(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-02
(54)【発明の名称】ＳＩＲＴ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20220826BHJP
C12P 7/56 20060101ALI20220826BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220826BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220826BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20220826BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220826BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C ZNA
C12P7/56
C12N5/10
C12P21/08
C12N15/55
C12N15/09 100
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576892
(86)(22)【出願日】2020-06-24
(85)【翻訳文提出日】2022-02-15
(86)【国際出願番号】 EP2020067579
(87)【国際公開番号】W WO2020260327
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】19182558.7
(32)【優先日】2019-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】アオスレンダー ジーモン
(72)【発明者】
【氏名】オスヴァルト ベネディクト
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD33
4B064AG26
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
(57)【要約】
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、当該組換え細胞において内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の発現が低減している、方法が報告される。例えばＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞におけるサーチュイン－１遺伝子（ＳＩＲＴ－１）のノックアウトが、組換え生産性を改善し、細胞による乳酸生産量を低減させることが見出されている。さらに、フェドバッチ発酵の終了時の生存率の低下が低減することが見出されている。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
同一の遺伝子型を有するが内因性のＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された哺乳動物細胞と比較して、ＳＩＲＴ－１発現を低減させることによって、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む組換え哺乳動物細胞の異種ポリペプチド力価を増加させ、かつ／または乳酸生産量を低減させるための方法。
【請求項2】
異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ａ）該異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
ｂ）該細胞または培養培地から該異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
ここで、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の発現が低減している、方法。
【請求項3】
改善された組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を持つ組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法が、ａ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性を低減させるために、哺乳動物細胞中の内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸を適用する工程、ならびに
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性が低減した哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、同一の遺伝子型を有するが内因性のＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された哺乳動物細胞と比較して、増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を持つ組換え哺乳動物細胞を生産する、方法。
【請求項4】
ＳＩＲＴ－１遺伝子ノックアウトが、ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＳＩＲＴ－１改変細胞の生産性が、ＳＩＲＴ－１コンピテント親哺乳動物細胞と比較して少なくとも１０％増加する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＳＩＲＴ－１遺伝子発現の低減が、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＳＩＲＴ－１遺伝子発現の低減が、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＲＮＡサイレンシングが、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
異種ポリペプチドが抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ＳＩＲＴ－１ノックアウトが、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入前、または異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入後に行われる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
哺乳動物細胞が標的指向性組込み宿主細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療用抗体などの治療用ポリペプチドの組換え生産のための細胞株開発の分野にある。より詳細には、本明細書では、ＳＩＲＴ－１遺伝子の機能的ノックアウトを有する哺乳動物細胞が報告されており、これは発現特性の改善をもたらす。
【背景技術】
【0002】
背景
哺乳類の宿主細胞株、特にＣＨＯおよびＨＥＫ細胞株は、供給タンパク質（例えば、抗原、受容体など）および治療用分子（例えば、抗体、サイトカインなど）などの分泌タンパク質の組換え生産のために使用される。これらの宿主細胞株は、対応する治療用分子をコードする発現カセットを含むベクターでトランスフェクトされる。続いて、選択圧を加えることにより、安定したトランスフェクタントが選択される。これにより、個々のクローンからなる細胞プールができる。単一の細胞クローニングの工程において、これらのクローンが単離され、続いて様々なアッセイでスクリーニングされ、トッププロデューサー細胞が特定される。
哺乳類の宿主細胞株、特にＣＨＯおよびＨＥＫ細胞株は、供給タンパク質（例えば、抗原、受容体など）および治療用分子（例えば、抗体、サイトカインなど）などの分泌タンパク質の組換え生産のために使用される。これらの宿主細胞株は、対応する治療用分子をコードする発現カセットを含むベクターでトランスフェクトされる。続いて、選択圧を加えることにより、安定したトランスフェクタントが選択される。これにより、個々のクローンからなる細胞プールができる。単一の細胞クローニングの工程において、これらのクローンが単離され、続いて様々なアッセイでスクリーニングされ、トッププロデューサー細胞が特定される。
【0003】
遺伝子工学的アプローチが、それらの特性、例えば、（ｉ）タンパク質の折り畳みと分泌を改善するための折り畳まれていないタンパク質応答経路に関与する内因性タンパク質の過剰発現（Ｇｕｌｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（２０１４）２６（非特許文献１））、（ｉｉ）細胞生存率を改善し、発酵プロセスを延長するための抗アポトーシスタンパク質の過剰発現（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（２０１３）２１９５－２２０７（非特許文献２））、（ｉｉｉ）細胞増殖と生産性を改善するためのｍｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ分子の過剰発現（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３（非特許文献３））、（ｉｖ）治療用分子（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（２００６）８５１－８６１（非特許文献４））および他の多く（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６（非特許文献５））のグリコシル化パターンを調節するための糖酵素の過剰発現など、を改善するために宿主細胞株に適用されてきた。
【0004】
さらに、内因性タンパク質のノックアウトは、細胞の特性を改善することが示されている。例としては、（ｉ）アポトーシス耐性の増加につながるＢＡＸ／ＢＡＫタンパク質のノックアウト（Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（２０１０）３３０－３４０（非特許文献６））、（ｉｉ）非フコシル化タンパク質を生成するためのＰＵＴＳのノックアウト（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４－６２２（非特許文献７））、（ｉｉｉ）ＧＳ選択システム（Ｆａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）１００７－１０１５（非特許文献８））および他の多く（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６（非特許文献５））を使用して選択効率を高めるためのＧＳのノックアウトがある。ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質が過去に主に使用されてきたが、最近ではノックアウトを目的としたゲノム配列の多用途かつシンプルなターゲティングのために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が確立されている。例えば、ｍｉＲＮＡ－７４４は、配列切除を可能にする複数のｇＲＮＡを使用することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＨＯ細胞において標的とされた（Ｒａａｂ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１９）１８００４７７（非特許文献９））。
【0005】
ＣＮ１０９１６１５４５（特許文献１）は、ニワトリのＳＩＲＴ－１の発現を阻害するためのマイクロＲＮＡを開示し、また、組換え過剰発現プラスミドとマイクロＲＮＡの特異的適用、および過剰発現ｍｉＲＮＡを利用して安定した低発現ＳＩＲＴ－１を構築するためのＬＭＨ細胞株を開示している。
【0006】
米国特許出願公開第２００７／１６０５８６号（特許文献２）は、細胞の複製寿命を延長するための方法を開示している。
【0007】
米国特許出願公開第２０１１／０１５２７２号（特許文献３）は、サーチュイン１および神経変性疾患の処置を開示している。
【0008】
Ｙｏｕｎｇｈｗａｎ，Ｈ．らは、ＳＩＲＴ－１ノックアウトマウスの休止Ｂ細胞におけるＨｓｐａ１ａおよびＨｓｐａ１ｂ遺伝子の増加を開示している（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．４６（２０１９）４２２５－４２３４（非特許文献１０））。
【0009】
欧州特許第３３０８７７８号（特許文献４）は、アルギニンとそのｔ細胞モジュレーターとしての使用を開示している。
【0010】
Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．らは、ＣＨＯ細胞におけるマイクロＲＮＡ－３０ファミリーによるタンパク質産生の亢進が、ユビキチン経路の調節によって媒介されることを開示している（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３（非特許文献３））。
【0011】
現在、生産性を高める単一の内因性遺伝子のノックアウトは知られていない。したがって、内因性遺伝子の単一のノックアウトは、宿主細胞株への導入が容易であることから、非常に望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】ＣＮ１０９１６１５４５
【特許文献2】米国特許出願公開第２００７／１６０５８６号
【特許文献3】米国特許出願公開第２０１１／０１５２７２号
【特許文献4】欧州特許第３３０８７７８号
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Ｇｕｌｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（２０１４）２６
【非特許文献2】Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（２０１３）２１９５－２２０７
【非特許文献3】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３
【非特許文献4】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（２００６）８５１－８６１
【非特許文献5】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６
【非特許文献6】Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（２０１０）３３０－３４０
【非特許文献7】Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４－６２２
【非特許文献8】Ｆａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）１００７－１０１５
【非特許文献9】Ｒａａｂ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１９）１８００４７７
【非特許文献10】Ｙｏｕｎｇｈｗａｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．４６（２０１９）４２２５－４２３４
【発明の概要】
【0014】
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または機能または発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている、方法が報告される。
【0015】
本発明は、少なくとも部分的には、例えばＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞におけるサーチュイン－１（ＳＩＲＴ－１）遺伝子のノックアウトが、一方では組換え生産性、例えば標準的なＩｇＧ型抗体および特に複合体抗体フォーマットの組換え生産性を改善し、他方では培養中の細胞による乳酸生産量を低減させるという知見に基づく。さらに、本発明によれば、フェドバッチ培養の終了時の生存率の低下は、組換え細胞について低減する、すなわち、完全に機能的なＳＩＲＴ－１遺伝子を有する細胞と比較して、一定の閾値を超える生存率を有する期間が増加することが見出されている。
【0016】
本発明の１つの独立した態様は、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。
【0017】
本発明の１つの独立した態様は、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の発現が低減した哺乳動物細胞であって、前記哺乳動物細胞が、同一の遺伝子型を有するが内因性のＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された細胞と比較して、異種ポリペプチドの生産性の増加および／または培養中の乳酸生産量の低減、および／または培養中の高い生存率レベルの延長、および／または培養時間の延長のうちの少なくとも１つを有する哺乳動物細胞である。
【0018】
本発明の１つの独立した態様は、同一の遺伝子型を有するが内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された細胞と比較して、前記異種ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む（内因性）ＳＩＲＴ－１発現が低減した組換え哺乳動物細胞の、異種ポリペプチド力価を増加させること、および／または乳酸生産量を低減させること、および／または培養中の高い生存率レベルの延長、および／または培養時間の延長のうちの少なくとも１つのための方法である。
【0019】
本発明の１つの独立した態様は、改善された組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を持つ組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）哺乳動物細胞中の内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸を適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性を低減させる工程、および
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性が低減した哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、同一の遺伝子型を有するが内因性のＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された細胞と比較して、増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を持つ組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）哺乳動物細胞中の内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸を適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性を低減させる工程、および
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性が低減した哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、同一の遺伝子型を有するが内因性のＳＩＲＴ－１遺伝子発現を有する同じ条件下で培養された細胞と比較して、増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を持つ組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0020】
本発明の１つの独立した態様は、
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含む、異種ポリペプチドを生産するための方法であって、
ここで、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている、方法である。
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含む、異種ポリペプチドを生産するための方法であって、
ここで、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている、方法である。
【0021】
