに関連付けられた基準軸位置の２つのパラメータに対応し、充填ラインの曲率は、充填ラインの軸までの距離を決定し（例えば、２０ｅは、チップを中心とした頂縁部から２Ｌ上方に基準軸位置を有し、一方、２０ｄの基準軸位置は頂縁部にある）、充填ライン上の任意の２点の垂直二等分線は、その軸を通る（したがって、２０ｂの基準軸はチップの右側にあり、２０ｄの基準軸はチップの左側にある）。
【0052】
［００５８］充填ライン２０ｂ－ｅの各々は、図面を明確に見ることができるように、それらの最大充填ラインよりも十分に下方に示されている（全てが最大充填ラインで示されている場合、それらのラインを区別することは困難である）。従って、充填ライン２０ａ、ｃ、ｄ、ｅの各々は、明らかに、ＧＳリザーバ１１の容積の６０％を超える充填容積を有する同心充填ラインを許容する。充填ライン２０ｂは、右側のボックスａの限界に基準軸位置を有する。この軸位置は、ＧＳリザーバ１１のほぼ４０％の充填容積を有する充填ラインを許容することができ、幾つかの用途に対して許容可能であるが、２つの点とチップ１０の頂縁部との間の角度が与えられると、チップ中心から左（ボックスａの左底）への等しいオフセットが充填ライン２０ｆを生成し、これは、あらゆる点で望ましくない。非常に少量の揮発性液体（１０％未満）が得られるので、非常に迅速に補充する必要があり、キャリアガス流と相互作用する比較的小さな自由表面を提供し、その結果、引き込みが制限され、自由表面は、有される液体の容積の変化に伴って劇的に収縮し、自由表面は、生成されたガスを除去するためにキャリアガス流に対して有利に位置決めされない。その結果、このＧＳリザーバ１１の機能的空間最適化は、この基準軸位置に対して不十分である。２０ｆの基準軸位置は、ボックスａの左底角部である。曲線ｃ１は、充填ライン２０ｆの軸位置のような軸位置を大まかに境界画定するボックスａ、ｂ、ｃの上に描かれ、充填ライン２０ｆは、リザーバ１１の容積に対して少なくとも４０％の充填容積を許容しない。
【0053】
［００５９］図３は、出願人の同時係属中の国際公開第２０１５／１８１７２５号に教示されているような、関節式ブレードプラットフォーム上で動作するように設計されたチップを概略的に示し、その従来技術は図３に示されている。図３の変形例は、以下の点で図１とは異なっている。
Ａ）ポートＰ１－Ｐ５は、チップが２５°－３５°傾斜したときに液体有物が放出されないように、それぞれのチャンバを中心とする。Ｂ）ＧＳリザーバ１１は、Ｐ１およびチャネル１６への入口を有する形状を有し、これは、非常に高い正または負の傾斜を必要とし、それを通るガス流のためのいずれかの開口を妨害する。Ｃ）送るチャンバが、その送られるチャンバの軸近位であるという点で、リザーバの構成体は遠心標準的である。Ｄ）チャネルは傾斜角選択的分配のためにサイフォンセグメントを有する。
Ａ）ポートＰ１－Ｐ５は、チップが２５°－３５°傾斜したときに液体有物が放出されないように、それぞれのチャンバを中心とする。Ｂ）ＧＳリザーバ１１は、Ｐ１およびチャネル１６への入口を有する形状を有し、これは、非常に高い正または負の傾斜を必要とし、それを通るガス流のためのいずれかの開口を妨害する。Ｃ）送るチャンバが、その送られるチャンバの軸近位であるという点で、リザーバの構成体は遠心標準的である。Ｄ）チャネルは傾斜角選択的分配のためにサイフォンセグメントを有する。
【0054】
［００６０］Ｂ）に関しては、ＧＳリザーバ１１からの液体がＰ１またはチャネル１６への開口部を塞がないことを確実にするために、ＧＳリザーバ１１の形状は、これら２つの開口部に対して狭い頂端部を有し、液体に対してより大きな膨らみ（ｂｅｌｌｙ）を有する。この構成体は、２つの開口部が互いに接近することを可能にし、それは、開口部の１つが所与の容積の液体によってブロックされる角度変動を独立に低減する。液体プラグの移動距離および（最初は遠心に逆らう）方向はより小さく、Ｐ１はチャネル１６よりも加圧キャリアガス供給源に近いので、Ｐ１への開口部の閉塞の結果はチャネル１６の閉塞の結果よりも小さい。なお、Ｐ１の開口部を塞ぐことは避けることが好ましい。
【0055】
［００６１］２つの開口部を互いに接近させることは、これらの開口部の間に多くのガスを引き込まない短い経路を招く構成体のように見えるかもしれないが、実際には、チャンバ内のガスの循環は、より多数の循環経路をもたらす他の設計とは対照的に、良好な引込みを生じさせることが期待される単純な対流パターンを有する設計によって促進される。
【0056】
［００６２］Ｃ）に関して、チャネル１７， １８， １９の軸近位セグメントは、傾斜角選択的分配に必要とされるそれぞれの設計された量だけ、それらのそれぞれの接続されたチャンバ（１２－１５）の軸近位縁部よりも軸に近い。ＧＳリザーバ１１およびＣＣ１３に示された充填ライン２０から推測される軸は、例示のためにチップ１０の頂縁部に平行であると仮定される（ただし、チップは、様々な軸位置で使用可能である）。（チップ１０の右上隅に示されるが、典型的にはチップから外れており、概して基準軸位置（ストリップ２２、または図２のボックスａ、ｂ、ｃ）に対して境界が画定されたのと同じ領域内にある）軸２５を中心にチップを傾斜させるが、好ましくは、示されるように基準軸位置から離れているか、または基準軸位置に対して直交している。チャネルの軸近位セグメント、ならびにチャンバの形状、位置および充填容積を上昇または低下させることによって、流体移送が起こる傾斜角度を、関節機構に対する制御に適合するように、および丈夫で信頼性のあるプロトコルを提供するように、変化させることができる。チャネルの軸近位セグメントを選択することによって、角度範囲間の角度間隔を提供して、２つ以上のチャンバ間の重複および同時移送を回避することができる。とは言うものの、例えばＣＣ１３の過剰充填を避けるために、同時移送が望ましい場合がある。傾斜は、回転軸が傾斜軸２５と平行である（かつ空間的に離れている）場合、チップ１０の回転速度を変化させることによって提供されてもよい。
【0057】
［００６３］図３に示されるように、チップ１０は、傾斜軸２５から矢印で示されるように、充填ライン２０に垂直に向けられた遠心力を伴って、基準傾斜配向にある。チャネル１９をプライミングするのに必要な時間の間、約－３０°－３５°（角度範囲２５ａ）の傾斜角度は、ＣＣ１３の有物物の上清レザーバ１４への移送を生じさせるのに有効である。チップが移送のための傾斜角にあるとき、容積の約２／３がＣＣ１３の開口部またはそれより上方にリザーバ１４に存在し、この画分は完全に分配される。同様に、基準配向から約２０－２５°の傾斜角範囲２５ｂは、ＣＣ１３の残りの全ての液体有物の廃棄１５への移送をもたらす。従って、チャネル１８，１９は、低い流体力学的抵抗、非毛管、フローチャネルである。
【0058】
［００６４］Ｄ）に従って、チャネル１７は、図１の変形例に関して、２つの部分を有するように修正される：サイフォン構造１７ａと大径セグメント１７ｂとを有する。ＳＵＰチャネル１７内に流体力学的直径の大きな段部を設けることによって、流れを離散化することが可能であり、ＳＵＰリザーバ１２からＣＣ１３への部分的な移送を容易にすることが可能である。サイフォンセグメント１７ａをプライミングするのに十分な期間、（リザーバ１２の瞬間充填容積に依存する）最小角度５－１５°だけ傾けることによって、液体が分配される。サイフォン構造１７ａを通る流量を制限することによって、流れを緩やかにすることができる。範囲２５ｃの最小角度よりも小さい傾斜角度を戻すことによって、移送は停止する。所望の間隔で傾斜を繰り返すことによって、所望のプロトコルに従って、追加のバッファ、試薬または他の供給源をＣＣ１３に供給することができる。関連する角度範囲でＣＣ１３に過充填ポートを配置することにより、Ｐ３を妨害するリスクを有することなく、またはＯＵＴリザーバ１４への移送中に漏れを生じるリスクを有することなく、ＣＣ１３の過充填を防止することができる。また、この変形チャネル１７は、図１の実施形態において、図２に示されるバルブ２１の代わりに、空気圧ポートＰ２に対するより高い巧妙な処理（ｆｉｎｅｓｓｅ）制御の代わりに空気圧制御と共に使用することができることに留意されたい。