本発明の別の独立した態様は、改善されかつ／または増加した組換え生産性、および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とする核酸または酵素またはヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現を低減させるかまたは排除するかまたは減少させるかまたは（完全に）ノックアウトする工程、ならびに
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善されかつ／または増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とする核酸または酵素またはヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現を低減させるかまたは排除するかまたは減少させるかまたは（完全に）ノックアウトする工程、ならびに
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性または／および機能または／および発現が低減しているかまたは排除されているかまたは減少しているかまたは（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善されかつ／または増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0022】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１遺伝子ノックアウトは、ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトである。
【0023】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１ノックアウト細胞株の生産性は、ＳＩＲＴ－１発現（親）哺乳動物細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上増加する。
【0024】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、低減または排除または減少またはノックアウトは、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される。一実施形態では、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【0025】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１遺伝子発現の低減は、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウンからなる群から選択される。
【0026】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入前、または異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入後に行われる。
【0027】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドは抗体である。一実施形態では、抗体は、２つ以上の異なる結合部位および任意選択でドメイン交換を含む抗体である。一実施形態では、抗体は、３つ以上の結合部位またはＶＨ／ＶＬペアまたはＦａｂ断片、および任意選択でドメイン交換を含む。一実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。一実施形態では、多重特異性抗体は、
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
ここで、第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み；または
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含み；
かつ
第２のＦａｂ断片は、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む
完全長抗体；
ｉｉ）ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２つのペアを含む１つの完全長抗体であって、ここで、完全長重鎖および完全長軽鎖のペアのそれぞれによって形成される結合部位は、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；および
－ １つの追加のＦａｂ断片であって、ここで、追加のＦａｂ断片は、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断片
を含み；
ここで、第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片は、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である
完全長抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む一アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメインおよび軽鎖カッパまたはラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、一アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位、および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、二アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、二アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体；
ならびに
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに結合した非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート
からなる群から選択される。
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
ここで、第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み；または
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含み；
かつ
第２のＦａｂ断片は、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む
完全長抗体；
ｉｉ）ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２つのペアを含む１つの完全長抗体であって、ここで、完全長重鎖および完全長軽鎖のペアのそれぞれによって形成される結合部位は、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；および
－ １つの追加のＦａｂ断片であって、ここで、追加のＦａｂ断片は、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断片
を含み；
ここで、第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片は、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である
完全長抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む一アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメインおよび軽鎖カッパまたはラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、一アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位、および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、二アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、二アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体；
ならびに
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに結合した非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート
からなる群から選択される。
【0028】
図示および特許請求された様々な実施形態に加えて、本開示の主題はまた、本明細書に開示され、特許請求された特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含むように、開示される主題の範囲内で他の様式で互いに組み合わせることができる。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示および説明目的のために提示されている。網羅的であること、または本開示の主題を開示されたそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明の実施形態の詳細な説明
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、組換え細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法が報告される。
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、組換え細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法が報告される。
【0030】
本発明は、少なくとも部分的には、例えばＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞におけるサーチュイン－１（ＳＩＲＴ－１）遺伝子のノックアウトが、組換え生産性、例えば標準的なＩｇＧ型抗体および特に複合体抗体フォーマットの組換え生産性を改善し、細胞による乳酸生産量を低減させるという知見に基づく。さらに、フェドバッチ培養の終了時の生存率の低下が低減することが見出されている。
【0031】
Ｉ．一般的な定義
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ － ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ － ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
【0032】
組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。該修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ － ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【0033】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。
【0034】
「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
【0035】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含する。
【0036】
本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つまたは複数の外因性核酸が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。一実施形態では、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
【0037】
本明細書で使用される「組換え細胞」という用語は、遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的の異種ポリペプチドを発現し、該目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞などを意味する。例えば、「外因性ヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞」は、目的の異種ポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノムに導入されている細胞を意味する。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。
【0038】
「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」および「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有している変異子孫は、包含される。
【0039】
「単離された」組成物は、自然環境の構成成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、またはイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって、９５％または９９％超の純度と決定されるまで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
【0040】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、前記核酸分子は、染色体外に存在するか、または自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0041】
「単離された」ポリヌクレオチドまたは抗体は、その自然環境の構成成分から分離された、ポリペプチド分子または抗体分子を指す。
【0042】
「組込み部位」という用語は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態では、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態では、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態では、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態では、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
【0043】
相互交換可能に使用することができる「ベクター」または「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターならびに、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【0044】
「結合する」という用語は、その標的への結合部位の結合を意味する。例えば、それぞれの抗原への、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位の結合である。この結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定することができる。すなわち、「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を意味する。一実施形態では、結合は、抗体が表面に結合しており、かつ抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される結合アッセイにおいて決定される。結合とは、例えば、１０－８Ｍ以下、いくつかの実施形態では１０－１３～１０－８Ｍ、いくつかの実施形態では１０－１３～１０－９Ｍの結合親和性（ＫＤ）を意味する。「結合する」という用語は、「特異的に結合する」という用語も含む。
【0045】
例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態では、抗原を表面に結合させ、抗体の結合、すなわちその結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合の親和性は、用語ｋａ（会合定数：複合体を形成するための会合の速度定数）、ｋｄ（解離定数、複合体の解離のための速度定数）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）によって定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。
【0046】
「結合部位」という用語は、標的への結合特異性を示す任意のタンパク質性エンティティを意味する。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。したがって、本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第２のポリペプチドに特異的に結合することができるか、または第２のポリペプチドによって特異的に結合され得るポリペプチドを意味する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、または特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を意味する。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、それぞれの選択剤の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ（選択的培養条件）、形質転換されていない宿主細胞は、該選択的培養条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にし得る。選択マーカーは、薬剤耐性を付与し、または宿主細胞の代謝的もしくは異化的欠陥を補い得る。原核細胞では、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が使用され得る。真核細胞の選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号および国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
【0048】
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
【0049】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つ以上の構成要素の並置を指し、該構成要素は、意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節するように作用する場合、該プロモーターおよび／またはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣接している。特定の実施形態では、例えば、分泌リーダーおよびポリペプチドなどの２つのタンパク質をコードする領域を結合する必要がある場合、該配列は、連続して隣接し、同じリーディングフレーム内に存在する。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの構成要素は隣接していなくても、作動可能に連結され得る。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、該エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、その中、または下流に位置し得、またコード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動可能な連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、および／または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。都合の良い制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の方法に従って使用し得る。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、該ＩＲＥＳは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。
【0050】