【0059】
［００６５］従って、使用時には、（例えば、細胞培養培地）をＰ２を介してＳＵＰリザーバ１２、ＣＣ１３内の生物学的試料、およびＧＳリザーバ１１内の揮発性液体に装填することにより、チップを基準角度で遠心分離し、次いで、遠心分離中に正または負の角度で傾斜させることができる。傾斜角度が角度範囲２５ｃを超えて上昇し、チャネルセグメント１７ａをプライミングするのに十分な長さに維持されるたびに、主に角度が維持される持続時間に依存する容積が分配される。傾斜角度が範囲２５ａ未満に低下するたびに、最小レベルを超える容積が上清としてＯＵＴリザーバ１４に分配される遠心分離は、典型的には、生物学的試料を最小レベル未満の容積まで沈降させる。最後に、ＣＣ１３からの全ての液体は、カートリッジを範囲２５ｂにおいて、またはそれを超えて傾斜させることによって、サイホンチャネル１８を介して廃棄物１５に移送することができる。
【0060】
［００６６］好ましくは、オフチップである任意の熱制御要素は、インキュベーションまたは他の熱的に制御されたプロセスが流体移送ステップのために停止する必要がないように、チップ傾斜を通してそれぞれの加熱量と合わされたままである。そのようなものとして、熱制御のための任意のオフチップ金属または同様の材料を、チップと共に傾斜するチップホルダまたはカートリッジ上に提供することができる。
【0061】
［００６７］図４は、遠心プラットフォーム、たとえば、Ｐ１のみに圧力を供給する空気圧スリップリングを用いて作動するように設計された変形例のチップ１０の概略図である。全てのポートＰ２－５は、単に装填ポートおよびベントとして使用される。図４のチップ１０は、図１のチップ１０と以下の点で異なる。第２のＯＵＴリザーバ１４は設けられず、ＳＵＰリザーバ１２の代わりに、受動的な流体計量および増分流体移送システムが使用される。受動的な計量システムは、出願人の特許開示ＷＯ２０１３／００３９３５に教示されており、流体力学的抵抗チャネル１７ａ’を介して計量チャンバ１２ｂに結合された大容積リザーバ１２ａを備える。チャネル１７ａ’は、遠心分離速度の実質的な変化によってもほとんど変化しない遅い移送を提供し、供給される流体の特定の粘度、接触角、および密度に対して設計される。この流体は、一定の速度で計量チャンバ１２ｂ内に蓄積される。チャンバ１２ｂが閾値レベルまで充填されると、サイフォンチャネル１７ｂ’がプライミングされ、チャンバ１２ｂ内の流体が一度にＣＣ１３内に放出される。チャネル１７ｂ’は、無視できる流体抵抗を有してもよく、放出は非常に速いプロセスであるか、または代替的に、液体がゆっくりとＣＣ１３に導入されるように、ＣＣ１３への開口部付近に流体狭窄部を有してもよい。これは、たとえば、チャンバ１２ｂがＣＣ１３と共に加熱されない場合、急激な化学的変化または温度変化を回避するのに好ましい場合がある。狭窄部が１７ｂ’及びＣＣ１３の開口部に設けられる場合、狭窄部は、チャネル１７ａ’よりも実質的に短い送達遅延を有さなければならず、さもなければ、チャンバ１２ｂは機能を提供しない。大容積リザーバ１２ａから直接ＣＣ１３に連続的な点滴供給を提供することができる。
【0062】
［００６８］図５は、複数の細胞支持構造体２８が提供される、図１－図４の実施形態のＣＣ１３の概略図である。細胞支持構造体２８は、好ましくは、同じチップ１０内に形成された微細加工されたピラーであり、当技術分野で周知の方法で細胞付着を促進するために、多孔性であってもよく、機能化されてもよく、またはコーティングされてもよい。
【0063】