本明細書において使用される場合、「外因性」という用語は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組み合わせ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組み合わせは、人工核酸である）から、または配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。「内因性」という用語は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。
【0051】
本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞／生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、または人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。
【0052】
「サーチュイン－１」という用語は、哺乳動物におけるシグナル伝達の一部である酵素、すなわち、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン－１を意味する。サーチュイン－１はＳＩＲＴ－１遺伝子によってコードされる。ヒトサーチュイン－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ９６ＥＢ６を有し、配列番号１７に示されている。チャイニーズハムスターサーチュイン－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリー Ａ０Ａ３Ｌ７ＩＦ９６を有し、配列番号１８に示されている。
【0053】
ＩＩ．抗体
（ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
（ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
【0054】
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔ番号付けシステムにより番号付けされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ番号付けシステム（６４７～６６０頁を参照）を、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１～７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、本明細書では、この場合の「ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け」を参照することでさらに明確になる）に使用する。
【0055】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体－抗体断片融合物、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【0056】
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖がジスルフィド結合したものを含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有し、それにより、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【0057】
「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。完全長抗体は、それぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域および軽鎖定常ドメインを含む２つの完全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変領域、第１の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の重鎖定常ドメイン、および第３の重鎖定常ドメインを含む、２つの完全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、完全長抗体はさらなる免疫グロブリンドメイン、例えば、完全長抗体の異なる鎖の１つまたは複数の末端に、ただし各末端に対しては単一の断片のみが結合した、１つまたは複数の追加のｓｃＦｖ、または重鎖もしくは軽鎖Ｆａｂ断片、またはｓｃＦａｂなどを含み得る。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。
【0058】
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのペアを意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属している。抗体結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）または３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３およびＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を表す。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。
【0059】
本明細書で用いられる「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である、アミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）および／または構造的に既定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域および／または抗原に接触する残基（「抗原接触」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。
【0060】
ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ。
【0061】
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。
【0062】
抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【0063】
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からそのカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。ただし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
【0064】
「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１またはＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。ただし、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を意味する。
【0065】
抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（同様に定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４；およびＥＰ０３０７４３４において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。
【0066】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。
【0067】
「価数」という用語は、本出願で使用される場合、抗体中の特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体中に、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位の存在を意味する。
【0068】
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）またはそれらの組み合わせ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでもよい。例えば、天然型の抗体は、単一特異性であるが二価である。
【0069】
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）またはそれらの組み合わせ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価である。すなわち、２つの抗原結合部位を含む。また、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つまたはより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７号（Ａ１）を参照）。
【0070】
特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、例えば少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一方は第１の抗原に対するものであり、他方は異なる第２の抗原に対するものである。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。
【0071】
多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体－抗体断片－融合物として調製することができる。
【0072】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７－５４０，国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照）および「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体もしくは断片の架橋（例えば、米国特許第４６７６９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１－８３を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照のこと）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照のこと）；および、例えばＴｕｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
【0073】
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。
【0074】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つまたは複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一実施形態では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【0075】
抗体または断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号または国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
【0076】
抗体またはその断片は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている多重特異性抗体でもあり得る。
【0077】
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。
【0078】
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【0079】
複合体（多重特異性）抗体は、
－ ドメイン交換を伴う完全長抗体：
第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、ここで、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメインとＶＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；かつ
前記第２のＦａｂ断片が、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換を伴う完全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖と、ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、第１重鎖および修飾された第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両ＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている、
多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２つのペアを含む１つの完全長抗体であって、ここで、完全長重鎖および完全長軽鎖のペアのそれぞれによって形成される結合部位は、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、および
ｂ）１つの追加のＦａｂ断片であって、ここで、追加のＦａｂ断片は、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断片
を含み、
ここで、第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片は、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である
多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ 一アーム一本鎖フォーマット（＝一アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ 二アーム一本鎖フォーマット（＝二アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ 共通軽鎖二重特異性フォーマット（＝共通軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット：
ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体
である。
－ ドメイン交換を伴う完全長抗体：
第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、ここで、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメインとＶＬドメインのみが互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；かつ
前記第２のＦａｂ断片が、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換を伴う完全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖と、ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、第１重鎖および修飾された第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両ＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている、
多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２つのペアを含む１つの完全長抗体であって、ここで、完全長重鎖および完全長軽鎖のペアのそれぞれによって形成される結合部位は、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、および
ｂ）１つの追加のＦａｂ断片であって、ここで、追加のＦａｂ断片は、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断片
を含み、
ここで、第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片は、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である
多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ 一アーム一本鎖フォーマット（＝一アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ 二アーム一本鎖フォーマット（＝二アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ 共通軽鎖二重特異性フォーマット（＝共通軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
の通りである、抗体；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット：
ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第２の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体
である。
【0080】
ノブ・イントゥー・ホール二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｎｕｍｂｅｒ１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。
【0081】
抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。
【0082】
（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインにおける変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」または「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、および「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」または「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
【0083】
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、もしくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１およびＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（またはＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
【0084】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨおよびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
【0085】
多重特異性抗体はまた、一実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う２つ以上のＦａｂが多重特異性抗体に含まれる場合、前記Ｆａｂは同じ抗原に特異的に結合する。
【0086】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0087】
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え細胞などの組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるすべての抗体（キメラ、ヒト化およびヒト）を意味する。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、羊膜細胞、ＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
【0088】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）が挙げられる。
【0089】