［００６９］図６は、ＣＣ１３の変形例であり、ここで、ＧＳチャネル１６がＣＣ１３の底部からＣＣ１３と合流し、ＧＳリザーバ１１からのキャリアガスおよび引込みガスをバブリング方式でＣＣ１３に供給する。ＣＣ１３は、気泡を収集し、バブリングによって生じた渦から細胞支持構造２８を遮蔽するため、または気泡をＣＣ１３を横切ってより均一に分配するために、ガストラップ２９を有してもよい。キャリアガスの送達速度が十分に低い場合、ガストラップ２９内に収集されたガスは、トラップがオーバーフローする前に溶解して、液体有物２６への高効率ガス送達を提供することができる。
【実施例】
【0064】
［００７０］出願人は、細胞培養デバイスに必要な全ての機能性を有する「生体適合性」ポリマーチップを設計し、試験した。チップは機能化またはコーティングを有することなく生体適合性を達成する。ガス交換はＧＳリザーバによって提供され、細胞培養条件チャンバは、制御された加湿雰囲気（制御されたガス微小環境）を提供された。これは、デバイス製造のための熱可塑性ポリマーの使用を実証するもので、通常はガス不透過性であり、ガス交換条件を作り出す一方で、ＰＤＭＳおよびＴＰＥへの依存を回避する。本発明は、チップの設計および使用によって実証される。この実証は、出願人のＷＯ２０１５／１３２７４３の能力を利用して、液体およびガスを培養チャンバに導入し、細胞を妨害することなくそれらを灌流／混合する。チップをインキュベータに入れることなく、マイクロ流体チップ上での長期細胞培養を可能にする、信頼性のあるマイクロスケールインキュベーションチャンバが効果的に生成される。８ポートマイクロ流体チップコントローラを用いて、チップ上での細胞培養を実証した。このようなコントローラは、他の細胞インキュベーションプラットフォームでは現在利用できない他のユニークな機能のホストを提供するように適合させることができ、遠心力と空気圧を併用して培養中に細胞にかかるせん断応力を正確に制御することがまれる。最後に、血液および他の臨床的に関連する試料からの細胞単離などの試料調製をむ、完全なアッセイ統合のための更なるチャンバおよびチャネルを用いて培養チップを容易に開発することができる。
【0065】
［００７１］提案したプラットフォームの応用は、細胞から解放されたインターフェロンγ（ＩＦＮγ）が潜在結核感染（ＬＴＢＩ）のような感染症診断応用の文脈の中で特性化できるように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の自動培養とコンディショニング（活性化／刺激）に対して実証されている。この目的のために、本発明者らは、以下の能力を有する遠心マイクロ流体チップコントローラによって操作されるマイクロ流体チップを設計し、作製し、試験した：（１）２つの別個のチャンバでＰＢＭＣを単離培養する。（３）ＰＢＭＣを刺激し、マイトジェンとともに６時間インキュベートする。（３）その後のアッセイへの接続のために、馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を分離する。
【0066】
［００７２］図７に示されるマイクロ流体カートリッジは、５つの要素のパネルである。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃは、それぞれ、作製および試験されたチップの２つの層のレイアウトである。複合レイアウト図（７Ａ）に示すように、チップの頂面（７Ｂ）と底面（７Ｃ）の両方がパターン化され、パターンはスルーホール（ビア）によって相互接続された。チップを操作して２つの細胞培養チャンバ（ＣＣ）に持続灌流の二酸化炭素を供給し、ＣＯ２／加湿チャンバ（ＧＳリザーバ）からの６時間の培養および刺激中の（水和による）蒸発を防いだ。ペルチェ加熱素子は、チップ支持体上に集積され、細胞培養およびＣＯ２加湿器チャンバの温度を３７℃に維持するために使用された。遠心分離機を通して、チップコントローラから５％ＣＯ２キャリアガス流をチップに供給した。ＣＯ２供給ラインをチップコントローラの空気圧ポンプに接続し、ＣＯ２を加熱加湿器チャンバ（水を有するＧＳリザーバ）に連続的にポンプで送り、チップ内の適切な培養チャンバへの灌流を可能にした。また、カートリッジは、それぞれのＣＣに結合された別々の培養培地チャンバ（ＳＵＰリザーバ）、ならびに上清および廃棄チャンバを備える。