ＩＩＩ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法および組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法および組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
【0090】
一態様では、抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養する工程と、任意に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養物）から回収する工程とを含む、方法が提供される。
【0091】
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【0092】
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」または「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞などの適切な宿主細胞に、前記目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
【0093】
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、およびポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
【0094】
目的のポリペプチドが、異なる（単量体）ポリペプチド、例えば、抗体または複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれに対して少なくとも１つの発現カセットが必要である。例えば、完全長抗体は、軽鎖の２つのコピーおよび重鎖の２つのコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、完全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、完全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個および重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、２つの軽鎖ならびに２つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドで構成されているため、４つの発現カセットが必要となる。
【0095】
目的のポリペプチドのための発現カセットは、次に、１つまたは複数のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
【0096】
以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割することができ、その結果サイズの縮小をもたらす。
【0097】
多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の異種ポリペプチドの発現および産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み（ＲＩ）または標的指向性組込み（ＴＩ）のいずれかを使用する。
【0098】
ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクターまたはその断片が、同一または異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
【0099】
ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
【0100】
（グリコシル化された）抗体の発現に適した宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物などの多細胞生物に由来する。
【0101】
ＩＶ．宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。また、組込み方法とは無関係に、すなわち、ＲＩの場合にもＴＩの場合にも、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。また、組込み方法とは無関係に、すなわち、ＲＩの場合にもＴＩの場合にも、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
【0102】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞（例えば、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．５（２０１１）Ｐ１３３に記載されているＣＡＰ－Ｔ細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）に記載されたＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、および、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照。
【0103】
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４など）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）、またはヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔなど）である。１つの好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0104】
標的指向性組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態では、標的指向性組込みは、ゲノムおよび組み込まれる外因性ヌクレオチド配列に存在する１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的指向性組込みは、相同組換えによって媒介される。
【0105】
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介性組換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳは、組換え事象がヌクレオチド配列内で発生する位置を定義するために使用され得る。
【0106】
特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
【0107】
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位またはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位またはφＣ３１ａｔｔＢ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて、あるいはタンパク質やｍＲＮＡとして細胞中に導入することができる。
【0108】
ＴＩに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、ＴＩに適した任意の既知または将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、本明細書に記載されるように、ランディング部位を含むハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。１つの好ましい実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞である。
【0109】
特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、互いに独立して、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
【0110】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は３つのＲＲＳを含み、ここで、第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する。特定の好ましい実施形態では、３つのＲＳＳはすべて異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位はさらに第２の選択マーカーを含み、かつ第１および第２の選択マーカーは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第３の選択マーカーおよび配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もさらに含み、該ＩＲＥＳは該第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なり得る。
【0111】
本発明は、以下ＣＨＯ細胞で例示されるが、これは本発明を例示するためにのみ提示され、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
【0112】
本発明による方法における使用に適した例示的な哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞であり、ここで、ランディング部位はＣｒｅリコンビナーゼを介したＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含む。
【0113】
この例では、異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、および２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照されたい）、その際、Ｌ３および２Ｌはランディング部位の５’末端および３’末端にそれぞれ隣接しており、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光性ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化することならびにトランスフェクションおよびＣｒｅ組換え後に該部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。
【0114】
先のパラグラフで概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、例えば、いわゆる、Ｌ３部位およびＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクターならびにＬｏｘＦａｓ部位および２Ｌ部位を内部に持つバックベクターを同時に組み込むことが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配させることができ：プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置することができるに対し、コード化領域およびポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する前記核酸の正しいリコンビナーゼ媒介性組込みのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
【0115】
通常、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。
【0116】
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。
【0117】
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つのランディング部位を含む。特定の実施形態では、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれる。
【0118】
特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、第１、第２および第３のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’側（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’側（下流）に位置している。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣接する。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。
【0119】
特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異なる。特定の好ましい実施形態では、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは同じ方向に配置される。特定の実施形態では、２つのＲＲＳはいずれもフォワードまたはリバース方向に存在する。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは反対方向に配置される。
【0120】
特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、２つのＲＳＳが隣接する、第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーは該第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光性タンパク質である。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なる。
【0121】
特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。
【0122】
Ｖ．標的指向性組込み
本発明による組換え哺乳動物細胞を生成するための１つの方法は、標的指向性組込み（ＴＩ）である。
本発明による組換え哺乳動物細胞を生成するための１つの方法は、標的指向性組込み（ＴＩ）である。
【0123】
標的指向性組込みでは、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座に外因性核酸を導入するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムに組み込まれた部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される１つのシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムである。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内ならびに外因性核酸内の２つのｌｏｘ（Ｐ）部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ（Ｐ）部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。これ以上何も必要としない。つまりＡＴＰなどは必要としない。もともとＣｒｅ－ｌｏｘシステムはバクテリオファージＰ１で発見された。
【0124】
Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、哺乳動物、植物、細菌、酵母など、様々な種類の細胞で機能する。
【0125】
一実施形態では、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一または二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって哺乳動物ＴＩ宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞が得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれ、それが次に異種ポリペプチドの効率的な発現および産生をもたらす。
【0126】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系で広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内および分子間組換えの両方を媒介できる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内の組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介性組換えは高効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みをもたらすであろう。
【0127】
「一致するＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致するＲＲＳは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0128】
「２プラスミドＲＭＣＥ」戦略または「二重ＲＭＣＥ」は、２つのベクターの組み合わせを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるわけではないが、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。
【0129】
２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いる哺乳動物ＴＩ宿主細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的とされる２つのプラスミドは、効率的な標的指向のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方のプラスミド（フロント）にはＲＲＳ１およびＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３およびＲＲＳ２が隣接している。また、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード化領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
【0130】
２プラスミドＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバーイベントを伴う。２プラスミドＲＭＣＥは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノムのあらかじめ定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を低減させ、かつ／または防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。
【0131】
特定の実施形態では、標的指向性組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、哺乳動物ＴＩ宿主細胞に一致するＲＲＳのゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、標的指向性組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
【0132】
特定の実施形態では、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向性組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つまたは複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカーおよび／または多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
【0133】
一実施形態のように、ＳＩＲＴ－１ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入前またはその後のいずれでも実施できることが指摘されなければならない。
【0134】
ＶＩ．組成物および方法
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法が報告される。
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ここで、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法が報告される。
【0135】