【0067】
［００７３］マイクロ流体カートリッジをＣＮＣ微細加工を用いてＣＯＣ熱可塑性ポリマ中に作製した。特定の用途の容積要件に依存して、チップは、熱エンボス加工または射出成形を用いて生体適合性熱可塑性ポリマから作製される可能性が高く、細胞トラップなどの培養チャンバ内の更なる構造のエッチングを可能にすることに出願人は留意する。チャンバおよびチャネルをチップの両面にエッチングし、（接着剤または溶媒接合を考慮したが）平坦なＣＯＣ基板を用いて熱ボンディングによって密封してカートリッジを形成した。
【0068】
［００７４］写真７Ｂは、２つの細胞培養ＣＣを示すが、各ＣＣは、ポートとＣＣの間に蛇行経路を有するそれぞれのポートを有し、各ＣＣは、ＣＣおよびそれらのポートの上に位置された共通の加湿チャンバ（ＧＳリザーバ）への（狭窄またはバルブを有さない）チャネルを有する。これらのチャネルの各々は、ＣＣまたはＧＳリザーバのいずれよりもチップの基準軸位置の近くを通過する。加湿器チャンバは、単一のポートを有し、これは、チャンバに水を装填するために、次いでキャリアガス供給ポートとして使用される。写真７Ｃは、それぞれのＣＣに対するそれぞれの上清（ＯＵＴリザーバ）および培地培養（ＳＵＰリザーバ）を示す。
【0069】
［００７５］カートリッジをチップコントローラに装着し、以下のように操作した。まず、細胞培養ＣＣをそれぞれの培地に懸濁したＰＢＭＣで満たし、１つの培養培地チャンバ（ＳＵＰリザーバ）を分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）を添加した培地（ＰＨＡ、５０ｍＭ）で満たし、もう１つを細胞培養培地のみで満たす。加湿器チャンバ（ＧＳリザーバ）に水を満たし、カートリッジを細胞培養および刺激のためにチップコントローラ上に置いた。最初にプラットフォームを高回転速度（５００－７００ＲＰＭ）で遠心分離し、全ての細胞をＣＣの底に沈降させることによって試料から細胞を単離した。最初の遠心分離に続いて、上清を廃棄物に除去し、培地を制御用の新鮮な培地および刺激用のマイトジェンをむ培地と交換する。刺激全体を通して、（～３００ＲＰＭ）速度での遠心分離および３７℃での加熱を、連続的な５％ＣＯ２灌流下で行う。これを６時間続けた。刺激後、細胞を再び高頻度で遠心分離し、刺激された細胞解放および制御を有する上清を、その後の分析のために、それらのそれぞれの上清チャンバに圧力を加えることによって移動させる。
【0070】
［００７６］上清をＥＬＩＳＡキットを用いて分析し、解放されたＩＦＮγの濃度を測定し、その結果を標準プレート培養を用いて得た結果と比較した。細胞培地のみを用いた６時間培養は、マイクロ流体カートリッジについて４５ｐｇ／ｍｌの平均ＩＦＮγ濃度を生じ、これは、標準プレートを用いて得た６７ｐｇ／ｍｌより僅かに低い。この差は、６時間の実験中に一定回転により細胞機能が抑制されたためと考えられた。それにもかかわらず、得られた結果は、抽出された上清中のＩＦＮγを測定するための分析センサの潜在的な下流統合を可能にする自動化細胞培養および刺激アッセイの成功した実施を示す。細胞は、脱水やＣＯ２潅流の欠如に影響されなかった。
【0071】
［００７７］構造に固有の他の利点は、当業者には明らかである。実施形態は、本明細書に例示的に記載されており、特許請求される本発明の範囲を限定することを意味するものではない。前述の実施形態の変形例は、当業者には明らかであり、本発明者は、以下の請求項に包されることを意図している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遠心マイクロ流体チップであって、各々が０．１μＬ～１ｍＬの容積、および基準軸位置に関して規定された公称充填ラインを有する複数のマイクロ流体チャンバと、
各チャンバを相互接続する複数のマイクロ流体チャネルと、
各ポートが一つ又は複数のチャンバと流体連通する複数のポートと、
を備え、
前記チャンバの１つは、チャンバ１、２、３、および少なくとも１つのポートにチャネルを介して接続された調節済みチャンバであり、
チャンバ１は、その充填ラインまたはそれより上のポートからの第１の開口部と、第１のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第１のチャネルは、その充填ラインより下の前記チャンバ１を前記調節済みチャンバに接続し、
チャンバ２は、その充填ラインまたはそれより上のポートからの第１の開口部と、その充填ラインまたはそれより上の第２のチャネルへの第２の開口部と、充填ラインの下のいずれの相互接続チャネルまたはポートへの開口部も有さず、前記第２のチャネルは、チャンバ２のいずれの部分よりも基準軸に近接して延びる経路セグメントを含み、その充填ラインより上の調節済みチャンバとその充填ラインより上の前記チャンバ２とを接続し、前記第２のチャネルは、バルブを有さず、毛細管流は収縮を測定せず、
チャンバ３は、その充填ラインの上方に、ポートへの第１の開口部と、第３のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第３のチャネルは、前記チャンバ３を、前記調節済みチャンバの充填ラインの下方の前記調節済みチャンバに接続する、チップ。
【請求項2】
遠心マイクロ流体チップであって、各々が０．１μＬ～１ｍＬの体積を有する複数のマイクロ流体チャンバと、
各チャンバを相互接続する複数のマイクロ流体チャネルと、
各ポートが一つ又は複数のチャンバと流体連通する複数のポートと、
を備え、
前記チャンバの１つは調節済みチャンバであり、前記調節済みチャンバは、チャンネルを介してチャンバ１およびチャンバ２に接続され、少なくとも１つのポートに直接接続されており、
チャンバ１は、チャンバ１の充填ラインの上方のポートからの第１の開口部と、第１のチャネルへの第２の開口部とを有し、前記第１のチャネルは、前記チャンバ１を、その充填ラインよりもチャンバ１の軸遠位点に近接して、前記調節済みチャンバの充填ラインの上方の前記調節済みチャンバに接続し、
チャンバ２は、前記チャンバ２のための充填ラインを画定する余水吐開口部、充填ラインの上方のポートからの第１の開口部、充填ラインの上方の第２のチャネルへの第２の開口部、および充填レベルより下の任意のチャネルへの開口部も有さず、
前記第２のチャネルは、経路セグメントを含み、前記経路セグメントは、前記調節済みチャンバまたはチャンバ２のいずれかよりも前記チップの基準軸位置に近接して延び、かつ前記調節済みチャンバに接続する、チップ。
【請求項3】
前記チップの前記基準軸位置は、前記チャンバの上方の区域内部にあり、前記チップの頂縁部から３／２Ｌ未満であり、前記チップの中心線から０．５Ｌ未満である（Ｌはチップの長さ）、または、
前記チャンバの上方の区域内部にあり、前記チップの頂縁部からＬ未満であり、前記チップの中心線から０．５Ｗ未満である（Ｌはチップの長さ、Ｗはチップの幅）、または、
前記チャンバ２の２つの開口部の中点を通る２本の線の間にあり、前記２本の線は、前記２つの開口部の垂直二等分線によって二等分され、それぞれ、前記垂直二等分線に対して３０°および－３０°の角度をなす、または、
Ｐ１および前記第２のチャネルへの開口部から分離され、これらの分離は、２の係数以下であり、前記チャンバ２の前記充填ラインは、前記充填ラインより下のチャンバ２の容積の少なくとも３３％の容積を含む、
請求項１又は２に記載のチップ。
【請求項4】
前記チャンバ２内の前記充填ラインの表面積は、チャンバ１の表面積よりも少なくとも２倍、より好ましくは４倍、より好ましくは１０倍大きい、または、