本発明は、少なくとも部分的には、例えばＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞におけるサーチュイン－１（ＳＩＲＴ－１）遺伝子のノックアウトが、組換え生産性、例えば標準的なＩｇＧ型抗体および特に複合体抗体フォーマットの組換え生産性を改善し、培養中の細胞による乳酸生産量を低減させるという知見に基づく。さらに、フェドバッチ培養の終了時での生存率の低下が低減する、すなわち、一定の閾値を超える生存率を有する期間が増加することが見出されている。
【0136】
ＳＩＲＴ－１遺伝子のノックアウトによって得られた結果は驚くべきものであり、同様に生産性に影響を与える可能性のある他の遺伝子をノックアウトしても、プラスの効果は得られなかったのである。また、異なる遺伝子の組み合わせノックアウトは、単一のＳＩＲＴ－１ノックアウトよりも良好に機能しなかった。これは、例えば、国際公開第２０１６／０７５２７８号で報告されている線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする抗原結合ドメインと４－１ＢＢリガンドの三量体（ＣＤ１３７Ｌ）からなる分子（ＦＡＰ－４－１ＢＢＬと命名）を産生する細胞株で示された（データは下記の表に示される）。記載されているノックアウトを除いて、すべての細胞は参照細胞と同じ遺伝子型を持っている。
【0137】
図１に示すように、異なる遺伝子をノックアウトしても細胞増殖に影響を与えなかった。
【0138】
サーチュイン１（ＳＩＲＴ－１）は、サーチュインタンパク質のファミリーに属する。ＳＩＲＴタンパク質は真核生物で高度に保存されており、多くの細胞経路の調節に関与するＮＡＤ依存性酵素である（Ｒｅｖｏｌｌｏ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｘ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３８（２０１３）１６０－１６７）。ＳＩＲＴ－１遺伝子は、細胞質および核に位置する８２ｋＤａのタンパク質をコードする。
【0139】
ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／発現のノックアウトは、異種ポリペプチドの産生のために使用される真核細胞において、特に、組換えポリペプチド、特に抗体を産生するために使用されるか、または使用されることが意図されている組換えＣＨＯ細胞において、より具体的には、標的指向性組込み組換えＣＨＯ細胞において有利である。このノックアウトは、有意な生産性増加ならびに乳酸生産量の低減、ならびに培養時間の延長（生存率低下の低減／減速／遅延）をもたらす。これは、個々のフェドバッチ工程からの生産物の高収率をもたらすことから、いかなる大規模生産工程にとっても経済的に非常に重要である。
【0140】
ＳＩＲＴ－１ノックアウトはＣＨＯ細胞に限定されるものではなく、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、およびＢＨＫ細胞のような他の宿主細胞株においても使用することができる。
【0141】
ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／発現をノックアウトするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が使用されている。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮＳなどの他の技術を使用することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡサイレンシング種を用いて、ＳＩＲＴ－１ ｍＲＮＡレベルをノックダウンし、その結果ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／発現をノックダウンすることができる。
【0142】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、ＳＩＲＴ－１遺伝子は、多重化リボ核タンパク質送達を使用して、同時に３つの異なるｇＲＮＡ（図２を参照）を使用して３つの異なる部位を標的としている。ＳＩＲＴ－１標的部位における二本鎖切断は、インデル形成を誘発するか、または多重化ｇＲＮＡの使用により、エクソン１配列内の欠失も誘発する（図３を参照）。ＳＩＲＴ－１ノックアウト細胞プールのＰＣＲ増幅ＳＩＲＴ－１遺伝子座の配列決定により、第１のｇＲＮＡ部位での配列決定反応の突然の中断が明らかになり、ＳＩＲＴ－１遺伝子のターゲティングが成功したことが示された（図４を参照）。これらの細胞プールは、編集されていないホモ接合性およびヘテロ接合性のＳＩＲＴ－１遺伝子座を含む細胞の混合物からなる。
【0143】
２８日間の培養後、再配列決定が行われ、ノックアウトの安定性を示している（図５を参照）。野生型、すなわちＳＩＲＴ－１ノックアウトのない細胞の増殖優位性、またはノックアウトプールの増殖低減は、それぞれ観察されていない。
【0144】
１４日間のフェッドバッチ培養プロセスにおいて、異なる複合体抗体フォーマットを発現するＳＩＲＴ－１ノックアウト細胞プールまたはクローンについて、未改変の細胞プールまたはクローンと比較して２～２０％の生産性の向上が観察された（以下の表にデータを提示する）。参照細胞とノックアウト細胞は、ノックアウト細胞におけるＳＩＲＴ－１遺伝子の追加ノックアウトを除いて、同じ遺伝子型を有する。
【0145】
【0146】
キャピラリーイムノブロッティングにより、リボ核粒子（ＲＮＰ）ヌクレオフェクションの７日後にサーチュイン－１のタンパク質レベルの抑制が確認された（図８）。
【0147】
この理論に束縛されることなく、ホモ接合性ノックアウトは、ヘテロ接合性ノックアウトよりも生産性の増加に有利な効果を有すると仮定される。
【0148】
本発明は以下に要約される：
本発明の１つの独立した態様は、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。
本発明の１つの独立した態様は、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。
【0149】
本発明の１つの独立した態様は、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現を低減させる／排除する／減少させる／（完全に）ノックアウトすることにより、力価を増加させる／乳酸生産量を低減させる／組換え哺乳動物細胞の培養時間を延長するための方法である。
【0150】
本発明の１つの独立した態様は、
ａ）ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意にポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程
を含むポリペプチドを生産するための方法であって、
ここで、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法である。
ａ）ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意にポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程
を含むポリペプチドを生産するための方法であって、
ここで、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている、方法である。
【0151】
本発明の別の独立した態様は、改善された／増加した組換え生産性、および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とする核酸を哺乳動物細胞に適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現を低減させる／排除する／減少させる／（完全に）ノックアウトする工程、および
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された／増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子を標的とする核酸を哺乳動物細胞に適用して、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現を低減させる／排除する／減少させる／（完全に）ノックアウトする工程、および
ｂ）内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性／機能／発現が低減している／排除されている／減少している／（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された／増加した組換え生産性および／または低減した乳酸生産量を有する（ｈａｖｉｎｇ）／持つ（ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0152】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１遺伝子ノックアウトは、ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトである。
【0153】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１ノックアウト細胞株の生産性は、ＳＩＲＴ－１コンピテント親哺乳動物細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上増加する。
【0154】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、低減または排除または減少またはノックアウトは、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される。一実施形態では、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【0155】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１遺伝子発現の低減は、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティングおよびノックダウンからなる群から選択される。
【0156】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＩＲＴ－１ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入前、または異種ポリペプチドをコードする外因性核酸の導入後に行われる。
【0157】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドは抗体である。一実施形態では、抗体は、２つ以上の異なる結合部位および任意選択でドメイン交換を含む抗体である。一実施形態では、抗体は、３つ以上の結合部位またはＶＨ／ＶＬペアまたはＦａｂ断片、および任意選択でドメイン交換を含む。一実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。
【0158】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドは抗体である。一実施形態では、抗体は複合体抗体である。
【0159】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の軽鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の軽鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
【0160】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、ＣＬドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、ＣＬドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
【0161】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
【0162】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＬドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＬドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
【0163】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖
を含むヘテロ多量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ多量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の軽鎖
を含むヘテロ多量体ポリペプチドであって、
ここで、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ多量体ポリペプチドである。
【0164】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、第１の軽鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の軽鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む第２の軽鎖
を含むヘテロ四量体ポリペプチドであって、
ここで、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインは第１の結合部位を形成し、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインは第２の結合部位を形成する、ヘテロ四量体ポリペプチドである。
【0165】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、治療用抗体である。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性（治療用）抗体である。一態様において、二重特異性（治療用）抗体はＴＣＢである。
【0166】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）であり、
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第１の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片の重鎖定常ドメイン１のＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）である。
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、ここで、第３のＦａｂ断片の結合部位は、第１の抗原に特異的に結合し、ここで、第３のＦａｂ断片は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片、および
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
ここで、第１および第２のＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片の重鎖定常ドメイン１のＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）である。
【0167】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、および非免疫グロブリンタンパク質性部分を含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖
を含む三量体ポリペプチドであって、
ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは結合部位を形成する、三量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、および非免疫グロブリンタンパク質性部分を含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖
を含む三量体ポリペプチドであって、
ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは結合部位を形成する、三量体ポリペプチドである。
【0168】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、（異種）ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、非免疫グロブリンタンパク質性部分、ペプチドリンカー、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖
を含む三量体ポリペプチドであって、
ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは結合部位を形成する、三量体ポリペプチドである。
－ Ｎ末端からＣ末端に、重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖、
－ Ｎ末端からＣ末端に、非免疫グロブリンタンパク質性部分、ペプチドリンカー、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖、ならびに
－ Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖
を含む三量体ポリペプチドであって、
ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは結合部位を形成する、三量体ポリペプチドである。
【0169】
本発明の別の独立した態様は、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含み、該ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、以下：
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞中に、３つの異なる組換え認識配列および１から８つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つまたは複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー
を含み、
かつ
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つまたは複数の発現カセット、および
－ 第２の組換え認識配列
を含み、
ここで、第１および第２のデオキシリボ核酸の第１から第３の組換え認識配列は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１から第３の組換え認識配列と一致しており、
前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前述の１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に；または
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つまたは複数のリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、場合によっては、１つまたは複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程；
ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含み、該ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞中に、３つの異なる組換え認識配列および１から８つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つまたは複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー
を含み、
かつ
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つまたは複数の発現カセット、および
－ 第２の組換え認識配列
を含み、
ここで、第１および第２のデオキシリボ核酸の第１から第３の組換え認識配列は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１から第３の組換え認識配列と一致しており、
前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前述の１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に；または
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つまたは複数のリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、場合によっては、１つまたは複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程；
ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含み、該ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0170】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。
【0171】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
【0172】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、１から８つの発現カセットを含む。
【0173】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも４つの発現カセットを含み、ここで、
－ 第１の組換え認識配列は、最も５’側の（すなわち、第１の）発現カセットの５’側に位置し、
－ 第２の組換え認識配列は、最も３’側の発現カセットの３’側に位置し、かつ
－ 第３の組換え認識配列は、
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、および
－ ２つの発現カセットの間
に位置し、
かつ
すべての組換え認識配列は異なっている。
－ 第１の組換え認識配列は、最も５’側の（すなわち、第１の）発現カセットの５’側に位置し、
－ 第２の組換え認識配列は、最も３’側の発現カセットの３’側に位置し、かつ
－ 第３の組換え認識配列は、
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、および
－ ２つの発現カセットの間
に位置し、
かつ
すべての組換え認識配列は異なっている。
【0174】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第３の組換え認識配列は、第４の発現カセットと第５の発現カセットとの間に位置する。
【0175】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。
【0176】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、選択マーカーをコードする該発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含み、該開始コドンは該コード配列に作動可能に連結されている。
【0177】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列に対して、
ｉ） ５’側、または
ｉｉ）３’側、または
ｉｉｉ）一部が５’側および一部が３’側
に位置する。
ｉ） ５’側、または
ｉｉ）３’側、または
ｉｉｉ）一部が５’側および一部が３’側
に位置する。
【0178】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む。
【0179】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、選択マーカーをコードする発現カセットの５’側に位置する部分は、開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、該プロモーター配列は、上流にそれぞれ第２、第３または第４の発現カセットが隣接し（すなわち、第２、第３または第４の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流に第３の組換え認識配列が隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの３’側に位置する部分は開始コドンを欠く、選択マーカーをコードする核酸を含み、上流には第３の組換え認識配列が隣接し、下流にはそれぞれ第３、第４または第５の発現カセットが隣接している。
【0180】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、開始コドンは翻訳開始コドンである。一実施形態では、開始コドンはＡＴＧである。
【0181】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、第１のデオキシリボ核酸は第１のベクターに組み込まれ、第２のデオキシリボ核酸は第２のベクターに組み込まれる。
【0182】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含む。
【0183】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、プロモーターは、イントロンＡの有無に関わらずヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨ ｐｏｌｙＡ部位であり、ターミネーターはｈＧＴターミネーターである。
【0184】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネーターが存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネーターはｈＧＴターミネーターである。
【0185】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
【0186】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ポリペプチドは、二価の単一特異性抗体、少なくとも１つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、および少なくとも１つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群から選択される。
【0187】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、リコンビナーゼ認識配列は、Ｌ３、２Ｌ、およびＬｏｘＦａｓである。一実施形態では、Ｌ３は配列番号０１の配列を有し、２Ｌは配列番号０２の配列を有し、ＬｏｘＦａｓは配列番号０３の配列を有する。一実施形態では、第１のリコンビナーゼ認識配列はＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列は２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列はＬｏｘＦａｓである。
【0188】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
【0189】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位であり、ターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
【0190】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０４の配列を有する。一実施形態では、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０６の配列を有する。
【0191】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号０８である。
【0192】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ｈＧＴターミネーターは、配列番号０９の配列を有する。
【0193】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＶ４０プロモーターは、配列番号１０の配列を有する。
【0194】
本発明のすべての態様および実施形態の一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号０７である。
【0195】
以下の実施例、配列および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
【0196】
配列の説明
配列番号０１：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０２：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０３：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０４－０６：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的バリアント
配列番号０７：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号０８：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号０９：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号１０：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１１：例示的なＧＦＰ核酸配列
配列番号１２：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿１：ＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡ
配列番号１３：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿２：ＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡ
配列番号１４：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿３：ＧＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＡ
配列番号１５：ｏＳＡ０６０＿ＳＩＲＴ１＿ｆｏｒ：ＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＧＧＣ
配列番号１６：ｏＳＡ０６１＿ＳＩＲＴ１＿ｒｅｖ：ＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＡＧ
配列番号１７：ヒトサーチュイン－１のアミノ酸配列
配列番号１８：チャイニーズハムスターサーチュイン－１のアミノ酸配列
配列番号０１：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０２：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０３：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０４－０６：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的バリアント
配列番号０７：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号０８：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号０９：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号１０：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１１：例示的なＧＦＰ核酸配列
配列番号１２：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿１：ＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡ
配列番号１３：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿２：ＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡ
配列番号１４：ｇＲＮＡ＿ＳＩＲＴ１＿３：ＧＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＡ
配列番号１５：ｏＳＡ０６０＿ＳＩＲＴ１＿ｆｏｒ：ＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＧＧＣ
配列番号１６：ｏＳＡ０６１＿ＳＩＲＴ１＿ｒｅｖ：ＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＡＧ
配列番号１７：ヒトサーチュイン－１のアミノ酸配列
配列番号１８：チャイニーズハムスターサーチュイン－１のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【0197】
【図1】標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのノックアウト（ＫＯ）後の増殖と生存率。示されているのは、異なるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰベースの標的遺伝子ノックアウトを有する、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする抗原結合ドメインと、４－１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）の三量体を含む抗体を発現する細胞の操作されたクローンの生細胞数である。ＮＴＣ：非ターゲティングコントロールｇＲＮＡ、線＝生存率、棒グラフ＝生存細胞濃度。
【図2】公共のＣＨＯゲノムに由来するＳＩＲＴ－１遺伝子。（Ａ）ＳＩＲＴ－１アンプリコン調製用のエクソンおよびイントロン、ｇＲＮＡ標的部位（青）およびプライマー配列（ｏＳＡ０６０およびｏＳＡ０６１）を示すＳＩＲＴ－１遺伝子。（Ｂ）ＳＩＲＴ－１遺伝子のエクソン１を拡大。
【図3】ＳＩＲＴ－１遺伝子座のＰＣＲ増幅のアガロースゲル電気泳動。インデルが検出されている。レーン１＝ＣＤ４０およびＦＡＰに特異的に結合できる二重特異性抗原結合分子；レーン２＝レーン１のレプリカ；レーン３＝線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする抗原結合ドメインと４－１ＢＢリガンドの三量体（ＣＤ１３７Ｌ）を含む分子（１）；レーン４＝レーン３のレプリカ；レーン５＝線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする抗原結合ドメインと４－１ＢＢリガンドの三量体（ＣＤ１３７Ｌ）を含む分子（２）；レーン６＝レーン５のレプリカ；レーン７＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－１；レーン８＝レーン７のレプリカ；レーン９＝ドメイン交換を伴う完全長抗体；レーン１０＝レーン９のレプリカ；レーン１１＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（プール）；レーン１２＝レーン１１のレプリカ；レーン１３＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（クローン）；レーン１４＝レーン１３のレプリカ；レーン１５＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－２；レーン１６＝レーン１５のレプリカ；レーン１７＝標的指向性組込みＣＨＯ宿主細胞；レーン１８＝レーン１７のレプリカ；ＭＷ＝分子量マーカー。
【図4-1】多重化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９改変細胞プールにおけるＳＩＲＴ－１ノックアウトの配列決定検証。６つの異なる複合体抗体フォーマットについての未改変プール／クローンとＳＩＲＴ－１ノックアウトプール／クローン（未改変／ヘテロ接合性／ホモ接合性ＳＩＲＴ－１ノックアウト遺伝子座の混合物を含む）とのＳＩＲＴ－１遺伝子アンプリコンの配列決定結果の比較。
【図5-1】ＳＩＲＴ－１遺伝子座のサンガー再配列決定ＳＩＲＴ－１は、ノックアウト（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰトランスフェクション）の２８日後にすべての細胞株においてプールレベルで安定して破壊されたままである。
【図6】フェドバッチ乳酸データ［ｍｇ／ｌ］．６つの異なる複合体抗体フォーマットについての未改変プール／クローンとＳＩＲＴ－１ノックアウトプール／クローン（未改変／ヘテロ接合性／ホモ接合性ＳＩＲＴ－１ノックアウト遺伝子座の混合物を含む）との比較。細胞は以下を発現している：１＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－２；２＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－１；３＝ドメイン交換を伴う完全長抗体；４＝ＦＡＰを標的とする抗原結合ドメインと４－１ＢＢリガンドの三量体（ＣＤ１３７Ｌ）を含む分子；５＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（プール）；６＝ＣＤ４０およびＦＡＰに特異的に結合できる二重特異性抗原結合分子；７＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（クローン）。
【図7】フェドバッチ生存率データ［％］．６つの異なる複合体抗体フォーマットについての未改変プール／クローンとＳＩＲＴ－１ノックアウトプール／クローン（未改変／ヘテロ接合性／ホモ接合性ＳＩＲＴ－１ノックアウト遺伝子座の混合物を含む）との比較。細胞は以下を発現している：１＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－２；２＝Ｔ細胞二重特異性フォーマット抗体－１；３＝ドメイン交換を伴う完全長抗体；４＝ＦＡＰを標的とする抗原結合ドメインと４－１ＢＢリガンドの三量体（ＣＤ１３７Ｌ）を含む分子；５＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（プール）；６＝ＣＤ４０およびＦＡＰに特異的に結合できる二重特異性抗原結合分子；７＝変異型インターロイキン－２ポリペプチドとＰＤ－１に結合する抗体を含むイムノコンジュゲート（クローン）。
【図8】キャピラリーイムノブロッティングにより、ＲＮＰヌクレオフェクションの７日後にタンパク質レベルの抑制が確認される。１＝宿主細胞株を５ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質と５ｐｍｏｌのＳＩＲＴ－１ゲノム遺伝子座を標的とする３ｇＲＮＡでヌクレオフェクトした；２＝宿主細胞株を５ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質でヌクレオフェクトした。
【実施例】
【0198】
実施例１
一般的技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）で説明されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
一般的技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）で説明されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
【0199】
２）ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。
【0200】
３）ＤＮＡおよびタンパク質配列解析および配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。
【0201】
４）遺伝子およびオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
【0202】
５）試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、製造業者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、製造業者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。