前記調節済みチャンバおよびチャンバ２のうちの少なくとも１つは、前記チップの他のどのチャンバまたはチャネルよりも大きいエッチング深さを有する、または、
前記チャンバ２の形状は、その液体含有物の自由表面積の変化が１０％未満となり、前記充填ラインからの前記液体含有物の容積が１０％減少する、
請求項１～３のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項5】
前記調節済みチャンバは、異なる遠心分留物を抽出するために前記充填ラインを越えて異なる軸方向距離にある出口チャネルへの複数の開口部を備え、微生物または細胞の支持体、または、前記第２のチャネルおよび基準軸位置への前記開口部と同一線上にあるガストラップであって、ガスが液体中に拡散する間にガス気泡を保持するために、前記基準軸位置と前記開口部との間に置かれる、ガストラップを備える、
請求項１～４のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項6】
熱吸収および分配材料が、前記調節済みチャンバおよび前記チャンバ２のうちの１つに隣接して提供され、２つの別々にアドレス指定可能な帯域の材料が、前記調節済みチャンバおよびチャンバ２を独立して加熱するために提供される、請求項１～５のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項7】
前記チップは被覆され、遠心機の加圧キャリアガス供給源に結合された前記チップの少なくとも１つの空気でアドレス可能なポートと共に前記遠心機に装着するように適合されたマイクロ流体カートリッジを形成する、請求項１～６のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項8】
前記第２のチャネル以外の３つ以上のチャネルは、それぞれの軸近位セグメントを有し、前記調節済みチャンバを、前記チップの前記面に垂直な傾斜軸を中心とする前記チップの傾斜角度が、前記調節済みチャンバとこれらのチャンバのうちの１つとの間の流体移動を可能にするように選択された形状、位置、および充填ラインを有するそれぞれのチャンバに接続し、オプションとして、４５°未満の傾斜角度の範囲は、前記調節済みチャンバと前記３つのそれぞれのチャンバとの間を連続的に移動するのに十分である、請求項１～７のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項9】
前記第１のチャネルは、流体力学的収縮および計量チャンバを備える、請求項１～８のいずれか一項に記載のチップ。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載のチップを備えたキットであって、前記チップ上に搭載するための液体と、
遠心マイクロ流体チップコントローラのうちの１つに結合するように適合されたチップ形態カートリッジと組み合わされた一つ又は複数のカートリッジ形成要素と、
空気圧スリップリングを備えた遠心ブレード、または、空気圧スリップリングを備えた関節式遠心ブレードと、
カートリッジ、前記チップ、またはチップ支持体に適用するための材料であって、前記調節済みチャンバを熱制御するための組成および寸法を有する材料と、
チャンバ２と、
または、それらの充填ラインの下にあるこれらのうちの一つの一部と、
を伴う、キット。
【請求項11】
前記キットは、組み立てられ、前記遠心マイクロ流体チップコントローラ、空気圧スリップリング付き遠心ブレード、または、空気圧スリップリングを備えた関節式遠心ブレードに装着される、請求項１０に記載のキット。
【請求項12】
前記チャンバの１つにその充填ラインまで液体が含まれており、前記チャンバの１つに含有される前記液体は、チャンバ２の揮発性液体含有物、前記調節済みチャンバ内に生物学的サンプルを含有する液体、またはチャンバ１内の一つ又は複数の試薬、緩衝液、または溶液である、請求項１～９のいずれか一項に記載のチップを備えた遠心マイクロ流体システム。
【国際調査報告】