【0203】
６）ＴＩ宿主細胞株の培養
ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞は、湿度８５％、５％のＣＯ２加湿インキュベーター内で３７℃で培養された。それらは、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養された。細胞を３日または４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総容量３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌのバッフルのない三角フラスコを使用した。細胞を振盪振幅５ｃｍで１５０ｒｐｍで振盪した。細胞数はＣｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。細胞は、６０日齢に達するまで培養を続けた。
ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞は、湿度８５％、５％のＣＯ２加湿インキュベーター内で３７℃で培養された。それらは、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養された。細胞を３日または４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総容量３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌのバッフルのない三角フラスコを使用した。細胞を振盪振幅５ｃｍで１５０ｒｐｍで振盪した。細胞数はＣｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。細胞は、６０日齢に達するまで培養を続けた。
【0204】
７）クローニング
一般
Ｒ部位によるクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に隣接するＤＮＡ配列が、後続の断片に存在する配列と等しいかどうかに依存する。このように、断片の組み立ては、等しい配列が重なり合い、それに続くＤＮＡリガーゼによる組み立てられたＤＮＡのニックの封鎖によって可能になる。したがって、適切なＲ部位を含む特定の予備ベクターに単一遺伝子をクローニングすることが必要である。これらの予備ベクターのクローニングに成功した後、Ｒ部位に隣接する目的の遺伝子は、Ｒ部位の隣を直接切断する酵素による制限消化を介して切り出される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を１つの工程で組み立てることである。より詳細には、５’－エキソヌクレアーゼが重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行うことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
一般
Ｒ部位によるクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に隣接するＤＮＡ配列が、後続の断片に存在する配列と等しいかどうかに依存する。このように、断片の組み立ては、等しい配列が重なり合い、それに続くＤＮＡリガーゼによる組み立てられたＤＮＡのニックの封鎖によって可能になる。したがって、適切なＲ部位を含む特定の予備ベクターに単一遺伝子をクローニングすることが必要である。これらの予備ベクターのクローニングに成功した後、Ｒ部位に隣接する目的の遺伝子は、Ｒ部位の隣を直接切断する酵素による制限消化を介して切り出される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を１つの工程で組み立てることである。より詳細には、５’－エキソヌクレアーゼが重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行うことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
【0205】
いくつかのベクターについては、制限酵素を介したクローニング戦略が用いられた。適当な制限酵素を選択することによって、目的の遺伝子を切り出し、その後ライゲーションによって別のベクターに挿入することができる。したがって、多重クローニング部位（ＭＣＳ）で切断する酵素を使用し、正しい配列の断片のライゲーションを行うことができるよう、賢く選択することが望ましい。ベクターと断片があらかじめ同じ制限酵素で切断されている場合、断片とベクターの粘着末端は完璧に組み合わされ、その後ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることができる。ライゲーション後、コンピテント大腸菌細胞を新たに生成されたプラスミドで形質転換する。
【0206】
制限消化によるクローニング
制限酵素によるプラスミドの消化のために、以下の成分を氷上で一緒にピペットで移した。
制限酵素によるプラスミドの消化のために、以下の成分を氷上で一緒にピペットで移した。
【0207】
（表）制限消化反応ミックス
【0208】
１回の消化でより多くの酵素を使用した場合は、各酵素１μｌを使用し、ＰＣＲグレードの水を多かれ少なかれ加えることで容積を調整した。すべての酵素は、新しいＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（１００％活性）との使用に適格であり、同じインキュベーション温度（すべて３７℃）であるという前提条件で選択された。
【0209】
サーモミキサーまたはサーマルサイクラーを使用してインキュベーションを行い、試料を一定温度（３７℃）でインキュベートできるようにした。インキュベーション中、試料を撹拌しなかった。インキュベーション時間は６０分とした。その後、試料をローディング色素と直接混合し、アガロース電気泳動ゲルにロードするか、さらに使用するために４℃／氷上で保存した。
【0210】
ゲル電気泳動用に１％アガロースゲルを調製した。そのため、１．５ｇの多目的アガロースを１２５三角フラスコに量り取り、１５０ｍｌのＴＡＥ緩衝液で満たした。混合物は、アガロースが完全に溶解するまでマイクロ波オーブン中で加熱した。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムをアガロース溶液に加えた。その後、ゲルを型に流し込んだ。アガロースをセットした後、型を電気泳動チャンバーに入れ、チャンバーをＴＡＥ緩衝液で満たした。その後試料をロードした。（左から）最初のポケットに、適切なＤＮＡ分子量マーカーをロードし、続いて試料をロードした。ゲルを＜１３０Ｖで約６０分間泳動した。電気泳動後、ゲルをチャンバーから取り出し、ＵＶ－Ｉｍａｇｅｒで分析した。
【0211】
標的バンドを切断し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。ゲルの精製のために、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを製造業者の指示に従って使用した。ＤＮＡ断片を、さらに使用するために－２０℃で保存した。
【0212】
ライゲーション用の断片は、挿入断片とベクター断片の長さ、および互いの相関関係に応じて、ベクターと挿入断片のモル比が１：２、１：３、１：５で一緒にピペットで移した。ベクターに挿入すべき断片が短い場合は、１：５の比率を使用した。挿入断片が長い場合は、ベクターとの相関でより少量の挿入断片を使用した。５０ｎｇの量のベクターを各ライゲーションで使用し、特定量の挿入断片をＮＥＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒで計算した。ライゲーションには、ＮＥＢのＴ４ＤＮＡライゲーションキットを使用した。ライゲーション混合物の例を次の表に示す。
【0213】
（表）ライゲーション反応ミックス
【0214】
ＤＮＡと水の混合から始まり、緩衝液の添加、最後に酵素の添加まで、すべての成分を氷上で一緒にピペットで移した。反応物を上下にピペッティングすることにより穏やかに混合し、短時間マイクロフュージし、次に室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ４リガーゼを６５℃で１０分間熱失活させた。試料を氷上で冷却した。最後の工程で、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した（以下を参照）。
【0215】
Ｒ部位アセンブリによるクローニング
組立てのために、両端にＲ部位をもつすべてのＤＮＡ断片を氷上で一緒にピペットで移した。４つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者の推奨どおり、すべての断片の等モル比（０．０５ｎｇ）を使用した。反応ミックスの半分はＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより具現化された。全反応容積は４０μｌで、ＰＣＲ清浄水による充填により到達した。以下の表では、例示的なピペッティングスキームを示す。
組立てのために、両端にＲ部位をもつすべてのＤＮＡ断片を氷上で一緒にピペットで移した。４つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者の推奨どおり、すべての断片の等モル比（０．０５ｎｇ）を使用した。反応ミックスの半分はＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより具現化された。全反応容積は４０μｌで、ＰＣＲ清浄水による充填により到達した。以下の表では、例示的なピペッティングスキームを示す。
【0216】
（表）アセンブリ反応ミックス
【0217】
反応混合物の設定後、チューブを恒常的に５０℃で６０分間サーモサイクラー中でインキュベートした。組み立てが成功した後、１０ベータコンピテント大腸菌を２μｌの組み立てたプラスミドＤＮＡで形質転換した（以下を参照）。
【0218】
形質転換１０ベータコンピテント大腸菌細胞
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温熱ブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与えた。直後、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ １０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に加えた。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μｌをあらかじめ加温した（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレート上にピペットで移し、使い捨てのスパチュラで広げた。このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。このプレート上で増殖できるのは、アンピシリンに対する耐性遺伝子をもつプラスミドをうまく取り込んだ細菌だけである。翌日に単一コロニーを拾い、その後のプラスミド調製のためにＬＢ‐Ａｍｐ培地で培養した。
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温熱ブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与えた。直後、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ １０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に加えた。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μｌをあらかじめ加温した（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレート上にピペットで移し、使い捨てのスパチュラで広げた。このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。このプレート上で増殖できるのは、アンピシリンに対する耐性遺伝子をもつプラスミドをうまく取り込んだ細菌だけである。翌日に単一コロニーを拾い、その後のプラスミド調製のためにＬＢ‐Ａｍｐ培地で培養した。
【0219】
細菌培養
大腸菌の培養は、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略である）中で行い、１ｍｌ／Ｌ １００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度とした。異なるプラスミド調製量について、以下の量を単一の細菌コロニーに播種した。
大腸菌の培養は、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略である）中で行い、１ｍｌ／Ｌ １００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度とした。異なるプラスミド調製量について、以下の量を単一の細菌コロニーに播種した。
【0220】
（表）大腸菌培養量
【0221】
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、９６ウェル２ｍｌディープウェルプレートにウェルあたり１．５ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填した。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーを採取したら、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じた。プレートを３７℃のインキュベーター中で２００ｒｐｍの振盪速度で２３時間インキュベートした。
【0222】
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、１５ｍｌチューブ（換気蓋付き）に３．６ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に播種した。つまようじは取り除かず、インキュベーションの間チューブ内に残した。９６ウェルプレートと同様に、チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。
【0223】
Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐでは、２００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラス製の１Ｌ三角フラスコに充填し、約５時間経過した１ｍｌの細菌の培養液を播種した。三角フラスコを紙栓で閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
【0224】
プラスミド調製
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を取り除き、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。約９０分後に実行が完了し、溶出したプラスミド－ＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り除くことができた。
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を取り除き、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。約９０分後に実行が完了し、溶出したプラスミド－ＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り除くことができた。
【0225】
Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐのために、１５ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を２ｍｌのエッペンドルフチューブに分けた。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００ｘｇで室温で３分間遠心分離した。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、製造業者の指示に従ってＭｉｎｉ－Ｐｒｅｐを実施した。プラスミドＤＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
【0226】
Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキットを用いて、製造業者の指示に従ってＭａｘｉ－Ｐｒｅｐを実施した。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
【0227】
エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の容量を２．５倍容量のエタノール１００％と混合した。この混合物を－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。再度、試験管を１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールを蒸発させたら、適量のエンドトキシンフリー水を加えた。ＤＮＡは４℃で一晩水に再溶解させる時間を置いた。少量のアリコートを取り、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置でＤＮＡ濃度を測定した。
ＤＮＡ溶液の容量を２．５倍容量のエタノール１００％と混合した。この混合物を－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。再度、試験管を１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールを蒸発させたら、適量のエンドトキシンフリー水を加えた。ＤＮＡは４℃で一晩水に再溶解させる時間を置いた。少量のアリコートを取り、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置でＤＮＡ濃度を測定した。
【0228】
実施例２
プラスミド生成
発現カセット組成
抗体鎖の発現のために、以下の機能的エレメントを含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、および
－ 任意でヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
プラスミド生成
発現カセット組成
抗体鎖の発現のために、以下の機能的エレメントを含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、および
－ 任意でヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
【0229】
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【0230】
フロントベクターとバックベクターのクローニング
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣおよびＬＣ断片を、Ｌ３およびＬｏｘＦＡＳ配列を含むフロントベクター骨格、ならびにＬｏｘＦＡＳおよび２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択マーカーを含むバックベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）は、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用された。
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣおよびＬＣ断片を、Ｌ３およびＬｏｘＦＡＳ配列を含むフロントベクター骨格、ならびにＬｏｘＦＡＳおよび２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択マーカーを含むバックベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）は、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用された。
【0231】
それぞれの抗体鎖をコードするｃＤＮＡは、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって生成された。３７℃で１時間、遺伝子合成物およびバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦおよびＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片およびバックボーンのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従って迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【0232】
翌日、クローンを採取し、ＭｉｎｉまたはＭａｘｉ－Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、またはそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な突然変異も存在しないように徹底した（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ）。
【0233】
第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦおよびＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。ＴＩバックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦおよびＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離および抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１の挿入断片／挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施し、６５℃で１０分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。
【0234】
クローニングされたプラスミドを、ＴＩトランスフェクションおよびプール作製のために使用した。
【0235】
実施例３
培養、トランスフェクション、選択および単一細胞クローニング
ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、および５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１および選択マーカー２を有効濃度で含む既知組成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
培養、トランスフェクション、選択および単一細胞クローニング
ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、および５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１および選択マーカー２を有効濃度で含む既知組成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
【0236】
安定したトランスフェクションのために、等モル量のフロントベクターとバックベクターを混合した。混合物５μｇあたり１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを添加した。つまり、５μｇのＣｒｅ発現プラスミドまたはＣｒｅｍＲＮＡを２５μｇのフロントおよびバックベクター混合物に添加した。
【0237】
トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置で実施した。３ｘ１０Ｅ７細胞を、合計３０μｇの核酸、すなわち、３０μｇのプラスミド（５μｇのＣｒｅプラスミドおよび２５μｇのフロントおよびバックベクター混合物）、または５μｇのＣｒｅ ｍＲＮＡおよび２５μｇのフロントおよびバックベクター混合物のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。
【0238】
播種後５日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために、ピューロマイシン（選択剤１）および１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ；選択剤２）を有効濃度で含む８０ｍＬの既知組成培地に、６ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で移した。細胞は、３７℃、１５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２、および８５％湿度でこの日から分割せずに培養された。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１および２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞濃度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、選択培地ＩＩ（既知組成培地、１／２選択マーカー１および２）４０ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
【0239】
選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰおよび細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した。ＦＡＣＳ染色のために、ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を使用した。フローサイトメトリは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。試料あたり１万イベントを測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｏｌｔｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、すべての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。異種ポリペプチドを、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。ＣＨＯ親細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用された細胞を、ＧＦＰおよび［［Ｘ］］発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したと見なされた。
【0240】
選択後、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを、限界希釈による単一細胞クローニングに供した。この目的のために、細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色し、３８４ウェルプレートに０．６細胞／ウェルで播種した。単一細胞クローニングおよびその後のすべての培養工程では、選択剤２を培地から除外した。１つの細胞のみを含むウェルを、明視野および蛍光ベースのプレートイメージングによって同定した。１つの細胞を含むウェルのみを、さらに検討した。プレーティング後約３週間で、コンフルエントなウェルからコロニーを採取し、９６ウェルプレートでさらに培養した。
【0241】
９６ウェルプレートで４日後、培養培地中の抗体力価を、抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、抗体を、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合した抗ヒトＦｃ抗体で細胞培養液から捕捉し、捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する抗ヒトＦｃ抗体－ＰＯＤコンジュゲートで検出した。二次抗体を、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた化学発光によって定量した。
【0242】
実施例４
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
【0243】
実施例５
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１×１０Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、３日目に温度を変化させた。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）および生存率割合を測定した。グルコース、乳酸および生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２および１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定された。
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１×１０Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、３日目に温度を変化させた。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）および生存率割合を測定した。グルコース、乳酸および生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２および１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定された。
【0244】
実施例６
ＣＨＯ細胞におけるＲＮＰベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト
材料／リソース：
・ ガイドおよびプライマー設計用のＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．１．５
・ ＣＨＯ ＴＩ宿主細胞株；培養状態：３０～６０日目
・ ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））
・ ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇＲＮＡ（標的遺伝子に対して特注設計、３ｎｍ未修飾ｇＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ（商標）ｓｇＲＮＡネガティブコントロール、非ターゲティング１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ 培地（２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、４μｇ／ｍｌの選択剤２）
・ ＤＰＢＳ－ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＣａおよびＭｇを含まず）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
・ マイクロプレート２４ディープウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｖｏｉｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）、カバー（自作）付き
・ ＯＣ－１００カセット装着用の細長いＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、パイロジェンフリーのフィルターチップ。（Ｂｉｏｚｙｍｅ）
・ ヘラセーフフード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓアナライザー（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）
・ Ｌｉｃｏｎｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｔｏｒｅｘ ＩＣ
・ ＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液
・ ＭａｘＣｙｔｅ ＯＣ－１００カセット
・ ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸエレクトロポレーションシステム
ＣＨＯ細胞におけるＲＮＰベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト
材料／リソース：
・ ガイドおよびプライマー設計用のＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．１．５
・ ＣＨＯ ＴＩ宿主細胞株；培養状態：３０～６０日目
・ ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））
・ ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇＲＮＡ（標的遺伝子に対して特注設計、３ｎｍ未修飾ｇＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ（商標）ｓｇＲＮＡネガティブコントロール、非ターゲティング１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ 培地（２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、４μｇ／ｍｌの選択剤２）
・ ＤＰＢＳ－ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＣａおよびＭｇを含まず）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
・ マイクロプレート２４ディープウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｖｏｉｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）、カバー（自作）付き
・ ＯＣ－１００カセット装着用の細長いＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、パイロジェンフリーのフィルターチップ。（Ｂｉｏｚｙｍｅ）
・ ヘラセーフフード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
・ Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓアナライザー（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）
・ Ｌｉｃｏｎｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｔｏｒｅｘ ＩＣ
・ ＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液
・ ＭａｘＣｙｔｅ ＯＣ－１００カセット
・ ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸエレクトロポレーションシステム
【0245】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ送達
ＲＮＰは、１０μＬのＰＢＳ中で５μｇのＣａｓ９を１μｇのｇＲＮＡミックス（各ｇＲＮＡの比率が等しい）と混合することによりあらかじめ組み立てられ、ＲＴで２０分間インキュベートされる。２－４ｘ１０Ｅ６細胞／ｍＬの間の濃度の細胞を遠心分離（３分間、３００ｇ）し、５００μＬのＰＢＳで洗浄する。洗浄工程の後、細胞を再度遠心分離し（３分間、３００ｇ）、９０μＬのＨｙｃｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。あらかじめインキュベートしたＲＮＰミックスを細胞に加え、５分間インキュベートする。次に、この細胞／ＲＮＰ溶液をＯＣ－１００キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステムを使用してプログラム「ＣＨＯ２」でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション直後、細胞懸濁液を２４ウェル（ｄｗｅｌｌ）に移し、３７℃で３０分間インキュベートする。新鮮なあらかじめ加熱した培地を最終細胞濃度が１ｘ１０Ｅ６になるように添加し、細胞増殖のために３７℃および３５０ｒｐｍでインキュベートする。ゲノムＤＮＡ調製（６日目または８日目）のために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を細胞に添加し、ＰＣＲ鋳型として利用した。特異的ＳＩＲＴ－１アンプリコンは、標準的なＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅプロトコル（ＮＥＢ）とプライマーｏＳＡ０６０およびｏＳＡ０６１（配列番号１５および１６）を使用してＰＣＲ増幅された。アンプリコンは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによるサンガー配列決定により解析された。
ＲＮＰは、１０μＬのＰＢＳ中で５μｇのＣａｓ９を１μｇのｇＲＮＡミックス（各ｇＲＮＡの比率が等しい）と混合することによりあらかじめ組み立てられ、ＲＴで２０分間インキュベートされる。２－４ｘ１０Ｅ６細胞／ｍＬの間の濃度の細胞を遠心分離（３分間、３００ｇ）し、５００μＬのＰＢＳで洗浄する。洗浄工程の後、細胞を再度遠心分離し（３分間、３００ｇ）、９０μＬのＨｙｃｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。あらかじめインキュベートしたＲＮＰミックスを細胞に加え、５分間インキュベートする。次に、この細胞／ＲＮＰ溶液をＯＣ－１００キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステムを使用してプログラム「ＣＨＯ２」でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション直後、細胞懸濁液を２４ウェル（ｄｗｅｌｌ）に移し、３７℃で３０分間インキュベートする。新鮮なあらかじめ加熱した培地を最終細胞濃度が１ｘ１０Ｅ６になるように添加し、細胞増殖のために３７℃および３５０ｒｐｍでインキュベートする。ゲノムＤＮＡ調製（６日目または８日目）のために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を細胞に添加し、ＰＣＲ鋳型として利用した。特異的ＳＩＲＴ－１アンプリコンは、標準的なＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅプロトコル（ＮＥＢ）とプライマーｏＳＡ０６０およびｏＳＡ０６１（配列番号１５および１６）を使用してＰＣＲ増幅された。アンプリコンは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによるサンガー配列決定により解析された。
【0246】
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。１ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌで細胞を播種した。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）および生存率割合を測定した。グルコース、乳酸および生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２および１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定された。
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。１ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌで細胞を播種した。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）および生存率割合を測定した。グルコース、乳酸および生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２および１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。生成物品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】